TWI870336B - 重組人類酸性α-葡萄糖苷酶 - Google Patents

Abstract

本案提供一種重組酸性α-葡萄醣苷酶及包含重組酸性α-葡萄醣苷酶之醫藥組合物，其中該重組酸性α-葡萄醣苷酶係在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中表現且當相較於帶有阿葡糖苷酶α之一個或兩個甘露糖-6-磷酸酯殘基之N-聚醣單元之含量而言，包含增加含量之帶有一個或兩個甘露糖-6-磷酸酯殘基的N-聚醣單元。本文亦提供產生、純化、及調配重組酸性α-葡萄醣苷酶或醫藥組合物以用於投與至受試者之方法及使用該重組酸性α-葡萄醣苷酶或醫藥組合物治療諸如龐貝氏症之疾病或病症的方法。

Description

重組人類酸性α-葡萄糖苷酶

本申請案主張2017年5月15日申請的美國臨時申請案序列號第62/506,561號、2017年5月15日申請的美國臨時申請案序列號第62/506,569號、2017年5月15日申請的美國臨時申請案序列號第62/506,574號、2017年9月27日申請的美國臨時申請案序列號第62/564,083號、2017年10月3日申請的美國臨時申請案序列號第62/567,334號、2018年1月16日申請的美國臨時申請案序列號第62/618,021號、2018年1月31日申請的美國臨時申請案序列號第62/624,638號、及2018年4月20日申請的美國臨時申請案序列號第62/660,758號之權益，主張該等申請案中每一者之優先權且其中每一者係以全文引用方式併入本文。

本發明涉及醫學、遺傳學及重組醣蛋白生物化學領域，且具體而言，係關於重組人類α-葡萄醣苷酶(recombinant humanα-glucosidase; rhGAA)組合物，其具有較高總含量之帶甘露糖-6-磷酸酯的N-聚醣，從而有效地靶向肌細胞上之CIMPR且隨後將rhGAA遞送至溶酶體，在溶酶體中，該rhGAA可分解異常高位準之所累積肝醣。本發明之rhGAA相較於習知rhGAA產品展現優異的對肌細胞之靶向及向溶酶體之後續遞送且展現其他藥物動力學性質，使得其尤其有效地用於患有龐貝氏症之受試者之酶替代療法。

本發明亦提供用於治療龐貝氏症之方法，其包含向個體投與rhGAA及藥理學伴護蛋白之組合。例如，在一些實施例中，本發明提供用於治療龐貝氏症之方法，其包含向個體投與rhGAA及美格魯特(miglustat)之組合。本發明之rhGAA在治療及逆轉罹患龐貝氏症之受試者中的疾病進程方面展現令人驚訝的功效。

龐貝氏症為一種由缺乏酸性α-葡萄醣苷酶(GAA)活性而產生的遺傳性溶酶體貯積症。患有龐貝氏症之人缺少酸性α-葡萄醣苷酶(GAA)或具有降低位準之酸性α-葡萄醣苷酶，該酶將肝醣分解成作為肌肉之主要能量來源的葡萄糖。此酶缺乏引起溶酶體中過量的肝醣累積，該等溶酶體為含有一般地分解肝醣及其他細胞碎屑或廢產物的酶的細胞內胞器。在患有龐貝氏症之受試者之某些組織、尤其上肌肉中之肝醣累積削弱細胞正常起作用的能力。在龐貝氏症中，肝醣並未適當地代謝且逐漸地累積在溶酶體中，尤其在骨骼肌細胞及在疾病之嬰兒型發病形式中在心肌細胞中。肝醣之累積破壞肌肉及神經細胞以及其他受影響組織中之彼等細胞。

傳統上，取決於發病之年齡，龐貝氏症在臨床上被視為早期嬰兒型形式或晚發型形式。發病之年齡趨向於與引起龐貝氏症之遺傳突變之嚴重性平行。最嚴重的遺傳突變引起GAA活性之完全損失且在嬰兒期期間表現為早期發病疾病。減少GAA活性但並未完全消除的遺傳突變與患有延遲型發病及進程之龐貝氏症形式相關聯。嬰兒型發病龐貝氏症在出生後不就表現且特徵在於肌肉虛弱、呼吸功能不全及心力衰竭。未治療時，通常在兩年內是致命的。青少年及成年發病之龐貝氏症在生命稍後期表現且通常比嬰兒型發病之疾病更緩慢地進程。雖然此形式之疾病通常不影響心臟，但其亦可造成死亡，此係歸因於骨骼肌及涉及呼吸之彼等肌肉之弱化。

龐貝氏症之當前非舒減治療涉及使用重組人類GAA (recombinant human GAA; rhGAA)之酶替代療法(enzyme replacement therapy; ERT)，該重組人類GAA係已知為Lumizyme®、Myozyme®、或阿葡糖苷酶α。此習知酶替代療法設法藉由投與rhGAA替換溶酶體中遺漏的GAA因此恢復細胞分解溶酶體肝醣之能力來治療龐貝氏症。「Lumizyme®」及「Myozyme®」係 藉由Genzyme作為生物學劑生產或出售且藉由美國食品及藥物管理局批准的習知形式之rhGAA，且參考Physician's Desk Reference (2014) (其據此以引用方式併入)來描述。阿葡糖苷酶α係鑑定為化學名稱[199-精胺酸, 223-組胺酸]前驅升-α-葡萄醣苷酶(人類)；分子式為C₄₇₅₈ H₇₂₆₂ N₁₂₇₄ O₁₃₆₉ S₃₅ ；CAS編號420794-05-0。該些產品係投與至患有龐貝氏症之受試者，該龐貝氏症亦稱為II型肝醣儲積病(glycogen storage disease type II; GSD-II)或酸性麥芽糖酶缺乏病。

rhGAA分子之細胞吸收係藉由特殊碳水化合物甘露糖-6-磷酸酯(M6P)促進，該碳水化合物結合至存在於諸如肌細胞之靶細胞上的陽離子獨立性甘露糖-6-磷酸酯受體(cation-independent mannose-6-phosphate receptor; CIMPR)。在結合之後，rhGAA分子藉由靶細胞吸收且隨後轉運至細胞內的溶酶體中。然而，大多數習知rhGAA產品缺少高總含量之帶單M6P及雙M6P之N-聚醣(亦即，分別是帶有一個M6P殘基之N-聚醣或帶有兩個M6P殘基之N-聚醣），從而限制其經由CIMPR之細胞吸收及溶酶體遞送，因此使得習知酶替代療法低效。例如，雖然20 mg/kg或更高劑量之習知rhGAA產品確實改善龐貝氏症之一些態樣，但其尤其不能充分地(i)治療隱伏的細胞功能障礙，(ii)恢復肌肉結構，或(iii)減少在諸如骨骼肌之許多靶組織中之累積肝醣以逆轉疾病進程。另外，較高劑量可對受試者以及治療受試者之醫學專業人士施加另外的負擔，諸如使靜脈內投與rhGAA所需的輸注時間加長。仍然存在對進一步改善用於治療龐貝氏症之酶替代療法的需要，諸如具有改善組織吸收、改善酶活性、改善穩定性、或減少免疫原性之rhGAA。

GAA或rhGAA之醣基化可藉由磷酸轉移酶及Canfield等人之美國專利第6,534,300號所描述的已揭露酶來活體外(in vitro)酶促修飾以產生M6P基團。酶促醣基化不能充分受控且產生具有不合需要的免疫學及藥理學性質之rhGAA。經酶促修飾的rhGAA可僅含有高甘露糖N-聚醣，其全部可潛在地經磷酸轉移酶/已揭露酶活體外酶促磷酸化且可含有每GAA平均5-6個M6P基團。藉由GAA之活體外酶促治療產生的醣基化型式係有問題的，因為另外的末端甘露糖殘基、尤其非磷酸化末端甘露糖殘基負面地影響經修飾rhGAA之藥物動力學。當此種經酶促修飾產品活體內投與時，該些甘露糖基團增加GAA之非生產性清除，增加經酶促修飾GAA藉由免疫細胞之吸收，且歸因於較少的達到靶組織之GAA而減少rhGAA治療功效，該等靶組織諸如心臟或骨骼肌肌母細胞。例如，末端非磷酸化甘露糖殘基為肝及脾中之甘露糖受體之已知配位體，其導致經酶促修飾rhGAA之快速清除及rhGAA對靶組織之減少靶向。此外，具有帶末端非磷酸化甘露糖殘基之高甘露糖N-聚醣的經酶促修飾GAA之醣基化型式類似於在酵母及黴菌中產生的醣蛋白上之彼者，且增加觸發對經酶促修飾rhGAA的免疫或過敏性反應、諸如危急生命的嚴重過敏(過敏性)或高敏性反應之風險。

鑒於習知rhGAA產品及醣基化rhGAA之活體外方法的該些缺陷，發明人致力於尋找一種經確認方式來產生具有最佳化N-聚醣分佈之rhGAA以增強生物分佈及溶酶體吸收且進而最小化rhGAA在一旦被投與時之非生產性清除。本發明為穩定或衰退的龐貝症患者提供一種有效療法，其在細胞水平逆轉疾病進程。發明人亦報告：本發明之rhGAA逆轉疾病進程—包括比當前照護標準更有效地清除溶酶體肝醣—且經本發明之rhGAA治療的患者展現令人驚訝及顯著的健康改善，包括肌肉強度、運動功能、及/或肺功能之改善，及/或包括疾病進程之逆轉，如在來自臨床研究之各種功效結果(例如，實例10及11)中所證明。

本發明係關於治療受試者的諸如龐貝氏症之疾病或病症之方法，其包含投與重組人類酸性α-葡萄醣苷酶(rhGAA)分子之群體。

本文描述的rhGAA分子可在中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary; CHO)細胞中表現且包含七個潛在的N-醣基化位點。在一些實施例中，rhGAA分子平均包含3-4個甘露糖-6-磷酸酯(M6P)殘基。在一些實施例中，rhGAA分子平均在第一潛在N-醣基化位點處包含每mol rhGAA約0.8 mol雙磷酸化N-聚醣基團(雙M6P)。在一些實施例中，rhGAA包含與SEQ ID NO : 1或SEQ ID NO : 5至少95%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，rhGAA包含與SEQ ID NO : 1或SEQ ID NO : 5一致的胺基酸序列。在一些實施例中，rhGAA分子之至少30%之分子包含帶有一個或兩個M6P殘基的一或多個N-聚醣單元。在一些實施例中，rhGAA分子包含每mol rhGAA平均約0.5 mol至約7.0 mol之帶有一個或兩個M6P殘基的N-聚醣單元。在一些實施例中，rhGAA分子包含每mol rhGAA平均至少2.5莫耳之M6P殘基及每mol rhGAA至少4 mol唾液酸殘基。在一些實施例中，在第一潛在N-醣基化位點處包含每分子平均3-4個M6P殘基及每mol rhGAA平均約0.8 mol雙M6P之rhGAA分子進一步包含在第二潛在N-醣基化位點處每mol rhGAA平均約0.4至約0.6 mol之單磷酸化N-聚醣(單M6P)、在第四潛在N-醣基化位點處每mol rhGAA約0.4至約0.6 mol之雙M6P、及在第四潛在N-醣基化位點處每mol rhGAA約0.3至約0.4 mol之單M6P。在一些實施例中，rhGAA分子進一步包含每mol rhGAA平均約4 mol至約5.4 mol之唾液酸殘基，包括在第三潛在N-醣基化位點處每mol rhGAA約0.9至約1.2 mol唾液酸、在第五潛在N-醣基化位點處每mol rhGAA約0.8至約0.9 mol唾液酸、及在第六潛在N-醣基化位點處每mol rhGAA約1.5至約1.8 mol唾液酸。在一些實施例中，rhGAA分子之群體係以醫藥組合物調配。在一些實施例中，包含rhGAA分子之群體的醫藥組合物進一步包含選自由檸檬酸鹽、磷酸鹽、及前述之組合組成之群的至少一種緩衝液，及選自由甘露醇、聚山梨醇酯80、及前述之組合組成之群的至少一種賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物之pH為約5.0至約7.0、約5.0至約6.0、或約6.0。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含水、酸化劑、鹼化劑、或前述之組合。在一些實施例中，醫藥組合物具有6.0之pH且包含約5-50 mg/mL之rhGAA分子之群體、約10-100 mM之檸檬酸鈉緩衝液、約10-50 mg/mL甘露醇、約0.1-1 mg/mL聚山梨醇酯80、及水，且視情況包含酸化劑及/或鹼化劑。在一些實施例中，醫藥組合物具有6.0之pH且包含約15 mg/mL之rhGAA分子之群體、約25 mM之檸檬酸鈉緩衝液、約20 mg/mL甘露醇、約0.5 mg/mL聚山梨醇酯80、及水，且視情況包含酸化劑及/或鹼化劑。

在一些實施例中，rhGAA分子之群體係以約1 mg/kg至約100 mg/kg之劑量投與。在一些實施例中，rhGAA分子之群體係以約20 mg/kg之劑量投與。在一些實施例中，rhGAA分子之群體係兩月一次、每月一次、兩週一次、每週一次、每週兩次、或每日一次地投與，例如，兩週一次地投與。在一些實施例中，rhGAA分子之群體係靜脈內投與。

在一些實施例中，rhGAA分子之群體係與諸如美格魯特(亦稱為AT2221)之藥理學伴護蛋白或其醫藥學上可接受的鹽並行地或連續地投與。在一些實施例中，美格魯特或其醫藥學上可接受的鹽係經口投與，例如以約200 mg至約600 mg、及視情況約260 mg之劑量投與。在一些實施例中，rhGAA分子之群體係以約5 mg/kg至約20 mg/kg之劑量靜脈內投與且美格魯特或其醫藥學上可接受的鹽係以約233 mg至約500 mg之劑量經口投與。在一些實施例中，rhGAA分子之群體係以約5 mg/kg至約20 mg/kg之劑量靜脈內投與且美格魯特或其醫藥學上可接受的鹽係以約50 mg至約200 mg之劑量經口投與。在一個實施例中，rhGAA分子之群體係以約20 mg/kg之劑量靜脈內投與且美格魯特或其醫藥學上可接受的鹽係以約260 mg之劑量經口投與。在一些實施例中，美格魯特或其醫藥學上可接受的鹽係在投與rhGAA分子之群體之前(例如，在投與rhGAA分子之群體之前約一小時)投與。在至少一個實施例中，受試者在投與美格魯特或其醫藥學上可接受的鹽之前至少兩個小時及之後至少兩個小時禁食。

本發明之實施例證明本文描述的rhGAA治療並逆轉患有龐貝氏症之受試者的疾病進程之功效。

在一些實施例中，rhGAA分子之群體係以能夠逆轉受試者之肌肉纖維中的細胞破壞的劑量投與。例如，在治療之後，受試者之肌肉纖維展現正常化的溶酶體大小及/或自噬堆積之解除。在一些實施例中，在治療之後，受試者中分析的肌肉纖維的少於65%具有自噬堆積。在一些實施例中，在治療之後，受試者中分析的肌肉纖維的至少36%具有正常或接近正常的外觀。

在一些實施例中，rhGAA分子之群體係以能夠在受試者之肌肉中比相同劑量之阿葡糖苷酶α更快地減少肝醣含量之劑量投與。rhGAA可比相同劑量之阿葡糖苷酶α快至少約1.25、1.5、1.75、2.0、或3.0倍地減少肝醣含量。在一些實施例中，rhGAA分子之群體係以在一次、兩次、三次、四次、五次、或六次投與之後評定時進一步能夠在受試者之肌肉中比以相同劑量投與的阿葡糖苷酶α更有效地減少肝醣含量之劑量投與。在一些實施例中，rhGAA分子之群體比以相同劑量投與的阿葡糖苷酶α至少約10%、20%、30%、50%、75%、或90%更有效地減少肝醣含量。在一些實施例中，在治療之後，受試者展現較低位準之肝醣累積生物標誌物尿己糖四醣(Hex4)。在至少一個實施例中，受試者中之Hex4位準在治療之後六個月相對於基線減少至少30%。例如，先前利用酶替代療法治療的有行動力或無行動力之受試者(ERT切換患者)可在治療之後六個月相對於基線展現至少35%的Hex4位準減少。在另一情況中，先前未接收酶替代療法的有行動力之受試者(ERT原始患者)可在治療之後六個月相對於基線展現至少45%的Hex4位準減少。

在一些實施例中，rhGAA分子之群體係以能夠改善受試者之運動功能的劑量投與。運動功能之改善可藉由運動功能測試量測，該運動功能測試諸如六分鐘步行測試(six-minute walk test; 6MWT)、計時起立行走測試、四層樓梯攀爬測試、十公尺步行測試、Gowers氏測試、步態-樓梯-gower-椅子(gait-stair-gower-chair; GSGC)測試、或前述之組合。在一些實施例中，在治療之後六個月的受試者(在相較於基線時)展示至少20公尺之6MWT距離增加、至少1秒之計時起立行走測試時間減少、至少0.6秒之四層樓梯攀爬測試時間減少、至少0.7秒之十公尺步行測試時間減少、至少1秒之Gowers氏測試時間減少、及/或至少1之GCSC記分減少。例如，有行動力之ERT切換患者在治療之後六個月(相較於基線)可展現至少20公尺之6MWT增加、至少1.5秒之計時起立行走測試時間減少、至少0.6秒之四層樓梯攀爬測試時間減少、及/或至少1秒之Gowers氏測試時間減少。在另一情況中，有行動力之ERT原始患者在治療之後六個月(相較於基線)可展現至少40公尺之6MWT距離增加、至少1秒之計時起立行走測試時間減少、至少0.6秒之四層樓梯攀爬測試時間減少、至少0.7秒之十公尺步行測試時間減少、及/或至少1之GSGC記分減少。在一些實施例中，ERT切換患者在治療之後在至少一個運動功能測試中相對於在利用阿葡糖苷酶α之前述ERT之後的患者之運動功能測試結果展現改善。

在一些實施例中，rhGAA分子之群體係以能夠改善受試者之上身力量的劑量投與。在一些實施例中，rhGAA分子之群體係投與至有行動力之受試者且進一步能夠改善受試者之下身力量及/或全身力量。

在一些實施例中，上身力量之改善係使用徒手肌肉力量記分來量測。受試者之徒手肌肉力量記分可在治療之後六個月相對於基線改善至少1 (對於有行動力之ERT切換患者而言)或至少5.5 (對無行動力之ERT切換患者而言)。在一些實施例中，ERT切換患者在治療之後在上身力量中相對於在利用阿葡糖苷酶α之前述ERT之後的患者之上身力量展現改善。

在一些實施例中，rhGAA分子之群體係以能夠改善上肢力量之劑量投與，如藉由定量肌肉測試或肩膀內收、肩膀外展、肘屈曲、及/或肘伸展之徒手肌肉測試來量測。例如，在治療之後六個月，相對於基線，無行動力之ERT切換患者可展現至少8磅力之肩膀內收改善、至少1磅力之肩膀外展改善、至少2磅力之肘屈曲改善、及/或至少5磅力之肘伸展改善。

