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TWI828662B - 4-1bb促效劑與抗–cd20抗體之組合療法 - Google Patents

4-1bb促效劑與抗–cd20抗體之組合療法 Download PDF

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Abstract

本發明係關於採用4-1BB促效劑與特異性抗體組合之組合療法，該4-1BB促效劑包含能夠與腫瘤相關抗原特異性結合之至少一個抗原結合域，該等特異性抗體結合人類CD20；及此等組合療法的用途，其用於治療癌症。

Description

4-1BB促效劑與抗-CD20抗體之組合療法
本發明係關於採用4-1BB (CD137)促效劑與特異性抗體之組合療法，該4-1BB (CD137)促效劑包含能夠與腫瘤相關抗原特異性結合之至少一個抗原結合域，特定言之CD19-靶向4-1BBL抗原結合分子，該等特異性抗體結合人類CD20；此等組合療法的用途，其用於治療癌症；及使用該等組合療法的方法。
B細胞增殖性病症描述包括白血病及淋巴瘤兩者之惡性疾病之異質群體。淋巴瘤發展於淋巴細胞且包括兩個主要類別：霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphomas；HL)及非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphomas；NHL)。在美國，B細胞來源之淋巴瘤構成所有非霍奇金淋巴瘤病例之大約80%至85%，且基於來源之B細胞之基因型及表現型表現模式，在B細胞子集中存在相當大的異源性。舉例而言，B細胞淋巴瘤子集包括緩慢生長之頑固性且不可治癒之疾病，諸如濾泡性淋巴瘤(Follicular lymphoma；FL)或慢性淋巴球性白血病(CLL)以及更具侵襲性之子類型套細胞淋巴瘤(MCL)及彌漫性大型B細胞淋巴瘤(DLBCL)。儘管可獲得用於治療B細胞增殖性病症之各種藥劑，但仍持續需要研發安全且有效的療法以延長緩解期及提高患者之治癒率。
目前正在研究的策略為使T細胞與惡性B細胞接合。為了使T細胞與惡性B細胞有效接合，近來已研發出兩種方法。此等兩種方法為：1)投與離體經工程改造以識別腫瘤細胞之T細胞(亦稱為經嵌合抗原受體修飾的T細胞療法或CAR T細胞) (Maude等人, N Engl J Med (2014) 371,1507-1517)；及2)投與活化內源性T細胞之藥劑，諸如雙特異性抗體(Oak及Bartlett, Expert Opin Investig Drugs (2015) 24, 715-724)。第一方法之實例報導於Maude等人之研究中，其中30個成年及小兒患者用經針對CD19之嵌合抗原受體慢病毒載體轉導之自體T細胞(CTL019 CAR-T細胞)治療。結果為基於67%之6個月無事件存活率及78%之總存活率之持續緩解。然而，所有患者均患有細胞介素釋放症候群(CRS) (與腫瘤負荷相關)，其中27%之患者患有嚴重CRS。亦注意到高頻之未知病因的中樞神經系統毒性。涉及活化內源性T細胞以識別腫瘤靶標之第二方法繞過此可擴展性障礙，且亦可提供競爭性功效、安全性資料及可能長期的反應持續時間。在不同CD20+ 血液科惡性疾病中，此方法最佳由布林莫單抗(blinatumomab)例示，一種CD19 CD3靶向T細胞雙特異性分子(Bargou等人, Science (2008) 321, 974-977)，其近年來得以批准以用於患有微小殘留病陽性急性淋巴球性白血病(ALL)之患者。此由兩個單鏈Fv片段構成(所謂BiTE®格式)之化合物引導細胞溶解T細胞裂解CD19+ 細胞。布林莫單抗之主要限制因素為其短半衰期(大致2小時)，由此使得必須經由泵連續輸注4至8週。此外，亦已頻繁地觀測到嚴重CRS及CNS毒性(Klinger等人, Blood. 2012;119(26):6226-6233)。在所有臨床試驗中，在接受布林莫單抗之患者中，神經毒性出現於大致50%之患者中，且在藥品說明書中充分界定觀察到之毒性類型。
4-1BB (CD137) (TNF受體超家族之成員)首先經鑑別為由T細胞表現之誘導性分子(Kwon and Weissman, Proc Natl Acad Sci U S A (1989)86 , 1963-1967)。後續研究表明，許多其他免疫細胞亦表現4-1BB，包括NK細胞、B細胞、NKT細胞、單核球、嗜中性白血球、肥大細胞、樹突狀細胞(DC)及非造血源之細胞(諸如內皮細胞及平滑肌細胞) (Vinay及Kwon, Cell Mol Immunol (2011)8 , 281-284)。4-1BB在不同細胞類型中之表現主要為誘導性的，且由各種刺激信號驅動，諸如T細胞受體(TCR)或B細胞受體觸發，以及經由促炎性細胞介素之共刺激分子或受體誘導的信號傳導(Diehl等人, J Immunol (2002)168 , 3755-3762；Zhang等人, J Immunol(2010 )184 , 787-795)。
已於1993年鑑別4-1BB配體(4-1BBL或CD137L) (Goodwin等人, Eur J Immunol. (1993)23 , 2631-2641)。已顯示，4-1BBL之表現限定於專職抗原呈現細胞(APC)上，諸如B細胞、DC及巨噬細胞。4-1BBL之誘導性表現為T細胞(包括αβ及γδ T細胞子集兩者)及內皮細胞之特徵(Shao及Schwarz, J Leukoc Biol (2011)89 , 21-29)。
經由4-1BB受體(例如藉由4-1BBL連接)之共刺激活化T細胞(CD4+ 及CD8+ 子集兩者)內之多個信號級聯，從而大大加強T細胞活化(Bartkowiak及Curran, Front Oncol (2015)5 , 117)。與TCR觸發組合，促效4-1BB特異性抗體增強T細胞之增殖、刺激淋巴激素分泌及降低T淋巴球對活化誘導之細胞死亡的靈敏度(Snell等人, Immunol Rev (2011)244 , 197-217)。此機制在癌症免疫療法中作為第一概念驗證而進一步經推進。在臨床前模型中，抗-4-1BB之促效抗體在攜帶腫瘤小鼠中之投與引起強效抗腫瘤效果(Melero等人, Nature Med (1997)3 , 682-685)。之後，累積證據指示，4-1BB通常僅在與其他免疫調節化合物、化學治療藥劑、腫瘤特異性接種疫苗或放射線療法組合投與時，展現其作為抗腫瘤劑之效能(Bartkowiak及Curran, Front Oncol (2015)5 , 117)。
TNFR超家族之信號傳導需要三聚配體之交聯以與受體接合，需要野生型Fc結合之4-1BB促效抗體同樣如此(Li及Ravetch, Science (2011)333 , 1030-1034)。然而，全身性投與具有功能活性Fc域之4-1BB特異性促效抗體引起與肝毒性相關的CD8+ T細胞之流入(Dubrot等人, Cancer Immunol Immunother (2010)59 , 1223-1233)，此在小鼠體內無功能性Fc受體存在下減弱或顯著改善。在臨床中，Fc勝任型4-1BB促效Ab (BMS-663513) (NCT00612664)引起導致試驗終止的4級肝炎(Simeone及Ascierto, J Immunotoxicol (2012)9 , 241-247)。因此，需要有效且更安全的4-1BB促效劑。
已製備出由一個4-1BB配體胞外域及單鏈抗體片段(Hornig等人, J Immunother (2012)35 , 418-429; Müller等人, J Immunother. (2008)31 , 714-722)或與重鏈之C端融合的單一4-1BB配體(Zhang等人, Clin Cancer Res (2007)13 , 2758-2767)構成的融合蛋白。WO 2010/010051揭示由彼此連接且與抗體部分融合之三個TNF配體胞外域組成的融合蛋白之產生。在本發明中，由三聚及因此生物學活性之4-1BB配體以及對腫瘤抗原CD19具有特異性之抗原結合域及不含FcγR結合之Fc區構成的抗原結合分子，經顯示尤其穩定及穩固(本文中被命名為CD19-4-1BBL)。此等構築體揭示於WO 2016/075278中，且藉由CD19靶向B細胞特異性交聯置換負責Fc介導之毒性的非特異性FcγR介導的交聯。
CD19為用於B細胞惡性疾病之免疫療法的理想靶標，此係因為其表現於B細胞之表面上且幾乎對此等細胞均具有特異性。在B細胞發育期間，CD19比CD20更廣泛地表現於B細胞上，因此CD20陽性細胞通常亦將表現CD19。在B細胞朝向漿細胞(抗體分泌細胞)分化期間，B細胞下調CD20表現。有時，B細胞淋巴瘤亦下調CD20表現，但對於CD19保持陽性。因此，靶向CD19及CD20兩者將廣泛地覆蓋淋巴瘤中之患病B細胞，此亦可使選擇壓力自CD20偏移至CD19及CD20兩者。儘管並不知曉CD19是否直接導致B細胞癌發生，但其表現在諸如急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)及B細胞淋巴瘤之大多數B細胞腫瘤上高度保守。在急性白血病中，CD19不斷且持續表現於幾乎所有子類型上，而僅少數白血病表現CD20。
因此，仍需要具有顯著有助於治療患有B細胞增殖性病症(諸如NHL及CLL)之患者之潛能的新穎化合物及組合。已發現，當CD19-靶向4-1BBL抗原結合分子與結合人類CD20之特異性抗體組合時，達成極佳抗腫瘤效果。因此，吾人在本文中描述一種用於癌症與B細胞惡性疾病之新穎組合療法。
本發明係關於一種4-1BB (CD137)促效劑，其包含能夠與腫瘤相關抗原特異性結合之至少一個抗原結合域，特定言之包含三個4-1BBL胞外域之抗原結合分子；及其與結合人類CD20之抗體(特定言之，利妥昔單抗(rituximab)或奧濱尤妥珠單抗(obinutuzumab))組合的用途，其用於治療癌症或延遲癌症之進展的方法中，更特定言之，用於治療B細胞增殖性病症或延遲B細胞增殖性病症之進展。已發現，本文中所描述之組合療法在抑制腫瘤生長及消除腫瘤細胞上比用單獨抗-CD20抗體之治療更有效。
在一個態樣中，本發明提供用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB (CD137)促效劑，其中該4-1BB促效劑與抗-CD20抗體組合使用，且其中該4-1BB促效劑包含能夠與腫瘤相關抗原特異性結合的至少一個抗原結合域，特定言之該4-1BB促效劑包含三個4-1BBL胞外域或其片段及能夠與腫瘤相關抗原特異性結合的至少一個抗原結合域。
特定言之，該4-1BB促效劑為包含能夠與CD19特異性結合之一個抗原結合域的抗原結合分子。在一個態樣中，該4-1BB促效劑為包含Fc域之抗原結合分子。在一特定態樣中，該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含具有降低或較佳地消除Fcγ受體結合及/或效應功能之修飾的Fc域。
在一個態樣中，該4-1BB促效劑及該抗-CD20抗體係相伴或同時投與。在另一態樣中，提供一種用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中包含能夠與CD19特異性結合的至少一個抗原結合域的該4-1BB促效劑與該抗-CD20抗體，以單一組合物形式一起投與，或以兩種或更多種不同組合物形式分開投與。
在一個態樣中，本發明提供一種與抗-CD20抗體組合用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，該4-1BB促效劑包含能夠與腫瘤相關抗原特異性結合的至少一個抗原結合域，其中該4-1BB促效劑包含三個4-1BBL胞外域或其片段。在另一態樣中，提供一種用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為包含三個4-1BBL胞外域或其片段的分子，且其中該等4-1BBL胞外域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8，特定言之SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。更特定言之，該等4-1BBL胞外域包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB (CD137)促效劑，其中該4-1BB促效劑與抗-CD20抗體組合使用，且其中該4-1BB促效劑包含能夠與CD19特異性結合的至少一個抗原結合域。
在一個態樣中，包含能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域及三個4-1BBL胞外域或其片段之抗原結合分子，將不會被表現CD19之B細胞內化。在另一態樣中，提供一種與抗-CD20抗體組合用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為包含能夠與CD19特異性結合的至少一個抗原結合域及三個4-1BBL胞外域或其片段的抗原結合分子，其中能夠與CD19特異性結合的該抗原結合域包含： (a)重鏈可變區(VH CD19)，其包含：(i) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CD19)，其包含：(iv) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列，或 (b)重鏈可變區(VH CD19)，其包含：(i) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CD19)，其包含：(iv) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。
在一特定態樣中，提供一種與抗-CD20抗體組合用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為包含能夠與CD19特異性結合的至少一個抗原結合域及三個4-1BBL胞外域或其片段的抗原結合分子，其中能夠與CD19特異性結合的該抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)，或其中能夠與CD19特異性結合的該抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 23之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)。在一特定態樣中，能夠與CD19特異性結合之該抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 23之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)。
在一個態樣中，提供一種與抗-CD20抗體組合用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中包含能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域的該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子進一步包含由能夠穩定結合的第一及第二次單元構成的Fc域。特定言之，該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含IgG Fc域，具體言之IgG1 Fc域或IgG4 Fc域。更特定言之，該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含含有降低與Fc受體之結合及/或效應功能的一或多個胺基酸取代的Fc域。在一特定態樣中，該4-1BB促效劑包含含有胺基酸取代L234A、L235A及P329G之IgG1 Fc域。
在本發明之另一態樣中，提供一種與抗-CD20抗體組合用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為包含以下的抗原結合分子： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域， (b)第一及第二多肽，其藉由二硫鍵彼此連接， 其中該第一多肽包含藉由肽連接子彼此連接的兩個4-1BBL胞外域或其片段，且其中該第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段。
在另一態樣中，本發明提供一種與抗-CD20抗體組合用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為包含以下的抗原結合分子： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個Fab域，及 (b)第一及第二多肽，其藉由二硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於： (i)分別地，第一多肽含有CH1或CL域及第二多肽含有CL或CH1域，其中第二多肽藉由CH1域與CL域之間的二硫鍵與第一多肽連接，且其中第一多肽包含兩個4-1BBL胞外域或其片段，該等胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且與CH1或CL域連接，且其中第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子與該多肽之CL或CH1域連接，或 (ii)分別地，第一多肽含有CH3域及第二多肽含有CH3域，且其中第一多肽包含兩個4-1BBL胞外域或其片段，該等胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且與CH3域之C端連接，且其中第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段，該一個胞外域或其片段經由肽連接子與該多肽之CH3域之C端連接，或 (iii)分別地，該第一多肽含有VH-CL或VL-CH1域及該第二多肽含有VL-CH1域或VH-CL域，其中該第二多肽藉由CH1域與CL域之間的二硫鍵與第一多肽連接，且其中第一多肽包含兩個4-1BBL胞外域或其片段，該等胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且與VH或VL連接，且其中第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子與該多肽之VL或VH連接。
在一個態樣中，提供一種與抗-CD20抗體組合用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為包含以下的抗原結合分子： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個Fab域，該至少一個Fab域包含：含有SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)，或含有SEQ ID NO: 23之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)，及 (b)第一及第二多肽，其藉由二硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於，該第一多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO: 32，且在於該第二多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8。
在一特定態樣中，提供一種與抗-CD20抗體組合用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為選自由以下組成之群的抗原結合分子： a)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 35之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 36之胺基酸序列的第二輕鏈； b)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 37之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的第二輕鏈； c)分子，其包含含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 39之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 40之胺基酸序列的第二重鏈； d)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 41之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 42之胺基酸序列的第二輕鏈； e)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 43之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 44之胺基酸序列的第二輕鏈； f)分子，其包含含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 45之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 46之胺基酸序列的第二重鏈； g)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 35之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 36之胺基酸序列的第二輕鏈； h)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 37之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的第二輕鏈； i)分子，其包含含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 49之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的第二重鏈； j)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 41之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 42之胺基酸序列的第二輕鏈； k)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 43之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 44之胺基酸序列的第二輕鏈；及 l)分子，其包含含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 51之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 52之胺基酸序列的第二重鏈。
在另一態樣中，本發明提供一種與抗-CD20抗體組合用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為包含以下的抗原結合分子： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域， (b)包含藉由肽連接子彼此連接之三個4-1BBL胞外域或其片段的多肽。
在一特定態樣中，提供一種與抗-CD20抗體組合用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為選自由以下組成之群的抗原結合分子： (a)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)及含有SEQ ID NO: 53之胺基酸序列的融合蛋白， (b)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)及含有SEQ ID NO: 53之胺基酸序列的融合蛋白； (c)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)及含有SEQ ID NO: 54之胺基酸序列的融合蛋白，及 (d)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)及含有SEQ ID NO: 55之胺基酸序列的融合蛋白。
在另一態樣中，本發明提供一種與抗-CD20抗體組合用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為抗-CD19/抗-4-1BB雙特異性抗體。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB (CD137)促效劑，其中該4-1BB促效劑與抗-CD20抗體組合使用，且其中該4-1BB促效劑包含能夠與FAP特異性結合之至少一個抗原結合域。
在一個態樣中，提供一種與抗-CD20抗體組合用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為包含能夠與FAP特異性結合之至少一個抗原結合域及三個4-1BBL胞外域或其片段的抗原結合分子，其中能夠與FAP特異性結合的該抗原結合域包含： (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 96之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 97之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 98之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 102之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 103之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 105之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 106之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 107之胺基酸序列。
在一特定態樣中，提供一種與抗-CD20抗體組合用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為包含能夠與FAP特異性結合的至少一個抗原結合域及三個4-1BBL胞外域或其片段的抗原結合分子，其中能夠與FAP特異性結合的該抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 108之胺基酸序列的重鏈可變區(VH FAP)及含有SEQ ID NO: 109之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL FAP)，或其中能夠與FAP特異性結合的該抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 110之胺基酸序列的重鏈可變區(VH FAP)及含有SEQ ID NO: 111之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL FAP)。在一特定態樣中，能夠與FAP特異性結合的該抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 110之胺基酸序列的重鏈可變區(VH FAP)及含有SEQ ID NO: 112之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL FAP)。
在一個態樣中，提供一種與抗-CD20抗體組合用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中包含能夠與FAP特異性結合的至少一個抗原結合域的該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子進一步包含由能夠穩定結合的第一及第二次單元構成的Fc域。特定言之，該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含IgG Fc域，具體言之IgG1 Fc域或IgG4 Fc域。更特定言之，該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含含有降低與Fc受體之結合及/或效應功能的一或多個胺基酸取代的Fc域。在一特定態樣中，該4-1BB促效劑包含含有胺基酸取代L234A、L235A及P329G之IgG1 Fc域。
在本發明之另一態樣中，提供一種與抗-CD20抗體組合用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為包含以下的抗原結合分子： (a)能夠與FAP特異性結合之至少一個抗原結合域， (b)第一及第二多肽，其藉由二硫鍵彼此連接， 其中該第一多肽包含藉由肽連接子彼此連接的兩個4-1BBL胞外域或其片段，且其中該第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段。
在另一態樣中，本發明提供一種與抗-CD20抗體組合用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為包含以下的抗原結合分子： (a)能夠與FAP特異性結合之至少一個Fab域，及 (b)第一及第二多肽，其藉由二硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於： (i)分別地，第一多肽含有CH1或CL域及第二多肽含有CL或CH1域，其中第二多肽藉由CH1域與CL域之間的二硫鍵與第一多肽連接，且其中第一多肽包含兩個4-1BBL胞外域或其片段，該等胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且與CH1或CL域連接，且其中第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子與該多肽之CL或CH1域連接，或 (ii)分別地，第一多肽含有CH3域及第二多肽含有CH3域，且其中第一多肽包含兩個4-1BBL胞外域或其片段，該等胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且與CH3域之C端連接，且其中第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段，該一個胞外域或其片段經由肽連接子與該多肽之CH3域之C端連接，或 (iii)分別地，該第一多肽含有VH-CL或VL-CH1域及該第二多肽含有VL-CH1域或VH-CL域，其中該第二多肽藉由CH1域與CL域之間的二硫鍵與第一多肽連接，且其中第一多肽包含兩個4-1BBL胞外域或其片段，該等胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且與VH或VL連接，且其中第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子與該多肽之VL或VH連接。
在一個態樣中，提供一種與抗-CD20抗體組合用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為包含以下的抗原結合分子： (a)能夠與FAP特異性結合之至少一個Fab域，該至少一個Fab域包含：含有SEQ ID NO: 108之胺基酸序列的重鏈可變區(VH FAP)及含有SEQ ID NO: 109之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL FAP)，或含有SEQ ID NO: 110之胺基酸序列的重鏈可變區(VH FAP)及含有SEQ ID NO: 111之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL FAP)，及 (b)第一及第二多肽，其藉由二硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於，該第一多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO: 32，且在於該第二多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8。
在一特定態樣中，提供一種與抗-CD20抗體組合用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為選自由以下組成之群的抗原結合分子： a)分子，其包含含有SEQ ID NO: 112之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 35之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 36之胺基酸序列的第二輕鏈； b)分子，其包含含有SEQ ID NO: 112之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 37之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的第二輕鏈； c)分子，其包含含有SEQ ID NO: 112之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 41之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 42之胺基酸序列的第二輕鏈； d)分子，其包含含有SEQ ID NO: 112之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 43之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 44之胺基酸序列的第二輕鏈； e)分子，其包含含有SEQ ID NO: 114之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 35之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 36之胺基酸序列的第二輕鏈； f)分子，其包含含有SEQ ID NO: 114之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 37之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的第二輕鏈； g)分子，其包含含有SEQ ID NO: 114之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 41之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 42之胺基酸序列的第二輕鏈； h)分子，其包含含有SEQ ID NO: 114之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 43之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 44之胺基酸序列的第二輕鏈； f)分子，其包含含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 45之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 46之胺基酸序列的第二重鏈； g)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 35之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 36之胺基酸序列的第二輕鏈； h)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 37之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的第二輕鏈； i)分子，其包含含有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 116之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 117之胺基酸序列的第二重鏈；及 j)分子，其包含含有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 118之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 119之胺基酸序列的第二重鏈。
在另一態樣中，本發明提供一種與抗-CD20抗體組合用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為包含以下的抗原結合分子： (a)能夠與FAP特異性結合之至少一個抗原結合域， (b)包含藉由肽連接子彼此連接之三個4-1BBL胞外域或其片段的多肽。
在另一態樣中，本發明提供一種與抗-CD20抗體組合用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為抗-FAP/抗-4-1BB雙特異性抗體。
在所有此等態樣中，本發明進一步提供一種與抗-CD20抗體組合用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中該抗-CD20抗體包含I型抗-CD20抗體。特定言之，該抗-CD20抗體為利妥昔單抗。在另一態樣中，本發明進一步提供一種與抗-CD20抗體組合用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中該抗-CD20抗體為II型抗-CD20抗體。特定言之，該抗-CD20抗體為奧濱尤妥珠單抗。在一個態樣中，該抗-CD20抗體為去岩藻糖基化抗-CD20抗體。在另一態樣中，該抗-CD20抗體為利妥昔單抗或奧濱尤妥珠單抗。
在另一態樣中，提供一種與如前文所定義之抗-CD20抗體組合用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合的至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑，且其中該組合係以約一週至三週的間隔投與。
在另一態樣中，提供一種與抗-CD20抗體組合用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合的至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑，且其中在該組合治療之前，用II型抗-CD20抗體(較佳地奧濱尤妥珠單抗)進行預治療，其中該預治療與該組合治療之間的時間段足以降低個體中回應於II型抗-CD20抗體(較佳地奧濱尤妥珠單抗)的B細胞。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥產品，其包含：(A)第一組合物，其包含作為活性成分之含有能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑及醫藥學上可接受之賦形劑；及(B)第二組合物，其包含作為活性成分之抗-CD20抗體及醫藥學上可接受之賦形劑，其用於組合或同步治療疾病，特定言之癌症。
在另一態樣中，提供一種醫藥組合物，其包含：含有能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑及醫藥學上可接受之賦形劑；以及包含抗-CD20抗體的第二藥物。在一個態樣中，該醫藥組合物用作藥物。特定言之，該醫藥組合物用於治療B細胞增殖性病症，特定言之選自由以下組成之群的疾病：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、彌漫性大型B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、多發性骨髓瘤(MM)及霍奇金淋巴瘤(HL)。
在一額外態樣中，本發明提供一種用於治療個體之癌症或延遲個體之癌症之進展的套組，其包含封裝，該封裝包含：(A)第一組合物，其包含作為活性成分之包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合的至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑及醫藥學上可接受之賦形劑；及(B)第二組合物，其包含作為活性成分的抗-CD20抗體及醫藥學上可接受之賦形劑；以及(C)在組合療法中，組合物的使用說明書。
在另一態樣中，本發明係關於一種4-1BB促效劑與抗-CD20抗體之組合的用途，該4-1BB促效劑包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合的至少一個抗原結合域，其用於製造用於治療增殖性疾病(特定言之，癌症)或延遲增殖性疾病之進展的藥物。
特定言之，提供一種4-1BB促效劑與抗-CD20抗體之組合的用途，該4-1BB促效劑包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合的至少一個抗原結合域，其用於製造用於治療選自由以下組成之群的疾病的藥物：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、多發性骨髓瘤(MM)及霍奇金淋巴瘤(HL)。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療個體之癌症或延遲個體之癌症之進展的方法，其包含向該個體投與有效量之包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合的至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑，及有效量之抗-CD20抗體。特定言之，本發明係關於一種用於治療個體之癌症或延遲個體之癌症之進展的方法，其中該4-1BB促效劑為包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合的至少一個抗原結合域的抗原結合分子。在一個態樣中，該4-1BB促效劑為包含Fc域之抗原結合分子。在一特定態樣中，該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含有降低Fcγ受體結合及/或效應功能之修飾的Fc域。在一特定態樣中，包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域之該4-1BB促效劑，為包含三個4-1BBL胞外域或其片段的抗原結合分子。更特定言之，該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含三個4-1BBL胞外域或其片段及能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合的抗原結合域。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療個體之癌症或延遲個體之癌症之進展的方法，其包含向該個體投與有效量之包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合的至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑，及有效量之抗-CD20抗體，其中包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合的至少一個抗原結合域的該4-1BB促效劑及該抗-CD20抗體，係以單一組合物形式一起投與，或以兩種或更多種不同組合物形式分開投與。特定言之，包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域的該4-1BB促效劑及該抗-CD20抗體，係經靜脈內或皮下投與。在另一態樣中，包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域的該4-1BB促效劑，係與該抗-CD20抗體相伴投與。
