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TWI790272B - 粒子分離系統及方法 - Google Patents

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TWI790272B
TWI790272B TW107128510A TW107128510A TWI790272B TW I790272 B TWI790272 B TW I790272B TW 107128510 A TW107128510 A TW 107128510A TW 107128510 A TW107128510 A TW 107128510A TW I790272 B TWI790272 B TW I790272B
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德雲 邱
趙孟夏
艾藍諾 Ｓ 強生
佩利 Ｇ 斯奇羅
游輝民
方偉峰
陳瑞麟
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美國華盛頓大學
開曼群島商上準微流體股份有限公司
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Abstract

本文提供用於分析試樣中之粒子之方法及裝置以及其他態樣。在一些態樣中，該等粒子可為分析物、細胞、核酸或蛋白質且可使其與標籤接觸，分配成等分試樣，藉由分級器件檢測，並分離。本文所提供之該等方法及裝置可包含微流體晶片。在一些態樣中，該等方法及裝置可用於量化試樣中之罕見粒子，例如癌細胞及其他用於疾病診斷、預後或治療之罕見細胞。

Description

粒子分離系統及方法
循環腫瘤細胞(CTC)自原發性腫瘤散佈至血流中且係癌症轉移之重要態樣。已在許多不同類型之癌症(例如乳癌、肺癌、前列腺癌及胰臟癌)中檢測到CTC。CTC數量與轉移性患者中之臨床結果直接相關，從而提供可幫助管控臨床護理之有價值預後資訊。
本文闡述用於分離及分析來自流體試樣(例如血液)之粒子(例如細胞)之方法、裝置、系統及器件。
在各個態樣中，收集流體試樣中之粒子之方法包括以下操作：i)檢測該試樣之第一等分試樣中粒子之第一存在；ii)在檢測到在第一等分試樣中存在粒子後，將第一等分試樣流引導至第一體積中以形成第一分離試樣；iii)分散第一分離試樣以形成分散試樣；及iv)對分散試樣實施分離程序。
在各個態樣中，分離程序係主動分離程序。在一些情形下，分離程序係被動分離程序。
在一些態樣中，檢測粒子之第一存在包括：i)使用第一電磁輻射源訊問第一等分試樣中之粒子；及ii)檢測第一電磁輻射與第一等分試樣中之粒子之第一相互作用。在一些情形下，第一電磁輻射包括光，且在一些情形下，光波長在選自由以下組成之群之範圍內：100 nm至400 nm、400 nm至700 nm、700 nm至1,000 nm、1 µm至10 µm、10 µm至100 µm及100 µm至1,000 µm。
在一些情形下，第一相互作用係選自由以下組成之群：光學反射、光學透射、彈性光學散射、非彈性光學散射、瑞利散射(Rayleigh scattering)、拉曼散射(Raman scattering)、表面增強式拉曼散射、米氏散射(Mie scattering)、布里淵散射(Brillouin scattering)、螢光、自發螢光、雷射誘導螢光、發光、生物發光及化學發光。
在一些情形下，在流體試樣連續流動期間檢測第一等分試樣中粒子之第一存在。
在各個態樣中，粒子係罕見粒子。在一些情形下，罕見粒子係細胞，且在一些情形下，細胞係罕見細胞。在一些情形下，罕見細胞係癌細胞，且在一些情形下，癌細胞係循環腫瘤細胞。在一些情形下，罕見細胞係免疫細胞。在一些情形下，罕見細胞係白血球。
在一些情形下，分散第一分離試樣包括流動伸展第一分離試樣，且在一些情形下，藉由第一分離試樣穿過流動路徑之抛物線型流動來賦予流動伸展。在一些情形下，藉由魚骨狀混合第一分離試樣來賦予流動伸展。在一些情形下，藉由第一分離試樣穿過複數個流動路徑之流動來賦予流動伸展。
