TWI872676B

TWI872676B - 趨化因子c-c基序配體7 (ccl7)拮抗劑在製備用於改善傷口癒合之藥物中的用途

Info

Publication number: TWI872676B
Application number: TW112133337A
Authority: TW
Inventors: 張婷婷; 陳肇文
Original assignee: 國立陽明交通大學
Filing date: 2023-09-01
Publication date: 2025-02-11

Abstract

本發明提供一種改善傷口癒合的方法，包括向有需要的受試者施用有效量的趨化因子C-C基序配體7(CCL7)拮抗劑以抑制CCL7活性。

Description

趨化因子C-C基序配體7(CCL7)拮抗劑在製備用於改善傷口癒合之藥物中的用途

本發明係關於一種改善傷口癒合的方法，特別係關於一種預防及/或治療慢性傷口的方法。

傷口通常會隨著時間的推移而癒合，但是糖尿病患者的傷口不會很快癒合，慢性傷口在糖尿病患者中很常見。這對患者與醫療保健系統都會產生負面影響。考慮到糖尿病盛行率不斷增加，在不久的將來它將成為重大的醫療、社會及經濟負擔。因此，需要為目前可用的治療提供替代方案，目前可用的治療雖然多種多樣，但不能保證快速且確定的修復過程。

在糖尿病患者中，血管病變和傷口血管形成不良可導致傷口癒合時間延長及截肢。除了高血壓、血脂及血糖等危險因子外，糖尿病血管病變也與全身血管發炎反應有關。糖尿病患者的傷口癒合不良佔慢性傷口患者的大多數。其主要原因係傷口血管生成緩慢，故營養物質在傷口部位不起作用；因此，如何促進傷口血管生成係一個重要的議題。然而，市場上經美國FDA批准用於改善慢性傷口的藥物很少，特別係推薦用於患有糖尿病血管疾病及感染的患者，例如糖尿病足患者的藥物；因此，仍需進一步開發一些創新藥物。

預計大多數糖尿病族群在一生中都會患有足部潰瘍。此等潰瘍本質上往往是慢性的，因為它們不會癒合或癒合極其緩慢。糖尿病足潰瘍對糖尿病患者來說係一個嚴重的問題，因為大多數糖尿病足潰瘍最終會因週邊血管病變而需要截肢。

鑑於前述，本發明提供一種用於改善傷口癒合的方法，包括向有需要的受試者施用有效量的趨化因子C-C基序配體7(CCL7)拮抗劑以抑制CCL7活性。

在本揭露之一實施態樣中，該CCL7拮抗劑係選自由CCL7中和抗體、CCL7 RNA干擾(RNAi)劑、C-C趨化因子受體1型拮抗劑、C-C趨化因子受體2型拮抗劑、C-C趨化因子受體3型拮抗劑、C-C趨化因子受體5型拮抗劑、及其組合所組成之群組。

在本揭露之一實施態樣中，該傷口係慢性傷口。

在本揭露之一實施態樣中，該受試者患有糖尿病足潰瘍。

在本揭露之一實施態樣中，該CCL7拮抗劑的有效量為約0.01μg/kg至約100mg/kg。在本揭露之另一實施態樣中，該CCL7拮抗劑的有效量為約0.1μg/kg至約1mg/kg。

在本揭露之一實施態樣中，該CCL7拮抗劑經由口服、舌下、腸胃外、直腸、腹膜內、靜脈內、皮內、肺內、肌內、皮下、胸膜內、局部、鼻內或經皮施用至受試者。

在本揭露之一實施態樣中，該施用增強受試者中的血管生成。

在本揭露之一實施態樣中，該施用保護受試者的內皮細胞功能。

在本揭露之一實施態樣中，管形成能力得到改善。

在本揭露之一實施態樣中，內皮細胞的遷移能力得到改善。

在本揭露之一實施態樣中，選自由G-CSF、IL-1β、IL-1α、IL-2、IL-6、IL-8、IL-11、IL-17、IL-18、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、TNF-β及其組合所組成之群組中的至少一種發炎因子的表達減少，較佳為該發炎因子選自由IL-1β、IL-6、TNF-α及其組合所組成之群組。