定義 除非以其他方式定義，否則本文所用之技術及科學術語具有與本發明所屬領域中通常所使用相同之含義。出於解釋本說明書之目的，將應用以下定義且只要合適，以單數形式使用之術語亦將包括複數形式且反之亦然。
如本文所用，術語「抗原結合分子 」在其最廣泛的意義上係指特異性結合抗原決定子的分子。抗原結合分子之實例為抗體、抗體片段及骨架抗原結合蛋白。
術語「抗體 」在本文中以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、單特異性及多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所需抗原結合活性即可。
如本文所用，術語「單株抗體 」係指自實質上均質抗體之群體獲得的抗體，亦即包含該群體之個別抗體相同及/或結合相同抗原決定基，除例如含有天然存在之突變或在單株抗體製備生產期間產生之可能變體抗體以外，此類變體一般以少量存在。與典型地包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑相比，單株抗體製劑中之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。
如本文所用，術語「單特異性 」抗體表示具有一或多個結合位點之抗體，該一或多個結合位點中之每一者與相同抗原之相同抗原決定基結合。術語「雙特異性 」意謂，抗原結合分子能夠與至少兩個不同的抗原決定子特異性結合。典型地，雙特異性抗原結合分子包含兩個抗原結合位點，其中之每一者對不同抗原性決定子具有特異性。在某些實施例中，雙特異性抗原結合分子能夠同時結合兩個抗原決定子，特定言之表現於兩個不同細胞上的兩個抗原決定子。
如本申請案中所使用之術語「價 」表示抗原結合分子中存在指定數目之結合位點。同樣，術語「二價」、「四價」及「六價」分別表示抗原結合分子中存在兩個結合位點、四個結合位點及六個結合位點。「一價」表示在抗原結合分子中僅存在一個針對特定靶標之結合域。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「完全抗體」在本文中可互換使用，其係指具有與原生抗體結構實質上類似之結構的抗體。「原生抗體 」係指具有不同結構之天然存在之免疫球蛋白分子。舉例而言，原生IgG類抗體為約150,000道爾頓(dalton)之雜四聚體醣蛋白，其由二硫鍵鍵合之兩條輕鏈及兩條重鏈構成。自N端至C端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變域，之後為三個恆定域(CH1、CH2及CH3)，亦稱為重鏈恆定區。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變域，之後為輕鏈恆定域(CL)，亦稱為輕鏈恆定區。抗體之重鏈可歸為五種類型中之一種，該五種類型稱為α (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE)、γ (IgG)或μ (IgM)，其中一些可進一步分成子類型，例如γ1 (IgG1)、γ2 (IgG2)、γ3 (IgG3)、γ4 (IgG4)、α1 (IgA1)及α2 (IgA2)。抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸為兩種類型中之一種，稱為κ (kappa)及λ (lambda)。
「抗體片段 」係指不同於完整抗體，包含完整抗體之結合完整抗體所結合之抗原之部分的分子。抗體片段之實例包括(但不限於) Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 ；雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、互換Fab片段；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及單域抗體。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人, Nat Med 9, 129-134 (2003)。關於scFv片段之綜述，參見例如Plückthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 第113卷, Rosenburg及Moore編, Springer-Verlag, New York, 第269-315頁 (1994)；亦參見WO93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含救助受體結合抗原決定基殘基及具有增加之活體內半衰期之Fab及F(ab')2 片段的論述，參見美國專利第5,869,046號。雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點之抗體片段，其可為二價或雙特異性的，參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人, Nat Med 9, 129-134 (2003)；及Hollinger等人, Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人, Nat Med 9, 129-134 (2003)中。單域抗體為包含抗體之重鏈可變域之全部或一部分或輕鏈可變域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA；參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。抗體片段可藉由各種技術來製備，包括(但不限於)如本文所描述之對完整抗體之蛋白水解消化以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E. coli)或噬菌體)生產。
對完整抗體之番木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其各自含有重鏈及輕鏈可變域以及輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(CH1)。如本文所用，因此，術語「Fab 片段 」係指包含含有輕鏈之VL域及恆定域(CL)之輕鏈片段，及重鏈之VH域及第一恆定域(CH1)的抗體片段。Fab'片段與Fab片段之不同之處在於，在包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸之重鏈CH1域的羧基端處添加幾個殘基。Fab'-SH為其中恆定域之半胱胺酸殘基帶有游離硫醇基之Fab'片段。胃蛋白酶處理產生F(ab')2片段，其具有兩個抗原結合位點(兩個Fab片段)及Fc區之一部分。
術語「互換 Fab 片段 」或「xFab片段」或「互換型Fab片段」係指其中重鏈及輕鏈之可變區或恆定區互換之Fab片段。互換型Fab分子之兩種不同鏈組成係可能的且包含於本發明之雙特異性抗體中：一方面，Fab重鏈及輕鏈之可變區經互換，亦即交換型Fab分子包含由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)構成的肽鏈，及由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)構成的肽鏈。此互換型Fab分子亦稱為互換Fab( VLVH ) 。另一方面，當Fab重鏈及輕鏈之恆定區互換時，互換型Fab分子包含由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)組成的肽鏈，及由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)組成的肽鏈。此互換型Fab分子亦稱為互換Fab(CLCH1) 。
「單鏈Fab片段」或「scFab 」為由抗體重鏈可變域(VH)、抗體恆定域1 (CH1)、抗體輕鏈可變域(VL)、抗體輕鏈恆定域(CL)及連接子組成之多肽，其中該等抗體域及該連接子按N端至C端方向之次序具有以下中之一者：a) VH-CH1-連接子-VL-CL，b) VL-CL-連接子-VH-CH1，c) VH-CL-連接子-VL-CH1或d) VL-CH1-連接子-VH-CL；且其中該連接子為至少30個胺基酸，較佳32與50個胺基酸之間的多肽。該等單鏈Fab片段經由CL域與CH1域之間的天然二硫鍵穩定化。另外，此等單鏈Fab分子可藉由經由插入半胱胺酸殘基(例如根據Kabat編號，可變重鏈中之位置44及可變輕鏈中之位置100)而產生鏈間二硫鍵來進一步穩定化。
「互換型單鏈Fab片段」或「x-scFab 」為由抗體重鏈可變域(VH)、抗體恆定域1 (CH1)、抗體輕鏈可變域(VL)、抗體輕鏈恆定域(CL)及連接子組成之多肽，其中該等抗體域及該連接子按N端至C端方向之次序具有以下中之一者：a) VH-CL-linker-VL-CH1及b)VL-CH1-連接子-VH-CL；其中VH及VL一起形成與抗原特異性結合的抗原結合位點，且其中該連接子為至少30個胺基酸的多肽。另外，此等x-scFab分子可藉由經由插入半胱胺酸殘基(例如根據Kabat編號，可變重鏈中之位置44及可變輕鏈中之位置100)而產生鏈間二硫鍵來進一步穩定化。
「單鏈可變片段 (scFv) 」為抗體之重鏈(VH )及輕鏈(VL )之可變區的融合蛋白，其與具有十至約25個胺基酸之短連接肽連接。連接子通常富含甘胺酸以具有可撓性，以及絲胺酸或蘇胺酸以具有可溶性，且可使VH 之N端與VL 之C端連接，或反之亦然。儘管移除恆定區且引入連接子，但此蛋白質保留初始抗體之特異性。scFv抗體例如描述於Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96)中。另外，抗體片段包含單鏈多肽，其具有VH域(亦即能夠與VL域一起組裝成功能性抗原結合位點)或VL域(亦即能夠與VH域一起組裝成功能性抗原結合位點)之特徵，且因此提供全長抗體之抗原結合特性。
「骨架抗原結合蛋白 」在此項技術中已知，例如纖維結合蛋白及經設計錨蛋白重複蛋白質(DARPins)已用作抗原結合域之替代骨架，參見例如Gebauer及Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009)及Stumpp等人, Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008)。在本發明之一個態樣中，骨架抗原結合蛋白係選自由以下組成之群：CTLA-4 (艾維伯迪(Evibody))，脂質運載蛋白(抗運載蛋白)，蛋白A衍生之分子(諸如蛋白A之Z域(親和抗體)、A域(高親和性多聚體/最大抗體))，血清運鐵蛋白(反式體)；經設計之錨蛋白重複蛋白質(DARPin)，抗體輕鏈或重鏈之可變域(單域抗體，sdAb)，抗體重鏈之可變域(奈米抗體，aVH)，VNAR 片段，纖維結合蛋白(阿德奈汀(AdNectin))，C型凝集素域(四連接素)；新型抗原受體β-內醯胺酶之可變域(VNAR 片段)，人類γ-晶狀體球蛋白或泛蛋白(阿菲林(Affilin)分子)；人類蛋白酶抑制劑之kunitz型域，微體(諸如來自knottin家族之蛋白質)，肽適體及纖維結合蛋白(阿德奈汀)。
脂質運載蛋白為胞外蛋白質之家族，其轉運小型疏水性分子，諸如類固醇、後色膽素、類視黃素及脂質。其具有剛性β-片狀第二結構，其在圓錐結構之開放端具有許多環，其可經工程改造以與不同靶抗原結合。抗運載蛋白之大小在160-180個胺基酸之間，且衍生於脂質運載蛋白。關於其他細節，參見Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)、US7250297B1及US20070224633。
經設計之錨蛋白重複蛋白質(DARPins)衍生於錨蛋白，其為介導整合膜蛋白質與細胞骨架之連接的蛋白質家族。單一錨蛋白重複為由兩個α螺旋及β旋轉(beta-turn)組成之33殘基基元。其可藉由隨機化各重複之第一個α螺旋及β旋轉中之殘基而經工程改造為結合不同靶抗原。可藉由增加模組數目來增加其結合界面(親和力成熟方法)。關於其他細節，參見J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)及J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)以及US20040132028A1。
單域抗體為由單一單體可變抗體域組成之抗體片段。第一個單域來源於來自駱駝之抗體重鏈之可變域(奈米抗體或VH H片段)。此外，術語單域抗體包括自主人類重鏈可變域(aVH)或來源於鯊魚之VNAR 片段。
至於參考分子，「與相同抗原決定基結合之抗原結合分子 」係指一種抗原結合分子，其在競爭分析中阻斷參考分子與其抗原之結合達50%或更多，且相反，參考分子在競爭分析中阻斷抗原結合分子與其抗原之結合達50%或更多。
術語「抗原結合域 」係指抗原結合分子之一部分，其包含與抗原之一部分或全部特異性結合且與其互補之區域。當抗原較大時，抗原結合分子可僅與抗原之特定部分結合，該部分稱為抗原決定基。抗原結合域可由例如一或多個可變域(亦稱為可變區)提供。較佳地，抗原結合域包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)。
如本文所用，術語「抗原決定子 」與「抗原」及「抗原決定基」同義，且係指多肽大分子上與抗原結合部分結合，形成抗原結合部分-抗原複合物的位點(例如連續胺基酸區段或由非連續胺基酸之不同區域構成的構形組態)。適用的抗原決定子可發現於例如腫瘤細胞表面上、病毒感染細胞表面上、其他病變細胞表面上、免疫細胞表面上、游離於血清中及/或胞外基質(ECM)中。除非另外指示，否則在本文中適用作抗原之蛋白質可以為來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)的任何原生形式之蛋白質。在一特定實施例中，抗原為人類蛋白質。在本文中提及特定蛋白質的情況下，該術語涵蓋「全長」未加工蛋白質，以及由細胞中之加工所產生的任何蛋白質形式。該術語亦涵蓋天然存在之蛋白質變體，例如剪接變體或等位基因變體。
「特異性結合 」意謂，結合對於抗原而言具選擇性且可與非所需或非特異性相互作用區分。抗原結合分子與特定抗原結合之能力可經由酶聯結免疫吸附分析(ELISA)或熟習此項技術者熟悉之其他技術，例如表面電漿子共振(SPR)技術(在BIAcore儀器上分析) (Liljeblad等人, Glyco J 17, 323-329 (2000))及傳統結合分析(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))量測。在一個實施例中，抗原結合分子與無關蛋白質之結合程度，小於抗原結合分子與抗原之結合的約10%，如例如藉由SPR所量測。在某些實施例中，與抗原結合之分子具有≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如10-8 M或更少，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)之解離常數(Kd)。
「親和力 」或「結合親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用總強度。除非另外指示，否則如本文所用之「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間的1:1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(Kd)表示，解離常數為解離速率常數與結合速率常數(分別為koff 及kon )之比率。因此，等效親和力可包含不同速率常數，只要速率常數之比率保持相同即可。可藉由此項技術中已知之常見方法(包括本文所描述之彼等方法)量測親和力。一種用於量測親和力之特定方法為表面電漿子共振(SPR)。
如本文所用，「B 細胞 抗原 」係指呈現於B淋巴球、特定言之惡性B淋巴球(在彼情況下，該抗原亦被稱作「惡性B細胞抗原」)之表面上的抗原決定子。
術語「腫瘤相關抗原 」意謂由腫瘤細胞高度表現或在腫瘤基質中表現的任何抗原。Particular tumor-associated antigens are CD19 or FAP。
除非另外指示，否則術語「CD19」係指B淋巴球抗原CD19，亦稱為B淋巴球表面抗原B4或T細胞表面抗原Leu-12，且包括來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生CD19。人類CD19之胺基酸序列顯示於Uniprot寄存編號P15391 (版本160，SEQ ID NO: 62)中。該術語涵蓋「全長」未加工人類CD19以及由細胞中之加工產生的任何人類CD19形式，只要如本文所報導之抗體與其結合即可。CD19為表現於人類B細胞，包括(但不限於)前B細胞、早期發育之B細胞(亦即不成熟B細胞)、經由終末分化為漿細胞之成熟B細胞及惡性B細胞之表面上的結構上不同的細胞表面受體。CD19由大部分前B急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、B細胞慢性淋巴球性白血病(CLL)、前淋巴球性白血病、毛狀細胞白血病、普通急性淋巴球性白血病及一些Null急性淋巴母細胞性白血病表現。CD19於漿細胞上之表現進一步表明其可在分化型B細胞腫瘤(諸如多發性骨髓瘤)上表現。因此，CD19抗原為非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴球性白血病及/或急性淋巴母細胞白血病之治療中免疫療法之靶標。
除非另外指示，否則術語「CD20 」係指B淋巴球抗原CD20，亦稱為B淋巴球表面抗原B1或白血球表面抗原Leu-16，且包括來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生CD20。人類CD20之胺基酸序列顯示於Uniprot寄存編號P11836 (版本149，SEQ ID NO: 63)中。CD20為表現於前B及成熟B淋巴球上之分子量為大致35 kD的疏水性跨膜蛋白。對應的人類基因為膜跨越4域，子族A，成員1，亦稱為MS4A1。此基因編碼膜跨越4A基因家族之一員。此初生蛋白家族之成員之特徵為常見結構特徵及類似的內含子/外顯子剪接界限且在造血細胞及非淋巴組織中呈現獨特的表現模式。此基因編碼B淋巴球表面分子，其在B細胞發育且分化為漿細胞之過程中發揮作用。在家族成員之叢集中，此家族成員侷限於11q12。此基因之替代性剪接產生編碼相同蛋白質之兩個轉錄變體。術語「CD20」涵蓋「全長」的未加工CD20以及由細胞中之加工產生的任何CD20形式。該術語亦涵蓋天然存在之CD20變體，例如剪接變體或等位基因變體。
術語「抗 -CD20 抗體 」及「與CD20結合之抗體」係指能夠以足夠親和力結合CD20以使得該抗體適用作靶向CD20之診斷劑及/或治療劑之抗體。在一個實施例中，抗-CD20抗體與無關非CD20蛋白之結合程度小於該抗體與CD20之結合的約10%，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，與CD20結合之抗體具有≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如10-8 M或更少，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)之解離常數(Kd)。在某些實施例中，抗-CD20抗體與在來自不同物種之CD20中保守的CD20抗原決定基結合。
「II 型 抗 -CD20 抗體 」意謂如Cragg等人, Blood 103 (2004) 2738-2743；Cragg等人, Blood 101 (2003) 1045-1052，Klein等人, mAbs 5 (2013), 22-33中所描述的具有II型抗-CD20抗體之結合特性及生物活性的抗-CD20抗體，且概述於下表1中。 表A. I型及II型抗-CD20抗體之特性 *當IgG1 同型時
II型抗CD20抗體之實例包括例如奧濱尤妥珠單抗(obinutuzumab；GA101)、托斯圖單抗(tositumumab；B1)、人類化B-Ly1抗體IgG1 (揭示於WO 2005/044859中之嵌合人類化IgG1抗體)、11B8 IgG1 (揭示於WO 2004/035607中)及AT80 IgG1。
在一個態樣中，II型抗-CD20抗體包含：重鏈可變區序列(VH CD20)，其包含SEQ ID NO: 73之HCDR1、SEQ ID NO: 74之HCDR2及SEQ ID NO: 75之HCDR3；及輕鏈可變區序列(VL CD20)，其包含SEQ ID NO: 76之LCDR1、SEQ ID NO: 77之LCDR2及SEQ ID NO: 78之LCDR3。在另一態樣中，II型抗-CD20抗體經工程改造以相較於未經工程改造之抗體，在Fc區中具有增加比例的非岩藻糖基化寡醣。在一個態樣中，II型抗-CD20抗體之Fc區中之至少約40%之N-連接寡醣為非岩藻糖基化的。
在一特定態樣中，II型抗-CD20抗體為奧濱尤妥珠單抗(INN, WHO Drug Information, 第26卷, 第4期, 2012, 第453頁所推薦)。如本文中所用，奧濱尤妥珠單抗為GA101之同物異名。商品名為GAZYVA®或GAZYVARO®。此置換所有先前版本(例如，第25卷, 第1期, 2011, 第75-76頁)，且以前被稱為阿夫妥珠單抗(afutuzumab) (INN, WHO Drug Information, 第23卷, 第2期, 2009, 第176頁; 第22卷, 第2期, 2008, 第124頁所推薦)。在一個實施例中，II型抗-CD20抗體包含SEQ ID NO: 79之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 80之輕鏈可變區序列。在一個態樣中，II型抗-CD20抗體為托西莫單抗(tositumomab)。
「I型抗-CD20抗體」意謂選自由以下組成之群的抗-CD20抗體：利妥昔單抗、奧伐木單抗(ofatumumab)、維托珠單抗(veltuzumab)、奧卡拉珠單抗(ocaratuzumab)、奧克珠單抗(ocrelizumab)、PRO131921、烏妥昔單抗(ublituximab)、HI47 IgG3 (ECACC，融合瘤)、2C6 IgG1 (如WO 2005/103081中所揭示)、2F2 IgG1 (如WO 2004/035607及WO 2005/103081中所揭示)及2H7 IgG1 (如WO 2004/056312中所揭示)。特定I型抗-CD20抗體為利妥昔單抗。
「利妥昔單抗」為針對人類CD20抗原之含有經基因工程改造之嵌合人類γ1鼠類恆定域的單株抗體。此嵌合抗體含有人類γ1恆定域且藉由於1998年4月17日所發佈、歸為IDEC Pharmaceuticals Corporation之US 5,736,137 (Andersen等人)中之名稱「C2B8」鑑別。利妥昔單抗經批准用於治療患有復發性或低級折射性或濾泡性CD20陽性B細胞非霍奇金淋巴瘤之患者。活體外作用機制研究已顯示，利妥昔單抗呈現人類補體依賴性細胞毒性(CDC) (Reff, M.E.,等人, Blood 83 (1994) 435-445)。另外，其在量測抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之分析法中呈現明顯的活性。利妥昔單抗未去岩藻糖基化。
術語「人類化B-Ly1抗體」係指如WO 2005/044859及WO 2007/031875中所揭示之人類化B-Ly1抗體，其係藉由與來自IgG1之人類恆定域嵌合及之後的人類化(參見WO 2005/044859及WO 2007/031875)獲自鼠類單株抗-CD20抗體B-Ly1 (鼠類重鏈(VH)之可變區：SEQ ID NO: 64；鼠類輕鏈(VL)之可變區：SEQ ID NO: 65 (參見Poppema, S.及Visser, L., Biotest Bulletin 3 (1987) 131-139)。此等「人類化B-Ly1抗體」詳細揭示於WO 2005/044859及WO 2007/031875中。
除非另有指示，否則術語「纖維母細胞活化蛋白質 (FAP) 」，亦稱為脯胺醯基內肽酶FAP或Seprase (EC 3.4.21)，係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生FAP。該術語涵蓋「全長」未加工FAP以及由細胞中之加工產生的任何FAP形式。該術語亦涵蓋天然存在之FAP變體，例如剪接變體或等位基因變體。在一個實施例中，本發明之抗原結合分子能夠與人類、小鼠及/或食蟹獼猴FAP特異性結合。人類FAP之胺基酸序列顯示於UniProt (www.uniprot.org)寄存編號Q12884 (版本149，SEQ ID NO: 120)或NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeqNP_004451.2中。人類FAP之胞外域(ECD)自胺基酸位置26延伸至胺基酸位置760。His標記之人類FAP ECD之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO: 121中。小鼠FAP之胺基酸序列顯示於UniProt寄存編號P97321 (版本126，SEQ ID NO: 122)或NCBI RefSeq NP_032012.1中。小鼠FAP之胞外域(ECD)自胺基酸位置26延伸至胺基酸位置761。SEQ ID NO: 123顯示His標記之小鼠FAP ECD之胺基酸序列。SEQ ID NO: 124顯示His標記之食蟹獼猴FAP ECD之胺基酸序列。較佳地，本發明之抗-FAP結合分子與FAP之胞外域結合。例示性抗-FAP結合分子描述於國際專利申請案第WO 2012/020006 A2號中。
術語「降低 (reduction) 」(及其文法變化形式，諸如「降低(reduce/reducing)」)，例如B細胞之數目或細胞介素釋放降低，係指各別量之減小，如藉由此項技術中已知之適當方法所量測。出於清楚起見，該術語亦包括降低至零(或低於分析方法之偵測極限)，亦即完全去除或消除。相反，「增加 」係指各別量之增加。
如本文所用，「T 細胞 抗原 」係指呈現於T淋巴球、特定言之細胞毒性T淋巴球之表面上的抗原決定子。
如本文所用，「T 細胞 活化治療劑 」係指能夠在個體內誘導T細胞活化之治療劑，特定言之經設計用於在個體內誘導T細胞活化的治療劑。T細胞活化治療劑之實例包括特異性結合活化T細胞抗原(諸如CD3)及靶細胞抗原(諸如CD20或CD19)的雙特異性抗體。其他實例包括包含T細胞活化域及與靶細胞抗原(諸如CD20或CD19)特異性結合之抗原結合部分的嵌合抗原受體(CAR)。
如本文所用，「活化 T 細胞抗原 」係指由T淋巴球、特定言之細胞毒性T淋巴球表現之抗原決定子，其能夠在與抗原結合分子相互作用時誘導或提高T細胞活化。具體言之，抗原結合分子與活化T細胞抗原的相互作用可藉由觸發T細胞受體複合物之信號級聯來誘導T細胞活化。例示性活化T細胞抗原為CD3。
術語「可變區 」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中涉及抗原結合分子與抗原之結合的域。原生抗體之重鏈及輕鏈(分別為VH及VL)可變域通常具有類似的結構，其中各域包含四個保守性構架區(FR)及三個高變區(HVR)。參見例如Kindt等人, Kuby Immunology, 第6版, W.H. Freeman and Co., 第91頁 (2007)。單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。
如本文所用，術語「高變區 」或「HVR」係指抗體可變域中在序列上具有高變性及/或形成結構上定義之環(「高變環」)的各區域。通常，原生四鏈抗體包含六個HVR；三個位於VH中(H1、H2、H3)，且三個位於VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含來自高變環及/或來自「互補決定區」(CDR)的胺基酸殘基，後者具有最高的序列可變性及/或涉及抗原識別。例示性高變環出現在胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)處。(Chothia及Lesk,J. Mol. Biol. 196:901-917(1987))。例示性CDR (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)出現在L1之胺基酸殘基24-34、L2之胺基酸殘基50-56、L3之胺基酸殘基89-97、H1之胺基酸殘基31-35B、H2之胺基酸殘基50-65及H3之胺基酸殘基95-102處。(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。高變區(HVR)亦稱為「互補決定區」(CDR)，且此等術語在本文中、在提及形成抗原結合區之可變區之部分時可互換使用。此特定區域已由Kabat等人, 美國衛生及人群服務部, 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」 (1983)及由Chothia等人,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)描述，其中當彼此對照比較時，該等定義包括胺基酸殘基之重疊或子集。然而，涉及抗體或其變體之CDR之任何定義的應用意欲處於如本文中所定義及所用之術語的範疇內。涵蓋以上所引用參考文獻中之每一者所定義的CDR的適當胺基酸殘基如下闡述於表B中作為比較。包含特定CDR的精確殘基數目將視CDR序列及大小而變。在抗體之可變區胺基酸序列指定之情況下，熟習此項技術者可以常規方式判定哪些殘基包含特定CDR。 表B. CDR定義1 1 表A中之所有CDR定義之編號皆依據Kabat等人所闡述之編號慣例(參見下文)。2 如表A中所使用之含有小寫字母「b」之「AbM」係指如藉由Oxford Molecular之「AbM」抗體建模軟體所定義的CDR。
Kabat等人亦定義適用於任何抗體之可變區序列之編號系統。一般熟習此項技術者可將此「Kabat編號」系統明確地分配給任何可變區序列，而不依賴於超過序列本身的任何實驗資料。如本文所用，「Kabat編號」係指Kabat等人, 美國衛生及人群服務部, 「Sequence of Proteins of Immunological Interest」 (1983)所闡述之編號系統。除非另外說明，否則提及抗體可變區中之特定胺基酸殘基位置的編號係根據Kabat編號系統。
除VH中之CDR1以外，CDR通常包含形成高變環之胺基酸殘基。CDR亦包含「特異性決定殘基」或「SDR」，其為接觸抗原之殘基。SDR含於簡稱為-CDR或a-CDR之CDR區域內。例示性a-CDR (a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)出現在L1之胺基酸殘基31-34、L2之胺基酸殘基50-55、L3之胺基酸殘基89-96、H1之胺基酸殘基31-35B、H2之胺基酸殘基50-58及H3之胺基酸殘基95-102處。(參見Almagro及Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008))。除非另外指示，否則在本文中，根據Kabat等人之前述文獻對可變域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)進行編號。
如本文所用，在抗原結合分子(例如抗體)之情形下，術語「親和力成熟 」係指衍生於參考抗原結合分子(例如藉由突變)之抗原結合分子，其與同參考抗體相同的抗原結合，較佳地同相同的抗原決定基結合；且與參考抗原結合分子相比對抗原具有更高親和力。親和力成熟通常涉及抗原結合分子之一或多個CDR中一或多個胺基酸殘基之修飾。通常，親和力成熟抗原結合分子與同初始參考抗原結合分子相同的抗原決定基結合。
「構架 」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基之外的可變域殘基。可變域之FR通常由四個FR域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，在VH (或VL)中，HVR及FR序列一般按以下次序呈現：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
出於本文之目的，「受體人類構架 」為包含衍生於如以下所定義之人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之輕鏈可變域(VL)構架或重鏈可變域(VH)構架之胺基酸序列的構架。「衍生於」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之受體人類構架可包含人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數目為10個或更少、9個或更少、8個或更少、7個或更少、6個或更少、5個或更少、4個或更少、3個或更少或2個或更少。在一些實施例中，VL受體人類構架與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架序列在序列上一致。
術語「嵌合 」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分來源於特定來源或物種，同時重鏈及/或輕鏈之其餘部分來源於不同來源或物種之抗體。
抗體之「類別 」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區的類型。存在五種主要類別之抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干者可進一步分成子類(同型)，例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
「人類化 」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含至少一個，且通常兩個可變域之實質上全部可變域，其中HVR之全部或實質上全部可變域(例如，CDR)對應於非人類抗體之彼等，且FR之全部或實質上全部對應於人類抗體之彼等。人類化抗體視情況可包含源自人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式 」係指已經歷人類化之抗體。本發明涵蓋之「人類化抗體」之其他形式為其中恆定區已經額外修飾或自原始抗體發生變化以產生根據本發明之特性(尤其在C1q結合及/或Fc受體(FcR)結合方面)之彼等抗體。
「人類 」抗體為胺基酸序列對應於由人類或人類細胞產生或來源於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體之胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義特別排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
術語「Fc域」或「Fc 區 」在本文中用於定義抗體重鏈中含有恆定區之至少一部分的C端區。該術語包括原生序列Fc區及變異Fc區。IgG Fc區包含IgG CH2及IgG CH3域。人類IgG Fc區之「CH2域」通常自約位置231處之胺基酸殘基延伸至約位置340處之胺基酸殘基。在一個實施例中，碳水化合物鏈與CH2域連接。本文中，CH2域可為原生序列CH2域或變異CH2域。「CH3域」包含Fc區中殘基C端至CH2域之延伸段(亦即IgG之約位置341處之胺基酸殘基至約位置447處之胺基酸殘基)。本文中之CH3區可為原生序列CH3域或變異CH3域(例如在其一條鏈中具有引入的「隆凸」(「杵」)及在其另一條鏈中具有對應引入的「凹穴」(「臼」)之CH3域；參見美國專利第5,821,333號，其明確地以引用之方式併入本文中)。此類變異CH3域可用於促進如本文中所描述之兩個非一致抗體重鏈之雜二聚化。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226、或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。除非本文另外規定，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所描述。
「杵 - 臼 」技術描述於例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人, Prot Eng 9, 617-621 (1996)及Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)中。一般而言，方法涉及在第一多肽之界面處引入隆凸(「杵」)及在第二多肽之界面處引入對應凹穴(「臼」)，使得隆凸可定位於凹穴中以便促進雜二聚體形成且阻礙均二聚體形成。藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換第一多肽界面中之小胺基酸側鏈來構築隆凸。大小與隆凸相同或類似之補償性凹穴係在第二多肽之界面中藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈來產生。隆凸及凹穴可藉由改變編碼多肽之核酸，例如藉由定點突變誘發或藉由肽合成來製備。在一具體實施例中，杵修飾包含Fc域之兩個次單元中之一者中的胺基酸取代T366W，且臼修飾包含Fc域之兩個次單元中之另一者中的胺基酸取代T366S、L368A及Y407V。在另一具體實施例中，包含杵修飾之Fc域之次單元另外包含胺基酸取代S354C，且包含臼修飾之Fc域之次單元另外包含胺基酸取代Y349C。引入此等兩個半胱胺酸殘基使得Fc區之兩個次單元之間形成二硫橋鍵，由此進一步穩定二聚體(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。
「與免疫球蛋白之Fc區等效之區」意欲包括免疫球蛋白之Fc區之天然存在之等位基因變體以及具有變化之變體，該等變化產生取代、添加或缺失，但不實質上降低免疫球蛋白介導效應功能(諸如抗體依賴性細胞毒性)之能力。舉例而言，免疫球蛋白之Fc區之N端或C端可缺失一或多個胺基酸而不實質性損失生物功能。此類變體可根據此項技術中已知的一般法則選擇以對活性具有最小影響(參見例如Bowie, J. U.等人, Science 247:1306-10 (1990))。
術語「效應功能 」係指可歸因於抗體之Fc區的彼等生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、細胞介素分泌、免疫複合體介導之抗原呈遞細胞攝入抗原、下調細胞表面受體(例如B細胞受體)及B細胞活化。
「活化 Fc 受體 」為一種Fc受體，其與抗體之Fc區接合之後，引發信號傳導事件，此刺激攜帶受體之細胞執行效應功能。活化Fc受體包括FcγRIIIa (CD16a)、FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32)及FcαRI (CD89)。特定活化Fc受體為人類FcγRIIIa (參見UniProt寄存編號P08637，版本141)。
如本文所用，術語「效應細胞 」係指將效應部分受體(例如細胞介素受體)及/或Fc受體呈現於其表面上的淋巴球群體，其經由該等受體結合效應部分(例如細胞介素)及/或抗體之Fc區且有助於破壞靶細胞(例如腫瘤細胞)。效應細胞可例如介導細胞毒性或吞噬細胞效應。效應細胞包括(但不限於)效應T細胞，諸如CD8+ 細胞毒素T細胞、CD4+ 輔助T細胞、γδ T細胞、NK細胞、淋巴激素活化殺手(LAK)細胞及巨噬細胞/單核球。
「胞外域 」為膜蛋白中延伸至細胞外空間(亦即靶細胞外之空間)的域。胞外域通常為蛋白質中起始與表面之接觸(其引起信號轉導)之部分。因此，如本文所定義之4-1BBL之胞外域係指4-1BBL中延伸至細胞外空間(胞外域)中且亦包括負責三聚化及與對應受體4-1BB結合的較短部分或其片段的部分。因此，術語「4-1BBL之胞外域或其片段」係指4-1BBL中形成細胞外域的胞外域，或係指其仍能夠與受體結合的部分(受體結合域)。
「4-1BBL 」或「4-1BB 配體 」或「CD137L 」為能夠共刺激T細胞之增殖及細胞介素產生的共刺激TNF配體家族成員。TNF家族配體可在與其相應TNF受體相互相用時共刺激TCR信號，且與其受體之相互相用引起TNFR相關因子(TRAF)之募集，其起始引起T細胞活化之信號級聯。4-1BBL為II型跨膜蛋白。已描述具有SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之完全或全長4-1BBL在細胞表面上形成三聚體。藉由4-1BBL之胞外域之特異性基元實現三聚體之形成。該等基元在本文中稱為「三聚化區」。人類4-1BBL序列(SEQ ID NO: 67)之胺基酸50-254形成4-1BBL之胞外域，但即使其片段亦能夠形成三聚體。在本發明之具體實施例中，術語「4-1BBL之胞外域或其片段」係指具有選自以下之胺基酸序列的多肽：SEQ ID NO: 4 (人類4-1BBL之胺基酸52-254)、SEQ ID NO: 1 (人類4-1BBL之胺基酸71-254)、SEQ ID NO: 3 (人類4-1BBL之胺基酸80-254)、SEQ ID NO: 2 (人類4-1BBL之胺基酸85-254)、SEQ ID NO: 5 (人類4-1BBL之胺基酸71-248)、SEQ ID NO: 6 (人類4-1BBL之胺基酸85-248)、SEQ ID NO: 7 (人類4-1BBL之胺基酸80-248)及SEQ ID NO: 8(人類4-1BBL之胺基酸52-248)，胞外域中能夠三聚化之其他片段且亦包括於本文中。
除非另外指示，否則如本文所用之術語「4-1BB 」或「CD137 」係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)的任何原生4-1BB。該術語涵蓋「全長」未加工4-1BB以及由細胞中之加工產生的任何4-1BB形式。該術語亦涵蓋天然存在之4-1BB變體，例如剪接變體或等位基因變體。例示性人類4-1BB之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO: 68 (Uniprot寄存編號Q07011)中，例示性鼠類4-1BB之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO: 69 (Uniprot寄存編號P20334)中，且例示性獼猴4-1BB (來自恆河猴)之胺基酸序列顯示於SEQIDNO: 70 (Uniprot寄存編號F6W5G6)中。