在一些實施例中，rhGAA分子之群體係以能夠改善受試者之肺功能的劑量投與。運動功能之改善可藉由肺功能測試量測，該肺功能測試諸如直立(坐立)用力肺活量測試、最大呼氣壓(maximal expiratory pressure; MEP)測試、最大吸氣壓(maximal inspiratory pressure; MIP)測試、或前述之組合。在一些實施例中，受試者在治療之後六個月(當與基線比較時)展示至少4%之FVC改善、至少16 cmH₂ O之MEP改善、及/或至少0.3 cmH₂ O之MIP改善。例如，有行動力之ERT切換患者在治療之後六個月(相較於基線)可展現至少16 cmH₂ O之MEP改善。在另一情況中，有行動力之ERT原始患者在治療之後六個月(相較於基線)可展現至少4%之FVC改善及/或至少11 cmH₂ O之MIP改善。在一些實施例中，ERT切換患者在治療之後在至少一個肺功能測試中相對於在利用阿葡糖苷酶α之前述ERT之後的患者之肺功能測試結果展現改善。

在一些實施例中，rhGAA分子之群體係以能夠減少受試者之疲勞的劑量投與，如根據疲勞嚴重程度量表(fatigue severity scale; FSS)記分所量測。例如，受試者可為無行動力之ERT切換患者且在治療之後六個月時相對於基線展現至少3.5之FSS記分減少。在另一實例中，受試者可為有行動力之ERT切換患者且在治療之後六個月時相對於基線展現至少8之FSS記分減少。在又一實例中，受試者可為有行動力之ERT原始患者且在治療之後六個月時相對於基線展現至少5之FSS記分減少。在一些實施例中，ERT切換患者在治療之後相對於在利用阿葡糖苷酶α之前述ERT之後的患者之FSS記分展現較低的FSS記分。

在一些實施例中，rhGAA分子之群體係以能夠減少肌肉損傷之至少一種生物標誌物之位準的劑量投與，該至少一種生物標誌物例如肌酸激酶(creatine kinase; CK)、丙胺酸轉胺酶(alanine aminotransferase; ALT)、天冬胺酸轉胺酶(aspartate aminotransferase; AST)、或前述之組合。在一些實施例中，受試者之CK位準在治療之後六個月相對於基線減少至少15%，受試者之ALT位準在治療之後六個月相對於基線減少至少5%，及/或受試者之AST位準在治療之後六個月相對於基線減少至少5%。例如，受試者可為有行動力之ERT切換患者且在治療之後六個月時相對於基線展現至少15%之CK位準減少、至少15%之ALT位準減少、及/或至少10%之AST位準減少。在另一實例中，受試者可為無行動力之ERT切換患者且在治療之後六個月時相對於基線展現至少20%之CK位準減少、至少5%之ALT位準減少、及/或至少5%之AST位準減少。在又一實例中，受試者可為有行動力之ERT原始患者且在治療之後六個月時相對於基線展現至少35%之CK位準減少、至少35%之ALT位準減少、及/或至少30%之AST位準減少。

在描述本發明之若干示範性實施例之前，應理解本發明不限於以下描述中闡述的構造細節或方法步驟。本發明能夠有其他實施例且以各種方式實踐或進行。 I. 定義

本說明書使用的術語在本發明之情形內及在使用每一術語之特定情形中大體上具有其在此項技術中的普通含義。某些術語在下文或在說明書中其他處論述來為行醫者提供描述本發明之組合物及方法及如何製得及使用其之另外的指導。冠詞「一(a)」及「一(an)」係指一個或多於一個(亦即，至少一個)該冠詞之語法對象。除非上下文另外清楚地指示，否則術語「或」意味著術語「及/或」且可與術語「及/或」互換地使用。在本申請案中，除非另外具體地說明，否則單數之使用包括複數。此外，術語「包括(including)」以及其他形式諸如「包括(includes)」及「包括(included)」之使用不受限制。本文描述的任何範圍將理解為包括端點及端點之間的所有值。在本說明書中，除非上下文另外由於表達語言或必要暗示而需要的情況，否則用詞「包含(comprises)」或變化形式諸如「包含(comprising)」係以包括性意義使用，亦即，用以指定所述特徵之存在但不排除在本發明之各種實施例中存在或增加其他特徵。

術語「GAA」係指催化溶酶體肝醣之α-1,4-醣苷鍵及α-1,6-醣苷鍵之水解的人類酸性α-葡萄醣苷酶(GAA)以及GAA胺基酸序列之插入、相關、或取代變異體及發揮酶促活性的較長GAA序列之片段。人類酸性α-葡萄醣苷酶係藉由GAA基因(美國國家生物科技資訊中心(National Centre for Biotechnology Information; NCBI)基因ID 2548)編碼，其已映射(mapped)至染色體17 (位置17q25.2-q25.3)之長臂。編碼GAA之示範性DNA序列為NP 000143.2，其係以引用方式併入。當前已在人類GAA基因中鑑別出多於500種突變，其中許多與龐貝氏症相關聯。造成酸性α-葡萄醣苷酶之錯誤折疊或錯誤加工的突變包括T1064C (Leu355Pro)及C2104T (Arg702Cys)。另外，影響酶之成熟及加工的GAA突變包括Leu405Pro及Met519Thr。胺基酸殘基516-521處的保守六肽WIDMNE係酸性α-葡萄醣苷酶蛋白質之活性所需的。如本文所使用，縮寫「GAA」意欲指代人類酸性α-葡萄醣苷酶，而斜體縮寫「GAA 」意欲指代編碼人類酸性α-葡萄醣苷酶之人類基因。斜體縮寫「Gaa 」意欲指代編碼非人類酸性α-葡萄醣苷酶之非人類基因，包括但不限於大鼠或小鼠基因，且縮寫「Gaa」意欲指代非人類酸性α-葡萄醣苷酶。

術語「rhGAA」意欲指代重組人類酸性α-葡萄醣苷酶且係用於將內源性GAA與合成或重組產生的GAA (例如，由利用編碼GAA之DNA轉變的CHO細胞產生的GAA)區別。術語「rhGAA」涵蓋個別rhGAA分子之群體。本文提供rhGAA分子之群體之特性。術語「習知rhGAA產品」意欲指代含有阿葡糖苷酶α之產品，諸如Lumizyme®或Myozyme®。

術語「經遺傳修飾」或「重組」係指在引入包含編碼基因產物的編碼序列之核酸連同控制編碼序列之表現的調控元件之後表現諸如rhGAA之特定基因產物的細胞，諸如CHO細胞。核酸之引入可藉由此項技術中所知的包括基因靶向及同源重組之任何方法來完成。如本文所使用，術語亦包括已經工程化來例如藉由基因活化技術表現或過度表現此種細胞不正常表現的內源性基因或基因產物的細胞。

如本文所使用的術語「純化」係指已在減少或消除無關材料之存在的條件下分離的材料，該等無關材料亦即污染物，包括自其獲得材料的原始材料。例如，純化蛋白質較佳地實質上不含在細胞中與其相關聯的其他蛋白質或核酸；純化核酸分子較佳地實質上不含在細胞內可與其一起發現的蛋白質或其他無關核酸分子。如本文所使用，術語「實質上不含」係在材料之分析測試的情形中在操作上使用。較佳地，實質上不含污染物之純化材料為至少95%純；更佳地，至少97%純，及又更佳地至少99%純。純度可藉由層析法、凝膠電泳、免疫檢定、組成分析、生物檢定、酶促檢定及此項技術中所知的其他方法來評估。在特定實施例中，純化意指污染物之位準低於管制機構對安全投與至人類或非人類動物可接受的位準。諸如rhGAA之重組蛋白質可使用此項技術中所知的方法自CHO細胞分離或純化，該等方法包括層析粒度分離、親和力層析、或陰離子交換層析法。在一些實施例中，rhGAA係藉由包含陰離子交換層析法之方法，繼之以固定金屬親和力層析，視情況，繼之以使用第三層析管柱純化來純化。

如本文所使用，術語「阿葡糖苷酶α」意欲指代鑑定為[199-精胺酸, 223-組胺酸]前驅升-α-葡萄醣苷酶(人類)的重組人類酸性α-葡萄醣苷酶；化學摘要註冊號420794-05-0。阿葡糖苷酶α在美國獲準由Genzyme作為產品Lumizyme®及Myozyme®上市出售。

如本文所使用，術語「ATB200」意欲指代國際申請案PCT/US2015/053252中描述的重組人類酸性α-葡萄醣苷酶，該國際申請案之揭示內容以引用方式併入本文。

如本文所使用，術語「聚醣」意欲指代共價地結合至蛋白質或多肽上之胺基酸殘基的多醣鏈。如本文所使用，術語「N-聚醣」或「N-連接聚醣」意欲指代經由與蛋白質或多肽上之胺基酸殘基之氮原子的共價結合連接至該胺基酸殘基的多醣鏈。例如，N-聚醣可共價地結合至天冬醯胺酸殘基之側鏈氮原子。聚醣可含有一個或若干個單醣單元，且單醣單元可共價地連接來形成直鏈或支鏈。在至少一個實施例中，連接至rhGAA之N-聚醣單元可包含各自獨立地選自N-乙醯葡萄胺糖、甘露糖、半乳糖、或唾液酸之一或多個單醣單元。蛋白質上之N-聚醣單元可藉由諸如質譜法之任何適當分析技術來測定。在一些實施例中，連接至rhGAA之N-聚醣單元係藉由液相層析-串聯式質譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry; LC-MS/MS)利用諸如以下各項之儀器來測定：Thermo Scientific™ Orbitrap Velos Pro™質譜儀、Thermo Scientific™ Orbitrap Fusion™ Lumos Tribid™質譜儀或Waters Xevo® G2-XS QTof質譜儀。

如本文所使用，術語「高甘露糖N-聚醣」意欲指代具有一至六個或更多個甘露糖單元之N-聚醣。在一些實施例中，高甘露糖N-聚醣單元可含有鍵結至天冬醯胺酸殘基且進一步鍵結至分支聚甘露糖鏈的之雙(N-乙醯葡萄胺糖)鏈。如本文可互換地使用，術語「M6P」或「甘露糖-6-磷酸酯」意欲指代在6位置處磷酸化，亦即，在6位置處具有鍵結至羥基的磷酸基的甘露糖單元。在一些實施例中，一或多個N-聚醣單元之一或多個甘露糖單元在6位置處經磷酸化以形成甘露糖-6-磷酸酯單元。在一些實施例中，術語「M6P」或「甘露糖-6-磷酸酯」係指在磷酸基上具有作為「帽蓋」之N-乙醯葡萄胺糖(GlcNAc)的甘露糖磷酸二酯，以及具有缺乏GlcNAc帽蓋之暴露磷酸基的甘露糖單元。在至少一個實施例中，蛋白質之N-聚醣可具有多個M6P基團，其中至少一個M6P基團具有GlcNAc帽蓋且至少一個其他M6P基團缺乏GlcNAc帽蓋。

如本文所使用，術語「複合N-聚醣」意欲指代含有一或多個半乳糖及/或唾液酸單元之N-聚醣。在至少一個實施例中，複合N-聚醣可為高甘露糖N-聚醣，其中一或多個甘露糖單元進一步鍵結至一或多個單醣單元，該等單醣單元各自獨立地選自N-乙醯葡萄胺糖、半乳糖、及唾液酸。非磷酸化、單M6P、及雙M6P N-聚醣之代表性結構展示於第1A圖中。甘露糖-6-磷酸酯基團展示在第1B圖中。

如本文所使用，肌肉纖維中之溶酶體之「正常化」係指藉由減少肌肉纖維中累積肝醣之大小及數量以便受影響肌肉纖維將實質上類似於正常溶酶體形態學來將該受影響肌肉纖維恢復至野生型肌肉纖維之溶酶體形態，從而最終引起疾病進程逆轉的過程。

如本文所使用，「疾病進程之逆轉」尤其意味著充分地(i)治療隱伏的細胞功能障礙，(ii)減少或消除肌肉纖維中之累積肝醣，及(iii)恢復肌肉結構。在一些實施例中，肌肉纖維為骨骼肌纖維。

如本文所使用，「溶酶體病理學之逆轉」意味著已累積在細胞中之肝醣由於缺乏最佳GAA活性之部分或完全清除。

如本文所使用，用力肺活量或「FVC」為在受試者做出可能的最深呼吸之後可自受試者之肺用力呼出的空氣量。

如本文所使用，「六分鐘步行測試」(6MWT)為用於量測個體在硬質、平坦表面上歷經總共六分鐘能夠步行的距離的測試。該測試係藉由使個體在六分鐘內盡可能遠地步行來進行。

如本文所使用，化合物美格魯特亦稱為N-丁基-1-脫氧野尻黴素或NB-DNJ或(2R,3R,4R,5S)-1-丁基-2-(羥甲基)哌啶-3,4,5-三醇，其為具有以下化學式之化合物：

美格魯特之一種調配物係以商標名zavesca®市售，以作為用於1型高歇氏病之單一療法。在一些實施例中，美格魯特係指代為AT2221。

如下文所論述，美格魯特之醫藥學上可接受的鹽亦可用於本發明。當使用美格魯特之鹽時，鹽之劑量將經調整以便藉由患者接收的美格魯特之劑量等於當使用美格魯特游離鹼時將接收的量。

如本文所使用，化合物杜格魯特(duvoglustat)亦稱為1-脫氧野尻黴素或DNJ或(2R,3R,4R,5S)-2-(羥甲基)哌啶-3,4,5-三醇，其為具有以下化學式之化合物：

如本文所使用，術語「藥理學伴護蛋白」或有時簡單而言術語「伴護蛋白」意欲指代特異地結合至酸性α-葡萄醣苷酶且具有以下效應之一或多者的分子： • 增強蛋白質之穩定分子構形之形成； • 增強蛋白質自內質網至另一細胞位置、較佳地原始細胞位置之得當運送，以便防止蛋白質之內質網相關聯降級； • 防止構形不穩定或錯誤折疊之蛋白質的聚集； • 恢復及/或增強蛋白質之至少部分野生型功能、穩定性、及/或活性；及/或 • 改善藏有酸性α-葡萄醣苷酶之細胞之表現型或功能。

因此，酸性α-葡萄醣苷酶之藥理學伴護蛋白為結合至酸性α-葡萄醣苷酶，從而產生酸性α-葡萄醣苷酶之得當折疊、運送、非聚集、及活性。如本文所使用，此術語包括但不限於活性位點特異性伴護蛋白(active site-specific chaperone; ASSC)，其結合在酶、抑制劑或拮抗劑、及促效劑之活性位點中。在至少一個實施例中，藥理學伴護蛋白可為酸性α-葡萄醣苷酶之抑制劑或拮抗劑。如本文所使用，術語「拮抗劑」意欲指代結合至酸性α-葡萄醣苷酶且部分地或完全地阻斷、抑制、減少、或中和酸性α-葡萄醣苷酶之活性的任何分子。在至少一個實施例中，藥理學伴護蛋白為美格魯特。用於酸性α-葡萄醣苷酶之藥理學伴護蛋白之另一非限制性實例為杜格魯特。

如本文所使用，術語「活性位點」意欲指代蛋白質中與該蛋白質之特異生物活性相關聯及該特異生物活性所必需的區域。在至少一個實施例中，活性位點可為結合底物或其他結合配偶體且貢獻出直接參與構成及破壞化學鍵之胺基酸殘基的位點。本發明中之活性位點可涵蓋酶之催化位點、抗體之抗原結合位點、受體之配位體結合結構域、調節蛋白之結合結構域、或分泌蛋白質之受體結合結構域。活性位點亦可涵蓋轉錄因子及調節蛋白之轉錄活化、蛋白質-蛋白質相互作用、或DNA結合結構域。

如本文所使用，術語「AUC」或「曲線下方面積」意欲指代評估身體隨時間對給定藥物之總體暴露量的數學計算。在繪製出投與至受試者的藥物之血液中濃度如何在給藥之後隨時間變化的圖表中，藥物濃度變數位於y軸上且時間位於x軸上。針對指定時間間隔在藥物濃度曲線與x軸之間的面積為AUC。AUC係用作用於給藥時程之指導且用於比較在體內可利用的不同藥物之生物可用性。

如本文所使用，術語「C_max 」意欲指代在投與受試者之後達成的最大藥物血漿濃度。

如本文所使用，術語「分佈體積」或「V」意欲指代在血液血漿中觀察到的相同濃度下含有所投與藥物之總量所必需的理論體積，且其表示藥物分佈在身體組織中而非血漿中的程度。較高的V值指示較大程度的組織分佈。「中心分佈體積」或「Vc」意欲指代在血液及由血液高度灌注的組織內的分佈體積。「周邊分佈體積」或「V2」意欲指代周邊組織內之分佈體積。

如本文可互換使用的，術語「清除率」、「全身性清除率」或「CL」意欲指代每單位時間完全清除所投與藥物的血漿體積。「周邊清除率」意欲指代每單位時間清除所投與藥物的周邊組織體積。

如本文所使用，術語「醫藥學上可接受的」意欲指代生理學上可耐受的且在投與至人類時典型地不產生不良反應的分子實體及組合物。較佳地，如本文所使用，術語「醫藥學上可接受的」意味著藉由聯邦或州政府之管制機關批准或列在美國藥典或其他普遍認可的藥典中，適用於動物，且更特地而言適用於人類。如本文所使用，術語「載劑」意欲指代與化合物一起投與的稀釋劑、佐劑、賦形劑、或媒劑。適合的醫藥載劑在此項技術中為已知的，且在至少一個實施例中，描述在「Remington's Pharmaceutical Sciences」, E. W. Martin, 第18版或其他版本。

如本文所使用的術語「醫藥學上可接受的鹽」意欲指一種鹽，其在完善醫學判斷之範疇內適用於與人類及低等動物之組織接觸而無不當毒性、刺激、過敏反應、及類似者，與合理利益/風險比率相稱，大體上為水溶性或油溶性或水可分散或油可分散的，且有效用於其所欲用途的。術語包括醫藥學上可接受的酸加成鹽及醫藥學上可接受的鹼加成鹽。適合的鹽之清單見於例如S. M. Berge等人, J. Pharm. Sci., 1977, 66, 第1-19頁，其係以引用方式併入本文。如本文所使用的術語「醫藥學上可接受的酸加成鹽」意欲指保持游離鹼之生物有效性及性質且在生物學上或在其他情況下不為不合需要的彼等鹽，其係用無機酸形成。如本文所使用的術語「醫藥學上可接受的鹼加成鹽」意欲指保持游離酸之生物有效性及性質且在生物學上或在其他情況下不為不合需要的彼等鹽，其係用無機鹼形成。

如本文所使用，術語「緩衝液」係指含有弱酸及其共軛鹼以有助於防止改變pH之溶液。

如本文所使用，術語「治療有效劑量」及「有效量」意欲指代酸性α-葡萄醣苷酶及/或美格魯特及/或前述之組合之量，其足以在受試者中產生治療反應。治療反應可為使用者(例如，臨床醫師)將認為是對療法之有效反應，包括對本文描述及此項技術中所知的任何代用臨床標誌物或症狀之有效反應的任何反應。因此，在至少一個實施例中，治療反應可為龐貝氏症之一或多個症狀或標誌物(諸如此項技術中所知的彼等者)之改善或抑制。龐貝氏症之症狀或標誌物包括但不限於減少的酸性α-葡萄醣苷酶組織活性；心肌病；心臟肥大；進行性肌肉虛弱，尤其在軀幹或下肢中；深度低張症；巨舌症(且在一些情況下，舌頭突起)；吞咽、吸吮、及/或進食困難；呼吸功能不全；肝腫大(中等)；面部肌肉鬆弛；無反射；鍛煉不持久；運動性呼吸困難；端坐呼吸；睡眠呼吸中止；早晨頭痛；嗜眠症；脊柱前凸及/或脊柱側凸；減少的深腱反射；下背部疼痛；及無法滿足發育的運動里程碑(motor milestone)。應注意，對酸性α-葡萄醣苷酶具有抑制效應的美格魯特之濃度可出於本發明之目的構成「有效量」，此係由於在活體內投與之後美格魯特之稀釋(及由於平衡改變引起的後續結合變換)、生物可用性、及新陳代謝。

