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TWI848946B - 包含異種尿路上皮細胞的組合物的用途 - Google Patents

包含異種尿路上皮細胞的組合物的用途 Download PDF

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TWI848946B
TWI848946B TW108116427A TW108116427A TWI848946B TW I848946 B TWI848946 B TW I848946B TW 108116427 A TW108116427 A TW 108116427A TW 108116427 A TW108116427 A TW 108116427A TW I848946 B TWI848946 B TW I848946B
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黃志平
吳羣傑
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中國醫藥大學
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Abstract

本發明提供了一種從哺乳動物來源培養尿路上皮細胞的方法以及本發明還提供治療患有膀胱炎、尿路上皮癌或膀胱癌的受試者的方法，包括向受試者膀胱內施用有效量的包含尿路上皮幹細胞、尿路上皮前驅細胞、細胞基質分子的組合物和多醣。

Description

包含異種尿路上皮細胞的組合物的用途
本發明涉及用於分離和擴增哺乳動物尿路上皮細胞以治療膀胱相關疾病的方法和組合物。特別地，本發明涉及使用仿生培養系統來獲得具有增生潛力的尿路上皮細胞，並在基質溶液中使用分離的細胞來治療尿路上皮功能障礙。具體地，本發明涉及用於治療具有尿路上皮損傷(例如膀胱炎和尿路上皮癌)的膀胱的方法和組合物，以修復、活化和恢復免疫系統和尿路上皮功能。具體地，本發明涉及一種新技術和用於使用異種細胞源修復受損的尿路上皮和恢復免疫系統以治療膀胱炎和尿路上皮癌的用途。
膀胱炎和尿路上皮癌等尿路上皮損傷可導致尿路上皮癌(一種主要形式的膀胱癌)的嚴重發病甚至死亡。膀胱癌(BCa)是一種全世界常見疾病，為全世界發病率和死亡率的主要原因，每年估計有429,800例病例，且估計每年導致165,100例死亡。BCa分為兩類：75%的屬於初期、乳頭狀和通常表淺的非肌肉浸潤性膀胱癌(NMIBC)，其預後良好；另外，接近25%的屬於後期的肌肉浸潤性膀胱癌(MIBC)。大約30%的新診斷的淺表性膀胱腫瘤是多灶性的，並且多灶性膀胱癌的發生可以通過“區域癌化”效應來解釋，環境暴露於潛在的致癌物質可以解釋大多數膀胱癌病例，但在大多數情況下，多灶性尿路上皮癌是單克隆的，來自腔內接種和單個 轉化細胞的上皮內遷移，隨後的遺傳變異為可變。一開始，60-70%的表面非肌肉浸潤性膀胱癌(NMIBC)將復發，其中10-20%會進展為肌肉浸潤性或轉移性疾病。經尿道膀胱腫瘤切除術(TUR)治療淺表性膀胱腫瘤以及以膀胱內注射(BCG)輔助免疫治療或化療後經尿道切除所有可見膀胱腫瘤(TURBT)，但復發率仍然高。幾十年來，使用活的減毒形式的牛分枝桿菌進行膀胱內BCG免疫治療用以治療高危險的淺表性膀胱癌復發一直是標準的治療方法。膀胱內灌注BCG的確切抗腫瘤機制尚不清楚，但各種局部免疫反應，如：CD4-T細胞浸潤的誘導，可能持續數月並且似乎與腫瘤抑制作用有相關。由於引入活細菌，BCG可引起嚴重的膀胱炎，甚至由於BCG敗血症導致的死亡。此外，對於具有根治性膀胱切除術和全身化療的肌肉浸潤性膀胱癌(MIBC)，至少50%的膀胱癌患者仍將在診斷後2年內死於轉移。更為迫切的是，在轉移性的膀胱癌病人中，95%化療失敗的病人，其五年內存活率低於10%。其原因可能是所有療法不但殺死了癌細胞，同時也破壞正常細胞並且刺激發炎反應，因此提供了癌細胞再生長的機會，甚至以更惡性的形式再復發。在美國，膀胱癌的高複發率導致每位患者的醫療費用達到96,000美元至187,000美元(從診斷到死亡，是所有癌症中最高的)，估計2010年的成本為39.8億美元。這些負擔是由於目前針對膀胱癌的療法(手術、免疫療法和化學療法)的無能。膀胱炎或膀胱發炎反應是由化學、生物或物理刺激造成膀胱和/或輸尿管粘膜表面的炎症。患有膀胱炎的患者可能會出現緊急情況，小體積尿頻以及排尿時疼痛的灼燒感。此外，患者還可能患有上恥骨疼痛、側腹或背痛。這些膀胱炎症狀對生活質量產生深遠的不利影響。有幾種主要類型的膀胱炎包括：出血性膀胱炎(HC)，這種類型的膀胱炎在接受大劑量化療的癌症患者中很常見，如果嚴重，可能是致命的。在化療誘導的膀胱炎中，HC是由丙烯醛的尿液排泄引起的，丙烯醛是環磷酰胺的肝代謝物，其導致進行性粘膜損傷。此外，通過放射療法治療骨盆腫瘤(例如：前列腺癌或宮頸癌) 期間的電離輻射也可能通過損傷尿粘膜導致出血性膀胱炎。然而，目前可用的膀胱炎療法雖然有效，但僅提供部分解決和緩解，因此沒有最佳治療方法。
本發明提供了一種從哺乳動物來源培養尿路上皮細胞的方法，包括：(a)從哺乳動物來源獲得膀胱組織樣品；(b)將尿路上皮與膀胱組織樣本的粘膜層解離；(c)從膀胱組織樣本中分離解離的尿路上皮細胞；(d)在仿生培養系統上種植解離的尿路上皮細胞；和(e)在仿生環境和培養基中培養解離的尿路上皮細胞，其中解離的尿路上皮細胞包括尿路上皮幹細胞、尿路上皮前驅細胞和其成熟細胞。