在本揭露之一實施態樣中，血管生成因子的表達增加。在本揭露之另一實施態樣中，該血管生成因子包括VEGF、SDF-1、EGF、Ang、EPO、FGF、GDF或其組合，較佳為該血管生成因子為選自由VEGF、SDF-1、EGF、Ang、EPO、FGF、GDF及其組合所組成之群組中的至少一種，更佳為該血管生成因子為VEGF、SDF-1或其組合。本揭露之又另一實施態樣中，VEGF可係VEGF家族中的任何一種，例如VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D或胎盤生長因子(PlGF)。

在本揭露中藉由使用CCL7拮抗劑，本揭露提供之方法可改善人類真皮微血管內皮細胞(HDMEC)的功能，進而促進傷口癒合。本揭露之使用CCL7拮抗劑的方法可用於改善內皮細胞的管形成能力及/或遷移能力，因此可有效改善傷口癒合。

更且，本揭露亦提供有效量的前述CCL7拮抗劑在製備用於改善有需要的受試者的傷口癒合之藥物中的用途，且該CCL7拮抗劑抑制CCL7活性。亦提供有效量的前述CCL7拮抗劑，用於改善有需要的受試者的傷口癒合，且該CCL7拮抗劑抑制CCL7活性。

藉由下述結合附圖的詳細描述，本發明之其他目的、優點及新穎特徵將變得更顯而易見。

本專利或申請文件包含至少一幅彩色附圖。智慧財產局將根據請求及必要的費用的支付提供帶有彩色附圖的本專利或專利申請出版物的副本。

藉由閱讀以下結合附圖對實施態樣的描述，可更全面地理解本揭露。

圖1A及1B表示經高葡萄糖刺激的HDMEC中CCL7的上調。

圖2A至2D顯示發炎因子(IL-1β、IL-6及TNF-α)的表達在經高葡萄糖刺激的HDMEC中增強。

圖3A至3C顯示血管生成因子(VEGF及SDF-1)的表達在經高葡萄糖刺激的HDMEC中降低。

圖4A至4D顯示發炎因子(TNF-α、IL-1β及IL-6)的表達藉由直接刺激CCL7而增強。

圖5A至5C顯示血管生成因子(VEGF及SDF-1)的表達藉由直接刺激CCL7而減少。

圖6A及6B表示HDMEC的管形成能力因施用CCL7而受損。

圖7A及7B表示HDMEC的遷移能力因施用CCL7而受損。

圖8A及8B顯示經高葡萄糖誘導的CCL7因施用CCL7 siRNA(siCCL7)而被敲低。

圖9A及9B顯示發炎因子(IL-1β、IL-6及TNF-α)的表達因施用siCCL7而減少。

圖10A及10B顯示血管生成因子(VEGF和SDF-1)的表達量藉由施用siCCL7而增加。

圖11A及11B表示HDMEC的管形成能力藉由施用siCCL7而改善。

圖12A及12B表示HDMEC的遷移能力藉由施用siCCL7而改善。

圖13A至13D表示藉由中和抗體對CCL7的抑制改善了db/db第2型糖尿病小鼠的傷口修復。圖13A顯示傷口區域。圖13B顯示傷口閉合率的定量結果。圖13C係H&E染色的圖像，顯示經CCL7抗體治療的糖尿病小鼠的傷口切片中傷口癒合的改善。圖13D係CD31免疫染色的圖像，顯示在經CCL7抗體治療的糖尿病小鼠的傷口區域中檢測到比未經治療的糖尿病(DM)小鼠更高的CD31表達。

以下實施例用於說明本發明。本發明所屬技術領域中具有通常知識者基於說明書的發明可輕易想到本揭露的其他優點與效果。本揭露亦可如各種實施例中所描述者來實現或應用。對於不同的面向與應用，可在不違背本揭露之精神與範圍的情況下修改或改變以下用於實施本揭露的實施例。

亦需注意者，除非清楚且明確地限於一個指稱物，本揭露中使用的單數形式「一(a)」、「一(an)」和「該(the)」包括複數指稱物。術語「或(or)」與術語「及/或(and/or)」可互換使用，除非上下文清楚地另有說明。

如本文所用，術語「包括(comprising)」或「包括(comprises)」用於指稱組成物、方法及其各自的組分，其對於本揭露是必要的，但可包括未指定的元素，無論是否必要。