治療反應亦可包括分子反應，諸如肝醣累積、溶酶體增殖、及自噬區之形成。治療反應可藉由比較在利用本文描述的rhGAA治療之前及之後肌肉生物檢體之生理學及分子反應來評估。例如，存在於生物檢體樣本中之肝醣之量可用作測定治療反應之標誌物。另一實例包括諸如LAMP-1、LC3、及Dysferlin之生物標誌物，其可用作溶酶體儲積功能障礙之指示物。例如，在利用本文描述的rhGAA治療之前及之後收集的肌肉生物檢體可利用識別生物標誌物之一的抗體來染色。

如本文所使用，術語「酶替代療法」或「ERT」意欲指代將非原生、純化酶引入具有此種酶之缺陷的個體中。所投與蛋白質可自天然來源獲得或藉由重組表現獲得。術語亦係指在另外需要或受益於純化酶之投與的個體中引入純化酶。在至少一個實施例中，此個體遭受酶不足。所引入的酶可為活體外產生的純化、重組酶，或自諸如例如胎盤或動物乳汁之分離組織或流體或自植物純化的蛋白質。

如本文所使用，術語「組合療法」意欲指代其中兩種或兩種以上個別療法並行地或順序地投與的任何療法。在一些實施例中，組合療法之結果為相較於當個別地執行每一療法時的每一療法之效應有所增強。增強可包括各種療法之效應之任何改善，其可相較於在單獨執行時藉由療法達成的結果產生有利的結果。增強效應或結果可包括協同增強，其中增強效應大於自身執行時每一療法之相加效應；相加增強，其中增強效應實質上等於自身執行時每一療法之相加相應；或不及協同效應，其中增強效應低於自身執行時每一療法之相加效應，但好於自身執行時每一療法之效應。增強效應可藉由此項技術中所知的任何手段量測，藉由該等手段可量測治療功效或結果。

如本文所使用的術語「並行地」意欲指與同時或之前或之後的合理短時期內，如熟習此項技術者將理解的。例如，若兩個治療互相並行地投與，則一個治療可在另一個治療之前或之後投與以允許來準備兩個治療中之後一者之所需的時間。因此，兩個治療之「並行投與」包括但不限於一個治療在另一治療之後20分鐘或更少、約20分鐘、約15分鐘、約10分鐘、約9分鐘、約8分鐘、約7分鐘、約6分鐘、約5分鐘、約4分鐘、約3分鐘、約2分鐘、約1分鐘、或小於1分鐘。

「龐貝氏症」係指以缺乏酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)活性從而有損溶酶體肝醣新陳代謝為特徵之體染色體隱性LSD。酶缺乏導致溶酶體肝醣累積且造成進行性骨骼肌虛弱、減小的心臟功能、呼吸功能不全、及/或在疾病晚期的CNS損傷。GAA基因之遺傳突變造成酶之較低表現或產生具有經改變穩定性及/或最終導致疾病之生物活性的酶之突變體形式(大體上參見Hirschhorn R, 1995, Glycogen Storage Disease Type II: Acid α-glucosidase (Acid Maltase) Deficiency, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, Scriver等人編, McGraw-Hill, New York, 第7版., 第2443-2464頁)。龐貝氏症之三種經識別的臨床形式(嬰兒型、青少年型及成人型)與殘留的α-葡萄醣苷酶活性之位準相關(Reuser A J等人, 1995, Glycogenosis Type II (Acid Maltase Deficiency), Muscle & Nerve Supplement 3, S61-S69)。嬰兒型龐貝氏症(I型或A型)最為常見且最為嚴重，其以發育失敗、全身低滲壓、心肥大、及生命第二年內心肺衰竭為特徵。青少年型龐貝氏症(II型或B型)嚴重程度中等且以肌肉症狀突出而無心臟肥大為特徵。青少年型龐貝症個體通常由於呼吸衰竭而在達到20歲之前死亡。成人型龐貝氏症(III型或C型)常常表現為青少年期或晚至六十歲的緩慢進行性肌病變(Felicia K J等人, 1995, Clinical Variability in Adult-Onset Acid Maltase Deficiency: Report of Affected Sibs and Review of the Literature, Medicine 74, 131-135)。在龐貝症中，已證實α-葡萄醣苷酶藉由醣基化、磷酸化、及蛋白水解處理而得以廣泛地轉譯後修飾。藉由溶酶體中之蛋白水解將110千道耳頓 (kDa)前驅物轉化為76及70 KDa成熟形式係最佳肝醣催化所需的。如本文所使用，術語「龐貝氏症」係指所有類型之龐貝氏症。本申請案中揭示的調配物及給藥方案可用以治療例如I型、II型或III型龐貝氏症。

「受試者」或「患者」較佳地為人類，但亦可治療患有涉及肝醣之累積的病症之其他哺乳動物及非人類動物。受試者可為患有龐貝氏症或其他肝醣儲積或累積病症之胎兒、新生兒、兒童、青少年、或成人。所治療的個體之一個實例為患有GSD-II (例如，嬰兒型發病GSD-II、青少年型發病GSD-II、或成人型發病GSD-II)之個體(胎兒、新生兒、兒童、青少年、青年、或成人人類)。個體可具有殘留GAA活性，或不具有可測量的活性。例如，患有GSD-II之個體可具有小於正常GAA活性之約1%的GAA活性(嬰兒型GSD-II)、正常GAA活性之約1-10%的GAA活性(青少年型GSD-II)、或正常GAA活性之約10-40%的GAA活性(成人型GSD-II)。在一些實施例中，受試者或患者為「經歷ERT」或「ERT切換」患者，其係指先前已接收酶替代療法之龐貝氏症患者。在一些實施例中，受試者或患者為「ERT原始」患者，其係指先前未接收酶替代療法之龐貝氏症患者。在某些實施例中，受試者或患者為有行動力的(例如，有行動力之ERT切換患者或有行動力之ERT原始患者)。在某些實施例中，受試者或患者為無行動力的(例如，無行動力之ERT切換患者)。有行動力或無行動力之狀態可藉由六分鐘步行測試(six-minute walk test; 6MWT)測定。在一些實施例中，有行動力之患者為能夠在6MWT中步行至少200公尺之龐貝氏症患者。在一些實施例中，無行動力之患者為無輔助情況下不能步行或坐輪椅的龐貝氏症患者。

如本文所使用的術語「治療(treat)」及「治療(treatment)」係指與疾病相關聯的一或多個症狀之改善、疾病之一或多個症狀之發病的預防或延遲、及/或疾病之一或多個症狀之嚴重程度或頻率的減輕。例如，治療可指代心臟狀態之改善(例如，舒張末期及/或收縮末期體積之增加，或在GSD-II中典型所見的進行性心肌病之減少、改善或預防)或肺功能之改善(例如，相對基線容量之啼泣時肺活量之增加，及/或在啼泣期間氧去飽和之正常化)；神經發育及/或運動技能之改善(例如，AIMS記分增加)；個體的受疾病影響之組織中肝醣位準之減少；或該些效應之任何組合。在一個較佳實施例中，治療包括心臟狀態之改善，尤其GSD-II相關聯心肌病之減少或預防。

如本文所使用的術語「改善」、「增加」及「減少」指示相對於基線量測值的值，該基線量測值諸如在起始本文描述的治療之前在同一個體中的量測值，或在不存在本文描述的治療的對照個體(或多個對照個體)中之量測值。對照個體為罹患與所治療個體相同形式之GSD-II (嬰兒型發病、青少年發病、或成人型發病)的個體，其與所治療的個體約相同年齡(以確保治療個體及對照個體中疾病之階段為可比較的)。

如本文所使用，術語「約」及「大致」意欲指代給定量測之性質或精度的情況下，所量測數量之可接受誤差程度。例如，誤差程度可藉由如此項技術中所理解的對量測提供的有效數字之數來指示，且包括但不限於對該量測報告的最精確有效數字的±1之變化。典型示範性誤差程度為給定值或值之範圍的20百分比(%)之內、較佳10%內、及更佳5%內。除非另有說明，否則本文給定的數字量為近似值，意味著術語「約」或「大致」可在未明確陳述時推斷。 II 重組人類酸性α-葡萄醣苷酶(rhGAA)

在一些實施例中，重組人類酸性α-葡萄醣苷酶(rhGAA)為具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:5中闡述的胺基酸序列之酶。在一些實施例中，rhGAA係藉由如SEQ ID NO:2中闡述的核苷酸序列編碼。 表1.核苷酸序列及蛋白質序列

在一些實施例中，rhGAA具有如SEQ ID NO: 1中闡述的野生型GAA胺基酸序列，如美國專利第8,592,362號所述且具有GenBank登錄號AHE24104.1 (GI:568760974)。在一些實施例中，rhGAA具有如SEQ ID NO: 2中編碼的野生型GAA胺基酸序列，mRNA序列具有GenBank登錄號Y00839.1。在一些實施例中，rhGAA具有如SEQ ID NO: 3中闡述的野生型GAA胺基酸序列。在一些實施例中，rhGAA具有如SEQ ID NO: 4中闡述的GAA胺基酸序列，且具有美國國家生物科技資訊中心(National Centre for Biotechnology Information; NCBI)登錄號NP_000143.2。在一些實施例中，rhGAA為阿葡糖苷酶α，其係藉由GAA 基因之最主要的九個觀察到的單倍型編碼的人類酸性α-葡萄醣苷酶。

在一些實施例中，rhGAA最初係表示為具有如SEQ ID NO: 1中闡述的野生型GAA之全長952胺基酸序列，且rhGAA經歷細胞內加工，從而移除胺基酸之一部分，例如前56個胺基酸。因此，藉由寄主細胞分泌的rhGAA可具有比細胞內最初表現的rhGAA短的胺基酸序列。在一個實施例中，較短蛋白質具有SEQ ID NO: 5中闡述的胺基酸序列，其與SEQ ID NO: 1不同之處僅在於已移除包含信號肽及前驅肽的前56個胺基酸，從而產生具有896個胺基酸之蛋白質。胺基酸數量之其他變化亦為可能的，諸如相對於藉由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5描述的胺基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或更多缺失、取代及/或插入。在一些實施例中，rhGAA產品包括具有不同胺基酸長度之重組人類酸性α-葡萄醣苷酶分子之混合物。

在一些實施例中，rhGAA包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5至少90%、95%、98%或99%一致的胺基酸序列。各種比對演算法及/或程式可用以計算兩個序列之間的一致性，包括FASTA或BLAST，其可作為GCG序列分析包裝(University of Wisconsin, Madison, Wis.)之一部分獲得，且可以例如預設設定來使用。例如，涵蓋具有與本文描述的特異性多肽至少90%、95%、98%或99%一致性且較佳地展現實質上相同功能之多肽，以及編碼此種多肽之多核苷酸。除非另外指示，否則相似性記分將基於BLOSUM62之使用。當使用BLASTP時，相似性百分比係基於BLASTP正記分且序列一致性百分比係基於BLASTP一致性記分。BLASTP「一致性」展示高記分序列對中為一致的總殘基數量及分數；且BLASTP「正值」展示比對記分具有正值且彼此類似的殘基數量及分數。本揭示內容預期且涵蓋與本文揭示的胺基酸序列具有該些一致性或相似性程度或任何中間一致性或相似性程度的胺基酸序列。使用遺傳碼推論類似多肽之多核苷酸序列且可藉由習知手段，尤其藉由使用遺傳碼逆向平移其胺基酸序列來獲得。

在一些實施例中，rhGAA在蛋白質中之一或多個胺基酸殘基處經歷轉譯後修飾及/或化學修飾。例如，甲硫胺酸及色胺酸殘基可經歷氧化。作為另一實例，N末端麩醯胺可形成焦麩胺酸鹽。作為另一實例，天冬醯胺酸殘基可經歷脫醯胺成天冬胺酸。作為又一實例，天冬胺酸殘基可經歷異構化成異天冬胺酸。作為另一實例，蛋白質中之未配對半胱胺酸殘基可與游離的麩胱甘肽及/或半胱胺酸形成二硫鍵。因此，在一些實施例中，酶最初表示為具有如在SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、或SEQ ID NO: 5中闡述的胺基酸序列，或藉由SEQ ID NO: 2編碼的胺基酸序列，且酶經歷該些轉譯後修飾及/或化學修飾中之一或多者。此種修飾亦在本揭示內容之範疇內。 III. rhGAA之N連接醣基化

在單一rhGAA分子上存在七個潛在N連接醣基化位點。該些潛在醣基化位點在SEQ ID NO: 5之以下位置處：N84、N177、N334、N414、N596、N826、及N869。類似地，對於SEQ ID NO: 1之全長胺基酸序列而言，該些潛在醣基化位點係處於以下位置：N140、N233、N390、N470、N652、N882、及N925。rhGAA之其他變異體可具有類似醣基化位點，此取決於天冬醯胺酸殘基之位置。通常，蛋白質胺基酸序列中之Asn-X-Ser或Asn-X-Thr之序列指示潛在醣基化位點，其中例外的是X不可為His或Pro。

本文描述的rhGAA分子可在其N-聚醣上具有1、2、3、或4個甘露糖-6-磷酸酯(mannose-6-phosphate; M6P)基團。例如，rhGAA分子上之僅一個N-聚醣可帶有M6P (單磷酸化或單M6P)，單一N-聚醣可帶有兩個M6P基團(雙磷酸化或雙M6P)，或同一rhGAA分子上之兩個不同的N-聚醣可各自帶有單一M6P基團。在一些實施例中，本文描述的rhGAA分子平均在其N-聚醣上具有3-4個M6P基團。重組人類酸性α-葡萄醣苷酶分子亦可具有不帶有M6P基團之N-聚醣。在另一實施例中，rhGAA平均包含每mol rhGAA大於2.5 mol M6P及每mol rhGAA大於4 mol唾液酸。在一些實施例中，rhGAA平均包含每mol rhGAA約3-3.5 mol M6P。在一些實施例中，rhGAA平均包含每mol rhGAA約4-5.4 mol唾液酸。在rhGAA上平均至少約3、4、5、6、7、8、9、或10%之總N-聚醣可呈單M6P N-聚醣形式，例如，約6.25%之總N-聚醣可運載單一M6P基團且在rhGAA上平均至少約0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0%之總N-聚醣呈雙M6P N-聚醣形式且平均小於25%之總rhGAA不含有結合至CIMPR之磷酸化N-聚醣。在一些實施例中，在rhGAA上平均約10%至約14%之總N-聚醣為單磷酸化的。在一些實施例中，在rhGAA上平均約7%至約25%之總N-聚醣為雙磷酸化的。在一些實施例中，rhGAA平均包含每mol rhGAA約1.3 mol雙M6P。

本文描述的rhGAA可具有範圍在每mol rhGAA 0.5至7.0 mol M6P或其任何中間值或子範圍的運載M6P之N-聚醣的平均含量，包括每mol rhGAA 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 mol M6P。rhGAA可經分餾以提供具有不同平均數量的帶有單M6P或帶有雙M6P之N-聚醣的rhGAA製劑，因此允許藉由選擇特定餾分或藉由選擇性地組合不同的餾分來進一步定製靶向靶組織中之溶酶體的rhGAA。

在一些實施例中，在rhGAA上多至60%之N-聚醣可完全唾液酸化，例如，多至10%、20%、30%、40%、50%或60%之N-聚醣可完全唾液酸化。在一些實施例中，4%至20%之總N-聚醣經完全唾液酸化。在其他實施例中，在rhGAA上不多於5%、10%、20%或30%之N-聚醣運載唾液酸及末端半乳糖殘基(Gal)。此範圍包括所有中間值及子範圍，例如，在rhGAA上7%至30%之總N-聚醣可運載唾液酸及末端半乳糖。在其他實施例中，在rhGAA上不多於5%、10%、15%、16%、17%、18%、19%、或20%之N-聚醣僅具有末端半乳糖且不含有唾液酸。此範圍包括所有中間值及子範圍，例如，組合物中在rhGAA上8%至19%之總N-聚醣可僅具有末端半乳糖且不含有唾液酸。

在一些實施例中，在rhGAA上40%、45%、50%、或55%至60%之總N-聚醣為複合型N-聚醣；或在rhGAA上不多於1%、2%、3%、4%、5%、6%、或7%之總N-聚醣為混合型N-聚醣；在rhGAA上不多於5%、10%、或15%之高甘露糖型N-聚醣為非磷酸化的；在rhGAA上至少5%或10%之高甘露糖型N-聚醣為單磷酸化的；及/或在rhGAA上至少1%或2%之高甘露糖型N-聚醣為雙磷酸化的。該些值包括所有中間值及子範圍。rhGAA可滿足上文所述的含量範圍中之一或多者。

在一些實施例中，rhGAA可每莫耳rhGAA平均帶有2.0至8.0莫耳之唾液酸殘基。此範圍包括其所有中間值及其子範圍，包括每mol rhGAA 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、及8.0 mol唾液酸殘基。在不受理論約束的情況下，咸信帶有唾液酸殘基之N-聚醣單元之存在可防止rhGAA藉由無唾液酸醣蛋白受體之非生產性清除。

在一或多個實施例中，rhGAA在某些潛在N-醣基化位點處具有特定N-醣基化分佈。在一些實施例中，rhGAA具有七個潛在N-醣基化位點。在一些實施例中，至少20%之rhGAA在第一潛在N-醣基化位點(例如，對SEQ ID NO : 5為N84且對SEQ ID NO : 1為N140)處磷酸化。例如，至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%之rhGAA可在第一潛在N-醣基化位點處磷酸化。此磷酸化可為單M6P及/或雙M6P單元之結果。在一些實施例中，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%之rhGAA在第一潛在N-醣基化位點處帶有單M6P單元。在一些實施例中，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%之rhGAA在第一潛在N-醣基化位點處帶有雙M6P單元。在一些實施例中，rhGAA在第一潛在N-醣基化位點處包含每mol rhGAA平均約0.8 mol雙M6P。在一些實施例中，rhGAA在第一潛在N-醣基化位點處包含每mol rhGAA平均約0.2 mol唾液酸。在至少一個實施例中，rhGAA包含如第6A圖中描繪的第一潛在N-醣基化位點佔用率及如第6B圖中描繪的N-醣基化分佈。

