UA100513C2 - Cd154-зв'язувальний білок та його застосування - Google Patents

Abstract

Винахід належить до CD154-зв’язувального білка (антитіла), молекули нуклеїнової кислоти, що його кодує, вектора, клітини-хазяїна, способу одержання антитіла, композиції та застосування даного білка у приготуванні лікарського засобу для лікування або профілактики стану, порушення або захворювання людини, опосередкованого у цілому або частково сигнальним шляхом за участі CD40.

Description

За даною заявкою вимагається пріоритет за попередньою заявкою на патент США Мо 60/920495, поданою 27 березня 2007, попередньою заявкою на патент США Мо 60/919938, поданою 22 березня 2007, і попередньою заявкою на патент США Мо 60/919816, поданою 22 березня 2007. Зміст заявок

США Мо 60/920495, 60/919938 і 60/919816 у повному обсязі включений у даний документ за допомогою посилання.

Галузь техніки, якої стосується винахід

Даний винахід стосується зв'язувальних білків, що включають антитіла, похідні антитіл і фрагменти антитіл, які специфічно зв'язуються з білюм СО154 (СО401Ї). Також даний винахід стосується химерного, гуманізованого і повністю людського антитіла, похідного антитіла або фрагмента антитіла, які специфічно зв'язуються з епітопом, з яким специфічно зв'язується гуманізований Гар-фрагмент, що містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО:1, і що містить послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:2. СО154-зв'язувальні білки за даним винаходом можуть виявляти знижену ефекторну функцію у порівнянні з другим анти-СО154-антитілом. СО154- зв'язувальні білюи за даним винаходом є придатними для діагностичних і терапевтичних способів, наприклад, при лікуванні і профілактиці захворювань, включаючи такі, у розвитку яких беруть участь небажані імунні реакції у відповідь, які опосередковуються взаємодіями СО154-С0040.

Рівень техніки

Генерація гуморальних і клітинних імунних реакцій регулюється взаємодією активованих Т-клітин- хелперів з антигенпрезентуючими клітинами (АРС") і ефекторними Т-клітинами. Активація Т-клітин- хелперів залежить не тільки від взаємодії з антигенспецифічним рецептором Т-клітин ("ТС") із його спорідненим пептидом-лігандом МНС, але також є необхідними скоординовані зв'язування та активація під дією ряду адгезії клітин і костимулювальних молекул. Наприклад, дивися ЗаїІа7аг-ЕРопіапа

Г.І. ї Віегег В.Е., 2001, Ситгг. Оріп. Нептаї. 8:5.

Однією критичною костимулювальною молекулою є СО154, трансмембранний білок типу Ії, який експресується на поверхні СО4" Т-клітин залежним від активації, обмеженим у часі чином. СО154 також експресується, після активації, на субпопуляції СО8" Т-клітин, базофілах, гладких клітинах, еозинофілах, природних клітинах-кілерах, В-клітинах, макрофагах, дендритних клітинах і тромбоцитах.

Протирецептором СО154, тобто СО40, є мембранний білок типу І, який конститутивно і на високому рівні експресується на поверхні клітин багатьох типів, включаючи АРС. Дивися, наприклад, ЕРоу Т.М. еї а!., 1996, Апп. Неу. Іттипої., 14:591.

Сигнальний шлях через СО40 за участю СО154 ініціює каскад подій, які призводять до активації клітин, що несуть СО40-рецептор, та оптимального СО4: Т-клітинного праймування. Конкретніше, зв'язування СО154 із СО40 стимулює диференціювання В-клітин у клітини, що секретують антитіла, і

В-клітини пам'яті. Дивися, наприклад, ВигКІу С.С., 2001, Іп Аду. Ехр. Мед. Віо., мої. 489., О.М.Мопгое еї а!., ед5., Кішгег Асадетіс/Ріепит Рибіїхпегв, р. 135 (далі у тексті "ВигкІу, вище"). Крім того, взаємодія бр154-2040 стимулює розвиток клітинних імунних реакцій за допомогою активації макрофагів і дендритних клітин і продукцію природних клітин-кілерів і цитотоксичних Т-лімфоцитів. Дивися, наприклад, ВигкІу, вище.

Важлива роль СО154 у регуляції функції гуморальних і клітинних імунних реакцій викликала великий інтерес до застосування інгібіторів даного шляху для терапевтичної імуномодуляції. Було показано, що анти-СО154-антитіла мають цілющі властивості на широкому ряді моделей імунної відповіді на інші терапевтичні білки або генну терапію, алергени, при автоіїмунних захворюваннях і трансплантації. Дивися, наприклад, патент США Мо 5474771, ВигкіІу, вище.

Було показано, що взаємодія СО40-СО154 є важливою при декількох індукованих в експерименті автоїмунних захворюваннях, де було встановлено, що індукцію захворювання можна блокувати антагоністами СО154 під час введення антигену (ВигКІуУ, вище). Також було показано пригнічення розвитку захворювання з використанням антагоністів СО154 на моделях спонтанного автоіїмунного захворювання на тваринах. Дивися, наприклад, ВигКІу, вище.

У цей час існує потреба в удосконалених анти-СО154-антитілах із вищою афінністю зв'язування і меншими небажаними побічними ефектами. Підвищені "ефекторні функції", такі як пряма цитотоксичність, комплементзалежна цитотоксичність ("СОС") антитілозалежна цитотоксичність (АрСС") та аномальна продукція антитіл, являють собою небажані побічні ефекти, що можуть бути пов'язані з застосуванням терапевтичних антитіл.

Декілька ефекторних функцій антитіл опосередковуються, принаймні, частково Ес-рецепторами (ГСК), які зв'язуються з Ес-ділянкою антитіла в константному домені типового імуноглобуліну. Існує ряд Ес-рецепторів, які є специфічними для різних класів імуноглобулінів. Дані класи імуноглобулінів включають Ідс, ІДЕ, ІдА, ІоМ їі дО. Класи імуноглобулінів додатково підрозділяють на підкласи: дО розділяють на чотири підкласи (Іде1, Ідс2, доз і Ід) і ІДА підрозділяють на два підкласи (ІдА!1 і

ІЧАг). Існує три відомих рецептори для Ідс: ЕсуВІ (СО64), Есуйі! (СО32) і ЕсукПШ (СО16). Кожен підклас

ЕсукК кодується двома або трьома генами, і альтернативний сплайсинг РНК призводить до утворення безлічі транскриптів і широкої різноманітності ізоформ ЕсуВ.

Як правило, імуноглобуліни являють собою молекули У-подібної форми, що містять два ідентичні важкі ланцюги і два ідентичні легкі ланцюги. Дисульфідні зв'язки зв'язують разом пари важкого і легкого ланцюгів, у також два важкі ланцюги. Кожен ланцюг складається з одного варіабельного домену, який варіює за послідовністю і є відповідальним за зв'язування з антигеном; ці домени відомі, як Мн- і Мі-домени для важкого і легкого ланцюгів відповідно. У легкому ланцюзі є один константний домен (Сі) і у важкому ланцюзі знаходиться три константних домени (Сні, Снг і Снз). Молекули, що містять усі варіабельні і константні домени, можна віднести до цілих антитіл.

Залишки у варіабельних доменах антитіла звичайно нумерують відповідно до системи, розробленої КаБбаї єї аІ. Дана система була представлена в КарБаї еї а!., 1987 у Зедиепсез ої Ргоїеїп5 ої Іттипоіодісаї! Іпієтеві, 05 Оерайтенпі ої Неайй апа Нитап Зегмісе5, МІН, О5А (далі у тексті "Кабаї єї аІм., вище"). Дана система нумерації використовується в цьому документі, за винятком тих випадків, коли зазначено інакше. Слід зазначити, що позначення залишків відповідно до системи Кабаї не завжди безпосередньо відповідає лінійній нумерації амінокислотних залишків. Фактична лінійна амінокислотна послідовність може містити менше, або, навпроти, більше амінокислот у порівнянні зі строгою нумерацією за Караї, що відповідає укороченню або вставці структурного компонента, каркасної ділянки або ділянки (СОК) основної структури варіабельного домену, що визначає комплементарність. Правильну нумерацію залишків за Караї можна визначити для даного антитіла вирівнюванням гомологічних залишків у послідовності антитіла зі "стандартною", нумерованою за

Каваї послідовністю.

У варіабельних доменах є три ділянки, які є гіперваріабельними за послідовністю в чотирьох більш консервативних каркасних ділянках. Дані гіперваріабельні ділянки СОК в основному відповідальні за розпізнавання антигену. Ділянки СОК варіабельного домену важкого ланцюга розташовані в залишках 31-35 (СОВ-НІ), залишках 50-65 (СОВ-Н2) і залишках 95-102 (СОВ-НЗ) відповідно до системи нумерації Караї. Однак відповідно до системи Споїпіа (Споїйіа С. апа І е5К А.М., у. Мої. Віо!., 1987, 196:901-917) петля, еквівалентна СОК-НІ, поширюється від залишку 26 до залишку 32. Таким чином, "СОВ-НТІ", у тому значенні, в якому цей термін використовується в даному документі, також включає

СОК, розташований у залишках 26-35, як описано при сполученні системи нумерації за КаБбаї і топологічного визначення петлі за Споїпіа. Ділянки СОК варіабельного домену легкого ланцюга розташовані в залишках 24-34 (СОВ-І1), залишках 50-56 (СОВ-І2) і залишках 89-97 (СОВ-Ї 3) відповідно до системи нумерації Кабраї.

Незважаючи на те, що природні антитіла, у вигляді цілих антитіл або у вигляді фрагментів, що зберігають специфічні зв'язувальні властивості, спочатку були одержані від одного виду, генно- інженерні антитіла можуть походити від більш ніж одного виду тварин, наприклад, химерні антитіла.

До цього часу, головним чином, були одержані химерні мишачі/людські антитіла і мишачі/антитіла приматів, які відрізняються від людини, хоча, можливі інші видові гібридні комбінації. У цей час відомо багато інших конфігурацій природних і генно-інженерних поліпептидів антитіл та їхніх похідних, і фрагментів. Загальною властивістю для усіх є те, що поліпептид або поліпептиди зберігають специфічність зв'язування антигену за допомогою одного або більше доменів, що зв'язуються з епітопом. Крім зв'язування з епітопом функціональні властивості поліпептиду антитіла можуть розрізнятися залежно від того, які інші послідовності присутні, наприклад, Ес-домени або інші послідовності, які активують ефекторні функції і/або взаємодіють з іншими клітинними шляхами.

Ср154-зв'язувальні білки, які містять епітоп-зв'язувальні домени (такі як ділянки СОК або варіабельні домени), включені в основу або каркас, які відрізняються від імуноглобулінів (дивися, наприклад, Віпл еї а!., 2005, Маї. Віоїесн., 23:1257-1268; Ноз5е вї а!., 2006, Ргоївїп Зсієпсе, 15:14-27), можуть виявляти знижені ефекторні функції. Бажано мати нові зв'язувальні білки, які специфічно перешкоджають зв'язуванню СО154 з СО40, і знижують або елімінують у прямому напрямку функції комплексу СО154-С040. Було б бажаним мати СО154-зв'язувальні білки, такі як анти-СО154-антитіла, зі зниженими ефекторними функціями у порівнянні з відомими анти-СО154-антитілами.

Суть винаходу

Даний винахід стосується рішення даних та інших проблем одержанням зв'язувального білка, такого як виділене, рекомбінантне або синтетичне антитіло, або його фрагмент або похідне, які специфічно зв'язуються з білююом СО154, який може являти собою людський білок СО154. Анти-СО0154- антитіла за винаходом, включаючи їхні фрагменти і похідні, можуть являти собою моноклональні, поліклональні, мишачі, химерні, приматизовані, гуманізовані або повністю людські антитіла. Анти-

СОр154-антитіла за винаходом можуть бути мультимерними, гетеродимерними, гемідимерними, моновалентними, бівалентними, тетравалентними, біспецифічними і можуть включати одноланцюгові антитіла; та їхні похідні.

У деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальні білки, наприклад, анти-СО154-антитіла, за даним винаходом, мають високу селективність стосовно СО154 і, у деяких варіантах здійснення, також мають одну або більше знижених ефекторних функцій порівняно, наприклад, з анти-СО154-антитілом 5с8 (продукованим гібридомою, депонованою в АТСС під інвентарним номером НВ 10916, як описано в патенті США Мо 5474771; або гуманізоване антитіло 5с8). Деякі з СО154-зв'язувальних білків,

наприклад, анти-СО154-антитіла, за винаходом є моновалентними стосовно зв'язування з СО154.

СОр154-зв'язувальні білки та анти-СО154-антитіла (включаючи фрагменти і похідні антитіл) за винаходом є придатними для інгібування зв'язування СО154 із СО40 і роблять це з високою специфічністю, наприклад, зі значенням ІСво у межах від 20 пкМ до 1,5 мкМ, включно. У деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальні білки, наприклад, анти-СО154-антитіла за винаходом можуть мати значення ІСзхо у межах від 20 пкМ до 500 пкМ, 50 пкМ до 500 пкМ або від 100 пкМ до 500 пкМ. У деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальні білки та анти-СО154-антитіла (включаючи фрагменти і похідні антитіл) за винаходом по суті не чинять агоністичної дії на активність СЮО40.

Деякі варіанти здійснення даного винаходу стосуються СО154-зв'язувальних білків, наприклад, анти-СО154-антитіл, які виявляють високу афінність до людського СО154. Наприклад, у деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-СО154-антитіло, дисоціює від людського СО154 (людського СЮО40)1|) зі значенням Ко у межах від 50 нМ до 1 пкМ включно за даними поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, ВіасогеФ). Наприклад, Ко для людського СО154 може складати від 50 пкМ до 1 пкМ, від 20 пкМ до 1 пкМ або навіть від 10 пкМ до 1 пкМ. У деяких варіантах здійснення Ко для людського СО154 складає менше ніж 20 пкМ. В інших варіантах здійснення Ко для людського СО154 складає менше ніж 10 пкМ.

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується СО154-зв'язувального білка, наприклад, анти-СО154-антитіла, який, коли знаходиться в насичувальних концентраціях або вище для зв'язування з СО154, грунтуючись на його афінності зв'язування, здатний блокувати зв'язування антитіла 5с8 із СО154, у тому випадку, коли його додають до СО154 першим, і також здатний витісняти антитіло 5с8, зв'язане з СО154, у тому випадку, коли його додають до СО154 після антитіла 5с8.

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується зв'язувального білка, наприклад, антитіла, який специфічно зв'язується з білюом СО154 і яке містить або складається з послідовності(ей) однієї або декількох СОК (Н) важкого ланцюга, вибраних із СОК-НІ (ЗЕО ІЮ МО:3), СОВ-Н2 (ЗЕО І МО 4) і

СОВ-НЗ (ЗЕО ІЮ МО:5). У додаткових варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок або антитіло містить або складається, принаймні, із двох СОК, вибраних із СОК-НІ (5ЕО І МО:3), СОВ-Н2 (5ЕО І

МО:4) і СОБ-НЗ (ЗЕО ІЮ МО:5). У ще одних варіантах здійснення зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовностей усіх трьох СОЕК Н, які являють СОК-НІ (ЗЕО І МО:3), СОВ-

Н2 (ЗЕО ІЮ МО:4) і СОБ-НЗ (5ЕО І МО:5).

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується зв'язувального білка, наприклад, антитіла, який специфічно зв'язується з білком СО154 і який містить або складається з послідовності(ей) однієї або декількох СОК (І) легкого ланцюга, вибраних із СОБК-І 1 (5ЕО 10 МО:6), СОВ-12 (ЗЕО ІО МО:7) і

СОВ-ІЗ (ЗЕО ІЮ МО:8). У додаткових варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок або антитіло містить або складається, принаймні, із двох СОК, вибраних із СОБ-Ї 1 (5ЕО ІЮ МО:6), СОВ-12 (5ЕО І

МО:7) ії СОК-ІЗ (ЗЕО ІЮ МО:8). У ще одних варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовностей усіх трьох СОК І, вибраних із СОК-І1 (5ЕО ІЮ

МО:6), СОВ-І 2 (ЗЕО ІО МО:7) і СОК-І З (ЗЕО І МО:8).

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується зв'язувального білка, наприклад, антитіла, який специфічно зв'язується з білком СО154 і містить або складається з однієї або декількох із СОВК-Ї 1 (ЗЕО ІЮ МО:6), СОВ-І2 (ЗЕО ІЮ МО:7) ії СОК-І З (ЗЕО ІО МО:8), і де зв'язувальний білок або антитіло додатково містить або складається з СОБ-НІ (ЗЕО ІЮ МО:3), СОК-Н2 (ЗЕО ІЮ МО:4) і СОБ-НЗ (5ЕО І

МО:5).

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується зв'язувального білка, наприклад, антитіла, який специфічно зв'язується з білюм СО154, де СО154-зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовності Ун, вибраної з БЗЕО ІЮ МО:1, 5ЕО ІЮ МО:9, 5ЕО ІЮО МО:10 і 5ЕО ІЮ МО:11.

У деяких інших варіантах здійснення даний винахід стосується зв'язувального білка, наприклад, антитіла, яке специфічно зв'язується з білююм СО154, де СО154-зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовності важкого ланцюга, вибраної з БЕО ІЮ МО:12 і 5ЕО ІЮ МО:13.

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується зв'язувального білка, наприклад, антитіла, який специфічно зв'язується з білюм СО154, де СО154-зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовності Мі, вибраної з 5ЕБЕО ІО МО:2 і 5ЕО ІО МО:14. У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується зв'язувального білка, наприклад, антитіла, який специфічно зв'язується з білюоом СО154, де СО154-зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовності легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:13.

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується зв'язувального білка, наприклад, антитіла, який специфічно зв'язується з білюм СО154, де СО154-зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовності Мі, вибраної з БЕО ІЮ МО:2 і ЗЕО ІЮ МО:14, і послідовності Мн, вибраної з

ЗЕО ІЮО МО:1, 5ЕО ІЮО МО:9, 5БО ІЮО МО:10 ї 5ЕО ІО МО:11. У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується зв'язувального білка, наприклад, антитіла, яке специфічно зв'язується з білком сОр154, де СО154-зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовності легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:15 і послідовності важкого ланцюга, вибраної з БЕО ІЮ МО:12 і ЗЕО ІЮ МО:13. В інших варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовності легкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО:15 і послідовності важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО:13.

В інших варіантах здійснення даний винахід стосується зв'язувального білка, наприклад, антитіла, який специфічно зв'язується з білком СО154 і який містить або складається з послідовності(ей) однієї або декількох СОК (Н) важкого ланцюга, вибраних із СОК-НІ (5ЕО ІО МО:42), СОВ-Н2 (5ЕО ІЮ МО:43) і СОБК-НЗ (ЗЕО І МО:44). У додаткових варіантах здійснення зв'язувальний білок або антитіло містить або складається, принаймні, із двох СОК, вибраних із СОК-НІ (ЗЕО ІЮ МО:42), СОВ-Н2 (5ЕО Ір

МО:43) і СОК-НЗ (ЗЕО ІЮО МО 44). У ще одних варіантах здійснення зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовностей усіх трьох СОК Н, які являють СОК-НІ (ЗЕО ІЮ МО:42),

СОВ-Н2 (ЗЕО І МО:43) і СОК-НЗ (ЗЕО ІЮ МО 44).

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується зв'язувального білка, наприклад, антитіла, який специфічно зв'язується з білююм СО154, де зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовності(ей) однієї або декількох СОК (І) легкого ланцюга, вибраних із СОК-Ї 1 (ЗЕО ІО МО:45), СОВ-І2 (5ЕО ІЮ МО:46) і СОК-Ї З (ЗЕО ІЮ МО:47). У додаткових варіантах здійснення зв'язувальний білок або антитіло містить або складається, принаймні, із двох СОК, вибраних із СОБК-

ЇЇ (5ЕО І МО 45), СОВ-І2 (ЗЕБО ІЮ МО:46) і СОК-І3 (ЗЕБО ІЮО МО:47). У ще одних додаткових варіантах здійснення зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовностей усіх трьох СОК І, які являють СОК-І 1 (5ЕО 10 МО:45), СОВ-І2 (ЗЕО ІЮ МО:46) і СОНК-І З (5ЕО ІО МО:А47).

У деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок або анти-СО154-антитіло за даним винаходом містить комплементарну послідовність, що містить або складається з однієї або декількох

СОК легкого ланцюга СОВК-І 1, СОВ-І2 ї СОК-І 3, відповідно наведених вище, або комплементарну послідовність, що містить або складається з однієї або декількох СОМ важкого ланцюга СОК-НІ, СОК-

Н2 ї СОК-НЗ, відповідно наведених вище. Таким чином, у деяких варіантах здійснення зв'язувальний білок або антитіло за даним винаходом містить або складається з СОК-НІ (5ЕО І МО:42), СОВ-Н2 (ЗЕО ІО МО:43) ії СОК-НЗ (ЗЕО ІЮ МО:44) і СОВК-І 1 (5ЕО 10 МО:45), СОВ-І2 (ЗЕО ІЮ МО:46) і СОК-І З (ЗЕО ІЮО МО 47).

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується СО154-зв'язувального білка, наприклад, анти-СО154-антитіла, де зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з наступних послідовностей трьох СОК ГГ: СОВ-І1 (5ЕО ІЮ МО:45), СОВ-12 (ЗЕО ІЮ МО:46) і СОК-І З (5ЕО І

МО:47) і де зв'язувальний білок або антитіло додатково містить або складається з наступних послідовностей трьох СОК Н: СОК-НІ (5ЕО ІЮ МО:42), СОВ-Н2 (ЗЕО ІС МО:43) ії СОК-НЗ (5ЕО І

МО:44).

У додаткових варіантах здійснення даний винахід стосується зв'язувального білка, наприклад, антитіла, який специфічно зв'язується з СО154 та який містить або складається з послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга (М) ЗЕО ІЮ МО:54. Також винахід стосується СО154- зв'язувального білка або анти-СО154-антитіла, які містять або складаються з послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга (Мн) ЗЕО ІЮ МО:56. У деяких варіантах здійснення СО154- зв'язувальний білок або анти-СО154-антитіло за винаходом може містити або складатися з послідовності Мі 5ЕО ІЮ МО:54 і послідовності Мн 5ЕО 1ЮО МО:56.

В інших варіантах здійснення даний винахід стосується СО154-зв'язувального білка, наприклад, анти-СО154-антитіла, який специфічно зв'язується з СО154, де СЮО154-зв'язувальний білок або анти-

Ср154-антитіло містить або складається з послідовності(ей) однієї або декількох СОК (Н) важкого ланцюга, вибраних із СОК-НІ (5ЕО ІЮ МО:48), СОВ-Н2 (5ЕО ІЮ МО:49) і СОК-НЗ (5ЕО ІЮ МО:50). У додаткових варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок або анти-СО154-антитіло містить або складається, принаймні, із двох СО, вибраних із СОК-НІ (5ЕО 10 МО:48), СОВ-Н2 (ЗЕО ІЮ МО:49) і

СОВ-НЗ (ЗЕО ІЮ МО:50). У ще одних варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок або анти-

Ср154-антитіло містить або складається з послідовностей усіх трьох СОК, які являють СОК-НІ (5ЕО

ІО МО:48), СОВ-Н2 (ЗЕО ІЮ МО:49) і СОБ-НЗ (ЗЕО ІО МО:50).

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується СО154-зв'язувального білка, наприклад, анти-СО154-антитіла, який специфічно зв'язується з білюом СО154, де СО154-зв'язувальний білок або анти-СО154-антитіло містить або складається з послідовності(ей) однієї або декількох СОК (І) легкого ланцюга, вибраних із СОК-Ї 1 (ЗЕО ІЮ МО:51), СОВ-12 (5ЕО І МО:52) і СОК-І З (ЗЕО ІО МО:53). У додаткових варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок або анти-СО154-антитіло містить або складається, принаймні, із двох СОК, вибраних із СОК-І 1 (5ЕО ІЮ МО:51), СОВ-12 (ЗЕО ІО МО:52) і

СОВ-ІЗ (ЗЕО ІЮ МО:53). У ще одних варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок або анти-СО154- антитіло містить або складається з послідовностей усіх трьох СОЕК Ї, які являють СОК-І 1 (ЗЕО ІЮ

МО:51), СОВ-І2 (ЗЕО ІЮ МО:52) і СОБ-ЇІ З (ЗЕО ІО МО:53).

У деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-СО154-антитіло, за даним винаходом містить комплементарну послідовність, що містить або складається з однієї або декількох СОК легкого ланцюга СОК-І1, СОВ-1І2 і СОК-І3, відповідно наведених вище, або комплементарну послідовність, що містить або складається з однієї або декількох СОК важкого ланцюга СОК-НІ, СОК-Н2 ї СОБК-НЗ, відповідно наведених вище. Таким чином, у деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом містить або складається з СОЕК Н, вибраних із СОК-НІ (5ЕО

ІО МО:48), СОВ-Н2 (ЗЕО ІО МО:49) ії СОБ-НЗ (5ЕО ІЮ МО:50), і СОК І, вибраних із СОБК-І 1 (ЗЕО ІЮ

МО:51), СОВ-І2 (ЗЕО ІЮ МО:52) і СОБ-ЇІ З (ЗЕО ІО МО:53).

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується СО154-зв'язувального білка, наприклад, анти-СО154-антитіла, де СО154-зв'язувальний білок або анти-СО154-антитіло містить або складається з послідовностей усіх трьох СОК І, що являють СОК-Ї 1 (5ЕО І МО:С51), СОВ-12 (ЗЕ Ір

МО:52) і СОМК-Ї З (5ЕО ІЮ МО:53) і де зв'язувальний білок, наприклад, антитіло, додатково містить або складається з послідовностей усіх трьох СОЕК Н, які являють СОБК-НІ (ЗЕО І МО:48), СОВ-Н2 (ЗЕО Ір

МО:49) і СОБ-НЗ (ЗЕО І МО:50).

У додаткових варіантах здійснення даний винахід стосується СО154-зв'язувального білка, наприклад, анти-СО154-антитіла, яке специфічно зв'язується з СО154, де СЮО154-зв'язувальний білок або анти-СО154-антитіло містить або складається з послідовності М 5ЕО ІЮО МО:58. У додаткових варіантах здійснення антитіло містить або складається з послідовності Мн 5ЕО ІЮ МО:60. У додаткових варіантах здійснення антитіло містить або складається з послідовності Мн 5ЕО ІЮ МО:60 і послідовності М. 5ЕО ІЮ МО:58.

У деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок за даним винаходом містить послідовність легкого ланцюга 5ЕО ІЮО МО:62 і послідовність важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:65. В інших варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок за даним винаходом містить послідовність легкого ланцюга 5ЕО 1О МО:63 і послідовність важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:66.

У деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок за даним винаходом містить послідовність легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО:68 і послідовність важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:71. В інших варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок за даним винаходом містить послідовність легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:69 і послідовність важкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО:72. В інших варіантах здійснення

Ср154-зв'язувальний білок містить, принаймні, одну з послідовностей 5ЕО ІЮ МО:68, 5ЕО ІЮ МО:69, 5ЕО ІЮ МО:71 і БЕО ІЮО МО:72.

Послідовності СОК 5ЕО ІЮ МО:3-8 одержані з щурячого моноклонального антитіла 342. В альтернативному варіанті здійснення винаходу анти-СО154-антитіло являє собою щуряче антитіло 342, що містить послідовність Мн-домену ЗЕО ІЮ МО:29 і послідовність Мі-домену 5ЕО ІЮ МО:30.

Також винахід стосується молекули виділеної, рекомбінантної або синтетичної ДНК, яка містить або складається, принаймні, з однієї послідовності, вибраної з БЕО ІЮО МО:31 і ЗЕО ІЮ МО:32. Додатково надається вектор, що містить, принаймні, одну послідовність, вибрану з БЗЕО ІЮ МО:33 і ЗЕО ІЮ МО:34.

Також винахід стосується СО154-зв'язувальних білків, наприклад, анти-СО154-антитіл, які селективно зв'язуються з тим же самим епітопом, що і будь-яке з анти-СО154-антитіл, розкритих у даному документі (наприклад, антитіла 342, 381 і 338 та їхні послідовності, що зв'язуються з епітопом).

Зокрема, антитіла 342 і 338 за даним винаходом виявляють аналогічні зв'язувальні СО154 властивості, коли використовуються у ролі першого або другого антитіл у конкурентних тестах з анти-

Ср154-антитілом 5с8, як описано в даному документі.

Таким чином, у деяких варіантах здійснення винахід стосується СО154-зв'язувальних білків і анти-

СОр154-антитіл, що зв'язуються з тим же самим епітопом, що і гуманізоване антитіло, що містить послідовність важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО:12 або 5ЕБЕО ІО МО:13 і містить послідовність легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:15 (Рар- і Рар'-ррагменти 342), і яке виявляє аналогічні зв'язувальні СЮО154 властивості в тому випадку, коли використовуються у ролі перших або других антитіл у конкурентних тестах з анти-СО154-антитілом 5с8, як описано в даному документі. В інших варіантах здійснення винахід стосується СО154-зв'язувальних білків і анти-СО154-антитіл, які зв'язуються з тим же самим епітопом, що і гуманізоване антитіло, що містить послідовність Мі-домену 5ЕО ІЮ МО:58 і послідовність Мн-домену 5ЕО ІЮ МО:60 (варіабельні послідовності антитіла 338), і які виявляють аналогічні зв'язувальні СО154 властивості в конкурентних тестах з анти-СО154-антитілом 5с8, як описано в даному документі.

У будь-якому з описаних вище варіантів здійснення, що стосуються СО154-зв'язувального білка за винаходом, зв'язувальний білок може бути ПЕГільований. У варіантах здійснення, в яких СО154- зв'язувальний білок є анти-СО154-антитілом, поліпептидом антитіла або його фрагментом або похідним, антитіло може бути ПЕГільоване у важкому ланцюзі, легкому ланцюзі або обох ланцюгах.

Також даний винахід стосується молекули виділеної, рекомбінантної і/або синтетичної ДНК, що містить або складається, принаймні, з однієї послідовності, вибраної з БЗЕО ІЮ МО:16, 5ЕО ІЮ МО:17, 5ЕО ІЮ МО:18 і БЕО ІЮ МО:25.

У деяких варіантах здійснення даний винахід також стосується молекули виділеної, рекомбінантної і/або синтетичної ДНК, що містить або складається, принаймні, з однієї послідовності, вибраної з БЕО

ІО МО:19, БЕО І МО:20, 5ЕО ІЮ МО:21, 5ЕО І МО:22, 5ЕО ІЮ МО:23, 5ЕО ІЮ МО:24, 5ЕО ІЮ МОС26, 5ЕО ІЮ МО:27, 5ЕО ІЮ МО:67, 5ЕО ІЮ МО:70 і 5ЕО ІО МО:73.

У ще одних варіантах здійснення винахід стосується молекули виділеної, рекомбінантної і/або синтетичної ДНК, що містить або складається, принаймні, з однієї послідовності, вибраної з ЗЕО ІЮ

МО:28 і БЕО ІЮ МО:41.

Також даний винахід стосується вектора, який містить будь-яку з молекул виділеної, рекомбінантної і/або синтетичної ДНК за даним винаходом. В одному варіанті здійснення вектор містить, принаймні, одну послідовність, вибрану з БЕО ІЮ МО:25, 5ЕО ІЮО МО:26, 5ЕО ІЮ МО:27, 5ЗЕО

ІО МО:28 і БЕО ІЮ МО:41.

У додаткових варіантах здійснення даний винахід стосується молекули виділеної, рекомбінантної і/або синтетичної ДНК, що містить або складається, принаймні, з однієї послідовності, вибраної з ЗЕО

ІО МО:55 і 5ЕО ІЮ МО:57. У деяких варіантах здійснення винахід стосується молекули виділеної, рекомбінантної і/або синтетичної ДНК, що містить або складається з обох послідовностей ЗЕО ІЮ

МО:55 і БЕО ІЮ МО:57.

У додаткових варіантах здійснення даний винахід стосується молекули виділеної, рекомбінантної і/або синтетичної ДНК, що містить або складається, принаймні, з однієї послідовності, вибраної з БЕО

І МО:59 і 5ЕО ІЮ МО:61. У деяких варіантах здійснення винахід стосується молекули виділеної, рекомбінантної і/або синтетичної ДНК, що містить або складається з обох послідовностей ЗЕО ІЮ

МО:59 і БЕО ІЮ МО:61.

У будь-якому з варіантів здійснення винаходу, що стосуються СО154-зв'язувальних білків і анти-

Ср154-антитіл, які містять послідовності, що вносять свій внесок у забезпечення ефекторних функцій, зазначені зв'язувальні білки та анти-СО154-антитіла можуть бути додатково вибрані або сконструйовані для вияву зниженої ефекторної функції у порівнянні з анти-СО154-антитілом з Ес- ділянкою, як описано в даному документі. Наприклад, СО154-зв'язувальні білки та анти-СО154- антитіла, які не містять послідовностей Ес-ділянки або константної ділянки або в яких відсутні послідовності функціональних Ес-ділянок або константної ділянки, можуть бути вибрані для використання за даним винаходом.

У деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальні білки та анти-СО154-антитіла за винаходом є моновалентними стосовно зв'язування з СО154 і переважно виявляють знижені ефекторні функції при введенні суб'єкту у порівнянні з СЮО154-зв'язувальним білком порівняння, таким як бівалентне анти-

СО154-антитіло.

У деяких інших варіантах здійснення послідовності Ес-ділянки або константної ділянки, якщо вони присутні в СО154-зв'язувальному білку, наприклад, поліпептиді анти-СО154-антитіла, можуть бути вибрані або сконструйовані для змісту однієї або більше модифікацій (наприклад, амінокислотних замін, вставок, аддуктів або делецій), що призведе до зниження або елімінації однієї або більше ефекторних функцій у порівнянні з контрольним анти-СО154-антитілом, що містить нативні, вихідні або немодифіковані послідовності Ес-ділянки або константної ділянки.

У деяких варіантах здійснення даного винаходу Ес-ділянка, у тому випадку, коли вона є, являє собою Ес-ділянку з або одержану з Ідс1, Ідс2, ІдОЗ або Ідс4 антитіла. У деяких варіантах здійснення можна використовувати гібридні Ес-ділянки, тобто Ідс1/Л9до4 гібридні Ес-послідовності. У конкретних варіантах здійснення Ес-ділянка містить Ес-послідовності ІдО4 або вона одержана з ІдСі4-антитіла.

Необхідно розуміти, що можна використовувати будь-яку гібридну комбінацію між різними Ес- ділянками, яка призводить до зниження однієї або більш ефекторних функцій за даним винаходом.

У деяких інших варіантах здійснення зменшують або елімінують глікозильовані Ес-ділянки антитіла або змінюють профіль глікозилювання антитіла, як описано далі в даному документі. У деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок або поліпептид анти-СО154-антитіла містить Снео- домен із Ес-ділянкою, що містить модифікацію з модифікацією в або поблизу консервативного сайта

М-зв'язаного глікозилювання. Модифікація в консервативному сайті М-зв'язаного глікозилювання може включати мутацію в або поблизу сайта глікозилювання важкого ланцюга, де мутація знижує, змінює або попереджає глікозилювання в сайті. У додаткових варіантах здійснення модифікація включає мутацію М2980 (М297 при використанні БО нумерації Кара). У деяких варіантах здійснення модифікація включає видалення гліканів у Сн»-домені або їхніх фрагментах. У деяких альтернативних варіантах здійснення модифікація попереджає утворення зрілого М-глікану в сайті глікозилювання.

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується СО154-зв'язувального білка, наприклад, анти-СО154-антитіла, що містить послідовність СОМКЗ важкого ланцюга, вибрану з ЗЕО ІЮ МО:5, 44 і 50, і варіантну Ес-ділянку, де варіантна Ес-ділянка містить перший амінокислотний залишок і сайт М- глікозилювання, де перший амінокислотний залишок модифікований зміною бічного ланцюга або амінокислотною заміною для досягнення підвищеного стеричного розміру або підвищеного електростатичного заряду у порівнянні з немодифікованим першим амінокислотним залишком, зі зниженням тим самим рівня або зміною іншим чином глікозилювання в сайті М-глікозилювання. У деяких з даних варіантів здійснення варіантна Ес-ділянка надає знижену ефекторну функцію у порівнянні з контрольною, неваріантною Ес-ділянкою.

У деяких варіантах здійснення винахід стосується СО154-зв'язувального білка, наприклад, анти-

Ср154-антитіла, що містить послідовність СОКЗ важкого ланцюга, вибраного з ЗЕО ІЮО МО:5, 44 і 50, і варіантну Ес-ділянку, де варіантна Ес-ділянка містить перший амінокислотний залишок і сайт М- глікозилювання, де перший амінокислотний залишок містить тіол цистеїн зі зниженням тим самим рівня або зміною іншим чином глікозилювання в сайті М-глікозилювання, де варіантна Ес-ділянка надає знижену ефекторну функцію.

У деяких варіантах здійснення перший амінокислотний залишок і сайт М-глікозилювання анти-

Ср154-антитіл, що містять варіантні Ес-ділянки, описані вище, знаходяться поблизу або в мотиві М- зв'язаного глікозилювання. У додаткових варіантах здійснення мотив М-зв'язаного глікозилювання містить амінокислотну послідовність МХТ або МХ5. У деяких варіантах здійснення мотив М-зв'язаного глікозилювання містить амінокислотну послідовність МХТ. У деяких варіантах здійснення сайт М- глікозилювання розташований в амінокислоті 297 за системою нумерації Караї. У додаткових варіантах здійснення перший модифікований амінокислотний залишок являє амінокислоту 299 за системою нумерації Кабаї.

У деяких з описаних вище варіантів здійснення знижена ефекторна функція, що виявляється будь- яким з антитіл або фрагментів антитіл, що містять зв'язувальні білки, описані в даному документі, являє знижене зв'язування з Ес-рецептором (ГСК). У деяких варіантах здійснення Ес-рецептор (ЕсСК) вибраний із ЕсуВіІ, ЕсуйіІ ї ЕсукІ, і одного або більше їхніх підтипів, наприклад, таких як ЕсукІПа. У деяких варіантах здійснення зв'язування з ЕсК нижче, принаймні, приблизно в 1,5 рази або більше, приблизно в 2 рази або більше, приблизно в З рази або більше, приблизно в 4 рази або більше, приблизно в 5 разів або більше, приблизно в 6 разів або більше, приблизно в 7 разів або більше, приблизно в 8 разів або більше, приблизно в 9 разів або більше, приблизно в 10 разів або більше, приблизно в 15 разів або більше, приблизно в 50 разів або більше або приблизно в 100 разів або більше.

У деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-СО154-антитіло, за винаходом з однією або більше зниженими ефекторними функціями, описаними в даному документі, не зв'язується зі специфічним ефекторним рецептором або підтипом ефекторного рецептора. У деяких із даних варіантів здійснення СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-СО154-антитіло, не зв'язується з ЕсуВІІа.

У деяких варіантах здійснення знижена ефекторна функція, що виявляється будь-яким одним з антитіл, описаних у даному документі, являє знижене зв'язування з білююм комплементу. У деяких варіантах здійснення білок комплементу являє С1д. У деяких варіантах здійснення зв'язування з білком комплементу нижче, принаймні, приблизно в 1,5 рази або більше, приблизно в 2 рази або більше, приблизно в З рази або більше, приблизно в 4 рази або більше, приблизно в 5 разів або більше, приблизно в 6 разів або більше, приблизно в 7 разів або більше, приблизно в 8 разів або більше, приблизно в 9 разів або більше, приблизно у 10 разів або більше, приблизно в 15 разів або більше.

У додаткових варіантах здійснення даного винаходу СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-

Ср154-антитіло, за винаходом містить одну або більше модифікацій або варіацій Ес-ділянки, не глікозильований і виявляє одну або більше знижених ефекторних функцій при введенні суб'єкту.

У деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-СО154-антитіло, за винаходом викликає менше тромбоемболічних ускладнень у порівнянні із введенням анти-СО154- антитіла 5с8 при введенні суб'єкту.

У деяких варіантах здійснення даного винаходу модифікований перший амінокислотний залишок

Ср154-зв'язувальних білків або анти-СО154-антитіл, що містять варіантні Ес-ділянки, описані в даному документі, зв'язаний із функціональною групою. У додаткових варіантах здійснення функціональна група являє блокувальну групу, детектовану групу, діагностичну групу або терапевтичну групу або їхні комбінації. Блокувальна група у деяких варіантах здійснення, може являти, наприклад, цистеїновий аддукт, змішаний дисульфід, поліетиленгліколь або поліетиленгліколь-малеїмід. Детектована група, у деяких варіантах здійснення, може являти, наприклад, флуоресцентну групу, люмінесцентну групу або ізотопну групу. У варіантах здійснення, в яких використовується діагностична група, то діагностична група може бути здатною виявляти наявність стану, захворювання або порушення. В інших варіантах здійснення можна використовувати терапевтичну групу, наприклад, таку як протизапальний засіб, протипухлинний засіб, засіб для лікування нейродегенеративного захворювання, антитіло, яке є селективним для молекули, що відрізняється від СО154, або протиінфекційний засіб.

У деяких варіантах здійснення даного винаходу СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-

Ср154-антитіло, містить модифікований амінокислотний залишок, де модифікація забезпечує сайт- спрямоване кон'югування білка або антитіла з функціональною групою, таке як сайт-спрямоване пегілювання. У деяких варіантах здійснення модифікований амінокислотний залишок являє залишок цистеїну, модифікований цистеїновим або змішаним дисульфідним аддуктом. Таким чином, у деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок являє поліпептид анти-СО154-антитіла, що пегільований за модифікованим амінокислотним залишком, наприклад, за залишком цистеїну або лізину. У деяких варіантах здійснення анти-СО154-антитіло є Рар- або Бар'-фрагментом, пегільованим

ПЕГ-малеїмідом.

Також даний винахід стосується нуклеїнової кислоти, наприклад, послідовностей ДНК, що кодують

Ср154-зв'язувальні білки, наприклад, анти-СО154-антитіла, за винаходом. Послідовності ДНК за даним винаходом можуть включати синтетичну ДНК, наприклад, одержану хімічною обробкою, кКДНК, геномну ДНК або будь-яку їхню комбінацію. Даний винахід додатково стосується клонуючих або експресуючих векторів, що містять одну або більше нуклеїнових кислот, наприклад, послідовності ДНК за даним винаходом. Також винахід стосується, у деяких варіантах здійснення, вектора, що містить будь-яку із синтетичних, виділених і/або рекомбінантних нуклеїнових кислот, описаних вище.

Даний винахід також стосується клітини-хазяїна, що містить послідовність ДНК або вектор за винаходом. У деяких аспектах даний винахід стосується способу одержання СО154-зв'язувального білка, наприклад, анти-СО154-антитіла, що включає культивування клітини-хазяїна, що містить будь- який із векторів, описаних вище, в умовах, придатних для продукції СО154-зв'язувального білка або анти-СО154-антитіла клітиною-хазяїном. У деяких варіантах здійснення спосіб включає виділення

СОр154-зв'язувального білка або анти-СО154-антитіла з культури клітин-хазяїнів.

У деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок, анти-СО154-антитіло або нуклеїнову кислоту за даним винаходом мітять детектованим маркером, який може являти собою радіоактивний ізотоп, фермент, барвник або біотин. У деяких інших варіантах здійснення антитіло за даним винаходом кон'югують, принаймні, з одним іншим терапевтичним засобом, який, наприклад, може являти собою радіоактивний ізотоп, радіонуклід, токсин, токсоїд, поліпептид або фрагмент не специфічного до СО154 антитіла (наприклад, одержавши при цьому біспецифічне або мультиспецифічне антитіло) або хіміотерапевтичний засіб. У ще одних варіантах здійснення антитіло за даним винаходом кон'югують із візуалізуючим агентом, який може являти групу для мічення. Агент для мічення також може являти біотин, флуоресцентну або люмінесцентну групу, радіоактивну групу, гістидинову мітку або пептидну мітку.

Також даний винахід стосується варіантів послідовностей СО154-зв'язувальних білків, наприклад, анти-СО154-антитіл, описаних у даному документі, послідовностей нуклеїнових кислот, які їх кодують.

Варіанти послідовностей за винаходом переважно мають, принаймні, 90 9», 91 9», 92 Фо, 93 95 або 94 95 ідентичність із поліпептидом за винаходом або з послідовністю нуклеїнової кислоти, яка кодує його.

Переважніше, варіант послідовності має, принаймні, 95 9», 96 Фо, 97 95 або 98 95 ідентичність на рівні амінокислот або нуклеїнових кислот. Найбільш переважний варіант послідовності за винаходом переважно має, принаймні, 99 95, 99,5 95, 99,9 95 ідентичність із поліпептидом за винаходом або з послідовністю нуклеїнової кислоти, яка кодує його.

Отже, даний винахід стосується виділеного білка, що містить послідовність, яка, принаймні, на 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9 або 100 95 ідентична послідовності ЗЕО ІЮ МО:1, 5ЕО ІЮ

МО:2, 5ЕО ІЮ МО:З3, 5ЕО 10 МОС4, 5БЕО ІЮ МО:5, 5ЕО ІЮ МО:б6, 5ЕО ІЮ МО:7, 5ЕО І МО:8, 5ЕО І

МО:9, 5ЕО ІЮ МО:10, 5ЕО ІЮ МО:С11, 5ЕО ІЮ МО:12, 5ЕО І МО:13, 5ЕО ІЮ МО 14, 5ЕО ІЮ МО:15, 5ЕО

ІО МО:16, 5ЕО ІЮ МО:29, 5ЕО ІО МО:30, 5ЕО І МО:42, 5ЕО ІЮ МО:43, 5ЕО 10 МО:44, 5ЕО ІЮ МО :45,

ЗЕО ІЮ МО:46, 5ЕО ІЮ МО:47, 5ЕО І МО:48, 5ЕО 10 МО:49, 5ЕО І МО:50, 5ЕО ІЮ МО:51, 5ЕО І

МО:52, 5ЕО ІЮ МО:53, 5ЕО 10 МО:54, 5ЕО ІЮ МО:56, 5БО І МО:58, 5ЕО ІО МО:60, 5ЕО І МО:68,

ЗЕО ІЮ МО:69, 5ЕО ІЮ МО:71 або 5ЕО ІО МО:72.

У деяких варіантах здійснення поліпептид химерного, гуманізованого або людського анти-СО154- антитіла за винаходом являє, наприклад, АБ, Раб, Рар', 5сЕм, Ем, зв'язаний через дисульфід Ем, або містить один варіабельний домен імуноглобуліну, такий як Мн- або Мі- домен, що є специфічним або моновалентним стосовно зв'язування СО154. Деякі СО154-зв'язувальні білки, наприклад, поліпептиди химерних, гуманізованих або людських анти-СО154-антитіл за винаходом містять одну, дві або більше ділянки СОК за винаходом та альтернативну основу або універсальні каркасні послідовності. У деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальні білки та анти-СО154-антитіла за винаходом містять єдиний варіабельний домен, вибраний із варіабельної ділянки важкого ланцюга (Мн) і варіабельної ділянки легкого ланцюга (Мі).

Також винахід стосується СО154-зв'язувального білка, наприклад, поліпептиду химерного, гуманізованого або людського анти-СО154-антитіла, яке є моновалентним стосовно зв'язування з

СОр154, яке кон'юговане з функціональною групою, що призводить до підвищення його часу напівжиття в умовах іп мімо у порівнянні з тим самим поліпептидом без функціональної групи. У деяких варіантах здійснення функціональна група включає або складається з поліетиленгліколю. У деяких варіантах здійснення функціональна група включає або складається з молекули альбуміну, такого як людський сироватковий альбумін. Отже, винахід стосується зв'язаного з ПЕГом СО154-зв'язувального білка, наприклад, зв'язаного з ПЕГом поліпептиду химерного, гуманізованого або людського анти-СО154- антитіла, який специфічно і моновалентно зв'язується з СО154, і який має збільшений час напівжиття в умовах іп мімо у порівнянні з тим же поліпептидом без зв'язаного поліетиленгліколю.

Також даний винахід стосується фармацевтичної композиції, що містить, принаймні, один СО154- зв'язувальний білок, наприклад, анти-СО154-антитіло, за даним винаходом, яка може, у деяких варіантах здійснення, додатково містити фармацевтично прийнятний носій. Фармацевтична композиція за винаходом може необов'язково додатково містити додаткову біологічно активну сполуку або терапевтичний засіб, наприклад, таку як імуносупресивна або імуномодулююча сполука або засіб; або діагностичний засіб. У деяких варіантах здійснення композиція містить терапевтично ефективну кількість пегільованого анти-СО154-Рар'-антитіла, що має специфічність до епітопу анти-СО154- антитіла 342 або 338, описаних у даному документі.

Додатково даний винахід стосується способу лікування або профілактики стану, порушення, захворювання в людини, опосередкованого в цілому або частково сигнальним шляхом за участю с040, або симптому будь-якого зі згаданого вище, де спосіб включає стадію введення суб'єкту, що потребує цього, терапевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, що містить СО154- зв'язувальний білок, наприклад, анти-СО154-антитіло, за даним винаходом, таким чином, що забезпечується лікування або профілактика стану, захворювання або порушення.

Також даний винахід стосується способу інгібування або профілактики імунної, автоїмунної або запальної реакції у відповідь, опосередкованої в цілому або частково сигнальним шляхом за участю с040, або симптому будь-якого зі згаданого вище, де спосіб включає стадію введення суб'єкту, що потребує цього, терапевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, що містить СО154- зв'язувальний білок, наприклад, анти-СО154-антитіло, за даним винаходом, таким чином, що забезпечується терапевтична або профілактична реакція у відповідь. У деяких варіантах здійснення спосіб використовують для лікування суб'єкта, що має симптоми або якому поставлений діагноз системного червоного вовчака (ЗЕ). В інших варіантах здійснення спосіб використовують для лікування суб'єкта, що має симптоми або якому поставлений діагноз ревматоїдного стану, наприклад, такого як ревматоїдний артрит (КА).

Даний винахід стосується поліпептиду людського антитіла, що є моновалентним стосовно зв'язування з СО154. У деяких варіантах здійснення поліпептид людського антитіла, який є моновалентним стосовно зв'язування з СО154, коли знаходиться в насичувальних концентраціях або вище для зв'язування з СО154, грунтуючись на його афінності зв'язування, блокує зв'язування антитіла 5с8 із СО154, у тому випадку, коли його додають до СО154 першим, і витісняє антитіло 5с8, зв'язане з СО154, у тому випадку, коли його додають після антитіла 5с8. У деяких варіантах здійснення поліпептид людського антитіла зв'язаний з ПЕГом. У деяких варіантах здійснення поліпептид людського антитіла не містить Ес-домену. У деяких з описаних вище варіантів здійснення

Ср154-зв'язувальний білок або поліпептид людського антитіла не витісняє СО154, зв'язаний із СЮО40.

У деяких варіантах здійснення винахід стосується пегільованого анти-СО154-Рар'-антитіла, яке є моновалентним стосовно зв'язування з СО154 і додатково стосується способів лікування або профілактики одного або більше симптомів артриту, такого як ревматоїдний артрит, або системного червоного вовчака (ЗІ Е), що включає стадію введення суб'єкту, що потребує цього, терапевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, що містить пегільоване анти-СО154-Рар'-антитіло, таким чином, що забезпечується терапевтична або профілактична реакція у відповідь.

Короткий опис фігур

На фіг.1 наведена таблиця з амінокислотними послідовностями ділянок (СОК) анти-СО154-антитіл 342, 381 і 338, що визначають комплементарність.

На фіг.2 наведена таблиця з амінокислотними і відповідними нуклеотидними послідовностями Ун- і

Мі-доменів щурячого анти-СО154-антитіла 342. Підкреслені послідовності відповідають нуклеотидній послідовності, що кодує лідерний (тобто сигнальний) пептид.

На фіг.3 наведена таблиця з амінокислотними і відповідними нуклеотидними послідовностями людських акцепторних каркасних ділянок, використаних для одержання гуманізованих анти-СО154- антитіл у прикладах.

На фіг.4 наведена таблиця з амінокислотними і відповідними нуклеотидними послідовностями Мн- і

Мі-доменів, в яких СОК антитіла 342 були пересаджені в каркасні ділянки, наведені на фіг.3.

На фіг.5 наведена таблиця з амінокислотними і відповідними нуклеотидними послідовностями Мн- доменів антитіла 342 (МНЗ д1 і МН4А 91), в яких СОК антитіла 342 були пересаджені в людські акцепторні каркасні ділянки та в яких були збережені деякі ключові донорні залишки.

На фіг.б6 наведена таблиця з амінокислотними і відповідними нуклеотидними послідовностями домену Мі антитіла 342 (МК 91), в яких СОК антитіла 342 були пересаджені в людські акцепторні каркасні ділянки та в яких були збережені деякі ключові донорні залишки.

На фіг.7 наведена таблиця з послідовностями для повного легкого ланцюга (варіабельної і константної ділянок легкого ланцюга) і ділянок важкого ланцюга антитіла 342. Підкреслені послідовності, що відповідають сигнальному/лідерному пептидам.

На фіг.8 показана нуклеотидна послідовність експресуючих інсертів, які використовували для одержання варіантів Бар (ЗЕБО ІЮ МО:28) і Рар' (ЗЕБЕО ІЮО МО:41) пересадженого 342 аі49Н!1.

Підкреслені сигнальна/лідерна послідовності і виділені великими літерами і жирним шрифтом сайти рестрикції (використані для клонування в експресуючий вектор Е. сої, як описано в прикладі 2).

На фіг.9 показане вирівнювання амінокислотної послідовності легкого і важкого ланцюгів щурячого анти-СО154-антитіла 342 (донорного антитіла) із людськими каркасними (акцепторними) ділянками зародкової лінії, використаними при гуманізації антитіла 342. "Легкий ланцюг антитіла 342" являє собою послідовність щурячого Мі-домену. "Важкий ланцюг антитіла 342" являє послідовність щурячого

Мн-домену. Залишки СОК виділені жирним шрифтом і підкреслені. Показано акцепторну каркасну ділянку легкого ланцюга (2 1 1 012; 5ЕО ІЮО МО:35) і важкого ланцюга (1-1 3-66; 5ЕО ІЮО МО:37 і 1-1 4- 59; 5ЕО ІО МО:39). Також показані тільки пересаджені СОК у людські акцепторні каркасні ділянки зародкової лінії (МК! 93, МНЗ 97 і МН4 96). У деяких гуманізованих важких і легких ланцюгах зберігаються донорні залишки антитіла 342 у каркасній ділянці, і дані ключові залишки донорної каркасної ділянки виділені курсивом і жирним шрифтом. Донор МК 914 являє КЗ8, У71 і 585. Донор

МНЗ ОН! являє У24, М48, 549, Т83 і М78. Донор УНА ЧНІ являє М48, К71 і М78. Наведені ЗЕО ІЮ МО для легких ланцюгів у порядку зверху вниз: БЕО ІЮ МО:30 ("342"), БЕО ІО МО:35 (72 1 1 0127), БЕО І

МО:14 ("342 9І 3") і БЕО ІЮО МО:2 ("342 ді 4"). Наведені 5ЕО ІО МО для важких ланцюгів (пересаджені

МНЗ) у порядку зверху вниз: ЗЕО ІЮ МО:29 ("342"), 5ЕО ІЮ МО:37 (1-1 3-66"), 5ЕО І МО:10 (7342 9Н7") ії 5ЕО ІО МО:1 ("342 9НІ1"). Наведені БЕО ІЮО МО для важких ланцюгів (пересаджені МН4У) у порядку зверху вниз: БЕО ІЮ МО:29 ("342"), БЕО ІЮ МО:39 ("1-1 4-59"), варіант БЕО ІЮ МО:9 (УНА дНнб" (ЗЕО ІО МО:74)) і варіант ЗЕО ІЮ МО:11 ("УНА ЧНІ" (5ЕО ІО МО:75)). Варіанти ЗЕО ІЮ МО:9 і ЗЕО ІЮ

МО:11, наведені на фіг.9, починаються з амінокислоти "Е" (замість "С", як має місце відповідно на фіг.4 ї 5) для експресії в Е. соїї. Отже, нуклеотидні послідовності, що відповідають даним мутантної

ЗЕО ІЮ МО:9 і 11, відрізняються від нуклеотидних послідовностей 5ЕО ІЮ МО:19 і БЕО ІО МО:21 тим, що вони починаються з нуклеотиду "д" замість "с".

На фіг.10 наведені амінокислотні і відповідні нуклеотидні послідовності Мн- і М-доменів анти-

Ср154-антитіла 381. Підкреслені амінокислотні послідовності СОВ.

На фіг.11 наведені амінокислотні і відповідні нуклеотидні послідовності Мн- і М-доменів анти-

Ср154-антитіла 338. Підкреслені амінокислотні послідовності СОВ.

На фіг.12 наведена таблиця з переліком антитіл щура проти людського СО154, виділені методом добору антитіл лімфоцитів (ЗІ АМ). У таблиці наведені значення Ка і ІСво, одержані для даних антитіл при постановці аналізу ВіасогеФф, тестів зі зв'язуванням СО40 і тестів із активації ІСАМ-1. Виділено дані, одержані з антитілом 342.

На фіг.13 наведені амінокислотні і відповідні нуклеотидні послідовності легкого каппа-ланцюга аглікозильованого анти-СО154-антитіла пиб5с8 (пиб5св8 адіуР-пиїдаса).

На фіг.14 наведені амінокислотні і відповідні нуклеотидні послідовності важкого ланцюга аглікозильованого анти-СО154-антитіла пиб5с8 (пиб5с8 адіуР-пиїдся4). Введені мутації для одержання аглікозильованого варіанта (5228Р/1299А згідно з ЄЮ номенклатурою Кара залишки 226 і 297) підкреслені і виділені жирним шрифтом у послідовності зрілого білка.

На фіг.15 наведені амінокислотні і відповідні нуклеотидні послідовності легкого каппа-ланцюга аглікозильованого анти-СО154-антитіла пи342 (пи342 адіуР-пиїдса).

На фіг.1б6 наведені амінокислотні і відповідні нуклеотидні послідовності важкого ланцюга аглікозильованого анти-СО154-антитіла пи342 (пи342 адіуР-пиїдся4). Уведені мутації для одержання аглікозильованого варіанта (5228Р/1299А відповідно до номенклатури Караї ЕО; залишки 226 і 297) підкреслені і виділені жирним шрифтом у послідовності зрілого білка.

На фіг.17 наведені зразкові Рар'-фрагменти і гель, що показує сайт-спрямоване пегілювання Еар'- фрагмента анти-СО154-антитіла. Рар'-фрагмент пегілювали взаємодією ПЕГ-малеіїміду з одним залишком цистеїну в шарнірній ділянці.

На фіг.18 наведена таблиця зі значеннями Ка і ІСво, одержаними при постановці аналізу ВіасогеФф, тестів зі зв'язуванням СО40, тестів з активації ІСАМ-1 і конкурентних тестів із СО40 для різних варіантів здійснення гуманізованого антитіла 342 9149Н1, включаючи Рар'-фрагменти і кон'югати антитіло-ПЕГ.

На фіг.19 наведені два графіки значень титру анти-ТТ (правцевого токсоїду) до як функції часу в макак циномолгус, які одержували контрольний фізіологічний розчин або різні дози анти-СО154- антитіла. На верхньому графіку наведені значення титру (ДС для періоду 0-20 діб після введення антитіла і зараження ТТ (первинна імунна відповідь) і на нижньому графіку наведені значення для періоду 30-50 діб після введення антитіла і другого зараження ТТ на 30 добу.

На фіг.20 наведений графік значень титру анти-ТТ (правцевого токсоїду) Її як функції часу в макак циномолгус, які одержували різні формати анти-СО154-антитіл в однократній дозі (20 мг/кг для пПи5св8, аглікозильного антитіла 5с8 і аглікозильного антитіла 342 і 40 мг/кг для 342 Бар'-ПЕГ і 342 ОЕЄЕМ-

ПЕГ). ОБЕМ-ПЕГ являє фрагмент антитіла, в якому два Еар'-фрагменти зшиті ПЕГільованим дималеїімідним містком.

На фіг.21 наведений графік значень титру анти-ТТ (правцевого токсоїду) (ІМ як функції часу в макак циномолгус, які одержували контрольний фізіологічний розчин або різні дози анти-СО154- антитіла. На графіку наведені значення титру І9М для періоду 0-20 діб після стимуляції ТТ (первинна відповідь).

На фіг.22 наведені порівняльні дані з фармакокінетики антитіла 342 Рар'-ПЕГ і антитіла пи5с8 у макак циномолгус.

На фіг.23 наведені результати аналізу проточною цитометрією перехресного блокування зв'язування міченого 342 Рар' з експресуючими СО154 клітинами Уигкаї 01.1, попередньо зв'язаними з неміченим першим анти-СО154 Рар', як зазначено на кожній панелі (23А - АЗ33; 238 - 338; 230 - 402; 230 - 381; 23Е - 300; 23Е - 294; 230 - 335; 23Н - 303) (дивися приклад 9). АЗЗ являє підібране за ізотипом контрольне антитіло, і показано, що в даному випадку неспецифічне перехресне блокування відсутнє.

