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TWI831797B - 靶向adam9之免疫接合物及其使用方法 - Google Patents

靶向adam9之免疫接合物及其使用方法 Download PDF

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TWI831797B TW108122055A TW108122055A TWI831797B TW I831797 B TWI831797 B TW I831797B TW 108122055 A TW108122055 A TW 108122055A TW 108122055 A TW108122055 A TW 108122055A TW I831797 B TWI831797 B TW I831797B
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Abstract

本發明係關於免疫接合物，其包含能夠特異性地結合至與至少一種類美登素化合物接合之「含解整合素與金屬蛋白酶結構域之蛋白質9」 (「ADAM9 」)之抗體或其片段。本發明特定而言係關於與人類ADAM9及非人類靈長類動物(例如食蟹猴)之ADAM9交叉反應之此類免疫接合物。本發明另外係關於所有此類免疫接合物，其包含已經人源化及/或經去免疫化以在向接受個體投予此免疫接合物後展現降低之免疫原性的輕鏈可變(VL)結構域及/或重鏈可變(VH)結構域。本發明亦係關於含有此類免疫接合物中之任一者之醫藥組合物，及涉及使用此類免疫接合物中之任一者治療癌症及其他疾病及病狀之方法。

Description

靶向ADAM9之免疫接合物及其使用方法
本發明係關於免疫接合物，其包含能夠特異性地結合至與至少一種藥用劑接合之「含解整合素與金屬蛋白酶結構域之蛋白質9」 (「ADAM9 」)之抗體或其片段。本發明特定而言係關於與人類ADAM9及非人類靈長類動物(例如食蟹猴)之ADAM9交叉反應之此類免疫接合物。本發明另外係關於所有此類免疫接合物，其包含已經人源化及/或經去免疫化以在向接受個體投予此類免疫接合物後展現降低之免疫原性的輕鏈可變(VL)結構域及/或重鏈可變(VH)結構域。本發明亦係關於含有此類免疫接合物中之任一者之醫藥組合物，及涉及使用此類免疫接合物中之任一者治療癌症及其他疾病及病狀之方法。
ADAM為涉及於各種生理及病理過程中之蛋白質家族(Amendola, R.S.等人 (2015) 「ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2 」, J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962；Edwars, D.R.等人 (2008) 「The ADAM Metalloproteases 」, Molec. Aspects Med. 29:258-289)。已鑑別該家族之至少40個基因成員，且據信此類成員中之至少21個在人類中具功能性(Li, J.等人 (2016) 「Overexpression of ADAM9 Promotes Colon Cancer Cells Invasion 」, J. Invest. Surg. 26(3):127-133；Duffy, M.J.等人 (2011) 「The ADAMs Family Of Proteases: New Biomarkers And Therapeutic Targets For Cancer ?」, Clin. Proteomics 8:9:1-13；亦參見美國專利公開案第2013/0045244號)。
ADAM家族成員具有充分保守結構，該結構具有8個結構域，其中有金屬蛋白酶結構域及整合素結合(解整合素)結構域(Duffy, M.J.等人 (2009) 「The Role Of ADAMs In Disease Pathophysiology 」, Clin. Chim. Acta 403:31-36)。ADAM金屬蛋白酶結構域充當脫落酶(sheddase)且已報導藉由使跨膜蛋白裂解而調節一系列生物過程，該結構域接著可充當可溶性配位體且調控細胞信號傳導(Amendola, R.S.等人 (2015) 「ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2 」, J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962；Ito, N.等人 (2004) 「ADAMs, A Disintegrin And Metalloproteinases, Mediate Shedding Of Oxytocinase 」, Biochem. Biophys. Res. Commun. 314 (2004) 1008-1013)。
ADAM9為ADAM分子家族之成員。ADAM9以非活性形式合成，其經蛋白水解性裂解以產生活性酶。在下游位點處加工對於酶原之活化尤為重要。ADAM9在以下細胞中表現：纖維母細胞(Zigrino, P.等人 (2011) 「The Disintegrin-Like And Cysteine-Rich Domains Of ADAM-9 Mediate Interactions Between Melanoma Cells And Fibroblasts 」, J. Biol. Chem. 286:6801-6807)、經活化之血管平滑肌細胞(Sun, C.等人 (2010) 「ADAM15 Regulates Endothelial Permeability And Neutrophil Migration Via Src/ERK1/2 Signalling 」, Cardiovasc. Res. 87:348-355)、單核細胞(Namba, K.等人 (2001) 「Involvement Of ADAM9 In Multinucleated Giant Cell Formation Of Blood Monocytes 」, Cell. Immunol. 213:104-113)、經活化之巨噬細胞(Oksala, N.等人 (2009) 「ADAM-9, ADAM-15, And ADAM-17 Are Upregulated In Macrophages In Advanced Human Atherosclerotic Plaques In Aorta And Carotid And Femoral Arteries - Tampere Vascular Study 」, Ann. Med. 41:279-290)。
ADAM9之金屬蛋白酶活性參與基質組分之降解，從而允許腫瘤細胞遷移(Amendola, R.S.等人 (2015) 「ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2 」, J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962)。與許多蛇毒解整合素高度同源之其解整合素結構域允許ADAM9與整合素之間相互作用，且使ADAM9能夠正向或負向調節細胞黏著事件(Zigrino, P.等人 (2011) 「The Disintegrin-Like And Cysteine-Rich Domains Of ADAM-9 Mediate Interactions Between Melanoma Cells And Fibroblasts 」, J. Biol. Chem. 286:6801-6807；Karadag, A.等人 (2006) 「ADAM-9 (MDC-9/Meltringamma), A Member Of The A Disintegrin And Metalloproteinase Family, Regulates Myeloma-Cell-Induced Interleukin-6 Production In Osteoblasts By Direct Interaction With The Alpha(v)Beta5 Integrin 」, Blood 107:3271-3278；Cominetti, M.R.等人 (2009) 「Inhibition Of Platelets And Tumor Cell Adhesion By The Disintegrin Domain Of Human ADAM9 To Collagen I Under Dynamic Flow Conditions 」, Biochimie, 91:1045-1052)。已顯示ADAM9解整合素結構域與α6β1、α6β4、αvβ5及α9β1整合素相互作用。
已發現ADAM9之表現與疾病、尤其癌症有關。已發現ADAM9裂解並釋放許多在腫瘤形成及血管生成中具有重要作用之分子，諸如TEK、KDR、EPHB4、CD40、VCAM1及CDH5。ADAM9係由許多類型之腫瘤細胞表現，包括以下疾病之腫瘤細胞：乳癌、結腸癌、胃癌、神經膠質瘤、肝癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤、骨髓瘤、胰臟癌及前列腺癌(Yoshimasu, T.等人 (2004) 「Overexpression Of ADAM9 In Non-Small Cell Lung Cancer Correlates With Brain Metastasis 」, Cancer Res. 64:4190-4196；Peduto, L.等人 (2005) 「Critical Function For ADAM9 In Mouse Prostate Cancer 」, Cancer Res. 65:9312-9319；Zigrino, P.等人 (2005) 「ADAM-9 Expression And Regulation In Human Skin Melanoma And Melanoma Cell Lines 」, Int. J. Cancer 116:853-859；Fritzsche, F.R.等人 (2008) 「ADAM9 Is Highly Expressed In Renal Cell Cancer And Is Associated With Tumour Progression 」, BMC Cancer 8:179:1-9；Fry, J.L.等人 (2010) 「Secreted And Membrane-Bound Isoforms Of Protease ADAM9 Have Opposing Effects On Breast Cancer Cell Migration 」, Cancer Res. 70, 8187-8198；Chang, L.等人 (2016) 「Combined Rnai Targeting Human Stat3 And ADAM9 As Gene Therapy For Non-Small Cell Lung Cancer 」, Oncology Letters 11:1242-1250；Fan, X.等人 (2016) 「ADAM9 Expression Is Associate with Glioma Tumor Grade and Histological Type, and Acts as a Prognostic Factor in Lower-Grade Gliomas 」, Int. J. Mol. Sci. 17:1276:1-11)。
已發現增加之ADAM9表現與腫瘤惡性及轉移潛力顯著正相關(Amendola, R.S.等人 (2015) 「ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2 」, J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962；Fan, X.等人 (2016) 「ADAM9 Expression Is Associate with Glioma Tumor Grade and Histological Type, and Acts as a Prognostic Factor in Lower-Grade Gliomas 」, Int. J. Mol. Sci. 17:1276:1-11；Li, J.等人 (2016) 「Overexpression of ADAM9 Promotes Colon Cancer Cells Invasion 」, J. Invest. Surg. 26(3):127-133)。另外，ADAM9及其分泌可溶性同功型似乎對於癌細胞播散而言至關重要(Amendola, R.S.等人 (2015) 「ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2 」, J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962；Fry, J.L.等人 (2010) 「Secreted And Membrane-Bound Isoforms Of Protease ADAM9 Have Opposing Effects On Breast Cancer Cell Migration 」, Cancer Res. 70, 8187-8198；Mazzocca, A. (2005) 「ASecreted Form Of ADAM9 Promotes Carcinoma Invasion Through Tumor-Stromal Interactions 」, Cancer Res. 65:4728-4738；亦參見美國專利第9,150,656號、第7,585,634號、第7,829,277號，第8,101,361號及第8,445,198號，及美國專利公開案第2009/0023149號)。
許多研究因此已將ADAM9鑑別為抗癌療法之潛在標靶(Peduto, L. (2009) 「ADAM9 As A Potential Target Molecule In Cancer 」, Curr. Pharm. Des. 15:2282-2287；Duffy, M.J.等人 (2009) 「Role Of ADAMs In Cancer Formation And Progression 」, Clin. Cancer Res. 15:1140-1144；Duffy, M.J.等人 (2011) 「The ADAMs Family Of Proteases: New Biomarkers And Therapeutic Targets For Cancer ?」, Clin. Proteomics 8:9:1-13；Josson, S.等人 (2011) 「Inhibition of ADAM9 Expression Induces Epithelial Phenotypic Alterations and Sensitizes Human Prostate Cancer Cells to Radiation and Chemotherapy 」, Prostate 71(3):232-240；亦參見美國專利公開案第2016/0138113號、第2016/0068909號、第2016/0024582號、第2015/0368352號、第2015/0337356號、第2015/0337048號、第2015/0010575號、第2014/0342946號、第2012/0077694號、第2011/0151536號、第2011/0129450號、第2010/0291063號、第2010/0233079號、第2010/0112713號、第2009/0285840號、第2009/0203051號、第2004/0092466號、第2003/0091568號及第2002/0068062號，及PCT公開案第WO 2016/077505號、第WO 2014/205293號、第WO 2014/186364號、第WO 2014/124326號、第WO 2014/108480號、第WO 2013/119960號、第WO 2013/098797號、第WO 2013/049704號及第WO 2011/100362號)。另外，亦已發現ADAM9之表現與肺病及炎症有關(參見例如美國專利公開案第2016/0068909號、第2012/0149595號、第2009/0233300號、第2006/0270618號及第2009/0142301號)。結合至ADAM9之抗體可購自Abcam、Thermofisher、Sigma-Aldrich及其他公司。
然而，儘管有所有先前進展，但仍需要高親和力ADAM9靶向免疫接合物，其展現與正常組織之最小結合且能夠以類似高親和力結合至人類及非人類ADAM9。本發明解決此需要及用於癌症之改良治療劑之需要。
本發明係關於免疫接合物，其包含能夠特異性地結合至與至少一種本文所述之類美登素(maytansinoid)接合之「含解整合素與金屬蛋白酶結構域之蛋白質9」 (「ADAM9 」)之抗體或其片段。本發明特定而言係關於與人類ADAM9及非人類靈長類動物(例如食蟹猴)之ADAM9交叉反應之此類免疫接合物。本發明另外係關於所有此類免疫接合物，其包含已經人源化及/或經去免疫化以在向接受個體投予此類免疫接合物後展現降低之免疫原性的輕鏈可變(VL)結構域及/或重鏈可變(VH)結構域。本發明亦係關於含有此類免疫接合物中之任一者之醫藥組合物，及涉及使用此類免疫接合物中之任一者治療癌症及其他疾病及病狀之方法。
詳言之，本發明提供一種由下式表示之免疫接合物： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： CB為抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段； L2 由下式中之一者表示：(L2a)，(L2b)，(L2c)，(L2d)，或(L2e)； 其中： Rx 、Ry 、Rx' 及Ry' 對於每次出現而言獨立地為H、-OH、鹵素、-O-(C1-4 烷基)、-SO3 H、-NR40 R41 R42 + ，或視情況經-OH、鹵素、SO3 H或NR40 R41 R42 + 取代之C1-4 烷基，其中R40 、R41 及R42 各自獨立地為H或C1-4 烷基； l及k各自獨立地為1至10之整數； l1為2至5之整數； k1為1至5之整數；且 s1指示連接至細胞結合劑CB之位點且s3指示連接至A基團之位點； A為胺基酸殘基或包含2至20個胺基酸殘基之肽； R1 及R2 各自獨立地為H或C1-3 烷基； L1 由下式表示： 其中R3 及R4 各自獨立地為H或Me，且L1 中之-C(=O)-部分連接至D； D由下式表示：； q為1至20之整數。
在某些實施方案中，抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含輕鏈可變(VL)結構域及重鏈可變(VH)結構域，其中重鏈可變結構域包含CDRH 1結構域、CDRH 2結構域及CDRH 3結構域，且輕鏈可變結構域包含CDRL 1結構域、CDRL 2結構域及CDRL 3結構域，其中： (A) 該等CDRH 1結構域、CDRH 2結構域及CDRH 3結構域具有MAB-A之最佳化變異體之重鏈可變(VH)結構域之CDRH 1結構域、CDRH 2結構域及CDRH 3結構域之胺基酸序列；且該等CDRL 1結構域、CDRL 2結構域及CDRL 3結構域具有MAB-A之輕鏈可變(VL)結構域之CDRL 1結構域、CDRL 2結構域及CDRL 3結構域之胺基酸序列；或 (B)  該等CDRH 1結構域、CDRH 2結構域及CDRH 3結構域具有MAB-A之重鏈可變(VH)結構域之CDRH 1結構域、CDRH 2結構域及CDRH 3結構域之胺基酸序列；且該等CDRL 1結構域、CDRL 2結構域及CDRL 3結構域具有MAB-A之最佳化變異體之輕鏈可變(VL)結構域之CDRL 1結構域、CDRL 2結構域及CDRL 3結構域之胺基酸序列；或 (C)  該等CDRH 1結構域、CDRH 2結構域及CDRH 3結構域具有MAB-A之最佳化變異體之重鏈可變(VH)結構域之CDRH 1結構域、CDRH 2結構域及CDRH 3結構域之胺基酸序列；且該等CDRL 1結構域、CDRL 2結構域及CDRL 3結構域具有MAB-A之最佳化變異體之輕鏈可變(VL)結構域之CDRL 1結構域、CDRL 2結構域及CDRL 3結構域之胺基酸序列。
在某些實施方案中，抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含： (A) (1) MAB-A之重鏈可變(VH)結構域之CDRH 1結構域、CDRH 2結構域及CDRH 3結構域；及 (2) MAB-A之人源化變異體之VH結構域之FR1、FR2、FR3及FR4；或 (B) (1) MAB-A之輕鏈可變(VL)結構域之CDRL 1結構域、CDRL 2結構域及CDRL 3結構域；及 (2) MAB-A之人源化變異體之VL結構域之FR1、FR2、FR3及FR4；或 (C) (1) MAB-A之最佳化變異體之重鏈可變(VH)結構域之CDRH 1結構域、CDRH 2結構域及CDRH 3結構域；及 (2) MAB-A之人源化變異體之VH結構域之FR1、FR2、FR3及FR4；或 (D) (1) MAB-A之最佳化變異體之輕鏈可變(VL)結構域之CDRL 1結構域、CDRL 2結構域及CDRL 3結構域；及 (2) MAB-A之人源化變異體之VL結構域之FR1、FR2、FR3及FR4；或 (E) (1) MAB-A之人源化/最佳化變異體之重鏈可變(VH)結構域；及 (2) MAB-A之人源化/最佳化變異體之VL輕鏈可變(VL)結構域。
在某些實施方案中，MAB-A之最佳化變異體之重鏈可變(VH)結構域之CDRH 1結構域、CDRH 2結構域及CDRH 3結構域具有以下胺基酸序列： (1)SEQ ID NO:47 (SYWX1 H) 其中：X1 為M或I； (2)SEQ ID NO:48 (EIIPIX2 GHTNYNEX3 FX4 X5 ) 其中：X2 、X3 、X4 及X5 經獨立地選擇，且 其中：X 2 為N或F；X 3 為K或R；X 4 為K或Q；且X 5 為S或G；及 (3)SEQ ID NO:49 (GGYYYYX6 X7 X8 X9 X10 X11 DY) 其中：X6 為P、F、Y、W、I、L、V、T、G或D，且X7 、X8 、X9 、X10 及X11 經選擇以使得： (A) 當X6 為P時：X7 為K或R；X8 為F或M；X9 為G；X10 為W或F；且X11 為M、L或K； (B) 當X6 為F、Y或W時：X7 為N或H；X8 為S或K；X9 為G或A；X10 為T或V；且X11 為M、L或K； (C) 當X6 為I、L或V時：X7 為G；X8 為K；X9 為G或A；X10 為V；且X11 為M、L或K； (D) 當X6 為T時：X7 為G；X8 為K、M或N；X9 為G；X10 為V或T；且X11 為L或M； (E) 當X6 為G時：X7 為G；X8 為S；X9 為G；X10 為V；且X11 為L；及 (F) 當X6 為D時：X7 為S；X8 為N；X9 為A；X10 為V；且X11 為L。
在某些實施方案中，MAB-A之最佳化變異體之重鏈可變(VH)結構域包含SEQ ID NO:15 之胺基酸序列： 其中：X1 、X2 、X3 、X4 、X5 及X6 經獨立地選擇， 其中：X1 為M或I；X2 為N或F；X 3 為K或R；X 4 為K或Q；X 5 為S或G，且X6 為P、F、Y、W、I、L、V、T、G或D； 其中：X7 、X8 、X9 、X10 及X11 經選擇以使得： 當X6 為P時；X7 為K或R；X8 為F或M；X9 為G；X10 為W或F；且X11 為M、L或K； 當X6 為F、Y或W時；X7 為N或H；X8 為S或K；X9 為G或A；X10 為T或V；且X11 為M、L或K； 當X6 為I、L或V時；X7 為G；X8 為K；X9 為G或A；X10 為V；且X11 為M、L或K； 當X6 為T時；X7 為G；X8 為K、M或N；X9 為G；X10 為V或T；且X11 為L或M； 當X6 為G時；X7 為G；X8 為S；X9 為G；X10 為V；且X11 為L； 當X6 為D時；X7 為S；X8 為N；X9 為A；X10 為V；且X11 為L。
在某些實施方案中，MAB-A之最佳化變異體之重鏈可變(VH)結構域選自由以下組成之群： (1) hMAB-A VH(1) (SEQ ID NO:16 )； (2) hMAB-A VH(2) (SEQ ID NO:17 )； (3) hMAB-A VH(3) (SEQ ID NO:18 )； (4) hMAB-A VH(4) (SEQ ID NO:19 )； (5) hMAB-A VH(2A) (SEQ ID NO:20 )； (6) hMAB-A VH(2B) (SEQ ID NO:21 )； (7) hMAB-A VH(2C) (SEQ ID NO:22 )； (8) hMAB-A VH(2D) (SEQ ID NO:23 )； (9) hMAB-A VH(2E) (SEQ ID NO:24 )； (10) hMAB-A VH(2F) (SEQ ID NO:25 )； (11) hMAB-A VH(2G) (SEQ ID NO:26 )； (12) hMAB-A VH(2H) (SEQ ID NO:27 )； (13) hMAB-A VH(2I) (SEQ ID NO:28 )；及 (14) hMAB-A VH(2J) (SEQ ID NO:29 )。
在某些實施方案中，MAB-A之最佳化變異體之輕鏈可變(VL)結構域之CDRL 1結構域、CDRL 2結構域及CDRL 3結構域分別具有以下胺基酸序列： (1)SEQ ID NO :66 (X12 ASQSVDYX13 GDSYX14 N) 其中：X12 、X13 、X14 經獨立地選擇，且 其中：X12 為K或R；X13 為D或S；且X14 為M或L； (2)SEQ ID NO:13 (AASDLES)；及 (3)SEQ ID NO:67 (QQSX15 X16 X17 PFT) 其中：X15 、X16 及X17 經獨立地選擇，且 其中：X15 為H或Y；X16 為E或S；且X17 為D或T。
在某些實施方案中，輕鏈可變(VL)結構域包含SEQ ID NO:53 之胺基酸序列： 其中：X12 、X13 、X14 、X15 、X16 及X17 經獨立地選擇，且 其中：X12 為K或R；X13 為D或S；X14 為M或L；X15 為H或Y；X16 為E或S；且X17 為D或T。
在某些實施方案中，MAB-A之最佳化變異體之輕鏈可變(VL)結構域選自由以下組成之群： (1) hMAB-A VL(1) (SEQ ID NO:54 )； (2) hMAB-A VL(2) (SEQ ID NO:55 )； (3) hMAB-A VL(3) (SEQ ID NO:56 )； (4) hMAB-A VL(4) (SEQ ID NO:57 )； (5) hMAB-A VL(2A) (SEQ ID NO:20 )。
在某些實施方案中，CDRH 1結構域包含胺基酸序列SYWMH (SEQ ID NO: 8 )，CDRH 2結構域包含胺基酸序列EIIPIFGHTNYNEKFKS (SEQ ID NO:35 )，且CDRH 3結構域包含胺基酸序列GGYYYYPRQGFLDY (SEQ ID NO:45 )。
在某些實施方案中，CDRL 1結構域包含胺基酸序列KASQSVDYSGDSYMN (SEQ ID NO:62 )，CDRL 2結構域包含胺基酸序列AASDLES (SEQ ID NO:13 )，且CDRL 3結構域包含胺基酸序列QQSHEDPFT (SEQ ID NO:14 )。
在某些實施方案中，免疫接合物包含： (A) hMAB-A (2I.2 ) (SEQ ID NO:28 )之重鏈可變(VH)結構域；或 (B) hMAB-A (2I.2 ) (SEQ ID NO:55 )之輕鏈可變(VL)結構域；或 (C) hMAB-A (2I.2 ) (SEQ ID NO:28 )之重鏈可變(VH)結構域及hMAB-A (2I.2 ) (SEQ ID NO:55 )之輕鏈可變(VL)結構域。
在某些實施方案中，免疫接合物包含Fc區。在一些實施方案中，Fc區為包含以下之變異體Fc區：(a) 降低變異體Fc區對FcγR之親和力之一或多個胺基酸修飾；及/或(b) 引入半胱胺酸殘基之一或多個胺基酸修飾。在一些實施方案中，降低變異體Fc區對FcγR之親和力之一或多個胺基酸修飾包含：(A) L234A；(B) L235A；或 (C) L234A及L235A；其中該編號為Kabat中之EU索引之編號。在一些實施方案中，引入半胱胺酸殘基之一或多個胺基酸修飾包含S442C，其中該編號為Kabat中之EU索引之編號。
在某些實施方案中，本發明之免疫接合物包含特異性地結合至人類ADAM9及食蟹猴ADAM9之人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其中人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段接合至藥用劑。
在一些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有選自由以下組成之群之序列的CDRH 1結構域、CDRH 2結構域及CDRH 3結構域以及CDRL 1結構域、CDRL 2結構域及CDRL 3結構域： (a) 分別為SEQ ID NO: 8、35及10以及SEQ ID NO: 62、13、14； (b) 分別為SEQ ID NO: 8、35及10以及SEQ ID NO: 63、13、14； (c) 分別為SEQ ID NO: 8、36及10以及SEQ ID NO: 63、13、14；及 (d) 分別為SEQ ID NO: 34、36及10以及SEQ ID NO: 64、13、65。
在一些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有與選自由以下組成之群之序列至少90%、至少95%或至少99%一致之序列的重鏈可變結構域(VH)及輕鏈可變結構域(VL)： (a) 分別為SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:55； (b) 分別為SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:56； (c) 分別為SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:56；及(d) 分別為SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:57。
在某些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有選自由以下組成之群之序列的重鏈可變結構域(VH)及輕鏈可變結構域(VL)： (a) 分別為SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:55； (b) 分別為SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:56； (c) 分別為SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:56；及 (d) 分別為SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:57。
在某些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段經最佳化以與嵌合或鼠類親本抗體相比，對食蟹猴ADAM9之結合親和力提高至少100倍且保留對人類ADAM9之高親和力結合。
在某些實施方案中，抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有選自由以下組成之群之序列的CDRH 1結構域、CDRH 2結構域及CDRH 3結構域以及CDRL 1結構域、CDRL 2結構域及CDRL 3結構域： (a) 分別為SEQ ID NO: 8、35及37以及SEQ ID NO: 62、13、14； (b) 分別為SEQ ID NO: 8、35及38以及SEQ ID NO: 62、13、14； (c) 分別為SEQ ID NO: 8、35及39以及SEQ ID NO: 62、13、14； (d) 分別為SEQ ID NO: 8、35及40以及SEQ ID NO: 62、13、14； (e) 分別為SEQ ID NO: 8、35及41以及SEQ ID NO: 62、13、14； (f) 分別為SEQ ID NO: 8、35及42以及SEQ ID NO: 62、13、14； (g) 分別為SEQ ID NO: 8、35及43以及SEQ ID NO: 62、13、14； (h) 分別為SEQ ID NO: 8、35及44以及SEQ ID NO: 62、13、14； (i) 分別為SEQ ID NO: 8、35及45以及SEQ ID NO: 62、13、14；及 (j) 分別為SEQ ID NO: 8、35及46以及SEQ ID NO: 62、13、14。
在某些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有與選自由以下組成之群之序列至少90%、至少95%或至少99%一致之序列的重鏈可變結構域(VH)及輕鏈可變結構域(VL)： (a) 分別為SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:55； (b) 分別為SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:55； (c) 分別為SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:55； (d) 分別為SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:55； (e) 分別為SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:55； (f) 分別為SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:55； (g) 分別為SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:55； (h) 分別為SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:55； (i) 分別為SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:55；及 (j) 分別為SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:55。
在某些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有選自由以下組成之群之序列的重鏈可變結構域(VH)及輕鏈可變結構域(VL)： (a) 分別為SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:55； (b) 分別為SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:55； (c) 分別為SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:55； (d) 分別為SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:55； (e) 分別為SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:55； (f) 分別為SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:55； (g) 分別為SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:55； (h) 分別為SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:55； (i) 分別為SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:55；及 (j) 分別為SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:55。
在某些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體為包含Fc區之全長抗體。在一些實施方案中，Fc區為包含以下之變異體Fc區： (a) 降低變異體Fc區對FcγR之親和力之一或多個胺基酸修飾，其選自由以下組成之群：L234A、L235A及L234A與L235A；及/或 (b) 在S442處引入半胱胺酸殘基之胺基酸修飾，其中該編號為Kabat中之EU索引之編號；及/或 (c) 延長針對FcRn之變異體Fc區之半衰期之一或多個胺基酸取代，其選自由以下組成之群：M252Y、S254T及T256E。
在一些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體包含具有選自由以下組成之群之序列的重鏈及輕鏈： (a) 分別為SEQ ID NO:50及SEQ ID NO:68； (b) 分別為SEQ ID NO:51及SEQ ID NO:68；及 (c) 分別為SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:68。
在某些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體包含具有選自由以下組成之群之序列的重鏈及輕鏈： (a) 分別為SEQ ID NO:141及SEQ ID NO:68； (b) 分別為SEQ ID NO:142及SEQ ID NO:68； (c) 分別為SEQ ID NO:143及SEQ ID NO:68； (d) 分別為SEQ ID NO:151及SEQ ID NO:68； (e) 分別為SEQ ID NO:152及SEQ ID NO:68； (f) 分別為SEQ ID NO:153及SEQ ID NO:68；及 (g) 分別為SEQ ID NO:154及SEQ ID NO:68。
在某些實施方案中，SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153或SEQ ID NO:154中之X為離胺酸。
在某些實施方案中，SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153或SEQ ID NO:154中之X不存在。
在某些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體包含分別具有SEQ ID NO:156及SEQ ID NO:68之序列的重鏈及輕鏈。在某些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體包含分別具有SEQ ID NO:155及SEQ ID NO:68之序列的重鏈及輕鏈。
在某些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體包含由SEQ ID NO:157編碼之輕鏈，及由以下編碼之重鏈：(i) SEQ ID NO:159，(ii) SEQ ID NO:160，(iii) SEQ ID NO:161，或(iv) SEQ ID NO:162。
在某些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體包含由SEQ ID NO:158編碼之輕鏈，及由以下編碼之重鏈：(i) SEQ ID NO:159，(ii) SEQ ID NO:160，(iii) SEQ ID NO:161，或(iv) SEQ ID NO:162。
在某些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體包含由SEQ ID NO:157編碼之輕鏈及由SEQ ID NO:161編碼之重鏈。
在某些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體包含由SEQ ID NO:157編碼之輕鏈及由SEQ ID NO:162編碼之重鏈。
在某些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體包含由SEQ ID NO:158編碼之輕鏈及由SEQ ID NO:161編碼之重鏈。
在某些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體包含由SEQ ID NO:158編碼之輕鏈及由SEQ ID NO:162編碼之重鏈。
在某些實施方案中，本發明之免疫接合物由下式表示：， 其中： CBA為人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其包含分別具有SEQ ID NO: 8、35及45以及SEQ ID NO: 62、13、14之序列的CDRH 1結構域、CDRH 2結構域及CDRH 3結構域以及CDRL 1結構域、CDRL 2結構域及CDRL 3結構域； q為1或2； D1 由下式表示：。
在某些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含分別具有SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:55之序列的重鏈可變結構域(VH)及輕鏈可變結構域(VL)。在一些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體包含分別具有SEQ ID NO:142及SEQ ID NO:68之序列的重鏈及輕鏈。在一些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體包含分別具有SEQ ID NO:152及SEQ ID NO:68之序列的重鏈及輕鏈。在一些實施方案中，在一些實施方案中，SEQ ID NO:142或SEQ ID NO:152中之X為離胺酸。在一些實施方案中，在一些實施方案中，SEQ ID NO:142或SEQ ID NO:152中之X不存在。在一些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體包含分別具有SEQ ID NO:156及SEQ ID NO:68之序列的重鏈及輕鏈。在一些實施方案中，包含免疫接合物之組合物(例如醫藥組合物)之DAR值在1.0至2.5、1.5至2.5、1.8至2.2或1.9至2.1之範圍內。在一些實施方案中，DAR為1.8、1.9、2.0或2.1。
在某些實施方案中，本發明之免疫接合物由下式表示：， 其中： CBA為人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其包含分別具有SEQ ID NO: 8、35及45以及SEQ ID NO: 62、13、14之序列的CDRH 1結構域、CDRH 2結構域及CDRH 3結構域以及CDRL 1結構域、CDRL 2結構域及CDRL 3結構域； q為1或10之整數； D1 由下式表示：。
在某些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含分別具有SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:55之序列的重鏈可變結構域(VH)及輕鏈可變結構域(VL)。在一些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體包含分別具有SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:68之序列的重鏈及輕鏈。在一些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體包含分別具有SEQ ID NO:151及SEQ ID NO:68之序列的重鏈及輕鏈。在一些實施方案中，SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:151中之X為離胺酸。在一些實施方案中，SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:151中之X不存在。在一些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體包含分別具有SEQ ID NO:155及SEQ ID NO:68之序列的重鏈及輕鏈。在一些實施方案中，包含免疫接合物之組合物(例如醫藥組合物)之DAR值在1.0至5.0、1.0至4.0、1.5至4.0、2.0至4.0、2.5至4.0、2.9至3.3、3.3至3.8、1.5至2.5或1.8至2.2之範圍內。在一些實施方案中，DAR小於4.0、小於3.8、小於3.6、小於3.5、小於3.0或小於2.5。在一些實施方案中，DAR在3.0至3.2之範圍內。在一些實施方案中，DAR在3.5至3.7之範圍內。在一些實施方案中，DAR為3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6或3.7。在一些實施方案中，DAR在1.9至2.1之範圍內。在一些實施方案中，DAR為1.9、2.0或2.1。
本發明之另一個態樣提供一種醫藥組合物，其包含有效量之本文所述之本發明免疫接合物及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
在另一個態樣中，本發明提供一種治療個體中與ADAM9之表現相關聯或由ADAM9之表現特徵化之疾病或病狀的方法，其包含向該個體投予有效量之本文所述之本發明免疫接合物或醫藥組合物。本發明亦提供本文所述之本發明免疫接合物或醫藥組合物治療個體中與ADAM9之表現相關聯或由ADAM9之表現特徵化之疾病或病狀的用途。本發明亦提供本文所述之本發明免疫接合物或醫藥組合物製造用於治療個體中與ADAM9之表現相關聯或由ADAM9之表現特徵化之疾病或病狀之藥劑的用途。
在某些實施方案中，與ADAM9之表現相關聯或由ADAM9之表現特徵化之疾病或病狀為癌症。在一些實施方案中，癌症選自由以下組成之群：非小細胞肺癌、結腸直腸癌、胃癌、胰臟癌、腎細胞癌、前列腺癌、食道癌、乳癌、頭頸癌、卵巢癌、肝癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、睪丸癌、骨髓癌、黑色素瘤及淋巴癌。在某些實施方案中，癌症為非小細胞肺癌、胃癌、胰臟癌或結腸直腸癌。在某些實施方案中，非小細胞肺癌為鱗狀細胞癌、腺癌或大細胞未分化癌。在某些實施方案中，結腸直腸癌為腺癌、胃腸類癌腫瘤、胃腸基質腫瘤、原發性結腸直腸淋巴瘤、平滑肌肉瘤或鱗狀細胞癌。
相關申請案
本申請案主張於2018年6月26日提出申請之美國臨時申請案第62/690,052號及於2018年6月28日提出申請之美國臨時申請案第62/691,342號及於2019年2月26日提出申請之美國臨時申請案第62/810,703號的優先權。該等申請案之全部內容以引用方式併入本文中。序列表