在一些實施例中，至少20%之rhGAA在第二潛在N-醣基化位點(例如，對SEQ ID NO : 5為N177且對SEQ ID NO : 1為N223)處磷酸化。例如，至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%之rhGAA可在第二N-醣基化位點處磷酸化。此磷酸化可為單M6P及/或雙M6P單元之結果。在一些實施例中，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%之rhGAA在第二N-醣基化位點處帶有單M6P單元。在一些實施例中，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%之rhGAA在第二N-醣基化位點處帶有雙M6P單元。在一些實施例中，rhGAA在第二潛在N-醣基化位點處包含每mol rhGAA平均約0.4至約0.6 mol單M6P。在至少一個實施例中，rhGAA包含如第6A圖中描繪的第二潛在N-醣基化位點佔用率及如第6C圖中描繪的N-醣基化分佈。

在一或多個實施例中，至少5%之rhGAA在第三潛在N-醣基化位點(例如，對SEQ ID NO : 5為N334且對SEQ ID NO : 1為N390)處磷酸化。在其他實施例中，小於5%、10%、15%、20%、或25%之rhGAA在第三潛在N-醣基化位點處磷酸化。例如，第三潛在N-醣基化位點可具有非磷酸化高甘露糖N-聚醣之混合物，二觸角、三觸角、及四觸角複合N-聚醣，以及作為主要物種的混合N-聚醣。在一些實施例中，至少3%、5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、或50%之rhGAA在第三潛在N-醣基化位點處唾液酸化。在一些實施例中，rhGAA在第三潛在N-醣基化位點處包含每mol rhGAA平均約0.9至約1.2 mol唾液酸。在至少一個實施例中，rhGAA包含如第6A圖中描繪的第三潛在N-醣基化位點佔用率及如第6D圖中描繪的N-醣基化分佈。

在一些實施例中，至少20%之rhGAA在第四潛在N-醣基化位點(例如，對SEQ ID NO : 5為N414且對SEQ ID NO : 1為N470)處磷酸化。例如，至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%之rhGAA可在第四潛在N-醣基化位點處磷酸化。此磷酸化可為單M6P及/或雙M6P單元之結果。在一些實施例中，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%之rhGAA在第四潛在N-醣基化位點處帶有單M6P單元。在一些實施例中，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%之rhGAA在第四潛在N-醣基化位點處帶有雙M6P單元。在一些實施例中，至少3%、5%、8%、10%、15%、20%、或25%之rhGAA在第四潛在N-醣基化位點處唾液酸化。在一些實施例中，rhGAA在第四潛在N-醣基化位點處包含每mol rhGAA平均約0.4至約0.6 mol雙M6P。在一些實施例中，rhGAA在第四潛在N-醣基化位點處包含每mol rhGAA平均約0.3至約0.4 mol單M6P。在一些實施例中，rhGAA在第四潛在N-醣基化位點處包含每mol rhGAA平均約0.2 mol唾液酸。在至少一個實施例中，rhGAA包含如第6A圖中描繪的第四潛在N-醣基化位點佔用率及如第6E圖中描繪的N-醣基化分佈。

在一些實施例中，至少5%之rhGAA在第五潛在N-醣基化位點(例如，對SEQ ID NO : 5為N596且對SEQ ID NO : 1為N692)處磷酸化。在其他實施例中，小於5%、10%、15%、20%、或25%之rhGAA在第五潛在N-醣基化位點處磷酸化。例如，第五潛在N-醣基化位點可具有作為主要物種的岩藻糖基化二觸角複合N-聚醣。在一些實施例中，至少3%、5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%之rhGAA在第五潛在N-醣基化位點處唾液酸化。在一些實施例中，rhGAA在第五潛在N-醣基化位點處包含每mol rhGAA平均約0.8至約0.9 mol唾液酸。在至少一個實施例中，rhGAA包含如第6A圖中描繪的第五潛在N-醣基化位點佔用率及如第6F圖中描繪的N-醣基化分佈。

在一些實施例中，至少5%之rhGAA在第六N-醣基化位點(例如，對SEQ ID NO : 5為N826且對SEQ ID NO : 1為N882)處磷酸化。在其他實施例中，小於5%、10%、15%、20%、或25%之rhGAA在第六N-醣基化位點處磷酸化。例如，第六N-醣基化位點可具有作為主要物種的二觸角、三觸角、及四觸角複合N-聚醣之混合物。在一些實施例中，至少3%、5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%之rhGAA在第六N-醣基化位點處唾液酸化。在一些實施例中，rhGAA在第六潛在N-醣基化位點處包含每mol rhGAA平均約1.5至約1.8 mol唾液酸。在一些實施例中，rhGAA在第六潛在N-醣基化位點處包含每mol rhGAA平均約0.9 mol乙醯化唾液酸。在至少一個實施例中，rhGAA包含如第6A圖中描繪的第六潛在N-醣基化位點佔用率及如第6G圖中描繪的N-醣基化分佈。

在一些實施例中，至少5%之rhGAA在第七潛在N-醣基化位點(例如，對SEQ ID NO : 5為N869且對SEQ ID NO : 1為N925)處磷酸化。在其他實施例中，小於5%、10%、15%、20%、或25%之rhGAA在第七潛在N-醣基化位點處磷酸化。在一些實施例中，小於40%、45%、50%、55%、60%、或65%之rhGAA在第七潛在N-醣基化位點處具有任何N-聚醣。在一些實施例中，至少30%、35%、或40%之rhGAA在第七潛在N-醣基化位點處具有N-聚醣。在至少一個實施例中，rhGAA包含如第6A圖中描繪的第七潛在N-醣基化位點佔用率。

在一些實施例中，rhGAA包含每rhGAA分子平均3-4個M6P殘基及每mol rhGAA約4至約5.4 mol唾液酸。在一些實施例中，rhGAA進一步包含平均在第一潛在N-醣基化位點處每mol rhGAA約0.8 mol雙M6P，在第二潛在N-醣基化位點處每mol rhGAA約0.4至約0.6 mol單M6P，在第三潛在N-醣基化位點處每mol rhGAA約0.9至約1.2 mol唾液酸，在第四潛在N-醣基化位點處每mol rhGAA約0.4至約0.6 mol雙M6P，在第四潛在N-醣基化位點處每mol rhGAA約0.3至約0.4 mol單M6P，在第五潛在N-醣基化位點處每mol rhGAA約0.8至約0.9 mol唾液酸，及在第六潛在N-醣基化位點處每mol rhGAA約1.5至約1.8 mol唾液酸。在至少一個實施例中，rhGAA包含七個潛在N-醣基化位點，其中佔用率及N-醣基化分佈如第6A圖-第6H圖中所描繪。

製備rhGAA之方法揭示在2014年9月30日申請的美國臨時專利申請案第62/057,842號中，該申請案之全部內容係以引用方式併入本文中。

一旦處於溶酶體內部，rhGAA可酶促降解累積的肝醣。然而，習知rhGAA產品具有總體低位準之帶有單M6P及雙M6P的N-聚醣，且因此較差地靶向肌細胞，從而造成rhGAA至溶酶體之低劣遞送。該些習知產品中之大多數rhGAA分子不具有磷酸化N-聚醣，進而缺乏對CIMPR之親和力。非磷酸化高甘露糖N-聚醣亦可藉由甘露糖受體清除，從而產生ERT之非生產性清除(第2B圖)。對比而言，如第2A圖所示，本文描述的rhGAA可含有較高量之帶有單M6P及雙M6P的N-聚醣，從而導致rhGAA對諸如肌肉之特異組織的生產性靶向。 IV. N-連接醣基化rhGAA之產生及純化

如國際申請案PCT/US2015/053252所述(其全部內容係以引用方式併入本文中)，諸如中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary; CHO)細胞之細胞可用以產生本文描述的rhGAA。在一些實施例中，rhGAA較佳地藉由一或多個CHO細胞系產生，該等CHO細胞系利用編碼本文描述的rhGAA之DNA構築體轉變。此種CHO細胞系可含有基因之多個複本，諸如編碼GAA之多核苷酸之5、10、15、或20個或更多個複本。可構築DNA構築體且在CHO細胞中表現，該等DNA構築體表現酸性α-葡萄醣苷酶之對偶基因變異體或其他變異體酸性α-葡萄醣苷酶胺基酸序列，諸如與SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO: 5至少90%、95%、98%、或99%一致的彼等胺基酸序列。熟習此項技術者可選擇適用於轉變CHO細胞以用於產生此種DNA構築體之替代載體。

用於製備此種CHO細胞系之方法描述在國際申請案PCT/US2015/053252中，該申請案之全部內容係以引用方式併入本文中。簡言之，該些方法涉及利用編碼GAA或GAA變異體之DNA轉變CHO細胞，選擇將編碼GAA之DNA穩定整合至其染色體中且穩定表現GAA之CHO細胞，且選擇表現具有高含量之帶有單M6P或雙M6P的N-聚醣之GAA的CHO細胞，及視情況，選擇具有含高唾液酸含量之N-聚醣及/或具有含低的非磷酸化高甘露糖含量之N-聚醣的CHO細胞。所選擇CHO細胞系可用以藉由培養CHO細胞系且自CHO細胞之培養物回收該組合物來產生rhGAA及rhGAA組合物。在一些實施例中，由所選擇CHO細胞系產生的rhGAA含有高含量之帶有靶向CIMPR之單M6P或雙M6P的N-聚醣。在一些實施例中，如本文描述產生的rhGAA具有低位準之具有末端半乳糖的複合N-聚醣。在一些實施例中，所選擇CHO細胞系稱為GA-ATB200或ATB200-X5-14。在一些實施例中，所選擇CHO細胞系涵蓋此種CHO細胞培養物之繼代培養物或衍生物。在一些實施例中，由所選擇CHO細胞系產生的rhGAA稱為ATB200。

如本文描述產生的rhGAA可藉由遵照國際申請案PCT/US2017/024981及美國臨時申請案第62/506,569號中描述的方法來純化，兩個申請案皆係以全文引用方式併入本文中。用於產生、俘獲、及純化由CHO細胞系產生的rhGAA之示範性方法展示在第3圖中。

簡言之，生物反應器601含有諸如CHO細胞之細胞的培養物，該等細胞表現且分泌rhGAA至周圍液體培養基中。生物反應器601可為用於培養細胞之任何適當的生物反應器，諸如灌注、分批或分批進料生物反應器。在細胞經充分時間段以產生rhGAA之後，自生物反應器移除培養基。此種培養基移除可對灌注生物反應器為連續的或可針對分批或進料分批反應器為逐批進行的。培養基可藉由過濾系統603過濾以移除細胞。過濾系統603可為任何適合的過濾系統，包括交替切向流過濾(alternating tangential flow filtration; ATF)系統、切向流過濾(tangential flow filtration; TFF)系統、及/或離心過濾系統。在各種實施例中，過濾系統利用具有在約10奈米與約2微米之間的孔隙大小的過濾器。

在過濾之後，將濾液裝載至蛋白質俘獲系統605上。蛋白質俘獲系統605可包括一或多個層析管柱。若使用多於一個層析管柱，則管柱可串聯置放以便下一管柱可在一旦第一管柱經裝載時開始裝載。替代地，培養基移除方法可在切換管柱的時間期間停止。

在各種實施例中，蛋白質俘獲系統605包括用於rhGAA之直接產物俘獲、尤其是具有高M6P含量之rhGAA的一或多個陰離子交換(anion exchange; AEX)管柱。藉由蛋白質俘獲系統605俘獲的rhGAA藉由改變pH及/或管柱中之鹽含量自管柱溶析。用於AEX管柱之示範性條件提供於表2中。 表2. 用於AEX管柱之示範性條件

經溶析rhGAA可經受進一步純化步驟及/或品質保證步驟。例如，經溶析rhGAA可經受病毒殺死步驟607。此種病毒殺死607可包括以下一或多者：低pH殺死、清潔劑殺死、或此項技術中所知其他技術。來自病毒殺死步驟607之rhGAA可引入第二層析法系統609中以進一步純化rhGAA產品。替代地，來自蛋白質俘獲系統605之經溶析rhGAA可直接地進料至第二層析法系統609。在各種實施例中，第二層析法系統609包括用於進一步移除雜質的一或多個固定金屬親和力層析(immobilized metal affinity chromatography; IMAC)管柱。用於IMAC管柱之示範性條件提供於下文表3中。 表3. 用於IMAC管柱之示範性條件

在將rhGAA裝載至第二層析法系統609上之後，自管柱溶析重組蛋白質。經溶析rhGAA可經受病毒殺死步驟611。與病毒殺死607一樣，病毒殺死611可包括以下一或多者：低pH殺死、清潔劑殺死、或此項技術中所知其他技術。在一些實施例中，僅使用病毒殺死607或611之一，或在純化方法中的相同階段執行該等病毒殺死。

來自病毒殺死步驟611之rhGAA可引入第三層析法系統613中以進一步純化重組蛋白質產品。替代地，來自第二層析法系統609之經溶析重組蛋白質可直接地進料至第三層析法系統613。在各種實施例中，第三層析法系統613包括用於進一步移除雜質的一或多個陽離子交換層析法(cation exchange chromatography; CEX)管柱及/或粒徑排阻層析法(size exclusion chromatography; SEC)管柱。rhGAA產品隨後自第三層析法系統613溶析。用於CEX管柱之示範性條件提供於下文表4中。 表4.用於CEX管柱之示範性條件

rhGAA產品亦可經受進一步加工。例如，另一過濾系統615可用以移除病毒。在一些實施例中，此種過濾可利用具有在5 μm與50 μm之間的孔隙大小的過濾器。其他產品加工可包括產品調整步驟617，其中重組蛋白質產品可經殺菌、過濾、濃縮、儲存、及/或使另外的組分添加至最終產物調配物。

如本文所使用，術語「ATB200」係指具有高含量之帶有單M6P及雙M6P的N-聚醣之rhGAA，其係由GA-ATB200細胞系產生且使用本文描述的方法純化。 V. 醫藥組合物

在各種實施例中，提供醫藥組合物，其包含本文描述的單獨的或與其他治療劑組合的rhGAA，及/或醫藥學上可接受的載劑。

在一或多個實施例中，本文描述的醫藥組合物包含醫藥學上可接受的鹽。

在一些實施例中，本文使用的醫藥學上可接受的鹽為醫藥學上可接受的酸加成鹽。醫藥學上可接受的酸加成鹽可包括但不限於鹽酸、氫溴酸、硫酸、胺磺酸、硝酸、磷酸、及類似物，以及包括但不限於以下各項之有機酸：乙酸、三氟乙酸、己二酸、抗壞血酸、天冬醯胺酸、苯磺酸、苯甲酸、丁酸、樟腦酸、樟腦磺酸、肉桂酸、檸檬酸、二葡萄糖酸、乙烷磺酸、麩胺酸、羥基乙酸、甘油磷酸、半磺酸、己酸、甲酸、富馬酸、2-羥基乙烷磺酸(2-羥乙磺酸)、乳酸、羥基順丁烯二酸、蘋果酸、丙二酸、扁桃酸、對稱三甲苯磺酸、甲烷磺酸、萘磺酸、菸鹼酸、2-萘磺酸、草酸、撲酸、果膠酯酸、苯基乙酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、丙酸、丙酮酸、水楊酸、硬脂酸、丁二酸、磺胺酸、酒石酸、對甲苯磺酸、十一烷酸、及類似物。

在一些實施例中，本文使用的醫藥學上可接受的鹽為醫藥學上可接受的鹼加成鹽。醫藥學上可接受的鹼加成鹽可包括但不限於氨，或銨或金屬陽離子之氫氧化物、碳酸鹽、或重碳酸鹽，該金屬陽離子諸如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、鐵、鋅、銅、錳、鋁、及類似物。來源於醫藥學上可接受的有機無毒鹼之鹽包括但不限於以下各項之鹽：一級胺、二級胺、及三級胺、四級胺化合物、包括天然存在經取代胺之經取代胺、環胺及鹼離子交換樹脂，諸如甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、異丙胺、三丙胺、三丁胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲基胺基乙醇、2-二乙基胺基乙醇、二環基胺、離胺酸、精胺酸、組胺酸、咖啡因、海卓胺、膽鹼、甜菜鹼、乙二胺、葡糖胺、甲基還原葡糖胺、可可鹼、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、四甲銨化合物、四乙銨化合物、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基嗎啉、二環基胺、二苄基胺、N,N-二苄基苯乙胺、1-ephenamine、N,N'-二苄基乙二胺、聚胺樹脂、及類似物。

在一些實施例中，rhGAA或其醫藥學上可接受的鹽可調配為適合於靜脈內投與之醫藥組合物。在一些實施例中，醫藥組合物為於無菌等張水性緩衝液中之溶液。必要時，組合物亦可包括增溶劑及局部麻醉劑以減輕注射位點處之疼痛。醫藥組合物之成分可分離地供應或以單位劑型混合在一起，例如，作為在諸如指示活性劑之數量的安瓿或包囊之氣密密封容器中的乾燥的冷凍乾燥粉末或無水濃縮物。在組合物將藉由輸注投與的情況下，可利用含有無菌醫藥級水、鹽水或葡萄糖/水之輸注瓶來分配該組合物。在一些實施例中，輸注可在醫院或診所進行。在一些實施例中，輸注可在醫院或診所設施外部進行，例如，在受試者之居所處進行。在組合物係藉由注射投與的情況下，可提供滅菌注射用水或鹽水之安瓿以便成分可在投與之前混合。

在一些實施例中，rhGAA或其醫藥學上可接受的鹽可調配用於經口投與。可經口投與的組合物可調配成以下形式：錠劑、膠囊、胚珠、酏劑、溶液或懸浮液、凝膠、糖漿、漱口劑、或用於在使用之前以水或其他適合媒劑復水的乾粉，視情況，利用調味劑及著色劑以用於立即釋放、延遲釋放、改質釋放、持續釋放、脈衝式釋放、或受控釋放應用。亦可使用固體組合物，諸如錠劑、膠囊、口含錠、丸粒、丸劑、推注劑、粉劑、糊劑、顆粒、彈丸劑、糖衣錠、或預混合製劑。用於經口用途的固體及液體組合物可根據此項技術中熟知的方法製備。此種組合物亦可含有一或多種醫藥學上可接受的載劑及賦形劑，其可呈固體或液體形式。錠劑或膠囊可藉由習知手段利用包括但不限於黏合劑、填料、潤滑劑、崩解劑、或潤濕劑之醫藥學上可接受的賦形劑製備。適合的醫藥學上可接受的賦形劑在此項技術中已知且包括但不限於預糊化澱粉、聚乙烯吡咯啶酮、普維酮、羥丙基甲基纖維素(hydroxypropyl methylcellulose; HPMC)、羥丙基乙基纖維素(hydroxypropyl ethylcellulose; HPEC)、羥基丙基纖維素(hydroxypropyl cellulose; HPC)、蔗糖、明膠、阿拉伯膠、乳糖、微晶纖維素、磷酸氫鈣、硬脂酸鎂、硬脂酸、甘油山崳酸酯、滑石、矽石、玉米、馬鈴薯或樹薯澱粉、澱粉羥基乙酸鈉、十二烷基硫酸鈉、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫二鈣、甘胺酸交聯甲基羧纖維素鈉、及複合矽酸鹽。錠劑可藉由此項技術中熟知的方法包衣。