На фіг.24 наведені результати аналізу проточною цитометрією перехресного блокування зв'язування міченого йпиб5с8 Бар' з експресуючими СО154 клітинами Уигкаї 01.1, попередньо зв'язаними з неміченим першим анти-СО154-Рар', як зазначено на кожній панелі (24А - 338; 248 - 402; 240 - 381; 240 - 303; 24Е - 335; 24Е - 300; 2403 - 294; 24Н - АЗЗ) (дивися приклад 9). АЗЗ3 являє підібране за ізотипом контрольне антитіло, і показано, що в даному випадку неспецифічне перехресне блокування відсутнє.

На фіг.25 А-Е наведені результати аналізу конкурентного зв'язування з використанням Віасогетєх різних форм антитіл 342 і пи5с8 із розчинним білком СО154 (ЕСО) або комплексом СО40:С0О154. РІ - повнорозмірне антитіло. СЮО4ОПЕс - людський злитий білок СО40.

На фіг.26 наведений графік, що показує результати тесту агрегації тромбоцитів, описаного в прикладі 11 (тест 1), що був проведений з пи5с8 анти-СО154-антитілом, 342 Рар'-ПЕГ анти-СО154- антитілом і контрольним антитілами. На першій панелі наведені результати, одержані з комплексами сО40ї, утвореними цільним Іде, і на другій панелі комплекси, утворені Бар'-ПЕГ або диБар'-ПЕГ. На третій панелі наведені результати, одержані з триБар'-«ПЕГ та аглікозильованим анти-СО154- антитілом пи342.

На фіг.27 наведений графік, що показує результати тесту агрегації тромбоцитів, описаного в прикладі 11 (тест 2), який був проведений із позитивними і негативними контрольними антитілами.

Результати показують, що агрегація тромбоцитів специфічно підсилюється під дією комплексів позитивного контрольного анти-СО154-антитіла і рекомбінантного людського розчинного СО40І. (520154).

На фіг.28 показане вирівнювання амінокислотних послідовностей людського (5ЕО ІЮ МО:76) і мишачого розчинного СО40І (ЗЕО ІЮ МО:77). Відмінності між людськими і мишачими послідовностями зазначені червоним кольором. Послідовності епітопу Ниб5с8 зазначені синім кольором. Внутрішні залишки відзначені " | ". Відібрано шість ділянок (1-6) послідовності, де людські послідовності введені в розчинний мишачий СО401.

На фіг.29 наведені результати постановки конкурентної ЕГІЗА для демонстрації перехресного блокування 342 Раб' їі пиб5с8 Рар' (дивися приклад 14). На фіг.29А наведені результати титрування біотин-342 Рар' на СО154. Концентрація 1 НМ знаходиться в лінійній частині кривої. На фіг.298 наведені результати титрування біотин-пибс8 Рар' на СО154. Концентрація 0,3 НМ знаходиться в лінійній частині кривої. На фіг.29С показане перехресне блокування біотин-342 і біотин-5с8 під дією неміченого 342 Бар'. Сп342 Рар являє собою химерний 342 Рабр'. На фіг.290 показане перехресне блокування біотин-342 під дією неміченого 5с8 Раб'.

Детальний опис винаходу

Для більш повного розуміння описаного в даному документі винаходу нижче наводиться детальний опис. Якщо не зазначено інакше, то всі технічні ії наукові терміни, використані в даному документі, мають ті ж значення, що звичайно розуміються фахівцями в галузі, якої стосується даний винахід. Нижче описані зразкові методи і матеріали, хоча, у практиці даного винаходу також можна використовувати методи і матеріали, аналогічні або еквівалентні описаним у даному документі, і вони зрозумілі фахівцям у даній галузі.

У даній заявці є звертання до різних патентів, публікацій і літературних джерел. Розкриття даних патентів, публікацій і літературних джерел у повному обсязі включено в даний документ до відома.

Класичні літературні джерела, в яких викладені основні принципи технології рекомбінантної ДНК, відомі фахівцям у даній галузі, включають А!йзибеї еї аїЇ., Сигепі Ргоїосої5 Іп Моїесшіаг Віоіоду, допп

М/їеу є 5оп5, Мем Моїк (1998 апа Зуиррієтепів ю 2001); Затрбгоок еї аї., МоІесшаг Сіопіпд: А ІГарогаїгу

Мапаиаї, га єа., Соїй ргіпд Набог І арогаїогу Ргезв, Ріаіїпмієм, Мем/ Моїк (1989); Кацїтап еї аї., Едв.,

Напабоок ої Моїесшіаг апа СеїІшаг Меїнподз Іп Віоіоду апа Меадісіпе, СВО Ргез5, Воса Наюп (1995);

МеРпегзоп, Еа., Оігесієд Митадепевів: А Ргасіїса! Арргоаси, ІВІ. Ргевзз, Охіога (1991).

Класичні літературні джерела, в яких викладені основні принципи імунології, відомі фахівцям у даній галузі, включають Нагіож апа І апе, Апііродієв: А І арогаїюгу Мапиаї, 2а Еа., Соїд брііпа Натбог

Гарогагогу Ргез55, Соїй 5ргіпд Нагрог, М.У. (1999); і Коїк еї аї., Іттипоіоду, За Еа., МозБру-Уєаг ВоокК

Еигоре Гітйеа, Гопдоп (1993). Класичні літературні джерела, в яких викладені основні принципи медичної фізіології і фармакології, відомі фахівцям у даній галузі, включають ЕРашсі еї аї., Нагтізоп'є

Ріїіпсірієз ої Іпіетаї! Медісіпе, 14" Ед., МсСгам-НІЇЇ Сотрапієв, Іпс. (1998).

Визначення

У тому значенні, в якому термін "СО154-зв'язувальний білок" використовується в даному документі, то він включає будь-яку молекулу, у тому числі, антитіло, яка специфічно зв'язується або має антагоністичну дію стосовно СО154. Таким чином, у тому значенні, в якому даний термін використовується в даному документі, то анти-СО154-антитіло являє один клас білків, що специфічно зв'язуються з СО154. СО154-зв'язувальний білок за винаходом може включати, принаймні, одну, переважно дві, три або більше СОК, розкритих у даному документі. СО154-зв'язувальний білок або інший такий антагоніст СО154 може включати молекули, які не є класичними фрагментами або похідними антитіл, але які, проте, містять амінокислотні послідовності і/або хімічні структури, що надають специфічність зв'язування з епітопом СО154. Такі антагоністи СО154 можна одержати, наприклад, з альтернативної основи (дивися, наприклад, Віпл еї аї., 2005, Маї. Віоїесп., 23:1257-1268 і

Ноззе еї аї., 2006, Ргоїєїп Зсієпсе, 15:14-27). Такий СО154-зв'язувальний білок або антагоніст може бути злитий із Ес-ділянкою антитіла, яка у функціональному відношенні є недостатньою, або з гетерологічною функціональною групою, описаною в даному документі, їз метою підвищення часу напівжиття і/або поліпшення інших іп мімо властивостей СО154-зв'язувального білка.

Ср154-зв'язувальні білки можуть містити, принаймні, одну з СОК, описаних у даному документі, включену в біологічно сумісну каркасну структуру. В одному прикладі біологічно сумісна каркасна структура включає поліпептид або його фрагмент, який є достатнім для утворення конформаційно стабільної структурної основи або каркаса, або основи, яка здатна до розміщення однієї або більше послідовностей амінокислот, які зв'язуються з антигеном (наприклад, СОК, варіабельний домен і т.д.) у локалізованій ділянці поверхні. Такі структури можуть являти природний поліпептид або "складку" поліпептиду (структурний мотив), або можуть мати одну або більше модифікацій, таких як додавання, делеції або заміни амінокислот у порівнянні з природним поліпептидом або "складкою" поліпептиду.

Дані основи можна одержати з поліпептиду від будь-якого виду (або від більше ніж одного виду), такого як людина, інший ссавець, інша хребетна, безхребетна, рослина, бактерія або вірус.

Як правило, біологічно сумісні каркасні структури засновані на білкових носіях або кістяках інших, ніж імуноглобулінові домени. Наприклад, можна використовувати такі на основі фібронектину, анкирину, ліпокаліну, неокарзиностаїну, цитохрому Б, СРІ "цинкового пальця", РЗТІ, закрученої спіралі,

І АСІ-0І, 2-домену і доменів тендрамізату (дивися, наприклад, Мудтеп апа Опіеп, 1997, Сцтепі Оріпіоп іп Бігисішга! Віоіоду, 7, 463-469).

У тому значенні, в якому термін "антитіло" використовується стосовно винаходу, то він включає виділене, рекомбінантне або синтетичне антитіло, кон'югат антитіла або похідне антитіла. Термін "антитіло" часто призначається для включення фрагмента антитіла, у тому числі, антигензв'язувального фрагмента, якщо не зазначено інакше або розуміється інакше за контекстом.

Антигензв'язувальний фрагмент конкурує з інтактним антитілом за специфічне зв'язування. Дивися в загальному ЕРипдатепіа! Іттипоіюоду, Сп. 7 (Раш УМ., ей., 279 ей. Вамеп Ргез5, М.М. (1989)).

Антигензв'язувальні фрагменти можна одержати методами рекомбінантної ДНК або ферментативним або хімічним розщепленням інтактних антитіл. У деяких варіантах здійснення антигензв'язувальні фрагменти включають Рар, Е(ар)», Бар, Е(аб)», К(ар')з, Ед, Ем, однодоменні антитіла (дАБ), інші моновалентні і дивалентні фрагменти, що визначають комплементарність ділянки (СОК), одноланцюгові антитіла (наприклад, 5сЕм, 5сЕаб і зсгарлдс), химерні антитіла, діантитіла (аіароау), триантитіла (Гіароаду), мініантитіла (тіпіроду), наноантитіла (папороду) і поліпептиди, які містять, принаймні, фрагмент антитіла, який є достатнім для надання здатності до специфічного зв'язування антигену з поліпептидом; і злиті конструкції і похідні описаного вище. Дивися, наприклад, Ноїїдег апа

Ниазоп, Майшге Віотесппоіоду, 23:1126-1136 (2005) і Ниві єї аІ., ВМС Віоїесп., 7:14 (2007). "БЕа-фрагмент" являє фрагмент антитіла, що складається з Мн і Сні доменів; "Рм-фрагмент" складається з Мі і Мн доменів одного плеча антитіла; "зсСгм-фрагмент" являє одноланцюгове антитіло, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (Мн) і варіабельну ділянку легкого ланцюга (Мі), з'єднані пептидним лінкером; "зсбар-фрагмент" є одноланцюговим антитілом, що містить фрагмент важкий (Ба), з'єднаний із легеим ланцюгом за допомогою пептидного лінкеру; "зсгардсС"-фрагмент являє варіант 5сбар без цистеїну (дивися, наприклад, Ниві еї аїЇ.,, вище); і "дЗАбБ-фрагмент" (однодоменне антитіло) містить один варіабельний домен (наприклад, Мн- або Мі- домен) (Мага еї аї.,

Маїшге, 341:544-546 (1989)). Крім того, сюди входять діантитіла і триантитіла. Діантитіла і триантитіла за даним винаходом включають, наприклад, гомодимерні і гетеродимерні діантитіла і триантитіла.

Наприклад, у деяких варіантах здійснення варіабельні домени, що входять до складу триантитіла, можуть зв'язуватися з трьома різними епітопами або з ідентичними епітопами.

Якщо не зазначено інакше або розуміється інакше за контекстом, то "антитіло" за даним винаходом включає цілі антитіла та їхні будь-які антигензв'язувальні фрагменти, похідні і варіанти антитіл, які можуть містити одну або більш модифікацій (наприклад, амінокислотну вставку, делецію, заміну, посттрансляційну модифікацію або її відсутність і т.д.), включаючи кон'югати антитіл (тобто антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, кон'юговані або зв'язані з функціональною групою).

Похідні антитіл, включаючи кон'югати антитіл, можуть бути засновані на або можуть містити антигензв'язувальний фрагмент за винаходом, що специфічно зв'язується з СО154. Крім того, описані вище варіанти здійснення антитіл можуть являти мишачі антитіла, антитіла хом'яка, козячі, кролячі, химерні, гуманізовані або повністю людські антитіла, їхні фрагменти, похідні або кон'югати. Очевидно, зрозуміло, що в деяких аспектах винаходу термін "антитіло" може виключати один або більше варіантів здійснення антитіла, згаданих вище; такі обставини будуть зрозумілі фахівцям у даній галузі.

Термін "пегілювання", "поліетиленгліколь" або "ПЕГ" включає поліалкіленгліколь або його похідне, з або без застосування агентів, що сполучають, або дериватизації групами, що сполучають або активують (наприклад, тіолом, трифлатом, трезилатом, азирдином, оксираном або переважно малеїмідом, наприклад, ПЕГ-малеіїмідом). Інші відповідні поліалкіленгліколі включають, не обмежуючись цим, малеімідомонометокси-ПЕГ, активований ПЕГ пропіленгліколь, але також заряджені або нейтральні полімери наступних типів: декстран, коломінова кислота, або інші полімери на основі вуглеводів, полімери амінокислот і біотин та інші похідні афінних реагентів.

Термін "ефекторна функція" стосується функціональної здатності або Ес-ділянки константної ділянки антитіла зв'язуватися з білками і/або клітинами імунної системи. У даній галузі добре відомі антитіла зі зниженою ефекторною функцією і методи конструювання таких антитіл (дивися, наприклад,

У 05/18572, УМО 05/03175 і патент США Мо 6242195) і вони детально описані в даному документі.

Типові ефекторні функції включають здатність зв'язуватися з білком комплементу (наприклад, білком комплементу Сід) і/або Ес-рецептором (ЕСК) (наприклад, ЕсуВіІ, ЕсуВІЇ, ЕсуВІа, Есукі! і/або ЕсуВПІБ).

Функціональні наслідки здатності зв'язуватися з однією або більше зазначених вище молекул включають, не обмежуючись цим, опсонізацію, фагоцитоз, антигензалежну клітинну цитотоксичність (АрсСс), комплементзалежну цитотоксичність (СОС) і/або модифікацію ефекторних клітин. Зниження ефекторної функції стосується зниження однієї або більше біохімічної або клітинної активності, ідукованої принаймні, частково зв'язуванням сф із його близьким рецептором або білком комплементу, або ефекторною клітиною, з одночасним збереженням антигензв'язувальної активності варіабельної ділянки антитіла (або його фрагмента), проте, зі зниженою, аналогічною, ідентичною або підвищеною афінністю зв'язування. Конкретні антитіла за винаходом виявляють знижену ефекторну функцію. Зниження ефекторної функції, наприклад, зв'язування Ес-ділянки з Ес-рецептором або білком комплементу, може виражатися в кратному зниженні (наприклад, зниженні в 1,5 рази, 2 рази тощо) і його можна розрахувати, грунтуючись, наприклад, на відсотковому зниженні активності зв'язування за даними тестів оцінки зв'язування, відомих у даній галузі (дивися, наприклад, заявку УМО 05/18572).

Якщо не потрібно інакше за контекстом, то терміни в однині будуть включати терміни в множині, і терміни в множині будуть включати терміни в однині.

У даній заявці і формулі винаходу слово "містити" або його варіації, такі як "містить" або "що містить" означають включення визначеного цілого числа або групи цілих чисел, але не означає виключення будь-якого іншого цілого числа або групи цілих чисел. бр154

СО154 відомий у даній галузі під декількома іншими назвами, такими як ліганд СО40 (СО401),

Ср40 протирецептор (СО40ОСК), др39, Т-ВАМ, молекула, що активує Т-клітини, ТКАЕ, ТМЕ-зв'язаний білок активації (ТЕАР) і член 5 надсімейства лігандів фактора некрозу пухлин (ТМЕЗЕ5) (Сацспаї еї аї., 1993, РЕВ5 Гей. 315:259-266; Стаї єї аЇ., Ешгор. у. Іттип., 22:3191-3194; НоїІепрацонй еї аї., 1992,

ЕМВО .., 11:4313-4321). У заявці дані терміни використовуються взаємозамінно. СЮО154-зв'язувальні білки, включаючи антитіла, за даним винаходом специфічно зв'язуються з людським СО154 і можуть перехресно реагувати і, отже, специфічно зв'язуватися з СО154 інших видів. У деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальні білки, включаючи антитіла, за даним винаходом специфічно зв'язуються з лодським СО154, мишачим СО154 або СО154 примату, що не стосується людини.

Анти-СОР154-антитіла і СО154-зв'язувальні білки

У тому значенні, в якому термін "анти-СО154-антитіло" використовують у даному документі, то він стосується молекули імуноглобуліну, яка здатна специфічно зв'язуватися з епітопом в антигені СО154.

Анти-СО154-антитіла можуть являти інтактні імуноглобуліни, одержані з природних джерел або з рекомбінантних джерел, і вони можуть являти імунореактивні ділянки інтактних імуноглобулінів. Як правило, антитіла є тетрамерами імуноглобулінових молекул.

Отже, і це стосується усіх варіантів здійснення або способів за даним винаходом, "анти-СО154- антитіло" включає (якщо не зазначено інакше або у випадках, коли це слід розуміти інакше за контекстом) моноклональне антитіло, поліклональне антитіло, мишаче антитіло, антитіло хом'яка, козяче антитіло, кроляче антитіло, химерне антитіло, приматизоване антитіло, гуманізоване антитіло, (повністю) людське антитіло, мультимерне антитіло, гетеродимерне антитіло, гемідимерне антитіло, бі-, три- або тетравалентне антитіла, біспецифічне антитіло, одноланцюгове антитіло (наприклад, 5сЕм, зсЕаб і зсгарлс), біс-5сЕм, діантитіло, триантитіло або тетрантитіло, однодоменні антитіла з однією ділянкою і модифіковані Рар-фрагменти. У деяких варіантах здійснення анти-СО154-антитіло є антитілом, що містить тільки один варіабельний домен імуноглобуліну. Отже, моновалентні антитіла включають антитіла, що містять тільки один варіабельний домен імуноглобуліну (тобто одну варіабельну ділянку легкого ланцюга або важкого ланцюга) і які специфічно зв'язуються з СО154. Крім того, анти-СО154-антитіла за винаходом можуть бути моновалентними, дивалентними або мультивалентними стосовно зв'язування з СО154.

У деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-СО154-антитіло, зі зниженою ефекторною функцією містить будь-який фрагмент анти-СО154-антитіла, який є достатнім для підтримування специфічного зв'язування з антигеном СО154. Наприклад, антитіло може містити тільки один варіабельний домен імуноглобуліну - Мн- або Мі- домен.

Отже, у деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-СО154-антитіло, є фрагментом антитіла. Фрагменти антитіла включають, наприклад, Рар-фрагмент, Е(ар)2-фрагмент,

Еар'-фрагмент, Е(аб')2-фрагмент, Е(ар')з-фрагмент, одноланцюговий Е(м)-фрагмент або ЕРу-фрагмент, і фрагменти будь-якого з зазначених вище, що зв'язуються з епітопом (дивися, наприклад, Ноїїдег апа

Нидзоп, 2005, Маїште Віоїесппоіоду, 23(9):11126-1136). Фрагменти антитіл за даним винаходом детальніше описані нижче.

В одному прикладі СО154-зв'язувальні білки або анти-СО154-антитіла являють антитіла (наприклад, антитіла підтипу ІдДО4) або фрагменти (наприклад, Рар'-фрагменти), які містять нативну або модифіковану шарнірну ділянку. Описано ряд модифікованих шарнірних ділянок, наприклад, у патенті США Мо 5677425, заявках МО 99/15549 і УМО 98/25971. В іншому прикладі антитіла за винаходом модифіковані в їхніх константних ділянках, як, наприклад, антитіла, описані в заявках УМО 05/003169, ММО 05/003170 і ММО 05/003171. Будь-які з наведених вище анти-СО154-антитіл, похідних антитіл або фрагментів антитіл можна використовувати для одержання кон'югатів антитіл за даним винаходом. Будь-які з наведених вище антитіл, фрагментів або кон'югатів можуть виявляти знижену ефекторну функцію у порівнянні з другим анти-СО154-антитілом.

Молекули антитіл за винаходом можуть походити з будь-якого класу (наприклад, дос, ІДЧЕ, ІМ, дО або ІдА) або підкласу молекул імуноглобулінів. Домени константної ділянки антитіла, якщо вони є, можуть бути вибрані з урахуванням передбачуваної функції молекули антитіла. Наприклад, домени константної ділянки можуть являти домени ІдА, дО, ІДЕ, дсС або ДМ людини. Зокрема, можна використовувати домени константної ділянки людського дО, особливо Ідс1, Ідс2, доз і Ідо4. Ізотипи 352 і 1954 можна використовувати в деяких варіантах здійснення, де молекула антитіла призначається для терапевтичних застосувань, при яких бажані знижені або еліміновані ефекторні функції антитіла. Альтернативно можна використовувати ізотипи ІдС1 і ІЇД3, коли молекула антитіла призначається для терапевтичних цілей, для яких вимагаються ефекторні функції антитіла.

У деяких варіантах здійснення одну або більше СОК СО154-зв'язувального білка, наприклад, анти-

Ср154-антитіла, за винаходом можна включити в один або більше імуноглобулінових доменів, універсальних каркасних структур, білкових носіїв або інших біологічно сумісних каркасних структур на основі білкових носіїв або інших каркасів ніж імуноглобулінові домени (Мудгеп 5 Опіеп, 1997, Ситт.

Оріп. Бігигаї. Віої!., 7:463-469; Загадомі еї а!., 1992, Віо/Тесппоіоду, 10:773-779; ЗКеїта, 2000, у. Мої.

Весодпійоп, 13:167-187). У деяких варіантах здійснення СОК анти-СО154-антитіла включають в універсальну каркасну структуру (тобто каркасну структуру, яку можна використовувати для створення повної варіабельності функцій, специфічностей і властивостей, які спочатку підтримуються великою колекцією різних каркасів, дивися патент США Мо 6300064). В інших варіантах здійснення можна використовувати альтернативні основи (дивися, наприклад, Віп; еї аї., 2005, Маї. Віоїесп., 23:1257- 1268 Ноззе і еї аї., 2006, Ргоївіп бсіепсе, 15:14-27) для створення СО154-зв'язувальних білків за винаходом.

Також термін "анти-СО154-антитіло" включає синтетичне антитіло або рекомбінантне антитіло, яке одержане з використанням технології рекомбінантної ДНК, наприклад, таке як антитіло, експресоване бактеріофагом. Термін "анти-СО154-антитіло" також слід розуміти, як такий, що містить антитіло, яке одержане синтезом молекули ДНК, що кодує антитіло, і молекула даної ДНК експресує білок антитіла або амінокислотну послідовність, що визначає антитіло, де ДНК або амінокислотна послідовність одержані з використанням технології синтетичної ДНК або амінокислотної послідовності, яка доступна і добре відома в даній галузі.

В одному варіанті здійснення винахід стосується "анти-СО154-антитіла", що є моноклональним антитілом. Моноклональне антитіло стосується антитіла, одержаного з популяції по суті гомогенних антитіл, тобто окремі антитіла, що складають популяцію, є ідентичними за винятком можливих природних мутацій, які можуть бути присутніми у мінорних кількостях. Прикметник "моноклональне" вказує на природу антитіла, як одержаного по суті з гомогенної популяції антитіл, і це не слід розглядати як обов'язкове одержання антитіла яким-небудь конкретним методом. Наприклад, моноклональні антитіла для застосування за даним винаходом можна одержати гібридомним методом (із використанням мишачої або людської гібридоми), вперше описаним КопПіег еї аї., Маїшге, 256:495 (1975), або можна одержати методами рекомбінантної ДНК (дивися, наприклад, патент США Мо 4816567). "Моноклональні антитіла" також можна виділити з фагових бібліотек антитіл із використанням методів, описаних, наприклад, Сіаскзоп еї аї., Майиге, 352:624-628 (1991) і Магкз еї аї.,

У. Мої. Віої., 222:581-597 (1991). Також слід розуміти, що деякі варіанти здійснення даного винаходу стосуються композицій, що містять одне або більше різних моноклональних антитіл, які специфічно зв'язуються з СО154, тобто композиції поліклональних антитіл, що містять безліч моноклональних антитіл із різними специфічностями до епітопів.

В іншому варіанті здійснення винаходу "анти-СО154-антитіло" стосується антитіла, яке є химерним антитілом, або похідного антитіла або кон'югату або його антигензв'язувального фрагмента. Як правило, химерні антитіла містять варіабельні ділянки важкого і/або легкого ланцюга, що включають залишки СОК і каркасної ділянки одного виду (як правило, миші), злиті 3 константними ділянками іншого виду (як правило, людини). Дані химерні мишачі/людські антитіла містять приблизно 75 95 людських і 25 95 мишачих амінокислотних послідовностей. Людські послідовності являють константні ділянки антитіла, у той час як мишачі послідовності являють варіабельні ділянки (і таким чином, містять антигензв'язувальні сайти) антитіла.

В іншому варіанті здійснення СО154-зв'язувальні білки, анти-СО154-антитіла за даним винаходом включають антитіла, похідні антитіл і антигензв'язувальні фрагменти, що містять варіабельний домен, що включає каркасні ділянки з одного антитіла, і ділянки СОК -- з іншого антитіла.

У конкретнішому варіанті здійснення СО154-зв'язувальні білки та анти-СО154-антитіла за даним винаходом включають химерні антитіла, що містять каркасні ділянки і ділянки СОК із різних людських антитіл.

Способи одержання всіх химерних антитіл, описаних вище, добре відомі фахівцям у даній галузі.

Дивися, наприклад, патент США Мо 5807715; Могттізоп еї аїЇ., 1984, Ргос. Май. Асай. зсі. О5А, 81(21):6851-5; ЗНагоп еї аї., 1984, Майте, 309(5966):364-7; Такеда евї а!., 1985, Майте, 314(6010):452-4.

У деяких варіантах здійснення даного винаходу анти-СО154-антитіло, яке зв'язується з СО154, одержують методом відбирання антитіл лімфоцитів (ЗІ АМ) (Варсоок еї аї., 1996, Ргос. Маї!. Асад. 5бі.

И5БА, 93:7843-7848; МО 92/02551; де М/ЇІа: єї а!., 1997, 9. Іттипої. Меїпоав, 207:61-67 і І адегКміві еї аї., 1995, ВіоТеснпіднез, 18:862-869), за допомогою яких можна виділити клітини будь-якого виду, що продукують високоафінні антитіла під час імунних відповідей в умовах іп мімо. Інші методи включають описані де УМ еї аї., 1997, 9. Іттипої. Меїйоа5, 207:61-67 і І адегкмі5і еї аї!., 1995, ВіоТесппідцев, 18(5):862-869. Зазначені вище методи засновані на виділенні окремих продукуючих антитіла клітин, які потім піддають клональній експансії з наступним скринінгом на клони, які продукують анти-СО154- антитіла, із наступною ідентифікацією послідовності генів їхньої варіабельної ділянки важкого ланцюга (Ми) ї легкого ланцюга (Мі). Конкретний метод скринінгу детально описаний у УМО 04/051268. Таким чином, виділяють В-клітини, які Є позитивними на антитіла проти СО154. В-клітини можуть походити від людини, миші, щура, хом'яка, кролика, кози або іншого виду ссавців. Гени антитіл у даних В- клітинах можна клонувати і експресувати у клітині-хазяїні, наприклад, із використанням звичайної технології рекомбінантної ДНК. У деяких варіантах здійснення клітиною-хазяїном є Е. соїї. Інші клітини- хазяїни детально описані нижче. Антитіла (які включають фрагменти антитіл, такі як Гар'-фрагменти), експресовані в даних клітинах, можна виділити звичайними методами. Якщо антитіла походять із джерела, що відрізняється від людини, то їх можна піддати гуманізації звичайними методами, такими як мутагенез їхніх генів. Потім гуманізовані антитіла можна експресувати у клітині-хазяїні і потім можна виділити.

Моноклональні антитіла можна одержати будь-яким методом, відомим у даній галузі, таким як гібридомний метод (Копієг 8 Міїєтеіїп, 1975, 256:495-497), триомний метод, метод людських В- клітинних гібридом (Ког2бог еї аї., Іттипоіоду Тодау, 1983, 4, 72) і ЕВМ-гібридомний метод (Соїе еї аї., "Мопосіопа! Апіїбодієх апа Сапсег ТНегару", рр. 77-96, АЇап К. і і55, Іпс., 1985). У даній галузі добре відомі методи створення та одержання рекомбінантних антитіл (дивися, наприклад, патент США Мо 4816397; патент США Мо 6331415; Біттопз еї аї., 2002, доигпаї ої Іттипоїодіса! Меїпод5, 263, 133-147;

МО 92/02551; Опапаї єї а!., 1989, Ргос. Маї). Асад. бсі. ОБА, 86:3833; Веісптапп Її аї., 1988, Майшге: 322, 323; патент США Мо 5585089; УМО 91/099967; Мошипіаїп апа Аааїг, 1992, ВіоєїесппоїЇод. Сепеї. Епа.

Вем., 10: 1-142; Мепта еї а!., 1998, 9. Іттипої!. Меїпод5, 216:165-181; НоїПпдег апа Нидзоп, 2005, Маїшге

Віоїесн., 23(9):1126-1136).

Антитіла за даним винаходом також можна одержати з використанням різних методів фагового дисплея, відомих у даній галузі, і вони включають описані Вгіпктап еї аї., 1995, 9. Іттипої. Меїподв5, 182:41-50; Атез еї аї., 1995, І. Іттипої. Меїшоаз, 184: 177-186; КешШерогоцдн еї аї., 1994, Єиг. у.

Іттипо)!., 24: 952-958; Регзіс єї а!., 1997, Сепе, 187: 9-18; і Вигоп еї аї., 1994, Адмапсез іп Іттипої., 57: 191-280; УМО 90/02809; МО 91/10737; УМО 92/01047; УМО 92/18619; УМО 93/11236; МО 95/15982; і УМО 95/20401; і патенти США Мо 5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908; 5516637; 5780225; 5658727; 5733743 і 5969108.

Також можна використовувати трансгенних (наприклад, генно-інженерних) мишей або інші організми, включаючи інших ссавців, для одержання зв'язувальних білків і антитіл за даним винаходом (дивися, наприклад, патент США Мо 6300129). Наприклад, відомо, що можна одержати мишей із метою заміщення тільки варіабельних ділянок мишачих імунних локусів (сегменти М, 0, ії У важкого ланцюга, сегменти М і У легкого ланцюга) на відповідні людські варіабельні послідовності, для одержання великих кількостей високоафінних антитіл із людськими варіабельними послідовностями (дивися, наприклад, патент США Мо 6586251; патент США Мо 6596541 і патент США Мо 7105348).

У ще одному варіанті здійснення даного винаходу "анти-СО154-антитіло" стосується антитіла, похідного або кон'югату антитіла, або антигензв'язувального фрагмента, які піддалися приматизації або гуманізації. Приматизовані і гуманізовані антитіла, як правило, включають СОМ важкого і/або легкого ланцюга з мишачого антитіла, пересадженого в каркасну М-ділянку антитіла примату, який відрізняється від людини, або людини, які звичайно додатково містять людську константну ділянку.

Дивися, наприклад, Кіесптапп еї аї., 1988, Маїшиге, 332:323-327; патенти США Мо 6054297; 5821337; 5770196; 5766886; 5821123; 5869619; 6180377; 6013256; 5693761 і 6180370.

Логічним обгрунтуванням застосування таких приматизованих або гуманізованих антитіл є збереження (людської) антигенної специфічності мишачого антитіла, яку надають мишачі СОК, з одночасним зниженням імуногенності мишачого антитіла (мишаче антитіло буде викликати імунну відповідь проти нього у видів, які відрізняються від миші) за допомогою використання якнайбільше людських каркасних послідовностей. Такі антитіла можна застосовувати при лікуванні людини з метою зведення до мінімуму або усунення небажаних побічних ефектів, таких як імунні реакції у відповідь.

Описані антитіла, що містять донорні СОК, пересаджені з антиген-специфічних антитіл, які відрізняються від людських, на гомологічні акцепторні каркасні ділянки від примату, який відрізняється від людини, зі зниженою імуногенністю в людей (заявки на патент США 2005/0208625; 2002/0062009; патент США Мо 7338658).

Отже, гуманізовані форми антитіл, які відрізняються від людських (наприклад, мишачих), є специфічними химерними імуноглобулінами, ланцюгами імуноглобулінів або їх фрагментами (такими як Ем, Бар, Раб', К(іаб')2 або іншими антигензв'язувальними послідовностями антитіл), які містять послідовності, одержані з імуноглобулінових послідовностей, які відрізняються від людських, і людських імуноглобулінових послідовностей. У своїй більшості гуманізовані антитіла являють людські імуноглобуліни (реципієнтне антитіло), в яких залишки з ділянок (СОК) реципієнтного антитіла, що визначають комплементарність, заміщені на залишки СОК від видів, які відрізняються від людини (донорне антитіло), таких як миша, щур або кролик, із бажаною специфічністю, афінністю або ємністю.

У деяких випадках залишки каркасної Ем-ділянки (ЕК) людського імуноглобуліну заміщають на відповідні залишки ЕК, які відрізняються від людських.

Крім того, гуманізоване антитіло може містити залишки, які неможливо знайти ні в реципієнтному антитілі, ні в імпортованих послідовностях СОМ або ЕК. Дані модифікації проводять для додаткової обробки та оптимізації функціональної здатності антитіла. У цілому гуманізоване антитіло може містити по суті всі, принаймні, один і, як правило, два варіабельних домени, в яких усі або по суті всі ділянки СОК відповідають таким в імуноглобуліні, який відрізняється від людського, і всі або по суті всі залишки ЕК являють такі консенсусної послідовності людського імуноглобуліну. Гуманізоване антитіло необов'язково може також містити, принаймні, ділянку константної ділянки імуноглобуліну (Ес), як правило, таку людського імуноглобуліну.

Гуманізоване антитіло (яке включає, наприклад, фрагменти антитіла, або похідні кон'югати антитіла) можна одержати технологією рекомбінантної ДНК, в якій деякі або всі амінокислоти легкого і важкого ланцюга людського імуноглобуліну, які не вимагаються для зв'язування антигену (наприклад, константні ділянки і каркасні ділянки варіабельного домену) використовують для заміни відповідних амінокислот із легкого і важкого ланцюга близького антитіла, який відрізняється від людського.

Способи одержання гуманізованих антитіл добре відомі фахівцям у галузі антитіл. Дивися, наприклад,

ЕР 239400; ддопев5 еї аїЇ., 1986, Майшге, 321:522-525; Віеєсптапп єї аї., 1988, Маїшйге, 332:323-327;

Метовеуеп еї а!., 1988, 5сіепсе, 239:1534-1536; Ойцееп еї аї., 1989, Ргос. Маї. Асай. 5сі. ОБА, 86:10029;

Опапаії еї аї., 1989, Ргос. Маї. Асад. Зсі. ОБА, 86:3833; патент США Мо 6180370 і ЕР 519596, в яких описана зміна антитіл через поверхневі залишки.

Отже, в одному варіанті здійснення даного винаходу анти-СО154-антитіло стосується гуманізованого антитіла (яке включає, без обмеження, гуманізований антигензв'язувальний фрагмент і похідне або кон'югат гуманізованого антитіла), яке одержують трансплантацією мишачих або щурячих (або інших нелюдських) СОР. у людське антитіло. Конкретніше, дану гуманізацію антитіла проводять у такий спосіб: (1) виділяють КДНК, що кодують варіабельні домени важкого і легкого ланцюга, з гібридоми або В-клітин, що секретують антитіло; (2) визначають секвенуванням послідовності ДНК варіабельних доменів, що включають СОМ; (3) ДНК, що кодують СОК, переносять у відповідні ділянки послідовності, що кодує варіабельні домени важкого і легсого ланцюга людського антитіла сайт- спрямованим мутагенезом, і (4) додають сегменти гена людської константної ділянки бажаного ізотипу (наприклад, 1 для СН і к для СІ). Нарешті, гени гуманізованих важкого і легкого ланцюгів коекспресують у клітинах-хазяїнах ссавців (наприклад, клітичах СНО або М5О) для одержання розчинного гуманізованого антитіла.

Однак пряме перенесення СОК у людську каркасну ділянку призводить до втрати афінності зв'язування антигену в одержаного зв'язувального білка або антитіла. Втрата афінності зв'язування антигену може мати місце, оскільки в деяких близьких антитілах деякі амінокислоти в константних ділянках взаємодіють із СОМ і, таким чином, впливають на афінність зв'язування антигену біля антитіла в цілому. У таких випадках фахівець зрозуміє, що буде критичним ввести "зворотні мутації" у каркасні ділянки акцепторного антитіла для збереження антигензв'язувальної активності близького антитіла. Загальні підходи проведення зворотних мутацій добре відомі фахівцям у даній галузі.

Дивися, наприклад, Осцееп еї аї., 1989, Ргос. Маї. Асайд. 5сі. ОБА, 86:10029; Со еї аї., 1991, Ргос. Маї.

Асад. Зсі. ОБА, 88:2869-2873; МО 90/07861; Тетреві 1991, Віоїесппоіоду, 9:266-271. Приклади зворотних мутацій антитіл за даним винаходом включають такі залишки, показані на фіг.9, під назвою донори.

У деяких варіантах здійснення зв'язувальний білок або антитіло за даним винаходом може містити домен Мн, який не є варіабельним доменом верблюжого або мишачого імуноглобуліну. У деяких варіантах здійснення поліпептид антитіла містить Мн-домен, який не містить одну або більше амінокислот, які є специфічними для варіабельних доменів верблюжого імуноглобуліну у порівнянні з людськими Мн-доменами.

В одному варіанті здійснення даного винаходу "анти-СО154-антитіло" стосується антитіла (яке включає антигензв'язувальний фрагмент і похідне або кон'югат антитіла), яке є повністю людським.

Повністю "людське" антитіло містить поліпептид антитіла або варіабельний домен імуноглобуліну, який має послідовність, одержану з людського імуноглобуліну (наприклад, одержану з кодуючої послідовності людського імуноглобуліну). Термін "людське антитіло" включає, наприклад, антитіла з варіабельною і константною ділянками (якщо присутні), одержані з людських імуноглобулінових послідовностей зародкової лінії. У тому значенні, в якому термін "людські" використовується в даному документі стосовно антитіла або фрагмента, такого як варіабельний домен, то він не включає антитіло від іншого виду, наприклад, миші, що було "гуманізоване" за допомогою перенесення послідовностей людської константної ділянки на поліпептид антитіла (тобто заміщенням константних ділянок, які відрізняються від людських, на людські константні ділянки), або за допомогою перенесення послідовностей людської каркасної ділянки М-домену у варіабельний домен імуноглобуліну від ссавця, який відрізняється від людини (наприклад, заміщенням каркасних ділянок У-домену, які відрізняються від людських, на людські каркасні ділянки). Описані способи гуманізації варіабельних ділянок імуноглобуліну за допомогою раціональної модифікації залишків, що визначають комплементарність (заявка на патент США 2006/0258852).

У деяких варіантах здійснення людські антитіла включають амінокислотні залишки, які не кодуються людськими імуноглобуліновими послідовностями зародкової лінії (наприклад, мутації, уведені випадковим або сайт-специфічним мутагенезом в умовах іп міго, або соматичною мутацією в умовах іп мімо). У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується анти-СО154-антитіла, що містить варіабельну ділянку з однією або більше каркасними ділянками (наприклад, ЕМ, ЕМУ/2, ЕМУЗ іМабо ЕМуУ4), що мають амінокислотну послідовність, яка є такою же, як амінокислотна послідовність відповідної каркасної ділянки, кодованої сегментом гена людського антитіла зародкової лінії, або амінокислотні послідовності однієї або більше зазначених каркасних ділянок, що у цілому містять до 5 амінокислотних відмінностей у порівнянні з амінокислотною послідовністю зазначеної відповідної каркасної ділянки, кодованої сегментом гена людського антитіла зародкової лінії. У додаткових варіантах здійснення амінокислотні послідовності каркасних ділянок (ЕММ1, ЕМУ2, ЕМУЗ і/або ЕМУМ4) варіабельного домену є такими ж, як амінокислотні послідовності відповідних каркасних ділянок, кодованих сегментом гена людського антитіла зародкової лінії, або послідовності ЕММ1, ЕММ2, ЕМУЗ мМабо ЕМУ4 у цілому містять до 10 амінокислотних відмінностей у порівнянні з послідовностями відповідних каркасних ділянок, кодованих сегментом гена людського антитіла зародкової лиінії.

Зразкові сегменти гена антитіла зародкової лінії включають, наприклад, ОР47, ОР45, ОР4А8 ії ОРК9У (заявка на патент США 2006/00627784) і сегменти, що кодують акцепторні каркасні послідовності, описані в прикладах і наведені на фігурах.

У деяких варіантах здійснення людське антитіло (яке включає фрагмент антитіла або послідовність варіабельного домену) має, принаймні, 85 95 ідентичність амінокислотної послідовності (у тому числі, наприклад, 87 9», 90 95, 93 У, 95 У, 97 У, 99 95 або вище ідентичність послідовностей) із природним людським антитілом.

Повністю людські або людські антитіла можна одержати з трансгенних (наприклад, генно- інженерних, таких як нок-ін) мишей, що несуть гени людського антитіла (що несуть екзони варіабельної ділянки (М), різноманітності (0), сполуки (У) і константної ділянки (С)) або людські М-, О- і

Галуз-)-ділянки з людських клітин. Наприклад, у даний час можливо одержати генно-інженерних тварин (наприклад, мишей), які здатні, при імунізації, продукувати повний репертуар людських антитіл за відсутності ендогенної продукції імуноглобулінів (дивися, наприклад, Чдакобромії5 еї аїЇ.,, РМАБ, 90:2551, 1993; ЧаКоромії5 сеї аї., Маїшге, 362:255-258, 1993; Вгиддегтапп есеї аї., Уеаг іп Іттипо., 7:33, 1993 і биспозаї еї аї., Маиге, 355:258, 1993). Можна одержати трансгенну лінію мишей (наприклад,

генно-інженерних, включаючи нок-аут, нок-ін, заміщення генів тощо) із послідовностями генів із нереаранжованих генів людських імуноглобулінів. Людські послідовності можуть кодувати важкі і легкі ланцюги людських антитіл і вони будуть функціонувати правильно в мишей, піддаючи реаранжуванню з одержанням широкого репертуару антитіл, аналогічних до таких у людей. Генно-інженерних мишей можна імунізувати білком-мішенню (наприклад, СО154, його фрагментами або клітинами, експресуючими СО154) з одержанням широкого спектра специфічних антитіл і кодуючих їх РНК.

Нуклеїнові кислоти, що кодують компоненти ланцюгів таких антитіл, потім можна клонувати із тварини у векторний дисплей. Як правило, клонують окремі популяції нуклеснових кислот, що кодують послідовності важкого і легкого ланцюгів і потім окремі популяції рекомбінують при уставлянні у вектор таким чином, щоб будь-яка дана копія вектора одержувала випадкову комбінацію важкого і легкого ланцюгів. Вектор сконструйований для експресії ланцюгів антитіла таким чином, щоб їх можна було зібрати і розташувати на зовнішній поверхні упаковки дисплея, що містить вектор. Наприклад, ланцюги антитіла можна експресувати у вигляді злитих конструкцій із білком оболонки фага із зовнішньої поверхні фага. Потім упаковку дисплея можна піддати скринінгу для розташування антитіл, що зв'язуються з мішенню.

Крім того, людські антитіла можна одержати з бібліотек фагового дисплея (Ноодепроопт еї аї.,..

МОЇ. Віої., 227:381, 1991; Магїкз еї аї., у. Мої. Віої., 222:581-597, 1991; Мацшднап еї аї., Маїшге Віоїесн., 14:309, 1996; патент США Мо 6300064). Можна створити синтетичні фагові бібліотеки, в яких використовуються рандомізовані комбінації М-ділянок синтетичних людських антитіл. Можна провести відбір повністю людських антитіл із використанням антигену, в яких М-ділянки за своєю природою є дуже близькими до людських. Дивися патенти США Мо 6794132, 6680209, 4634666 і О5ібрего еї аї., 1983, Нуріідота, 2:361-367.

Одержання людських антитіл також дивися в Мепае? еї аї., Маїшге Сепеїіс5, 15:146-156, 1997;

Стееп апа дакороміїв, у). Ехр. Мед., 188:483-495. Додатково людські антитіла обговорюються та описані в патентах США Мо 5939598 і 6673986. Також дивися патенти США Мо 6114598, 6075181 і 6162963.

Також дивися патенти США Мо 6150584, 6713610, 6657103, заявки на патент США 2003/0229905 А1, 2004/0010810 А, 2004/0093622 А, 2006/0040363 А, 2005/0054055 А, 2005/0076395 А! і 2005/0287630 А1. Також дивися ЕР 0463151 В1, УМО 94/02602, УМО 96/34096 і УМО 98/24893.

В альтернативному підході інші автори використовували "мінілокусний" підхід. При мінілокусному підході імітують екзогенний локус д за допомогою включення ділянок (окремих генів) з локусу Ід.

Таким чином, один або більше МН-генів, один або більше ОН-генів, один або більше /Н-генів, ти-генів константної ділянки і другої константної ділянки (переважно константної гамма-ділянки) формують у конструкцію для вставки тварині. Даний підхід описаний, наприклад, у патентах США Мо 5545807, 5545806, 5625825, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650, 5814318, 5591669, 5612205, 5721367, 5789215 і 5643763. Також дивися патенти США Мо 5569825, 5877397, 6300129, 5874299, 6255458 і 7041871, розкриття яких у повному обсязі включено в даний документ до відома. Також дивися ЕР 0546073, МО 92/03918, УМО 92/22645, МО 92/22647, МО 92/22670, МО 93/12227, МО 94/00569, МО 94/25585, МО 92/14436, УМО 97/13852 і УМО 98/24884. Також дивися Тауїог еї аї. (1992,

Мис. Асід5 ВНев., 20:6287); Спеп еї аї. (1993, Іпї. Іттипої., 5:647); Тоайоп еї аї. (1993, РМАБ О5А, 90:3720-4); Сної єї а. (1993, Маште Сепеїїсв5, 47117); І опрего 6вї аї. (1994, Маїшге, 368:856-859); Тауїог єї а!. (1994, Іпіетайопаї Іттипо!оду, 6:579-591) і Тнайоп еї аї. (1995, У. Іпгптипої., 154:6453-65), Ріпа еї аІ. (1996, Майшге Віотесппоіоду, 14:845) і Тиайоп еї а!. (2000, Єнг. 9. Іттипої., 10:2998-3005).

У конкретнішому варіанті здійснення даного винаходу повністю людські антитіла одержують із використанням праймованих в умовах іп міго людських спленоцитів (Воегпег еї аї., 1991, У. Іттипої., 147:86-95).

У конкретнішому варіанті здійснення даного винаходу повністю людські антитіла одержують клонуванням репертуару (Рег55оп еї аї., 1991, Ргос. Маї. Асай. 5сі. ОА, 88:2432-2436; Ниапа апа еіоїІаг, 1991, у). Іттипої. Меїпоав, 141:227-236). Крім того, у патенті США 5798230 описане одержання людських моноклональних антитіл з В-клітин людини, де людські В-клітини, продукуючі антитіла, імморталізують зараженням вірусом Епштейна-Барра, або їхніх похідних, які експресують ядерний антиген 2 віруса Епштейна-Барра (ЕВМА2"), білок, необхідний для імморталізації. Потім "відключають" функцію ЕВМА2, що призводить до підвищення продукції антитіл.

Інші способи одержання повністю людських антитіл включають застосування тварин, які відрізняються від людини, в яких є інактивовані локуси ендогенного Ід і які є трансгенними для нереаранжованих генів важкого і легкого ланцюга людського антитіла. Таких трансгенних тварин можна піддати імунізації активованими Т-клітинами або білком 01.1 (патенти США Мо 5474771; 6331433 і 6455044) і гібридоми можна одержати з В-клітин, одержаних від них. У даній галузі детально описані ці методи. Дивися, наприклад, різні публікації/патенти, що стосуються трансгенних мишей, що містять мінілокуси людського дД, включаючи патент США Мо 5789650; різні публікації/патенти щодо мишей ХЕМОМОИЗЕФ), включаючи патенти США Мо 6075181, 6150584 і 6162963; Сгееп, 1997, Маїшиге

Сепеїісв, 7:13-21; Мепае?, 1997, Маїште Сепеїїсв5, 15:146-56, і різні публікації/патенти, що стосуються "трансомних" мишей, включаючи ЕР 843961 і Тоті?2икКа еї а!., 1997, Майшге Сепеїіс5, 16:1433-43.

Ср154-зв'язувальні білки та анти-СО154-антитіла за даним винаходом також стосуються білків або антитіл, що перехресно блокують зв'язування, або зв'язувальним білків або антитіл, які зв'язуються з одним і тим самим епітопом або які зв'язуються з дуже близьким епітопом або епітопом, який перекривається, що і будь-які антитіла, описані в даному документі. Білки або антитіла, що перехресно блокують зв'язування, можуть конкурентно інгібувати або блокувати зв'язування будь- якого з антитіл, описаних у даному документі. У деяких варіантах здійснення винахід стосується

Ср154-зв'язувальних білків і анти-СО154-антитіл, які зв'язуються з одним і тим самим епітопом, що і гуманізоване антитіло, що містить послідовність важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО:12 або 5ЕО ІЮ МО:13 і містить послідовність легсого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:15 (Рар- і Рар'-ррагменти антитіла 342), і яке виявляє аналогічні стосовно СО154 зв'язувального властивості в конкурентних тестах з анти-СО154- антитілом 5с8, описаним у даному документі. В інших варіантах здійснення винахід стосується СО154- зв'язувальних білків і анти-СО154-антитіл, які зв'язуються з тим самим епітопом, що і гуманізоване антитіло, що містить послідовність Мі-домену ЗЕО ІЮО МО:58 і послідовність Мн--домену ЗЕО ІЮ МО:60 (послідовності варіабельної ділянки антитіла 338) і які виявляють аналогічні стосовно СО154 зв'язувальні властивості в конкурентних тестах з анти-СО154-антитілом 508, описаним у даному документі.

У деяких варіантах здійснення даного винаходу СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-

Ср154-антитіло, виявляє високу афінність для людського СО154. Наприклад, у деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок дисоціює від людського СЮО154 (людського СО40Ї)) зі значенням

Ка у межах від 50 нМ до 1 пкМ включно за даними поверхневого плазмонного резонансу (наприклад,

ВіасогеФ). Наприклад, Ка для людського СО154 може складати від 25 нМ до 1 пкМ, від 10 нМ до 1 пкМ, від 5 НМ до 1 пкМ, від 1 нМ до 1 пкМ, від 0,5 НМ до 1 пкМ, від 0,1 нМ до 1 пкМ, від 75 пкМ до 1 пкМ, від пкМ до 1 пкМ, від 20 пкМ до 1 пкМ або навіть від 10 пкМ до 1 пкМ. В інших варіантах здійснення

Ср154-зв'язувальний білок за даним винаходом дисоціює від людського СО154 зі значенням Ка у межах від 500 пкМ до 1 пкМ включно за даними поверхневого плазмонного резонансу (наприклад,

ВіасогеФ). У деяких варіантах здійснення Ко для людського СО154 дорівнює менше 50 пкМ.

Наприклад, у деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок дисоціює від людського СО154 зі значенням Ка меншим 20 пкМ. У деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок дисоціює від людського СО154 зі значенням Ка меншим 10 пкМ. У деяких варіантах здійснення СО154- зв'язувальний білок зв'язується з СЮО154 з високою афінністю, але не витісняє зв'язаний СО154 від сОра40. Афінність антитіла можна підвищити способами, відомими в даній галузі (дивися, наприклад,

Сіатк єї аї., 2006, Ргоївїп 5сі., 15(5):949-60, у даному джерелі описане підвищення афінності антитіла з використанням заснованого на структурі комп'ютерного аналізу, і Спао еї аї., 2006, Маї. Ргоїос., 1:755- 768, у даному джерелі описані методи виділення і конструювання 5сЕм з бажаними властивостями з використанням дисплея на поверхні дріжджів).

У тих випадках, коли бажано підвищити афінність антитіл за винаходом, що містять одну або більше зазначених вище СОК, то такі антитіла з підвищеною афінністю можна одержати з використанням ряду протоколів дозрівання афінності, включаючи, але не обмежуючись цим, збереження СОК (хХапд еї аї., 9. Мої. ВіоїІ., 254:392-403, 1995), поворот ланцюгів (Магк5 еї аї.,

Віо/ТесппоІоду, 10:779-783, 1992), застосування мутантних штамів Е. соїї (Гом/ еї аї., У. Мої. Віої., 250:350-368, 1996), поворот ДНК (РайЦеп еї аї., Сигг. Оріп. Віосїесппої., 8:724-733, 1997), фаговий дисплей (Тпотрзоп еї аї., У. Мої. Віо!., 256:7-88, 1996) і ПЛР (Статегі еї аї., Майиге, 391:288-291, 1998).

Усі дані методи дозрівання афінності обговорюються Уацшднап еї аї. (Маїиге Віотесппоїоду, 16:535-539, 1998). Таким чином, винахід стосується варіантів послідовностей антитіл за винаходом, що специфічно зв'язуються з СО154. Такі варіанти послідовностей містять одну або більше напівконсервативних або консервативних замін у їхній послідовності, і такі заміни переважно істотно не впливають на бажану активність поліпептиду. Заміни можуть бути природними або їх можна ввести, наприклад, за допомогою мутагенезу (наприклад, Ниїспіпбзоп еї аї., 1978, 9. ВіоЇ. Спет., 253:6551). Наприклад, амінокислоти гліцин, аланін, валін, лейцин і ізолейцин часто можна замістити на інші амінокислоти (амінокислоти, що мають аліфатичні бічні ланцюги). З даних можливих замін переважно, щоб гліцин та аланін використовували для заміни на іншу амінокислоту (оскільки вони мають відносно короткі бічні ланцюги) і щоб валін, лейцин і ізолейцин використовували для заміни на іншу амінокислоту (оскільки вони мають великі аліфатичні бічні ланцюги, що є гідрофобними). Інші амінокислоти, які часто можна замінити на іншу амінокислоту, включають, але не обмежуються цим: - фенілаланін, тирозин і триптофан (амінокислоти, що мають ароматичні бічні ланцюги); - лізин, аргінін і гістидин (амінокислоти, що мають основні бічні ланцюги); - аспартат і глутамат (амінокислоти, що мають кислі бічні ланцюги); - аспарагін і глутамін (амінокислоти, що мають амідні бічні ланцюги); і - цистеїн і метіонін (амінокислоти, що мають сірковмісні бічні ланцюги).

Афінність зв'язування СО154-зв'язувальних білків, наприклад, анти-СО154-антитіл, за даним винаходом також можна представити у відносних показниках або при порівнянні з афінністю зв'язування другого антитіла, яке також специфічно зв'язується з СО154 (наприклад, другого анти-

Ср154-антитіла, яке є СО154-специфічним, котре можна віднести в даному документі до "другого

СОр154-специфічного антитіла"). У деяких варіантах здійснення СО154-специфічне антитіло може являти антитіло 5с8 (продуковане гібридомою, депонованою в АТСС під інвентарним номером НВ 10916, описаною в патенті США Мо 5474771) або гуманізоване антитіло 5с8. В інших варіантах здійснення друге СО154-специфічне антитіло може являти будь-яке з антитіл за винаходом, таке як 342, 381, 338, 294, 295, 300, 335, 303 або 402 (фіг.12). Отже, деякі варіанти здійснення даного винаходу стосуються анти-СО154-антитіла, що зв'язується з людським СО154 з вищою афінністю у порівнянні з антитілом 5с8 або з Ко, яка нижче ніж Ко антитіла 5с8. У деяких варіантах здійснення анти-СО154-антитіло за даним винаходом також інгібує активність СО154 або блокує взаємодію ср154:2040 у більшому ступені у порівнянні з другим СО154-специфічним антитілом, таким як 5с8, в еквімолярних концентраціях. Відносну здатність анти-СО154-антитіла блокувати взаємодію ср154:20040 можна оцінити будь-яким доступним методом аналізу, наприклад, таким як тест позитивної регуляції ІСАМ-1, описаний у даному документі та у тестах конкурентного зв'язування.

Отже, у деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальні білки та анти-СО154-антитіла (включаючи фрагменти і похідні антитіл) за винаходом є придатними для інгібування зв'язування СО154 з СО40 і роблять це з високою специфічністю, наприклад, зі значенням ІСзо у межах від 10 пкМ до 1,5 мкМ, включно. У деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальні білки, наприклад, анти-СО154-антитіла, за винаходом можуть мати значення ІСзо у межах від 10 пкМ до 500 пкМ, від 50 пкМ до 500 пкМ, від 100 пКМ до 500 пкМ, від 250 пкМ до 750 пкМ, від 500 пкМ до 1 мкМ або від 750 пкМ до 1,5 мкМ. У додаткових варіантах здійснення анти-СО154-антитіло по суті не має агоністичну дію стосовно активності СО40 або не активує сигнальний шлях за участю СО40. У деяких варіантах здійснення анти-СО154-антитіло за даним винаходом чинить антагоністичну дію на активність СО154 або СО40 або обох молекул.

Отже, деякі варіанти здійснення даного винаходу стосуються СО154-зв'язувальних білків і анти-

Ср154-антитіл, які зв'язуються з людським СО154 з вищою або однаковою афінністю у порівнянні з другим СО154-специфічним антитілом (наприклад, антитілом 5с8 або гуманізованим антитілом 5с8), або зі значенням Ко, яке нижче або дорівнює Ко другого СО154-специфічного антитіла, де анти-

Ср154-антитіло по суті не інгібує взаємодію СО154:2040 у порівнянні з другим СО154-специфічним антитілом. Такі антитіла можуть бути придатними, наприклад, для постановки тесту зв'язування і як діагностичні реагенти. Зразкові антитіла, що виявляють високу афінність для людського СО154, але мають нижчий ступінь інгібування взаємодії СО154:2040 у порівнянні з другим СО154-специфічним антитілом, є антитілами 381 і 338, описаними в даному документі. Наприклад, даний винахід стосується анти-СО154-антитіл, що специфічно зв'язуються з людським СО154 з вищою або однаковою афінністю (у порівнянні з другим СО154-специфічним антитілом, наприклад, таким як гуманізоване антитіло 5с8), але яке блокує взаємодію СО154:2040 у меншому ступені, ніж це робить друге СЮО154-специфічне антитіло. У додаткових варіантах здійснення дані анти-СО154-антитіла, які інгібують зв'язування СО154 (СО40Ї) з СО40 у меншому ступені, ніж це робить друге СО154- специфічне антитіло, також по суті не чинять агоністичної дії стосовно активності СО40 або не активують сигнальний шлях за участю СО40. Наприклад, такі антитіла, якщо їх застосовують у тесті оцінки ефективності в умовах іп міго, як описано в прикладі 7, можуть не виявляти статистично значимого агоністичної дії у порівнянні з контрольною обробкою або можуть виявляти агоністичну дія на рівні 1 95, 2 95, З Ув, 5 Уо або 10 95 у порівнянні з позитивним контролем (наприклад, лігандом

СО154). Мідаїаїп еї ані. (Тне ЕМВО доишгпаї, 2000, 19:3304-3313) і Реаг:хоп еї аї. (Іпіегпайіопаї! Іттипоїіоду, 2001, 13:273-283) описують сигнальний шлях СО40 і також наводять тести, які можна використовувати для визначення того, блокується або інгібується, або ні, взаємодія СО154:С040, і в якому ступені.

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується анти-СО154-антитіла, що містить, принаймні, одну СОК, вибрану з СОК-НІ (5ЕО ІО МО:3), СОК-Н2 (ЗЕО ІЮ МО:С4) і СОБ-НЗ (ЗЕО І

МО:5). Переважно антитіло містить, принаймні, дві СОК, вибрані з СОК-НІ (ЗЕО ІЮ МО:3), СОВ-Н2 (ЗЕО ІЮ МО:4) і СОБ-НЗ (5ЕО ІЮО МО:5) і переважніше всі три дані СОК-НІ, СОБ-Н2 ії СОК-НЗ.

В іншому варіанті здійснення анти-СО154-антитіло за винаходом, містить, принаймні, одну СОК, вибрану з СОК-Ї 1 (ЗЕО 10 МО:6), СОВ-І2 (ЗЕО ІЮ МО:7) і СОК-Ї З (ЗЕО ІЮ МО:8). Переважно антитіло містить, принаймні, дві СОК, вибрані з СОК-І 1 (5ЕО ІЮ МО:6), СОВ-І 2 (5ЕО ІО МО:7) і СОК-АІ З (ЗЕО

ІО МО:8) і переважніше всі три дані СОВ-І 1, СОВ-І2 ї СОВА З.

У додаткових варіантах здійснення антитіло містить усі три СОК-НІ, СОК-Н2 ії СОК-НЗ (ЗЕО І

МО:3-5) і всі три СОК-І 1, СОВ-12 ії СОК-І З (ЗЕО ІЮ МО:6-8).