在一些態樣中，分散第一分離試樣包括第一分離試樣之細胞伸展。在一些情形下，藉由障壁賦予細胞伸展，且在一些情形下，障壁基於細胞之物理屬性來改變細胞速度。在一些情形下，細胞之物理屬性係選自由以下組成之群：細胞體積、細胞形狀及細胞可變形性。在一些情形下，障壁包括過濾器結構、通道收縮段或堰結構。
在一些態樣中，分散第一分離試樣包括流動伸展及流動分選。
在一些情形下，分離程序包括：i)使用第二電磁輻射源訊問粒子；及ii)檢測第二電磁輻射之第二相互作用。在一些情形下，第二電磁輻射包括光，且在一些情形下，光波長在選自由以下組成之群之範圍內：100 nm至400 nm、400 nm至700 nm、700 nm至1,000 nm、1 µm至10 µm、10 µm至100 µm及100 µm至1,000 µm。
在各個態樣中，第二相互作用係選自由以下組成之群：光學反射、光學透射、彈性光學散射、非彈性光學散射、瑞利散射、拉曼散射、表面增強式拉曼散射、米氏散射、布里淵散射、螢光、自發螢光、雷射誘導螢光、發光、生物發光及化學發光。
在一些態樣中，在流體試樣之連續流動期間檢測粒子之第二存在。
在一些情形下，該方法進一步包括在一定結構中收集粒子，且在各個情形下，該結構係選自由以下組成之群：小瓶、孔板及過濾體積。
在一些態樣中，本文所闡述之方法進一步包括使用過濾元件捕獲粒子。在一些情形下，該方法進一步包括自過濾元件釋放粒子，且在一些情形下，釋放包括將粒子釋放至選自由小瓶、孔板及其他過濾體積組成之群之體積。
在一些態樣中，該方法包括使過濾元件與一或多個珠粒接觸，且在一些態樣中，釋放包括使過濾元件與一或多個珠粒接觸。
在各個態樣中，本文所闡述之方法包括操作閥門以使用被動流體結構濃縮所收集粒子或純化粒子。在一些情形下，該方法包括使用一或多個障壁、一或多個堰伸展體、一或多個微狹縫或一或多個微過濾器來分散粒子。
在各個態樣中，用於收集流體試樣中之粒子之裝置包括輸入通道；檢測器，其經構形以檢測輸入通道中之粒子；定向流動通道，其與輸入通道流體連通；閥門，其經構形以調節定向流動通道中之流體流動；輸出通道，其與輸入通道流體連通；分散級，其與輸出通道流體連通；及電腦，其包括處理器及在上面儲存有可執行指令之非暫時性記憶體，該等可執行指令在由處理器執行時使得裝置：操作檢測器來檢測粒子在該試樣之第一等分試樣中之第一存在；在檢測到在第一等分試樣中存在粒子後，操作閥門來將第一等分試樣流引導至第一體積中以形成第一分離試樣；將第一分離試樣引導至分散級以形成分散試樣；及對分散試樣實施分離程序。
在一些情形下，藉由該裝置實施之分離程序係主動分離程序或被動分離程序。在一些情形下，檢測粒子之第一存在包括：使用第一電磁輻射源訊問第一等分試樣中之粒子；及檢測第一電磁輻射與第一等分試樣中之粒子之第一相互作用。在一些情形下，第一電磁輻射包括波長在選自由以下組成之群之範圍內之光：100 nm至400 nm、400 nm至700 nm、700 nm至1,000 nm、1 µm至10 µm、10 µm至100 µm及100 µm至1,000 µm。在一些情形下，第一相互作用係選自由以下組成之群：光學反射、光學透射、彈性光學散射、非彈性光學散射、瑞利散射、拉曼散射、表面增強式拉曼散射、米氏散射、布里淵散射、螢光、自發螢光、雷射誘導螢光、生物發光及化學發光。在一些情形下，處理器使得檢測第一等分試樣中粒子之第一存在，同時處理器使得流體試樣在系統中連續流動。
在各個態樣中，使用本文所闡述之裝置分散第一分離試樣包括流動伸展第一收集試樣。在一些態樣中，藉由第一收集試樣穿過流動路徑之抛物線型流動來賦予流動伸展；且在一些情形下，裝置進一步經構形以賦予所收集試樣穿過流動路徑之抛物線型流動。在一些態樣中，藉由第一分離試樣穿過複數個流動路徑之流動來賦予流動伸展。在一些態樣中，分散第一分離試樣包括流動伸展及細胞伸展。
在一些情形下，本文所闡述之裝置包括經構形以賦予第一收集試樣流動伸展之魚骨狀伸展體。在一些情形下，本文所闡述之裝置包括經構形以賦予第一分離試樣細胞伸展之障壁。在一些情形下，障壁經構形以基於細胞之物理屬性來改變細胞速度，且在一些態樣中，細胞之物理屬性係選自由以下組成之群：細胞體積、細胞形狀及細胞可變形性。在一些情形下，障壁包括過濾器結構或通道收縮段。