在一些實施例中，本文描述的醫藥組合物可根據國際申請案PCT/US2017/024982及美國臨時申請案第62/506,574號來調配，兩個申請案係以全文引用方式併入本文中。例如，在一些實施例中，本文描述的醫藥組合物之pH為約5.0至約7.0或約5.0至約6.0。在一些實施例中，pH範圍為約5.5至約6.0。在一些實施例中，醫藥組合物之pH為6.0。在一些實施例中，pH可藉由使用pH調節劑(例如，鹼化劑及酸化劑)諸如氫氧化鈉及/或鹽酸來調整至目標pH。

本文描述的醫藥組合物可包含緩衝液系統，諸如檸檬酸鹽系統、磷酸鹽系統、及前述之組合。檸檬酸鹽及/或磷酸鹽可為檸檬酸鈉或磷酸鈉。其他鹽包括鉀鹽及銨鹽。在一或多個實施例中，緩衝液包含檸檬酸鹽。在其他實施例中，緩衝液包含檸檬酸鈉(例如，檸檬酸鈉脫水物及檸檬酸一水合物之混合物)。在一或多個實施例中，包含檸檬酸鹽之緩衝液溶液可包含檸檬酸鈉及檸檬酸。在一些實施例中，存在檸檬酸鹽及磷酸鹽緩衝液。

在一些實施例中，本文描述的醫藥組合物包含至少一種賦形劑。賦形劑可起張力劑、增積劑、及/或穩定劑的作用。張力劑為有助於確保調配物具有類似於或相同於人類血液之滲透壓的組分。增積劑為向調配物(例如冷凍乾燥)增加質量並向餅塊提供足夠結構的成分。穩定劑為可防止或最小化在疏水性空氣-水界面表面處的聚集體形成之化合物。一種賦形劑可同時起張力劑及增積劑的作用。例如，甘露醇可起張力劑作用且亦提供作為增積劑之益處。

張力劑之實例包括氯化鈉、甘露醇、蔗糖、及海藻糖。在一些實施例中，張力劑包含甘露醇。在一些實施例中，張力劑之總量範圍為約10 mg/mL至約50 mg/mL之量。在其他實施例中，張力劑之總量範圍為約10、11、12、13、14、或15 mg/mL至約16、20、25、30、35、40、45、或50 mg/mL之量。

在一些實施例中，賦形劑包含穩定劑。在一些實施例中，穩定劑為表面活性劑。在一些實施例中，穩定劑為聚山梨醇酯80。在一或多個實施例中，穩定劑之總量範圍為約0.1 mg/mL至約1.0 mg/mL。在其他實施例中，穩定劑之總量範圍為約0.1、0.2、0.3、0.4、或0.5 mg/mL至約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1.0 mg/mL。在其他實施例中，穩定劑之總量為約1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1.0 mg/mL。

在一些實施例中，醫藥組合物包含(a) rhGAA (諸如ATB200)，(b)至少一種選自由檸檬酸鹽、磷酸鹽、及前述之組合組成之群的緩衝液，及(C)至少一種選自由甘露醇、聚山梨醇酯80、及前述之組合組成之群的賦形劑，且具(i)約5.0至約6.0、或(ii)約5.0至約7.0之pH。在一些實施例中，組合物進一步包含水。在一些實施例中，組合物可進一步包含酸化劑及/或鹼化劑。

在一些實施例中，醫藥組合物包含(a)濃度為約5-50 mg/mL、約5-30 mg/mL、或約15 mg/mL之rhGAA (諸如ATB200)，(b)濃度為約10-100 mM或約25 mM之檸檬酸鈉緩衝液，(c)濃度為約10-50 mg/mL、或約20 mg/mL之甘露醇，(d)以約0.1-1 mg/mL、約0.2-0.5 mg/mL、或約0.5 mg/mL之濃度存在的聚山梨醇酯80，及(e)水，且具有約6.0之pH。在至少一個實施例中，醫藥組合物包含(a) 15 mg/mL rhGAA (諸如ATB200)、(b) 25 mM檸檬酸鈉緩衝液、(c) 20 mg/mL甘露醇、(d) 0.5 mg/mL聚山梨醇酯80、及(e)水，且具有約6.0之pH。在一些實施例中，組合物可進一步包含酸化劑及/或鹼化劑。

在一些實施例中，包含rhGAA之醫藥組合物係在投與至有需要之受試者之前稀釋。

在一些實施例中，本文描述的醫藥組合物包含伴護蛋白。在一些實施例中，伴護蛋白為美格魯特或其醫藥學上可接受的鹽。在另一實施例中，伴護蛋白為杜格魯特或其醫藥學上可接受的鹽。

在一些實施例中，本文描述的rhGAA係調配在一種醫藥組合物中而諸如美格魯特之伴護蛋白係調配在另一醫藥組合物中。在一些實施例中，包含美格魯特之醫藥組合物係基於可作為Zavesca® (Actelion Pharmaceuticals)商購的調配物。

在一些實施例中，本文描述的醫藥組合物可經歷凍乾(冷凍乾燥)方法以提供餅塊或粉末。因此，本發明之另一態樣係關於凍乾之後的醫藥組合物。冷凍乾燥混合物可包含本文描述的rhGAA (例如，ATB200)，選自由檸檬酸鹽、磷酸鹽、及前述之組合組成之群的緩衝液，及至少一種選自由海藻糖、甘露醇、聚山梨醇酯80、及前述之組合組成之群的賦形劑。在一些實施例中，其他成分(例如，其他賦形劑)可添加至冷凍乾燥混合物。包含冷凍乾燥調配物之醫藥組合物可提供在小瓶中，其隨後可儲存、運輸、復水及/或投與至患者。 VI. 治療方法 A. 疾病之治療

本發明之另一態樣係關於藉由投與本文描述的rhGAA或醫藥組合物治療與肝醣儲積調節不良有關的疾病或病症之方法。在一些實施例中，疾病為龐貝氏症(亦稱為酸性麥芽糖酶缺乏(acid maltase deficiency; AMD)及II型肝醣儲積病(GSD II))。在一些實施例中，rhGAA為ATB200。在一些實施例中，醫藥組合物包含ATB200。

本文描述的rhGAA或醫藥組合物藉由適當路線投與。在一個實施例中，rhGAA或醫藥組合物係靜脈內投與。在其他實施例中，rhGAA或醫藥組合物係藉由直接投與至靶組織以達心臟或骨骼肌(例如，肌肉內)、或神經系統(例如，直接注射至腦中；心室內；鞘內)來投與。在一些實施例中，rhGAA或醫藥組合物係經口投與。若需要，則可並行地使用多於一種路線。

在一些實施例中，本文描述的rhGAA或醫藥組合物之治療效應可基於以下標準之一或多者來評定：(1)心臟狀態(例如，舒張末期及/或收縮末期體積之增加，或在GSD-II中典型所見的進行性心肌病之減少、改善或預防)，(2)肺功能(例如，相對基線容量之啼泣時肺活量之增加，及/或在啼泣期間氧去飽和之正常化)，(3)神經發育及/或運動技能(例如，AIMS記分增加)，及(4)個體的受疾病影響之組織中肝醣位準之減少。

在一些實施例中，受試者之心臟狀態在投與一或多個劑量之本文描述的rhGAA或醫藥組合物之後相較於利用媒劑治療的受試者之彼心臟狀態或治療之前的受試者之彼心臟狀態改善10%、20%、30%、40%、或50% (或居間的任何百分比)。受試者之心臟狀態可藉由量測舒張末期及/或收縮末期體積及/或藉由臨床評估心肌病來評定。在一些實施例中，受試者之肺功能在投與一或多個劑量之ATB200或包含ATB200之醫藥組合物之後相較於利用媒劑治療的受試者之彼肺功能或治療之前的受試者之彼肺功能改善10%、20%、30%、40%、或50% (或居間的任何百分比)。在某些實施例中，在自投與算1週、2週、3週、1個月、2個月、或更久(或居間的任何時間段)之後達成改善。在某些實施例中，ATB200或包含ATB200之醫藥組合物在自投與算1週、2週、3週、1個月、2個月、或更久(或居間的任何時間段)之後改善受試者之肺功能。

在一些實施例中，受試者之肺功能在投與一或多個劑量之本文描述的rhGAA或醫藥組合物之後相較於利用媒劑治療的受試者之彼肺功能或治療之前的受試者之彼肺功能改善10%、20%、30%、40%、或50% (或居間的任何百分比)。受試者之肺功能可藉由相對基線容量之啼泣時肺活量及/或啼泣期間氧去飽和作用之正常化來評定。在一些實施例中，受試者之肺功能在投與一或多個劑量之ATB200或包含ATB200之醫藥組合物之後相較於利用媒劑治療的受試者之彼肺功能或治療之前的受試者之彼肺功能改善10%、20%、30%、40%、或50% (或居間的任何百分比)。在某些實施例中，在自投與算1週、2週、3週、1個月、2個月、或更久(或居間的任何時間段)之後達成改善。在某些實施例中，ATB200或包含ATB200之醫藥組合物在自投與算1週、2週、3週、1個月、2個月、或更久(或居間的任何時間段)之後改善受試者之肺功能。

在一些實施例中，受試者之神經發育及/或運動技能在投與一或多個劑量之本文描述的rhGAA或醫藥組合物之後相較於利用媒劑治療的受試者之彼神經發育及/或運動技能或治療之前的受試者之彼神經發育及/或運動技能改善10%、20%、30%、40%、或50% (或居間的任何百分比)。受試者之神經發育及/或運動技能可藉由測定AIMS記分來評定。AIMS為12項固定量表，其係臨床醫師投與並記分的(參見Rush JA Jr., Handbook of Psychiatric Measures, American Psychiatric Association, 2000, 166-168)。1-10項係在5分固定量表上分級。1-4項評定口面移動。5-7項應對肢體及軀幹運動困難。8-10項應對如藉由檢查人判斷的總體嚴重程度，及患者對移動之意識及與其相關聯的痛苦。11-12項為關於牙齒及/或假牙之問題(此種問題可導致運動困難之錯誤診斷)的是/非題。在一些實施例中，受試者之神經發育及/或運動技能在投與一或多個劑量之ATB200或包含ATB200之醫藥組合物之後相較於利用媒劑治療的受試者之彼神經發育及/或運動技能或治療之前的受試者之彼神經發育及/或運動技能改善10%、20%、30%、40%、或50% (或居間的任何百分比)。在某些實施例中，在自投與算1週、2週、3週、1個月、2個月、或更久(或居間的任何時間段)之後達成改善。在某些實施例中，ATB200或包含ATB200之醫藥組合物在自投與算1週、2週、3週、1個月、2個月、或更久(或居間的任何時間段)之後改善受試者之神經發育及/或運動技能。

在一些實施例中，受試者之某一組織的肝醣位準在投與一或多個劑量之本文描述的rhGAA或醫藥組合物之後相較於利用媒劑治療的受試者之彼肝醣位準或治療之前的受試者之彼肝醣位準減少10%、20%、30%、40%、或50% (或居間的任何百分比)。在一些實施例中，組織為肌肉，諸如四頭肌、三角肌、及腓腸肌。組織之肝醣位準可使用此項技術中所知的方法分析。肝醣位準之測定熟知係基於澱粉葡萄糖苷酶消化，且描述於諸如以下的出版物中：Amalfitano等人(1999), 「Systemic correction of the muscle disorder glycogen storage disease type ii after hepatic targeting of a modified adenovirus vector encoding human acid-alphaglucosidase」, Proc Natl Acad Sci USA, 96:8861-8866。在一些實施例中，受試者之肌肉中的肝醣位準在投與一或多個劑量之ATB200或包含ATB200之醫藥組合物之後相較於利用媒劑治療的受試者之彼肝醣位準或治療之前的受試者之彼肝醣位準減少10%、20%、30%、40%、或50% (或居間的任何百分比)。在某些實施例中，在自投與算1週、2週、3週、1個月、2個月、或更久(或居間的任何時間段)之後達成減少。在某些實施例中，ATB200或包含ATB200之醫藥組合物在自投與算1週、2週、3週、1個月、2個月、或更久(或居間的任何時間段)之後減少受試者之肌肉中的肝醣位準。 B. 生物標誌物

受試者之肌肉纖維中的肝醣累積之生物標誌物諸如尿己糖四醣(Hex4)可用以評定並比較酶替代療法在患有龐貝氏症之受試者中的治療效應。在一些實施例中，rhGAA或包含rhGAA之醫藥組合物對肝醣累積之治療效應係藉由量測受試者中Hex4之位準來評定。

肌肉損傷或破壞之生物標誌物諸如肌酸激酶(creatine kinase; CK)、丙胺酸轉胺酶(alanine aminotransferase; ALT)、及天冬胺酸轉胺酶(aspartate aminotransferase; AST)可用以評定並比較酶替代療法在患有龐貝氏症之受試者中的治療效應。在一些實施例中，rhGAA或包含rhGAA之醫藥組合物對肌肉破壞之治療效應係藉由量測受試者中CK、ALT、及/或AST之位準來評定。在至少一個實施例中，rhGAA或包含rhGAA之醫藥組合物對肌肉破壞之治療效應係藉由量測受試者中CK之位準來評定。

生物標誌物諸如LAMP-1、LC3、及Dysferlin亦可用於評定並比較本文描述的rhGAA或醫藥組合物之治療效應。在龐貝氏症中，GAA無法水解溶酶體肝醣導致在一些組織中經肝醣填充的大溶酶體之異常累積。(Raben等人, JBC 273: 19086-19092, 1998。)在龐貝氏症之小鼠模型中之研究已展示骨骼肌中之增多溶酶體不能充分地解釋機械效能之減少，且含有經降解肌原纖維的大內容物之存在(亦即，自噬堆積)貢獻了肌肉功能之損傷。(Raben等人, Human Mol Genet 17: 3897-3908, 2008。)報告亦暗示受損自噬通量與龐貝症患者中之不良治療結果相關聯。(Nascimbeni等人, Neuropathology and Applied Neurobiology doi: 10.1111/nan.12214, 2015；Fukuda等人, Mol Ther 14: 831-839, 2006。)另外，晚發型龐貝氏症在未分類的肢帶肌肉營養不良(limb-girdle muscular dystrophy; LGMD)中為普遍的 (Preisler等人, Mol Genet Metab 110: 287-289, 2013)，其係由肌肉萎縮蛋白-醣蛋白複合物(dystrophin-glycoprotein complex; DGC)之各種成員的缺乏所引起。IHC檢查顯示在Gaa KO小鼠之骨骼肌纖維中dysferlin之實質上增加的肌漿性存在。

各種已知的方法可用於量測此種生物標誌物之基因表現位準及/或蛋白質位準。例如，可獲得來自利用本文描述的rhGAA或醫藥組合物治療的受試者之樣本，諸如組織、尤其是肌肉之生物檢體。在一些實施例中，樣本為受試者中肌肉之生物檢體。在一些實施例中，肌肉係選自四頭肌、三角肌、及腓腸肌。自受試者獲得的樣本可利用一或多種抗體或偵測此種生物標誌物的其他偵測劑染色。樣本亦可或替代地經加工以用於經由例如RT-qPCR方法偵測諸如mRNA的編碼生物標誌物之核酸的存在。

在一些實施例中，一或多種生物標誌物之基因表現位準及/或蛋白質位準係在自利用本文描述的rhGAA或醫藥組合物治療之前及之後的個體獲得的肌肉生物檢體中量測。在一些實施例中，一或多種生物標誌物之基因表現位準及/或蛋白質位準係在自利用媒劑治療的個體獲得的肌肉生物檢體中量測。在一些實施例中，一或多種生物標誌物之基因表現位準及/或蛋白質位準在投與一或多個劑量之本文描述的rhGAA或醫藥組合物之後相較於利用媒劑治療的受試者之彼基因表現位準及/或蛋白質位準或治療之前的受試者之彼基因表現位準及/或蛋白質位準減少10%、20%、30%、40%、或50% (或居間的任何百分比)。在一些實施例中，一或多種生物標誌物之基因表現位準及/或蛋白質位準在投與一或多個劑量之ATB200或包含ATB200之醫藥組合物之後相較於利用媒劑治療的受試者之彼基因表現位準及/或蛋白質位準或治療之前的受試者之彼基因表現位準及/或蛋白質位準減少10%、20%、30%、40%、或50% (或居間的任何百分比)。在某些實施例中，在自投與算1週、2週、3週、1個月、2個月、或更久(或居間的任何時間段)之後達成減少。在某些實施例中，ATB200或包含ATB200之醫藥組合物在自投與算1週、2週、3週、1個月、2個月、或更久(或居間的任何時間段)之後減少一或多種生物標誌物之基因表現位準及/或蛋白質位準。 C. rhGAA之給藥

醫藥調配物或復水組合物係以治療有效量(例如，當以規則間隔投與時足以治療疾病，諸如改善與疾病相關聯的症狀、防止或延遲疾病之發病、及/或減輕疾病症狀之嚴重程度或頻率的劑量之量)投與。在治療疾病方面為治療有效的量可取決於疾病之性質及疾病之效應的程度，且可藉由標準臨床技術測定。另外，活體外或活體內檢定可視情況用於幫助鑑別最佳劑量範圍。在至少一個實施例中，本文描述的rhGAA或包含rhGAA之醫藥組合物係以約1 mg/kg至約100 mg/kg、諸如約5 mg/kg至約30 mg/kg、典型地約5 mg/kg至約20 mg/kg之劑量投與。在至少一個實施例中，本文描述的rhGAA或醫藥組合物係以約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約50 mg/kg、約50 mg/kg、約60 mg/kg、約70 mg/kg、約80 mg/kg、約90 mg/kg、或約100 mg/kg 之劑量投與。在一些實施例中，rhGAA係以5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg、50 mg/kg、75 mg/kg、或100 mg/kg之劑量投與。在至少一個實施例中，rhGAA或醫藥組合物係以約20 mg/kg之劑量投與。在一些實施例中，rhGAA或醫藥組合物與藥理學伴護蛋白並行地或順序地投與。在一些實施例中，藥理學伴護蛋白為美格魯特。在至少一個實施例中，美格魯特係以約260 mg之經口劑量投與。用於特定個體之有效劑量可隨時間變化(例如，增加或減少)，此取決於個體之需要。例如，在身體有疾患或壓力時，或若抗酸性α-葡萄醣苷酶抗體變得存在或增加時，或若疾病症狀惡化時，可增加該量。

在一些實施例中，本文描述的rhGAA或醫藥組合物之治療有效劑量低於習知rhGAA產品之彼治療有效劑量。例如，若習知rhGAA產品之治療有效劑量為20 mg/kg，則產生與習知rhGAA產品相比相同或更好治療效應所需的本文描述的rhGAA或醫藥組合物之劑量可低於20 mg/kg。治療效應可基於上述論述的一或多個標準(例如，心臟狀態、肝醣位準、或生物標誌物表現)來評定。在一些實施例中，本文描述的rhGAA或醫藥組合物之治療有效劑量低於習知rhGAA產品之彼治療有效劑量至少約5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或更大。