У додаткових варіантах здійснення анти-СО154-антитіло містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга однієї з 5ЕО ІЮО МО':1, 9, 10 або 11 їі містить послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга однієї з ЗЕО ІЮ МО:2 або 14.

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується анти-СО154-антитіла, що містить, принаймні, одну СОК, вибрану з СОБ-НІ (ЗЕО ІЮ МО:42), СОК-Н2 (ЗЕО ІЮ МО:43) ії СОБ-НЗ (5ЕО І

МО:44). Переважно антитіло містить, принаймні, дві СОР, вибрані з СОБК-НІ (ЗЕО ІЮ МО:42), СОВ-Н2

(ЗЕО ІЮ МО:43) і СОК-НЗ (ЗЕО ІЮ МО:44) і переважніше всі три дані СОБК-НІ, СОК-Н2 і СОК-НЗ.

В іншому варіанті здійснення анти-СО154-антитіло за винаходом, містить, принаймні, одну СОК, вибрану з СОБК-І1 (5ЕО ІЮ МО:45), СОВ-І2 (ЗЕО І МО:46) і СОБ-І З (ЗЕО ІЮ МО:47). Переважно антитіло містить, принаймні, дві СОК, вибрані з СОК-І 1 (5ЕО ІЮ МО:45), СОВ-І2 (5ЕО ІО МО:46) і

СОВ-ІЇЗ (5ЕО ІЮ МО:47) і переважніше всі три дані СОК-І 1, СОВ-І2 ї СОК-Ї 3.

У додаткових варіантах здійснення антитіло містить усі три СОК-НІ, СОК-Н2 ії СОК-НЗ (ЗЕО І

МО:42-44) і всі три СОК-І 1, СОВ-І2 ї СОВА З (5ЕО ІЮ МО:45-47).

У додаткових варіантах здійснення анти-СО154-антитіло містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:56 і містить послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга

ЗЕО ІЮО МО:54.

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується анти-СО154-антитіла, що містить, принаймні, одну СОЕК, вибрану з СОБК-НІ (ЗЕО ІЮ МО:48), СОНК-Н2 (5ЕО І МО:49) і СОК-НЗ (ЗЕО І

МО:50). Переважно антитіло містить, принаймні, дві СОР, вибрані з СОК-НІ (ЗЕО ІЮ МО:48), СОВБ-Н2 (ЗЕО ІЮ МО:49) і СОК-НЗ (ЗЕО ІО МО:50) і переважніше всі три дані СОБК-НІ, СОК-Н2 і СОК-НЗ.

В іншому варіанті здійснення анти-СО154-антитіло за винаходом, містить, принаймні, одну СОК, вибрану з СОБК-І1 (5ЕО ІЮ МО:51), СОВ-І2 (ЗЕО ІО МО:52) і СОК-І З (ЗЕО ІЮ МО:53). Переважно антитіло містить, принаймні, дві СОК, вибрані з СОК-І 1 (5ЕО ІЮ МО:51), СОВ-І2 (5ЕО ІО МО:52) і

СОВ-ІЇЗ (5ЕО І МО:53) і переважніше всі три дані СОК-І 1, СОВ-І2 ї СОК-Ї 3.

У деяких варіантах здійснення антитіла містять комплементарну послідовність, що включає одну або більше СОМ легкого ланцюга СОВ-11, СОВ-І2 і СОК-ІЗ3, відповідно наведені вище, або комплементарну послідовність, що включає одну або більше СОК важкого ланцюга СОК-НІ, СОВБ-Н2 і

СОВ-НЗ, відповідно наведених вище. Таким чином, у деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом містить СОБ-НІ (5ЕО ІЮ МО:48), СОВ-Н2 (ЗЕО ІЮ МО:49) або СОБК-НЗ (ЗЕО ІЮ МО:50) і

СОВ-І1 (5ЕО І МО:51), СОВ-І2 (ЗЕО ІЮ МО:52) або СОК-І З (5ЕО І МО: 53).

У додаткових варіантах здійснення антитіло містить усі три СОК-НІ, СОК-Н2 і СОВ-НЗ (ЗЕО І

МО:48-50) і всі три СОК-І 1, СОВ-І2 ї СОВА З (5ЕО ІЮ МО:51-53).

У додаткових варіантах здійснення анти-СО154-антитіло містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:60 і/або містить послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга 5ЕО ІО МО:58.

У деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок за даним винаходом містить послідовність легкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО:62 і послідовність важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:65. В інших варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок за даним винаходом містить послідовність легкого ланцюга 5ЕО 1О МО:63 і послідовність важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:66.

У деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок за даним винаходом містить послідовність легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:68 і послідовність важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:71. В інших варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок за даним винаходом містить послідовність легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:69 і послідовність важкого ланцюга 5ЗЕО ІЮ МО:72. У ще одних варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок за даним винаходом містить послідовності ФЕО ІЮ МО:68, 5ЗЕО

ІО МО:69, 5ЕО ІЮ МО:71 або 5ЕО ІЮО МО:72.

Даний винахід також стосується зв'язувального СО154 білка, що переважно має, принаймні, 90 95, 91 95, 92 95, 93 95 або 94 95 ідентичність із СО154-зв'язувальним білком за винаходом. Переважніше

Ср154-зв'язувальний білок має, принаймні, 95 95, 96 95, 97 95 або 9895 ідентичність. Найбільше переважно СО154-зв'язувальний білок має, принаймні, 99 95, 99,5 95, 99,9 95 ідентичність із СО154- зв'язувальним білком за винаходом. СО154-зв'язувальні білки за винаходом можуть містити послідовність варіабельного домену, принаймні, на 85 95 ідентичну варіабельному домену 5ЕО ІЮ

МО:1, 5ЕО І МО:2, 5ЕО ІЮО МО:9, 5ЕО ІЮ МО:10, 5ЕО ІО МО:11, БЕО ІЮ МО:14, 5ЕО ІЮ МО:29, 5ЕО ІЮ

МО:30, 5ЕО ІЮО МО:54, 5ЕО ІЮ МО:56, 5ЕО ІЮО МО:58 або 5ЕО ІЮ МО:60, або її однієї або більш СОК.

Інші варіанти здійснення винаходи стосуються біспецифічних антитіл. Біспецифічні антитіла є моноклональними, переважно людськими або гуманізованими, антитілами, що мають специфічність зв'язування, принаймні, до двох антигенів. Їх можна використовувати самостійно або змішаними в композиції, що містить поліклональні популяції. У даному винаході одна зі специфічностей зв'язування являє таку для антигену СО154, у той час як інша специфічність зв'язування є такою для будь-якого іншого антигену, і переважно для білка або рецептора клітинної поверхні, або субодиниці рецептора.

Наприклад, інша специфічність зв'язування може бути лігандом, вибраним із людського сироваткового альбуміну (НБА), ТМ, 1-1, 1-2, 1-4, 1-6, 1-8, 1-12, 11-18, ТЕМ-у, 602, 204, СО8, СТІ А4, І ГАТТ, І гАЗ і МІ А4.

В інших варіантах здійснення даного винаходу анти-СО154-антитіло містить сайт зв'язування близького ліганду. Близький ліганд (наприклад, поліпептид) здатний зв'язуватися з функціональними членами репертуару незалежно від специфічності ліганду-мішені. Отже, близький ліганд можна використовувати для або ідентифікації добору (наприклад, при очищенні або скринінгу) функціональних членів репертуару (таких як панель або група антитіл, незалежно від специфічності зв'язування антигену в антитіла). Близькі ліганди включають, наприклад, протеїн А, протеїн с і протеїн

І. Попередній відбір членів фагової бібліотеки за допомогою близьких лігандів описаний у заявці М/О 99/20749.

Фрагменти антитіл

Також даний винахід стосується антигензв'язувальних або епітопзв'язувальних фрагментів анти-

Ср154-антитіла. Усі способи і реагенти, описані вище, стосовно анти-СО154-антитіл можна в однаковому ступені використовувати для одержання і застосування фрагментів анти-СО154-антитіл за винаходом.

У деяких варіантах здійснення даного винаходу фрагменти анти-СО154-антитіла включають гетеродимерні комплекси антитіл і гібридні антитіла, такі як біспецифічні антитіла, гемідимерні антитіла, мультивалентні антитіла (тобто тетравалентні антитіла) та одноланцюгові антитіла.

Гемідимерне антитіло складається з Ес-ділянки та одного Гар-фрагмента. Одноланцюгове антитіло складається з варіабельних ділянок, зв'язаних білковими спейсерами, в один білковий ланцюг.

У деяких варіантах здійснення даного винаходу фрагменти анти-СО154-антитіла за винаходом також можуть включати білки, що містять один або більше імуноглобулінових легких ланцюгів і/або важких ланцюгів, такі як мономери і гомо- або гетеромультимери (наприклад, димери або тримери) даних ланцюгів, де дані ланцюги необов'язково зв'язані дисульфідним зв'язком або зв'язані інакше.

Дані антитіла можуть бути здатні зв'язуватися з одним або більше антигенами.

У деяких варіантах здійснення даний винахід включає антигензв'язувальні фрагменти цілісних антитіл, такі фрагменти антитіла, як Раб, Е(аб)г, Рар', Каб)», К(аб')з, Ем, Ра, аАБ, діатіла, мінітіла або нанотіла. Також даний винахід стосується фрагментів, що містять тільки один варіабельний домен, такий як Мн- або Мі-домен, або фрагмента, що містить тільки домен важкого ланцюга або легкого ланцюга. Фрагменти можуть бути гуманізованими або повністю людськими. Також даний винахід включає антигензв'язувальні фрагменти, які складаються з альтернативних основ (дивися, наприклад,

Віп7, вище і Ноз5зе, вище) або які містять універсальний каркас. Також даний винахід стосується кон'югатів, що містить будь-який антигензв'язувальний фрагмент або СО154-зв'язувальний білок, який специфічно зв'язується з СО154, кон'югований ковалентно або нековалентно, або прямо опосередковано, із функціональною групою, наприклад, такий як білок-носій або ПЕГ.

Анти-СО154-антитіла за даним винаходом включають дивалентні антитіла. Так, у деяких варіантах здійснення винахід стосується фрагмента дивалентного анти-СО154-антитіла, що містить два важких ланцюги антитіла і, принаймні, одну полімерну молекулу в ковалентному зв'язку, де кожен важкий ланцюг ковалентно зв'язаний з іншим, принаймні, за допомогою одного містка між ланцюгами, який відрізняється від дисульфідного, що з'єднує атом сірки залишку цистеїну в одному ланцюзі з атомом сірки залишку цистеїну в іншому ланцюзі, де залишки цистеїну розташовані поза доменом варіабельної ділянки кожного ланцюга, який відрізняється тим, що, принаймні, один місток між ланцюгами, який відрізняється від дисульфідного, містить ковалентно зв'язану полімерну молекулу. У тому значенні, в якому термін "який відрізняється від дисульфідного" використовується в даному документі, то він означає, що містки 5-5, наприклад, типу звичайно наявного в антитілах, виключаються. Однак місток між ланцюгами типу, що є у фрагменті за винаходом, може бути зв'язаним із важким ланцюгом за допомогою зв'язку 5-5, описаного нижче. У загальному кожна полімерна молекула у фрагменті дивалентного антитіла за винаходом утворює частину містка між ланцюгами. Кожен місток служить для зв'язування двох важких ланцюгів і в кожному ланцюзі він буде ковалентно зв'язаний з атомом сірки залишку цистеїну. Як правило, ковалентний зв'язок буде являти дисульфідний зв'язок або у конкретних варіантах здійснення зв'язок сірка-вуглець. Зразкові структури дивалентних антитіл дивися в УМО 99/64460 і ММО 05/061005.

Також винахід стосується анти-СО154-антитіла, що є моновалентним антитілом або моновалентним антигензв'язувальним фрагментом. У тому значенні, в якому термін "моновалентний" використовується в даному документі, то він означає, що дане антитіло або антигензв'язувальний фрагмент (наприклад, Ем, одноланцюговий 5сЕм, ЯАБ, Раб, Рар', Га, зсЕРар, зсЕарАдс і т.д.) можуть зв'язуватися тільки з однією молекулою їхньої мішені. Звичайно природні антитіла є дивалентними у тому відношенні, що вони мають два антигензв'язувальних плеча, де кожне містить Мн- і Мі- домен.

Дивалентне антитіло може зв'язуватися з двома окремими молекулами того самого антигену, у тому випадку коли не відсутня стерична перешкода. На противагу "моновалентне" антитіло має антигензв'язувальний сайт для мішені. Антигензв'язувальний домен моновалентного антитіла може містити Мн- і Мі- або домен може містити тільки один імуноглобуліновий варіабельний домен, тобто

Мн- або Мі- домен, який має здатність зв'язуватися з СО154 без необхідності у відповідному МУн- або

Мі-домені. Таким наведеним як приклад моновалентним антитілом є Ба-фрагмент, що містить один імуноглобуліновий варіабельний домен і який може зв'язуватися тільки з однією молекулою СО154 антитіла. У моновалентного антитіла відсутня здатність перехресно зв'язуватися з молекулами одного антигену.

Даний винахід стосується анти-СО154-антитіла, де антитіло специфічно зв'язується з епітопом, з яким специфічно зв'язується гуманізований Рар- або Рар'-фрагмент із послідовністю важкого ланцюга відповідно ЗЕО ІЮ МО:12 або 13 і послідовністю легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:15. У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом являє фрагмент антитіла з послідовністю варіабельної ділянки важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:1, 9, 10 або 11 їі з послідовністю варіабельної ділянки легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО:2 або 14. В інших варіантах здійснення антитіло за даним винаходом являє фрагмент антитіла з послідовністю важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:12 або 13 ї з послідовністю легкого ланцюга 5ЕО ІО МО:15.

У деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовності легкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО:15 і послідовності важкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО:13. У деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовності легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:15 і послідовності важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:12.

В альтернативних варіантах здійснення винахід стосується фрагмента антитіла, що містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга ЗЕ ІЮ МО:56 і містить послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга ЗЕО ІО МО:54. В інших варіантах здійснення антитіло за даним винаходом являє фрагмент антитіла, що містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга 5ЗЕО ІЮ МО:60 і містить послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:58.

В одному варіанті здійснення даний винахід стосується Раб- або Е(аб')2- або Е(ар')з-фрагмента, що специфічно зв'язується з СО154. Даний Бар'- або Е(аб)»- або Р(ар')з--фрагмент може бути гуманізований і може містити послідовність важкого ланцюга, який містить або складається з послідовності ЗЕО І МО:13, і може включати послідовність легкого ланцюга, який містить або складається з послідовності 5ХЕО ІЮО МО:15.

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується анти-СО154-антитіла, яке не містить Ес- домен. Таке антитіло або фрагмент без Ес-ділянки можуть бути моновалентними, дивалентними або додатково мультивалентними.

Також даний винахід стосується антитіл або фрагментів антитіл, які специфічно зв'язуються з епітопом, з яким специфічно зв'язуються Раб'- або Е(аб')»-, або Е(ар')з-фрагменти, описані вище. Дані антитіла або фрагменти антитіл можна ідентифікувати в тесті перехресного зв'язування, описаному в даному документі (приклад 9). Дані антитіла або фрагменти антитіл можуть бути виділеними, рекомбінантними або синтетичними та їх можна приєднати до другої молекули з утворенням кон'югата антитіла.

Антитіла зі зниженою ефекторною функцією

Взаємодія антитіл і комплексів антиген-антитіло з клітинами імунної системи призводить до "запуску" різних реакцій у відповідь, що стосуються в даному документі ефекторних функцій. Ідс- антитіла активують ефекторні шляхи імунної системи за допомогою зв'язування з членами сімейства клітинних поверхневих рецепторів Есу і з С1д4д системи комплементу. Лігування ефекторних білків кластерними антитілами "запускає" різні реакції у відповідь, що включають вивільнення запальних цитокінів, регуляцію продукції антигенів, ендоцитоз і загибель клітин. У деяких клінічних застосуваннях дані реакції у відповідь є критичними для прояву ефективності моноклонального антитіла. В інших - вони провокують розвиток небажаних побічних ефектів, таких як запалення та елімінація клітин, що несуть антиген. Отже, даний винахід додатково стосується СО154-зв'язувальних білків, включаючи антитіла, зі зміненими, наприклад, зниженими ефекторними функціями. Важливо, що знижена ефекторна функція не обов'язково призводить до зменшення здатності анти-СО154-антитіла інгібувати одне або кілька захворювань за допомогою блокування взаємодії СО154:2040 (дивися заявку МО 05/03175, яка в повному обсязі включена в даний документ до відома).

Анти-СО154-антитіла зі зниженою ефекторною функцією (наприклад, опосередкованими Ес- ділянкою ефекторними функціями; дивися нижче) є особливо бажаними для застосування в суб'єктів, в яких існує потенційна імовірність прояву небажаної тромбоемболічної активності. Додатково знижена ефекторна функція анти-СО154-антитіл може призвести до зниження або усунення інших потенційних небажаних ефектів, що виникають при терапії анти-СО154-антитілами, таких як делеція активованих Т-клітин та інших популяцій клітин, індукованих на експресію СО154, або Ес-залежна активація моноцитів/макрофагів.

Ефекторну функцію анти-СО154-антитіла за даним винаходом можна визначити з використанням багатьох відомих тестів. Ефекторна функція анти-СО154-антитіла може бути знижена стосовно другого анти-СО154-антитіла. В одних варіантах здійснення друге анти-СО154-антитіло може являти собою будь-яке антитіло, яке специфічно зв'язується з СЮО154. У деяких варіантах здійснення друге анти-СО154-антитіло може являти собою антитіло 508 (продуковане гібридомою, депонованою в

АТСС під інвентарним номером НВ 10916, описане в патенті США Мо 5474771) або гуманізоване антитіло 5с8. В інших варіантах здійснення друге СО154-специфічне антитіло може бути будь-яким з антитіл за винаходом, таким як 342, 381, 338, 294, 295, 300, 335, 303 або 402 (фіг.12). У ще одних варіантах здійснення, у тому випадку, коли анти-СО154-антитіло, що цікавить, піддалося модифікації з метою зниження ефекторної функції, то друге антитіло може являти немодифікований або вихідний варіант антитіла.

Ефекторну функцію анти-СО154-антитіла за даним винаходом також можна оцінити, наприклад, за визначенням рівня агрегації або активації тромбоцитів, викликаним обробкою анти-СО154-антитілом, у порівнянні з контрольним антитілом. Отже, у деяких варіантах здійснення анти-СО154-антитіла за даним винаходом не опосередковують або не підсилюють агрегацію або активацію тромбоцитів у стандартному тесті агрегації або активації тромбоцитів. В інших варіантах здійснення анти-СО154- антитіла опосередковують нижчий рівень агрегації або активації тромбоцитів у порівнянні з другим анти-СО154-антитілом (наприклад, 5с8 або гуманізованим 5с8).

Ефекторні функції, які наводять у ролі прикладу, включають зв'язування з Ес-рецептором, фагоцитоз, апоптоз, прозапальні реакції у відповідь, негативну регуляцію клітинних поверхневих рецепторів (наприклад, В-клітинного рецептора; ВСК) і т.д. Інші ефекторні функції включають антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (АОСС), за допомогою якої антитіла зв'язуються з ЕРсо-рецепторами на цитотоксичних Т-клітинах, природних клітинах-кілерах (МК) або макрофагах, призводячи до загибелі клітин, і комплементзалежну цитотоксичність (СОС), при якій загибель клітин індукується за допомогою активації каскаду комплементу (дивися огляд Юаєегоп, Аппи.

Веу. Іттипої., 15:203-234, 1997; Мага апа Сеїйє, ТПнегарешіс Іттипої., 2:77-94, 1995; і Камеїсп апа

Кіпеї, Аппи. Нем. Іттипої., 9:457-492, 1991)). Як правило, для прояву таких ефекторних функцій потрібно, щоб Ес-ділянка сполучалася із зв'язувальною ділянкою (наприклад, варіабельним доменом антитіла), та їх можна оцінити з використанням стандартних методів, які відомі в даній галузі (дивися, наприклад, заявку М/О 05/018572, ММО 05/003175 і патент США Мо 6242195).

Ефекторні функції можна "скасувати" при використанні фрагментів без Ес-домену, таких як Раб,

Кабв)г або одноланцюговий Ему. Альтернативою є використання підтипу Ід54 антитіла, який зв'язується з ЕсукіЇ, але який слабко зв'язується з С14 і ЕсукІІ ії ЕсуйкІ. Підтип Їд2 також має знижене зв'язування з Ес-рецепторами, але зберігає здатність до значного зв'язування з алотипом Н131

ЕсумПа і С1д. Таким чином, необхідні додаткові зміни в послідовності ЕСК для елімінації зв'язування з усіма Ес-рецепторами і з Ста.

Декілька ефекторних функцій, включаючи АЮСС, опосередковуються Ес-рецепторами (ЕсК), які зв'язуються з Ес-ділянкою антитіла. Афінність антитіла для конкретного ЕсК і, отже, ефекторну активність, опосередковану антитілом, можна модулювати зміною амінокислотної послідовності і/або посттрансляційними модифікаціями Ес-ділянки і/або константної ділянки антитіла.

ЕСсК визначаються їхньою специфічністю для ізотипів імуноглобулінів; Ес-рецептори для Ідс- антитіл стосуються ЕсукК, для ІДЕ до ЕсеК, для ІдА до Есок. і т.д. Було встановлено три підкласи Есув:

ЕсуВІ (СО064), Есукі! (СО32) і ЕсувВІ (СО16). ЕсукіІ ї ЕсукІЇ мають два типи: ЕсукКПА (СО32) і ЕсуйкІІВ (С032); і сук ША (СО16а) і ЕсУукПІВ (СО16Б). Оскільки кожен підклас Есук кодується двома або трьома генами, та альтернативний сплайсинг РНК призводить до численних транскриптів, то існує широка різноманітність ізоформ Есук. Наприклад, Есукі! (СО32) включає ізоформи Па, ІБ1, ПБ2, ІІБЗ і Іс.

Сайт зв'язування в людських і мишачих антитілах для Есук раніше був картований до так називаної "нижньої шарнірної ділянки", що складається з залишків 233-239 (ЕО нумерація за системою

Кабаї еї аї., Зедиєпсев ої Ргоїєїн5 ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, 5" Ва., Рибіїс Неапй бегмісе, Маїйопаї!

ІпзіШйшев ої Неацп, Веїпезаа, Ма., 1991; М/соої еї а!ї., Моїес. Іттипої!., 23:319-330, 1986; ЮОипсап еї аї.,

Маїшге, 332:563, 1988; Сапіїєїд апа Могітізоп, У. Ехр. Меад., 173:1483-1491, 1991; Спарреї еї аї., Ргос.

Маї!. Асад. осі. ОБА, 88:9036-9040, 1991). Залишки 233-239, Р238 і 5239 знаходяться серед тих, які згадуються у ролі тих, що беруть участь у зв'язуванні. Іншими раніше згадуваними ділянками, що, можливо, беруть участь у зв'язуванні з Есумк, є: 5316-К338 (людський Ід) для людського ЕсукКі (тільки при порівнянні послідовностей; мутанти по заміні не оцінювалися) (Мусої еї аї., Моїес. Іттипої., 23:319- 330, 1986); К274-К301 (людський ІдДС1) для людського ЕсукІІ! (грунтуючись на пептидах) (Заптау еї а!., Моїес. Іттипої, 21:43-51, 1984; ії У407-К416 (людський Ід) для людського ЕсукІ! (грунтуючись на пептидах) (Сегдеїу еї аїЇ., Віоспет. ос. Тгап5., 12:739-743, 1984) і Зпієїй5 еї аї., 9. ВіоЇї. Спет., 276:6591-6604, 2001; І агаг С.А. єї аї., Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА, 103:4005-4010, 2006). Дані та інші ділянки амінокислотних залишків, що беруть участь у зв'язуванні з ЕСВ, можуть бути очевидними фахівцям у даній галузі за даними дослідження кристалічної структури комплексів ІД-ЕСК (дивися, наприклад, зопдегтапп еї аї., 2000, Маїиге, 406(6793):267-73 і Зопдептапп еї аї., 2002, Віоспет. 5об.

Тгапв., 30(4):481-6). Отже, анти-СО154-антитіла за даним винаходом включають модифікації одного або більше зазначених вище залишків.

Інші відомі підходи зниження ефекторної функції тАб включають мутування амінокислот на поверхні тАБ, які беруть участь в ефекторних взаємодіях зв'язування (І шипа .). еї аї., 1991, 9. Іттипої., 147(8):2657-62; ЗНівЇд5 В.І. еї аї., 2001, 9. Віоії. Спет., 276(9):6591-604); і використання комбінацій послідовностей сегментів різних підтипів (наприклад, комбінації Ідс2 і 954) з одержанням більш істотного зниження зв'язування з Есу-рецепторами у порівнянні з одним підтипом (Агтоиг еї аї., Єиг. У.

Іттипо)!., 1999, 26:2613-1624; Мої. Іттипо)!., 40, 2003, 585-593).

У даній галузі відома велика кількість варіантів Ес-ділянки зі зміненою і/або зниженою афінністю для Ес-рецепторів деяких або всіх підтипів (і в такий спосіб для ефекторних функцій). Дивися, наприклад, заявки на патент США 2007/0224188; 2007/0148171; 2007/0048300; 2007/0041966; 2007/0009523; 2007/0036799; 2006/0275283; 2006/0235208; 2006/0193856; 2006/0160996; 2006/0134105; 2006/0024298; 2005/0244403; 2005/0233382; 2005/0215768; 2005/0118174; 2005/0054832; 2004/0228856; 2004/132101; 2003/158389; також дивися патенти США Мо 7183387; 6737056; 6538124; 6528624; 6194551; 5624821; 5648260.

При СОС комплекс антитіло-антиген зв'язується з комплементом, призводячи до активації каскаду комплементу і генерації атаки мембрани комплексом. Активація класичного шляху комплементу ініціюється зв'язуванням першого компонента системи комплементу (Ста) з антитілами (відповідного підкласу), які зв'язані з їхнім антигеном; таким чином, активація каскаду комплементу частково регулюється афінністю зв'язування імуноглобуліну з білюом С14д. Для активації каскаду комплементу необхідно, щоб С14 зв'язався, принаймні, із двома молекулами Ідс1, Ідс2 або Ідс3З, але тільки з однією молекулою з ІДМ, приєднаною до антигенної мішені (Умага апа спецйе, Тпегарешіс Іттипо!іоду, 2:77-94, 1995, р. 80). Для оцінки активації комплементу можна провести тест СОС, наприклад, описаний Са;7апо-Запіого вї аї., У. Іттипої. Меїйодв», 202:163, 1996.

Було висловлене припущення, що різні залишки молекули Ідс беруть участь у зв'язуванні з С1д, включаючи залишки (іи318, Іу5320 і Гуз322 у СНо2-домені, амінокислотний залишок 331, розташований у максимальній близькості до того ж бета ланцюга, залишки Гуз235 і сіІуг237, розташовані в нижній шарнірній ділянці, і залишки 231-238, розташовані в М-кінцевій ділянці в СН2- домені (дивися, наприклад, Хи еї аї., У. Іттипої., 150:152А (АБрзігас), 1993, УМО 94/29351; Тао еї аї., 9.

Ехр. Меа., 178:661-667, 1993; ВгекКе еї аї., Єшиг. у. Іттипої., 24:2542-47, 1994; Випоп еї аї., Маїшиге, 288:338-344, 1980; ОипКап апа УУіпіег, Маїшге, 332:738-40, 1988; Ідизодіє еї аї., уУ. Іттипої., 164:4178- 4184, 2000; патенти США Мо 5648260 і 5624821). Як приклад: в Їдс1 дві мутації в СООН кінцевої ділянки СН2-домену людського ІдС1 - КЗ322А і РЗ29А - не активують шлях СОС і було показано, що вони призводять до більш ніж 100-кратного зниження зв'язування С14 (патент США Мо 6242195).

Таким чином, у деяких варіантах здійснення винаходу можна модифікувати, замістити або видалити один або більше даних залишків або один або більше амінокислотних залишків можна вставити з метою зниження активності СОС антитіл проти СО154, описаних у даному документі.

Наприклад, у деяких варіантах здійснення може бути бажаним знизити або елімінувати ефекторну функцію(ї) даних антитіл для зниження або елімінації імовірності активування імунних реакцій у відповідь. Антитіла зі зниженою ефекторною функцією також можуть знизити ризик розвитку тромбоемболічних ускладнень у суб'єктів, що одержують антитіла.

У деяких інших варіантах здійснення даний винахід стосується анти-СО154-антитіла, яке виявляє знижене зв'язування з одним або більше Ес-рецепторами, але яке зберігає його здатність зв'язуватися з комплементом (наприклад, в аналогічному або, у деяких випадках, меншому ступені у порівнянні з нативним, немутантним або вихідним анти-СО154-антитілом). Отже, анти-СО154-антитіло за даним винаходом може зв'язуватися та активувати комплемент, одночасно виявляючи знижене зв'язування з

Есе, наприклад, таким як ЕсукКІа (наприклад, ЕсукКІа, експресованим на тромбоцитах). Таке антитіло зі зниженим зв'язуванням або антитіло, яке не зв'язується з ЕсукКІа (наприклад, таким як ЕсуВІна, експресованим на тромбоцитах), але яке може зв'язуватися з С14 та активувати каскад комплементу, принаймні, до деякої міри буде знижувати ризик розвитку тромбоемболічних ускладнень, одночасно зі збереженням бажаних ефекторних функцій. В альтернативних варіантах здійснення анти-СО154- антитіло за даним винаходом показує знижене зв'язування з одним або більше ЕСК, але зберігає здатність зв'язуватися з одним або іншим БСК. Дивися, наприклад, заявки на патент США 2007/0009523, 2006/0194290, 2005/0233382, 2004/0228856 і 2004/0191244, в яких описуються різні амінокислотні модифікації, що призводять до одержання антитіл зі зниженим зв'язуванням з ЕсуВі,

ЕсуйІ! і/або Есукі, а також амінокислотні заміни, які забезпечують підвищене зв'язування з одним

ЕСЕ, але знижене зв'язування з іншим Еск.

Отже, ефекторні функції, у забезпеченні яких бере участь константна ділянка анти-СО154- антитіла, можна модулювати зміною властивостей константної ділянки і Ес, зокрема. У деяких варіантах здійснення анти-СО154-антитіло зі зниженою ефекторною функцією порівнюють із другим антитілом з ефекторною функцією і яке може бути немутантним, нативним або вихідним антитілом (наприклад, антитілом 342 або антитілом 5с8, яке описане в патенті США Мо 5474771), що містить константну ділянку або Ес-ділянку, яка опосередковує ефекторну функцію. У конкретних варіантах здійснення модуляція ефекторної функції включає ситуації, при яких активність скасовується або повністю відсутня.

Нативна послідовність Ес-ділянки або константної ділянки містить амінокислотну послідовність, ідентичну до амінокислотної послідовності Ес-ділянки або константної ділянки ланцюга, що виявляється в природних умовах. Переважно контрольна молекула, використовувана для оцінки відносної ефекторної функції, містить той же тип/підтип Ес-ділянки, що і тестоване або мутантне антитіло. Варіантна або змінена Ес-ділянка або константна ділянка містить амінокислотну послідовність, яка відрізняється від такої нативної послідовності ділянки важкого ланцюга в результаті, принаймні, однієї амінокислотної модифікації (наприклад, такої як посттрансляційна модифікація, амінокислотна заміна, вставка або делеція). Отже, мутантна константна ділянка може містити одну або більше амінокислотних замін, делецій або вставок, які призводять до змінених посттрансляційних модифікацій, що включають, наприклад, змінений профіль глікозилювання. Вихідне антитіло або Ес- ділянка являє, наприклад, варіант, що має нормальну ефекторну функцію, використовуваний для конструювання константної ділянки (тобто Ес-ділянки) зі зміненою, наприклад, зниженою ефекторною функцією.

Антитіла зі зміненою (наприклад, зниженою або елімінованою) ефекторною функцією(іями) можна одержати конструюванням або продукцією антитіл з варіантною константною ділянкою, Ес-ділянкою або ділянкою важкого ланцюга. Можна використовувати технологію рекомбінантної ДНК і/або культивування клітин і умови експресії для одержання антитіл зі зміненою функцією і/або активністю.

Наприклад, технологію рекомбінантної ДНК можна використовувати для конструювання однієї або більше амінокислотних замін, делецій або вставок в ділянках (наприклад, таких як Ес-ділянка або константна ділянка), що впливають на функції антитіл, включаючи ефекторні функції. Альтернативно можна забезпечити зміни в посттрансляційних модифікаціях, таких як профілі глікозилювання (дивися нижче), за допомогою маніпуляцій із клітинами-хазяїнами і культивуванням клітин і умовами експресії, за допомогою яких одержують антитіло.

Зміни амінокислот, такі як амінокислотні заміни, можуть призвести до зміни ефекторної функції анти-СО154-антитіл за даним винаходом без зміни афінності зв'язування антигену. Описані вище амінокислотні заміни (зокрема, сіІи318, Губз320, Губз322, Гуз235, СіІу237, ДО332 і РЗ329) наприклад, можна використовувати для одержання антитіл зі зниженою ефекторною функцією.

В інших варіантах здійснення амінокислотні заміни можна провести для одного або більше наступних амінокислотних залишків: 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 і 322 константної ділянки важкого ланцюга (дивися патенти США Мо 5624821 і 5648260). Такі заміни можуть змінити ефекторну функцію з одночасним збереженням при цьому активності зв'язування антигену. Зміна за однією або більше амінокислотами 234, 235, 236 і 237 може знизити афінність зв'язування Ес-ділянки з ЕсуВІ-рецептором у порівнянні з немодифікованим або немутантним антитілом. Амінокислотні залишки 234, 236 і/або 237 можна піддати заміщенню, наприклад, на аланін, і амінокислотний залишок 235 можна замістити, наприклад, на глутамін. В іншому варіанті здійснення анти-СО154-антитіло може містити заміну Г ем у положенні 234 на Аа, заміну Гей у положенні 235 на Сіи, і заміну СіІу у положенні 237 на Аа.

Додатково або альтернативно можна змінити амінокислотні залишки в Ес-ділянці в положеннях 318, 320 і 322. Дані амінокислотні залишки, що є висококонсервативними в мишачому і людському Ідс, опосередковують зв'язування комплементу. Було показано, що зміна даних амінокислотних залишків знижує зв'язування з С1д, але не змінює зв'язування з антигеном, зв'язування з протеїном А або здатність Ес-ділянки зв'язуватися з мишачими макрофагами.

В іншому варіанті здійснення анти-СО154-антитіло за даним винаходом являє собою імуноглобулін

Іде4, що містить заміни, які знижують або елімінують ефекторну функцію. Ес-ділянка Ідс4 анти-

СОр154-антитіла за винаходом може містити одну або більше з наступних замін: заміну проліну на глутамат у залишку 233, аланіну або валіну на фенілаланін у залишку 234 та аланіну або глутамату на лейцин у залишку 235 (ЄО нумерація за Кабаї Е.А. еї аї., 1991, вище). Крім того, видалення сайта М- зв'язаного глікозилювання в Ес-ділянці Ід54 заміною АїЇа на Азп у залишку 297 (БО нумерація) може додатково знизити ефекторну функцію та елімінувати будь-яку залишкову ефекторну активність, що може мати місце. Іншим зразковим мутантом Іде4 зі зниженою ефекторною функцією є варіант підтипу Ідс4, що містить мутації 5228Р і І1235Е (РЕ мутація) у константній ділянці важкого ланцюга.

Дана мутація призводить до забезпечення зниженої ефекторної функції. Дивися патенти США Мо 5624821 і 5648260. Іншою зразковою мутацією в Ід04, яка призводить до зниження ефекторної функції, є 5228Р/1229А, описана в даному документі.

Інші зміни амінокислотних послідовностей у константній ділянці, що наводяться в ролі прикладу, включають, але не обмежуються цим, мутацію Аїа-АЇа, описану Вінезіопе еї аї!. (дивися МО 94/28027 і

УМО 98/47531; також дивися Хи еї аї., 2000, СеїІ Іттипої., 200:16-26). Таким чином, у деяких варіантах здійснення анти-СО154-антитіла з мутаціями в константній ділянці, включаючи мутацію АїІа-АІа, можна використовувати для зниження або відміни ефекторної функції. За даними варіантами здійснення константна ділянка анти-СО154-антитіла містить мутацію на аланін у положенні 234 або мутацію на аланін у положенні 235. Додатково константна ділянка може містити подвійну мутацію: мутацію на аланін у положенні 234 і другу мутацію на аланін у положенні 235.

В одному варіанті здійснення анти-СО154-антитіло містить каркасну ділянку Ід04, де мутація Аїа-

АЇа буде стосуватися мутації(ій) фенілаланіну на аланін у положенні 234 і/або мутації лейцину на аланін у положенні 235. У ще одному варіанті здійснення анти-СО154-антитіло містить каркасну ділянку ІДС1, де мутація АйІа-АЇа буде стосуватися мутації(ій) лейцину на аланін у положенні 234 і/або мутації лейцину на аланін у положенні 235. Анти-СО154-антитіло може альтернативно або додатково містить інші мутації, включаючи точкову мутацію КЗ22А в СН2-домені (Нелагепй еї аї., 2001, 9. Мігої., 75:12161-8).

Інші зразкові амінокислотні заміни наведені в заявці УМО 94/29351 (це джерело в повному обсязі включене у даний документ до відома), в якій описані антитіла з мутаціями в М-кінцевій ділянці СН2- домену, які призводять до зміни здатності антитіл зв'язуватися з ЕСКІ зі зниженням тим самим здатності антитіл зв'язуватися з Ст1д, що, у свою чергу, пригнічує здатність антитіл фіксувати комплемент. Також дивися Соїе еї аї. (9. Іттипої., 1997, 159:3613-3621), у цьому джерелі описані мутації у верхніх ділянках СН2 у Ідс2, які призводять до зниження зв'язування з Еск.

Способи одержання будь-якого з описаних вище варіантів антитіл, що містять амінокислотні заміни, добре відомі в даній галузі. Дані методи включають, не обмежуючись цим, одержання за допомогою сайт-спрямованого (або олігонуклеотид-опосередкованого) мутагенезу, ПЛР-мутагенезу і касетного мутагенезу одержаної молекули ДНК, що кодує антитіло або, принаймні, константну ділянку антитіла.

Сайт-спрямований мутагенез є добре відомим у даній галузі (дивися, наприклад, Сапег еї аї.,

Мисівїс Асіаз Нев., 13:4431-4443, 1985 і Кипкеї еї а!., Ргос. Май. Асай. зсі. ОБА, 82:488, 1987).

ПЛР-мутагенез також підходить для одержання варіантів амінокислотних послідовностей вихідного поліпептиду. Дивися Нідиспі у РОК Ргоїосої5, рр. 177-183 (Асадетіс Ргез5, 1990) і МайПекне еї аї., Мис.

Асіа5 Нез., 17:723-733, 1989.

Іншим способом одержання варіантів послідовностей є касетний мутагенез, заснований на методі, описаному Умеїї5 еї аї., бепе, 34:315-323, 1985.

Інший варіант здійснення даного винаходу стосується анти-СО154-антитіла зі зниженою ефекторною функцією, в якому Ес-ділянка антитіла або її ділянки замінені на Ес-ділянку (або її ділянки) із природною зниженою індукованою активністю. Наприклад, константна ділянка людського

Ід4 виявляє знижену здатність до активації комплементу або її відсутність. Крім того, різні молекули

Іде відрізняються за їхньою афінністю зв'язування стосовно ЕСК, що частково може бути результатом різної довжини або гнучкості шарнірних ділянок дос (яка знижується в наступному порядку

ІЧОЗ»ІдО12І9542Ід2). Наприклад, Ідс4 показує знижене зв'язування з ЕсукКІПа або його відсутність.

Приклади, химерних молекул і химерних константних ділянок дивися, наприклад, у Сіез еї аї. (Сапсег

Вев., 1999, 59:2159-2166) і МіПег еї а!., (Мої. Іттипої., 1997, 34:441-452).

Також винахід стосується анти-СО154-антитіл зі зниженою ефекторною функцією, в яких Ес- ділянка повністю відсутня. Такі антитіла також можна віднести до похідних антитіл і антигензв'язувальних фрагментів за даним винаходом. Такі похідні і фрагменти можна злити з білковими послідовностями, які відрізняються від антитіл, або небілюовими структурами, особливо структурами, призначеними для сприяння доставці і/або біодоступності при введенні тварині, наприклад, людині (дивися нижче).

Як вже обговорювалося вище, зміни в шарнірній ділянці також впливають на ефекторні функції.

Наприклад, делеція шарнірної ділянки може призвести до зниження афінності для Ес-рецепторів і може знизити активацію комплементу (Кіеєїп еї а!., 1981, РМАБ ЗА, 78:524-528). Отже, даний винахід стосується антитіл зі змінами в шарнірній ділянці.

У конкретних варіантах здійснення антитіла за даним винаходом можна модифікувати з метою інгібування комплементзалежної цитотоксичності (СОС). Модульовану активність СОС можна забезпечити введенням однієї або більше амінокислотних замін, вставок або делецій у Ес-ділянки антитіла (дивися, наприклад, патенти США Мо 6194551 і 6242195). або альтернативно додатково можна ввести залишок(и) цистеїну в Ес-ділянку зі створенням тим самим дисульфідного зв'язку між ланцюгами в даній галузі. Одержане в такий спосіб гомодимерне антитіло може мати підвищену або знижену здатність до інтерналізації і/або підвищену або знижену комплементзалежну загибель клітин.

Дивися, наприклад, Сагоп еї аї., У. Ехр. Мей., 176:1191-1195, 1992 і 5порез В., у. Іттипої., 148:2918- 2922, 1992, МО 99/51642, Юипсап а М/іІпег, Майте, 322:738-40, 1988; патент США Мо 5648260; патент

США 5624821 і УМО 94/29351.

Крім того, слід розуміти, що ефекторна функція може варіювати залежно від афінності зв'язування антитіла. Наприклад, антитіла з високою афінністю можуть бути більш ефективними в активації системи комплементу у порівнянні з антитілами з відносно низькою афінністю (Маг2осспі-Маснавдо єї аі!., 1999, Іттипої. Іпмеві., 28:89-101). Отже, антитіло можна змінити таким чином, що афінність зв'язування з його антигеном була знижена (наприклад, зміною варіабельних ділянок антитіла з використанням таких способів, як заміна, додавання або делеція одного або більше амінокислотних залишків). Антитіло зі зниженою афінністю зв'язування може виявляти знижені ефекторні функції, включаючи, наприклад, знижену АОСС і/або СОС.

Анти-СО154-антитіла за даним винаходом зі зниженою ефекторною функцією включають антитіла зі зниженою афінністю зв'язування з одним або більше Ес-рецепторами (ЕСЕ) у порівнянні з вихідним або немутантним анти-СО154-антитілом. Отже, анти-СО154-антитіла зі зниженою афінністю зв'язування з ЕС включають анти-СО154-антитіла, що мають 1,5-, 2-, 2,5-, 3-, 4- або 5-кратне або більше зниження афінності зв'язування з одним або більше Ес-рецепторами у порівнянні з вихідним або немутантним анти-СО154-антитілом (наприклад, антитілом 342 або 5с8). У деяких варіантах здійснення анти-СО154-антитіло зі зниженою ефекторною функцією зв'язується з БСК з афінністю приблизно в 10 разів нижчою у порівнянні з вихідним або немутантним антитілом. В інших варіантах здійснення анти-СО154-антитіло зі зниженою ефекторною функцією зв'язується з БСК з афінністю приблизно в 15 разів нижчою або з афінністю приблизно в 20 разів нижчою у порівнянні з вихідним або немутантним антитілом. Еск-рецептор може являти один або більш з ЕсуВІ (СОб4), Есукі! (СО32) і

ЕсукП (СО16) і їхні ізоформи, і Есе, ЕснНЕ, Есок і/або Есовм. У конкретних варіантах здійснення анти-

Ср154-антитіло зі зниженою афінністю має 1,5-, 2-, 2,5-, 3-, 4- або 5-кратне або більше зниження афінності зв'язування з сука.

Отже, у деяких варіантах здійснення анти-СО154-антитіло за даним винаходом виявляє знижене зв'язування з білком комплементу у порівнянні з другим анти-СО154-антитілом. У деяких варіантах здійснення анти-СО154-антитіло виявляє зв'язування, що нижче приблизно в 1,5 рази або більше, приблизно в 2 рази або більше, приблизно в З рази або більше, приблизно в 4 рази або більше, приблизно в 5 разів або більше, приблизно в 6 разів або більше, приблизно в 7 разів або більше, приблизно в 8 разів або більше, приблизно в 9 разів або більше, приблизно в 10 разів або більше або приблизно в 15 разів або більше у порівнянні з другим анти-СО154-антитілом.

Отже, у деяких варіантах здійснення даний винахід стосується антитіл, що виявляють знижену ефекторну функцію при введенні суб'єкту. У деяких варіантах здійснення анти-СО154-антитіло за даним винаходом не викликає тромбозу в суб'єкта, якому вводять антитіло. Тромбоз включає, наприклад, тромбоемболічні ускладнення. Такі ускладнення включають, наприклад, вазопатію (наприклад, судинні зміни, такі як потовщення внутрішньої оболонки судин і зміни в судинній стінці). У деяких варіантах здійснення анти-СО154-антитіло за даним винаходом викликає менші тромбоемболічні ускладнення у порівнянні з другим СО154-специфічним антитілом (наприклад, антитілом 342, антитілом 5с8 або гуманізованим антитілом 5с8). Анти-СО154-антитіло зі зниженою ефекторною функцією може показувати 5 9», 10 95, 15 95, 20 90, 25 о, 30 Фо, 40 96 або 50 95 зниження частоти прояву тромбоемболічних ускладнень при введенні суб'єкту та у порівнянні з немутантним або вихідним анти-СО154-антитілом.

У деяких варіантах здійснення анти-СО154-антитіло за даним винаходом не викликає агрегацію або активацію тромбоцитів в умовах іп міїго і/або в меншому ступені підвищує агрегацію або активацію тромбоцитів у порівнянні з другим СО154-специфічним антитілом (наприклад, антитілом 5с8 або гуманізованим антитілом 5с8; дивися приклад 1). Отже, у деяких варіантах здійснення присутність

Ср154-зв'язувального білка, наприклад, анти-СО154-антитіла, за даним винаходом у звичайному тесті оцінки агрегації або активації тромбоцитів не призводить до підвищення агрегації або активації більш ніж 20 95, 25 У, 30 95 або 50 95 у порівнянні з або агрегацією активацією, що спостерігається в тесті з негативним контролем. Зразковим стандартним тестом оцінки агрегації тромбоцитів є тест, описаний у даному документі (приклад 11, тест 1) і наведений на фіг.26. Обидва стандартний тест і альтернативний тест агрегації тромбоцитів (тест 2, фіг.27), які можна використовувати у винаході, описані в прикладі 11. СО154-зв'язувальний білок може бути розчинним.

У деяких варіантах здійснення даний винахід також стосується СО154-зв'язувального білка, наприклад, анти-СО154-антитіла, де зазначений білок містить один варіабельний домен імуноглобуліну, що специфічно і моновалентно зв'язується з СО40Ї, де зв'язування зазначеного розчинного білка з СЮО154 по суті не індукує фосфорилування МК у Т-клітинах Удигкаї. Також даний винахід стосується СЮО154-зв'язувального білка, наприклад, анти-СО154-антитіла, де зазначений білок містить один варіабельний домен імуноглобуліну, який специфічно і моновалентно зв'язується з

СО154, де зв'язування зазначеного розчинного білка з СО154 по суті не індукує секрецію ІЕМ-гама Т- клітинами Уигкаї, костимульованими анти-СОЗ-антитілом.

Деякі варіанти здійснення даного винаходу стосуються анти-СО154-антитіла, що містить одну або більше послідовностей СОМ важкого ланцюга, вибраних із СОВ-НІ (ЗЕО ІЮ МО:3), СОБ-Н2 (5ЕО Ір

МО:4) і СОК-НЗ (ЗЕО ІО МО:5), де антитіло додатково містить варіантну Ес-ділянку, яка надає знижену ефекторну функцію у порівнянні з нативною або вихідною Ес-ділянкою. У додаткових варіантах здійснення анти-СО154-антитіло містить, принаймні, дві СОК, і в інших варіантах здійснення антитіло містить усі три послідовності СОМ важкого ланцюга, які являють СОК-НІ (ЗЕО ІЮ МО:3), СОБ-Н2 (5ЕО

ІО МО:4) і СОБ-НЗ (5ЕО ІО МО:5).

Інші варіанти здійснення даного винаходу стосуються анти-СО154-антитіла, що містить одну або більше послідовностей СОМ легкого ланцюга, вибраних із СОК-І1 (ЗЕО ІЮ МО:6), СОВ-12 (5ЕО Ір

МО:7) ії СОК-ІЗ (5ЕО ІЮ МО:8), де антитіло додатково містить варіантну Ес-ділянку, яка надає знижену ефекторну функцію у порівнянні з нативною або вихідною Ес-ділянкою. У додаткових варіантах здійснення анти-СО154-антитіло містить, принаймні, дві 3 СОМ. легкого ланцюга, і в інших варіантах здійснення антитіло містить усі три послідовності СОК легкого ланцюга, які являють СОБ-Ї 1 (5ЕО 10

МО:6), СОК-Ї 2 (ЗЕО ІО МО:7) і СОК-І З (ЗЕО І МО:8).

У додаткових варіантах здійснення даного винаходу анти-СО154-антитіло зі зниженою ефекторною функцією містить послідовності всіх трьох СОК легкого ланцюга, які являють СОК-Ї 1 (ЗЕО ІЮ МО:6), СОК-І 2 (5ЕО І МО:7) і СОК-Ї З (5ЕО ІО МО:8) і містить послідовності всіх трьох СОК важкого ланцюга, які являють СОК-НІ1 (5ЕО ІЮ МО:3), СОК-Н2 (ЗЕО ІЮ МО:С4) і СОК-НЗ (5ЕО ІЮ МО: 5).

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується анти-СО154-антитіла, яке специфічно зв'язується з білюоюм СО154, де антитіло містить послідовність Мн, вибрану з БЕО ІЮ МО:1, ЗЕО І

МО:9, 5ЕО ІЮО МО:10 ії БЕО ІЮО МО:11. У деяких інших варіантах здійснення даний винахід стосується анти-СО154-антитіла, яке специфічно зв'язується з білююом СО154, де антитіло містить послідовність важкого ланцюга, вибрану з БЕО ІЮ МО:12 і 5ЕО ІЮ МО:13. У додаткових варіантах здійснення анти-

Ср154-антитіло, що містить будь-яку одну або більше СОК або послідовності важкого або легкого ланцюга, описані вище, являє ЕРар- або Раб'-фрагмент або їх похідне У ще одних варіантах здійснення антитіло являє Е(аб')»-фрагмент або його похідне. Також включаються інші фрагменти антитіл або їхніх похідних, що містять СОК або послідовності важкого або легкого ланцюга, які специфічно зв'язуються з білюоом СО154. Дані антитіла можна модифікувати для прояву знижених ефекторних функцій або їхньої відсутності. Отже, у деяких варіантах здійснення даний винахід стосується анти-СО154-антитіла, що містить послідовність Ун, вибрану з БЕО ІЮ МО-1, 5ЕО І МО:9,

ЗЕО ІЮ МО:10 ії БЕО ІО МО:11, де антитіло додатково містить варіантну Ес-ділянку, яка надає знижену ефекторну функцію у порівнянні з нативною або вихідною Ес-ділянкою.

В інших варіантах здійснення винахід стосується анти-СО154-антитіла, що містить послідовність

Мі, вибрану з БЕО ІЮ МО:2 і 5ЕО ІЮ МО:14, де антитіло додатково містить варіантну Ес-ділянку, яка надає знижену ефекторну функцію у порівнянні з нативною або вихідною Ес-ділянкою.

У деяких варіантах здійснення антитіло містить послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО:2. У додаткових варіантах здійснення антитіло, що містить ХЕО ІЮ МО:2, являє

Еаб- або Рар'-ррагмент або їх похідне. У ще одних варіантах здійснення антитіло є фрагментом

Каб')г або його похідним. Також включаються інші фрагменти антитіл або їхні похідні, що містять СОК або послідовності важкого або легкого ланцюга, які специфічно зв'язуються з білюом СО154.

У додаткових варіантах здійснення винахід стосується анти-СО154-антитіла, що містить послідовність Мі, вибрану групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО:2 і 5ЕО ІО МО:14, і додатково містить послідовність Мн, вибрану з БЕО ІЮ МО:1, 5ЕО ІЮ МО:9, 5ЕО ІЮО МО:10 і 5ЕО ІЮ МО:11, де антитіло додатково містить варіантну Ес-ділянку, яка надає знижену ефекторну функцію у порівнянні з нативною або вихідною Ес-ділянкою.

В інших варіантах здійснення даний винахід стосується анти-СО154-антитіла, що містить послідовність Мн 5ЕО ІЮ МО:29 і послідовність Мі 5ЕО ІЮО МО:30, де антитіло додатково містить варіантну Ес-ділянку, яка надає знижену ефекторну функцію у порівнянні з нативною або вихідною Ес- ділянкою.

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується анти-СО154-антитіла, яке специфічно зв'язується з білююм СО154, де антитіло містить послідовність легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО:15. У додаткових варіантах здійснення антитіло, що містить послідовність легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО:15, додатково містить варіантну Ес-ділянку, яка надає знижену ефекторну функцію у порівнянні з нативною або вихідною Ес-ділянкою (наприклад, Ес-ділянка зі зміненим глікозилюванням і/або іншою модифікацією).

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується анти-СО154-антитіла, що містить послідовність легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО':15 і послідовність важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з БЕО ІЮО МО:12 ії 5ЕО ІЮО МО:13, де антитіло додатково містить варіантну Ес-ділянку, яка надає знижену ефекторну функцію у порівнянні з нативною або вихідною Ес-ділянкою (наприклад, Ес- ділянка зі зміненим глікозилюванням і/або іншою модифікацією).

У деяких варіантах здійснення винахід стосується анти-СО154-антитіла, що містить послідовність легкого ланцюга 5ЕО ІЮО МО:2 або 14 і послідовність важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:1, 9, 10 або 11. У деяких варіантах здійснення анти-СО154-антитіло може бути фрагментом антитіла. У додаткових варіантах здійснення антитіло є Бар- або Рар'-фрагментом або їхнім похідним. У ще одних варіантах здійснення антитіло є Е(аб'я»-фрагментом або його похідним. Також включаються інші фрагменти антитіл або їхні похідні, що містять СОК або послідовності важкого або легкого ланцюга, що специфічно зв'язуються з більоюм СО154. Додатково антитіла можуть виявляти знижену ефекторну функцію. Наприклад, антитіла, що містять Ес-ділянку, можуть містити Ес-ділянку з однією або більш модифікаціями (наприклад, зміненим глікозилюванням, кон'югуванням і т.д.), таким чином, що антитіло буде виявляти знижену ефекторну функцію) або її відсутність.

В інших варіантах здійснення даний винахід стосується анти-СО154-антитіла, що містить послідовність легкого ланцюга ЗЕ ІЮ МО:15 і послідовність важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:13, де антитіло додатково містить варіантну Ес-ділянку, яка надає знижену ефекторну функцію у порівнянні з нативною або вихідною Ес-ділянкою. У ще одних варіантах здійснення даний винахід стосується анти-

Ср154-антитіла, що містить послідовність легкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО:15 і послідовність важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО:12, де антитіло додатково містить варіантну Ес-ділянку, яка надає знижену ефекторну функцію у порівнянні з нативною або вихідною Ес-ділянкою.

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується анти-СО154-антитіла, що містить одну або більше послідовностей СОК важкого ланцюга, вибраних із СОК-НІ1 (ЗЕО ІЮ МО:42), СОК-Н2 (5ЕО

ІО МО:43) ії СОК-НЗ (ЗЕО ІО МО:44), де антитіло додатково містить варіантну Ес-ділянку, яка надає знижену ефекторну функцію у порівнянні з нативною або вихідною Ес-ділянкою. У деяких варіантах здійснення анти-СО154-антитіло містить, принаймні, дві з СОМ важкого ланцюга та в інших варіантах здійснення антитіло містить послідовності всіх трьох СОК важкого ланцюга, які являють СОК-НІ (5ЕО

ІО МО:42), СОК-Н2 (ЗЕО ІЮ МО:43) і СОБ-НЗ (ЗЕО ІО МО:44).

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується анти-СО154-антитіла, що містить одну або більше послідовностей СОК легкого ланцюга, вибраних із СОК-1 1 (5ЕО ІЮ МО:45), СОК-І 2 (ЗЕО

ІО МО:46) і СОК-ІЗ (ЗЕО ІО МО:47), де антитіло додатково містить варіантну Ес-ділянку, яка надає знижену ефекторну функцію у порівнянні з нативною або вихідною Ес-ділянкою. У деяких варіантах здійснення анти-СО154-антитіло містить, принаймні, дві 3 СОМ. легкого ланцюга, і в інших варіантах здійснення антитіло містить послідовності всіх трьох СОК легкого ланцюга, які являють СОК-І 1 (5ЕО

ІО МО:45), СОК-12 (5ЕО ІО МО:46) і СОК-Ї З (ЗЕО ІЮ МО 47).

Додаткові варіанти здійснення даного винаходу стосуються анти-СО154-антитіла, що містить варіантну Ес-ділянку, яка надає знижену ефекторну функцію у порівнянні з нативною або вихідною Ес- ділянкою, де антитіло містить усі три послідовності СОМ. легкого ланцюга, які являють СОК-І 1 (5ЕО 10

МО:45), СОК-І2 (5ЕБО ІЮО МО:46) ії СОК-І З (5ЕО ІЮО МО 47), і де антитіло містить послідовності всіх трьох СОК важкого ланцюга, які являють СОК-НІТ (5ЕО ІЮ МО:42), СОК-Н2 (5ЕО ІЮ МО:43) і СОК-НЗ (ЗЕО ІЮ МО 44).

У ще одних варіантах здійснення даний винахід стосується анти-СО154-антитіла, що містить одну або більше послідовностей СОК важкого ланцюга, вибраних із СОК-НІ1 (ЗЕО ІЮ МО:48), СОК-Н2 (5ЕО

ІО МО:49) ії СОК-НЗ (ЗЕО ІО МО:50), де антитіло додатково містить варіантну Ес-ділянку, яка надає знижену ефекторну функцію у порівнянні з нативною або вихідною Ес-ділянкою. У додаткових варіантах здійснення анти-СО154-антитіло містить, принаймні, дві 3 СОК важкого ланцюга, і в інших варіантах здійснення антитіло містить послідовності всіх трьох СОК важкого ланцюга, які являють

СОР-НІ (ЗЕО ІЮ МО:48), СОК-Н2 (ЗЕО ІЮ МО:49) і СОБ-НЗ (5ЕО ІЮ МО:50).

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується анти-СО154-антитіла, що містить одну або більше послідовностей СОК легкого ланцюга, вибраних із СОБ-Ї 1 (ЗЕО ІЮ МО:51), СОК-І 2 (ЗЕО

ІО МО:52) і СОК-ІЗ (ЗЕО ІО МО:53), де антитіло додатково містить варіантну Ес-ділянку, яка надає знижену ефекторну функцію у порівнянні з нативною або вихідною Ес-ділянкою. У додаткових варіантах здійснення антитіло містить, принаймні, дві з СОК легкого ланцюга, і в інших варіантах здійснення антитіло містить послідовності всіх трьох СОК легкого ланцюга, які являють СОК-І 1 (5ЕО

ІО МО:51), СОК-12 (5ЕО ІО МО:52) і СОК-Ї З (ЗЕО ІЮ МО:53).

У деяких варіантах здійснення анти-СО154-антитіло зі зниженою ефекторною функцією містить усі три послідовності СОК легкого ланцюга, які являють СОК-ЇІ 1 (ЗЕО ІЮ МО:51), СОК-І2 (5ЕО ІЮО МО:52) і

СОК-ІЗ (5ЕО ІО МО:53), і додатково містить послідовності всіх трьох СОК важкого ланцюга, які являють СОК-НІ (5ЕО І МО:48), СОНК-Н2 (5ЕО ІЮ МО:49) і СОВК-НЗ (5ЕО ІЮО МО:50).

У додаткових варіантах здійснення даний винахід стосується анти-СО154-антитіла, яке специфічно зв'язується з СО154, де антитіло містить послідовність Мі 5ЕО І МО:54. Також даний винахід стосується анти-СО154-антитіла, яке містить послідовність Мн 5ЕО ІЮ МО:56. Анти-СО154-антитіло за винаходом може містити послідовність Мі ЗЕО ІЮО МО:54 і послідовність Мн ЗЕО ІЮ МО:56. У додаткових варіантах здійснення антитіло є Рар- або Рар'-фрагментом або їхнім похідним. У ще одних варіантах здійснення антитіло або фрагмент антитіла є Е(аб')».-фрагментом або його похідним.