本發明還提供治療患有膀胱炎、尿路上皮癌或膀胱癌的受試者的方法，包括向受試者膀胱內施用有效量的包含尿路上皮幹細胞、尿路上皮前驅細胞、細胞基質分子的組合物和多醣。
本發明提供了用於從哺乳動物膀胱組織培養尿路上皮細胞的方法。需要產生用於膀胱內尿道上皮細胞療法的正常尿路上皮細胞的方法。除了具有其他期望的特性之外，本發明還涉及解決該需求的解決方案。需要分離和擴增尿路上皮細胞的方法。除了具有其他期望的特性之外，本發明還涉及解決該需求的解決方案。
在一個方面，本發明提供了用於培養來自不同哺乳動物來源的尿路上皮細胞的方法，包括人、豬、牛和馬來源，該方法包括以下步驟：第一步，從哺乳動物來源移除膀胱組織。第二步，使用酶和物理程序從膀胱組織的粘膜層切開尿路上皮。第三步，分離解離的尿路上皮細胞並在仿 生環境中培養細胞，該仿生環境由類似基底膜組成以提供貼附細胞培養的支持；在包含胎牛血清、細胞基質、生長因子和信號傳導途徑調節劑的培養基中。在仿生系統中，解離的尿路上皮細胞隨尿路上皮/前驅細胞擴增。
該方法包括使包含尿路上皮幹/前驅細胞，其前驅或成熟細胞的細胞群與有效量的生長因子、細胞外基質和信號傳導途徑調節劑接觸，以維持幹/前驅細胞群並擴增前驅細胞和增加總細胞數。
根據本發明內容，該時期包括3天至10天。根據本發明內容，細胞培養物群含有至少50%和90%的尿路上皮幹/前驅細胞。該分離的尿路上皮幹/前驅細胞或其群體表達了尿路上皮幹/前驅細胞標記基因。
根據本發明的一個實施方案，提供了包含分離的尿路上皮幹/前驅細胞和細胞基質的組合物。根據本發明的一個實施方案，公開了一種治療有此需要的受試者的方法。該方法包括膀胱內給予有需要的受試者包含分離的尿路上皮幹/前驅細胞和細胞基質的組合物。根據本發明的內容，受試者患有肌肉浸潤性膀胱癌或具有增加的肌肉浸潤性膀胱癌的風險。
本發明涉及用於來自受試者的哺乳動物膀胱的尿路上皮細胞的仿生培養的方法。例如，本發明還涉及從豬膀胱快速有效地分離和擴增尿路上皮幹/前驅細胞的新方案。這些擴增的尿路上皮幹/前驅細胞可用於治療尿路上皮功能障礙，例如膀胱炎和尿路上皮癌。該領域的先前工作尚未使用仿生培養物來培養來自膀胱組織的尿路上皮幹/前驅細胞以治療尿路上皮損傷。以前的研究僅在二維環境中培養細胞，並且沒有重現尿道上皮細胞的天然生長和維持條件，沒有基質和信號調節。
在一個實施方案中，受試者是動物。在其他實施方案中，受試 者是人。在其他實施方案中，受試者是哺乳動物。在一些實施方案中，受試者是囓齒動物，例如小鼠或大鼠。在一些實施方案中，受試者是牛，豬，綿羊，山羊，貓，馬，狗和/或用作牲畜或作為寵物飼養的任何其他動物物種。
擴增的尿路上皮細胞的表型可以通過評估標誌物來確定。可以通過本領域已知的多種方法評估標誌物的表達。可以在DNA、RNA或多肽表現量確定標記的存在。在一個實施方案中，該方法可包括檢測標誌物基因多肽表達的存在。多肽表達包括標記基因多肽序列的存在或不存在。這些可以通過本領域已知的各種技術檢測，包括通過測序和/或結合特定配體(例如抗體)。例如，可以通過包括但不限於免疫染色、細胞流式儀的分析或西方墨點法評估多肽表達。這些方法在本領域中是公知的。
在另一個實施方案中，該方法可以包括檢測在尿路上皮細胞中標誌物基因(例如：p63、Ki-67、CK5、CK8、CK14、CK20或其組合)RNA表達的存在。RNA表達包括RNA序列的存在、RNA剪接或加工的存在或一定量RNA的存在。這些可以通過本領域已知的各種技術檢測，包括通過測序全部或部分標記基因RNA，或通過選擇性雜交或選擇性擴增全部或部分RNA。
根據本發明的一個實施方案，提供了治療有此需要的受試者的方法。在一個實施方案中，本發明涉及膀胱膀胱炎的治療以修復受損的尿路上皮。
該方法需要向有此需要的受試者施用一分離細胞外基質的培養基中擴增的尿路上皮細胞群。在一些方面，受試者患有膀胱炎。通過本發 明的方法產生的擴增的尿路上皮細胞可以膀胱內施用於受試者以治療膀胱炎。在一些方面，受試者患有尿路上皮癌。在一些方面，向受試者施用包括膀胱內施用的尿路上皮細胞進入受試者。受試者可以是人受試者或動物受試者。
在一些實施方案中，本發明涉及膀胱癌的治療以修復受損的尿路上皮並恢復抗腫瘤免疫。
在一些方面，治療方法還包括將細胞結合至含有基質的培養基中。在給予患者之前，細胞可以在基質培養基中體外維持。
在一個實施方案中，培養基包含鹼性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)。在另一個實施方案中，培養基不包含bFGF。在一個實施方案中，培養基包含抗生素-抗真菌劑。在另一個實施方案中，培養基不包含抗生素-抗真菌劑。
在一個實施方案中，培養基包含血清，包括但不限於胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)。在另一個實施方案中，培養基不包含血清，包括但不限於FBS。在一個實施方案中，培養基包含ROCK(A Rho kinase)抑制劑。在另一個實施方案中，培養基不包含ROCK抑制劑。在一個實施方案中，培養基包含骨塑型蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)抑制劑。在另一個實施方案中，培養基不包含BMP抑制劑。在一個實施方案中，培養基包含WNT(Wnt/beta-catenin)活化劑。在另一個實施方案中，培養基不包含WNT活化劑。
在一個實施方案中，培養基包含細胞外基質。在另一個實施方案中，培養基不包含細胞外基質。在一個實施方案中，培養基包含基質膠 (Matrigel)。在另一個實施方案中，培養基不包含基質膠(Matrigel)。