本申請案含有序列表，該序列表已經以ASCII格式電子提交且其全部內容以引用方式併入本文中。在2019年5月16日創建之該ASCII拷貝命名為121162-04820_SL.txt，且大小為163,070字節。
本發明係關於免疫接合物，其包含能夠特異性地結合至與至少一種本文所述之類美登素接合之「含解整合素與金屬蛋白酶結構域之蛋白質9」 (「ADAM9 」)之抗體或其片段。本發明特定而言係關於與人類ADAM9及非人類靈長類動物(例如食蟹猴)之ADAM9交叉反應之此類免疫接合物。本發明另外係關於所有此類免疫接合物，其包含已經人源化及/或經去免疫化以在向接受個體投予此類免疫接合物後展現降低之免疫原性的輕鏈可變(VL)結構域及/或重鏈可變(VH)結構域。本發明亦係關於含有此類免疫接合物中之任一者之醫藥組合物，及涉及使用此類免疫接合物中之任一者治療癌症及其他疾病及病狀之方法。I . 抗體及其結合結構域
本發明之免疫接合物包含結合至ADAM9之抗體或其ADAM9結合片段。「抗體 」為能夠經由位於免疫球蛋白分子之可變結構域 中之至少一個抗原識別位點特異性結合至標靶，諸如碳水化合物、聚核苷酸、脂質、多肽等的免疫球蛋白分子。如本文所用之術語「抗體 (antibody /antibodies )」係指單株抗體、多特異性抗體、人類抗體、人源化抗體、合成抗體、嵌合抗體、多株抗體、駱駝化抗體、單鏈Fv (scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab')片段、胞內抗體，及上述任一者之抗原決定基結合片段。特定而言，術語「抗體」包括免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性片段，亦即，含有抗原決定基結合位點之分子。免疫球蛋白分子可為任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、種類(例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 )或子類。最近數十年已重新開始關注抗體之治療潛力，且抗體已成為源於生物技術之藥物的主要種類之一(Chan, C.E.等人 (2009) 「TheUse Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases 」, Singapore Med. J. 50(7):663-666)。除其用於診斷中之外，已顯示抗體適用作治療劑。超過200種基於抗體之藥物已核准使用或在開發中。
抗體能夠「免疫特異性地結合 」至多肽或蛋白質或非蛋白質分子，此係歸因於此種分子上特定結構域或部分或構形(「抗原決定基 」)之存在。含抗原決定基分子可具有免疫原性活性，使得其在動物中引出抗體產生反應；此類分子稱為「抗原 」。據稱如本文所用之抗體「免疫特異性地 」結合另一個分子之區域(亦即，抗原決定基)，條件為相對於替代性抗原決定基，該抗體更頻繁地、更快速地、以更長持續時間及/或以更高親和力與彼抗原決定基反應或締合。舉例而言，免疫特異性地結合至病毒抗原決定基之抗體為與其免疫特異性地結合至其他病毒抗原決定基或非病毒抗原決定基相比，以更高親和力、親合力、更容易地及/或以更長持續時間結合彼病毒抗原決定基之抗體。藉由閱讀此定義亦瞭解，例如，免疫特異性地結合至第一標靶之抗體(或部分或抗原決定基)可能或可能不特異性地或優先結合至第二標靶。因而，「免疫特異性結合」至特定抗原決定基未必需要(儘管其可包括)排他性結合至彼抗原決定基。一般而言但未必如此，提及結合意指「免疫特異性」結合。據稱兩個分子能夠以「生理特異性 」方式結合至彼此，條件為此種結合展現受體結合至其各別配位體之特異性。
術語「單株抗體 」係指均質抗體群體，其中單株抗體包含涉及於抗原之選擇性結合中之胺基酸(天然存在或非天然存在)。單株抗體為高度特異性的，針對單一抗原決定基(或抗原位點)。術語「單株抗體」不僅涵蓋完整單株抗體及全長單株抗體，而且涵蓋其片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv)、單鏈(scFv)、其突變體、包含抗體部分之融合蛋白質、人源化單株抗體、嵌合單株抗體，及包含具有所需特異性及結合至抗原之能力的抗原識別位點之免疫球蛋白分子之任何其他經修飾之構型。該術語關於抗體來源或其製造方式(例如藉由融合瘤、噬菌體選擇、重組表現、轉殖基因動物等)不欲受限制。該術語包括整個免疫球蛋白以及上文在「抗體」之定義下所述之片段等。製造單株抗體的方式在此項技術中已知。可採用之一種方法為Kohler, G.等人 (1975) 「Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity 」, Nature 256:495-497之方法，或其修改。通常，單株抗體在小鼠、大鼠或兔中開發。抗體係藉由用免疫原性量之含有所要抗原決定基之細胞、細胞提取物或蛋白質製劑使動物免疫而產生。免疫原可為(但不限於)初級細胞、經培養之細胞系、癌細胞、蛋白質、肽、核酸或組織。用於免疫之細胞在其用作免疫原之前可培養一段時間(例如至少24小時)。細胞可本身或與非變性佐劑組合用作免疫原，該佐劑諸如Ribi (參見例如Jennings, V.M. (1995) 「Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production 」, ILAR J. 37(3):119-125)。一般而言，細胞當用作免疫原時應保持完整且較佳有活力。完整細胞相比破裂之細胞可允許抗原由經免疫之動物更好地偵測。變性或烈性佐劑，例如弗氏佐劑(Freund's adjuvant)之使用可使細胞破裂且因此而受阻。免疫原可按週期性時間間隔多次投予，諸如兩週一次或每週一次，或可按在動物中(例如在組織重組體中)維持活力之方式投予。或者，可將對所要病原性抗原決定基具免疫特異性之現有單株抗體及任何其他等效抗體定序，且藉由此項技術中已知之任何方式重組產生。在一個實施方案中，將此種抗體定序，接著將聚核苷酸序列選殖至用於表現或繁殖之載體中。可將編碼所關注之抗體之序列維持於宿主細胞中之載體中，接著可擴充宿主細胞且冷凍用於未來使用。此類抗體之聚核苷酸序列可用於遺傳操縱以產生親和力最佳化、嵌合抗體、人源化抗體及/或犬化抗體，以改良抗體以及本發明之免疫接合物之親和力或其他特徵。使抗體人源化之一般原理涉及保留抗體之抗原結合部分之基本序列，同時將抗體之非人類其餘部分與人類抗體序列交換。
天然抗體(諸如天然IgG抗體)由兩個「輕鏈 」與兩個「重鏈 」複合而組成。各輕鏈含有可變結構域(「VL 」)及恆定結構域(「CL 」)。各重鏈含有可變結構域(「VH 」)、三個恆定結構域(「CH1 」、「CH2 」及「CH3 」)，及位於CH1 與CH2 結構域之間的「鉸鏈 」區(「H 」)。相比之下，scFv為藉由將輕鏈與重鏈可變結構域經由短連接肽連接在一起而製成之單鏈分子。
天然存在之免疫球蛋白(例如IgG)之基本結構單元因此為具有兩個輕鏈及兩個重鏈之四聚體，通常以約150,000 Da之醣蛋白表示。各鏈之胺基端(「N 端 」)部分包括約100個至110個或110個以上胺基酸之可變結構域，其主要負責抗原識別。各鏈之羧基端(「C 端 」)部分界定恆定區，其中輕鏈具有單一恆定結構域且重鏈通常具有三個恆定結構域及鉸鏈區。因此，IgG分子之輕鏈之結構為n-VL-CL-c且IgG重鏈之結構為n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (其中n及c分別代表多肽之N端及C端)。A. 抗體可變結構域之特徵
IgG分子之可變結構域由以下組成：1個、2個且最通常3個含有與抗原決定基接觸之殘基的互補決定區(「CDR 」，亦即，分別為CDR1 、CDR2 及CDR3 )；及非CDR區段，稱作構架區 (「FR 」)，其一般維持結構且確定CDR區域之定位以允許此種接觸(不過某些構架殘基亦可接觸抗原決定基)。因此，VL及VH結構域通常具有結構：n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c (其中「n」表示N端且「c」表示C端)。作為(或可充當)抗體輕鏈之第一、第二、第三及第四FR之多肽在本文中分別指定為：FRL 1 結構域 、FRL 2 結構域 、FRL 3 結構域 及FRL 4 結構域 。類似地，作為(或可充當)抗體重鏈之第一、第二、第三及第四FR之多肽在本文中分別指定為：FRH 1 結構域 、FRH 2 結構域 、FRH 3 結構域 及FRH 4 結構域 。作為(或可充當)抗體輕鏈之第一、第二及第三CDR之多肽在本文中分別指定為：CDRL 1 結構域、 CDRL 2 結構域 及CDRL 3 結構域 。類似地，作為(或可充當)抗體重鏈之第一、第二及第三CDR之多肽在本文中分別指定為：CDRH 1 結構域 、CDRH 2 結構域 及CDRH 3 結構域 。因此，術語CDRL 1結構域、CDRL 2結構域、CDRL 3結構域、CDRH 1結構域、CDRH 2結構域及CDRH 3結構域係針對當併入抗體中時促使抗體能夠結合至特異性抗原決定基之多肽。
在本說明書通篇，免疫球蛋白之成熟重鏈及輕鏈之可變結構域中之殘基編號係由鏈中胺基酸之位置指定。Kabat描述抗體之眾多胺基酸序列，鑑別各子群之胺基酸一致序列，且向各胺基酸賦予殘基編號，且CDR如Kabat所定義來鑑別(將瞭解，如Chothia, C.及Lesk, A. M. ((1987) 「Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins 」, J. Mol. Biol. 196:901-917)定義之CDRH 1始於較早五個殘基)。Kabat之編號方案可延伸至其綱要中不包括之抗體，此係藉由在Kabat中參考保守胺基酸將討論中之抗體與一致序列中之一者進行比對。賦予殘基編號之此方法已成為本領域中之標準且易於鑑別在不同抗體，包括嵌合或人源化變異體中之等效位置處之胺基酸。舉例而言，在人類抗體輕鏈之位置50處之胺基酸佔據與小鼠抗體輕鏈之位置50處之胺基酸等效之位置。
抗體結合抗原之抗原決定基之能力視抗體之VL及VH結構域之存在及胺基酸序列而定。抗體之輕鏈與重鏈之相互作用且特定而言其VL與VH結構域之相互作用形成天然抗體，諸如IgG之兩個抗原決定基結合位點中之一者。天然抗體能夠僅結合至一個抗原決定基種類(亦即，其為單特異性的)，不過其可結合彼抗原決定基種類之多個複本(亦即，展現二價或多價)。
因此，如本文所用之術語「抗原決定基結合片段 」意指能夠免疫特異性地結合至抗原決定基之抗體片段，且術語「抗原決定基結合位點 」係指包含抗原決定基結合片段之分子部分。抗原決定基結合片段可含有抗體之任何1個、2個、3個、4個或5個CDR結構域，或可含有抗體之全部6個CDR結構域，且儘管能夠免疫特異性地結合至此種抗原決定基，但可對不同於此種抗體之抗原決定基之此種抗原決定基展現免疫特異性、親和力或選擇性。然而，較佳地，抗原決定基結合片段將含有此種抗體之全部6個CDR結構域。抗體之抗原決定基結合片段可為單一多肽鏈(例如scFv)，或可包含各自具有胺基端及羧基端之兩個或兩個以上多肽鏈(例如Fab片段、Fab2 片段等)。除非特別註釋，否則本文所述之蛋白質分子之結構域之次序沿「N 端至 C 端 」方向。
本發明亦涵蓋包含含有本發明之抗ADAM9-VL及/或VH結構域之單鏈可變結構域片段(「scFv 」)之免疫接合物。單鏈可變結構域片段包含使用短「連接子」肽連接在一起之VL及VH結構域。此類連接子可經修飾以提供額外功能，諸如允許藥物附接或允許附接至固體支撐物。單鏈變異體可重組或合成產生。對於scFv之合成產生，可使用自動化合成器。對於scFv之重組產生，可將含有編碼scFv之聚核苷酸之適合質體引入適合之宿主細胞中，其為真核的，諸如酵母、植物、昆蟲或哺乳動物細胞，或原核的，諸如大腸桿菌。編碼所關注之scFv之聚核苷酸可藉由常規操縱，諸如聚核苷酸連接而製成。可使用此項技術中已知之標準蛋白質純化技術分離所得scFv。
本發明亦特定涵蓋免疫接合物，其包含本發明之抗ADAM9抗體之人源化/最佳化變異體之CDRH 1、CDRH 2、CDRH 3、CDRL 1、CDRL 2及CDRL 3結構域，以及含有此類CDRL 中之任何1者、2者或3者之VL結構域及含有此類CDRH 中之任何1者、2者或3者之VH結構域，以及包含上述結構域之多特異性結合分子。術語「人源化 」抗體係指嵌合分子，其具有來自非人類物種之免疫球蛋白之抗原決定基結合位點及基於人類免疫球蛋白之結構及/或序列之其餘免疫球蛋白結構。人源化抗體一般使用重組技術製備。本發明之免疫接合物可包含抗體之人源化、嵌合或犬化變異體，在本文中指定為「MAB-A 」。編碼MAB-A之可變結構域之聚核苷酸序列可用於遺傳操縱以產生具有改良或改變之特徵(例如親和力、交叉反應性、特異性等)之MAB-A衍生物。使抗體人源化之一般原理涉及保留抗體之抗原決定基結合部分之基本序列，同時將抗體之非人類其餘部分與人類抗體序列交換。存在用以使單株抗體人源化之四個一般步驟。此等步驟為：(1)確定初始抗體輕及重可變結構域之核苷酸及預測胺基酸序列；(2)設計人源化抗體或犬化抗體，亦即，決定哪個抗體構架區在人源化或犬化過程期間使用；(3)採用實際人源化或犬化方法/技術；及(4)轉染及表現人源化抗體。參見例如美國專利第4,816,567號、第5,807,715號、第5,866,692號及第6,331,415號。術語「最佳化 」抗體係指在輕鏈或重鏈可變區中之至少一個互補決定區(CDR)中具有至少一個不同於親本抗體之胺基酸的抗體，其與親本抗體相比賦予對人類ADAM9及/或食蟹猴ADAM9之更高結合親和力(例如2倍或2倍以上之更高結合親和力)。自本文所提供之教示將瞭解，本發明之抗體可經人源化、最佳化，或經人源化與最佳化。
抗原決定基結合位點可包含融合至一或多個恆定結構域之完整可變結構域或僅包含移植至適當構架區之此種可變結構域之CDR。抗原決定基結合位點可為野生型或可藉由一或多個胺基酸取代、插入或缺失而修飾。此作用部分或完全消除恆定區充當接受者(例如人類個體)中之免疫原之能力，然而，對外來可變結構域之免疫反應之可能性保留(LoBuglio, A.F.等人 (1989) 「Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response 」, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224)。另一種方法不僅集中於提供源於人類之恆定區，而且集中於修飾可變結構域以及將其改型為儘可能接近於人類免疫球蛋白中所見之形式。據知抗體之重鏈與輕鏈之可變結構域含有響應討論中之抗原而變化且確定結合能力之三個CDR，其由四個構架區側接，該等構架區在給定物種中相對保守且推定地提供CDR之架構。當關於特定抗原製備非人類抗體時，可變結構域可藉由將來源於非人類抗體之CDR移植於有待修飾之人類抗體中存在之FR上來「改型」或「人源化」。將此方法應用於各種抗體已由以下文獻報導：Sato, K.等人 (1993) Cancer Res 53:851-856；Riechmann, L.等人 (1988) 「Reshaping Human Antibodies for Therapy 」, Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.等人 (1988) 「Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity 」, Science 239:1534-1536；Kettleborough, C. A.等人 (1991) 「Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation 」, Protein Engineering 4:773-3783；Maeda, H.等人 (1991) 「Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity 」, Human Antibodies Hybridoma 2:124-134；Gorman, S. D.等人 (1991) 「Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody 」, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185；Tempest, P.R.等人 (1991) 「Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo 」, Bio/Technology 9:266-271；Co, M. S.等人 (1991) 「Humanized Antibodies For Antiviral Therapy 」, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873；Carter, P.等人 (1992) 「Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy 」, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289；及Co, M.S.等人 (1992) 「Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen 」, J. Immunol. 148:1149-1154。在一些實施方案中，人源化抗體保存所有CDR序列(例如，含有存在於鼠類抗體中之全部六個CDR之人源化鼠類抗體)。在其他實施方案中，人源化抗體具有相對於原始抗體之CDR在序列中不同之一或多個CDR (一個、兩個、三個、四個、五個或六個)。
已描述包含來源於非人類免疫球蛋白之抗原決定基結合位點之許多人源化抗體分子，包括具有融合至人類恆定結構域之囓齒動物或經修飾之囓齒動物可變結構域及其相關互補決定區(CDR)之嵌合抗體(參見例如Winter等人 (1991) 「Man-made Antibodies 」, Nature 349:293-299；Lobuglio等人 (1989)「 Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response 」, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224；Shaw等人 (1987) 「Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen 」, J. Immunol. 138:4534-4538；及Brown等人 (1987) 「Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody 」, Cancer Res. 47:3577-3583)。其他參考文獻描述在與適當人類抗體恆定結構域融合之前移植至人類支撐構架區(FR)中之囓齒動物CDR (參見例如Riechmann, L.等人 (1988) 「Reshaping Human Antibodies for Therapy 」, Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.等人 (1988) 「Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity 」, Science 239:1534-1536；及Jones等人 (1986) 「Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse 」, Nature 321:522-525)。另一個參考文獻描述由重組鑲飾之囓齒動物構架區支撐之囓齒動物CDR (參見例如歐洲專利公開案第519,596號)。此等「人源化」分子經設計以使對囓齒動物抗人類抗體分子之不合需要之免疫反應降至最低，該免疫反應限制在人類接受者中彼等部分之治療性應用的持續時間及有效性。亦可利用之使抗體人源化之其他方法係由Daugherty等人 (1991) 「Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins 」, Nucl. Acids Res. 19:2471-2476及美國專利第6,180,377號、第6,054,297號、第5,997,867號及第5,866,692號揭示。B. 抗體恆定結構域之特徵
在本說明書通篇，IgG重鏈之恆定區中之殘基編號為Kabat等人, SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 第5版 Public Health Service, NH1, MD (1991) (「Kabat 」)中之EU索引之編號，該文獻以引用的方式明確併入本文中。術語「Kabat 中所陳述之 EU 索引 」係指Kabat中所提供之人類IgG1 EU抗體之恆定結構域之編號。賦予殘基編號之此方法已成為本領域中之標準且易於鑑別在不同抗體同型之恆定區中之等效位置處之胺基酸。1. 輕鏈之恆定區
如上文所指示，抗體之各輕鏈含有可變結構域(「VL 」)及恆定結構域(「CL 」)。
較佳CL結構域為人類IgG CL κ結構域。例示性人類CL κ結構域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:69 )： 或者，例示性CL結構域為人類IgG CL λ結構域。例示性人類CL λ結構域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:70 )： 2. 重鏈之恆定區 a. 天然存在之 Fc 區
如本文所提供，本發明之免疫接合物可包含Fc區。本發明之此類免疫接合物之Fc區可為任何同型(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。本發明之免疫接合物可進一步包含CH1結構域及/或鉸鏈區。當存在時，CH1結構域及/或鉸鏈區可為任何同型(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)，且較佳為與所要Fc區相同之同型。
本發明之含Fc區免疫接合物之Fc區可為完整Fc區(例如完整IgG Fc區)或僅Fc區之片段。視情況，本發明之含Fc區免疫接合物之Fc區缺乏C端離胺酸胺基酸殘基。
抗體之兩個重鏈之CH1結構域與抗體輕鏈之「CL」恆定區複合，且經由間插鉸鏈結構域附接至重鏈CH2結構域。
例示性CH1結構域為人類IgG1 CH1結構域。例示性人類IgG1 CH1結構域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:71 )：
例示性CH1結構域為人類IgG2 CH1結構域。例示性人類IgG2 CH1結構域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:72 )：
例示性CH1結構域為人類IgG4 CH1結構域。例示性人類IgG4 CH1結構域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:73 )：
一個例示性鉸鏈區為人類IgG1鉸鏈區。例示性人類IgG1鉸鏈區之胺基酸序列為(SEQ ID NO:74 )：EPKSCDKTHTCPPCP。
另一個例示性鉸鏈區為人類IgG2鉸鏈區。例示性人類IgG2鉸鏈區之胺基酸序列為(SEQ ID NO:75 )：ERKCCVECPPCP。
另一個例示性鉸鏈區為人類IgG4鉸鏈區。例示性人類IgG4鉸鏈區之胺基酸序列為(SEQ ID NO:76 )：ESKYGPPCPSCP。如上文所述，IgG4鉸鏈區可包含穩定突變，諸如S228P取代。例示性穩定之IgG4鉸鏈區之胺基酸序列為(SEQ ID NO:77 )：ESKYGPPCPPCP。
抗體之兩個重鏈之CH2及CH3結構域相互作用以形成「Fc區」，其為由細胞「Fc 受體 」，包括(但不限於) Fc γ受體(「FcγRs 」)識別之結構域。如本文所用之術語「Fc區」用於定義IgG重鏈之C端區，其包含彼鏈之CH2及CH3結構域。據稱Fc區為特定IgG同型、種類或子類，條件為相對於其他IgG同型，該Fc區之胺基酸序列與彼同型最具同源性。
例示性人類IgG1之CH2-CH3結構域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:1 )：
如由Kabat中所陳述之EU索引編號，其中X 為離胺酸(K)或不存在。
例示性人類IgG2之CH2-CH3結構域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:2 )：
如由Kabat中所陳述之EU索引編號，其中X 為離胺酸(K)或不存在。
例示性人類IgG3之CH2-CH3結構域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:3 )：
如由Kabat中所陳述之EU索引編號，其中X 為離胺酸(K)或不存在。
例示性人類IgG4之CH2-CH3結構域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:4 )：
如由Kabat中所陳述之EU索引編號，其中X 為離胺酸(K)或不存在。
在抗體恆定區內之許多不同位置(例如Fc位置，包括(但不限於)如由Kabat中所陳述之EU索引編號之位置270、272、312、315、356及358)處已觀測到多形性，且因此在所呈現之序列與先前技術中之序列之間可存在微小差異。人類免疫球蛋白之多形形式已充分特徵化。目前，已知18種Gm異型：G1m (1、2、3、17)或G1m (a、x、f、z)、G2m (23)或G2m (n)、G3m (5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m (b1、c3、b3、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5) (Lefranc等人, 「The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis of Structure, Function And Regulation .」 Pergamon, Oxford, 第43-78頁 (1990)；Lefranc, G.等人, 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211)。特定預期，本發明之抗體可合併任何免疫球蛋白基因之任何異型、同種異型或單倍型，且不限於本文所提供之序列之異型、同種異型或單倍型。此外，在一些表現系統中，CH3結構域之C端胺基酸殘基(上文加粗)可在轉譯後移除。因此，CH3結構域之C端殘基為本發明之免疫接合物中視情況存在之胺基酸殘基。本發明特定涵蓋缺乏CH3結構域之C端殘基之免疫接合物。本發明亦特定涵蓋包含CH3結構域之C端離胺酸殘基之此類構築體。b . Fc γ 受體 ( FcγRs)
在傳統免疫功能中，抗體-抗原複合物與免疫系統細胞之相互作用產生一大批反應，範圍自諸如抗體依賴性細胞毒性、肥大細胞脫顆粒及吞噬作用之效應功能至諸如調控淋巴細胞增殖及抗體分泌之免疫調節信號。經由抗體或免疫複合物之Fc區與造血細胞上之特化細胞表面受體，且特定而言與多種類型之免疫系統細胞(例如B淋巴細胞、濾泡樹突狀細胞、天然殺傷細胞、巨噬細胞、嗜中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球及肥大細胞)之表面上所見之受體(單獨稱作「Fc γ 受體 」「FcγR 」且統稱作「FcγRs 」)的結合來起始所有此等相互作用。
由抗體及免疫複合物觸發之細胞反應之多樣性由以下三個Fc受體之結構異質性引起：FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)及FcγRIII (CD16)。FcγRI (CD64)、FcγRIIA (CD32A)及FcγRIII (CD16)為活化(亦即，免疫系統增強)受體；FcγRIIB (CD32B)為抑制(亦即，免疫系統阻抑)受體。另外，與新生兒Fc受體(FcRn)之相互作用介導IgG分子自核內體再循環至細胞表面且釋放至血液中。例示性野生型IgG1 (SEQ ID NO:1 )、IgG2 (SEQ ID NO:2 )、IgG3 (SEQ ID NO:3 )及IgG4(SEQ ID NO:4 )之胺基酸序列呈現於上文。
不同FcγRs介導截然相反之功能的能力反映不同FcγRs當中之結構差異，且特定而言反映經結合之FcγR是否具有基於免疫受體酪胺酸之活化基元(「ITAM 」)或基於免疫受體酪胺酸之抑制基元(「ITIM 」)。不同細胞質酶募集至此等結構指示FcγR介導之細胞反應之結果。含ITAM之FcγRs包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA，且當結合至Fc區(例如，存在於免疫複合物中之聚集Fc區)時活化免疫系統。FcγRIIB為唯一當前已知之天然含ITIM之FcγR；其當結合至聚集Fc區時用以阻抑或抑制免疫系統。人類嗜中性球表現FcγRIIA基因。經由免疫複合物或特異性抗體交聯之FcγRIIA成簇用來使ITAM與促進ITAM磷酸化之受體相關激酶聚集。ITAM磷酸化用作Syk激酶之停泊位點，該激酶之活化引起下游受質(例如PI3 K)之活化。細胞活化得以釋放促炎性介體。FcγRIIB基因在B淋巴細胞上表現；其細胞外結構域與FcγRIIA 96%一致且以不可區分之方式結合IgG複合物。FcγRIIB之細胞質結構域中ITIM之存在定義FcγR之此抑制子類。最近確立此抑制之分子基礎。當與活化FcγR一起共連接時，FcγRIIB中之ITIM變得磷酸化且吸引磷酸肌醇5'-磷酸酶(SHIP)之SH2結構域，其使作為含ITAM之FcγR介導之酪胺酸激酶活化之結果而釋放之磷酸肌醇信使水解，從而防止細胞內Ca++ 流入。因此，FcγRIIB之交聯阻抑對FcγR連接之活化反應且抑制細胞反應性。因此中止B細胞活化、B細胞增殖及抗體分泌。c. 變異體 Fc 區
Fc區之修飾可引起表型改變，例如血清半衰期改變、穩定性改變、對細胞酶之易感性改變或效應功能改變。因此可能需要關於效應功能修飾本發明之含Fc區分子，例如，以增強此種分子在治療癌症中之有效性。效應功能之降低或消除在某些情況下為合乎需要的，例如在作用機制涉及帶有靶抗原之細胞之阻斷或拮抗而非殺傷之抗體的情況下。增加之效應功能當針對非所要之細胞，諸如FcγRs以低水準表現之腫瘤及外來細胞時一般合乎需要，該等細胞例如具有低水準之FcγRIIB之腫瘤特異性B細胞(例如非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、CLL及伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma))。具有此種賦予或改變之效應功能活性之本發明免疫接合物適用於治療及/或預防需要效應功能活性之增強功效之疾病、病症或感染。
因此，在某些實施方案中，本發明之含Fc區免疫接合物之Fc區可為工程改造之變異體Fc區。儘管本發明之免疫接合物之Fc區可具有結合至一或多個Fc受體(例如FcγR(s))之能力，但更佳地，此種變異體Fc區與FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)具有改變之結合(相對於由野生型Fc區展現之結合)，例如，將與活化受體具有增強之結合及/或將具有實質上降低或不具有結合至抑制受體之能力。因此，本發明之免疫接合物之Fc區可包括完整Fc區之一些或所有CH2結構域及/或一些或所有CH3結構域，或可包含變異體CH2及/或變異體CH3序列(其可包括例如關於完整Fc區之CH2或CH3結構域之一或多個插入及/或一或多個缺失)。此類Fc區可包含非Fc多肽部分，或可包含非天然完整Fc區之部分，或可包含CH2及/或CH3結構域之非天然存在之定向(例如兩個CH2結構域或兩個CH3結構域，或沿N端至C端方向，CH3結構域連接至CH2結構域，等)。
鑑別為改變效應功能之Fc區修飾在此項技術中已知，包括增加與活化受體(例如FcγRIIA (CD16A))之結合及減少與抑制受體(例如FcγRIIB (CD32B))之結合的修飾(參見例如Stavenhagen, J.B.等人 (2007) 「Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors 」, Cancer Res. 57(18):8882-8890)。表 1 列出增加與活化受體之結合及/或減少與抑制受體之結合之例示性修飾的例示性單取代、雙取代、三取代、四取代及五取代(編號為Kabat中之EU索引之編號，且取代係相對於SEQ ID NO:1 之胺基酸序列)。
與CD32B之結合減少及/或與CD16A之結合增加之人類IgG1 Fc區之例示性變異體含有F243L、R292P、Y300L、V305I或P396L取代，其中編號為Kabat中之EU索引之編號。此等胺基酸取代可按任何組合存在於人類IgG1 Fc區中。在一個實施方案中，變異體人類IgG1 Fc區含有F243L、R292P及Y300L取代。在另一個實施方案中，變異體人類IgG1 Fc區含有F243L、R292P、Y300L、V305I及P396L取代。
在某些實施方案中，本發明之免疫接合物之Fc區較佳展現減少(或實質上不展現)與FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD 16a)或FcγRIIIB (CD16b)之結合(相對於由野生型IgG1 Fc區(SEQ ID NO:1 )展現之結合)。在特定實施方案中，本發明之免疫接合物包含展現降低之ADCC效應功能之IgG Fc區。在較佳實施方案中，免疫接合物之CH2-CH3結構域包括以下取代中之任何1者、2者、3者或4者：L234A、L235A、D265A、N297Q及N297G，其中編號為Kabat中之EU索引之編號。在另一個實施方案中，CH2-CH3結構域含有N297Q取代、N297G取代、L234A與L235A取代或D265A取代，此係因為此等突變消除FcR結合。或者，利用天然存在之Fc區之CH2-CH3結構域，其固有地展現減少(或實質上不展現)與FcγRIIIA (CD16a)之結合及/或降低之效應功能(相對於由野生型IgG1 Fc區(SEQ ID NO:1 )展現之結合及效應功能)。在特定實施方案中，本發明之免疫接合物包含IgG2 Fc區(SEQ ID NO:2 )或IgG4 Fc區(SEQ ID:NO:4 )。當利用IgG4 Fc區時，本發明亦涵蓋引入穩定突變，諸如上文所述之鉸鏈區S228P取代(參見例如SEQ ID NO:77 )。因為N297G、N297Q、L234A、L235A及D265A取代消除效應功能，所以在需要效應功能之情況下，將較佳不採用此等取代。
具有降低或消除之效應功能的本發明之含Fc區免疫接合物之CH2及CH3結構域之較佳IgG1序列將包含取代L234A/L235A (加下劃線示出) (SEQ ID NO:78 )： 其中X 為離胺酸(K)或不存在。
本發明之含Fc區免疫接合物之CH2及CH3結構域之第二較佳IgG1序列包含允許兩個CH3結構域經由二硫鍵彼此共價鍵結或醫藥劑接合之S442C取代(加下劃線示出)。此種分子之胺基酸序列為(SEQ ID NO:79 )： 其中X 為離胺酸(K)或不存在。
本發明之含Fc區免疫接合物之CH2及CH3結構域之第三較佳IgG1序列包含降低或消除效應功能之L234A/L235A取代(加下劃線示出)及允許兩個CH3結構域經由二硫鍵彼此共價鍵結或醫藥劑接合之S442C取代(加下劃線示出)。此種分子之胺基酸序列為(SEQ ID NO:80 )： 其中X 為離胺酸(K)或不存在。
包含Fc區之蛋白質之血清半衰期可藉由增加Fc區對FcRn之結合親和力而增加。如本文所用之術語「半衰期」意指在投予分子之後作為分子之平均存活時間之量度的分子之藥物動力學特性。半衰期可表示為自個體(例如人類患者或其他哺乳動物)之身體或其特定區室中消除百分之五十(50%)已知量之分子所需之時間，例如，如在血清中量測，亦即，循環半衰期，或在其他組織中量測。一般而言，半衰期之增加使得所投予之分子在循環中之平均滯留時間(MRT)增加。
在一些實施方案中，本發明之免疫接合物包含相對於野生型Fc區包含至少一個胺基酸修飾之變異體Fc區，使得該分子具有增加之半衰期(相對於包含野生型Fc區之分子)。在一些實施方案中，本發明之免疫接合物包含變異體IgG Fc區，其中該變異體Fc區在一或多個選自由以下組成之群的位置處包含延長半衰期之胺基酸取代：238、250、252、254、256、257、256、265、272、286、288、303、305、307、308、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428、433、434、435及436，其中編號為Kabat中之EU索引之編號。能夠增加含Fc區分子之半衰期之眾多突變在此項技術中已知且包括例如M252Y、S254T、T256E及其組合。舉例而言，參見美國專利第6,277,375號、第7,083,784號、第7,217,797號、第8,088,376號；美國公開案第2002/0147311號、第2007/0148164號；及PCT公開案第WO 98/23289號、第WO 2009/058492號及第WO 2010/033279號中所述之突變，該等文獻以全文引用的方式併入本文中。具有提高之半衰期之免疫接合物亦包括具有變異體Fc區之彼等，該等Fc區包含在Fc區殘基250、252、254、256、257、288、307、308、309、311、378、428、433、434、435及436中之兩者或兩者以上處之取代，其中編號為Kabat中之EU索引之編號。特定而言，兩個或兩個以上取代選自：T250Q、M252Y、S254T、T256E、K288D、T307Q、V308P、A378V、M428L、N434A、H435K及Y436I，其中編號為Kabat中之EU索引之編號。
在特定實施方案中，本發明之免疫接合物具有包含以下取代之變異體IgG Fc區： (A) M252Y、S254T及T256E； (B) M252Y及S254T； (C) M252Y及T256E； (D) T250Q及M428L； (E) T307Q及N434A； (F) A378V及N434A； (G) N434A及Y436I； (H) V308P及N434A；或 (I) K288D及H435K。
在較佳實施方案中，本發明之免疫接合物具有變異體IgG Fc區，其包含以下取代中之任何1者、2者或3者：M252Y、S254T及T256E。本發明進一步涵蓋免疫接合物，其具有包含以下之變異體Fc區： (A) 改變效應功能及/或FcγR之一或多個突變；及 (B) 延長血清半衰期之一或多個突變。
本發明之含Fc區免疫接合物之CH2及CH3結構域之第四較佳IgG1序列包含M252Y、S254T及T256E取代(加下劃線示出)，以延長血清半衰期。此種分子之胺基酸序列為(SEQ ID NO:147 )： 其中X 為離胺酸(K)或不存在。
本發明之含Fc區免疫接合物之CH2及CH3結構域之第五較佳IgG1序列包含M252Y、S254T及T256E取代(加下劃線示出)，以延長血清半衰期；及S442C取代(加下劃線示出)，以允許兩個CH3結構域經由二硫鍵彼此共價鍵結或允許藥物部分接合。此種分子之胺基酸序列為(SEQ ID NO: 148 )： 其中X 為離胺酸(K)或不存在。
本發明之含Fc區免疫接合物之CH2及CH3結構域之第六較佳IgG1序列包含降低或消除效應功能之L234A/L235A取代(加下劃線示出)；及M252Y、S254T及T256E取代(加下劃線示出)，以延長血清半衰期。此種分子之胺基酸序列為(SEQ ID NO: 149 )： 其中X 為離胺酸(K)或不存在。
本發明之含Fc區免疫接合物之CH2及CH3結構域之第七較佳IgG1序列包含降低或消除效應功能之L234A/L235A取代(加下劃線示出)；及M252Y、S254T及T256E取代(加下劃線示出)，以延長血清半衰期；及S442C取代(加下劃線示出)，以允許兩個CH3結構域經由二硫鍵彼此共價鍵結或允許藥物部分接合。此種分子之胺基酸序列為(SEQ ID NO: 150 )： 其中X 為離胺酸(K)或不存在。II. 例示性抗 ADAM9 抗體
本發明提供能夠特異性地結合至ADAM9之特定抗體及其抗原結合片段，其適用於產生本發明之免疫接合物。
代表性人類ADAM9多肽(NCBI序列NP_003807，包括28個胺基酸殘基信號序列，加下劃線示出)具有胺基酸序列(SEQ ID NO:5 )：
在ADAM9之819個胺基酸殘基(SEQ ID NO:5 )中，殘基1-28為信號序列，殘基29-697為細胞外結構域，殘基698-718為跨膜結構域，且殘基719-819為細胞內結構域。三個結構域位於細胞外結構域內：再生溶素(Reprolysin) (M12B)家族鋅金屬蛋白酶結構域(大約在殘基212-406處)；解整合素結構域(大約在殘基423-497處)；及EGF樣結構域(大約在殘基644-697處)。已鑑別許多轉譯後修飾及同功型，且蛋白質在反式高基網(trans-Golgi network)中蛋白水解性裂解，隨後其到達質膜以產生成熟蛋白質。前結構域之移除經由在兩個不同位點處之裂解而發生。在前結構域與催化結構域(Arg-205/Ala-206)之間的邊界處，最有可能由諸如弗林蛋白酶(furin)之前蛋白轉化酶加工。額外上游裂解前蛋白轉化酶位點(Arg-56/Glu-57)在ADAM9活化中具有重要作用。
代表性食蟹猴ADAM9多肽(NCBI序列XM_005563126.2，包括可能之28個胺基酸殘基信號序列，加下劃線示出)具有胺基酸序列(SEQ ID NO:6 )：
蛋白質之再生溶素(M12B)家族鋅金屬蛋白酶結構域大約在殘基212-406處；蛋白質之解整合素結構域大約在殘基423-497處。
在某些實施方案中，本發明之抗ADAM9抗體及其ADAM9結合片段由以下準則中之任何一者、兩者、三者、四者、五者、六者、七者、八者或九者特徵化： (1) 免疫特異性地結合如在癌細胞表面上內源性表現之人類ADAM9之能力； (2) 以類似結合親和力特異性地結合人類及非人類靈長類動物ADAM9 (例如食蟹猴之ADAM9)； (3) 以4 nM或小於4 nM之平衡結合常數(KD )特異性地結合人類ADAM9； (4) 以4 nM或小於4 nM之平衡結合常數(KD )特異性地結合非人類靈長類動物ADAM9； (5) 以5 × 105 M-1 min-1 或大於5 × 105 M-1 min-1 之締合速率(ka)特異性地結合人類ADAM9； (6) 以1 × 106 M-1 min-1 或大於1 × 106 M-1 min-1 之締合速率(ka)特異性地結合非人類靈長類動物ADAM9； (7) 以1 × 10-3 min-1 或小於1 × 10-3 min-1 之解離速率(kd)特異性地結合人類ADAM9； (8) 以9 × 10-4 min-1 或小於9 × 10-4 min-1 之解離速率(kd)特異性地結合非人類靈長類動物ADAM9； (9) 經最佳化以與嵌合或鼠類親本抗體相比，對食蟹猴ADAM9之結合親和力(例如，如藉由BIACORE®分析量測)提高至少100倍(例如提高至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少250倍、至少300倍、至少350倍、至少400倍、至少450倍、至少500倍、至少550倍或至少600倍)且保留對人類ADAM9之高親和力結合(例如BIACORE®分析)。
如本文所述，抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段之結合常數可使用表面電漿子共振，例如經由BIACORE®分析確定。可將表面電漿子共振資料與1:1朗謬結合模型(Langmuir binding model) (同時ka kd)擬合，且自速率常數之比率kd/ka計算平衡結合常數KD 。可對單價抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段(亦即，包含單一ADAM9抗原決定基結合位點之分子)、二價抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段(亦即，包含兩個ADAM9抗原決定基結合位點之分子)或具有更高價數之抗ADAM9抗體及其ADAM9結合片段(例如包含三個、四個或四個以上ADAM9抗原決定基結合位點之分子)確定此類結合常數。
本發明特定涵蓋免疫接合物，其具有包含免疫特異性地結合至人類ADAM9多肽之抗原決定基的抗ADAM9輕鏈可變(VL)結構域及抗ADAM9重鏈可變(VH)結構域之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段。除非另有規定，否則所有此類抗ADAM9抗體及其ADAM9結合片段能夠免疫特異性地結合至人類ADAM9。如本文所用之此類ADAM9可變結構域分別稱作「抗 ADAM9-VL 」及「抗 ADAM9-VH 」。A. 鼠類抗人 ADAM9 抗體
阻斷ADAM9之靶蛋白加工活性之鼠類抗ADAM9抗體經內化且鑑別到具有抗腫瘤活性(參見例如美國專利第8,361,475號)。在美國專利第7,674,619號及第8,361,475號中指定為由融合瘤純系ATCC PTA-5174產生之「抗KID24」抗體之此抗體在本文中指定為「MAB-A 」。MAB-A展現對腫瘤超過正常組織之強優先結合(參見圖 7A-7C )。MAB-A跨越一大組正常細胞類型展現極少或無染色(表 2 )。
如圖 2 中所示，MAB-A以高親和力結合人類ADAM9，但在較小程度上結合非人類靈長類動物(例如食蟹猴) ADAM9。
下文提供MAB-A之VL及VH結構域之胺基酸序列。MAB-A之VH及VL結構域經人源化且CDR經最佳化以改良親和力及/或移除潛在胺基酸不利。CDRH 3經進一步最佳化以增強與非人類靈長類動物ADAM9之結合同時維持其對人類ADAM9之高親和力。
本發明之較佳免疫接合物包含MAB-A之最佳化變異體之VH結構域之1個、2個或全部3個CDRH 及/或VL結構域之1個、2個或全部3個CDRL ，且較佳進一步具有人源化MAB-A之VH及/或VL結構域之人源化構架區(「FR 」)。本發明之其他較佳免疫接合物具有MAB-A之人源化/最佳化變異體之整個VH及/或VL結構域。
本發明特定而言係關於包含以下之免疫接合物： (A) (1) MAB-A之VH結構域之三個CDRH ；及 (2) MAB-A之人源化變異體之VH結構域之四個FR；或 (B) (1) MAB-A之VL結構域之三個CDRL ；及 (2) MAB-A之人源化變異體之VL結構域之四個FR；或 (C) MAB-A之最佳化變異體之VH結構域之三個CDRH ；及MAB-A之VL結構域之三個CDRL ；或 (D) MAB-A之VH結構域之三個CDRH ；及最佳化變異體MAB-A之VL結構域之三個CDRL ；或 (E) MAB-A之最佳化變異體之VH結構域之三個CDRH ；及最佳化MAB-A之VL結構域之三個CDRL ；或 (F) (1) MAB-A之最佳化變異體之VH結構域之三個CDRH ；及 (2) MAB-A之人源化變異體之VH結構域之四個FR；或 (G) (1) MAB-A之最佳化變異體之VL結構域之三個CDRL ；及 (2) MAB-A之人源化變異體之VL結構域之四個FR；或 (H) (1) MAB-A之人源化/最佳化變異體之VH結構域；及 (2) MAB-A之人源化/最佳化變異體之VL結構域。鼠類抗體「MAB-A」