Антитіло або фрагмент також може являти гуманізоване або повністю людське антитіло або його фрагмент. Деякі варіанти здійснення даного винаходу стосуються анти-СО154-антитіла, що містить послідовність Мн 5ЕО ІЮ МО:56 і послідовність Мі 5ЕО ІЮО МО:54, де антитіло додатково містить варіантну Ес-ділянку, яка надає знижену ефекторну функцію у порівнянні з нативною або вихідною Ес- ділянкою.

У додаткових варіантах здійснення даний винахід стосується анти-СО154-антитіла, яке специфічно зв'язується з білююм СО154, де антитіло містить послідовність Мі ЗЕО ІЮ МО:58. У додаткових варіантах здійснення антитіло містить послідовність Мн ЗЕО ІЮ МО:60. У додаткових варіантах здійснення антитіло або фрагмент містить послідовність Мн ЗЕО ІЮ МО:60 і послідовність Мі 5ЕО 10

МО:58. Антитіло може бути Рар- або Рар'-фрагментом або їхнім похідним. У ще одних варіантах здійснення антитіло є Е(ар')»-фрагментом або його похідним. Також антитіло може бути гуманізованим або повністю людським антитілом або його фрагментом. В інших варіантах здійснення даний винахід стосується анти-СО154-антитіла, що містить послідовність Мн 5ЕО ІЮ МО:58 і послідовність Мі 5ЕО 10

МО:60, де антитіло додатково містить варіантну Ес-ділянку, яка надає знижену ефекторну функцію у порівнянні з нативною або вихідною Ес-ділянкою.

Анти-СО154-антитіла зі зміненим глікозилюванням

Видалення глікану призводить до структурної зміни, яка буде істотно знижувати зв'язування з усіма членами сімейства Ес-рецепторів різних видів. У глікозильованих антитілах, включаючи анти-

Ср154-антитіла, глікани (олігосахариди), приєднані до консервативного М-зв'язаного сайта, у СН2- доменах Ес-димера, знаходяться між СН2-доменами, із залишками цукру, що забезпечують контактування з певними амінокислотними залишками в протилежному СН2-домені. Різні профілі глікозилювання зв'язані з різними біологічними властивостями антитіл (дейегі5 апа І ипа, 1997, Спет.

Іттипої!., 65:111-128; М/гідні апа Моїтізоп, 1997, Тгепавз Віоїесппої!., 15:26-32). Деякі певні глікоформи надають потенційно переважні біологічні властивості Втрата гліканів змінює просторове розташування ділянок і підвищує їхню рухомість стосовно один одного, і як думають, це робить інгібуючу дію на зв'язування з усіма членами сімейства Ес-рецепторів. Наприклад, результати дослідів в умовах іп міїго з різними глікозильованими антитілами показали, що видалення гліканів у СН2-домені змінять структуру Ес-ділянки таким чином, що зв'язування з Ес-рецепторами і білюом комплементу С1і4 істотно знижується. Іншим відомим підходом до зниження ефекторних функцій є інгібування продукції або видалення М-зв'язаних гліканів у положенні 297 (ЄО нумерація) у СН2-домені Ес-ділянки (Мове еї аі!., 1983, РМАБ, 80:6632; І еаіпегбатом єї аї., 1985, Мої. Іттипої., 22:407; Тао вї аї., 9). Іттипої., 143:2595; І па еї а!., 1990, Мої. Іттипої!., 27:1145; Рогаї еї а!., 1991, Нубідота, 10:211; Напа еї аї., 1992, Сапсег Іттипої!. ІттипоїНег., 35:165; І еадег еї а!., 1991, Іттипоіоду, 72:481; Рошпа еї аї!., 1993,

МОЇ. Іттипої., 30:233; Воуа еї аї., Мої. Іттипої., 32:1311). Також відомо, що різні глікоформи можуть впливати на властивості терапевтичного засобу, включаючи фармакокінетику, фармакодинаміку, взаємодію з рецептором і тканеспецифічну спрямованість (Сгадаіб еї аїЇ.,, 2002, Си. РВагт.

Віотесппої., 3:285-297). Зокрема, стосовно антитіл, то структура олігосахариду може впливати на властивості антитіла, пов'язані з резистентністю до протеази, часом напівжиття в сироватці крові, опосередкованим ЕсКп-рецептором, фагоцитозом і зворотним зв'язком антитіла, на додаток до ефекторних функцій антитіла (наприклад, зв'язування з комплексом комплементу С1, яке індукує СОС, і зв'язування з ЕсуВ-рецепторами, яке є відповідальним за модулювання шляху АЮСС (Мозе апа

М/ід2:еїЇ, 1983; І еаїпегбатом апа Юмек, 1983; І еаіпегба!тому евї аї!., 1985; УМаїКег" сеї аї., 1989; Сапег евї аї., 1992, РМАБ, 89:4285-4289).

Отже, інший спосіб модуляції ефекторної функції антитіл включає зміну глікозилювання константної ділянки антитіла. Змінене глікозилювання включає, наприклад, зниження або підвищення кількості глікозильованих залишків, зміна характеру або розташування глікозильованих залишків, а також зміна в структурі(ах) цукру. Олігосахариди, виявлені в людських ДОС, впливають на ступінь прояву їх ефекторної функції (Ка)счи Т.5., ВіоРгосез55 Іпіегпайопаї, Аргії 2003, 44-53); мікрогетерогенність олігосахаридів людського до може вплинути на біологічні функції, такі як СОС ї АОСС, зв'язування з різними Ес-рецепторами і зв'язування з білком С1Т4д (Умгідні А. 8 Могтізоп 5.І., ТІВТЕСН 1997, 15:26-32;

Зпіва5 єї аї., у. Віої. Снет., 2001, 276(9):6591-604; ЗНіваз єї аї., у. Віої. Снет., 2002, 277(30):26733-40;

Зпіпкама еї аї., у. Віої. Спет., 2003, 278(5):3466-73; Отапа еї а!., Маї. Віоїесппої., 1999 Реб., 17(2):176- 80). Наприклад, здатність до зв'язуватися з С14 і активувати каскад комплементу може залежати від присутності, відсутності або модифікації вуглеводної групи, розташованої між двома СН2-доменами (яка в нормі зв'язана з залишком Азп297) (Умага апа спеїйе, Тпегарешіс Іттипо|оду, 2:7 7-94, 1995).

Сайти глікозилювання у Ес-вмісному поліпептиді, наприклад, в антитілі, такому як Ідс-антитіло, можна ідентифікувати стандартними методами. Ідентифікація сайта глікозилювання може бути експериментальною або може грунтуватися на аналізі послідовності або даних моделювання. Описані консенсусні мотиви, тобто амінокислотні послідовності, розпізнавані різними глікозилтрансферазами.

Наприклад, консенсусний мотив для мотиву М-зв'язаного глікозилювання звичайно являє МХТ або

МХ5, де Х може бути будь-якою амінокислотою, за винятком проліну. Також описано кілька алгоритмів для визначення локалізації потенційного мотиву глікозилювання. Отже, для ідентифікації потенційних сайтів глікозилювання в антитілі або Ес-вмісному фрагменті досліджують послідовність антитіла, наприклад, при використанні широко доступної бази даних, такої як мерзіїєе, наведеної Центром аналізу біологічних послідовностей (дивися МеїМОїус для прогнозу сайтів М-зв'язаного глікозилювання і меюсіус для прогнозу сайтів О-зв'язаного глікозилювання).

Результати дослідів іп мімо підтвердили зниження ефекторної функції в аглікозильних антитіл.

Наприклад, аглікозильне анти-СОв8-антитіло не здатне призводити до елімінації клітин, що несуть СО8, у мишей (Ізаасв, 1992, 9. Іттипої!., 148:3062), і аглікозильне анти-СОЗ-антитіло не індукує синдром вивільнення цитокінів у або мишей людей (Воуай, 1995, вище; Егіепа, 1999, Тгап5ріапіайоп, 68:1632).

Важливо, що незважаючи на те, що видалення гліканів у СН2-домені впливає на прояв ефекторної функції, інші функціональні і фізичні властивості антитіла залишаються без змін. Зокрема, було показано, що видалення гліканів впливало на час напівжиття в сироватці крові і зв'язування з антигеном (Мозе, 1983, вище; Тао, 1989, вище; Рогаї, 1991, вище; Напа, 1992, вище; Норбр», 1992, МоО)1.

Іттипої., 29:949).

Незважаючи на те, що є визнання аглікозильного підходу в умовах іп мімо, є повідомлення про залишкову ефекторну функцію в аглікозильних тАб (дивися, наприклад, Рошипа 9.0. єї аї!., 1993, Мо).

Іттипої., З30(3):233-41; Могаі Н. еї аї., 1991, Нубгідота, 10(2):211-7). Аппошиг еї аїЇ. встановили збереження залишкового зв'язування з білками ЕсукКІа і ЕсуВІІБ (Єиг. У. Іттипої!., 1999, 29:2613-2624;

МОЇ. Іттипої!., 40, 2003, 585-593). Таким чином, додаткове зниження ефекторної функції, особливо активації комплементу, у деяких випадках може бути важливим для гарантії повної відміни активності.

З цієї причини аглікозильні форми Ідса2 і досі і гібриди 51/54 передбачаються у ролі придатних у способах і композиціях антитіл зі зниженими ефекторними функціями за винаходом.

Одержання деглікозильованих або аглікозильних анти-СО154-антитіл

Анти-СО154-антитіла за даним винаходом можна модифікувати або змінити з метою прояву зниженої ефекторної функції(й) (у порівнянні з другим СО154-специфічним антитілом), одночасно зберігши інші важливі властивості Ес-ділянки.

Отже, у деяких варіантах здійснення даний винахід стосується аглікозильних анти-СО154-антитіл зі зниженою ефекторною функцією, які відрізняються модифікацією в консервативному М-зв'язаному сайті в СН2-доменах Ес-ділянки антитіла. Модифікація консервативного М-зв'язаного сайта в СН2- доменах Есо-димера може призвести до забезпечення аглікозильних анти-СО154-антитіл. Приклади таких модифікацій включають мутацію консервативного М-зв'язаного сайта в СН2-доменах Ес-димера, видалення гліканів, приєднаних до М-зв'язаного сайта в СН2г-доменах, і попередження глікозилювання. Наприклад, аглікозильне анти-СО154-антитіло можна одержати зміною канонічного

Авп М-зв'язаного сайта в СН2-домені важкого ланцюга на залишок Сіп (дивися, наприклад, заявку УМО 05/03175 і заявку на патент США 2006/0193856).

В одному варіанті здійснення даного винаходу модифікація включає мутацію в сайті глікозилювання важкого ланцюга з метою відміни глікозилювання в сайті. Таким чином, в одному варіанті здійснення даного винаходу аглікозильні анти-СО154-антитіла одержують мутацією сайта глікозилювання важкого ланцюга, тобто мутацією М2980 (М297 із використанням ЕО нумерації Кава) і експресують у придатній клітині-хазяїні. Наприклад, дану мутацію можна провести, дотримуючись рекомендованого виробником протоколу до набору для мутагенезу унікальних сайтів виробництва

Атегепат-РІагтасіа Віоїесі (Різсагамжау, МУ, США).

Мутоване антитіло можна стабільно експресувати у клітині-хазяїні (наприклад, клітині МБО або

СНО) і потім виділити. У ролі одного прикладу виділення можна проводити з використанням протеїну

А і гель-хроматографії. Фахівцям у даній галузі, мабуть, зрозуміло, що також можна використовувати інші придатні способи експресії і виділення.

У ще одному варіанті здійснення даного винаходу аглікозильні анти-СО154-антитіла мають знижену ефекторну функцію, де модифікація в консервативному М-зв'язаному сайті в СН2-доменах

Ес-ділянки зазначеного антитіла або похідного антитіла включає видалення гліканів у СН2-доменах, тобто деглікозильовані. Дані аглікозильні анти-СО154-антитіла можна одержати звичайними методами і потім піддати ферментативному деглікозилюванню. Способи ферментативного деглікозилювання антитіл є добре відомими фахівцям у даній галузі (М/Шіатв, 1973; УММпКеІпаке 4. Місоізоп, 1976, 9. Віо|.

Спет., 251:1074-80).

В іншому варіанті здійснення даного винаходу деглікюзилювання можна забезпечити культивуванням клітин-хазяїнів, які продукують антитіла, у культуральному середовищі, що містить інгібітор глікозилювання, такий як тунікаміцин (Мозе 8 М/ід27еїІ, 1983). Тобто, модифікація являє собою зниження або відміну глікозилювання в консервативному М-зв'язаному сайті в СН2-доменах Ес- ділянки зазначеного антитіла.

У ще одних варіантах здійснення даного винаходу рекомбінантні СО154 поліпептиди (або клітини або клітинні мембрани, що містять такі поліпептиди) можна використовувати як антиген для одержання анти-СО154-антитіл або похідних антитіл, які потім можна деглікозилювати.

В альтернативних варіантах здійснення аглікозильні анти-СО154-антитіла або анти-СО154- антитіла зі зниженим глікозилюванням за даним винаходом можна одержати способом, описаним

Тауїюг еї аіІ. (М/О 05/18572 і заявка на патент США 2007/0048300). Наприклад, в одному варіанті здійснення аглікозильне антитіло проти СО154 можна одержати зміною першого амінокислотного залишку (наприклад, заміною, вставкою, делецією або хімічною модифікацією), де змінений перший амінокислотний залишок призводить до інгібування другого амінокислотного залишку за допомогою стеричної перешкоди або заряду або обома факторами разом. У деяких варіантах здійснення перший амінокислотний залишок модифікований амінокислотним заміщенням. У додаткових варіантах здійснення амінокислотна заміна вибрана з групи, що складається з Су, Аа, Ммаї, І еи, Пе, Ріє, Авп,

СіІп, Тгр, Рго, зег, ТАг, Туг, Суб, Меї, Ар, Сім, Гуз, Агд і Ніх5. У ще одних варіантах здійснення амінокислотна заміна являє введення незвичайного амінокислотного залишку. Другий амінокислотний залишок може знаходитися біля або усередині мотиву глікозилювання, наприклад, у мотиві М- зв'язаного глікозилювання, який містить амінокислотну послідовність МХТ або МХ5. В одному наведеному як приклад варіанті здійснення перший амінокислотний залишок є амінокислотою 299 і другий амінокислотний залишок є амінокислотою 297 відповідно до нумерації Кабаї. Наприклад,

перше заміщення амінокислоти може являти Т299А, Т1299М, 129965, Т299У, 1299С, Т299Н, Т299Е,

Тт2990, Т1299К, Т299Е, Т2995, Т1299І, 12991, Т299М, Т299Е, Т299Р, Т299УМ ї Т299М відповідно до нумерації Кабаї. У конкретних варіантах здійснення амінокислотна заміна являє Т2996.

Також ефекторну функцію можна знизити модифікацією антитіла за даним винаходом таким чином, що антитіло буде містити блокувальну групу. Наведені як приклад блокувальні групи, включають групи з достатнім стеричним розміром і/або зарядом таким чином, що забезпечується знижене глікозилювання, наприклад, блокуванням здатності глікозидази каталізувати глікозилювання поліпептиду. Блокувальна група може або додатково альтернативно пригнічувати ефекторну функцію, наприклад, інгібуванням здатності Ес-ділянки зв'язуватися з рецептором або комплементом. У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується СО154-зв'язувального білка, наприклад, анти-СО154- антитіла, що містить послідовність СОМКЗ важкого ланцюга, вибраного з 5ЕО ІЮ МО:5, 44 і 50, і варіантну Ес-ділянку, де варіантна Ес-ділянка містить перший амінокислотний залишок і сайт М- глікозилювання, перший амінокислотний залишок, модифікований зміною бічного ланцюга з метою досягнення підвищеного стеричного розміру і/або підвищеного електростатичного заряду у порівнянні з немодифікованим першим амінокислотним залишком, зі зниженням у такий спосіб рівня або зміною іншим способом зміни глікозилювання в сайті М-глікозилювання. У деяких з даних варіантів здійснення варіантна Ес-ділянка надає знижену ефекторну функцію у порівнянні з контрольною, неваріантною Ес- ділянкою. У додаткових варіантах здійснення бічний ланцюг з підвищеним стеричним розміром являє бічний ланцюг амінокислотного залишку, вибраного з групи, що складається з Ре, Тгр, Ні, Сім, Сп,

Аг, Гуз, Меї і ТугМ. У ще одних варіантах здійснення бічна хімічна група з підвищеним електростатичним зарядом є бічним ланцюгом амінокислотного залишку, вибраного з групи, що складається з Азр, Сім, Гуз, Аго і Нів.

Отже, в одному варіанті здійснення глікозилювання і Ес-зв'язування можна модулювати заміною

Т299 на заряджений бічний ланцюг такий, як 0, Е, К або К. Одержане антитіло буде мати знижений профіль глікозилювання, а також знижену афінність зв'язування Ес-ділянки з Ес-рецептором за рахунок несприятливих електростатичних взаємодій.

У ще одному варіанті здійснення мутантне антитіло Т299С, що одночасно є аглікозильованим і здатним утворювати цистеїновий аддукт, може виявляти меншу ефекторну функцію (наприклад, зв'язування з ЕсукіІ) у порівнянні з аглікозильованим прототипом антитіла (дивися, наприклад, заявку

УМО 05/18572). Отже, зміна першої амінокислоти, яка знаходиться проксимальніше до мотиву глікозилювання, може інгібувати глікозилювання антитіла в другому амінокислотному залишку; коли перша амінокислота є залишком цистеїну, то антитіло може виявляти навіть ще більш знижену ефекторну функцію. Крім того, інгібування глікозилювання антитіла підтипу Ї9054 може більш виражено впливати на зв'язування з ЕсукіІ у порівнянні з впливом аглікозилювання в інших підтипах.

У додаткових варіантах здійснення даний винахід стосується анти-СО154-антитіла зі зміненим глікозилюванням, яке виявляє знижене зв'язування з одним або більше ЕсЕК-рецепторами і яке також необов'язково показує підвищене або нормальне зв'язування з одним або більше Ес-рецепторами або комплементом - наприклад, антитіла зі зміненим глікозилюванням, що, принаймні, зберігають таку саму або близьку афінність зв'язування з одним або більше Ес-рецепторами і/або комплементом, що й у нативного, контрольного анти-СО154-антитіла). Наприклад, анти-СО154-антитіла переважно з

Мап5аісМАс2гМ-гліканом у ролі наявної гліканової структури (наприклад, де Мап5асісМАсегМ-глікан знаходиться в кількості, що складає, принаймні, приблизно 5 мольдо вище у порівнянні з наступною переважною глікановою структурою композиції Ід) можуть виявляти змінену ефекторну функцію у порівнянні з популяцією анти-СО154-антитіл, в яких структура МапосісМАс2гМ-глікану не є домінуючою.

Антитіла переважно з даною глікановою структурою виявляють знижене зв'язування з ЕсукКІІа і

ЕсуйкПЬ, підвищене зв'язування з ЕсукКІШа і ЕсукКПЬ, і підвищене зв'язування із субодиницею С14д комплексу С1 (дивися заявку на патент США 2006/0257399). Дана гліканова структура, у тому випадку, коли вона є основною глікановою структурою, надає підвищену АЮОСС, підвищену СОС, підвищений час напівжиття в сироватці крові, підвищену продукцію антитіл В-клітинами і знижений фагоцитоз макрофагами.

У цілому структури глікозилювання в глікопротеїні будуть варіювати залежно від експресії хазяїном і умов культивування (Каї)и Т.5., ВіоРгосез5 Іпіегпайопаї, Аргії 2003, 44-53). Такі відмінності можуть призвести до одночасних змін ефекторної функції і фармакокінетики (Ізгаєї еї аї., ІттипоїЇоду, 1996, 89(4):573-578; Мем/Кіїк єї аїЇ., Р. Сііп. Ехр., 106(2):259-64). Наприклад, галактозилування може варіювати залежно від культуральних умов, які можуть зробити деякі імуноглобуліни імуногенними залежно від їхнього специфічного профілю галактози (Раїеї еї аї!., 1992, Віоспет .., 285:839-845). Для олігосахаридів глікопротеїнів, продукованих клітинами ссавців, які відрізняються від людини, властива тенденція бути ближче до людських глікопротеїнів. Крім того, можна сконструювати і відібрати білки- що експресують системи-хазяїни для експресії домінуючої глікоформи Ід, або альтернативно можуть природно продукувати глікопротеїни з домінуючими глікановими структурами. Приклади сконструйованих експресуючих білки систем-хазяїнів, продукуючих глікопротеїн з переважної глікоформою, включають нок-аути/мутації генів (Зпіеїа5 еї аї., 2002, УВС, 277:26733-26740); генну інженерію (Штапа еї аї!., 1999, Маїиге Віоїесп., 17:176-180) або їхнє сполучення. Альтернативно деякі клітини природно експресують домінуючу глікоформу, наприклад, клітини курей, людей і корів (Ка)и еї аі,, 200, Сіусоріоіоду, 10:477-486). Таким чином, фахівець у даній галузі може одержати експресію анти-СО154-антитіла або композиції антитіла зі зміненим глікозилюванням (наприклад, переважно з однією визначеною глікановою структурою) добором, принаймні, однієї з багатьох експресуючих систем-хазяїнів. Що експресують білки системи-хазяїна, які можна використовувати для продукції анти-СО154-антитіл за даним винаходом, включають клітини тварин, рослин, комах, бактерій тощо.

Наприклад, у заявках на патент США 2007/0065909, 2007/0020725 і 2005/0170464 описане одержання молекул аглікозильованих імуноглобулінів у бактеріальних клітинах. Як додатковий приклад Мугідні і

Могтізоп одержували антитіла в лінії клітин СНО з недостатнім глікозилюванням (1994, .). Ехр. Меад., 180:1087-1096) і показали, що антитіла, продуковані даною клітинною лінією, не здатні до комплементзалежного цитолізу. Інші приклади експресуючих систем-хазяїнів, знайдені в ділянці одержання глікопротеїнів, включають клітини СНО: Кай УМО 99/22764 і Ргеяа УУО 03/35835; гібридомні клітини: Тгтерак еї аї., 1999, У). Іттипої. Меїйоа5, 230:59-70; клітини комах: Нзи еї аї., 1997,

УВС, 272:9062-970, і рослинні клітини: сегпдго55 еї аі., МО 04/74499. Оцінку ступеня, до якого дана клітина або екстракт забезпечує глікозилювання даного мотиву, можна провести відомими в даній галузі методами визначення того, наскільки мотив глікозильований, наприклад, із використанням гель- електрофореза і/або спектроскопії-мас-спектроскопії.

Додаткові способи зміни сайтів глікозилювання антитіл описані, наприклад, у патенті США Мо 6350861 і патенті США Мо 5714350, УУО 05/18572 і МО 05/031175; дані способи можна використовувати для одержання анти-СО154-антитіл за даним винаходом зі зміненим, зниженим глікозилюванням або його відсутністю.

Аглікозильні анти-СО154-антитіла зі зниженою ефекторною функцією можуть являти антитіла, які містять модифікації або які можна кон'югувати для включення функціональної групи. Такі групи включають блокувальну групу (наприклад, ПЕГ, цистеїновий аддукт і т.д.), детектовану групу (наприклад, флуоресцентні групи, радіоїзотопні групи, непроникні для радіоактивності групи і т.д., включаючи діагностичні групи) і/або терапевтичну групу (наприклад, цитотоксичні агенти, протизапальні засоби, імуномодулятори, проти інфекційні засоби, протипухлинні засоби, засоби для лікування нейродегенеративних захворювань, радіонукліди і т.д.).

Кон'югати антитіл

При введенні часто антитіла звичайно швидко елімінуються з кровотоку і, отже, можуть виявляти фармакологічну активність протягом відносно нетривалого періоду часу. Отже, можуть бути необхідними часті введення відносно великих доз антитіл для підтримування терапевтичної ефективності при лікуванні антитілами.

В одному варіанті здійснення даного винаходу анти-СО154-антитіла за даним винаходом можуть являти модифіковані антитіла (наприклад, з'єднані з іншими групами, такими як гетерологічна функціональна група) з метою підвищення цілісності та існування антитіла в умовах іп мімо.

Наприклад, анти-СО154-антитіла за даним винаходом можуть являти антитіла, що модифіковані для включення групи (функціональної групи), яка може підвищити стабільність, тим самим пролонгуючи час напівжиття в сироватці крові антитіла. Час напівжиття в сироватці крові СО154-зв'язувального білка, наприклад, антитіла, за винаходом може складати, принаймні, З доби, принаймні, 7 діб, принаймні, 14 діб, принаймні, 21 добу, принаймні, 28 діб, принаймні, 1 місяць або більше. Такі функціональні групи, які підвищують час напівжиття антитіл, можуть бути особливо придатними у варіантах здійснення, коли антитіло являє, наприклад, фрагмент антитіла.

Модифікації антитіл також можуть призводити до підвищення розчинності білка у водному розчині, попередженню агрегації, підвищенню фізичної і хімічної стабільності білка та істотному зниженню імуногенності та антигенності білка. У результаті бажану біологічну активність в умовах іп мімо можна забезпечити введенням таких аддуктів полімер-білок або рідше в більш низьких дозах у порівнянні з немодифікованим білком.

Отже, у деяких варіантах здійснення антитіла за винаходом є антитілами, з'єднаними з гетерологічними функціональними групами, з одержанням кон'югатів антитіл. "Функціональна група" стосується будь-якої функціональної групи (наприклад, поліпептиду, домену білка, носія, полімеру і т.д.), яка зв'язана з антитілом за винаходом. Зв'язування анти-СО154-антитіла може бути ковалентним або нековалентним і також може бути оборотним або контрольованим. Зразкові молекули, які можна використовувати для одержання кон'югатів антитіл проти СО154, включають, але не обмежуються цим, функціональні молекули, наприклад, такі як протипухлинні засоби, лікарські засоби, токсини, біологічно активні білки, наприклад, ферменти, інше антитіло, похідне антитіла або фрагменти антитіла, синтетичні (наприклад, ПЕГ) або природні полімери, нуклеїнові кислоти і їхні фрагменти, наприклад, ДНК, РНК та їхні фрагменти, аптамери, радіонукліди, особливо радіойодиди, радіоізотопи, хелатвані метали, наночастинки і репортерні групи, такі як флуоресцентні або люмінесцентні сполуки, або сполуки, які можна детектувати за допомогою візуалізуючих методів, таких як ЯМР- або ЕБК-

спектроскопія.

У додатковому прикладі функціональна група, з якою кон'югують антитіла за винаходом, може призвести до підвищення часу напівжиття антитіла в умовах іп мімо і/або зниженню імуногенності антитіла, і/або підвищенню проходження антитіла через епітеліальний бар'єр в імунну систему.

Приклади придатних функціональних молекул даного типу включають полімери, декстран, гідроксипропілметакриламід (НРМА), трансферин, альбумін, зв'язувальні білки альбумінової фракції, або сполуки, що зв'язуються з альбуміном, такі як описані в РСТ/ЗВ2005/002084.

У тих випадках, коли функціональна група є полімером, то в загальному він може являти собою синтетичний або природний полімер, наприклад, необов'язково заміщений поліалкілен, поліалкенілен або поліоксіалкілен з прямим або розгалуженим ланцюгом, або розгалужений або нерозгалужений полісахарид, наприклад, гомо- або гетерополісахарид. Дивися, наприклад, Мегопезе апа Равзиї, 2005,

Огид Оівсомегу Тодау, 10(21):1451-1458; Равшї єї аїЇ., 2004, Ехреп Оріпіоп іп Тнегарешіс Раїепів, 14(6):859-894.

Конкретні необов'язкові замісники, які можуть бути присутніми у вищезазначених, синтетичних полімерах, включають одну або більш гідроксильних, метильних або метоксильних груп.

Конкретні приклади синтетичних полімерів включають необов'язково заміщені поліетиленгліколь, поліпропіленгліколь, полівініловий спирт із прямим або розгалуженим ланцюгом або їхні похідні, особливо необов'язково заміщений поліетиленгліколь, такий як метоксиполіетиленгліколь або його похідні.

Конкретні природні полімери включають лактозу, амілозу, декстран, глікоген або їхні похідні. "Похідні" у даному контексті включають реакційноздатні похідні, наприклад, тіол-вибіркові реакційноздатні групи, такі як малеїіміди тощо. Реакційноздатна група може бути зв'язана з полімером прямо або через лінкер. Очевидно, зрозуміло, що в деяких випадках така група буде утворювати частину продукту у вигляді єднальної групи між фрагментом антитіла і полімером.

Розмір полімеру може варіювати, як бажано, але як правило, буде мати середню молекулярну масу в межах від 500 Да до 50000 Да, переважно від 5000 Да до 40000 Да і переважніше від 20000 Да до 40000 Да. Розмір полімеру, зокрема, може бути вибраний на основі передбачуваного застосування продукту, наприклад, з урахуванням здатності локалізуватися у визначених тканинах, таких як пухлини, і подовження часу напівжиття в кровотоці (дивися огляд Спартап, 2002, Адмапсей Огид

Оеєїїмегу Веміємв, 54:531-545). Так, наприклад, у тих випадках, коли передбачається, щоб продукт видалявся з кровотоку і проникав у тканини, наприклад, при лікуванні пухлини, то може бути переважним використовувати полімер із низькою молекулярною масою, наприклад, з молекулярною масою приблизно 5000 Да. Для застосувань, при яких потрібно, щоб продукт залишався в кровотоці, то може переважним використовувати полімер із вищою молекулярною масою, наприклад, із молекулярною масою в межах від 20000 Да до 40000 Да.

Особливо переважні полімери включають поліалкілен, такий як поліетиленгліколь, або, зокрема, метоксиполієтиленгліколь або його похідне, і, зокрема, із молекулярною масою в межах приблизно від 15000 Да до приблизно 40000 Да.

Переважно антитіло, похідне антитіла або фрагмент антитіла за даним винаходом, у тому числі, антитіло або фрагмент зі зниженою ефекторною функцією, були з'єднані з поліалкіленом, зокрема, поліетиленгліколем (скорочено в даному документі ПЕГом) або його похідним. У деяких варіантах здійснення антитіло, похідне антитіла або фрагмент антитіла за даним винаходом являє фрагмент антитіла, який є ЕРар'- або Е(аб')»-фрагментом або похідним, який з'єднаний із ПЕГом за важким ланцюгом або легким ланцюгом, або обома разом. Даний ЕРаБр'- або Е(аб')з»-фрагмент може бути людським або гуманізованим.

Отже, у деяких варіантах здійснення даного винаходу анти-СО154-антитіла за даним винаходом є антитілами, які модифіковані ковалентним приєднанням функціональних груп, таких як водорозчинні полімери, наприклад, полієтиленгліколь, співполімери поліетиленгліколю і поліпропіленгліколю, карбоксиметилцелюлоза, декстран, полівініловий спирт, полівінілліролідон або поліпролін - про які всім відомо, що вони мають більш довгий час напівжиття в крові після внутрішньовенного введення у порівнянні з відповідними немодифікованими білками. Дивися, наприклад, Ариспому»кКі еї аї., 1981. У "Епгутевз аз ЮОгид5", НоїІсепрегу еї аї. (єд.), 1981. УМіеу-Іпіегзсіепсе, Мем/ МоїКк, ММ, 367-383, 1981;

Апдегзоп МУ.Р., 1992, Нитап Сепе ТНегару. Зсіепсе, 256:808-813; Мемлтаг!к еї аї., 1982, 9. Аррі.

Віоспет., 4:185-189; Каїге єї аї., 1987, Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА, 84:1487-1491.

У деяких варіантах здійснення антитіла за даним винаходом являють антитіла, з'єднані з функціональними групами, такими як поліетиленгліколь (ПЕГ). В одному конкретному варіанті здійснення антитіло являє фрагмент антитіла, і молекули ПЕГу можна приєднати через будь-який доступний бічний ланцюг амінокислоти або кінцеву функціональну групу амінокислоти, розташовану у фрагменті антитіла, наприклад, будь-яку вільну групу, таку як аміно, іміно, тіол, гідроксил або карбоксил. Такі амінокислоти можуть природно знаходитися у фрагменті антитіла або їх можна ввести у фрагмент із використанням методів рекомбінантної ДНК (дивися, наприклад, патент США Мо

5219996; патент США Мо 5667425; заявка ММО 98/25971). В інших варіантах здійснення Гар-фрагмент за даним винаходом модифікують додаванням однієї або більше амінокислот до С-кінця його важкого ланцюга для забезпечення приєднання функціональної групи. Переважно додаткові амінокислоти утворять модифіковану шарнірну ділянку, що містить один або більше залишків цистеїну, до яких можна приєднати функціональну групу. Можна використовувати безліч сайтів для приєднання однієї або більше молекул ПЕГУ.

У деяких аспектах даного винаходу молекули ПЕГу ковалентно зв'язані через тіольну групу, принаймні, одного залишку цистеїну, що знаходиться у фрагменті антитіла за даним винаходом.

Кожна молекула ПЕГу, приєднана до модифікованого фрагмента антитіла, може бути ковалентно зв'язана з атомом сірки залишку цистеїну у фрагменті. Як правило, ковалентний зв'язок буде являти дисульфідний зв'язок або, зокрема, зв'язок сірка-вуглець. У тому випадку, коли використовується тіольна група як місце приєднання відповідним чином активованих груп, наприклад, тіол-вибіркових похідних, таких як малеїміди, то можна використовувати похідні цистеїну. Активований ПЕГ можна використовувати як вихідну речовину в одержанні модифікованих ПЕГом фрагментів антитіла, як описано вище. Активований ПЕГ може бути будь-яким ПЕГом, що містить тіольну реакційноздатну групу, таку як о-галогенкарбонова кислота або ефір, наприклад, йодацетамід, імід, наприклад, малеїмід, вінілсульфон або дисульфід. У деяких варіантах здійснення кон'югат анти-СО154-антитіла може містити дві молекули ПЕГу з двома молекулами малеїіміду. Вихідні речовини можна одержати з комерційних джерел (наприклад, від МеКіаг, колишня назва Зпеагмаїег Роїутегв Іпс., НипібвміПе, АГ,

США) або можна приготувати з промислово доступних сполук із використанням звичайних хімічних реакцій. Конкретні молекули ПЕГу включають 20К метокси-ПЕГ-амін (виробництва Мекіаг, колишня назва Зпеагмайег; Карр Роїутеге; і З!ипВіо) і М-ПЕГ-5РА (виробництва МекКіаг, колишня назва зЗпеагмагег).

В одному переважному варіанті здійснення антитіло за винаходом являє модифікований Еар- фрагмент, який ПЕГільований, тобто містить ПЕГ (поліетиленгліколь), ковалентно приєднаний до нього, наприклад, з використанням методу, описаного в ЕР 0948544 (також дивися "Роу(еїпуіІепедіусої) Спетівгу, Віоїесппіса! апа Віотеадіса! Арріїсайопв5", 1992, У. Мійоп Наїтіз (ед),

Рієпит Ргевз5, Мем МогїКк, "Роїу(еїпуіІепедіусої) Спетівігу, ВіоїесНнпіса! апа Віотевдісаї Арріїісайопв", 1997,

У. Мікп Наїгтіз апа 5. 7аїїрзКу (ед5), Атегісап Спетіса! Зосієїу, Умазпіпоїоп ОС і "Віосопійдайоп Ргоїеїп

Соцріїпа Тесппіднев Тог Те Віотеадаіса! бсіепсе5", 1998, М. Авіат апа А. Оепі, Стоме РибіїзНетв5, Мем хо; Спартап А., 2002, Адмапсед Опша Овєїїмегу Веміємв5, 2002, 54:531-545). В одному прикладі ПЕГ приєднується до цистеїну в шарнірній ділянці. В іншому прикладі модифікований ПЕГом Бар-фрагмент містить малеїмід, ковалентно зв'язаний з однією тіольною групою в модифікованій шарнірній ділянці.

Залишок лізину можна ковалентно зв'язати з малеіїмідною групою, і до кожної аміногрупи в залишку лізину можна приєднати метоксиполіетиленгліколь із молекулярною масою приблизно 20000 Да.

Отже, загальна молекулярна маса ПЕГу, приєднаного до Раб-фрагмента, може складати приблизно 40000 Да.

В іншому варіанті здійснення функціональна група являє ПЕГ, і його приєднують із використанням методів, описаних у заявках УМО 98/25971 ії УМО 04/72116, за допомогою яких лізил-малеїмід приєднують до залишку цистеїну в С-кінці важкого ланцюга, і будь-яку аміногрупу лізилового залишку ковалентно зв'язують із залишком метоксиполіетиленгліколю з молекулярною масою приблизно 20000

Да. Отже, загальна молекулярна маса ПЕГУу, приєднаного до антитіла, складає приблизно 40000 Да.

У ще одному варіанті здійснення функціональна група являє ПЕГ, і його приєднують до Е(аб)»г- фрагмента з використанням методів, описаних у заявках УМО 98/25971 і УМО 04/072116, за допомогою яких лізил-дималеїмід з'єднується з залишком цистеїну в С-кінці важкого ланцюга і кожна аміногрупа лізилового залишку ковалентно зв'язується з залишком метоксиполіетиленгліколю з молекулярною масою приблизно 20000 Да. Отже, загальна молекулярна маса ПЕГу, приєднаного до (аб)г- фрагмента, складає приблизно 40000 Да.

У деяких варіантах здійснення даного винаходу антитіло за даним винаходом являє Еар'- фрагмент, який може бути повністю людським або гуманізованим, і він ПЕГільований або за важким ланцюгом, або за легким ланцюгом, або за обома ланцюгами. В інших варіантах здійснення фрагмент антитіла, який може бути повністю людським або гуманізованим, ПЕГільований за одним або обома важкими ланцюгами, за одним або обома легкими ланцюгами, за важким і легким ланцюгами.

Отже, у деяких варіантах здійснення анти-СО154-антитіло являє зв'язане з ПЕГом антитіло (наприклад, зв'язане з ПЕГом людське антитіло), де ПЕГ зв'язаний з антитілом за залишком цистеїну або залишком лізину. У деяких варіантах здійснення ПЕГільоване анти-СО154-антитіло має гідродинамічну масу, принаймні, 24 кДа. В інших варіантах здійснення ПЕГ може варіювати за масою в межах від 20 до 60 кДа (включно). У додаткових варіантах здійснення зв'язане з ПЕГом анти-СО154- антитіло має гідродинамічну масу, принаймні, 200 кДа. У варіантах здійснення даного винаходу, коли анти-СО154-антитіло зв'язане з ПЕГом, то ПЕГільоване анти-СО154-антитіло може мати підвищений час напівжиття в умовах іп мімо у порівнянні з антитілом, в якому відсутній ПЕГ.

У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується СО154-зв'язувального білка, що містить послідовність легкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО:15 і послідовність важкого ланцюга ЗЕО ІЮО МО:13, де білок є ПЕГільованим.

Інші функціональні групи, які можуть бути придатними для підвищення цілісності та існування антитіл за даним винаходом в умовах іп мімо, включають поліпептиди. Наприклад, анти-СО154- антитіла або фрагменти антитіл за даним винаходом можна модифікувати для включення поліпептиду людського сироваткового альбуміну (НБА). Такий кон'югат антитіла може мати підвищену стабільність і підвищений час напівжиття в сироватці крові у порівнянні з некон'югованим антитілом або антигензв'язувальним фрагментом. Наприклад, у деяких варіантах здійснення анти-СО154-антитіло, кон'юговане з НА, може мати підвищений час напівжиття в умовах іп мімо у порівнянні з некон'югованим анти-СО154-антитілом. Час напівжиття (час їо- або Ір-напівжиття) кон'югованого з

НАЗВ антитіла може бути вищим на 10 95, 20 Фв, 30 Фо, 40 Фо, 50 95 або більше. Час іс-напівжиття може знаходитися, наприклад, у межах від 0,25 хв до 12 г, у той час як час Ір-напівжиття складає, наприклад, 12-48 г. Переважно час їо- або ІрД-напівжиття може дорівнювати, принаймні, З доби, принаймні, 7 діб, принаймні, 14 діб, принаймні, 21 добу, принаймні, 28 діб, принаймні, 1 місяць або більше.

У деяких варіантах здійснення даного винаходу анти-СО154-антитіла за даним винаходом являють антитіла, модифіковані функціональною групою, міченням детектованою міткою, наприклад, радіоактивним ізотопом, ферментом, барвником або біотином, або іншим афінним реагентом.

У деяких варіантах здійснення даного винаходу анти-СО154-антитіла за даним винаходом являють антитіла, модифіковані функціональною групою, кон'югуванням із терапевтичним агентом, наприклад, радіоїзотопом або радіонуклідом (наприклад, "п або 90), із токсином (наприклад, правцевим токсоїдом або рицином), з токсоїдом або хіміотерапевтичним засобом (патент США Мо 6307026).

У деяких варіантах здійснення даного винаходу анти-СО154-антитіла за даним винаходом є антитілами, модифікованими кон'югацією з візуалізуючим агентом. Візуалізувальні агенти можуть включати, наприклад, групу для мічення (наприклад, біотин, флуоресцентні групи, радіоактивні групи, гістидинову мітку або тус-мітку або інші пептидні мітки) для спрощення або виділення детектування.

Додаткові приклади функціональних груп для модифікації або кон'югації анти-СО154-антитіл за винаходом можуть включати серотоксини або цитотоксичні речовини, у тому числі, будь-яку речовину, яка чинить руйнівну дію на клітини (тобто призводить до їхньої загибелі). Приклади включають комбрестатини, доластатини, епотилони, стауроспорин, маїтанзиноїди, спонгістатини, ризоксин, галіхондрини, роридини, геміастерліни, таксол, цитохалазин В, граміцидин 0, етидій бромід, еметин, мітоміцин, етопозид, тенопозид, вінкристин, вінбластин, колхіцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дигідроксіантрациндіон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин, р, 1-дегідротестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, тетракаїн, лідокаїн, пропранолол і пуроміцин та їхні аналоги або гомологи.

Функціональні групи, придатні для кон'югації, включають, але не обмежуються цим, антифолати (наприклад, аміноптерин і метотрексат), антиметаболіти (наприклад, метотрексат, б-меркаптопурин, б-тіогуанін, цитарабін, 5-фторурацил, декарбазин), алкілуючі агенти (наприклад, меклоретамін, тіоєпа хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (В5МШ) і ломустин (ССМО), циклофосфамід, бусульфан, дибромманіт, стрептозотоцин, мітоміцин С и цис-дихлордіамін платини (Ії) (ОР) цисплатин), антрацикліни (наприклад, даунорубіцин (раніше називався дауноміцином) і доксорубіцин), антибіотики (наприклад, дактиноміцин (раніше називався актиноміцином), блеоміцин, мітраміцин, антраміцин (АМС), каліхеаміцини або даунокарміцини, СС-1065, енедієни, неокарзиностатин) і антимітотичні речовини (наприклад, вінкристин і вінбластин). Більш детально дивися Сагпеїй, 2001, Адмапсей Огид

Оеєїїмегу Неміємув, 53:171-216.

Інші функціональні групи можуть включати хелатовані радіонукліди, такі як "91, па вом, | ци, вісмут-"З, каліфорнійг»2, іридій"»!, тунгстен'в88/реній!88, гЛластатин; або лікарські засоби, такі, але не обмежуючись цим, алкілфосфохоліни, інгібітори топоізомерази І, токсоїди і сурамін.

Додаткові функціональні групи включають білки, пептиди і ферменти. Ферменти, що цікавлять, включають, не обмежуючись цим, протеолітичні ферменти, гідролази, ліази, ізомерази, трансферази.

Білки, поліпептиди і пептиди, що цікавлять, включають, не обмежуючись цим, імуноглобуліни, токсини, такі як абрин, рицин А, екзотоксин Рзхендотопах або дифтерійний токсин, маїтанзиноїди (наприклад, не обмежуючись цим, ЮОМ'І), білок, такий як інсулін, фактор некрозу пухлин, со-інтерферон, р- інтерферон, фактор росту нервів, тромбоцитарний фактор росту або активатор тканинного плазміногену, тромботичний агент або антиангіогенна речовина, наприклад, ангіостатин або ендостатин, ангіогенін, гелонін, долстатини, речовини, що зв'язується з мінорною борозною, біс- ідофенольний іприт, або модифікатор біологічної реакції у відповідь, такий як лімфокін, інтерлейкін-1 (І/-1), інтерлейкін-2 (І/-2), інтерлейкін-б6 (1/-6), колонієстимулювальний фактор гранулоцитів- макрофагів (ЗМ-С5Е), колонієстимулювальний фактор гранулоцитів (3-С5Е), фактор росту нервів (МОБ) або інший ростовий фактор.

Інші функціональні групи можуть включати детектовані сполуки, придатні, наприклад, для діагностики. Приклади детектованих сполук включають різні ферменти, простетичні групи, флуоресцентні сполуки, люмінесцентні сполуки, біолюмінесцентні сполуки, радіонукліди, метали, що випускають позитрони (для застосування в позитронно-емісійній томографії) та іони нерадіоактивних парамагнітних металів. Загальну інформацію про іони металів, які можна кон'югувати з антитілами для застосування в діагностиці, дивися в патенті США Мо 4741900. Придатні ферменти включають пероксидазу з хрону, лужну фосфатазу, бета-галактозидазу або ацетилхолінестеразу; придатні простетичні групи включають стрептавідин, авідин і біотин; придатні флуоресцентні сполуки включають умбеліферон, флуоресцеїн, флуоресцеїн ізотіоціанат, родамін, дихлортриазиніламін флуоресцеїн, данзилхлорид і фікоеритрин; придатні люмінесцентні сполуки включають люмінол; придатні біолюмінесцентні сполуки включають люциферазу, люциферин і екворин; і придатні радіонукліди включають "251, 191|, 111Іп і 99То.

Нуклеїнові кислоти

У деяких аспектах даний винахід стосується нуклеїновим кислот, що кодують СО154-зв'язувальні білки, наприклад, анти-СО154-антитіла, за даним винаходом.

Отже, у деяких варіантах здійснення даний винахід стосується молекули виділеної, рекомбінантної іМабо синтетичної ДНК, яка містить одну або більше послідовностей, вибраних із групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО:16, 5ЕО ІЮ МО:17, 5ЕО ІЮ МО:18, 5ЕО ІЮ МО:19, 5ЕО ІЮ МО:20, 5ЕО ІВ

МО:21, 5ЕО ІЮ МО:22, 5ЕО ІЮ МО:23, 5ЕО ІЮ МО 24, 5ЕО ІЮ МОс:25, 5ЕО ІЮ МОС26, ЗЕО ІЮ МО:с27,

ЗЕО ІЮ МО:28, 5ЕО І МО:31, БО ІЮ МО:32, ЗЕО І МО:33, 5ЕО І МО:34, 5ЕО 10 МО:А41, 5ЕО 10

МО:55, ЗЕО ІЮ МО:57, ЗЕО ІЮ МО:59, 5БЕО ІЮ МО:61, ЗЕО ІЮ МО:67, ЗЕО ІЮ МО:70 і БЕО ІО МО:73.

У ще одному аспекті в заявці описується виділена нуклеїнова кислота, яка містить одну або більше послідовностей, яка кодує поліпептид, що включає послідовність, принаймні, на 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 і 100 95 ідентичну послідовності варіабельного домену 5ЕО ІЮ МО:1, 5ЕО ІЮ МО:2, ЗЕО

ІО МО:9, 5ЕО 10 МО:10, 5ЕО ІО МО: 11, 5ЕО ІЮ МО:14, 5ЕО ІЮ МО:29, 5ЕО І МО:30, 5ЕО ІЮ МО:54,

ЗЕО ІЮ МО:56, ЗЕО ІЮ МО:58 або 5ЕО ІЮ МО:60, або послідовності, яка гібридизується (наприклад, у жорстких умовах) з нуклеїновою кислотою, що кодує послідовність варіабельного домену ЗЕО ІЮ

МО:1, 5ЕО ІО МО:9, 5ЕО ІЮ МО:10, 5ЕО ІЮ МО-11, 5ЕО ІЮ МО:29, ЗЕО ІО МО:56 або 5ЕО ІЮ МО:60.

Нуклеїнові кислоти за винаходом можуть додатково містити регуляторні послідовності (наприклад, промоторну послідовність, нетрансльовану 5'-ділянку і нетрансльовану 3'-ділянку) і/або векторні послідовності. Наприклад, нуклеїнова кислота складає вектор. У ще одних додаткових варіантах здійснення винахід стосується клітини-хазяїна, що містить вектор. Клітина-хазяїн може продукувати антитіло таким чином, що антитіло виявляє знижене глікозилювання або його відсутність (наприклад, якщо є Ес-ділянка).

Також даний винахід стосується варіантів послідовностей нуклеїнових кислот, описаних вище.

Наприклад, даний винахід включає послідовності нуклеїнових кислот, що приблизно на 75 95, приблизно на 80 95, приблизно на 85 95, приблизно на 90 95, приблизно на 91 95, приблизно на 92 95, приблизно на 93 95, приблизно на 94 95, приблизно на 95 95, приблизно на 96 95, приблизно на 97 95, приблизно на 98595, приблизно на 9995, 99,595, 99,995 або 10095 ідентичні будь-якій із послідовностей, наведених у даному документі, включаючи їхні фрагменти і комплементарні їм послідовності. Також даний винахід включає нуклеїнові кислоти, що відрізняються від конкретних послідовностей, наведених у даному документі, у результаті виродженості генетичного коду.

Крім того, даний винахід включає послідовності, що специфічно гібридизуються з будь-якою з нуклеїнових кислот, наведених у даному документі. Термін "специфічно гібридизуються" стосується здатності послідовності нуклеїнової кислоти гібридизуватися, принаймні, з 12, 15, 20 25, 30, 35, 40, 45, або 100 послідовними нуклеотидами в послідовності, наведеної в даному документі, або послідовності, комплементарної до неї, таким чином, що вона має менше ніж 15 95, переважно менше ніж 10 95 їі переважніше менше ніж 5 95 фонової гібридизації з контрольною нуклеїновою кислотою (наприклад, неспецифічною ДНК або ДНК іншою, ніж конкретна послідовність антитіла, наведена в даному документі). Для детектування специфічної гібридизації можна використовувати різні умови гібридизації, і жорсткість визначається, головним чином, умовами на стадії промивання при гібридизації. Як правило, висока температура і низька концентрація солей забезпечують високу жорсткість, у той час як низька температура і висока концентрація солей забезпечують низьку жорсткість. Гібридизація в умовах низької жорсткості досягається промиванням, наприклад, приблизно при 2,0 х 55С при 502С, і висока жорсткість забезпечується приблизно при 0,2 х 55С при 5026.

Нуклеїнові кислоти, що кодують СО154-зв'язувальні білки за даним винаходом, можуть містити лідерну або сигнальну послідовності. Лідерна або сигнальна послідовність можуть варіювати і можуть бути заміщені альтернативною лідерною послідовністю і, мабуть, зрозуміло, що в деяких варіантах здійснення СО154-зв'язувальні білки за даним винаходом містять послідовності без лідерної послідовності. Можна використовувати будь-яку альтернативну лідерну або сигнальну послідовність.

Клітини-хазяїни

Даний винахід стосується клітин-хазяїнів, сконструйованих для експресії будь-якої з молекул ДНК,

наведених на фіг.2-8, 10, 11 ії 13-16, включаючи варіанти послідовностей.

Також забезпечуються клітини-хазяїни, що експресують СО154-зв'язувальні білки, наприклад, анти-СО154-антитіла, за даним винаходом. Зв'язувальний білок або антитіло може містити тільки один ланцюг, тоді в такому випадку необхідно використовувати тільки послідовність ДНК, що кодує поліпептид даного ланцюга, для трансфекції клітин. Для продукції антитіл, що містять два ланцюги, клітинну лінію можна трансфектувати двома векторами. Альтернативно, коли це є придатним, один вектор може кодувати послідовності обох ланцюгів, наприклад, легкий і важкий ланцюг анти-СО154- антитіла, і варіації залежно від конкретної структури антитіла, яке необхідно експресувати. Клітина- хазяїн може являти собою, наприклад, прокаріотичні клітини, такі як Е. соїї, або інші мікробні клітини, або еукаріотичні клітини, включаючи, не обмежуючись цим, клітини ссавців, такі як клітини людини, миші, мавпи, кролика, кози, хом'яка або щура, клітини комах, клітини птахів, клітини рослин і клітини нижчих еукаріотів, такі як клітини грибів (дивися нижче). Очевидно, зрозуміло, що організація клітини- хазяїна відповідальна за глікозилювання рекомбінантно експресованих білків і, таким чином, можна вибрати конкретні профілі глікозилювання для подальшої зміни ефекторної функції антитіл за винаходом.

У деяких варіантах здійснення даного винаходу клітини-хазяїни, придатні для практики винаходу, можуть являти, наприклад, (1) бактеріальні клітини, такі як Е. соїї, Сашобрасіег сгезсепійв, 5 Геріососсі, егарпуЇососсі, види бігеріотусез і клітини Васійи5 5,иБій5, і ЗаітопеїЇа їурпітигічт; (2) клітини грибів і клітини Азрегаїи5, дріжджові клітини, такі як Засспаготусев сегемізіає, Зспі2гозасспаготусез ротрбе,

Ріспіа равіогі5, Ріспіа теїПпапоїїса, інші види Ріспіа, К. Іасіїв; (3) лінії клітин комах, такі як з 5родоріега їгидірегда - наприклад, клітинні лінії 509 і 5021, і клітини ехрге55Е "М (Ргоїєїп бсіепсев5 Согр., Мегідап,

СТ, США) - клітини Огозорпійа 52 і клітини Тгіспоріивіа пі Ніпд Еїме (Іпмігодеп, Сагі5райд, СА, США); (4) клітини або ссавців (5) рослинні клітини.

Отже, СО154-зв'язувальні білки, наприклад, анти-СО154-антитіла, за даним винаходом можна продукувати у будь-яких доступних прокаріотичних або еукаріотичних клітинах-хазяях, які можна змінити для експресії екзогенних послідовностей нуклеїнових кислот. Нижчі еукаріотичні клітини- хазяїни, які можна використовувати для продукції анти-СО154-антитіл за даним винаходом, включають клітини, описані в даній галузі (дивися, наприклад, МО 01/00879, МО 03/056914, УМО 04/074498, М/О 04/074499, Сної єї аї., 2003, РМАБ5, 100:5022-5027; Натійоп єї аї., 2003, Майшге, 301:1244-1246 і Вобгомісл еї а!., 2004, СіІусобіоіоду, 14:757-766).

Типові клітини ссавців включають клітини СО51 і СО57, клітини яєчника китайських хом'яків (СНО), клітини мієломи М50, клітини МІН 313, клітини 293, клітини НЕРС2, клітини НеГа, С127, 33,

ВНК, клітини меланоми Вомжев, клітини Ї, МОСК, НЕК293, УМІЗ38, лінії мишачих клітин ЕЗ (наприклад, штами 129/5М, С57/8І 6, ОВА-1, 129/54), К562, клітини УигКкаї і ВУУ5147. Таким чином, винахід стосується клітин, які експресують антитіла за даним винаходом, включаючи, не обмежуючись цим, гібридомні клітини, В-клітини, плазматичні клітини, а також клітини-хазяїни ссавців і людини, модифіковані рекомбінантним шляхом для експресії антитіл за даним винаходом (наприклад, ембріональні стовбурні клітини). Добре відомі інші лінії клітин ссавців і вони легко доступні з

Американської колекції типових культур (АТСС") (Мапазза5, МА, США) ї Національного інституту загальних медичних досліджень (МІЗМС), Генетичного сховища клітин людини при сховищі клітин

Согієї!!ї (Сатаеєп, ММ, США). Дані типи клітин наводяться тільки як приклад, і даний перелік не є вичерпним переліком.

Серед інших положень, деякі з яких уже згадувалися вище, клітину-хазяїна можна вибрати з урахуванням її здатності бажаним чином процесувати експресовані анти-СО154-антитіла. На додаток до модифікованого глікозилювання та аглікозилювання такі післятрансляційні модифікації поліпептиду включають, не обмежуючись цим, ацетилування, карбоксилування, карбоксиметилування, фосфорилування, ліпідування та ацилування.

У ще одному варіанті здійснення даного винаходу анти-СО154-антитіла за даним винаходом одержують трансляцією в безклітинній системі або синтезом в умовах іп міїго. Гени, які кодують дані білки, можна синтезувати в умовах іп міїго.

У ще одному варіанті здійснення анти-СО154-антитіла за даним винаходом одержують у біореакторах, які містять клітини, що експресують антитіла, для проведення великомасштабної продукції.

В іншому варіанті здійснення СО154-зв'язувальні білки або анти-СО154-антитіла за даним винаходом одержують із використанням генно-інженерних або трансгенних ссавців (наприклад, кіз, корів, овець), що експресують антитіло в молоко для продукції анти-СО154-антитіл у великих кількостях (патент США Ме 5827690; Роїоск еї а!., 1999, У. Іттипої. Мет., 231(1-2):147-57).

Терапевтичні способи

В одному варіанті здійснення даного винаходу СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-

СОр154-антитіло, або фармацевтична композиція, що містить антитіло, здатна інгібувати імунну відповідь у суб'єкта. Антитіло за даним винаходом або фармацевтичну композицію за винаходом вводять суб'єкту в ефективній інгібуючій кількості.

У деяких варіантах здійснення "ефективна інгібуюча кількість" анти-СО154-антитіла або фармацевтичної композиції, що містить антитіло, є будь-якою кількістю, яка ефективна для інгібування взаємодії СО154-С040 у суб'єкта, якому їх вводять. Способи визначення "Іінгібуючої кількості" добре відомі фахівцям у даній галузі, і вона залежить від факторів, включаючи, не обмежуючись цим, тип суб'єкта, який піддається лікуванню, масу і вік суб'єкта, і фармакокінетичні властивості конкретного терапевтичного агента, який вводять.

В іншому конкретному варіанті здійснення даного винаходу СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-СО154-антитіло, або фармацевтична композиція, що містить антитіло, здатна інгібувати імунну відповідь за допомогою інгібування взаємодії СО154-С040.

У ще одному конкретному варіанті здійснення даного винаходу СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-СО154-антитіло, або фармацевтична композиція, що містить антитіло, здатні інгібувати запалення. Для цілей даного винаходу запальні реакції характеризуються почервонінням, набряканням, жаром і болем, унаслідок розширення капілярів із набряком і міграцією фагоцитуючих лейкоцитів. Деякі приклади запальних реакцій включають: артрит, контактний дерматит, гіпер-ІДЕ- синдром, запальне захворювання кишечнику, алергічну астму та ідіопатичне запальне захворювання.

Ідіопатичне запальне захворювання, наприклад, включає псоріаз і вовчак (наприклад, системний червоний вовчак (5ГЕ), індукований лікарським засобом червоний вовчак і вовчак з ураженням нирок).

Дивися, наприклад, Саїйп, 1989, Еипаатепаї! Іттипоіоду, СНарієг 26, Вамеп Ргезз, 2а Еа., рр. 721- 733, Мем/ ХогкК. Даний винахід стосується способу лікування або профілактики симптому системного червоного вовчака (5Е) в індивідуума, де спосіб включає введення моновалентного СО154- зв'язувального білка, наприклад, моновалентного анти-СО154-антитіла, індивідууму в кількості, ефективній для лікування або профілактики симптому І Е.

Деякі приклади артриту включають: ревматоїдний артрит, неревматоїдний запальний артрит, артрит, асоційований із хворобою Ліма, і запальний остеоартрит. Деякі приклади ідіопатичного запального захворювання включають: псоріаз і системний вовчак.

В одному варіанті здійснення даного винаходу анти-СО154-антитіло або фармацевтична композиція, що містить антитіло, здатна інгібувати відторгнення трансплантованого органа в суб'єкта.

У конкретнішому варіанті здійснення даного винаходу СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-СО154-антитіло, за даним винаходом або фармацевтична композиція, що містить антитіло, здатні інгібувати відторгнення трансплантованого серця, нирок, шкіри, острівців Лангерганса підшлункової залози або кісткового мозку в суб'єкта.

В одному варіанті здійснення даного винаходу СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-

Ср154-антитіло, або фармацевтична композиція, що містить антитіло, здатні пригнічувати синдром трансплантат проти хазяїна в суб'єкта.

В одному варіанті здійснення даного винаходу СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-

СОр154-антитіло, або фармацевтична композиція, що містить антитіло, здатні інгібувати алергічні реакції в суб'єкта -- наприклад, сінну лихоманку або алергію на пеніцилін або інші лікарські засоби.

В одному варіанті здійснення даного винаходу СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-

Ср154-антитіло, за даним винаходом, або фармацевтична композиція, що містить антитіло, здатні інгібувати автоїмунну реакцію в суб'єкта, що страждає на автоїмунне захворювання. У деяких варіантах здійснення автоіїмунна реакція асоційована з або виникає в результаті стану, вибраного з групи, що складається з ревматоїдного артриту, важкої псевдопаралітичної міастенії, системного червоного вовчака, хвороби Граве, ідіопатичної тромбоцитопенічної пурпури, гемолітичної анемії, цукрового діабету, запального захворювання кишечнику, хвороби Крона, розсіяного склерозу, псоріазу, індукованих лікарськими засобами автоїмунних захворювань або індукованого лікарським засобом вовчака. У деяких варіантах здійснення автоїмунна реакція зв'язана з або виникає в результаті системного червоного вовчака.

