TWI838147B

TWI838147B - 米糠萃取組合物之製備方法及其用於皮膚保健之用途

Info

Publication number: TWI838147B
Application number: TW112107722A
Authority: TW
Inventors: 陳瑞惠; 詹育欣; 林守麟; 羅勝仁; 陳勁中; 陳錦坤; 王逸萍; 蔡銘璋
Original assignee: 台灣中油股份有限公司
Priority date: 2023-03-03
Filing date: 2023-03-03
Publication date: 2024-04-01
Also published as: JP2024125137A; KR20240135335A; TW202435844A; EP4424295A1

Abstract

本發明提供一種米糠萃取組合物之製備方法及其用於皮膚保健之用途，製備方法的步驟包含：將米糠與濃度大於80%的溶劑進行混合以獲得混合液，並於40~55℃環境下攪拌萃取；將混合液進行離心或過濾，以收取上清液或濾液；將上清液或濾液進行減壓濃縮以獲得米糠萃取物；以及將米糠萃取物加工處理為米糠萃取組合物。本發明將常被廢棄卻又富含保健元素之米糠進行資源回收再利用，將其製備成米糠萃取組合物並添加到個人護理產品之中，提升產品之皮膚美白、抗衰老、抗發炎、抗過敏等皮膚保健之用途，且製備過程中經減壓濃縮後的溶劑可以再回收，並再次作為本發明的溶劑使用，可以達到節省資源使用、循環經濟的效益。

Description

米糠萃取組合物之製備方法及其用於皮膚保健之用途

本發明是有關於一種米糠萃取組合物之製備方法及其用於皮膚保健之用途，特別是一種具有美白、抗衰老、抗發炎、抗過敏等功效，並可應用於皮膚保健的用途。

米糠(rice bran)係將糙米碾成白米過程中的產物，含有12%~16%蛋白質、16%~22%油脂、20%~25%膳食纖維及許多微量礦物質、植化素，如榖維素(γ-oryzanol)、植物固醇、維生素E (vitamin E)、角鯊烯(squalene)、葡萄糖神經醯胺(glucosylceramide)等；然而，由於米糠保存不易、容易酸敗腐爛，僅少數有機栽種者會將其去活性或焙炒後食用或販賣，但因質地粗糙、口感不佳，市面上並不普及。過去米糠都被當成飼料，過量的米糠甚至直接被當成廢棄物丟棄，對環境造成負擔。許多文獻報導米糠所含的植化素具有皮膚保健的功能，因此，許多產品會添加米糠萃取物以提升產品功效及價值。然而，米糠為常見素材、取得容易，若無詳細的萃取方法及產物樣態，米糠萃取物將是一個籠統名詞，功效再現性及使用方便性值得存疑。

關於米糠的萃取應用，習知技術中，利用6~10倍米糠體積之＞75℃熱水先處理過米糠後，等待冷卻到＜40℃後，再用＜80%乙醇進行萃取至少半小時，過濾或離心後的第一次上清液(濾液)即可以使用。或進一步減壓濃縮，得到分層的上清液與沉澱物，沉澱物再進行水性醇(甲醇、乙醇、丙醇)處理，取得第二次上清液及第二次沉澱物。然而，上述的技術中步驟繁瑣，且對非脫脂米糠的第一次上清液進行噴霧乾燥時還會使用到正己烷等有毒害性溶劑。

習知技術中，採用甲醇、丙酮、乙醇等與水以30~70:70~30(體積比)混合後作為萃取液，換算後溶劑濃度約30%~70%，以米糠:萃取液=1:1~20(重量比) 進行萃取。溫度設定50~70℃，萃取1~3小時。萃取物進行各種試管生化試驗( in vitro)；習知技術中，先利用酵素對米糠進行，再使用水跟乙醇混合液(比例為1:1~25:1，相當於50%~3.8%乙醇)進行萃取，溫度4~40℃，時間6小時~7天。

從上述習知技術可知，米糠萃取的製程難易不一，米糠是否先脫脂、萃取用的溶劑種類及比例、是否使用酵素、萃取溫度、時間等，差異很大，而且功效試驗方法不同，有些是試管試驗、有些是細胞試驗，無指標成份比較批次及功效上的差異優劣。

此外，米糠的許多植化素，如榖維素(γ-oryzanol) 、植物固醇、維生素E (vitamin E)、角鯊烯(squalene)、葡萄糖神經醯胺(glucosylceramide)等，具有改善肌膚功效，但多偏油溶性，若溶劑濃度太低，難把油溶性物萃取出來。雖然，提高溫度有助於提取油溶性物，如習知技術中先將米糠以＞75℃熱水處理，冷卻後(＜40℃)再用溶劑提取。另一習知技術中，提高萃取溫度為50~70℃，但溶劑濃度＜70%。再另一習知技術中，若在低濃度溶劑下(＜50%)，可藉由酵素及拉長萃取時間來達成。然而，這些先前技術的手續繁雜、費時，如必須分成水處理、溶劑處理之兩個步驟，或是必須拉長萃取時間等，雖然提高溫度可能有助於萃取，但高溫處理容易破壞及氧化油溶性物質。

有鑑於此，本發明人深刻瞭解前案之不足與缺陷，乃亟思加以改良創新，並經多年研究後，終於研發出可以大幅簡化米糠萃取步驟的同時，所製作出的米糠萃取組合物能添加到個人護理產品之中，提升產品之皮膚美白、抗衰老、抗發炎、抗過敏等保健用途，也為皮膚保健提供一個新穎且低成本的保健策略。此外，也提升米糠的價值、開創額外經濟，更能減少農業廢棄物對環境的負擔，實踐資源回收再利用的精神。