在一個實施方案中，將擴增的尿路上皮細胞在細胞培養基中溫育。在一個實施方案中，細胞培養基是Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)。在另一個實施方案中，細胞培養基是Dulbecco改良的Eagle培養基/營養混合物F-12(DMEM/F-12)。在一個實施方案中，細胞培養基補充有FBS。
在一個實施方案中，將組織樣品，例如尿路上皮樣品，被解離成單細胞懸浮液。在另一個實施方案中，組織樣品，例如尿路上皮樣品，被解離成細胞簇。
在一個實施方案中的組織樣品，例如尿路上皮樣品，利用機械力促使解離。在一個實施方案中，通過用剪刀切碎促使解離組織樣品。
在一個實施方案中的組織樣品，例如尿路上皮樣品，以酵素促進分離。在一個實施方案中，通過將組織與補充有膠原酶(collagenase)的細胞培養基一起溫育，使組織樣品以酵素促進分離。膠原酶可以分解組織中的膠原蛋白。
在一個實施方案中，通過將組織與補充有透明質酸酶(hyaluronidase)的細胞培養基一起溫育，使組織樣品，例如尿路上皮樣品，以酵素促進分離。透明質酸酶可以分解組織中發現的透明質酸。
在一個實施方案中，通過將組織與補充有分散酶II(Dispase II)的細胞培養基一起溫育，使組織樣品，例如尿路上皮樣品以酵素促進分離。分散酶II可以分解組織中發現的膠原蛋白。
在一個實施方案中，細胞培養基補充有膠原酶(collagenase)、透 明質酸酶(hyaluronidase)和分散酶II(Dispase II)。
在一個實施方案中，將解離的組織細胞懸浮液，例如解離的尿路上皮細胞懸浮液通過40μm細胞過濾器過濾。在一個實施方案中，將解離的組織細胞懸浮液通過70μm細胞過濾器過濾。在另一個實施方案中，將解離的組織細胞懸浮液通過100μm細胞過濾器過濾。
細胞可以通過它們從先前的培養物轉移到具有新鮮培養基的培養物來繼代。在一個實施方案中，誘導的上皮細胞在細胞培養物中穩定維持至少3次繼代，至少4次繼代，至少5次繼代，至少6次繼代，至少7次繼代，至少8次繼代，至少9次繼代，至少10次繼代，至少11次繼代，至少12次繼代，至少13次繼代，至少14次繼代，至少15次繼代，至少20次繼代，至少25次繼代或至少30次繼代。
在一個實施方案中，通過向每個孔中加入Dispase製備細胞，例如尿路上皮細胞用於繼代。在一個實施方案中，通過向每個孔中添加胰蛋白酶(Trypsin)來繼代細胞，例如尿路上皮細胞。
培養基還可以選擇性地補充來自以下任何類別的一種或多種組分：(1)鹽，例如：鎂，鈣和磷酸鹽；(2)激素和其他生長因子，如：血清、胰島素、轉鐵蛋白、表皮生長因子和成纖維細胞生長因子；(3)蛋白質和組織水解產物，例如：蛋白腖或蛋白腖混合物，其可以從純化的明膠，植物材料或動物副產物中獲得；(4)核苷和鹼，如：腺苷、胸苷和次黃嘌呤；(5)緩衝液，如：HEPES；(6)抗生素，如：慶大霉素或氨芐青黴素；(7)細胞保護劑，例如：pluronic多元醇；和(8)半乳糖。
可以在適合於培養的特定細胞或類器官的培養基中製備與本發 明一起使用的尿路上皮細胞。在一個實施方案中，培養基可以是上述(例如：DMEM或DMEM/F-12培養基)之一，其補充有來自哺乳動物來源的血清(例如：胎牛血清)。
在一個方面，本發明提供尿道上皮細胞，其中尿路上皮細胞通過以下方法獲得：(a)從受試者獲得膀胱組織樣品；(b)分離尿路上皮；(c)從膀胱組織樣本中分離解離的尿路上皮細胞；(d)將步驟(c)所分離的膀胱上皮細胞接種在仿生培養系統上；和(e)在包含FBS、信號傳導途徑調節劑和細胞外基質分子和多醣的培養基中培養解離的尿路上皮細胞；其中解離的尿路上皮細胞包括尿路上皮幹細胞、尿路上皮前驅細胞和其成熟細胞。
細胞外基質分子選自蛋白多醣、非蛋白多醣多醣、透明質酸、膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白。
本文描述的任何治療應用可以應用於需要這種膀胱內細胞療法的任何受試者，包括例如哺乳動物，例如狗、貓、牛、馬、兔、猴、豬、羊、山羊或人。
本發明提供了一種從哺乳動物來源培養尿路上皮細胞的方法，包括：(a)從哺乳動物來源獲得膀胱組織樣品；(b)將尿路上皮與膀胱組織樣本的粘膜層解離；(c)從膀胱組織樣本中分離解離的尿路上皮細胞；(d)在仿生培養系統上接種該解離的尿路上皮細胞；和(e)在仿生環境和培養基中培養該解離的尿路上皮細胞，其中該解離的尿路上皮細胞包括尿路上皮幹細胞、尿路上皮前驅細胞和成熟細胞。
在一個實施方案中，哺乳動物來源選自人、豬、牛或馬來源。在一個實施方案中，通過酵素和物理方法處理解離。在一個實施方案中，仿 生培養系統包含用於貼壁細胞培養支持的類基底膜支持物。在一個實施方案中，培養基選自FBS、細胞基質、生長因子和信號傳導途徑調節劑。在一個實施方案中，培養基包含bFGF和/或抗生素-抗真菌劑。在一個實施方案中，培養基包含血清、ROCK抑制劑、BMP抑制劑和/或WNT活化劑。在一個實施方案中，培養基包含細胞外基質分子和多醣。在一個實施方案中，細胞外基質分子選自蛋白多醣、非蛋白多醣多醣、透明質酸、膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白。在一個實施方案中，培養基包含基質膠(Matrigel)。在一個實施方案中，該方法還包括使解離的尿路上皮細胞與有效量的生長因子、細胞外基質分子、多醣和信號傳導途徑調節劑接觸，用於維持尿路上皮幹細胞或尿路上皮前驅細胞的細胞群並擴增前驅細胞的細胞群來增加總細胞數。在一個實施方案中，前驅細胞選自CK5/14+尿路上皮幹細胞、CK5/14+尿路上皮前驅細胞及其組合。