В одному варіанті здійснення даного винаходу СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-

Ср154-антитіло, за даним винаходом, або фармацевтична композиція, що містить антитіло, здатні інгібувати автоіїмунну реакцію в суб'єкта, що страждає на автоїмунну реакцію в результаті інфекційного захворювання.

В одному варіанті здійснення даного винаходу СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-

Ср154-антитіло, за даним винаходом або фармацевтична композиція, що містить антитіло, здатні інгібувати автоїмунну реакцію в суб'єкта, що страждає на автоїмунну реакцію в результаті синдрому

Рейтера, спондилоартриту, хвороби Ліма, ВІЛ-інфекції, сифілісу або туберкульозу.

В одному варіанті здійснення даного винаходу СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-

Ср154-антитіло, за даним винаходом або фармацевтична композиція, що містить антитіло, здатний інгібувати фіброз у суб'єкта.

Деякі приклади фіброзу включають: фіброз або фіброзне захворювання легень. Деякі приклади фіброзу легень включають: фіброз легень, вторинний респіраторний дистрес-синдром у дорослих, індукований лікарськими засобами фіброз легень, ідіопатичний фіброз легень або пневмонію при гіперчутливості. Деякі приклади фіброзних захворювань включають: гепатит С, гепатит В, цироз, цироз печінки, вторинний до токсичного ураження, цироз печінки, вторинний до токсичної дії лікарських засобів, цироз печінки, вторинний до вірусної інфекції, ії цироз печінки, вторинний до автоїмунного захворювання.

В одному варіанті здійснення даного винаходу СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-

Ср154-антитіло, за даним винаходом, або фармацевтична композиція, що містить антитіло, здатні інгібувати шлунково-кишкове захворювання. Деякі приклади шлунково-кишкових захворювань включають: дискінезію стравоходу, запальне захворювання кишечнику (включаючи хворобу Крона і виразковий коліт), гастрит, колагенозний коліт (включаючи лімфоцитарний коліт і мікроскопічний коліт), целіакію (так звану глютенову ентеропатію, спру-целіакю або глютенову недостатність) і склеродерму.

В одному варіанті здійснення даного винаходу СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-

Ср154-антитіло, за даним винаходом або фармацевтична композиція, що містить антитіло, здатні інгібувати судинне захворювання. Деякі приклади судинного захворювання включають: атеросклероз, захворювання ниркових артерій, лімфедему, ішемічні порушення і порушення при реперфузії. Також сюди входять комплексні судинні/мунні захворювання, такі як системний червоний вовчак або кріоглобулінемія.

В одному варіанті здійснення даного винаходу СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-

Ср154-антитіло, за даним винаходом або фармацевтична композиція, що містить антитіло, здатні інгібувати проліферацію пухлинних Т-клітин у суб'єкта що страждає на Т-клітинне злоякісне захворювання, наприклад, Т-клітинну лейкемію або лімфому. Таке анти-СО154-антитіло або фармацевтичну композицію, що містить антитіло, можна вводити суб'єкту в кількості, ефективній для інгібування проліферації Т-клітинних злоякісних захворювань у даного суб'єкта.

В одному варіанті здійснення даного винаходу СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-

Ср154-антитіло, за даним винаходом або фармацевтична композиція, що містить антитіло, здатні інгібувати вірусну інфекцію Т-клітин у суб'єкта, викликану людським Т-лімфотропним вірусом типу 1 (НТІМ І). Таке анти-СО154-антитіло або фармацевтичну композицію, що містить антитіло, можна вводити суб'єкту в кількості, ефективній для інгібування вірусної інфекції.

В одному варіанті здійснення даного винаходу СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-

Ср154-антитіло, за даним винаходом або фармацевтична композиція, що містить антитіло, здатні забезпечувати візуалізацію пухлинних клітин або неопластичних клітин у суб'єкта, які експресують білок СО154, з яким специфічно зв'язується антитіло за даним винаходом. Спосіб візуалізації пухлинних клітин або неопластичних клітин у суб'єкта включає стадії: введення суб'єкту ефективної кількості анти-СО154-антитіла за даним винаходом або фармацевтичної композиції, що містить його, в умовах, що дозволяють утворюватися комплексу між антитілом і білком на поверхні пухлинних клітин або неопластичних клітин; і візуалізації будь-якого комплексу антитіло/білок, що утворився, із візуалізацією таким чином будь-яких пухлинних клітин або неопластичних клітин у суб'єкта.

В одному варіанті здійснення даного винаходу СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-

Ср154-антитіло, за даним винаходом або фармацевтична композиція, що містить антитіло, здатна детектувати наявність пухлинних клітин або неопластичних клітин у суб'єкта, які експресують білок

СО154, з яким специфічно зв'язується антитіло за даним винаходом. Один такий спосіб детектування наявності пухлинних клітин або неопластичних клітин у суб'єкта включає стадії: уведення суб'єкту ефективної кількості анти-СО154-антитіла за даним винаходом або фармацевтичної композиції, що містить його, в умовах, що дозволяють утворитися комплексу між антитілом і білком; видалення будь- якого незв'язаного агента, що візуалізується, з організму суб'єкта; і детектування наявності будь-якого комплексу антитіло/білок, що утворився, де наявність такого комплексу вказує на наявність пухлинних клітин або неопластичних клітин у суб'єкта.

Фармацевтичні композиції

Даний винахід стосується фармацевтичних композицій, що містять СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-СО154-антитіло, описані в даному винаході.

В одному варіанті здійснення даного винаходу фармацевтична композиція містить, принаймні, один СО154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-СО154-антитіло, за даним винаходом.

В одному варіанті здійснення даного винаходу аглікозильне анти-СО154-антитіло (або інше анти-

Ср154-антитіло зі зниженою ефекторною функцією) за винаходом або фармацевтична композиція, що містить антитіло, здатні зв'язуватися з антигеном СО154 (наприклад, антигеном СО154, що специфічно зв'язується з аглікозильним антитілом Пиб5с8, продукованим клітинною лінією, депонованою в АТСС під інвентарним номером РТА-4931), і де аглікозильне анти-СО154-антитіло характеризується наявністю мутації М2980) (М297 із використанням Б нумерації за Кара)» і який додатково виявляє знижену ефекторну функцію, як неодноразово описано в даному документі.

У деяких варіантах здійснення даного винаходу аглікозильне анти-СО154-антитіло (або інше анти-

СОр154-антитіло зі зниженою ефекторною функцією) або фармацевтична композиція, що містить антитіло, не зв'язуються з ефекторним рецептором. У конкретнішому варіанті здійснення аглікозильне анти-СО154-антитіло або фармацевтична композиція, що містить антитіло, здатні зв'язуватися з білком СО154, що специфічно зв'язується з аглікозильним антитілом пи5с8, продукованим клітинною лінією, депонованою в АТСС під інвентарним номером РТА-4931, і де аглікозильне анти-СО154- антитіло або фармацевтична композиція не зв'язуються з ефекторним рецептором.

У конкретних варіантах здійснення даного винаходу аглікозильне анти-СО154-антитіло (або інше анти-СО154-антитіло зі зниженою ефекторною функцією) або фармацевтична композиція, що містить антитіло, не викликають тромбоз, включаючи тромбоемболічні ускладнення. У конкретнішому варіанті здійснення даного винаходу аглікозильне анти-СО154-антитіло або фармацевтична композиція, що містить антитіло, здатні зв'язуватися з білюм СО154, який специфічно зв'язується з аглікозильним антитілом пи5с8, продукованим клітинною лінією, депонованою в АТСС під інвентарним номером

РТА-4931, і де аглікозильне анти-СО154-антитіло або фармацевтична композиція не викликають тромбоз.

У ще одному варіанті здійснення даного винаходу фармацевтичні композиції можуть додатково містити будь-який один або більше фармацевтично прийнятних носіїв, ад'ювантів, розчинників для доставки, буферів і/або стабілізаторів. Зразкові методи формуляції і введення антитіл за даним винаходом можна знайти, наприклад, у "Кеміпдіоп'є Рпагтасецшііса! 5сіепсев5", Маск Рибіїзпіпд Со.,

ЕаФоп, РА, саме останнє видання.

У конкретнішому варіанті здійснення даного винаходу фармацевтично прийнятний носій являє забуферений фосфатом фізіологічний розчин, фізіологічний розчин, воду, композиції цитрат/сахароза/твін і емульсії - наприклад, емульсії олія/вода.

В одному варіанті здійснення даного винаходу фармацевтичну композицію можна вводити в пристрої для мікроінкапсулювання для того, щоб знизити або попередити імунну відповідь у хазяїна на композицію. Також зв'язувальні агенти, такі як антитіла або фрагменти антитіл за даним винаходом, можна вводити мікроїнкапсулюваннями в мембрані, наприклад, у ліпосомі або іншому носії для інкапсулювання або захисту від імунної системи для доставки.

В одному варіанті здійснення даного винаходу фармацевтична композиція може знаходитися у вигляді стерильного ін'єкційного засобу, наприклад, у вигляді стерильної водної або масляної суспензії для ін'єкцій. Дану суспензію можна формулювати відповідно до методів, відомих у даній галузі, із використанням придатних диспергувальних, змочувальних агентів, і суспендувальних агентів.

В одному варіанті здійснення даного винаходу фармацевтичну композицію можна вводити перорально, місцево або внутрішньовенно. Для системного введення терапевтична композиція повинна бути стерильною, яка по суті не містить пірогенів і в прийнятному для парентерального введення розчині з придатним рн, ізотонічністю і стабільністю. Наприклад, фармацевтичний засіб повинен по суті не містити пірогенних речовин, щоб він був придатним для введення у ролі терапевтичного засобу людині. Дані вимоги відомі фахівцям у даній галузі.

У конкретнішому варіанті здійснення даного винаходу для перорального введення фармацевтичну композицію формулюють у вигляді придатної капсули, таблетки, водної суспензії або розчину. Тверді лікарські форми для перорального введення можуть містити придатні носії або наповнювачі, такі як кукурудзяний крохмаль, желатин, лактозу, аравійську камедь, сахарозу, мікрокристалічну целюлозу, каолін, дикальцій фосфат, кальцій карбонат, хлорид натрію або альгінову кислоту. Розпушувачі, які можна використовувати, включають без обмеження, мікрокристалічну целюлозу, кукурудзяний крохмаль, натрій-крохмаль гліколят і альгінову кислоту. Зв'язувальні речовини для таблеток, які можна використовувати, включають аравійську камедь, метилцелюлозу, натрієву сіль карбоксиметилцелюлози, полівінілпіролідон (повідон"М), гідроксипропілметилцелюлозу, сахарозу, крохмаль і етилцелюлозу. Ковзні речовини, які можна використовувати, включають стеарат магнію, стеаринову кислоту, рідкий кремній, тальк, воску, олії і колоїдний діоксид кремнію.

У конкретнішому варіанті здійснення даного винаходу для місцевих застосувань фармацевтичні композиції можна формулювати в придатній мазі. Деякі приклади формуляцій композиції для місцевого застосування включають краплі, настойки, лосьйони, креми, розчини і мазі, що містять активний інгредієнт і різні основи і носії.

В одному варіанті здійснення даного винаходу напівтверда мазь для місцевого застосування, як правило, містить активний інгредієнт у концентрації приблизно від 1 до 20 95, наприклад, від 5 до

Фо, у носії, такому як фармацевтичний крем у ролі основи.

В одному варіанті здійснення даного винаходу також можна легко приготувати фармацевтичні композиції для інгаляційного і трансдермального введення. Терапевтичну композицію можна вводити через ніс або легені, наприклад, у вигляді рідкого або порошкового аерозолю (ліофілізованого).

В одному варіанті здійснення даного винаходу рідкі лікарські форми фармацевтичної композиції для перорального введення, приготовлені на або воді інших водних розчинниках, можуть містити різні суспендувальні агенти, такі як метилцелюлоза, альгінати, трагакант, пектин, кельгін, карагінан, аравійська камедь, полівінілпіролідон і полівініловий спирт. Рідкі формуляції фармацевтичних композицій за даним винаходом також можуть включати розчини, емульсії, сиропи та еліксири, що містять разом з активною сполукою), змочувальні речовини, підсолоджувачі і барвники, і смакові речовини. Різні рідкі і порошкові формуляції фармацевтичних композицій можна приготувати з використанням звичайних методів для інгаляції в легені ссавця, який піддається лікуванню.

В одному варіанті здійснення даного винаходу рідкі лікарські форми фармацевтичної композиції для ін'єкції можуть одержати різні носії, такі як рослинні олії, диметилацетамід, диметилформамід, етиллактат, етилкарбонат, ізопропілміристат, етанол, поліоли, тобто гліцерин, пропіленгліколь, рідкий поліетиленгліколь тощо. У деяких варіантах здійснення композиція містить носій цитрат/сахароза/твін.

Для внутрішньовенних введень водорозчинні варіанти композицій можна вводити краплинним вливанням, при цьому фармацевтичну композицію, що містить протигрибковий засіб і фізіологічно прийнятний наповнювач, уводять інфузією. Фізіологічно прийнятні наповнювачі включають, наприклад, до декстрози, 0,9 95 фізіологічний розчин, розчин Рінгера та інші придатні наповнювачі. Можна приготувати придатну нерозчинну форму композиції і вводити у вигляді суспензії на водній основі або фармацевтично прийнятній масляній основі, такій як ефір довголанцюгової жирної кислоти - наприклад, етилолеат.

В одному варіанті здійснення даного винаходу фармацевтична композиція містить приблизно від 0,1 95 до 90 95 за масою (наприклад, від 1 до 20 95 або від 1 до 10 95) анти-СО154-антитіла за даним винаходом у фармацевтично прийнятному носії.

В одному варіанті здійснення даного винаходу оптимальний відсоток анти-СО154-антитіла за даним винаходом у кожній фармацевтичній композиції варіює залежно від самої формуляції і бажаного терапевтичного ефекту при конкретних патологіях і скоректованих терапевтичних схем.

Фармацевтична формуляція є добре відомою в даній галузі Можна використовувати звичайні способи, відомі фахівцям у галузі медицини, для введення фармацевтичної композиції суб'єкту.

Отже, фармацевтичні композиції за даним винаходом стосуються композицій із тривалим вивільненням. Тривале вивільнення або контрольоване вивільнення, або уповільнене вивільнення стосується лікарських композицій, що вивільняють активний лікарський засіб, такий як поліпептид або антитіло, протягом періоду часу після введення суб'єкту. Тривале вивільнення поліпептидних лікарських засобів, яке може мати місце протягом бажаних періодів часу (наприклад, обчислюваних хвилинами, годинами, цілодобово, тижнями або більше, залежно від формуляції лікарського засобу), відрізняється від стандартних формуляцій, в яких по суті вся лікарська форма доступна для негайного усмоктування або негайного розподілу через кровотік. Композиції для тривалого вивільнення, у деяких варіантах здійснення, забезпечують рівень циркулюючого лікарського засобу в результаті одного введення, який підтримується, наприклад, протягом 8 г або більше, 12 г або більше, 24 г або більше, 36 г або більше, 48 г або більше, 60 г або більше, 72 г або більше, 84 г або більше, 96 г або більше, або навіть протягом 1 тижня або 2тижнів або більше, наприклад, протягом 1 місяця або більше.

Композиції для тривалого вивільнення можуть містити моновалентне анти-СО154-антитіло за даним винаходом. У додаткових варіантах здійснення моновалентне антитіло є гуманізованим або повністю людським антитілом. У додаткових варіантах здійснення анти-СО154-антитіло є антитілом зі зниженою ефекторною функцією, описаною в даному документі.

У деяких варіантах даного винаходу фармацевтична композиція додатково містить імуносупресивну або імуномодулюючу сполуку. Наприклад, така імуносупресивна або імуномодулююча сполука може являти одну з наступного: агент, який перериває костимулювальний сигнальний шлях Т-клітин через СО28; агент, що перериває сигнальний шлях за участю кальцінейрину, кортикостероїд, антипроліферативний засіб та антитіло, яке специфічно зв'язується з білком, експресованим на поверхні імунних клітин, включаючи, не обмежуючись цим, СО45, СО2, І 2Е, ср4, СО8 і ГАМК Ес, В7, СТІ А4, ТМЕ, І Тр ї МІ А-4.

У деяких варіантах здійснення даного винаходу імуносупресивна або імуномодулююча сполука являє такролімус, сіролімус, мікофенолят мофетил або активну форму мікофенольної кислоти, мізорубін, дезоксиспергуалін, бреквінар натрій, лефлуномід, рапаміцин або азаспіран.

В інших варіантах здійснення даного винаходу антитіла за даним винаходом або фармацевтичні композиції, що містять їх, можна включити в контейнер, упаковку або диспенсер або самостійно у вигляді частини набору з етикетками та інструкціями для застосування.

Введення і шляхи доставки

Анти-СО154-антитіла за даним винаходом і фармацевтичні композиції за даним винаходом можна вводити суб'єкту будь-яким шляхом, який є прийнятним із медичної точки зору. Для цілей даного винаходу "введення" означає будь-який зі звичайних способів введення антитіла, фрагмента антитіла або фармацевтичної композиції, відомий фахівцям у даній галузі, і він не обмежується наведеними в даному документі прикладами.

У деяких варіантах здійснення даного винаходу анти-СО154-антитіла за даним винаходом і фармацевтичні композиції за даним винаходом можна вводити суб'єкту ін'єкцією внутрішньовенно, підшкірно, внутрішньочеревенно, внутрішньом'язово, інтрамедулярно, інтравентрикулярно, інтраепідурально, внутрішньоартеріально, внутрішньосудинно, внтурішньоартикулярно, інтрасиновіально, інтрастернально, інтратекально, усередину печінки, інтраспінально, у пухлину, інтракранеально; ентерально, внутрішньопульмонально, через слизову, усередину матки або сублінгвально, або місце, наприклад, у місця запалення або росту пухлини.

У деяких варіантах здійснення даного винаходу анти-СО154-антитіла за даним винаходом і фармацевтичні композиції за даним винаходом можна вводити суб'єкту перорально або інтраназально, або інгаляцією, всередину ока, ректально або місцево.

У конкретніших варіантах здійснення даного винаходу анти-СО154-антитіла за даним винаходом і фармацевтичні композиції за даним винаходом можна вводити суб'єкту перорально у вигляді капсул, таблеток, водних суспензій або розчинів.

У деяких конкретніших варіантах здійснення даного винаходу анти-СО154-антитіла за даним винаходом і фармацевтичні композиції за даним винаходом можна вводити суб'єкту місцево при аплікації крему, мазі або тощо.

У деяких варіантах здійснення даного винаходу анти-СО154-антитіла за даним винаходом і фармацевтичні композиції за даним винаходом також можна вводити інгаляційно з використанням розпилювача, інгалятора для сухих порошків або дозуючого інгалятора.

У додаткових варіантах здійснення даного винаходу анти-СО154-антитіла за даним винаходом і фармацевтичні композиції за даним винаходом можна вводити суб'єкту введенням із тривалим вивільненням за допомогою ін'єкцій-депо імплантатів, що розсмоктуються, введених суб'єкту безпосередньо під час хірургічної операції або імплантацією інфузійного насоса або біологічно сумісного імплантата для тривалого вивільнення.

У конкретнішому варіанті здійснення анти-СО154-антитіла за даним винаходом і фармацевтичні композиції за даним винаходом можна вводити суб'єкту введенням депонуючих ін'єкцій, наприклад, із використанням ін'єкцій-депо або біодеградованих сполук і методів на 1, З або 6 місяців.

У конкретнішому варіанті здійснення анти-СО154-антитіла за даним винаходом і фармацевтичні композиції за даним винаходом можна вводити суб'єкту аплікацією на шкіру суб'єкта трансдермального пластиру, що містить антитіло, похідне антитіла або фармацевтичну композицію, і забезпеченням знаходження пластиру в контакті зі шкірою суб'єкта, як правило, протягом 1-5 г на пластир.

У ще одних варіантах здійснення даного винаходу анти-СО154-антитіла за даним винаходом і фармацевтичні композиції за даним винаходом можна вводити суб'єкту в будь-якій дозі в перерахуванні на масу тіла і з будь-якою кратністю введення, які є прийнятними з медичної точки зору.

Прийнятні дози знаходяться в межах від 0,01 до 200 мг/кг маси тіла суб'єкта.

У будь-якому зі способів застосування антитіл або фармацевтичних композицій за даним винаходом антитіла або фармацевтичні композиції можна вводити суб'єкту в однократній або багаторазовій дозах щодня, кожні 2, 3, 4, 5 або 6 днів, щотижня, кожен місяць або будь-яку їхню проміжну частину або багаторазово, і додатково можна вводити суб'єкту повторно з інтервалом у межах від введення щодня до введення кожен місяць, що визначає фахівець у даній галузі.

У будь-якому зі способів застосування антитіл або фармацевтичних композицій за даним винаходом зв'язувальні білки, антитіла або фармацевтичні композиції, що їх містять, можна вводити суб'єкту, що потребує цього, з інтервалом протягом періоду часу, показаного з медичної точки зору, у межах від днів або тижнів до показання вводити засіб суб'єкту протягом усього життя. У додаткових варіантах здійснення даного винаходу анти-СО154-антитіла за даним винаходом і фармацевтичні композиції за даним винаходом можна вводити суб'єкту багаторазово з інтервалом від одного дня до кожного місяця.

В одному варіанті здійснення даного винаходу анти-СО154-антитіла за даним винаходом і фармацевтичні композиції за даним винаходом можна вводити багаторазово в день, якщо бажано, для забезпечення загальної бажаної добової дози. Ефективність способу лікування можна оцінити моніторингом стану суб'єкта стосовно прояву відомих ознак або симптомів порушення.

Для усіх варіантів здійснення даного винаходу дозування і кратність введення анти-СО154-антитіл за даним винаходом і фармацевтичних композицій за даним винаходом, ефективні для одержання бажаних ефектів, будуть залежати від різних факторів, таких як природа захворювання, яке піддається лікуванню, маса і вік суб'єкта, ціль лікування, конкретна використовувана фармацевтична композиція, і фармакокінетика активної речовини, а також думка лікуючого лікаря.

Отже, анти-СО154-антитіла за даним винаходом і фармацевтичні композиції за даним винаходом вводять у кількості, ефективній для досягнення призначеної для них мети. Терапевтично ефективна кількість стосується кількості антитіла, ефективної для профілактики, ослаблення або пригнічення симптомів захворювання або пролонгації тривалості життя суб'єкта, який піддається лікуванню.

Терапевтично ефективну кількість можна забезпечити зміною дози і схеми введення антитіл за винаходом суб'єкту.

Анти-СО154-антитіла за даним винаходом і фармацевтичні композиції за даним винаходом можна вводити у вигляді однократної дози для деяких показань, таких як попередження імунної відповіді на антиген, впливу, якому суб'єкт піддається протягом короткого періоду часу, такому як екзогенний антиген, що вводиться за однократною схемою лікування. Приклади такої терапії будуть включати спільне уведення фрагмента антитіла за винаходом з терапевтичним засобом, наприклад, антигенним фармацевтичним засобом, алергеном або продуктом, одержаним із крові, або вектором для генної терапії. При тих показаннях, коли вплив антигену є тривалим, наприклад, при контролюванні імунної реакції на трансплантовану тканину або на антигенні фармацевтичні засоби, що вводять тривало, фрагменти антитіла або фармацевтичні композиції за винаходом вводять з інтервалами протягом періоду часу, показаного з медичних міркувань, у межах від доби або тижнів до показання вводити засіб протягом усього життя суб'єкта.

У будь-якому зі способів, описаних у даному документі, антитіла або фармацевтичні композиції можна вводити суб'єкту з другим засобом. У деяких варіантах здійснення засіб є терапевтичним засобом, наприклад, таким як імуномодулюючий або імуносупресивний засіб. Імунюомодулюючий або імуносупресивний засіб може бути одним з наступного: (а) агент, який перериває костимулювальний сигнальний шлях Т-клітин через СО28; (р) агент, який перериває сигнальний шлях за участю кальцінейрину; (с) кортикостероїд; (а) антипроліферативний засіб; і (є) антитіло, яке специфічно зв'язується з білком, експресованим на поверхні імунних клітин, включаючи, не обмежуючись цим, СО45, СО2, І. 2, С04, СОВ8 і КАМК Ес, В7, СТІ А4, ТМЕ, І Т (ії МІ А-4.

Імуносупресивна або імуномодулююча сполука може являти, наприклад, такролімус, сіролімус, мікофенолят мофетил, мізорубин, дезоксиспергуалін, бреквінар натрій, лефлуномід, рапаміцин або азаспіран. Антитіло і другий засіб можна вводити одночасно або послідовно.

У деяких випадках може бути переважним вводити одну або більше нуклеїнових кислот за винаходом суб'єкту, що потребує цього. Терапевтичні і діагностичні способи за винаходом, що включають стадію введення, принаймні, однієї нуклеїнової кислоти за винаходом згідно з добре відомими способами, входять в обсяг даного винаходу.

В одному варіанті здійснення даного винаходу суб'єкт(и), якого можна лікувати з застосуванням описаних вище способів, являє тварину. Переважно тварина є ссавцем. Приклади ссавців, яких можна лікувати, включають, не обмежуючись цим, людей, приматів, які відрізняються від людини, гризунів (включаючи щурів, мишей, хом'яків і морських свинок), корів, коней, овець, кіз, свиней, собак і котів.

Переважно, ссавець є людиною.

Даний винахід можна краще зрозуміти на основі прикладів, які наведені далі. Однак, фахівці в даній галузі, мабуть, розуміють, що описані конкретні способи і результати тільки ілюструють винахід, описаний у даному документі.

ПРИКЛАДИ

Наступні приклади ілюструють способи і продукт за даним винаходом. Придатні модифікації й адаптації описаних умов і параметрів, звичайно прийнятих в галузі молекулярної біології, які відомі фахівцям у даній галузі, не відступають від суті та обсягу даного винаходу.

Приклад 1

Одержання антитіл проти людського СО154 методом 5 АМ

Метод добору антитіл лімфоцитів (5І АМ) (Вабсоок еї а!., 1996, Ргос. Маї). Асай. 5сі., 93:7943-7848;

МО 92/02551; де МУйаг еї аїЇ., 1997, 9. ІттипоїЇ. Меїйпод5, 207:61-67 і І адегКмібї еї аї., 1995,

ВіоТесппідне5, 18:862-869) використовували для ідентифікації і виділення антитіл проти людського

СОр154. За допомогою 5ІАМ можливо одержувати високоафінні антитіла, продуковані під час імунної відповіді в умовах іп мімо, з будь-якого виду. Потім виділені окремі клітини, що продукують антитіла, піддають клональній експансії з наступним скринінгом на клони, що продукують анти-СО154-антитіла з наступною ідентифікацією послідовності генів їхньої варіабельної ділянки важкого (Мн) і легкого ланцюга (Мі). Конкретний метод скринінгу детально описаний у заявці УМО 04/051268. Таким чином, виділяють В-клітини, позитивні на антитіла до людського СО154.

Було ідентифіковано і виділено декілька щурячих антитіл проти людського СО154 із використанням технології Б'АМ (фіг.12). Одне з даних антитіл САО8І1 00342 ("антитіло 342") гуманізували, як описано в наступному прикладі. Його ДНК і виведені амінокислотні послідовності наведені на фіг.2. Клонували ген, що кодує дане антитіло.

Приклад 2

Гуманізація антитіла САО81 00342 - створення антитіла 342.02

Одержане за допомогою 5ІАМ антитіло 342 гуманізовали переносом СОК на людські каркасні ділянки зародкової лінії. Вирівнювання послідовності щурячого антитіла (донорного антитіла) з людськими каркасними ділянками зародкової лінії (акцепторні) наведено на фіг.9 разом з одержаною гуманізованою послідовністю. Вибрана акцепторна послідовність легкого ланцюга зародкової лінії представляла людську МК1 2-1-(1) ОБ12 М-ділянку плюс УК1 У-ділянку (М ВАЗЕ, МКС Сепіге ог Ргоїеїп

Епдіпеегіпд; Великобританія; ЗЕО ІЮ МО:35 і 36) (фіг.3). Вибрана акцепторна послідовність важкого ланцюга зародкової лінії представляла людську МНЗ 1-1 3-66 М-ділянку плюс УНА .-ділянку (М ВАЗЕ,

МАС Сепіге Гог Ргоївіп Епдіпеегіпу; Великобританія; 5ЕО ІЮ МО:37 і 38) (фіг.3). У доповненні була вибрана інша акцепторна каркасна МН-ділянка, послідовність людської МНА 1-1 4-59 (ЗЕО ІЮ МО:39 і 40) (фіг.3). СОК, пересаджені з донорної в акцепторну послідовність, визначені за системою нумерації

Кавбаї (Кабаї єї а., Зедиепсез ої Ргоївїн5 ої Іттипоіодіса! Іпіегезі, Веїйезаа МО, Маїйопаї! Інвійшев ої

Неапп, 05) за винятком СОМК-НІ, коли використовували комбіноване визначення за системою

Споптіа/Каваї (дивися заявку УМО 91/09967). Стосовно трансплантатів, де переносили тільки СОК з донорного антитіла на акцепторні каркасні ділянки, то конструювали варіанти, в які також включали ключові залишки донорної каркасної ділянки. Дані залишки ідентифікували з використанням методу, описаного в заявці М/О 91/09967. Наприклад, трансплантат легкого ланцюга МК19494 містить донорні залишки в положеннях 38, 71 і 85; трансплантат важкого ланцюга МНЗЯ1 містить залишки донорної каркасної ділянки в положеннях 24, 48, 49, 73 і 78; трансплантат важкого ланцюга МН4д1 містить донорні каркасні ділянки в положеннях 48, 71 і 78. Послідовності всіх даних трансплантатів наведені на фіг.9.

Розробили і сконструювали гени, що кодують послідовності даних М-ділянок, з використанням стандартних методів молекулярної біології за контрактом із компаніями, що займаються синтезом генів (Епів(еспоп СтВвН; ОМА 2.0; Віце Негоп). Модифікації для одержання трансплантованих варіантів проводили з використанням звичайного олігонуклеотид-спрямованого мутагенезу з ПЛР.

Послідовності сигнальних пептидів із вихідних щурячих антитіл включали у вихідні генні конструкції для забезпечення експресії з використанням експресуючих векторів на основі клітин ссавців.

Гени пересадженого легкого ланцюга субклонували в експресуючий вектор легкого ланцюга, який містить ДНК, що кодує константну ділянку людського каппа-ланцюга (алотип КтУ3). Гени пересадженого важкого ланцюга субклонували в експресуючий вектор людського гама-4 ланцюга, який містив ДНК, що кодує константну ділянку людського гама-4 ланцюга, що містить стабілізуючу мутацію 5241Р у шарнірній ділянки (Апда! еї аїЇ.,, Мої. Іттипої., 1993, 30(1):105-8). Можна використовувати будь-який придатний експресуючий вектор. Гени вихідного щурячого антитіла також субклонували в дані вектори з одержанням плазмід, експресуючих химерне антитіло М-ділянка щура /

С-ділянку людини для порівняння в тестах.

Спільна трансфекція плазмід із геном легкого ланцюга і геном важкого ланцюга в клітини СНО забезпечує експресію дос і аналіз людського СЮО154-зв'язувального білка за допомогою Віасоге "М,

Для аналізу експресії в Е. сої ії активності у ролі моновалентного Рар'-фрагмента гени ключових конструкцій субклонували в експресуючий вектор рРТТОЮ (Раб) (МО 03/48208, УМО 03/031475).

Субклонування проводили двостадійним способом: на першій стадії фрагмент гена УК клонували у фрагмент ЕсокМ-В5іумІі; потім фрагмент гена МН клонували у фрагмент РмушіІ-ХпоЇ. За допомогою даного процесу відбувається злиття ДНК, що кодує сигнальний пептид з білка ОтрА, з генами, що кодують легкий і важкий ланцюги, що надає здатність до секреції трансльованого білка в периплазму бактерій. Одержані плазміди, що експресують, трансформували в штам К-12 Е. сої і використовували в дослідах з індукції в колбах невеликого об'єму, що струшуються, і для ферментації з високим клітинним титром.

Таблиця 1

Афінність конструкцій Бар 342 з використанням аналізу Віасоге "м (виділений Раб із середовища ферментації об'ємом 1 л)

Трансплантат Ка (1 Мс) ка (1/с) КО (М) КО (пкМ) 9 49Н!1 1,53Е--07 6,97Е-05 4, 55Е-12 4,55

Вибір оптимального трансплантата проводили з урахуванням активності в тесті і рівня експресії

Бар при ферментації в Е. соїї. Приклад визначення афінності з використанням аналізу Віасоге "м наведений у таблиці 1. На даній основі був вибраний трансплантат ді 49Н1.

Одержували плазміду, що кодує варіант Рар' трансплантата 91/4д9Н1. ДНК-послідовність інсерту для вставки даного трансплантата наведена на фіг.8 (5ЕО ІЮ МО:41). Також на фігурі представлена послідовність інсерту (5ЕО ІЮ МО:28) для експресії Рар-фрагмента, який можна використовувати для одержання Е(ар)г2-фрагмента.

Приклад З

Одержання аглікозильованих антитіл пи5с8 і пи342 сайт-спрямованим мутагенезом

Аглікозильовані антитіла йпибс8 і пи342, використані в наступних дослідах, одержували, дотримуючись стандартних методів рекомбінантної ДНК. Аглікозильоване антитіло пибс8 по суті одержували, як описано в заявці на патент США 2006/0193856, за винятком заміни Ес-домену пиЇдс4 на Ес-домен Ідс1, використану раніше, для додаткового зниження ефекторної функції. Послідовність легкого каппа-ланцюга аглікозильованого антитіла пи5с8 наведена на фіг.13 (5ЗЕО ІЮО МО:62, 5ЕО ІЮ

МО:63 і БЕО ІОЮ МО:64). Важкий ланцюг аглікозильованого антитіла пи5с8 містить дві мутацій, зроблені сайт-спрямованим мутагенезом у СН2-домені (Т299А, БО нумерація Кара) і шарнірному домені (5228Р. БО нумерація Кабаю (фіг.14; 5ЕО ІЮ МО:65, 5ЕО ІЮО МО:6б і 5ЗЕО ІЮО МО:67). У результаті мутації Т299А відбувається модифікація сайта М-глікозилювання в СН2-домені таким чином, що субстрат для ферментів М-глікозилювання відсутній, що робить молекулу аглікозильованною.

Аглікозильоване антитіло пи342 одержували з вектора БРар-фрагмента 342. Дану послідовність модифікували додаванням людських сигнальних послідовностей і придатних послідовностей людських константних ділянок. Також аглікозильоване антитіло пи342 містить Ес-домен ПпиЇдсаі.

Послідовність легкого каппа-ланцюга аглікозильованого антитіла пи342 наведена на фіг.15 (ЗЕО ІЮ

МО:68; 5ЕО ІО МО:69 і БЕО ІЮО МО:70). Важкий ланцюг аглікозильованого антитіла пи342 містить дві мутацій, зроблені сайт-спрямованим мутагенезом у СН2-домені (Т299А, БО нумерація Кава) і шарнірному домені (5228Р БІО нумерація Кабад (фіг.16; ЗЕО ІЮ МО:71, БЕО ІЮО МО:72 і БЕО ІЮО МО:73).

У результаті мутації Т299А відбувається модифікація сайта М-глікозилювання в СН2-домені таким чином, що субстрат для ферментів М-глікозилювання відсутній, що робить молекулу аглікозильованою. Аглікозильоване антитіло пи5с8 і пи342 стабільно експресували в клітинах СНО.

Приклад 4

Зв'язування з СЮО154: визначення афінності зв'язування

За допомогою технології Віасоге"м можна проводити моніторинг зв'язування між біологічними молекулами в режимі реального часу і без необхідності в міченні. Одну із взаємодіючих сполук, що називають лігандом, імобілізують безпосередньо або вона захоплюється іммобілізованою поверхнею, у той час як іншу, що називають аналітом, просувається в розчині уздовж захопленої поверхні. Сенсор детектує зміну в масі на поверхні сенсора, оскільки аналіт зв'язується з лігандом з утворенням комплексу на поверхні. Це відповідає процесу асоціації. Процес дисоціації просліджується, коли аналіт витісняється буфером. У тесті визначення афінності Віасоге М ліганд є анти-СО154-антитілом, таким як антитіло 342, і аналіт являє собою внутрішньоклітинний домен людського СО154.

Деталі постановки методу є такими:

Прилад: Віасогет 3000, Віасоге АВ, Оррзаїа, Швеція.

Сенсорний чип: СМ5 (для аналізів) номер за каталогом: ВК-1001-14, Віасоге АВ, Оррзаїа, Швеція.

Чипи зберігали при 42С.

ВІАнормалізуючий розчин: 70 95 (за масою) гліцерин. Входить у набір для ВіАтайепапсе, номер за каталогом: ВК-1002-51, Віасоге АВ, Оррзаїа, Швеція. Набір для ВіАтаїйепапсе зберігали при 42С.

Набір для сполучення аміну: номер за каталогом ВК-1000-50, Віасоге АВ, Оррзаїа, Швеція. Етил-3- (З-диметиламінопропіл)карбодіїмід гідрохлорид (ЕОС). Доводили до концентрації 75 мг/мл дистильованою водою і зберігали порціями по 200 мкл при -702С.

М-гідроксисукцинімід (МН). Доводили до концентрації 11,5 мг/мл дистильованою водою і зберігали порціями по 200 мкл при -702С.

Етаноламін гідрохлорид-маон рн 8,5. Зберігали порціями по 200 мкл при -702С.

Буфери: рухомим буфером для аналізу є НВ5О-ЕР (являє собою 0,01 М НЕРЕЗ5, рН 7,4, 0,15 М масі, З мМ ЕДТА, 0,005 95 поверхнево-активної речовини Р20). Номер за каталогом: ВК-1001-88,

Віасоге АВ, Оррзаїа, Швеція. Буфери зберігали при 42С. Буфер для іммобілізації являє собою ацетатний буфер, рН 5,0 (10 мм ацетату натрію, рН 5,0). Номер за каталогом: ВК-1003-51, Віасоге АВ,

Оррзаїа, Швеція. Буфер зберігали при 42с.

Ліганд для захоплення: Е(ар')2--фрагмент козячого антилюдського до АйЙіпіриге, специфічний Рабр'- фрагмент (номер за каталогом: 109-006-097) або специфічний Ес-фрагмент (номер за каталогом: 109- 006-098), даскзоп ІттипоКезеасії Іпс (РеппзуїЇмапіа, США). Реагенти зберігали при 42С.

Ліганд: анти-СО154-антитіла.

Аналіт: рекомбінантний позаклітинний домен людського СО154. Речовину готували в концентрації 2 мг/мл (40 мкм) у забуференому фосфатом фізіологічному розчині, зберігали при 42С і розводили рухомим буфером для аналізу НВЗ-ЕР. Звичайно СО154 розчиняли в концентрації в межах від «хі НМ до «100 пкМ подвійними розведеннями для постановки аналізу афінності.

Розчин для регенерації: 40 мм НСІ готували розведенням дистильованою водою з 116 М маточного розчину (ВОН, Рооїе, Англія. Номер за каталогом: 101254Н). 5 мМ розчин Маон готували розведенням дистильованою водою з 50 мМ маточного розчину. Номер за каталогом: ВК-1003-58,

Віасоге АВ, Оррзаїа, Швеція.

Метод аналізу: ВІА (Віатоїесшаг Іпієегасіоп Апаїузіз) проводили з використанням ВіасогеФ 3000 (Віасоге АВ). Е(ар'»-фрагмент козячого антилюдського Ідс АйЙіпіриге, специфічний Ес- або Раб'- фрагмент (даскзоп, ІттипоКезеасії) імобілізували на сенсорних чипах СМ5 за допомогою реакції сполучення амінів до рівня захоплення «6000 одиниць відгуку (КО). Буфер НВ5-ЕР (10 мм НЕРЕ5, рн 7,4, 015 М Масі, З мм ЕДТА, 0,00595 поверхнево-активної речовини Ра2О, Віасоге АВ) використовували як рухомий буфер для аналізу зі швидкістю потоку 10 мкл/хв. Анти-СО154-антитіла або Рар-фрагменти використовували в таких концентраціях, що при захопленні іммобілізованим на поверхні антилюдським Ідс-ЕСК (або антилюдським дсС Рар') відтворювався сигнал, що дорівнює 200 КО. Людський СО154 титрували проти захопленого антитіла в різних концентраціях. Вводили 90 мкл СО154 на поверхню (фаза асоціації) із наступною фазою дисоціації 240 с, все при швидкості потоку, що дорівнює 30 мкл/хв. Поверхню регенерували дворазовим введенням 40 мм НСІ об'ємом 10 мкл із наступним введенням 5 мкл 5 мМ Маон зі швидкістю потоку, що дорівнює 10 мкл/хв.

Одержували криві зв'язування після віднімання фонового зв'язування з використанням програмного забезпечення ВіАемаїчайоп (версія 3.2), дотримуючись стандартних методик. Визначали кінетичні параметри з використанням алгоритму підбирання.

Даний метод можна використовувати для оцінки афінності для білка СО154 або його фрагмента в антитіла, похідного антитіла або фрагмента антитіла за даним винаходом. Значення Ка, одержані з використанням аналізу Віасоге"М для анти-СО154-антитіл, виділених при постановці 5І АМ, наведені на фіг.12 і 18.

Приклад 5

Інгібування зв'язування з СЮО154

Аналіз на основі проточної цитометрії використовували для оцінки зв'язування міченого СО40 з експресуючими СО154 клітинами 01.1. Клітини Чигкаї 01.1 (Американська колекція типових культур) підтримували в середовищі КРМІ 1640 (сібсо, 31870-025)) що містить 10 95 (за об'ємом) фетальної бичачої сироватки (ЕС5), 2 мМ глутаміну (Іпмігодеп, 23030024), 1 мМ пірувату натрію (Іпмігодеп, 11360-039), 1 95 (за об'ємом) О-(-)-глюкози (Зідта, 558769) 5 10 мМ НЕРЕ (Зідта, НО887). Під час аналізу клітини 01.1 з титром 100000 інкубували в 100 мкл середовища КРМІ 1640-4-10 95 РС5 у присутності або за відсутності серії розведень анти-СО154-антитіла протягом 15 хв при кімнатній температурі. Потім додавали 5 мкл розведення 1:75 пСО40-тЕс-РЕ (АїІехів Согр., АМО-504-050) та інкубували ще протягом 30 хв при кімнатній температурі. Після дворазового промивання забуференим фосфатом фізіологічним розчином (РВ5), що містить 1 95 (мас./06.) бичачого сироваткового альбуміну (фракція М В5А, Зегоїіодіса! Ргоїеїп5 Іпс., 81-068-5) і 0,02 95 (мас./об.) азиду натрію (ВОН, 103692К), клітини ресуспендували в 200 мкл суміші РВЗ/1 95 ВБА/0,02 96 азид натрію і проводили проточну цитометрію Весіоп ОісКкіпбоп ЕБАСоЗсап. В усіх випадках розраховували значення середнього геометричного флуоресценції (РІ 2). Визначали інгібування зв'язування пСО40-тЕс-РЕ стосовно сигналу за відсутності антитіла (0 95 інгібування) і сигналу за відсутності НСО40-тЕс-РЕ (100 95 інгібування) із використанням формули:

Ообінгібуванія - 95у дослід х100

Оосінгібування - 10095інгібування

Значення ІСво визначали за даними, одержаним з використанням ХІ'її як частини програми Асіїміу

Вазе.

Значення ІСхо для анти-СО154-антитіл, виділених з використанням 5 АМ, наведені на фіг.12 і 18.

Приклад 6

Конкурентний аналіз зв'язування

Аналіз на основі проточної цитометрії використовували для оцінки анти-СО154-антитіла з експресуючими СО154 клітинами 01.1. Клітини УигКкаї 01.1 (Американська колекція типових культур) підтримували в середовищі КРМІ 1640 (сірсо, 31870-025), що містить 10 95 (за об'ємом) фетальної бичачої сироватки (ЕС5), 2 мМ глутаміну (Віом/піжакКег, 17-605Е і 1 суміші пеніцилін-стрептоміцин (Меадіасесі, 30002107). Під час аналізу клітини 01.1 з титром 100000 інкубували в 10 мл РЗА, 0,01 95

ВЗА, 0,02 95 азиду натрію (буфер для ЕГАС5) у присутності або за відсутності серії розведень анти-

Ср154-антитіла і біотинілованого анти-СО154-баб (клон 342) протягом 2 годин при 42С. Клітини промивали три рази буфером для ЕБАС5 із центрифугуванням при 290х д протягом З хв між промиваннями. Додавали розведення 1:500 кон'югата стрептавідин-К-фікоеритрин (Часкбзоп

Іттипогезвєагсі, 016-110-084) у 150 мкл буфера для ЕАСЗ і клітини інкубували протягом 1 години при 426. Клітини промивали один раз і фіксували в РВ5 із З 96 формальдегіду при кімнатній температурі протягом 10 хв. Клітини ресуспендували в буфері для ЕАС5 та аналізували на проточному цитометрі

ЕасзСаїїриг (ВО). В усіх випадках визначали середні геометричні значення флуоресценції (РІ 2).

Будували графік залежності зв'язування біотинілованого 342 Рар проти концентрації конкурентного антитіла з одержанням сигмоїдальних кривих інгібування, для чого будували чотирипараметрову криву з використанням програми сСгарпРаай Ргізт. Значення ІСвхо, одержані в даному тесті, наведені на фіг.18.

Приклад 7

Тест активації ІСАМ-1

Здатність анти-СО154-антитіл інгібувати взаємодії СО40І "2040 на поверхні клітин визначали в співкультурі в тесті в умовах іп міїго. Лігування (тобто зв'язування) СО40 із СО154 (СО401І) активує В- лімфоцити, призводячи до активації СО154 (ІСАМ-1) на поверхні клітин, і даний контакт, залежний від

СО401 С040-активації В-клітин, можна блокувати анти-СО154-антитілами. Коротко, клітини Т-лімфоми

Уижаї 01.1 (СВІ-10915, Американська колекція типових культур (АТСС), Мапазза5, МА, США), що експресують СО154, і В-клітини лімфоми Катоз 256.4С10 (СКІ -1923, АТСС), що експресують СО40, культивували разом в термостаті при 372С в атмосфері 5 95 СО» протягом ночі у співвідношенні 1.4 із титрами анти-СО154-Рар або контрольного інтактного АБ (пиб5с8). Тест проводили в 96б-ямкових круглодонних планшетах із титром 1х105 клітин/мл у повному середовищі ЕРМІ (ЕРМІ із 10 95 ЕВ5, 1 90 І-глутаміну, 1 96 пірувату натрію і 10 мМ НЕРЕБ5 рН 6,8, Сібсо ВК, Коскміїє, МО, США). На наступну добу клітини забарвлювали протягом 1 години при 42С СО20 РІТС (Ж555622) і СО54 АРС (Ж559771) виробництва ВО РІПагтіпдеп (Зап Оіедо, СА, США) у концентрації відповідно 1:100 ії 1:200 у

РВ5, що містить 195 ВБА і 0,195 азиду натрію. Клітини промивали і фіксували в 195 параформальдегіді та аналізували на проточному цитометрі БАСбЗсап Саїїриг (ВО Віозсіепсев5).

Визначали середнє геометричне значення флуоресценції клітин Катоз (подвійні позитивні клітини) проти концентрації анти-СО154-антитіл (20401) за чотирипараметровою кривою, яку будували з використанням програмного забезпечення ЮОепйасгарі (Кей КосК Зоймаге, зак аке Сйу, США) (фіг.12 і 18). Значення ІСхо використовували для визначення відносної активності анти-СО154-антитіл.

Приклад 8

Активність на моделі імунної відповіді в макак циномолгус

Модель, використана для демонстрації активності в умовах іп ммо, описана Сорбриги еї аї., 1998, 4).

РНнаптасої. Ехр. Тпегарешііс5, 286:925. Макакам циномолгус внутрішньовенно вводили однократні дози фізіологічного розчину, антитіла пи5с8 або дозу 342 Рар'-ПЕГ за 4 г до зараження однократною дозою правцевого токсоїду (ТТ) внутрішньом'язово об'ємом 0,5 мл. Кожна дослідна група складалася з З самців і З самок. На 30 добу вводили другу дозу інгібітору, і тварин повторно заражали ТТ (друга реакція). У певні періоди часу відбирали проби крові аж до 50 доби для визначення титрів Ідс і дм проти ТТ (фіг.19 ї 21). Дані показують, що 342 Рар'-ПЕГ інгібує дО і І(9М імунну відповідь на ТТ залежно від дози.

Також визначали титри Ідс проти ТТ у макак циномолгус після обробки однократною дозою різних форм анти-СО154-антитіл (20 мг/кг - антитіло пи5с8, аглікозильне антитіло 5с8 і аглікозильне антитіло 342 і 40 мг/кг - Рар'-ПЕГ ї 342 ОЕМ-ПЕГ) (фіг.20). Пригнічення імунної відповіді ТТ спостерігали при введенні всіх тестованих антитіл.

Приклад 9

Тест перехресного блокування на основі клітинного сортингу з порушенням флуоресценції

Зв'язувальні властивості анти-СО154-Рар'-ррагментів за винаходом оцінювали тестами перехресного блокування зв'язування антитіл. Коротко, СО154-експресуючі клітини Уигкаї 01.1 інкубували з середовищем або 10 мкг/мл неміченого першого анти-СО154-Рар' протягом 60 хв при кімнатній температурі. Без відмивання вносили оптимальне розведення другого анти-СО154-Рар", міченого АІеха БРійог 488, (300 нг/мл) протягом 6О хв. Потім клітини відмивали та аналізували проточною цитометрією. Якщо перший і другий Рар' зв'язуються з тим самим епітопом, то перший Еар' буде конкурентно блокувати зв'язування другого Бар Якщо два антитіла зв'язуються з різними епітопами, то перший Рар' не буде блокувати зв'язування другого Рар'. У тому випадку, коли міченим тестованим другим Раб' є антитіло 342, то можна показати, що 342 Рар' перехресно блокується 338 (фіг.238), 381 (фіг.230) і 335 (фіг.230) Рар', але не блокується перехресно 295 (не показане), 402 (фіг.23С), 300 (фіг.23Е), 303 (фіг.23Н) або 294 (фіг.23є) Рар'. У тому випадку, коли мічений Рар' являє собою пи5бс8, то може мати місце перехресне блокування під дією 338 (фіг.24А), 402 (фіг.248В), 381 (фіг.24С), 303 (фіг.240), 335 (фіг.24Е), 300 (фіг.24РЕ) і 294 (фіг.2405) Раб". Тестування з АЗЗ (підібране за ізотипом контрольне антитіло) підтверджує, що відсутнє неспецифічне перехресне зв'язування (фіг.23А і 24Н). Антитіла 342 і пи5с8 конкурували один з одним за зв'язування з СО154 незалежно від того, не містили вони мітку (перший) або містили мітку (другий) Рар'.

Приклад 10

Аналіз Віасоге "М зв'язування антитіл

Результати аналізу за допомогою Віасоге "мМ зв'язування антитіл 342 і пиб5с8 з розчинним білком ср154 (500154) (позаклітинний домен; ЕСО) вказували на те, що антитіло 342 витісняло антитіло пи5бсв8 їхнього комплексу з 500154 при додаванні другим до 520154 (фіг.25А і В). Антитіло 5с8 не було здатним витісняти 342 від 5020154 при додаванні другим до 520154 (фіг.25С). Антитіло 338 поводилося аналогічно до антитіла 342 за результатами в конкурентному тесті з пи5с8.

Ни5бс8 Раб може зв'язуватися з комплексом повнорозмірне антитіло 342 (Е/)/5С0154 (фіг.250). На підставі цих результатів можна припустити, що пи5с8 не конкурує зі зв'язувальним сайтом 342 РГ1., коли 342 РІ. вносили першим. Не зв'язуючись теорією, дані результати припускають, що зв'язування одного або більше плечей тримера 500154 з антитілом 342 не перешкоджає зв'язуванню пи5бс8 з вільним плечем(ами).

Має місце незначне («20 КІ) підвищення зв'язування, коли пи5с8 Бар йде за 342 Рар' (фіг.25Е).

Даний результат піднімає питання про можливість того, що пи5с8 Раб блокував зв'язування 342 Рар' або що 342 Рар' заміщав пи5с8 Рар' у захопленому 5020154.

Ні 342 Рар', ні пиб5с8 Рар' не зв'язувалися з комплексом СО40:520154 або не впливали на дисоціацію комплексу в тесті з білком. Той факт, що Еар' не міг зв'язуватися з комплексом

СбОр40:520154, дозволяє припустити, що комплекс використовує всі три плеча 520154 або що комплекс стерично перешкоджає доступу ЕРар' до "вільного" плеча.

Приклад 11

Активація людських тромбоцитів

Тест 1

Агрегацію тромбоцитів можна визначити з використанням опублікованих методів аналізу (наприклад, Ріогіап єї аї., 2005, Тиготбров5і5 Нетозвіавів, 93:1137). В одному тесті тромбоцити вимивали з плазми крові від нормального донора з високим вмістом тромбоцитів із використанням забуференого НЕРЕЗ фізіологічного розчину в покритих В5А пробірках і доводили до титру 250000 на мікролітр (мкл). Потім вимиті тромбоцити переносили піпеткою в кювету агрегометра (СПпгопо-І 09 4900) і записані сигнали калібрували до нульового відсотка агрегації з використанням буфера НЕРЕ5 (для аналізу) як контроль. У даному приладі кювету підтримували при 37,02С и тромбоцити перемішували силіконовою паличкою магнітної мішалки зі швидкістю 1000 об/хв. До тромбоцитів додавали повністю утворені імунні комплекси (тобто антитіло плюс рекомбінантний людський розчинний СО40ІЇ (п5С0401Ї) у стехіометричному співвідношенні 1:11, де гп5СО401Ї обробляли у вигляді тримера) і оцінювали агрегацію у вигляді кривої, одержаної за даними оптичної щільності розчину. Зокрема, 15 мкл імунного комплексу додавали до 285 мкл суспензії вимитих тромбоцитів, таким чином, що після внесення в кювету кінцева концентрація 520154 складала 10 мкг/мл, Ідо- антитіла - 27,8 мкг/мл і Бар'-ПЕГ - 16,7 мкг/мл. Дані показують, що агрегація мала місце в присутності інтактного (до анти-СО154-антитіла пи5с8, але не з 342 Рар'-ПЕГ (фіг.26).

Тест2

В іншому тесті, описаному в заявці УМО 07/59332, агрегацію тромбоцитів оцінювали при контактуванні тромбоцитів з активуючим тромбоцити агентом, (наприклад, аденозиндифосфатом (АДФ), колагеном, тромбіном, тромбоксаном, еластазою нейтрофілів, п-селектином або конвулюксином), при контактуванні активованих тромбоцитів з анти-СО154-антитілом, і потім при контактуванні активованих тромбоцитів із зшивальним агентом (наприклад, розчинним СО154 (520154), антилюдським Ідс-антитілом, анти-пЕс-антитілом, КЕ, позитивною на РЕс-рецептор допоміжною клітиною, розчинним протеїном А або розчинним людським Ес-рецептором). Потім агрегацію визначали кількісно осадженням тромбоцитів, де осадження тромбоцитів вказує на агрегацію тромбоцитів. Тест оцінки агрегації проводили на багатій тромбоцитами плазмі (РЕР).

Приблизно 50 мл цільної крові відбирали аліквотними порціями об'ємом 4,5 мл у вакуумні пробірки з 0,5 мл 3,8 96 розчину цитрату натрію. РКР готували центрифугуванням крові з антикоагулянтом при 200 д протягом 10 хв і відбирали супернатант. Для постановки тесту використовували 4-канальний прилад для визначення агрегації тромбоцитів Віодаїа (РАР-4; Віодаїа Согр., Наїбого, РА) із використанням кювети, що містить тільки бідну тромбоцитами плазму (РРР). Аліквотну порцію РКР об'ємом 350 мкл, що містить приблизно 2-5 х 108 мл тромбоцитів вносили в кювету з паличкою для перемішування. Додавали анти-СО401І -антитіло, людський ІдС, нормальну людську сироватку, СО40-

Ес або анти-пЕс у загальному об'ємі 100 мкл. Навантажені кювети поміщали в прилад і компоненти реакційної суміші змішували перед внесенням АДФ.

Агрегацію ініціювали додаванням субоптимальної концентрації АДФ у 50 мкл (кінцева концентрація варіює для кожної окремої проби). Прилад для визначення агрегації має чотири канали, які працюють одночасно. Для кожного зразка одержували криву протягом 4 хв після внесення АДФ. Наприкінці реєстрації на приладі визначали відсоток агрегації порівнянням із трансмісії світла через пробу і трансмісії світла через контроль РРР. Титрування проводили на початку кожного досліду і наступні аналізи проводили при субоптимальній концентрації АДФ.

Результати даного тесту наведені на фіг.27. РЕР одержували від здорового суб'єкта. Агрегацію індукували внесенням 0,75 мкл АДФ, значення, як було визначено, є субоптимальним для даного донора. Позитивне контрольне анти-СО154-антитіло і негативне контрольне антитіло пІдДО оцінювали в концентрації 200 мкг/мл і при концентрації 520154 30 мкг/мл. Анти-СО154-антитіло або пІдС змішували з рекомбінантним 520154 не більш ніж протягом 20 хв перед внесенням у кювету з РЕР.

Стовпчики показують середні значення і стандартні відхилення даних у двох точках. Результати показують, що незважаючи на те, що негативний контрольний людський Іде (пІдс) і 520154 разом не впливали на агрегацію тромбоцитів, позитивне контрольне анти-СО154-антитіло призводило до підвищення агрегації тромбоцитів. Результати даного аналізу з використанням позитивного або негативного контролю показують, що даний тест можна використовувати для порівняння відносного впливу антитіл за даним винаходом на агрегацію тромбоцитів.

Для визначення того, наскільки тромбоцити експресують СО154 на їхній поверхні, тромбоцити інкубують з кон'югованим з біотинілованим анти-СО154-антитілом і наявність поверхневого СЮО154 визначають кількісним аналізом зв'язаного біотинілованого анти-СО154-антитіла. Отже, експресію

СО0154 на поверхні оцінювали через 1, 10, 20, 40 ії 60 хв після інкубації з або без 10 мкл АДФ.

Експресію СО154 на поверхні детектували на активованих АДФ тромбоцитах через 1 хв після активації, і вона згодом підвищувалася. Зв'язування кон'югованого з біотином анти-СО154-антитіла з 5020154 є специфічним для СО154, оскільки попередня інкубація кон'югованого з біотином анти-

СОр154-антитіла призводила до інгібування зв'язування з активованими тромбоцитами. Кількість поверхневого СО154, виявлена на неактивованих ("спочиваючих") тромбоцитах також згодом зростала. Імовірно, дане явище можна віднести до фонового рівня активації тромбоцитів в експериментальних умовах.

Приклад 12

Способи визначення зміненої ефекторної функції аглікозильованих та інших мутантних антитіл

У наступному прикладі описані тести, придатні для визначення і характеристики ефекторної функції(ій) аглікозильованих та інших модифікованих мутантних антитіл за винаходом.

Ефекторну функцію аглікозильованих та інших модифікованих мутантних антитіл за винаходом можна охарактеризувати за здатністю антитіл зв'язуватися з антигеном і також зв'язуватися з Ес- рецептором або молекулою комплементу С1ід. Зокрема, афінність зв'язування з Есук можна визначити з використанням тестів, основаних на здатності антитіла утворювати "місток" між антигеном

СОр154 і клітиною з Ес-рецептором. Афінність зв'язування з С1д можна визначити тестами на основі оцінки здатності антитіла утворювати "місток" між антигеном СО154 і С1д. Взаємодію антитіл за даним винаходом з БСК або з комплементом також можна проаналізувати технологією на основі кульок

АІрпазсгееп "м (Регкіп ЕІтегфв).

Тести оцінки зв'язування з Ес-рецептором

Тест утворення "містка" з ЕсукК можна провести покриттям 96-ямкових планшетів для постановки

ЕНЗА Махізого (Маїде-Мипе Коспезіег, МУ, США) рекомбінантним розчинним людським лігандом

СО0154 (наприклад, у концентрації 1 мкг/мл протягом ночі при 49С у РВ5; Кагризав еї аї., 1995, зЗігисіцге, 3З(10):1031-1039 і 3(12): 1426; Кагриза5 еї аіІ., 2001, Зігисіиге, 9(4):321-329). Титрування глікозильованих або аглікозильованих форм анти-СО154-антитіла проводили на СО154 протягом 30 хв при 372С, потім планшети промивали та аналізували зв'язування мічених флуоресцентною міткою клітин ШеОЗ37 (СО647). Клітини ШШО37 можна культивувати в середовищі КРМІ із 10 95 ЕВ5, 10 мМ

НЕРЕФЗ5, І -глутаміном і сумішшю пеніцилін/стрептоміцин, розщеплення 1:2, і активували протягом 1 доби перед постановкою аналізу з 1000 Е/мл ІЄМу для підвищення експресії Ес-рецептора (ЕсуВІі).