本文中使用的包括描述性或技術性術語在內的所有術語均應被解釋為具有對於本發明所屬技術領域中具有通常知識者而言顯而易見的含義。然而，根據本發明所屬技術領域中具有通常知識者的意圖、先例或新技術的出現，此等術語可具有不同的意義。在本揭露中可任意選擇一些術語，且在這種情況下，所選的術語的含義將在本揭露的描述中詳細描述。本文所使用的術語必須基於術語的含義以及整個說明書的描述共同來定義。

本揭露提供改善傷口癒合的方法，包括向有需要的受試者施用有效量的趨化因子C-C基序配體7(CCL7)拮抗劑以抑制CCL7活性。

在本揭露實施型態中，CCL7拮抗劑，又稱為單核細胞特異性趨化因子(MCP)-3拮抗劑，其能夠阻止CCL7與其受體的結合。在另一個實施態樣中，CCL7拮抗劑係抑制由CCL7與其受體結合所產生的細胞內訊號傳導的藥劑。例如，CCL7拮抗劑可針對CCL7與CCL7受體中的至少一種，從而阻斷CCL7訊號傳導。如本文所用，CCL7的受體包括但不限於CCR1、CCR2、CCR3、CCR5。

如本文所用，術語「CCR1」或「CCR1受體」、「CCR2」或「CCR2受體」、「CCR3」或「CCR3受體」、以及「CCR5」或「CCR5受體」可互換使用並且具有它們在本領域中的一般意義。CCR1、CCR2及CCR3受體可來自任何來源，惟通常係哺乳動物(例如，人類或非人靈長類動物)CCR1、CCR2、CCR3及CCR5受體。在本揭露的一些實施態樣中，CCR1、CCR2、CCR3及CCR5受體是人類受體。

如本文所用，術語「CCL7」具有其在本領域中的一般意義。CCL7係CCR3受體的天然配體並且可來自任何來源，惟通常是哺乳動物(例如，人類或非人靈長類動物)CCL7。在本揭露之一實施態樣中，CCL7係人類CCL7。

如本文所用，術語「CCL7拮抗劑」包括在向受試者施用後導致受試者中與CCL7相關的生物活性的抑制或下調的任何實體，包括除此之外的任何由CCL7與其受體結合所產生之下游生物效應。CCL7拮抗劑包括可抑制CCL7活性或阻斷CCL7受體活化或CCL7受體活化的任何下游生物效應的任何藥劑。此類CCL7拮抗劑包括能夠與CCL7相互作用從而阻止或降低其正常生物活性的任何藥劑。例如，該試劑可係針對CCL7的有機小分子或抗體，例如CCL7中和抗體，其可以阻斷CCL7與其受體之間的相互作用，或者可阻斷CCL7的活性。CCL7拮抗劑亦可係針對CCL7受體的小分子或抗體，其可藉由佔據受體的配體結合位點或其一部分來發揮作用，從而使受體無法接近其配體CCL7。

片語「有效量」意指導致個體中病症、異常或症狀的減少、抑制或預防所需的活性成分的量。如本發明所屬技術領域中具有通常知識者所認識到的，有效量將根據施用途徑、賦形劑的使用以及與其他治療方法共同使用的可能性而變化。

本文所使用的術語「受試者」可與「個體」互換，且包括單一生物體，包括但不限於動物例如脊椎動物、哺乳動物或人類。術語「有需要的受試者」意指表現出或患有與慢性傷口相關的一種或多種症狀的受試者。具有適當資格的人員或醫生能夠使用標準測試方案或指南來識別需要治療的個體。相同的測試方案或指南亦可用於確定個體的疾病或症狀是否有所改善，或確定對需要治療的個體施用的改善慢性傷口的最有效劑量。

本文所使用的術語「改善」意指在任何程度上預防或減少被診斷患有慢性傷口的個體所表現的一種或多種症狀或異常的嚴重性或頻率。這種改善可由接受治療的個體自己或其他人觀察到。

本揭露的方法及CCL7拮抗劑可用於治療多種病症，這些病症將受益於內皮細胞管形成能力的改善、內皮細胞遷移能力的改善、發炎因子的表達減少，及/或血管生成因子的表達增加。

術語「血管生成」表示血管的生長或形成。血管生成包括從預先存在的血管生長出新血管，以及血管發生(vasculogenesis)(指自發性血管形成)及套疊(intussusception)(指藉由分裂現有血管形成新血管)。血管生成包括「新血管形成」、「血管再生」、「新血管生成」及「血管重建」。