鼠類抗ADAM9抗體MAB-A之VH結構域之胺基酸序列為SEQ ID NO:7 (CDRH 殘基加下劃線示出):
MAB-A之CDRH 1結構域之胺基酸序列為(SEQ ID NO: 8 )：SYWMH。
MAB-A之CDRH 2結構域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:9 )：EIIPINGHTNYNEKFKS。
MAB-A之CDRH 3結構域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:10 )：GGYYYYGSRDYFDY。
鼠類抗ADAM9抗體MAB-A之VL結構域之胺基酸序列為SEQ ID NO: 11 (CDRL 殘基加下劃線示出)：
MAB-A之CDRL 1結構域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:12 )：KASQSVDYDGDSYMN。
MAB-A之CDRL 2結構域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:13 )：AASDLES。
MAB-A之CDRL 3結構域之胺基酸序列為(SEQ ID NO:14 )：QQSHEDPFT。B. 例示性人源化 / 最佳化抗 ADAM9-VH 及 VL 結構域 1. MAB-A 之變異體 VH 結構域
MAB-A之某些較佳人源化/最佳化抗ADAM9-VH結構域之胺基酸序列為MAB-A之ADAM9-VH結構域(SEQ ID NO:7 )之變異體且由SEQ ID NO:15 表示(CDRH 殘基加下劃線示出)： 其中：X1 、X2 、X3 、X4 、X5 及X6 經獨立地選擇， 其中：X1 為M或I；X2 為N或F；X 3 為K或R；X 4 為K或Q；X 5 為S或G，且X6 為P、F、Y、W、I、L、V、T、G或D； 其中：X7 、X8 、X9 、X10 及X11 經選擇以使得： (A) 當X6 為P時：                                 (B) 當X6 為F、Y或W時：X7 為K或R；X7 為N或H；X8 為F或M；X8 為S或K；X9 為G；X9 為G或A；X10 為W或F；且X10 為T或V；且X11 為M、L或K；X11 為M、L或K； (C) 當X6 為I、L或V時：              (D) 當X6 為T時：X7 為G；X7 為G；X8 為K；X8 為K、M或N；X9 為G或A；X9 為G；X10 為V；且X10 為V或T；且X11 為M、L或K；X11 為L或M； (E) 當X6 為G時：                                及(F) 當X6 為D時：X7 為G；X7 為S；X8 為S；X8 為N；X9 為G；X9 為A；X10 為V；且X10 為V；且X11 為L；X11 為L。
MAB-A之較佳人源化抗ADAM9 VH結構域之胺基酸序列：hMAB-A VH(1) (SEQ ID NO:16 )，及MAB-A之某些較佳人源化/最佳化抗ADAM9-VH結構域之胺基酸序列：
呈現於下文(CDRH 殘基以單下劃線示出；相對於hMAB-A VH(1) (SEQ ID NO:7 )之差異以雙下劃線示出)。 hMAB-A VH(1) (SEQ ID NO:16 )： hMAB-A VH(2) (SEQ ID NO:17 )： hMAB-A VH(3) (SEQ ID NO:18 )： hMAB-A VH(4) (SEQ ID NO: 19 )： hMAB-A VH(2A) (SEQ ID NO: 20 )： hMAB-A VH(2B) (SEQ ID NO: 21 )： hMAB-A VH(2C) (SEQ ID NO: 22 )： hMAB-A VH(2D) (SEQ ID NO: 23 )： hMAB-A VH(2E) (SEQ ID NO: 24 )： hMAB-A VH(2F) (SEQ ID NO: 25 )： hMAB-A VH(2G) (SEQ ID NO: 26 )： hMAB-A VH(2H) (SEQ ID NO: 27 )： hMAB-A VH(2I) (SEQ ID NO: 28 )： hMAB-A VH(2J) (SEQ ID NO: 29 )：
MAB-A之人源化及/或最佳化抗ADAM9-VH結構域之FR之適合胺基酸序列為： FRH 1結構域(SEQ ID NO:30 )：EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS FRH 2結構域(SEQ ID NO:31 )：WVRQAPGKGLEWVG FRH 3結構域(SEQ ID NO:32 )：RFTISLDNSKNTLYLQMGSLRAEDTAVYYCAR FRH 4結構域(SEQ ID NO:33 )：WGQGTTVTVSS
抗ADAM9-VH結構域之CDRH 1結構域之適合替代性胺基酸序列包括：SEQ ID NO: 8 ：SYWMHSEQ ID NO:34 ：SYWIH
抗ADAM9-VH結構域之CDRH 2結構域之適合替代性胺基酸序列包括：SEQ ID NO:9 ：EIIPINGHTNYNEKFKSSEQ ID NO:35 ：EIIPIFGHTNYNEKFKSSEQ ID NO:36 ：EIIPIFGHTNYNERFQG
抗ADAM9-VH結構域之CDRH 3結構域之適合替代性胺基酸序列包括：SEQ ID NO:10 ：GGYYYYGSRDYFDYSEQ ID NO:37 ：GGYYYYFNSGTLDYSEQ ID NO:38 ：GGYYYYIGKGVLDYSEQ ID NO:39 ：GGYYYYPRFGWLDYSEQ ID NO:40 ：GGYYYYTGKGVLDYSEQ ID NO:41 ：GGYYYYDSNAVLDYSEQ ID NO:42 ：GGYYYYFHSGTLDYSEQ ID NO:43 ：GGYYYYFNKAVLDYSEQ ID NO:44 ：GGYYYYGGSGVLDYSEQ ID NO:45 ：GGYYYYPRQGFLDYSEQ ID NO:46 ：GGYYYYYNSGTLDY
因此，本發明涵蓋具有VH結構域之ADAM9結合分子，該VH結構域包含： (1) 具有以下胺基酸序列之CDRH 1結構域：SEQ ID NO: 47 ：SYWX1 H 其中：X1 為M或I； (2) 具有以下胺基酸序列之CDRH 2結構域：SEQ ID NO:48 ：EIIPIX2 GHTNYNEX3 FX4 X5 其中：X2 、X3 、X4 及X5 經獨立地選擇，且 其中：X 2 為N或F；X 3 為K或R；X 4 為K或Q；且X 5 為S或G。 及 (3) 具有以下胺基酸序列之CDRH 3結構域：SEQ ID NO:49 ：GGYYYYX6 X7 X8 X9 X10 X11 DY 其中：X6 為P、F、Y、W、I、L、V、T、G或D，且X7 、X8 、X9 、X10 及X11 經選擇以使得： (A) 當X6 為P時：                                (B) 當X6 為F、Y或W時：X7 為K或R；X7 為N或H；X8 為F或M；X8 為S或K；X9 為G；X9 為G或A；X10 為W或F；且X10 為T或V；且X11 為M、L或K；X11 為M、L或K； (C) 當X6 為I、L或V時：              (D) 當X6 為T時：X7 為G；X7 為G；X8 為K；X8 為K、M或N；X9 為G或A；X9 為G；X10 為V；且X10 為V或T；且X11 為M、L或K；X11 為L或M； (E) 當X6 為G時：                                及(F) 當X6 為D時：X7 為G；                                              X7 為S；X8 為S；X8 為N；X9 為G；X9 為A；X10 為V；且X10 為V；且X11 為L；X11 為L。
MAB-A之衍生物/變異體之第一例示性人源化/最佳化IgG1重鏈含有hMAB-AVH (2) 結構域(SEQ ID NO: 17 )，且具有胺基酸序列(SEQ ID NO:50 )： 其中X為離胺酸(K)或不存在。
MAB-A之衍生物/變異體之第二例示性人源化/最佳化IgG1重鏈含有hMAB-AVH (2C) 結構域(SEQ ID NO:22 )，且具有胺基酸序列(SEQ ID NO:51 )： 其中X為離胺酸(K)或不存在。
MAB-A之衍生物/變異體之第三例示性人源化/最佳化IgG1重鏈含有hMAB-AVH (2I) 結構域(SEQ ID NO:28 )，且具有胺基酸序列(SEQ ID NO:52 )： 其中X為離胺酸(K)或不存在。
如上文所提供，Fc區之CH2-CH3結構域可經工程改造，例如，以降低效應功能及/或引入接合位點及/或延長血清半衰期。在某些實施方案中，本發明之例示性人源化/最佳化IgG1重鏈之CH2-CH3結構域包含選自以下之一或多個取代：L234A、L235A、M252Y、S254T、T256E及S442C。
因此，MAB-A之衍生物/變異體之第四例示性人源化/最佳化IgG1重鏈含有hMAB-AVH (2I) 結構域(SEQ ID NO:28 )，且進一步包含Fc區之CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:78 )中之取代L234A及L235A且具有胺基酸序列(SEQ ID NO:141 ) 其中X為離胺酸(K)或不存在。
MAB-A之衍生物/變異體之第五例示性人源化/最佳化IgG1重鏈含有hMAB-AVH (2I) 結構域(SEQ ID NO:28 )，且進一步包含Fc區之CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:79 )中之S442C取代且具有胺基酸序列(SEQ ID NO: 142 )： 其中X為離胺酸(K)或不存在。
MAB-A之衍生物/變異體之第六例示性人源化/最佳化IgG1重鏈含有hMAB-AVH (2I) 結構域(SEQ ID NO:28 )，且進一步包含Fc區之CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:80 )中之取代L234A、L235A及S442C且具有胺基酸序列(SEQ ID NO:143 )： 其中X為離胺酸(K)或不存在。
MAB-A之衍生物/變異體之第七例示性人源化/最佳化IgG1重鏈含有hMAB-AVH (2I) 結構域(SEQ ID NO:28 )，且進一步包含Fc區之CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:147 )中之取代M252Y、S254T及T256E且具有胺基酸序列(SEQ ID NO:151 )： 其中X 為離胺酸(K)或不存在。
在一個實施方案中，MAB-A之衍生物/變異體之人源化/最佳化IgG1重鏈含有hMAB-AVH (2I) 結構域(SEQ ID NO:28 )，且進一步包含Fc區之CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:147 )中之取代M252Y、S254T及T256E且具有胺基酸序列(SEQ ID NO:155 )：
MAB-A之衍生物/變異體之第八例示性人源化/最佳化IgG1重鏈含有hMAB-AVH (2I) 結構域(SEQ ID NO:28 )，且進一步包含Fc區之CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:148 )中之取代M252Y、S254T、T256E及S442C且具有胺基酸序列(SEQ ID NO:152 )： 其中X 為離胺酸(K)或不存在。
在一個實施方案中，MAB-A之衍生物/變異體之人源化/最佳化IgG1重鏈含有hMAB-AVH (2I) 結構域(SEQ ID NO:28 )，且進一步包含Fc區之CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:148 )中之取代M252Y、S254T、T256E及S442C且具有胺基酸序列(SEQ ID NO:156 )：
MAB-A之衍生物/變異體之第九例示性人源化/最佳化IgG1重鏈含有hMAB-AVH (2I) 結構域(SEQ ID NO:28 )，且進一步包含Fc區之CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:149 )中之取代L234A、L235A、M252Y、S254T及T256E且具有胺基酸序列(SEQ ID NO:153 )： 其中X 為離胺酸(K)或不存在。
MAB-A之衍生物/變異體之第十例示性人源化/最佳化IgG1重鏈含有hMAB-AVH (2I) 結構域(SEQ ID NO:28 )，且進一步包含Fc區之CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:150 )中之取代L234A、L235A、M252Y、S254T、T256E及S442C且具有胺基酸序列(SEQ ID NO:154 )： 其中X 為離胺酸(K)或不存在。2. MAB-A之變異體 VL 結構域
MAB-A之較佳人源化/最佳化抗ADAM9-VL結構域之胺基酸序列為MAB-A之ADAM9-VL結構域(SEQ ID NO:11 )之變異體且由SEQ ID NO:53 表示(CDRL 殘基加下劃線示出)： 其中：X12 、X13 、X14 、X15 、X16 及X17 經獨立地選擇，且 其中：X12 為K或R；X13 為D或S；X14 為M或L；X15 為H或Y；X16 為E或S；且X17 為D或T。
MAB-A之較佳人源化抗ADAM9-VL結構域之胺基酸序列：hMAB-A VL(1) (SEQ ID NO:54 )，及MAB-A之某些較佳人源化/最佳化抗ADAM9-VL結構域之胺基酸序列：hMAB-A VL(2) (SEQ ID NO:55 )、hMAB-A VL(3) (SEQ ID NO:56 )及hMAB-A VL(4) (SEQ ID NO:57 )，呈現於下文(CDRL 殘基以單下劃線示出；相對於hMAB-A VL(1) (SEQ ID NO:54 )之差異以雙下劃線示出)。 hMAB-A VL(1) (SEQ ID NO:54 )： hMAB-A VL(2) (SEQ ID NO:55 )： hMAB-A VL(3) (SEQ ID NO:56 )： hMAB-A VL(4)(SEQ ID NO: 57 )：
因此，MAB-A之人源化及/或最佳化抗ADAM9-VL結構域之FR之適合胺基酸序列為： FRL 1結構域(SEQ ID NO:58 )：DIVMTQSPDSLAVSLGERATISC FRL 2結構域(SEQ ID NO:59 )：WYQQKPGQPPKLLIY FRL 3結構域(SEQ ID NO:60 )：GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYC FRL 4結構域(SEQ ID NO:61 )：FGQGTKLEIK
抗ADAM9-VL結構域之CDRL 1結構域之適合替代性胺基酸序列包括：SEQ ID NO:12 ：KASQSVDYDGDSYMNSEQ ID NO:62 ：KASQSVDYSGDSYMNSEQ ID NO:63 ：RASQSVDYSGDSYMNSEQ ID NO:64 ：RASQSVDYSGDSYLN
抗ADAM9-VL結構域之CDRL 3結構域之適合替代性胺基酸序列包括：SEQ ID NO:14 ：QQSHEDPFTSEQ ID NO:65 ：QQSYSTPFT
因此，本發明涵蓋包含以下之抗ADAM9抗體VL結構域： (1) 具有以下胺基酸序列之CDRL 1結構域：SEQ ID NO: 66 ：X12 ASQSVDYX13 GDSYX14 N 其中：X12 、X13 、X14 經獨立地選擇，且 其中：X12 為K或R；X13 為D或S；且X14 為M或L； (2) 具有以下胺基酸序列之CDRL 2結構域：SEQ ID NO:13 ：AASDLES 及 (3) 具有以下胺基酸序列之CDRL 3結構域：SEQ ID NO:67 ：QQSX15 X16 X17 PFT 其中：X15 、X16 及X17 經獨立地選擇，且 其中：X15 為H或Y；X16 為E或S；且X17 為D或T。
MAB-A之衍生物/變異體之例示性人源化/最佳化IgG1輕鏈含有hMAB-A VL (2)結構域(SEQ ID NO:55 )，且具有胺基酸序列(SEQ ID NO: 68 )：
本發明另外明確涵蓋免疫特異性地結合至人類ADAM9多肽之抗原決定基且包含上文所提供之MAB-A CDRH 1、CDRH 2、CDRH 3、CDRL 1、CDRL 2或CDRL 3中之任一者的免疫接合物，且特定涵蓋包含上文所提供之MAB-A CDRH 1中之一者、上文所提供之MAB-A CDRH 2中之一者、上文所提供之MAB-A CDRH 3中之一者、上文所提供之MAB-A CDRL 1中之一者、上文所提供之MAB-A CDRL 2中之一者及上文所提供之MAB-A CDRL 3中之一者的此類免疫接合物。本發明進一步涵蓋進一步包含上文所提供之人源化MAB-A FRH 1、FRH 2、FRH 3或FRH 4、FRL 1、FRL 2、FRL 3或FRL 4中之任一者的此類免疫接合物，且特定涵蓋包含FRH 1、FRH 2、FRH 3及FRH 4及/或包含FRL 1、FRL 2、FRL 3、FRL 4及FRH 1之此類免疫接合物。
在一些實施方案中，人源化/最佳化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包括具有選自由以下組成之群之序列的CDRH 1結構域、CDRH 2結構域及CDRH 3結構域以及CDRL 1結構域、CDRL 2結構域及CDRL 3結構域： (a) 分別為SEQ ID NO: 8、35及10以及SEQ ID NO: 62、13、14； (b) 分別為SEQ ID NO: 8、35及10以及SEQ ID NO: 63、13、14； (c) 分別為SEQ ID NO: 8、36及10以及SEQ ID NO: 63、13、14； (d) 分別為SEQ ID NO: 34、36及10以及SEQ ID NO: 64、13、65； (e) 分別為SEQ ID NO: 8、35及37以及SEQ ID NO: 62、13、14； (f) 分別為SEQ ID NO: 8、35及38以及SEQ ID NO: 62、13、14； (g) 分別為SEQ ID NO: 8、35及39以及SEQ ID NO: 62、13、14； (h) 分別為SEQ ID NO: 8、35及40以及SEQ ID NO: 62、13、14； (i) 分別為SEQ ID NO: 8、35及41以及SEQ ID NO: 62、13、14； (j) 分別為SEQ ID NO: 8、35及42以及SEQ ID NO: 62、13、14； (k) 分別為SEQ ID NO: 8、35及43以及SEQ ID NO: 62、13、14； (l) 分別為SEQ ID NO: 8、35及44以及SEQ ID NO: 62、13、14； (m) 分別為SEQ ID NO: 8、35及45以及SEQ ID NO: 62、13、14；及 (n) 分別為SEQ ID NO: 8、35及46以及SEQ ID NO: 62、13、14。
在特定實施方案中，人源化/最佳化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包括分別具有SEQ ID NO: 8、35及45以及SEQ ID NO: 62、13、14之序列的CDRH 1結構域、CDRH 2結構域及CDRH 3結構域以及CDRL 1結構域、CDRL 2結構域及CDRL 3結構域。
在一些實施方案中，人源化/最佳化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包括具有與如下序列至少90%、至少95%、至少99%或100%一致之序列的重鏈可變結構域(VH)及輕鏈可變結構域(VL)： (a) 分別為SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:55； (b) 分別為SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:56； (c) 分別為SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:56； (d) 分別為SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:57； (e) 分別為SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:55； (f) 分別為SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:55； (g) 分別為SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:55； (h) 分別為SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:55； (i) 分別為SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:55； (j) 分別為SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:55； (k) 分別為SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:55； (l) 分別為SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:55； (m) 分別為SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:55；及 (n) 分別為SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:55。
「實質上一致」或「一致」意指多肽與參考胺基酸序列(例如本文所述之胺基酸序列中之任一者)展現至少50%一致性。此種序列在胺基酸水準或核酸下與用於比較之序列較佳至少60%、更佳至少80%或至少85%且更佳至少90%、至少95%、至少99%或甚至100%一致。
序列一致性通常使用序列分析軟體量測(例如Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705之序列分析套裝軟體(Sequence Analysis Software Package)，BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程式)。此種軟體藉由向各種取代、缺失及/或其他修飾賦予同源性程度來匹配一致或相似序列。保守性取代通常包括在以下組內之取代：甘胺酸、丙胺酸；纈胺酸、異白胺酸、白胺酸；天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、麩醯胺；絲胺酸、蘇胺酸；離胺酸、精胺酸；及苯丙胺酸、酪胺酸。在用以確定一致性程度之例示性方法中，可使用BLAST程式，其中e-3 與e-100 之間的機率分值指示密切相關之序列。
在特定實施方案中，人源化/最佳化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包括分別具有與SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:55之序列至少90%、至少95%、至少99%或100%一致之序列的重鏈可變結構域(VH)及輕鏈可變結構域(VL)。
在某些實施方案中，人源化/最佳化抗ADAM9抗體包含如下重鏈及輕鏈序列： (a) 分別為SEQ ID NO:50及SEQ ID NO:68； (b) 分別為SEQ ID NO:51及SEQ ID NO:68； (c) 分別為SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:68； (d) 分別為SEQ ID NO:141及SEQ ID NO:68； (e) 分別為SEQ ID NO:142及SEQ ID NO:68； (f) 分別為SEQ ID NO:143及SEQ ID NO:68； (g) 分別為SEQ ID NO:151及SEQ ID NO:68； (h) 分別為SEQ ID NO:152及SEQ ID NO:68； (i) 分別為SEQ ID NO:153及SEQ ID NO:68；及 (j) 分別為SEQ ID NO:154及SEQ ID NO:68。
在特定實施方案中，人源化/最佳化抗ADAM9抗體包含具有SEQ ID NO:52之序列之重鏈及具有SEQ ID NO:68之序列之輕鏈。在其他特定實施方案中，人源化/最佳化抗ADAM9抗體包含具有SEQ ID NO:142之序列之重鏈及具有SEQ ID NO:68之序列之輕鏈。在其他實施方案中，人源化/最佳化抗ADAM9抗體經工程改造用於延長血清半衰期且包含具有SEQ ID NO:151之序列之重鏈及具有SEQ ID NO:68之序列之輕鏈。在其他特定實施方案中，人源化/最佳化抗ADAM9抗體經工程改造用於延長血清半衰期且包含具有SEQ ID NO:155之序列之重鏈及具有SEQ ID NO:68之序列之輕鏈。在其他特定實施方案中，人源化/最佳化抗ADAM9抗體經工程改造用於延長血清半衰期及用於位點特異性接合且包含具有SEQ ID NO:152之序列之重鏈及具有SEQ ID NO:68之序列之輕鏈。在其他特定實施方案中，人源化/最佳化抗ADAM9抗體經工程改造用於延長血清半衰期及用於位點特異性接合且包含具有SEQ ID NO:156之序列之重鏈及具有SEQ ID NO:68之序列之輕鏈。
本發明亦明確涵蓋免疫特異性地結合至人類ADAM9多肽之抗原決定基，且包含上文所提供之人源化/最佳化抗ADAM9 MAB-A VL或VH結構域中之任一者的免疫接合物。本發明特定涵蓋包含人源化/最佳化抗ADAM9 VL或VH結構域之以下組合中之任一者的此類抗ADAM9抗體及其ADAM9結合片段。
本發明特定涵蓋包含如上文所提供之人源化/最佳化抗ADAM9-VL及/或VH結構域之免疫接合物。在特定實施方案中，本發明之免疫接合物包含(i)如上文所提供之人源化/最佳化抗ADAM9-VL及/或VH結構域，及(ii) Fc區。
儘管上文概述針對抗ADAM9 VH及VL結構域之特定修飾且在圖 3A-3B 中進行比較，但當工程改造本發明之人源化及/或最佳化抗ADAM9-VH或VL結構域時未必修飾所有或大多數此等殘基。本發明亦涵蓋此等VH及VL序列之少量變異，包括例如可引入以促進次選殖之C端及/或N端胺基酸殘基之胺基酸取代。III. 抗體藥物接合物 定義
如本文所用之術語「免疫接合物 」、「接合物 」或「ADC 」係指連接至或接合至細胞結合劑(例如本文所述之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段)之本文所述之類美登素化合物。
「連接子 」為能夠將本文所述之類美登素化合物以穩定、共價方式連接至細胞結合劑，諸如抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段之任何化學部分。在化合物或抗體保持活性之條件下，連接子可易於或實質上抵抗酸誘導之裂解、光誘導之裂解、肽酶誘導之裂解、酯酶誘導之裂解及二硫鍵裂解。適合之連接子在此項技術中熟知且包括例如二硫基、硫醚基、酸不穩定基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團及酯酶不穩定基團。連接子亦包括如本文所述及此項技術中已知之帶電連接子及其親水形式。
如本文所用之「烷基 」係指一至二十個碳原子之飽和直鏈或分支鏈單價烴基。烷基之實例包括(但不限於)甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基、-CH2 CH(CH3 )2 、2-丁基、2-甲基-2-丙基、1-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基、3,3-二甲基-2-丁基、1-庚基、1-辛基及其類似基團。較佳地，烷基具有一至十個碳原子。更佳地，烷基具有一至四個碳原子。
基團中碳原子之數目可在本文中由字首「Cx-xx 」指明，其中x及xx為整數。舉例而言，「C1-4 烷基」為具有1至4個碳原子之烷基。
術語「化合物 」或「細胞毒性化合物 」或「細胞毒性劑 」可互換使用。其欲包括本發明中已揭示結構或式或其任何衍生物或者以引用的方式已併入結構或式或其任何衍生物之化合物。該術語亦包括本發明中所揭示之所有式之化合物的立體異構體、幾何異構體、互變異構體、溶劑合物、代謝物及鹽(例如醫藥學上可接受之鹽)。該術語亦包括前述任一者之任何溶劑合物、水合物及多形體。在本申請案中所述之本發明之某些態樣中對「立體異構體」、「幾何異構體」、「互變異構體」、「溶劑合物」、「代謝物」、「鹽」、「接合物」、「接合物鹽」、「溶劑合物」、「水合物」或「多形體」之特定敍述不應解釋為在本發明之其他態樣中在未敍述此等其他形式之情況下使用術語「化合物」時有意省略此等形式。
術語「對掌性 」係指具有鏡像伴侶之不可重疊特性之分子，而術語「非對掌性」係指與鏡像伴侶可重疊之分子。
術語「立體異構體 」係指具有相同化學組成及連接性，但其原子在空間中之不同定向不可藉由繞單鍵旋轉而相互轉換之化合物。
「非對映異構體 」係指具有兩個或兩個以上對掌性中心且其分子不為彼此之鏡像的立體異構體。非對映異構體具有不同物理特性，例如熔點、沸點、光譜特性及反應性。非對映異構體之混合物可在諸如結晶、電泳及層析之高解析度分析程序下分離。
「對映體 」係指為彼此之不可重疊鏡像之化合物之兩個立體異構體。
本文所用之立體化學定義及慣例一般遵循S. P. Parker編, McGraw-Hill,Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York；及Eliel, E.與Wilen, S.,Stereochemistry of Organic Compounds , John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994。本發明之化合物可含有不對稱或對掌性中心，且因此以不同立體異構形式存在。本發明之化合物之所有立體異構形式，包括(但不限於)非對映異構體、對映體及阻轉異構體以及其混合物(諸如外消旋混合物)欲構成本發明之一部分。許多有機化合物以光學活性形式存在，亦即，其具有使平面偏振光之平面旋轉之能力。在描述光學活性化合物中，字首D及L或R及S用於表示分子繞其對掌性中心之絕對構型。字首d及l或(+)及(-)用於指定化合物使平面偏振光旋轉之標誌，其中(-)或l意指化合物為左旋的。以(+)或d作字首之化合物為右旋的。對於給定化學結構，此等立體異構體除其為彼此之鏡像外均相同。特定立體異構體亦可稱作對映體，且此類異構體之混合物常稱為對映體混合物。50:50之對映體混合物稱作外消旋混合物或外消旋體，其可在化學反應或過程中尚不存在立體選擇性或立體特異性之情況下出現。術語「外消旋混合物」及「外消旋體」係指缺乏光學活性之兩種對映體物質之等莫耳混合物。
術語「互變異構體 」或「互變異構形式 」係指經由低能量障壁可相互轉換之不同能量之結構異構體。舉例而言，質子互變異構體(亦稱為質子轉移互變異構體)包括經由質子遷移而達成之相互轉換，諸如酮-烯醇及亞胺-烯胺異構。價鍵互變異構體包括藉由鍵結電子中之一些重新組織而達成之相互轉換。
術語「陽離子 」係指具有正電荷之離子。陽離子可為單價(例如Na+ 、K+ 、NH4 + 等)、二價(例如Ca2+ 、Mg2+ 等)或多價(例如Al3+ 等)。較佳地，陽離子為單價。
如本文所用之片語「醫藥學上可接受之鹽 」係指本發明之化合物之醫藥學上可接受之有機或無機鹽。例示性鹽包括(但不限於)硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異菸鹼酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、鞣酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、丁二酸鹽、順丁烯二酸鹽、龍膽酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡萄糖酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、蔗糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、麩胺酸鹽、甲烷磺酸鹽「甲磺酸鹽」、乙烷磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、撲酸鹽(pamoate) (亦即，1,1'-亞甲基-雙(2-羥基-3-萘甲酸鹽))鹽、鹼金屬(例如鈉及鉀)鹽、鹼土金屬(例如鎂)鹽，及銨鹽。醫藥學上可接受之鹽可涉及包括另一個分子，諸如乙酸根離子、丁二酸根離子或其他相對離子。相對離子可為穩定親本化合物上之電荷的任何有機或無機部分。此外，醫藥學上可接受之鹽在其結構中可具有多於一個帶電原子。多個帶電原子為醫藥學上可接受之鹽的一部分之情況可具有多個相對離子。因此，醫藥學上可接受之鹽可具有一或多個帶點原子及/或一或多個相對離子。
若本發明之化合物為鹼，則所要醫藥學上可接受之鹽可藉由此項技術中可用之任何適合方法製備，例如用以下酸處理游離鹼：無機酸，諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、甲烷磺酸、磷酸，及其類似物；或有機酸，諸如乙酸、順丁烯二酸、丁二酸、苦杏仁酸、反丁烯二酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水楊酸，哌喃糖酸(pyranosidyl acid)，諸如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸，α羥酸，諸如檸檬酸或酒石酸，胺基酸，諸如天冬胺酸或麩胺酸，芳香族酸，諸如苯甲酸或桂皮酸，磺酸，諸如對甲苯磺酸或乙烷磺酸，或其類似物。
若本發明之化合物為酸，則所要醫藥學上可接受之鹽可藉由任何適合方法製備，例如用以下無機或有機鹼處理游離酸：諸如胺(第一、第二或第三)、鹼金屬氫氧化物或鹼土金屬氫氧化物，或其類似物。適合鹽之說明性實例包括(但不限於)來源於以下之有機鹽：胺基酸，諸如甘胺酸及精胺酸，氨，第一、第二及第三胺，及環胺，諸如哌啶、嗎啉及哌嗪；及來源於以下之無機鹽：鈉、鈣、鉀、鎂、錳、鐵、銅、鋅、鋁及鋰。
如本文所用之術語「溶劑合物 」意指進一步包括由非共價分子間力結合之化學計算或非化學計算量之溶劑的化合物，該溶劑諸如水、異丙醇、丙酮、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸及乙醇胺二氯甲烷、2-丙醇，或其類似物。化合物之溶劑合物或水合物易於藉由將至少一莫耳當量之羥基溶劑，諸如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇或水添加至化合物中以引起亞胺部分之溶劑合或水合來製備。
「代謝物 」或「異化代謝物 」為經由指定化合物、其衍生物或其接合物或其鹽在體內代謝或異化產生之產物。化合物、其衍生物或其接合物之代謝物可使用此項技術中已知之常規技術鑑別，且其活性係使用諸如本文所述之彼等之測試確定。此類產物可例如由所投予之化合物之氧化、羥基化、還原、水解、醯胺化、脫醯胺、酯化、脫酯化、酶促裂解及其類似方式產生。因此，本發明包括本發明之化合物、其衍生物或其接合物之代謝物，包括藉由如下過程產生之化合物、其衍生物或其接合物，該過程包含使本發明之化合物、其衍生物或其接合物與哺乳動物接觸足以得到其代謝產物之時段。
片語「醫藥學上可接受 」指示物質或組合物必須在化學上及/或毒物學上與構成調配物之其他成分及/或其所治療之哺乳動物相容。
術語「保護基 」或「保護部分 」係指通常用於阻斷或保護特定官能度，同時使化合物、其衍生物或其接合物上之其他官能基反應之取代基。舉例而言，「胺保護基」或「胺基保護部分」為阻斷或保護化合物中之胺基官能度的附接至胺基之取代基。此類基團在此項技術中熟知(參見例如P. Wuts及T. Greene, 2007,Protective Groups in Organic Synthesis , 第7章, J. Wiley & Sons, NJ)且由以下例示：胺基甲酸酯，諸如胺基甲酸甲酯及胺基甲酸乙酯、FMOC、經取代之胺基甲酸乙酯、藉由1,6-β-消除而裂解之胺基甲酸酯(亦稱為「自消型」)，脲、醯胺、肽、烷基及芳基衍生物。適合之胺基保護基包括乙醯基、三氟乙醯基、第三丁氧基羰基(BOC)、苯甲氧基羰基(CBZ)及9-茀基亞甲氧基羰基(Fmoc)。對於保護基及其用途之一般描述，參見P. G.M. Wuts及T. W. Greene,Protective Groups in Organic Synthesis , John Wiley & Sons, New York, 2007。
術語「胺基酸 」係指天然存在之胺基酸或非天然存在之胺基酸。在一個實施方案中，胺基酸由NH2 -C(Raa' Raa )-C(=O)OH表示，其中Raa 及Raa' 各自獨立地為H，視情況經取代之具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基，芳基、雜芳基或雜環基，或Raa 與N端氮原子可一起形成雜環(例如在脯胺酸中)。術語「胺基酸殘基 」係指當一個氫原子自胺基酸之胺末端移除及/或羥基自胺基酸之羧基末端移除時之對應殘基，諸如-NH-C(Raa' Raa )-C(=O)-。當在未指示α碳之特定立體化學之情況下提及胺基酸或胺基酸殘基時，意欲包括L-異構體與R-異構體。舉例而言，「Ala」包括L-丙胺酸與R-丙胺酸。
術語「肽 」係指由肽(醯胺)鍵連接之胺基酸單體之短鏈。在一些實施方案中，肽含有2至20個胺基酸殘基。在其他實施方案中，肽含有2至10個胺基酸殘基。在其他實施方案中，肽含有2至5個胺基酸殘基。如本文所用，當肽為由胺基酸之特定序列表示之本文所述之細胞毒性劑或連接子之一部分時，肽可在兩個方向上連接至細胞毒性劑或連接子之其餘部分。舉例而言，二肽X1-X2包括X1-X2及X2-X1。類似地，三肽X1-X2-X3包括X1-X2-X3及X3-X2-X1，且四肽X1-X2-X3-X4包括X1-X2-X3-X4及X4-X2-X3-X1。X1、X2、X3及X4表示胺基酸殘基。當在未指示各胺基酸或胺基酸殘基之立體化學之情況下提及肽或肽殘基時，意欲包括L-異構體與R-異構體。然而，當肽或肽殘基中之一或多個胺基酸或胺基酸殘基之立體化學指定為D-異構體時，肽或肽殘基中未指定立體化學之其他胺基酸或胺基酸殘基意欲僅包括天然L-異構體。舉例而言，「Ala-Ala-Ala」意欲包括肽或肽殘基，其中Ala中之每一者可為L-異構體或R-異構體；而「Ala-D-Ala-Ala」意欲包括L-Ala-D-Ala-L-Ala。
術語「反應性酯基 」係指可易與胺基反應形成醯胺鍵之酯基基團。例示性反應性酯基包括(但不限於) N-羥基丁二醯亞胺酯、N-羥基鄰苯二甲醯亞胺酯、N-羥基磺基-丁二醯亞胺酯、對硝基苯酯、二硝基苯酯、五氟苯酯及其衍生物，其中該等衍生物促進醯胺鍵形成。在某些實施方案中，反應性酯基為N-羥基丁二醯亞胺酯或N-羥基磺基-丁二醯亞胺酯。
術語「胺反應基 」係指可與胺基反應形成共價鍵之基團。例示性胺反應基包括(但不限於)反應性酯基、醯基鹵化物、磺醯基鹵化物、醯亞胺酯或反應性硫酯基。在某些實施方案中，胺反應基為反應性酯基。在一個實施方案中，胺反應基為N-羥基丁二醯亞胺酯或N-羥基磺基-丁二醯亞胺酯。
術語「硫醇反應基 」係指可與硫醇(-SH)基反應形成共價鍵之基團。例示性硫醇反應基包括(但不限於)順丁烯二醯亞胺、鹵乙醯基、鹵乙醯胺、乙烯基碸、乙烯基磺醯胺或乙烯基吡啶。在一個實施方案中，硫醇反應基為順丁烯二醯亞胺。
除非上下文另有明確指示，否則如本揭示案及申請專利範圍中所用之單數形式「一(a/an )」及「該 」包括複數形式。
應瞭解，在本文中用語言「包含 」描述實施方案之任何情況下，亦提供以術語「由 …… 組成 」及/或「基本上由 …… 組成 」描述之其他方面類似之實施方案。A. 例示性免疫接合物
使用此項技術中已知之技術可將本發明之類美登素化合物直接地或間接地經連接子偶合或接合至抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段以產生「免疫接合物」、「接合物」或「ADC」。
在第一實施方案中，本發明之免疫接合物包含本文所述之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其經由位於抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段上之一或多個離胺酸殘基之ε-胺基或經由位於抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段上之一或多個半胱胺酸殘基之硫醇基共價連接至本文所述之類美登素化合物。
在第一實施方案之第一個特定實施方案中，本發明之免疫接合物由上文所述之式(I)表示，其中Rx 、Ry 、Rx' 及Ry' 全部為H；且l及k各自獨立地為2至6之整數；且其餘變數如上文關於式(I)所述。
在第一實施方案之第二個特定實施方案中，本發明之免疫接合物由上文所述之式(I)表示，其中A為含有2至5個胺基酸殘基之肽；且其餘變數如上文關於式(I)或在第一個特定實施方案中所述。在一些實施方案中，A為由蛋白酶可裂解之肽。在一些實施方案中，由蛋白酶可裂解之肽在腫瘤組織中表現。在一些實施方案中，A為具有用-NH-CR1 R2 -S-L1 -D共價連接之胺基酸的肽，該胺基酸選自由以下組成之群：Ala、Arg、Asn、Asp、Cit、Cys、硒代半胱胺酸(selino-Cys)、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr及Val，各自獨立地呈L或D異構體。在一些實施方案中，連接至-NH-CR1 R2 -S-L1 -D之胺基酸為L胺基酸。
在第一實施方案之第三個特定實施方案中，本發明之免疫接合物由上文所述之式(I)表示，其中A選自由以下組成之群：Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、D-Val-Ala、Val-Cit、D-Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 144)、β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 145)、Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 146)、Val-Arg、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe、Gln-Ala、D-Ala-Pro及D-Ala-tBu-Gly，其中各肽中之第一胺基酸連接至L2基團且各肽中之最末胺基酸連接至-NH-CR1R2-S-L1-D；且其餘變數如關於式(I)或在第一個特定實施方案中所述。
在第一實施方案之第四個特定實施方案中，本發明之免疫接合物由上文所述之式(I)表示，其中R1 與R2 均為H；且其餘變數如關於式(I)或在第一個、第二個或第三個特定實施方案中所述。
在第一實施方案之第五個特定實施方案中，本發明之免疫接合物由上文所述之式(I)表示，其中L1 為-(CH2 )4-6 -C(=O)-；且其餘變數如關於式(I)或在第一個、第二個、第三個或第四個特定實施方案中所述。
在第一實施方案之第六個特定實施方案中，本發明之免疫接合物由上文所述之式(I)表示，其中D由下式表示：； 且其餘變數如關於式(I)或在第一個、第二個、第三個、第四個或第五個特定實施方案中所述。
在第七個特定實施方案中，本發明之免疫接合物由下式表示：(Ia)；(Ib)；(Ic)；(Id)；或(Ie)； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：為經Lys胺基連接至L2 基團之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段；為經Cys硫醇基連接至L2 基團之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段； R3 及R4 各自獨立地為H或Me； m1、m3、n1、r1、s1及t1各自獨立地為1至6之整數； m2、n2、r2、s2及t2各自獨立地為1至7之整數； t3為1至12之整數； D1 由下式表示：；且 q為1至20之整數。在更特定實施方案中，D1 由下式表示：。
在第八個特定實施方案中，本發明之免疫接合物由下式表示：(Ia)，或(Id)； 其中： m1及m3各自獨立地為2至4之整數； m2為2至5之整數； r1為2至6之整數； r2為2至5之整數；且 其餘變數如第七個特定實施方案中所述。
在第九個特定實施方案中，對於第七個或第八個特定實施方案中所述之免疫接合物，A為Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。在更特定實施方案中，對於第七個或第八個特定實施方案中所述之免疫接合物，A為L-Ala-D-Ala-L-Ala。
在第十個特定實施方案中，本發明之免疫接合物由下式表示：；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；；或；；；；；；；；；；；；；；；或 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： A為Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly，且 D1 由下式表示：； 且其餘變數如第七個、第八個或第九個特定實施方案中所述。在更特定實施方案中，A為L-Ala-D-Ala-L-Ala。在更特定實施方案中，D1 由下式表示：。
在第十一個特定實施方案中，本發明之免疫接合物由下式表示：；；；；；或， 其中D1 由下式表示：。
在第十二個特定實施方案中，本發明之免疫接合物由下式表示：，， 其中： CBA為人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其包含分別具有SEQ ID NO: 8、35及45以及SEQ ID NO: 62、13、14之序列的CDRH 1結構域、CDRH 2結構域及CDRH 3結構域以及CDRL 1結構域、CDRL 2結構域及CDRL 3結構域； q為1或2； D1 由下式表示：。