В іншому варіанті тесту можна оцінити здатність антитіл за винаходом зв'язуватися або, точніше, не зв'язуватися, з іншим Ес-рецептором, таким як ЕсукП (СО16) із використанням описаного вище утворення "містка" проти мічених флуоресцентною міткою людських Т-клітин (клітин «игкай, трансфектованих СО16б-експресуючою конструкцією. Ліганд можна продукувати у моношарі СО154- експресуючих клітин яєчника китайського хом'яка (СНО), культивованих у 96-ямкових планшетах для культивування тканин (Согпіпд І е Зсіепсез5 Асіоп, МА, США). Наприклад, клітини СНО-С0О154- висівали в 96-ямкові планшети з титром 1 х 105 клітин/мл і культивували до злиття в середовищі ос-

МЕМ із 10 95 діалізованою ЕВ5, 100 нМ метотрексату, І -глутаміном і сумішшю пеніцилін/стрептоміцин (Сібсо-ВКІ Коскмійєе, МО, США). Клітини СО16:УдигКаї культивували в середовищі КРМІ с 10 95 ЕВ5, 400 пкг/мл генетицину, 10мМ НЕРЕ5, піруватом натрію, І-глутаміном і сумішшю пеніцилін/стрептоміцин (сірсо-ВКІ) і розщеплювали 1:2 за добу до постановки аналізу.

У тестах для обох рецепторів клітини з Ес-рецепторами можна позначити ацетоксиметиловим ефіром 2",7"-біс-(2-карбоксіетил)-5-(б)карбоксифлуоресцеїну (ВСЕСЕ-АМ) (Моїесшціаг Ргобез Еидепе,

ОР, США) протягом 20 хв при 372С. Після промивання для видалення надлишку мітки 1х105 мічених клітин інкубують у тесті протягом 30 хв при 372С. Декількома промиваннями видаляють незв'язані з

Есук позитивні клітини і планшети "читають" на рідері для мікропланшетів (Суїюйног 2350 Ріпогевзсепі

Місгоріаїе Кеадег, Мійїроге Согрогайоп Веаїтога, МА, США) при довжині хвилі збудження 485 НМ і довжині хвилі емісії 530 НМ.

На додаток до тестів, описаних вище, зв'язування антитіл за винаходом із Ес-рецепторами можна визначити у форматі конкурентного тесту з використанням АІрпазсгееп'"м (Атрійейа Гитіпезсепі

Ргохітйу Нотодепеои5 авззау; Регкіп ЕІтег) або безпосередньо з використанням поверхневого плазмонного резонансу (ВіасогеФ). За допомогою аналізу Віасоге можна реєструвати зв'язування рецептора-аналіту з антитілом, іммобілізованим на чипі протеїн А/З із використанням приладу

ВіасогеФ 3000. Віасогеж є добре відомим методом, що застосовується для характеристики білок- білкових взаємодій (Муз2Ка, 1997, Сигг. Оріп. Віоїтесппої., 8:50-57; Ма!трога 4 ВоітераєскК, 1995, ..

Іттипої. Меїпоа5, 183:7-13) і його успішно застосовували для оцінки зв'язування Ідс-антитіл із Есув (Саюп еї аї., 1997, Єишг. у). Іттипої., 27:1928-1932). Наприклад, протеїн А/5 ковалентно зв'язують із сенсорним чипом (наприклад, сенсорний чип СМ5 із використанням реакції МН5). Рухомий буфер для аналізу (наприклад, НВ5-ЕР (0,01 М НЕРЕ5, рН 7,4, 0,15 М Масі, З мм ЕДТА, 0,005 95 поверхнево- активної речовини Р20 (за об'ємом), Віасогеф)) і буфер для регенерації чипів (наприклад, гліциновий буфер, рН 1,5 (10 мМ глцін-НСЇІ, рН 1,5, ВіасогеФ)) використовували в тесті. Мутантні антитіла проти

Ср154 зі зниженою ефекторною функцією і дикого типу або нативні антитіла проти СО154 розводили до 100 нМ рухомим буфером для аналізу (наприклад, буфером НВЗ-ЕР) і зв'язували з чипом протеїн

А/З протягом 5 хв. Рецептори зв'язуються у фазі асоціації в концентраціях із наступною фазою дисоціації буфером. Цикл без антитіла забезпечує фонову реакцію. У цілому сенсограми можна підігнати 1:11 до моделі зв'язування Гапдтий з одержанням констант рівноваги дисоціації (Ков5) із використанням, наприклад, програмного забезпечення ВіАемаїчаїййоп, версія 4.1 (Віасоге Ф).

У тестах з АІрпазЗсгееп використовують немічене антитіло для конкуренції для взаємодії біотинілованого Ід, зв'язаного з донорними кульками зі стрептавідином, і ЕсуВ-Ніз-О5Т, зв'язаного з акцепторними кульками з анти-55Т. Анти-СО154-антитіло дикого типу або нативне (таке як Ідс1- антитіло) піддають біотинілуванню з використанням стандартних методів і діалізу в РВ5. Акцепторні кульки з анти-з5ї і донорні кульки зі стрептавідином є промислово доступними і їх можна використовувати в кінцевій концентрації 20 мкг/мл. ЕсуВІ-Ніз-245Т, ЕсуВШа-Нібз-а51тТ, ЕсуВПа-Ніб-5Т або будь-який інший мічений ЕСК у їх буфері (наприклад, 25 мМ НЕРЕ5, 100 мМ Масі, 0,1 95 В5А, 0,01 95 твіну-20, рН 7,4) вносять у кожну ямку 96-ямкового планшета до кінцевої концентрації 0,5 нМ.

Анти-СО154-антитіла дикого типу або нативне, мутантне анти-СО154-антитіло або буфер готують у вигляді 2 0д розведень в їх буфері для аналізу і вносять у кожну ямку. Після нетривалого центрифугування біотиніловане анти-СО154-антитіло дикого типу (наприклад, Ідс1-антитіло) в їх буфері для аналізу вносять у кожну ямку до кінцевої концентрації 5 нМ. 100 мкг/мл акцепторних кульок з анти-З5Т вносять у кожну ямку і планшет інкубують у темряві протягом 1 години при кімнатній температурі. 100 мкг/мл донорних кульок зі стрептавідином вносять у кожен планшет і після нетривалого центрифугування планшет інкубують при кімнатній температурі протягом 1,5 г. Проби реакційної суміші переносять у білі непрозорі планшети і визначають флуоресценцію на рідері для мікропланшетів Ривіоп м АІрпа-ЕР НТ (РегкКіп ЕІтег). Дані нормалізують до найбільш високого сигналу (без конкуренції) і підганяють до моделі односайтової конкуренції з використанням нелінійної регресії, наприклад, за допомогою програмного забезпечення сСгарпРай Ргізт (програмного забезпечення

СтарпРад).

Фахівці у даній галузі можуть провести вищеописані або аналогічні тести для визначення зв'язування варіантів-антитіл із будь-яким ЕСК, включаючи, наприклад, ЕсуВІНа.

Тести зв'язування з С14

Тест оцінки зв'язування з СТд можна провести покриттям 96-ямкових планшетів для постановки

ЕПІЗА Махізогть (Маіде-Мипе Коспевіег, МУ, США) 50 мкл рекомбінантного розчинного людського ліганду СО154 (Кагризаз еї аї., 1995, Бігисішге, 15; 3(12): 1426) у концентрації 10 мкг/мл протягом ночі при 42С у РВ5. Вміст ямок аспірували і промивали три рази буфером для промивання (РВ5, 0,05 95 твіну-20) і блокували, принаймні, протягом 1 години із розрахунку 200 мкл/ямку буфером для блокування/розведення (0,1 М МагНРО», рн 7,0, 0,1 М Масі, 0,05 95 твіну-20, 0,1 95 желатину).

Антитіло, призначене для тестування, розводять у буфері для блокування/розведення, починаючи з мкг/мл при 3-кратних розведеннях. Вносять 50 мкл на ямку і планшети інкубують протягом 2 годин при кімнатній температурі.

Після аспірації вмісту і промивання ямок, як описано вище, додають людський С14 (Зідта) (30660) із концентрацією 2 мкг/мл із розрахунку 50 мкл/ямку, розведений у буфері для блокування/розведення, та інкубують протягом 1,5 г при кімнатній температурі. Після аспірації вмісту і промивання ямок, як описано вище, додають овечий анти-С14 (Зегоїес АНРНОЗ3), розведений у 3,560 разів буфером для блокування/розведення з розрахунку 50 мкл/ямку. Після інкубації протягом 1 години при кімнатній температурі вміст ямок аспірують і промивають, як описано вище. Потім вносять кон'югат ослиного антиовечого ДС НРК (дасКзоп ІттипоКезеагсп 713-035-147), розведений 1:10000 у буфері для блокування/розведення, і ямки інкубують протягом 1 години при кімнатній температурі.

Після аспірації і промивання, як описано вище, додають 100 мкл субстрату ТМВ (420 мкм ТМВ, 0,004 95 НО: у 0,1 М буфері ацетат натрію/лимонна кислота, рН 4,9) (бідта) та інкубують протягом 2 хв перед тим, як реакцію зупиняють внесенням 100 мкл 2Н сірчаної кислоти. Визначають поглинання при 450 НМ на приладі бБойтах РКО і використовують програмне забезпечення бойгпах для визначення відносної афінності зв'язування (С значення) на 4-параметровому графіці.

В альтернативному тесті оцінки зв'язування з С14 використовують ЕГІЗБА для визначення зв'язування анти-СО154-антитіл із С1д, але не застосовують СО154 у ролі "містка". Коротко, планшети для постановки аналізу можна покрити протягом ночі при 42С мутантним антитілом або вихідним антитілом (контрольним) у буфері для покриття. Потім планшети можна промити і блокувати. Після промивання вносять аліквотну порцію людського С14 у кожну ямку та інкубують протягом 2 годинодин при кімнатній температурі. Після додаткового промивання вносять у кожну ямку 100 мкл овечого антитіла проти комплементу С14д, кон'югованого з пероксидазою із хрону, та інкубують протягом 1 години при кімнатній температурі. Планшет знову промивають буфером для промивання та в кожну ямку додають 100 мкл субстрату в буфері, що містить ОРО (О-фенілендіамін дигідрохлорид (Зідта)).

Протягом 30 хв проводять реакцію окиснювання, про хід якої судять за появою жовтого забарвлення, і її зупиняють додаванням 100 мкл 4,5 МН25О». Потім можна визначити поглинання при (492-405) нМ.

Наведене як приклад мутантне антитіло являє собою таке, яке показує "достовірне зниження зв'язування з Сід" у даному тесті. У деяких варіантах здійснення достовірним зниженням є, коли приблизно 100 мкг/мл мутантного антитіла викликають зниження зв'язування С14 приблизно в 50 або більше разів у порівнянні з 100 мкг/мл контрольного антитіла з неваріантною Ес-ділянкою ІдДС1. У найбільш переважному варіанті здійснення мутантний поліпептид (тобто антитіло) не зв'язується з

Ста, тобто 100 мкг/мл мутантного антитіла викликає зниження зв'язування С14 приблизно в 100 або більше разів у порівнянні з 100 мкг/мл контрольного антитіла.

Активація комплементу і СОС

Для оцінки активації комплементу можна провести тест комплементзалежної цитотоксичності (СОС), наприклад, як описано Са;7апо-запіого еї аї., У. Іттипої. Меїпоа5, 202:163, 1996. Коротко, різні концентрації мутантного поліпептиду (тобто антитіла) і людського комплементу розводять буфером.

Клітини, що експресують антиген, з яким зв'язується мутантний поліпептид, розводять до титру 1х105 клітин/імл. Суміші мутантного поліпептиду, розведеного людського комплементу і клітин, що експресують антиген, вносять у 9б6-ямковий плоскодонний планшет для культивування тканин та інкубують протягом 2 годин при 379С в атмосфері СО» для забезпечення протікання опосередковуваного комплементом лізису клітин. У кожну ямку вносять 50 мкл аіатаг синього (Асситеа Іпегпаїййіопаї) та інкубують протягом ночі при 372С. Поглинання визначають на флуорометрі для 9б-ямкових планшетів при довжині хвилі збудження 530 НМ і довжині хвилі емісії 590 нМ.

Результати виражають у відносних одиницях флуоресценції (КЕШ). Концентрації зразка можна розрахувати на комп'ютері за стандартною кривою і визначити відсоток активності для мутантного поліпептиду, що цікавить, у порівнянні з немутантним поліпептидом.

Приклад 13

Картування зв'язувального антитіло 342 сайта в білкові СЮО154

Проводили досліди для ідентифікації амінокислотних залишків у людському СО154, які є важливими для зв'язування антитіла 342 із використанням химерних людських-мишачих білків СЮО154.

Антитіло 342 зв'язується з високою афінністю з людським СО154, але не зв'язується з мишачим

СОр154. Отже, у результаті мутування мишачих залишків СО154 у такі, що відповідають людським залишкам, і визначення зміни афінності мутованого білка для антитіла 342 можна встановити важливі для зв'язування залишки. Відбирали шість груп мутантів, в яких людські залишки були введені у відібрані ділянки розчинного мишачого СО154 (відзначені 1-6 на фіг.28). Також оцінювали людський і мишачий розчинний білок СО154 (520154), що не були піддані мутації. Різні білюи СО154 використовували в дослідах за аналізом ВіасогефФ із використанням антитіла 342 (у форматі Ідс), іммобілізованого на чипі та з супернатантами 520154 у фазі розчинення. Результати показували, що зв'язування антитіла 342 має місце тільки при введенні людських залишків групи 5 у мишачий СО154.

Приклад 14

Тест перехресного блокування в конкурентній ЕГІЗА

Для демонстрації перехресного блокування антитіла 342 і 5с8 Рар' автори використовували конкурентну ЕГІЗБА. У даному тесті планшет для ЕГІЗБА покривали анти-Мус-антитілом 9Е10. Мус- мічений СО154 зв'язувався даним антитілом. Серію розведень немічених 342 і 5с8 Рар' інкубували з 1 НМ біотин-342 Рар' або 0,3 нМ біотин-5с8 у планшеті протягом 2 годин при кімнатній температурі у

РВ5Б, 0,05 95 твіну-20, 1 95 ВБА. Планшет промивали і визначали кількість біотинілованого 5с8 Рар' із використанням стрептавідин-НКР. Реєстрували сигнали і складали графік із використанням гіперболічної кривої з одним сайтом зв'язування або гіперболічної кривої з двома сайтами зв'язування з програмним забезпеченням Ргізт (Сгарі Рад).

Проводили титрування біотин-342 Рар' на СО154 з метою визначення відповідної концентрації для аналізу перехресного блокування (фіг.29А). Було встановлено, що концентрація, що дорівнює 1 нМ, знаходиться в лінійній частині кривої. Також проводили титрування біотин-5с8 Рар'на СО154 з метою визначення відповідної концентрації для перехресного блокування (фіг.298). Було встановлено, що концентрація, що дорівнює 0,3 НМ, знаходиться в лінійній частині кривої. У досліді з оцінки перехресного блокування біотин-342 і біотин-5с8 Рар' неміченим 342 Рар', виявилося, що 342 Рар' інгібував зв'язування біотин-342 Рар' з афінністю, що дорівнює 0,09 нМ (фіг.29С). 342 Рар' інгібували зв'язування біотин 5с8 Рар' із двома показниками афінності 0,134 нМ ії 76 нМ (фіг.29С). Перехресне блокування біотин-342 під дією неміченого 5с8 Рар' показане на фіг.290. Максимальна концентрація 5с8 Рар' на даній кривій складає 50 нМ, яка знаходиться значно вище точки насичення для 5с8 і також значно вище концентрації 1 нМ біотин-342. На підставі відсутності повного інгібування при даних концентраціях можна припустити, що антитіло 508 не здатне конкурентно блокувати всі сайти зв'язування 342 на СО40Ї.

Й список постІдОоВнОСстТЕЙ «від» ВІОСЕМ ІБЕС МА ІМ,

Шев о РНАВМА 5. А, х18о5 ЗВ'ЯЗУВАЛЬКІ БІЛЮЙ, ЩО ВКЛЮЧАЮТЬ ДЯТИРІЛА, ПОХІДНІ АНТИТІЛ

Ж ФРАГМЕНТИ антитхл, ЯК специфічно ЗВ'ЯЖУЮТЬСЯ З сріба, ТА ІНТЕ

ЗАСТОСУВАННЯ

«3» подав ОоЗвІ ної, «зай» встУОБОВ/ 003735 «кат 8908-03 и1 «Ба» 6бп/ч20,а8 «151» 2007-03-97 «1805. 60/918,938 «185815 2007-0352 «150» 50/919, 816 «1512 2007-03-59 «БО «170» Баїепсій туегвісгй 33 «віп їі «115 117 кві?» БК к132 Штучна послідовність «вай» кааЗ» Опис штучною послідовності: синтетичний поліпецтих ка х піп Уві сіл ей Уві бій бек обі 61У 515 Бе Маїі Ів оБго бі оту ї В 18 ї5 ех Гео Ага пе ех був діа Уаі Хех бСіу ЕББе Бех бек Тпх АБО Ту о 25 Зо

Бі Уаї Ні Тхр Уа ха бід Ма РЕ сб1уУу був біу Бем што ТЕр Меє мВ 45 біУу уаі їі Тк бІу Авропі Вер ТБх о Зех ТтТук Ди бек Маі їсях Був и пек о Ажч Ве Тлу ї1іє бегт Ака АвроТвпг о Зек о лув Авп ТпЕ Уаї Туко ГПец 55 за 75 СК сіп Меб Авпобек їв ду Віва бій бар ТВг о В)а Уаії Тех Тух Сув ДІВ 85 зо 5

Аха бій рез Твк Ніз Ту Тук Уаї за Ара о Аїа ТЕробіУ бі біу ТОК 100 1605 ка

Без туаї тп оУал бах «РІ» й «ЕІ 157 каТие ВНІ «віЗх Штучив послідовність «го «край е Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпентид «оп а двроІТєе біп Меє Тк бій бак Рео Бех бек Тек бек Аів бек Уах ЗІіу і 5 15 15

Азор вха Заї Тв Іїе Тахо Суя Агу Аза Бек біс Вер Бен Ту Тук Авт, 5 39 їв Аза Тхр Тук Сіл Ако Був Рко Піу був Аза Рко Був о Бей Ббем Ті1в

Зо 40 15

Тут др о ТвЕ Тух Ах їеий Аза АБросіу ві Ро беї Аа Бе Бех О1У 59 з5 50 бвж спіу Зек озу Тпх АвроТух Тв Мей УВЕ їе беї бЗвт цем біп ро то 35 5О сій: Ав овпе Лів бек тую оТух Сув бій бЗіпотуюх Тук Був РЕ Ро РрЄ

З5 зо 5

Так вна СТУ був Б1у ХВ Був Узї Зі їте Буд що ї05 «8102 3 кеї1» 19 «та» РКТ «13» птучицоа пюслідевністі» «ог «ві» Опис осштучнеої послідавності: синтетичний пептид «00х З біу пе обБет дес Тр оди Туг Бія Ухі Ні 1 5 19 «810» 4 «211» 16 «12» БЕТ «В132 Штучна поспідовніств «ах «рої» Опмс штучної послідовності: синтетичний пептид

«4005 а таї пе Тер зі вв о с1у Азов РТБЕ бек Ту Авпобеї Уаї без буд Яех ії З 10 . 15 «105 5 «її То «12 БЕТ «135 Штучна послідовньсть «рей» кЕййх спис шуучної послідовності: синтетичний пептид «005 бІіп гей тпЕ Бів Тук Тук Уві Пе діа дАта ї 5 10 «РІЗ 5 «ії 11 «Т195 РТ «213» Штучна послідовність «ях «223» Опис нтучної паслідовностії синтетичний пептид «Ох вка Аза ех ЗітоАвроїбей Тую Тух Аяпоїей Аїа ї З 10 «вік «Вії» 7 «їЕї0» РЕ «еї3З» Штучна поспіЗевніште ких дах ЮШПИиС штучної пойлімовностії: синтетичний пептид «400» 7

Авр ТвЕжх Тук Вго без Аїа Ава 1 5 «210з 8 «її «йде РЕ «рії» Штучна послідовцість «во «23» пис штучної послідовкостії синтетичний пептид кедах Я бів біп Тук оТух Ппув РБе Бко ВВа Ліс 1 З «Рій. а «11» 117 «ріг» РВЕ «ІЗ» Штучна послідовність «г0дх «2235 Опис и штуУучНОЇ посСслідавцностії синтетичний попіпептиц «МО» З піп Уві Сіл обев біп сій бек б1у Рго біу ем Уа) Пув Рго бет 51 1 5 15 15

Так рем обек бе) Тахо був так уві Яек обі ле бех бек Тс оАзп Тук 23 е5 20

Біз Уві Чіє Тур І1е Ак біп Рко хо біу Був б1іу Пе біб Тгроїїа 33 40 45 сту Увазі Ті Тк ЩІ1Іб Азв лу Азо Тих обах тує Ап дек уві Пец пув 55 йо во

Бек Арч Уві ТвК тів Бех Ууаї Дбр тік бек цуз Аза біб Ре бек Бех 63 то 7 во пу їв Бех век Уа Тв Аїя Аїа бер тео Аїа МаЯї Тук Ту Сув о Аїа 30. з5 ака сій Бе тб нія Ту ТУЄ Уаї ес Аза АТа ттр Б1іу біді ТЕ

ОО 105 119

Бе хаї тв уаї бах

Тї5 «кій» 10 «вії М «125 РЕЖ чаї» Штучна послідовність «Вей» «вЕЗз Опис штучної послідовнкоржщії синтетичний поліпеплид «ай» 10 «ла баї бів пем уаї 530 бек обіу БіУу біу пем Маї Сп о Рхо біу Су 1 5 19 15

Бех ми Ату ви Бек Сув Аза діа бек біу рБе бех Бех Так Авло тує 2о 5 30

БНів'таї Ні То Чаї Ако бій діа Рко бі Був шіу Гей сій ТкЕр Мах 5 49 45 ек уаї де Ткр о Біу Авр о біу Ар Твжх дес Тух Авп оЗвЕ Уні бва був 5о зЗ5 бо вк одха ге Тк їїе бек дхч Азроаєв о Зах Був Аг ожлХ Пес тут Бей та ТБ во біп Меї двпобех без Ага Аіа біз АзороїБбу Ата Уві Тук Тух був ДІВ ва 20 з5

Або Ба Цей Таб нія Тух Тук уаї Гей оАіа ів Ттрооту сій бі ТВЖЕ 00 105 ВЕК) спец чаї Так ові ек 115 «війх 1 «віта 17 кеї2з РЕТ «13з Штучва послідовність «ах 2235 Олис штучної послідовне стя: Синтетичний попіпейтид каз 1 біз чаю бій рез Бій бли Беж бЗіу РЕО 5іУу бе чаї був Ро Бех ОД ї 5 15 15

Тпх Без БаЖ Бей Тйх Суб ТлЕ Увь Бех ЗХ Ре Зех дек ТІ Ава Тут 2 і5н Зо пів Уві Нів Тер Ії Ак 030 РКО жо біу пу ту цей Бій Ту Ме 49 45 сту зав тіє Тур зіу Ар ось АБЮ Тве Бек Тує Аза Бех Уаі Пен оПуз во 5 БО бек вго Уві ТБЕ Її Вех дру ввр Тв бек буз Ашв о біп Уві Чех цей 79 75 80

Бук деч Бер Зею Уві Ти дів Аза Ар ТВх Аза уві Тує Тук був Аха 85 Зо 5

Вхт чіп пей ТВі НУЄ тує Тук Уві Бей Аїа Атха тт сфу сій біу ТНт 100 105 115

Без таї Тк оУВЗї бек 115 ки1їйз 19 кЕ11їз ВВ ка» РЕТ «13» Штучна послідовність «ВО. «ЕЕ3з Опис штучної послідовноств: Сичтетичний паліпептид

«ад 12 сій Уві сій бен Чаї 510 бех біУу бгУ с01у Без уаї 0їй Рко зі БІ1У 1 З 10 15

Беж Пен Ака Гей бек Суб вів Ха) Бек Сі» Ре беж Бех Так Аа тую 20 25 30

Дав Уаії дів хр Зах Аа Зі Аіа Рео бі Бу ЗіУ Цей Бій Тр Меє 35 ві 45 5іу уаї Ії Тк» Б5Б1у Авр БІ АзротТлк бет Тут йву бек уві Бей уз

Зо 55 БО цех Ахоа Бе ЖТас оїїе бек одку Авр от бах ув АвпоТвх УВІ Тує Бем 55 то 75 80

Єїп Меб Ав бек без Ак Аза біз дзротТву Дів Уві Тук Тук був йдта 83 о З5 дху бра ей тк Ні ТухкоТук о Мві рей Аза Аза Ткробіу біп З1іу ТЕ ї2о 185 110 їв Уві Тк оУаї Бек бек Аїва Вес ТВк був ЗІ Рро бек Маї Ре Рка

ІтТ20 125 їен діа Рус бек Зег Пуз бек Тех бек бтіу зу Тйх АласАїа Бех Бім із 35 149

Сучз еп бай Був АвроТук Ре Бгто спа ржо Уві Тв Уаї бвк їтр Ав ї45 150 153 150 сек біУу Аза рем ТБ оБес бЕу Маї Ні ТО о Бпе рко Аїа Узь Без пів 145 179 175 бек Бек сьу дей; Тут бек це) йех Євх Уві Чаї Тахо Ув3і Еко Зек зб їі80 185 153 бех їви сіу тТвх сіб Так оТух тів Су дей Уаї А5п Ні був ршо ЗвЕ 155 250 2595

Авп оїйх Мов уві Авз)з Бу Був маії сії Бе Бу ЗвБх Сук 21а 215 220 «102 13 «вії ви «кі2» ват «ВІЗ» Штучна послідсевнусте: «880» «врЗ»м Опис штучної лослідовності: синтетичний поліпептид «4005 13 піц Уаї сій пев Уві біз бЗег біу Б1іу піу ев Уа бів ро бі б3у 1 В іо 15 бат Бемодує Цей бек о Сув АТа а! Єву біу Вре бех бат ТЬх АвпоТую 29 25 З9

Нів Уві нів Тхв Уггі Агу біб АТа Рко 01у пув о віу ей о бІч тер Меб

З 40 З іу Уаї Ії тко 5іу Ар оВіУ Вер тТпк Бегт Тух Авц Мах Уві дез Будз

Зо 5 бо

Зак Ака РБе Тв о їтів Зежх лЕФ Аво о їБу о Зек Був Авг Твгоуві Тукорей 65 78 та во сліпо мес АчпоЗаек їв Ака Аїя 01» Азо Тапс о Атїа уві тую тТук Сув Аізв | зо З5

Вха бяп лей Те Ніївз тую жк Уві Гей віа Аїв тк ЗУ біп зі Так 100 155 150

Без ах Тпх Уаї Бад бех Ліз Зах ТЕ Буз бі Рко Зех уві ББе вхо 115 120 125 їжи діа Бхо бет Зак Пув бе їТвВкК Зек п1у сіу Так Аїа Азїа рей 915 130 135 150

Сув ви Майї був Авор Тут Рре Бхо бі Бро Уаї Тахо Уві Бех Тхр Авд 145 1550 155 1650

Ббег обіу Аїа пез СМлх бехт З1у Уа) Нія Тах Ве Бго Аза Уві ей бів 165 170 ї75

Бех бек Суу беп тує бетх цец Бег бех Уді Уві ТВх Уві Рго бек ЗеЕ і80 185 1995

Чех печ сіу ТрЕ ЗР їх Тух 16 Суз Авп ові Азп о Нів ру Ро бвг 155 2Ио 205 двпотих Був Уві Авроцує був Уві бів Ркб був Бек Суб Авробув ТЕ 213 215 220 нів Тк Сук Аіїа Аїа «шах 14

«11» 107 «зд РЕ «3 Штузна лослідовність «ва» кошЗ» Опис штучної плоблідовностії сяювенвниний поліпзитий «00» 14

Ав лів сій Мет ТВ бів бек ото Зак обБет Гевіи 5Зву дій Бех Уві б1У 1 5 19 15

Авр Агу уві Те її ТБ був Ака Аіа бе біз Азр о цаб Тук Тух Авп

КОЕВІ 23 ЗО рес оАЗа то тує б5іп біп о буз ро біу муз Аізіа Ро Муз ва обов ї18

ЗО за 45

Тук Ар ТЕЖ Тук Ага без А1ї8 Авр о Біу уві Бжо бек Ака Раасб5вех б1у 5о з5 Бо

Бек сіу бек йіу Тпк Ав оре Тахо Гей ТВт ї1їе Бек Бех бен біз РКО 85 7о 75 ва стій Авр оРбе Аїва Тех тух Туг Сує тп зі Тух Тух Був вве рт РБе я за 55 тих вве еїу бій бтїу Тих Був Уаї біб лів тув їоо а5 «ов КЕ чої» 214 «ей» РЕТ «ІЗ» Штучна послідовнаиств ках «УЗ» Опис винучнаї поопідовностії синтетичний поліпептид «От 5

Авроїїв біб Мее Те бій бек Бко Звк Бех їзо Бех Азія бек ЗМаї Є1уУ 1 5 10 15

Авр обкуа Чаї ТБ їіє Те Сув Яку Аіа бЗех сій йвроїєй Тух Тух Авп ін йіяа Ткр Тук Сіп Аку Ппув Рко біу Був Аза Рго був Без Тем ІТе

Тук Авр оТах Тук Ака Тез Аїа АвроБіу Уаї Бо бех Ако Вп ощек СІ1уУ

Во 50

Зех о1іу бек біу ТвЕ Ар отух Тпх Бей ТП оїїє Зех бек Бей о зій ха

65 то ть 80 ї-хїй взо Рпе Аїа зве Тук тус Сув біб бій тує Бук Пуз Ре рт окде зо з5

Тнх Ве сту СьпоБІуУ ТВт Був отак сії їі пуб Асо бе Чаї АТа Аза 106 105 119

Вко бек чаї Рне КЗ ре бо Ро Бех Авр обіз бій Бей пу веї біУ 115 170 125

Таж дІіз овак Чаї Уві був рей бе) Аві дви Рпе Ту Рхо Аж сви Аа 130 135 ї40 ув Уві бій Тер оп Уві двзр о Аяйп Ада рез біп Бебо осі бзй бер Кп т45 150 ї55 150

Сій йет Уаї ТБ Стій Сів Аворобек Був Авробав Тк Ту о бек сей век 1655 175 р цек Тйк Пес Тйх Бей бек Гуд АтТа Ар оТук 01 бує Нів був Уві Тухг 78о 185 95 дія Сув бі Уві Тв Пів СіпобіУ пер пек Беб РкЕО Уаї Тахо буб щеш 195 209 205 вВпе Авп Аса біу бі Сув 215: «ко» 16 «11 ЗИ «12 ДНК - «ізх Шеуєна послідовність «ВИЙ» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний полінуклесотиі «400 16 часаєссацча спазсосадзач есазоаседч стстссусов дсагачасцча сепгкакаао бо «сстассіскс зсоссаціса дуасссстат сасзассосоу сотовсвеса чдозазвасся 150 часавацесс совзасебась сявсстаєсчає асстасозес сучстовсво губсчссавас Т8 ссЕсксваса дсгдсаоасад саутасссавс єткасостсов савссвоуєє сосссоаовсу 240

Чаацпаєсссу сстстасттасса ббогсацеаа карівосваст сессосисосво скора всас 200 дчсастваву падаавтсова а 321 кої ІЛ «гії З

«ли ДНК «13» Штучна посліпловикоти «Ра «3» Опис штучної послідовності: сивтетвичний лолінуклестид «ож ху чахавбссвоа стоайсссачач сосавасечо стососоуєЄса Збохаччасоа тоскасеасе 50 «спасссвьс дтоссазаковВ дчвоссстає тасавостяЗз ссбупсаєса содсвавессо 129 пусзаацеосо сузазеобет сакссзбове асдівссасс баЧекуаєсту вохпссявує 80 счссїсачеа зсачесочсво содсвосвсає бабасесков саасрЕсасс БсЕссВОссО ай чЧчазчавїкоу себе тавва ссуксачсза Бастасзааю всоссвртвас ЄсЕссоачеса зо часзесзавса бачавассав а 323 «а» 18 «212 705 кхеї2» ДНК «13» Штучна послідовність «ех «вва» лис штучної мнослідсевност: синтетичний полпінуклаотий «ВО 8 агсачззазза сачстаєсос ватсосазее десоксачеса ЗК сЯстас ссосаувосая що чебчцавкаессе заасцчаєоса сзабссвавдс васевесссся созосоасвач ссадсобоео 129 естаєтассєї здоссохясесач гЧачуаєсссс созтсвсавсо соЗесбудва Ссзспозсаза Іо соучасаває ссссувассї сесесаєстає дасвосасесо пдоссччогсса спобоасеаєсса 2 вцсисцЕсьсСа чецасачеоУ сачсбусаєе цастабасоо бсававЕкеЄ Ззкесошевах зо сесосгачаєк сСецсосвсств ссвессстат савтаєтаса взесвосотек сассгсоаУ ЗО салочевсока задівзуаває сваваєсуєвоя діаЗсуцесс саєстабссе сабосоюосоо йо ссаєсстоавсч воссазегЯва агобооаздов соссостетЕоа сосбЯасокуєє спвабсвассвео «80 тассссоаозач апдуссвавз: асазсосава дезосвосвасу сссбосваєс здудевасссю ака садозчасис ссасададса пасачсавзо сасзадсавссї асауосссву сзасасосту 200 асастчацса надсачаста ссабаввсас ввадессасс серЯсозаує свсссаїсеч що чЧасстчадес сассадтазс ваввацевкк заїлзувсоада вуса ча «їз 15 «й1їз З5і1 «в12о дих «135 Штучнв послідовнастлв кад» «ші» Опис штучної послідовностії синтетичний полінуклеотихй

«400» 15 садчсусацс босасцачсо гудасочзау сісцссавос стасвоволавс сековусово со асхЕдсасся ссауесозсте свостстасо аасбазсаєс гдсастчдає ссуссадюсв їхО сстссадаасчу ссссоудачсо чассоставсо асскодоФаоса асзчочасас асрссвовас Іо бссдсссслпа вчаусеусоє свосаєсься усгодасассє савадхаєся все соскс аз зачессачсї сіІдбсассус васодасасв ссзасставт вассабчеася ссСавсроасе Зх састаксвся єстсадсазс суч сав подасссвод езсадтекс й ЗА «10 20 «Фі а51 «вій» ДЕК «еїЗ» Штучна послідовність «ред «ТЗ» ОциЄ штучної послідовності: синтевиний полінуклвотид «4005 20 пажибуусаує кусссузаєе єодвобсоау сесокссаде стЗасучозу сесадеувстю 6 кесвокосаз суаосоцове бадесстасо засбассаєе гусассяас дсуссвцаса 129 сегсочазау сосссчоазса одаговост вессасасос асучосасає абоссасває 185 бесчуссгЯВ адзссовЕсв сассщхвссс соусдзсайсь сазадчвасає обсссасоке 24 зчасвковас соуссчезо адзочдасавса сасаФчсстаке астчсасасс седасковос хо саскаєссясе сессопевас ссосчоадссава одааасесвод бсвсвосоте з 351 «810» 21 «815 ЗБ «212» ДНК «2153» Штучна послідовність «-й20У «вва» Опис штучної послідовності: синтетичний попінуклестий «сп вх сасубосСаче гусвачазес боадасозаця еЕсобсазас ссачедадаєс ссковасскео бо: астсчізссц Буачедасст савостксваєс аасвассвоо босаскаЗає сепебачоєв 129 ссізсочадоч Честозвчсу Часласеаве авсеоочаса асочсзчаєас асссбасвас 159 сссоссстда здачесуюає сассавтєссе сусоасассу савазаассв аЗкеЕсовоте 4 авдіссчадзстї ссодссасосЯс засодасаов дсаутссавз вебосусвея овасвдасс КВ. зассвісаса ссісодозоас осодчассяав дочассосвпу ссвсвчсобе о зв1 «2103 220 «вії 351 «війз пНК

«2714» Штучна послідовніств «23 Опис штучної послідовності: синтетичний полінуклесзтив «ах | Щ заадєчсвце КоЗессачес содазосодо сбсубсоадєе ссодєсддасє сссасуєсте 5 ссетізввсасй ксвоасачек сезссстасс зассассава гчсастщеє десоссводта 170 зехадсавоя доскчоваву дакусобохс асекузсзоя водосдаєсно вбсссасаво іо соми сссов азасвссяєи сассаєсвос сусдасаєсс сайауачеає субтгассо 245 савцвсдваси осстссоасЧе зозадаевса Чозчїставе астчсабаса ссазассдаєс 305 сасгаркасу сеЕсСсодсадсе скууочова сосвовстяш срасадіобе Зі «М 23 «2115 853 «їй ДНК «віз» Штучна послідсвність чав? «ви3З» Опис штучної чослідовності: синтетичний поліцуклвовид «ОО» 23 чаЧдУуєЕсаяс кавссувчес спозаУсода сстодкесаце стоазгуотає ссгосасеке бо тест осгусад говасзоудосе садовсрасо вабсвосаво счсассосює чезсачдєа ї20 сетосавача зсстосачеа осссозобаке всісолозсо асзосчатаєс восствсває 153

Есеуєостоа азчазссусто сСассабусс:х суссасасстї сзавсавакас сусссасосси рай гачасзевась скросссосус асазчасаєсв дезаєсосаво сскасасасєст сосааствасе 309 састатєтсася Ергсочсадс ссзсоуЗєсав чодЧастскод бсасезссе чассдстесь з6о азсавватаєс сабссодесев сосостоадса сссесссоссв воаусасссс спсзбосаса 42 зесосестсо депасстучи сазсуассас сбсессоцадс сочедцасоої ссеусадаас 8 хсазлсооссс созвсснасао сасасвосовсс бсвссазцссо Ессрасавсю скЕсвоалаєсе Зо чартвсстьса чевасобоці дассубасос ссвусвась боподсассса дасстасаєе Бо гусаасуєда авбссасавосс саосавсаєсс авоуссдаса зуазасьсса зсссвавтсї Бо жУЄ 63 кій» 24 чеії» 587 «а» ДНК «13» Штучна послідовність «г2ах «223» Опис штучної: послідовностії синтетичний полінуклестид

«000» 24 чачсасссвос Бутессвуво сзсааосоуа сгкосссадо стсстдоувУ серусувеко Фа стек осая ховасуассЕ сачеєсгасссвастассака тесасксяах чепкевощеа. 120 спкчччаваза чпоссоззача засл астролазсоя аслчслахтас агссововас 185 ссспроссов возассУсЕс пбассавесее састасвосвї сезвавззкас соуїстассто зай садаєсчвасє сестесподо ададавсаса дсадбставт аосясосясо Єовастувсю 380 сасстастаса сгеЕтововос сбочецесаз ЯУузЗасессяч бевсвУсеко даосасвссЕ 3805 зсававцчасо сабсозесво созеосссуса сосстсстосСв вавосассос сочдодовова 45 чсаЧсосстоу Четосесоуоє сзапдаство Бкесоссозаєс сустозасвов десовозаво 489 гсесдочцсесо ЄпассазссаЯ савчсзсясо себссочевоа состава сгсзусвесо 230 кастсостса дсадсякоае пассопдвоусвє сосвусваєе босчсвссса чзвоссзсвЕе ко суєзасчсча ассасавсос саЧсавсасо авудкодасв ацаваостояз досоваатосї во гаєсасаава обсясасас сассуюю 687 «ім 55 її 384 «ій» ДЕК «213» Штучна послідовність «вай «ва» Опис штучвої послідовності: синтетичний полінуклеотий «по» 25 асазазазочв сзостаєвос гаєгтасавчсоа ЧеосскоЗесо овес суєтає созрадедсева, Б чЧекузовісс язасдассоса чаодсоссввус вубсскопосо ссядоутасу оБасспсот 156 асьаєсасстї десоїдссао ссаддасобс бабкбасавсос Базссвудва ксадеодівяка І80 ссчачезхаву сесосуваусь чессавсове чакасяхасс достцассаа соус асвоса 24 адесатЕвЕса сіосевасас сзоасазкасс дассвбассс ссасвассбо здосбсксова Зо ссоусаалаве Седссьовса стастоассащ савасзеібсаса воїссеспи сСаєсскеспть ЗБ садсусаєста авдтадазає слаа Зв «шо 2 «В1їз 7и6 «їй ДНК «213» Штучна послідовність «гр» «ваз Опис штучної послідовнастії синтетичний полівуклеотий кап» 26 асчававача соцссасаде авбспасауєо дсчетадева совеЕовссрас сосуососва 0

Ччепоаавчовсс васоцассов чІстсовоаЧс ЗавсБЕЧксес здостсаУоУу счсебУсоє 179 соосстсаса савасспадсзчш соссвосоо ассааєсасс вгобосасго сдсчсосово ІВо чЧсесстаоча «оцасссоача зоузахачає заст чсдасуєсва басасоссаво 245 часбссзкос бдавцачосЯя ЕжжЕсассвтї собсоакавса остовавцав сасеасесас З сЕссауаєуа асссссусся Соасадазчас асадсазєсе зссассзкас асуссвчасоо 3Бо всссрсастаст вояк тсЗс аосссоаясЕ савадудасос соадссасазе сеспачеЯсЕ: дО тксхасаввУуч Чоссвсза5 бгусссоессЯ дсвосеесої севадвачесво сксгозЧчоае «50 асасосаассс сусоастосох чУссавечаз басссссгоеч авсовусаво даєчесусоє 330 застсвачса сессаасосзц содсузсово арсегсссяя сстасессасх чессесацух 500 звстасвсссос тесвосядеЯо осдбдаооясо сосспобачса досскооддосвс ссаздасстає во асссцсавет спуааи:свсва досгапсвасє посСавчавеч асазсвавах Ечвососава по коза . 726 кй1й0х 27 хаті» 750 «рї2» ДчК «13» Штучна послідовність чех «ва» пис штучної поблідовностії: сичцтєЄтиесний полінуУКклЛлестид садах я аедаасевуа стссівтаєс аахттзсятко зсастасста чи счссво судбодоцева во

Четсазсчксо апстчассоа ЗЕссіоуадас досесттасоп адосгсокує дуадестоаєсує КО сетскстсастл свосозусоя срісачесес ассвастасс абстасаса часове 189 десасседова пачасссцоав чгподасзаяс чоскаствода дсдасаччоса сзсаксство 246 азсксповес куаазсвоссот ссссвосвіх їособсзчаса ссровааова бассясетає 300 ссссзчахсча астстсксевоеа сусачачсвосо всвусвоасесє аствсгцутос асабславосо 360 асосастаке асЯгссрсуєс вуусекчацує сааачоазове бочссасває сбечачачеє 450 текзсаваде дессавусецЕ сігсссоста дсасосссоб ссвадаєсає сісгспачацо 45 асадсадюсс бадаостассї добсвадово сасствососо засодуєчає сусовсосоу 54 засссачасч сесізасево сзчсабдсас звособссову ссзсосвраса чеЕесоскоача БОЮ сЕствесебсоос ссвзусаоцечс аусдасозеЯ сссвобацсв достигає ссацвостає БО звкстасавод соавісасав дсосвясвас зсбевочьсу асавдчаваяє Єсацоссала 779

Есєсукоавса авастсасас асдсаососа Т50 «ій 28 «віз 1438 кеїгв ДЕК

«215» Штучна послідовність «223» Опис штучної лослідовностії синтетичний поліцуклесотид «по» В захдаяавача садстабсоде азебудеваву. десетечсву сЕсссвіве сдсаососва бо чоїзасвісе азасчассса частосазас аосоксксоя совасствяц сувесавУєя 120 ассястасек шсспбассас саводасскс сабгзсавсз сзсобуєюта Ксацечвава. зве ссоадчасазадч ссоссузазчев Зсссакстає Забвссосасо чесеочцсЕца соЗкУгчсев ап ассвасвссз усозсазсдю сазсязЗсасє чвогаравес єсасваєесо ЧеЕссобссад 305 сезуавуаєь Бозсесксівса ссаврабсво сватаєтася азбсосевьє сасоркечеє Зо свпачевесса дадчсадеває савасаєзсаЯ чкадсооссв бакссасеке свостссосо 125 ссабссзасо вопсачесовя асеєсуаваес дсстссуску сордесвось чаахааеювсо зво касоссвава адуссзазох всвосутаза Збадасавоя сосєосваєс дадтавосвоо зо саочацадкс гсасачацсе дигзседсаво Звсацеассс асасссісва садсвосско оуо асЯдсбуадев застадаста сдабсавасас взадссівся себуєсвзадче сСассосеєсад 550

Чоасссчачесї сассадуаас звавацесєс засаовоочу зУусоссвааз сЧавчавадає 720 спсрасваса асвЕЧсаЧсчо сус сссад се сасвасо ЧЕддЧсасвач ссуаздуєтса зво чехсчиссаве ссводадаос состсзс оса чссечуєсоче ечсссасаво сскссбакає 84 ацізачссоє сСссацебста сосзаєвбассв боасдсаскца пбососовоє сасстдодсава яоо

Чадпосодпат гудчасачося гхасссобоу счасзуссає асасестасв зосссшеоссь ве цавацаасоде Стсассаєбеє сесЯбцавсає стсаазогває ессзустіасо сесвавесда 05о сіссстссЯс зсазадучаса сассаубвсва сбасозбуса сагбсавстов ссорасевоке 11530 сассссдоса Зостоадоасс вадузасссє сдбоводосс ссдвоасоств стасааашая 1140 сссайсудосв бкссссптод сассостаесвс севуазсасс ссбспзоацеа садедуєссе 12855

Чецекессья чесвачуасс авспоссссда воссззбсасо чЕчеісосчаа всоспаасее 1250 ссізассаде зчасусосаса ссоксоссвас губсстасяло бостсзодас ссоівобосоє Ко садсздсусу стоассуєде себсеацсву сссоудсасос свдасеєвса ЕссдсявеоЕ 1280 цазксасває сосацеваса ссавоусєсда саацавацчеЕс овасссазват ска ева 1435 кат «215 117 кий ВАТ «б1і3У Ваїєця 8. «ак» иа. -щлі Маї біт їв був бїо Бех Бі РКО спіу пейп Уа» іп ба бех ба 1 З ї0 15 тис ТВі Зех бе Тв о Суз ТЕ уві бер осіу ВНе Бех бек ТК дбо Ту за 25 Зо

Кіз Уаї Ні Торо Уві Але сів рРко Ро БУ буз щас цей біз ТкКЮ Мес піч Ук її ТЕрозіу Азоб о 5ІУ Авр о ТБт бої Тук лап Зак Учі Сей Бу

ВО 55 53 бвт Ах Бей бак Ії Тр Ага АкроТБК бек дДхо бедосіп Уві спе Гей то 75 во

Буз Мес бек Зак'їйви бів ТВ обіч Ахб ТЕ Абе ТЕ Тук тує Су Аза 85 З0 за

Акч бія Без ТБ віз тує Тук Ууяії їй Дт АТа Теросьу сій сіб АТа коб 105 110

Зех Ууаї Так оуві бег 175 «В10юм 30 «11» 7 «рій ЕВТ ке» касков вр. «пох Зо

Авв іі іп Меб тлу бІВ бе Рг Аіа бе пес Бебойіа бек рей РУ 1; 5 ЕН 15 бта тТвж Узі Тв Уві по Суз Ака Аза Бех бів Авроїев Тук тує Де 29 25 30

Квзмовта Теротук сій ко цу Ро біу АвловБаторто біпоїео Бей; о ї1в 35 І о) 45 тТук дев Тлу Тук дка Пец Аіз Авробіу Уді Рез Бех Ах ВБе бВех бу 56 ЗВ Бо ек С1у бех бту Тлж біл Тух бек фей Буг Іі Авп оТПжк оцей Бо Бек 55 7 75 ВО б5іу др Уві Аїа бех тух Рів Сув біб біб о ТуУуюк Тук був Бе обко Бва 85 я па

Твж Врпєе біу Бек біу Тв Буш Без б)й Меп Пув 105 т05

«10 31 хаїї» ЗЕ «гло ДНК «135 Каскив яр. «400» 31 часаєссаца Бузсвснцсє Бссадссвос зсчгстасах сресодзоазча евосуєсвосє бо чесочасуєс Зачдсвассда пасок сас басзастбау сзсочраїса дсозаватосв, ї2а поачазоссоко сЕсзастсст Часстаєсаає зсесакачає сассваагсах чаоссвоса І80 спбсксвосо довасоЗасс годбасасау саксстосза зуасавасає сссобовесюЕ 40 счазаїєУуєсо свадссаєьк соухтсвасас вабєтасаави сБесабЕсво зрЕсоаусков 390 бччассавос Єодуадесоав г 321 «їй» 39 «ші з51 «їй» ДВК «213 Бвевсчв яр, «400» 39 своацсцсаає спдаадзацес відабесочс ссаусусаче ссоксадаове сссажокево 50 ассіцсаску сгосоідауЄєє сссабсваєс завтассавєс сарСассоадає сссасаЧесе 125

Фсачочаваав дЕстсчазса засоаодассв асдссоаЧчоава асууававоєс атсасатавє 185 тксвзсссев айссоссчасе даосассаєс зЗаозсассс ссазовоссв адсесвсвеа 240; завасчацчеа ЗксеЧеваас здадчасасе дссвссбаєх абсостассвя чевахссЧчасе зЗ00 сассвстаса шсссодовас сечу сав осообаесессаєт ссастлцьссо ЗА «віп» 33 й «21ї» ЗВ «2122 ДНК «813: Каши вро, «300533 айцчодтосас ссастсавсє сстозчоЗсва бастассавє ззаєсасаєяа зуосвеасою БО

Ччасабсосвов їдасвсяото госадстісс стосстосає сосссчовов вастабсаєсо 125 чесчааєцес Чдвосвачсза здовоссбсввос бабваєсєва собапьасст деоувавося 180 чдопавстскс ссєваєстесе дасствесве асасабвеає содсачаєсу пуксссахов 240 счасссазсо чозекчастс гЯдсасасва басвосесва асасайасає собубсаєее 00 ззачасессоя сайвдесавес сточбсазсач бастасававае віссасвсво чсссоасеов З5О почассвачо сцЗдаасксве в ЗХ «гій» За «вії 408 «Іі дак «213» вабив р.

кхайпм 34 асадстатосє вЗуЧецекщЕЄ севскусету асцуасаїтско савуєтуває совеуксесад бо стодсауесув адсвоєсавад ассссуоессо сбдеадороссс садауассоє Ядсобсосвоо 129 тусасеуссь содсаєісіс зссавосазї Євссабсуєдо ассчауєсст всадоетеса 185 чзазааваєс стовоасечає Зачвосавта бочуЗвЗасо уздвсасасю зкаєЄваєюса 240

ЧоБЕстовгає ссодастдну сассзсосеату здасасосося ачадссавді с5ЕстІвавв запо асоацсачес сосавасода дуасаєсосос асесастаєт чеясовочса асссвовсве 3650 тастакасьс гоусезссіо чачусвадуя пстссваєса содїсссо 208 «210У. 35 «2115 197 «2155 РЕК кгіЗ2 Ношжо вврівпв «40. 35

Аврої1іе біп Меє ТБ піп обехк Ро беїх Бек їв Беж біа бек Уаї бІ1У ї 5 10 15

Звроджо Маї ТБ ї1а ТвБУу Суб Акб Аза вк бій Зак їі беї бех тТук їевн'Аяц Тер Тухк біб бій Був го біу буз Аїа Бго був цец о пйейп їЩе ща 45

Тут Віз Аіїа Бех беї Тепобіп пек о 5іу Ма) Кто Зак Аку Ра о бек б1іу

ЗО А: во

Зех бїіу чек біу ТпХ Азр РбБе ТВ їєч Тпж Кіе ех бек Бей 5іп го 70 7 7 за сів АзровББе Аза Тнх Тук Тук Су 5іп біп Бех оТук Веє ТЕЖ рхо їхр

В зо зв

Тпг вне біу бів З1у ТЕ пуз'уві бій ї1їв БУВ то 1055 «ОЛОЗ 36 «їїз 321 «12» ДНК «13» Нотео зарівтав «Ох 36 стпасабосауа судоссвабс сбавосіос седдссесосає ссубазпаза садатисасе Бо аксвпсбссчсо дупсвзазеса дЧаЗзсзсЕводо вдстасеєсвза асекерасся ссззайлвося 130 сопззвазссс стазвустоет забстаєост дсвтссацьс гогазазєза зассосасов їВо зачиЕбсвусо дсазіоваєс содувсасаб сбсассоїса осабсадево собосавось ай чаачастУтз свасстаєста сеЕцієзасая адЕсасачєа ссостоодас зо ссав щю чосчассвачу гадавассяв. а Зв «Ці» 37 «гії 11 «вій РАТ «віЗ» Бото зарізав «Ойх 37 бЗівн Уві із рев УЗ. Зіч Зех 01у БіУу сзу без Уа1ї бів Ехо сі 0Ііу ї З 15 їх

Зех їши Яка Без бек Су діа діа бек біу Бе Ту Уві бвг Зх дво 3

Тук Мес Вес ТЕр Мах Аку бій Аза рхо сіу Був БІУ ес біб ТЕв Ух

Бех уаіїі Т1із тує Бвкобпію зіу Зех ТБ: Тук ТУ АТа Аво бек УВІ Пує о 5 о

СЕУ вк Епе ТНК їі 5ес Ага Авроввр бек БУ Аво тв Бей Тух ре о 15 во біс Меб Ав: дес рез АК Ата б1ц дБ ТВ діа Уді тує Тук Сув Аа 85 зо 95

Ага Тух Бре Дер Тук Тхтр бі бія біу Тбробен Уаї Ліх Уві бек 100 1595 ї1ї0 «210» ЗВ «еїї» 333 «2122 ДНЕ «2ї32» Мото варієпе «4005 38 чадососвус сачесовсо соочодаояс ссодессвое спудазсове сстдауасос во ссекоїасад соксвазась пассоїсаче: з9свастаса «удоско сеосовоасї 1293 ссацдучааоа чЧччевсочвова чассрсацвьс асссввадео зЕЧасадсвои вбасевеоов 180. чассссавзча ваочсачастт сассоаврсксо асасзеавьс ссваседеаєс сесувавесї 340 сазаєЧазса одссідасачо суацдзбваса уссусосаєєт асбесусозу абассєьстас Зо

Еастчуачсо заздзасості пчесасоашє пос: ЗУ «2105 38 «РЕ» 11 «гій» РЕ «ві3-и Ното зворзепае

«чо0пх 39 із уаї бі Без сів біз бек обу Бо сіу Те) Уві Буз Рко Зех ПТ 1 З 10 ї5 тах цей бек їєм ТАК Ст Тах уві Бех біу п1у бат їїе баг бек Тк 20 25 36

Туш Тжр Зехк Тхр їТїе Ак спіл орхо РЕо сіу Був біу Бей сіб Схр її 35 40 45 біт тук Їїе Тух Тук бЗех б1у Беж ТВ Аква ТУуж Авй Ро Бек Бей Був 50 55 60 бек Аку Уаії Тпкхотіє бек о уа1ї Авр о Те бек о був Авп біо Ре бдех ії 7 75 Б) пу Би Бех Бех Уві ТПх Аза Аів Авр оТвк о Аіа уві Тук Тук Сув А1а 85 95 З

Ага Ту ВВе АвзротТую Ткр Щіу ій біу Тпх ва Уаї о Твг уаї бек по 105 116 «ато 40 «11» 333 «912 ЦК пі» Ноще завіса каб» 40 сапасосацс сосачавуєс пеодсосаєта ссобковаєе собсодадаєс секдксеске БО асстдсвска Бесостаосяоу свсесаєсвас вЯкеастастї созбобїочає ссддпсвасос Т2о ссазучаєзо чассозасьт чассовчсас вестассасв деуоазосас сзаєстасває ї8о ссесособоз ацадеслачс сассасзуся чгадасасяах совзачазоса зсіскесова о звасессоавшст сстаечаєсує сзсоуасасо ссесдеясасб астусосозач засо дас Зло тастозаусос ачодавсось Ус сассео тоб 333 «210» 41 «2112 1453 «гій: ДНК «іїх Штучна послідовніств ха» «ева апис штучнеї послідовності: синтетичний полінуклесотил «400» 41 звіЧалаайча сасстабсоє авктібслоба сссЕбодеа бЕшсссосас собадспсавй БО чЧекчаєавкЕсс задзбдассоа здадпссдвадо ззсетовову ссачодівадч ссаксугтога ТО асквЕТаєсть сісасоосая ссвопдасстс саксасоваос ссоасстцадба безастбада ХВО осоаддсзавоа ссососсаачис чЧекссасстаїє двтассосасо досскоазоссса саодвоєвоеса КО зассосквса ч«суссачсча садосесаст састатасос ссвсваїсос Ядоссогосає запо сеподаацасх бссостЄсва советассву сватаєсасв зажессотІ сасексвоче з6о сзачосаств зассіздавах свайсчсвош чгаподазсс расова сесо сасосессЯ 420 стаєстдаєч азсовчеецав аск освасо псегесаста бзсассгтаст ознак е «89

ЖагоссацаЗ вусссаваче зсачезаааг зуаасвася ссосбссвеєо чучсвасьос Бей вазчазадив сгсвосачаєсса чуасачсвяо сзсвасассє абсашесссвЯ сачрассова об асчссовгоцса звасачасіа севозаасво азаусстасо сссчодавеє Сатосаксяу сво часссовасе слосасіває адзаачсесє азгачаєучо апа евава вславсваєве тво свасінсіваев весосвоасоач счссавоссяу ссбсоссзоо поодечсева осчвауютеоа 7во чсясчесеЕсЧчад гсгоадазуєЯ сасЕасосВ доссоосцад асесеусоуво соевссоствє 240 «асчассзче сссадсбста ссавескасса сусасаскод пдедечесаоя сасогудсав. 90о сЧасссечова сопоасочасу стасксцодо содасодезве асаєссєвов всесофисої 96 чавовосоду вссассаєку ссоусдвасас ссосазвозає ассуктЕсасс тссадаєсаа 1028 сЕсьсрссоо дсадвоасаса сачсаосста бсасБасеса савсзастца ссоезотасса хо5О сестекудесв сескосбовзЕс авучадастев дассвсасес бодачесасве сптасвавяуу 4149 сапассауке сєссоостач сассстосво саадабсасв Собспууадєв. заясодеось 12709

Фучесаевьо чссазадаос ассессосєеза аосудсдасо зкуссуєосв ваоссадовє 1260 согсзссачс пасосасася сосесссчас ЄЧІоссасва Бостсвочас хстасоссо і359 падевцчсссч стсессасус секвовасау стсводсвсс садасстаса кобосласцу. 138 чазссвовад сссасеваса ссзачеєсса свадазачьє дадессевах стетсотчасма 1549 вастсасвса сасусечсо 1553 кші0: 45 «Від 16 «ЕІ» рЕТ «13» Шуучна послідовнвісте «дух «ва3З Опис штучної послюьдовностії: синтетичний пептид «во» а біу ве ТтТьх Рое о бдеє Авр о Тух Тух Меї Аа 1 З 16 «210» 83 І «хії» 17 «п12У вт кшідж Штучна послідовність «во

«аа» Опис штучнеаї посльдповності: сивтетичний пептид «Юм 4 бек Тіє Зак Тук Біц сіу Бек Бас Тпх Ту Тук суіу Аввобек чаї цу ї 5 їй щ5 у «й1ійх 44 «її» 11 «2122 РЕЖ «е13» Штучна послідовністів «пейУ «та3» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400» 44 нів АвроАязр Бех ро бі Тух Тух Ре АвБр Тук ку а 10 «10» 45 «2115 11 «81й» вВВт -913з Штучна постпідовність к«г20» «га3» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «00» 45 без АТїа біу сів йврої1іе Зех АБда о Маї бенойта 1 5 ї0 «Оз 5 «Е1їЇ» 7 «9135 ЕТ «ві» Штучна послідсвмість «во «2235 Опис штучної паоаслідовностії сойнтетичний пертид «Ох «6

А1їа Аїа вт АХЯ ей ІП. Авр ї 5 кг105 47 «ктіїж З «19» РВТ «Й» Штучна послідовнаєтжьв. «аг «ВВ Опис штучної послідоавностії сицтетичний пептий «бом піп ЗБ Тв вЕБе АК Тук РЕ бе ТВ 1 В «5102 48

«21ї» 10 кв1й РЕТ «813з Штучна послідовність «720» «ви3» Опис штучної йосСслівдовнастії сивтетичний пептид «ай» 48 б51іу ве Бех Бевз Тпс беж Нів Ні ї16 бБво 1 В) 10 «105 Ат «дії» їб «125» РЕ «215» Шреучна посліюьдовність «29» «вві» Опис штучної послідовності: синтетичний йвитид «ай 485