本發明還提供治療患有膀胱炎、尿路上皮癌或膀胱癌的受試者的方法，包括向受試者膀胱內施用有效量的包含尿路上皮幹細胞、尿路上皮前驅細胞和細胞基質分子的組合物和多醣。在一個實施方案中，該方法還包括將尿路上皮幹細胞和尿路上皮前驅細胞與細胞外基質分子和多醣結合。在一個實施方案中，細胞外基質分子選自蛋白聚醣、非蛋白多醣多醣、透明質酸、膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白。在一個實施方案中，組合物包含含有5-10%二甲基亞碸(DMSO)的培養基。
在一個實施方案中，膀胱內異種尿路上皮細胞免疫療法和吉西他濱加順鉑(GC)化療聯合治療在原位MBT-2-luc移植膀胱腫瘤小鼠模型中具有協同抗腫瘤作用。在一個實施方案中，膀胱內異種尿路上皮細胞免疫 療法和協同地延遲BBN誘導的膀胱腫瘤小鼠模型中的腫瘤進展。
圖1A、說明了用於膀胱內細胞療法的仿生培養方法分離和擴增尿路上皮細胞的示例性方案的示意圖。
圖1B、是通過將異種尿路上皮細胞灌入膀胱炎或尿路上皮癌的膀胱內細胞療法的較佳實施方案的示意圖。
圖2、擴增的豬尿路上皮細胞(porcine urothelial cell,PUC)具有尿路上皮幹/前驅細胞標記物。(A)第1代和第5代的PUC細胞的代表性圖像。(B)第5代的PUC細胞的代表性圖像。(C)對第3代PUC細胞進行CK5和CK14表達的西方墨點法分析。(D)第3代PUC細胞的免疫螢光染色用針對CK5和CK14的抗體進行，細胞核用DAPI染色，放大400倍。比例尺代表50μm。DAPI：4’,6-二脒基-2-苯基吲哚；PUC：豬尿路上皮細胞。
圖3、培養條件對豬尿路上皮細胞生長的影響。測試培養條件中有無包覆Matrigel的96孔板上、添加bFGF(10μg/ml)和Y27632(10μM)的不同組合，進行培養1、2和6天。並在不同時間點，通過XTT測定法測量細胞存活率。數據表示為平均值±SD。相對於僅10% FBS組，** P<0.01，*** P<0.001。Y27632是ROCK抑制劑。
圖4、環磷酰胺(CPP)誘導的膀胱炎隨著尿路上皮的改變和膀胱內灌注PUC減弱CPP誘導的膀胱炎。小鼠腹腔注射300mg/kg CPP(300mg/kg)，然後在CPP注射後4小時膀胱內灌注豬尿路上皮細胞(PUC)(106 細胞/100μl)或載體對照。灌注後的24小時後犧牲老鼠，取出膀胱進行蘇木精-伊紅(H&E)染色、膀胱形態、重量等分析。(A)載體對照組和PUC處理組下小鼠膀胱代表圖。其中，載體對照組CPP處理的小鼠膀胱明顯充血、腫大和出血，但PUC治療後的小鼠膀胱則無此現象。(B)載體對照組和PUC處理組中的膀胱重量/體重比。(C)H&E染色的膀胱切片組織變化代表圖。載體對照組中的尿路上皮顯示一些剩餘的尿路上皮細胞和裸露的區域。(D)載體對照和PUC處理的小鼠的膀胱切片的水腫指數。數據代表三次獨立實驗的平均值±SD。比例尺代表50μm。相對於載體對照，** P<0.01。
圖5、膀胱內灌注PUC可減少尿路上皮損傷。(A)來自載體對照和PUC處理組的膀胱切片上IHC染色的Ki-67的代表性圖像。(B)CPP注射和治療後尿路上皮細胞增殖的定量。注射CPP後，Ki-67陽性細胞顯示為總細胞的百分比。(C)代表性TUNEL染色膀胱切片的圖像。(D)糖胺聚醣(GAG)層的阿爾新藍(Alcian blue)染色，箭頭表示GAG圖層，虛線劃分了尿道上皮和固有層之間的邊界，數據表示為平均值±SD，顯著性通過未配對的學生t檢驗計算。與載體對照相比，***P<0.01。比例尺代表50μm。L：膀胱腔；TUNEL：末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)介導的dUTP缺口末端標記。
圖6、膀胱異種尿路上皮細胞免疫療法，GC化療和聯合療法在MBT-2-luc原位移植膀胱腫瘤模型中的抗腫瘤作用。當荷瘤小鼠其腫瘤生物發光信號達到總共105個plex時，則將根據治療方案(A)進行治療。(B)治療前後的荷瘤小鼠代表性的IVIS影像；通過Sigma Plot 13進行3個獨立研究中具有不同治療組的腫瘤的小鼠的Kaplan-Meier進行性無惡化存活期曲 線(Kaplan-Meier progressive free survival curve)(C)和總存活曲線(D)並與對數-等級檢定(log-rank test)進行比較並顯示聯合治療與異種尿路上皮細胞免疫治療和化療之間的P值。
圖7、膀胱異種尿路上皮細胞免疫療法、GC化學療法和聯合療法對MBT-2-luc原位移植物尿路上皮膀胱腫瘤模型中腫瘤細胞增殖和存活的影響。將不同治療組別的老鼠的腫瘤取下，經過處理和切片且進行Ki-67免疫組織染色和TUNEL測定。(A)Ki-67免疫組織染色的影像代表圖。(B)對3個獨立實驗的小鼠計數並定量腫瘤切片上的Ki-67表現為陽性細胞。(C)腫瘤切片用TUNEL(FITC)螢光染色並以螢光顯微鏡擷取的代表圖，其中DAPI用於核染色。(D)對來自腫瘤切片的TUNEL陽性細胞進行計數並從3次獨立實驗的小鼠中定量。值表示為平均值±平均值的標準誤差(n=3)。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，通過學生t檢驗進行分析。比例尺：50μm。