如本文所用，術語「治療(treating)」或「治療(treatment)」意指獲得期望的藥理學及/或生理學效果，例如，改善傷口癒合或刺激血管生成。此效果可係預防性的，即完全或部分預防疾病或其症狀，或者可係治療性的，即完全或部分治癒、緩解、減輕、補救、改善疾病或疾病引起的副作用。

如本文所用，術語「傷口」包括手術切口和由意外創傷或病理引起的傷口。這個術語亦包括靜脈淤滯性潰瘍、燒傷、皮質類固醇治療期間觀察到的傷口癒合延遲、老年人中觀察到的傷口癒合延遲(老化缺陷)、壓力、糖尿病患者中觀察到的傷口癒合延遲以及手術疤痕或皮膚移植後的上皮化缺陷。具體而言，本文使用的術語「傷口」意指由糖尿病引起的任何傷口，例如糖尿病足潰瘍。

如本文所用，片語「有效量」意指對經治療的受試者賦予期望的治療效果(例如，期望的血管生成刺激水平)所需的活性劑(例如，CCL7拮抗劑)的量。如本發明所屬技術領域中具有通常知識者所認識到的，有效劑量將根據施用途徑、賦形劑使用、與其他治療方法共同使用的可能性以及待治療的病症而變化。

在本揭露之一實施態樣中，CCL7拮抗劑的有效量為從約0.01μg/kg至約100mg/kg，例如從約0.05μg/kg至約90mg/kg、從約0.1μg/kg至約80mg/kg、從約0.2μg/kg至約70mg/kg、從約0.4μg/kg至約60mg/kg、從約0.6μg/kg至約50mg/kg、從約0.7μg/kg至約40mg/kg、從約0.8μg/kg至約30mg/kg、從約0.9μg/kg至約20mg/kg、從約1μg/kg至約10mg/kg、從約1.5μg/kg至約5mg/kg、從約2μg/kg至約1mg/kg、從約2.5μg/kg至約500μg/kg、從約3μg/kg至約400μg/kg、從約3.5μg/kg至約300μg/kg、從約4μg/kg至約200μg/kg、從約4.5μg/kg至約100μg/kg、從約5μg/kg至約50μg/kg、從約5.5μg/kg至約40μg/kg、從約6μg/kg至約30μg/kg、從約6.5μg/kg至約20μg/kg、從約7μg/kg至約10μg/kg、從約7.5μg/kg至約9.5μg/kg或從約8μg/kg至約9μg/kg。在另一實施態樣中，CCL7拮抗劑的有效量的下限選自0.01μg/kg、0.05μg/kg、0.1μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、3μg/kg、4μg/kg及5μg/kg，且上限選自100mg/kg、90mg/kg、80mg/kg、70mg/kg、60mg/kg、50mg/kg、40mg/kg、30mg/kg、20mg/kg、10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、10μg/kg、9μg/kg、8μg/kg、7μg/kg及6μg/kg。

在本揭露之一實施態樣中，在2至4天內施用CCL7拮抗劑1至2次。在另一實施態樣中，在3至5週的時間內施用CCL7拮抗劑8至15次。例如，CCL7拮抗劑在一週內施用3次、或在4週的時間內施用10次。在又另一實施態樣中，間隔1至4週施用CCL7拮抗劑，例如一週、8天、9天、10天、11天、12天、13天、兩週、15天、16天、17天、18天、19天、20天、三週、22天、23天、24天、25天、26天、27天或4週。

如本文所用，術語「施用(administering)」或「施用(administration)」意指藉由導致活性劑至少部分地定位於期望的位點從而產生期望的效果的方法或途徑來將活性劑(例如CCL7拮抗劑)置入受試者中。本文所述的活性劑可藉由本領域已知的任何適當途徑施用，包括但不限於口服或腸胃外途徑，包括口服、舌下、腸胃外、直腸、腹膜內、靜脈內、皮內、肺內、肌肉內、皮下、胸膜內、局部、鼻內或經皮途徑。

在本揭露一個實施態樣中，CCL7拮抗劑可存在於待施用於受試者的藥物組成物中。在某些實施態樣中，本揭露提供用於刺激血管生成的藥物組成物，其包含CCL7拮抗劑及藥學上可接受的載體。本揭露提供的藥物組成物可有效預防或治療傷口癒合。