在一些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含分別具有SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:55之序列的重鏈可變結構域(VH)及輕鏈可變結構域(VL)。在一些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體包含分別具有SEQ ID NO:142及SEQ ID NO:68之序列的重鏈及輕鏈。在一些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體包含分別具有SEQ ID NO:152及SEQ ID NO:68之序列的重鏈及輕鏈。在一些實施方案中，SEQ ID NO:142或SEQ ID NO:152中之X為離胺酸。在一些實施方案中，SEQ ID NO:142或SEQ ID NO:152中之X不存在。在一些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體包含分別具有SEQ ID NO:156及SEQ ID NO:68之序列的重鏈及輕鏈。
在第十三個特定實施方案中，本發明之免疫接合物由下式表示：， 其中： CBA為人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其包含分別具有SEQ ID NO: 8、35及45以及SEQ ID NO: 62、13、14之序列的CDRH 1結構域、CDRH 2結構域及CDRH 3結構域以及CDRL 1結構域、CDRL 2結構域及CDRL 3結構域； q為1或10之整數； D1 由下式表示：。
在某些實施方案中，抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含分別具有SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:55之序列的重鏈可變結構域(VH)及輕鏈可變結構域(VL)。在一些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體包含分別具有SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:68之序列的重鏈及輕鏈。在一些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體包含分別具有SEQ ID NO:151及SEQ ID NO:68之序列的重鏈及輕鏈。在某個實施方案中，SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:151中之X為離胺酸。在一些實施方案中，SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:151中之X不存在。在某些實施方案中，人源化抗ADAM9抗體包含分別具有SEQ ID NO:155及SEQ ID NO:68之序列的重鏈及輕鏈。
在第十四個實施方案中，本發明之免疫接合物包含抗ADAM9抗體hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K))，其偶合至由以下結構式表示之類美登素化合物DM21C (亦稱作Mal-LDL-DM或MalC5-LDL-DM或化合物17a)：(D-4)， 其中D1 由下式表示：。
抗ADAM9抗體hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K))具有分別具有SEQ ID NO:156及SEQ ID NO:68之序列的重鏈及輕鏈。在一些實施方案中，免疫接合物在本文中以hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K)-Mal-LDL-DM提及。
在一個實施方案中，免疫接合物hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K)-Mal-LDL-DM由以下結構式表示：， 其中： CBA為經Cys硫醇基連接至類美登素化合物之抗ADAM9抗體hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K)；且 q為1或2。
在某些實施方案中，對於包含第十四個特定實施方案之免疫接合物之組合物(例如醫藥組合物)，DAR在1.5至2.2、1.7至2.2或1.9至2.1之範圍內。在某個實施方案中，DAR為1.7、1.8、1.9、2.0或2.1。
在第十五個特定實施方案中，本發明之免疫接合物包含抗ADAM9抗體hMAB-A(2I.2)(YTE/-K))，其偶合至由以下結構式表示之類美登素化合物DM21L (亦稱作LDL-DM或化合物14c)：(D-2)； 該偶合係經由γ-順丁烯二醯亞胺基丁酸N-丁二醯亞胺酯(GMBS)或N-(γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基)磺基丁二醯亞胺酯(磺基-GMBS或sGMBS)連接子。抗ADAM9抗體hMAB-A(2I.2)(YTE/-K))具有分別具有SEQ ID NO:155及SEQ ID NO:68之序列的重鏈及輕鏈。在一些實施方案中，接合物在本文中稱作hMAB-A(2I.2)(YTE/-K)-sGMBS-LDL-DM。接合物亦可稱作hMAB-A(2I.2)(YTE/-K)-GMBS-LDL-DM，其可與hMAB -A(2I.2)(YTE/-K)-sGMBS-LDL-DM互換使用。
GMBS及磺基-GMBS (或sGMBS)連接子在此項技術中已知且可由以下結構式表示： 。
在一個實施方案中，免疫接合物由以下結構式表示：， 其中： CBA為經Lys胺基連接至類美登素化合物之抗ADAM9抗體hMAB-A(2I.2)(YTE/-K))；且 q為1或10之整數。
在某些實施方案中，對於包含第十五個特定實施方案之免疫接合物之組合物(例如醫藥組合物)，DAR在3.0至4.0、3.2至3.8或3.4至3.7之範圍內。在一些實施方案中，DAR為3.2、3.3、3.4、3.5、3.5、3.7或3.8。
在某些實施方案中，對於包含第一實施方案或第一個、第二個、第三個、第四個、第五個、第六個、第七個、第八個、第九個、第十個、第十一個、第十二個、第十三個、第十四個或第十五個特定實施方案之免疫接合物之組合物(例如醫藥組合物)，組合物中每個抗體分子之細胞毒性劑之平均數目(亦即，q之平均值)，亦稱為藥物-抗體比(DAR)在1.0至8.0之範圍內。在一些實施方案中，DAR在1.0至5.0、1.0至4.0、1.5至4.0、2.0至4.0、2.5至4.0、1.0至3.4、1.0至3.0、2.9至3.3、3.3至3.8、1.5至2.5、2.0至2.5、1.7至2.3或1.8至2.2之範圍內。在一些實施方案中，DAR小於4.0、小於3.8、小於3.6、小於3.5、小於3.0或小於2.5。在一些實施方案中，DAR在3.2至3.4之範圍內。在一些實施方案中，DAR在3.0至3.2之範圍內。在一些實施方案中，DAR在3.5至3.7之範圍內。在一些實施方案中，DAR為3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6或3.7。在一些實施方案中，DAR在1.8至2.0之範圍內。在一些實施方案中，DAR在1.7至1.9之範圍內。在一些實施方案中，DAR在1.9至2.1之範圍內。在一些實施方案中，DAR為1.9、2.0或2.1。在一些實施方案中，對於包含經一或多個半胱胺酸硫醇基連接至類美登素化合物之抗ADAM9抗體或其抗ADAM9結合片段之本發明免疫接合物，DAR在1.5至2.5、1.8至2.2、1.1至1.9或1.9至2.1之範圍內。在一些實施方案中，DAR為1.8、1.9、2.0或2.1。C. 例示性連接子分子
此項技術中已知之任何適合連接子可用於製備本發明之免疫接合物。在某些實施方案中，連接子為雙官能連接子。如本文所用之術語「雙官能連接子 」係指具有兩個反應基之修飾劑；其中一個反應基能夠與細胞結合劑反應，而另一個反應基與類美登素化合物反應以將兩個部分連接在一起。此類雙官能連接子在此項技術中熟知(參見例如Isalm及Dent,Bioconjugation 第5章, 第218-363頁, Groves Dictionaries Inc. New York, 1999)。舉例而言，能夠經由硫醚鍵連接之雙官能交聯劑包括4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)-環己烷-1-甲酸N- 丁二醯亞胺酯(SMCC)以引入順丁烯二醯亞胺基，或4-(碘乙醯基)-胺基苯甲酸N -丁二醯亞胺酯(SIAB)以引入碘乙醯基。將順丁烯二醯亞胺基或鹵乙醯基引入細胞結合劑上之其他雙官能交聯劑在此項技術中熟知(參見美國專利公開案第2008/0050310號、第20050169933號，可獲自Pierce Biotechnology Inc. P.O. Box 117, Rockland, IL 61105, USA)，且包括(但不限於)雙順丁烯二醯亞胺基聚乙二醇(BMPEO)、BM(PEO)2 、BM(PEO)3 、N-(β-順丁烯二醯亞胺基丙氧基)丁二醯亞胺酯(BMPS)、γ-順丁烯二醯亞胺基丁酸N-丁二醯亞胺酯(GMBS)、ε-順丁烯二醯亞胺基己酸N-羥基丁二醯亞胺酯(EMCS)、5-順丁烯二醯亞胺基戊酸NHS、HBVS、作為SMCC之「長鏈」類似物(LC-SMCC)之4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)-環己烷-1-羧基-(6-醯胺基己酸) N-丁二醯亞胺酯、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺酯(MBS)、4-(4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基)-丁酸醯肼或鹽酸鹽(MPBH)、3-(溴乙醯胺基)丙酸N-丁二醯亞胺酯(SBAP)、碘乙酸N-丁二醯亞胺酯(SIA)、κ-順丁烯二醯亞胺基十一酸N-丁二醯亞胺酯(KMUA)、4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)-丁酸N-丁二醯亞胺酯(SMPB)、6-(β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)己酸丁二醯亞胺酯(SMPH)、(4-乙烯基磺醯基)苯甲酸丁二醯亞胺酯(SVSB)、二硫代雙順丁烯二醯亞胺基乙烷(DTME)、1,4-雙順丁烯二醯亞胺基丁烷(BMB)、1,4-雙順丁烯二醯亞胺基-2,3-二羥基丁烷(BMDB)、雙順丁烯二醯亞胺基己烷(BMH)、雙順丁烯二醯亞胺基乙烷(BMOE)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基-甲基)環己烷-1-甲酸磺基丁二醯亞胺酯(磺基-SMCC)、(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸磺基丁二醯亞胺酯(磺基-SIAB)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基磺基丁二醯亞胺酯(磺基-MBS)、N-(γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基)磺基丁二醯亞胺酯(磺基-GMBS或sGMBS)、N-(ε-順丁烯二醯亞胺基己醯氧基)磺基丁二醯亞胺酯(磺基-EMCS)、N-(κ-順丁烯二醯亞胺基十一醯氧基)磺基丁二醯亞胺酯(磺基-KMUS)及4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸磺基丁二醯亞胺酯(磺基-SMPB)。
異雙官能交聯劑為具有兩個不同反應基之雙官能交聯劑。含有胺反應性N -羥基丁二醯亞胺基(NHS基團)與羧基反應性肼基之異雙官能交聯劑亦可用於連接本文所述之細胞毒性化合物與細胞結合劑(例如抗體)。此類市售異雙官能交聯劑之實例包括丁二醯亞胺基6-肼基菸鹼醯胺丙酮腙(SANH)、4-肼醯基對苯二甲酸丁二醯亞胺酯鹽酸鹽(SHTH)及肼菸鹼酸丁二醯亞胺酯鹽酸鹽(SHNH)。帶有酸不穩定連接之接合物亦可使用本發明之帶有肼之苯并二氮呯衍生物製備。可使用之雙官能交聯劑之實例包括對甲醯基苯甲酸丁二醯亞胺酯(SFB)及對甲醯基苯氧基乙酸丁二醯亞胺酯(SFPA)。
能夠經由二硫鍵連接細胞結合劑與細胞毒性化合物之雙官能交聯劑在此項技術中已知，且包括3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N -丁二醯亞胺酯(SPDP)、4-(2-吡啶基二硫代)戊酸N -丁二醯亞胺酯(SPP)、4-(2-吡啶基二硫代)丁酸N -丁二醯亞胺酯(SPDB)、4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基丁酸N -丁二醯亞胺酯(磺基-SPDB或sSPDB)以引入二硫代吡啶基。可用於引入二硫基之其他雙官能交聯劑在此項技術中已知且揭示於美國專利6,913,748、6,716,821及美國專利公開案20090274713及20100129314中，該等文獻全部以引用的方式併入本文中。或者，亦可使用引入硫醇基之交聯劑，諸如2-亞胺基硫雜環戊烷、升半胱胺酸硫代內酯或S-乙醯基丁二酸酐。D. 例示性類美登素
在第二實施方案中，本發明提供可用於製造本發明之免疫接合物之類美登素化合物。
在一些實施方案中，類美登素化合物由下式表示：(II) 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： L2 ' 由以下結構式表示：(L2a')；(L2b')；(L2c')；(L2d')；或(L2e')； 其中： Rx 、Ry 、Rx' 及Ry' 對於每次出現而言獨立地為H、-OH、鹵素、-O-(C1-4 烷基)、-SO3 H、-NR40 R41 R42 + ，或視情況經-OH、鹵素、-SO3 H或NR40 R41 R42 + 取代之C1-4 烷基，其中R40 、R41 及R42 各自獨立地為H或C1-4 烷基； l及k各自獨立地為1至10之整數； JCB ' 為-C(=O)OH或-COE，其中-COE為反應性酯； A為胺基酸或包含2至20個胺基酸之肽； R1 及R2 各自獨立地為H或C1-3 烷基； L1 由下式表示：； 其中R3 及R4 各自獨立地為H或Me，且L1 中之-C(=O)-部分連接至D； D由下式表示：，且 q為1至20之整數。
在一些實施方案中，本發明之類美登素由下式表示：(III) 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： A'為胺基酸或包含2至20個胺基酸之肽(亦即，A-NH2 )； R1 及R2 各自獨立地為H或C1-3 烷基； L1 為-CR3 R4 -(CH2 )1-8 -C(=O)-；R3 及R4 各自獨立地為H或Me； D由下式表示：；且 q為1至20之整數。
在一些實施方案中，本發明之類美登素由下式表示：(IV)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： Rx' 及Ry' 對於每次出現而言獨立地為H、-OH、鹵素、-O-(C1-4 烷基)、-SO3 H、-NR40 R41 R42 + ，或視情況經-OH、鹵素、SO3 H或NR40 R41 R42 + 取代之C1-4 烷基，其中R40 、R41 及R42 各自獨立地為H或C1-4 烷基； k為1至10之整數； A為胺基酸殘基或包含2至20個胺基酸殘基之肽； R1 及R2 各自獨立地為H或C1-3 烷基； L1 為-CR3 R4 -(CH2 )1-8 -C(=O)-；R3 及R4 各自獨立地為H或Me； D由下式表示：；且 q為1至20之整數。
在一些實施方案中，對於式(II)、(III)或(IV)之類美登素化合物，變數如第一實施方案或第一實施例中之第一個、第二個、第三個、第四個、第五個、第六個、第七個、第八個、第九個、第十個或第十一個特定實施方案中所述。
在特定實施方案中，類美登素化合物由下式表示：(D-1)；(D-2)；(D-3)；(D-4)；(D-5)；或(D-6)； 其中D1 由下式表示：。IV. 產生方法
如此項技術中所熟知，本發明之抗ADAM9抗體及其ADAM9結合片段最佳經由編碼此類多肽之核酸分子之重組表現產生。
本發明之多肽可便利地使用固相肽合成製備(Merrifield, B. (1986) 「Solid Phase Synthesis 」, Science 232(4748):341-347；Houghten, R.A. (1985) 「General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids 」, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135；Ganesan, A. (2006) 「Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century 」, Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10)。
在替代方案中，可使用此項技術中已知之任何方法重組製造及表現抗體。可藉由首先分離自宿主動物製造之抗體、獲得基因序列及使用基因序列以在宿主細胞(例如CHO細胞)中重組表現抗體來重組製造抗體。可採用之另一種方法為在植物(例如菸草)或轉殖基因牛乳中表現抗體序列。已揭示在植物或牛乳中重組表現抗體之適合方法(參見例如Peeters等人 (2001) 「Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants 」, Vaccine 19:2756；Lonberg, N.等人 (1995) 「Human Antibodies From Transgenic Mice 」, Int. Rev. Immunol 13:65-93；及Pollock等人 (1999) 「Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies 」, J. Immunol Methods 231:147-157)。製造抗體衍生物，例如人源化、單鏈等之方法在此項技術中已知，其已在上文描述。在另一個替代方案中，可藉由噬菌體顯示技術重組製造抗體(參見例如美國專利第5,565,332號、第5,580,717號、第5,733,743號、第6,265,150號；及Winter, G.等人 (1994) 「Making Antibodies By Phage Display Technology 」, Annu. Rev. Immunol. 12.433-455)。
可藉由許多適當方式中之任一者將含有所關注之聚核苷酸(例如編碼本發明之抗ADAM9抗體及其ADAM9結合片段之多肽鏈之聚核苷酸)之載體引入宿主細胞中，該等方式包括電穿孔；採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-聚葡萄糖或其他物質之轉染；微彈轟擊；脂質體轉染；及感染(例如在載體為感染物，諸如牛痘病毒之情況下)。引入載體或聚核苷酸之選擇常常將視宿主細胞之特徵而定。
能夠過度表現異源DNA之任何宿主細胞可用於表現所關注之多肽或蛋白質之目的。適合哺乳動物宿主細胞之非限制性實例包括(但不限於) COS、HeLa及CHO細胞。
本發明包括包含本發明之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段之胺基酸序列的免疫接合物。本發明之多肽可藉由此項技術中已知之程序製造。多肽可藉由抗體之蛋白水解性或其他降解、藉由如上文所述之重組方法(亦即，單一或融合多肽)或藉由化學合成產生。抗體之多肽、尤其至多約50個胺基酸之較短多肽，便利地藉由化學合成製造。化學合成之方法在此項技術中已知且市售可得。
本發明包括免疫接合物，其包含抗ADAM9抗體及其片段之變異體，包括不顯著影響此類分子之特性之功能等效多肽以及具有增強或降低之活性的變異體。多肽修飾為此項技術中之常規實踐且無需在本文中詳細描述。經修飾多肽之實例包括具有胺基酸殘基之保守性取代、不顯著不利地改變功能活性之胺基酸之一或多個缺失或添加的多肽，或使用化學類似物。可彼此保守性取代之胺基酸殘基包括(但不限於)：甘胺酸/丙胺酸；絲胺酸/蘇胺酸；纈胺酸/異白胺酸/白胺酸；天冬醯胺/麩醯胺；天冬胺酸/麩胺酸；離胺酸/精胺酸；及苯丙胺酸/酪胺酸。此等多肽亦包括糖基化及非糖基化多肽以及具有其他轉譯後修飾之多肽，該等修飾諸如使用不同糖之糖基化、乙醯化及磷酸化。較佳地，胺基酸取代將為保守性的，亦即，經取代之胺基酸將具有與原始胺基酸類似之化學特性。此類保守性取代在此項技術中已知，且實例已在上文提供。胺基酸修飾之範圍可自改變或修飾一或多個胺基酸至完全重新設計區域，諸如可變結構域。可變結構域中之變化可改變結合親和力及/或特異性。其他修飾方法包括使用此項技術中已知之偶合技術，包括(但不限於)酶促方式、氧化取代及螯合。修飾可用於例如附接用於免疫檢定之標記，諸如附接用於放射免疫檢定之放射性部分。經修飾之多肽係使用此項技術中確立之程序製造且可使用此項技術中已知之標準檢定篩選。
本發明涵蓋包含具有本發明之抗ADAM9-VL及/或VH中之一或多者之融合蛋白質的免疫接合物。在一個實施方案中，提供包含輕鏈、重鏈或輕鏈與重鏈之融合多肽。在另一個實施方案中，融合多肽含有異源免疫球蛋白恆定區。在另一個實施方案中，融合多肽含有自公開寄存之融合瘤產生之抗體之輕鏈可變結構域及重鏈可變結構域。出於本發明之目的，抗體融合蛋白質含有一或多個特異性地結合至ADAM9之多肽結構域及另一個在原生分子中未附接之胺基酸序列，例如異源序列或來自另一個區域之同源序列。
本發明亦提供包含編碼本發明之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段之核苷酸序列的聚核苷酸。
在某些實施方案中，本發明提供編碼具有SEQ ID NO:68之胺基酸序列之hMAB-A VL (2)輕鏈的聚核苷酸，其中聚核苷酸具有SEQ ID NO:157 之核苷酸序列：
在某些實施方案中，本發明提供編碼具有SEQ ID NO:68之胺基酸序列之hMAB-A VL (2)輕鏈的聚核苷酸，其中聚核苷酸經密碼子最佳化且具有SEQ ID NO:158 之核苷酸序列：
在某些實施方案中，本發明提供編碼具有SEQ ID NO:151之胺基酸序列之hMAB-A VH (2I)重鏈的聚核苷酸，其中聚核苷酸具有SEQ ID NO: 159 之核苷酸序列： 其中xxx為aaa或不存在。
在某些實施方案中，本發明提供編碼具有SEQ ID NO:155之胺基酸序列之hMAB-A VH (2I)重鏈的聚核苷酸，其中聚核苷酸具有SEQ ID NO: 160 之核苷酸序列：
在某些實施方案中，本發明提供編碼具有SEQ ID NO:156之胺基酸序列之hMAB-A VH (2I)重鏈的聚核苷酸，其中聚核苷酸具有SEQ ID NO:161 之核苷酸序列：
在某些實施方案中，本發明提供編碼具有SEQ ID NO:156之胺基酸序列之hMAB-A VH (2I)重鏈的聚核苷酸，其中聚核苷酸經密碼子最佳化且具有SEQ ID NO:162 之核苷酸序列： V. 藥物接合
包含共價連接至本文所述之類美登素化合物之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段的免疫接合物可根據此項技術中已知之任何適合方法製備。
在某些實施方案中，第一實施方案之免疫接合物可藉由第一種方法製備，其包含使抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段與第二實施方案中所述之式(II)之類美登素化合物反應之步驟。
在某些實施方案中，第一實施方案之免疫接合物可藉由第二種方法製備，其包含以下步驟： (a) 使式(III)或(IV)之類美登素化合物與本文所述之連接子化合物反應以形成具有與其結合之胺反應基或硫醇反應基之細胞毒性劑-類美登素化合物，該胺反應基或硫醇反應基可共價連接至抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段(或CBA)；及 (b) 使抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段與類美登素-連接子化合物反應以形成免疫接合物。
在某些實施方案中，第一實施方案之免疫接合物可藉由第三種方法製備，其包含以下步驟： (a) 使抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段與本文所述之連接子化合物反應以形成具有與其結合之胺反應基或硫醇反應基之經修飾之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段(例如式(II)化合物)，該胺反應基或硫醇反應基可共價連接至式(III)或(IV)之類美登素化合物；及 (b) 使經修飾之抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段與式(III)或(IV)之類美登素化合物反應以形成免疫接合物。
在某些實施方案中，第一實施方案之免疫接合物可藉由第三種方法製備，其包含使抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段、連接子化合物及式(III)或(IV)之類美登素化合物反應以形成免疫接合物。在一個實施方案中，首先混合抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段及式(III)或(IV)之類美登素化合物，繼而添加連接子化合物。
在某些實施方案中，對於上文所述之第二種、第三種或第四種方法，連接子化合物由式(a1L) - (a10L)中之任一者表示：(a1L)；(a2L)；(a3L)；(a4L)；(a5L)；(a6L)；(a7L)；(a8L)；(a9L)；及(a10L)， 其中X為鹵素；JD -SH或-SSRd ；Rd 為苯基、硝基苯基、二硝基苯基、羧基硝基苯基、吡啶基或硝基吡啶基；Rg 為烷基；且U為-H或SO3 H，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一個實施方案中，連接子化合物為由式(a9L)表示之GMBS或磺基-GMBS，其中U為-H或SO3 H，或其醫藥學上可接受之鹽。
在特定實施方案中，本發明之免疫接合物由下式表示：(I-1)；且免疫接合物可藉由上文所述之第二種、第三種或第四種方法製備，其中連接子化合物為由式(a9L)表示之GMBS或磺基-GMBS，其中U為-H或SO3 H，或其醫藥學上可接受之鹽；且類美登素化合物由上文所述之式(D-1)表示。在更特定實施方案中，藉由使式(D-1)之類美登素化合物與連接子化合物GMBS或磺基-GMBS反應以形成類美登素-連接子化合物，繼而使抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段與類美登素-連接子化合物反應來製備式(I-1)之免疫接合物。在甚至更特定實施方案中，類美登素連接子化合物在與抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段反應之前未經純化。
在另一個特定實施方案中，免疫接合物由下式表示：(I-2)；且免疫接合物可藉由上文所述之第二種、第三種或第四種方法製備，其中連接子化合物為由式(a9L)表示之GMBS或磺基-GMBS，其中U為-H或SO3 H，或其醫藥學上可接受之鹽；且類美登素化合物由上文所述之式(D-2)表示。在更特定實施方案中，藉由使式(D-2)之類美登素化合物與連接子化合物GMBS或磺基-GMBS反應以形成類美登素-連接子化合物，繼而使抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段與類美登素-連接子化合物反應來製備式(I-2)之免疫接合物。在甚至更特定實施方案中，類美登素連接子化合物在與抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段反應之前未經純化。
在另一個特定實施方案中，免疫接合物由下式表示：(I-3)；且免疫接合物係根據上文所述之第一種方法藉由使抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段與上文所述之式(D-3)之類美登素化合物反應來製備。
在另一個特定實施方案中，免疫接合物由下式表示：(I-4)；且免疫接合物係根據上文所述之第一種方法藉由使抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段與上文所述之式(D-4)之類美登素化合物反應來製備。
在另一個特定實施方案中，免疫接合物由下式表示：(I-5)；且免疫接合物係根據上文所述之第一種方法藉由使抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段與上文所述之式(D-5)之類美登素化合物反應來製備。
在另一個特定實施方案中，免疫接合物由下式表示：(I-6)；且免疫接合物係根據上文所述之第一種方法藉由使抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段與上文所述之式(D-6)之類美登素化合物反應來製備。
在一些實施方案中，使藉由上文所述之任何方法製備之免疫接合物經受純化步驟。就此而言，可使用切向流過濾(TFF)、非吸附層析、吸附層析、吸附過濾、選擇性沈澱或任何其他適合之純化過程以及其組合自混合物之其他組分純化免疫接合物。
在一些實施方案中，使用單一純化步驟(例如TFF)純化免疫接合物。較佳地，使用單一純化步驟(例如TFF)純化接合物且轉換成適當調配物。在本發明之其他實施方案中，使用兩個依序純化步驟純化免疫接合物。舉例而言，可首先藉由選擇性沈澱、吸附過濾、吸收層析或非吸收層析純化免疫接合物，繼而用TFF純化。一般熟習此項技術者將瞭解，免疫接合物之純化能夠分離包含化學偶合至細胞毒性劑之細胞結合劑的穩定接合物。
可利用任何適合之TFF系統用於純化，包括Pellicon型系統(Millipore, Billerica, Mass.)、Sartocon Cassette系統(Sartorius AG, Edgewood, N.Y.)及Centrasette型系統(Pall Corp., East Hills, N.Y.)。
可利用任何適合之吸附層析樹脂用於純化。較佳吸附層析樹脂包括羥磷灰石層析、疏水電荷誘導層析(HCIC)、疏水相互作用層析(HIC)、離子交換層析、混合模式離子交換層析、固定化金屬親和層析(IMAC)、染料配位體層析、親和層析、逆相層析及其組合。適合羥磷灰石樹脂之實例包括陶瓷羥磷灰石(CHT I型及II型, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)、HA Ultrogel羥磷灰石(Pall Corp., East Hills, N.Y.)及陶瓷氟磷灰石(CFT I型及II型, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)。適合HCIC樹脂之實例為MEP Hypercel樹脂(Pall Corp., East Hills, N.Y.)。適合HIC樹脂之實例包括丁基-瓊脂糖、己基-瓊脂糖、苯基-瓊脂糖及辛基瓊脂糖樹脂(全部來自GE Healthcare, Piscataway, N.J.)，以及Macro-prep甲基樹脂及Macro-Prep第三丁基樹脂(Biorad Laboratories, Hercules, Calif.)。適合離子交換樹脂之實例包括SP-瓊脂糖、CM-瓊脂糖及Q-瓊脂糖樹脂(全部來自GE Healthcare, Piscataway, N.J.)及Unosphere S樹脂(Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)。適合混合模式離子交換劑之實例包括Bakerbond ABx樹脂(JT Baker, Phillipsburg N.J.)。適合IMAC樹脂之實例包括螯合瓊脂糖樹脂(GE Healthcare, Piscataway, N.J.)及Profinity IMAC樹脂(Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)。適合染料配位體樹脂之實例包括藍色瓊脂糖樹脂(GE Healthcare, Piscataway, N.J.)及藍親和凝膠(Affi-gel Blue)樹脂(Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)。適合親和樹脂之實例包括蛋白質A瓊脂糖樹脂(例如MabSelect, GE Healthcare, Piscataway, N.J.)，其中細胞結合劑為抗體；及凝集素親和樹脂，例如扁豆凝集素瓊脂糖樹脂(GE Healthcare, Piscataway, N.J.)，其中細胞結合劑帶有適當凝集素結合位點。或者，可使用對細胞結合劑具特異性之抗體。此種抗體可固定至例如瓊脂糖4快速流動樹脂(GE Healthcare, Piscataway, N.J.)。適合逆相樹脂之實例包括C4、C8及C18樹脂(Grace Vydac, Hesperia, Calif.)。
可利用任何適合之非吸附層析樹脂用於純化。適合非吸附層析樹脂之實例包括(但不限於)SEPHADEXTM G-25、G-50、G-100、SEPHACRYLTM樹脂(例如S-200及S-300)、SUPERDEXTM樹脂(例如SUPERDEXTM 75及SUPERDEXTM 200)、BIO-GEL®樹脂(例如P-6、P-10、P-30、P-60及P-100)，及一般熟習此項技術者所知之其他樹脂。VI. 本發明之免疫接合物之用途
本發明涵蓋包含本發明之免疫接合物之組合物，包括醫藥組合物。
如本文所提供，包含本文所提供之人源化/最佳化抗ADAM9-VL及/或VH結構域之本發明之免疫接合物具有結合存在於細胞表面上之ADAM9且介導細胞殺傷的能力。特定而言，包含藥用劑之本發明之免疫接合物經內化且經由藥用劑之活性介導細胞殺傷。此種細胞殺傷活性可由誘導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)之免疫接合物增強。
因此，包含本文所提供之人源化/最佳化抗ADAM9-VL及/或VH結構域之本發明之免疫接合物具有治療與ADAM9之表現相關聯或由ADAM9之表現特徵化之任何疾病或病狀的能力。如上文所論述，ADAM9為在眾多血液及實體惡性病中表現之癌胚抗原，該癌胚抗原與展現較低分化形態之高級別腫瘤相關聯且與不良臨床結果相關。因此，不受限制地，本發明之免疫接合物可用於治療癌症，尤其由ADAM9之表現特徵化之癌症。
在其他特定實施方案中，本發明之免疫接合物可適用於治療肺癌(例如非小細胞肺癌)、結腸直腸癌、膀胱癌、胃癌、胰臟癌、腎細胞癌、前列腺癌、食道癌、乳癌、頭頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、睪丸癌、骨髓癌、黑色素瘤及淋巴癌。在其他特定實施方案中，本發明之免疫接合物可適用於治療非小細胞肺癌、結腸直腸癌、胃癌、乳癌(例如三陰性乳癌(TNBC))或胰臟癌。
在其他實施方案中，本發明之免疫接合物可適用於治療非小細胞肺癌(鱗狀細胞、非鱗狀細胞、腺癌或大細胞未分化癌)、結腸直腸癌(腺癌、胃腸類癌腫瘤、胃腸基質腫瘤、原發性結腸直腸淋巴瘤、平滑肌肉瘤或鱗狀細胞癌)或乳癌(例如三陰性乳癌(TNBC))。
除用於療法中以外，本發明之免疫接合物可依可偵測方式作標記且用於癌症診斷或腫瘤及腫瘤細胞成像。VII. 醫藥組合物
本發明之組合物包括適用於製造醫藥組合物之原料藥組合物(例如不純或非無菌組合物)及可用於製備單位劑型之醫藥組合物(亦即，適合於向個體或患者投予之組合物)。此類組合物包含預防或治療有效量之本發明之免疫接合物，或此類藥劑與醫藥學上可接受之載劑之組合。較佳地，本發明之組合物包含預防或治療有效量之本發明之免疫接合物及醫藥學上可接受之載劑。本發明亦涵蓋此類醫藥組合物，其另外包括對特定癌抗原具特異性之第二治療性抗體(例如腫瘤特異性單株抗體)及醫藥學上可接受之載劑。
在特定實施方案中，術語「醫藥學上可接受 」意指由聯邦政府或州政府之管制機構核准或在美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或其他一般公認之藥典中列出用於動物中且更特定而言用於人類中。術語「載劑 」係指與治療劑一起投予之稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全及不完全))、賦形劑或媒劑。一般而言，本發明之組合物之成分單獨供應或在單位劑型中混合在一起，例如作為諸如安瓿或小袋之氣密密封容器中之凍乾乾粉或無水濃縮物，該容器指示活性劑之量。在組合物有待藉由輸注投予之情況下，其可用含有無菌醫藥級水或鹽水之輸注瓶分配。在組合物藉由注射投予之情況下，可提供無菌注射用水或鹽水之安瓿以使得成分可在投予之前混合。
本發明亦提供醫藥包裝或套組，其包含一或多個填充有單獨或與此種醫藥學上可接受之載劑一起之本發明之免疫接合物的容器。另外，一或多種適用於治療疾病之其他預防劑或治療劑亦可包括於醫藥包裝或套組中。本發明亦提供醫藥包裝或套組，其包含一或多個填充有本發明之醫藥組合物之成分中之一或多者的容器。由管制醫藥品或生物產品之製造、使用或銷售之政府機構指定之形式的通知可視情況與此種或此類容器相關聯，該通知反映由製造、使用或銷售機構核准用於人類投藥。
本發明提供可用於上述方法中之套組。套組可包含本發明之免疫接合物中之任一者。套組可進一步包含在一或多個容器中之一或多種適用於治療癌症之其他預防劑及/或治療劑。VIII. 投藥方法
可提供本發明之組合物用於藉由向個體投予有效量之本發明之免疫接合物來治療、預防及改善一或多種與疾病、病症相關聯之症狀。在較佳態樣中，此類組合物實質上經純化(亦即，實質上不含限制其作用或產生非所要之副作用之物質)。在特定實施方案中，個體為動物，較佳為哺乳動物，諸如非靈長類動物(例如牛、馬、貓、犬、囓齒動物等)或靈長類動物(例如猴，諸如食蟹猴，人類等)。在較佳實施方案中，個體為人類。
各種遞送系統為已知的且可用於投予本發明之組合物，例如囊封於能夠表現抗體或融合蛋白質之脂質體、微粒、微膠囊、重組細胞中，受體介導之胞吞作用(參見例如Wu等人 (1987) 「Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System 」, J. Biol. Chem. 262:4429-4432)，將核酸構築成反轉錄病毒或其他載體之一部分等。
投予本發明之免疫接合物之方法包括(但不限於)非經腸投藥(例如皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內及皮下)、硬膜外及經黏膜(例如鼻內及經口途徑)。在特定實施方案中，肌肉內、靜脈內或皮下投予本發明之免疫接合物。組合物可藉由任何便利途徑投予，例如藉由輸注或團注，且可與其他生物活性劑一起投予。投藥可為全身或局部。
本發明亦提供將本發明之免疫接合物之製劑封裝於諸如安瓿或小袋之氣密密封容器中，該容器指示分子之量。在一個實施方案中，此類分子作為氣密密封容器中之無菌凍乾乾粉或無水濃縮物供應且可例如用水或鹽水復原至適當濃度用於向個體投予。較佳地，本發明之免疫接合物作為氣密密封容器中之無菌凍乾乾粉供應。
本發明之免疫接合物之凍乾製劑應在2℃與8℃之間儲存於其原始容器中，且應在復原之後12小時內、較佳6小時內、5小時內、3小時內或1小時內投予。在替代性實施方案中，此類分子在氣密密封容器中以液體形式供應，該容器指示分子、融合蛋白質或接合分子之量及濃度。較佳地，此類免疫接合物當以液體形式提供時在氣密密封容器中供應。
如本文所用之醫藥組合物之「有效量 」為足以實現有益或所要結果之量，該等結果包括(但不限於)臨床結果，諸如減少由疾病引起之症狀、減弱感染症狀(例如病毒負荷、發熱、疼痛、敗血症等)或癌症症狀(例如癌細胞增殖、腫瘤存在、腫瘤轉移等)，從而增加罹患疾病之彼等之生活品質、減少治療疾病所需之其他藥物之劑量、諸如經由靶向及/或內化增強另一種藥物之作用、延遲疾病進展及/或延長個體存活。有效量可在一或多次投藥中投予。出於本發明之目的，藥物、化合物或醫藥組合物之有效量為足以達成以下之量：殺傷及/或減少癌細胞之增殖，及/或消除、減少及/或延遲自癌症之原發性部位之轉移的發展。
可向有治療需要之區域局部投予本發明之醫藥組合物；此可藉由例如且不限於以下達成：局部輸注、藉由注射或藉助於植入物，該植入物為多孔、無孔或凝膠狀材料，包括膜，諸如矽橡膠膜(sialastic membrane)或纖維。較佳地，當投予本發明之免疫接合物時，必須謹慎使用分子不吸收之材料。
本發明之組合物可在囊泡、尤其脂質體中遞送(參見Langer (1990) 「New Methods Of Drug Delivery 」, Science 249:1527-1533；Treat等人, LIPOSOMES IN THE THERAPY OF INFECTIOUS DISEASE AND CANCER, Lopez-Berestein及Fidler (編), Liss, New York, 第353-365頁 (1989)；Lopez-Berestein, 同上, 第317-327頁)。實施例
現已大體上描述本發明，經由參考以下實施例將更容易理解上述內容。以下實施例說明組合物在本發明之診斷或治療方法中之各種方法。實施例欲說明而決不限制本發明之範疇。實施例 1 抗 ADAM9 抗體 MAB-A 之腫瘤細胞特異性
鑑別鼠類抗ADAM9抗體(在本文中指定為MAB-A)：(1)阻斷ADAM9之靶蛋白加工活性；(2)經內化；及(3)具有抗腫瘤活性(參見例如美國專利第8361475號)。藉由IHC研究MAB-A之腫瘤細胞特異性。使腫瘤組織與MAB-A (0.4 μg/mL)或同型對照(0.4 μg/mL)接觸且目測染色程度。發現MAB-A強有力地標記多種大細胞癌、鱗狀細胞癌及腺癌非小細胞肺癌細胞類型(圖 1A )、乳癌細胞、前列腺癌細胞、胃癌細胞(圖 1B )以及結腸癌樣品(圖 1C )。使正常組織與MAB-A (1.25 μg/mL)接觸且目測染色程度。如上表 2 中概述，MAB-A展現廣泛多種正常組織之極少染色或無染色。將注意到，此等研究中所用之MAB-A之濃度接近用於腫瘤細胞染色之3倍。此等IHC研究之結果指示MAB-A展現對腫瘤細胞超過正常細胞之強優先結合。實施例 2 物種交叉反應性
檢查MAB-A與人類ADAM9 (huADAM9)及食蟹猴ADAM9 (cynoADAM9)之結合。簡言之，將短暫表現huADAM9、cynoADAM9、無關抗原之293-FT及CHO-K細胞或未轉染之親本細胞與MAB-A、繼而與山羊抗鼠-PE二級抗體一起培育，且藉由FACS分析。如圖 2 中所示，MAB-A展現與在兩種細胞類型上短暫表現之huADAM9之強結合。MAB-A展現與cynoADAM9之不良結合。MAB-A不結合至親本細胞或表現無關抗原之細胞。在ELISA檢定中觀察到與cynoADAM之類似低水準結合。實施例 3 人源化與初始最佳化
MAB-A之人源化得到人源化VH結構域，在本文中指定為「hMAB-A VH(1) 」；及人源化VL結構域，在本文中指定為「hMAB-A VL(1)」。接著使人源化可變結構域最佳化以增強結合活性及/或移除如下文更詳細描述之潛在不穩定胺基酸殘基。此第一輪最佳化得到三個額外人源化VH結構域，在本文中指定為「hMAB-A VH(2) 」、「hMAB-A VH(3) 」及「hMAB-A VH(4) 」；及三個額外人源化VL結構域，在本文中指定為「hMAB-A VL(2) 」、「hMAB-A VL(3) 」及「hMAB-A VL(4) 」。另外，產生具有鼠類VH及VL結構域及人類恆定區之MAB-A之嵌合型式(「chMAB-A 」)。上文提供鼠類及人源化/最佳化VH及VL結構域之胺基酸序列，比對在圖 3A 及3B 中提供。上文提供此等人源化/最佳化VH及VL結構域之一致序列。在產生多個人源化可變結構域之情況下，特定抗ADAM9抗體(例如MAB-A)之人源化重鏈及輕鏈可變結構域可按任何組合使用，且人源化鏈之特定組合係藉由參考特定VH/VL結構域而提及，例如包含hMAB-A VH(1)及hMAB-A VL(2)之抗體特定地稱作「hMAB-A (1.2)」。
產生具有來源於人類生殖系VH3-21及VH3-64之構架區之hMAB-A VH(1)，且產生具有來源於人類生殖系B3及L6之構架區之hMAB-A VL(1)。鼠類CDR保留於此等人源化可變結構域中。
在CDRH 2中鑑別潛在脫醯胺位點(在圖 3A 中以單下劃線示出)，且在CDRL 1中鑑別潛在天冬胺酸異構化位點(在圖 3B 中以單下劃線示出)。檢查在此等位置處之胺基酸取代以鑑別用以移除此等位點同時維持結合親和力之取代。選擇在CDRH 2 (存在於hMAB-A VH(2)中)之位置54 (N54F)處之苯丙胺酸取代及在CDRL 1 (存在於hMAB-A VL(2)中)之位置28 (D28S)處之絲胺酸取代，其中編號係根據Kabat。所鑑別之取代可單獨或組合使用。令人驚訝地，發現包含N54F取代之抗體展現對人類ADAM9之親和力增加約2倍(參見例如下表 3 )及與食蟹猴ADAM9之結合稍有改良。
另外，產生最佳化變異體以使存在於CDR中之離胺酸殘基之數目減至最少。兩個離胺酸殘基存在於CDRH 2中(在圖 3A 中以雙下劃線指示)，且一個離胺酸存在於CDRL 1中(在圖 3B 中以雙下劃線指示)。檢查在此等位置處之胺基酸取代以鑑別維持結合親和力之取代。對於CDRH 2 (存在於hMAB-A VH(3)中)選擇在位置62 (K62R)處之精胺酸取代、在位置64 (K64Q)處之麩醯胺取代及在位置65 (S65G)處之絲胺酸取代，其中編號係根據Kabat。對於CDRL 1 (存在於hMAB-A VL(3))中選擇在位置24 (K24R)處之精胺酸取代。所鑑別之取代可單獨或組合使用。
鑑別存在於CDR中之其他潛在不穩定殘基(在圖 3A-3B 中以虛下劃線指示)，一個甲硫胺酸殘基在CDRH 1內之位置34 (M34)處，一個甲硫胺酸殘基在CDRL 1內之位置33 (M33)處，且組胺酸、麩胺酸及天冬胺酸殘基在CDRL 3內之位置92 (H93)、93 (E93)及94 (D94)處，其中編號係根據Kabat。檢查在此等位置處之胺基酸取代以鑑別維持結合親和力之取代。對於CDRH 1選擇在位置34 (M34I)處之異白胺酸取代，且對於CDRL 3之位置33 (M33L)、92 (H93Y)、93 (E93S)及94 (D94T)選擇白胺酸、酪胺酸、絲胺酸及蘇胺酸取代，其中編號係根據Kabat。此等位置中之每一者可容易地與上文詳述之所有取代組合取代以得到hMAB-A VH(4)及hMAB-A VL(4)，其當一起配對時產生保留與親本鼠類抗體相比親和力之較小改良，且具有大大降低之脫醯胺或氧化潛力且在CDR中無離胺酸殘基之抗體。
使用BIACORE®分析研究人源化/最佳化抗體hMAB-A (1.1)、hMAB-A (2.2)、hMAB-A (2.3)、hMAB-A (3.3)、hMAB-A (4.4)及嵌合chMAB-A (具有鼠類VH/VL結構域)對huADAM之相對結合親和力，其中加His標籤之可溶性人類ADAM9( 「shADAM9-His 」，其含有融合至含組胺酸蛋白質之人類ADAM9之細胞外部分)在塗佈有經固定抗體之表面上穿過。簡言之，在Fab2山羊抗人Fc表面上捕獲各抗體，接著在不同濃度(6.25-100 nM)之shADAM9-His蛋白質存在下培育。經由BIACORE®分析結合(正規化之1:1朗謬結合模型)確定結合動力學。自此等研究計算之ka 、kd 及KD 呈現於表 3 中。藉由如上文所述之FACS及藉由ELISA檢查與cynoADAM9之結合。表 3.