術語「抗 -4-1BB 抗體 」、「抗-4-1BB」、「4-1BB抗體」及「與4-1BB特異性結合之抗體」係指能夠以足夠親和力結合4-1BB以使得抗體在靶向4-1BB時適用作診斷劑及/或治療劑之抗體。在一個實施例中，抗-4-1BB抗體與無關非-4-1BB蛋白之結合程度小於該抗體與4-1BB之結合的約10%，如例如藉由放射免疫分析(RIA)或流式細胞測量術(FACS)所量測。在某些實施例中，與4-1BB結合之抗體具有≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如10-6 M 或更少，例如10-68 M至10-13 M，例如10-8 M至10-10 M)之解離常數(KD )。舉例而言，烏瑞魯單抗(urelumab)為衍生自抗體20H4.9之抗-4-1BB抗體。
術語「肽連接子 」係指包含一或多個胺基酸(通常約2至20個胺基酸)的肽。肽連接子在此項技術中已知或描述於本文中。合適的非免疫原性連接肽為例如(G4 S)n 、(SG4 )n 或G4 (SG4 )n 肽連接子，其中「n」一般為介於1與10之間，通常介於2與4之間，特定言之為2之數字，亦即肽選自由以下組成之群：GGGGS (SEQIDNO: 81)、GGGGSGGGGS (SEQIDNO: 82)、SGGGGSGGGG (SEQIDNO: 83)及GGGGSGGGGSGGGG (SEQIDNO: 84)，且亦包括序列GSPGSSSSGS (SEQIDNO: 85)、(G4S)3 (SEQ ID NO: 86)、(G4S)4 (SEQIDNO: 87)、GSGSGSGS (SEQIDNO: 88)、GSGSGNGS (SEQIDNO: 89)、GGSGSGSG (SEQIDNO: 90)、GGSGSG (SEQIDNO: 91)、GGSG (SEQIDNO: 92)、GGSGNGSG (SEQIDNO: 93)、GGNGSGSG (SEQIDNO: 94)以及GGNGSG (SEQIDNO: 95)。備受關注之肽連接子為(G4S) (SEQ ID NO: 81)及(G4 S)2 (SEQ ID NO: 82)。
如本申請案內所用之術語「胺基酸 」表示天然存在之羧基α-胺基酸之群，其包含丙胺酸(三字母代碼：ala，一字母代碼：A)、精胺酸(arg，R)、天冬醯胺(asn，N)、天冬胺酸(asp，D)、半胱胺酸(cys，C)、麩醯胺酸(gln，Q)、麩胺酸(glu，E)、甘胺酸(gly，G)、組胺酸(his，H)、異白胺酸(ile，I)、白胺酸(leu，L)、離胺酸(lys，K)、甲硫胺酸(met，M)、苯丙胺酸(phe，F)、脯胺酸(pro，P)、絲胺酸(ser，S)、蘇胺酸(thr，T)、色胺酸(trp，W)、酪胺酸(tyr，Y)及纈胺酸(val，V)。
「融合」或「連接」意謂，組分(例如4-1BBL之多肽及胞外域)藉由肽鍵直接連接，或經由一或多個肽連接子連接。
相對於參考多肽(蛋白質)序列之「胺基酸序列一致性 百分比 (%) 」定義為在比對序列且視需要引入間隙以達成最大序列一致性百分比之後，且在不將任何保守性取代視為序列一致性之一部分的情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基的百分比。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以此項技術內之各種方式達成，例如使用公開可用之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN. SAWI或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可判定適用於比對序列之參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何演算法。然而，出於本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2，產生胺基酸序列一致性%值。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech, Inc.設計，且原始程式碼已在U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559申請用戶文檔，其在此註冊在美國版權註冊第TXU510087號下。ALIGN-2程式可公開獲自Genentech, Inc., South San Francisco, California或可自原始程式碼編輯。ALIGN-2程式經編譯可用於UNIX操作系統，包括數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且不變化。在使用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，既定胺基酸序列A與既定胺基酸序列B (或者，其可表述為與既定胺基酸序列B具有或包含一定胺基酸序列一致性%的既定胺基酸序列A)之胺基酸序列一致性%如下計算： 100乘以分數X/Y 其中X為在A與B之比對程式中藉由序列比對程程式ALIGN-2評為一致匹配之胺基酸殘基之數目，且其中Y為B中之胺基酸殘基之總數目。應瞭解，在胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不相等之情況下，A相對於B之胺基酸序列一致性%與B相對於A之胺基酸序列一致性%將不相等。除非另外特定陳述，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%值如緊接前述段落中所描述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
在某些實施例中，涵蓋本文提供之抗原結合分子之胺基酸序列變體 。舉例而言，可能需要改良抗原結合分子之結合親和力及/或其他生物特性。抗原結合分子之胺基酸序列變體可藉由將適當修飾引入至編碼分子之核苷酸序列中或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如抗體之胺基酸序列內的殘基缺失及/或插入及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所需特徵，例如抗原結合。用於取代型突變誘發之所關注位點包括HVR及構架(FR)。保守性取代提供於表C中標題「較佳取代」下且在下文中參考胺基酸側鏈類別(1)至(6)進一步描述。可將胺基酸置換引入至所關注之分子中，且針對所需活性進行篩選之產物例如保持/改良抗原結合或減少免疫原性，或改良ADCC或CDC。 表C
胺基酸可根據共有側鏈特性進行分組： (1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3)酸性：Asp、Glu； (4)鹼性：His、Lys、Arg； (5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro； (6)芳族性：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代將引起此等類別中之一者之成員換成另一個類別。
術語「胺基酸序列變體 」包括其中在母體抗原結合分子(例如人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基中存在胺基酸取代的實質性變體。一般而言，所選擇之用於進一步研究之所得變體與母體抗原結合分子相比將具有某些生物特性之修飾(例如改良) (例如提高之親和力、降低之免疫原性)及/或將實質上保留母體抗原結合分子之某些生物特性。一種示例性取代型變體為親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文所描述之彼等技術)便利地產生。簡言之，一或多個CDR殘基發生突變且變異抗原結合分子呈現於噬菌體上且針對特定生物活性(例如結合親和力)進行篩檢。在某些實施例中，取代、插入或缺失可出現於一或多個CDR內，只要此類改變不實質上降低抗原結合分子結合抗原之能力即可。舉例而言，不實質上降低結合親和力之保守改變(例如，如本文所提供之保守取代)可以在CDR中進行。一種適用於鑑別可作為突變誘發之靶標之抗體之殘基或區域的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如Cunningham及Wells (1989)Science , 244:1081-1085所描述。在此方法中，鑑別一個或一組靶標殘基(例如，帶電殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)，且用中性或帶負電胺基酸(例如，丙胺酸或聚丙胺酸)置換以判定抗體與抗原之相互作用是否受影響。可在對初始取代展現功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。可替代地或另外，抗原-抗原結合分子複合物之晶體結構用以鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及鄰近殘基可作為取代候選物之靶標或排除在取代候選物之外。可篩檢變體以判定其是否含有所需特性。
胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百個或多於一百個殘基之多肽範圍內的胺基端及/或羧基端融合，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗原結合分子。分子之其他插入型變體包括N或C端與多肽之融合，此延長抗原結合分子之血清半衰期。
在某些實施例中，本文提供之抗原結合分子經改變以提高或降低抗體經糖基化之程度。可藉由改變胺基酸序列使得產生或移除之一或多個糖基化位點來便利地獲得分子之糖基化變體。在抗原結合分子包含Fc區之情況下，可改變與其連接之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之原生抗體通常包含分支鏈雙觸角寡醣，其一般藉由N鍵與Fc區之CH2域的Asn297連接。參見例如Wright等人TIBTECH 15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接至雙觸寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc的岩藻糖。在一些實施例中，可對抗原結合分子中之寡醣進行修飾以便產生具有某些改良特性之變體。在一個態樣中，提供具有缺乏與Fc區(直接或間接)連接之岩藻糖之碳水化合物結構的抗原結合分子的變體。此類岩藻糖基化變體可具有改良之ADCC功能，參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta, L.)或US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。本發明之抗原結合分子之其他變體包括具有平分寡醣之變體，例如其中與Fc區連接之雙觸角寡醣經GlcNAc平分。此類變體可具有降低之岩藻糖基化及/或改良之ADCC功能，參見例如WO 2003/011878 (Jean-Mairet等人)；美國專利第6,602,684號(Umana等人)；及US 2005/0123546 (Umana等人)。亦提供寡醣中之至少一個半乳糖殘基與Fc區連接之抗體變體。該等抗體變體可具有改良之CDC功能且描述於例如WO 1997/30087 (Patel等人)；WO 1998/58964 (Raju, S.)；及WO 1999/22764 (Raju, S.)中。
「工程改造」(特定言之使用前綴「糖基」)以及術語「糖基化工程改造」包括細胞之糖基化機制之代謝工程改造，包括基因操縱寡醣合成路徑以達成表現於細胞中之醣蛋白之變化的糖基化。此外，糖基化工程改造包括突變及細胞環境對糖基化之作用。在一個實施例中，糖基化工程改造為糖基轉移酶活性之變化。在一特定實施例中，工程改造引起葡萄糖胺基轉移酶活性及/或岩藻糖基轉移酶活性變化。糖基化工程改造可用於獲得「具有提高之GnTIII活性之宿主細胞」(例如，經操縱以表現提高水準之具有β(1,4)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III (GnTIII)活性之一或多種多肽的宿主細胞)、「具有提高之ManII活性之宿主細胞」(例如，經操縱以表現提高水準之具有α-甘露糖苷酶II (ManII)活性之一或多種多肽的宿主細胞)或「具有降低α(1,6)岩藻糖基轉移酶活性之宿主細胞」(例如，經操縱以表現降低水準之α(1,6)岩藻糖基轉移酶的宿主細胞)。
如本文所用，術語「具有GnTIII活性之多肽」係指能夠催化β-1,4鍵中之N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)殘基添加至N-連接寡醣之三甘露糖基核心之β-連接之甘露糖甘的多肽。此包括呈現與β(1,4)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III (根據國際生物化學及分子生物學聯合命名委員會(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology；NC-IUBMB)，亦稱為β-1,4-甘露糖基-醣蛋白4-β-N-乙醯基葡糖胺基-轉移酶(EC 2.4.1.144))之活性類似，但未必一致之酶活性的融合多肽，如在具有或不具有劑量依賴性之特定生物分析法中量測。在其中劑量依賴性確實存在之情況下，其不一定與GnTIII之活性一致，而實際上在給定活性下其劑量依賴性實質上與GnTIII之劑量依賴性類似(亦即，相對於GnTIII，候選多肽將呈現更高活性或低不大於約25倍，且較佳地低不大於約十倍活性，且最佳地低不大於約三倍活性)。
抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)為導致免疫效應細胞溶解塗有抗體之靶細胞的免疫機制。靶細胞為包含Fc區之抗體或其片段與Fc區特異性結合(一般經由N端之蛋白質部分)的細胞。如本文所用，術語「增加 / 降低之 ADCC 」定義為在圍繞靶細胞之培養基中，在給定抗體濃度下，在給定時間內，藉由上文所定義之ADCC機制溶解之靶細胞的數目增加/減少，及/或在圍繞靶細胞之培養基中，在給定時間內，藉由ADCC機制達成給定數目個標靶細胞溶解所需的抗體濃度降低/增加。ADCC之增加/減少係相對於由同類型宿主細胞使用相同的標準生產、純化、調配及儲存方法(熟習此項技術者已知)所產生、但尚未經工程改造之相同抗體介導的ADCC而言。舉例而言，藉由本文所描述之方法經工程改造以具有糖基化之變化模式(例如以表現糖基轉移酶GnTIII或其他糖基轉移酶)之由宿主細胞產生之抗體介導的ADCC之增加，係相對於藉由相同類型之未經工程改造之宿主細胞產生之相同抗體介導的ADCC而言。
在某些態樣中，本發明涵蓋擁有一些但並非所有效應功能之抗體變體，該等效應功能使其成為抗體在活體內之半衰期至關重要且某些效應功能(諸如補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC))不必要或有害之應用的所需候選。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以確認CDC及/或ADCC活性之降低/消耗。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體缺乏FcγR結合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之主要細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現概述於Ravetch及Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)之第464頁之表3中。用以評定所關注分子之ADCC活性之活體外分析之非限制性實例描述於美國專利第5,500,362號(參見例如Hellstrom, I.等人 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986))及Hellstrom, I等人, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；第5,821,337號(參見Bruggemann, M.等人, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987))中。替代地，可採用非放射性分析方法(參見例如用於流式細胞測量術之ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；及CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI))。適用於此類分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。可替代地或另外，可例如在動物模型中，諸如Clynes等人, Proc Nat'l Acad Sci USA 95:652-656 (1998)中所揭示之動物模型中，活體內評定所關注分子之ADCC活性。亦可進行C1q結合分析以確認抗體不能結合C1q且因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為了評定補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S.等人, Blood 101:1045-1052 (2003)；及Cragg, M.S.及M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004))。亦可使用此項技術中已知之方法(參見例如Petkova, S.B.等人, Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)；WO 2013/120929 Al)進行FcRn結合及活體內清除/半衰期測定。
效應功能降低之抗體包括具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者之取代的彼等抗體(美國專利第6,737,056號)。此類Fc突變體包括具有胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者之取代的Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸的所謂「DANA」 Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。描述具有改良或減弱之與FcR之結合的某些抗體變體。(參見例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312，及Shields等人, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001))。在某些實施例中，抗體變體包含具有改良ADCC之一或多個胺基酸取代，例如Fc區之位置298、333及/或334 (殘基之EU編號)處之取代的Fc區。
在某些態樣中，抗體變體包含具有減少FcγR結合之一或多個胺基酸取代，例如Fc區之位置234及235 (殘基之EU編號)處之取代的Fc區。在一個態樣中，該等取代為L234A及L235A (LALA)。在某些態樣中，抗體變體進一步包含來源於人類IgG1 Fc區之Fc區中的D265A及/或P329G。在一個態樣中，該等取代為來源於人類IgG1 Fc區之Fc區中的L234A、L235A及P329G (LALA-PG)。(參見例如WO 2012/130831)。在另一態樣中，該等取代為來源於人類IgG1 Fc區之Fc區中的L234A、L235A及D265A (LALA-DA)。
在一些實施例中，在Fc區中製備引起C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)變化(亦即，提高或減弱)的變化，例如如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie 等人 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)中所描述。
半衰期延長且與負責將母體IgG轉移至胎兒之新生兒Fc受體(FcRn) (Guyer等人, J. Immunol. 117:587 (1976)及Kim等人, J. Immunol. 24:249 (1994))之結合改良的抗體，描述於US 2005/0014934 (Hinton等人)中。彼等抗體包含其中具有一或多個取代之Fc區，該等取代改良Fc區與FcRn的結合。此類Fc變體包括具有以下Fc區殘基中之一或多者處之取代的彼等：238、252、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc區殘基434之取代(參見例如美國專利第7,371,826號；Dall'Acqua, W.F.等人 J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524)。
在某些態樣中，抗體變體包含具有降低FcRn結合之一或多個胺基酸取代，例如Fc區之位置253及/或310及/或435(殘基之EU編號)處之取代的Fc區。在某些態樣中，抗體變體包含具有位置253、310及435處之胺基酸取代的Fc區。在一個態樣中，該等取代為來源於人類IgG1 Fc區之Fc區中的I253A、H310A及H435A。參見例如Grevys, A.等人, J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508。
在另一態樣中，抗體變體包含具有降低FcRn結合之一或多個胺基酸取代，例如Fc區之位置310及/或433及/或436 (殘基之EU編號)處之取代的Fc區。在某些態樣中，抗體變體包含具有位置310、433及436處之胺基酸取代之Fc區。在一個態樣中，該等取代為來源於人類IgG1 Fc區之Fc區中的H310A、H433A及Y436A。(參見例如WO 2014/177460 Al)。
在某些態樣中，抗體變體包含具有增加FcRn結合之一或多個胺基酸取代，例如Fc區之位置252及/或254及/或256 (殘基之EU編號)處之取代的Fc區。在某些實施例中，抗體變體包含具有位置252、254及256處之胺基酸取代之Fc區。在一個實施例中，該等取代為來源於人類IgG1 Fc區之Fc區中的M252Y、S254T及T256E (亦參見Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及關於Fc區變體之其他實例的WO 94/29351)。
在某些實施例中，可能需要產生本發明之抗原結合分子之半胱胺酸工程改造的變體 ，例如「thioMAb」，其中該分子之一或多個殘基被半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代之殘基存在於分子之可達位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，藉此將反應性硫醇基安置於抗體之可達位點處，且可用於使抗體與其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)結合以產生免疫結合物。在某些實施例中，以下殘基中之任一者或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205 (Kabat編號)；重鏈之A118 (EU編號)；及重鏈Fc區之S400 (EU編號)。半胱胺酸工程改造之抗原結合分子可例如美國專利第7,521,541號中所描述產生。
在某些態樣中，本文所提供之抗原結合分子可進一步經修飾以含有為此項技術中已知且可容易獲得之額外非蛋白質部分。適用於抗體之衍生化之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及聚葡萄糖或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其在水中之穩定性而可能在製造中具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為分支鏈或未分支鏈的。與抗體連接之聚合物的數目可變化，且若連接多於一個聚合物，則聚合物可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生化之聚合物之數目及/或類型可基於包括(但不限於)待改良抗體之特定特性或功能、雙特異性抗體衍生物是否將用於限定條件下之療法等考慮因素來判定。在另一態樣中，提供抗體與可藉由暴露於輻射來選擇性地加熱之非蛋白質部分之結合物。在一個實施例中，非蛋白質部分為碳奈米管(Kam, N.W.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605)。輻射可具有任何波長，且包括(但不限於)不損害普通細胞但將非蛋白質部分加熱至殺死抗體-非蛋白質部分近側之細胞之溫度的波長。在另一態樣中，可獲得本文所提供之含4-1BBL抗原結合分子之免疫結合物。「免疫結合物 」為與一或多個異源分子，包括(但不限於)細胞毒性劑結合之抗體。
術語「聚核苷酸 」係指經分離核酸分子或構築體，例如信使RNA (mRNA)、病毒源性RNA或質體DNA (pDNA)。聚核苷酸可包含習知磷酸二酯鍵或非習知鍵(例如醯胺鍵，諸如肽核酸(PNA)中所發現)。術語「核酸分子」係指聚核苷酸中存在之任一或多個核酸區段，例如DNA或RNA片段。
「經分離 」核酸分子或聚核苷酸意指已自其原生環境中移出的核酸分子、DNA或RNA。舉例而言，出於本發明之目的，編碼載體中所含之多肽的重組聚核苷酸視為經分離的。經分離聚核苷酸的其他實例包括異源宿主細胞中所維持之重組聚核苷酸或溶液中經純化(部分或實質上)之聚核苷酸。經分離聚核苷酸包括通常含有聚核苷酸分子之細胞中所含的聚核苷酸分子，但聚核苷酸分子存在於染色體外或存在於與其天然染色體位置不同之染色體位置處。經分離RNA分子包括本發明之活體內或活體外RNA轉錄物，以及正股及負股形式，及雙股形式。根據本發明之經分離聚核苷酸或核酸進一步包括以合成方式產生之此類分子。另外，聚核苷酸或核酸可為或可包括調節元件，諸如啟動子、核糖體結合位點或轉錄終止子。
一種核酸或聚核苷酸的核苷酸序列與本發明之參考核苷酸序列具有至少例如95%「一致」，意指該聚核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致，但該聚核苷酸序列相對於參考核苷酸序列可每100個核苷酸中包括至多五個點突變。換言之，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%一致的聚核苷酸，參考序列中至多5%的核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代，或參考序列中可插入佔參考序列核苷酸總數至多5%的多個核苷酸。參考序列之此等變化可發生於參考核苷酸序列之5'或3'末端位置或此等末端位置之間的任何位置，此等位置個別地散佈於參考序列中之殘基中或參考序列內之一或多個相鄰基團中。實際上，可使用已知電腦程式，諸如上文關於多肽所論述之一者(例如ALIGN-2)，習知地測定任何特定聚核苷酸序列是否與本發明之核苷酸序列為至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。
術語「表現盒 」係指以重組或合成方式產生之聚核苷酸，其具有容許特定核酸在靶細胞中發生轉錄的一系列特定核酸元件。重組表現盒可併入質體、染色體、粒線體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。通常，表現載體之重組表現盒部分包括待轉錄之核酸序列及啟動子，以及其他序列。在某些實施例中，本發明之表現盒包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段的聚核苷酸序列。
術語「載體 」或「表現載體」與「表現構築體」同義，且係指用於引入特定基因且引導該基因表現的DNA分子，該DNA分子與該基因在靶細胞中可操作地連接。該術語包括作為自我複製核酸結構之載體以及併入至已引入其之宿主細胞之基因組中的載體。本發明之表現載體包含表現盒。表現載體允許大量的穩定mRNA發生轉錄。一旦表現載體進入靶細胞內，則藉由細胞轉錄及/或轉譯機制產生由該基因編碼的核糖核酸分子或蛋白質。在一個實施例中，本發明之表現載體包含表現盒，該表現盒包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段的聚核苷酸序列。
術語「宿主細胞 」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用，且係指已引入外源核酸之細胞，包括此類細胞之後代。宿主細胞包括「轉化體」及「經轉化的細胞」，其包括初代轉化細胞及自其衍生之後代(不考慮繼代次數)。後代之核酸含量與母細胞可能不完全相同，但可能含有突變。本文包括針對原始轉化細胞篩檢或選擇具有相同功能或生物活性之突變型後代。宿主細胞為可用於產生本發明之雙特異性抗原結合分子之任何類型的細胞系統。宿主細胞包括培養細胞，例如哺乳動物培養細胞，諸如CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及植物細胞(僅舉數例)，且亦包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或培養植物或動物組織內所含的細胞。
藥劑之「有效量 」係指在所投與之細胞或組織中產生生理變化所需的量。
藥劑，例如醫藥組合物之「治療有效量 」係指在劑量及必需時間段下，有效達成所需治療性或防治性結果的量。治療有效量之藥劑例如消除、減少、延遲、最小化或預防疾病之副作用。
「個體 (individual/subject)」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如牛、羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。特定言之，個體(individual/subject)為人類。
術語「醫藥組合物 」係指所呈形式允許其中所含活性成分之生物活性有效發揮的製劑，且其不含對調配物將投與之個體具有不可接受毒性之其他組分。
「醫藥學上可接受之賦形劑 」係指醫藥組合物中之除活性成分之外的對個體無毒的成分。醫藥學上可接受之賦形劑包括(但不限於)緩衝劑、穩定劑或防腐劑。
術語「藥品說明書 」用以指通常包括於治療性產品之商業包裝中的說明書，其含有關於與使用此類治療性產品有關之適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、禁忌症及/或警告的資訊。
如本文所用，「治療 (treatment)」(及其語法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指試圖改變所治療個體之自然病程的臨床介入且可出於防治目的或在臨床病理學之病程期間進行。所需治療效果包括(但不限於)預防疾病發生或復發，緩解症狀，減輕疾病之任何直接或間接病理性結果，預防癌轉移，減緩疾病進展速率，改善或緩和疾病病況及緩解或改良預後。在一些實施例中，本發明之分子用於延遲疾病發展或減慢疾病之進展。
如本文所用，術語「癌症 」係指增殖性疾病，諸如淋巴瘤或淋巴球性白血病，或黑素瘤。
「B 細胞 增殖性病症 」意謂患者之B細胞數目相較於健康個體之B細胞數目增加，且特定言之，其中B細胞數目之增加為疾病之病因或標誌的疾病。「CD20陽性B細胞增殖性病症」為其中B細胞、特定言之惡性B細胞(除正常B細胞外)表現CD20之B細胞增殖性病症。例示性B細胞增殖病症包括：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、彌漫性大型B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)以及一些類型之多發性骨髓瘤(MM)及霍奇金淋巴瘤(HL)。
用於本發明中之例示性4-1BB促效劑 特定言之，與抗-CD20抗體組合使用的包含能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑為包含4-1BBL的分子。特定言之，用於本發明之4-1BB促效劑包含三個4-1BBL胞外域或其片段。
在一特定態樣中，4-1BB促效劑為包含三個4-1BBL胞外域或其片段之分子，且其中該等4-1BBL胞外域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8，特定言之SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。
本文中已顯示，4-1BB促效劑在其包含對腫瘤靶標，特定言之對B細胞上之靶標具有特異性之抗原結合域時尤其適用。因此，在另一態樣中，4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含三個4-1BBL胞外域或其片段及能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域。
本文中已進一步顯示，包含能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑未經CD19內化至B細胞中，且因此未丟失其與腫瘤微環境相互作用之能力。在另一態樣中，提供一種將不會被內化於B細胞中從而維持其活性的4-1BB促效劑。
在另一態樣中，4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含三個4-1BBL胞外域或其片段及能夠與CD19特異性結合之至少一個部分，其中能夠與CD19特異性結合的抗原結合域為食蟹獼猴交叉反應性的(cyno-cross-reactive)，亦即能夠與CD19特異性結合的抗原結合域與人類及食蟹獼猴CD19特異性結合。
在另一態樣中，4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含三個4-1BBL胞外域或其片段及能夠與CD19特異性結合之至少一個部分，其中能夠與CD19特異性結合之抗原結合域包含： (a)重鏈可變區(VH CD19)，其包含：(i) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CD19)，其包含：(iv) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列，或 (b) VH域，其包含：(i) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列；及VL域，其包含：(iv) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。
在一特定態樣中，能夠與CD19特異性結合之抗原結合域包含：VH域，其包含：(i) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列；及VL域，其包含：(iv) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。
在另一態樣中，4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含三個4-1BBL胞外域或其片段及能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域，其中能夠與CD19特異性結合之抗原結合域包含：含有SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)，或其中能夠與CD19特異性結合之抗原結合域包含：含有SEQ ID NO: 23之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)。更特定言之，能夠與CD19特異性結合抗原結合域包含：含有SEQ ID NO: 23之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)。
在另一態樣中，4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子進一步包含由能夠穩定結合之第一及第二次單元構成的Fc域。在一個態樣中，4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含IgG Fc域，具體言之IgG1 Fc域或IgG4 Fc域。特定言之，4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含含有降低與Fc受體之結合及/或效應功能的一或多個胺基酸取代的Fc域。在一特定態樣中，4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含含有胺基酸取代L234A、L235A及P329G之IgG1 Fc域。
在一個態樣中，4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域， (b)第一及第二多肽，其藉由二硫鍵彼此連接， 其中該第一多肽包含藉由肽連接子彼此連接的兩個4-1BBL胞外域或其片段，且其中該第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段。
在一特定態樣中，4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個Fab域，及 (b)第一及第二多肽，其藉由二硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於： (i)分別地，第一多肽含有CH1或CL域及第二多肽含有CL或CH1域，其中第二多肽藉由CH1域與CL域之間的二硫鍵與第一多肽連接，且其中第一多肽包含兩個4-1BBL胞外域或其片段，該等胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且與CH1或CL域連接，且其中第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子與該多肽之CL或CH1域連接，或 (ii)分別地，第一多肽含有CH3域及第二多肽含有CH3域，且其中第一多肽包含兩個4-1BBL胞外域或其片段，該等胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且與CH3域之C端連接，且其中第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段，該一個胞外域或其片段經由肽連接子與該多肽之CH3域之C端連接，或 (iii)分別地，該第一多肽含有VH-CL或VL-CH1域及該第二多肽含有VL-CH1域或VH-CL域，其中該第二多肽藉由CH1域與CL域之間的二硫鍵與第一多肽連接，且其中第一多肽包含兩個4-1BBL胞外域或其片段，該等胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且與VH或VL連接，且其中第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子與該多肽之VL或VH連接。
在另一態樣中，4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個Fab域，該至少一個Fab域包含：含有SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)，或含有SEQ ID NO: 23之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)，及 (b)第一及第二多肽，其藉由二硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於，該第一多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO: 32，且在於該第二多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8。
在一特定態樣中，4-1BB促效劑為選自由以下組成之群的抗原結合分子： a)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 35之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 36之胺基酸序列的第二輕鏈； b)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 37之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的第二輕鏈； c)分子，其包含含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 39之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 40之胺基酸序列的第二重鏈； d)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 41之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 42之胺基酸序列的第二輕鏈； e)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 43之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 44之胺基酸序列的第二輕鏈； f)分子，其包含含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 45之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 46之胺基酸序列的第二重鏈； g)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 35之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 36之胺基酸序列的第二輕鏈； h)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 37之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的第二輕鏈； i)分子，其包含含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 49之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的第二重鏈； j)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 41之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 42之胺基酸序列的第二輕鏈； k)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 43之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 44之胺基酸序列的第二輕鏈；及 l)分子，其包含含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 51之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 52之胺基酸序列的第二重鏈。