在各個態樣中，本文所闡述之裝置經構形以實施包括以下之分離程序：使用第二電磁輻射源訊問粒子；及檢測第二電磁輻射與粒子之第二相互作用。在一些情形下，第二電磁輻射包括波長在選自由以下組成之群之範圍內之光：100 nm至400 nm、400 nm至700 nm、700 nm至1,000 nm、1 µm至10 µm、10 µm至100 µm及100 µm至1,000 µm。在一些態樣中，第二相互作用係選自由以下組成之群：光學反射、光學透射、彈性光學散射、非彈性光學散射、瑞利散射、拉曼散射、表面增強式拉曼散射、米氏散射、布里淵散射、螢光、自發螢光、雷射誘導螢光、發光、生物發光及化學發光。在一些態樣中，分離程序包括螢光活化等分試樣分選、eDAR、流式細胞術、螢光活化細胞分選(FACS)、磁粒子分離或磁活化細胞分選(MACS)。
在各個態樣中，本文所闡述裝置之處理器經構形以使得在流體試樣連續流動期間檢測粒子之第二存在。在一些態樣中，處理器進一步經構形以使得粒子收集於連結至出口通道之體積中，該體積選自由以下組成之群：小瓶、孔板及過濾體積。在一些態樣中，處理器進一步經構形以使得粒子經過濾元件捕獲。在一些情形下，處理器進一步經構形以使得粒子自過濾元件釋放。在一些情形下，處理器進一步經構形以使得粒子自過濾元件釋放並收集於選自由小瓶、孔板及其他過濾體積組成之群之體積中。
在各個態樣中，處理器經構形以引導一或多個珠粒與過濾元件接觸。在一些態樣中，處理器經構形以藉由使過濾元件與一或多個珠粒接觸自過濾元件釋放粒子。在一些情形下，處理器進一步經構形以藉由操作第二閥門來濃縮所收集粒子。
在各個態樣中，該等裝置經構形以濃縮粒子，該結構係選自由以下組成之群：一或多個障壁、一或多個過濾元件、一或多個堰伸展體、一或多個微狹縫及一或多個微過濾器。
在一些情形下，本文所闡述之裝置進一步包括經構形以純化粒子之被動流體結構。以引用方式併入
本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案皆以引用方式併入本文中，其併入程度如同明確地且個別地指示將每一個別公開案、專利或專利申請案以引用方式併入一般。
交叉參考
本申請案主張2017年8月15日提出申請之美國臨時專利申請案第62/545,925號之權利，該申請案之全部內容以引用方式併入本文中。
本發明提供用於檢測、分離及分析流體試樣(例如血液)中之粒子(例如細胞)之方法、系統及器件，其中通常使用微流體裝置。粒子可為罕見粒子(例如罕見細胞)。本文所提供之許多微流體裝置及方法可用於對流體試樣實施整體決策等分分級(eDAR)，此允許在將流體試樣分成等分試樣之後分析流體試樣。藉由採用eDAR且隨後實施分散操作及分離操作，本文所提供之微流體裝置及方法可用於增加流體試樣中之粒子之純度。
可藉由本文所闡述之各種微流體裝置及方法來實施分散操作。舉例而言，可使用流動伸展操作來實施分散操作。如本文所闡述，可在初始eDAR操作後藉由含有粒子之等分試樣或流體體積穿過微流體通道之抛物線型流動來賦予流動伸展。如本文所闡述，可在初始eDAR操作後藉由使含有粒子之等分試樣或流體體積流經包括一或多個魚骨狀結構之微流體通道來賦予流動伸展。如本文所闡述之，可在初始eDAR操作後藉由使含有粒子之等分試樣或流體體積流經多個流動路徑來賦予流動伸展。在一些情形下，可使用細胞伸展操作來實施分散操作。可藉由使含有粒子之等分試樣或流體體積流經障壁或過濾器結構或堰結構或具有收縮段之通道來賦予細胞伸展，該等結構皆用於基於粒子之體積、形狀或可變形性來改變粒子速度。舉例而言，用於實施細胞伸展操作之過濾器結構可包括複數個經定大小以優先影響一或多個細胞類型之速度(例如減小)之孔口。在一些情形下，用於實施細胞伸展操作之過濾器結構之一或多個孔口可具有經定大小(例如相對於靶細胞之尺寸或性質，例如靶細胞之直徑或可變形性)以需要一或多個細胞類型之細胞發生變形以通過過濾結構之孔口的高度、長度寬度或橫截面。在一些情況下，可使用流動伸展操作及細胞伸展操作之組合來實施分散操作。
在分散操作後，可實施分離操作。分離操作可為被動分離操作或主動分離操作。分離操作可為第二eDAR操作。分離操作可為流式細胞術(例如螢光活化細胞分選)操作。分離操作可為磁分離操作。