此等研究之結果證明，與親本鼠類抗體相比，人源化/最佳化抗體對人類ADAM9具有相同或更高之結合親和力。特定而言，觀測到在人源化抗體中引入N54F突變使得與huADAM9之結合改良(亦即，hMAB-A (2.2)、hMAB-A (2.3)及hMAB-A (3.3))。如藉由FACS及ELISA確定，此突變亦使得與cynoADAM9之結合稍有改良，然而，此等抗體繼續展現與cynoADAM9之不良結合。此等研究亦鑑別可引入以自CDR移除離胺酸殘基而不降低親和力之額外取代。鑑別用以移除其他潛在不穩定殘基且對親和力具有最小影響之額外取代。實施例 4 與非人類靈長類動物 ADAM9 之結合的最佳化
隨機誘變用於將取代引入hMAB-A (2.2)之重鏈CDRH 2 (Kabat位置53-58)及CDRH 3 (Kabat位置95-100及100a-100f)結構域內。篩選突變體以鑑別具有與非人類靈長類動物ADAM9 (例如cynoADAM9)增強之結合且保留與huADAM9之高親和力結合的純系。自CDRH 3 (Kabat位置100a-100f)內之突變之兩個獨立篩選選擇48個純系。表 4 提供自兩個獨立篩選針對與cynoADAM9增強之結合而選擇的來自hMAB-A (2.2 )純系之CDRH 3 Kabat殘基100a-f之胺基酸序列之比對。額外純系比對在表 5 中提供。如此等表格中指示，類似純系在各實驗中出現，其屬於離散取代模式。
對於所檢查之所有純系，Gly及Ala為在位置4 (P4)處之較佳胺基酸殘基，且Leu、Met及Phe為在位置6 (P6)處之較佳胺基酸殘基。在其他位置(例如位置2 (P2)、位置3 (P3)及位置5 (P5))處之較佳胺基酸殘基視P1處所見之胺基酸殘基而定。對於在位置1 (P1)處具有Pro殘基之純系，Lys及Arg在P2處較佳，Phe及Met在P3處較佳，Gly在P4處較佳，且Trp或Phe在P5處較佳。對於在P1處具有Phe、Tyr或Trp之純系，Asn及His在P2處較佳，Ser及His在P3處較佳，且Leu在P6處較佳。對於在P1處具有Ile、Leu或Val之純系，Gly在P2處較佳，Lys在P3處較佳，Val在P5處較佳，且疏水性在P6處較佳。另外，如表 4 中可見，對於在P1處具有Thr殘基之純系，Gly在P2處較佳，Lys、Met及Asn在P3處較佳，Gly在P4處較佳，Val或Thr在P5處較佳，且Leu及Met在P6處較佳。在P1處具有Asp、Gly、Arg、His或Ser殘基之額外純系亦以較低頻率鑑別(參見表 4 及表 5 )。
表 5 中所示之10個純系之VH結構域用於產生hMAB-A (2.2)之其他最佳化變異體，指定為hMAB-A (2A.2)-(2J.2)。藉由ELISA檢定檢查所選純系之結合。簡言之，結合至含組胺酸肽且已塗佈至微量滴定盤上之抗體用於捕獲加His肽標籤之可溶性cynoADAM9 (「cynoADAM9-His 」) (1 μg/mL)或加His肽標籤之可溶性huADAM9 (1 μg/mL)，且檢查親本hMAB-A (2.2)及十個CDRH 3 hMAB-A (2A.2)變異體之連續稀釋液之結合。結合曲線cynoADAM9及huADAM9分別呈現於圖 4A 及圖 4B 中。包含所選VH結構域中之每一者之hMAB-A (2A.2)變異體展現以MAB-A VH(2B)、MAB-A VH(2C)、MAB-A VH(2D)及MAB-A VH(2I)與cynoADAM9改良之結合，顯示cynoADAM9結合之最大增強同時維持類似於親本hMAB-A (2.2)抗體的與huADAM9之結合。
使用基本上如上文所述之BIACORE®分析研究人源化/其他最佳化抗體MAB-A VH(2B.2)、MAB-A VH(2C.2)、MAB-A VH(2D.2)及MAB-A VH(2I.2)以及親本hMAB-A (2.2)對huADAM9-His及cynoADAM9-His之相對結合親和力。自此等研究計算之ka 、kd 及KD 呈現於表 6 中。
結合研究證明四個頂級純系展現對cynoADAM9之結合親和力介於150倍至550倍之間的增強，同時維持與親本抗體相同的對huADAM9之高親和力結合。選擇hMAB-A (2C.2)及hMAB-A (2I.2)用於進一步研究。實施例 5 抗體 hMAB-A (2I.2) 之免疫組織化學研究
藉由IHC研究hMAB-A (2I.2)之細胞特異性。使陽性及陰性對照細胞以及正常人類及食蟹猴組織與hMAB-A (2I.2) (2.5 μg/mL)或同型對照(2.5 μg/mL)接觸且目測染色程度。研究結果概述於表 7 中。
亦進行IHC研究以評估在12.5 μg/mL濃度(5×最佳染色濃度)下人源化/最佳化hMAB-A (2I.2)之結合。在此研究中採用陽性及陰性對照細胞以及正常人類及食蟹猴組織。研究結果概述於表 8 中。
進行比較性IHC研究以評估在2.5 μg/mL或5 μg/mL下由hMAB-A (2.2)、hMAB-A (2.3)、hMAB-A (2C.2)及hMAB-A (2I.2)之結合的差異。在此研究中採用陽性及陰性對照細胞以及正常人類及食蟹猴組織。研究結果概述於表 9 中。
進行進一步比較性IHC研究以評估在2.5 μg/mL、5 μg/mL或12.5 μg/mL下由hMAB-A (2.2)、hMAB-A (2.3)、hMAB-A (2C.2)及hMAB-A (2I.2)及鼠類MAB-A之結合的差異。在此研究中採用陽性及陰性對照細胞以及正常人類及食蟹猴組織。研究結果概述於表 10 中。
結果由此證明hMAB-A (2.2)在最佳濃度下展現人類肝細胞及腎小管之總體低水準染色，且在陰性對照中觀測到肝細胞及腎小管之反應性的較低染色強度/頻率。hMAB-A (2.2)在最佳濃度下展現食蟹猴肝細胞及腎小管之類似低水準染色，且在陰性對照中觀測到腎小管之反應性的較低染色強度/頻率。
結果亦證明hMAB-A (2C.2)在最佳濃度下展現人類肝細胞及腎小管之總體低水準染色，且在陰性對照中觀測到肝細胞及腎小管之反應性的較低染色強度/頻率。hMAB-A (2C.2)在最佳濃度下展現食蟹猴肝細胞及腎小管之類似低水準染色。在對應人類組織中未觀測到在食蟹猴肺上皮、胰島/上皮及膀胱上皮中對於hMAB-A (2C.2)之額外最低發現；在陰性對照中之肺上皮、腎小管、膀胱上皮中觀測到反應性之較低染色強度/頻率。結果亦證明hMAB-A (2I.2)在最佳濃度下不展現人類或食蟹猴組織之染色，伴有罕見+/-膀胱移形細胞上皮染色。hMAB-A (2I.2)亦在5×最佳濃度下展現人類肺泡細胞、胰導管上皮、腎小管、膀胱移形細胞上皮之總體低水準及低頻率染色，且在5×最佳濃度下展現食蟹猴支氣管上皮及膀胱移形細胞上皮之總體低水準染色。hMAB-A (2I.2)在所測試之人類正常組織上展現總體有利之IHC型態且在對應食蟹猴組織上展現類似型態。實施例 6 包含變異體 Fc 區之 hMAB-A (2I.2)
hMAB-A(2I.2)包含具有κ輕鏈恆定區之輕鏈(SEQ ID NO: 68 )及具有野生型IgG重鏈恆定區之重鏈(SEQ ID NO:52 )。Fc變異體係藉由將以下取代引入Fc區中而產生：L234A/L235A (參見例如SEQ ID NO: 78 )，指定為hMAB-A (2I.2)(AA)；S442C (參見例如SEQ ID NO: 79 )，指定為hMAB-A (2I.2)(C)；及L234A/L235A/S442C (參見例如SEQ ID NO: 80 )，指定為hMAB-A (2I.2)(AA/C)。藉由ELISA檢定檢查各Fc變異體與huADAM9-His及cynoADAM9-His之結合。簡言之，結合至含組胺酸肽且已塗佈至微量滴定盤上之抗體用於捕獲加His肽標籤之可溶性cynoADAM9或加His肽標籤之可溶性huADAM9 (0.5 μg/mL)，且檢查親本hMAB-A (2.2)及Fc變異體之連續稀釋液之結合。結合曲線huADAM9及cynoADAM9分別呈現於圖 5A 及圖 5B 中，且展示Fc變異體中之每一者保留具有野生型Fc區之hMAB-A (2I.2)之結合親和力。實施例 7 標靶表現分析
為評價跨越不同適應症之ADAM9表現，使用ImmunoGen開發用於初步研究使用之ADAM9 IHC檢定首先評價具有20種不同腫瘤類型之組織微陣列(TMA)。
所分析之所有樣品為FFPE (福馬林固定及石蠟包埋)樣品。500核心20癌瘤TMA購自Folio Biosciences (目錄號ARY-HH0212)。具有80個腺癌核心及80個鱗狀細胞癌核心之NSCLC TMA購自US Biomax (目錄號LC1921A)。具有80個腺癌核心之結腸直腸癌TMA購自Pantomics Inc. (目錄號COC1261)。胃癌樣品購自Avaden Biosciences。
使用Ventana Discovery Ultra自動染色儀進行ADAM9之免疫組織化學染色。ADAM9之初級抗體為可商購之兔單株抗體。評價所有樣品且由經培訓之專業認證病理學家在評分演算法中進行評分。評分需要至少100個活腫瘤細胞之存在。在0至3之半定量整數標度上對染色強度評分，其中0表示無染色，1表示弱染色，2表示中等染色且3表示強染色。記錄在各強度水準下陽性染色之細胞百分比。評分係基於Adam9僅定位至細胞膜以及對定位至細胞質及膜的評價。由H分值分析染色結果，該H分值將染色強度之分量與陽性細胞之百分比組合。其值介於0與300之間且定義如下： 1 * (在1+強度下染色之細胞百分比) + 2 * (在2+強度下染色之細胞百分比) + 3 * (在3+強度下染色之細胞百分比) = H分值。
將具有各腫瘤類型之5個正常組織對照之500核心20癌瘤TMA染色且以兩種不同方式評分：(1)基於單獨膜染色或(2)基於膜及細胞質染色。下表11及圖6A概述基於全部二十種適應症之膜染色之ADAM9之盛行率，且表12及圖6B概述八個所選適應症之膜及細胞質染色之結果。
基於來自多癌瘤TMA之結果，選擇用於經擴展之盛行率分析之三個適應症：非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸直腸癌(CRC)及胃癌。對於NSCLC，將具有80個腺癌核心及80個鱗狀細胞癌核心之一個TMA染色並評價。對於CRC，分析具有具有80個腺癌核心之一個TMA，其中78個為可評價的。對於胃癌，分析腺癌之15個全組織切片。將所有此等樣品針對膜及細胞質染色評分，且結果概述於表13中。此等初步研究之結果顯示ADAM9在大範圍之實體癌症中表現且支持抗ADAM9藥物接合物在許多不同表現ADAM9之實體腫瘤中使用。表 11 ：基於膜染色在 20 種不同適應症中 ADAM9 之盛行率 表 12 ：基於膜及細胞質染色在 8 種所選適應症中 ADAM9 之盛行率 表 13 ：基於膜及細胞質染色在 NSCLC 、 CRC 及胃癌之額外樣品中 ADAM9 之盛行率 實施例 8 抗 ADAM9 抗體內化研究
為評估本發明之抗ADAM9抗體之內化，對接合至Alexa Fluor 488之hMAB-A(2.2)、hMAB-A(2I.2)及hMAB-A(2I.2)-S442C抗體進行基於流動式細胞量測術之內化實驗。
根據製造商之說明書(Thermofisher)使用Alexa Fluor 488四氟苯酯產生hMAB-A(2.2)、hMAB-A(2I.2)、hMAB-A(2I.2)-S442C之抗ADAM9 Alexa488抗體接合物。將接合物在不含疊氮化鈉之PBS (pH7.2)中溶離以能夠進行內化檢定。自280 nm及494 nm下之吸收量測計算標記之濃度及程度。進行FACS結合檢定以確保Alexa488標記不會不利地影響標靶結合。
在連續暴露與脈衝暴露於螢光接合物之後確定抗ADAM9-Alexa488接合物之內化。對於連續實驗，在冰上或在37℃下用飽和濃度之所指示之Alexa488標記抗體處理NCI-H1703細胞，持續所指示之整個時間。而對於脈衝實驗，在冰上使抗ADAM9-Alexa488接合物預結合至細胞且洗去過量接合物，隨後變換至37℃且監測內化。在連續或脈衝暴露之後所指示之時間點處，用維耳新(versene) (Thermofisher)使細胞脫離且用冰冷PBS洗滌兩次，且使平行測定孔再懸浮於不含(未淬滅之樣品)或含300 nM抗A488抗體(淬滅之樣品)之冰冷PBS中。將所有樣品在冰上培育30分鐘。接著使細胞成團塊，固定於1%三聚甲醛中且藉由流動式細胞量測術分析。在冰上培育30分鐘、接著與抗Alexa488抗體一起培育之細胞之螢光表示不可淬滅之螢光部分且在計算內化之前自所有其他樣品扣除。用針對不完全表面淬滅校正之淬滅樣品之螢光(細胞內螢光)除以未淬滅細胞之螢光(總螢光)來計算內化百分比。將抗ADAM9抗體接合物之內化繪圖且使用單相指數衰減方程(GraphPad Prism, 5.01版)擬合資料。
在NCI-H1703細胞中在脈衝處理與連續處理之後評價表面結合之Alexa488標記抗ADAM9抗體之內化。所測試之所有三個抗ADAM9-Alexa488接合物均顯示快速內化，其中約39%之接合物在最初15分鐘內內化且總共約77%在6小時後內化(圖7A)。有趣地，在連續暴露24小時後，內化之螢光信號比30分鐘後結合至細胞表面之總初始螢光信號約大7倍(圖7B)。因此，ADAM9可能在37℃下培育期間自細胞內庫補充於細胞表面處，允許多輪抗ADAM9抗體接合物內化。抗ADAM9免疫接合物之功效依賴於內化、細胞內運輸及免疫接合物降解。抗ADAM9免疫接合物之效力可部分地由抗ADAM9免疫接合物之高度內化來解釋，該高度內化可能使得大量細胞毒性異化代謝物產生。實施例 9 抗 ADAM9 抗體細胞加工研究
為評估chMAB-A之細胞上標靶結合、吸收及溶酶體降解，使用先前所述之3 H-丙醯胺標記抗體加工方法(Lai等人, Pharm Res. 2015年11月; 32(11):3593-603)。使用此方法，用氚化丙酸酯經由離胺酸殘基將靶向ADAM9之chMAB-A抗體作示蹤標記。先前已顯示在細胞結合、吸收及運輸至溶酶體後，使[3 H]丙酸酯標記之Ab (3 H-Ab)降解且將離胺酸-[3 H]丙醯胺釋放至細胞生長培養基中。添加有機溶劑使完整經標記之抗體沈澱且在溶液中留下離胺酸-[3 H]丙醯胺，允許便利且準確量測抗體加工之程度。
如先前所述用[3 H]-丙酸酯標記chMAB-A。在經由結合曲線確定抗原飽和之後，用10 nM3 H-chMAB-A抗體處理NSCLC系NCI-H1703及CRC系DLD-1。用非靶向氚化同型對照抗體3 H-chKTI處理一些細胞樣品，而其他未經處理。將細胞在6孔盤中塗盤且生長隔夜，接著如先前所述用試劑脈衝處理。簡言之，將細胞與3 H-chMAB-A抗體或3 H-chKTI一起培育20分鐘，隨後在新鮮培養基中洗滌3次。在37℃與5% CO2 下將細胞培育隔夜。培育20-24小時後，收集細胞且用4:3體積之丙酮:培養基/細胞混合物使蛋白質沈澱。將樣品在-80℃下冷凍最少1小時，隨後解凍且藉由離心分離。處理團塊以溶解蛋白質，隨後在Tri-Carb液體閃爍計數器(LSC)中計數5分鐘。按照製造商之方案，將1 mL SOLVABLE (Perkin Elmer)添加至各團塊樣品中且在50℃水浴中培育隔夜。自水浴移出樣品，轉移至20 mL玻璃閃爍小瓶，且將EDTA及H2 O2 添加至樣品中，繼而在50℃下再培育1小時。用HCl淬滅樣品，添加15 mL Optima Gold液態閃爍流體(Perkin Elmer)，且使樣品充分渦旋。將樣品在黑暗中保持最少4小時，隨後由LSC計數。將無蛋白質丙酮提取樣品在真空下乾燥至＜1 mL體積且在LSC之前如上文所述使用Solvable加工。自所得樣品CPM值計算結合、降解及完整經標記之抗體的量。
在脈衝處理及在37℃下培育隔夜之後確定3 H-chMAB-A抗體之加工水準。NCI-H1703細胞顯示在24小時內加工93%之3 H-chMAB-A，且DLD-1細胞顯示在相同時間段內加工92%之3 H-chMAB-A。3 H-chKTI之結合及加工為可忽略的(總CPM比靶向之抗體低＞100倍)。此等細胞系之加工值較高，尤其與先前對於其他ADC標靶/抗體所報導之24小時脈衝加工值相比，此支持本發明之抗ADAM9抗體作為有效藥物接合物。實施例 10. 合成本發明之類美登素衍生物 實施例 10a. 製備 DM-H (7) 儲備溶液
將美登醇(maytansinol) (5.0 g，8.85 mmol)溶解於無水DMF (125 mL)中，接著在冰浴中冷卻。接著在氬氣氛圍下在磁性攪拌下添加N-甲基丙胺酸之N-羧基酸酐(5.7 g，44.25 mmol)、無水DIPEA (7.70 mL，44.25 mmol)及三氟甲烷磺酸鋅(22.5 g，62 mmol)。移除冰浴且在攪拌下使反應物升溫。16小時後，添加去離子水(10 mL)。30分鐘後，在劇烈攪拌下添加飽和碳酸氫鈉水溶液:飽和氯化鈉水溶液之1:1溶液(190 mL)及乙酸乙酯(250 mL)。將混合物轉移至分液漏斗且保留有機層。用乙酸乙酯(100 mL)萃取水層，接著合併有機層且用飽和氯化鈉水溶液(50 mL)洗滌。在真空下在不加熱蒸發器浴之情況下藉由旋轉蒸發將有機層濃縮至其體積之約1/4，不進行純化。藉由用反應中所用之美登醇之毫莫耳數(1.77 mmol)除以體積(150 mL)估算溶液濃度，得到DM-H儲備溶液(0.06 mmol/mL)。立即分配儲備溶液之等分試樣，接著在反應中使用或儲存於-80 C冷凍器中，接著在需要時解凍。實施例 10b. 合成硫 - 肽 - 類美登素 1. FMoc- 肽 -NH-CH2 -OAc 化合物 ( 化合物 9a -j) 合成 FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -OAc (9c) ： 步驟 1 ： FMoc-L-Ala-D-Ala-OtBu (3c ) ：
將FMoc-L-丙胺酸(10 g，32.1 mmol)及D-Ala-OtBu, HCl (7.00 g，38.5 mmol)溶解於CH2Cl2 (100 ml)中，用COMU (20.63 g，48.2 mmol)及DIPEA (11.22 ml，64.2 mmol)處理。使反應在氬氣下在室溫下進行。2小時後，藉由UPLC顯示反應完成，用2-MeTHF (50 ml)稀釋，用10%檸檬酸水溶液(2 × 100 mL)、水(100 mL)、繼而用鹽水(100 mL)洗滌。經硫酸鎂乾燥有機層，過濾且濃縮，得到粗FMoc-L-Ala-D-Ala-OtBu，假定100%產率。步驟 2 ： FMoc-L-Ala-D-Ala (4c )
用TFA:水(95:5) (50 ml)處理FMoc-LAla-DAla-OtBu (11.25 g，25.7 mmol)。使反應在室溫下在氬氣氛圍下進行。4小時後，藉由UPLC顯示反應完成，用甲苯(25 mL)稀釋且共蒸發3次，得到FMoc-L-Ala-D-Ala，假定100%產率。步驟 3 ： FMoc-L-Ala-Gly-OtBu (5c )
將Z-L-Ala-ONHS (10 g，31.2 mmol)及甘胺酸第三丁酯(6.28 g，37.5 mmol)溶解於CH2Cl2 (100 ml)中，用DIPEA (10.91 ml，62.4 mmol)處理。使反應在氬氣下在室溫下進行。2小時後，UPLC顯示完成，用2-MeTHF (50 mL)稀釋反應物，用10%檸檬酸水溶液(100 mL)、飽和碳酸氫鈉(2 × 100 mL)、水(100 mL)、鹽水(100 mL)洗滌。經硫酸鎂乾燥有機層，過濾且濃縮，得到Z-L-Ala-Gly-OtBu，假定100%產率。步驟 4. L-Ala-Gly-OtBu (6c )
將Z-Ala-Gly-OtBu (10.05 g，29.9 mmol)溶解於95:5 MeOH:水(50 ml)中，轉移至氫化器燒瓶，用Pd/C (1.272 g，11.95 mmol)處理。將氫化器燒瓶置於振盪器上，由真空移除空氣，同時振盪燒瓶。氫氣填充燒瓶至30 psi，將燒瓶振盪2分鐘，且由真空移除氫氣。將此過程再重複2次。使氫氣填充燒瓶至30 psi且振盪。4小時後，UPLC顯示完成，經矽藻土栓塞真空過濾反應物，再溶解於2-MeTHF中，濃縮得到LAla-Gly-OtBu，假定100%產率。步驟 5 ： FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-Gly-OtBu (7c )
將FMoc-LAla-D-ALa-OH (0.959 g，2.508 mmol)及L-Ala-Gly-OtBu (0.718 g，3.01 mmol)溶解於CH2Cl2 (10 ml)中，用COMU (1.181 g，2.76 mmol)及DIPEA (0.876 ml，5.02 mmol)處理。使反應在氬氣下在室溫下進行。2小時後，顯示反應完成。濃縮反應物以移除CH2Cl2，再溶解於2 mL DMF中且藉由C18 combiflash使用線性梯度純化，將產物合併，得到FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-Gly-OtBu (660 mg，46%產率)。步驟 6. FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-Gly-OH (8c )
用TFA:水(95:5) (2 ml)處理FMoc-LAla-DAla-LAla-GlyOtBu (200 mg，0.353 mmol)。使反應在氬氣下在室溫下進行。1小時後，藉由UPLC顯示反應完成。用甲苯(1 mL)稀釋粗產物，與甲苯共蒸發2次，得到FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-Gly-OH，假定100%產率。步驟 7. FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-CH2 -OAc (9c )
將FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-Gly-OH (2.65 g，5.19 mmol)溶解於DMF (20 mL)中，用乙酸銅(II) (0.094 g，0.519 mmol)及乙酸(0.446 ml，7.79 mmol)處理，一旦所有試劑均溶解，即用四乙酸鉛(3.45 g，7.785 mmol)處理反應物。使反應在氬氣下在60℃下進行30分鐘。經由Combiflash Rf 200i使用C18 450 g管柱以125 mL/min之流動速率用含有0.1%甲酸之去離子水及乙腈作為溶劑使用如下梯度(以分鐘計之時間，乙腈百分比) (0，5) (8，50) (26，55)純化粗反應物。所要產物具有11分鐘之滯留時間，將產物部分立即冷凍並凍乾，得到FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-CH2 -OAc (843 mg，1.607 mmol，31.0%產率)。HRMS (M+Na)+ 計算值547.2163，實驗值547.2167。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.23 (dd, J = 12.5, 7.4 Hz, 9H), 1.95 (s, 2H), 4.00 - 4.13 (m, 1H), 4.17 - 4.38 (m, 6H), 5.06 (q, J = 8.8 Hz, 2H), 7.33 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 7.42 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.62 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.71 (t, J = 8.6 Hz, 2H), 7.85 - 8.01 (m, 3H), 8.21 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 8.69 (d, J = 6.9 Hz, 1H)。
如圖9A中所示及如上述FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -OAc (9c)所例示製備FMoc-肽-NH-CH2 -OAc類型之以下化合物。
FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH 2 -OAc (9a )：將FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-Gly-OH (SEQ ID NO:163) (500 mg，0.979 mmol)溶解於DMF (2 mL)中，在磁性攪拌下在氬氣下向其中添加乙酸銅(II) (17.8 mg，0.098 mmol)及乙酸(84 μL，1.47 mmol)。一旦固體溶解，即添加四乙酸鉛(434 mg，0.979 mmol)。使反應在60℃下進行20分鐘，接著在C18 30微米450 g管柱筒上用含有0.1%甲酸之去離子水及經26分鐘5%至55%之線性乙腈梯度以125 mL/min之流動速率溶離來純化。將含有純所要產物之部分冷凍並凍乾，得到178 mg (34%產率)之白色固體。HRMS (M + Na)+ 計算值547.2163；實驗值547.2160。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 1.20 (qd,J = 7.5, 6.9, 4.2 Hz, 9H), 1.91 - 2.05 (m, 3H), 3.26 - 3.38 (m, 1H), 4.05 (q,J = 7.3 Hz, 1H), 4.23 (td,J = 11.9, 10.7, 6.4 Hz, 5H), 5.07 (ddd,J = 11.2, 6.9, 4.3 Hz, 2H), 7.32 (q,J = 7.5 Hz, 2H), 7.41 (q,J = 7.4 Hz, 2H), 7.52 (t,J = 6.8 Hz, 1H), 7.71 (q,J = 7.5, 7.0 Hz, 2H), 7.82 - 8.08 (m, 4H), 8.84 (q,J = 7.1 Hz, 1H)。
FMoc-D-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH 2 -OAc (9b )：HRMS (M+Na)+ 計算值547.2163，實驗值547.2167。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.23 (dd,J = 12.5, 7.4 Hz, 9H), 1.95 (s, 2H), 4.00 - 4.13 (m, 1H), 4.17 - 4.38 (m, 6H), 5.06 (q,J = 8.8 Hz, 2H), 7.33 (t,J = 7.3 Hz, 2H), 7.42 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 7.62 (d,J = 6.8 Hz, 1H), 7.71 (t,J = 8.6 Hz, 2H), 7.85 - 8.01 (m, 3H), 8.21 (d,J = 7.0 Hz, 1H), 8.69 (d,J = 6.9 Hz, 1H)。
FMoc-L-Ala-L-Ala-D-Ala-NH-CH 2 -OAc (9d )：HRMS (M+Na)+ 計算值547.2163，實驗值547.2167。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.18 - 1.25 (m, 9H), 1.97 (s, 3H), 3.96 - 4.15 (m, 1H), 4.17 - 4.36 (m, 5H), 5.09 (d,J = 6.9 Hz, 2H), 7.34 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 7.42 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 7.57 (d,J = 7.2 Hz, 1H), 7.71 (d,J = 7.3 Hz, 2H), 7.90 (d,J = 7.5 Hz, 2H), 8.07 (s, 2H), 8.86 (s, 1H)。
FMoc-L-Ala-D-Ala-NH-CH2 -OAc (9f )：HRMS (M+Na)+ 計算值476.1792，實驗值476.1786。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.13 (dd,J = 7.1, 1.4 Hz, 6H), 1.89 (s, 3H), 3.99 (q,J = 7.1 Hz, 1H), 4.10 - 4.29 (m, 4H), 4.95 - 5.08 (m, 2H), 7.26 (t,J = 7.4, 1.3 Hz, 2H), 7.35 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 7.49 (d,J = 7.2 Hz, 1H), 7.66 (t,J = 7.6 Hz, 2H), 7.82 (d,J = 7.5 Hz, 2H), 8.11 (d,J = 7.7 Hz, 1H), 8.76 (t,J = 7.0 Hz, 1H)。
FMoc-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -OAc (9g )：HRMS (M+Na)+ 計算值476.1792，實驗值476.1788。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.21 (dd,J = 7.1, 1.4 Hz, 6H), 1.96 (s, 3H), 4.08 (t,J = 7.1 Hz, 1H), 4.17 - 4.36 (m, 4H), 5.05 - 5.14 (m, 2H), 7.26 - 7.38 (m, 2H), 7.42 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 7.56 (d,J = 7.3 Hz, 1H), 7.73 (t,J = 7.6 Hz, 2H), 7.90 (d,J = 7.6 Hz, 2H), 8.18 (d,J = 7.8 Hz, 1H), 8.83 (t,J = 6.9 Hz, 1H)。
FMoc-D-Ala-D-Ala-NH-CH2 -OAc (9h )：HRMS (M+H)+ 計算值455.4877，實驗值455.2051。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.14 (dd,J = 7.1, 3.3 Hz, 6H), 1.21 (d,J = 7.2 Hz, 1H), 1.81 (s, 1H), 1.91 (s, 2H), 4.01 (q,J = 7.7 Hz, 1H), 4.09 - 4.27 (m, 5H), 4.95 - 5.10 (m, 1H), 7.26 (td,J = 7.4, 1.2 Hz, 3H), 7.35 (t,J = 7.4 Hz, 3H), 7.45 (d,J = 7.6 Hz, 1H), 7.65 (t,J = 7.1 Hz, 3H), 7.82 (d,J = 6.4 Hz, 2H), 7.96 (d,J = 7.4 Hz, 1H), 8.78 (t,J = 7.0 Hz, 1H)。 2. FMoc-肽-COOH化合物(化合物10a-10j)
如圖9A中所示及如FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO2 H所例示製備FMoc-肽-NH-CH2 -S-(CH2 )n -CO2 H類型之化合物。
FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 - CO2 H (10a )：將6-巰基己酸(287 μL，2.07 mmol)溶解於1:4 TFA:二氯甲烷之溶液(5 mL)中，接著添加至含有FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2 -OAc (178 mg，0.339 mmol)之小瓶中。使反應在磁性攪拌下在氬氣氛圍下在室溫下進行20分鐘。真空濃縮粗物質，再溶解於最小體積之DMF中，且在C18 30微米30 g筒上用含有0.1%甲酸之去離子水與經13分鐘自5%至95%之乙腈線性梯度以35 mL/min溶離來純化。將含有純所要產物之部分冷凍並凍乾，得到200 mg (96%產率)之白色固體。HRMS (M + H )+ 計算值613.2690；實驗值613.2686。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 1.20 (dt,J = 7.1, 4.9 Hz, 10H), 1.31 (tt,J = 10.1, 6.0 Hz, 2H), 1.49 (dq,J = 12.5, 7.4 Hz, 4H), 2.18 (t,J = 7.3 Hz, 2H), 4.05 (t,J = 7.3 Hz, 1H), 4.16 - 4.30 (m, 7H), 7.33 (td,J = 7.4, 1.2 Hz, 2H), 7.42 (td,J = 7.3, 1.1 Hz, 2H), 7.54 (d,J = 7.4 Hz, 1H), 7.72 (t,J = 7.0 Hz, 2H), 7.89 (d,J = 7.5 Hz, 2H), 7.94 - 8.07 (m, 2H), 8.44 (t,J = 6.1 Hz, 1H)。
FMoc-D-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO2 H (10b )：HRMS (M+Na)+ 計算值635.2510，實驗值635.2515。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.15 (d,J = 6.8 Hz, 3H), 1.18 - 1.25 (m, 10H), 2.18 (q,J = 7.5 Hz, 4H), 2.40 - 2.48 (m, 1H), 2.70 (t,J = 7.2 Hz, 1H), 4.15 - 4.30 (m, 6H), 6.29 (s, 2H), 7.34 (q,J = 7.3 Hz, 3H), 7.42 (t,J = 7.4 Hz, 3H), 7.63 - 7.78 (m, 1H), 7.85 (d,J = 7.3 Hz, 2H), 7.89 (d,J = 7.5 Hz, 3H), 8.37 - 8.46 (m, 1H)。
FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO2 H (10c )：HRMS (M+Na)+ 計算值635.2510，實驗值635.2514。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.18 - 1.23 (m, 10H), 1.34 (q,J = 3.4 Hz, 5H), 2.24 (s, 2H), 2.44 (s, 2H), 4.05 (t,J = 7.1 Hz, 1H), 4.16 - 4.35 (m, 8H), 7.33 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 7.42 (t,J = 7.5 Hz, 2H), 7.58 (d,J = 7.0 Hz, 1H), 7.71 (t,J = 8.4 Hz, 2H), 7.90 (s, 1H), 7.98 (d,J = 7.5 Hz, 1H), 8.15 (d,J = 7.3 Hz, 1H), 8.39 (t,J = 6.2 Hz, 1H), 11.98 (s, 1H)。
FMoc-L-Ala-L-Ala-D-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO2 H (10d )：HRMS (M+Na)+ 計算值635.2510，實驗值635.2510。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.15 (d,J = 6.9 Hz, 3H), 1.21 (d,J = 7.1 Hz, 9H), 1.28 - 1.38 (m, 3H), 1.44 - 1.60 (m, 5H), 2.13 - 2.22 (m, 3H), 3.33 (q,J = 6.9 Hz, 1H), 4.20 (s, 2H), 6.29 (s, 2H), 7.29 - 7.40 (m, 3H), 7.38 - 7.47 (m, 3H), 7.85 (d,J = 7.5 Hz, 2H), 7.89 (d,J = 7.5 Hz, 2H), 8.26 (d,J = 7.6 Hz, 1H), 8.48 (d,J = 6.2 Hz, 1H)。
FMoc-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO2 H (10g )：HRMS (M+H)+ 計算值542.2319，實驗值542.2316。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.13 (dd,J = 7.1, 1.7 Hz, 6H), 1.16 - 1.25 (m, 2H), 1.32 - 1.47 (m, 4H), 2.08 (t,J = 7.3 Hz, 2H), 3.25 (s, 2H), 3.99 (p,J = 7.0 Hz, 1H), 4.07 - 4.27 (m, 6H), 7.26 (t,J = 7.4, 1.2 Hz, 2H), 7.35 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 7.52 (d,J = 7.0 Hz, 1H), 7.65 (t,J = 7.3 Hz, 2H), 7.82 (d,J = 7.5 Hz, 2H), 8.08 (d,J = 7.7 Hz, 1H), 8.27 (t,J = 6.2 Hz, 1H), 11.82 (s, 1H)。
FMoc-L-Ala-D-Ala-NH-CH 2 -S-(CH2 )5 -CO2 H (10f) ：HRMS (M+H)+ 計算值542.2319，實驗值542.2321。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.13 (dd,J = 7.1, 1.8 Hz, 7H), 1.17 - 1.26 (m, 2H), 1.32 - 1.48 (m, 5H), 2.08 (t,J = 7.3 Hz, 2H), 3.99 (p,J = 7.1 Hz, 1H), 4.07 - 4.26 (m, 7H), 7.26 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 7.35 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 7.53 (d,J = 7.1 Hz, 1H), 7.65 (t,J = 7.3 Hz, 2H), 7.82 (d,J = 7.4 Hz, 2H), 8.10 (d,J = 7.7 Hz, 1H), 8.28 (t,J = 6.3 Hz, 1H)。
FMoc-D-Ala-D-Ala-NH-CH 2 -S-(CH2 )5 -CO2 H (10h )：(16.7 mg，0.031 mmol，70%產率)。HRMS (M+H)+ 計算值542.2319，實驗值542.2318。
FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH 2 -S-(CH2 )3 -CO2 H (10j )：HRMS (M+H)+ 計算值585.2377，實驗值585.2367。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.14 - 1.26 (m, 9H), 1.75 (p,J = 7.3 Hz, 2H), 2.27 (t,J = 7.3 Hz, 2H), 2.54 (d,J = 7.7 Hz, 2H), 3.97 - 4.10 (m, 1H), 4.13 - 4.34 (m, 7H), 7.33 (t,J = 7.5 Hz, 2H), 7.42 (t,J = 7.5 Hz, 2H), 7.57 (d,J = 6.9 Hz, 1H), 7.71 (t,J = 8.4 Hz, 2H), 7.89 (d,J = 7.6 Hz, 2H), 7.97 (d,J = 7.5 Hz, 1H), 8.14 (d,J = 7.0 Hz, 1H), 8.41 (s, 1H), 12.06 (s, 1H)。
FMoc-D-Ala-L-Ala-NH-CH 2 -S-(CH)2 -CO2 H (10i )：HRMS (M+H)+ 計算值500.1850，實驗值500.1843。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 1.20 (dd,J = 7.2, 1.9 Hz, 6H), 2.53 (d,J = 7.1 Hz, 2H), 2.70 (t,J = 7.1 Hz, 2H), 4.07 (q,J = 7.0 Hz, 1H), 4.17 - 4.26 (m, 4H), 4.29 (d,J = 6.8 Hz, 2H), 7.33 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 7.41 (t,J = 7.5 Hz, 2H), 7.56 (d,J = 7.1 Hz, 1H), 7.72 (t,J = 7.7 Hz, 2H), 7.89 (d,J = 7.5 Hz, 2H), 8.14 (d,J = 7.6 Hz, 1H), 8.42 (t,J = 6.3 Hz, 1H), 12.22 (s, 1H)。 3. FMoc-肽-May-NMA化合物(化合物11a-11j)
如圖9A中所示及如FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM所例示製備FMoc-肽-NH-CH2 -S-(CH2 )n -CO2 -DM類型之化合物。
FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH 2 -S-(CH 2 ) 5 -CO-DM (11a )：向DM-H儲備溶液(8.2 mL，0.49 mmol)中添加FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -COOH (300 mg，0.49 mmol)、EDC (94 mg，0.490 mmol)及DIPEA (90 μL，0.49 mmol)。使反應在磁性攪拌下在室溫下在氬氣氛圍下進行2小時。藉由在真空下旋轉蒸發濃縮粗物質，且將殘餘物溶於最小體積之DMF中，接著在C18 30微米30 g筒上用含有0.1%甲酸之去離子水及經25分鐘自5%至50%之乙腈線性梯度溶離來純化。將含有純所要產物之部分冷凍並凍乾，得到151 mg (37.2%產率)之白色固體。HRMS (M + Na)+ 計算值1266.5170；實驗值1266.5141。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 0.77 (s, 3H), 1.12 (d,J = 6.4 Hz, 3H), 1.14 - 1.22 (m, 12H), 1.22 - 1.30 (m, 3H), 1.35 - 1.49 (m, 4H), 1.50 - 1.55 (m, 1H), 1.59 (s, 3H), 2.00 - 2.07 (m, 1H), 2.14 (ddd,J = 15.6, 8.7, 5.9 Hz, 1H), 2.40 (dtd,J = 17.0, 7.9, 7.0, 4.9 Hz, 3H), 2.69 (s, 3H), 2.79 (d,J = 9.6 Hz, 1H), 3.08 (s, 3H), 3.20 (d,J = 12.6 Hz, 1H), 3.24 (s, 3H), 3.43 (d,J = 12.4 Hz, 2H), 3.48 (d,J = 8.9 Hz, 1H), 3.92 (s, 3H), 4.08 (ddd,J = 20.8, 10.8, 5.0 Hz, 3H), 4.14 - 4.24 (m, 4H), 4.26 (d,J = 6.0 Hz, 3H), 4.52 (dd,J = 12.0, 2.8 Hz, 1H), 5.34 (q,J = 6.7 Hz, 1H), 5.56 (dd,J = 14.7, 9.0 Hz, 1H), 5.91 (s, 1H), 6.50 - 6.66 (m, 3H), 6.88 (s, 1H), 7.17 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 7.33 (td,J = 7.5, 1.2 Hz, 2H), 7.41 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 7.53 (d,J = 7.4 Hz, 1H), 7.72 (t,J = 7.0 Hz, 2H), 7.89 (d,J = 7.5 Hz, 3H), 7.99 (d,J = 7.3 Hz, 1H), 8.36 (t,J = 6.3 Hz, 1H)。
FMoc-D-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH 2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (11b )：HRMS (M+Na)+ 計算值1266.5170，實驗值1266.5164。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.78 (s, 3H), 1.14 (dd,J = 14.6, 6.5 Hz, 6H), 1.22 (t,J = 6.8 Hz, 10H), 1.33 - 1.57 (m, 4H), 1.59 (s, 3H), 2.04 (d,J = 13.5 Hz, 1H), 2.27 - 2.44 (m, 1H), 2.69 (s, 3H), 2.80 (d,J = 9.7 Hz, 1H), 3.08 (s, 3H), 3.14 - 3.28 (m, 5H), 3.37 - 3.55 (m, 3H), 3.92 (s, 3H), 3.98 - 4.16 (m, 3H), 4.20 (dd,J = 15.6, 7.6 Hz, 7H), 4.52 (d,J = 12.7 Hz, 1H), 5.34 (d,J = 6.9 Hz, 1H), 5.57 (dd,J = 14.7, 9.0 Hz, 1H), 5.92 (s, 1H), 6.46 - 6.72 (m, 4H), 6.88 (s, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.33 (t,J = 7.5 Hz, 3H), 7.41 (t,J = 7.4 Hz, 3H), 7.60 - 7.75 (m, 4H), 7.80 - 7.93 (m, 4H), 8.12 (t, 1H), 8.29 (d,J = 6.9 Hz, 1H)。
FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH 2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (11c )：HRMS (M+Na)+ 計算值1266.5170，實驗值1266.5170。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.71 (s, 3H), 0.96 - 1.16 (m, 10H), 1.16 - 1.51 (m, 10H), 1.52 (s, 4H), 1.82 - 2.16 (m, 1H), 2.17 - 2.56 (m, 11H), 2.62 (d,J = 5.8 Hz, 4H), 2.68 - 2.87 (m, 3H), 2.92 - 3.04 (m, 4H), 3.09 - 3.22 (m, 7H), 3.24 (d,J = 7.4 Hz, 1H), 3.33 - 3.50 (m, 2H), 3.73 - 3.89 (m, 4H), 3.92 - 4.07 (m, 2H), 4.07 - 4.25 (m, 2H), 4.45 (dd,J = 12.0, 2.8 Hz, 1H), 5.27 (q,J = 6.7 Hz, 1H), 5.40 - 5.55 (m, 1H), 5.85 (s, 1H), 6.33 - 6.66 (m, 4H), 6.81 (s, 2H), 7.03 - 7.19 (m, 1H), 7.19 - 7.43 (m, 2H), 7.62 (d,J = 11.6 Hz, 1H), 7.73 - 7.85 (m, 1H)。
FMoc-L-Ala-L-Ala-D-Ala-NH-CH 2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (11d )：HRMS (M+Na)+ 計算值1266.5170，實驗值1266.5158。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.78 (s, 3H), 1.06 - 1.33 (m, 16H), 1.44 (d,J = 10.3 Hz, 11H), 1.59 (s, 3H), 1.99 - 2.22 (m, 3H), 2.35 - 2.45 (m, 2H), 2.55 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 2.69 (s, 3H), 2.80 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 3.08 (s, 2H), 3.25 (s, 3H), 3.39 - 3.52 (m, 3H), 3.92 (s, 3H), 3.99 - 4.40 (m, 4H), 4.52 (d,J = 11.1 Hz, 1H), 5.34 (d,J = 6.8 Hz, 1H), 5.57 (dd,J = 14.5, 9.2 Hz, 1H), 5.92 (s, 1H), 6.53 - 6.64 (m, 2H), 6.88 (s, 2H), 7.17 (d,J = 1.9 Hz, 1H), 7.33 (t,J = 7.3 Hz, 3H), 7.42 (t,J = 7.4 Hz, 3H), 7.57 (d,J = 7.4 Hz, 1H), 7.72 (s, 3H), 7.89 (d,J = 7.6 Hz, 3H), 7.99 (d,J = 7.6 Hz, 1H), 8.07 (s, 1H), 8.35 (s, 1H)。
FMoc-D-Ala-L-Ala-NH-CH 2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (11g )：HRMS (M+H)+ 計算值1173.4980，實驗值1173.4964。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.79 (s, 3H), 1.06 - 1.34 (m, 13H), 1.36 - 1.54 (m, 4H), 1.60 (s, 2H), 1.88 - 2.10 (m, 1H), 2.10 - 2.23 (m, 1H), 2.31 - 2.51 (m, 13H), 2.71 (s, 3H), 2.80 (d,J = 9.6 Hz, 1H), 3.10 (s, 3H), 3.26 (s, 4H), 3.33 - 3.66 (m, 3H), 3.98 - 4.32 (m, 4H), 4.53 (dd,J = 12.0, 2.8 Hz, 1H), 5.35 (q,J = 6.7 Hz, 1H), 5.49 - 5.65 (m, 1H), 6.51 - 6.67 (m, 3H), 6.89 (s, 1H), 7.19 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 8.25 (s, 2H), 8.34 (d,J = 7.1 Hz, 1H), 8.58 (t,J = 6.3 Hz, 1H)。
FMoc-L-Ala-D-Ala-NH-CH 2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (11f )：HRMS (M+H)+ 計算值1173.4980，實驗值1173.4969。
FMoc-D-Ala-D-Ala-NH-CH 2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (11h )：HRMS (M+Na)+ 計算值1195.4907，實驗值1195.4799。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 0.71 (s, 3H), 1.00 - 1.22 (m, 13H), 1.28 - 1.45 (m, 2H), 1.52 (s, 3H), 1.91 - 2.14 (m, 1H), 2.26 (t,J = 1.9 Hz, 5H), 2.48 (t,J = 1.8 Hz, 2H), 2.62 (s, 3H), 2.66 - 2.77 (m, 2H), 3.01 (s, 2H), 3.10 - 3.21 (m, 5H), 3.28 - 3.47 (m, 2H), 3.86 (d,J = 6.7 Hz, 4H), 3.93 - 4.25 (m, 10H), 4.37 - 4.54 (m, 1H), 5.27 (d,J = 6.7 Hz, 1H), 5.40 - 5.56 (m, 1H), 5.85 (s, 1H), 6.31 - 6.66 (m, 3H), 6.81 (s, 1H), 7.11 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 7.26 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 7.35 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 7.45 (d,J = 7.5 Hz, 1H), 7.65 (t,J = 7.1 Hz, 2H), 7.82 (d,J = 7.5 Hz, 2H), 7.89 (d,J = 7.3 Hz, 1H)。
FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH 2 -S-(CH 2 ) 3 -CO-DM (11j )：HRMS (M+H)+ 計算值1216.5038，實驗值1216.4999。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.78 (s, 3H), 0.95 - 1.29 (m, 16H), 1.37 (d,J = 3.4 Hz, 1H), 1.46 (t,J = 12.5 Hz, 2H), 1.59 (s, 3H), 1.62 - 1.90 (m, 1H), 1.99 - 2.07 (m, 1H), 2.08 (s, 2H), 2.18 - 2.43 (m, 1H), 2.50 - 2.59 (m, 1H), 2.69 (s, 3H), 2.73 - 2.83 (m, 1H), 3.10 (s, 2H), 3.25 (s, 3H), 3.38 - 3.55 (m, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.99 - 4.13 (m, 4H), 4.12 - 4.35 (m, 7H), 4.52 (dd,J = 12.0, 2.9 Hz, 1H), 5.34 (q,J = 6.7 Hz, 1H), 5.48 - 5.65 (m, 1H), 5.92 (s, 1H), 6.48 - 6.70 (m, 3H), 6.88 (s, 1H), 7.17 (d,J = 1.7 Hz, 1H), 7.33 (t,J = 7.5 Hz, 2H), 7.41 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 7.58 (d,J = 7.0 Hz, 1H), 7.71 (t,J = 8.3 Hz, 2H), 7.89 (d,J = 7.5 Hz, 3H), 7.95 (d,J = 7.6 Hz, 1H), 8.15 (d,J = 7.2 Hz, 1H), 8.29 - 8.38 (m, 1H), 8.41 (s, 1H)。
FMoc-D-Ala-L-Ala-NH-CH 2 -S-(CH 2 ) 2 -CO-DM (11i )：HRMS (M+H)+ 計算值1131.4510，實驗值1131.4507。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 0.76 (s, 3H), 1.08 - 1.21 (m, 12H), 1.24 (d,J = 13.9 Hz, 1H), 1.38 - 1.52 (m, 2H), 1.58 (s, 3H), 1.99 - 2.09 (m, 1H), 2.33 - 2.44 (m, 1H), 2.68 (s, 3H), 2.80 (dd,J = 14.4, 8.6 Hz, 2H), 3.08 (s, 3H), 3.17 (d,J = 12.5 Hz, 1H), 3.23 (s, 3H), 3.46 (t,J = 10.3 Hz, 2H), 3.91 (s, 3H), 4.00 - 4.13 (m, 3H), 4.13 - 4.34 (m, 5H), 4.52 (dd,J = 12.0, 2.9 Hz, 1H), 5.30 (q,J = 6.8 Hz, 1H), 5.55 (dd,J = 13.4, 9.1 Hz, 1H), 5.91 (s, 1H), 6.55 (dd,J = 7.4, 5.7 Hz, 3H), 6.87 (s, 1H), 7.16 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 7.32 (tt,J = 7.4, 1.5 Hz, 2H), 7.41 (tt,J = 7.5, 1.5 Hz, 2H), 7.57 (d,J = 7.0 Hz, 1H), 7.71 (dd,J = 10.5, 7.5 Hz, 2H), 7.88 (d,J = 7.5 Hz, 2H), 8.14 (d,J = 7.6 Hz, 1H), 8.37 (t,J = 6.3 Hz, 1H)。4. 胺基 - 肽 - 類美登素 ( 化合物 12a -12j)
如圖9A中所示及如H2 N-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM所例示製備H2 N-肽-NH-CH2 -S-(CH2 )n -CO2 -DM類型之化合物。