Уаї Має Тсо о АвпоАво Біу бЗіу Тбе іез Тук АБо) деїх Аза Мей був БЕ ї 5 10 15 «шій 50 «ім То «ріг» РЕ «13» Цеусна поспідсвність «ей «а» Опис шШвузної послідовності: Синтетичний лівптид «00 50 сіу Був Меж Ні Тух Тур Маї Пец Авр о Аха ї 5 10 «І10з 51 «11 11 «Рій» ВЕЕ «213» Штучна послідавність «КД «тез Опиб штучної послідовності: синтетичний пептид «ож 51 вВхч тах Бек січ Ав їЩ4е Тут бек Авт Бем Вів ї 5 ло «во 52 ке1ї 7 «из РЕТ «8132 Штучна послідовність «РІО «их дпмо штучноХ послідовності: синтетичний пептид кад» 5

Аве отв Ав Ах во Аза Аво 1 З

«102 53 «115 5 «125 РЕ. «ке Штучна послідовно. «ий» «ВЕ3» Опис втучної послідсвності: Синтетизний пептид «поз З сій НіЗз Тує Бек Ав Бір Рко тТхроТтЬЕ

З З

«БО» ва «вій 507 «12» ВЕЖ «13 Штучна послідовність «220 «ВІЗ» Опис шсучнаї послідовності: сивтетичний поліпептид «0» а

Авротіє біп Мех ТБ бій бех Рхо ТБ дек Бе йект АТа шед йзи зіУ і З то 15

Ст тн Маї дес їі бі Суз печ Аза біу бі Авр оТіе бБеє Авпоїаї о 25 30 їз Ата тжр оТук о біп бій Був Беж 51у СЖу Бек РЕ бів Пею Печз ода

Тук Аїва діа Депо Аху пев сів дер ос1іу аї рРео беж АхО Ре беж пу 5, 50 йеж бБіу ваг обІіу Те вк тТУуг 5ажх іва вуз тів о бЗвт слу Меб Ага Ро то 75 за си Аз оо діа СА о тТУух Ве Сув Сі бів Стах Епе оАкса Ту РЕ тей 85 3 ЗО

ТНЕ РН Біу щшеж бБіу ТЛХ Був ови біш бев Бук 500 05 «кій 55 «вії» 321 «8352 ДНК «іх Щтучна послідовніств «ВОх «23» Опис штучної лослідовності: синшевичним полінуклеосид «4002. 55 часаєоссача Сдасесазес бссвасекся стоссіосрає стоссчузавз агскуєсвосс во аєсззайєцєс Увоасвадчеда ачасактссс вабстїббад сабозкаєса цездвачьса 12 чаЗачакосс сксвуосоос чассгасусе дсавасауас сесавовеуу зусеососса 130 сцоїсссачса Зсачсезчаєс гоасасасує басестоєса ачатсастоад саєчсансоє 285 сваписавао сачаставее содссвасав зсЕсесваЯу акссосссво ссрвоуєссх 330 ачассазус гусдваскава а 321 «210» 55 «11» 118 «12 РЕТ «135 Штучна послідовність «ра» «в232 Опис штучної послідовності! синтетичний пеолідцептид ках 56 сіц Уві Рео їст Уаї біз Бех с1у біу з1у Ппей Уаї б5Бів Руб З1у вд 1 З 10 15

Зек Меї був Бен бек Сув Хаї 518 Зек о біу Рое ТВ Рпе Бек Вбр о Тух 20 25 за тТук Маб АтТа тТЕр уві йка бів Аїв Во Був пу біу Без сій Тр Уві

З 40 45

А1їа бек їіє Бех Тук бум Біу бек 5ех Тк Тк тТук Біу дер бах Уві

Зо 5 во

Був сту Ага тре тТВвЕ Уві бек дкЯ Вар їз дія буз Зеж ТВКопем Тух 55 то 7 я ів: біп Мер нів б5Зву Бе мув Беї січ дв о твх вАтвотзе ТУуж чук СУ

Те: зо 25 віз дк ців ВароАвровег орто 01уУ Тур Жук оРНе Авротух Тгробіт БІ 160 05 о біу Уві Меє Маї ТЕ Хаії ет «ій 5. «ав З «й122 ДНЕ «13» Штучна послідовність «пед «Вга» Опис штучної послідевностії: Сибтетичний полінуклеотид «ап 5 чадаєоссас сопсазчаціс БЄадодосазчє ссвасослос сібчавтово сесдваавссЕ 5 ссссдсоасад о ссссаяуас: сасеоровуЄ часбассаса сщоссазаЄ ссосрсааце ї2а ссвазогачЯ чссбоадазея дчісадсвтсе атсвоєскваса апдосачова БасвсвОсає 186 чЧчоздаскссз гцавзаусео астсастотс соссадасвса соусаававо сарсссвваєс 25 сЕссавассс асачіссзав сЕсссгодає асочеосаєьє ассассоєцо астасакцяє зо

Е -е ааЗ є я З ЧУ я З четазцсссач чЧатастасеє сЧагсакттоу дуесавачавоу ссвссчсево адссбоч 357 «вій» 5й «81125 107 «рід» БВТ «ій» Штучна послюдовнасть «а» «вай спис штучнох послідевності: Синтетичний попілвнтид «0» 58

Авр ті бів Мет Тк бів Бекоржо Аа Бех Гей Бах Ата беж Тов бу 1 Х то Ї5

Зі: ТлкЕ Уа Тв діє БТ Суз до Тпх Бех Бі Ава 116 Тут Беж Ави 20 25 Зо

Ісп діа Тер Туд Ако бів Дхо Втхо 51у Був Зех Рхо біп во їм Тїе 33 49 45 тТук Двр ТБ дви дру ів дін о дяр бі Маї ко бет дк Рре бех біу бо

Бех біу Бех біу ТБх Суп оТук бек їсєм їуз Ті Аза бек рем бів БВ 65 То 75 о бішобар Уаї ів Бех бух Рре Сув піп Ні Тує бБег Авп Ре Рко Те

Тс вве сСіу біу Бр Тржх Був без біз пе) Гу 306 тх95 хе1ов 55 «Ті В кої» ДЯК: «їі» Штучна послідовність «Рая «рах Опис штучної послідовності: синтетичний полінуклеотид «айоз 58. часасссваа сдасасодесс сеоуасвкев стцескдсає ссссЯочаче аастчбевос БО ассоаваєуєс Чвасвачьсча зчасавстає васаакесяй совстагасосц доводвааюоса 120 чучавзїскс сссасетосе даєстасчає всаваєачає содокавсу5 одеесооься 188 гпчцстозчсу усадсадаєс содсасасаа басьскобаа адеаєсвавсвч секусвасєое 240

Чавчасассс ссадесаєкх стзссавсає сесвосваєт бесід зас стусооасада зо часассваче сцоваксцдев я: З «2105 50 «2115 117 «тат РТ «бІіЗ» Штучна послідовність когпх «23» бимо штучної лослпідсвнобті; синтетичним попіпептид «8005 60 сі Уві бій Мем отак осі ех бі Рго 01у гер Уді пів Рко беж бів 1 У то І

Тв їй Бех бен Сг оСуя Ту Уа Ваг о біу Ре беж Бей ТІ бек Ні

В зб пів Ії Бек Ткр чтаї Ака біп Ро Рго б1у був Бім цем Су Ткр очах чо 45 сіу Мві Меб Тр Азп оАво с1у 015 Тв пез ТУхє Авзп бек о Аза Бей бив 50 зах дкЯ Рко бек Ї1ї6 цех Ак Ва Тл бек пт Бак обіп Уві Ре пе пу Меє бек Беж Тецобій Тих СІ Авур тп Вів ТЕ Тух Кук Сув Дуй 85. 50 35

Ак зіу пуш Мебс нів Тук Тух Уві Бей Ар оАїа тТкр о Зіу біз БІ Вів 109 105 КІ бек уві тих Уві двЕ

Т15 . «Е1оз 81 «ії ЗУ «від НК «піз» Штучна послідовність «ох «ві» Опис штучної послідовностії: синтетичний пелінуклестихй «Об» 51 сапусчсаєс тоавсауачіс азазессссос сіодсоцдсаче себсасауає совбусстого 80 асссудсассу сесссодсуесє стсаєсгавсес азссастста бассссачас содасвусеє 120 ссачузавач асетодасья Забзччазес аквусодааеєссасбоадусєас ахбабакаве Во ссадессссса адссьссасос дЧадсаєсвує асоочаєвеост ссозазадеся докоєсевта 240 сгазасцадса здсстосавас сдадвдасаса зесовестаєсс авебсотусова задосававаєт 300 засівесваса ссстодакоо сседчлесав суаозссксво ссассцтово З З51 «ті» б «2115 238 «12» РТ «13» Штучна послідовність «ех «вах пис штучної лпослідесвності: синтЕтичний поліпептид «100» 62 мекв біз стик АБО о ТНЕ дей пем дей Тбкроуаі цей Деу Бей ТЕроУаї ко 1 З 10 15 спіу бек Твж Сі Ав ТІВ Заї пед ТВх бій ет Ро Аза Тр зе озет 29 25 30

Уві бех рто 01У бі Ажш Аза Тнк її6 дес Сув дкЯ Аїа бек бій вгя 35 МУЗ; 5

Уві бек беж Шек Тс о Тук пек Тук Мет нів Тер Тух Зп Зі був Бо 5А 5 біт бів Рхо Ркбо був йде пе ї18 цуз Тур дїіа бех Взп ойей 01) Вех 65 То 75 во сіу Маі то Дів Аку ББе бех 515 бек шіу Жех бі Те Лврорле ТВЕ 85 0 5 ївзи їй ї1в беж бек Удь піз Рго Біо Авр о тБе Аза ТПх Жук Тук був 105 105 110 бЗіпонів бек стер біо Іїе вро Рго ТБ оВНе Сьу Біу БбЕу тТпЕ ув тей 115 Т2О Т25 із їтТе Був Ах ТЕ Уа) Аївз Атїз Рко Зехк Уаї Бе ІТе Ре вхо Бо ї1Зза щу Іо дет дво» біо біповей був Бех 01У ТНУ вія дек Чаї Уві Су Бей Ббеб 155 ІЗ 155 150

Авей Ав Рпе Тух Рг Ахт біз Аївї Був чаї Бін тур цу Уаї Азрв Аа

ТБа | 175 іТУ

Аїа їви Зір Зах біо Авин бе бій т) Зек ді ТЕ обі бів йзБ о Зех

180 і 130

Був Азо Зак ТЕ туго Зах Бей Бек ех ТпжЖ Без їж бзо веж Був діа. 135 200 205

Ар Тук бій Був пів Ббуз чаї ТУ Аїв був сій таії Тйх нів сій 51Уу 215 215 ва їв Зех беж Рто Уві ТБЕоБбув Бех Ре Авп Аку біу з сСуз 525 - ЗО 235 «210» 3 «21їз 218 «іа» РЕТ «кіз» Штучна послідовність «вв «иа Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид «Об» 83

Аввої18 Маї рец ТБкосій Бех Бто Аз ТВБуІ Гео Зех Мах беж РЕ біу ї З їй ї5 біз Аге Аза ТвВкЕ ї16є Бег сСув дк Аза бах бів го ув) Бвект о беж З

За тих Тух шех Тук Ме Ні тТхр тТук ів бСіп Був рхо БІУ ій бо Бо 4 а

Був їво рей ЇМе бує Тух Аїа деєЄ Веб рем сій совЕ бфу Хаї Ро діа охо ЗВ 5О дха Ре лаб бРу бек о біу бек б1у ТВх АврорБе Тв Це) ТВХ Т18 беж ви то 75 о

Беж май сіс Бго біл Аве о Без Віа ТБ Тук Тук був бБ3Хьт Бі Яехт хр. 35 зо я біш її хо Рко тв Ре бьу біу Зіу Тахо Був бер бі їХе пувш зго 1600 105 1

Тит Маї Аїв Аїа Рхо бек Уві Рре Ї1є РБе Рхо Рхо Баг дер ЗІ бів 115 15 185

Шез Був ЯХех Піу Бі йів Бех Уаї Маї Сув мес Мей Ава ДБА бле тує їз 135 140

Рос о йку 51ч Ата пу Уві Бій ТкЕр Був Уаї АвроАвг Ахас Пед боїв Зв 145 ІЗ0 ї55 ї50 у Авп бек б5іп біс Шеє Ма1ї тп біш біз двробак Був Авробек тву 165 170 175

Тук Зеж Пеп оЯвж о бЗех Твк без так о йей Бех рув Аля Аве тТух С Був ї50 185 155

Нія пре Маї Тух діа був бі Заї ТвВгоНія бія Бу Пез беж Бех рто 1835 200 2935 узі важ Пуя Зех Рпе Ап о Ако бСіу бій був 1 218 «10 64 «ії» Ті «рід ДНК «-2ііз Штучна послідевність «вих «ві» Опис штучної послідовності! синтетичний полівнуклестид чи» ва ї асоздавчасає асвсасссст Збтасчачеа стастестох счуссссада сросапезЧе 50 часаєтадтає базсасаєес кссобостаєс хтаєсідрас ссостддада чадодссвос уді айостсастоса чоадосацеса всазсчисвої Єсаєссавсосс абвуєсасви деасгпдтає 180 свзасадчааво садуасазсс всосавасвс ствабсзацу абасасссвя остазчависї 246 чадассоссоя Бсаучасссає ЄдЧовусадо ветоудасьо аштісвссоої сассвсосеє Зоо тсвасустачо содзоуавсь бусвасатає сассдісвус вогосекоооя дассостеос зб асссссуцео дасадассаа Чссудачаєс агзбзавста бодокувасо вгсзЯжссво 425 ахегпсовас саврстсчасчЧа псвесечавж сота азес сстосуткас щичсожуско 150: васзасстшсї агссосасвча доссавацев сазсчуавачо созасвасус ссбосавксо Ба зЧозастесвс возвзвасчє сабсводадсау чдасадозвад зозбовоста садсстсвує 2-00 адсасостов спстуачова васазастас дадчавзовся вадЕскасус свдсовзуко БО асссассзаз чоссувусто Чесопесвзса задЗацстссв асзойозада пса ТЕ «гій» 55 «Вії? че «е125 РЕЖ «135 Штузня послідовність «220» «аа опис штучної поблійовностії сивтетичвий пеліпептий «ОО» 65

Мес АвротТкв Тахо тТхр о Агя Маї Ебае о Суз Гей бео Аза Уві діа Зо біу ї 5 10 15

Аза Ніз дес біп Уві біп Бей Уві Сів Бек біу Ака біо Уві Чаї Був 29 25 З

Рго піїу два башт Уді Був рем бЗеї Су Був дів Бех сту Тух їі рКе

З 49 45

Тс обех Тук Туш Меб Тух Тер таї Ппуз сій Віа хо Сіу бій біз пе

З5 бо біб Тер ої біу 01м ТТІє АзпоБхо бек Авп обіу АБО Тйх Аво рРпе АВ т В во

Зі Був Вде Гуз бег о гуз дів Тв рей Трг Маі АБр бує бек Ата бек 85 о 55

Тс о АївоТук Мек З) Бевобехс бвгобей бо бек б1з Аврер отв АТа Ув 100 1о5 110

Тук Тух Суз ТБк о Ако бек АвросСіу Вгу Авп оАвер МеБ дер оБбех Тер біу 115 Іо 125

Стів о б1у тп цей Заї Тако оуаї Бех бЗет Віа Зеї Тк о буз бі рек беЕ 130 135 159

Уві пе Рко Бей Аїа Рео Сув Беї Аку Зек Тк бек оій Бех ТИХ Із 145 155; 155 169

Аза ївз бі Сув во ба) був Авр Ту Вва Рео осіб Рко Зав ТЕ уві ї65 Уто 175

Бех Тхр Азп бек бі с АБа ішо ТВх бек обзіу Уві Ніш Ти сРБе Рез Аїа ї 4 уво 185 ї82 уві йо біп о бак Шев бБІіу Бей тух беж Бе) шасє бЗеї Уз» Уаї їВвх Май 155 208 205

Бхо Зах бас бер Бей йпіу Тв Був Тк Тук Тк оСув Авпоуаї Аярю НІВ хо 15 о

Був Руб беж Авпоїну Був Уві Авр обу Вк Хаї Січ бесб був Тук б1їу аз Зо 235 0 го ро Сув Брко Рхо Сув Руб Атя Рхо бі: Ре Бей сСіу 1 Бга бах 245 258 255

Уві рРКе Гео Бе Рто Рхо Пух ГІ Муз Авгрв ТВжх цем Меї З18е бех Ах 253 й

ТВе Вго біз Ууаї Тк був уві Уві узї Авр уУаї Зех бій СМ Яр вхо 215 Я Ва тп уві біл бБе два Ткротух Узі Дер б1іу угй біз Мах Нів й лів

Ж ав зо

Був ТИХ Був Рго Ага біз Зі» біп Рбе Депо бек дта Тут Ака Уві Уві з05 зЗзй 315 2

Зек Уві пдейпо тик Уаї стїевеуц нів Бій АБа о Ткр оба Ав СБУ Був біпотує 325 З 335

Вуз Суз БПу5ж Уі бек Ав пу бу бемй Буо бех Бек тує 5 був ТОГ зо за3 5 її ех був Аіз Бу біУу біб РЕо АхХа яра ва шій Майї Тук ТЕ Гей

З 359 зх ха бо паб сбіп обБій пло Ме тах суб вп ЗМ Зак век цей Тих Су

Зо 35 380 їв Мазї Був б1Уу бе Тук рхо бек Азвоїі18 Аїв Заї бін оТкрозій Бех 38 390 395 400 двпобіє Бів же біб Ава АвпоТук був Тах ТБЕ РКО Бхо Мах во; АБе 455 жо 415

Бек дер біу Бек рРБе ББе Гео Тую Зек о йру Печ ТвБЕ Оаї Взр пек бЗех

Ка: 425 аз

Вха Жер бін біз Бу Авт Уді пе бек Сув бек Уві Меб Бяв5 бів вія аа 440 44 цей Нів йзпоНіз Тує Тк сій Був бе рес Бек обец бек рей 01у 455 45 «вій» аб «В1к» 844 ки12 ЕТ «гії» Штучна послідовність ких «пе Опуве зикучної послідовності: синтетичний пзлупептид «а005 66 біп Маї ій їТей Маї Ів пек біу діа бій Уві У Му ро СЬУ Ак ї З 10 15

Шеж Уві вуз гей бах Сув Муз дів бах 51у Тух Іі вра Так бас тух 2 25 ЗО

Туг Мес ту Ттр Уві Був бБіп о АтТа Рко бі» сій сту Бей: БІ; Тк Іїв бі іа іє Ав БІ Бех АвпоЗфіу д5роТх дяб БЦе Ав оз и пуз пе що Б 50

Був Зак груш Аза Три ей Тк о Маї дер Буз бетгт Аза бек ТВ вів ТУуг 70 75 во

Ме бів іо Бес Бек ец Аку бек сій Дяр тс оАла Чаї Тую Бук сСув 85 зо З5 тах Акад бех Азробіу ху Ав лвр о Меє АвроЗех Тк обі біб піу ТВх

Мн 05 Її ем очМаї ТБ бві Бек БЕК вів Зеї ТБЕ Був біб Есо бес УЧаковне бу 115 тах 125 цец Аів Ркго Суд бек о дед Бей ТЕ Бек біо Бек ТВЕ Аза Ава Пе) Бу їзо 135 140 ув обуви таї гпув о АБІ Тут Бе Ртб олія ро чаї тпх Уві беж Тхр Ави 145 150 а 160 тек сіу дів Пез Тк бет Сіу уд) Ніз ТВ БДе Ро діа Уаі Гез бій ї65 170 МІВ

Вот бет С1Уу Тем Тук бах їви бех дех уаї Уа1 Ту Уві хо бет беш і80 185 ї50

Зек Іва су ТЕ Буш ШАХ Тук Трт бух Авпоса1 АвроНія Був рхо дех 135 250 пз

Вап оту Пув Уві йаробув Аку Уві білі Зеє цуз Тугобіу Ро Бхо був 219 5 280 жа Рко Сув Рко вів бо біз Ре Бей б1у піу Бхо Зех Маї вне Гео 225 з35 235 40

Рпе обхо Бо Був РХО Бук йВЮ ТЛх ей Меї 116 5еї Ак Ти о вко б) 245 254 255

Уві. Тпж Сув Уаї Уаї Уаї Авр о уаї Бех бів БІ Аво Бк ки Май ІЙ 250 255 29

Бе одзи, їх Тух Чаї Авробіу Уаі 51 Уві Нів'АвпоАів Гпув ТЕ Був 275 280 255

Ро Авч СТ Бі сів РБе Авпобех Аїв Тук дко Уві Заї Бех Мві Шви 750 ЗУ 00 тТВжх Уві Тез Нів сій Ар отТхр оіви Ав сьу муз Сіз о Тух Був був Був 305 Зо ЗІ5 зго

Уаї шек Авп обу СІУу Пец Рез бек дес Ті біо Буз Тк їі бек Був 325 Зо 335

Аїя Муз Бі сій Рез Ага бій рРко Стіп Уві Тухк Таг обед реко Рео Бех з4а 345 ЗУ

Збій ста ри Мес ТЕ Був Ав бів Уві бе Без ТВх Суб без Уа гу з55 60 365 сіу Ббе Тут рхо ШЕ Ам їфе діа узі бій тер бів бек Дяй бі» пі пу пе ту хо БвЕ АБ а Аїа МЕ п оТвкр вас БВ Авт сту сій 37 375 зва то Зі: ВЕБ олвиИ ТМЕ Був ТЕХ ТБ Рхо кЕко Маї Пезч о Адю» бек Авр сту

ЗВУ 38 За 409

Бат вла овве Сей Тухк ек Аклоїбез ЇВ Уві Азо був бех вка Тужробів 805 ло 815

Пім біу Авп уві Ба ЄвгоСує бек оуаї Мет Ніж бій Ада їевм Ні Аза го 425 435 нів тую ВТНЕ сі бує ех Без пеї Пеа бак рей оту 435 440 «Ех «вії» 1395 «РІЙ ДНК кріз» Штучна послідсвність «ие х «таз Опис штучної послідовності: синтетичний полінуклестид чай» є зкочасточа сскачачосує соплссЧовЕа ссцостевасє свссвячесс осассеосво 50 чЕссвасєця сссазчксаза пассчазаєа Чеочцзачесеч ппЗсєссаєе даапесаюес 120

Хасавазсїс ссЗУщоквсас стссассацс бЄассасаврує зессооуєчах осасуєсуєлос 185 чаасвесодсс скчазкечає Сззачезчаєї азбсосачсв акосктакає хаассссаве 850 чадаавассса ацачеазаує сасасудасе Ядсачасааває соусовосвс адовеасву ЗО0 даечессСадеа спостбачасс кчаудасасе дечсссевЕЕ вскудгасаву ассочасаае зо ачезваєсався сацастсеїз зшуссаааоч зсосссячеся ссассосевбс ацсвсссасо. ща азуашасосве ссассткссо сосзсподесе боссссвзає стасссосов садсасачеє 430

Ччесссоцаск дсокуотева дуаєссвсьсс сссбавосяу гузсадЕЧке зудвасеся Бай спассесебоув созсоусЯє дсасвосоокос ссофзосаєсс вовуєосюс аедаєросає БО тоссетсвусв ЧоссоЧеЗас собЧесстос адсзачсісяЯ псводаачво сСтасасовує БО згабсссзовкс авсавосссва сазвсасссву усосвсавув заз бсоваєсс сазахасоФо 20 сесосабєуєс сассоагчссв апсасоїдчазч БІссбзазаз уасесвксаучу скесокоюхе "7 соспосвазавос ссозгацовсаяас бсотсзсодаєс боссодассос ссочваачссає чеЕдосеоаста 40

Ейцесусоз бссаводавоє сссосдабуєс саобссагвсї сесвсяатоца осока зо зіссабавсу ссавцасаваа еедсозчад зазсазавсса асвосаеца сечсасеве о зуссстотса себусокусе ссавадчвскає содвасчцав зчздачсасва зсосазучно 1028 їосвавсавач Чсессссоусо стосасосуаз ваавассвчст ссваацєссва вадосадосо 1055 сздацдосас задсодтасас согуссссоса ссоссаззацу зсвебдассва Завосаууєт 1340 адсстчасоє Чессосесва возесовкстіає сосадосовса содссбївов Чедадацатє 1905 «гахацасачо соуадаасва спгасавуасс асчостссоя есссчЧаєсс соводареос 1260

КЕСЕЕссоссВ зсвдсацоєє аасспсодає гауазсазчє оповудвоцо чавсавобее що ксвбосіссЗ счасусатєзча зчсвоебосас авссвссвов сасвудазчад ссбссосева ї550 хетскучаєв да ЕЗВА «2105 ба «115 23 «еїй» ВЕЖ «ІЗ» Штучна поевпідавиіїств хи2Ох «вуз Опис шрручної послідовності: синтериений поліпептид «ОО 65

Мек Аєр Мес Дт Уаї Рго Аїв о дій Бе) рей Біу цей Бей ПебЯ Бей ТКе ї З 10 ї5 еп ово біу Аїа ка був дар о Бі 10 Меї Так бів бек Ркб бек Бек ав За

Без бек Дів Бех уаї б1іу двр Аку аі Ту тіє Тахо Суя дку 18 бек за що 45 ши Агр Пейа Туп Тух АвпоПпев А) ЖТтротТух Біб Ахоа буз хо б31у Був

50 5 650

Аза вхо пуб ей зей їле Тук дар ТЕ Тухк АкЧ Пен о Аіж Ар о суу Уві 135) то 75 йо

Рез бат дз кре Зех Біу зек сбіу зак ошім Тк оАно Тук Тйт о беа стих 85 5 5

Тле Зах о Бєї Бей осі Рте Св Аврогбвпе да шет тух Ту Сув біт Біл 100 185 ЗІ тТУуК Ту Був Ре хо ГБне тву рве сту бій 5іу тах Був Уві бій її

ТІ5 120 175

Бух вх Тлх Уві Аїа АЗча гКо бог Ма) Бпе Ті Рпе Рго Ехо Вер АБО та 135 о бла біп ієм дув Бех сСіу тре біз бек уаї Уві Су ей без Авт: Ава 145 ї59 355 ІБ

БНе Тук Рко Да біз Аза пув оУаї бій тур пузв Уаї Авв о Ап оата їні 55 то 175 пів ех біу два бек біб бій бек чаї ТтБЕ бі осів Авр Бек Був дар хво 185 1985

Зех ТЕБЕ о тТук Шеж еп обех Бек тп деп Тбо Пес; обеєс бух Аїв АЗО о ТтТУє 195 20 205 сіє Був Ні Ббев узі Ту діа був бів зії ТВАЕ Бі біля 5ІУ рез бе мае 25 820 бек Бк Ма) ЖТпг Бу ек врпе Авт дра ву ій о Сув 233 233 «віп в «211 218 «бід» ВК «2і132 Штучна псспідовніствь «ий» «бай» Опис штучної посліловностії: синтеричний поліцептих «а» 65

Аврот1з сСіп Меб Тл біпобах Его бек ех Бей Явк Ата Бех Уві 51у 1 З 19 ї5

Аве» Ага Маї Так о Тїіє Тк сухо бхз А)в бек піц дхроїже ТухсТух дп в Б З о а 30 їтви іа Тер Тук бів Ак мух Ро 01уУ був АЇЗ Рв Буш Бей бен Ті їй 49 45

Тук Ар Тих Тук да їжі Аза Дяр б» Маї Рго зеї Ага вЧе вех 1У

Зо 60

Бек бСіу Ббет БІУ тТЬК Ява Тух Тпх рей То ЇГ1іе беж бах бео свй вхо

З 15 5 о ща АзроРпе пла ех Тук Ту Сув зі сОїпсотуює Тут Пуш Ра Вро Ра 85 зо 35 так опе сту біп шщіу ТІ був бай бі тів уз о Ака ті Уже Аза вка 159 125 19

Еко Бек Уа) Ре ї1е Ба Рго Ркго бесг о Авр біз бІіп о Пем цу ет Ту хто БІВ зу

Так Азїа бек Уяі Чак осуз гео йдем Ав Авзповце Ту Рг Атш о сїМ діа 135 155 ї40 їУуБ Чаї БІ Тур опучз Уві Авродни Аїа іївцн Зі Явт о біУу Вип оЗех бій 145 150 155 160 бід б5еї Уві Тплобсій сій о Авр о Беї уз АвробБех Так Тух Бех єм ек їх ї7а 175

Зех тн пев тах пем Бей цу Азїа Авротух зі Був НіБ уд Мах тує 180 185 133

Аїа Су бій Уві Тче нів біз сіуУу ев бет Бех Бо ун) тих ув Бас 195 200 205 не Авто Акт сіу 010 Су 214 «ВМ» то «В1їз 11 «зі25 ДВК «2132» Штучна послідовність «Ох «ваз» Опис йтузчної послідовною ті» синтетичний попічзуклесотид «4003. 70 асчодасаєув чаадесессос ксадсіссса Чодсвсскас бассссзуЧео ссосеасуєчее ві ачасчєуаса сСесалаєсасє бсадвоссоса воасацесссо содесавзсує ачсосзаєсє ісп ч:частатка остатсозтас сззсдаздас ссскагсаса восєячостя чбабевчее 85 звассчадев вадссосова зстусксаєс саїуасасує ассуссбодо паса а са ссаадесоУєс гсацідосас суссапосоає асідаскаса сосбсвсавї гео ко ЗО свопссоадаяу вссЕсЯсстс бБастасбтЯ садсвасасс асаваєсссс БСсасосвос Ба чосеалодої скаааатата азЕсеаасос ассодтадотфосвссаїсясе сстевсовве Ся сапосвіста аспадсачех дадаєсскочоа зобдестсосЯя піша сЯсеї ссосбуавсащо ва

Жсствксоса садаоуссаз азбтасазіоз заззгподаса асесосбссв авссапотаве 540

Есссазчзазча зсЧчесасауа сдсадзасвас азодвсазса сотавазесе садсвасасс Бо сечассстов дсвазвосача сгасоатава сзсазвасеї асзсосічеста апповосове бей сапчуссоча Чепососоос пасаавтадс БЕсвасаасв зчачачеаота 5 чн «МІ 71 «811» 4653 сеї» вт " се43з Штучна послідовність «220» «виз» Опис штучної послідсвностії синтетичний поліпептид «4005 71

Мес Авр оїхо Ту Тсройка Чаї Бле бух беб Пе) АтТа Уві Ага Бро с біу 1 З 10 15.

Аіїв ні бек біс За1ї Зір Пец Уві бій бех бі» БІ У Бей Уаі БІВ

Вхко біу сліу ваг оцей ДУ беи о Бет Сув Аза Чві бек Біу Бр» бек Бе 4 35 тик оаБи Тук Ні уаї Ні ТЕр 81 Ако бій діасвко Оу Був Біу Ба

БИ п що сі лрвоМеб о біу їз» І1їе тро бІіу АБ ОбІтТу АБО ТВ йеї Тує АявоБех та пе во баз Чех пу Зекх Ака гпе ТпХх ї1і65 Бех дхЯ АБЮ Таговек пу Адпо ТЕ 85 о 5

Уукі Тук цей піп. Ме АБИ ек цем Ахку дз Зк Авр їй вата Уві Тут

То 105 15

Туш Сув Аза Ака бів реп Тьт НіЗ Тук тус ді Бей Атв АТа с сттр о Зіж 115 що 125 сіп біу Таж їй Уві твж Уаї бак Ббег Аїа Бек Тс Пув бу ро Баш

130 ї3а 155

Уві Ббе Бго Пес Аза БкосСув Бех о Аку бег ТНсобБек бій бек ТЕ Ав 145 153 155 тб

Аїв пез сіу Су й-ей Уаї Пух дер Тур Ба Рго піз Ро Уві ТВх Уві 165 170 195

Бек ткр о АБпобех бі Аза без ТЕ Бек бі Уаї Наз Тбрг о ве хо Віа ї50 185 І8О чаі їеа біб бек бек Сіу цер Тек беє Цей бек о-еек Уж Уві ТПпх Уві 195 о 205

Рго Зес Зах ек Пец о сіу ТДЖ бує Тк Тек Лвх Суз АБ Уві Авв ОЧІ

Іо 2ї5 ау

Був Рко Жак Ав тТпх Був Уві Вер зує Ак Уві 3 б5аву був Тук бу 230 25 Кай

Рко рРхо Сук Вго рго Сув Рхо Аза Еко піп Ре цех піу сіу Зто Євжш маї Ейе їй Впе жо Го Був Рхо Пуз АбвроЖих лез Меб І1е бек оАхд

МІВ) 2е5 мож Кей тах Бо бі; Уа. тах Суз Уві чуві Уві Дер оУді Євх біпосфй двробко

РУ 250 85 іш Ма) вів вва дви оТкроТух заї Авро5зу Уві бій Маї Нів Депо Ала 290 255 309 був ТБх ув о РЕо Ака 1 514 бів Боб Авпобек Аза Тук Аку Уві Уві 05 З1 ВІ з

Зах чаї зви тБЖж Зах їм Назо'сій Азо о тТкроїєй Авіа сіу рук бі Туу дей За ЗВУ уз Су Гуз Чаї бек Ачи Був о шуу Бей ржо бек Бех Ті БІ пу тих

ЗА 345 ЗО

Іїв дек рух Дів Гуз сажу 518 вто ка 51 РУЗ Біп Уал тТух ТВХ ви 355 350 365

Еко РКО Баг Сі Сів сій Ме Тв буз Авпосій Маї бек Сез ТЕ Сув

ЗО 378 зна

Бва уві бух біу Бе Ту Бко Зах Взр о Ї1е дів та1і біш Ткр біо Бех

385: зад 355 409

Ач осдіу Бій Бхо бід одзп два ТУхюк Був ТБЕ Твх о Бго Бо Чаї беч зво 305 То 415

Бех Авр СТІу бер ре Епе Бей Тук бек о Ахо цеч Тпк о уаї дер пух пек 450 аа а

Дта Ттр біп бі сСіу АвпоЗаї Бе Беж бух Бех Маї Мат НіБ СТЕ ДІВ

За 40 «45 рез Нів АвпоНіз Тує Твх б1п уз беж Пев Бе рей Жеж део 19 450 155 4650 «І ТЕ «е1І1х 454 «ФУ Штучна послідсвнаисть «ай0х «веЗ» Олис стучнаї послідовності: оймтетичний поліпептид «ап 75

Та чаї бій ев Уаї біз Бек Ту біу 01у Бей ані бів ро Бі Бу ї 5 18 15 бШех їйеви Ако Цей бек о Сувз АїТа Уві Чег Су Ріє Бех бек ІТВж дай ТУ нів Уаї Ніє Ткр уві Аху бів Ала рго біу ру5 Біу їва бій Ткр МеЄ 45 бі Уаї Тїв тко біу Авровіу Авр о ТвБх ВВЕ Тух АБ обет Май гемо ув во 55 во

Бех Дуо Рве Тв Ті беж Ако Азротаж беж Гув Ап тих Уві Бук їеч 65 та 75 Во лій 'Меж Авт Бек Тви вгЯ АтТа. БІО Во тних віа Ууаії тує Ту Сув Аа 85 зб я дкч о біп Гео ТнжЖ нів Тут Ту УВА Ба Аїзаз Аза тв ЗІу с оту Те 155 105 ї15 тей Уві Теж чаї беє Бех Аза беж пп Був б)іу Ес беж Маф рРНе рРХхо 315 185 125 їй Аля рРто Су Зек о Аку Бек Тк Беж би пек отв АвБа Ма Бе пу 139 ЕЗ5 їі40

Сув без Уві був Авр Тук Ріе Ро бів ро Узі Тв Чаї Бех Ткр дви 145 1556 155 165

Зег Біу Аїа рей Тйх бек о шіу чаї нів Зп Вре бо аіа Маї Пе зій ї65 ї79 175

Бек век бІіу їви ту Зеж цей Беж Бех уаї Маї ТБж Уві вко бек пок 1950 Мо 159 ек пей сіу ТВ Гуз тнт тує Тв Суя Ази баі зр нів Му Вго 585

МОУ 2650 2755 дипПоОТВиХ був чаї Днр Був Дт Уві бій Бех Буз Ту БУУ Бко Бк Су 218 ІБ йо вко РІО Сув Бгто Дів овко бід Ре йез піу сіу Руб Бех Маї Бе Пеи жи за яз» ло ве о рхо Рко Був рхо Був Авр отТвх їм Ме їіє пес Агу Тих Еко іх

А во БУ уаї тнж сук уні уді Уві дер уаї дак осій сі) Авр обо пуп тал бій во 255 та

Ва даботТкЕв тТух Уаї с Аво сі баї бі Уа! Нів Азподіа Су ТВі Був ат 240 255

Рко Акад 510 біз бій ре Ав бек Ата Тут Аку Уві Уві ех Уві Цей 253 85 300

Те уві без Вів бій дер о ТЕр о Маи йвпобіу Пух біш Тух Був Сув пуд 305 ага 15 328

Чаї бет ав оГує с1у цен орго бег беж тів 10 Був тп оті бБею Був Н

ЗО 335

Аїаа Був Б1У бів Рхо АБУ бій Ето іп Чаї Тук Тв ву Бус Бко бек

За 45 359 сСіп Сіз бій Меб бнс пув Ана біл уаї Бек ївц ТВх Сув їве Маї Буз

У Її Її 355 збо 55 сіу кре Тук Рка Зах Ашр їі Аза Уві сі Тжо бій Бех дей шт сій я 375. зво

Тто віч АвБпоАва Тух бує Тв Тих Рхо Бго Таї Бей дер Зак Ав оту 85 ЗО 395. 400.

Зекг вве РБе Тед тує бег Аа Гей ТВ Мазд о АБО Зуб бвє дка ТерозІя 195 яв; ЗЕ бінсбіу ви Меї Рпє дек ув бек Уа оМех Ні Ото Аха емо нів Авт о 125 30 нів Тує Так озуй Був Бах цес Бех без мес Бей ощіу аЗх 840 «Й «15 1357 коїй» ДЕК «2Р3Р шеучна послідовність «вам «тегії» Опис штучної послідовності синтетичний їіолпінуклеотид -а302 73 вкачастсча ссезувсвак севсетасста спасостувач свсевудває ссазкеоава Б пбасваєтодч їсоазкогас зоачезазосЕ убсозссета чсдддадесе деавсвевек 122 гогоасвоасив чоззсіксва соіскассввї сгессасаєдс асізучоуєсу говошсассї їВЗ сочвачачЧес спозасоЧас додсасвасе Боудадоуасо дфосвзевоаєо совсзастся 240 йпсстуааса десутессаєс савекосеце Часасстсва зазаєвосає ксасотосах За вЕшзаєстсетс гссдсосвяв довсасадса постасеасє Уусзсасовсва асбовссове ЗЕ

Бастапакту кцасвассето чауссазоса аскстацтва садесвеодяє сусспсавнє 490 ваучвдсосеї ссаксесьсеє ссєдосасоо бастосачає сбзсскссовя двоасарацеє 180 ченскоуасе сдсоссуассяа дсастастско ссссавсочж їпасоусесе суда аосив зо фодсососеда совасудсзї псаСаєстто содоствЕсс сасавссссс вадасеостве 505 тссстовоаса воссочсоав сзвкчсссссо адсазовкзо чсасзЗавави сстасаєстоое Бо засчізсвре зсавососза садсвосвач сФсосвсвада сачесчазчис свавтавбцех 7ао ссрссаєсбчосс сасезочесс адсасссчат сеесспасач чдассассвае серсобУуєко т8о песросваваєс ссаваевозчасас сЄвсасунсс ссосзадасос севаствсово усе часа 54 чеочасзєца соссазоваза сссодазясс сачсєсавої чехкасосеодав сестру, Зао чЕЧдсвтааКа ссзасасаза десосуяуаз зачовостса асезчоосяба сеспсзсоцее зва авдеотсевса содісобдов ссвадастяз обуазесцуєв ззувасвсза збоарвачоєе 109о сесСаасваву чесесобдьс сіссаєсоза зававссвесє ссаввоасєвна возасвадесо 0 1050 сзадасссаєс васісотвсає сспдсссоса їсссвосвеоб зчабцассва дазеозоюео 1140 ацсебЧассї зсобууєсла адцосвессес сосауодава ссобсусдоа ссазувсаос 3900 аасацчсаас соцчадвасвне стасвауасо асосскоссо БоезЗзЕсдчавєвос совсочсісе 285 кЕсеЕсессь асацевустох зассосазЗас затачсвузс часвапачУч заасясеее 320 сбраєчстссо сдваспсаваа зассстосас засоаствса сасадаацає сотесососко 1550 птобосачавс да 13953 «вій» 74 жвіїз 117 «Ти» РВЕ «2135 Штучна послідовність «В» «23» Опис штучної послідовності: синтетичний поліпептид «аб» 74 біз мМаї біп ойез бів біо бек Сіу Бхо біу Пец Уві уз Бхо бек 3

І З 13 15

ТБх Пцезобех гей ТВК о Сув ТнкоУаї Бех сіу Бпе беж дев ТБх Двв Тук 20 5 я;

Нів Уві Ні Тр ї1є дк бій Ехо рко біб бук б01у рей Зо тТхр тів 35 40 4х

Би уві Бі утоб піу ВЕр обіу Др оївх веж ТУК о АБп Бек Маю ей Бук 50 | 55 50 зет Акса "аї Так о ї1іє бЗех Уві АзрБ о тТБЕ пет Пув Авпосій Бе Швк Бех ба та | 75 ва пу рей Бвк обек Уві так оАдза вів АвВр оТНЕ Аза уаї Тук Тук му Віа 85 ща -в5

Ага бій собей ТЬХ БІБ тує тую Ууді Тез діа Аіз Тв Бту пів о біу ТЕ 100 125 310 їм Узї тах Уві ех «810» 75 «21» 117 кеі2х ВАТ «213» Штучна послідовний отв «ев» «йеа» бпис штучної послідсзності: синтетичний поліпенйти «ад» 75 бів Уаї бів дев біб біб бекосіу Ро біу Без уві Пуво Бгто сбак Іа 1 5 10 15

ТПУ тлйхксВат Ба Спр Оу тн Уа ве о усе ее век ше Тая ВІ Ту ення 25 25 30

Нів Уаї нія Тжр Ті Ак Сі Бгто Ркб біу бу біу Гей 91. ТЕр о Меє 35 30 45

Зіу Мі її Тр БІуУ ВБр Сіу АвБ о ТЕ Бек Тук Аби щшех ді пем Пуз 50 35 ва

Зек АкФ Уві Тк ї1іє Шетг Врш зр таг Зет Був двЗпобій Уві бЗех бе е5 то 75 во

Зув'сеи бек Бех Уві тТАх Аза Аза Авор Тпжх віз Уві ТУЖ Тук Су Віа 85 за 5

Акч бів Пе Тк Ні Туж о Тук Уві Гец о Ата Аїа Тур піУу біп о біш Тег 109 105 116 їні Маї тк Уві бек 115 «2102 7 «11» 146 «Р12» вет «віз» Ношпо зарієце «от 6 зЗіу АнНо Зі Авпорко бій Ії Атв А1їа низ Уві Тіва БЖ СТО діа Бек 1 5 10 І5 ек пу ТАкКотржх Ех вх Бей сів Ттр АтТа бів цу О1У тую Тух Так а З 30

Меб зак АБа йЕпоремо чаї Тр опев Бім АвбоЗзтТу Був стй реа стБж УА

За 0 5

Ту Ар біп бІу Без тух тТухк 116 ТУЖ Ава біп Уді ТЕЖ о Бне сСув бек о З 5О

Авпойткч біз Аза бек бВег обіп Аза Рекс ве тів Аза бек дер був Бен вх то т5 Во пу бер рРхе сСіу Аква Рпе бів Дхо їТе Пез ца хо АТіа вів Авп о Тпт 85 по 28

Вхя бдех беє дів Суворко Суз бі біп біп Бех їі бі бец б1у іх 105 119

Уві Вре 514 Пес бів Рго сіу Лів бек Уві Ре уаї Авп оУуваі Ту Авр 115 120 125 рРто дат бій Ма) бек Ніз Б1у ТБк біу кре Тк бек Ре біу цей їви 130 У35 140

Пуя Пе 145 «ві 7 «Ф1їм 1465 «Вій РВЕ «вія» Моз пизсміцв «4300577

Зі Авр аі) Авш о Рро Сів ї1е Аїа Аза Ні Уві Маї беж їзії АТа дл 1 З 15 ї5

Зек Авт Азїа Ата бек Узі Пе бів Тв іа Пув пув 51у Тук Тук ТЕ 2 5 0

Мак Був бах Ав ва Узі Ме пев сіб дай 1Уу був осі ви ТАх Уві 35 йо 45

БТуш АкФойін пім йец Тук Тухк Уві Тує Тк бій Уві Тео ЕНе Сув Бех 5о У ви

А Дксе51іц) Бхо Бех Шех біп Дхп о бтое рРбе ї1із Уві п5)м ФеароВктя Дей

Аапотм у щем о БжЕО сек зес біполху ЕКО ЕЛЕ є мах А МУ НЕ ЕВ ДЕ 55 70 7 о

Був Ркго Бех Вех біу Зех СіЯ Аку Ії8 ізн без пу дів АТ8 АБИ ТАХ 0 55

Бі бат Бек бат сій цес Сув бій біп бЗій бег Майї Нів Гей спіу Б3у ща 105 пшКз:

Чаї Бе бій бе) сій Ата сіу Аза беї Уаї РБе Уві с АвпоУві ТВАХ сім ї29 125 діз Бех бБжйх Маї Ті НІВ Ака Узі ску ВВ обЗек беїт ЕВ оОТу пе Бей 136 ї35 140 мує Гей й

Послідовності СОК анти-Ст 1 54-антитіна 347

Опис 00 Послідовність 5Е0ІБМО 3 СОН СЕБЕ ТМУНУН ОО 5БЕО МО: 4 СОН УМО вОотЗУМЗМ Кк

ЗБОЮ МО; 5 | соні ТОНУ ЄМУАА 5ЕСО МО: 6 ГсСОоКЯл КАЗЕОСУХМСА

ЗО МО: 7 Со» ОТУКГАЮ

ЗО ЮМО: В ІбОок3 ООХУКЕРЕТ й

Послідовності СЮОК анти-СПІ54-антитіла 381

Номер послідовності Опис Послідовність

ЗБОЮ МО: 42 |СОВНІ | СЕТЕБОУУМА і ЗЕОЮ МО: 43 СОН ЗІБУЕСЗЗТУТООЗУКО

ЗО Ю МО: 44 сові НООЗРОУТУРОХ

І ЗЕ МО: 45 | сов ГАСЕОІЗММЬА

І ЗЕО ТО МО: 46 Сов 2 ААМКОЮ .

ЗЕОІЮ МО: 47 сот З ООТЕКУРІТ

Послідовності СОВ. анти-СП154-антитіла 338

Номер послідовності! Опис

ЕС МО ЯВ СОН ОСББ ТННІВ

5БЕО Ю МО: 49 Сорв-но | УМ МОСТІ УМ5АКЗ

ЗКО НО МО; БО СсОоК-НЗ ООКМНУУМОА 15ЕБО Ю МО; 51 і Сов КТБЕСГУЗМ А ше

ЗЕ0ІЮМО:52 | СО ПТМАКГАЮ ШИ

ЗЕ Ю МО: 53 сов-ї3 0 ГОНУЗМЕРУТ

Фіг. 1

Послідовності щшурячего анти СТ 1 54антитіва 342 осліовності Опис Послідовність

СЕСІЮ НОЖУ | Уношянка | ОУСШКЕВОРОГУОРБЕТЬСІТСТУВСКОВТМУНУНИУКОРРОКАТНИ бкжкеленнюг | шурячого ЛЬ? | мсутеарортВУКЕУПКОВЬСТТВПТеВООУРЬКМОВІОТЕОТАТУХ фі І САКОСТНУУУБАДИООСАВУТУВ у н-пілянка ач сЕЧЕсоКЯ ц кЧевЯ евасесе чо сдвслвсаксьсоваосу шурячоть дь 343 | СИЕССЕСЕСССВОЧсУсСВЯСЬЯавучачссадчасстдчесевавус ізспуннявиною | адспоссазачассссЯдкессосовесстясаси чесну ссвса послідовністю | Кедассвастаєсвсчкосасьзучессзасазостосачзаана ва

ЗЕ Ю що: Кессовцочассччачаасагозчосчасучачасасаєсаєава за с асссачсссссазакоссчассчачсазссассаздочасасссоссаця ачссазасссссссааззаєцачсацьссусазасозаччЧчасвскао сасстассвессчедесвзчовассчасссаєсассасчсессачесе сесоучєссавчаазсессазссассувсвоя «ЛЕ дінника садчічезасьдагодадессвадчасстувсссочедсачсссксаца порачого двьзяї | ЧасосЕЧкссоссавовусастесексевоцеес Єсассаассваєс 1 в сигнальнок ассаєзсасавссчеазессоасачосьссазчазазачествчачьцо

БОЮ МО: | послідовністю | ассодасьзасзсочочгоасададасасаєсакасавессаячскосє два саватсссоассчачевссассазучоасассессвочадчесаачесе Ссссадазасчачсазестосавасудадцчасастассассвастає бокуссадасавеєчастсвссассасеассосачеовусссоуачеса заучачесссвчесаєссцвсься

БО НУМО Тор лілянкя ПІОМТОСРАНОЯАСІСКТУРТВСВАВЕОГУУМОАНУСВКРОМВРОІ: нн здона МрячоголЬ3Я: | ХУПТТНІАПСУРЕНЕВОВСВСТОУВІКІМТЬРОСОУАЧУРСОСТУКА фі ! РЕТЕОЗСТКЬКИК ! і акчачеуксусссвсссассєсстоасасв Че еастасьоаєезчаєває ! Мі -щілянка адчассссатаєсесасахссаздаєдчасасвдьсьссачеввсосває щшурячого АБ342 І седоакстстЧЧаасайассогсасозссовасаєодадчевачвова паль ! дасесрекассасааєттаососоубсассадсодазаєсводдавассс

БОЮ ЩО: посллОВНІСТЮ Е сскга всесаг й ; " Я їм й і й , - заз псзаескаксозсасасасвччссоасзавасасчаксо 33 свЕсвсодЕссадесссадедадчосооосасасаукаєсстосваву агавасасосьчесаєссдоазасчесасаауєсаськстоссавса псассасаавсскосатссасосссуЧоссадоадассазчесудчаве соуагза у,

Ї Чі-ділянки | асакссацаєцасасацьсьсовусеесссвавстлсавсьссваЗ щурячето АБЗ , ачазассо сасочесдава Бчассдадсаеувуаачасове їтастате веб іЮ КО: послідовністю | всскадодтоссаєсвясодавассьоовася стксех бавокесся ; стаєцасасасесвудесозсвуасдддаєсссаєсасядексац о ' Еачсачказчстоавсасасвзаатаєсоссосазачасазасасессво рсаксецоачассесосаацесассвсесгсуссавсазсассасаваєсєс

І ссасєсасасссучсесвозчассзвасстадчаассдава

Фіг.

Послідовності акцепторної харкасної ділянки

ІНомер Мн ис і піч т я. дослідовності Оп | Послідовність 55003 МО:35 1 Анкцепторна каркасна ПІОМТОБЕВБЬЯАВУСОВУТІТСКАВОВТВБУТТИУООК 2-лоОз на ділянка подського І РОКАРКГЬІХААЕВБОБОУРОВКВОВОВОТОКТСТІВВЬ дну. 93 УВІ 2-14 ОБУКІ ОРБЕОЕАТУУСООБУВТВИТЕСОСТКУвІК и | часаєсседаєчасссадесстссарссьсессакс : гЕЧсасссчкачазавсачавабсассвесастсасо чачсаачссачадсаєсавсадссавссвзавксоа

Акцепторна Саксадесзуааассадазазачоссствадевосе

І | каркасна ділянка | Засскасуссдсаєссацчессдсазацьчоадвсс

ЗЕСЮ МО: 36 людського УК 2. саєсааччсссаасдасачеочаєскудчасачає ! пз ессасесстсассассадсвясстосавоссозача. сесссосвасссассасвуссвасачачесасадса сесессдчасчексодссавачдассазчЗкчава ассаза вот» мості Акцепторна каркасна | БУОБУВОСОСІУОРОСВЕВІВСААЕСЕТУВЕКУМЕИВО нин і фіг в СМ ділянкаллюдського | АРСОКССЕНУСУХУВОСЯТУХАОВУКОВЕТІСВОМЕКИТЬ ро мн ГУБ ЯУБОММБІНАЄОТАУ УСТ ЕОНОрОТЬУ ТУ В. чачесдсачсьчосочачЕссаоЧадачасссоув ссвассечадачавссссдачасесьсскасоєсва : сскссеачасссзесуєсвасачсазогасаєдаче по | хгучассссесадчесессазчоадаачччассачачкя полдаухода | сабпторна каркасна | сессссаєстасєсаєвусядьачсадсасакваєє

ЗЕ МОВ пана нен І асасачассссоєчанчоусачасссвяесавстсс 7 шо ачачасзаксссаздазасасассакассстсазає

Її чЧаасацсстчадачссчачуасасчасеясевасєе ассакусзасасассесоасктасузадчссачада асессучесассУєстьсс

Іво дз кю за -і) А кценторна каркасна, ОУОГОКБВСРОБУКРВЕТЬВІТСТУЄСЯВІБЗУХИНОНІНО ; во МОЗУМЯІ о ддянкалючського | РРОКОСЬЕНІСУТУУЗСЗТМУНРВІКОВУТІЗУПТЯКНОК тя ма фіг. Я) УНЯ 1459 | БОКИББУТАЛОТАУТХСАВУКрУНООСТІТУВ

ЩІ пи иа | садчєусвоскссаучачьсячосссаузаседає чаачесессодачассстосссстсасссоасаєсся ; кессрчасудссссассачевчсбастастчоавас

Акнепторна каркасна Сусвсссчасаче ссесаччааадзчассочвасе й ди о щлощеке даткадусакасстастасачьчудадсассваси

БЕОЛО МО: 40 на а59щи асаасссебоссссазачачесчадесассаєаєса. чеадасасуєссзачаассачьсесьсесссдаваеє ! | ще чачстссзузЗассястасодвсасоеса своє ! асечсасчзчасасствчастассочадесачаза. звесссадчсевосЯяксовес

Фіг. З

Транспляантати СОК 342 на основі акцепторних каркасних ділянок

Номер по | пілоні посліовноси Опне Послідовність

ЗВО МОЮ З врноньни нн, шен | ЕУОБУВВООСІМОРОСВІКЬЗСААБСКВВТМУНУНККОА

СУБ ВНУ на линшюга а основі акцептовної | РОКОЮЕНУЗУТНООТОУМВУСКОКЕТІВКОМЕКНТОХЬ фіг: 8) керіненої хлянки УНІ ТЗІ ММЗ ПКАВОТАУТУСАВОГТНУУУБАЛИЗОСТІУТУВ і чаззсасадесаче свадссетдасосочусекоєссадес

Й | скзЗзсаЗчзасссасцестсссссосчсачечачецесе

ЧрансилянттСОК / садсьссасозаєсассатусусасєучаєосвєсводса о ділянки важкого ланцюга | ССсчУЧаваоососовачсаакоаеЧесастсоаоосд

ЗЕ МО: на обнові акнетстної асодочасасассстасвасссосяссскдчаачадссовсе 29 каркасної ділянки УНІЇ | сассаксссссосдасаасьсалаодзакасеськкассьс ! туввли і садаєдаасссссьссясусачаочасасаусачі стає с ассдегдсасуєсаасвчасссассвссасЧЕсскачсадо

І ссусасссазуззассссочесасвавсточ г Транспівнтяє СК їньки ОУСТОБОСРССЬУКРОЕТЬСЬТСТУВСКООТМУНУНИХ вархіасютьної ДІЛЕНКИ і ; х. сф че м си не ук м -

ЗЕСІЮМО: о. | неекого ланшюга мо основі ВОРРОКсЬКит Оу ТИОВО тв ун лькнуТІЄ т акцепторної каркасної КМОК5 ГКСБББВУТААПТАМТЕСАВО ТНУХУСАВ с ділянки На їла а-5озНА трутує сачасусачскасазаваєсстучасочаучееваєса " ачсссачссчачасссгчачсестосасесоагассокаву

Трансплантат СІК тіль | содосссадскстассваєсассаєдеЕчсассодаєс варіабсленої лілннки мі суссадссассідааааачоссьччассачассодя

І ВЕСНОЮ МО: нкцепторної кархясної 0 сКасссуЧудсчасучечасасаєсссасвасьсяує їЯ9 00 дійяен УНІЯ | сстдзачадссуєзссассастссечЕсдасасстса азччазассазЕкеЕссссссаазсссаадчесседесасся садсядасасачсачестаєсаскоакдсасуєсався часссвораєсасувсесаосацессочачесевацчяя ассоєдассасачіссься 7 Крансплантет СО ільни | ІОМТОБРЕБОВАЗУСОКУТІТСНАВЕОСУУМОАНІО

ЗОШ МОЯ -/ Інарідбеньної дітки ОКРОКАРЕТІТУрТУВІАРСУрОВЕВОБСНСТОЕТИТ (УКІ вільне. важкого ланнюта носові ни ой Мой ріг. Мед вкденторної каркасної ІБ БІСОРЕОБАТУТСОСТІКЕР ЕТ ВЕС ТКУВ ку інянкв УКІ ЗУНЕННЯ ЖІ І. часасссачакдаєссачачессвадсачесьстосу тільки вартарельної сачечдаччасссстаєсасвасесачессччсасса у

І ділянки важкого савааассузчсааачесссчаавчссчессасстаса

БОЮЮНО: ввиюгнеосью | акассассдєседоскзасаачкоссаасске ! ділянки УК 5-0 дз | сачсдЧезякадсачездкасеуасессасссссяса

Ж аєрссуєсьсьссеадссчавачасессяссасссасо авсчесацсаасаскасазчсссесссссасосвсоу

Ксадачсасєзавачсвазазссдав пи о и а

349 Ніна основі акцепторних каркасних ділянок постковності Опис Послідовність

БЕ МС (УНІ НІ на бснбяі ЕМОБУЕВССИБУОРОСЗБЕБОСАМОСЕБВНТНУНУ

ВНІ на фік, 9) Вкцептерної каркаскої Ї НИУКОАРОВОСЬКИМОМ ТИСПОрТЗУМОУСКОКЕЕ рони ЗІ) ХВКОТВКНТУУТОММОСВАВОТАУУУСАВОСТНУ

Що ЖУБАВИСОСТІ ТУ

І чаччсосачссоадссодачексвучачусосоасевакос ачЧсскудказчацсесаечвсвсссссосусачечад сачдсЕссваадсЕссассавзессассвеЕчсосасточчсу ов набснові зкцеплорної | ся ссадодсасссдодчавчудесесоаовасочакося

Ї | каркасної ділянки МАЗІ | ксасссооучсчасучдсчатасаєсстасавссосЯє

БЕ мо: 22 з-бо да | сссдаадзассуєсесаєсаєсьссосіцчасасстса ! азчаваасассунесатсссевчасчуаасксссессоЗся . : сачаззасасачсзуссгвЕсвесососсвсЧєсався ! і пасссастассасчссуспчсвоссоваассавача асгессччесасвасссоч

ЕС МК ВО назонсні зкцескорвої оуагОокБОРСЦУКРЕ ЕТЬ ПТСТУБОР. ЗВІМУНУ (УНА НІ на фіг. 9. )| каркасної лілянни У НА -Ї | НИТВОВрРОКОССЕНМСуУТИСОСОТОХМОМЬКаКУТ з5 а ІЗЕОТКНОУВІКЬВВУТААОТАУТУСАНОМТНУ уМТАдМсостТьУтуВ саччесчсачсьчсвоачачсссачассччачесвса

Есазасссзоєсчачасостдадестсасссотсас сзєчадчсачесЕсаускстассваєсассаєчса сассазчаєесяссачсесасстчоачазацчасссоа

ЕН на основі акценторної адкччасачокає сасекоачочсчасуасчасас

ЗБОЮ МО: 21 нернкасної підянкя УНЯ1З | ассстасаасєссясессваздачседеЧчеесасе ї що ІаееЕксесчечасассєісвазчзаавсавчсссос ксазасєдадсестчрсассчсвасачасасацче ауЕстаксассчкусасуєсвассдаєссвесає

І сасчсессадсадсеськоадуєсвачачасссьяа ссасаваксссо

Фіг. 5

З42 ді. 4

Номер: Чи че » ще -- ро Для

БО МОЗ(УКІ! вені варізбельна ділянка рІОМТОВ РОБОБАВУБОКУТТТСВАВБОСТХНЬА фі Ачнафік. 9) легкого паншюга МПУОВКРОКАВКОВЬІОТІК ПАВЛО ЕВРЕВОБОВО

ТОТТОТІЗБІОРЕСЕАЗХХСООУХКЕРЕТЕВОСТ

КУКІК сасасссачаєчасссзаачессзвасавссесх ссчссачсчсачасчассчсассвассассаяасска сечсасоздбозчдасстосассасзассьсосс

ЯНІ варійбельна ділянка | СУУСассачсусааассудасавадссседвадес і й | леїкого ланшега : касесасессагчасасоабассчесстачсесстазова !