在一些實施例中，本文描述的rhGAA或醫藥組合物之治療效應包含運動功能之改善、肌肉力量之改善(上身、下身、或全身)、肺功能之改善、減少疲勞、減少位準的肌肉損傷之至少一種生物標誌物、減少位準的肝醣累積之至少一種生物標誌物、或前述之組合。在一些實施例中，本文描述的rhGAA或醫藥組合物之治療效應包含肌肉纖維中溶酶體病理學之逆轉、肌肉纖維中肝醣含量的較快及/或更多的有效減少、六分鐘步行測試距離之增加、計時起立行走測試時間之減少、四層樓梯攀爬測試時間之減少、十公尺步行測試時間之減少、步態-樓梯-gower-椅子記分之減少、上肢力量之增加、肩膀內收之改善、肩膀外展之改善、肘屈曲之改善、肘伸展之改善、上身力量之改善、下身力量之改善、全身力量之改善、直立(坐立)用力肺活量之改善、最大呼氣壓之改善、最大吸氣壓之改善、疲勞嚴重程度量表記分之減少、尿己糖四醣位準之減少、肌酸激酶位準之減少、丙胺酸轉胺酶位準之減少、天冬胺酸轉胺酶位準之減少、或其任何組合。

在一些實施例中，在以相同劑量投與時，本文描述的rhGAA或醫藥組合物比習知rhGAA產品更快地達成所要治療效應。治療效應可基於上述論述的一或多個標準(例如，心臟狀態、肝醣位準、或生物標誌物表現)來評定。例如，若習知rhGAA產品之單劑量在一週內降低所治療個體之組織中的肝醣位準達10%，則當投與相同劑量之本文描述的rhGAA或醫藥組合物時，可在少於一週內達成相同程度之減少。在一些實施例中，當以相同劑量投與時，本文描述的rhGAA或醫藥組合物可比習知rhGAA產品快至少約1.25、1.5、1.75、2.0、3.0倍、或更快地達成所要治療效應。

在一些實施例中，治療有效量之rhGAA (或包含rhGAA之組合物或藥劑)係投與一次以上。在一些實施例中，本文描述的rhGAA或醫藥組合物係以規則間隔投與，此取決於疾病之性質及疾病之效應的程度，且取決於正在發展的狀況。如本文所使用的以「規則間隔」投與指示治療有效量係週期性地投與(如與單次劑量區別)。間隔可藉由標準臨床技術測定。在某些實施例中，rhGAA係兩月一次、每月一次、兩週一次、每週一次、每週兩次、或每日一次投與。在一些實施例中，rhGAA係每週兩次、每週一次、或每隔一週靜脈內投與。用於單一個體的投與間隔不需為固定間隔，但可隨時間變化，此取決於個體之需要。例如，在身體有疾患或壓力時，若抗rhGAA抗體變得存在或增加時，或若疾病症狀惡化時，可減少劑量之間的間隔。

在一些實施例中，當以相同劑量使用時，如本文描述的rhGAA或醫藥組合物可比習知rhGAA產品投與頻率更低，且仍能夠與習知rhGAA產品相比產生相同或更好的治療效應。例如，若每週一次以20 mg/kg投與習知rhGAA產品，則如本文描述的rhGAA或醫藥組合物可在以20 mg/kg投與時與習知rhGAA產品相比產生相同或更好的治療效應，即使rhGAA或醫藥組合物投與頻率更低，例如，兩週一次或每月一次投與時，亦如此。治療效應可基於上述論述的一或多個標準(例如，心臟狀態、肝醣位準、或生物標誌物表現)來評定。在一些實施例中，本文描述的rhGAA或醫藥組合物之兩個劑量之間的間隔比習知rhGAA產品之彼間隔更長。在一些實施例中，rhGAA或醫藥組合物之兩個劑量之間的間隔比習知rhGAA產品之彼間隔長至少約1.25、1.5、1.75、2.0、3.0倍、或更長。

在一些實施例中，在相同治療條件下(例如，以相同間隔投與相同劑量)，本文描述的rhGAA或醫藥組合物以比藉由習知rhGAA產品提供的彼治療效應更優異之程度提供治療效應。治療效應可基於上述論述的一或多個標準(例如，心臟狀態、肝醣位準、或生物標誌物表現)來評定。例如，當相較於每週一次以20 mg/kg投與的習知rhGAA產品時，每週一次以20 mg/kg投與的rhGAA或醫藥組合物可以更高程度減少所治療個體之組織中的肝醣位準。在一些實施例中，當在相同治療條件下投與時，本文描述的rhGAA或醫藥組合物提供比習知rhGAA產品之彼等治療效應大至少約1.25、1.5、1.75、2.0、3.0倍、或更大的治療效應。 D. 組合療法

在一或多個實施例中，本文描述的rhGAA或包含rhGAA之醫藥組合物係與藥理學伴護蛋白並行地或順序地投與。在一些實施例中，rhGAA或醫藥組合物係經由相較於藥理學伴護蛋白而言不同的路線來投與。例如，藥理學伴護蛋白可經口投與而rhGAA或醫藥組合物係靜脈內投與。

在各種實施例中，藥理學伴護蛋白為美格魯特。在一些實施例中，美格魯特係以約50 mg至約600 mg之經口劑量投與。在至少一個實施例中，美格魯特係以約200 mg至約600 mg之經口劑量，或以約200 mg、約250 mg、約300 mg、約350 mg、約400 mg、約450 mg、約500 mg、約550 mg、或約600 mg之經口劑量投與。在至少一個實施例中，美格魯特係以約233 mg至約500 mg之經口劑量投與。在至少一個實施例中，美格魯特係以約250至約270 mg之經口劑量，或以約250 mg、約255 mg、約260 mg、約265 mg或約270 mg之經口劑量投與。在至少一個實施例中，美格魯特係以約260 mg之經口劑量投與。

熟習此項技術者將理解的是，在約200 mg至600 mg範圍或屬於其之任何較小範圍內的美格魯特之經口劑量可取決於成人患者之體重而適用於該成人患者。例如，對於具有體重顯著低於約70 kg之患者，包括但不限於幼兒、兒童、或重量不足之成人，可藉由醫師適當地考慮較小劑量。因此，在至少一個實施例中，美格魯特係以約50 mg至約200 mg之經口劑量、或以約50 mg、約75 mg、約100 mg、125 mg、約150 mg、約175 mg、或約200 mg之經口劑量投與。在至少一個實施例中，美格魯特係以約65 mg至約195 mg之經口劑量，或以約65 mg、約130 mg、或約195 mg之經口劑量投與。

在一些實施例中，rhGAA係以約5 mg/kg至約20 mg/kg之劑量靜脈內投與且美格魯特係以約50 mg至約600 mg之劑量經口投與。在一些實施例中，rhGAA係以約5 mg/kg至約20 mg/kg之劑量靜脈內投與且美格魯特係以約50 mg至約200 mg之劑量經口投與。在一些實施例中，rhGAA係以約5 mg/kg至約20 mg/kg之劑量靜脈內投與且美格魯特係以約200 mg至約600 mg之劑量經口投與。在一些實施例中，rhGAA係以約5 mg/kg至約20 mg/kg之劑量靜脈內投與且美格魯特係以約233 mg至約500 mg之劑量經口投與。在一個實施例中，rhGAA係以約20 mg/kg之劑量靜脈內投與且美格魯特係以約260 mg之劑量經口投與。

在一些實施例中，美格魯特及rhGAA係並行地投與。例如，美格魯特可在rhGAA之投與之前或之後10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1分鐘內投與。在一些實施例中，美格魯特係在rhGAA之投與之前或之後5、4、3、2、或1分鐘內投與。

在一些實施例中，美格魯特及rhGAA係順序地投與。在至少一個實施例中，美格魯特係在rhGAA之投與之前投與。在至少一個實施例中，美格魯特係在rhGAA之投與之前小於三小時投與。在至少一個實施例中，美格魯特係在rhGAA之投與之前約兩個小時投與。例如，美格魯特可在rhGAA之投與之前約1.5小時、約1小時、約50分鐘、約30分鐘、或約20分鐘投與。在至少一個實施例中，美格魯特係在rhGAA之投與之前約一小時投與。

在一些實施例中，美格魯特係在rhGAA之投與之後投與。在至少一個實施例中，美格魯特係在rhGAA之投與之後三小時內投與。在至少一個實施例中，美格魯特係在rhGAA之投與之後兩個小時內投與。例如，美格魯特可在rhGAA之投與之後約1.5小時、約1小時、約50分鐘、約30分鐘、或約20分鐘內投與。

在一些實施例中，受試者在美格魯特之之投與之前至少兩小時及投與之後至少兩小時禁食。 E. 套組

本發明之另一態樣係關於包含本文描述的rhGAA或醫藥組合物之套組。在一或多個實施例中，套組包含容器(例如，小瓶、管、袋子、等等)，其包含rhGAA或醫藥組合物(凍乾之前或之後)，且包含用於復水、稀釋及投與之說明。實例 實例1：具有高含量之帶有單M6P或雙M6P的N-聚醣之產生rhGAA的CHO細胞之製備。

利用表現rhGAA之DNA構築體轉染DG44 CHO (DHFR-)細胞。DNA構築體展示在第4圖中。在轉染之後，利用缺乏次黃嘌呤/胸苷(-HT)之培養基選擇含有穩定整合的GAA基因之CHO細胞。該些細胞中之GAA表現係藉由胺甲喋呤處理(MTX, 500 nM)來誘導。

表現高量之GAA的細胞池係藉由GAA酶活性檢定來鑑別且用於建立產生rhGAA之個別純系。在半固體培養板上產生個別純系，藉由ClonePix系統拾取，且轉移至24深孔板。分析個別純系之GAA酶活性以鑑別表現高位準之GAA的純系。用於測定GAA活性之條件培養基使用4-MU-α-葡萄醣苷酶底物。進一步評估如藉由GAA酶檢定所量測的產生較高位準之GAA的純系之生存力、生長能力、GAA生產率、N-聚醣結構及穩定蛋白質表現。使用此程序分離表現具有增強的單M6P或雙M6P N-聚醣之rhGAA的CHO細胞系，包括CHO細胞系GA-ATB200。 實例2：rhGAA之純化

在搖瓶及在灌注生物反應器中使用CHO細胞系GA-ATB200產生根據本發明的多批rhGAA，產物係稱為「ATB200」。弱陰離子交換(weak anion exchange;「WAX」)液相層析用於根據末端磷酸酯分餾ATB200 rhGAA。藉由溶析具有漸增量之鹽的ERT來產生溶析分佈。藉由UV (A280nm)監視分佈。對來自不同生產批次的純化ATB200 rhGAA觀察到類似的CIMPR受體結合(至少約70%)分佈(第5圖)，從而指示ATB200 rhGAA可一致地產生。 實例3：ATB200 rhGAA之寡醣表徵

使用兩種不同的LC-MS/MS分析技術分析ATB200 rhGAA之位點特異性N-聚醣分佈。在第一分析中，在LC-MS/MS分析之前使蛋白質變性、還原、烷基化、及消化。在蛋白質變性及還原期間，將200 μg之蛋白質樣本、5 μL之 1 mol/L tris-HCl (最終濃度50 mM)、75 μL之8 mol/L胍HCl (最終濃度6 M)、1 μL之0.5mol/L EDTA(最終濃度5 mM)、2 μL之1mol/L DTT (最終濃度20 mM)、及 Milli-Q®水添加至1.5 mL管以提供100 μL之總體積。將樣本混合且在56℃下於無水浴中孵化30分鐘。在烷基化期間，將變性及還原的蛋白質樣本與5 μL之1mol/L碘乙醯胺(IAM,最終濃度50 mM)混合，隨後在10-30℃下於黑暗中孵化30分鐘。在烷基化之後，將400 μL預冷卻的丙酮添加至樣本且將混合物在-80℃冷凍下凍結4小時。隨後將樣本在13000 rpm下在4℃下離心5 min且將上清液移除。將400 μL之預冷卻丙酮添加至團塊，隨後將其在13000 rpm下在4℃下離心5 min且將上清液移除。隨後將樣本在冰上於黑暗中空氣乾燥以移除丙酮殘餘物。將四十微升之8M尿素及160 μL之100 mM NH₄ HCO₃ 添加至樣本以溶解蛋白質。在胰蛋白酶消化期間，隨後將50 μg之蛋白質與胰蛋白酶消化緩衝液一起添加至100 μL之最終體積，且添加5 μL之0.5mg/mL胰蛋白酶(蛋白質與酶比率為20/1 w/w)。將溶液充分混合且在37℃下孵化隔夜(16±2小時)。添加2.5微升之20% TFA (最終濃度0.5%)以將反應淬滅。隨後使用Thermo Scientific™ Orbitrap Velos Pro™質譜儀分析樣本。

在第二LC-MS/MS分析中，根據類似的變性、還原、烷基化、及消化程序製備ATB200樣本，只不過碘乙酸(iodoacetic acid; IAA)係用作烷基化試劑替代IAM，且隨後使用Thermo Scientific™ Orbitrap Fusion™ Lumos Tribid™質譜儀分析。

第一分析及第二分析之結果係展示在第6A圖-第6H圖。在第6A圖-第6H圖中，第一分析之結果係由左側條柱(深灰色)表示且來自第二分析之結果係由右側條柱(淺灰色)表示。用於聚醣表示之符號命名法係根據Varki, A., Cummings, R.D., Esko J.D.等人, Essentials of Glycobiology, 第2版(2009)。

如自第6A圖-第6H圖可見，兩個分析提供類似的結果，但結果之間存在一些變化。此變化可歸因於許多因素，包括所使用的儀器及N-聚醣分析之完整性。例如，若未鑑別及/或未定量磷酸化N-聚醣之一些物種，則磷酸化N-聚醣之總數可為未被充分表示的，且在彼位點處帶有磷酸化N-聚醣之rhGAA之百分比可為未被充分表示的。作為另一實例，若未鑑別及/或未定量非磷酸化N-聚醣之一些物種，則非磷酸化N-聚醣之總數可為未被充分表示的，且在彼位點處帶有磷酸化N-聚醣之rhGAA之百分比可為過度表示的。

第6A圖展示ATB200之N-醣基化位點佔用率。如自第6A圖可見，第一、第二、第三、第四、第五、及第六N-醣基化位點幾乎被佔用，其中兩個分析偵測到在每一潛在N-醣基化位點處大約或超過90%及至多約100%之ATB200酶具有偵測到的N-聚醣。然而，第七潛在N-醣基化位點約一半時間係經N-醣基化的。

第6B圖展示第一潛在N-醣基化位點N84之N-醣基化分佈。如自第6B圖可見，主要的N-聚醣物種為雙M6P N-聚醣。第一分析及第二分析偵測到在第一位點處超過75%之ATB200具有雙M6P，其對應於在第一位點處平均每mol ATB200約0.8 mol雙M6P。

第6C圖展示第二潛在N-醣基化位點N177之N-醣基化分佈。如自第6C圖可見，主要的N-聚醣物種為單M6P N-聚醣及非磷酸化高甘露糖N-聚醣。第一分析及第二分析偵測到在第二位點處超過40%之ATB200具有單M6P，其對應於在第二位點處平均每mol ATB200約0.4至約0.6 mol單M6P。

第6D圖展示第三潛在N-醣基化位點N334之N-醣基化分佈。如自第6D圖可見，主要的N-聚醣物種為非磷酸化高甘露糖N-聚醣，二觸角、三觸角、及四觸角複合N-聚醣，及混合N-聚醣。第一分析及第二分析偵測到在第三位點處超過20%之ATB200具有唾液酸殘基，其對應於在第三位點處平均每mol ATB200約0.9至約1.2 mol唾液酸。

第6E圖展示第四潛在N-醣基化位點N414之N-醣基化分佈。如自第6E圖可見，主要的N-聚醣物種為雙M6P及單M6P N-聚醣。第一分析及第二分析偵測到在第四位點處超過40%之ATB200具有雙M6P，其對應於在第四位點處平均每mol ATB200約0.4至約0.6 mol雙M6P。第一分析及第二分析亦偵測到在第四位點處超過25%之ATB200具有單M6P，其對應於在第四位點處平均每mol ATB200約0.3至約0.4 mol單M6P。

第6F圖展示第五潛在N-醣基化位點N596之N-醣基化分佈。如自第6F圖可見，主要的N-聚醣物種為岩藻糖基化二觸角複合N-聚醣。第一分析及第二分析偵測到在第五位點處超過70%之ATB200具有唾液酸殘基，其對應於在第五位點處平均每mol ATB200約0.8至約0.9 mol唾液酸。

第6G圖展示第六潛在N-醣基化位點N826之N-醣基化分佈。如自第6G圖可見，主要的N-聚醣物種為二觸角、三觸角、及四觸角複合N-聚醣。第一分析及第二分析偵測到在第六位點處超過80%之ATB200具有唾液酸殘基，其對應於在第六位點處平均每mol ATB200約1.5至約1.8 mol唾液酸。

在第七位點N869處之N-醣基化之分析展示大致40% N-醣基化，其中最普遍的N-聚醣為A4S3S3GF (12%)、A5S3G2F (10%)、A4S2G2F (8%)及A6S3G3F (8%)。

第6H圖展示在七個潛在N-醣基化位點之每一者處的磷酸化之概要。如自第6H圖可見，第一分析及第二分析在第一、第二、及第四潛在N-醣基化位點處偵測到高磷酸化位準。兩個分析偵測到在第一位點處超過80%之ATB200為單或雙磷酸化的，在第二位點處超過40%之ATB200為單磷酸化的，且在第四位點處超過80%之ATB200為單或雙磷酸化的。

ATB200之另一N-醣基化分析係根據親水性相互作用液相層析-螢光偵測-質譜法(hydrophilic interaction liquid chromatography-fluorescent detection-mass spectrometry; HILIC-FLD-MS)方法執行。HILIC-FLD-MS分析之結果係提供於下文表5中。在表5中，在三數字數中之第一個數指示N-聚醣中分支之數量，第二個數指示核心岩藻糖單元之數量且第三個數指示末端唾液酸單元之數量。使用此命名法，「303」表示三觸角N-聚醣(第一個3)，其具有0個核心岩藻糖(第二個0)及3個末端唾液酸(最後一個3)，「212」表示二觸角N-聚醣，其具有1個核心岩藻糖及2個末端唾液酸，「404」表示四觸角N-聚醣，其具有0個核心岩藻糖及4個末端唾液酸等等。 表5：ATB200之HILIC-FLD-MS分析之概要

基於此HILIC-FLD-MS分析，所測試的ATB200具有每mol ATB200 2-3 mol之平均岩藻糖含量、每mol ATB200 20-25 mol之GlcNAc含量、每mol ATB200 8-12 mol之半乳糖含量、每mol ATB200 22-27 mol之甘露糖含量、每mol ATB200 3-5 mol之M6P含量(代表單M6P及雙M6P兩者)及每mol ATB200 4-7 mol之唾液酸含量。 實例4：ATB200及Myozyme®/Lumizyme®之分析比較

純化的ATB200及Lumizyme® N-聚醣係藉由MALDI-TOF評估來測定在每一ERT上發現的個別N-聚醣結構。Lumizyme®係自商業來源獲得。如第7圖所示，ATB200展現溶析至Lumizyme®右側的四個主峰。此證實ATB200經磷酸化至比Lumizyme®大的程度，因為此評估係藉由末端電荷而非CIMPR親和力進行。如第8圖中所概述，發現ATB200樣本比Lumizyme®含有較低量之非磷酸化高甘露糖型N-聚醣。