與僅使用eDAR分離靶粒子相比，本文所闡述之微流體裝置及方法可顯著增強流體試樣中之靶粒子與非靶粒子之分離。在一些情形下，與僅藉由eDAR獲得之純度相比，最終收集粒子之純度可增強5倍、10倍、20倍、30倍或大於30倍。
本發明中所闡述之方法、系統、裝置及器件可用於生物學及病理學中之眾多種應用中以分離、濃縮及/或隔離分析物(例如罕見細胞)。舉例而言，一些應用可包含(但不限於)自流體(例如體液)捕獲罕見細胞(例如癌細胞、癌症幹細胞、瘧疾感染性紅血球、幹細胞、胎兒細胞、免疫細胞、感染細胞)以用於診斷及預後疾病；分離單細胞寄生蟲(例如梨形鞭毛蟲(giardia)、隱孢子蟲(cryptosporidium)以用於水品質監測；分離感染細胞(例如淋巴球、白血球)以用於監測疾病進展(例如HIV、AIDS、癌症)；用於篩選(例如疾病、基因異常)之母血中之胎兒細胞；用於治療應用中之幹細胞；用於普里昂蛋白相關(例如瘋牛)疾病篩選之普里昂蛋白感染細胞；及其他應用。
在一特定態樣中，罕見粒子係罕見細胞。罕見細胞可有核或無核。罕見細胞包含(但不限於)表現惡性表型之細胞；胎兒細胞，例如母體末梢血中之胎兒細胞；腫瘤細胞，例如自腫瘤散佈至血液或其他體液中之腫瘤細胞；感染病毒之細胞，例如感染HIV之細胞；經所關注基因轉染之細胞；及存在於患有自體反應病症之個體之末梢血中之T細胞或B細胞之異常亞型。
如本文中所使用，「整體決策」係指基於檢測粒子整體或組中特性之存在或不存在所作出之決策。組可包括至少3種粒子、分析物及/或細胞。在一些態樣中，整體決策係基於含有複數個粒子之流體等分試樣中單一獨特粒子之存在或不存在所作出。重要的是，將基於存在或不存在單一粒子所作出之整體決策應用於整個等分試樣(亦即應用於存在於等分試樣中之所有粒子)。
如本文中所使用，「等分試樣」係指擬分析之流體試樣之總體積之一部分。等分試樣可含有至少一種粒子、分析物或細胞。等分試樣可含有一組粒子、分析物或細胞。等分試樣可佔據三維空間且內部粒子可無組織地隨機分佈。等分試樣可具有有限深度，且粒子可沿深度分佈且並無可辨別層。在本申請案之上下文中，整體分析等分試樣而不細分。
如本文中所使用，片語「分配流體」係指自總體積之流體試樣分離或另外再引導流體之一部分或等分試樣。
在某些態樣中，等分試樣可包括較大流體試樣之一部分，例如約1/2之流體試樣或約1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10或更少之流體試樣。在某些態樣中，等分試樣可包括(例如)約10%之流體試樣或約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.001%或更少之流體試樣。因此，可將擬藉由本文所提供之eDAR方法檢驗或處理之流體分成(例如)至少約2個等分試樣或至少約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1百萬、2百萬、3百萬、4百萬、5百萬、6百萬、7百萬、8百萬、9百萬、10百萬或更多個等分試樣。熟習此項技術者將理解，流體試樣所分配成之等分試樣數量將取決於流體中之預期罕見粒子數量及流體試樣之總體積。
在某些態樣中，等分試樣可包括較大流體試樣之一部分，例如1/2之流體試樣或1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10或更少之流體試樣。在某些態樣中，等分試樣可包括(例如)10%之流體試樣或9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.001%或更少之流體試樣。因此，可將擬藉由本文所提供之eDAR方法檢驗或處理之流體分成(例如)至少2個等分試樣或至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1百萬、2百萬、3百萬、4百萬、5百萬、6百萬、7百萬、8百萬、9百萬、10百萬或更多個等分試樣。熟習此項技術者將理解，流體試樣所分配成之等分試樣數量將取決於流體中之預期罕見粒子數量及流體試樣之總體積。