H 2 N-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (12a )：用含20%嗎啉之DMF (2 mL)處理FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (151 mg，0.121 mmol)。使反應在磁性攪拌下在氬氣下在室溫下進行1小時。在C18 30微米150 g管柱筒上用含有0.1%甲酸之去離子水及經26分鐘自5%至50%之乙腈線性梯度溶離來純化粗物質。將含有所要產物之部分立即冷凍並凍乾，得到46 mg (37.1%產率)之無色油狀物。HRMS (M + H)+ 計算值1022.4670；實驗值1022.4669。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 0.78 (s, 3H), 1.12 (d,J = 6.3 Hz, 3H), 1.13 - 1.21 (m, 10H), 1.21 - 1.31 (m, 3H), 1.37 - 1.50 (m, 4H), 1.51 - 1.57 (m, 1H), 1.59 (s, 3H), 2.04 (dd,J = 14.4, 2.8 Hz, 1H), 2.15 (ddd,J = 15.9, 8.7, 6.0 Hz, 1H), 2.38 (td,J = 7.0, 3.6 Hz, 2H), 2.70 (s, 3H), 2.79 (d,J = 9.6 Hz, 1H), 3.09 (s, 3H), 3.21 (d,J = 12.5 Hz, 1H), 3.25 (s, 3H), 3.33 - 3.55 (m, 8H), 3.93 (s, 3H), 4.01 - 4.33 (m, 5H), 4.52 (dd,J = 12.0, 2.8 Hz, 1H), 5.34 (q,J = 6.7 Hz, 1H), 5.57 (dd,J = 14.6, 9.0 Hz, 1H), 5.95 (s, 1H), 6.48 - 6.65 (m, 3H), 6.89 (s, 1H), 7.18 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 8.07 (d,J = 7.5 Hz, 1H), 8.13 (s, 1H), 8.31 (s, 1H), 8.40 (t,J = 6.3 Hz, 1H)。
H 2 N-D-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (12b )：HRMS (M+H)+ 計算值1022.4670，實驗值1022.4675。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.71 (s, 3H), 1.05 (dd,J = 6.7, 3.1 Hz, 7H), 1.08 - 1.16 (m, 10H), 1.19 (t,J = 8.1 Hz, 3H), 1.30 - 1.50 (m, 6H), 1.52 (s, 3H), 1.97 (d,J = 13.3 Hz, 1H), 2.01 - 2.21 (m, 2H), 2.34 (s, 3H), 2.63 (s, 3H), 2.73 (d,J = 9.8 Hz, 1H), 3.02 (s, 3H), 3.14 (d,J = 12.5 Hz, 1H), 3.33 - 3.48 (m, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.95 - 4.23 (m, 7H), 4.45 (dd,J = 13.1 Hz, 1H), 5.27 (q,J = 6.8 Hz, 1H), 5.41 - 5.58 (m, 1H), 5.85 (s, 1H), 6.39 - 6.63 (m, 4H), 6.81 (s, 1H), 7.12 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 8.02 (s, 1H), 8.13 (d,J = 7.7 Hz, 1H), 8.26 (s, 1H), 8.36 (t,J = 6.2 Hz, 1H)。
H 2 N-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (12c )：HRMS (M+H)+ 計算值1022.4670，實驗值1022.4680。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.71 (s, 3H), 1.01 - 1.26 (m, 19H), 1.25 - 1.50 (m, 6H), 1.52 (s, 3H), 1.97 (d,J = 13.7 Hz, 1H), 2.02 - 2.22 (m, 1H), 2.35 (dd,J = 17.2, 9.5 Hz, 2H), 2.47 (d,J = 11.5 Hz, 1H), 2.63 (s, 4H), 2.73 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 3.02 (s, 3H), 3.10 - 3.24 (m, 6H), 3.32 - 3.50 (m, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.95 - 4.18 (m, 4H), 4.45 (dd,J = 12.1, 2.6 Hz, 1H), 5.27 (q,J = 6.9 Hz, 1H), 5.44 - 5.55 (m, 1H), 5.85 (s, 1H), 6.42 - 6.59 (m, 4H), 6.81 (s, 1H), 7.12 (d,J = 1.7 Hz, 1H), 8.02 (s, 1H), 8.13 (d,J = 7.7 Hz, 1H), 8.36 (t,J = 6.3 Hz, 1H)。
H 2 N-L-Ala-L-Ala-D-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (12d )：HRMS (M+H)+ 計算值1022.4670，實驗值1022.4675。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.71 (s, 3H), 0.98 - 1.14 (m, 13H), 1.14 - 1.26 (m, 2H), 1.30 - 1.49 (m, 4H), 1.52 (s, 3H), 2.24 - 2.41 (m, 2H), 2.44 (d,J = 1.8 Hz, 16H), 2.63 (s, 2H), 2.73 (d,J = 9.6 Hz, 1H), 3.02 (s, 2H), 3.08 - 3.21 (m, 4H), 3.32 - 3.49 (m, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.92 - 4.23 (m, 3H), 4.45 (d,J = 11.8 Hz, 1H), 5.26 (t,J = 6.7 Hz, 1H), 5.40 - 5.57 (m, 1H), 5.86 (s, 1H), 6.41 - 6.66 (m, 3H), 6.81 (s, 1H), 7.12 (d,J = 1.7 Hz, 1H), 8.02 (s, 1H), 8.10 (d,J = 7.7 Hz, 1H), 8.35 (t,J = 6.3 Hz, 1H)。
H 2 N-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (12g )：HRMS (M+H)+ 計算值951.4299，實驗值951.4289。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.79 (s, 3H), 1.06 - 1.34 (m, 13H), 1.36 - 1.54 (m, 4H), 1.60 (s, 2H), 1.88 - 2.10 (m, 1H), 2.10 - 2.23 (m, 1H), 2.31 - 2.51 (m, 13H), 2.71 (s, 3H), 2.80 (d,J = 9.6 Hz, 1H), 3.10 (s, 3H), 3.26 (s, 4H), 3.33 - 3.66 (m, 3H), 3.98 - 4.32 (m, 4H), 4.53 (dd,J = 12.0, 2.8 Hz, 1H), 5.35 (q,J = 6.7 Hz, 1H), 5.49 - 5.65 (m, 1H), 6.51 - 6.67 (m, 3H), 6.89 (s, 1H), 7.19 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 8.25 (s, 2H), 8.34 (d,J = 7.1 Hz, 1H), 8.58 (t,J = 6.3 Hz, 1H)。
H 2 N-L-Ala-D-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (12f )：HRMS (M+H)+ 計算值951.4226，實驗值951.1299。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.71 (s, 3H), 1.00 - 1.13 (m, 11H), 1.19 (t,J = 8.9 Hz, 3H), 1.29 - 1.45 (m, 4H), 1.52 (s, 3H), 1.92 - 2.03 (m, 1H), 2.07 (dd,J = 15.7, 8.7 Hz, 1H), 2.23 - 2.39 (m, 1H), 2.63 (s, 3H), 2.73 (d,J = 9.7 Hz, 1H), 3.02 (s, 3H), 3.07 - 3.32 (m, 14H), 3.34 - 3.47 (m, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.95 - 4.21 (m, 4H), 4.45 (dd,J = 11.9, 2.8 Hz, 1H), 5.27 (q,J = 6.8 Hz, 1H), 5.50 (dd,J = 14.7, 9.0 Hz, 1H), 5.85 (s, 1H), 6.40 - 6.61 (m, 3H), 6.81 (s, 1H), 7.12 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 8.41 (t,J = 6.1 Hz, 1H)。
H2 N-D-Ala-D-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (12h )：HRMS (M+H)+ 計算值950.4226，實驗值951.4299。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.71 (s, 3H), 0.96 - 1.14 (m, 14H), 1.19 (t,J = 8.9 Hz, 3H), 1.38 (q,J = 10.5, 7.0 Hz, 5H), 1.52 (s, 3H), 1.88 - 2.02 (m, 1H), 2.02 - 2.18 (m, 1H), 2.22 - 2.41 (m, 2H), 2.48 (s, 1H), 2.63 (s, 3H), 2.73 (d,J = 9.6 Hz, 1H), 3.02 (s, 3H), 3.08 - 3.22 (m, 4H), 3.34 - 3.48 (m, 2H), 3.86 (s, 4H), 3.95 - 4.23 (m, 5H), 4.45 (dd,J = 11.9, 2.8 Hz, 1H), 5.27 (q,J = 6.7 Hz, 1H), 5.41 - 5.60 (m, 1H), 5.85 (s, 1H), 6.40 - 6.65 (m, 4H), 6.81 (s, 1H), 7.12 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 8.44 (t,J = 6.1 Hz, 1H)。
H2 N-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )3 -CO-DM (12j )：HRMS (M+H)+ 計算值994.4357，實驗值994.4330。
H 2 N-D-Ala-L-Ala-NH-CH 2 -S-(CH 2 ) 2 -CO-DM (12i )：HRMS (M+H)+ 計算值909.3830，實驗值909.3826。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 0.77 (s, 3H), 1.12 (d,J = 6.7 Hz, 6H), 1.17 (dd,J = 7.0, 5.2 Hz, 6H), 1.25 (d,J = 13.3 Hz, 1H), 1.40 - 1.51 (m, 2H), 1.59 (s, 3H), 2.04 (dd,J = 14.4, 2.9 Hz, 1H), 2.41 (ddt,J = 18.6, 10.1, 5.4 Hz, 1H), 2.61 - 2.70 (m, 1H), 2.72 (s, 3H), 2.76 - 2.90 (m, 3H), 3.09 (s, 3H), 3.20 (d,J = 12.4 Hz, 1H), 3.25 (s, 3H), 3.33 (q,J = 6.9 Hz, 1H), 3.39 - 3.64 (m, 3H), 3.93 (s, 3H), 4.03 - 4.16 (m, 2H), 4.24 (dt,J = 15.1, 7.6 Hz, 2H), 4.53 (dd,J = 12.0, 2.9 Hz, 1H), 5.32 (q,J = 6.8 Hz, 1H), 5.51 - 5.64 (m, 1H), 5.93 (s, 1H), 6.49 - 6.62 (m, 2H), 6.88 (s, 1H), 7.19 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 8.10 (s, 1H), 8.55 (t,J = 6.3 Hz, 1H)。5. SPDB- 肽 - 類美登素 ( 化合物 13a -13j)
如圖9A中所示及如SPDB-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM所例示製備SPDB-肽-NH-CH2 -S-(CH2 )n -CO2 -DM類型之化合物。
SPDB-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (13a )：將H2 N-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (46 mg，0.045 mmol)溶解於DMF (2 mL)中，向其中添加SPDB (14.7 mg，0.045 mmol)，且在室溫下在磁性攪拌下在氬氣氛圍下反應1小時。在C18 430微米30 g筒上用含有0.1%甲酸之去離子水及經35分鐘自5%至95%之乙腈線性梯度溶離來純化粗物質。將含有純所要產物之部分冷凍並凍乾，得到38 mg (68.5%產率)之白色固體。HRMS (M + H)+ 計算值1233.4796；實驗值1233.4783。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 0.78 (s, 3H), 1.12 (d,J = 6.4 Hz, 3H), 1.14 - 1.21 (m, 10H), 1.22 - 1.30 (m, 3H), 1.44 (qd,J = 10.2, 4.5 Hz, 5H), 1.50 - 1.56 (m, 1H), 1.59 (s, 3H), 1.84 (p,J = 7.3 Hz, 2H), 2.04 (dd,J = 14.4, 2.7 Hz, 1H), 2.15 (ddd,J = 15.8, 8.6, 5.9 Hz, 2H), 2.24 (t,J = 7.2 Hz, 2H), 2.39 (dtdd,J = 18.1, 13.2, 8.1, 4.7 Hz, 3H), 2.70 (s, 3H), 2.76 - 2.86 (m, 3H), 3.09 (s, 3H), 3.21 (d,J = 12.5 Hz, 1H), 3.25 (s, 3H), 3.43 (d,J = 12.4 Hz, 1H), 3.48 (d,J = 9.0 Hz, 1H), 3.92 (s, 3H), 4.13 (s, 2H), 4.19 (h,J = 6.6 Hz, 4H), 4.52 (dd,J = 12.1, 2.8 Hz, 1H), 5.34 (q,J = 6.8 Hz, 1H), 5.56 (dd,J = 14.7, 9.0 Hz, 1H), 5.92 (s, 1H), 6.49 - 6.66 (m, 3H), 6.85 - 6.97 (m, 2H), 7.18 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 7.23 (ddd,J = 7.3, 4.8, 1.2 Hz, 1H), 7.76 (dt,J = 8.1, 1.2 Hz, 1H), 7.78 - 7.91 (m, 2H), 8.00 (d,J = 7.1 Hz, 1H), 8.09 (d,J = 7.0 Hz, 1H), 8.33 (t,J = 6.3 Hz, 1H), 8.44 (dt,J = 4.7, 1.3 Hz, 1H), 8.50 (s, 1H)。
SPDB-D-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH 2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (13b )：HRMS (M+H)+ 計算值1233.4796，實驗值1233.4799。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.71 (s, 3H), 1.01 - 1.22 (m, 13H), 1.27 - 1.45 (m, 2H), 1.52 (s, 3H), 1.91 - 2.16 (m, 1H), 2.26 (d,J = 7.4 Hz, 7H), 2.26 (t,J = 1.9 Hz, 4H), 2.48 (t,J = 1.8 Hz, 2H), 2.57 - 2.65 (m, 3H), 2.65 - 2.77 (m, 2H), 3.01 (s, 2H), 3.13 (d,J = 12.2 Hz, 1H), 3.18 (s, 3H), 3.32 - 3.47 (m, 2H), 3.86 (d,J = 6.7 Hz, 4H), 3.93 - 4.11 (m, 3H), 4.18 (t,J = 11.2 Hz, 7H), 4.39 - 4.50 (m, 1H), 5.27 (d,J = 6.7 Hz, 1H), 5.50 (dd,J = 14.7, 8.8 Hz, 1H), 5.85 (s, 1H), 6.37 - 6.61 (m, 3H), 6.81 (s, 1H), 7.11 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 7.26 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 7.35 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 7.45 (d,J = 7.5 Hz, 1H), 7.65 (t,J = 7.1 Hz, 2H), 7.82 (d,J = 7.5 Hz, 2H), 7.89 (d,J = 7.3 Hz, 1H)。
SPDB-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH 2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (13c )：HRMS (M+H)+ 計算值1233.4796，實驗值1233.4795。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.71 (s, 3H), 1.02 - 1.25 (m, 18H), 1.29 - 1.50 (m, 6H), 1.52 (s, 3H), 1.70 - 1.87 (m, 2H), 1.87 - 2.14 (m, 2H), 2.13 - 2.22 (m, 2H), 2.27 - 2.40 (m, 3H), 2.63 (s, 3H), 2.69 - 2.84 (m, 4H), 3.02 (s, 3H), 3.14 (d,J = 12.3 Hz, 1H), 3.18 (s, 3H), 3.32 - 3.45 (m, 2H), 3.85 (s, 3H), 3.95 - 4.07 (m, 2H), 4.07 - 4.19 (m, 4H), 4.45 (dd,J = 11.9, 2.7 Hz, 1H), 5.27 (q,J = 6.7 Hz, 1H), 5.44 - 5.55 (m, 1H), 5.85 (s, 1H), 6.42 - 6.59 (m, 3H), 6.81 (s, 1H), 7.11 (s, 1H), 7.13 - 7.19 (m, 1H), 7.68 (d,J = 8.2, 2.7 Hz, 1H), 7.72 - 7.80 (m, 1H), 7.88 (t,J = 6.6 Hz, 1H), 8.04 (d,J = 6.4 Hz, 1H), 8.09 (d,J = 7.4 Hz, 1H), 8.25 (t,J = 6.3 Hz, 1H), 8.37 (dd,J = 5.0, 1.9 Hz, 1H)。
SPDB-L-Ala-L-Ala-D-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (13d )：HRMS (M+H)+ 計算值1233.4796，實驗值1233.4797。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.72 (d,J = 3.3 Hz, 3H), 0.98 - 1.28 (m, 22H), 1.30 - 1.46 (m, 3H), 1.53 (s, 3H), 1.78 (q,J = 7.1 Hz, 2H), 1.86 - 2.16 (m, 2H), 2.19 (q,J = 7.4, 5.6 Hz, 2H), 2.26 - 2.41 (m, 2H), 2.41 - 2.55 (m, 4H), 2.64 (d,J = 3.2 Hz, 2H), 2.81 - 2.92 (m, 1H), 3.02 (s, 2H), 3.14 (d,J = 12.0 Hz, 1H), 3.26 (s, 1H), 3.31 - 3.48 (m, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.97 - 4.30 (m, 7H), 4.46 (dd,J = 11.8, 3.2 Hz, 1H), 5.24 - 5.36 (m, 1H), 5.45 - 5.62 (m, 1H), 5.86 (s, 1H), 6.40 - 6.65 (m, 3H), 6.82 (d,J = 3.4 Hz, 1H), 7.11 (d,J = 3.2 Hz, 1H), 7.18 (d,J = 12.1, 6.1, 4.9 Hz, 2H), 7.69 (d,J = 8.1 Hz, 1H), 7.75 (t,J = 7.6 Hz, 2H), 7.89 (d,J = 7.8, 3.2 Hz, 1H), 7.95 - 8.04 (m, 2H), 8.26 (d,J = 6.1 Hz, 1H), 8.33 - 8.47 (m, 1H)。
SPDB-D-Ala-L-Ala-NH-CH 2 -S-(CH 2 ) 5 -CO-DM (13g )：HRMS (M+H)+ 計算值1162.4425，實驗值1162.4405。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.71 (s, 3H), 1.08 (dt,J = 13.9, 6.9 Hz, 15H), 1.15 - 1.25 (m, 3H), 1.28 - 1.44 (m, 5H), 1.52 (s, 3H), 1.77 (p,J = 7.2 Hz, 2H), 1.91 - 2.02 (m, 1H), 2.02 - 2.13 (m, 1H), 2.17 (t,J = 7.2 Hz, 2H), 2.22 - 2.40 (m, 2H), 2.63 (s, 3H), 2.68 - 2.80 (m, 3H), 3.02 (s, 3H), 3.13 (d,J = 12.3 Hz, 1H), 3.18 (s, 3H), 3.33 - 3.45 (m, 2H), 3.85 (s, 3H), 3.95 - 4.16 (m, 5H), 4.45 (dd,J = 12.1, 2.8 Hz, 1H), 5.27 (q,J = 6.7 Hz, 1H), 5.44 - 5.56 (m, 1H), 5.85 (s, 1H), 6.43 - 6.60 (m, 3H), 6.82 (s, 1H), 7.11 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 7.12 - 7.18 (m, 1H), 7.65 - 7.79 (m, 2H), 8.06 - 8.16 (m, 2H), 8.30 (t,J = 6.3 Hz, 1H), 8.35 - 8.40 (m, 1H)。
SPDB-L-Ala-D-Ala-NH-CH 2 -S-(CH 2 ) 5 -CO-DM (13f )：HRMS (M+H)+ 計算值1162.4399，實驗值1162.455。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.71 (s, 3H), 1.02 - 1.13 (m, 12H), 1.14 - 1.25 (m, 3H), 1.31 - 1.44 (m, 5H), 1.52 (s, 3H), 1.77 (p,J = 7.3 Hz, 2H), 1.97 (d,J = 14.3, 2.7 Hz, 1H), 2.02 - 2.13 (m, 1H), 2.17 (t,J = 7.2 Hz, 2H), 2.28 - 2.40 (m, 3H), 2.43 (m,J = 3.2 Hz, 3H), 2.63 (s, 3H), 2.69 - 2.80 (m, 3H), 3.02 (s, 3H), 3.13 (d,J = 12.4 Hz, 1H), 3.18 (s, 3H), 3.39 (dd,J = 21.0, 10.7 Hz, 2H), 3.85 (s, 3H), 3.96 - 4.18 (m, 5H), 4.45 (dd,J = 12.1, 2.8 Hz, 1H), 5.27 (q,J = 6.7 Hz, 1H), 5.45 - 5.55 (m, 1H), 5.85 (s, 1H), 6.43 - 6.60 (m, 3H), 6.81 (s, 1H), 7.10 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 7.16 (t,J = 7.2, 4.9 Hz, 1H), 7.68 (d,J = 8.1 Hz, 1H), 7.71 - 7.79 (m, 1H), 8.02 - 8.15 (m, 2H), 8.28 (t,J = 6.3 Hz, 1H), 8.37 (d,J = 4.8, 1.7 Hz, 1H)。
SPDB-D-Ala-D-Ala-NH-CH 2 -S-(CH 2 ) 5 -CO-DM (13h )：HRMS (M+H)+ 計算值1162.4399，實驗值1162.455。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.71 (s, 3H), 1.02 - 1.16 (m, 13H), 1.14 - 1.25 (m, 3H), 1.28 - 1.49 (m, 5H), 1.52 (s, 3H), 1.77 (p,J = 7.2 Hz, 2H), 1.92 - 2.14 (m, 2H), 2.17 (t,J = 7.2 Hz, 2H), 2.23 - 2.40 (m, 2H), 2.46 - 2.54 (m, 1H), 2.63 (s, 3H), 2.65 - 2.85 (m, 4H), 3.02 (s, 3H), 3.03 - 3.16 (m, 2H), 3.18 (s, 3H), 3.28 - 3.45 (m, 2H), 3.85 (s, 3H), 3.95 - 4.20 (m, 5H), 4.45 (dd,J = 12.1, 2.8 Hz, 1H), 5.27 (q,J = 6.7 Hz, 1H), 5.44 - 5.55 (m, 1H), 5.82 - 5.88 (m, 1H), 6.42 - 6.59 (m, 3H), 6.81 (s, 1H), 7.11 (d,J = 1.9 Hz, 1H), 7.14 - 7.20 (m, 1H), 7.67 - 7.72 (m, 1H), 7.72 - 7.80 (m, 1H), 7.88 (d,J = 7.6 Hz, 1H), 7.99 (d,J = 7.1 Hz, 1H), 8.28 (t,J = 6.3 Hz, 1H), 8.35 - 8.40 (m, 1H)。
SPDB-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH 2 -S-(CH 2 ) 3 -CO-DM (13j )：HRMS (M+H)+ 計算值1203.4337，實驗值1203.4315。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.71 (s, 3H), 0.94 - 1.24 (m, 20H), 1.38 (s, 3H), 1.52 (s, 3H), 1.57 - 1.87 (m, 1H), 1.89 - 2.08 (m, 1H), 2.26 (t,J = 15.1 Hz, 1H), 2.50 (d,J = 5.2 Hz, 2H), 2.54 - 2.79 (m, 7H), 3.05 (d,J = 3.8 Hz, 3H), 3.18 (s, 5H), 3.29 - 3.46 (m, 3H), 3.86 (d,J = 6.1 Hz, 4H), 4.00 (s, 3H), 4.05 - 4.24 (m, 4H), 4.33 - 4.54 (m, 1H), 5.17 - 5.38 (m, 1H), 5.39 - 5.58 (m, 1H), 5.85 (s, 1H), 6.29 - 6.58 (m, 4H), 6.63 (s, 1H), 6.81 (s, 1H), 7.04 - 7.19 (m, 1H), 7.90 (s, 1H), 8.14 - 8.39 (m, 1H), 8.45 (s, 1H)。
SPDB-D-Ala-L-Ala-NH-CH 2 -S-(CH 2 ) 2 -CO-DM (13i )：HRMS (M+H)+ 計算值1120.3955，實驗值1120.3951。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 0.74 - 0.82 (m, 3H), 1.10 - 1.22 (m, 13H), 1.25 (d,J = 14.1 Hz, 1H), 1.46 (t,J = 10.9 Hz, 2H), 1.56 - 1.63 (m, 3H), 1.85 (ddd,J = 14.4, 9.0, 5.1 Hz, 2H), 2.00 (ddd,J = 14.7, 9.3, 5.4 Hz, 9H), 2.24 (dt,J = 10.8, 5.0 Hz, 2H), 2.72 (d,J = 3.6 Hz, 2H), 2.94 (dq,J = 10.7, 7.2, 5.7 Hz, 9H), 3.10 (d,J = 3.7 Hz, 3H), 3.20 (d,J = 3.4 Hz, 1H), 3.25 (d,J = 3.6 Hz, 3H), 3.32 (d,J = 3.7 Hz, 1H), 3.47 (td,J = 10.7, 10.0, 3.8 Hz, 2H), 3.93 (t,J = 4.6 Hz, 3H), 4.02 - 4.25 (m, 6H), 4.49 - 4.57 (m, 1H), 5.28 - 5.37 (m, 1H), 5.53 - 5.62 (m, 1H), 5.92 (d,J = 3.6 Hz, 1H), 6.57 (q,J = 5.4, 4.5 Hz, 3H), 6.85 - 6.93 (m, 1H), 7.17 (d,J = 3.3 Hz, 1H), 7.25 (dq,J = 8.0, 4.9 Hz, 6H), 7.72 - 7.87 (m, 11H), 8.16 (dt,J = 15.4, 4.9 Hz, 2H), 8.45 (tt,J = 9.9, 5.9 Hz, 6H)。6. 硫 - 肽 - 類美登素 ( 化合物 14a -14j)
如圖9A中所示及如HS-(CH2 )3 CO-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM所例示製備HS-(CH2 )3 CO-肽-NH-CH2 -S-(CH2 )n -CO2 -DM類型之化合物。
HS-(CH2 )3 CO-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (14a )：將SPDB-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (38 mg，0.031 mmol)溶解於DMSO (1 mL)中，向其中添加DTT (19 mg，0.12 mmol)於100 mM磷酸鉀、2 mM EDTA pH 7.5緩衝液(1 mL)中之溶液。使反應在室溫下在磁性攪拌下在氬氣下進行1小時。在C18 30微米30 g筒上用含有0.1%甲酸之去離子水及經35分鐘5%至95%之乙腈線性梯度溶離來純化粗反應物。將含有所要產物之部分立即冷凍並凍乾，得到18.2 mg (52.5%產率)之白色固體。HRMS (M + H)+計算值1124.4809；實驗值1124.4798。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 0.78 (s, 3H), 1.12 (d,J = 6.4 Hz, 3H), 1.14 - 1.21 (m, 10H), 1.22 - 1.30 (m, 3H), 1.37 - 1.50 (m, 5H), 1.51 - 1.57 (m, 1H), 1.59 (s, 3H), 1.74 (p,J = 7.2 Hz, 2H), 2.04 (dd,J = 14.4, 2.8 Hz, 1H), 2.09 - 2.18 (m, 1H), 2.18 - 2.24 (m, 2H), 2.27 (t,J = 7.6 Hz, 1H), 2.38 (td,J = 7.1, 4.7 Hz, 2H), 2.44 (t,J = 7.3 Hz, 2H), 2.70 (s, 3H), 2.79 (d,J = 9.6 Hz, 1H), 3.09 (s, 3H), 3.21 (d,J = 12.6 Hz, 1H), 3.25 (s, 3H), 3.43 (d,J = 12.4 Hz, 1H), 3.49 (d,J = 9.0 Hz, 1H), 3.93 (s, 3H), 4.08 (ddd,J = 21.6, 11.4, 4.1 Hz, 2H), 4.13 - 4.28 (m, 4H), 4.52 (dd,J = 12.1, 2.8 Hz, 1H), 5.34 (q,J = 6.7 Hz, 1H), 5.56 (dd,J = 14.7, 9.0 Hz, 1H), 5.91 (d,J = 1.4 Hz, 1H), 6.48 - 6.66 (m, 3H), 6.88 (s, 1H), 7.18 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 7.86 (d,J = 7.5 Hz, 1H), 7.96 (d,J = 7.3 Hz, 1H), 8.05 (d,J = 7.1 Hz, 1H), 8.33 (t,J = 6.3 Hz, 1H)。
HS-(CH 2 )3 CO-D-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (14b )：HRMS (M+Na)+ 計算值1146.4629，實驗值1146.4591。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.71 (s, 3H), 1.03 - 1.25 (m, 19H), 1.30 - 1.45 (m, 6H), 1.52 (s, 4H), 1.65 (p,J = 7.3 Hz, 2H), 1.91 - 2.02 (m, 1H), 2.02 - 2.13 (m, 1H), 2.12 - 2.19 (m, 4H), 2.29 - 2.39 (m, 4H), 2.63 (s, 3H), 2.73 (d,J = 9.6 Hz, 1H), 3.02 (s, 3H), 3.14 (d,J = 12.5 Hz, 1H), 3.33 - 3.47 (m, 2H), 3.86 (s, 3H), 4.01 (td,J = 10.4, 9.7, 4.3 Hz, 2H), 4.04 - 4.16 (m, 5H), 4.45 (dd,J = 12.0, 2.9 Hz, 1H), 5.27 (q,J = 6.7 Hz, 1H), 5.43 - 5.56 (m, 1H), 5.85 (s, 1H), 6.38 - 6.61 (m, 4H), 6.81 (s, 1H), 7.11 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 7.82 (d,J = 7.7 Hz, 1H), 7.97 (t,J = 6.3 Hz, 1H), 8.10 (d,J = 6.0 Hz, 1H), 8.25 (d,J = 6.9 Hz, 1H)。
HS-(CH 2 )3 CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (14c )：HRMS (M+Na)+ 計算值1146.4629，實驗值1146.4553。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.71 (s, 3H), 0.99 - 1.26 (m, 21H), 1.31 - 1.45 (m, 5H), 1.52 (s, 3H), 1.67 (p,J = 7.2 Hz, 2H), 1.89 - 2.02 (m, 1H), 2.02 - 2.24 (m, 4H), 2.25 - 2.46 (m, 3H), 2.63 (s, 3H), 2.73 (d,J = 9.7 Hz, 1H), 3.02 (s, 3H), 3.18 (s, 3H), 3.32 - 3.51 (m, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.96 - 4.18 (m, 7H), 4.45 (dd,J = 12.0, 2.9 Hz, 1H), 5.27 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 5.44 - 5.63 (m, 1H), 5.85 (s, 1H), 6.37 - 6.59 (m, 4H), 6.81 (s, 1H), 7.11 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 7.89 (d,J = 7.7 Hz, 1H), 8.03 (d,J = 6.5 Hz, 1H), 8.08 (d,J = 7.3 Hz, 1H), 8.27 (t,J = 6.3 Hz, 1H)。
HS-(CH 2 )3 CO-L-Ala-L-Ala-D-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (14d )：HRMS (M+Na)+ 計算值1146.4629，實驗值1146.4519。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.71 (s, 3H), 0.95 - 1.24 (m, 20H), 1.27 - 1.45 (m, 5H), 1.52 (s, 3H), 1.67 (p,J = 7.3 Hz, 2H), 1.93 - 2.01 (m, 1H), 2.02 - 2.22 (m, 4H), 2.22 - 2.41 (m, 5H), 2.63 (s, 3H), 2.73 (d,J = 9.6 Hz, 1H), 3.02 (s, 3H), 3.18 (s, 4H), 3.39 (dd,J = 21.4, 10.7 Hz, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.94 - 4.24 (m, 6H), 4.45 (dd,J = 12.0, 2.8 Hz, 1H), 5.27 (q,J = 6.7 Hz, 1H), 5.44 - 5.57 (m, 1H), 5.85 (s, 1H), 6.37 - 6.65 (m, 3H), 6.81 (s, 1H), 7.11 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 7.89 (d,J = 7.6 Hz, 1H), 7.93 - 8.05 (m, 2H), 8.26 (t,J = 6.4 Hz, 1H)。
HS-(CH 2 )3 CO-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (14g )：HRMS (M+H)+ 計算值1053.4438，實驗值1053.4426。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.71 (s, 3H), 1.01 - 1.15 (m, 13H), 1.15 - 1.27 (m, 3H), 1.31 - 1.44 (m, 5H), 1.53 (s, 3H), 1.67 (p,J = 7.1 Hz, 2H), 1.93 - 2.03 (m, 1H), 2.03 - 2.23 (m, 4H), 2.22 - 2.41 (m, 5H), 2.63 (s, 3H), 2.73 (d,J = 9.7 Hz, 1H), 3.02 (s, 3H), 3.14 (d,J = 12.5 Hz, 1H), 3.18 (s, 3H), 3.32 - 3.46 (m, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.92 - 4.20 (m, 6H), 4.45 (dd,J = 11.9, 2.8 Hz, 1H), 5.27 (q,J = 6.7 Hz, 1H), 5.42 - 5.58 (m, 1H), 5.85 (s, 1H), 6.42 - 6.60 (m, 3H), 6.81 (s, 1H), 7.12 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 8.05 (d,J = 6.5 Hz, 1H), 8.10 (d,J = 7.8 Hz, 1H), 8.30 (t,J = 6.3 Hz, 1H)。
HS-(CH 2 )3 CO-L-Ala-D-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (14f )：HRMS (M+H)+ 計算值1053.4366，實驗值1053.4438。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.71 (s, 3H), 1.02 - 1.14 (m, 13H), 1.19 (t,J = 9.7 Hz, 3H), 1.31 - 1.43 (m, 6H), 1.53 (s, 3H), 1.67 (p,J = 7.3 Hz, 2H), 1.91 - 2.02 (m, 1H), 2.02 - 2.22 (m, 4H), 2.34 - 2.39 (m, 4H), 2.63 (s, 3H), 2.73 (d,J = 9.5 Hz, 1H), 3.02 (s, 3H), 3.19 (d,J = 4.2 Hz, 4H), 3.30 - 3.47 (m, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.94 - 4.20 (m, 6H), 4.45 (d,J = 11.8, 2.8 Hz, 1H), 5.27 (q,J = 6.7 Hz, 1H), 5.44 - 5.56 (m, 1H), 5.85 (s, 1H), 6.40 - 6.61 (m, 3H), 6.81 (s, 1H), 7.12 (s, 1H), 8.03 (d,J = 6.5 Hz, 1H), 8.08 (d,J = 7.8 Hz, 1H), 8.29 (t,J = 6.2 Hz, 1H)。
HS-(CH 2 )3 CO-D-Ala-D-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (14h )：HRMS (M+H)+ 計算值1053.4366，實驗值1053.4438。1 H NMR (400 MHz, DMSFO-d6) δ 0.71 (s, 3H), 1.02 - 1.15 (m, 13H), 1.14 - 1.24 (m, 3H), 1.30 - 1.45 (m, 5H), 1.53 (s, 3H), 1.67 (p, J = 7.1 Hz, 2H), 1.90 - 2.01 (m, 1H), 2.01 - 2.24 (m, 4H), 2.27 - 2.33 (m, 1H), 2.33 - 2.42 (m, 4H), 2.63 (s, 3H), 2.73 (d,J = 9.7 Hz, 1H), 3.02 (s, 3H), 3.10 - 3.21 (m, 4H), 3.33 - 3.46 (m, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.95 - 4.18 (m, 6H), 4.45 (dd,J = 11.9, 2.8 Hz, 1H), 5.27 (q,J = 6.7 Hz, 1H), 5.44 - 5.55 (m, 1H), 5.85 (s, 1H), 6.42 - 6.59 (m, 3H), 6.81 (s, 1H), 7.12 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 8.05 (d,J = 6.5 Hz, 1H), 8.10 (d,J = 7.8 Hz, 1H), 8.30 (t,J = 6.3 Hz, 1H)。
HS-(CH 2 )3 CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )3 -CO-DM (14j )：HRMS (M+H)+ 計算值1096.4496，實驗值1096.4464。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 0.78 (s, 3H), 1.02 - 1.31 (m, 19H), 1.35 - 1.55 (m, 2H), 1.60 (s, 3H), 1.74 (p,J = 7.4 Hz, 3H), 1.78 - 1.93 (m, 1H), 2.14 - 2.33 (m, 4H), 2.41 - 2.49 (m, 2H), 2.71 (s, 3H), 2.80 (d,J = 9.6 Hz, 1H), 3.12 (s, 3H), 3.22 (d,J = 12.7 Hz, 1H), 3.26 (s, 3H), 3.47 (dd,J = 21.3, 10.6 Hz, 2H), 3.93 (s, 4H), 4.03 - 4.13 (m, 3H), 4.13 - 4.25 (m, 3H), 4.52 (dd,J = 12.0, 2.8 Hz, 1H), 5.35 (q,J = 6.8 Hz, 1H), 5.50 - 5.64 (m, 1H), 5.92 (s, 1H), 6.47 - 6.69 (m, 4H), 6.88 (s, 1H), 7.18 (d,J = 1.7 Hz, 1H), 7.94 (d,J = 7.3 Hz, 1H), 8.09 (d,J = 6.4 Hz, 1H), 8.15 (d,J = 7.3 Hz, 1H), 8.32 (t,J = 6.3 Hz, 1H)。
HS-(CH 2 )3 CO-(CH2 )3 -CO-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )2 -CO-DM (14i )：HRMS (M+H)+ 計算值1011.3969，實驗值1011.3961。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 0.77 (s, 3H), 1.12 (d,J = 6.4 Hz, 3H), 1.17 (dd,J = 7.0, 5.1 Hz, 9H), 1.25 (d,J = 13.0 Hz, 1H), 1.40 - 1.51 (m, 2H), 1.59 (s, 3H), 1.74 (q,J = 7.2 Hz, 2H), 2.00 - 2.08 (m, 1H), 2.23 (dt,J = 16.8, 7.6 Hz, 3H), 2.43 (q,J = 7.4 Hz, 2H), 2.62 - 2.69 (m, 1H), 2.72 (s, 3H), 2.76 - 2.88 (m, 2H), 3.10 (s, 3H), 3.20 (d,J = 12.6 Hz, 1H), 3.25 (s, 3H), 3.31 (s, 3H), 3.39 - 3.54 (m, 2H), 3.93 (s, 3H), 4.01 - 4.26 (m, 5H), 4.53 (dd,J = 12.0, 2.8 Hz, 1H), 5.32 (q,J = 6.8 Hz, 1H), 5.49 - 5.63 (m, 1H), 5.92 (d,J = 1.4 Hz, 1H), 6.48 - 6.62 (m, 3H), 6.88 (s, 1H), 7.18 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 8.10 (d,J = 6.5 Hz, 1H), 8.16 (d,J = 7.7 Hz, 1H), 8.41 (t,J = 6.3 Hz, 1H)。 7. HOOC-(CH2 )3 -CO-肽-NH-CH2 -S-(CH2 )n -CO2 -DM (化合物19a-19j)
如圖9B中所示及如HOOC-(CH2 )3 -CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM所例示製備HOOC-(CH2 )3 -CO-肽-NH-CH2 -S-(CH2 )n -CO2 -DM類型之化合物。
HOOC-(CH2 )3 -CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (19a )：用戊二酸酐(38.5 mg，0.337 mmol)處理L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (17.25 mg，0.017 mmol)，且在室溫下在磁性攪拌下在氬氣下反應隔夜。藉由HPLC使用XDB-C18 21.2 × 5 mm 5微米管柱用含有0.1%甲酸之去離子水及經30分鐘自5%至95%之乙腈線性梯度以20 ml/min溶離來純化粗反應物。將含有純所要產物之部分立即合併，冷凍並凍乾，得到3 mg (15%產率)之白色固體。HRMS (M+H)+ 計算值1136.4987，實驗值1136.4954。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.71 (s, 3H), 0.92 - 1.27 (m, 20H), 1.26 - 1.48 (m, 5H), 1.52 (s, 3H), 1.63 (q,J = 7.1 Hz, 2H), 1.83 - 2.20 (m, 7H), 2.23 - 2.41 (m, 5H), 2.63 (s, 4H), 2.73 (d,J = 9.5 Hz, 1H), 3.02 (s, 3H), 3.36 - 3.50 (m, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.91 - 4.24 (m, 7H), 4.45 (d,J = 11.8 Hz, 1H), 5.27 (q,J = 6.7 Hz, 1H), 5.41 - 5.57 (m, 1H), 5.86 (s, 1H), 6.32 - 6.66 (m, 3H), 6.81 (s, 1H), 7.12 (s, 1H), 8.06 (t,J = 9.1 Hz, 2H), 8.35 (d,J = 11.6 Hz, 1H), 8.62 (s, 1H)。
HOOC-(CH 2 )3 -CO-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (19g )：HRMS (M+H)+ 計算值1136.4987，實驗值1136.4962。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.71 (s, 3H), 0.97 - 1.14 (m, 13H), 1.14 - 1.26 (m, 3H), 1.28 - 1.45 (m, 5H), 1.52 (s, 3H), 1.62 (p,J = 7.5 Hz, 2H), 1.93 - 2.00 (m, 1H), 2.08 (dt,J = 13.1, 7.4 Hz, 6H), 2.25 - 2.41 (m, 3H), 2.63 (s, 3H), 2.73 (d,J = 9.5 Hz, 1H), 3.02 (s, 3H), 3.18 (s, 3H), 3.31 - 3.48 (m, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.93 - 4.19 (m, 6H), 4.45 (dd,J = 12.0, 2.8 Hz, 1H), 5.27 (q,J = 6.8 Hz, 1H), 5.43 - 5.58 (m, 1H), 5.85 (s, 1H), 6.40 - 6.61 (m, 3H), 6.81 (s, 1H), 7.11 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 8.03 (d,J = 6.5 Hz, 1H), 8.13 (d,J = 7.8 Hz, 1H), 8.34 (t,J = 6.3 Hz, 1H), 11.94 (s, 1H)。
HOOC-(CH 2 )3 -CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )3 -CO-DM (19i )：HRMS (M+H)+ 計算值1108.4674，實驗值1108.4634。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.78 (s, 3H), 1.04 - 1.32 (m, 16H), 1.45 (d,J = 12.6 Hz, 2H), 1.60 (s, 3H), 1.69 (p,J = 7.2 Hz, 3H), 1.77 - 1.95 (m, 1H), 1.99 - 2.07 (m, 1H), 2.11 - 2.20 (m, 4H), 2.20 - 2.39 (m, 1H), 2.55 (s, 1H), 2.71 (s, 3H), 2.80 (d,J = 9.5 Hz, 1H), 3.12 (s, 3H), 3.40 (d,J = 21.0 Hz, 8H), 3.49 (d,J = 9.1 Hz, 1H), 3.93 (s, 3H), 4.02 - 4.27 (m, 6H), 4.48 - 4.61 (m, 1H), 5.34 (q, J = 6.6 Hz, 1H), 5.48 - 5.65 (m, 1H), 5.92 (s, 1H), 6.50 - 6.71 (m, 3H), 6.88 (s, 1H), 7.18 (s, 1H), 7.99 (d,J = 7.6 Hz, 1H), 8.08 (d,J = 6.5 Hz, 1H), 8.22 (d,J = 7.4 Hz, 1H), 8.30 (s, 1H), 8.42 (s, 1H)。8. NHS-OOC-(CH2 )3 -CO- 肽 -NH-CH2 -S-(CH2 )n - CO2 -DM ( 化合物 20a -20j)
如圖9B中所示及如NHS-OOC-(CH2 )3 -CO-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM所例示製備NHS-OOC-(CH2 )3 -CO-肽-NH-CH2 -S-(CH2 )n -CO2 -DM類型之化合物。
NHS-OOC-(CH2 )3 -CO-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (20g )：將HOOC-(CH2 )3 -CO-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (8 mg，7.5 μmol)溶解於DMSO (1 mL)中，用NHS (0.9 mg，7.51 μmol)及EDC (1.4 mg，7.51 μmol)處理。使反應在室溫下在磁性攪拌下在氬氣氛圍下進行2小時。經由HPLC使用XDB-C18 21.2 × 5 mm 5 μm管柱用含有0.1%甲酸之去離子水及經30分鐘自5%至95%之乙腈線性梯度以20 ml/min溶離來純化粗物質。將含有所要產物之部分合併且立即冷凍，接著凍乾，得到6.5 mg (74%產率)之白色固體。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.71 (s, 3H), 1.00 - 1.14 (m, 13H), 1.14 - 1.25 (m, 3H), 1.29 - 1.46 (m, 5H), 1.52 (s, 3H), 1.75 (p,J = 7.5 Hz, 2H), 1.92 - 2.12 (m, 2H), 2.16 (t,J = 7.3 Hz, 2H), 2.22 - 2.39 (m, 3H), 2.62 (d,J = 10.8 Hz, 5H), 2.73 (d,J = 10.5 Hz, 5H), 3.02 (s, 3H), 3.18 (s, 3H), 3.32 - 3.47 (m, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.95 - 4.19 (m, 6H), 4.45 (dd,J = 12.0, 2.8 Hz, 1H), 5.27 (q,J = 6.8 Hz, 1H), 5.42 - 5.57 (m, 1H), 5.82 - 5.87 (m, 1H), 6.41 - 6.60 (m, 4H), 6.81 (s, 1H), 7.11 (d,J = 1.7 Hz, 1H), 8.05 (d,J = 6.5 Hz, 1H), 8.10 (d,J = 7.7 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 8.29 (t,J = 6.3 Hz, 1H)。