在另一態樣中，該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域， (b)包含藉由肽連接子彼此連接之三個4-1BBL胞外域或其片段的多肽。
在一個態樣中，4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域， (b)包含藉由肽連接子彼此連接之三個4-1BBL胞外域或其片段的多肽，及 (c)由能夠穩定結合之第一及第二次單元構成之Fc域，其中包含藉由肽連接子彼此連接之三個4-1BBL胞外域或其片段的多肽視情況經由肽連接子與Fc域之兩個次單元中之一者的N端或C端胺基酸融合。
在一特定態樣中，4-1BB促效劑為選自由以下組成之群的抗原結合分子： (a)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)及含有SEQ ID NO: 53之胺基酸序列的融合蛋白， (b)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)及含有SEQ ID NO: 53之胺基酸序列的融合蛋白； (c)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)及含有SEQ ID NO: 54之胺基酸序列的融合蛋白，及 (d)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)及含有SEQ ID NO: 55之胺基酸序列的融合蛋白。
在另一態樣中，4-1BB促效劑為抗-CD19/抗-4-1BB雙特異性抗體。
在另一態樣中，4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含三個4-1BBL胞外域或其片段及能夠與FAP特異性結合之至少一個抗原結合域，其中能夠與FAP特異性結合之抗原結合域包含： (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 96之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 97之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 98之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 102之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 103之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 105之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 106之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 107之胺基酸序列。
在一特定態樣中，能夠與FAP特異性結合之抗原結合域包含：重鏈可變區(VH FAP)，其包含：(i) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 102之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 103之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含：(iv) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 105之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 106之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 107之胺基酸序列。
在另一態樣中，4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含三個4-1BBL胞外域或其片段及能夠與FAP特異性結合之至少一個抗原結合域，其中能夠與FAP特異性結合之抗原結合域包含：含有胺基酸序列SEQ ID NO: 108之重鏈可變區(VH FAP)及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 109之輕鏈可變區(VL FAP)，或其中能夠與FAP特異性結合之抗原結合域包含：含有胺基酸序列SEQ ID NO: 110之重鏈可變區(VH FAP)及含有胺基酸序列SEQ ID NO: 111之輕鏈可變區(VL FAP)。更特定言之，能夠與FAP特異性結合抗原結合域包含：含有SEQ ID NO: 110之胺基酸序列的重鏈可變區(VH FAP)及含有SEQ ID NO: 111之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL FAP)。
在另一態樣中，4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子進一步包含由能夠穩定結合之第一及第二次單元構成的Fc域。在一個態樣中，4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含IgG Fc域，具體言之IgG1 Fc域或IgG4 Fc域。特定言之，4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含含有降低與Fc受體之結合及/或效應功能的一或多個胺基酸取代的Fc域。在一特定態樣中，4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含含有胺基酸取代L234A、L235A及P329G之IgG1 Fc域。
在一個態樣中，4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與FAP特異性結合之至少一個抗原結合域， (b)第一及第二多肽，其藉由二硫鍵彼此連接， 其中該第一多肽包含藉由肽連接子彼此連接的兩個4-1BBL胞外域或其片段，且其中該第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段。
在一特定態樣中，4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與FAP特異性結合之至少一個Fab域，及 (b)第一及第二多肽，其藉由二硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於： (i)分別地，第一多肽含有CH1或CL域及第二多肽含有CL或CH1域，其中第二多肽藉由CH1域與CL域之間的二硫鍵與第一多肽連接，且其中第一多肽包含兩個4-1BBL胞外域或其片段，該等胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且與CH1或CL域連接，且其中第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子與該多肽之CL或CH1域連接，或 (ii)分別地，第一多肽含有CH3域及第二多肽含有CH3域，且其中第一多肽包含兩個4-1BBL胞外域或其片段，該等胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且與CH3域之C端連接，且其中第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段，該一個胞外域或其片段經由肽連接子與該多肽之CH3域之C端連接，或 (iii)分別地，該第一多肽含有VH-CL或VL-CH1域及該第二多肽含有VL-CH1域或VH-CL域，其中該第二多肽藉由CH1域與CL域之間的二硫鍵與第一多肽連接，且其中第一多肽包含兩個4-1BBL胞外域或其片段，該等胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且與VH或VL連接，且其中第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子與該多肽之VL或VH連接。
在一特定態樣中，4-1BB促效劑為選自由以下分子組成之群的抗原結合分子：分子，其包含含有SEQ ID NO: 112之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 41之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 42之胺基酸序列的第二輕鏈。
在另一態樣中，該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與FAP特異性結合之至少一個抗原結合域， (b)包含藉由肽連接子彼此連接之三個4-1BBL胞外域或其片段的多肽。
特定雙特異性抗體描述於PCT公開案第WO 2016/075278 A1號中或PCT公開案第WO 2016/156291A1號中。
在另一態樣中，4-1BB促效劑為抗-FAP/抗-4-1BB雙特異性抗體。
用於本發明中之抗原結合分子之製備 在某些態樣中，用於組合中之治療劑包含多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些態樣中，該等結合特異性係針對不同抗原的。在某些態樣中，該等結合特異性係針對相同抗原上之不同抗原決定基。雙特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段。
用於製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)：具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之重組共表達(參見Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))、WO 93/08829及Traunecker等人, EMBO J. 10: 3655 (1991))，及「杵-臼」工程改造(參見例如美國專利第5,731,168號)。多特異性抗體亦可如下製備：用於製備抗體Fc-雜二聚分子之工程改造靜電導向效應(WO 2009/089004A1)；使兩種或更多種抗體或片段交聯(參見例如美國專利第4,676,980號及Brennan等人, Science, 229: 81 (1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992))；使用用於製備雙特異性抗體片段之「雙功能抗體」技術(參見例如Hollinger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993))；及使用單鏈Fv (sFv)二聚體(參見例如Gruber等人, J. Immunol., 152:5368 (1994))；及如例如Tutt等人, J. Immunol. 147: 60 (1991)中所秒述製備三特異性抗體。
本文亦包括經工程改造的具有三個或更多個功能性抗原結合位點的抗體(包括「章魚抗體」) (參見例如US 2006/0025576A1)。
本文中之抗體或片段亦包括包含與兩個不同抗原結合之抗原結合位點的「雙作用FAb」或「DAF」(參見例如US 2008/0069820)。本文中亦包括「互換單抗(Crossmab)」抗體(參見例如WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO2009/080253或WO2009/080254)。
用於製備雙特異性抗體片段之另一技術為「雙特異性T細胞接合子」或BiTE®方法(參見例如WO2004/106381、WO2005/061547、WO2007/042261及WO2008/119567)。此方法利用排列於單一多肽上之兩個抗體可變域。舉例而言，單一多肽鏈包括兩個單鏈Fv (scFv)片段，各自具有藉由長度足以允許兩個域之間的分子內結合的多肽連接體分隔的可變重鏈(VH)域及可變輕鏈(VL)域。此單一多肽進一步包含兩個scFv片段之間的多肽間隔序列。各scFv識別不同抗原決定基，且此等抗原決定基可對不同細胞類型具有特異性，以使得當各scFv與其同源抗原決定基接合時兩個不同細胞類型之細胞接近或經繫栓。此方法之一個特定實施例包括識別與另一scFv連接之由免疫細胞表現之細胞表面抗原(例如T細胞上之CD3多肽)的scFv，該另一scFv識別由靶細胞(諸如惡性或腫瘤細胞)表現之細胞表面抗原。
由於其為單一多肽，所以可使用此項技術中已知之任何原核或真核生物細胞表現系統(例如CHO細胞株)，來表現雙特異性T細胞接合子。然而，特定純化技術(參見例如EP1691833)可為將單體雙特異性T細胞接合子與其他多聚物種分離所必需的，該等其他多聚物種可具有除單體之預期活性外之生物活性。在一個例示性純化方案中，首先對含有所分泌多肽之溶液進行金屬親和層析，且用咪唑濃度之梯度溶離多肽。使用陰離子交換層析法進一步純化此溶離液，且使用氯化鈉濃度之梯度溶離多肽。最後，對此溶離液進行尺寸排阻層析法以將單體與多聚物種分離。在一個態樣中，用於本發明中之雙特異性抗體由包含藉由肽連接子彼此融合之兩個單鏈FV片段(scFV)的單一多肽鏈構成。
降低Fc受體結合及/或效應功能之Fc域修飾 本發明之抗原結合分子之Fc域由包含免疫球蛋白分子之重鏈域的一對多肽鏈組成。舉例而言，免疫球蛋白G (IgG)分子之Fc域為二聚體，其中各次單元包含CH2及CH3 IgG重鏈恆定域。Fc域之兩個次單元彼此間能夠穩定結合。
Fc域賦予本發明之抗原結合分子有利的藥物動力學特性，包括長血清半衰期，其促進靶組織中之良好聚集，及有利的組織-血液分佈率。然而，其同時可引起本發明之雙特異性抗體不合需要地靶向表現Fc受體之細胞而非靶向較佳的攜帶抗原之細胞。因此，在特定態樣中，相較於原生IgG1 Fc域，本發明之抗原結合分子之Fc域呈現與Fc受體之降低結合親和力及/或降低效應功能。在一個態樣中，Fc不實質上與Fc受體結合及/或不誘導效應功能。在一特定態樣中，Fc受體為Fcγ受體。在一個態樣中，Fc受體為人類Fc受體。在一個特定態樣中，Fc受體為活化人類Fcγ受體，更特定言之，人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特定言之，人類FcγRIIIa。在一個態樣中，Fc域不誘導效應功能。降低之效應功能可包括(但不限於)以下中之一或多者：降低之補體依賴性細胞毒性(CDC)、降低之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、降低之抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、降低之細胞介素分泌、降低之免疫複合物介導之抗原呈遞細胞攝入抗原、降低之與NK細胞之結合、降低之與巨噬細胞之結合、降低之與單核球之結合、降低之與多形核細胞之結合、降低之誘導細胞凋亡之直接信號傳導、降低之樹突狀細胞成熟或降低之T細胞活化。
在某些態樣中，可將一或多個胺基酸修飾引入至本文所提供之抗體的Fc區中，從而產生Fc區變體。Fc區變體可包含在一或多個胺基酸位置處含有胺基酸修飾(例如取代)之人類Fc區序列(例如，人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在一特定態樣中，本發明提供一種抗體，其中Fc域包含降低與Fc受體、詳言之Fcγ受體之結合的一或多個胺基酸取代。
在一個態樣中，本發明之抗體之Fc域包含降低Fc域對Fc受體之結合親和力及/或效應功能的一或多個胺基酸突變。典型地，Fc域之兩個次單元中之每一者中存在相同的一或多個胺基酸突變。特定言之，Fc域在位置E233、L234、L235、N297、P331及P329 (EU編號)處包含胺基酸取代。特定言之，Fc域包含IgG重鏈之位置234及235 (EU編號)及/或329 (EU編號)處的胺基酸取代。更特定言之，提供一種根據本發明之抗體，其包含在IgG重鏈中具有胺基酸取代L234A、L235A及P329G (「P329G LALA」，EU編號)之Fc域。胺基酸取代L234A及L235A係指所謂的LALA突變。胺基酸取代之「P329G LALA」組合幾乎完全消除人類IgG1 Fc域之Fcγ受體結合且描述於國際專利申請公開案第WO 2012/130831 A1號中，其亦描述製備此類突變型Fc域之方法及測定其特性(諸如Fc受體結合或效應功能)之方法。
具有降低之Fc受體結合及/或效應功能之Fc域亦包括具有以下中之一或多者之取代的彼等Fc域：Fc域殘基238、265、269、270、297、327及329 (美國專利第6,737,056號)。此類Fc突變體包括具有胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者之取代的Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸的所謂「DANA」 Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
在另一態樣中，Fc域為IgG4 Fc域。IgG4抗體展現相較於IgG1抗體，與Fc受體之結合親和力減弱及/或效應功能減低。在一更特定態樣中，Fc域為包含位置S228 (Kabat編號)之胺基酸取代(特定言之，胺基酸取代S228P)的IgG4Fc域。在一更特定態樣中，Fc域為IgG4 Fc域，其包含胺基酸取代L235E及S228P及P329G (EU編號)。此類IgG4 Fc域突變體及其Fcγ受體結合特性亦描述於WO 2012/130831中。
突變型Fc域可使用此項技術中熟知之遺傳學或化學方法，藉由胺基酸缺失、取代、插入或修飾來製備。遺傳學方法可包括編碼DNA序列之位點特異性突變誘發、PCR、基因合成及類似方法。恰當的核苷酸變化可藉由例如定序來驗證。
與Fc受體的結合可容易測定，例如藉由ELISA，或藉由表面電漿子共振(SPR)，使用標準儀器，諸如BIAcore儀器(GE Healthcare)，且可諸如藉由重組表現來獲得Fc受體。替代地，Fc域或包含Fc域之細胞活化抗體對於Fc受體之結合親和力可使用已知表現特定Fc受體之細胞株(諸如表現FcγIIIa受體之人類NK細胞)來評價。
Fc域或包含Fc域之本發明之抗體之效應功能可藉由此項技術中已知之方法量測。適用於量測ADCC之分析描述於本文中。用於評定所關注分子之ADCC活性的活體外分析之其他實例描述於美國專利第5,500,362號；Hellstrom等人 Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)；及Hellstrom等人, Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；美國專利第5,821,337號；Bruggemann等人, J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)中。替代地，可採用非放射性分析方法(參見例如用於流動式細胞測量術之ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；及CytoTox 96® 非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI))。適用於此類分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。替代地或另外，可以在活體內，例如在動物模型中，諸如Clynes等人, Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)中所揭示之動物模型中評定所關注分子之ADCC活性。
在一些態樣中，Fc域與補體組分(具體言之C1q)的結合降低。因此，在其中Fc域經工程改造以具有降低之效應功能的一些實施例中，該降低之效應功能包括降低之CDC。可進行C1q結合分析以測定本發明之雙特異性抗原結合分子是否能夠結合C1q且因此具有CDC活性。(參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。)為了評定補體活化，可執行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人, J Immunol Methods 202, 163 (1996)；Cragg等人, Blood 101, 1045-1052 (2003)；及Cragg及Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004))。
促進雜二聚化之Fc域修飾 本發明之雙特異性抗原結合分子包含與Fc域之兩個次單元的一個或另一個融合的不同抗原結合位點，因此Fc域之兩個次單元可包含於兩條不相同多肽鏈中。此等多肽之重組共表現及後續二聚化產生兩種多肽之若干種可能的組合。為了提高重組產生中本發明之雙特異性抗體的產量及純度，因此將適宜在本發明之雙特異性抗原結合分子的Fc域中引入促進所要多肽之結合的修飾。
因此，在特定態樣中，本發明係關於雙特異性抗原結合分子，其包含：(a)能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個部分，(b)藉由二硫鍵彼此連接之第一及第二多肽，其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含藉由肽連接子彼此連接的兩個TNF配體家族成員胞外域或其兩個片段，且在於第二多肽包含僅一個該TNF配體家族成員胞外域或其片段，及(c)由能夠穩定結合之第一及第二次單元構成的Fc域，其中Fc域包含促進Fc域之第一及第二次單元之結合的修飾。人類IgG Fc域中之兩個次單元之間的最廣泛蛋白質-蛋白質相互作用的位點位於Fc域之CH3域中。因此，在一個態樣中，該修飾存在於Fc域之CH3域中。
在一特定態樣中，該修飾為所謂的「杵-臼」修飾，其包含Fc域之兩個次單元中之一者中的「杵」修飾及Fc域之兩個次單元之另一者中的「臼」修飾。因此，本發明係關於一種抗原結合分子，其包含：(a)能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個部分，(b)藉由二硫鍵彼此連接之第一及第二多肽， 其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含藉由肽連接子彼此連接的兩個4-1BBL胞外域或其兩個片段，且特徵在於第二多肽包含僅一個該4-1BBL胞外域或其片段，及(c)由能夠穩定結合之第一及第二次單元構成的Fc域，其中根據杵-臼方法，Fc域之第一次單元包含杵且Fc域之第二次單元包含臼。在一特定態樣中，Fc域之第一次單元包含胺基酸取代S354C及T366W (EU編號)，且Fc域之第二次單元包含胺基酸取代Y349C、T366S及Y407V (根據Kabat EU指數編號)。
杵-臼技術描述於例如US5,731,168；US7,695,936；Ridgway等人, Prot Eng9, 617-621 (1996)及Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)中。一般而言，方法涉及在第一多肽之界面處引入隆凸(「杵」)及在第二多肽之界面處引入對應凹穴(「臼」)，使得隆凸可定位於凹穴中以便促進雜二聚體形成且阻礙均二聚體形成。藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換第一多肽界面中之小胺基酸側鏈來構築隆凸。大小與隆凸相同或類似之補償性凹穴係在第二多肽之界面中藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈來產生。
因此，在一個態樣中，在本發明之雙特異性抗原結合分子的Fc域的第一次單元的CH3域中，胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，由此在第一次單元之CH3域內產生隆凸，其可定位於第二次單元之CH3域內的凹穴中，且在Fc域之第二次單元的CH3域中，胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，由此在第二次單元之CH3域內產生凹穴，第一次單元之CH3域內的隆凸可可定位於該凹穴中。隆凸及凹穴可藉由改變編碼多肽之核酸，例如藉由定點突變誘發或藉由肽合成來製備。在一特定態樣中，在Fc域之第一次單元之CH3域中，位置366處之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基(T366W)置換，且在Fc域之第二次單元之CH3域中，位置407處之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基(Y407V)置換。在一個態樣中，在Fc域之第二次單元中，位置366之蘇胺酸殘基另外經絲胺酸殘基(T366S)置換且位置368之白胺酸殘基經丙胺酸殘基(L368A)置換。
在又一態樣，在Fc域之第一次單元中，位置354之絲胺酸殘基另外經半胱胺酸殘基(S354C)置換，且在Fc域之第二次單元中，位置349之酪胺酸殘基另外經半胱胺酸殘基(Y349C)置換。引入此等兩個半胱胺酸殘基使得Fc域之兩個次單元之間形成二硫橋鍵，進一步穩定二聚體(Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15)。在一特定態樣中，Fc域之第一次單元包含胺基酸取代S354C及T366W (EU編號)，且Fc域之第二次單元包含胺基酸取代Y349C、T366S及Y407V (根據Kabat EU指數編號)。
在一替代性態樣中，促進Fc域之第一與第二次單元結合的修飾包含調節靜電導向效應之修飾，例如PCT公開案WO 2009/089004中所描述。一般而言，此方法涉及用帶電胺基酸殘基置換兩個Fc域次單元之界面處之一或多個胺基酸殘基，使得同二聚體形成在靜電上不利的，但雜二聚在靜電上為有利的。
如本文所報導之雙特異性抗體之重鏈的C端可為以胺基酸殘基PGK結束之完整C端。重鏈之C端可為縮短C端，其中已移除一或兩個C端胺基酸殘基。在一個較佳態樣中，重鏈之C端為以PG結束之縮短C端。在如本文所報導之所有態樣之一個態樣中，如本文所規定之包含包括C端CH3域之重鏈的雙特異性抗體包含C端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat EU索引編號)。在如本文所報導之所有態樣中之一個態樣中，如本文所規定之包含包括C端CH3域之重鏈的雙特異性抗體包含C端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat EU索引編號)。
Fab 域中之修飾 在一個態樣中，本發明係關於一種含4-1BBL抗原結合分子，其包含：(a)能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之Fab片段，(b)藉由二硫鍵彼此連接之第一及第二多肽，其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含藉由肽連接子彼此連接的兩個4-1BBL胞外域或其兩個片段，且在於第二多肽包含僅一個4-1BBL胞外域或其片段，及(c)由能夠穩定結合之第一及第二次單元構成的Fc域，其中在Fab片段中之一者中，可變域VH及VL或恆定域CH1及CL互換。根據互換單抗技術製備雙特異性抗體。
在一個結合臂中具有域置換/交換的多特異性抗體(互換單抗VH-VL或互換單抗CH-CL)詳細描述於WO2009/080252及Schaefer, W.等人, PNAS, 108 (2011) 11187-1191中。其明顯地減少由針對第一抗原之輕鏈與針對第二抗原之錯誤重鏈失配(相較於沒有此類域交換之方法)而造成的副產物。
在一個態樣中，本發明係關於一種雙特異性抗原結合分子，其包含：(a)能夠與CD19特異性結合之第一Fab片段，(b)藉由二硫鍵彼此連接之第一及第二多肽，其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含藉由肽連接子彼此連接的兩個4-1BBL胞外域或其兩個片段，且在於第二多肽包含僅一個4-1BBL胞外域或其片段，且其中其中之每一者與CH1或CL域連接，及(c)由能夠穩定結合之第一及第二次單元構成的Fc域，其中鄰近於4-1BBL之恆定域CL及CH1彼此置換，使得CH1域為輕鏈的一部分而CL域為重鏈的一部分。
在另一態樣中，本發明係關於一種雙特異性抗原結合分子，其包含：(a)包含能夠與共刺激TNF配體家族成員特異性結合之兩個Fab片段及Fc域之抗體的兩條輕鏈及兩條重鏈，及(b)能夠與靶細胞抗原特異性結合的兩個額外Fab片段，其中該等額外Fab片段各自經由肽連接子與(a)之重鏈之C端連接。在一特定態樣中，額外Fab片段為Fab片段，其中可變域VL及VH經彼此置換，使得VH域為輕鏈的一部分且VL域為重鏈的一部分。
在另一態樣中，且為了進一步提高正確配對，雙特異性抗原結合分子包含：(a)能夠與CD19特異性結合之第一Fab片段，(b)藉由二硫鍵彼此連接之第一及第二多肽，其中抗原結合分子之特徵在於第一多肽包含藉由肽連接子彼此連接的兩個4-1BBL胞外域或其兩個片段，且在於第二多肽包含僅一個4-1BBL胞外域或其片段，且其中其中之每一者與CH1或CL域連接，及(c)由能夠穩定結合之第一及第二次單元構成的Fc域，該雙特異性抗原結合分子可含有不同的帶電胺基酸取代(所謂的「帶電殘基」)。將此等修飾引入互換或非互換CH1及CL域中。在一特定態樣中，本發明係關於一種雙特異性抗原結合分子，其中在CL域中之一者中，位置123 (EU編號)處之胺基酸經精胺酸(R)置換且位置124 (EU編號)處之胺基酸經離胺酸(K)取代，且其中在CH1域中之一者中，位置147 (EU編號)及位置213 (EU編號)處之胺基酸經麩胺酸(E)取代。
更特定言之，本發明係關於一種包含Fab之雙特異性抗原結合分子，其中在鄰近於共刺激TNF配體家族成員之CL域中，位置123 (EU編號)處之胺基酸經精胺酸(R)置換且位置124 (EU編號)處之胺基酸經離胺酸(K)取代，且其中在鄰近於共刺激TNF配體家族成員之CH1域中，位置147 (EU編號)及位置213 (EU編號)處之胺基酸經麩胺酸(E)取代。
聚核苷酸 本發明進一步提供編碼如本文中所描述之雙特異性抗體或其片段的經分離聚核苷酸。
編碼本發明之抗體之經分離聚核苷酸可表述為編碼整個抗原結合分子的單一聚核苷酸或表述為共表現的多個(例如，兩個或更多個)聚核苷酸。由共表現之聚核苷酸編碼之多肽可經由例如二硫鍵或其他手段結合，以形成功能性抗原結合分子。舉例而言，免疫球蛋白之輕鏈部分可由來自免疫球蛋白之重鏈部分的單獨聚核苷酸編碼。當共表現時，重鏈多肽與輕鏈多肽結合，形成免疫球蛋白。
在一些態樣中，經分離聚核苷酸編碼如本文中所描述之根據本發明之完整抗體。在其他實施例中，經分離聚核苷酸編碼如本文中所描述的根據本發明之抗體中所包含的多肽。
在某些實施例中，聚核苷酸或核酸為DNA。在其他實施例中，本發明之聚核苷酸為RNA，例如呈信使RNA (mRNA)形式。本發明之RNA可為單股或雙股RNA。
重組方法 本發明中所用之雙特異性抗體可例如藉由固態肽合成(例如梅里菲爾德固相合成(Merrifield solid phase synthesis))或重組生產獲得。對於重組生產，分離編碼例如如上文所描述之抗體或其多肽片段的一或多個聚核苷酸，且將其插入至一或多個載體中，以用於進一步選殖於宿主細胞中及/或在宿主細胞中表現。此類聚核苷酸可使用習知程序容易地分離及定序。在本發明之一個態樣中，提供包含本發明之聚核苷酸中之一或多者的載體，較佳表現載體。可使用已為熟習此項技術者所熟知之方法來構築含有抗體(片段)之編碼序列連同適當轉錄/轉譯控制信號的表現載體。此等方法包括活體外重組DNA技術、合成技術及活體內重組/基因重組。參見例如Maniatis等人, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及Ausubel等人, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)中所描述之技術。表現載體可為質體、病毒之一部分，或可為核酸片段。表現載體包括表現盒，將編碼抗體或其多肽片段之聚核苷酸(亦即編碼區)選殖至該表現盒中與啟動子及/或其他轉錄或轉譯控制元件可操作的連接。如本文所用，「編碼區」為核酸中由轉譯成胺基酸之密碼子組成的部分。儘管「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)不轉譯成胺基酸，但其可視為編碼區(若存在)之一部分，但任何側接序列(例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子、5'及3'非轉譯區及類似序列)不為編碼區之一部分。在單一聚核苷酸構築體中，例如在單一載體上，或在單獨聚核苷酸構築體中，例如在單獨(不同)載體上，可存在兩個或更多個編碼區。此外，任何載體可含有單一編碼區，或可包含兩個或更多個編碼區，例如本發明之載體可編碼一或多個多肽，其經由蛋白質裂解而轉譯後或共轉譯分離成最終蛋白質。另外，本發明之載體聚核苷酸或核酸可編碼與編碼本發明抗體或其多肽片段之聚核苷酸融合或未融合的異源編碼區或其變異體或衍生物。異源編碼區包括(但不限於)專用元件或基元，諸如分泌性信號肽或異源功能域。可操作連接為當基因產物(例如多肽)之編碼區與一或多個調節序列以使得基因產物之表現置於調節序列之影響或控制下的方式結合時。若誘導啟動子功能導致編碼所要基因產物之mRNA轉錄且若兩個DNA片段之間連接的性質不干擾表現調節序列導引基因產物表現的能力或不干擾DNA模板轉錄的能力，則兩個DNA片段(諸如多肽編碼區及與其相關聯的啟動子)為「可操作地連接」。因此，若啟動子能夠影響彼核酸之轉錄，則啟動子區域與編碼多肽之核酸可操作地連接。啟動子可為僅導引預定細胞中之DNA實質性轉錄的細胞特異性啟動子。除啟動子以外的其他轉錄控制元件(例如強化子、操縱子、抑制子及轉錄終止信號)可與引導細胞特異性轉錄之聚核苷酸可操作地連接。
合適的啟動子及其他轉錄控制區揭示於本文中。多個轉錄控制區已為熟習此項技術者所知。此等區域包括(但不限於)在脊椎動物細胞中起作用的轉錄控制區，諸如(但不限於)啟動子及增強子區段，其來自巨細胞病毒(例如即刻早期啟動子，連同內含子-A)、猴病毒40 (例如早期啟動子)及反轉錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))。其他轉錄控制區包括來源於脊椎動物基因(諸如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔α-血球蛋白)之區域，以及能夠控制真核細胞中之基因表現的其他序列。其他合適的轉錄控制區包括組織特異性啟動子及強化子以及誘導性啟動子(例如啟動子誘導性四環素(tetracyclin))。類似地，多種轉譯控制元件已為一般熟習此項技術者所知。此等元件包括(但不限於)核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子，以及來源於病毒系統的元件(特定言之，內部核糖體入口位點或IRES，亦稱為CITE序列)。表現盒亦可包括其他特徵，諸如複製起點，及/或染色體整合元件，諸如反轉錄病毒長末端重複序列(LTR)，或腺相關聯病毒(AAV)反向末端重複序列(ITR)。
本發明之聚核苷酸及核酸編碼區可能與編碼分泌性肽或信號肽的其他編碼區連接，從而導引由本發明之聚核苷酸編碼的多肽之分泌。舉例而言，若需要分泌抗體或其多肽片段，則可將編碼信號序列之DNA置於本發明抗體或其多肽片段之核酸之上游。根據信號假設，哺乳動物細胞所分泌之蛋白質具有信號肽或分泌性前導序列，一旦生長蛋白質鏈跨越粗糙內質網之輸出已起始，該信號肽或分泌性前導序列自成熟蛋白質裂解。一般熟習此項技術者將認識到，脊椎動物細胞分泌的多肽通常具有與多肽之N端融合的信號肽，該信號肽自所轉譯之多肽裂解而產生分泌性或「成熟」形式的多肽。在某些實施例中，使用原生信號肽，例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽，或彼序列之保持導引與其可操作地連接之多肽分泌之能力的功能衍生物。替代地，可使用異源哺乳動物信號肽或其功能衍生物。舉例而言，野生型前導序列可經人類組織纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸酶之前導序列取代。
在編碼本發明抗體或其多肽片段之聚核苷酸內或在該聚核苷酸之末端處，可包括編碼可用以幫助後續純化(例如組胺酸標記)或有助於標記融合蛋白之短蛋白質序列的DNA。
在本發明之另一態樣中，提供一種宿主細胞，其包含本發明之一或多種聚核苷酸。在某些實施例中，提供一種宿主細胞，其包含本發明之一或多種載體。聚核苷酸及載體可併有本文分別關於聚核苷酸及載體所描述之任一特徵(單個或組合)。在一個態樣中，宿主細胞包含(例如已用以下轉化或轉染)包含編碼本發明抗體(之一部分)之聚核苷酸的載體。如本文所用，術語「宿主細胞」係指任何類型之可經工程改造以產生本發明之融合蛋白或其片段的細胞系統。適用於複製及支持抗原結合分子之表現的宿主細胞為此項技術中熟知。此類細胞可視需要經特定表現載體轉染或轉導，且可生長含有大量載體之細胞以用於接種大型醱酵槽，以獲得足量的抗原結合分子以用於臨床應用。合適的宿主細胞包括原核微生物，諸如大腸桿菌，或各種真核細胞，諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、昆蟲細胞或其類似物。舉例而言，可在細菌中生產多肽，尤其在不需要糖基化時。在表現之後，可自可溶性部分中之細菌細胞糊狀物分離出多肽且可將該多肽進一步純化。除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母菌之真核微生物為適用於編碼多肽之載體的選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」，從而生產具有部分或完全人類糖基化模式之多肽的真菌及酵母菌株。參見Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)，及Li等人, Nat Biotech 24, 210-215 (2006)。
適用於表現(糖基化)多肽的宿主細胞亦來源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出眾多可與昆蟲細胞結合使用，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞之桿狀病毒株。植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述在轉殖基因植物中產生抗體的PLANTIBODIESTM 技術)。脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適合於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為藉由SV40轉化之猴腎臟CV1細胞株(COS-7)；人胚腎細胞株(293或293T細胞，如例如Graham等人, J Gen Virol 36, 59 (1977)中所描述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏細胞(TM4細胞，如例如Mather, Biol Reprod. 23, 243-251 (1980))中所描述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠獼猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌瘤細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；水牛鼠肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞(如例如Mather等人, Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)中所描述；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他適用哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括dhfr- CHO細胞(Urlaub等人, Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如YO、NS0、P3X63及Sp2/0。關於適用於蛋白質生產之某些哺乳動物宿主細胞株之綜述，參見例如Yazaki及Wu, Methods in Molecular Biology, 第248卷 (B.K.C. Lo, 編, Humana Press, Totowa, NJ), 第255-268頁 (2003)。宿主細胞包括經培養細胞，例如經培養之哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、細菌細胞及植物細胞(僅舉數例)，且亦包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或經培養之植物或動物組織中所包含的細胞。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，較佳為哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人胎腎(HEK)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在此等系統中表現外來基因之標準技術為此項技術中已知的。表現包含免疫球蛋白之重鏈或輕鏈之多肽的細胞可經工程改造，以便亦表現免疫球蛋白鏈中之另一者，使得所表現產物為具有重鏈及輕鏈的免疫球蛋白。
在一個態樣中，提供一種生產本發明抗體或其多肽片段之方法，其中該方法包含：在適合於表現本發明抗體或其多肽片段的條件下，培養包含編碼如本文所提供之本發明抗體或其多肽片段之聚核苷酸的宿主細胞，及自該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收本發明抗體或其多肽片段。
在某些實施例中，形成抗原結合分子之一部分之能夠與靶細胞抗原(例如Fab片段)特異性結合的部分包含能夠與抗原結合的至少一免疫球蛋白可變區。可變區可形成天然或非天然存在之抗體及其片段之一部分且來源於天然或非天然存在之抗體及其片段。產生多株抗體及單株抗體之方法為此項技術中熟知的(參見例如Harlow及Lane, 「Antibodies, a laboratory manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。非天然存在之抗體可使用固相肽合成法來構築，可以重組方式產生(例如，如美國專利第4,186,567號中所描述)或可藉由例如篩檢包含可變重鏈及可變輕鏈之組合文庫來獲得(參見例如McCafferty之美國專利第5,969,108號)。