在某些態樣中，等分試樣之體積可(例如)介於約0.1 nL與約10 mL之間或介於約1 nL與約1mL之間或介於約1 nL與約100 μL之間或介於約1 nL與約10 μL之間或介於約1 nL與約1 μL之間或介於約1 nL與約100 nL之間或介於約0.1 nL與約10 nL之間。
在某些態樣中，等分試樣之體積可(例如)介於0.1 nL與10 mL之間或介於1 nL與1mL之間或介於1 nL與100 μL之間或介於1 nL與10 μL之間或介於1 nL與1 μL之間或介於1 nL與100 nL之間或介於0.1 nL與10 nL之間。
如本文中所使用，術語「分級」係指藉由分類來評價等分試樣之定量性質、定性性質或重要性。在一態樣中，等分試樣可分級為零(例如在等分試樣中未檢測到罕見粒子時)或非零(例如在等分試樣中檢測到至少一種罕見粒子時)。在一態樣中，分級可為二元性。在其他態樣中，可根據其他類別來將等分試樣分級，舉例而言，該等類別與罕見粒子在等分試樣中之濃度、罕見粒子在等分試樣中之屬性、複數個不同罕見粒子在等分試樣中之屬性及諸如此類相關。以此方式，可基於濃度範圍分配任一數量之類別，例如介於約1與10之間、介於約11與20之間、介於約1與50之間、介於約51與100之間、介於約1與100之間、介於約101與201之間等。在一些態樣中，可基於濃度範圍來分配類別數量，例如介於1與10之間、介於11與20之間、介於1與50之間、介於51與100之間、介於1與100之間、介於101與201之間等。該等分級可分配對應於諸多預定定量或定性類別中之一者之任意數量(例如0、1、2、3、4、5等)，或對應於對應於等分試樣中罕見粒子之數量或近似數量之實際值之數量。
如本文中所使用，術語「微流體晶片」可與術語晶片、流體晶片、微晶片或流體微晶片互換使用。
如本文中所使用，「電腦」至少係指數位處理器。數位處理器可為(但不限於)場效可程式閘陣列(FGPA)、專用積體電路(ASIC)或實時(RT)處理器。
eDAR裝置可用於鑑別及分離分析物(例如罕見細胞)。eDAR可將試樣處理成等分試樣且可藉由由流體動力學切換方案控制之主動分選步驟收集通道或室中之罕見細胞。具有通道及室之「一體式微流體晶片」 (在本文中稱為微流體晶片)可用於分選罕見細胞。微流體晶片可部分地由功能區、微製作過濾器構成。可使用eDAR以高回收率(例如大於或等於90%)及低假正率(例如接近0)來快速(例如小於或等於12.5分鐘/1 mL)分析含有混合分析物群體之流體(例如大於或等於一毫升之全血)。
微流體晶片之一般結構及eDAR之實例性構形繪示於圖5中。可使用底部左通道來收集經分選等分試樣且可用於將其轉移至後續純化(例如純化室)區域(例如20,000個微狹縫)。經虛線框標誌之區域進一步繪示於圖5B-D中。在未分級陽性等分試樣時之實例性流動條件展示於圖5B中。可將血流切換至收集通道，且經分選等分試樣可藉由圖5C中之第二窗口證實。圖5D展示，可在分選等分試樣之後切換回血流。
裝置可具有若干流速。流速可係指流體流經eDAR裝置及附接至該裝置之任何組件之速率。在一些態樣中，實例性流速可小於約5µL/min、10µL/min、20µL/min、25µL/min、30µL/min、35µL/min、40µL/min、41µL/min、42µL/min、43L/min、44µL/min、45µL/min、46µL/min、47µL/min、48µL/min、49µL/min、50µL/min、51µL/min、52µL/min、53µL/min、54µL/min、55µL/min、56µL/min、57µL/min、58µL/min、59µL/min、60µL/min、61µL/min、62µL/min、63µL/min、64µL/min、65µL/min、66µL/min、67µL/min、68µL/min、69µL/min、70µL/min、71µL/min、72µL/min、73µL/min、74µL/min、75µL/min、76µL/min、77µL/min、78µL/min、79µL/min、80µL/min、81µL/min、82µL/min、83µL/min、84µL/min、85µL/min、86µL/min