NHS-OOC-(CH2 )3 -CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 ) 5 -CO-DM (20g )：HRMS (M+H)+ 計算值1233.5151，實驗值1233.5135。
NHS-OOC-(CH2 )3 -CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )3 -CO-DM (20i )：HRMS (M+H)+ 計算值1205.4838，實驗值1205.4808。9. Mal-(CH2 )3 -CO- 肽 -NH-CH2 -S-(CH2 )n -CO-DM ( 化合物 23a -23j)
如圖9B中所示及如化合物23c所例示製備化合物23a-23j。
Mal-(CH2 )3 -CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM 或 Mal-LDL-DM (23c )：將H2 N-L-Ala-D-Ala-L-Ala-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-DM (8 mg，7.82 μmol)溶解於DMF (2 mL)中，用3-順丁烯二醯亞胺基丙酸(1.32 mg，7.82 μmol)、EDC (2.25 mg，0.012 mmol)及HOBt (1.198 mg，7.82 μmol)處理。使反應在室溫下在磁性攪拌下在氬氣氛圍下進行2小時。經由半製備型HPLC使用XDB-C18 21.2 × 5 mm 5 μm用含有0.1%甲酸之去離子水及經30分鐘自5%至95%之乙腈線性梯度以20 ml/min溶離來純化粗物質。將含有所要產物之部分立即合併且冷凍，接著凍乾，得到1.8 mg (19.60%產率)之白色固體。HRMS (M+H)+ 計算值1173.4940，實驗值1173.4931。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.71 (s, 3H), 1.02 - 1.14 (m, 15H), 1.16 - 1.25 (m, 3H), 1.30 - 1.44 (m, 5H), 1.52 (s, 3H), 1.92 - 2.03 (m, 1H), 2.03 - 2.17 (m, 1H), 2.23 - 2.39 (m, 4H), 2.63 (s, 3H), 2.73 (d,J = 9.6 Hz, 1H), 3.02 (s, 3H), 3.18 (s, 4H), 3.33 - 3.46 (m, 2H), 3.52 (t,J = 7.3 Hz, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.95 - 4.17 (m, 7H), 4.45 (dd,J = 12.0, 2.9 Hz, 1H), 5.27 (q,J = 6.7 Hz, 1H), 5.44 - 5.56 (m, 1H), 5.85 (s, 1H), 6.39 - 6.64 (m, 3H), 6.81 (s, 1H), 6.86 (s, 1H), 6.92 (s, 2H), 7.11 (d,J = 1.7 Hz, 1H), 7.89 (d,J = 7.4 Hz, 1H), 8.10 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 8.17 (d,J = 6.7 Hz, 1H), 8.28 (t,J = 6.3 Hz, 1H), 8.43 (s, 1H)。10. 其他化合物 Mal2-LAla-D-Ala-L-Ala-Imm-C6-May
Mal-C5-L-Ala-D-Ala-L-Ala-Imm-C6-May ：L-Ala-D-Ala-L-Ala-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-MayNMA (化合物I-1a) (25 mg，0.024 mmol)與6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(7.54 mg，0.024 mmol)之間的反應得到Mal-C5-L-Ala-D-Ala-L-Ala-Imm-C6-May (化合物I-2a) (20.8 mg，0.017 mmol，70.0%產率)。LRMS (M+H)+ 計算值1215.52，實驗值1216.4。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 0.71 (s, 3H), 1.05 (d,J = 6.4 Hz, 3H), 1.07 - 1.14 (m, 14H), 1.15 - 1.25 (m, 3H), 1.39 (t,J = 9.2 Hz, 10H), 1.52 (s, 3H), 2.01 (t,J = 7.6 Hz, 3H), 2.26 (t,J = 1.9 Hz, 1H), 2.28 - 2.38 (m, 2H), 2.57 - 2.62 (m, 1H), 2.63 (s, 3H), 2.73 (d,J = 9.6 Hz, 1H), 3.02 (s, 3H), 3.14 (d,J = 12.5 Hz, 1H), 3.18 (s, 3H), 3.29 (t,J = 7.1 Hz, 2H), 3.36 (d,J = 12.5 Hz, 1H), 3.42 (d,J = 9.0 Hz, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.96 - 4.05 (m, 1H), 4.04 - 4.15 (m, 4H), 4.41 - 4.48 (m, 1H), 5.27 (q,J = 6.7 Hz, 1H), 5.46 - 5.54 (m, 1H), 5.82 - 5.88 (m, 1H), 6.47 - 6.50 (m, 2H), 6.54 (t,J = 11.4 Hz, 2H), 6.82 (s, 1H), 6.92 (s, 2H), 7.11 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 7.86 - 7.93 (m, 2H), 7.95 (s, 1H), 8.05 (d,J = 7.4 Hz, 1H), 8.24 (t,J = 6.2 Hz, 1H)。Mal-(CH2 )2 -PEG2 -CO-L-Ala-D-Ala-L-ALa-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-MayNMA Mal-(CH2 )2 -PEG2 -CO-L-Ala-D-Ala-L-ALa-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-MayNMA ：
L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-MayNMA (化合物I-1a) (25 mg，0.024 mmol)與Mal-醯胺基-PEG2 -NHS (10.40 mg，0.024 mmol)之間的反應得到Mal-(CH2)2 -PEG2 -CO2-L-Ala-D-Ala-L-ALa-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-MayNMA (化合物I-3a) (14.1 mg，10.58 μmol，43.3%產率)。LRMS (M+H)+ 計算值1332.58，實驗值1332.95。
1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 0.71 (s, 4H), 1.05 (d,J = 6.3 Hz, 4H), 1.07 - 1.14 (m, 15H), 1.18 (d,J = 9.0 Hz, 2H), 1.37 (d,J = 11.8 Hz, 6H), 1.52 (s, 3H), 2.23 - 2.38 (m, 5H), 2.63 (s, 4H), 2.72 (d,J = 9.7 Hz, 1H), 3.02 (s, 3H), 3.07 (q,J = 5.7 Hz, 2H), 3.18 (s, 3H), 3.39 (s, 4H), 3.41 (d,J = 9.9 Hz, 2H), 3.47 - 3.56 (m, 4H), 3.86 (s, 4H), 3.95 - 4.08 (m, 2H), 4.08 - 4.19 (m, 3H), 4.41 - 4.51 (m, 1H), 5.23 - 5.31 (m, 1H), 5.44 - 5.54 (m, 1H), 5.85 (s, 1H), 6.46 - 6.50 (m, 2H), 6.54 (t,J = 11.3 Hz, 2H), 6.83 (s, 1H), 6.93 (s, 2H), 7.12 (s, 1H), 7.88 - 8.00 (m, 2H), 8.01 - 8.08 (m, 2H), 8.27 (t,J = 6.2 Hz, 1H)。Mal-(CH2 )2 -PEG4 -CO-L-Ala-D-Ala-L-ALa-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-MayNMA Mal-(CH2 )2 -PEG4 -CO2 -L-Ala-D-Ala-L-ALa-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-MayNMA ：
L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-MayNMA (化合物I-1a) (25 mg，0.024 mmol)與Mal-醯胺基-PEG4-NHS (12.55 mg，0.024 mmol)之間的反應得到Mal-(CH2 )2 -PEG4 -CO2-L-Ala-D-Ala-L-ALa-NH-CH2 -S-(CH2 )5 -CO-MayNMA Mal-PEG4-CO2-C6-LDL-DM (化合物I-3b) (22.3 mg，0.016 mmol，64.2%產率)。
LRMS (M+H)+ 計算值1420.63，實驗值1420.06
1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 0.71 (s, 4H), 1.05 (d,J = 6.4 Hz, 3H), 1.07 - 1.16 (m, 14H), 1.19 (t,J = 8.1 Hz, 2H), 1.31 - 1.50 (m, 2H), 1.52 (s, 4H), 1.98 (s, 1H), 2.02 - 2.17 (m, 2H), 2.20 - 2.40 (m, 7H), 2.63 (s, 4H), 2.73 (d,J = 9.6 Hz, 1H), 3.02 (s, 3H), 3.05 - 3.12 (m, 2H), 3.18 (s, 3H), 3.28 - 3.36 (m, 1H), 3.37 - 3.45 (m, 15H), 3.47 - 3.57 (m, 4H), 3.86 (s, 4H), 3.94 - 4.08 (m, 2H), 4.12 (ddt,J = 14.5, 7.3, 3.6 Hz, 4H), 4.41 - 4.49 (m, 1H), 5.27 (q,J = 6.7 Hz, 1H), 5.45 - 5.55 (m, 1H), 5.86 (s, 1H), 6.42 - 6.60 (m, 4H), 6.83 (s, 1H), 6.94 (s, 1H), 7.12 (d,J = 1.8 Hz, 1H), 7.89 - 8.00 (m, 2H), 8.00 - 8.09 (m, 2H), 8.26 (t,J = 6.2 Hz, 1H)。實施例 11 製備抗 ADAM9 抗體之離胺酸連接之 DM 接合物 a. 製備 hMAB-A(2I. 2)-sSPDB-DM4
hMAB-A(2I.2)為具有SEQ ID NO:68之輕鏈序列及具有SEQ ID NO:52 (SEQ ID NO:52中之X為K)之重鏈序列的人源化/最佳化抗體。
為製備hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4接合物，以逐步方式進行磺基-SPDB (sSPDB)及DM4加成。首先，將含有在pH 8.1下用50 mM 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪丙烷磺酸(EPPS)、50 mM氯化鈉緩衝之hMAB-A(2I.2)抗體之溶液與來自DMA儲備溶液之DMA及11.5當量sSPDB混合，以使得最終溶劑組成為10% (v/v) DMA及90% (v/v)水性緩衝液。使第一反應步驟在25℃下進行4小時後，將來自DMA儲備溶液之17.3當量DM4、DMA及500 mM EPPS/500 mM氯化鈉pH 8.1緩衝液添加至反應混合物中，以使得維持來自第一反應步驟之10% (v/v) DMA及90% (v/v)水性緩衝液之最終溶劑組成。使第二反應步驟在25℃下進行隔夜。
將接合物經Sephadex G-25脫鹽管柱純化至10 mM丁二酸鹽、250 mM甘胺酸、0.5%蔗糖、0.01% Tween-20 (pH 5.5)中，使用具有10 kDa分子量截止之膜以此種緩衝液透析，且經0.22 μm針筒過濾器過濾。
接合物具有藉由UV-vis分析之3.5 mol DM4/mol抗體之平均值、藉由SEC分析之99.2%單體及藉由混合模式HPLC分析之≤ 1.7%未接合DM4。未示出脫糖基化接合物之LC-MS。b. 製備 hMAB-A(2I. 2)-S442C-Mal-LDL-DM
hMAB-A(2I.2)-S442C為具有SEQ ID NO:68之輕鏈序列及SEQ ID NO: 142 (其中X為K)之重鏈序列的人源化/最佳化抗體。
使用標準程序製備處於還原狀態中之帶有兩個未配對半胱胺酸殘基(在重鏈CH3區之C442位置處)之hMAB-A(2I.2)-S442C抗體，且純化至磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) pH 7.4、2 mM EDTA中。還原及再氧化之抗體溶液立即用於接合至Mal-LDL-DM (化合物17a)。
向再氧化之hMAB-A(2I.2)-S442C抗體外加PBS pH 6.0、2 mM EDTA，且在含10% N-N-二甲基乙醯胺(DMA，SAFC)及5當量Mal-LDL-DM (化合物17a)之90%水溶液中進行接合。將反應物在25℃下培育隔夜。
反應後，使用NAP脫鹽管柱(GE Healthcare)將接合物純化至10 mM乙酸鹽、9%蔗糖、0.01% Tween-20、pH 5.0調配緩衝液中，且經具有0.22 μm PVDF膜之針筒過濾器過濾。
發現經純化之接合物具有藉由UV-Vis分析之2.1 mol LDL-DM/mol抗體、藉由SEC分析之95%單體及藉由SEC/逆相HPLC雙管柱分析之低於1%游離藥物。c. 製備 hMAB-A(2I. 2)-sGMBS-LDL-DM ， 3.1 DAR
在接合之前，藉由在丁二酸鹽緩衝液pH 5.0存在下將sGMBS (圖9C)於N-N-二甲基乙醯胺(DMA，SAFC)中之儲備溶液與LDL-DM (化合物14c，圖9A中)於DMA中之儲備溶液混合以獲得60:40有機溶液:水溶液及3 mM磺基-GMBS與3.9 mM LDL-DM之最終濃度來製備sGMBS-LDL-DM。將反應物在25℃下培育2小時。將粗sGMBS-LDL-DM混合物添加至含有hMAB-A(2I.2)抗體於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) pH 7.4中之溶液中，外加300 mM 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪丙烷磺酸(EPPS) pH 8.5及10% DMA (v/v)之5×溶液至7.8 mol磺基-GMBS-LDL-DM與1 mol hMAB-A (2I.2)抗體之最終比率。將反應物在25℃下培育隔夜。
使用NAP脫鹽管柱(GE Healthcare)將反應物純化至10 mM組胺酸、250 mM甘胺酸、1%蔗糖、0.01% Tween20、pH 5.5調配緩衝液中，且經具有0.22 μm PVDF膜之針筒過濾器過濾。
發現經純化之接合物具有藉由UV-Vis分析之3.1 mol LDL-DM/mol抗體、藉由SEC分析之97%單體及藉由SEC/逆相HPLC雙管柱分析之低於4%游離藥物。d. 製備 hMAB-A(2I. 2)-sGMBS-LDL-DM ， 2.0 DAR
在接合之前，藉由在丁二酸鹽緩衝液pH 5.0存在下將sGMBS於N-N-二甲基乙醯胺(DMA，SAFC)中之儲備溶液與LDL-DM (化合物14c，圖9A中)於DMA中之儲備溶液混合以獲得60/40有機溶液/水溶液及3 mM磺基-GMBS與3.9 mM LDL-DM之最終濃度來製備sGMBS-LDL-DM。將反應物在25℃下培育2小時。將粗sGMBS-LDL-DM混合物添加至含有hMAB-A(2I.2)抗體於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) pH 7.4中之溶液中，外加300 mM 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪丙烷磺酸(EPPS) pH 8.5及10% DMA (v/v)之5×溶液至3 mol sGMBS-LDL-DM與1 mol hMAB-A (2I.2)抗體之最終比率。將反應物在25℃下培育隔夜。
使用NAP脫鹽管柱(GE Healthcare)將反應物純化至10 mM乙酸鹽、9%蔗糖、0.01% Tween20、pH 5.0調配緩衝液中，且經具有0.22 μm PVDF膜之針筒過濾器過濾。
發現經純化之接合物具有藉由UV-Vis分析之2.0 mol LDL-DM/mol抗體、藉由SEC分析之99%單體及藉由SEC/逆相HPLC雙管柱分析之低於1%游離藥物。e. 製備 hMAB-A(2I. 2)(YTE/C/-K)-Mal-LDL-DM
hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K)為具有SEQ ID NO:68之輕鏈序列及SEQ ID NO:156之重鏈序列的人源化抗體。
使用標準程序製備處於還原狀態中之帶有兩個未配對半胱胺酸殘基(在重鏈CH3區之C442位置處)之hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K)抗體，且純化至磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) pH 7.4、2 mM EDTA中。還原及再氧化之抗體溶液立即用於接合至Mal-LDL-DM。
向再氧化之hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K)抗體外加PBS pH 6.0、2 mM EDTA，且在含10% N-N-二甲基乙醯胺(DMA，SAFC)及5當量Mal-LDL-DM (化合物17a)之90%水溶液中進行接合。將反應物在25℃下培育隔夜。
反應後，使用NAP脫鹽管柱(GE Healthcare)將接合物純化至10 mM乙酸鹽、9%蔗糖、0.01% Tween-20、pH 5.0調配緩衝液中，且經具有0.22 μm PVDF膜之針筒過濾器過濾。
發現經純化之接合物具有藉由UV-Vis分析之2.0 mol LDL-DM/mol抗體、藉由SEC分析之99%單體及藉由SEC/逆相HPLC雙管柱分析之低於5%游離藥物。f. 製備 hMAB-A(2I. 2)(YTE/-K)-sGMBS-LDL-DM
hMAB-A(2I.2)(YTE/-K)抗體為具有SEQ ID NO:68之輕鏈序列及SEQ ID NO:155之重鏈序列的人源化抗體。
在接合之前，藉由在丁二酸鹽緩衝液pH 5.0存在下將磺基-GMBS於N-N-二甲基乙醯胺(DMA，SAFC)中之儲備溶液與LDL-DM於DMA中之儲備溶液混合以獲得60:40有機溶液:水溶液及3 mM 磺基-GMBS與3.9 mM LDL-DM (化合物14c)之最終濃度來製備sGMBS-LDL-DM。將反應物在25℃下培育2小時。將粗sGMBS-LDL-DM混合物添加至含有hMAB-A(2I.2)(YTE/-K)抗體於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) pH 7.4中之溶液中，外加300 mM 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪丙烷磺酸(EPPS) pH 8.5及10% DMA (v/v)之5×溶液至5 mol sGMBS-LDL-DM與1 mol hMAB-A(2I.2)(YTE/-K)抗體之最終比率。將反應物在25℃下培育隔夜。
使用NAP脫鹽管柱(GE Healthcare)將反應物純化至10 mM乙酸鹽、9%蔗糖、0.01% Tween20、pH 5.0調配緩衝液中，且經具有0.22 μm PVDF膜之針筒過濾器過濾。
發現經純化之接合物具有藉由UV-Vis分析之3.6 mol LDL-DM/mol抗體、藉由SEC分析之99%單體及藉由SEC/逆相HPLC雙管柱分析之低於4%游離藥物。實施例 12 抗 ADAM9 抗體藥物接合物之結合親和力
為評價接合對抗原結合之影響，藉由對內源表現人類ADAM9之NCI-H1703細胞進行FACS分析來確定各抗ADAM9 ADC及其各別未接合之抗體對ADAM9之相對結合親和力。簡言之，將表現ADAM9之NCI-H1703細胞與抗ADAM9抗體或ADC之稀釋系列一起在4℃下在FACS緩衝液(PBS、0.1% BSA、0.01% NaN3)中培育30分鐘。接著洗滌樣品，且與螢光標記之二級抗體一起在4℃下培育30分鐘。繪製在各濃度下螢光強度之正規化平均值，且使用非線性回歸分析(GraphPad Prism 7.0)計算結合之EC50。來自此等研究之結果概述於表14中。
所有抗ADAM9抗體及ADC以類似親和力結合至人類ADAM9，藉由流動式細胞量測術量測之EC50 為約0.3 nM，指示接合不明顯改變抗體結合親和力，圖10。表 14. 實施例 13 抗 ADAM9 抗體藥物接合物之試管內細胞毒性
將使用LDL-DM連接子/有效負荷之抗ADAM9 ADC對抗三個表現ADAM9之肺癌細胞系之試管內細胞毒性與非靶向IgG1 ADC或首先用未接合之抗體阻斷之細胞相比較。包括使用DM4有效負荷之抗ADAM9 ADC以供比較。特定而言，在處理前24小時將500至2000個細胞/孔塗於96孔盤中。使用3倍稀釋系列將接合物稀釋至培養基中且每孔添加100 μL。在各檢定盤中包括含有細胞但缺乏接合物之對照孔以及僅含培養基之孔。對於各資料點一式三份進行檢定。將盤在37℃下在加濕5% CO2 培育箱中培育5天。接著使用基於WST-8之細胞計數套組-8確定各孔中活細胞之相對數目。藉由首先校正培養基背景吸光度，接著用各值除以對照孔(未處理細胞)中之值的平均值來計算各孔中細胞之存活分數。針對接合物濃度繪製存活細胞之百分比，且使用非線性回歸分析(GraphPad Prism 7.0)計算活性之EC50 。此等結果示於表15及圖11A與11B中。LDL-DM接合物為強效的且與DM4接合物相比顯示更大特異性窗口。表 15 實施例 14 帶有 Calu-3 人類非小細胞肺腺癌異種移植物之 SCID 小鼠中抗 ADAM9 抗體藥物接合物之抗腫瘤活性
在帶有Calu-3細胞之雌性SCID小鼠，亦即人類肺腺癌異種移植模型中評價50 μg/kg DM (類美登素)有效負荷之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (3.6 DAR)、hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (3.3 DAR)、hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)、hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (1.9 DAR)、hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-SPBD-DM4 (1.8 DAR)及hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)接合物之抗腫瘤活性。免疫接合物hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-SPBD-DM4包含經由Mal-SPDB連接子偶合至DM4之hMAB-A(2I.2)-S442C抗體：(Mal-SPDB)。
收集Calu-3細胞用於接種，藉由錐蟲藍排除法確定具有100%活力。將小鼠用含5 × 106個Calu-3細胞之0.2 ml 50%基質膠(Matrigel)/50%無血清培養基藉由皮下注射於右後脇上之區域中而接種。獲得八十八隻雌性CB.17 SCID小鼠(6週齡)。接收後，在研究起始之前觀測動物7天。動物在到達後或在處理前顯示無疾病或疾患徵象。
將五十六隻小鼠按腫瘤體積隨機分成7組(每組8隻小鼠)。腫瘤體積在78.92至123.62 (98.60 ± 12.90，平均值 ± SD) mm3之範圍內。在植入後第7天量測小鼠且基於腫瘤體積隨機分組。在植入後第7天(12/19/17)向小鼠給藥。小鼠體重在16.99至21.57 (18.89 ± 0.93，平均值 ± SD)公克之範圍內。藉由打孔法鑑別各組中之小鼠。藉由使用配備有27號½吋針之1.0 ml注射器靜脈內投予測試劑及媒劑。在50 μg/kg DM有效負荷下每天一次給予抗體藥物接合物測試劑，該有效負荷對於DAR約3.5之接合物為約2.5 mg/kg抗體且對於DAR約2.0之接合物為約4.3 mg/kg抗體。組包括：給予媒劑(PBS，150 μL)之對照組、2.6 mg/kg抗體之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (3.6 DAR)、2.9 mg/kg抗體之hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (3.3 DAR)、4.3 mg/kg抗體之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)、5.1 mg/kg抗體之hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (1.9 DAR)、5.3 mg/kg抗體之hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-SPBD-DM4 (1.8 DAR)及5.3 mg/kg抗體之hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)。
使用測徑器在三個維度上每週兩次量測腫瘤尺寸。腫瘤體積以mm3為單位使用公式體積 = 長度 × 寬度 × 高度 × ½表示。當腫瘤體積減小50%或50%以上時小鼠視為具有部分消退(PR)，當不可偵測到可觸知之腫瘤時視為具有完全腫瘤消退(CR)，且若在研究結束時未偵測到可觸知之腫瘤則視為無腫瘤存活者(TFS)。由StudyLog軟體確定腫瘤體積。
腫瘤生長抑制(%T/C)為在預定時間(例如，當對照腫瘤之中位數TV達到約1000 mm3 之最大腫瘤體積之時間，此時對小鼠施以無痛致死術)，處理組(T)之中位數腫瘤體積(TV)與對照組(C)之中位數TV之比率。在接種後第58天計算%T/C，此時對照組之中位數TV達到953 mm3 。根據NCI標準，T/C ≤42%為抗腫瘤活性之最低水準且T/C ＜10%視為高抗腫瘤活性水準。腫瘤生長延遲(T-C)為處理組(T)與對照組腫瘤(C)達到1000 mm3 (不包括無腫瘤存活者)之預定尺寸之中位數時間(天數)之間的差異。腫瘤倍增時間(Td)自對照腫瘤生長之每日中位數之非線性指數曲線擬合估算且由StudyLog軟體確定。Td為16.9天，其中R2 = 0.998。Log10細胞殺傷(LCK)用公式LCK = (T - C) / Td × 3.32計算，其中3.32為每個對數細胞生長之細胞倍增數目。關於LCK之南方研究所(Southern Research Institute，SRI)活性準則為＜0.7：- (非活性)，0.7-1.2：+，1.3-1.9：++，2.0-2.8：+++，＞2.8：++++ (高度活性)。
每週兩次量測所有小鼠之體重(BW)作為藥物毒性之粗略指標且由StudyLog軟體確定。小鼠體重以自處理前體重之體重百分比變化如下表示：% BW變化 = [(BW後 / BW前) - 1] × 100，其中BW後為處理後體重且BW前為處理前之初始體重。百分比體重損失(BWL)以處理後體重之平均變化表示。若在研究期間之任何時間，腫瘤體積變得大於1000 mm3 ，腫瘤變得壞死，小鼠損失＞其初始體重之20%，或小鼠變得瀕死，則對動物施以無痛致死術。
研究結果示於圖12中。LDL-DM ADC全部比其SPDB-DM4對應物更具活性。hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (3.6 DAR)接合物具有30% (活性)之腫瘤生長抑制(T/C)值、34天之腫瘤生長延遲(T-C)值及6.7 (++++)之log10細胞殺傷(LCK)值，其中8隻小鼠中之1隻部分腫瘤消退且無完全消退。hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (3.3 DAR)接合物具有7% (高度活性)之T/C值、＞66天之T-C值及＞13.0 (++++)之LCK值，其中8隻小鼠中之6隻部分腫瘤消退且無完全消退。此證明hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM在約3.5 DAR下比hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4更具活性。hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)具有58% (非活性)之T/C值、20天之T-C值及4.0 (++++)之LCK值，其中8隻小鼠中之0隻部分腫瘤消退且無完全消退。hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (1.9 DAR)具有15% (活性)之T/C值、47天之T-C值及9.2 (++++)之LCK值，其中8隻小鼠中之6隻部分腫瘤消退且1隻完全消退。此證明hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM在約2.0 DAR下比hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4更具活性。hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-SPBD-DM4 (1.8 DAR)具有97% (非活性)之T/C值、3天之T-C值及0.6 (-)之LCK值，其中8隻小鼠中之0隻部分腫瘤消退且無完全消退。hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)具有15% (活性)之T/C值、39天之T-C值及7.7 (++++)之LCK值，其中8隻小鼠中之6隻部分腫瘤消退且2隻完全消退。此證明hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM在DAR約2.0下以位點特異性接合比hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-SPBD-DM4更具活性。在所指示之劑量下用ADC中之任一者未觀測到顯著體重損失，且因此所有六種接合物在此研究中在小鼠中耐受良好。
另外，DAR約2.0之ADC與DAR約3.5之其對應物具可比活性。特定而言，hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (3.3 DAR)與hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (1.9 DAR)及hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)活性大約相同。因為耐受性及毒性由有效負荷濃度確定，所以可在比具有DAR 3.5之ADC更高之抗體濃度下給予具有DAR 2.0之ADC。DAR 2.0 ADC之增加暴露可藉由使標靶介導之藥物處置(TMDD)飽和及/或增加腫瘤滲透來改良功效。來自此研究之結果表明，hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)接合物展示引人注目之抗腫瘤活性且在Calu-3非小細胞肺腺癌腫瘤異種移植模型中高度有效。實施例 15 帶有 H1703 人類非小細胞肺鱗狀細胞癌異種移植物之裸小鼠中抗 ADAM9 抗體藥物接合物之抗腫瘤活性
在帶有H1703細胞之雌性裸小鼠，亦即人類非小細胞肺鱗狀細胞癌異種移植模型中評價50 μg/kg DM有效負荷之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (3.6 DAR)、hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (3.3 DAR)、hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)、hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (1.9 DAR)、hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-SPBD-DM4 (1.8 DAR)及hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)接合物之抗腫瘤活性。
收集H1703細胞用於接種，藉由錐蟲藍排除法確定具有100%活力。將小鼠用含5 × 106個H1703細胞之0.2 ml 50%基質膠/50%無血清培養基藉由皮下注射於右後脇上之區域中而接種。獲得六十六隻雌性無胸腺裸Foxn1nu小鼠(6週齡)。接收後，在研究起始之前觀測動物3天。動物在到達後或在處理前顯示無疾病或疾患徵象。
將四十二隻小鼠按腫瘤體積隨機分成7組(每組6隻小鼠)。腫瘤體積在61.84至310.17 (128.05 ± 46.61，平均值 ± SD) mm3 之範圍內。在植入後第26天量測小鼠且基於腫瘤體積隨機分組。在植入後第27天(12/28/17)向小鼠給藥。小鼠體重在19.69至26.59 (23.54 ± 1.61，平均值 ± SD)公克之範圍內。藉由打孔法鑑別各組中之小鼠。藉由使用配備有27號½吋針之1.0 ml注射器靜脈內投予測試劑及媒劑。在50 μg/kg DM有效負荷下每天一次給予抗體藥物接合物測試劑，該有效負荷對於DAR約3.5之接合物為約2.5 mg/kg抗體且對於DAR約2.0之接合物為約4.3 mg/kg抗體。組包括：給予媒劑(PBS，150 μL)之對照組、2.6 mg/kg抗體之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (3.6 DAR)、2.9 mg/kg抗體之hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (3.3 DAR)、4.3 mg/kg抗體之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)、5.1 mg/kg抗體之hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (1.9 DAR)、5.3 mg/kg抗體之hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-SPBD-DM4 (1.8 DAR)及5.3 mg/kg抗體之hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)。
使用測徑器在三個維度上每週兩次量測腫瘤尺寸。腫瘤體積以mm3 為單位使用公式體積 = 長度 × 寬度 × 高度 × ½表示。當腫瘤體積減小50%或50%以上時小鼠視為具有部分消退(PR)，當不可偵測到可觸知之腫瘤時視為具有完全腫瘤消退(CR)，且若在研究結束時未偵測到可觸知之腫瘤則視為無腫瘤存活者(TFS)。由StudyLog軟體確定腫瘤體積。
腫瘤生長抑制(%T/C)為在預定時間(例如，當對照腫瘤之中位數TV達到約1000 mm3 之最大腫瘤體積之時間，此時對小鼠施以無痛致死術)，處理組(T)之中位數腫瘤體積(TV)與對照組(C)之中位數TV之比率。在接種後第44天計算%T/C，此時對照組之中位數TV達到1206 mm3 。根據NCI標準，T/C ≤42%為抗腫瘤活性之最低水準且T/C ＜10%視為高抗腫瘤活性水準。腫瘤生長延遲(T-C)為處理組(T)與對照組腫瘤(C)達到1000 mm3 (不包括無腫瘤存活者)之預定尺寸之中位數時間(天數)之間的差異。腫瘤倍增時間(Td)自對照腫瘤生長之每日中位數之非線性指數曲線擬合估算且由StudyLog軟體確定。Td為7.60天，其中R2 = 0.994。Log10細胞殺傷(LCK)用公式LCK = (T - C) / Td × 3.32計算，其中3.32為每個對數細胞生長之細胞倍增數目。關於LCK之南方研究所(SRI)活性準則為＜0.7：- (非活性)，0.7-1.2：+，1.3-1.9：++，2.0-2.8：+++，＞2.8：++++ (高度活性)。
每週兩次量測所有小鼠之體重(BW)作為藥物毒性之粗略指標且由StudyLog軟體確定。小鼠體重以自處理前體重之體重百分比變化如下表示：% BW變化 = [(BW後 / BW前) - 1] × 100，其中BW後為處理後體重且BW前為處理前之初始體重。百分比體重損失(BWL)以處理後體重之平均變化表示。若在研究期間之任何時間，腫瘤體積變得大於1000 mm3，腫瘤變得壞死，小鼠損失＞其初始體重之20%，或小鼠變得瀕死，則對動物施以無痛致死術。
研究結果示於圖13中。LDL-DM ADC全部比其SPDB-DM4對應物更具活性。hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (3.6 DAR)接合物具有5% (高度活性)之腫瘤生長抑制(T/C)值、32天之腫瘤生長延遲(T-C)值及1.3 (++)之log10細胞殺傷(LCK)值，其中6隻小鼠中之3隻部分腫瘤消退、1隻完全消退且1隻為無腫瘤存活者。hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (3.3 DAR)接合物具有0% (高度活性)之T/C值、＞85天之T-C值及＞3.4 (++++)之LCK值，其中6隻小鼠中之6隻部分腫瘤消退、6隻完全消退且5隻為無腫瘤存活者。此證明hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM在約3.5 DAR下比hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4更具活性。hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)具有1% (高度活性)之T/C值、＞66天之T-C值及＞2.6 (+++)之LCK值，其中6隻小鼠中之6隻部分腫瘤消退、5隻完全消退且2隻為無腫瘤存活者。hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (1.9 DAR)具有1% (高度活性)之T/C值、64天之T-C值及2.5 (+++)之LCK值，其中6隻小鼠中之6隻部分腫瘤消退、5隻完全消退且1隻為無腫瘤存活者。此證明hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM在約2.0 DAR下比hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4更具活性。hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-SPBD-DM4 (1.8 DAR)具有36% (活性)之T/C值、13天之T-C值及0.5 (-)之LCK值，其中6隻小鼠中之1隻部分腫瘤消退且無完全消退。hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)具有1% (高度活性)之T/C值、38天之T-C值及1.5 (++)之LCK值，其中6隻小鼠中之6隻部分腫瘤消退、5隻完全消退且4隻為無腫瘤存活者。此證明hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM在DAR約2.0下以位點特異性接合比hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-SPBD-DM4更具活性。在所指示之劑量下用ADC中之任一者未觀測到顯著體重損失，且因此所有六種接合物在此研究中在小鼠中耐受良好。
另外，DAR約2.0之ADC與DAR約3.5之其對應物具可比活性。特定而言，hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (3.3 DAR)與hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (1.9 DAR)及hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)活性大約相同。因為耐受性及毒性由有效負荷濃度確定，所以可在比具有DAR 3.5之ADC更高之抗體濃度下給予具有DAR 2.0之ADC。DAR 2.0 ADC之增加暴露可藉由使標靶介導之藥物處置(TMDD)飽和及/或增加腫瘤滲透來改良功效。來自此研究之結果表明，hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)接合物展示引人注目之抗腫瘤活性且在H1703非小細胞鱗狀肺癌腫瘤異種移植模型中高度有效。實施例 16 帶有 SNU-5 人類胃癌異種移植物之裸小鼠中抗 ADAM9 抗體藥物接合物之抗腫瘤活性
在帶有SNU-5細胞之雌性裸小鼠，亦即人類胃癌異種移植模型中評價50 μg/kg DM有效負荷之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (3.6 DAR)、hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (3.3 DAR)、hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)、hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (1.9 DAR)、hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-SPBD-DM4 (1.8 DAR)及hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)接合物之抗腫瘤活性。
收集SNU-5細胞用於接種，藉由錐蟲藍排除法確定具有100%活力。將小鼠用含5 × 106 個SNU-5細胞之0.1 ml 50%基質膠/50%無血清培養基藉由皮下注射於右後脇上之區域中而接種。獲得六十六隻雌性無胸腺裸Foxn1nu小鼠(6週齡)。接收後，在研究起始之前觀測動物6天。動物在到達後或在處理前顯示無疾病或疾患徵象。
將四十二隻小鼠按腫瘤體積隨機分成7組(每組6隻小鼠)。腫瘤體積在61.84至310.17 (128.05 ± 46.61，平均值 ± SD) mm3 之範圍內。在植入後第18天量測小鼠且基於腫瘤體積隨機分組。在植入後第20天(1/7/18)向小鼠給藥。小鼠體重在19.69至26.59 (23.63 ± 1.57，平均值 ± SD)公克之範圍內。藉由打孔法鑑別各組中之小鼠。藉由使用配備有27號½吋針之1.0 ml注射器靜脈內投予測試劑及媒劑。在50 μg/kg DM有效負荷下每天一次給予抗體藥物接合物測試劑，該有效負荷對於DAR約3.5之接合物為約2.5 mg/kg抗體且對於DAR約2.0之接合物為約4.3 mg/kg抗體。組包括：給予媒劑(PBS，150 μL)之對照組、2.6 mg/kg抗體之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (3.6 DAR)、2.9 mg/kg抗體之hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (3.3 DAR)、4.3 mg/kg抗體之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)、5.1 mg/kg抗體之hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (1.9 DAR)、5.3 mg/kg抗體之hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-SPBD-DM4 (1.8 DAR)及5.3 mg/kg抗體之hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)。
使用測徑器在三個維度上每週兩次量測腫瘤尺寸。腫瘤體積以mm3 為單位使用公式體積 = 長度 × 寬度 × 高度 × ½表示。當腫瘤體積減小50%或50%以上時小鼠視為具有部分消退(PR)，當不可偵測到可觸知之腫瘤時視為具有完全腫瘤消退(CR)，且若在研究結束時未偵測到可觸知之腫瘤則視為無腫瘤存活者(TFS)。由StudyLog軟體確定腫瘤體積。
腫瘤生長抑制(%T/C)為在預定時間(例如，當對照腫瘤之中位數TV達到約1000 mm3 之最大腫瘤體積之時間，此時對小鼠施以無痛致死術)，處理組(T)之中位數腫瘤體積(TV)與對照組(C)之中位數TV之比率。在接種後第70天計算%T/C，此時對照組之中位數TV達到1122 mm3 。根據NCI標準，T/C ≤42%為抗腫瘤活性之最低水準且T/C ＜10%視為高抗腫瘤活性水準。腫瘤生長延遲(T-C)為處理組(T)與對照組腫瘤(C)達到1000 mm3 (不包括無腫瘤存活者)之預定尺寸之中位數時間(天數)之間的差異。腫瘤倍增時間(Td)自對照腫瘤生長之每日中位數之非線性指數曲線擬合估算且由StudyLog軟體確定。Td為19.7天，其中R2 = 0.986。Log10細胞殺傷(LCK)用公式LCK = (T - C) / Td × 3.32計算，其中3.32為每個對數細胞生長之細胞倍增數目。關於LCK之南方研究所(SRI)活性準則為＜0.7：- (非活性)，0.7-1.2：+，1.3-1.9：++，2.0-2.8：+++，＞2.8：++++ (高度活性)。
每週兩次量測所有小鼠之體重(BW)作為藥物毒性之粗略指標且由StudyLog軟體確定。小鼠體重以自處理前體重之體重百分比變化如下表示：% BW變化 = [(BW後 / BW前) - 1] × 100，其中BW後為處理後體重且BW前為處理前之初始體重。百分比體重損失(BWL)以處理後體重之平均變化表示。若在研究期間之任何時間，腫瘤體積變得大於1000 mm3 ，腫瘤變得壞死，小鼠損失＞其初始體重之20%，或小鼠變得瀕死，則對動物施以無痛致死術。
研究結果示於圖14中。LDL-DM ADC全部比其SPDB-DM4對應物更具活性。hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (3.6 DAR)接合物具有66% (非活性)之腫瘤生長抑制(T/C)值、0天之腫瘤生長延遲(T-C)值及0.0 (-)之log10細胞殺傷(LCK)值，其中6隻小鼠中之2隻部分腫瘤消退且無完全消退。hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (3.3 DAR)接合物具有14% (活性)之T/C值、45天之T-C值及0.7 (+)之LCK值，其中6隻小鼠中之4隻部分腫瘤消退、1隻完全消退且1隻為無腫瘤存活者。此證明hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM在約3.5 DAR下比hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4更具活性。hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)具有47% (非活性)之T/C值、10天之T-C值及0.2 (-)之LCK值，其中6隻小鼠中之1隻部分腫瘤消退、1隻完全消退且1隻為無腫瘤存活者。hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (1.9 DAR)具有41% (活性)之T/C值、10天之T-C值及0.2 (-)之LCK值，其中6隻小鼠中之2隻部分腫瘤消退、1隻完全消退且1隻為無腫瘤存活者。此證明hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM在約2.0 DAR下比hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4更具活性。hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-SPBD-DM4 (1.8 DAR)具有107% (非活性)之T/C值、-11天之T-C值及-0.2 (-)之LCK值，其中6隻小鼠中之1隻部分腫瘤消退、1隻完全消退且1隻為無腫瘤存活者。hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)具有22% (活性)之T/C值、28天之T-C值及0.4 (-)之LCK值，其中6隻小鼠中之2隻部分腫瘤消退、1隻完全消退且1隻為無腫瘤存活者。此證明hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM在DAR約2.0下以位點特異性接合比hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-SPBD-DM4更具活性。在所指示之劑量下用ADC中之任一者未觀測到顯著體重損失，且因此所有六種接合物在此研究中在小鼠中耐受良好。
另外，DAR約2.0之ADC與DAR約3.5之其對應物具可比活性。特定而言，hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (3.3 DAR)與hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (1.9 DAR)及hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)活性大約相同。因為耐受性及毒性由有效負荷濃度確定，所以可在比具有DAR 3.5之ADC更高之抗體濃度下給予具有DAR 2.0之ADC。DAR 2.0 ADC之增加暴露可藉由使標靶介導之藥物處置(TMDD)飽和及/或增加腫瘤滲透來改良功效。來自此研究之結果表明，hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)接合物展示引人注目之抗腫瘤活性且在SNU-5胃癌腫瘤異種移植模型中有效。實施例 17 帶有 EBC-1 人類非小細胞肺鱗狀細胞癌異種移植物之 SCID 小鼠中抗 ADAM9 抗體藥物接合物之抗腫瘤活性
在帶有EBC-1細胞之雌性SCID小鼠，亦即人類非小細胞肺鱗狀細胞癌異種移植模型中評價25、50及100 μg/kg DM有效負荷之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)及hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (2.1 DAR)接合物之抗腫瘤活性。
收集EBC-1細胞用於接種，藉由錐蟲藍排除法確定具有100%活力。將小鼠用含5 × 106 個EBC-1細胞之0.2 ml 50%基質膠/50%無血清培養基藉由皮下注射於右後脇上之區域中而接種。獲得六十六隻雌性CB.17 SCID小鼠(6週齡)。接收後，在研究起始之前觀測動物6天。動物在到達後或在處理前顯示無疾病或疾患徵象。
將四十二隻小鼠按腫瘤體積隨機分成7組(每組6隻小鼠)。腫瘤體積在79.38至124.29 (95.81 ± 11.83，平均值 ± SD) mm3 之範圍內。在植入後第7天(4/16/18)量測小鼠，基於腫瘤體積隨機分組並給藥。小鼠體重在15.94至21.10 (18.55 ± 1.17，平均值 ± SD)公克之範圍內。藉由打孔法鑑別各組中之小鼠。藉由使用配備有27號½吋針之1.0 ml注射器靜脈內投予測試劑及媒劑。在25、50或100 μg/kg DM有效負荷下每天一次給予抗體藥物接合物測試劑，該有效負荷對於DAR約2.0之接合物為約2、4及9 mg/kg抗體(Ab)。組包括：給予媒劑(PBS，200 μL)之對照組，2.18、4.36及8.76 mg/kg Ab之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)，及2.14、4.28及8.57 mg/kg Ab之hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (2.1 DAR)。
使用測徑器在三個維度上每週兩次量測腫瘤尺寸。腫瘤體積以mm3 為單位使用公式體積 = 長度 × 寬度 × 高度 × ½表示。當腫瘤體積減小50%或50%以上時小鼠視為具有部分消退(PR)，當不可偵測到可觸知之腫瘤時視為具有完全腫瘤消退(CR)，且若在研究結束時未偵測到可觸知之腫瘤則視為無腫瘤存活者(TFS)。由StudyLog軟體確定腫瘤體積。
腫瘤生長抑制(%T/C)為在預定時間(例如，當對照腫瘤之中位數TV達到約1000 mm3 之最大腫瘤體積之時間，此時對小鼠施以無痛致死術)，處理組(T)之中位數腫瘤體積(TV)與對照組(C)之中位數TV之比率。在接種後第28天計算%T/C，此時對照組之中位數TV達到1279 mm3 。根據NCI標準，T/C ≤42%為抗腫瘤活性之最低水準且T/C ＜10%視為高抗腫瘤活性水準。腫瘤生長延遲(T-C)為處理組(T)與對照組腫瘤(C)達到1000 mm3 (不包括無腫瘤存活者)之預定尺寸之中位數時間(天數)之間的差異。腫瘤倍增時間(Td)自對照腫瘤生長之每日中位數之非線性指數曲線擬合估算且由StudyLog軟體確定。Td為6.04天，其中R2 = 0.995。Log10細胞殺傷(LCK)用公式LCK = (T - C) / Td × 3.32計算，其中3.32為每個對數細胞生長之細胞倍增數目。關於LCK之南方研究所(SRI)活性準則為＜0.7：- (非活性)，0.7-1.2：+，1.3-1.9：++，2.0-2.8：+++，＞2.8：++++ (高度活性)。
每週兩次量測所有小鼠之體重(BW)作為藥物毒性之粗略指標且由StudyLog軟體確定。小鼠體重以自處理前體重之體重百分比變化如下表示：% BW變化 = [(BW後 / BW前) - 1] × 100，其中BW後為處理後體重且BW前為處理前之初始體重。百分比體重損失(BWL)以處理後體重之平均變化表示。若在研究期間之任何時間，腫瘤體積變得大於1000 mm3 ，腫瘤變得壞死，小鼠損失＞其初始體重之20%，或小鼠變得瀕死，則對動物施以無痛致死術。
研究結果示於圖15中。LDL-DM ADC比SPDB-DM4對應物更具活性。以25 μg/kg DM (2.18 mg/kg Ab)給予之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)具有17% (活性)之T/C值、21天之T-C值及1.06 (+)之LCK值，其中無腫瘤消退或不存在無腫瘤存活者。以50 μg/kg DM (4.36 mg/kg Ab)給予之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)具有2% (高度活性)之T/C值、34天之T-C值及1.68 (++)之LCK值，其中6隻小鼠中之6隻部分腫瘤消退、1隻完全消退且不存在無腫瘤存活者。以100 μg/kg DM (8.76 mg/kg Ab)給予之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)具有2% (高度活性)之T/C值、＞65天之T-C值及＞3.26 (++++)之LCK值，其中6隻小鼠中之6隻部分腫瘤消退、6隻完全消退且2隻為無腫瘤存活者。以25 μg/kg DM (2.14 mg/kg Ab)給予之hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (2.1 DAR)具有2% (高度活性)之T/C值、56天之T-C值及2.79 (+++)之LCK值，其中6隻小鼠中之6隻部分腫瘤消退、3隻完全消退且不存在無腫瘤存活者。以50 μg/kg DM (4.28 mg/kg Ab)給予之hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (2.1 DAR)具有2% (高度活性)之T/C值、＞65天之T-C值及＞3.26 (++++)之LCK值，其中6隻小鼠中之6隻部分腫瘤消退、6隻完全消退且不存在無腫瘤存活者。以100 μg/kg DM (8.57 mg/kg Ab)給予之hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (2.1 DAR)具有1% (高度活性)之T/C值、＞65天之T-C值及＞3.26 (++++)之LCK值，其中6隻小鼠中之6隻部分腫瘤消退、6隻完全消退且6隻為無腫瘤存活者。在所指示之劑量下用ADC中之任一者未觀測到顯著體重損失，且因此所有六種接合物在此研究中在小鼠中耐受良好。來自此研究之結果表明hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)與hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (2.1 DAR)接合物均展示劑量依賴性抗腫瘤活性且在EBC-1非小細胞肺鱗狀細胞癌腫瘤異種移植模型中有效。實施例 18 帶有 SW48 人類結腸直腸腺癌異種移植物之 CD1 裸小鼠中抗 ADAM9 抗體藥物接合物之抗腫瘤活性