圖8、分析來自不同治療的小鼠MBT-2-luc腫瘤中淋巴細胞和NK細胞的浸潤情況。通過IHC染色分析來自給予不同治療的小鼠的腫瘤的淋巴細胞和NK細胞浸潤。腫瘤切片以CD4(A)，CD8(B)和NKG2D(C)抗體進行IHC染色的代表圖。通過計數每組3隻小鼠，每個腫瘤切片以4個隨機放大視野圖的陽性細胞來定量治療組中腫瘤的CD4+T淋巴細胞(D)，CD8+T淋巴細胞(E)和NKG2D+NK細胞(F)，數值表示為平均值±SD、誤差線表示SD。* p<0.05；** p<0.01；*** p<0.001，通過學生t檢驗進行分析。
圖9、膀胱內異種尿路上皮細胞免疫療法、GC化療、聯合療法在BBN誘導的膀胱腫瘤小鼠模型中的抗腫瘤作用。(A)BBN誘導的膀胱腫 瘤小鼠模型實驗流程圖。給予不同處理的小鼠的腫瘤代表圖(B)、腫瘤重量(C)和H & E染色代表圖(D)。進一步針對H & E染色切片分析其病理的增生和腫瘤變化比例分析圖(E)。數值表示為平均值±SD、誤差線表示SD，來自3次獨立實驗的至少9隻小鼠。* p<0.05；** p<0.01；*** p<0.001，通過學生t檢驗進行分析。
圖10、分析來自不同治療的小鼠MBT-2-luc腫瘤中反應性T細胞增殖的免疫激活功能。使用從不同處理的小鼠脾臟分離出來的淋巴細胞進行混合淋巴細胞反應。淋巴細胞用CFDA-SE標記並與異種尿路上皮細胞或MBT-2-luc細胞共培養。培養2天後通過FACS分析測量CFDA-SE標記的淋巴細胞的增殖。CFDA-SE標記的淋巴細胞分裂是透過監控5x105 CFDA-SE標記的淋巴效應細胞(effector cells)與1x105靶異種細胞或腫瘤細胞培養。CFDA-SE標記的淋巴細胞與異種尿路上皮細胞(A)或MBT-2-luc細胞(C)共培養2天後，以流式細胞術分析的圖譜。異種尿路上皮細胞(B)或MBT-2-luc細胞(D)處理2天後，相對於處理前的增殖淋巴細胞的百分比。* p<0.05；** p<0.01；*** p<0.001，通過學生t檢驗進行分析。數值顯示為平均值±SD並代表4個單獨的實驗。
圖11、通過不同處理對攜帶MBT-2-luc腫瘤的小鼠中的反應性T細胞細胞因子產生和細胞毒性的刺激活性。將46種不同處理的小鼠脾臟分離的淋巴細胞與異種尿路上皮細胞或MBT-2-luc細胞共培養2天後，收集其上清液並以ELISA測量IFN-γ表現量，並以單獨培養的淋巴細胞上清液當作計算的基準值。異種尿路上皮細胞(A)。對來自不同治療組小鼠的淋巴細胞產生IFN-γ的相對刺激活性計算如下：([IFN-γ]共培養-[IFN-γ]基線) /([IFN-γ]基準)。單獨使用淋巴細胞培養物上清液中的IFN-γ水平作為基線。將來自不同處理組小鼠脾臟的效應細胞淋巴細胞(1×106)加入已接種1×105的具有CFDA-SE標記的靶效應物異種尿路上皮細胞(B & C)或MBT-2-luc細胞(D & E)共培養4個小時。在共培養結束時，洗出孔中的懸浮效應細胞(effector cells)並測量CFDA-SE標記的靶細胞的強度。(D)代表性螢光圖像為添加了來自小鼠的淋巴細胞，其具有針對異種尿路上皮細胞(B)和MBT-2-luc細胞(D)的不同處理。根據以下公式計算出淋巴細胞的相對細胞毒活性：螢光值(實驗組)-螢光值(對照組)/螢光值(對照組)。將不添加淋巴細胞的CFDA-SE標記的靶標的強度設定為對照。效應淋巴細胞對靶異種尿路上皮細胞(C)和MBT-2-luc細胞(E)的細胞毒性的定量。* p<0.05；** p<0.01；*** p<0.001，通過學生t檢驗進行分析。
以下實施例是非限制性的，並且僅代表本發明的各個方面和特徵。
材料和方法
豬尿路上皮細胞(PUC)分離和培養
用於尿路上皮細胞分離的豬尿囊從當地屠宰場獲得。將膀胱組織切成1-2cm2的組織塊，並用溶於Hank's平衡鹽溶液(HBSS)的分散酶II(Dispase II)處理以剝離尿路上皮。將剝離的尿路上皮切成小塊，並在具有HBSS的第VI型膠原酶(type VI collagenase)(100U/ml)的細胞分離溶液中反應以解聚細胞。分離的豬上皮細胞在含有DMEM/Ham's F12培養基的Matrigel包覆的培養皿中培養，所述培養基補充有抗生素(青黴素100 U/ml，鏈黴素100mg/ml，兩性黴素B5mg/ml)、10% FBS)、生長因子或信號通路抑制劑。在實驗中使用第2-10代細胞。
PUC細胞療法用於環磷酰胺(cyclophosphamide,CPP)誘導的膀胱炎中
週齡9週的雌性C3H/HeJ小鼠用於以下實驗(購於樂斯科公司)。為了誘導化學損傷誘導的膀胱炎，小鼠腹膜內注射100μl PBS的溶液，其中包含了誘導膀胱癌的CPP的劑量為300mg/kg。將CPP誘導後的膀胱炎小鼠隨機分成兩組：一組載體處理對照組和一PUC處理組。CPP注射後4小時，在載體處理組，對小鼠進行膀胱內滴注載體；在PUC處理組，將106個細胞(第1代至第5代)膀胱內滴注到膀胱中。簡而言之，通過尿道將導管插入膀胱，並使用注射器將載體或PUC細胞滴注到膀胱中並保持50分鐘，使PUC細胞粘附。處理後20小時對所有小鼠實施安樂死，快速取出尿囊，稱重，並在10%中性緩衝福爾馬林中固定24小時。縱向切割組織、常規包埋在石蠟中進行切片並用蘇木精和曙紅(H & E)染色用於組織病理學檢查。同時亦進行了尿路上皮糖胺聚醣(GAG)層的阿爾新藍(Alcian blue)染色以評估尿路上皮完整性。通過檢查每個膀胱的切片以反應膀胱炎的嚴重程度來確定水腫評分。分數為0為沒有明顯的水腫跡象；1為輕度水腫使固有層(lamina propria)擴張至正常尺寸的兩倍以下；2為與正常人相比，固有層(lamina propria)大小兩倍的中度水腫；3為與正常相比，固有層大小的中度水腫增加三倍；並且分數4為固有層(lamina propria)和逼尿肌(detrusor)的嚴重水腫使固有層擴張超過正常大小的三倍。動物實驗經中國醫藥大學實驗動物照護及使用委員會批准。