、87µL/min、88µL/min、89µL/min、90µL/min、91µL/min、92µL/min、93µL/min、94µL/min、95µL/min、96µL/min、97µL/min、98µL/min、99µL/min、100µL/min、105µL/min、110µL/min、115µL/min、120µL/min、125µL/min、130µL/min、140µL/min、150µL/min、160µL/min、170µL/min、180µL/min、190µL/min、200µL/min、225µL/min、250µL/min、275µL/min、300µL/min、350µL/min、400µL/min、450µL/min、500µL/min、600µL/min、700µL/min、800µL/min、900µL/min或1000µL/min。
在一些態樣中，流速可在以下範圍內：約5µL/min - 30µL/min、15µL/min-50µL/min、25µL/min-75µL/min、40µL/min-80µL/min、50µL/min-90µL/min、60µL/min-100µL/min、800µL/min-160µL/min、90µL/min-180µL/min、100µL/min-200µL/min、150µL/min-300µL/min、200µL/min-400µL/min、300µL/min-500µL/min、400µL/min-600µL/min、500µL/min-700µL/min、600µL/min-800µL/min、700µL/min-900µL/min或800µL/min-1000µL/min。
在一些態樣中，實例性流速可小於5µL/min、10µL/min、20µL/min、25µL/min、30µL/min、35µL/min、40µL/min、41µL/min、42µL/min、43L/min、44µL/min、45µL/min、46µL/min、47µL/min、48µL/min、49µL/min、50µL/min、51µL/min、52µL/min、53µL/min、54µL/min、55µL/min、56µL/min、57µL/min、58µL/min、59µL/min、60µL/min、61µL/min、62µL/min、63µL/min、64µL/min、65µL/min、66µL/min、67µL/min、68µL/min、69µL/min、70µL/min、71µL/min、72µL/min、73µL/min、74µL/min、75µL/min、76µL/min、77µL/min、78µL/min、79µL/min、80µL/min、81µL/min、82µL/min、83µL/min、84µL/min、85µL/min、86µL/min、87µL/min、88µL/min、89µL/min、90µL/min、91µL/min、92µL/min、93µL/min、94µL/min、95µL/min、96µL/min、97µL/min、98µL/min、99µL/min、100µL/min、105µL/min、110µL/min、115µL/min、120µL/min、125µL/min、130µL/min、140µL/min、150µL/min、160µL/min、170µL/min、180µL/min、190µL/min、200µL/min、225µL/min、250µL/min、275µL/min、300µL/min、350µL/min、400µL/min、450µL/min、500µL/min、600µL/min、700µL/min、800µL/min、900µL/min或1000µL/min。