本發明中可使用任何動物物種之免疫球蛋白。適用於本發明之非限制性免疫球蛋白可為鼠類、靈長類動物或人類來源。若融合蛋白意欲用於人類用途，則可使用其中免疫球蛋白之恆定區係來自人類的免疫球蛋白之嵌合形式。人類化或全人類形式之免疫球蛋白亦可根據此項技術中熟知之方法來製備(參見例如Winter之美國專利第5,565,332號)。人類化可藉由多種方法來達成，包括(但不限於)：(a)將非人類(例如供體抗體) CDR移植至人類(例如受者抗體)構架區及恆定區上，保留或不保留關鍵構架殘基(例如對於保留良好抗原結合親和力或抗體功能而言具有重要作用之彼等殘基)；(b)僅將非人類特異性決定區(SDR或a-CDR；對於抗體-抗原相互作用而言具有關鍵作用之殘基)移植至人類構架區及恆定區上；或(c)移植整個非人類可變域，但藉由表面殘基置換而用人類類似區段對其進行「遮掩」。人類化抗體及其製造方法綜述於例如Almagro及Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)中，且進一步描述於例如Riechmann等人, Nature 332, 323-329 (1988)；Queen等人, Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)；美國專利案第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Jones等人, Nature 321, 522-525 (1986)；Morrison等人, Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984)；Morrison及Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988)；Verhoeyen等人, Science 239, 1534-1536 (1988)；Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994)；Kashmiri等人, Methods 36, 25-34 (2005) (描述SDR (a-CDR)移植)；Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (描述「表面重修」)；Dall'Acqua等人, Methods 36, 43-60 (2005) (描述「FR改組」)；及Osbourn等人, Methods 36, 61-68 (2005)及Klimka等人, Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (描述FR改組的「導向選擇」方法)中。根據本發明之特定免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。人類抗體及人類可變區可使用此項技術中已知之各種技術產生。人類抗體大體上描述於van Dijk及van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001)及Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)中。人類可變區可形成藉由融合瘤方法製得之人類單株抗體的一部分且可來源於藉由融合瘤方法製得的人類單株抗體(參見例如Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 第51-63頁 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。人類抗體及人類可變區亦可藉由如下製備：向已經修飾之轉殖基因動物投與免疫原，從而回應於抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體(參見例如Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005))。人類抗體及人類可變區亦可藉由分離選自人類衍生之噬菌體呈現文庫的Fv純系可變區序列來產生(參見例如Hoogenboom等人, Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien等人編, Human Press, Totowa, NJ, 2001)；及McCafferty等人, Nature 348, 552-554；Clackson等人, Nature 352, 624-628 (1991))。噬菌體通常以單鏈Fv (scFv)片段或Fab片段形式呈現抗體片段。
在某些態樣中，根據例如PCT公開案WO 2012/020006 (參見關於親和力成熟之實例)或美國專利申請公開案第2004/0132066號中揭示之方法，將抗體進行工程改造以具有增強的結合親和力。本發明之抗原結合分子與特異性抗原決定子結合之能力可經由酶聯免疫吸附分析(ELISA)或熟習此項技術者熟悉之其他技術(例如表面電漿子共振技術(Liljeblad等人, Glyco J 17, 323-329 (2000))及傳統結合分析(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))量測。可使用競爭分析來鑑別與參考抗體競爭與特定抗原之結合的抗原結合分子。在某些實施例中，此種競爭性抗原結合分子與同參考抗原結合分子所結合的相同抗原決定基(例如線性或構形抗原決定基)結合。抗原結合分子所結合之抗原決定基之定位的詳細例示性方法提供於Morris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」, Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press, Totowa, NJ)中。在例示性競爭分析法中，在包含與抗原結合之第一標記抗原結合分子及測試與第一抗原結合分子競爭與抗原結合之能力的第二未標記抗原結合分子之溶液中培育經固定的抗原。第二抗原結合分子可存在於融合瘤上清液中。作為對照，在包含第一標記抗原結合分子但不包含第二未標記抗原結合分子之溶液中培育經固定的抗原。在允許第一抗體與抗原結合之條件下培育之後，移除過量的未結合之抗體，且量測與經固定的抗原結合的標記的量。若與對照樣本相比，測試樣本中與經固定的抗原結合之標記之量實質上降低，則表明第二抗原結合分子與第一抗原結合分子競爭與抗原結合。參見Harlow及Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual 第14章 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。
如本文中所描述製備之本發明抗體可藉由此項技術中已知的技術(諸如高效液相層析法、離子交換層析法、凝膠電泳、親和力層析法、尺寸排阻層析法等)純化。用於純化特定蛋白質之實際條件部分地視諸如淨電荷、疏水性、親水性等因素而定，且對於熟習此項技術者而言為顯而易見的。對於親和層析純化，可使用與抗原結合分子結合之抗體、配體、受體或抗原。舉例而言，關於本發明之融合蛋白之親和層析純化，可使用具有蛋白A或蛋白G之基質。可使用序列蛋白A或G親和層析及尺寸排阻層析來分離基本上如實例中所描述之抗原結合分子。抗原結合分子或其片段之純度可藉由多種熟知的分析方法中之任一者測定，包括凝膠電泳、高壓液相層析及其類似方法。舉例而言，如實例中所描述表現之含4-1BBL抗原結合分子顯示為完整的且適當地組裝，如藉由還原及非還原SDS-PAGE所證明。
分析 可藉由此項技術中已知之各種分析，對本文中提供之抗原結合分子針對其物理/化學特性及/或生物活性進行鑑別、篩選或表徵。
1.親和力分析 本文所提供之雙特異性抗原結合分子對於對應受體之親和力，可根據闡述於實例中之方法(藉由表面電漿子共振(SPR))，使用標準儀器(BIAcore儀器(GE Healthcare))測定，且受體或靶蛋白可諸如藉由重組表現獲得。雙特異性抗原結合分子對於靶細胞抗原之親和力，亦可藉由表面電漿子共振(SPR)，使用諸如BIAcore儀器(GE Healthcare)之標準儀器測定，且受體或靶蛋白可諸如藉由重組表現獲得。關於CD19-4-1BBL抗原結合分子，該等方法已更詳細地描述於國際專利申請公開案第WO 2016/075278 A1號中。根據一個態樣，藉由表面電漿子共振，使用BIACORE® T100機器(GE Healthcare)在25℃下量測KD 。
2.結合分析及其他分析 在一個態樣中，如實例2中更詳細描述來測試如本文所報導之CD19-4-1BBL抗原結合分子之其抗原結合活性。
3.活性分析 在一個態樣中，提供用於鑑別CD19-4-1BBL抗原結合分子之生物活性的分析。生物活性可包括例如對B細胞增殖之抑制或B細胞之殺傷。亦提供在活體內及/或活體外具有此生物活性之抗體。關於CD19-4-1BBL抗原結合分子，某些方法已更詳細地描述於國際專利申請公開案第WO 2016/075278 A1號中。
在某些實施例中，測試如本文所報導之抗體之此類生物活性。
醫藥組合物、調配物及投與途徑 在另一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含含有能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑及本文提供的抗-CD20抗體，其例如用於以下治療方法中的任一者中。在一個態樣中，醫藥組合物包含：本文提供之含有能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑；以及第二藥物，其包含抗-CD20抗體。在另一實施例中，醫藥組合物包含：本文提供之含有能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑；第二藥物，其包含抗-CD20抗體；及例如如下文所描述的至少一種額外治療劑。
本發明之醫藥組合物包含治療有效量之一或多種溶解或分散於醫藥學上可接受之賦形劑中之本文所描述之抗原結合分子。片語「醫藥學上或藥理學上可接受」係指分子實體及組合物在所用劑量及濃度下對於接受者而言一般為無毒性的，亦即當適當時向動物(諸如人類)投與時，不會產生有害的過敏反應或其他不良反應。含有至少一種抗體及視情況選用之額外活性成分的醫藥組合物之製備將為熟習此項技術者依據本發明而知，如以引用的方式併入本文中之Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版 Mack Printing Company, 1990所例示。特定言之，組合物為凍乾調配物或水溶液。如本文所用，「醫藥學上可接受之賦形劑」包括如一般熟習此項技術者已知之任何及所有溶劑、緩衝液、分散介質、包衣、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌劑、抗真菌劑)、等張劑、鹽、穩定劑及其組合。
非經腸組合物包括為藉由注射(例如皮下、皮內、病灶內、靜脈內、動脈內、肌肉內、鞘內或腹膜內注射)投藥所設計的彼等組合物。對於注射，本發明之抗原結合分子可於水溶液中調配，較佳於生理上相容的緩衝液(諸如漢克氏溶液(Hanks' solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理鹽水緩衝液)中調配。溶液可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。替代地，融合蛋白可呈粉末形式以用於在使用之前用合適的媒劑(例如，無菌無熱原質水)復原。藉由將所需量之本發明之融合蛋白併入視需要具有多種下文列舉之其他成分之適當溶劑中來製備無菌可注射溶液。無菌性可容易地藉由例如經由無菌過濾膜過濾來實現。一般而言，分散液係藉由將各種滅菌活性成分併入含有基本分散介質及/或其他成分的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液、懸浮液或乳液之無菌粉末的情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥技術，其利用預先無菌過濾之液體介質產生活性成分加任何其他所需成分之粉末。視需要，液體介質宜經緩衝，且在與足量鹽水或葡萄糖一起注射之前，首先使液體稀釋劑呈等張性。組合物必須在製造及儲存條件下穩定且必須抵抗諸如細菌及真菌之微生物的污染作用而保藏。應瞭解，內毒素污染應最低限度地保持在安全水準，例如低於0.5 ng/mg蛋白質。合適的醫藥學上可接受之賦形劑包括(但不限於)：緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨；氯化苯索銨；酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成鹽反離子，諸如鈉；金屬複合物(例如Zn-蛋白質複合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之化合物，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、聚葡萄糖或其類似物。視情況，懸浮液亦可含有合適的穩定劑或增加化合物溶解性以允許製備高度濃縮溶液之藥劑。另外，活性化合物之懸浮液可視需要製備成油性注射懸浮液。合適的親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，諸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或三酸甘油酯；或脂質體。
活性成分可包覆於微膠囊中，例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合法所製備之微膠囊，例如分別為羥基甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊；包覆於膠態藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或巨乳液中。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences (第18版, Mack Printing Company, 1990)中。可以製備持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之適合實例包括含有多肽之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質呈成形物品形式，例如膜或微膠囊。在特定實施例中，可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中使用延遲吸收劑(諸如單硬脂酸鋁、明膠或其組合)來達成。
本文中之例示性醫藥學上可接受之賦形劑進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)。某些示例性sHASEGP (包括rHuPH20)及使用方法描述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，sHASEGP與一或多種其他葡萄糖胺聚糖酶(諸如軟骨素酶)組合。
例示性凍乾抗體調配物描述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括美國專利案第6,171,586號及WO 2006/044908中所描述之彼等調配物，後者中之調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
除了先前描述的組合物之外，抗體亦可調配為儲槽式製劑。此類長效調配物可藉由植入(例如皮下或肌肉內植入)或藉由肌肉內注射來投與。因此，舉例而言，融合蛋白可用合適的聚合或疏水性材料(例如呈於可接受之油中的乳液形式)或離子交換樹脂調配，或調配成微溶性衍生物，例如微溶性鹽。
包含本發明之抗原結合分子的醫藥組合物可藉助於習知混合、溶解、乳化、囊封、包覆或凍乾法製造。醫藥組合物可使用生理學上可接受之有利於將蛋白質處理成可在醫藥學上使用之製劑的一或多種載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑，以習知方式調配。適當調配物視所選擇之投藥途徑而定。
包含能夠與本文提供之CD19特異性結合之至少一個抗原結合域之4-1BB促效劑，可調配成游離酸或鹼、中性或鹽形式之組合物。醫藥學上可接受之鹽為實質上保留游離酸或鹼之生物活性的鹽。此等鹽包括酸加成鹽，例如與蛋白質組合物之游離胺基形成的鹽，或與無機酸(諸如鹽酸或磷酸)或有機酸(諸如乙酸、乙二酸、酒石酸或杏仁酸)形成的鹽。與游離羧基形成之鹽亦可衍生自無機鹼，諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；或有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因(procaine)。相較於對應的游離鹼形式，醫藥鹽傾向於更可溶於水性及其他質子溶劑中。
本文中之組合物亦可含有多於一種為所治療之特定適應症所必需之活性成分，較佳為具有不會對彼此產生不利影響之互補活性的彼等活性成分。此類活性成分宜以對預期目的有效之量組合存在。
在一個態樣中，提供一種醫藥組合物，其包含：4-1BB促效劑，其包含能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域及醫藥學上可接受之賦形劑；以及第二藥物，其包含如本文所描述之抗-CD20抗體。在一特定態樣中，該醫藥組合物用於治療B細胞增殖性病症，特定言之選自由以下組成之群的疾病：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、彌漫性大型B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、多發性骨髓瘤(MM)及霍奇金淋巴瘤(HL)。
用於活體內投與之調配物通常為無菌的。無菌性可容易地藉由例如經由無菌過濾膜過濾來實現。
本文提供之包含能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域之4-1BB促效劑及抗-CD20抗體的投與 包含能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域之4-1BB促效劑及抗-CD20抗體(兩者在本文中均稱為物質)兩者可藉由任何合適的手段投與，包括非經腸、肺內及鼻內，且在需要局部治療時，病灶內投與。然而，本發明方法對於藉由非經腸(特定言之靜脈內)輸注投與之治療劑尤其適用。
非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。部分地視投藥之短期或長期性而定，給藥可藉由任何適合之途徑(例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射)來進行。本文中涵蓋各種給藥時程，包括(但不限於)單次投藥或經各個時間點多次投藥、快速投藥(bolus administration)及脈衝式輸注。在一個實施例中，非經腸(特定言之靜脈內)投與治療劑。在一特定實施例中，藉由靜脈內輸注投與物質。在另一態樣中，物質經皮下投與。
包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域之4-1BB促效劑及抗-CD20抗體兩者將以與符合良好醫學實踐之方式調配、給藥及投與。在此情形中考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症起因、藥劑遞送位點、投藥方法、投藥時程及醫學從業者已知之其他因素。包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域之4-1BB促效劑及抗-CD20抗體兩者未必但視情況與目前用於預防或治療所討論之病症的一或多種藥劑一起調配。此類其他藥劑之有效量視存在於調配物中之治療劑之量、病症或治療之類型及上文所論述之其他因素而定。此等藥劑一般以相同劑量且以如本文所描述之投與途徑使用，或以本文所描述之劑量之約1%至99%使用，或以任何劑量且以憑經驗/臨床上判定為適當之任何途徑使用。
對於疾病之預防或治療，本文提供之包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域之4-1BB促效劑及抗-CD20抗體(當以其組合或與一種或多種其他額外治療劑一起使用時)之適當劑量，將視以下而定：待治療之疾病的類型、4-1BB藥劑的類型、疾病的嚴重程度及時程、投與兩種藥劑是預防性還是治療性目的、先前療法、患者之臨床病史及對於治療劑之反應，以及主治醫師之判斷。一次性或歷經一系列治療向患者適當投與各物質。視疾病之類型及嚴重程度而定，約1 µg/kg至15 mg/kg (例如0.1 mg/kg-10 mg/kg)之物質可為向個體投與的初始候選劑量，無論是例如藉由一或多次獨立投與還是藉由連續輸注。視上文所提及之因素而定，一個典型的日劑量可在約1 μg/kg至100 mg/kg之範圍內或更高。對於歷經數日或更長時間之重複投與，治療一般將視病狀而定持續直至發生疾病症狀之所需抑制為止。各物質之一個例示性劑量將在約0.05 mg/kg至約10 mg/kg範圍內。因此，可向個體投與一或多次以下劑量：約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg (或其任何組合)。此類劑量可間歇地投與，例如每一週、每兩週或每三週投與(例如，使得個體接受約兩個至約二十個，或例如約六個劑量之治療劑)。可在最初投與較高速效劑量、繼之以一或多個較低劑量，或最初投與較低劑量、繼之以一或多個較高劑量。例示性給藥方案包含投與約10 mg之初始劑量、繼之以約20 mg之治療劑之每兩週劑量。然而，其他給藥方案可為適用的。此療法之進程易於藉由習知技術及分析法來監測。
在一個態樣中，包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域之4-1BB促效劑及抗-CD20抗體兩者之投與為單次投與。在某些態樣中，物質之投與為兩次或更多次投與。在一個此類態樣中，每一週、每兩週或每三週(特定言之每兩週)投與該等物質。在一個態樣中，以治療有效量投與該物質。在一個態樣中，以以下之劑量投與該物質：約50 µg/kg、約100 µg/kg、約200 µg/kg、約300 µg/kg、約400 µg/kg、約500 µg/kg、約600 µg/kg、約700 µg/kg、約800 µg/kg、約900 µg/kg或約1000 µg/kg。在一個實施例中，包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域之4-1BB促效劑，以高於不投與抗-CD20抗體之對應治療方案中包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域之4-1BB促效劑之劑量的劑量投與。在一個態樣中，本文提供之包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域之4-1BB促效劑的投與，包含初次投與第一劑量之抗-CD20抗體，及隨後一或多次投與第二劑量之抗-CD20抗體，其中第二劑量高於第一劑量。在一個態樣中，包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域之4-1BB促效劑的投與，包含初次投與第一劑量之抗-CD20抗體，及隨後一或多次投與第二劑量之抗-CD20抗體，其中第一劑量不低於第二劑量。
在一個態樣中，在根據本發明之治療方案中，包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域之4-1BB促效劑的投與，為首先向個體投與包含能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域之4-1BB促效劑(至少在相同治療時程內)。在一個態樣中，在投與包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域之4-1BB促效劑之前，不向個體投與抗-CD20抗體。在另一態樣中，在投與包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域之4-1BB促效劑之前，向個體投與抗-CD20抗體。
在另一態樣中，包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域之4-1BB促效劑與抗-CD20抗體組合使用，其中在組合治療之前用II型抗-CD20抗體(較佳地，奧濱尤妥珠單抗)進行預處理，其中預處理與組合處理之間的時間段足以減少個體中回應於II型抗-CD20抗體(較佳地，奧濱尤妥珠單抗)之B細胞。
T細胞之活化可導致嚴重的細胞介素釋放症候群(CRS)。在由TeGenero進行的1期研究(Suntharalingam等人, N Engl J Med (2006) 355,1018-1028)中，所有6個健康志願者在輸注不適當給藥之T細胞刺激超促效劑抗CD28單株抗體之後，迅速經歷幾乎致命之嚴重細胞介素釋放症候群(CRS)。藉由對個體用II型抗-CD20抗體(諸如奧濱尤妥珠單抗)進行預處理，與向該個體投與T細胞活化治療劑(諸如包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域之4-1BB促效劑)相關的細胞介素釋放可顯著降低。使用GAZYVA®預處理(Gpt)將有助於快速消耗周邊血液及周圍淋巴樣器官兩者中之B細胞，使得藉由T細胞活化治療劑，來自於強力全身性T細胞活化的高度相關不良事件(AE) (例如CRS)的風險降低，同時支持T細胞活化治療劑的暴露水準自開始給藥時足夠高以介導腫瘤細胞消除。迄今為止，已在持續奧濱尤妥珠單抗臨床試驗中經數百患者評定及管控奧濱尤妥珠單抗之安全概況(包括細胞介素釋放)。最終，除支持本文提供之包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域之4-1BB促效劑之安全概況以外，Gpt應亦幫助預防形成此等獨特分子之抗藥物抗體(ADA)。
在本發明中，包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域之4-1BB促效劑及抗-CD20抗體之組合可與療法中之一或多種其他藥劑組合使用。舉例而言，可共同投與至少一種額外治療劑。在某些態樣中，額外治療劑為免疫治療劑。
上文所提及之此類組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括在同一或獨立調配物中)及單獨投與，在此情況下，治療劑之投與可在投與一或多種額外治療劑之前、同時及/或之後進行。在一個實施例中，治療劑之投與及額外治療劑之投與彼此在約一個月；或相隔約一週、兩週或三週；或相隔約一天、兩天、三天、四天、五天或六天內進行。
治療方法及組合物 CD20及CD19表現於除幹細胞及漿細胞外之大多數B細胞(pan-B-細胞標記)上，且頻繁地表現於大多數人類B細胞惡性疾病上(腫瘤相關抗原)，諸如除多發性骨髓瘤以外之淋巴瘤及白血病，例如表現於非霍奇金淋巴瘤及急性淋巴母細胞白血病中。
識別不同細胞群上之兩種細胞表面蛋白質的雙特異性分子有希望再引導細胞毒性免疫細胞以破壞病原性靶細胞。
在一個態樣中，提供一種治療個體之癌症或延遲個體之癌症之進展的方法，其包含向個體投與有效量之包含能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑及抗-CD20抗體。
在一個此類態樣中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種額外治療劑。在其他態樣中，本文提供一種用於消耗B細胞之方法，其包含向個體投與有效量之本文提供之包含能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑及抗-CD20抗體。根據任一上述態樣之「個體(individual或subject)」較佳為人類。
在其他態樣中，提供一種用於癌症免疫療法中之組合物，其包含本文提供之包含能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑及抗-CD20抗體。在某些態樣中，提供一種用於癌症免疫療法之方法中之組合物，其包含本文提供之包含能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑及抗-CD20抗體。
在另一態樣中，本文提供一種組合物之用途，其用於製造或製備藥物，該組合物包含本文提供之包含能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑及抗-CD20抗體。在一個實施例中，藥物用於治療B細胞增殖性病症。在另一實施例中，藥物用於治療B細胞增殖性病症之方法中，該方法包含向患有B細胞增殖性病症之個體投與有效量之藥物。在一個此類實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種額外治療劑。在另一實施例中，藥物係用於消耗B細胞。B細胞增殖性病症係選自由以下各者組成之群：非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、彌漫性大型B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、多發性骨髓瘤(MM)及霍奇金淋巴瘤(HL)。在一個特定態樣中，B細胞癌為非霍奇金淋巴瘤或急性淋巴母細胞白血病。
在另一態樣中，本文提供一種用於治療B細胞癌之方法。在一個實施例中，該方法包含向患有此類B細胞癌之個體投與有效量之抗-人類CD20抗體。在一個此類實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種如下文所描述之額外治療劑。根據任一上述實施例之「個體」可為人類。在一個實施例中，B細胞癌為B細胞淋巴瘤或B細胞白血病。在一個實施例中，B細胞癌為非霍奇金淋巴瘤或急性淋巴母細胞白血病。
上文提及之該等組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括在同一或單獨調配物中)及單獨投與，在此情況下，如本文所報導之抗體的投與可在投與一或多種額外治療劑之前、同時及/或之後進行。在一個實施例中，抗-人類CD20抗體之投與及視情況額外治療劑之投與在相隔約一個月內、或在相隔約一、二或三週內、或在相隔約一、二、三、四、五或六天內進行。
如本文所報導之包含能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域之4-1BB促效劑及抗-CD20抗體兩者(及任何額外治療劑)可藉由任何適合手段投與，包括非經腸、肺內及鼻內，且在需要局部治療時，病灶內投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。部分地視投藥之短期或長期性而定，給藥可藉由任何適合之途徑(例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射)來進行。本文中涵蓋各種給藥時程，包括(但不限於)單次投藥或經各個時間點多次投藥、快速投藥(bolus administration)及脈衝式輸注。
如本文所報導之包含能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域之4-1BB促效劑及抗-CD20抗體兩者將以與符合良好醫學實踐之方式調配、給藥及投與。在此情形中考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症起因、藥劑遞送位點、投藥方法、投藥時程及醫學從業者已知之其他因素。抗體無需但視情況與一或多種當前用於預防或治療所討論病症之藥劑一起調配。此類其他藥劑之有效量視存在於調配物中之抗體之量、病症或治療之類型及如上文所論述之其他因素而定。此等藥劑一般以相同劑量且以如本文所描述之投與途徑使用，或以本文所描述之劑量之約1%至99%使用，或以任何劑量且以憑經驗/臨床上判定為適當之任何途徑使用。
其他藥劑及治療 本發明之抗原結合分子可與療法中之一或多種其他藥劑組合投與。舉例而言，本發明之融合蛋白可與至少一種額外治療劑共同投與。術語「治療劑」涵蓋可投與以用於治療需要此類治療之個體之症狀或疾病的任何藥劑。此類額外治療劑可包含適於所治療之特定適應症的任何活性成分，較佳為具有彼此間無不利影響之互補活性的彼等活性成分。在某些實施例中，額外治療劑為另一抗癌劑。
此類其他藥劑宜以有效用於預期目的之量組合存在。此類其他藥劑之有效量視所使用之融合蛋白之量、病症或治療之類型及上文所論述之其他因素而定。抗原結合分子通常以與如本文中所描述相同之劑量及投與途徑，或本文中所描述之劑量之約1%至99%，或以憑經驗/在臨床上測定為適合的任何劑量及任何途徑使用。
上文提及之此類組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括於同一組合物或單獨組合物中)及單獨投與，在單獨投與之情況下，本發明之抗原結合分子之投與可發生在額外治療劑及/或佐劑之投與之前、同時及/或之後。
製品(套組) 在本發明之另一態樣中，提供一種套組，其含有適用於治療、預防及/或診斷上文所描述之病症的材料。套組包含至少一個容器及在容器上或容器隨附之標記或藥品說明書。合適的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由多種材料(諸如玻璃或塑膠)形成。容器容納單獨或與有效治療、預防及/或診斷病狀之另一組合物組合之組合物，且可具有無菌接取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。套組中之至少兩種活性劑為本發明之抗-CD20/抗-CD3雙特異性抗體及包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑。
在一特定態樣中，提供一種用於治療個體之癌症或延遲個體之癌症之進展的套組，其包含封裝，該封裝包含：(A)第一組合物，其包含作為活性成分之含有能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑及醫藥學上可接受之賦形劑；(B)第二組合物，其包含作為活性成分之抗-CD20抗體及醫藥學上可接受之賦形劑；及(C)在組合療法中，組合物之使用說明書。
標記或藥品說明書指示如何將組合物用於治療所選病狀，且提供關於在組合療法中使用組合物的說明。此外，套組可包含：(a)第一容器以及其中所含之組合物，其中該組合物包含本發明之含有能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑；及(b)第二容器以及其中所含之組合物，其中該組合物包含本發明之抗-CD20抗體。另外，套組可包含含有可組合使用之其他活性成分的一或多個其他容器。本發明之此實施例中之製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病狀之藥品說明書。
可替代地或另外，套組可進一步包含第二(或第三)容器，該第二(或第三)容器包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液。其可進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。 表D (序列)：
關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列之一般資訊提供於Kabat, E.A.等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 美國公眾衛生服務署, 國家衛生研究院, Bethesda, MD (1991)中。抗體鏈之胺基酸係根據如上文所定義之Kabat之編號系統(Kabat, E.A.等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 美國公眾衛生服務署, 國家衛生研究院, Bethesda, MD (1991))編號及歸類。
本發明之態樣 下文列出本發明之一些態樣。
1.一種用於治療癌症或延遲癌症之進展之方法中的4-1BB (CD137)促效劑，其中該4-1BB促效劑與抗-CD20抗體組合使用，且其中該4-1BB促效劑包含能夠與腫瘤相關抗原，特定言之CD19或FAP特異性結合的至少一個抗原結合域。
2.如段落1之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑及該抗-CD20抗體係相伴投與。
3.如段落1或2之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑及該抗-CD20抗體以單一組合物形式一起投與，或以兩種或更多種不同組合物形式分開投與。
4.如前述態樣之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑與該4-1BB促效劑同時、在其之前或之後投與。
5.如前述態樣中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑包含三個4-1BBL胞外域或其片段。
6.如前述態樣中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為包含三個4-1BBL胞外域或其片段的分子，且其中該等4-1BBL胞外域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8，特定言之SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。
7.如前述態樣中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為包含三個4-1BBL胞外域或其片段及能夠與CD19特異性結合之一個抗原結合域的抗原結合分子。
8.如前述態樣中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中包含三個4-1BBL胞外域或其片段及能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域的該抗原結合分子將不會被表現CD19之B細胞內化。
9.如前述態樣中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含三個4-1BBL胞外域或其片段及能夠與CD19特異性結合之至少一個部分，其中能夠與CD19特異性結合之該抗原結合域包含： (a)重鏈可變區(VH CD19)，其包含：(i) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CD19)，其包含：(iv) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列，或 (b) VH域，其包含：(i) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列；及VL域，其包含：(iv) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。
10.如前述態樣中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含三個4-1BBL胞外域或其片段及能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域，其中能夠與CD19特異性結合之該抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)，或其中能夠與CD19特異性結合之該抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 23之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)。
11.如前述態樣中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子進一步包含由能夠穩定結合之第一及第二次單元構成的Fc域。
12.如前述態樣中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含IgG Fc域，具體言之IgG1 Fc域或IgG4 Fc域。
13.如前述態樣中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含含有降低或消除與Fc受體之結合及/或效應功能之一或多個胺基酸取代的Fc域。
14. 如前述態樣中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為包含含有胺基酸取代L234A、L235A及P329G之IgG1 Fc域的抗原結合分子。
15.如前述態樣中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域， (b)第一及第二多肽，其藉由二硫鍵彼此連接， 其中該第一多肽包含藉由肽連接子彼此連接的兩個4-1BBL胞外域或其片段，且其中該第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段。
16.如前述態樣中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個Fab域，及 (b)第一及第二多肽，其藉由二硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於： (i)分別地，第一多肽含有CH1或CL域及第二多肽含有CL或CH1域，其中第二多肽藉由CH1域與CL域之間的二硫鍵與第一多肽連接，且其中第一多肽包含兩個4-1BBL胞外域或其片段，該等胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且與CH1或CL域連接，且其中第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子與該多肽之CL或CH1域連接，或 (ii)分別地，第一多肽含有CH3域及第二多肽含有CH3域，且其中第一多肽包含兩個4-1BBL胞外域或其片段，該等胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且與CH3域之C端連接，且其中第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段，該一個胞外域或其片段經由肽連接子與該多肽之CH3域之C端連接，或 (iii)分別地，該第一多肽含有VH-CL或VL-CH1域及該第二多肽含有VL-CH1域或VH-CL域，其中該第二多肽藉由CH1域與CL域之間的二硫鍵與第一多肽連接，且其中第一多肽包含兩個4-1BBL胞外域或其片段，該等胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且與VH或VL連接，且其中第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子與該多肽之VL或VH連接。