本發明之目的即在簡化萃取步驟，提高溶劑濃度＞80%，降低萃取溫度(不超過55℃)，避免破壞米糠中的功效活性，萃取時間縮短至最少1小時即可。並以一系列細胞試驗反映米糠萃取物的功效，且將米糠萃取物製作成方便使用的樣態(米糠萃取組合物)，實現其產業利用性。

為達成上述目的，本發明的主要目的在於提供一種米糠萃取組合物之製備方法，其步驟包含：將米糠與濃度大於80%的溶劑進行混合以獲得混合液，並於40~55℃環境下攪拌萃取；將混合液進行離心或過濾，以收取上清液或濾液；將上清液或濾液進行減壓濃縮以獲得米糠萃取物；以及將米糠萃取物加工處理為米糠萃取組合物。

在本發明的一實施例中，米糠為脫脂或未脫脂的米糠，米糠與溶劑之米糠重量:溶劑體積的混合比例為1:4~1:8，重量的單位為公克，體積的單位為毫升。

在本發明的一實施例中，溶劑是乙醇體積:水體積為100~80:0~20之溶劑；或是丙醇體積:水體積為100~80:0~20之溶劑。

在本發明的一實施例中，上清液或濾液於進行減壓濃縮之前，包含使用活性碳除色及淨化的步驟，且減壓濃縮為利用減壓蒸餾的方法使上清液或濾液的體積濃縮18~22倍以獲得米糠萃取物。

在本發明的一實施例中，加工處理為添加賦形劑以製作成米糠萃取組合物，其中賦形劑包含水、油、乳化劑、防腐劑、助溶劑，使米糠萃取組合物成為包含20~30%之米糠萃取物的液劑的劑型。

在本發明的一實施例中，加工處理為添加植物澱粉以製作成米糠萃取組合物，其中植物澱粉的添加比例為米糠萃取物體積:植物澱粉重量為1:0.4~1:2，並進行噴霧乾燥使米糠萃取組合物成為粉劑的劑型；重量的單位為公克，體積的單位為毫升。

在本發明的一實施例中，噴霧乾燥之前包含添加乳化劑、防腐劑、助溶劑的步驟；植物澱粉包含麥芽糊精、玉米澱粉、小麥澱粉、大米澱粉、或木薯澱粉。

在本發明的一實施例中，藉由測定米糠萃取物中葡萄糖神經醯胺的濃度來調整米糠萃取物與植物澱粉的添加比例。

本發明另外提供一種米糠萃取組合物用於皮膚保健之用途，其中米糠萃取組合物是藉由上述製備方法而成，米糠萃取組合物無細胞毒性、無光毒性、無皮膚刺激性，且皮膚保健包含皮膚美白、抗衰老、抗發炎、抗過敏。

在本發明的一實施例中，米糠萃取物的有效劑量為7.8~1000 μg/ml。

在本發明之米糠萃取組合物之製備方法的步驟中，使用的溫度是關鍵因素，因為米糠萃取物如果經高溫處理，例如經70℃水浴處理0.5~1小時後，將使後續加工製備而成的米糠萃取組合物(粉劑及液劑)的功效減弱。

本發明將原本以廢棄物處理之米糠賦予新的生命，將自然環保的米糠進行資源回收再利用，，並在大幅簡化米糠萃取步驟的同時製作米糠萃取組合物，且製備過程中經減壓濃縮後的溶劑可以再回收，並再次作為本發明的溶劑使用，即本發明可以達到節省資源使用、循環經濟的效益；此外，製作出的米糠萃取組合物能添加到個人護理產品之中，提升產品之皮膚美白、抗衰老、抗發炎、抗過敏等保健用途。

[術語定義] 本說明書中廣泛地使用生物技術領域內習用之許多技術性及科學術語，在以下描述中，為了對本說明書及申請專利範圍以及賦予該等術語之範疇有清楚又一致的瞭解，提供以下定義。沒有在下述所特別定義的其他術語，則為該所屬專業人士領域可共同瞭解的意義。

本說明書使用之「或」、「以及」、「和」，除非另有說明，皆指涉「或/和」。此外，用語「包含」、「包括」皆非有所限制之開放式連接詞。前述段落僅為系統性之指涉而不應解釋為對發明主體之限制。

本說明書使用之「%」若無特定說明皆指「重量百分比（wt%）」；數值範圍（如10%~11%的A）若無特定說明皆包含上、下限值（即10%≦A≦11%）；數值範圍若未界定下限值（如低於0.2%的B，或0.2%以下的B），則皆指其下限值可能為0（即0%≦B≦0.2%）；各成份的「重量百分比」之比例關係亦可置換為「重量份」的比例關係。

本說明書中所揭露的所有數值可具有 ± 10% 的標準技術測量誤差(標準差)。詞彙「約」的目的是表示相對某給定值的 ±10%、±5%、±2.5%、或±1%，也就是說，「約20%」代表 20±2%、20±1%、20±0.5%、或 20±0.25%。

本說明書使用之「有效劑量(effective amount)」，係指涉有效活性物質之一足夠量，可始授予者預防或減輕一或多項疾病症狀或生理狀況之劑量；其結果為降低和/或緩和徵象(sign)、症狀(symptom)、或病因，或為其他生理系統之有意圖之改變。

[米糠原料] 本發明所使用之米糠的狀態沒有任何限制，例如可以包含未經處理之米糠、或是經處理(例如發酵、脫脂等)之米糠；在一實施例中，本發明使用的米糠為脫脂或未脫脂的米糠。另外，除非另有說明，本發明所用之材料皆市售易於取得。