在帶有SW48細胞之雌性CD1裸免疫缺陷小鼠，亦即人類結腸直腸腺癌異種移植模型中評價25、50及100 μg/kg DM有效負荷之hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K)-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)及100 μg/kg DM有效負荷之非結合對照huKTI-Mal-LDL-DM (2.0 DAR)接合物之抗腫瘤活性。
收集SW48 (ATCC CCL-231)細胞用於接種，藉由錐蟲藍排除法確定具有大於90%活力。將小鼠用含5 × 106 個SW48細胞之0.1 ml 50%基質膠/50%無血清培養基藉由皮下注射於右後脇上之區域中而接種。雌性CD1裸小鼠(5-7週齡)獲自Charles Rivers Laboratories。接收後，在研究起始之前觀測動物3-4天。動物在到達後或在處理前顯示無疾病或疾患徵象。
將四十隻小鼠按腫瘤體積隨機分成5組(每組8隻小鼠)。在植入後第19天，腫瘤體積在121.33至186.59 (152.49 ± 18.50，平均值 ± SD) mm3 之範圍內。在植入後第19天量測小鼠且基於腫瘤體積隨機分組，且在第21天給藥。第19天之小鼠體重在18.80至29.90 (25.75 ± 2.50，平均值 ± SD)公克之範圍內。藉由耳標法鑑別各組中之小鼠。藉由使用配備有28號½吋針之0.5 ml注射器尾靜脈注射來靜脈內投予測試劑及媒劑。在25、50或100 μg/kg DM有效負荷下每天一次給予抗體藥物接合物測試劑，該有效負荷對於DAR約2.0之接合物等效於約2、4及9 mg/kg抗體(Ab)。組包括：給予媒劑(1× PBS，100 μL)之對照組，2.18、4.36及8.57 mg/kg Ab之hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K)-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)，及8.57 mg/kg Ab之huKTI-Mal-LDL-DM (2.0 DAR)。
使用電子測徑器藉由正交量測每週一次量測腫瘤尺寸，且一旦向組給藥，即每週兩次量測。腫瘤體積以mm3 為單位使用公式體積 = 長度 × 寬度 × 高度 × ½表示。當腫瘤體積自給藥當天減小50%或50%以上時小鼠視為具有部分消退(PR)，當對於三個至四個連續量測不可偵測到可觸知之腫瘤(≤14.08 mm3 )時視為具有完全腫瘤消退(CR)，且若在研究結束時未偵測到可觸知之腫瘤(≤14.08 mm3 )則視為無腫瘤存活者(TFS)。在Study Director軟體內記錄腫瘤體積。
腫瘤生長抑制(%T/C)為在預定時間(例如，當所有媒劑對照動物仍然在研究中之時間點)，處理組(T)之中位數腫瘤體積(TV)與對照組(C)之中位數TV之比率。在接種後第56天計算%T/C，此時對照組之中位數TV達到663.04 mm3 。根據NCI標準，T/C ≤42%為抗腫瘤活性之最低水準且T/C ＜10%視為抗腫瘤活性之高水準。
在給藥前每週一次量測且在給藥後每週兩次量測所有小鼠之體重(BW)作為藥物毒性之粗略指標且在Study Director軟體內記錄。小鼠體重以自處理前體重之體重百分比變化如下表示：% BW變化 = [(BW後 / BW前) - 1] × 100，其中BW後為處理後體重且BW前為處理前之初始體重。百分比體重損失(BWL)以處理後體重之平均變化表示。若在研究期間之任何時間，腫瘤體積變得大於2000 mm3 ，腫瘤顯示顯著潰瘍或壞死徵象，小鼠損失＞其初始體重之20%，或小鼠變得瀕死，則對動物施以無痛致死術。
研究結果示於圖16中。hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K)-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)在100 μg/kg DM (8.57 mg/kg Ab)之劑量下為高度活性的，其中8/8小鼠部分消退，7/8小鼠完全消退，7/8小鼠為無腫瘤存活者，且%T/C為1%。在50 μg/kg DM (4.36 mg/kg Ab)之劑量水準下，hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K)-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)為活性的，其中5/8小鼠部分消退，2/8小鼠完全消退，2/8小鼠為無腫瘤存活者，且%T/C為15%。hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K)-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)在25 μg/kg DM (2.18 mg/kg Ab)下由NCI標準視為非活性的，其中1/8小鼠部分消退，0/8小鼠完全消退，0/8小鼠為無腫瘤存活者，且%T/C為51%。結果證明hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K)-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)靶向ADAM9，此係因為非結合對照huKTI-Mal-LDL-DM (2.0 DAR)接合物在100 μg/kg DM (8.57 mg/kg Ab)之劑量下為非活性的，其中0/8部分消退，0/8完全消退，0/8為無腫瘤存活者，且%T/C為93%。在所指示之劑量下用ADC中之任一者未觀測到顯著體重損失，且因此所有接合物在此研究中在小鼠中耐受良好。來自此研究之結果表明hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K)-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)接合物展示劑量依賴性靶向抗腫瘤活性且在SW48結腸直腸腺癌異種移植模型中有效。實施例 19 帶有 HPAF-II 人類胰腺癌異種移植物之 CD1 裸小鼠中抗 ADAM9 抗體藥物接合物之抗腫瘤活性
在帶有HPAF-II細胞之雌性CD1裸免疫缺陷小鼠，亦即人類胰腺癌異種移植模型中評價25、50及100 μg/kg DM有效負荷之hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K)-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)及100 μg/kg DM有效負荷之非結合對照huKTI-Mal-LDL-DM (2.0 DAR)接合物之抗腫瘤活性。
收集HPAF-II (ATCC CRL-1997)細胞用於接種，藉由錐蟲藍排除法確定具有大於90%活力。將小鼠用含5 × 106 個HPAF-II細胞之0.1 ml 50%基質膠/50%無血清培養基藉由皮下注射於右後脇上之區域中而接種。雌性CD1裸小鼠(5-7週齡)獲自Charles Rivers Laboratories。接收後，在研究起始之前觀測動物3-4天。動物在到達後或在處理前顯示無疾病或疾患徵象。
將三十五隻小鼠按腫瘤體積隨機分成5組(每組7隻小鼠)。在植入後第15天，腫瘤體積在81.64至136.77 (104.94 ± 13.89，平均值 ± SD) mm3 之範圍內。在植入後第15天量測小鼠且基於腫瘤體積隨機分組，且在第16天給藥。第15天之小鼠體重在21.00至28.60 (25.21 ± 1.70，平均值 ± SD)公克之範圍內。藉由耳標法鑑別各組中之小鼠。藉由使用配備有28號½吋針之0.5 ml注射器尾靜脈注射來靜脈內投予測試劑及媒劑。在25、50或100 μg/kg DM有效負荷下每天一次給予抗體藥物接合物測試劑，該有效負荷對於DAR約2.0之接合物等效於約2、4及9 mg/kg抗體(Ab)。組包括：給予媒劑(1× PBS，100 μL)之對照組，2.18、4.36及8.57 mg/kg Ab之hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K)-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)，及8.57 mg/kg Ab之huKTI-Mal-LDL-DM (2.0 DAR)。
使用電子測徑器藉由正交量測每週一次量測腫瘤尺寸，且一旦向組給藥，即每週兩次量測。腫瘤體積以mm3 為單位使用公式體積 = 長度 × 寬度 × 高度 × ½表示。當腫瘤體積自給藥當天減小50%或50%以上時小鼠視為具有部分消退(PR)，當對於三個至四個連續量測不可偵測到可觸知之腫瘤(≤14.08 mm3 )時視為具有完全腫瘤消退(CR)，且若在研究結束時未偵測到可觸知之腫瘤(≤14.08 mm3 )則視為無腫瘤存活者(TFS)。在Study Director軟體內記錄腫瘤體積。
腫瘤生長抑制(%T/C)為在預定時間(例如，當所有媒劑對照動物仍然在研究中之時間)，處理組(T)之中位數腫瘤體積(TV)與對照組(C)之中位數TV之比率。在接種後第47天計算%T/C，此時對照組之中位數TV達到882.83 mm3 。根據NCI標準，T/C ≤42%為抗腫瘤活性之最低水準且T/C ＜10%視為抗腫瘤活性之高水準。
在給藥前每週一次量測且在給藥後每週兩次量測所有小鼠之體重(BW)作為藥物毒性之粗略指標且在Study Director軟體內記錄。小鼠體重以自處理前體重之體重百分比變化如下表示：% BW變化 = [(BW後 / BW前) - 1] × 100，其中BW後為處理後體重且BW前為處理前之初始體重。百分比體重損失(BWL)以處理後體重之平均變化表示。若在研究期間之任何時間，腫瘤體積變得大於2000 mm3 ，腫瘤顯示顯著潰瘍或壞死徵象，小鼠損失＞其初始體重之20%，或小鼠變得瀕死，則對動物施以無痛致死術。
研究結果示於圖17中。hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K)-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)在100 μg/kg DM (8.57 mg/kg Ab)之劑量下為高度活性的，其中7/7小鼠部分消退，3/7小鼠完全消退，3/7小鼠為無腫瘤存活者，且%T/C為3%。在50 μg/kg DM (4.36 mg/kg Ab)之劑量水準下，hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K)-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)為活性的，其中5/7小鼠部分消退，1/7小鼠完全消退，1/7小鼠為無腫瘤存活者，且%T/C為11%。hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K)-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)在25 μg/kg DM (2.18 mg/kg Ab)下由NCI標準視為非活性的，其中0/7小鼠部分消退，0/7小鼠完全消退，0/7小鼠為無腫瘤存活者，且%T/C為56%。結果證明hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K)-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)靶向ADAM9，此係因為非結合對照huKTI-Mal-LDL-DM (2.0 DAR)接合物在100 μg/kg DM (8.57 mg/kg Ab)之劑量下視為非活性的，其中0/7部分消退，0/7完全消退，0/7為無腫瘤存活者，且%T/C為48%。在所指示之劑量下用ADC中之任一者未觀測到顯著體重損失，且因此所有接合物在此研究中在小鼠中耐受良好。來自此研究之結果表明hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K)-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)接合物展示劑量依賴性靶向抗腫瘤活性且在HPAF-II胰腺癌異種移植模型中有效。實施例 20 帶有 H1975 人類非小細胞肺腺癌異種移植物之裸小鼠中抗 ADAM9 抗體藥物接合物之抗腫瘤活性
在帶有H1975細胞之雌性裸小鼠，亦即人類非小細胞肺腺癌異種移植模型中評價25、50及100 μg/kg DM有效負荷之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)及hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (2.1 DAR)接合物之抗腫瘤活性。
收集H1975細胞用於接種，藉由錐蟲藍排除法確定具有100%活力。將小鼠用含3 x 106 個H1975細胞之0.2 ml 50%基質膠/50%無血清培養基藉由皮下注射於右後脇上之區域中而接種。獲得66隻雌性無胸腺Foxn1nu 小鼠(6週齡)。接收後，在研究起始之前觀測動物7天。動物在到達後或在處理前顯示無疾病或疾患徵象。
將四十二隻小鼠按腫瘤體積隨機分成7組(每組6隻小鼠)。腫瘤體積在79.43至119.61 (92.44 ± 10.36，平均值 ± SD) mm3 之範圍內。在植入後第7天量測小鼠，隨機分組，且基於腫瘤體積給藥(4/10/18)。小鼠體重在18.87至26.30 (22.92 ± 1.50，平均值 ± SD)公克之範圍內。藉由打孔法鑑別各組中之小鼠。藉由使用配備有27號½吋針之1.0 ml注射器靜脈內投予測試劑及媒劑。在25、50或100 μg/kg DM有效負荷下每天一次給予抗體藥物接合物測試劑，該有效負荷對於DAR約2.0之接合物為約2、4及9 mg/kg抗體(Ab)。組包括：給予媒劑(PBS，200 μL)之對照組，2.18、4.36及8.76 mg/kg Ab之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)，及2.14、4.28及8.57 mg/kg Ab之hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (2.1 DAR)。
使用測徑器在三個維度上每週兩次量測腫瘤尺寸。腫瘤體積以mm3 為單位使用公式體積 = 長度 × 寬度 × 高度 × ½表示。當腫瘤體積減小50%或50%以上時小鼠視為具有部分消退(PR)，當不可偵測到可觸知之腫瘤時視為具有完全腫瘤消退(CR)，且若在研究結束時未偵測到可觸知之腫瘤則視為無腫瘤存活者(TFS)。由StudyLog軟體確定腫瘤體積。
腫瘤生長抑制(%T/C)為在預定時間(例如，當對照腫瘤之中位數腫瘤體積(TV)達到約1000 mm3 之最大腫瘤體積之時間，此時對小鼠施以無痛致死術)，處理組(T)之中位數TV與對照組(C)之中位數TV之比率。在接種後第20天計算%T/C，此時對照組之中位數TV達到729 mm3 。根據NCI標準，T/C ≤42%為抗腫瘤活性之最低水準且T/C ＜10%視為高抗腫瘤活性水準。腫瘤生長延遲(T-C)為處理組(T)與對照組腫瘤(C)達到1000 mm3 (不包括無腫瘤存活者)之預定尺寸之中位數時間(天數)之間的差異。腫瘤倍增時間(Td)自對照腫瘤生長之每日中位數之非線性指數曲線擬合估算且由StudyLog軟體確定。Td為3.84天，其中R2 = 0.998。Log10細胞殺傷(LCK)用公式LCK = (T - C) / Td × 3.32計算，其中3.32為每個對數細胞生長之細胞倍增數目。關於LCK之南方研究所(SRI)活性準則為＜0.7：- (非活性)，0.7-1.2：+，1.3-1.9：++，2.0-2.8：+++，＞2.8：++++ (高度活性)。
每週兩次量測所有小鼠之體重(BW)作為藥物毒性之粗略指標且由StudyLog軟體確定。小鼠體重以自處理前體重之體重百分比變化如下表示：% BW變化 = [(BW後 / BW前) - 1] × 100，其中BW後為處理後體重且BW前為處理前之初始體重。百分比體重損失(BWL)以處理後體重之平均變化表示。若在研究期間之任何時間，腫瘤體積變得大於1000 mm3 ，腫瘤變得壞死，小鼠損失＞其初始體重之20%，或小鼠變得瀕死，則對動物施以無痛致死術。
研究結果示於圖18中。LDL-DM ADC比SPDB-DM4 ADC對應物更具活性。以25 μg/kg DM (2.18 mg/kg Ab)給予之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)具有26% (活性)之T/C值、10天之T-C值及0.79 (+)之LCK值，其中無腫瘤消退或不存在無腫瘤存活者。以50 μg/kg DM (4.36 mg/kg Ab)給予之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)具有8% (高度活性)之T/C值、35天之T-C值及2.72 (+++)之LCK值，其中6隻小鼠中之5隻部分腫瘤消退、1隻完全消退且不存在無腫瘤存活者。以100 μg/kg DM (8.76 mg/kg Ab)給予之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)具有7% (高度活性)之T/C值、＞38天之T-C值及＞2.98 (++++)之LCK值，其中6隻小鼠中之6隻部分腫瘤消退、無完全消退且不存在無腫瘤存活者。以25 μg/kg DM (2.14 mg/kg Ab)給予之hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (2.1 DAR)具有6% (高度活性)之T/C值，其中6隻小鼠中之4隻部分腫瘤消退、1隻完全消退且不存在無腫瘤存活者。由於此組中動物之損失，不可計算T-C及LCK值，該損失係由於腫瘤壞死或7%之最低值的體重損失(注射後10天，組中1隻動物由於體重損失＞20%必須被施以無痛致死術)。以50 μg/kg DM (4.28 mg/kg Ab)給予之hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (2.1 DAR)具有4% (高度活性)之T/C值，其中6隻小鼠中之5隻部分腫瘤消退、無完全消退且不存在無腫瘤存活者。由於此組中動物之損失，不可計算T-C及LCK值，該損失係由於35%之最低值的體重損失(注射後20天，此組中之所有動物由於因水袋墜體重損失＞20%而必須被施以無痛致死術)。以100 μg/kg DM (8.57 mg/kg Ab)給予之hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (2.1 DAR)具有6% (高度活性)之T/C值、＞38天之T-C值及＞2.98 (++++)之LCK值，其中6隻小鼠中之6隻部分腫瘤消退、2隻完全消退且2隻為無腫瘤存活者。在所指示之劑量中之任一者下用hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)或在100 µg/kg之最高劑量下用hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (2.1 DAR)未觀測到顯著體重損失，且因此兩種接合物在此研究中在小鼠中耐受良好。來自此研究之結果表明hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)與hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (2.1 DAR)接合物均展示劑量依賴性抗腫瘤活性且在H1975非小細胞肺腺癌腫瘤異種移植模型中有效。實施例 21 帶有 Hs 746T 人類胃癌異種移植物之 SCID 小鼠中抗 ADAM9 抗體藥物接合物之抗腫瘤活性
在帶有Hs 746T細胞之雌性SCID小鼠，亦即人類胃癌異種移植模型中評價25、50及100 μg/kg DM有效負荷之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)及hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (2.1 DAR)接合物之抗腫瘤活性。
收集Hs 746T細胞用於接種，藉由錐蟲藍排除法確定具有100%活力。將小鼠用含5 x 106 個Hs 746T細胞之0.1 ml無血清培養基藉由皮下注射於右後脇上之區域中而接種。獲得60隻雌性CB.17 SCID小鼠(6週齡)。接收後，在研究起始之前觀測動物7天。動物在到達後或在處理前顯示無疾病或疾患徵象。
將四十二隻小鼠按腫瘤體積隨機分成7組(每組6隻小鼠)。腫瘤體積在69.09至136.75 (101.40 ± 19.16，平均值 ± SD) mm3 之範圍內。在植入後第13天量測小鼠，隨機分組，且基於腫瘤體積給藥(7/11/18)。小鼠體重在18.03至23.21 (19.66 ± 1.21，平均值 ± SD)公克之範圍內。藉由打孔法鑑別各組中之小鼠。藉由使用配備有27號½吋針之1.0 ml注射器靜脈內投予測試劑及媒劑。在25、50或100 μg/kg DM有效負荷下每天一次給予抗體藥物接合物測試劑，該有效負荷對於DAR約2.0之接合物為約2、4及9 mg/kg抗體(Ab)。組包括：給予媒劑(PBS，200 μL)之對照組，2.18、4.36及8.76 mg/kg Ab之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)，及2.14、4.28及8.57 mg/kg Ab之hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (2.1 DAR)。
使用測徑器在三個維度上每週兩次量測腫瘤尺寸。腫瘤體積以mm3 為單位使用公式體積 = 長度 × 寬度 × 高度 × ½表示。當腫瘤體積減小50%或50%以上時小鼠視為具有部分消退(PR)，當不可偵測到可觸知之腫瘤時視為具有完全腫瘤消退(CR)，且若在研究結束時未偵測到可觸知之腫瘤則視為無腫瘤存活者(TFS)。由StudyLog軟體確定腫瘤體積。
腫瘤生長抑制(%T/C)為在預定時間(例如，當對照腫瘤之中位數腫瘤體積(TV)達到約1000 mm3 之最大腫瘤體積之時間，此時對小鼠施以無痛致死術)，處理組(T)之中位數TV與對照組(C)之中位數TV之比率。在接種後第25天計算%T/C，此時對照組之中位數TV達到1536 mm3 。根據NCI標準，T/C ≤42%為抗腫瘤活性之最低水準且T/C ＜10%視為高抗腫瘤活性水準。腫瘤生長延遲(T-C)為處理組(T)與對照組腫瘤(C)達到1000 mm3 (不包括無腫瘤存活者)之預定尺寸之中位數時間(天數)之間的差異。腫瘤倍增時間(Td)自對照腫瘤生長之每日中位數之非線性指數曲線擬合估算且由StudyLog軟體確定。Td為3.38天，其中R2 = 0.991。Log10細胞殺傷(LCK)用公式LCK = (T - C) / Td × 3.32計算，其中3.32為每個對數細胞生長之細胞倍增數目。關於LCK之南方研究所(SRI)活性準則為＜0.7：- (非活性)，0.7-1.2：+，1.3-1.9：++，2.0-2.8：+++，＞2.8：++++ (高度活性)。
每週兩次量測所有小鼠之體重(BW)作為藥物毒性之粗略指標且由StudyLog軟體確定。小鼠體重以自處理前體重之體重百分比變化如下表示：% BW變化 = [(BW後 / BW前) - 1] × 100，其中BW後為處理後體重且BW前為處理前之初始體重。百分比體重損失(BWL)以處理後體重之平均變化表示。若在研究期間之任何時間，腫瘤體積變得大於1000 mm3 ，腫瘤變得壞死，小鼠損失＞其初始體重之20%，或小鼠變得瀕死，則對動物施以無痛致死術。
研究結果示於圖19中。LDL-DM ADC比SPDB-DM4 ADC對應物更具活性。以25 μg/kg DM (2.18 mg/kg Ab)給予之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)具有77% (無活性)之T/C值、1天之T-C值及0.12 (-)之LCK值，其中無腫瘤消退或不存在無腫瘤存活者。以50 μg/kg DM (4.36 mg/kg Ab)給予之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)具有67% (無活性)之T/C值、3天之T-C值及0.24 (-)之LCK值，其中無腫瘤消退或不存在無腫瘤存活者。以100 μg/kg DM (8.76 mg/kg Ab)給予之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)具有12% (活性)之T/C值、15天之T-C值及1.35 (++)之LCK值，其中6隻小鼠中之1隻部分腫瘤消退、無完全消退且不存在無腫瘤存活者。以25 μg/kg DM (2.14 mg/kg Ab)給予之hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (2.1 DAR)具有58% (無活性)之T/C值、4天之T-C值及0.33 (-)之LCK值，其中無腫瘤消退或不存在無腫瘤存活者。以50 μg/kg DM (4.28 mg/kg Ab)給予之hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (2.1 DAR)具有26% (活性)之T/C值、12天之T-C值及1.09 (+)之LCK值，其中無腫瘤消退或不存在無腫瘤存活者。以100 μg/kg DM (8.57 mg/kg Ab)給予之hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (2.1 DAR)具有6% (高度活性)之T/C值、29天之T-C值及2.59 (+++)之LCK值，其中6隻小鼠中之4隻部分腫瘤消退、無完全消退且不存在無腫瘤存活者。在所指示之劑量下用ADC中的任一者未觀測到顯著體重損失，且因此所有六種接合物在此研究中在小鼠中耐受良好。來自此研究之結果表明hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)及hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (2.1 DAR)接合物均展示劑量依賴性抗腫瘤活性且在Hs 746T胃癌腫瘤異種移植模型中有效。
本說明書中所提及之所有公開案及專利以引用的方式併入本文中，引用程度如同各個別公開案或專利申請案特定及個別地指示以全文引用的方式併入一般。儘管本發明已結合其特定實施方案加以描述，但應瞭解，能夠進行進一步修改且本申請案欲涵蓋本發明之任何變更、用途或改適，其一般遵循本發明之原理且包括自本揭示案之偏離，該等偏離屬於本發明所屬技術中之已知或習用實踐內且可應用於前文所陳述之基本特徵。
圖 1A-1C 呈現免疫組織化學(IHC)研究之結果且展示MAB-A特異性地標記多種非小細胞肺癌類型( 圖 1A )、乳癌細胞、前列腺癌細胞、胃癌細胞(圖 1B )及結腸癌細胞(圖 1C )之能力，而同型對照未能特異性地標記此等癌細胞類型中之任一者(圖 1A-1C )。
圖 2 呈現細胞染色研究之結果且展示MAB-A結合至在293-FT及CHO-K細胞(分別為上圖及下圖)之表面上短暫表現之人類ADAM9及(在較小程度上)食蟹猴ADAM9。
圖 3A-3B 描繪與MAB-A之若干人源化/最佳化變異體比對之鼠類抗ADAM9-VH結構域(圖 3A ， SEQ ID NO:7 、 16 、 17 、 18 、 19 、 21 、 22 、 23 及28 )及與MAB-A之若干人源化/最佳化變異體比對之鼠類抗ADAM9-VL結構域(圖 3B ， SEQ ID NO:11 、 54 、 55 、 56 及57 )的胺基酸序列。在初始最佳化期間在CDR內取代之位置如下加下劃線：潛在脫醯胺及異構化位點以單下劃線指示，離胺酸殘基以雙下劃線指示，額外不穩定殘基以虛下劃線指示。
圖 4A-4B 呈現包含CDRH 3變異體、親本hMAB-A (2.2)及同型對照抗體之十個所選最佳化hMAB-A純系之ELISA結合曲線。圖 4A 呈現cynoADAM9之結合曲線且圖 4B 呈現huADAM9之結合曲線。
圖 5A-5B 呈現Fc變異體之ELISA結合曲線。圖 5A 呈現huADAM9之結合曲線且圖 5B 呈現cynoADAM9之結合曲線。
圖 6A-6B 分別展示20種癌瘤組織微陣列中之ADAM9 IHC膜染色及八個所選適應症中之ADAM IHC膜及細胞質染色。
圖 7A-7B 展示各種抗ADAM9抗體接合物之脈衝內化及連續內化。
圖 8A 展示在pH 6.0下250 nM及1000 nM huFcRn與具有及不具有YTE突變之經捕獲之抗ADAM9抗體的結合。
圖 8B 展示在pH 6.0下具有及不具有YTE突變之25 nM及100 nM抗ADAM9抗體與經固定之FcRn的結合。
圖 9A 、9B 及9C 展示用於製備本發明之例示性類美登素化合物及免疫接合物之合成流程。
圖 10 展示hMAB-A(2I.2)、hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4、hMAB-A(2I.2)(YTE/-K)-LDL-DM及hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K)-LDL-DM之FACS結合曲線。
圖 11A 及11B 展示各種抗ADAM9免疫接合物對抗各種非小細胞肺癌細胞系之試管內細胞毒性。基於非靶向IgG1之接合物作為陰性對照包括在內。
圖 12 展示在Calu-3人類非小細胞肺腺癌異種移植模型中hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (3.6 DAR)、hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (3.3 DAR)、hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)、hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (1.9 DAR)、hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-SPBD-DM4 (1.8 DAR)及hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)之抗腫瘤活性。
圖 13 展示在H1703人類非小細胞肺鱗狀細胞癌異種移植物中hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (3.6 DAR)、hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (3.3 DAR)、hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)、hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (1.9 DAR)、hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-SPBD-DM4 (1.8 DAR)及hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)之抗腫瘤活性。
圖 14 展示在SNU-5人類胃癌異種移植物中hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (3.6 DAR)、hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (3.3 DAR)、hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)、hMAB-A(2I.2)-sGMBS-LDL-DM (1.9 DAR)、hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-SPBD-DM4 (1.8 DAR)及hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (1.8 DAR)之抗腫瘤活性。
圖 15 展示在帶有EBC-1人類非小細胞肺鱗狀細胞癌異種移植物之SCID小鼠中25、50及100 μg/kg DM有效負荷之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 (2.1 DAR)及hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (2.1 DAR)接合物之抗腫瘤活性。
圖 16 展示在帶有SW48人類結腸直腸腺癌異種移植物之CD1裸小鼠中25、50及100 μg/kg DM有效負荷之hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K)-Mal-LDL-DM接合物及100 μg/kg DM有效負荷之非結合對照huKTI-Mal-LDL-DM (2.0 DAR)接合物之抗腫瘤活性。
圖 17 展示在帶有HPAF-II人類胰腺癌異種移植物之CD1裸小鼠中25、50及100 μg/kg DM有效負荷之hMAB-A(2I.2)(YTE/C/-K)-Mal-LDL-DM接合物及100 μg/kg DM有效負荷之非結合對照huKTI-Mal-LDL-DM (2.0 DAR)接合物之抗腫瘤活性。
圖 18 展示在帶有H1975人類非小細胞肺腺癌異種移植物之CD1裸小鼠中25、50及100 μg/kg DM有效負荷之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4(2.1 DAR)接合物及25、50及100 μg/kg DM有效負荷之hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (2.1 DAR)接合物之抗腫瘤活性。
圖 19 展示在帶有Hs 746T人類胃癌異種移植物之CD1裸小鼠中25、50及100 μg/kg DM有效負荷之hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4(2.1 DAR)接合物及25、50及100 μg/kg DM有效負荷之hMAB-A(2I.2)-S442C-Mal-LDL-DM (2.1 DAR)接合物之抗腫瘤活性。
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Claims (15)

  1. 一種由下式表示之免疫接合物，
    Figure 108122055-A0305-02-0328-1
     或其醫藥學上可接受之鹽，其中：CB為抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段；L2由下式中之一者表示：
    Figure 108122055-A0305-02-0328-3
    Figure 108122055-A0305-02-0328-4
    Figure 108122055-A0305-02-0328-5
    Figure 108122055-A0305-02-0328-6
    Figure 108122055-A0305-02-0328-7
     其中：Rx、Ry、Rx'及Ry'對於每次出現而言獨立地為H、-OH、鹵素、-O-(C1-4烷基)、-SO3H、-NR40R41R42 +，或視情況經-OH、鹵素、SO3H或NR40R41R42 +取代之C1-4烷基，其中R40、R41及R42各自獨立地為H或C1-4烷基； l及k各自獨立地為1至10之整數；l1為2至5之整數；k1為1至5之整數；且s1指示連接至細胞結合劑CB之位點且s3指示連接至A基團之位點；A為胺基酸殘基或包含2至20個胺基酸殘基之肽；R1及R2各自獨立地為H或C1-3烷基；L1由下式表示：-CR3R4-(CH2)1-8-C(=O)-其中R3及R4各自獨立地為H或Me，且L1中之-C(=O)-部分連接至D；D由下式表示：
    Figure 108122055-A0305-02-0329-8
    ；且q為1至20之整數。
  2. 如請求項1之免疫接合物，其中Rx、Ry、Rx'及Ry'全部為H；且l及k各自獨立地為2至6之整數。
  3. 如請求項1或2之免疫接合物，其中A為含有2至5個胺基酸殘基之肽，視情況地其中A選自由以下組成之群：Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、D-Val-Ala、Val-Cit、D-Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、 Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：144)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：145)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：146)、Val-Arg、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe、Gln-Ala、D-Ala-Pro及D-Ala-tBu-Gly，其中各肽中之第一胺基酸連接至L2基團且各肽中之最末胺基酸連接至-NH-CR1R2-S-L1-D。
  4. 如請求項1或2之免疫接合物，其中：R1與R2均為H；L1為-(CH2)4-6-C(=O)-；且D由下式表示：
    Figure 108122055-A0305-02-0330-9
  5. 如請求項1或2之免疫接合物，其中(i)該免疫接合物由下式表示：
    Figure 108122055-A0305-02-0331-10
    Figure 108122055-A0305-02-0331-11
    Figure 108122055-A0305-02-0331-12
    Figure 108122055-A0305-02-0331-13
    Figure 108122055-A0305-02-0331-16
     或其醫藥學上可接受之鹽，其中：
    Figure 108122055-A0305-02-0331-17
    為經Lys胺基連接至該L2基團之該抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段；
    Figure 108122055-A0305-02-0331-18
    為經Cys硫醇基連接至該L2基團之該抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段；R3及R4各自獨立地為H或Me； m1、m3、n1、r1、s1及t1各自獨立地為1至6之整數；m2、n2、r2、s2及t2各自獨立地為1至7之整數；t3為1至12之整數；D1由下式表示：
    Figure 108122055-A0305-02-0332-19
    ；且視情況地，其中A為Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly；或(ii)該免疫接合物由下式表示：
    Figure 108122055-A0305-02-0332-20
    Figure 108122055-A0305-02-0332-21
     其中：
    Figure 108122055-A0305-02-0332-22
    為經Lys胺基連接至該L2基團之該抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段；
    Figure 108122055-A0305-02-0332-23
    為經Cys硫醇基連接至該L2基團之該抗ADAM9抗體或其ADAM9 結合片段；R3及R4各自獨立地為H或Me；m1及m3各自獨立地為2至4之整數；m2為2至5之整數；r1為2至6之整數；且r2為2至5之整數；D1由下式表示：
    Figure 108122055-A0305-02-0333-24
    ；且視情況地，其中A為Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。
  6. 如請求項5之免疫接合物，其中該免疫接合物由下式表示：
    Figure 108122055-A0305-02-0333-25
    Figure 108122055-A0305-02-0333-26
    Figure 108122055-A0305-02-0334-27
    Figure 108122055-A0305-02-0334-28
    Figure 108122055-A0305-02-0334-29
    Figure 108122055-A0305-02-0334-31
    Figure 108122055-A0305-02-0334-32
    Figure 108122055-A0305-02-0335-33
    Figure 108122055-A0305-02-0335-36
    Figure 108122055-A0305-02-0335-37
    Figure 108122055-A0305-02-0335-38
    Figure 108122055-A0305-02-0335-39
    Figure 108122055-A0305-02-0335-40
    Figure 108122055-A0305-02-0336-41
    Figure 108122055-A0305-02-0336-42
    Figure 108122055-A0305-02-0336-43
    Figure 108122055-A0305-02-0336-44
    Figure 108122055-A0305-02-0336-45
    Figure 108122055-A0305-02-0336-46
    Figure 108122055-A0305-02-0337-47
    Figure 108122055-A0305-02-0337-48
    Figure 108122055-A0305-02-0337-49
    Figure 108122055-A0305-02-0337-50
    Figure 108122055-A0305-02-0337-51
    Figure 108122055-A0305-02-0337-52
    Figure 108122055-A0305-02-0338-53
    Figure 108122055-A0305-02-0338-54
    Figure 108122055-A0305-02-0338-55
    Figure 108122055-A0305-02-0338-56
    Figure 108122055-A0305-02-0338-57
    Figure 108122055-A0305-02-0338-58
    Figure 108122055-A0305-02-0339-59
    Figure 108122055-A0305-02-0339-60
    Figure 108122055-A0305-02-0339-61
    Figure 108122055-A0305-02-0339-62
    Figure 108122055-A0305-02-0339-64
    Figure 108122055-A0305-02-0339-65
    Figure 108122055-A0305-02-0340-66
    Figure 108122055-A0305-02-0340-67
    Figure 108122055-A0305-02-0340-68
    Figure 108122055-A0305-02-0340-69
     或其醫藥學上可接受之鹽，其中：A為Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly，且D1由下式表示：
    Figure 108122055-A0305-02-0341-70
  7. 如請求項1或2之免疫接合物，其中該免疫接合物包含特異性地結合至人類ADAM9及食蟹猴ADAM9之人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其中該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段接合至藥用劑，視情況地其中：(1)該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有選自由以下組成之群之序列的CDRH1結構域、CDRH2結構域及CDRH3結構域以及CDRL1結構域、CDRL2結構域及CDRL3結構域：(a)分別為SEQ ID NO：8、35及10以及SEQ ID NO：62、13、14；(b)分別為SEQ ID NO：8、35及10以及SEQ ID NO：63、13、14；(c)分別為SEQ ID NO：8、36及10以及SEQ ID NO：63、13、14；及(d)分別為SEQ ID NO：34、36及10以及SEQ ID NO：64、13、65；(2)該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有與選自由以下組成之群之序列至少90%、至少95%或至少99%一致之序列的重鏈可變結構域(VH)及輕鏈可變結構域(VL)：(a)分別為SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：55；(b)分別為SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：56；(c)分別為SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：56；及 (d)分別為SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：57；或(3)該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有選自由以下組成之群之序列的重鏈可變結構域(VH)及輕鏈可變結構域(VL)：(a)分別為SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：55；(b)分別為SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：56；(c)分別為SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：56；及(d)分別為SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：57。
  8. 如請求項7之免疫接合物，其中該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段經最佳化以與嵌合或鼠類親本抗體相比，對食蟹猴ADAM9之結合親和力提高至少100倍且保留對人類ADAM9之高親和力結合，視情況地其中：(1)該抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有選自由以下組成之群之序列的CDRH1結構域、CDRH2結構域及CDRH3結構域以及CDRL1結構域、CDRL2結構域及CDRL3結構域：(a)分別為SEQ ID NO：8、35及37以及SEQ ID NO：62、13、14；(b)分別為SEQ ID NO：8、35及38以及SEQ ID NO：62、13、14；(c)分別為SEQ ID NO：8、35及39以及SEQ ID NO：62、13、14；(d)分別為SEQ ID NO：8、35及40以及SEQ ID NO：62、13、14；(e)分別為SEQ ID NO：8、35及41以及SEQ ID NO：62、13、14；(f)分別為SEQ ID NO：8、35及42以及SEQ ID NO：62、13、14；(g)分別為SEQ ID NO：8、35及43以及SEQ ID NO：62、13、14；(h)分別為SEQ ID NO：8、35及44以及SEQ ID NO：62、13、14； (i)分別為SEQ ID NO：8、35及45以及SEQ ID NO：62、13、14；及(j)分別為SEQ ID NO：8、35及46以及SEQ ID NO：62、13、14；(2)該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有與選自由以下組成之群之序列至少90%、至少95%或至少99%一致之序列的重鏈可變結構域(VH)及輕鏈可變結構域(VL)：(a)分別為SEQ ID NO：20及SEQ ID NO：55；(b)分別為SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：55；(c)分別為SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：55；(d)分別為SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：55；(e)分別為SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：55；(f)分別為SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：55；(g)分別為SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：55；(h)分別為SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：55；(i)分別為SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：55；及(j)分別為SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：55；(3)該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有選自由以下組成之群之序列的重鏈可變結構域(VH)及輕鏈可變結構域(VL)：(a)分別為SEQ ID NO：20及SEQ ID NO：55；(b)分別為SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：55；(c)分別為SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：55；(d)分別為SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：55；(e)分別為SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：55；(f)分別為SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：55； (g)分別為SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：55；(h)分別為SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：55；(i)分別為SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：55；及(j)分別為SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：55；或(4)該人源化抗ADAM9抗體包含具有選自由以下組成之群之序列的重鏈及輕鏈：(a)分別為SEQ ID NO：141及SEQ ID NO：68；(b)分別為SEQ ID NO：142及SEQ ID NO：68；(c)分別為SEQ ID NO：143及SEQ ID NO：68；(d)分別為SEQ ID NO：151及SEQ ID NO：68；(e)分別為SEQ ID NO：152及SEQ ID NO：68；(f)分別為SEQ ID NO：153及SEQ ID NO：68；及(g)分別為SEQ ID NO：154及SEQ ID NO：68，視情況地其中SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153或SEQ ID NO：154中之X為離胺酸；或SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153或SEQ ID NO：154中之X不存在。
  9. 如請求項7之免疫接合物，其中該人源化抗ADAM9抗體為包含Fc區之全長抗體，視情況地其中：(i)該人源化抗ADAM9抗體包含具有選自由以下組成之群之序列的重鏈及輕鏈：(a)分別為SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：68； (b)分別為SEQ ID NO：51及SEQ ID NO：68；及(c)分別為SEQ ID NO：52及SEQ ID NO：68；或(ii)該Fc區為包含以下之變異體Fc區：(a)降低該變異體Fc區對FcγR之親和力之一或多個胺基酸修飾，其選自由以下組成之群：L234A、L235A及L234A與L235A；及/或(b)在S442處引入半胱胺酸殘基之胺基酸修飾，其中該編號為Kabat中之EU索引之編號；及/或(c)延長針對FcRn之該變異體Fc區之半衰期之一或多個胺基酸取代，其選自由以下組成之群：M252Y、S254T及T256E。
  10. 如請求項1之免疫接合物，其中該免疫接合物由下式表示：
    Figure 108122055-A0305-02-0345-71
     其中：CBA為人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其包含分別具有SEQ ID NO：8、35及45以及SEQ ID NO：62、13、14之序列的CDRH1結構域、CDRH2結構域及CDRH3結構域以及CDRL1結構域、CDRL2結構域及CDRL3結構域；q為1或2；D1由下式表示：
    Figure 108122055-A0305-02-0346-72
  11. 如請求項10之免疫接合物，其中(i)該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含分別具有SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：55之序列的重鏈可變結構域(VH)及輕鏈可變結構域(VL)；(ii)該人源化抗ADAM9抗體包含分別具有SEQ ID NO：142及SEQ ID NO：68之序列的重鏈及輕鏈；(iii)該人源化抗ADAM9抗體包含分別具有SEQ ID NO：152及SEQ ID NO：68之序列的重鏈及輕鏈；或(iv)該人源化抗ADAM9抗體包含分別具有SEQ ID NO：156及SEQ ID NO：68之序列的重鏈及輕鏈，視情況地其中SEQ ID NO：142或SEQ ID NO：152中之X為離胺酸；或SEQ ID NO：142中之X不存在。
  12. 如請求項1之免疫接合物，其中該免疫接合物由下式表示：
    Figure 108122055-A0305-02-0346-73
     其中： CBA為人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其包含分別具有SEQ ID NO：8、35及45以及SEQ ID NO：62、13、14之序列的CDRH1結構域、CDRH2結構域及CDRH3結構域以及CDRL1結構域、CDRL2結構域及CDRL3結構域；q為1或10之整數；D1由下式表示：
    Figure 108122055-A0305-02-0347-74
  13. 如請求項12之免疫接合物，其中(i)該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含分別具有SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：55之序列的重鏈可變結構域(VH)及輕鏈可變結構域(VL)；(ii)該人源化抗ADAM9抗體包含分別具有SEQ ID NO：52及SEQ ID NO：68之序列的重鏈及輕鏈；(iii)該人源化抗ADAM9抗體包含分別具有SEQ ID NO：151及SEQ ID NO：68之序列的重鏈及輕鏈；或(iv)該人源化抗ADAM9抗體包含分別具有SEQ ID NO：155及SEQ ID NO：68之序列的重鏈及輕鏈，視情況地其中SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：151中之X為離胺酸；或SEQ ID NO：52中之X不存在。
  14. 一種醫藥組合物，其包含有效量之如請求項1至13中任一項之免疫接合物及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
  15. 一種如請求項1至13中任一項之免疫接合物或如請求項14之醫藥組合物的用途，其係用於製備治療個體中與ADAM9之表現相關聯或由ADAM9之表現特徵化之疾病或病狀的藥物，視情況地其中該與ADAM9之表現相關聯或由ADAM9之表現特徵化之疾病或病狀為癌症，且視情況地其中(i)該癌症選自由以下組成之群：非小細胞肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、胃癌、胰臟癌、腎細胞癌、前列腺癌、食道癌、乳癌、頭頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、睪丸癌、骨髓癌、黑色素瘤及淋巴癌；視情況地其中該結腸直腸癌為腺癌、胃腸類癌腫瘤、胃腸基質腫瘤、原發性結腸直腸淋巴瘤、平滑肌肉瘤或鱗狀細胞癌；且視情況地其中該非小細胞肺癌為鱗狀細胞癌、非鱗狀細胞癌、腺癌或大細胞未分化癌；或(ii)該癌症為非小細胞肺癌、胃癌、胰臟癌、三陰性乳癌(TNBC)或結腸直腸癌。
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