17.如前述態樣中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個Fab域，該至少一個Fab域包含：含有SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)，或含有SEQ ID NO: 23之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)，及 (b)第一及第二多肽，其藉由二硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於，該第一多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO: 32，且在於該第二多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8。
18.如前述態樣中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為選自由以下組成之群的抗原結合分子： a)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 35之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 36之胺基酸序列的第二輕鏈； b)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 37之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的第二輕鏈； c)分子，其包含含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 39之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 40之胺基酸序列的第二重鏈； d)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 41之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 42之胺基酸序列的第二輕鏈； e)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 43之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 44之胺基酸序列的第二輕鏈； f)分子，其包含含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 45之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 46之胺基酸序列的第二重鏈； g)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 35之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 36之胺基酸序列的第二輕鏈； h)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 37之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的第二輕鏈； i)分子，其包含含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 49之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的第二重鏈； j)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 41之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 42之胺基酸序列的第二輕鏈； k)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 43之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 44之胺基酸序列的第二輕鏈；及 l)分子，其包含含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 51之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 52之胺基酸序列的第二重鏈。
19.如前述態樣中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域， (b)包含藉由肽連接子彼此連接之三個4-1BBL胞外域或其片段的多肽。 20.如前述態樣中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域， (b)包含藉由肽連接子彼此連接之三個4-1BBL胞外域或其片段的多肽，及 (c)由能夠穩定結合之第一及第二次單元構成之Fc域，其中包含藉由肽連接子彼此連接之三個4-1BBL胞外域或其片段的多肽視情況經由肽連接子與Fc域之兩個次單元中之一者的N端或C端胺基酸融合。
21.如前述態樣之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為選自由以下組成之群的抗原結合分子： (a)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)及含有SEQ ID NO: 53之胺基酸序列的融合蛋白， (b)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)及含有SEQ ID NO: 53之胺基酸序列的融合蛋白； (c)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)及含有SEQ ID NO: 54之胺基酸序列的融合蛋白，及 (d)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)及含有SEQ ID NO: 55之胺基酸序列的融合蛋白。
22.如態樣1至3中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑為抗-CD19/抗-4-1BB雙特異性抗體。
23.如前述態樣1至14中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該抗-CD20抗體為I型抗-CD20抗體。
24.如前述態樣中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該抗-CD20抗體為利妥昔單抗。
25.如前述態樣之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該抗-CD20抗體為II型抗-CD20抗體。
26.如前述態樣之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該抗-CD20抗體為去岩藻糖基化抗-CD20抗體。
27.如態樣1至14或17或18中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該抗-CD20抗體為奧濱尤妥珠單抗。
28.如態樣1至14中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該抗-CD20抗體為利妥昔單抗或奧濱尤妥珠單抗。
29.如前述態樣中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該抗-CD20抗體包含：重鏈可變區(VH CD20)，其包含SEQ ID NO: 73之CDR-H1序列、SEQ ID NO: 74之CDR-H2序列及SEQ ID NO: 75之CDR-H3序列；及/或輕鏈可變區(VL CD20)，其包含SEQ ID NO: 76之CDR-L1序列、SEQ ID NO: 77之CDR-L2序列及SEQ ID NO: 78之CDR-L3序列。
30.如前述態樣中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該第二抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 79之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD20)及/或含有SEQ ID NO: 80之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD20)。
31.如前述態樣中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑包含含有降低與Fc受體之結合及/或效應功能之一或多個胺基酸取代的Fc域。
32.如前述態樣中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑包含含有胺基酸取代L234A、L235A及P329G之IgG1 Fc域。
33.如前述態樣中任一項之用於方法中之4-1BB促效劑，其中該4-1BB促效劑與抗-CD20抗體組合使用，且其中該組合係以約一週至三週之間隔投與。
34.一種醫藥產品，其包含：(A)第一組合物，其包含作為活性成分之含有能夠與腫瘤相關抗原，特定言之CD19或FAP，特異性結合之至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑及醫藥學上可接受之賦形劑；及(B)第二組合物，其包含作為活性成分的抗-CD20抗體及醫藥學上可接受之賦形劑，該等組合物組合、依序或同步使用以治療疾病，特定言之癌症。
35.如態樣34之醫藥產品，其用於治療B細胞增殖性病症，特定言之選自由以下組成之群的疾病：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、彌漫性大型B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、多發性骨髓瘤(MM)及霍奇金淋巴瘤(HL)。
36.一種醫藥組合物，其包含含有能夠與腫瘤相關抗原，特定言之CD19或FAP，特異性結合之至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑及抗-CD20抗體。
37.如態樣36之醫藥組合物，其中包含能夠與腫瘤相關抗原，特定言之CD19或FAP，特異性結合之至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑及抗-CD20抗體，以單一組合物形式一起投與，或以兩種或更多種不同組合物形式分開投與。
38.如態樣36或37之醫藥組合物，包含能夠與腫瘤相關抗原，特定言之CD19或FAP，特異性結合之至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑係與抗-CD20抗體同時、在其之前或之後投與。
39.如態樣36至38中任一項之醫藥組合物，其中該4-1BB促效劑包含三個4-1BBL胞外域或其片段。
40.如態樣36至39中任一項之醫藥組合物，其中該4-1BB促效劑為包含三個4-1BBL胞外域或其片段的分子，且其中該等4-1BBL胞外域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8，特定言之SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。
41.如態樣36至40中任一項之醫藥組合物，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含三個4-1BBL胞外域或其片段及能夠與腫瘤相關抗原，特定言之CD19，特異性結合的至少一個抗原結合域。
42.如態樣36至41中任一項之醫藥組合物，其中該4-1BB促效劑將不會被內化於B細胞中。
43.如態樣36至42中任一項之醫藥組合物，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含三個4-1BBL胞外域或其片段及能夠與CD19特異性結合之至少一個部分，其中能夠與CD19特異性結合之該抗原結合域包含： (a)重鏈可變區(VH CD19)，其包含：(i) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CD19)，其包含：(iv) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列，或 (b) VH域，其包含：(i) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列；及VL域，其包含：(iv) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。
44.如態樣36至43中任一項之醫藥組合物，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含三個4-1BBL胞外域或其片段及能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域，其中能夠與CD19特異性結合之該抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)，或其中能夠與CD19特異性結合之該抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 23之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)。
45.如態樣36至44中任一項之醫藥組合物，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子進一步包含由能夠穩定結合之第一及第二次單元構成的Fc域。
46.如態樣36至44中任一項之醫藥組合物，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含IgG Fc域，具體言之IgG1 Fc域或IgG4 Fc域。
47.如態樣36至46中任一項之醫藥組合物，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含含有降低與Fc受體之結合及/或效應功能之一或多個胺基酸取代的Fc域。
48.如態樣36至47中任一項之醫藥組合物，其中該4-1BB促效劑為包含含有胺基酸取代L234A、L235A及P329G之IgG1 Fc域的抗原結合分子。
49.如態樣36至48中任一項之醫藥組合物，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域， (b)第一及第二多肽，其藉由二硫鍵彼此連接， 其中該第一多肽包含藉由肽連接子彼此連接的兩個4-1BBL胞外域或其片段，且其中該第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段。
50.如態樣36至49中任一項之醫藥組合物，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個Fab域，及 (b)第一及第二多肽，其藉由二硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於： (i)分別地，第一多肽含有CH1或CL域及第二多肽含有CL或CH1域，其中第二多肽藉由CH1域與CL域之間的二硫鍵與第一多肽連接，且其中第一多肽包含兩個4-1BBL胞外域或其片段，該等胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且與CH1或CL域連接，且其中第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子與該多肽之CL或CH1域連接，或 (ii)分別地，第一多肽含有CH3域及第二多肽含有CH3域，且其中第一多肽包含兩個4-1BBL胞外域或其片段，該等胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且與CH3域之C端連接，且其中第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段，該一個胞外域或其片段經由肽連接子與該多肽之CH3域之C端連接，或 (iii)分別地，該第一多肽含有VH-CL或VL-CH1域及該第二多肽含有VL-CH1域或VH-CL域，其中該第二多肽藉由CH1域與CL域之間的二硫鍵與第一多肽連接，且其中第一多肽包含兩個4-1BBL胞外域或其片段，該等胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且與VH或VL連接，且其中第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子與該多肽之VL或VH連接。
51.如態樣36至50中任一項之醫藥組合物，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個Fab域，該至少一個Fab域包含：含有SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)，或含有SEQ ID NO: 23之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)，及 (b)第一及第二多肽，其藉由二硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於，該第一多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO: 32，且在於該第二多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8。
52.如態樣36至51中任一項之醫藥組合物，其中該4-1BB促效劑為選自由以下組成之群的抗原結合分子： a)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 35之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 36之胺基酸序列的第二輕鏈； b)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 37之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的第二輕鏈； c)分子，其包含含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 39之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 40之胺基酸序列的第二重鏈； d)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 41之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 42之胺基酸序列的第二輕鏈； e)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 43之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 44之胺基酸序列的第二輕鏈； f)分子，其包含含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 45之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 46之胺基酸序列的第二重鏈； g)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 35之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 36之胺基酸序列的第二輕鏈； h)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 37之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的第二輕鏈； i)分子，其包含含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 49之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的第二重鏈； j)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 41之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 42之胺基酸序列的第二輕鏈； k)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 43之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 44之胺基酸序列的第二輕鏈；及 l)分子，其包含含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 51之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 52之胺基酸序列的第二重鏈。
53.如態樣36至48中任一項之醫藥組合物，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域， (b)包含藉由肽連接子彼此連接之4-1BBL胞外域或其片段的多肽。
54.如態樣36至48或53中任一項之醫藥組合物，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域， (b)包含藉由肽連接子彼此連接之三個4-1BBL胞外域或其片段的多肽，及 (c)由能夠穩定結合之第一及第二次單元構成之Fc域，其中包含藉由肽連接子彼此連接之三個4-1BBL胞外域或其片段的多肽視情況經由肽連接子與Fc域之兩個次單元中之一者的N端或C端胺基酸融合。
55.如態樣36至48或53或54中任一項之醫藥組合物，其中該4-1BB促效劑為選自由以下組成之群的抗原結合分子： (a)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)及含有SEQ ID NO: 53之胺基酸序列的融合蛋白， (b)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)及含有SEQ ID NO: 53之胺基酸序列的融合蛋白； (c)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)及含有SEQ ID NO: 54之胺基酸序列的融合蛋白，及 (d)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)及含有SEQ ID NO: 55之胺基酸序列的融合蛋白。
56.如態樣36至38中任一項之醫藥組合物，其中該4-1BB促效劑為抗-CD19/抗-4-1BB雙特異性抗體。
57.如態樣36至56中任一項之醫藥組合物，其中該抗-CD20抗體包含：重鏈可變區(VH CD20)，其包含SEQ ID NO: 73之CDR-H1序列、SEQ ID NO: 74之CDR-H2序列及SEQ ID NO: 75之CDR-H3序列；及/或輕鏈可變區(VL CD20)，其包含SEQ ID NO: 76之CDR-L1序列、SEQ ID NO: 77之CDR-L2序列及SEQ ID NO: 78之CDR-L3序列。
58.如態樣36至57中任一項之醫藥組合物，其中該抗-CD20抗體包含：含有SEQ ID NO: 79胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD20)及/或含有SEQ ID NO: 80之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD20)。
59.如態樣36至58中任一項之醫藥組合物，其中包含能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域的該4-1BB促效劑與抗-CD20抗體組合使用，且其中該組合係以約一週至三週之間隔投與。
60.如態樣36至59中任一項之醫藥組合物，其用於治療增殖性疾病(特定言之癌症)或延遲增殖性疾病之進展。
61.如態樣36至60中任一項之醫藥組合物，其用於治療B細胞增殖性病症，特定言之選自由以下組成之群的疾病：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、彌漫性大型B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、多發性骨髓瘤(MM)及霍奇金淋巴瘤(HL)。
62.一種用於治療個體之癌症或延遲個體之癌症之進展的套組，其包含封裝，該封裝包含：(A)第一組合物，其包含作為活性成分之含有能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑及醫藥學上可接受之賦形劑；(B)第二組合物，其包含作為活性成分的抗-CD20抗體及醫藥學上可接受之賦形劑；及(C)在組合療法中，組合物的使用說明書。
63.一種4-1BB促效劑與抗-CD20抗體之組合的用途，該4-1BB促效劑包含能夠與CD19特異性結合的至少一個抗原結合域，該組合用於製造用於治療增殖性疾病(特定言之，癌症)或延遲增殖性疾病的進展的藥物。
64.一種4-1BB促效劑與抗-CD20抗體之組合之用途，該4-1BB促效劑包含能夠與CD19特異性結合的至少一個抗原結合域，該組合用於製造藥物，其中該藥物係用於治療B細胞增殖性病症，特定言之選自由以下組成之群的疾病：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、多發性骨髓瘤(MM)及霍奇金淋巴瘤(HL)。
65.一種用於治療個體之癌症或延遲個體之癌症之進展的方法，其包含向該個體投與有效量之4-1BB促效劑及抗-CD20抗體，該4-1BB促效劑包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合的至少一個抗原結合域。
66.一種用於治療個體之癌症或延遲個體之癌症之進展的方法，其包含向該個體投與有效量之4-1BB促效劑及抗-CD20抗體，該4-1BB促效劑包含能夠與CD19特異性結合的至少一個抗原結合域，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子。
67.如態樣65或66之方法，其中該4-1BB促效劑為包含Fc域之抗原結合分子。
68.如態樣65至67中任一項之方法，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含具有降低Fcγ受體結合及/或效應功能之修飾的Fc域。
69.如態樣65至68中任一項之方法，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含三個4-1BBL胞外域或其片段。
70.如態樣65至69中任一項之方法，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含三個4-1BBL胞外域或其片段及能夠與CD19特異性結合之抗原結合域。
71.如態樣65至70中任一項之方法，其中該4-1BB促效劑為包含三個4-1BBL胞外域或其片段的分子，且其中該等4-1BBL胞外域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8，特定言之SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。
72.如態樣65至71中任一項之方法，其中該4-1BB促效劑將不會被內化於B細胞中。
73.如態樣65至72中任一項之方法，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含三個4-1BBL胞外域或其片段及能夠與CD19特異性結合之至少一個部分，其中能夠與CD19特異性結合之該抗原結合域包含： (a)重鏈可變區(VH CD19)，其包含：(i) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CD19)，其包含：(iv) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列，或 (b) VH域，其包含：(i) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列；及VL域，其包含：(iv) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。
74.如態樣65至73中任一項之方法，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含三個4-1BBL胞外域或其片段及能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域，其中能夠與CD19特異性結合之該抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)，或其中能夠與CD19特異性結合之該抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 23之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)。
75.如態樣65至74中任一項之方法，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子進一步包含由能夠穩定結合之第一及第二次單元構成的Fc域。
76.如態樣65至75中任一項之方法，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含IgG Fc域，具體言之IgG1 Fc域或IgG4 Fc域。
77.如態樣65至76中任一項之方法，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含含有降低與Fc受體之結合及/或效應功能之一或多個胺基酸取代的Fc域。
78.如態樣65至77中任一項之方法，其中該4-1BB促效劑為包含含有胺基酸取代L234A、L235A及P329G之IgG1 Fc域的抗原結合分子。
79.如態樣65至78中任一項之方法，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域， (b)第一及第二多肽，其藉由二硫鍵彼此連接， 其中該第一多肽包含藉由肽連接子彼此連接的兩個4-1BBL胞外域或其片段，且其中該第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段。
80.如態樣65至79中任一項之方法，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個Fab域，及 (b)第一及第二多肽，其藉由二硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於： (i)分別地，第一多肽含有CH1或CL域及第二多肽含有CL或CH1域，其中第二多肽藉由CH1域與CL域之間的二硫鍵與第一多肽連接，且其中第一多肽包含兩個4-1BBL胞外域或其片段，該等胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且與CH1或CL域連接，且其中第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子與該多肽之CL或CH1域連接，或 (ii)分別地，第一多肽含有CH3域及第二多肽含有CH3域，且其中第一多肽包含兩個4-1BBL胞外域或其片段，該等胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且與CH3域之C端連接，且其中第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段，該一個胞外域或其片段經由肽連接子與該多肽之CH3域之C端連接，或 (iii)分別地，該第一多肽含有VH-CL或VL-CH1域及該第二多肽含有VL-CH1域或VH-CL域，其中該第二多肽藉由CH1域與CL域之間的二硫鍵與第一多肽連接，且其中第一多肽包含兩個4-1BBL胞外域或其片段，該等胞外域或其片段藉由肽連接子彼此連接且與VH或VL連接，且其中第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段，該胞外域或其片段經由肽連接子與該多肽之VL或VH連接。
81.如態樣65至80中任一項之方法，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個Fab域，該至少一個Fab域包含：含有SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)，或含有SEQ ID NO: 23之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)，及 (b)第一及第二多肽，其藉由二硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於，該第一多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO: 32，且在於該第二多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8。
82.如態樣65至81中任一項之方法，其中該4-1BB促效劑為選自由以下組成之群的抗原結合分子： a)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 35之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 36之胺基酸序列的第二輕鏈； b)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 37之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的第二輕鏈； c)分子，其包含含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 39之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 40之胺基酸序列的第二重鏈； d)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 41之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 42之胺基酸序列的第二輕鏈； e)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 43之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 44之胺基酸序列的第二輕鏈； f)分子，其包含含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 45之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 46之胺基酸序列的第二重鏈； g)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 35之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 36之胺基酸序列的第二輕鏈； h)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 37之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的第二輕鏈； i)分子，其包含含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 49之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的第二重鏈； j)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 41之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 42之胺基酸序列的第二輕鏈； k)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 43之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 44之胺基酸序列的第二輕鏈；及 l)分子，其包含含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 51之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 52之胺基酸序列的第二重鏈。
83.如態樣65至82中任一項之方法，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域， (b)包含藉由肽連接子彼此連接之三個4-1BBL胞外域或其片段的多肽。
84.如態樣65至83中任一項之方法，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域， (b)包含藉由肽連接子彼此連接之三個4-1BBL胞外域或其片段的多肽，及 (c)由能夠穩定結合之第一及第二次單元構成之Fc域，其中包含藉由肽連接子彼此連接之三個4-1BBL胞外域或其片段的多肽視情況經由肽連接子與Fc域之兩個次單元中之一者的N端或C端胺基酸融合。
85.如態樣65至84中任一項之方法，其中該4-1BB促效劑為選自由以下組成之群的抗原結合分子： (a)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)及含有SEQ ID NO: 53之胺基酸序列的融合蛋白， (b)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)及含有SEQ ID NO: 53之胺基酸序列的融合蛋白； (c)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)及含有SEQ ID NO: 54之胺基酸序列的融合蛋白，及 (d)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)及含有SEQ ID NO: 55之胺基酸序列的融合蛋白。
86.如態樣65至68中任一項之方法，其中該4-1BB促效劑為抗-CD19/抗-4-1BB雙特異性抗體。
87.如態樣65至86中任一項之方法，其中該抗-CD20抗體包含：重鏈可變區(VH CD20)，其包含SEQ ID NO: 73之CDR-H1序列、SEQ ID NO: 74之CDR-H2序列及SEQ ID NO: 75之CDR-H3序列；及/或輕鏈可變區(VL CD20)，其包含SEQ ID NO: 76之CDR-L1序列、SEQ ID NO: 77之CDR-L2序列及SEQ ID NO: 78之CDR-L3序列。
88.如態樣65至87中任一項之方法，其中該抗-CD20抗體包含：含有SEQ ID NO: 79之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD20)及/或含有SEQ ID NO: 80之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD20)。
89.如態樣65至86中任一項之方法，其中該抗-CD20抗體包含利妥昔單抗。
90.如態樣65至89中任一項之方法，其中包含能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域的4-1BB促效劑與抗-CD20抗體組合使用，且其中該組合係以約一週至三週之間隔投與。
91.如態樣65至90中任一項之方法，其中包含能夠與腫瘤相關抗原(特定言之，CD19或FAP)特異性結合之至少一個抗原結合域的該4-1BB促效劑及該抗-CD20抗體，以單一組合物形式一起投與，或以兩種或更多種不同組合物形式分開投與。
92.如態樣65至91中任一項之方法，其中包含能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域的該4-1BB促效劑及該抗-CD20抗體經靜脈內或皮下投與。
93.如態樣65至92中任一項之方法，其中包含能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域的該4-1BB促效劑，係與該抗-CD20抗體同時、在其之前或之後投與。
94.一種組合，其包含4-1BB (CD137)促效劑及抗-CD20抗體，其中該4-1BB促效劑為包含能夠與腫瘤相關抗原特異性結合之至少一個抗原結合域的抗原結合分子。
95.如態樣94之組合，其中該4-1BB促效劑及該抗-CD20抗體係同時投與。
96.如態樣94或95之組合，其中該4-1BB促效劑及該抗-CD20抗體以單一組合物形式一起投與，或以兩種或更多種不同組合物形式分開投與。
97.如態樣94至96中任一項之組合，其中該4-1BB促效劑包含能夠與CD19特異性結合的至少一個抗原結合域。
98.如態樣94至97中任一項之組合，其中該4-1BB促效劑包含三個4-1BBL胞外域或其片段。
99.如態樣94至98中任一項之組合，其中該4-1BB促效劑包含三個4-1BBL胞外域或其片段，且其中該等4-1BBL胞外域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8，特定言之SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。
100.如態樣94至99中任一項之組合，其中該4-1BB促效劑為包含能夠與CD19特異性結合的至少一個抗原結合域及三個4-1BBL胞外域或其片段的抗原結合分子，其中能夠與CD19特異性結合的該抗原結合域包含： (a)重鏈可變區(VH CD19)，其包含：(i) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CD19)，其包含：(iv) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列，或 (b)重鏈可變區(VH CD19)，其包含：(i) CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列，及(iii) CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CD19)，其包含：(iv) CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列，(v) CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列，及(vi) CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。