[混合萃取步驟] 本發明的米糠萃取組合物之製備方法包含將米糠與濃度約大於80%的溶劑進行混合以獲得混合液，並於約40~55℃環境下攪拌萃取；溶劑的濃度可以是重量百分濃度大於80%，也可以是體積百分濃度大於80%，端視溶劑的種類而定，本發明並不受限於此。

米糠與溶劑之混合比例並不受到限制，但從提升米糠萃取效率的觀點考量，米糠與溶劑之米糠重量(單位為克):溶劑體積(單位為毫升)的混合比例較佳為約1:4~1:8，例如可以為約1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、或上述任意兩數值之間的比例；混合萃取步驟可以分批進行，其中每次進行混合萃取步驟所使用之米糠與溶劑之混合比例可以相同，也可以不同。

米糠與溶劑混合時的溫度不可以超過約55℃，即必須低於約55℃，具體的溫度並不受到限制，但從提升米糠萃取效率的觀點考量，較佳為約50℃以下，例如可以為約5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、或上述任意兩數值之間的溫度，其中最佳為約40~50℃；混合萃取步驟可以分批進行，其中每次進行混合萃取步驟的溫度可以相同，也可以不同。

米糠與溶劑混合後之攪拌萃取時間並不受到限制，但從提升米糠萃取效率的觀點考量，攪拌萃取時間較佳為至少約1小時，例如可以為約1.5小時、2小時、2.5小時、3小時、3小時以上、或上述任意兩數值之間的攪拌時間；混合萃取步驟可以分批進行，其中每次進行混合萃取步驟的攪拌萃取時間可以相同，也可以不同。

溶劑的濃度必須大於約80%，其具體種類並不受到限制，但從提升米糠萃取效率的觀點考量，溶劑較佳為約80%~100%(體積百分濃度)的乙醇或丙醇，例如體積百分濃度可以為約82%、84%、86%、88%、90%、92%、94%、96%、98%、99%、或上述任意兩數值之間的體積百分濃度之乙醇或丙醇；上述的乙醇、丙醇包含其任何同分異構體，例如可以為正丙醇、異丙醇等；亦即，溶劑較佳為乙醇體積:水體積為約100~80:0~20之溶劑；或是丙醇體積:水體積為約100~80:0~20之溶劑，例如可以為約99:1、98:2、96:4、94:6、92:8、90:10、88:12、86:14、84:16、82:18、或上述任意兩數值之間的比例；混合萃取步驟可以分批進行，其中每次進行混合萃取步驟所使用之溶劑的種類、溶劑的濃度可以相同，也可以不同。

本發明可以不使用正己烷等有毒害性之溶劑，即本發明優先選擇對人體友善、對環境保護良好之溶劑；此外，本發明可以不使用熱水進行萃取，即本發明優先選擇溶劑萃取(溫度不超過55℃)。

[混合液分離步驟]

本發明的米糠萃取組合物之製備方法包含將萃取後之混合液進行離心或過濾，以將米糠與溶劑進行分離並獲得上清液或濾液。

在使用離心的實施例中，離心只要能讓米糠與溶劑分離，其具體離心的轉速、次數等都不受到限制；以及在使用過濾的實施例中，只要能讓米糠與溶劑分離，過濾時使用的器材(例如濾網、濾芯等)、過濾的孔徑等都不受到限制，可以視分離狀況而適宜地進行調整。

在一實施例中，混合萃取步驟以及混合液分離步驟採用分批來進行，例如可以分成三次進行，總共獲得三批上清液或濾液，並集中所有上清液或濾液之後，再進行後續的除色淨化步驟(視情況可省略)、以及減壓濃縮步驟；在一實施例中，各批次可以是各自獨立萃取及分離，也可以是同一批進行分離(過濾)後，再回來萃取1~2次，端視萃取及分離的狀況而定。

[除色淨化步驟]

在一實施例中，可以在混合液分離步驟之後，對分離出的上清液或濾液進行除色及淨化的步驟，再進行後續的減壓濃縮步驟；除色及淨化所使用的材料並不受到限制，但從提升米糠萃取物的品質觀點考量，較佳為使用活性碳。

[減壓濃縮步驟]

本發明的米糠萃取組合物之製備方法包含將上清液或濾液進行減壓濃縮以獲得米糠萃取物，減壓濃縮的方法並不受到限制，例如可以為減壓蒸餾、真空濃縮等方法。

在一實施例中，減壓濃縮的步驟中可以回收溶劑，且回收的溶劑濃度約大於80%，該回收溶劑也可作為本發明的溶劑使用，達到節省資源使用、循環經濟的效益。具體回收溶劑的濃度將視混合萃取步驟中使用的溶劑濃度而定，但本發明並不受限於此。

在一實施例中，減壓濃縮是利用減壓蒸餾的方法使該上清液或濾液的體積濃縮約18~22倍(例如可以為約19倍、20倍、21倍、或上述任意兩數值之間的倍率)，以獲得米糠萃取物(濃縮液)，再進行後續的加工處理，但本發明並不受限於此。

在一實施例中，濃縮液可以視情況再進一步濃縮，以取得更黏稠之米糠萃取物，例如可以使該上清液或濾液的體積濃縮約23倍、24倍或25倍，以獲得米糠萃取物(濃縮液)；在一實施例中，相較於米糠原料的總重量，萃取出之米糠萃取物的重量約占12~18%(例如可以為約13%、14%、15%、16%、17%、或上述任意兩數值之間的重量百分濃度)，但本發明並不受限於此。