為評估Myozyme®及Lumizyme®中之習知rhGAA與CIMPR相互作用之能力，將兩個習知rhGAA製劑注射至CIMPR管柱(其結合具有M6P基團之rhGAA)上且隨後利用自由M6梯度溶析。將餾分收集在96孔板中且藉由4MU-α-葡萄糖底物分析GAA活性。結合及未結合rhGAA之相對量係基於GAA活性測定且報告為總酶之分數。第9A圖及第9B圖展示Myozyme®及Lumizyme®中之rhGAA之結合分佈：Myozyme®中73%之rhGAA (第9B圖)及Lumizyme®中78%之rhGAA (第9A圖)不結合至CIMPR。的確，Myozyme®中僅27%之rhGAA及Lumizyme®中22%之rhGAA含有可為生產性以使其靶向至肌細胞上之CIMPR的M6P。對比而言，如第5圖所示，在相同條件下，發現ATB200中多於70%之rhGAA結合至CIMPR。

除具有可結合至CIMPR的較大百分比之rhGAA之外，重要的是理解彼相互作用之品質。Lumizyme®及ATB200受體結合係使用CIMPR板結合檢定來測定。簡言之，CIMPR塗佈之板係用於俘獲GAA。將變化濃度之rhGAA應用於固定受體且洗掉未結合rhGAA。剩餘rhGAA之量係藉由GAA活性測定。如第10A圖所示，ATB200比Lumizyme®顯著更好地結合至CIMPR。第10B圖展示Lumizyme® (習知rhGAA產品)及根據本發明之ATB200中的雙M6P N-聚醣之相對含量。對Lumizyme®而言，存在平均僅10%的具有雙磷酸化N-聚醣之分子。對比而言，平均ATB200中每個rhGAA分子具有至少一個雙磷酸化N-聚醣。

總體上，ATB200中比Lumizyme®中含量更高的M6P N-聚醣指示ATB200中較高部分之rhGAA分子可靶向肌細胞。如上文所示，藉由MALDI測定的高百分比之單磷酸化及雙磷酸化結構符合CIMPR分佈，從而說明ATB200對CIMPR受體之顯著更大的結合。經由MALDI-TOF質譜法的N-聚醣分析證實平均每一ATB200分子含有至少一個天然雙M6P N-聚醣結構。ATB200上的此較高雙M6P N-聚醣含量在M6P受體板結合檢定中直接與對CIMPR之高親和力結合(KD約2-4 nM)相關。

ATB200及Lumizyme® rhGAA之相對細胞吸收係使用正常及龐貝症纖維母細胞系來比較。比較涉及5-100 nM之根據本發明之ATB200與10-500 nM的習知rhGAA產品Lumizyme®。在16 hr孵化之後，外部rhGAA係利用TRIS鹼鈍化且將細胞在收穫之前用PBS洗滌3次。藉由4MU-α-糖苷水解量測內在化GAA且相對於總細胞蛋白質作圖並將結果呈現在第11A圖-第11C圖中。

ATB200亦經顯示為有效地內在化於細胞中。如第11A圖-第11B圖中所描繪，ATB200內在化於正常及龐貝症纖維母細胞中，且比習知rhGAA產品Lumizyme®內在化至更大程度。ATB200在約20 nM下使細胞受體飽和，而需要約250 nM之Lumizyme®來使細胞受體飽和。自該些結果外推的吸收效率常數(K吸收)對ATB200而言為2-3 nm且對Lumizyme®而言為56 nM，如藉由第11C圖所示。該些結果暗示ATB200為用於龐貝氏症之良好靶向治療。 實例5：ATB200及藥理學伴護蛋白

在染料之螢光在蛋白質變性時增加時在使用SYPRO Orange之熱穩定性檢定中評估ATB200在酸性或中性pH緩衝液中之穩定性。如第12圖所示，以濃度依賴性方式添加pH 7.4之AT2221穩定化ATB200，相當於在pH 5.2下ATB200之穩定性，此為模擬溶酶體之酸性環境的條件。如表6中所概述，AT2221之添加使ATB200之熔融溫度(Tm)增加幾乎10℃。 表6. ATB200與AT2221組合之穩定性 實例6：在Gaa KO小鼠中共同投與ATB200及AT2221

在Gaa KO小鼠中評估ATB200及AT2221之治療效應且針對阿葡糖苷酶α之彼等治療效應進行比較。對於研究而言，使用雄性Gaa KO (3至4個月大)及年齡匹配的野生型(wild-type; WT)小鼠。阿葡糖苷酶α係經由推注尾部靜脈靜脈內(IV)注射來投與。在共同投與方案中，AT2221係經由口部胃管灌食法(PO)在ATB200之IV注射之前30分鐘投與。治療兩週一次給予。自最後一次投與14天之後犧牲所治療的小鼠且收集各種組織以供進一步分析。表7概述研究設計： 表7.共同投與研究設計

組織樣本中之組織肝醣含量係使用澱粉葡萄糖苷酶消化測定，如上文所論述。如第13圖所示，20 mg/kg ATB200及10 mg/kg AT2221之組合相較於相同劑量之阿葡糖苷酶α顯著地減少四種不同組織(四頭肌、三角肌、腓腸肌、及心臟)中之肝醣含量。

亦遵照論述於以下各項中之方法分析組織樣本之生物標誌物改變：Khanna R等人(2012), 「The pharmacological chaperone AT2220 increases recombinant human acid α-glucosidase uptake and glycogen reduction in a mouse model of Pompe disease」, Plos One 7(7): e40776；及Khanna, R等人(2014), 「The Pharmacological Chaperone AT2220 Increases the Specific Activity and Lysosomal Delivery of Mutant Acid α-glucosidase, and Promotes Glycogen Reduction in a Transgenic Mouse Model of Pompe Disease」, PLoS ONE 9(7): e102092。如第14圖所示，在Gaa KO動物之肌肉纖維中相較於WT看到LAMP1陽性囊泡之深度增加及擴大，指示溶酶體增殖。ATB200/AT2221之共同投與產生具有正常化LAMP1位準之更多纖維，而剩餘的LAMP1陽性囊泡亦在大小上減小(插圖)。

類似地，未治療Gaa KO小鼠之肌肉纖維中密集的LC3陽性聚集體表示自噬區之存在及自噬堆積。LC3陽性聚集體在利用ATB200/AT2221共同投與治療的小鼠中相較於利用阿葡糖苷酶α治療的小鼠優先減小(第15A圖)。當使用西方墨點評定LC3之表現時，得到類似的觀察結果。如第15B圖所示，利用ATB200/AT2221治療的大多數動物展示LC3 II之位準的顯著減少，該LC3 II為與自噬體相關聯的脂質化形式，從而暗示改善的自噬通量。比較而言，阿葡糖苷酶α對自噬之效應為適度的。

亦評定Dysferlin，其係涉及膜修復且其缺乏/錯誤運送與許多肌肉營養不良相關聯的蛋白質。如第16圖所示，dysferlin係猛烈地累積在Gaa KO小鼠之肌漿中。相較於阿葡糖苷酶α，ATB200/AT2221能夠在較大量之肌肉纖維中使dysferlin恢復至肌纖維膜。

該些資料與在細胞水平在利用ATB200及美格魯特治療的人類龐貝氏症患者(例如，患者展現位準減少的肝醣累積及肌肉損傷之生物標誌物)中證明的改善一致，從而不僅引起龐貝氏症之有效治療而且引起疾病進程之逆轉。人類龐貝氏症患者中之臨床資料係概括在下文實例8-13中。 實例7：單一纖維分析

如第17圖所示，大多數媒劑治療之小鼠展示粗略擴大的溶酶體(綠色)及大塊自噬堆積之存在(紅色)。Myozyme®治療之小鼠不展示相較於媒劑治療之小鼠的任何顯著差異。對比而言，自利用ATB200治療之小鼠分離的大多數纖維展示劇烈減小的溶酶體大小。此外，具有自噬堆積之區域亦減少達各種程度。作為結果，自ATB200治療之小鼠分析的肌肉纖維之大部分(36-60%)呈現為正常或接近正常的。下文表8概述第17圖中展示的單一纖維分析。 表8. 單一纖維分析

總體而言，資料指示：當投與至Gaa KO小鼠時，單獨的及藉由藥理學伴護蛋白AT2221在血液之中性pH下進一步穩定的具有其較高M6P含量之ATB200在組織靶向及溶酶體運送方面相較於阿葡糖苷酶α更有效，此與ATB200藉由AT2221之穩定化一致，如第18圖所描繪。作為結果，ATB200之投與及ATB200/AT2221之共同投與在校正一些疾病相關病理學諸如肝醣累積、溶酶體增殖、及自噬區形成方面比阿葡糖苷酶α更有效。由於該些積極治療效應，ATB200之投與及ATB200/AT2221共同投與經顯示改善肌肉纖維自破壞復原之機會且甚至藉由清除肝醣而逆轉破壞，該肝醣已由於缺乏最佳GAA活性而累積在細胞中。與實例6一樣，該些資料亦與在細胞水平在人類龐貝氏症患者中證明的改善一致，該等改善在ATB200及美格魯特之投與之後引起龐貝氏症之有效治療及疾病進程之逆轉。人類龐貝氏症患者中之臨床資料係概括在下文實例8-13中。 實例8：ATB200-02試驗：在患有龐貝氏症之患者中的ATB200/AT2221之非人類研究

在Gaa敲除小鼠中進行臨床前研究以評估在變化ATB200酶替代療法(enzyme replacement therapy；ERT)及AT2221伴護蛋白劑量下的藥物動力學(pharmacokinetics；PK)及肝醣減少之效率。該些資料係用於估計人類中可比較的AT2221伴護蛋白劑量。隨後將研究ATB200-02(NCT02675465)設計為開放標記固定序列、上升劑量、先於人類中、1/2期研究以評估在患有龐貝氏症之患者中ATB200與AT2221共同投與之安全性、可耐受性、PK、藥效學(pharmacodynamics；PD)、及功效。第19A圖-第19B圖呈現ATB200-02研究設計。先前已接收利用阿葡糖苷酶α之酶替代療法的有行動力之患者係稱為有行動力之ERT切換(或ERT切換有行動力)患者或群組1患者。先前已接收利用阿葡糖苷酶α之酶替代療法的無行動力之患者係稱為無行動力之ERT切換(或ERT切換無行動力)患者或群組2患者。先前未接收利用阿葡糖苷酶α之酶替代療法的有行動力之患者係稱為ERT原始(或ERT原始有行動力)患者或群組3患者。

五個國家的十六個臨床場所參與ATB200-02研究。研究使用以下關鍵納入標準：年齡18-65歲的男性及女性，其基於記載的GAA酶活性缺乏或GAA表現型而診斷為患有龐貝氏症，且在試驗起始之前已接收利用阿葡糖苷酶α之酶替代療法2-6年(群組1)(或對群組2是

2年)。合格受試者為當前正在以每隔一週之頻率接收阿葡糖苷酶α且已完成最後2次輸注而沒有造成劑量中斷的藥物有關不利事件(adverse event; AE)的彼等受試者(群組1及2)。受試者必須能夠在6分鐘步行測試(6-Minute Walk Test; 6MWT)步行200公尺與500公尺之間(群組1及3)，具有為預測正常值之30-80%的直立用力肺活量(forced vital capacity; FVC) (群組1及3)，或要坐輪椅且不能在無輔助情況下步行(群組2)。用於6MWT及FVC測試之方案可例如見於Lachman及Schoser, Journal of Rare Diseases, 2013, 8:160，及Bittner及Singh, The 6 Minute Walk Test, Cardiology Advisor, 2013。第19C圖提供20位受試者之基線特性。評定群組1、2及3之安全性、可耐受性、及生物標誌物。評定群組1及3之以下功能評定結果：6MWT、其他運動功能測試(時間測試及步態-樓梯-gower-椅子(gait-stair-gower-chair; GSGC))、徒手肌肉測試、及肺功能(FVC、最大吸氣壓(maximal inspiratory pressure; MIP)/最大呼氣壓(maximal expiratory pressure; MEP))。用於時間測試及GSGC測試之方案可例如見於Lachman及Schoser, Journal of Rare Diseases, 2013, 8:160。對於群組2，功能評定包括肌肉力量測試。實例 9 ： 來自 ATB200-02 試驗之期中 PK 結果

用於AT2221之藥物動力學資料之概要係提供於第20圖中。在5 mg/kg、10 mg/kg、及20 mg/kg下用於ATB200的血漿中之總GAA蛋白質濃度係藉由rhGAA特異性「署名」肽T09 (主要)及T50 (確認)之經驗證LC-MS/MS定量對完成階段1及2之11位群組1患者，以及完成階段3之PK研究的五位群組2患者進行測定。對於階段1，在開始ATB200輸注之前及在開始輸注之後的1、2、3、3.5、4、4.5、5、6、8、10、12、及24小時收集用於血漿總GAA蛋白質濃度的血液樣本。對於階段2及階段3，在開始輸注之前及在開始輸注之後的1、2、3、3.5、4、4.5、5、6、8、10、12、及24小時收集用於血漿總GAA蛋白質濃度的血液樣本。

亦對完成階段1及2的11位群組1患者，以及對完成階段3中之PK研究的五位群組2患者執行AT2221 PK分析。恰好在AT2221經口投與之前(時間0)及在AT2221經口投與之後的1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、9、11、及25小時獲取用於血漿AT2221濃度之血液樣本。血漿AT2221係藉由經驗證LC-MS/MS檢定來測定。

如第21圖所示，當單獨投與時，ATB200之位準以稍微大於劑量比例方式增加。20 mg/kg下之ATB200與單一高劑量(260 mg)之AT2221之共同投與使總GAA蛋白質暴露曲線下方面積(area under the curve; AUC)相較於以20 mg/kg單獨投與的ATB200增加大致17% (第21圖、第22C圖)。20 mg/kg下之ATB200與多個高劑量(260 mg)之AT2221之共同投與使總GAA蛋白質暴露曲線下方面積(area under the curve; AUC)相較於以20 mg/kg單獨投與的ATB200增加大致29% (第21圖、第22D圖)。在末端消除階段期間在對數尺度上觀察到分佈半衰期及部分AUC-24h之增加(第21圖、第22A圖、第22B圖)。如第21圖所示，分佈半衰期(α階段)增加40%，與血漿中高劑量AT2221對ATB200之穩定化效應一致。分佈半衰期之增加伴隨有自達到最大血漿濃度之時間至給藥後24小時的達到42.2%的部分AUC增加(第21圖、第22B圖)。在低劑量AT2221及高劑量AT2221對比單獨ATB200的給藥後12小時及24小時比較中觀察到藉由AT2221對ATB200穩定化之進一步證據(第22E圖及第22F圖)。在ERT原始(群組3)患者與ERT切換患者(群組1)之間不存在血漿總GAA蛋白質暴露之統計學顯著差異(第23圖)。署名肽T50之PK佈置並非不同於署名肽T09之彼者(AUC比率：1.00)。 實例10：來自ATB200-02試驗之期中功效結果

如第24A圖及第24B圖所示，在第6個月有行動力之ERT切換患者及ERT原始患者之6MWT改善並且直至第12個月觀察到持續益處。分別在第6個月、第9個月、及第12個月7/10、8/10、及8/8的ERT切換患者之6MWT增加。分別在第6個月、第9個月、及第12個月5/5、5/5、及2/2的ERT原始患者之6MWT增加。

如第24C圖、第26A圖、及第26C圖所示，運動功能測試及徒手肌肉力量連同6MWT之改善與ERT切換及ERT原始患者歷經12個月的肌肉功能之總體改善一致。

如第25圖及第26B圖所示，在第6個月及第9個月，在所有無行動力之ERT切換患者中觀察到上肢力量的一致及實質增加。

如第27圖所示，分別在第6個月、第9個月、及第12個月在5/9、6/9、及3/7的ERT切換患者中FVC為穩定或增加的，且分別在第6個月、第9個月、及第12個月在5/5、5/5、及2/2的ERT原始患者中FVC為穩定或增加的。亦如第27圖所示，在ERT切換有行動力之患者中最大吸氣壓(maximal inspiratory pressure; MIP)為穩定的且最大呼氣壓(maximal expiratory pressure; MEP)增加，而在ERT原始患者中MIP增加且MEP為穩定的。

疲勞嚴重程度量表(Fatigue Severity Scale;「FSS」)為由九個問題組成的自我評定調查表，每一問題在1至7之量表上記分。總記分範圍為9至63，其中較高值表示歸因於疾病病狀的較高疲勞程度。健康群體中之正常值為大致21(Grace J等人 Parkinsonism Relat Disord. 2007;13:443-445)。如第28圖所示，所有群組在基線受疲勞顯著影響，且所有群組在接收ATB200/AT2221之後證明其FSS之改善。 實例11：來自ATB200-02試驗之期中結果：肌肉損傷之標誌物

評定以下肌肉破壞標誌物：肌酸激酶(creatine kinase; CK)、丙胺酸轉胺酶(alanine aminotransferase; ALT)、及天冬胺酸轉胺酶(aspartate aminotransferase; AST)。臨床試驗之九個月之後可獲得的結果係報告在第29A圖-第29C圖中(來自分別對群組1、2、及3而言最多58週、24週、及36週之資料；較低n值反映一些資料不能被分析或尚未分析)。在該些相應時間點觀察到的自基線之平均減少對有行動力之ERT切換患者(n = 9)而言為大致30-35%，對無行動力之ERT切換患者(n = 4)而言為5-20%，且對ERT原始患者(n = 5)而言為40-55%。在臨床試驗之十二個月之後可獲得CK酶之結果係報告於第29D圖中(來自對群組1、2、及3而言最多12個月之資料；較低n值反映一些資料不能被分析或尚未分析)。

評定作為肝醣累積之標誌物的尿己糖四醣(Hex4)。在臨床試驗之十二個月之後可獲得Hex4之結果係報告於第29D圖中(來自對群組1、2、及3而言最多12個月之資料；較低n值反映一些資料不能被分析或尚未分析)。 實例12：來自ATB200-02試驗之期中安全性結果

治療之最長持續時間係歷經20個月。不利事件(adverse event; AE)大體為輕度及短暫的，其中跨於所有三個群組在歷經400次總輸注之後存在極低速率之輸注相關聯反應(小於1%)。該些事件發生係藉由標準預用藥來控制。

直至72週報告為治療有關的最普遍AE為噁心(3/20)、顫動(3/20)、頭痛(3/20)、疲勞(3/20)、腹瀉(2/20)、肌肉痙攣(2/20)、及關節腫脹(2/20)。

直至20+個月報告為治療有關的最普遍AE為腹痛(包括上腹痛及下腹痛) (8/20)、腹瀉(8/20)、鼻咽炎(6/20)、噁心(5/20)、頭痛(5/20)、及上呼吸道感染(5/20) (第30圖)。報告了一個嚴重AE，其與研究藥物無關(因下呼吸道感染而住院治療)。無患者由於AE而中斷研究。

在550+次輸注中發生三次輸注相關聯反應(infusion-associated reaction; IAR)，其係藉由標準預用藥來控制。在無行動力之ERT切換患者(群組2)中發生一個IAR事件(皮膚脫色)。在ERT原始患者(群組3)中發生兩個IAR事件(局部瘙癢、紅斑、及燒灼感) (第30圖)。 實例13：來自ATB200-02試驗之期中結果之概要及結論