101.如態樣94至100中任一項之組合，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域及三個4-1BBL胞外域或其片段，其中能夠與CD19特異性結合的該抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)，或其中能夠與CD19特異性結合之該抗原結合域包含含有SEQ ID NO: 23之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)。
102.如態樣94至101中任一項之組合，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含IgG Fc域，具體言之IgG1 Fc域或IgG4 Fc域。
103.如態樣94至102中任一項之組合，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個抗原結合域， (b)第一及第二多肽，其藉由二硫鍵彼此連接， 其中該第一多肽包含藉由肽連接子彼此連接的兩個4-1BBL胞外域或其片段，且該第二多肽包含一個4-1BBL胞外域或其片段。
104.如態樣94至103中任一項之組合，其中該4-1BB促效劑為抗原結合分子，該抗原結合分子包含： (a)能夠與CD19特異性結合之至少一個Fab域，該至少一個Fab域包含：含有SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)，或含有SEQ ID NO: 23之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及含有SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)，及 (b)第一及第二多肽，其藉由二硫鍵彼此連接， 其中該抗原結合分子之特徵在於，該第一多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO: 32，且在於該第二多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8。
105.如態樣94至104中任一項之組合，其中該4-1BB促效劑為選自由以下組成之群的抗原結合分子： a)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 35之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 36之胺基酸序列的第二輕鏈； b)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 37之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的第二輕鏈； c)分子，其包含含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 39之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 40之胺基酸序列的第二重鏈； d)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 41之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 42之胺基酸序列的第二輕鏈； e)分子，其包含含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 43之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 44之胺基酸序列的第二輕鏈； f)分子，其包含含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 45之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 46之胺基酸序列的第二重鏈； g)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 35之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 36之胺基酸序列的第二輕鏈； h)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 37之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 38之胺基酸序列的第二輕鏈； i)分子，其包含含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 49之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的第二重鏈； j)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 41之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 42之胺基酸序列的第二輕鏈； k)分子，其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO: 43之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO: 44之胺基酸序列的第二輕鏈；及 l)分子，其包含含有SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO: 51之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO: 52之胺基酸序列的第二重鏈。
106.如態樣94至105中任一項之組合，其中該4-1BB促效劑為包含能夠與CD19特異性結合之一個抗原結合域的抗原結合分子。
107.如態樣94至97中任一項之組合，其中該4-1BB促效劑為抗-CD19/抗-4-1BB雙特異性抗體。
108.如態樣94至107中任一項之組合，其中該抗-CD20抗體為I型抗-CD20抗體。
109.如態樣94至108中任一項之組合，其中該抗-CD20抗體為利妥昔單抗。
110.如態樣94至107中任一項之組合，其中該抗-CD20抗體為II型抗-CD20抗體。
111.如態樣94至110中任一項之組合，其中該抗-CD20抗體為去岩藻糖基化抗-CD20抗體。
112.如態樣94至107或111或112中任一項之組合，其中該抗-CD20抗體為奧濱尤妥珠單抗。
113.如態樣94至107中任一項之組合，其中該抗-CD20抗體為利妥昔單抗或奧濱尤妥珠單抗。
114.如態樣94至113中任一項之組合，其用作藥物。
115.如態樣94至114中任一項之組合，其中該4-1BB促效劑及該抗-CD20抗體以單一組合物形式一起投與，或以兩種或更多種不同組合物形式分開投與。
116.如態樣94至115中任一項之組合，其中該4-1BB促效劑及該抗-CD20抗體係用於同步投與或用於依序投與。
117.如態樣94至116中任一項之組合，其用於治療B細胞增殖性病症，特定言之選自由以下組成之群的疾病：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、多發性骨髓瘤(MM)及霍奇金淋巴瘤(HL)。 ***
實例 以下為本發明之方法及組合物的實例。應理解，考慮到上文提供之一般描述，可實踐各種其他實施例。
重組DNA技術 使用標準方法來如Sambrook, J.等人, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989中所描述操作DNA。分子生物試劑係根據製造商之說明書使用。關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列之一般資訊在以下中給出：Kabat, E.A.等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, NIH公開案第91-3242號。
DNA定序 藉由雙股定序法測定DNA序列。
基因合成 所需基因區段係使用適當模板藉由PCR產生，或藉由自動化基因合成法，藉由Geneart AG (Regensburg, Germany)自合成寡核苷酸及PCR產物合成。在確切基因序列無法獲得的情況下，基於來自最近同源物的序列來設計寡核苷酸引子，且藉由RT-PCR自來源於適當組織之RNA分離基因。將側接有單數個限制性核酸內切酶裂解位點的基因區段選殖至標準選殖/定序載體中。自經轉化之細菌純化出質體DNA且藉由UV光譜分析來測定濃度。經次選殖之基因片段之DNA序列藉由DNA定序來確認。基因區段設計成具有允許次選殖至各別表現載體中的合適的限制位點。所有構築體設計成具有5'端DNA序列，該序列編碼靶向真核細胞中分泌之蛋白質的前導肽。
細胞培養技術 如Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J.及Yamada, K.M. (編), John Wiley & Sons, Inc.中之現有方案中所描述使用標準細胞培養技術。
蛋白質純化 參考標準方案，自經過濾之細胞培養物清液層純化蛋白質。簡言之，將抗體施用於蛋白A瓊脂糖凝膠管柱(GE Healthcare)且用PBS洗滌。在pH 2.8下達成抗體之溶離，隨後立即中和樣本。在PBS或20 mM組胺酸、150 mM NaCl pH 6.0中，藉由尺寸排阻層析(Superdex 200，GE Healthcare)將聚集之蛋白質與單體抗體分離。單體抗體級分經合併、使用例如MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO)離心濃縮器濃縮(必要時)、冷凍且儲存在-20℃或-80℃下。提供部分樣本用於例如藉由SDS-PAGE、尺寸排阻層析(SEC)或質譜法進行後續蛋白質分析及分析型表徵。
SDS-PAGE 根據製造商說明書使用NuPAGE® Pre-Cast凝膠系統(Invitrogen)。特定言之，使用10%或4-12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast凝膠(pH 6.4)及NuPAGE® MES (還原性凝膠，具有NuPAGE® Antioxidant操作緩衝液添加劑)或MOPS (非還原性凝膠)操作緩衝液。
分析性尺寸排阻層析 藉由HPLC層析進行用於測定抗體之聚集及寡聚狀態之尺寸排阻層析(SEC)。簡言之，將蛋白A純化抗體施用於Agilent HPLC 1100系統上300 mM NaCl、50 mM KH2 PO4 /K2 HPO4 ，pH 7.5中之Tosoh TSKgel G3000SW管柱或Dionex HPLC系統上2×PBS中之Superdex 200管柱(GE Healthcare)。藉由UV吸光度及峰面積之積分來定量溶離之蛋白質。將BioRad Gel過濾標準151-1901用作標準。
使用表面電漿子共振 (SPR) (BIACORE) 測定多特異性抗體與各別抗原之結合及結合親和力 使用BIACORE儀器(GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Sweden)，藉由表面電漿子共振研究所產生之抗體與各別抗原之結合。簡言之，對於親和力量測，經由胺偶合，將山羊抗-人類IgG JIR 109-005-098抗體固定在CM5晶片上以用於針對各別抗原之抗體之呈現。在HBS緩衝液(HBS-P) (10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.005% Tween 20，pH 7.4)中，在25℃下(或替代地在37℃下)量測結合。在溶液中以多種濃度添加抗原(R&D Systems或內部純化)。藉由80秒至3分鐘之抗原注射來量測結合；藉由用HBS緩衝液洗滌晶片表面3-10分鐘來量測解離，且使用1:1朗繆爾結合模型(Langmuir binding model)來評估KD值。自樣本曲線減去陰性對照資料(例如緩衝液曲線)以用於系統內源性基線偏移之校正及降低雜訊信號。使用各別Biacore Evaluation軟體進行感測器圖譜之分析及親和力資料之計算。
實例1
包含能夠與腫瘤相關抗原特異性結合之至少一個抗原結合域之4-1BBL抗原結合分子的製備、純化及表徵 如國際專利申請公開案第WO 2016/075278 A1號中所描述製備CD19-含靶向4-1BB配體三聚體之Fc融合抗原結合分子。
特定言之，製備以下分子：
a)一價CD19-含靶向及非靶向4-1BB配體三聚體之Fc融合抗原結合分子 將編碼與人類CL域融合之二聚4-1BB配體之DNA序列，次選殖在杵上具有人類IgG1重鏈CH2及CH3域之框架中(Merchant, Zhu等人 1998)。將含有一個4-1BB配體胞外域之多肽與人類IgG1-CH1域融合。在構築體3.4中，為了提高鏈之正確配對，另外將以下突變引入互換CH-CL (帶電變體)中。在與人類CL融合之二聚4-1BB配體中，引入E123R及Q124K，在與人類CH1融合之單體4-1BB配體中，引入K147E及K213E。
將編碼對CD19具有特異性之結合子(純系8B8-018或純系8B8-2B11)之重鏈及輕鏈DNA序列的可變區，次選殖在具有臼之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中。根據WO 2012/130831中描述之方法，已將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入杵及臼重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。含有S354C/T366W突變之二聚配體-Fc杵鏈、單體CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之靶向抗CD19-Fc臼鏈及抗CD19輕鏈之組合，允許產生雜二聚體，其包括所組裝之三聚4-1BB配體及CD19結合Fab (圖 1A 及圖 1B )。已相應地藉由用生殖系DP47置換CD19結合子來製備非靶向型式(圖 1C )。表 1 ： 實驗中所用之一價 CD19-4-1BBL 構築體
b)二價CD19-含靶向及非靶向4-1BB配體三聚體之Fc融合抗原結合分子 將編碼重鏈及輕鏈之重鏈及輕鏈可變區(特定地，對CD19具有特異性之結合子(純系8B8-018或純系8B8-2B11))的DNA序列，次選殖在具有臼之恆定重鏈、杵或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中。根據WO 2012/130831中描述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入杵及臼重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。此外，將包含兩個4-1BB配體胞外域之多肽與人類IgG1 Fc臼鏈之C端融合，且將包含一個4-1BB配體胞外域之多肽與人類IgG1 Fc杵鏈之C端融合。含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗-CD19 huIgG1臼二聚配體重鏈、含有S354C/T366W突變之抗-CD19 huIgG1杵單體配體重鏈及抗-CD19輕鏈之組合，允許產生雜二聚體，其包括所組裝之三聚4-1BB配體及兩個CD19結合Fab (圖 1D )。已相應地藉由用生殖系DP47置換CD19結合子來製備非靶向型式(圖 1E )。表 2 ：實驗中所用之二價 CD19-4-1BBL 構築體
在WO 2016/075278之實例7.4及實例8至11中，分別詳細描述CD19-含靶向及未靶向4-1BB配體三聚體之Fc融合抗原結合分子的產生及表徵。
亦如國際專利申請公開案第WO 2016/075278 A1號中所描述製備FAP-含靶向4-1BB配體三聚體之Fc融合抗原結合分子。
特定言之，製備以下分子： c)一價FAP-含靶向4-1BB配體三聚體之Fc融合抗原結合分子 將編碼對FAP具有特異性之結合子(純系28H1或純系4B9)之重鏈及輕鏈DNA序列之可變區，次選殖在具有臼之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中。根據WO 2012/130831中描述之方法，已將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入杵及臼重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。含有S354C/T366W突變之二聚配體Fc杵鏈、單體CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之靶向抗-FAP-Fc臼鏈及抗-FAP輕鏈之組合，允許產生雜二聚體，其包括所組裝之三聚4-1BB配體及FAP結合Fab (類似於圖1A)。表 3 ： 一價 FAP-4-1BBL 構築體
d)二價FAP-含靶向4-1BB配體三聚體之Fc融合抗原結合分子 將編碼重鏈及輕鏈之重鏈及輕鏈可變區(特定地，對FAP具有特異性之結合子(純系28H1或純系4B9))的DNA序列，次選殖在具有臼之恆定重鏈、杵或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中。根據WO 2012/130831中描述之方法，將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入杵及臼重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。此外，將包含兩個4-1BB配體胞外域之多肽與人類IgG1 Fc臼鏈之C端融合，且將包含一個4-1BB配體胞外域之多肽與人類IgG1 Fc杵鏈之C端融合。含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之抗-FAP huIgG1臼二聚配體重鏈、含有S354C/T366W突變之抗-FAP huIgG1杵單體配體重鏈及抗-FAP輕鏈之組合，允許產生雜二聚體，其包括所組裝之三聚4-1BB配體及兩個FAP結合Fab (圖 1D )。表 4 ： 二價 FAP-4-1BBL 構築體
在WO 2016/075278之實例1至6中，分別詳細描述FAP-含靶向4-1BB配體三聚體之Fc融合抗原結合分子的產生及表徵。
實例2
一價CD19-mu4-1BBL抗原結合分子(混合替代物)之製備、純化及表徵 如國際專利申請公開案第WO 2016/075278 A1號中所描述製備CD19-含靶向鼠類4-1BB配體三聚體之Fc融合抗原結合分子。根據Uniprot資料庫之Q3U1Z9-1序列，合成編碼小鼠4-1BB配體之胞外域之一部分(胺基酸104-309，包括C160S突變)的DNA序列。
將編碼與人類CL域融合之二聚鼠類4-1BB配體之DNA序列，次選殖在杵上具有人類IgG1重鏈CH2及CH3域之框架中(Merchant, Zhu等人 1998)。將含有一個鼠類4-1BB配體胞外域之多肽與人類IgG1-CH1域融合。將編碼對CD19具有特異性之結合子(純系8B8-018)之重鏈及輕鏈DNA序列的可變區，次選殖在具有臼之恆定重鏈或人類IgG1之恆定輕鏈的框架中。根據WO 2012/130831中描述之方法，已將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變引入杵及臼重鏈之恆定區以消除與Fcγ受體之結合。含有S354C/T366W突變之二聚配體-Fc杵鏈、單體CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之靶向抗-CD19-Fc孔鏈及抗-CD19輕鏈之組合，允許產生雜二聚體，其包括所組裝之三聚鼠類4-1BB配體及CD19結合Fab (圖 1F )。
混合替代物CD19-mu4-1BBL之胺基酸序列可見於表 5 中。表 5 ： 成熟混合替代物 CD19-mu4-1BBL 之胺基酸序列
藉由使用eviFect (Evitria AG)，用哺乳動物表現載體共轉染生長於懸浮液中的CHO-K1細胞，來產生混合替代物CD19-mu4-1BBL。用對應表現載體以1:1:1:1比率(「載體Fc-臼重鏈」:「載體CD19輕鏈」:「載體4-1BBL Fc-杵重鏈」:「載體mu4-1BBL輕鏈」)轉染細胞。為了轉染，在eviMake (Evitria AG)培養基中以不含血清之懸浮液培養CHO-K1細胞。在培育箱中在37℃下5% CO2 氛圍下7天後，藉由離心收集培養上清液以用於純化，且將溶液無菌過濾(0.22 mm過濾器)並保持於4℃下。藉由親和層析，使用蛋白A，隨後尺寸排阻層析，自細胞培養物上清液純化所分泌之蛋白質。對於親和層析，將上清液裝載於使用20 mM磷酸鈉、20 mM檸檬酸鈉pH 7.5平衡之蛋白A MabSelectSure管柱(GE Healthcare)上。藉由用含有20 mM磷酸鈉、20 mM檸檬酸鈉之緩衝液(pH 7.5)洗滌來移除未結合蛋白質。使用20 mM檸檬酸鈉、100 mM NaCl、100 mM甘胺酸、0.01% Tween20 ，pH 3.0之線性pH梯度之氯化鈉來溶離結合蛋白質。隨後用20 mM檸檬酸鈉、100 mM NaCl、100 mM甘胺酸、0.01% Tween20，pH 3.0洗滌管柱。藉由添加1/40 (v/v) 2 M Tris，pH 8.0來調節所收集之級分之pH。在裝載於用20 mM組胺酸、140 mM NaCl、0.01% Tween20，pH 6.0平衡之HiLoad Superdex 管柱(GE Healthcare)上之前，將蛋白質進行濃縮且過濾。
藉由使用基於胺基酸序列計算之莫耳消光係數量測280 nm下的OD，來測定經純化的雙特異性構築體的蛋白質濃度。使用LabChipGXII (測徑規)在存在及不存在還原劑(Invitrogen, USA)下，藉由CE-SDS分析雙特異性構築體之純度及分子量。在25℃下，使用在25 mM K2 HPO4 、125 mM NaCl、200 mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02% (w/v) NaN3 、pH 6.7操作緩衝液中平衡之TSKgel G3000 SW XL分析型尺寸排阻管柱(Tosoh)，分析雙特異性構築體之聚集物含量。表 6 ： 混合替代物CD19-mu4-1BBL之生物化學分析
藉由表面電漿子共振對混合替代物 CD19-mu4-1BBL 進行功能性表徵 藉由表面電漿子共振(SPR)評定同時結合鼠類4-1BB Fc(kih)及人類CD19之能力。所有SPR實驗均在Biacore T200上在25℃下用HBS-EP作為操作緩衝液(0.01 M HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.005%界面活性劑P20, Biacore, Freiburg/Germany)來進行。經生物素標記之鼠類4-1BB Fc(kih)與抗生蛋白鏈菌素(SA)感測器晶片之流動細胞直接偶合。使用至多600個共振單位(RU)之固定水準。CD19-靶向mu4-1BBL構築體以200 nM濃度範圍以30微升/分鐘流速歷經90秒流過流動細胞，且解離設定為零秒。以500 nM之濃度，以30微升/分鐘之流速，歷經90秒流過流動細胞，注射單體人類CD19-Fc(kih)作為第二分析物(圖 2A )。監測解離120秒。藉由減去在參考流動細胞(其中未固定蛋白質)中獲得之反應來校正整體折射率差異。如圖 2B 之曲線中可見，混合替代物CD19-mu4-1BBL可同時結合鼠類4-1BB及人類CD19。
實例3
活體外 CD19-4-1BBL 及利妥昔單抗或奧濱尤妥珠單抗之組合療法
NK 細胞 之活化 CD19-4-1BBL在其可在表現CD19之NHL細胞上交聯時為活性的。諸如利妥昔單抗或奧比尼單抗(加澤瓦)之抗體與NHL細胞上之CD20結合，且從而可活化NK細胞以介導ADCC。活化的NK細胞表現4-1BB。吾人之假設為，CD19-4-1BBL可與抗-CD20 ADCC介導抗體協同作用，以用於NK細胞活化。為了測試此，吾人使用3種不同NHL細胞株，例如WSU-DLCL2 (CD19+ CD20high )、SU-DHL-8 (CD19+ CD20low )及Naml-6 (CD19+ CD20low )。為了量測已活化NK細胞之生物活性，吾人將各別NHL細胞與來自新鮮健康血液之純化PBMC，以1:25之比率，在存在單獨劑量滴定的利妥昔單抗或奧濱尤妥珠單抗、或在利妥昔單抗或奧濱尤妥珠單抗之最高EC50 濃度上添加劑量滴定的CD19-4-1BBL之情況下，在IMDM培養基(Gibco，目錄號31980-048) +10% FBS (Gibco，目錄號16140-071)及1%青黴素-鏈黴素(Gibco，目錄號15070-063)中，一起培育24小時。收集上清液以用於藉由ELISA (DuoSet人類IFN-γ ELISA套組，R&D Systems，目錄號DY285)量測IFN-γ。圖 3 顯示，在所有三種所測試NHL細胞株中，CD19-4-1BBL可增強藉由利妥昔單抗或奧濱尤妥珠單抗(加澤瓦)活化之NK細胞之IFN-γ產生的效應功能。對於諸如SU-DHL-8及Nalm-6之CD20low 細胞，與奧濱尤妥珠單抗之組合比與利妥昔單抗之組合誘導更高的IFN-γ產生。
為了確認CD19-4-1BBL僅能夠在添加ADCC介導抗體之後活化NK細胞，吾人量測NK細胞上之活化標記物(諸如CD25) (在CD3- CD56dim 上閘控)。與IFN-γ產生一致，CD19-4-1BBL可藉由上調CD25僅增強已藉由利妥昔單抗或奧濱尤妥珠單抗活化之NK細胞的活化(圖 4 )。相比之下，T細胞(CD4及CD8兩者)顯示在此共培養中在CD25或CD69方面無活化(資料未顯示)。
吾人亦研究在與奧濱尤妥珠單抗協同NK細胞之ADCC功能中，靶向CD19-4-1BBL是否優於4-1BB促效抗體烏瑞魯單抗。在與吾人上文所做類似之實驗中，吾人觀測到，僅CD19-4-1BBL與奧濱尤妥珠單抗之組合增強NK細胞活化(CD25上調)，而烏瑞魯單抗與奧濱尤妥珠單抗之組合則不增強(圖 5 )。
實例4
活體內混合 CD19-4-1BBL 及利妥昔單抗之組合療法 在腫瘤攜帶huCD16tgScid小鼠中，進行混合CD19-4-1BBL (一價CD19-mu4-1BBL)及利妥昔單抗之組合的第一概念驗證。
最初自ECACC (European Collection of Cell Culture)獲得WSU-DLCL2細胞(人類彌漫性大B細胞淋巴瘤)且在擴增後寄存於Roche Glycart AG之內部細胞庫中。於含有10% FCS及1x Glutamax之RPMI中培養細胞。在37℃下在5% CO2 下於水飽和氛圍中培養細胞。在＞ 95.0%之存活力下，將於RPMI細胞培養基(Gibco)及GFR基質膠(1:1，總體積100 µl)中之1.5 × 106 個細胞/動物，皮下注射至動物之右側腹中。
根據提交指南(GV-Solas; Felasa; TierschG)，以每天12 h光照/12 h黑暗之循環，將在實驗開始時8-10週齡之人類FcγRIIIa (CD16)轉殖基因SCID小鼠(其表現鼠類FcγRIV陽性巨噬細胞及人類FcγRIIIa陽性轉殖基因鼠類NK細胞兩者作為效應子) (在Charles River, France處培育)，維持在不含特定病原體的條件下。實驗研究方案由當地政府審查且批准。動物在到達之後維持一週以使其適應新環境且進行觀察。在常規基礎上進行連續健康監測。
根據方案(圖6)，當腫瘤大小達到大約200 mm3 (第13天)時，如上文所描述對雌性huCD16TgScid小鼠皮下注射腫瘤細胞，且每週使用化合物或PBS (媒劑)處理一次。對所有小鼠每週一次靜脈內注射200 µl適當溶液。為了得到每200 µl適當量之化合物，必需時，用PBS稀釋儲備溶液(表5)。對於用利妥昔單抗及混合CD19-4-1BBL構築體之組合療法(組D，圖6)，以一天之間隙注射療法。使用測徑規每週量測腫瘤生長兩次，且如下計算腫瘤體積： Tv : (W2 /2) × L (W：寬度，L：長度)
在八次注射化合物之後(腫瘤細胞注射後第64天)終止研究且處死所有小鼠，且分離腫瘤並稱重。圖7A及圖7B顯示所有處理組之腫瘤生長動力學(平均值+/- SEM)以及研究終止時之腫瘤重量。混合CD19-4-1BBL之單藥療法不展現任何腫瘤生長抑制。利妥昔單抗之單藥療法相較於媒劑誘導較慢腫瘤生長。然而，相較於所有其他處理組，利妥昔單抗及混合CD19-4-1BBL之組合在研究終止時誘導統計學上顯著的腫瘤生長抑制，且顯示顯著更低腫瘤重量。表 7 ：用於活體內實驗中之組合物
實例5
活體內一價 CD19(2B11)-4-1BBL 及奧濱尤妥珠單抗 ( 加澤瓦 ) 之組合療法 在完全人類化NSG小鼠中，進行單CD19(2B11)-4-1BBL及加澤瓦之組合的概念驗證。
最初自ECACC (European Collection of Cell Culture)獲得WSU-DLCL2細胞(人類彌漫性大B細胞淋巴瘤)且在擴增後寄存於Roche Glycart內部細胞庫中。於含有10% FCS及1x Glutamax之RPMI中培養細胞。在37℃下在5% CO2 下於水飽和氛圍中培養細胞。在＞ 95.0%之存活力下，將於RPMI細胞培養基(Gibco)及GFR基質膠(1:1，總體積100 μl)中之1.5 × 106 個細胞(活體外第18代)/動物，皮下注射至動物右側腹中。
根據提交之指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)，以每日12 h光/12 h黑暗之循環，將在實驗開始時4-5週齡之雌性NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull (NSG)小鼠(在Taconic, Denmark處培育)，維持在不含特定病原體之條件下。實驗研究方案由當地政府審查且批准(ZH193/2014)。動物在到達之後維持一週以使其適應新環境且進行觀察。在常規基礎上進行連續健康監測。
根據方案(圖 8 )，對雌性NSG小鼠腹膜內注射15 mg/kg白消安(Busulfan)，隨後一天之後靜脈內注射1×105 個自臍帶血分離之人類造血幹細胞。在幹細胞注射後第14-16週，對小鼠進行舌下抽血，且針對成功人類化，藉由流式細胞測量術分析血液。根據有效移植之小鼠之人類T細胞頻率，將該等小鼠隨機分組成不同處理組(圖8，n=10隻/組)。彼時，如上文所描述對小鼠皮下注射腫瘤細胞，且當腫瘤大小達到大約450 mm3 時(第11天)，使用化合物或PBS (媒劑)每週處理一次。對所有小鼠均靜脈內注射200 µl適當溶液。為了得到每200 µl適當量之化合物，必需時，用PBS稀釋儲備溶液(表6)。對於與加澤瓦之組合療法(組D，圖8)，同時注射CD19-4-1BBL構築體。使用測徑規每週量測腫瘤生長兩次，且如下計算腫瘤體積： Tv ：(W2 /2) × L (W：寬度，L：長度)
圖 9 顯示所有處理組中之腫瘤生長動力學(平均值+/- SEM)。不能偵測到CD19-4-1BBL之單藥療法效果。作為單一藥劑，奧濱尤妥珠單抗誘導極少腫瘤生長抑制，然而，與CD19-4-1BBL之組合在所有動物中均誘導完全腫瘤消退(圖9)。表 8 ：用於此實驗中之組合物
圖 1 顯示如實例中所使用的特定CD19-4-1BBL抗原結合分子。此等分子分別更詳細地描述於實例1及實例2中。粗黑點表示杵-臼修飾。圖1A顯示在鄰近於4-1BBL二聚體及4-1BBL單體之CH1及Cl域中具有胺基酸修飾之含有一價CD19 4-1BBL-三聚體的抗原結合分子。由於其包含CD19結合子8B8-018，故其在本文中稱為單單CD19(018)-4-1BBL。圖1B中所顯示之構築體與圖1A之不同之處在於其包含CD19結合子8B8-2B11且因此被稱為單CD19(2B11)-4-1BBL。圖1D顯示具有結合子CD19(018)之二價構築體，被稱為二CD19(018)-4-1BBL。圖1C及圖1E顯示非靶向對照分子(CD19結合子已經非結合DP47 Fab置換)。圖1F顯示含有一價CD19 4-1BBL-三聚體之抗原結合分子，其包含鼠類4-1BBL二聚體及鼠類4-1BBL單體，在本文中被稱為混合CD19-4-1BBL或CD19-mu4-1BBL。圖 2A 說明量測CD19靶向三聚裂解型4-1BBL與鼠類4-1BB及人類CD19之同步結合之分析的設定(實例2)。圖 2B 中之曲線顯示混合替代物CD19-mu4-1BBL (分析物1)與經固定之鼠類4-1BB及人類CD19 (分析物2)之同步結合。 在圖 3A 至圖 3C 中，顯示，CD19-4-1BBL可增強NK細胞之活化(IFNγ釋放)，該NK細胞之活化由利妥昔單抗或奧濱尤妥珠單抗(加澤瓦(Gazyva))在該抗體與NHL細胞株，亦即與WSU-DLCL2 (CD19+ CD20high ) (圖 3A )、SU-DHL-8 (CD19+ CD20low ) (圖 3B )或Naml-6 (CD19+ CD20low ) (圖 3C )接合時活化。圖 4A 至 4C 顯示，藉由將CD19-4-1BBL與利妥昔單抗或奧濱尤妥珠單抗(加澤瓦)組合，當與NHL細胞株，亦即與WSU-DLCL2 (CD19+ CD20high ) (圖 4A )、SU-DHL-8 (CD19+ CD20low ) (圖 4B )或Naml-6 (CD19+ CD20low ) (圖 4C )接合時，NK細胞之活化增強(CD25上調)。 在圖 5A 至圖 5C 中，顯示，CD19-4-1BBL及奧濱尤妥珠單抗(加澤瓦)之組合，當與NHL細胞株WSU-DLCL2 (圖 5A )、SU-DHL-8 (圖 5B )或Naml-6 (圖 5C )接合時，增強NK細胞之活化(CD25上調)，而烏瑞魯單抗與奧濱尤妥珠單抗之組合則不。圖 6 顯示與利妥昔單抗組合之一價混合CD19-4-1BBL分子(單CD19-mu4-1BBL)在huCD16Tg Scid小鼠中之活體內功效研究的方案。在下方之表中，定義接受不同組合及劑量之小鼠之子組。實驗描述於實例4中，且結果顯示於圖 7A 及圖 7B 中。相較於用利妥昔單抗單藥療法或用單CD19-mu4-1BBL之單藥療法，在所測試之所有劑量中，單CD19-mu4-1BBL與利妥昔單抗組合之組合確實誘導更強及更快的腫瘤生長抑制。如圖 7B 所展示，研究終止時之腫瘤重量證實此等發現。圖 8 顯示與奧濱尤妥珠單抗(加澤瓦)組合之一價CD19(2B11)-4-1BBL構築體在攜帶WSU-DLCL2之全人類化NSG小鼠中之活體內功效研究的方案。在下方之表中，定義接受不同組合及劑量之小鼠之子組。實驗描述於實例5中且結果顯示於圖 9 中。相較於用加澤瓦之單藥療法，單CD19(2B11)-4-1BBL與加澤瓦之組合誘導強許多的腫瘤生長抑制。
<110> 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司(F.HOFFMANN-LA ROCHE AG)
<120> 4-1BB促效劑與抗-CD20抗體之組合療法
<130> P34718-WO
<140> TW 108108151
<141> 2019-03-12
<150> EP18161435.5
<151> 2018-03-13
<160> 124
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 184
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Figure 108108151-A0305-02-0179-1
Figure 108108151-A0305-02-0180-2
<210> 2
<211> 170
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Figure 108108151-A0305-02-0180-3
<210> 3
<211> 175
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Figure 108108151-A0305-02-0180-4
Figure 108108151-A0305-02-0181-5
<210> 4
<211> 203
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Figure 108108151-A0305-02-0181-6
Figure 108108151-A0305-02-0182-7
<210> 5
<211> 178
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Figure 108108151-A0305-02-0182-8
Figure 108108151-A0305-02-0183-9
<210> 6
<211> 164
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Figure 108108151-A0305-02-0183-10
<210> 7
<211> 169
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Figure 108108151-A0305-02-0184-11
<210> 8
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Figure 108108151-A0305-02-0184-12
Figure 108108151-A0305-02-0185-13
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-018)CDR-H1
<400> 9
Figure 108108151-A0305-02-0185-14
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-018)CDR-H2
<400> 10
Figure 108108151-A0305-02-0186-15
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-018)CDR-H3
<400> 11
Figure 108108151-A0305-02-0186-16
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-018)CDR-L1
<400> 12
Figure 108108151-A0305-02-0186-17
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-018)CDR-L2
<400> 13
Figure 108108151-A0305-02-0186-18
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-018)CDR-L3
<400> 14
Figure 108108151-A0305-02-0186-19
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-2B11)CDR-H1
<400> 15
Figure 108108151-A0305-02-0187-20
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-2B11)CDR-H2
<400> 16
Figure 108108151-A0305-02-0187-21
<210> 17
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-2B11)CDR-H3
<400> 17
Figure 108108151-A0305-02-0187-22
<210> 18
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-2B11)CDR-L1
<400> 18
Figure 108108151-A0305-02-0187-23
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RVSKRFS
<400> 19
Figure 108108151-A0305-02-0188-24
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-2B11)CDR-L3
<400> 20
Figure 108108151-A0305-02-0188-25
<210> 21
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-018)VH
<400> 21
Figure 108108151-A0305-02-0188-26
<210> 22
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-018)VL
<400> 22
Figure 108108151-A0305-02-0189-27
<210> 23
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-2B11)VH
<400> 23
Figure 108108151-A0305-02-0189-28
Figure 108108151-A0305-02-0190-29
<210> 24
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-2B11)VL
<400> 24
Figure 108108151-A0305-02-0190-30
<210> 25
<211> 378
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由(G4S)2連接子連接之二聚hu 4-1BBL(71-254)
<400> 25
Figure 108108151-A0305-02-0190-31
Figure 108108151-A0305-02-0191-32
Figure 108108151-A0305-02-0192-33
<210> 26
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由(G4S)2連接子連接之二聚hu 4-1BBL(85-254)
<400> 26
Figure 108108151-A0305-02-0192-34
Figure 108108151-A0305-02-0193-35
<210> 27
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由(G4S)2連接子連接之二聚hu 4-1BBL(80-254)
<400> 27
Figure 108108151-A0305-02-0193-36
Figure 108108151-A0305-02-0194-37
Figure 108108151-A0305-02-0195-38
<210> 28
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由(G4S)2連接子連接之二聚hu 4-1BBL(52-254)
<400> 28
Figure 108108151-A0305-02-0195-39
Figure 108108151-A0305-02-0196-40
<210> 29
<211> 366