[加工處理步驟]

本發明的米糠萃取組合物之製備方法包含加工處理步驟，以將米糠萃取物加工處理成為作為產品之米糠萃取組合物，具體的做法將視米糠萃取組合物的劑型而適宜地調整。

在將米糠萃取組合物製作為液劑實施例中，加工處理步驟為將米糠萃取物添加賦形劑以製作成米糠萃取組合物，其中賦形劑包含水、油、乳化劑、防腐劑、助溶劑等，使米糠萃取組合物成為包含約20~30%(例如可以為約22%、24%、26%、28%、或上述任意兩數值之間的濃度)之米糠萃取物的液劑的劑型。

本發明賦形劑中所包含的水、油、乳化劑、防腐劑、助溶劑等，其各成分的具體種類、含量比例並不受到限制，可以視產品(米糠萃取組合物)的狀態而適宜地調整。

在將米糠萃取組合物製作為粉劑實施例中，加工處理步驟為將米糠萃取物添加植物澱粉以製作成米糠萃取組合物，其中植物澱粉的添加比例為米糠萃取物體積(單位為毫升):植物澱粉重量(單位為克)為約1:0.4~1:2(例如可以為約1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、或上述任意兩數值之間的添加比例)，並進行噴霧乾燥使該米糠萃取組合物成為粉劑。

在一實施例中，植物澱粉的具體種類並不受到限制，但從提升粉劑形成的品質的觀點考量，植物澱粉較佳為包含麥芽糊精、玉米澱粉、小麥澱粉、大米澱粉、或木薯澱粉。

在一實施例中，可以在噴霧乾燥之前包含添加乳化劑、防腐劑、助溶劑的步驟，以幫助米糠萃取物(濃縮液)均勻混合之後，再進行後續的噴霧乾燥。其中使用之乳化劑、防腐劑、助溶劑等成分的具體種類、含量比例並不受到限制，可以視產品(米糠萃取組合物)的狀態而適宜地調整。

在一實施例中，本發明將米糠萃取物(濃縮液)製作成液劑或粉劑的劑型(米糠萃取組合物)之後，經由細胞試驗驗證其功效具再現性。

[品質管控]

由於米糠是天然物，即使製程相同，也會因稻米的栽種區域、每年氣候不一等因素，造成品質上的落差。因此，需要有指標成份來確認批次的差異性，以調整米糠萃取濃縮液與植物澱粉之噴霧乾燥比例。

作為指標成份，例如可以使用穀維素、維生素E、角鯊烯、葡萄糖神經醯胺(glucosyceramide，GluCer)等；其中，由於葡萄糖神經醯胺的量少具鑑別性，本發明較佳為藉由測定米糠萃取物中葡萄糖神經醯胺的濃度來調整米糠萃取物與植物澱粉的添加比例。

[皮膚保健之用途]

本發明另提供一種米糠萃取物用於皮膚保健之用途，其中米糠萃取物是藉由如上述製備方法而成，米糠萃取物無細胞毒性、無光毒性、無皮膚刺激性，且皮膚保健包含皮膚美白、抗衰老、抗發炎、抗過敏。

在一實施例中，本發明之米糠萃取物經過細胞試驗，確認其安全性，包括細胞存活率/細胞毒性 (cell viability / cytotoxicity)、光毒性 (phototoxicity)、皮膚刺激性 (in vitro skin irritation)；並且，本發明之米糠萃取物也經過細胞試驗，確認其功效性，包括美白(skin-whitening)、抗衰老(anti-senescence)、抗發炎(anti-inflammatory)、抗過敏(anti-allergy)。

在一實施例中，本發明之米糠萃取組合物中所包含之米糠萃取物的有效劑量為7.8~1000 μg/ml，例如可以為15.6 μg/ml、31.2 μg/ml、62.5 μg/ml、125 μg/ml、250 μg/ml、500 μg/ml、或上述任意兩數值之間的有效劑量。

以下列舉數個實施例與比較例來說明本發明的米糠萃取組合物之製備方法，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明精神與範圍內，當可做各種更動與潤飾，另外，以下所用之材料皆從市售易於取得。

實驗1：製備米糠萃取物

本實驗將100 g的米糠加入溶劑(400 mL乙醇及50 mL水之混合液，即89%乙醇)，於42℃攪拌萃取1小時，離心後取上清液，再重複萃取兩次，共三批上清液。把所有上清液合併體積約1000~1200 mL，進行活性碳處理及減壓濃縮，得到黏稠萃取物(米糠萃取物)約15 g，萃取率約15%。

實驗2：細胞存活率/細胞毒性測試(Cell viability / Cytotoxicity)

本實驗先接種8×10 ³小鼠L929纖維母細胞株於96孔盤，經24小時細胞貼附後，以不同濃度之米糠萃取物處理24~48小時後，移除培養液，加入MTS試劑與細胞反應2~4小時，用微量盤檢測儀(plate reader)測量波長490 nm吸收值。負對照組NC(negative control)為不含米糠萃取物之培養液(1% DMSO)，且確認細胞存活；正對照組PC(positive control)為細胞處理5% DMSO，且確認細胞死亡。負對照組的吸光值設定細胞存活率為100%與實驗組進行比較分析，以達80%之細胞存活率做為樣品安全濃度參考值設定。

請參考圖1，其為米糠萃取物之細胞毒性測試的結果；從圖1可知，藉由本發明的製備方法所獲得之米糠萃取物在500 μg/mL時有高於90%的存活率，且在高濃度1000 μg/mL時仍有70%存活率。