同源小鼠移植物MBT-2-luc腫瘤模型
使用雌性C3H/HeJ 9週齡小鼠建立壁內原位模型(intramural orthotopic model)。將穩定表達螢光素酶基因(luciferase,luc)的MBT-2鼠尿路上皮癌細胞(MBT-2-luc cells)以肌內注射到小鼠膀胱壁並由Xenogen IVIS 200每週一次腫瘤影像擷取。當腫瘤在生物發光成像中達到約1×105p/s總通量時，將荷瘤小鼠分成4個治療組：(i)空白對照組；(ii)異種尿路上皮細胞：膀胱灌注異種尿路上皮細胞(1×106)，每週一次，第3天，持續4週；(iii)吉西他濱(gemcitabine)結合順鉑(cisplatin)的化療(簡稱GC)：以腹腔注射(IP)吉西他濱(6mg/小鼠，第1天)和順鉑(0.12mg/小鼠，第2天)，每週一次，持續4週，以及(iv)聯合治療。小鼠實驗經中國醫藥大學實驗動物照護及使用委員會批准。對於正常異種尿路上皮細胞的膀胱內滴注中，當細胞接近長滿基底的狀態經胰蛋白酶切下且利用台盼藍(trypan blue)染色證實細胞存活率超過90%。雌性C3H小鼠用異氟醚麻醉，腹部輕度壓迫尿液從膀胱排空，通過尿道將24號導管引入膀胱腔。將100μl的1×106異種尿路上皮細胞(本實驗使用PUC)懸浮液注入膀胱中，為防止異種尿路上皮細胞排空，在注射器附著的情況下將導管固定至少40分鐘，小鼠從麻醉中恢復之前移除導管。從基線開始分析BLI總通量強度變化對小鼠的反應，然後通過Kaplan-Meier方法分析小鼠的無進展存活率(腫瘤體積增加20%)和總存活率(在死亡時或人道終點：13隻動物表現出嚴重的發病跡象)。
N-丁基-N-(4-羥基丁基)-亞硝胺(BBN)誘導的腫瘤模型
對於BBN誘導的膀胱腫瘤形成，將0.05%濃度的BBN溶解在飲用水中，並將含有BBN的水在暗瓶中提供給8-10週齡的雌性C57BL/6隻小鼠 自由飲用長達10-20週，直到血尿評分超過2+(Arkray Aution Sticks urine strip，尿液試紙)作為膀胱腫瘤形成的標誌。根據實驗方法流程，在攜帶MBT-2-luc腫瘤的小鼠中處理BBN誘導的荷瘤小鼠。處理後，取出膀胱，稱重並進行組織學檢查。從六個獨立實驗合併結果。對膀胱的H & E染色石蠟切片進行病理學評估，其定義如下：增生(hyperplasia)：上皮增厚而無侵襲；原位癌(CIS)：癌細胞侷限於上皮層；入侵(invasion)：癌細胞侵入粘膜下層或肌肉層。小鼠實驗經中國醫藥大學實驗動物照護及使用委員會批准。
混合淋巴細胞增殖測定
將來自具有不同處理的MBT-2-luc腫瘤小鼠的脾臟的淋巴細胞取出且在黑暗中與5μM CFDA-SE一起作用15分鐘，並且以PBS洗滌。將1×105靶異種尿路上皮細胞或MBT-2-luc細胞與來自脾臟的5×105 CFDA-SE標記的淋巴細胞(E/T比例為5：1)共培養2天後進行測定。通過使用FACS Calibur流式細胞儀測量淋巴細胞中的CFDA-SE螢光強度，並用FlowJo軟件分析。
細胞毒性測定
將用CFDA-SE標記的靶異種尿路上皮細胞或MBT-2-luc細胞接種24小時，然後與效應細胞/靶標上不同處理的小鼠脾臟分離的效應淋巴細胞共培養(E：T的比率=10)。作用4小時後，除去效應細胞，用螢光計測量剩餘的粘附CFDA-SE標記的靶細胞的螢光強度。將沒有共培養效應細胞的CFDA-SE標記的靶細胞的強度設定為基線。來自不同處理的小鼠的效應淋巴細胞的相對細胞毒活性由一式三份樣品計算為[(基線強度-實驗強度)/(基線強度)]並表示為百分比。
免疫組織化學
從不同處理組的小鼠中取出的MBT-2-luc腫瘤在福爾馬林中固定、以石蠟包埋，進一步以抗CD4(GTX85525，GeneTex)、CD8(GTX53126，GeneTex)和NKG2D(bs-0938R，Bioss)的抗體按標準製造商的程序使用自動化Leica Bond III-自動染色劑並以DAB作用顯示出抗體染色的信號。蘇木精用作為對比染色。4個隨機選取的腫瘤切片染色的400倍放大視野圖來做定量具陽性細胞數量的依據，數值表示為每個視野的平均細胞數。
TUNEL測定
MBT-2-luc腫瘤切片用於檢測DNA片段化。通過末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)檢測凋亡細胞中的DNA片段化，遵循製造商的手冊進行分析(TUNEL BrightGreen凋亡檢測試劑盒，Vazyme Biotec，南京，江蘇，中國)。所有圖像均使用帶有影像感測(CCD)相機的顯微鏡(Nikon Eclipse 80i)擷取。
通過ELISA定量IFN-γ
通過靶異種細胞或MBT-2-luc細胞共培養2天，從攜帶不同處理組的MBT-2-luc腫瘤小鼠分離的效應淋巴細胞(effector cells)的培養基中的測定IFN-γ表現量。方法為根據製造商操作手冊中使用酶聯免疫吸附測定試劑盒(BioLegend)去評估。具有共培養的效應細胞用作基線對照。如下計算由共培養的靶細胞(target cells)刺激的效應細胞的相對IFN-γ活化：([IFN-γ]共培養-[IFN-γ]基線)/([IFN-γ]基線)×100。
統計分析
使用PASW Statistics 18進行統計學分析。圖表代表平均值±平均值的標準誤差。使用學生t檢驗計算P值以比較兩組。通過對數秩檢驗(log-rank test)確定存活分析。P<0.05被認為具有統計學意義。
結果