如第31圖中所概述，來自ATB200-02試驗之期中資料存在一致性，從而證實肌肉損傷及底物累積之標誌物、肌肉功能測試(計時測試及耐久性)、徒手肌肉力量之顯著及意外的平行改善，以及跨於不同群組的呼吸功能測試之穩定及/或改善。分別在第6個月及第9個月在16/18及10/10的患者中肌肉功能有所改善。6MWT距離之增加在ERT切換有行動力之患者及ERT原始患者中直至第12個月係一致及持久的，在ERT切換有行動力之患者及ERT原始患者中其他運動功能測試之改善亦如此。定性及定量量測展示在第6個月及第9個月在無行動力之ERT切換患者中的上肢力量增加。FVC、MIP、及MEP在ERT切換患者中為大體上穩定的且在ERT原始患者中有所增加。在所有群組中觀察到疲勞記分之改善。生物標誌物位準(例如，CK及Hex4之位準)在所有群組中減少且ATB200/AT2221大體上良好耐受。

因此，療法之多維影響暗示ATB200/AT2221之組合方案有潛力成為用於患有龐貝氏症之患者的重要治療選項。該些臨床結果支援來自實例7中描述的單一纖維分析研究之結果，從而證明治療在自肌肉纖維清除病理學方面係有效的。臨床試驗之進一步研究仍在進行中。

601‧‧‧生物反應器603‧‧‧過濾系統605‧‧‧蛋白質俘獲系統607‧‧‧病毒殺死609‧‧‧第二層析法系統611‧‧‧病毒殺死613‧‧‧第三層析法系統615‧‧‧過濾系統617‧‧‧產品調整步驟

第1A圖展示非磷酸化高甘露糖N-聚醣、單M6P N-聚醣、及雙M6P N-聚醣。第1B圖展示M6P基團之化學結構。每一正方形表示N-乙醯葡萄胺糖(GlcNAc)，每一圓形表示甘露糖，且每一P表示磷酸鹽。

第2A圖描述rhGAA經由帶M6P之N-聚醣對靶組織(例如患有龐貝氏症之受試者之肌肉組織)的生產性靶向。第2B圖描述對非靶組織(例如肝及脾)之非生產性藥物清除或非M6P N-聚醣與非靶組織之結合。

第3圖為用於製造、俘獲及純化重組溶酶體蛋白質之示範性方法之示意圖。

第4圖展示利用編碼rhGAA之DNA轉變CHO細胞之DNA構築體。

第5圖為展示在利用(實施例2)及不利用(實施例1)陰離子交換(AEX)管柱上之俘獲的情況下ATB200 rhGAA之CIMPR親和力層析之結果的圖表。

第6A圖-第6H圖展示ATB200 rhGAA之位點特異性N-醣苷化分析之結果。第6A圖展示用於ATB200之七個潛在N-醣基化位點之位點佔用率。第6B圖展示用於ATB200的第一潛在N-醣基化位點之N-醣基化分佈的兩個分析。第6C圖展示用於ATB200的第二潛在N-醣基化位點之N-醣基化分佈的兩個分析。第6D圖展示用於ATB200的第三潛在N-醣基化位點之N-醣基化分佈的兩個分析。第6E圖展示用於ATB200的第四潛在N-醣基化位點之N-醣基化分佈的兩個分析。第6F圖展示用於ATB200的第五潛在N-醣基化位點之N-醣基化分佈的兩個分析。第6G圖展示用於ATB200的第六潛在N-醣基化位點之N-醣基化分佈的兩個分析。第6H圖概述第一、第二、第三、第四、第五、及第六潛在N-醣基化位點之單磷酸化及雙磷酸化物種的相對百分比。

第7圖為展示Lumizyme® (阿葡糖苷酶α，較細線，溶析至左側)及ATB200 (較粗線，溶析至右側)之Polywax溶析分佈之圖表。

第8圖為展示Lumizyme®相較於識別為BP-rhGAA、ATB200-1及ATB200-2的ATB200 rhGAA之三種不同製劑的N-聚醣結構之摘要的表。

第9A圖及第9B圖分別為展示Lumizyme®及Myozyme®之CIMPR親和力層析之結果的圖表。

第10A圖為將ATB200 rhGAA之CIMPR結合親和力(左側跡線)與Lumizyme®之彼CIMPR結合親和力(右側跡線)比較的圖表。第10B圖為比較Lumizyme®及ATB200 rhGAA之雙M6P含量的表。

第11A圖為在各種GAA濃度下比較正常纖維母細胞內部ATB200 rhGAA活性(左側跡線)與Lumizyme® rhGAA活性(右側跡線)之圖表。第11B圖為在各種GAA濃度下比較來自患有龐貝氏症之受試者的纖維母細胞內部ATB200 rhGAA活性(左側跡線)與Lumizyme® rhGAA活性(右側跡線)之表。第11C圖為比較來自正常受試者及患有龐貝氏症之受試者的纖維母細胞之K_吸收 的表。

第12圖描繪在染料之螢光在蛋白質變性時增加時在使用SYPRO Orange之熱穩定性檢定中評估的ATB200在酸性或中性pH緩衝液中之穩定性。

第13圖展示使用澱粉葡萄糖苷酶消化測定的WT小鼠或利用媒劑、阿葡糖苷酶α、或ATB200/AT2221治療的Gaa KO小鼠之組織肝醣含量。柱條表示7只小鼠/組之平均值±SEM。* p＜0.05，在單向ANOVA分析下使用鄧奈特方法進行的多重比較中相較於阿葡糖苷酶α而言。

第14圖描繪利用媒劑、阿葡糖苷酶α、或ATB200/AT2221治療的Gaa KO小鼠或WT小鼠之肌肉纖維中的LAMP1陽性囊泡。影像係自外股肌獲取且表示每組7只小鼠。放大率= 200x (插圖為1,000x)。

第15A圖展示利用媒劑、阿葡糖苷酶α、或ATB200/AT2221治療的Gaa KO小鼠或WT小鼠之肌肉纖維中的LC3陽性聚集體。影像係自外股肌獲取且表示每組7只小鼠。放大率= 400x。第15B圖展示LC3 II蛋白質之西方墨點分析。每一泳道加載總共30 mg蛋白質。

第16圖展示利用媒劑、阿葡糖苷酶α、或ATB200/AT2221治療的Gaa KO小鼠或WT小鼠之肌肉纖維中的Dysferlin表現。影像係自外股肌獲取且表示每組7只小鼠。放大率= 200x。

第17圖描繪自利用媒劑、阿葡糖苷酶α、或ATB200治療的Gaa KO小鼠之白色腓腸肌分離的單個纖維中LAMP1 (綠色)及LC3 (紅色)之共免疫螢光染色。自每一動物檢查最少30個纖維。

第18圖描繪相較於單獨的ATB200，分別在17 μM及170 μM AT2221下 ATB200藉由AT2221之穩定。

第19A圖及第19B圖展示ATB200-02研究設計。低劑量= 130 mg。高劑量= 260 mg。在第26A圖中，「6MWT」= 6分鐘步行測試；「FVC」=用力肺活量；「QOW」=每隔一週。「a」=在群組2及3中給藥之前，在每一劑量位準下審查來自群組1的2位警哨患者之安全資料；「b」=在階段2及3期間，在開始ATB200靜脈內輸注之前經口投與AT2221。針對所有劑量，ATB200係靜脈內輸注4小時之持續時間。「c」=群組2及3中之前2位患者用作其相應群組的警哨患者。第19C圖概述跨於群組1、2、及3登記的患者之基線特性。「NA」=不適用。「SD」=標準偏差。「a」=要求群組1患者在基線服用阿葡糖苷酶α達2-6年。LOPD = 晚發型龐貝氏症。

第20圖描繪AT2221之藥物動力學資料。「AUC」=曲線下方面積；「CL/F」=針對AT2221經口生物可用性調整的血漿清除率；「C_max 」=最大藥物濃度；「CV」= 變異係數；「t_1/2 」=半衰期；「t_max 」=達到最大藥物濃度之時間；「V_Z /F」=針對AT2221經口生物可用性調整的表觀終末期分佈體積。「a」=幾何平均值(CV%)；「b」=中值(min-max)；「c」=算術平均值(CV%)。

第21圖描繪群組1及3的藉由署名肽(signature peptide) T09的總GAA蛋白質。「AUC」=曲線下方面積；「CL_T 」=全身清除率；「C_max 」=最大藥物濃度；「CV」=變異係數；「MD」=多劑量；「t_1/2 」=半衰期；「t_max 」=達到最大藥物濃度之時間；「F_rel 」=單獨的20 mg/kg ATB 200及單獨的10 mg/kg ATB200對比單獨的5 mg/kg ATB200，及20 mg/kg ATB200 +低劑量或高劑量AT2221相對單獨的20 mg/kg ATB200之AUC比率。「a」=幾何平均值(CV%)；「b」=中值(min-max)；「c」=算術平均值(CV%)；「d」= n = 11；「e」= n = 5。低劑量= 130 mg。高劑量= 260 mg。

第22A圖、第22B圖、第22C圖、第22D圖、第22E圖、及第22F圖按群組描繪總GAA蛋白質。低劑量= 130 mg。高劑量= 260 mg。第22A圖展示群組1 (單劑量)之平均總GAA蛋白質濃度-時間分佈。第22B圖展示群組1 (多劑量)之平均總GAA蛋白質濃度-時間分佈。第22C圖展示群組1對比群組3 (單劑量)之平均總GAA蛋白質濃度-時間分佈。第22D圖展示群組1對比群組3 (多劑量)之平均總GAA蛋白質濃度-時間分佈。第22E圖展示在給藥後12小時與20 mg/kg ATB200進行的總GAA蛋白質比較；* = p＜0.05；** = p ＜0.01；*** p＜0.001。第22F圖展示在給藥後24小時與20 mg/kg ATB200進行的總GAA蛋白質比較；* = p＜0.05；** = p ＜0.01；「ns」= 不顯著。

第23圖展示對藉由署名肽T09的總GAA蛋白質之變異數分析(analysis of variance; ANOVA)。曲線下方面積(area under the curve; AUC)係以μg-h/mL提供；「CI」=信賴區間。

第24A圖描繪來自6分鐘步行測試(6-Minute Walk Test;「6MWT」)之分析及可利用期中資料之概要，展示群組1及群組3中之患者的在第6個月、第9個月、及第12個月時自基線之變化(change from baseline;「CFBL」)。

第24B圖描繪個別群組1及群組3患者之6MWT資料。

第24C圖描繪來自其他運動功能測試：計時起立行走運動功能測試；4層樓梯攀爬測試；十公尺(10M)步行測試；Gowers氏測試；及步態-樓梯-gower-椅子(gait-stair-gower-chair; 「GSGC」)運動功能測試之分析及可利用期中資料之概要，展示群組1及群組3中之患者的在第6個月、第9個月、及第12個月時自基線之變化(change from baseline;「CFBL」)。GSGC為以下四種運動功能評定之觀察者分級組合記分：步態(10公尺步行)、4層樓梯攀爬、Gowers氏(自地板站立)、及自椅子坐起。每一測試自1 (正常)至7 (無法執行；針對自椅子坐起之測試最大記分為6)記分。總記分範圍為4至27。「a」 = n=9，未獲得的缺失值係歸因於患者拒絕執行測試；「b」 = 自基線之中值變化為-1.5，且7/9之患者具有減少量；「c」=自基線之中值變化為-0.8，且4/5之患者具有減少量。

第25圖描繪來自肌肉力量測試(QMT)之分析及可利用期中資料之概要，展示群組2中之患者的在第6個月及第9個月時自基線之變化(change from baseline;「CFBL」)。QMT =定量肌肉測試。所展示值表示右側及左側組合的力之磅數。「a」= 對一位受試者肩膀內收不可用；「b」=記分：(1)可見肌肉移動，但在關節處無移動；(2)在關節處移動，但不對抗重力；(3)對抗重力之移動，但不對抗附加的阻力；(4)對抗阻力的移動，但不及正常狀態；(5)正常力量。

第26A圖描繪群組1患者中來自徒手肌肉測試(manual muscle test; MMT)之分析及可利用期中資料之概要。對上身(最大記分：40)、下身(最大記分：40)、及全身(最大記分：80)計算MMT記分。在群組1患者中，在第6個月、第9個月、及第12個月時觀察到徒手肌肉力量之增加。「SD」=標準偏差。

第26B圖描繪群組2患者中來自徒手肌肉測試(manual muscle test; MMT)之分析及可利用期中資料之概要。對上身(最大記分：40)計算MMT記分。在群組2患者中，在第6個月及第9個月時觀察到徒手肌肉力量之增加。「SD」=標準偏差。MMT結果大體上與QMT結果一致(第28圖中展示)。

第26C圖描繪群組3患者中來自徒手肌肉測試(manual muscle test; MMT)之分析及可利用期中資料之概要。對上身(最大記分：40)、下身(最大記分：40)、及全身(最大記分：80)計算MMT記分。在群組3患者中，在第6個月、第9個月、及第12個月之每一者時觀察到徒手肌肉力量之增加。「SD」=標準偏差。

第27圖描繪來自坐立用力肺活量(「FVC」)、最大吸氣壓(「MIP」)、及最大呼氣壓(「MEP」)之分析及可利用期中資料之概要，展示群組1及群組3中之患者的在第6個月、第9個月、及第12個月時自基線之變化(change from baseline;「CFBL」)。「a」=對一位受試者FVC不可用。MEP及MIP係以cmH₂ O量測。

第28圖描繪來自疲勞嚴重程度量表(Fatigue Severity Scale;「FSS」)之分析及可利用期中資料之概要，該疲勞嚴重程度量表係一種由九項問題組成的自我評定調查表，每一問題以1至7之量表來記分。總記分範圍為9至63，其中較高值表示歸因於疾病病狀的較高疲勞程度。健康群體中之正常值為約21。第28圖展示群組1、群組2、及群組3中之患者的在第6個月、第9個月、及第12個月時自基線之變化(change from baseline;「CFBL」)。

第29A圖-第29C圖描繪所有患者群組中標誌物損傷之標誌物(丙胺酸轉胺酶、天冬胺酸轉胺酶、及肌酸激酶)的自基線之平均變化百分比。第29A圖描繪歷經58週來自群組1患者之資料，第29B圖描繪歷經24週來自群組2患者之資料，且第29C圖描繪歷經36週來自群組3患者之資料。第29D圖描繪群組1、群組2、及群組3中之患者的直至12個月的肌肉損傷之標誌物(CK =肌酸激酶)及疾病底物之標誌物(Hex4 =尿己糖四醣)的自基線之平均變化百分比。「BL」=基線。「SE」=標準誤差。「WK」=週。「M」=月。

第30圖概述來自ATB200-02研究之安全資料。「AE」=不利事件。「IAR」=輸注相關聯反應；「a」=經由期中資料分析報告(最多20+個月)；「b」= 包括上腹痛及下腹痛。

第31圖概述來自ATB200-02研究的可利用功效及安全資料。

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國外寄存資訊 (請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無

Claims (9)

1. 一種用於治療有需要之一受試者的龐貝氏症(Pompe disease)之包含重組人類酸性α-葡萄醣苷酶(rhGAA)分子之一群體的組合物，其中該等rhGAA分子是生產自中國倉鼠卵巢(CHO)細胞；其中該等rhGAA分子包含七個潛在N-醣基化位點；其中該等rhGAA分子平均包含3-4個甘露糖-6-磷酸酯(M6P)殘基；其中藉由使用液相層析-串聯式質譜法(LC-MS/MS)測定，該等rhGAA分子在第一潛在N-醣基化位點處，每mol rhGAA平均包含至少約0.8mol雙甘露糖-6-磷酸酯(bis-M6P)；其中rhGAA分子之該群體係與一藥理學伴護蛋白並行地或順序地投與，且其中該藥理學伴護蛋白為美格魯特(miglustat)或其醫藥學上可接受的鹽；其中rhGAA分子之該群體係以約20mg/kg之一劑量靜脈內投與，以及該美格魯特或其醫藥學上可接受的鹽係以約260mg至之一劑量口服投與；且其中(i)該受試者為ERT切換患者，以及相較於基線，在治療之後六個月時藉由直立用力肺活量(FVC)測試來量測，該受試者的肺功能為穩定或改善的；及/或 (ii)該受試者為一有行動力之ERT切換患，以及相較於基線，在治療之後六個月時該受試者之肌酸激酶位準減少至少15%；及/或(iii)該受試者為一無行動力之ERT切換患，以及相較於基線，在治療之後六個月時該受試者之肌酸激酶位準減少至少20%；及/或(iv)該受試者為ERT切換患者，以及相較於基線，在治療之後六個月時該受試者之尿己糖四醣位準減少至少35%。
2. 如請求項1所述之用途的組合物，其中該美格魯特或其醫藥學上可接受的鹽係在該rhGAA之投與之前投與。
3. 如請求項1或請求項2所述之用途的組合物，其中該等rhGAA分子包含與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5至少95%一致的一胺基酸序列。
4. 如請求項1或請求項2所述之用途的組合物，其中藉由使用LC-MS/MS測定，該等rhGAA分子包含每mol rhGAA平均約0.5mol至約7.0mol之單M6P或雙M6P。
5. 如請求項1或請求項2所述之用途的組合物，其中藉由使用LC-MS/MS測定，該等rhGAA分子包含每mol rhGAA平均至少2.5mol之M6P及每mol rhGAA至少4mol唾液酸。
6. 如請求項1或請求項2所述之用途的組合物，其中，每mol rhGAA，該等rhGAA分子包含平均：(a)在第二潛在N-醣基化位點處約0.4至約0.6mol單M6P；(b)在第四潛在N-醣基化位點處約0.4至約0.6mol雙M6P；及(c)在第四潛在N-醣基化位點處約0.3至約0.4mol單M6P；其中使用LC-MS/MS測定(a)~(c)。
7. 如請求項1或請求項2所述之用途的組合物，其中，每mol rhGAA，該等rhGAA分子進一步包含約4mol至約7.3mol唾液酸；且其中，每mol rhGAA，該等rhGAA分子包含平均：(a)在第三潛在N-醣基化位點處約0.9至約1.2mol唾液酸；(b)在第五潛在N-醣基化位點處約0.8至約0.9mol唾液酸；及(c)在第六潛在N-醣基化位點處約1.5至約4.2mol唾液酸；其中使用LC-MS/MS測定(a)~(c)。
8. 如請求項1或請求項2所述之用途的組合物，其中rhGAA分子之該群體係以一醫藥組合物調配， 且其中該醫藥組合物進一步包含至少一種緩衝液及至少一種賦形劑，該至少一種緩衝液選自由檸檬酸鹽、磷酸鹽及前述之組合組成之群，該至少一種賦形劑選自由甘露醇、聚山梨醇酯80及前述之組合組成之群；其中該醫藥組合物具有約5.0至約7.0之一pH。
9. 如請求項1或請求項2所述之用途的組合物，其中在該醫藥組合物，rhGAA分子之該群體係以約5-50mg/mL之一濃度存在，該至少一種緩衝液為以約10-100mM之一濃度存在的檸檬酸鈉緩衝液，該至少一種賦形劑為以約10-50mg/mL之一濃度存在的甘露醇及以約0.1-1mg/mL之一濃度存在的聚山梨醇酯80，且該醫藥組合物進一步包含水及視情況包含一酸化劑及/或鹼化劑；其中該醫藥組合物具有約6.0之一pH。