實驗3：光毒性測試(phototoxicity)

本實驗參照OECD規範No.432，接種1×10 ⁴小鼠3T3細胞株於兩盤96孔盤，培養24小時後，分別加入米糠萃取物和CPZ(Chlorpromazine，正對照)，每組測試需含8個濃度，在37℃避光培養1小時後，其中一盤細胞進行UVA暴露(5J/cm ²)0.5~1小時；另一盤保持避光。更換新細胞培養液，培養18小時。加入中性紅(neural red)染劑作用3小時，磷酸緩衝液潤洗細胞後進行細胞內中性紅萃取，以微量盤檢測儀測量波長540 nm吸收值，讀值高表示細胞存活率高。繪出測試物濃度對應細胞存活率反應曲線計算IC50。光刺激因子(PIF)計算公式[IC50(-UV)/IC50(+UV)]≧6顯示具有光毒性風險。

請參考圖2，其為米糠萃取物之光毒性測試的結果，當照光後細胞存活曲線向左偏移，則表示有光毒性；從圖2可知，藉由本發明的製備方法所獲得之米糠萃取物PIF值為1.28~1.67(有些批次甚至無法算出曲線)，從上述結果可知，相較於正對照的CPZ均超過31，米糠萃取物PIF數值皆低於2，即本發明之米糠萃取物之光毒性風險極低。

實驗4：皮膚刺激性測試 (in vitro skin irritation)

本實驗參照OECD規範No.439，以角質細胞培養成仿皮膚重組細胞角質層進行測試，選定測試濃度(通常為擬添加於產品中的最高濃度或其2~3倍濃度)塗佈於仿皮膚組織表面(apical surface)室溫作用15分鐘，正對照組PC塗佈5% SDS，負對照組NC為配置米糠萃取物之溶劑(礦物油)。移除皮膚表面樣品以磷酸鹽緩衝溶液潤洗表面3次後加入MTS試劑作用24小時，以微量盤檢測儀測量波長490 nm吸收值，負對照組之吸光值設定為存活率100%，正對照組細胞存活率需低於50%，檢測樣品之細胞存活率大於50%則視為無皮膚刺激性。

請參考圖3，其為米糠萃取物之皮膚刺激性測試的結果；從圖3可知，藉由本發明的製備方法所獲得之米糠萃取物在高達50 mg/mL濃度下，仍不具皮膚刺激性。

實驗5：美白試驗:體外酪胺酸酶活性抑制試驗(in vitro inhibition of tyrosinase)

本實驗將緩衝溶液中含不同濃度樣品加入96孔盤，正對照組PC含麴酸(最終濃度6.25 μg/ml)，負對照組NC為不含測試物質的緩衝液(2% DMSO)。加入125 U Mushroom tyrosinase，室溫作用5分鐘後，加入受質L-tyrosine，以微量盤檢測儀偵測波長475 nm的每分鐘吸光值變化共計30分鐘，酪胺酸酶活性未被抑制其吸光值隨時間增加而上升，吸光值上升減少表示活性受抑制，計算0~15分鐘單位時間內吸光值變化量比較酪胺酸酶活性。

請參考圖4，其為米糠萃取物之體外酪胺酸活性抑制的結果；從圖4可知，藉由本發明的製備方法所獲得之米糠萃取物在抑制酪胺酸酶活性具有濃度正相關的趨勢。

實驗6：美白試驗: 黑色素生成抑制試驗(anti-melanogensis in B16F10 cells)

本實驗先接種2×10 ⁴黑色素瘤細胞株(B16/F10)至6孔培養盤貼附24小時後，移除培養液，加入100 ng/mL促黑素細胞激素(α-MSH)反應30分鐘，再加入等體積含2倍萃取物濃度之細胞培養液，負對照組NC為不含米糠萃取物的細胞培養液(經α-MSH處理，但不含米糠萃取物)，正對照組PC為0.5 mg/ml麴酸(經α-MSH處理)；細胞背景值組(base line)為不處理α-MSH。經72 小時培養後去培養液，以磷酸緩衝液清洗並加入0.25% 胰蛋白酶作用使細胞脫落後，離心收集細胞，再以無菌磷酸緩衝液清洗細胞2~3 次，沉澱細胞塊加入100 ul M-PER 細胞裂解液打破細胞後離心，取上清液進行蛋白濃度定量，沉澱物則加入1N氫氧化鈉溶液於80℃反應2小時，取上清液至96孔盤，以微量盤檢測儀偵測波長405 nm 吸收值，吸收值越小，表示黑色素越少。黑色素吸光值除以自身蛋白質濃度標準化後，再進行實驗組和負對照組數值比較，負對照組黑色素含量設為100%。

請參考圖5，其為米糠萃取物之黑色素生成抑制試驗結果；從圖5可知，藉由本發明的製備方法所獲得之米糠萃取物在濃度50 μg/mL即見抑制黑色素生成趨勢，250 μg/mL抑制效果更勝於500 μg/mL的麴酸。

實驗7：美白試驗:黑色素體吞噬試驗(melanosome transfer to keratinocytes)

從實驗5~6的兩個美白試驗顯示，胞外試驗( in vitro)及細胞試驗結果有差距，可能是米糠萃取物具多種美白相關生理機制途徑。因此，進行另一個細胞試驗，加強驗證美白功效及從另一個角度檢視本發明之製備方法所獲得之米糠萃取物的美白機制。