ЗО МО: 17 гебаассаадєсоаєсссадссасачсочсачсачі асечастаєсасссосасваєсвссяєссістосадо садваачаєськсясссстьсассаєсоаєсачсааса ссасвзачЕсссевгссассессачьсадудсас авзачсачаааессавзаа і асчаазаздаовастассаасвастсодсачсадесе сачесачвЕссяскассясадчедсаачсечаса є ссадасчасссауачсссазасачьсьсросЯсо ги послідовність ачсчсзсачсчассасзсчассассасстяссака варіабельвої дітивки сесачедчаччасесстаєсасаасесвассточеа 5ЕО Ю МО: 25 легкого лаїшюга з ксадсусавассодусавадсссодаауєсоєссс о Щ «підкресленою акстасчасасосассчессоадссдчасочеасас і пкКелевністю, ЩО кодує о плей г Й Я ; сигнальний нейТил савуссяєсссачсоасадсуасачсяакассвда стабассессасваєсссугєсесессадесазчав часресассссектаєсаєсассачсааваєстаса ачЕсСссогсЕссассбссацісачачсастазачь зчачаєсава Шо , | Й

Фіг. 6

Послідовності антитіла 342

Номер ; ск й ;

ПІОМТОБРЕБЬБАЗУСОКУТІТСВЕАВЕНСЬХУМСАНУО

Дегкня лейцшює 34224 | ВКРОКАРКІШІУРТУВАрОУРБКЕЗСЯОВСТОУТОТ

Го (включаючи конетавтну | ТВБІОРЕОКАВІУСООУУКЕРЕТАСОСТКУВТКАТМА

ЗЕСЮ МО: 15 ділянку) АРЕУРТЕРРЕВКОСКОСТАВУУЄТ МЕ УРЕНАКУОМ "куОМАОЮвОоМОсовеУ Твори КОетТУВСОВТОТЬСКАЮ

ЖЕКНКУХАСЕЧТНОСЬКОРУТКВИНКОВО агсдазазачасечссассясааєсчсазсчассссдчсво і чевкечссасечсачсасавастісасасссадасчасоса чуачсесазвзасассссовесачсеаасасвоассавоцицсо ассахкассуабсавоссадесдасдчасстстаєсасивсс садессоацевксадсобнаасеучасааацссосявачис чеїсассезсуасасоатасодссссчекуасаусасасса ачесчесіссазсуасачечесачусчосасєдаскавасес сСеасвасеЕсезссссуссачесчучзачассссосяссесоєста

Пежей линцюг ЯЗ в сврастцтсаосвасаєтасвачсссссткссассєссодде

ЗЕОІЮ МОЇЙ | включаючи константу | сауудсассзазусвдаваєсвавсовасоусачеацесо ділянку) сассрчвссссасоссссодчесзіссдчасзачсвассоав акстччаасечессссЧскЧсасосссдскоазасавсвсе

Кассессадасчаучссвзавзсасазкачаачзсачасався состесвассазчсвасссосвазачачечассасачаоса ччасазсвадазсачсасстасачосьсачеаасасосса асчсідчадсавадсавчастассаадавасасазвасся су сседссаадссасссаєсачадсстчачстсассавзсває апавадсєссавкацчачачаасоєх

Важкий ланцек 42 яні | ЕУОПБМЕрОСОПТОРСОСЯСБКІВСАУВСЕБЯТМУНУНИУ тах Їбез шеарнірної КОАрРОКОСПЕНМОУІТНСООПТВУМОУВКОКЕ гово ТО . ділянки) (включаючи КИТУУТОММОГКАКОТАУУХСАВОСТНУХУБААНСОЮ

ЗБОЮ МО:12 | женстентнулянкУ) | груТУЄВАВТКСРЕУЕРІАРОВКЕТЕОСТААВОСТИК

ОХЕРЕРУТУВИМНОСАСТООУНТЕРАУТОВОСЬУВСЬВЯ

УУТУРБВВІСТОГУТСМУМНКРЗМІКЧОККУЕРКОЄ

Фіг. 7

Немер н . . пор ЩЕ Опис Послідовність:

ІП агдаачаачассясваєассавєсдсастсосастачссуц / Ексассассуєдасясаасссдадаєссадссячесчавьсь і ччачасачдусссасссазсссочеоччачсевасяссссесє сасасачссозосодсексадекствосвастсассасуєчсас сучасасуксацосасстяоавачачессачавссчавчаи і й ши ДИ чеЕсасссооучезасазаслактасассссасаассссуюессо

ББОЇЮ МОЄ | Вежкий ланцюг 342 ВНІ аададесуєсесяссавсесссувуасасстсваздчаасяссе (БО МО 3 без еВ із певсвяМ |абесассксовуасоваасеогсгссусусазаддасасачеа сигнаньвої. ліняньм) (влити честкактассосусасцєсвасссдасссвоваєсасвисся поснідовностії 7 7- ІГуасвасесєвавзчссааадчвасЕсссогсасачьсьсчааесе гскасааачучессаєссачсстсосссостдсасестссвос аадачесасстссочцуссасацсадессосооссдесеваке ! аззчаєсасьссессувассзчУсчасяцьчисуєааавсеса засасестцассаосадсасусасассекеесачстакеста саассстсводасьсстассоссссадезчечеовечасесче у р сосесовасвасссдудсасосазасесасаєссоснасоєу ! і авссвозачессзусаасаяссавачісчасаацазачьсча сосаваєсссує

Нажкий ланіог 342 | КУОБУКЗОООГМОрРОСЕБВБяСАучсКЗаТМУНУНИУВО

ЕНІ Бо (включаючи | АРОКОСОЕНМСУТИСрОрІБУМОУОКБВЕТІВКОТВЕНТУ ик | комстантну ділянку) | УТОММНОСВАБЕОТАМУХСАВОМТНУ ХУ САВИСОСТІЛТТУВ ко о НО: З БАБТКСРЕУЕРІАРОЕКОТОССТААСОСТУКОХЕРЕВУТ

УБИМНЗСАСТЕСУНТЕРАМЦОВОСЬуБЬВВУМТУрРОБВСО

ТОТУТІСНУМНКРОНТКУРККУЕВКОСВКРНІСАА зсцавсаноаасіоссасадсвассчсачсачечсьачсьоче сЕСсцесассасоссосаадосуауЧеесадессудесзавьеє зчазЧсччсссстссацесьучУсчачачессЧєчесускоє ! кчсусауєчацдсачссесадесссасезаєсассаєсдвдсас вро п МОЯ Важкий ж 30 саачсусоссааасасстоддаазачсссязачсчакуає (8ЕО ТОЮ МОгЯ зажкий ланцюї З42 чесасссододсовсдусавсасасосєасвассесевсскя вея спальної ЕНІ Раб'(вклюочаючи | задаассуєсссассаєсссесчєдасасессваадаасасс несхідовност) константну ділянку) чеесасссссадаєуавастсьссссоусусачаддасасадея чЕскаскастусосасубсзассуасссаесаєкасчвсстя чсачсосоцачссаваачассссочісасацеьсьсчацедеє єссасазачадсссассудсссксссссвчасасссвосскес вачасскассссєдадацсасацечассссдачесцсссаке ! заззастасекесссозассочевчасоассисаєсоцавскса дасасосечаєсазасучсчеосасассвссосачетавоста сазкостсзудастстасесссссаоездсагоасчассова сессссядсаасттоузсасссачасстасасстчсзастсч і ІП ааксасазадсссвзасаасассвачовеуасавцявачЧчесяау . ! - сосазаксссчсЧасавзасссасасатасоаєссчся

Фіг. 7 продовження

5ЕО ЩО МО:28; послідовність ДНК вектора 342 14 еНІ Каб (без шарнірної ділянки) і асуазааада садсезесдс заєсосачкя ЯссєсоаассЯ ЧгсЕссдссас ві счсадсясаайа чеЕСАТАТОС ачаєдчассса чазсссазує адссескесЯ 101 сесвзусчсада саассабсасч ассассассс чесабоассад Сочзачасоєсе 151 баєсасавсо содадсссоччса бсачсусаза ссуддсазач ссссчаадеє 301 «чебссаєсссає чабсасцбсасо десбачебва суда васса адсеусессса 251 чЧчЕддосачсчч садсодсасс дастабассос ссасаасссс дЕстссссач з сесодзаззчакс ссесессессса ссассуєссаа сзасавєтсаса ачессосец 351 сасссссчає саччасаєста аазчксасааає савасстАсСо чЕадсаччосе ап саєсстясесе сасессссося ссасстчасч звасачесбааа асстоадчаавсє а5і десістчкса сосусссасє даасзасекс сассссадач адассвааче

Б0ї асачсччазу ччсаЧасався сесессаасе сучсвасьсо садчачачся вві Есасачачса ччасадсаат часачсассє асачдссссау садчдсассосу 01 асчскдЧадса авасачаска счадазасає вааЗєсквоя сеосгдсчаадче 651 сасссабсацз часссуадсо сассадсває азазачессс засачачачо 731ії адечссаваа буазуаачас состаєвуса ассосачсоєя соссаЧчесає 751 ЖЕЕсЧссасе чЗкачсзсазу сечадУуєесА асточесава ссбоучачУєя 01 часссабсса чсссчзусодач адсскдсЯчьо ЕсСЕссвусЯс вчбоазосоде 851 сесадсссса ссавебасса гаєасасвуд чеасассачу сасстчесав 901 чЧачсссозчач БбочасчаЧка ссасесодад сзчзасучезає асассстаса. 351 астседбссс даачачсочї Ебсассабє: сссубєдасас сссадзадаає 1001 ассчЕсСсасс гссадчаєцчаа стсссссочс дсачаччаса сеасадсога 1051 Єбассуєчса сассаассча сесассасса себсссооса асеобоачачЕс 1101 аадочзасссс чассасачес ТеЗАссЧесс ссасаззачу сесасечаєс 1155 Екссоссбоач сасосксесбєс саздачсасс сссочааодса саздсачессс 1301 ачасеоуссса чЧФесазачасі асебсоссосза ассчзеєчЧаса сесчсесзсаЗа 251 асссачасус себуассачес ччсасосаса сссссссдас сабсссасад 1301 єссєсаччас бстасесссо сачсадсчся чеЧассяєує собсесвасад 1351 ссєадасасо сачасосаса сссосаасчє дааєсаєвач сссаусваса 1401 ссаачассча сазузааасєє чадсссагає себуєкай

Фіг. 8

ЗЕОЛО МОЯ; послідовність ДИК-вектора 342 в НІ га їі асчазазача сачесаєсчє зассасачіч чссссаЧоса Чосреустас

Бі сусзасусав ЧсЕбАТАТСо адабсуаосса задбесавчє адестевсся ссачечзсачу сзчассоясасеа асстасбассєї чссчсозссву СдзчЧасссе 151 Єассасаавсс Сочесгууа бозасдезаа ссуоддсаваау ссссазачсе 201 чсеЕсаєссає дабсасчсасо чессодсеча сочечсдсса аассагсвса 251 чсчсачсуЯ сазчесаччвасо часстасассс Есасааєскс чсессососва 301 сседчаачаєс бесскссса сбаєсчссву сазагаєстаса адсссосссе. 351 сасокесаЧс сазчзасасса авчезчазає сеавасстАсо чбадечссес 401 сасесусесс сасссессся ссассебдчаєч засачссчаа акссоддчазесє «451 чЧесескЧсвЯ сУсосссусеЕ чзаасвасьсс сассоссачач аччссвааче 501 асвусєччаач чеЕЧазсався ссобссазаєо чадсаасвес саччачаЧчсч 551 Есасачадса чдзасзасаву часачсассс асадссссза садсасссса 601 асчисовуса зачсачасса суачазасас завусссася сстосуазуУє 651 сассосассач часссдачст сассасіаас зазваааєссє засачаздчау 701 аяЯясказссвааза счазчазчас БоЯссасачса ассосачсчя соссаессач 753 єсЕсяссасо чеЕдЧасасаву сечачеасссА осСтбЯесчад сседчадЧся 801 дасссчесса дсесачсцочч ачсссасясс сессбсусас ачсуачедчує 85і1 БЕСсСадсЕсСка сезааєсасса суєдсастуу чечсуєсацеа сасобоудаав 9301 саческодчач сочасзачсе сЕВЕсвЯаЧод ссасяусчає асагссбаса 9351 асЕссЯсссї дазвчачссоЯє бсассасьс ссосуєчасає сесагачаве 1091 ассассЄсасс Ессачаєчаа сссссвссус зсадаачаса сачсвабета 1051 ссаєвуєсса сегесазассЧа сссастсасса счвБсссодса чессадачсе 1101 аачодасєцсв ччссасачео тТОобАбедевс ссасавачач сссассачес 1ї514 ЄЕссссосСуа сассссосес савазасасо сСсесчадааса садсучеоосс 1201 часа ссвЯ ЧесСзачавої асссосессза ассччсечася деусосача 1251 асеЕсачусас ссечассаче часа басаса сесрсссодє бассебасад

ЗОМ бессссачаас сстазсссссе сачесазсчеч чечзассясаєс сссссачсад 1351 сгсадцсасс сачасстаса ссБасаасує чзассзсаацч ссосзучсвнаса 1401 ссаачаєЄсЧда саачавачіє Чачсссазає сссусдасаз дпасссасаса 1451 сасоассчед т

Фіг, 8 продовження

Траноплатаєи легкого леищога вити трів 42 шпнша а 2.8 МК 04820025 30. 35 40 як 50 85 бо 5 20 75 Зб Ж 0 55 105 0 щи ПН МТ нн пи Кт ни НВ ТЯ УУКЕРУТРОВОТКОВІ : І. НО НО І ИН ПЕТЯ Теми ву ли Я

З 1012 ОИШТОХРЕКСОЛЕ ОП ТІТСВАВО СІВ НК ОКА Кі туда ко ВОВК ТАТУ оо вка ЗО КвІх

УКЖ ОВ 0 СМОМТОБРЕБЬХАВЧООИЧКІТОВАБЕОЬХУНСАНУОКРОКАРКСІУОХ УВІ АПСТРНКУВОВО ВИТОКОМ ВОРАТЕУ СОТИХ ЕТО ІК 4 і І

МКК ов БІОНТОБІИСЬНАБУПОКУТІ СК АВЕРС ДИКО СКАРКІНІ МИТНА НОРКОВУ ТТ ОРЕрР АВТ СО Кен ТКУ вІЕ

Трансплаєтати важкого ланка УНУ знизила За

Бакюйлаиюг у в. ХО 15 2о 25 30 35 8505 ях Б; 55 50 55 70 35 806 Ба а5 Бу 55 ї25 це аиумяк чи фиоквко ровно ть тот УКИУНОеРаКОЬКНМО У ОВУ А Мо ХВО ТВ ОТ КМ СОТ КОТАК У САВОБТНУ МАЛАНЮК : Р ПЕ ПЯУ ОО ЗЕ ТЕРЕНИ І ТЕ ЕЕ | лІ ДИ хв ра-5е ВЕДЕ В ВО О РОС ЕГО САК ЗВ ОН М ОАРОКСЕ НОВУ ВО ВТУ АОЕК РТВ НОМЕ КМТ ОМ КАЕВТАХСКЯ лЕВУЙСОСТІУТТЯ

ЧИЯ оЩН? БУОСУВУООЯКУДУВИВЬВІЗСАКВСВа ХНУ КЦАаКО кути ОУН КНТУ ОМНЕСЛАВОИТАУТУ САН КНУ АЛОЕ і В) ЕЕ

НУ ВР ВУДІХЕВООВЬМОРООВЬНОеСКУ ВОВНУ НУ НАРИС с М КОЖ ТХ ОВК У ОВОНВЕОТАЧІУСАКООТ НУ У БАМНОУ ТІК

Транеплантктк важкого ланеюа УК автитіля З4Х

Вкюкхийлзкцют Я 008 58. 35. 50 25 30. З ХО. с45.. вх 55.50.0068 070. 75 вабовбо єв 20055... 105 335 вкїипле 342 ОУЙОКНВОРСТАРЕтТЬ БІТ ОКло КУНУНУКОоКи ЕНН СУ ТИС оТ Как ВІТОВТА САН ЕКУТ У КАЛЕТОВАУТИ 4 1 Пи НИ ЗЛЕ ТЕ НЕО РЕ НН. ПЕНІ! і ї-К БЖ СОЛИОБНОРОМУККІЕТОЗ ОСТ ох на УЖ ОРІ КОрЕнісу ВНУКИ КУТІ ВО ТВО ЕЛ КОЕЗУТААСТАТИЯСЬЯ ХВоуНотетУВ

УНІ НЕ БУД ОБЗОРССУКРАВУИВСТСТу ОВЕН ННМІ РСКОСЕНІСУ НОВО БУМ КВТ ККО ККУ ТА АН КАУТІСАНО НУ ЧЬКАНО ТУ . я і Е і ; чна ЗМІ СБУФДЯЗОРОТУКРОБТИЗ СТУС ВЕНУ НУ НИ ВЕ РОКО ЕКО ВУК а КУН І р ЬКЬВ ТАНЕ ТАУ ТИ САКОЦЕН ЕК АКНСООТМИВ

Фіг. 9

Анти-СІ154-антитіло 381

Послідовність У;

БО о МО За (підкреслена послідовність являє послідевнють СВК)

РІОМТОВРТО ПБАБЬОЕТУВ ТЕСЬАСЕОТО ВИУБАМНТООКВ ССБРОТЬТХА

АМЕІОЮСУРО ВЕЗСВОЗСТЕ УБІКІВСМЕР ЕОЕАОЖКСОЮ ТРЕНУРІОТЕОВ

ТК

БЕОІЮ МО: 55

САСАТОССАСА ТОАСАСАСТС ТОСААСТТСО СТОТСТОСАТ СТОТоСОСАчА

ААСТОТСТОС АТОСААТОТС ТАбСАООТОА ВОАОСАТЕТОС ДАТОсТТТТАС

СОТОСТАТСА БСАСВАВТСА ООСООсТеТе СТСАСЄСТОСТ САТСТАТОСТ

ОСАААТАСОТ ТАСЛАСАСОС сотТеСОоСтТоА СОСТІСАСТо ССАСТОСАТС

ТЗОСАСАСОС ТАТІСТСТСА АБАТОСАСТОЗ САТОСОСАССТ СААСАТСААС

САСАТТАТТТ СТІОТСААСАС ВСТІТСАССТ АТССОСТСАС СТТСОСТІСТ

ССОАССАВОС ТОСААТТОДЛА А.

Посліловність У

БОЮ МО: Б (підкреслена поезідовність являє постловність СВК)

БУРІЧЕВОСВО ІМОРСВОМКІ ЗСУАОСЕТЕВ. ОУУМАМУКОА. РЕКСТКИУАВ їІбЖЕОоБоТУТ срБУКОВЕТУ БКОТАКЕТЬХ ОМНБЬКЕЕО ТАТУУСАКНО прерсІчкОочи сОосумутУв

ЗЕСІЮ МО: 57 сАсСсТосССос ТОСтТОсАОотТо ТОБООСАСОС ТТАсТОсСАОос СТОСАдостТе

САТОАААСТТ ТОСТОТОТАС ССТОЛОСАТТ САСТТТСАСТ ЗАСТАТТАСА

ТО СТОЗСТ СОСССАСОСТ ССАААСААСС сСТСТОоасАСТО БОТСОСАТОС

АТТАСТТАТО АСОСТАСТАС ТАСТТАСТАТ ЗСАСАСТССО ТОДАсоОСОО

АТТСАСТОТС ТССАСАСАТА ТТОСАААДАС САССОСТАТАЄС СТТСАЛАТОС

АСАСТСТСАА СТСТОАОСАТ АСОСССАТТТ АТТАТТОТОС АОСАСАТОАС

ЗАТАСТОСАО САТАСТАСТІ ТОАТТАТТОВ ОЗССААОСАС ТСАТОСТСАЄ

АОТСТоо : Фіг. 10

Анти СІЯ антитіло 335

Послідовність Мі,

ЕО УМОВ підкреслена послідбаністе являє посліноввість СТВІ

ПІОМТОБРАВ БЗАВІСЕТУТ ТЕСЕТБЕОІХ ЯМНОАЙУКОВР скаРОСЬТУо

ТМАСАВОСУРВ ВЕБОБОВОТО УБОКІНЕСОЗ ЕПУАВУВСОН ХОМЕРИТЕОЄ

ПТК

ЗЕО Ю МО: 59

САСАТССАСА ТОАСАСАСТС ВОосСООСТТОС СТОТСТОСАТ СТСТОСОАСА

ААСТСТСАСС АТООААТОТС СОААСААСТОА ССАСАТТТАС АСТААТТтТАб

СОТастТАТОЯ ОСАОСАСАССА СОСААОТСТО СТОВОСТОСТ САТСТАТОАТ

АСАААТАСАТ ТОССТСАТОС ОСОТСОСОТСА СОСТТІСАСТО ЗСАСТОСАТС

ТОССАСАСАА ТАТТІСТСТАА АБАТАЛАСАС ССТОСААТСТ СААСАТаИтос

ССАССТАТТТ СТОТСААСАС ТАТАОСААТТ ТТССОТОСАС СЕТСОСТОСА

ЗАСАССААОС ТООСААТТОВА А

Посліловність М

БЕО ПО МО бО (підкреслені послідовність являє послідовність сою

ОУОПТЕБСВО ПМОРБОТЬВ, ТтетТуцвоквот зни ИУВОВ раксьеЕнуву

Ммимроотьум БАІЖБЕРБІВ КОТКБОУКЬ КМЕБГОТЕОТ АТУХСАВОКМ

НУХУУПОВИСО САБУТУВ

МО:61.

САСОТОСАСЄС ТОАСОСАСТС ДОосаСсСТоООС Стас ССТСАСАСАС

ССТСТСТСТО АССТОСАСТа ТСТСТОСОТЕТ СТСАТТААСС АСССАТСАТА

ТАТОСТОСОТ ТОСАСАСССТ ССАССААДАО СТОТОСАСТО ОСТООСАСТС

АТОТОСААТО АТОСАОССАС АТТАТАТААТ ТСДОСТСТСА АСТСТОСАСС

САССАТСАСТ АОСОСАСАССТ ССААСАСТСА ССТСТТСТТА ААААТСАОСА

СТСТОСАААС ТОААСАСАСА ОССАСТТАСТІ АСТОТОССАС ООБСААДАТО

САТТАСТАТО ТТСТОСАТОС СТОСОСТСВА СОДОСТТСАС ТСАСТОТСТО й

Фіг. 1

Антитіла проти людського СІ154 (СП4ОГ) (химервий Баб) п СТ дане ки | Ілля зв'язування з ЇСза ля позитивної зе |в роннвве зе | жо | век нев

Пенні ВИБУЛИХ Жак Ме ява яр не сжнзниея ех розв бони воряеянк словеооюювіюг САОВІ-00402 (402) б аа 92 (пе?)

Фіг. 12

Легкий каппа-ланцює антитіла ПиЗс5

ЗЕСО У МО 62 пилкреслена послідовність являє сигнальну последавність)

МЕТОТЬВОНУ БІМНУРСяТа рІУСТОБРАТ СЗУБРОСВЕНАТ ТОСВАБОКУЄ

ЗеБТІОУМНМІ ООКРОСРВКЬ ПІКЧТАБНСВО ствБАВКООВа БОТОЕТИТІв

БУБРЕВОКАТХ ЖХСОНБМИВБІРЕ ТЕООСТКОЕІ КЕТУДАРЕБУКЕ ТЕРРБОВЕОСК

ВаИТАБУУСЬ ММЕХРЕБАКУ СККУВМАрОВ сМВОовБУТКО ДЕБКОБТУВСЕ

БТІЛІБКАВУ ЕКНКУХАСЕУ ТНОЗОвЕрРУТ КОЕМКОСВС

ЗЕОЛОМО 63 Орілий білок)

ПБІМБТОВРАТ ББУБРОЕКАТ ГІ5СЕАЖОВУЄ ЯБТУЯУМНИУ ООКРООРРЕ,

ПІКТАВМОЬЕО СУРАНЕБОБО ВОТОКТОТІВ БУЕРЕОКАТУ ХСОНОМЕТРР

ТЕСОСТКОЕІ КЕТУААРБУК ТЕРРБОВОМК БОТАБУУСЬ» ММЕУРЕБЕАКУ

ОМКУПЮМАТОЄ СМБОББУТЕО ОБКОВТУСО БТІТЬКАРУ ЕКНКУХАСЕУ тнОоссовБРУТ КБЕМНОШС

МО б відхрита рамка зчитування)

АТООСАСАСАС АСАСАСТОССТ СТТАтТОсСсСТОо СТОСтТОсСтТСт СОС УТОСАЦО

ТТССАСТОСТ САСАТТСТАС ТОАСАСАСТОо ТОСТОСРАСС ТТАТСТОТАТ

СТСОООСАСА САССОССАСО АТСТСАКИА ОсСОССАСсСА дсатотсвот

ТСАТСТАССТ АТАСТТАТАТ ЗСАСТОСТАС СДАСАСАДАС САаСАСАОСС

АСССАААСТС СТСАТСААСТ АТОСАТССАА ССТАОВАТСТ ОООСТОССТО

ССАОСТТСАС ТОССАСТОСО ТеТОСОАСТО АСТТСАСОСТ САССАТОТСТ

ТСТОТОСАСС СОБАОСАТІТ ТОСААСАТАТ ТАСТОТСАбС АСАСТТОССА,

СсАТТОСТОСО АСОТТСООТО САСОСАССАА ССТОСАСАТО АААССААСТО тТООСТОСАСС АТСТОТСТТС АТСТТСССОС САТСТОАТСА ОСАСТТСАДА

ТСТОСААСТО ССТСТСТТОТ ОТОССТОСТО ААТААСТЕСТ АТСССАСАСА

СОССАААСТА САСТОСДАСС ТОСАТААСОС ССТОССААТСО СОТААСТОСС

АОССАСАСТОТ САСАСАОСАС САСАССААСО АСАОСАССТА САОССТОВОС

АОСАСССТОА СОСТОАССАА ВОСАСАСТАС САСАААСАСА ААБТСТАСОС

СТОССААСТС ВСССАТСАОО ООСТОВОСТС СССССТСАСА ААбАСсСТТСА

ВСАООСОДСА ОТОТТАЄ

Фіг. 13

Важкий ланцюг антитіла пиЗсе ао1іуР-вив о 5ЕО До Моне (підкреслена послідовність являє сигнальну послідовність)

МОМТСВУКСІ САУАРСАНВОИ ОСБУОБСАВУ УМКРОАБУКІВ СКдеСсУКЕТВ

ХТМУМУКОАР СОСЦЕМІСВІ МРОМОСОТМЕМ ЕКЕКОКАТЬТ ЧОКБАБТАХМ

БООБІКОЕБТ АУУХСТЕВроа кМОоМораМсоОй ТІ/ТУБОЗАВТ КОрВУуврІде

СЗЕВТЕЕБТА. АБОСЬУКОТЕ РЕРУТУБИМО СОЛІТЕСУНТЕ РАУБОБЕСЬХ

БІО УУТУрРВ БЗЬСТЕТУТС МУЮНКРЕНТК УРКВУВОКУС РРОРРСРАрРЕ

ЕПОСРОЧМЕБЕ РЕРКРКОЛІМІ ЗБІРЕУТСУУ УрУБОВБОРЕ ОКМИУУВОМЕ

ЧИМАКТЕРНЕ КОвЕМОАХУВУуМ ЗУБТУБНОЮЯ їМОКЕХКОоКУ ЯНКОПРаЗаТЕ

КТІБКАКООР КЕРОУУТЬРР БОБЕМТКМОУ ББІСЬУКОВХ РБЕОТАУБИВО

МСОРЕММУКІ ТРРЕУБООООО ВЕБУЗВОУУЮ КОБМОБОМУК ЗОБУМНВАС

МНУтТОоКВІвІ. ЗІ 5БО ЦО МО 66 (рілий білої: підкреслені і виділені жирвим шрифтом мусації 5228РТОООА)

ОУОБУОВСАБ УУКРОАБУКІ. ЗСКАЗСХІТКТ ЗЖУМУМНУКОА РООССЕНІСЕ

ІМРОМСОІМНЕ МЕКЕКВКАТІИ ТУОКОАЯТАУ МЕБОБОВБКО ТАМЖУСТВОО сиМОоМосисо СтТУГТУВВАВ ТКСРБУКРЬА РСЕВОТЕВОТ АВІССІУКОХ

ЕРЕРУРУЗИМ БОАБТООУНТ КЕРАУТОВБОСЇ, ТбіБЕВУМУТМи БББІСТКРЖЕ

СМУЮНКРОМТ КУОКИУВЕКУ ОРРОБЕСРАР ЕРБООРЕОМЕІ КВРКРКОТЬМ

ТВКЕТРЕУТСУ УУПУБОБОРЕ МОККИУМОСУ БУНМНАЖТКРВ ЕКОВИБАХКУ чачьтУуснОоОю чОМОККуКсК УаМКСЬБРБЕТ ЕКТІЗКАКОО РЕЕРОУУТЬЕ

РЕОБЕМТКМО УБІТСПУКОЕ УРЕВІАУВНЕ ЗМСОРЕМНМЕК ТТВРУБОВОСЄ

БЕББУБКОТМ ПКОКИОКОКУ ЕБСОБУМНЕЛІ, НИНЕУТОКОСО БББО

ЗЕО МО: 67

АТОСАСТОСА ОсСтТОсдОосОоТ СТІСТОСТТО СТООСРОТАС САССАбСТОоС ссАстсосАОо стосАдстод тасАстоАбо састоАлОоТОо СТоАдосстТе

ССС ТСАСТ СААОРТОТОС ТОСААСОСТТ СТООСТАСАТ СТТСАССАСТ

ТАТТАТАТСТ АСТООСТОАА САС ОСАСААСОСС ТТСАСТОСАТ

ТОСЗАСАСАЖТ ААТССТАОСА АТОСТСАТАС ТААСТІСААТ САСААСТТСА

АСАСТААООС САСАСТОСАСТ ОТАСАСАВАТ СОСОСАОСАЄС АССАТАСАТО

СсАОСТОВОСА ОССТОДОСТС ТОАССАСАСТ ОСОСТСТАТЕ АСТОТАСАдО

АТОССАСОСТ АСААЛАТОАТА ТОСАСКОСТО СОЗСОВЛАСОВ АСССТОСТОВ

СССТСТОСТС АОСТТССАСС ААОСССОСАТ ССсСТСсТТОоСС ссТосСасСсс

ТОСТОСАСАТ СТАССТОССА сАОСВсВССо сСосТОсОсСТ СОСТОСТСвА

ОСАСТАСТІС СССОААССОО ТОАСОсСтТОоТС ПТОСААСТСА сСОСОССОСтТОА

ССВОСОБСОТ ССАСАССТІС ССООСТОТОС ТАСАСТОСТС АОСАСТСТАС

ТеССТСАОСА СОТОСТОАС ОаТоСССтТОС ВаСАОСТТОв ССАССААСАС

СТАСАССТОС ААСОСТАЧАТО АСААССССАС СААСАССААО СТОСАСААОА

СОАСТТСАСТС СВААТАТОСТ СССССАТОСС СдОеСИТОСОЄС АОСАССТоАЄ

ТТОССТОСОС ЗАССАТСАЗТ СТТОСТОТІС СССОСАЛАВО ССКАСОАСАС

ТСТСАТСАТС БОС СТА ТСАС СТОасСОТО СТОСАССТОА.

СССАОСААСБА СССОЗАОСТС САОТТСАдДОТ ОСТАСОТОСА ТООСОТОСАЄ

Фіг. 14

СТОСАТААТО ССААСАСААА СССОСОСОДО ОАОСАСТТСА АСАОСОСОТА

СОСТСТОСтТО АОСОТОСТОА ССОТОСТОСА ССАСОАСТОС СТОДАССОСА

АОССАСТАСАА СТОСАДССТС ТОСАВСВАДО СССТСССОТС СТОСАТОСАЄ

ААААССАТСТ ССАААСССАА АСООСАОССС СОАОАОССЬС ААОТОТАСАС

ССТОСССОСА ТОССАСОАСС АСАТСАССАА СААССАСОТО ДОССТОвеСТ

СОСТОСТСАВ АООСТІСТАС СССАСОСАСА ТОССССТОСА СтТСосАСАсС

ААТОПОСАСС СОСАСААСАА СТАСАДОДОС АСОССТОССО ТОСТОсСАТТо

СОАСООСТоС ТІСТТОСТСТ АСВОСАСОСТ ААСОССТОСАС ААОАОоСЛОСТ

СССАССАОСО СААТСТСТТС ТОСАТОСТССО ТОАТОСАТСА СОСТСТОСАС

ААССАСТАСА САСАСАДСАЄ ССТОТСОСТО ТСТОТООСТТ СА

Фіг, 14 продовження

Легкий каппа-ланцюг антитіла пи345 5ЕО 10 МО 68 (пілкреслени послідовність являє сигнальну послідовність)

МОМЕМРАСТІ, СЬСБЬОМБКСА ЕСОТОМТОвР вВиБАБУЗОК УТЕІТСВАВКО

БЖУМНЬАМХУОК КРОКАРКОЬІ ХОТУКСАрсу роБЕБОаБСсВОо ТОЖТИТІББ,

ОБЕВКАБУУС ООУУКЕРЕТЕ СОСТКУВІКЕ ТУААРОЗУВІК РРБОКОГКОС

ТАЯУУСЬСММ ЕХРЕЕАКУСЯ КУПМАТОВОМ ЗОББУТЕОрО КОТІВ еТ

ГТЬОКАПУЕК НКУХАСЕУТН ОСГ8БРУТКВ ЕЩРЕОСВС 5ЕО ІЮ МО 69 (зрілий білою) рІОМтТОовРЕВ БОАБУСОВКМТ ЇІТСКАБЕВСУ УМСАМУОВКЕ ОКАРКОЬТХО

ТУВІВЮСУРВ БЕЧСЯСВОТО УТЬТІВЯЗГОР ЕПОБАБУХУСОО УУКЕРЕТЕОО

СТКУБІКЕТУ ААРБУВІТЕРЕ БОБОБКБОТА БУУСТЬІММЕХ РЕБАКУЄЮНКУ

ОМАКОБСМоОо БЄУТКОВОКО БТУчБвЯтТІтТ ПЕКАОУВКНК ТУАСЕУТНОС

ПБВРУТКВЕМ СЕС

БО ТО МОТО бпдкрите рамка зчитування)

ВАТОСЗАСАТОСА ЗОСТССССОС ТСАОоСТОСТОо ОСОСстТоОСТас ТАСТСТООСТ

СОСАССТОСС АСАТОТОАТА ТОССАСАТОВС ССАСАсТОСЯ ДОоСАСсТеТеТ

ССООСАСССТ АССССАТСОТ ЗТСОАСТАТТА ССО САСТИАОСАС

СТСТАТТАСА АССТОСССТО СТАТОДОСОТ АААССОСОСА АВОССССОдА

ССТОСТСАТС ТАТОАТАСОТ АОСОССТОСС ТОАСОСТОТО ССААСеСОтТ

ТСАОТООСАЄ ТОЗСАВСООТ АСТСАСТАТА СОСТСАСААТ ТТССТСТСТС

САбССОСАдО АТТТОЗССТС ТТАСТАТТОТ САОСААТАТТ АсАТ

ТІТСАССТТС ССТСАБООСА СТАААСТАСА ААТСАААСОТ АСОсСТООСТО

САССАТСТОТ СТТСАТСТТС СОЗССАТСТО АТОЛОСАСТТ ЗАААТСТОСА

АСТОССТСТО ТІСТОТОССЕ ОСТОДАТААС ТІСТАЖОССА ПАСАООССДАА

АСТАСАСТОС АДОСТОСАТА АСОСОСТССА АТОСССТААС ТОССАССАВА

СТОТСАСАБА ЗСАССАСАОС ААОСАСАОСА ССТАСАСССТ САОСАОСАСС

СТОАСОСТОА ССААлЛОСАСА СТАСОДОСААА САСАКАСТСТ АСОССТОСОА

АОТСАСССАТ СдООСССТОА ОСТООССССТ САСАААСАСС ТТСААСАСОС

САСАСТОТТА с

Фіг. І5

Важкий ланцюг антитіля ІЗ аріур-наївСа

ЗО ПО МОСК (підкреслена послідовність являє сигнальну послідовність)

МОжТИНУКсСь БАЧАРОАНе УСЬУЮаОСОЗСЬ ОРОС ІЬа САУЗОЕВОТИ

ЖНУНИЧНОАЕ ОКСОЕЯМОУІ КСРОБІЗУМО УБКОВЕТІЗВ ОТВКИТУХІЮ

ММВТКАБОТА УХХСАКОСТН ХУУБААМСОС ТСУТУВЗАВТ КОРЕБУКРЕАВ

СВЕЗТІЗЕВТА АБОСОУКОХЕ РЕБУТУВИМО СЗАБТОСУНТЕ РАМ МУ

БІВЗМУТМЕЕ ЗБІШТКТУТС МУЮНКРОМІК УРККУВОКХО РРОВРОРАРЕ

ЕСОСРЕУКСЕ ВРКРКОТОМІ БВТРЕУТСУУ УВУБОВБОРЕМ ОРМИУЧОВУВ

УНМАКТКРКЕ БОБМНБАХКМУ БУБТУШНОВИ БНОКЕХКОСКУ БМКСЬРЕЯТЕ

КТІЗКАКООР КЕРОМУТЬРР БОБЕМТКМОУ ББЕССУКСЕХ РОБІЛДУКНКЗ

МНООРЕНМНУКТ ТРРУЦПОВЮОСЯ ЕКЕЕМЛУБЕОТУЮ КЕЕМОВСМУК БСБУМНЕАСН

МННЕУТОКЯСОЇ 513

ЗБОЮ МО:79 (зрілий білок: пепереєленії виділені жирним шрифтом мутації

ОФЕРТА

ЕОБУВБООС БУОРОСОВІНІ. ЗСАУЗСЕББТ МІБУНЯУКОЯ ВОКОБЕНМОУ тхясозотТехМ БУКВІ БОТОКНТУХЬ ОММЯБКАВОТ АУХУСАКОБІ

НУЖУБААМОСОЮ СТОУТМОВАВ ТКОРБУВКРЬА РОБОТ ААБОСОЧКИХ

ЕРЕРУТУЗИМ БОАГТЯСУНТ ЕРАУТОСВОЬ БІЛОБУУТУЮ ЗЕБОЬОТКТУТ

СМУЮНКРЕОМІ КУКЕУБВКУ ОРРСРЕСРАР ЕБОСОРЕУКЬ КРРЕРКОТЬМ

ХБЕТРЕУТСУ МУОУБОВОРЕ ЧОБМНЯЖУЮЄУ ЕУНМАКТКРЕ БЕОЖМЗАТКУ

УБУБДТУНОЮВ МІМОКЕУКСКЕ УБНКСРБВЕ ВЕТІЗКАКСО РЕЕРОУЖТЬР

РЕОБЕМТКМО УБЮОТСОЧУКСЕ УРООІАУКИЕ ЗМНООРВЕННЕЖЕ ТЕРЕМБОІ

БЕКБУВЕМОКУ ЮКБИНОВОМУ КБЕБСЯУМНЕВЬ НИНЖТОКаБО Ба

ЗО ОО МО; 73 дтОсАсСтТОосА ССТОСАОССІТ ЄТЕСТССТТОо СТОоОСтТеТАш САССАОСТИС

ССАСТОСОАА СТАСАдТТО ТООАСТСТОЮ Осо СТЕ ЗзКССАСССТо

СТОСОдОосСсСтТ ОСОТСТСтсТР ТатосАТаА ЗСЗОСЕТСАа СТСТАССАА

ТАССАТОТОС АСТОССТОаСО ТСАСОСАССТ СОСАВОВОСС ТОСВаИТОСАТ

СОСТОТТАТЕ ТОСОССОАСО СССАТАСАТО СТАСААСТОС ОТОСТОАВОСА

ЗОСОСТТТСАЄС САТТТССССТ СОАСАССТСАА АСААТАСОсСТ ТрАССТОСАЄ

АТОАВСТОТС ТОСОСОСАСА ССАСАСАССА СТОСТАТТАСТ СТОСАСОТСА.

АСТОАСССАС ТАТТАСОТТІ ТООСАСОСТО СОСТСААОСО АСТСТОСТСА

САСТСТОСАС СОСТТСААСС дАдОосОСсосАТ СОЗТСТКОСИ сотТОСОССе тастесАвАТ СТАССТСОССА САОСАСсаСсС пОссСтТОЗОсСт ССС ТСВА.

ОСАСТАСТТС ССССААСОВО ТОАСОСТОТС ОТОСААСТСА СОСОСОСТОА

ССАООСОСХ ЗСАСАССТУС ССООСТОТСС ТАСАОТОСТО ОСАСТСТАЄ

ТССеСТСАБСА сСотастісве ССТОСССтСО АшСВОСТТє ОСАОпАдСАЄ

СТАСАССТОС ААССТАСАТО ВСАВОСССАС СААСВССААИ СТОСАСААСА.

САСТІЯАЖКС САААТАТОСТ СССОССАТОСО САСОБТИС АеСАССТОовО

ТРОСТОООООЗ ЗАССАТСАСТ СТТОСТОТТС СССОСААДАС ССАВОСАСАС

"КСТСАТСОАТС ТеССОСАСС СТсАсаТсАС ауссОтаста ЗтТОСАСОТОВ

Фіг. 16

СССАССААСА СССОСАОСТО САСТТСААСТ ССТАССТОСА ТОСОСТОСАЄ

СТОСАТААТО ССААСАСААА ОССОСООСДО САССАСТТСА АСАССОССТА

СОСТОТОСТО АОСОТОСТСА СССТОСТОСА ССАССАСТОС СТОЛАССОСА

ВОСАСТАСАА СТОСААОСТО ТОСААСАААО ОССТООСОТО СТОСАТСоАо

ААААССАТСТ ССАААСССАА АСОССАССОС ССАСАСССАС ВАСТОТАСАС

ССТОСССССА ТОССАССАСО АСАТОАССАА СААССАССТО АОССТОдеСТ

СОСТОСТСАА АСОСТТСТАС СССАСОССАСА ТСОССОТОСА СТОССАСАСО

ВАТОСОСЛОС СОСАСАДСАА СТАСААСАСС АСОССТСССО ТОСТОСАТТС

СОАСОССТОС ТТСТТССТСТ АСАОСАСОСТ ААССОТОСАС ААСАССАСОТ

СОСАССАСОС СААТОТСТТІС ТСАТОСТОСО ТОАТОСАТОА СССТСТОСАС

ААССАСТАСА САСАСААСАС ССТСТОССТО ТСТСТОССТТ СА

Фіг. 16 продовження

Й, | аігаб х 5-в ЕДб ач за и ще чі - 2 те ЩІ тгібав" «цій в !

Фіг. 17 щ

Профіль активності азитизіла 342 Еаб'є аб ПЕГ 342 « трансплантат ФІ 4еНІ

Значенні Ку ІС для со для і Св улесті конкурентного

Шини зв'язування з нау зв'язування (пкМ)

ВізеетекмМуй СЕМ (нгУМЛ) інет Що у ще ж Не: і . не:

Атлікозильне 000 ; 7 ши Но що І

Теб4- антитіло 342 | робиля. | 25 «8 ши 38 ши

Фіг. 18

Інгібування ІгС імунної відповіді на правневий токсоїд У макак ципомолгує

Первинна імунна відповідьна ТТ т- БФ:

Що зБ0 ше

Б 40 - мен ФеВОВІЗНІН рОЗЧНИ, "В за кантроть. І :

Е ; К- 345 баБЗРЕВ 5 зніке ж Зоо рай і 2 -- аз Бар 20 мике

З 2500 -е- 349 Баб-РЕО 60 міг/кт о і ! ті НибоВ 20 м/ке ково і щ і ;

Шо що . геї БО тал нн нини пе б. перс сови я - 1 ях 00л40006за ; Доба досліду.

Імунна відповідь на ГІ на 30-50 добу

КЕ зоба тп ЗО і ; це вод ; х оодж Фіз нхМгічннЕйй розчинуконтНодь х ; Х --2 Бар-РЕО Б щоку в бо / ; фот З4 БаБУРЕО 20 Мі/кг с, хюко / Зк -- НОБсЯ 20 меке з їй ан В

Е зводо - ! я і ї в и що вою . т Й в шк

Що 32 34 36 38 40 42 да аб «в бо 52 доба вових:

Фіг. 19

Інгібування ІРО імунної відповіді направцевий токсоїд у макак циномолгус 2250- 2000 ра 2 -к- Контроль

Е 1750 - Нибоб

Н «500 / і - шовк сгнновильне беете

ЕЕ | их -- З42 Баб'РЕС і. 1250 | и - 342 ОЕМ-РЕС х Аглікозильне актитню го 4006 ; -- з ство : ух дя 500 і Коні т і я і 25О І ай ще го "МЕН | ; Я 02 4 6 8 1019141618202524 2698 30 32

Доба досніду

Фіг. 20

Первинний ІМ імунної відповіді на правцевий токсоїд у макак пиномолгус 900 о. е І М - ВО ; чі

Я й че --фуологічний розчин, Контроль дою я --е-342 Еар'«РЕО 5 мікг й я во --- 342 Баб-РЕС 20 мкг ща 50 ; --342 гав бо меке - | о и сь НиБСеВ 20 мілкг

І; 400 - ЩІ - І р я 300 К. 200 | ; тої о, ; 196 г п-А--ї ія і мі І

Є) - че 14 16 18 20

Доба лостду

Фармакокінетика антитіла 342 Каб у макак циномолтус чорною

С й я бдйві то боннсені. й ш 4 що «- щк - а - "ж

З Гой пан ЗМ уд о Не НИАЩНЇ 5 як і Шо | ее

В Ши г 40 фнннння й с й ее спосотннтю пн А а 9 100 жо зо що що тоб аб «іх Е Че (тодинн) чех мій: виБев авефуанукт БаБ'НЕФ наб мк ваг'рео

Фіг. 22

Е » В. Й б. - Аз 3 1 338 З 402

Ше ! | 5 ЩЕ) В 1

ЕІ КН в . З

З 4. Е. з о. Ей С ж. І !

МО рює ою б в йо бю юю ю

Зіктенсканість Вахенонакасхв Титснсивнть флуврегцення «вворта финореєденни света фаумресненнв сянодта р. Ба лона нв Е. З й й Р.в оз

ДИ шк / 0 я і)

Ж : ; ШЕ Кї г лашогя соч пгт з в НН Й с ДЦ пет танути бо зве о? я ФО обо яой юбзо! тое ой інтенсивність Інтенсивність інтенесняність

Ффлусрсоцени "Висоти флудрогвении -нисста флуспесненци -висата а / З з 1 | 303

Бе З п : "Я:

Ко В Кк «р 51 1 Е - яке : свй за у А -, й с шани жи суль жи: й бо або о бою оно й

Титецоканість Інтенснаяність й флусресненци -явсвй фуореєцении свнсота

Фіг. 23

А. - В. С. я й пт ятш---- ВІї - ШІ 8 - 402 - 13 81 мя о у о ! юю! юю ою б зо оо зо юю ше о інФчесавність інтенсивність ТнзевенЕкать флусресценій! висот фхуорвепени сяноока флупресценції висота є Ву ШТ Е, 8 - шииони Е. З ї -1ЩИА 5 ви 335 ЩА зо с з щи о Зх в ери у мнврсутнн рвуть т ен й

ЮР вк ак м М мб зо! о юю моз об ав? омливнить Титенснаність Інтеновінсте флуоресцентх висота фтуоросценни «висота фзусресценци -внсота: - Нн. -1Щ А го в ш т ! Е. я пе а Я юю юю тб об лоб ою

Інтенсивність Титов

Фалусресценци висота: флузресценити-вицуєа.

Фіг. 24

А. 4300---- . . . ше ї ще о» лиш яв 5с8 Баб' М й т 342 Раб" шо! |З НІ. -400. 0 00 200 300 400 БОЮ 600 яю 800

Час (сю

В. 4300 ст - 4200 до СО в ше М 342 Ба 4000- Й 5с8 БІ, 528 Еаб'

БО 00250 БЮ 7850 4000 4250 1500 1750

Часісех)

Фіг. 25 б. я. 14750 : 1909 Її | 528 Еаб'

Я: 14250. « ЕСО о

М 342 ау 11009 342 ГК, -00 1000 00 200 300 400 500 600

І Чисісек)

Фіг. 25 продовження

0.

ЗВО систе 2 134004 Ї то і в ща, ;

В 13200 4 й

Е: ї чи 5Св кар

А 130064 жк СО 1 ее 28 пн нн ее орніяння - 0 250 що Та 3090

Часісек)

Е. 13800-е - : : 13600- т 13400 х а ; щ- 13200 - ік К 3З42 Ба м .

В --е 908 Ба

З ззорої. ж Со 12800 вх хл- ННЯ

Е 0 250 БО 750 1090

Й пе сек)

ТБ --я -

НИ ЕС

Е БОС. ве а а у апенванннн ! 2505 М | (буфер, й-іх ! 42 гай аби х СО4ОвЕс 5Се баб -250-г- яр ; . 0 300 200 300 400 500 600 700 800

Насісвю

Фіг. 25 продовження

Типова агрегація тромбоцитів у відповідь на комплекси

ТВ5СВА /антитіло (тест І) ех Їсвщй «З ре, і | тгасе 1 дхасе 2 штвсв З ткасе кі

ГЕС Дует пенсія Ши ня кун ння

Ром ЯМИ ВИ НИМ ПИ коли поля МЕ ЩЕ Пл викон звнавьня новання нон

І ! ( наче сік аняьло протя СПЯФЬ. І | кет пімльне внтитию Ра -НЕЄ Е зазеклу МОЯ МУ І І хна ольяе азлрятухх ДІЕа НЕ : 0 Гр яолоьке та антикіно проти Ян діння протя СТМОЮ БВ НЕТ Ма й г Срер отих вот нибся, н ши дйтитіво проти СТМЮЇ, шеав-пег зда ; зо й лад. оВЕпІхузМ ьо лкмдено: ки 13 я й й й щЩИ. актнтою пре СТЯОЇ; внатипу Таб БохеВ щи Я пливе Кат ро дже КА зхотих Те, Ї й їн . сннікннн. ренні ча снасть соноя о А 1 1 о Я МИ М М ВИ

СМ ИИ МА ПТ НИХ ОН ИМЕНИ МИ ля М М

Мк м он: кох Нв НИ ПОН МОЯ ОХ АН НАННЯ НЄ ВОНО ПОЛОН А: ро Шик нин р шт моє пи и о ВО ВО нвг- -8---- ; - й Й ЦПоріжа лвка Кк. й ня ПОД и УНН жнкк н зитетио проти СЮОР, діквв КЕКС Ма лихаське контрольне ців узамиту ТО вові ай

Машини Ар вититще проти СТО мотипу ач проти СТ РУ МЕ З.

ТВЄно Неосе й чека кантроньне анти ЕВ ПЕГ з; мкшачеля Ар 'авнтяпло прота СІМОХ. дкатису (ОМ і жонтрольне млитло Кап шиті Зкасвне Не цим ло проти СТИКИ іону ТЕО ЛлКасоВ фіг. 26

Шкасе 1 Ікасе. й пасе .3 тхВсе,й

Мини Пани пнів ші "0 ЗЕФТрикав-ПЕС

І Щ Атгукозильне За-аитихтию 342 481 ванн ши ща . жи ши ши Ши МИ ю 100111 - 2-1 2 6 їх0й 8106 31054100 я пиши Час (ха:сек)

Фіг. 26

Типова агрегація тромбоцитів у відповідь на контрольне й анти-СТІ54-антитіла (тест 2) 70 ск ще . ппнснннюнюненннн ! с 65а Е а Мпа й с ві ММЗ ке |жех Ї я їв ця р ше; і 020 свв: | -3 пд : ще СИ і -товічня

ШІ І ші

НН Не еЯ Я ел и и Ше ко 5 а ог - МО 5 ЕВ 5 5 о 5 о 15 дО Б Ж в К т а вої Ж 8 сл а о ОВ В

Ко Я юю й г щ

В те й Но : Е т я 5

В в в х - ся о і 2 2 5 тА х : Е шк т з В 5 і: 8

Ж в

Бані :

З шо тя Кк я т

Зк

Фіг. 27

4 І З 1

Людський розчинний СТ40Ї. о ронвотА АЯУІЯЕАЄСК ТТЄУПОНАНИ СУТТНОКМІМ ТОЕМСКОБТУ

Мизвачнй розчинний СОЇ, Шо Що

СОНОРОТА АНЧУБЕАМЯН ДАБУТЛНАКЕ СУЄТМКУМІХ НЬЕНОКОБТУ

. | 5. 11 2 в в. в

Людський розчниний СОЯОЇ; ККОСКІУЕУА ОМТРУСВМВКА З8ОАРКІАФІ СІКЕРСЯАКЕА ІБЬКААНТНЯ

Мишачий розчинний СОЯОЇ, 0 кнесьутутт дутесямаАне ЗБОБРЕТУСІ, МЕЖРЕЄОВКА ІІЛКААИТНО

І сх -2. 1 5 -8 Я

Людський розчинний СЮОЇ ВАКРОСОСОЇ ЯБОСУКЕБОР САЯУРУМУТО РЕОЧЕНСТОВ ТЕРОБІКЕ

Мищшачий розчинний СОЯОЇ. вроксвоову нрссчтяцох зАВУРУНТТЕ БсОУінвуст ЗОЕШИКЬ

Фіг, 28.

А. 4004 д З00 й о 8 Е 2004 / 74004 / 0.060001 0.01 1 100 10000

Ібіотинілований 342 Еаб/1 (НМ)

В. 200 150- я 0 що 5 І й 0.01 0 1 70 100

ЇІбіотинілований 5с81| (НМ)

Фіг. 29 б.

Ж біотинілонане аититідо 342 в «В біотиніловане зититіло 528 гу ший ся я 05 а я ж во що. ШЕ ОН ан Я 00001 01 1 100 160000

ІєЬ342 Ба) (ВМ) 0. 1004, я 0.75. |. ка й те ! У с шо

З |. пд

В І Ше 7 6254 ох п в тт 0 0.4 у 10 100 (58 Баб'ї (НМ)

Фіг. 29 продовження

Claims (29)

1. СО154-зв'язувальний білок, що містить послідовності СОКІ, СЮОКО 1 СОКЗ важкого ланцюга, згідно з 5ЕО Ю МО:3, 5ЕО ІЮ МО 4 1 БЕО Ю МО:5, відповідно; і, що містить послідовності СОКІ, СЮОК2О 1 СОКЗ легкого ланцюга, згідно з 5ЕО Ю МО:6, 5ЕО ІЮ МО :7 1 БЕО ІЮ МО:8, відповідно.

2. СОБІ154-зв'язувальний білок за п. І, де зв'язувальний білок являє собою анти-СО154- антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент.

3. СО154- зв'язувальний білок за п. І або п. 2, що містить послідовності важкого і легкого ланцюгів 5ЕО ІЮ МО: 13 1 БЕО ІЮ МО 15, відповідно.

4. Анти-СО154-антитіло за п. 2 або п. 3, де антитіло вибране з моноклонального антитіла, химерного антитіла, приматизованого антитіла і гуманізованого антитіла.

5. Анти-СО154-антитіло за п. 2 або п. 3, де антитіло вибране з мультимерного антитіла, гетеродимерного антитіла, гемідимерного антитіла, тетравалентного антитіла, біспецифічного антитіла та одноланцюгового антитіла; та їхніх похідних.

б. Антигензв'язувальний фрагмент за п. 2 або п. 3, вибраний з Раб, Е(аб)», Раб, Е(аб')», К(аб')з, Ед, Еу та однодоменного антитіла.

7. Анти-СР154-антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 2-6, які модифіковані ковалентним приєднанням функціональної групи.

8. Анти-СО154-антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за п. 7, в яких функціональна група являє собою поліетиленгліколь або його похідне.

9. Анти-СЮ154-антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за п. 8, де антигензв'язувальний фрагмент являє собою Еар' де тіольна група в модифікованій шарнірній ділянці ковалентно зв'язана з малеїмідною групою, яка ковалентно зв'язана із залишком лізину, де полімер метоксиполіетиленгліколю, що має молекулярну масу приблизно 20000 Да, приєднаний до кожної з аміногруп лізину.

10. СО154-зв'язувальний білок за п. 1, де зв'язувальний білок містить білковий кістяк, який відрізняється від імуноглобулінових доменів.

11. СО154-зв'язувальний білок за п. 1 або п. 2, де в зв'язувальному білку відсутня Ес-ділянка імуноглобуліну.

12. СР154-зв'язувальний білок за п. 1 або п. 2, де зв'язувальний білок містить Ес-ділянку імуноглобуліну, вибрану з Ес-ділянок ІФбі1, 1602, ІОе3 1 Ібб4 або одержану з Ес-ділянок Ів, ІгО2, ІСв3 або ІвС4.

13. СР154-зв'язувальний білок за п. І або п. 2, де зв'язувальний білок додатково містить варіантну Ес-ділянку, яка надає знижену ефекторну функцію у порівнянні з нативною або початковою Ес-ділянкою.

14. СР154-зв'язувальний білок за п. 13, де варіантна Ес-ділянка являє собою гібридну Ес-

ділянку, що містить послідовності з Ес-домену Ів більше ніж одного типу.

15. СО154-зв'язувальний білок за будь-яким із пп. 1-14, де зв'язувальний білок не глікозилований.

16. СЮ154-зв'язувальний білок за п. 13 або п. 14, де знижена ефекторна функція являє собою знижене зв'язування з Ес-рецептором (РЕсК).

17. СЮ154-зв'язувальний білок за п. 13 або п. 14, де знижена ефекторна функція являє собою знижене зв'язування з білком комплементу.

18. СЮ154-зв'язувальний білок, анти-СО154-антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 1-17, де зв'язувальний білок, антитіло або фрагмент зв'язані з функціональною групою.

19. Молекула нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид СО154-зв'язувального білка, анти- СО154-антитіло або антигензв'язувальний фрагмент, за будь-яким із пп. 1-18.

20. Молекула ДНК, що кодує поліпептид СЮ154-зв'язувального білка, анти-СО154-антитіла або антигензв'язувального фрагмента, яка містить послідовність, що вибрана з 5БО І МО:16, 5ЕО І МО:17, 5ЕО ІЮ МО:18, 5ЕО ІЮ МО:19, 5ЕО ІЮ МО:20, 5ЕО І МО:21, 5ЕО Ір МО:22, 5ЕО ІЮ МО:23, 5ЕО ІЮ МО:24, 5БО ІЮ МО:25, 5БО ІЮ МО:26, 5БО ІЮ МО:27, 5ЕО Ір МО:28, 5ЕО ІЮ МО:31, 5ЕО ІЮ МО:32, 5ЕО І МО:33, 5ЕО ІЮ МО:34, 5ЕО ІЮ МО:41, 5ЕО Ір МО:701 5ЕО ІЮ МО:73.

21. Вектор, що містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 19 або молекулу ДНК за п. 20.

22. Клітина-хазяїн, що містить вектор за п. 21.

23. Спосіб одержання СІ154-зв'язувального білка анти-СЮ154-антитіла або антигензв'язувального фрагмента за будь-яким із пп. 1-18, який включає стадії: (а) культивування клітини-хазяїна за п. 22 в умовах, придатних для експресії СО154- зв'язувального білка, анти-СО154-антитіла або антигензв'язувального фрагмента клітиною- хазяїном; 1 (5) виділення СО154-зв'язувального білка, анти-СО154-антитіла або антигензв'язувального фрагмента.

2А. Спосіб за п. 23, в якому клітина-хазяїн є прокаріотичною або еукаріотичною клітиною.

25. Композиція, що містить СІ154-зв'язувальний білок, анти-СО154-антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 1-18 і придатний фармацевтичний носій.

26. Композиція за п. 25, що додатково містить додаткову імуносупресивну або імуномодулюючу сполуку або засіб.

21. Застосування С0РІ154-зв'язувального білка, анти-СР154-антитіла або антигензв'язувального фрагмента за будь-яким із пп. 1-18 або композиції за п. 25 у приготуванні лікарського засобу для лікування або профілактики стану, порушення або захворювання людини, опосередкованого у цілому або частково сигнальним шляхом за участі СЮ40, або симптому будь-якого з зазначених вище.

28. Застосування за п. 27, де стан, порушення або захворювання являє собою запальну або аутоїмунну реакцію у відповідь або фіброз.

29. Застосування за п. 28, де запальна або аутоїмунна реакція у відповідь або фіброз вибрані з ревматоїдного артриту, системного червоного вовчака, спондилоартриту, запального захворювання кишечнику, хвороби Крона, псоріазу, склеродерми 1 розсіяного склерозу.