在本揭露之一實施態樣中，該藥學上可接受的載體可係稀釋劑、崩解劑、黏合劑、潤滑劑、助流劑、界面活性劑或其組合。

在本揭露之一實施態樣中，該藥物組成物係無菌可注射組成物，其可係在無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的溶液或懸浮液。可使用的可接受的載體及溶劑係1,3-丁二醇、甘露醇、水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，固定油通常用作溶劑或懸浮介質(例如合成甘油單酯或甘油二酯)。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物，作為天然藥學上可接受的油，例如橄欖油和蓖麻油，特別係它們的聚氧乙烯化形式，可用於製備注射劑。此等油溶液或懸浮液亦可含有長鏈醇稀釋劑或分散劑、羧甲基纖維素或類似的分散劑。其他常用的界面活性劑例如Tweens及Spans或其他類似的乳化劑或生物利用度增強劑(其通常用於製造藥學上可接受的固體、液體或其他劑型)亦可用於配製的目的。

藥物組成物中的載體必須係「可接受的」，意指其與組成物之活性劑相容(且能夠穩定活性劑)並對待治療的受試者無害。一種或多種增溶劑可用作藥物賦形劑來遞送活性化合物。其他載體之例子包括膠體氧化矽、硬脂酸鎂、纖維素及十二烷基硫酸鈉。

已使用許多實施例來說明本揭露。以下實施例不應被視為對本揭露之範圍的限制。

[實施例]

材料與方法

活體外研究

細胞培養

以含有VEGF及1%青黴素/鏈黴素(Sigma-Aldrich，P4333，Darmstadt，德國)之內皮細胞培養基(ECM)培養人類真皮微血管內皮細胞(HDMECs，ScienCell，Catalog #2000，Carlsbad，CA，USA)，且培養皿在使用前塗覆上纖維連接蛋白。

將一些細胞直接用重組人CCL7蛋白(R&D Systems，282-P3，Minneapolis，MN，USA)以0.1或1ng/mL處理48小時。

使用siRNA對照(Santa Cruz Biotechnology，sc-37007，Dallas，TX，USA)及CCL7 siRNA(Santa Cruz Biotechnology，sc-72035，Dallas，TX，USA)處理一些細胞，以評估CCL7的直接內源性作用。為了模擬DM中的高血糖，向HDMEC施用濃度為25mM的高葡萄糖(HG；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)。

西方墨點法

使用裂解緩衝液萃取樣品，並在8至12%(v/v)SDS-PAGE凝膠中分離蛋白質。電泳後(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)，將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜(Millipore，Darmstadt，Germany)上。將膜與針對CCL7(R&D Systems，MAB282；Minneapolis，MN，USA)、VEGF(Santa Cruz Biotechnology，sc-152；Dallas，TX，USA)、基質細胞衍生因子1(SDF-1；Cell Signaling，3740S；Boston，MA，USA)、TNF-α(Cell Signaling，3707S；Boston，MA，USA)、白血球介素-6(IL-6；Cell Signaling，12153S；Boston，MA，USA)、白血球介素-1β(IL-1β；Santa Cruz Biotechnology，sc-7884；Dallas，TX，USA)及β-肌動蛋白(Merck，MAB1501，Darmstadt，Germany)之一級抗體在4℃孵育過夜。洗滌3次後，將該膜與HRP共軛的二級抗體(1：1000)在室溫孵育1小時。最後，使用ECL套組對膜進行可視化。

遷移測定

使用Transwell(Corning，Tewksbury，MA，USA)遷移測定來分析處理後的HDMEC遷移能力。將細胞(1x10⁴個細胞)懸浮在無血清培養基中。處理後，將HDMEC與含有25mM葡萄糖之培養基一起孵育2天。將細胞接種於帶有聚碳酸酯膜之24孔Transwell板的上室，細胞向下室遷移，該下室含有 600μL含FBS的培養基，在37℃、5% CO₂下。18小時後，將遷移的細胞固定在4%多聚甲醛中並用蘇木精溶液染色。使用高倍率(x100)顯微鏡捕捉影像。