黑色素(melanin)有很強的抗氧化力，當角質細胞(keratinocyte)受UV刺激時為避免遺傳物質核糖核酸受到突變，會吞噬由黑色素細胞分泌的黑色素體(melanosome)，並圍繞在細胞核周圍以保護遺傳物質。這樣的正常防護機制也是膚色變黑的原因之一。低生長因子 (即飢餓)的刺激下會促進角質細胞胞吞噬作用(Endocytosis)，故以相當於黑色素體大小的螢光珠模擬黑色素體，觀察萃取物是否能抑制角質細胞吞噬黑色素體，了解其抑制變黑的作用機制。

本實驗先接種1×10 ⁴角質細胞於24孔盤中，用10%血清(生長因子)之培養基培養貼附後，在0~2%血清培養條件下加入米糠萃取物，共培養4~6小時後，之後加入粒徑大小相當於黑色素體的紅螢光微珠(0.5 μm)，作用2小時。移除未被吞噬的螢光微珠，細胞以4%福馬林溶液固定後，以DAPI進行細胞核染色，於螢光顯微鏡下(ex/em:580/605 nm)觀察計數50個細胞吞噬螢光微珠量計算平均值；0~5 顆:0 分，6~10 顆:1 分，11~15 顆:2 分，16~20 顆:3分，21~25 顆:4 分，≥26 顆:5 分。空白對照組PC為10% 生長因子濃度培養(10% 血清，充足營養，角質細胞不進行吞噬)，負對照組NC為不萃取物之0~2%血清培養(例如為2%血清，飢餓刺激角質細胞的吞噬作用)。

請參考圖6，其為米糠萃取物之黑色素體吞噬試驗結果；從圖6可知，藉由本發明的製備方法所獲得之米糠萃取物在16~40 μg/mL濃度下呈現濃度正相關之抑制角質細胞吞噬黑色素體之效果。

實驗8：抗衰老試驗(anti-senescence)

本實驗先接種5×10 ⁴纖維母細胞(fibroblast)於6孔盤中培養隔夜後，置換不含血清新培養液，並加入8 mM羥基脲(hydroxyurea)和萃取物共處理24小時。更換不含血清新培養液後再培養24小時，細胞用磷酸緩衝液潤洗2次後，以3.7%福馬林液固定，進行β-半乳糖苷酶染色。細胞背景值組(base line)為不處理羥基脲，負控制組NC為處理羥基脲，但不添加米糠萃取物，由於羥基脲誘導衰老會導致細胞中的β-半乳糖苷酶(SA-β-galactosidase)上升，使細胞染色後呈藍色，藍色比例越低表示細胞越具抗衰老特質。以光學顯微鏡觀察拍照，計數3~5個視野下，100顆細胞中呈藍色反應的比例。

請參考圖7，其為米糠萃取物之抗衰老試驗結果；從圖7可知，藉由本發明的製備方法所獲得之米糠萃取物能使細胞的藍色比例下降，且呈現濃度正相關，顯示具有抗衰老現象。

實驗9：抗發炎試驗(anti-inflammatory)

本實驗先接種2×10 ⁴巨噬細胞(RAW264.7)至96孔盤，待細胞貼附後，移除原培養液加入含有250 ng/mL 脂多醣(LPS)和米糠萃取物的新培養液，負對照組NC為不含米糠萃取物的培養液(不給予硝基精氨酸)，正對照組PC為給予1 mM硝基精氨酸(nitroarginine，LNNA)；LPS將誘發Nitrite上升，而LNNA將抑制Nitrite上升。細胞培養24小時收取培養液用Griess試劑反應檢測Nitrite生成量。Nitrite可作為細胞內發炎調節因子一氧化氮(NO)的指標，抑制NO生成代表具有抗發炎效果，因此，Nitrite生成量越少，消炎效果越好。

請參考圖8，其為米糠萃取物之抗發炎試驗結果；從圖8可知，藉由本發明的製備方法所獲得之米糠萃取物在500 μg/mL能明顯抑制Nitrite，具有抗發炎功效。

實驗10：抗過敏試驗(anti-allergy)

本實驗先接種3×10 ⁵噬鹼性白血球(RBL-2H3) 於24孔盤，培養24小時後移除原培養液。實驗組加入含米糠萃取物的培養液，細胞培養4~6小時後，加入500 ng/mL藥物A23187刺激30分鐘，收集培養上清液測定氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase)活性；細胞背景值組(base line)為不處理ketotifen、也不處理A23187，負對照組NC為不含米糠萃取物的培養液(不給予ketotifen，但有A23178誘發酵素活性)，正對照組PC為給予0.3 mM ketotifen後，給予A23178以誘發酵素活性；將30 μL培養上清液和50 μL酵素受質溶液(p-nitrophenyl N-acetyl-Dglucosamine，濃度1.3 mg/mL) 在37℃作用反應1小時，加入0.5 M氫氧化鈉溶液中止反應，以微量盤檢測儀偵測波長405 nm 吸收值。吸收值越低，表示β-hexosaminidase活性越低，越有減緩過敏的效果。A23187會誘導RBL-2H3細胞去顆粒化(degranulation)並釋放許多發炎介質，其中β-hexosaminidase常被作為檢測是否發生過敏的生化指標。

請參考圖9，其為米糠萃取物之抗過敏試驗結果；從圖9可知，藉由本發明的製備方法所獲得之米糠萃取物在500 μg/mL能明顯抑制β-hexosaminidase活性，具有抗過敏功效。

實驗11：加工處理步驟-製作液劑

本實驗分成油相、水相兩部分處理。油相：將米糠萃取物、乳化劑、甘油、防腐劑加熱至約50℃並進行混合。水相：將水、防腐劑、助溶劑等加熱至約50℃並進行混合。再將油相倒入水相中混合均勻，調製成含20~30%米糠萃取物之米糠萃取組合物(液劑)。

實驗12：加工處理步驟-製作粉劑.