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由(G4S)2連接子連接之二聚hu 4-1BBL(71-248)
<400> 29
Figure 108108151-A0305-02-0197-41
Figure 108108151-A0305-02-0198-42
<210> 30
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由(G4S)2連接子連接之二聚hu 4-1BBL(85-248)
<400> 30
Figure 108108151-A0305-02-0198-43
Figure 108108151-A0305-02-0199-44
<210> 31
<211> 348
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由(G4S)2連接子連接之二聚hu 4-1BBL(80-248)
<400> 31
Figure 108108151-A0305-02-0200-45
Figure 108108151-A0305-02-0201-46
<210> 32
<211> 404
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由(G4S)2連接子連接之二聚hu 4-1BBL(52-248)
<400> 32
Figure 108108151-A0305-02-0201-47
Figure 108108151-A0305-02-0202-48
Figure 108108151-A0305-02-0203-49
<210> 33
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD19(8B8-018)Fc臼鏈
<400> 33
Figure 108108151-A0305-02-0203-50
Figure 108108151-A0305-02-0204-51
<210> 34
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD19(8B8-018)輕鏈
<400> 34
Figure 108108151-A0305-02-0205-52
<210> 35
<211> 722
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚hu 4-1BBL(71-254)-CL* Fc杵鏈
<400> 35
Figure 108108151-A0305-02-0206-53
Figure 108108151-A0305-02-0207-54
Figure 108108151-A0305-02-0208-55
<210> 36
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 單體hu 4-1BBL(71-254)-CH1*
<400> 36
Figure 108108151-A0305-02-0209-56
Figure 108108151-A0305-02-0210-57
<210> 37
<211> 722
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚hu 4-1BBL(71-254)-CL Fc杵鏈
<400> 37
Figure 108108151-A0305-02-0210-58
Figure 108108151-A0305-02-0211-59
Figure 108108151-A0305-02-0212-60
<210> 38
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 單體hu 4-1BBL(71-254)-CH1
<400> 38
Figure 108108151-A0305-02-0213-61
Figure 108108151-A0305-02-0214-62
<210> 39
<211> 838
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD19(8B8-018)Fc臼二聚配體鏈
<400> 39
Figure 108108151-A0305-02-0214-63
Figure 108108151-A0305-02-0215-64
Figure 108108151-A0305-02-0216-65
Figure 108108151-A0305-02-0217-66
<210> 40
<211> 644
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD19(8B8-018)Fc杵單體配體
<400> 40
Figure 108108151-A0305-02-0217-67
Figure 108108151-A0305-02-0218-68
Figure 108108151-A0305-02-0219-69
Figure 108108151-A0305-02-0220-70
<210> 41
<211> 710
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚hu 4-1BBL(71-248)-CL* Fc杵鏈
<400> 41
Figure 108108151-A0305-02-0220-71
Figure 108108151-A0305-02-0221-72
Figure 108108151-A0305-02-0222-73
Figure 108108151-A0305-02-0223-74
<210> 42
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 單體hu 4-1BBL(71-248)-CH1*
<400> 42
Figure 108108151-A0305-02-0223-75
Figure 108108151-A0305-02-0224-76
<210> 43
<211> 710
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚hu 4-1BBL(71-248)-CL Fc杵鏈
<400> 43
Figure 108108151-A0305-02-0224-77
Figure 108108151-A0305-02-0225-78
Figure 108108151-A0305-02-0226-79
Figure 108108151-A0305-02-0227-80
<210> 44
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 單體hu 4-1BBL(71-248)-CH1
<400> 44
Figure 108108151-A0305-02-0227-81
Figure 108108151-A0305-02-0228-82
<210> 45
<211> 826
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD19(8B8-018)Fc臼二聚配體(71-248)鏈
<400> 45
Figure 108108151-A0305-02-0228-83
Figure 108108151-A0305-02-0229-84
Figure 108108151-A0305-02-0230-85
Figure 108108151-A0305-02-0231-86
<210> 46
<211> 638
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD19(8B8-018)Fc杵單體(71-248)配體
<400> 46
Figure 108108151-A0305-02-0231-87
Figure 108108151-A0305-02-0232-88
Figure 108108151-A0305-02-0233-89
Figure 108108151-A0305-02-0234-90
<210> 47
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD19(8B8-2B11)Fc臼鏈
<400> 47
Figure 108108151-A0305-02-0234-91
Figure 108108151-A0305-02-0235-92
Figure 108108151-A0305-02-0236-93
<210> 48
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-2B11)輕鏈
<400> 48
Figure 108108151-A0305-02-0236-94
Figure 108108151-A0305-02-0237-95
<210> 49
<211> 838
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD19(8B8-2B11)Fc臼二聚配體(71-254)鏈
<400> 49
Figure 108108151-A0305-02-0237-96
Figure 108108151-A0305-02-0238-97
Figure 108108151-A0305-02-0239-98
Figure 108108151-A0305-02-0240-99
<210> 50
<211> 644
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD19(8B8-2B11)Fc杵單體(71-254)配體
<400> 50
Figure 108108151-A0305-02-0240-100
Figure 108108151-A0305-02-0241-101
Figure 108108151-A0305-02-0242-102
<210> 51
<211> 826
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD19(8B8-2B11)Fc臼二聚配體(71-248)鏈
<400> 51
Figure 108108151-A0305-02-0243-103
Figure 108108151-A0305-02-0244-104
Figure 108108151-A0305-02-0245-105
Figure 108108151-A0305-02-0246-106
<210> 52
<211> 638
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-CD19(8B8-2B11)Fc杵單體(71-248)配體
<400> 52
Figure 108108151-A0305-02-0246-107
Figure 108108151-A0305-02-0247-108
Figure 108108151-A0305-02-0248-109
<210> 53
<211> 809
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 三聚hu 4-1BBL(71-254)Fc杵鏈
<400> 53
Figure 108108151-A0305-02-0248-110
Figure 108108151-A0305-02-0249-111
Figure 108108151-A0305-02-0250-112
Figure 108108151-A0305-02-0251-113
<210> 54
<211> 1032
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與三聚hu 4-1BBL融合之抗-CD19(8B8-018)Fc杵鏈
<400> 54
Figure 108108151-A0305-02-0252-114
Figure 108108151-A0305-02-0253-115
Figure 108108151-A0305-02-0254-116
Figure 108108151-A0305-02-0255-117
Figure 108108151-A0305-02-0256-118
<210> 55
<211> 1032
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與三聚hu 4-1BBL(71-254)融合之抗-CD19(8B8-2B11)Fc杵鏈
<400> 55
Figure 108108151-A0305-02-0256-119
Figure 108108151-A0305-02-0257-120
Figure 108108151-A0305-02-0258-121
Figure 108108151-A0305-02-0259-122
Figure 108108151-A0305-02-0260-123
<210> 56
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47 Fc臼鏈
<400> 56
Figure 108108151-A0305-02-0260-124
Figure 108108151-A0305-02-0261-125
<210> 57
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47輕鏈
<400> 57
Figure 108108151-A0305-02-0262-126
<210> 58
<211> 834
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與二聚hu 4-1BBL(71-254)融合之DP47 Fc臼鏈
<400> 58
Figure 108108151-A0305-02-0263-127
Figure 108108151-A0305-02-0264-128
Figure 108108151-A0305-02-0265-129
Figure 108108151-A0305-02-0266-130
<210> 59
<211> 640
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與單體hu 4-1BBL(71-254)融合之DP47 Fc杵鏈
<400> 59
Figure 108108151-A0305-02-0266-131
Figure 108108151-A0305-02-0267-132
Figure 108108151-A0305-02-0268-133
<210> 60
<211> 766
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二-mu4-1BBL-CL Fc杵鏈
<400> 60
Figure 108108151-A0305-02-0268-134
Figure 108108151-A0305-02-0269-135
Figure 108108151-A0305-02-0270-136
Figure 108108151-A0305-02-0271-137
<210> 61
<211> 319
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 單-mu4-1BBL-CH1鏈
<400> 61
Figure 108108151-A0305-02-0271-138
Figure 108108151-A0305-02-0272-139
Figure 108108151-A0305-02-0273-140
<210> 62
<211> 556
<212> PRT
<213> 智人
<400> 62
Figure 108108151-A0305-02-0273-141
Figure 108108151-A0305-02-0274-142
Figure 108108151-A0305-02-0275-143
<210> 63
<211> 297
<212> PRT
<213> 智人
<400> 63
Figure 108108151-A0305-02-0275-144
Figure 108108151-A0305-02-0276-145
<210> 64
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠類抗-CD20 B-Ly1 VH
<400> 64
Figure 108108151-A0305-02-0276-146
Figure 108108151-A0305-02-0277-147
<210> 65
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠類抗-CD20 B-Ly1 VL
<400> 65
Figure 108108151-A0305-02-0277-148
<210> 66
<211> 254
<212> PRT
<213> 智人
<400> 66
Figure 108108151-A0305-02-0277-149
Figure 108108151-A0305-02-0278-150
<210> 67
<211> 205
<212> PRT
<213> 智人
<400> 67
Figure 108108151-A0305-02-0278-151
Figure 108108151-A0305-02-0279-152
<210> 68
<211> 163
<212> PRT
<213> 智人
<400> 68
Figure 108108151-A0305-02-0279-153
Figure 108108151-A0305-02-0280-154
<210> 69
<211> 256
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 69
Figure 108108151-A0305-02-0280-155
Figure 108108151-A0305-02-0281-156
<210> 70
<211> 254
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
<400> 70
Figure 108108151-A0305-02-0281-157
Figure 108108151-A0305-02-0282-158
<210> 71
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB(20H4.9)VH
<400> 71
Figure 108108151-A0305-02-0282-159
Figure 108108151-A0305-02-0283-160
<210> 72
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB(20H4.9)VL
<400> 72
Figure 108108151-A0305-02-0283-161
<210> 73
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD20-HCDR1
<400> 73
Figure 108108151-A0305-02-0283-162
<210> 74
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD20-HCDR2
<400> 74
Figure 108108151-A0305-02-0284-163
<210> 75
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD20-HCDR3
<400> 75
Figure 108108151-A0305-02-0284-164
<210> 76
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD20-LCDR1
<400> 76
Figure 108108151-A0305-02-0284-165
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD20-LCDR2
<400> 77
Figure 108108151-A0305-02-0284-166
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD20-LCDR3
<400> 78
Figure 108108151-A0305-02-0284-167
<210> 79
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD20 VH
<400> 79
Figure 108108151-A0305-02-0285-168
<210> 80
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD20 VL
<4()0> 80
Figure 108108151-A0305-02-0285-169
Figure 108108151-A0305-02-0286-247
<210> 81
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G4S肽連接子
<400> 81
Figure 108108151-A0305-02-0286-171
<210> 82
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (G4S)2
<400> 82
Figure 108108151-A0305-02-0286-248
<210> 83
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SG4)2
<400> 83
Figure 108108151-A0305-02-0286-249
<210> 84
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接子
<400> 84
Figure 108108151-A0305-02-0287-174
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接子
<400> 85
Figure 108108151-A0305-02-0287-175
<210> 86
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接子2
<400> 86
Figure 108108151-A0305-02-0287-176
<210> 87
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接子3
<400> 87
Figure 108108151-A0305-02-0287-177
<210> 88
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接子4
<400> 88
Figure 108108151-A0305-02-0287-178
<210> 89
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接子5
<400> 89
Figure 108108151-A0305-02-0288-179
<210> 90
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接子6
<400> 90
Figure 108108151-A0305-02-0288-180
<210> 91
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接子7
<400> 91
Figure 108108151-A0305-02-0288-181
<210> 92
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接子8
<400> 92
Figure 108108151-A0305-02-0288-182
<210> 93
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接子9
<400> 93
Figure 108108151-A0305-02-0288-183
<210> 94
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接子10
<400> 94
Figure 108108151-A0305-02-0289-184
<210> 95
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接子11
<400> 95
Figure 108108151-A0305-02-0289-185
<210> 96
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)CDR-H1
<400> 96
Figure 108108151-A0305-02-0289-186
<210> 97
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)CDR-H2
<400> 97
Figure 108108151-A0305-02-0289-187
<210> 98
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)CDR-H3
<400> 98
Figure 108108151-A0305-02-0289-188
Figure 108108151-A0305-02-0290-189
<210> 99
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)CDR-L1
<400> 99
Figure 108108151-A0305-02-0290-190
<210> 100
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)CDR-L2
<400> 100
Figure 108108151-A0305-02-0290-191
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)CDR-L3
<400> 101
Figure 108108151-A0305-02-0290-192
<210> 102
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)CDR-H1
<400> 102
Figure 108108151-A0305-02-0290-193
<210> 103
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)CDR-H2
<400> 103
Figure 108108151-A0305-02-0291-194
<210> 104
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)CDR-H3
<400> 104
Figure 108108151-A0305-02-0291-195
<210> 105
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)CDR-L1
<400> 105
Figure 108108151-A0305-02-0291-196
<210> 106
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)CDR-L2
<400> 106
Figure 108108151-A0305-02-0291-197
<210> 107
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)CDR-L3
<400> 107
Figure 108108151-A0305-02-0291-198
<210> 108
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)VH
<400> 108
Figure 108108151-A0305-02-0292-199
<210> 109
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)VL
<400> 109
Figure 108108151-A0305-02-0292-200
Figure 108108151-A0305-02-0293-201
<210> 110
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)VH
<400> 110
Figure 108108151-A0305-02-0293-202
<210> 111
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9)VL
<400> 111
Figure 108108151-A0305-02-0293-203
Figure 108108151-A0305-02-0294-204
<210> 112
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-FAP(4B9)Fc臼鏈(構築體2.4)
<400> 112
Figure 108108151-A0305-02-0294-205
Figure 108108151-A0305-02-0295-206
Figure 108108151-A0305-02-0296-207
<210> 113
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-FAP(4B9)輕鏈(構築體2.4)
<400> 113
Figure 108108151-A0305-02-0296-208
Figure 108108151-A0305-02-0297-209
<210> 114
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-FAP(28H1)Fc臼鏈
<400> 114
Figure 108108151-A0305-02-0297-210
Figure 108108151-A0305-02-0298-211
<210> 115
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-FAP(28H1)輕鏈
<400> 115
Figure 108108151-A0305-02-0299-212
<210> 116
<211> 834
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與二聚hu 4-1BBL(71-254)融合之抗-FAP(4B9)Fc臼鏈
<400> 116
Figure 108108151-A0305-02-0300-213
Figure 108108151-A0305-02-0301-214
Figure 108108151-A0305-02-0302-215
Figure 108108151-A0305-02-0303-216
<210> 117
<211> 640
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與單體hu 4-1BBL(71-254)融合之抗-FAP(4B9)Fc杵鏈
<400> 117
Figure 108108151-A0305-02-0303-217
Figure 108108151-A0305-02-0304-218
Figure 108108151-A0305-02-0305-219
<210> 118
<211> 833
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與二聚hu 4-1BBL(71-254)融合之抗-FAP(28H1)Fc臼鏈
<400> 118
Figure 108108151-A0305-02-0306-220
Figure 108108151-A0305-02-0307-221
Figure 108108151-A0305-02-0308-222
Figure 108108151-A0305-02-0309-223
<210> 119
<211> 639
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 與單體hu 4-1BBL(71-254)融合之抗-FAP(28H1)Fc杵鏈
<400> 119
Figure 108108151-A0305-02-0309-224
Figure 108108151-A0305-02-0310-225
Figure 108108151-A0305-02-0311-226
<210> 120
<211> 760
<212> PRT
<213> 智人
<400> 120
Figure 108108151-A0305-02-0311-227
Figure 108108151-A0305-02-0312-228
Figure 108108151-A0305-02-0313-229
Figure 108108151-A0305-02-0314-230
<210> 121
<211> 748
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu FAP胞外域+聚lys標記+his6標記
<400> 121
Figure 108108151-A0305-02-0314-231
Figure 108108151-A0305-02-0315-232
Figure 108108151-A0305-02-0316-233
Figure 108108151-A0305-02-0317-234
<210> 122
<211> 761
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 122
Figure 108108151-A0305-02-0317-235
Figure 108108151-A0305-02-0318-236
Figure 108108151-A0305-02-0319-237
Figure 108108151-A0305-02-0320-238
<210> 123
<211> 749
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠類FAP胞外域+聚lys標記+his6標記
<400> 123
Figure 108108151-A0305-02-0320-239
Figure 108108151-A0305-02-0321-240
Figure 108108151-A0305-02-0322-241
Figure 108108151-A0305-02-0323-242
<210> 124
<211> 748
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹獼猴FAP胞外域+聚lys標記+his6標記
<400> 124
Figure 108108151-A0305-02-0323-243
Figure 108108151-A0305-02-0324-244
Figure 108108151-A0305-02-0325-245
Figure 108108151-A0305-02-0326-246

Claims (9)

  1. 一種4-1BB(CD137)促效劑或抗-CD20抗體用於製備治療B細胞增殖性病症之藥物的用途，其中該4-1BB促效劑係與抗-CD20抗體併用，或該抗-CD20抗體係與4-1BB(CD137)促效劑併用，且其中：該4-1BB促效劑為包含以下之抗原結合分子：(a)能夠與CD19特異性結合之至少一個Fab域，該至少一個Fab域包含：包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的重鏈可變區(VHCD19)以及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的輕鏈可變區(VLCD19)，或包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的重鏈可變區(VHCD19)以及包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的輕鏈可變區(VLCD19)，以及(b)第一多肽及第二多肽，其藉由二硫鍵彼此連接，其中該抗原結合分子之特徵在於該第一多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32，且該第二多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8，該抗-CD20抗體為利妥昔單抗(rituximab)或奧濱尤妥珠單抗(obinutuzumab)，以及該B細胞增殖性病症選自由以下組成之群：非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma，NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套 細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、多發性骨髓瘤(MM)及霍奇金淋巴瘤(HL)。
  2. 如請求項1之用途，其中該4-1BB促效劑及該抗-CD20抗體係同時投與。
  3. 如請求項1之用途，其中該4-1BB促效劑及該抗-CD20抗體以單一組合物形式一起投與，或以兩種或更多種不同組合物形式分開投與。
  4. 如請求項1之用途，其中該4-1BB促效劑為選自由以下組成之群的抗原結合分子：a)分子，其包含含有SEQ ID NO：33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO：34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO：35之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO：36之胺基酸序列的第二輕鏈；b)分子，其包含含有SEQ ID NO：33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO：34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO：37之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO：38之胺基酸序列的第二輕鏈；c)分子，其包含含有SEQ ID NO：34之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO：39之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO：40之胺基酸序列的第二重鏈；d)分子，其包含含有SEQ ID NO：33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO：34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO：41之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO：42之胺基酸序列的第二輕鏈； e)分子，其包含含有SEQ ID NO：33之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO：34之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO：43之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO：44之胺基酸序列的第二輕鏈；f)分子，其包含含有SEQ ID NO：34之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO：45之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO：46之胺基酸序列的第二重鏈；g)分子，其包含含有SEQ ID NO：47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO：48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO：35之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO：36之胺基酸序列的第二輕鏈；h)分子，其包含含有SEQ ID NO：47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO：48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO：37之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO：38之胺基酸序列的第二輕鏈；i)分子，其包含含有SEQ ID NO：48之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO：49之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO：50之胺基酸序列的第二重鏈；j)分子，其包含含有SEQ ID NO：47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO：48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO：41之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO：42之胺基酸序列的第二輕鏈；k)分子，其包含含有SEQ ID NO：47之胺基酸序列的第一重鏈、含有SEQ ID NO：48之胺基酸序列的第一輕鏈、含有SEQ ID NO：43之胺基酸序列的第二重鏈及含有SEQ ID NO：44之胺基酸序列的第二輕鏈；及l)分子，其包含含有SEQ ID NO：48之胺基酸序列的兩條輕鏈、含有SEQ ID NO：51之胺基酸序列的第一重鏈及含有SEQ ID NO：52之胺基酸 序列的第二重鏈。
  5. 如請求項1之用途，其中該抗-CD20抗體為利妥昔單抗(rituximab)。
  6. 如請求項1之用途，其中該抗-CD20抗體為奧濱尤妥珠單抗(obinutuzumab)。
  7. 如請求項1之用途，其中該4-1BB促效劑與該抗-CD20抗體係以約一週至三週之間隔投與。
  8. 如請求項1之用途，其中在該4-1BB促效劑與該抗-CD20抗體之組合治療之前用奧濱尤妥珠單抗進行預治療，其中該預治療與該組合治療之間的時間段足以降低個體中回應於奧濱尤妥珠單抗之B細胞。
  9. 如請求項1之用途，其中該4-1BB促效劑為包含以下之抗原結合分子：包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的第二重鏈以及包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的第二輕鏈。
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