管形成測定

將HDMEC接種到6孔板之每個孔中直到形成單層，然後進行聯合處理。藉由胰蛋白酶消化收集細胞，並將1x10⁴個細胞/孔接種到96孔板的ECMatrix凝膠(Merck，ECM625，Darmstadt，Germany)中，在100μL含有10%FBS的培養基中，於37℃及5% CO₂下培養16小時。使用高倍率(x40)顯微鏡捕捉影像。使用Image-Pro Plus(Media Cybemetics，Inc.Rockville，MD，USA)計算所形成的細胞管的數量。

活體內研究

DM動物模型

六週齡雄性BKS.Cg-m+/+Lepr^db/JNarl小鼠購自國家實驗動物中心(台灣台北)。實驗前小鼠均已適應環境2週。為了治療傷口癒合，小鼠經腹膜內注射CCL7中和抗體(0.1或1μg；R&D，AF-456，Minneapolis，MN，USA)或IgG抗體(1μg；R&D，AB-108，Minneapolis，MN，USA)，每週三次。根據國立陽明交通大學(台灣台北)動物照護委員會之規定飼養動物。此動物研究已獲得國立陽明交通大學動物照護委員會批准(LACUC No.1100419)。

傷口癒合測定

進行傷口癒合測定以探討CCL7在DM小鼠皮膚傷口恢復中的作用。藉由吸入異氟烷麻醉小鼠。將背部皮膚剃毛，並用抗菌皂液及75%酒精清洗。藉由活檢穿孔器產生直徑3mm的圓形全層切除傷口，無肌肉損傷。傷口產生後用數位相機(Nikon，Tokyo，Japan)記錄。

組織學與免疫組織化學分析

將傷口樣本用4%多聚甲醛固定24小時，在分級酒精中脫水，然後包埋在石蠟中。將組織切成5μm厚的樣本。將切片乾燥過夜並用蘇木精和伊紅染色進行組織學分析。此外，亦測定毛細血管密度的組織學分析。使用0.05M檸檬酸鈉緩衝液進行抗原修復。然後將玻片與一級抗體一起在4℃孵育過夜以檢測CD31(Abcam，124432，Waltham，MA，USA)。使用PBS溶液洗滌樣品，並與二級抗體(兔)室溫孵育2小時。CD31陽性位點顯示為深棕色。對每隻動物之三個橫斷面進行分析；從每個組織製品中隨機選擇十個不同的區，並對可見的毛細血管進行計數。

統計分析

結果以平均值±標準差(SD)表示。數據集藉由未配對的Student t檢定進行分析，然後進行Scheffe多重比較事後檢定。統計顯著性設定為p值<0.05。

結果

使用從成人皮膚分離之HDMEC來探索CCL7在活體外病理條件下傷口癒合過程中的直接作用。圖1至3顯示在經HG刺激的HDMEC中CCL7(圖1A及1B；n=3)、發炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α(圖2A至2D；n=3)，以及血管新生因子VEGF、SDF-1(圖3A至3C；n=3)的西方墨點及統計分析結果。C代表未經處理的HDMEC。HG代表高血糖；1D代表處理1天；2D代表處理2天。*P<0.05，**P<0.01。

從圖1至3可知，CCL7在經HG刺激之HDMEC中上調，具有增強的發炎及減少的血管生成因子表達。

圖4及圖5顯示發炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6(圖4A至4D；n=3)、血管生成因子VEGF及SDF-1(圖5A至5C；n=3)之西方墨點及統計分析結果。C代表未經處理的HDMEC。*P<0.05，**P<0.01。

圖6及圖7分別顯示HDMEC之管形成能力及遷移能力以及定量分析。施用CCL7後管形成能力受損(圖6A及6B；n=3)。施用CCL7後遷移能力受損(圖7A及7B；n=3)。C代表未經處理的HDMEC。*P<0.05，**P<0.01。

從圖4至圖7所示之結果可知，直接刺激CCL7會損害細胞功能，HDMEC中發炎因子表達增強，血管生成因子表達降低，且HDMEC中細胞功能包括管形成能力及遷移能力受損。

圖8至10顯示施用siCCL7後關於CCL7(圖8A及8B及1B；n=3)、發炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α(圖9A及9B；n=3)、以及血管生成因子VEGF及SDF-1(圖10A及10B；n=3)之西方墨點及統計分析結果。C代表未經處理的HDMEC。HG代表高糖處理2天。SiC+HG代表siRNA對照(SiC)合併高葡萄糖處理2天。SiCCL7+HG代表SiCCL7合併高葡萄糖處理2天。M代表甘露醇處理2天。*P<0.05，**P<0.01。