本實驗考量製作護膚產品時，粉末原料在秤取、調配時較為方便，此外，為了驗證本發明的製備方法具有產業利用性，本實驗將萃取規模放大100倍，並將米糠萃取物進一步製成粉劑。

將10 kg米糠添加溶劑(60 L乙醇及7.5 L水之混合液)於42℃攪拌萃取1小時，離心後取上清液並過濾米糠，再加入溶劑(50 L乙醇及6.25 L水之混合液)，取得第二次萃取上清液。合併上清液、經過活性碳處理後，獲得的體積約100 L，進行減壓濃縮，得到濃縮液(米糠萃取物)約5 L，再添加防腐劑Spectrastat™ E及丁二醇，與3000 g麥芽糊精進行噴霧乾燥，以製成米糠萃取組合物(粉劑)。

實驗13：米糠萃取組合物之美白功效

前述實驗是以米糠萃取物進行，並已證實米糠萃取物以美白效果最顯著，因此，本實驗將米糠萃取組合物(粉劑)也進行與米糠萃取物類似之美白相關之細胞試驗，以證實本發明之製備方法所獲得之米糠萃取組合物也具有美白效果。

本實驗的方法與前述實驗6~7之黑色素生成抑制 (anti-melanogensis in B16F10 cells)試驗、黑色素體吞噬 (melanosome transfer to keratinocytes)試驗的實驗方法相同，只是將米糠萃取物置換成米糠萃取組合物(粉劑)。

請參考圖10~圖11，其分別為米糠萃取組合物之黑色素生成抑制試驗以及黑色素體吞噬試驗的結果；從圖10~圖11可知，藉由本發明的製備方法所獲得之米糠萃取組合物在0.1%濃度時，具有媲美500 μg/mL麴酸的抑制黑色素效果及抑制角質細胞吞噬黑色素體之效果。

實驗14：米糠萃取組合物指標成份

指標成份是用於確認批次萃取時的差異性，並作為調整濃縮液(米糠萃取物)與植物澱粉之噴霧乾燥比例；本實驗取米糠萃取組合物0.5~0.25 g加入10 mL水，混合均勻後，以20~50倍稀釋於100%甲醇，過濾後注射5 uL利用LC-MSMS進行葡萄糖神經醯胺(GluCer)的定量定性分析。使用管柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18 4.6*50 mm 2.7-Micron，移動相為0.5~5mM 醋酸銨的100% Methanol，流速1 mL/min，溫度40℃。必要時，可加入半乳糖神經醯胺(glalactosylceramide)作為內標。

請參考下述表1及圖12，其為各GluCer的離子參數及層析圖譜；從表1及圖12可知，本發明之製備方法所獲得之米糠萃取組合物中，GluCer濃度約0.01~0.03%。

[表1] GluCer的離子參數

		前體離子(precursor ion) Q1	產物離子(product ion) Q3
種類	RT時間 (RT time)	[M+H] ⁺	類神經鞘胺醇鹼(sphingoid base) [B+H-2H ₂O] ⁺	[M+H-180] ⁺	峰 (Peak)
d18:2-C16:0h	1.48	714.8	262.2	534.2
d18:2-C18:0h	1.85	742.8	262.2	562.2	1
d18:2-C19:0h	2.11	756.8	262.2	576.2
d18:2-C20:0h	2.38	770.8	262.2	590.4	2
d18:2-C22:0h	3.12	798.8	262.2	618.5	4
d18:2-C24:0h	4.18	826.8	262.2	646.5	6
t18:1-C22:0h	2.70	816.8	262.2	636.5	3
t18:1-C24:0h	3.57	844.8	280.2	664.5	5
t18:1-C26:0h	4.83	872.8	280.2	692.5	7
d18:1-C20:0h	2.37	772.6	264.2	592.5

實驗15：溫度的重要性

本實驗是用於說明本發明之製備方法所限定的溫度的重要性；將4 kg米糠添加溶劑(24 L乙醇及3 L水之混合液)於42℃攪拌萃取1小時，離心後取上清液並過濾米糠，再加入溶劑(20L乙醇及2.5L水之混合液)，取得第二次萃取上清液。合併上清液及活性碳處理後，獲得之體積約為40 L，進行減壓濃縮，得到濃縮液(米糠萃取物)約為1.9 L，再添加防腐劑Spectrastat™ E及丁二醇，與2500 g麥芽糊精進行噴霧乾燥。利用LC-MSMS測得GluCer濃度0.019%，此為正常組。

將10 kg米糠添加溶劑(60 L乙醇及7.5 L水之混合液)於42℃攪拌萃取1小時，離心後取上清液並過濾米糠，再加入溶劑(50 L乙醇及6.25 L水之混合液)，取得第二次萃取上清液。合併上清液及活性碳處理後，獲得之體積約為105 L，進行減壓濃縮，得到濃縮液(米糠萃取物)約為5 L，再添加防腐劑Spectrastat™ E及丁二醇，取約2.5 L的濃縮液放入70℃水浴、1小時，高溫處理。之後，再與3000 g麥芽糊精進行噴霧乾燥，利用LC-MSMS測得GluCer濃度約0.029%，此為高溫處理組。米糠萃取組合物中GluCer濃度較高，理論上含有美白組成也相對較高、細胞試驗的結果應該更好。