圖1A顯示了用於膀胱內細胞療法的仿生培養方法分離和擴增尿路上皮細胞的示例性方案的示意圖。圖1B顯示了通過將異種尿路上皮細胞灌入膀胱炎或尿路上皮癌的膀胱內細胞療法的本發明優選實施方案的示意圖。
擴增的PUC表達尿路上皮前驅細胞/幹細胞標記物：細胞角蛋白5(CK5)和細胞角蛋白14(CK14)
為了測試治療假設，從豬膀胱尿路上皮分離尿路上皮細胞並擴張。第1和第5代的PUC圖像顯示在圖2A和2B中。尿路上皮/前驅細胞標誌物：CK5和CK14，它們是細胞角蛋白並在尿路上皮幹/前驅細胞內共表達，用於表徵擴增的PUC。PUC的西方墨點法分析(圖2C)和免疫螢光染色(圖2D)顯示CK5和CK14均在PUC細胞中表達。接下來，我們通過在不同的培養基和環境中培養來進一步闡明PUC的增殖潛力。結果顯示出當在Matrigel包覆的平板上培養時，PUC增殖顯著增加。此外，在Matrigel包覆的平板上培養細胞且同時添加FBS、bFGF和Y27632時，具有最高的增殖潛力(圖3)。
膀胱內PUC滴注減緩CPP誘導的膀胱炎
為了證明膀胱內滴注PUC對出血性膀胱炎的治療效果，CPP誘導的膀胱炎小鼠模型已被廣泛用作尿路上皮損傷和出血性膀胱炎的動物模型。將注射CPP的雌性小鼠分成兩組，對照組接受載體對照，治療組在CPP注射後4小時給予106個PUCs並且在注射CPP後24小時犧牲所有小鼠，用於後續實驗數據分析。與載體處理的對照相比，結果顯示膀胱內PUC治療緩 減了CPP引起的損傷，減少了膀胱出血、充血和重量(圖4A和B)。此外，膀胱HE染色切片的組織學分析亦顯示出在PUC處理組中，固有層的水腫較低並且觀察到較少的剝脫(圖4C和4D)。這些結果顯示出膀胱內施用PUC可以保護尿路上皮免受於害化學物質的攻擊，因而減少尿路上皮損傷。
膀胱內PUC滴注抑制CPP誘導的尿路上皮損傷
在CPP注射後24小時，PUC處理組的Ki-67陽性細胞的比例顯著低於載體處理組，顯示出PUC處理減緩了CPP誘導的基底尿路上皮細胞增殖(圖5A和B)。為了評估膀胱內滴注PUC對CPP造成的細胞損傷的影響，使用TUNEL測定來檢測由CPP引起的凋亡細胞。結果顯示出在尿路上皮細胞和固有層中的基質細胞中均觀察到CPP誘導的凋亡細胞，但與載體對照相比，膀胱內PUC處理顯著降低了凋亡細胞(圖5C)。進行阿爾新藍(Alcian blue)染色以觀察CPP處理所影響的尿路上皮完整性。結果顯示出在PUC處理組中保留了GAG的超級層，但在載體對照組中不存在(圖5D)。這些結果顯示出膀胱內PUC處理減少了CPP誘導的細胞增殖、細胞凋亡並維持了尿路上皮完整性。
膀胱內異種尿路上皮細胞免疫療法和GC化療聯合治療在原位MBT-2-luc移植膀胱腫瘤小鼠模型中具有協同抗腫瘤作用
使用原位MBT-2-luc移植物尿路上皮膀胱腫瘤小鼠模型來評估異種尿路上皮細胞作為療法和與標準細胞毒性化學療法組合的抗腫瘤作用的功效。實驗方案如圖6A所示。結果顯示，與載體對照組相比，在所有異種尿路上皮細胞，GC或聯合治療組中腫瘤生長顯著降低(圖6B)。此外，無進展存活(圖6C)和總存活(圖6D)延長。用異種尿路上皮細胞或組合治療的 那些分別在無進展存活中分別顯示出約30%和40%的持久反應，並且在總存活中分別顯示出45%和60%。儘管異種尿路上皮細胞免疫療法或吉西他濱和順鉑化療單獨具有抗腫瘤活性，但用異種細胞免疫療法和GC化學療法治療的小鼠顯示出腫瘤進行性游離存活和總存活率的顯著增加，並且聯合治療具有最高存活率。漸進性和總存活期的異種細胞處理均提高了曲線的尾部，表明異種細胞免疫療法比化學療法具有更持久的效果。
膀胱內異種尿路上皮細胞免疫治療，GC化療和聯合治療可減少腫瘤細胞增殖和增加腫瘤細胞凋亡
為了證明異種尿路上皮細胞免疫療法，GC化療和聯合治療的抗腫瘤作用，將腫瘤固定並切片用於Ki-67 IHC染色和TUNEL測定以分別測定細胞增殖和細胞死亡。結果顯示，所有處理組中Ki-67陽性腫瘤細胞均低於未處理對照組。另外，增殖性腫瘤細胞在聯合治療組中最低(圖7A和B)。相反，TUNEL試驗結果顯示，所有治療組腫瘤組織中凋亡細胞均增加，尤其是聯合治療組。無論單一異種尿路上皮細胞免疫治療還是化療聯合治療，誘導腫瘤細胞死亡的效果均優於化療(圖7C和D)。
膀胱內異種尿路上皮細胞免疫療法、GC化療和聯合治療增強了腫瘤中的免疫細胞浸潤
為了評估不同處理對腫瘤內免疫細胞組成的影響，分析了T細胞和NK細胞向腫瘤的浸潤。腫瘤T細胞浸潤(CD4+和CD8+效應T細胞)在異種尿路上皮細胞免疫療法、GC治療和聯合療法(圖8A和B)中增加，這反應了有效的免疫療法。定量結果顯示，與載體治療組腫瘤相比，發現來自單一和聯合治療組的異種尿路上皮細胞治療的腫瘤具有顯著增加的效應 CD4+T細胞(圖8D)、CD4+T細胞(圖8E)和NKG2D+NK細胞(圖8F)的浸潤。然而，在單獨用GC處理組的腫瘤中未觀察到增加的NK細胞浸潤(圖8C和F)。
膀胱內異種尿路上皮細胞免疫療法和吉西他濱加順鉑(GC)化療聯合治療協同延遲BBN誘導的膀胱腫瘤小鼠模型中的腫瘤進展
為了測試膀胱內異種細胞療法與化學治療劑聯合用於延遲腫瘤進展的抗腫瘤作用，BBN誘導的腫瘤小鼠模型，可觀察到從增生(hyperplasia)、原位癌(CIS)到浸潤性癌(invasive carcinoma)，常被使用來模擬人膀胱腫瘤發生。將BBN誘導的膀胱腫瘤小鼠分成4個治療組：(i)載體對照；(ii)異種尿路上皮細胞：膀胱灌注異種異種尿路上皮細胞(1×106細胞)，每週一次，第3天，持續4週；(iii)吉西他濱加順鉑(GC)化療：吉西他濱(6mg/小鼠，第1天)腹腔注射(IP)和順鉑(0.12mg/小鼠，第2天)，每週一次，持續4週，和(iv)綜合治療。從取下的膀胱的肉眼和組織病理學檢查評估治療組和對照組中BBN誘導的膀胱腫瘤的進展。實驗方案如圖9A所示。結果顯示出膀胱內異種尿路上皮細胞免疫治療、單獨GC治療或化療聯合治療顯著降低腫瘤重量。此外，聯合治療實現了腫瘤重量的最大降低(圖9B和C)。與這種巨觀差異一致，組織病理學分析亦顯示在異種細胞、GC治療組和聯合治療中小鼠進展為浸潤性癌的比例顯著較低(圖9D和E)。