圖11及圖12分別顯示HDMEC之管形成能力及遷移能力以及定量分析。施用siCCL7後管形成能力得到改善(圖11A及11B；n=3)。施用siCCL7後遷移能力亦得到改善(圖12A及12B；n=3)。C代表未經處理的HDMEC。HG代表高糖處理2天。SiC+HG代表siRNA對照(SiC)合併高葡萄糖處理2天。SiCCL7+HG代表SiCCL7合併高葡萄糖處理2天。M代表甘露醇處理2天。*P<0.05，**P<0.01。

從圖8至12之結果可知，siRNA對CCL7之抑制將恢復HG受損的HDMEC的功能，同時降低發炎因子及增加血管生成蛋白表達。

請參照圖13A及圖13B。如圖13A所示之傷口區域，與非DM對照組相比，糖尿病小鼠在受傷後有顯著延遲的傷口修復。測量3mm穿孔活檢之閉合率(n=6)，並將結果示於圖13B。與對照組相比，*p<0.05，**p<0.01；與DM相比，#p<0.05，##p<0.01。與未經治療之DM小鼠相比，在經CCL7抗體治療的小鼠(即DM+CCL7 Ab 0.1μg及DM+CCL7 Ab 1μg)觀察到傷口閉合速度加快。

圖13C及13D分別係H&E染色與CD31免疫染色的代表性影像。H&E染色結果顯示，可在經CCL7抗體治療之糖尿病小鼠的傷口切片觀察到傷口癒合的改善(圖13C)。在經CCL7中和抗體處理之小鼠中CD31陽性區域增強，且在經CCL7抗體處理之糖尿病小鼠中檢測到傷口區域中的CD31表達高於未經處理的DM小鼠(圖13D)。鑑於上述圖13A至13D的結果，證明中和抗體對CCL7的抑制可改善db/db 2型糖尿病小鼠的傷口修復。

綜上所述，實驗證明CCL7的抑制可提高HDMEC的功能，進而促進傷口癒合。使用本揭露之CCL7拮抗劑的方法可用於改善內皮細胞的管形成能力及/或遷移能力，因此可有效改善傷口癒合。

儘管在前面的描述中已闡述本揭露之許多特徵及優點以及本發明之結構與特徵的細節，惟本揭露僅係說明性者。在表達所附申請專利範圍之術語的廣泛一般含義所指示的本發明最大範圍的原理內，可在細節上進行改變，尤其係在形狀、尺寸及部件的佈置方面。

Claims

一種趨化因子C-C基序配體7(CCL7)拮抗劑在製備用於改善有需要的受試者的傷口癒合之藥物中的用途，其中，該CCL7拮抗劑抑制CCL7活性，該CCL7拮抗劑的有效量為0.1μg/kg至1mg/kg，且其中，該傷口係慢性傷口。
如請求項1所述之用途，其中，該CCL7拮抗劑係選自由CCL7中和抗體、CCL7 RNA干擾(RNAi)劑、C-C趨化因子受體1型拮抗劑、C-C趨化因子受體2型拮抗劑、C-C趨化因子受體3型拮抗劑、C-C趨化因子受體5型拮抗劑及其組合所組成之群組。
如請求項1所述之用途，其中，該受試者患有糖尿病足潰瘍。
如請求項1所述之用途，其中，該CCL7拮抗劑經由口服、舌下、腸胃外、直腸、腹膜內、靜脈內、皮內、肺內、肌內、皮下、胸膜內、局部、鼻內或經皮施用至該受試者。
如請求項4所述之用途，其中，該施用增強受試者中的血管生成。
如請求項4所述之用途，其中，該施用保護受試者的內皮細胞功能。
如請求項4所述之用途，其中，該施用改善受試者的管形成能力。
如請求項4所述之用途，其中，該施用改善受試者的內皮細胞的遷移能力。
如請求項7或8所述之用途，其中，選自由G-CSF、IL-1β、IL-1α、IL-2、IL-6、IL-8、IL-11、IL-17、IL-18、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、TNF-β及其組合所組成之群組中的至少一種發炎因子的表達減少。
如請求項7或8所述之用途，其中，血管生成因子的表達增加。
如請求項10所述之用途，其中，該血管生成因子包括VEGF、SDF-1、EGF、Ang、EPO、FGF、GDF或其組合。