實驗方法與實驗6~7類似，只是將米糠萃取物置換成正常組及高溫處理組；請參考圖13~圖14，其分別為米糠萃取組合物(正常組、高溫處理組)之黑色素生成抑制試驗以及黑色素體吞噬試驗的結果；從圖13~圖14可知，高溫處理組雖然有較高GluCer濃度 (0.029%)，但黑色素生成抑制試驗、黑色素體吞噬試驗結果卻僅正常組(0.019% GluCer)的一半，萃取溫度高低著實影響組合物的美白效力。因此，本發明之製備方法所限定的溫度需低於55℃，最好落在40~50℃，以確保美白功效。

綜上所述，本發明將常被廢棄卻有富含保健元素之米糠進行資源回收再利用，製作成米糠萃取組合物，其製程步驟簡單，且經減壓濃縮後的溶劑可以再回收，並再次作為本發明的溶劑使用，即本發明可以達到節省資源使用、循環經濟的效益，屬於綠色技術之範疇。此外，米糠萃取組合物具有美白、抗衰老、抗發炎、抗過敏等功效。

以上所述之實施例僅係為說明本發明之技術思想及特點，其目的使熟習此項技藝人士能夠瞭解本發明之內容並據以實施，當不能以之限定本發明之專利範圍，即凡大依本發明所揭示之精神所作之均等變化或修飾，仍應涵蓋在本發明之專利範圍內。

無。

圖1為本發明之一實施例的米糠萃取物之細胞毒性測試。圖2為本發明之一實施例的米糠萃取物之光毒性測試。圖3為本發明之一實施例的米糠萃取物之皮膚刺激性測試。圖4為本發明之一實施例的米糠萃取物之體外酪胺酸酶活性抑制試驗(in vitro inhibition of tyrosinase)。圖5為本發明之一實施例的米糠萃取物之黑色素生成抑制試驗(anti-melanogensis in B16F10 cells)。圖6為本發明之一實施例的米糠萃取物之黑色素體吞噬試驗(melanosome transfer to keratinocytes)。圖7為本發明之一實施例的米糠萃取物之抗衰老試驗(anti-senescence)。圖8為本發明之一實施例的米糠萃取物之抗發炎試驗(anti-inflammatory)。圖9為本發明之一實施例的米糠萃取物之抗過敏試驗(anti-allergy)。圖10為本發明之一實施例的米糠萃取物組合物之黑色素生成抑制試驗。圖11為本發明之一實施例的米糠萃取物組合物之黑色素體吞噬試驗。圖12為本發明之一實施例的葡萄糖神經醯胺之質譜參數及分析圖譜。圖13為本發明之一實施例的高溫處理對米糠萃取物組合物之黑色素生成抑制試驗。圖14為本發明之一實施例的高溫處理對米糠萃取物組合物之黑色素體吞噬試驗。

無。

Claims

一種米糠萃取組合物之製備方法，其步驟包含：將米糠與濃度大於80%的溶劑進行混合以獲得混合液，並於攪拌萃取溫度為40~50℃且不包含50℃的環境下攪拌萃取；將該混合液進行離心或過濾，以收取上清液或濾液；將該上清液或濾液進行減壓濃縮以獲得米糠萃取物；以及將該米糠萃取物加工處理為米糠萃取組合物；其中該米糠為脫脂或未脫脂的米糠，該米糠與該溶劑之米糠：溶劑體積的混合比例為1：4~1：8，該重量的單位為公克，該體積的單位為毫升；其中該溶劑是乙醇體積：水體積為100~80：0~20之溶劑；或是丙醇體積：水體積為100~80：0~20之溶劑。
如請求項1所述之米糠萃取組合物之製備方法，其中該上清液或濾液於進行該減壓濃縮之前，包含使用活性碳除色及淨化的步驟，且該減壓濃縮為利用減壓蒸餾的方法使該上清液或濾液的體積濃縮18~22倍以獲得該米糠萃取物。
如請求項1所述之米糠萃取組合物之製備方法，其中該加工處理為添加賦形劑以製作成米糠萃取組合物，其中該賦形劑包含水、油、乳化劑、防腐劑、助溶劑，使該米糠萃取組合物成為包含20~30%之該米糠萃取物的液劑的劑型。
如請求項1所述之米糠萃取組合物之製備方法，其中該加工處理為添加植物澱粉以製作成米糠萃取組合物，其中該植物澱粉的添加比例為米糠萃取物體積：植物澱粉重量為1：0.4~1：2，並進行噴霧乾燥使該米糠萃取組合物成為粉劑的劑型；該重量的單位為公克，該體積的單位為毫升。
如請求項4所述之米糠萃取組合物之製備方法，其中於該噴霧乾燥之前包含添加乳化劑、防腐劑、助溶劑的步驟；該植物澱粉包含麥芽糊精、玉米澱粉、小麥澱粉、大米澱粉、或木薯澱粉。
如請求項4所述之米糠萃取組合物之製備方法，其中藉由測定該米糠萃取物中葡萄糖神經醯胺的濃度來調整該米糠萃取物與該植物澱粉的添加比例。
一種米糠萃取組合物用於皮膚保健之用途，其中該米糠萃取組合物是藉由如請求項1所述之製備方法而成，該米糠萃取組合物無細胞毒性、無光毒性、無皮膚刺激性，且該皮膚保健包含皮膚美白、抗衰老、抗發炎、抗過敏。
如請求項7所述之米糠萃取組合物用於皮膚保健之用途，其中該米糠萃取物的有效劑量為7.8~1000μg/ml。