膀胱內異種尿路上皮細胞免疫療法、GC化療和組合治療激活免疫反應
異種細胞免疫療法的假設可以誘導由於異種注射引起的免疫反 應並且可以間接地增加抗腫瘤免疫反應。檢測從異種細胞處理的小鼠分離的T細胞是否能表現出增強的增殖反應。通過混合淋巴細胞反應(mixed lymphocyte reaction，MLR)將上述的淋巴T細胞與異種尿路上皮細胞或膀胱腫瘤細胞共培養並且使用羧基螢光素二乙酸琥珀酰亞胺酯(CFDA-SE)的增殖分析。首先，在具有不同處理的MBT-2-luc腫瘤小鼠的脾臟中分離出淋巴細胞，然後用CFDA-SE標記。將標記的CFDA-SE淋巴細胞與已貼附好的異種尿路上皮細胞或腫瘤細胞(效應細胞/靶細胞比例5：1)共培養兩天。兩天之後，收集淋巴細胞並通過流式細胞術分析CFDA-SE螢光的強度。結果顯示，與異種尿路上皮細胞共培養來刺激的效應淋巴細胞增殖反應中，異種尿路上皮細胞處理的小鼠淋巴細胞增殖比例高於載體對照小鼠，顯示出異種尿路上皮細胞處理的小鼠對異種細胞產生免疫反應較好(圖10A和B)。此外，當用MBT-2-luc膀胱腫瘤細胞刺激時，來自處理異種尿路上皮細胞的小鼠的效應淋巴細胞顯示出更高的增殖比例(圖10C和D)。在聯合治療小鼠中也發現淋巴細胞增殖增加，顯示出不論植入異種尿路上皮細胞或腫瘤細胞，異種尿路上皮細胞治療都能引發荷瘤小鼠的免疫反應。
膀胱內異種尿路上皮細胞免疫療法、GC化學療法和聯合療法增加了效應免疫細胞功能
評估了干擾素-γ(IFN-γ)的產生，在免疫細胞中的抗腫瘤免疫中起重要作用。將具有不同處理的荷瘤小鼠脾臟分離的淋巴細胞與異種尿路上皮細胞或MBT-2-luc細胞共培養，然後測定共培養條件培養基中的IFN-γ活化。結果顯示無論是與異種尿路上皮細胞還是腫瘤MBT-2-luc細胞共培養，在單獨異種尿路上皮細胞免疫療法和與化療聯合治療中分離的淋巴細 胞中IFN-γ活化均較高(圖11A)。透過治療而增加效應細胞激素生成與效應細胞增生有關，顯示出植入異種尿路上皮細胞能調節效應細胞功能。然而，進一步確認參與異種尿路上皮細胞誘導的小鼠中抗腫瘤反應的細胞活化的效應細胞亞群。將T細胞透過體外用異種尿路上皮細胞或MBT-2-luc細胞再刺激，由T細胞增殖和更多的IFN-γ活化結果證實了比起對照處理的小鼠，其他處理組的小鼠具有更多的T細胞表現出效應特徵。為了證明異種尿路上皮細胞免疫療法是否可以影響T細胞的細胞毒活性功能，因此進行了免疫效應細胞介導的靶細胞細胞毒性測定。從不同治療組的小鼠的脾臟分離的效應淋巴細胞與CFDA-SE標記的靶細胞共培養，所述靶細胞是異種尿路上皮細胞或MBT-2-luc細胞，然後通過測量殘留的螢光強度檢測T細胞的細胞毒活性功能。結果顯示，在接受聯合治療的小鼠組中，針對異種尿路上皮細胞或MBT-2-luc細胞具有最高細胞毒活性。異種尿路上皮細胞和GC處理皆能激活細胞毒性細胞(cytotoxic cells)，增加了靶異種尿路上皮細胞或MBT-2-luc細胞的細胞毒殺性(圖11B-E)。

Claims (7)

  1. 一種包含異種尿路上皮細胞的組合物的用途，其係用於製備一免疫療法的藥物，其中該包含異種尿路上皮細胞的組合物包含尿路上皮幹細胞、尿路上皮前驅細胞和成熟尿路上皮細胞，且該免疫療法的藥物為一治療膀胱炎的藥物或一治療尿路上皮癌或膀胱癌的藥物。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該包含異種尿路上皮細胞的組合物的來源為一哺乳類動物。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的用途，其中該哺乳類動物選自人、豬、牛、狗、貓、綿羊、山羊、兔、猴、馬、小鼠或大鼠。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該包含異種尿路上皮細胞的組合物為膀胱內給予受試者。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該包含異種尿路上皮細胞的組合物更包含一有效量的一種或多種化療藥物的組合。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的用途，其中該有效量的一種或多種化療藥物係選自烷基化劑、亞硝基脲劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、植物來源的生物鹼、拓撲異構酶抑制劑、激素治療藥、激素拮抗劑、芳香酶抑制劑、P-糖蛋白抑制劑和鉑絡合物衍生物。
  7. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該治療尿路上皮癌或膀胱癌的藥物係透過抑制腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞死亡。
TW108116427A 2018-05-14 2019-05-13 包含異種尿路上皮細胞的組合物的用途 TWI848946B (zh)

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