在一些態樣中，流速可在以下範圍內：5µL/min - 30µL/min、15µL/min-50µL/min、25µL/min-75µL/min、40µL/min-80µL/min、50µL/min-90µL/min、60µL/min-100µL/min、800µL/min-160µL/min、90µL/min-180µL/min、100µL/min-200µL/min、150µL/min-300µL/min、200µL/min-400µL/min、300µL/min-500µL/min、400µL/min-600µL/min、500µL/min-700µL/min、600µL/min-800µL/min、700µL/min-900µL/min或800µL/min-1000µL/min。
裝置可具有若干分選效率。分選效率可係指所關注分析物之回收率。在一些態樣中，實例性分選效率可大於約5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些態樣中，分選效率可在約5% - 30%、15%-50%、25%-75%、40%-80%、50%-90%或60%-100%之範圍內。
在一些態樣中，實例性分選效率可大於5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些態樣中，分選效率可在5% - 30%、15%-50%、25%-75%、40%-80%、50%-90%或60%-100%之範圍內。
eDAR裝置可具有若干回收比率。回收比率可係指所關注分析物之回收率。在一些態樣中，回收比率可大於約5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些態樣中，回收比率可在約5% - 30%、15%-50%、25%-75%、40%-80%、50%-90%或60%-100%之範圍內。
在一些態樣中，回收比率可大於5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
在一些態樣中，回收比率可在5% - 30%、15%-50%、25%-75%、40%-80%、50%-90%或60%-100%之範圍內。
在一些態樣中，使用eDAR裝置或方法來分離第一細胞類型與第二細胞類型。在一些態樣中，經分離試樣包括大於5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之總數量之第一細胞類型。在一些態樣中，經分離試樣包括小於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45、50%、60%、70%、80%或90%之總數量之第二細胞類型。
eDAR裝置可包含配備有激發輻射源(例如雷射)之顯微鏡及檢測模式、光源、計時器、管道、廢物收集器件、照相機(用於使加標籤分析物(例如細胞)成像)、幫浦(用以控制流體流入及流出微流體晶片)、數位處理器(用以控制主動分選步驟)及用於處理影像之數位處理器(例如電腦系統)。數位處理器可為電腦。
在一些態樣中，eDAR平臺可包含用於捕獲一種以上分析物(例如罕見細胞)之裝置。「雙重捕獲」 eDAR可自混合試樣分離多種罕見細胞。混合試樣(例如流體試樣)可經檢測試劑標記且沿主通道進入「雙重捕獲」裝置之頂部。可使用兩個側通道來控制混合試樣流之流體動力學切換。在一些態樣中，可使用兩個電磁閥來控制流動。可分離罕見細胞之兩個亞群體且捕集於相同微流體晶片上之兩個不同過濾區上。
在各個態樣中，提供裝置以自衍生自流體之試樣分配表現特定生物標記物特徵之細胞，其中：該等裝置包括一組連結至具有至少一個通道及室之微流體晶片之管道；且該等裝置能夠在室中分離細胞，其中在分離之後，該室包括大於80%之總群體之表現特定生物標記物特徵之試樣細胞，且其中在分離之後，該室包括小於5%之總群體之表現不同生物標記物特徵之試樣細胞。
在一些態樣中，表現特定生物標記物特徵之細胞之分離發生於小於20分鐘內。在一些態樣中，特定生物標記物特徵存在於小於5%之流體試樣細胞中。在某些態樣中，流體係血液。在其他態樣中，流體係經分級分離之全血。在其他態樣中，流體係全血之有核細胞部分。
在各個態樣中，提供用於檢測流體試樣中之粒子之系統，該等系統包括：微流體晶片，其包括輸入通道、第一輸出通道、第二輸出通道及定向流動通道；閥門，其中該閥門可與微流體晶片分離，且其中：該閥門調控第一流體在定向流動通道中之流動；且第一流體在定向流動通道中之流動引導第二流體自輸入通道流向第一輸出通道、第二輸出通道或其組合；檢測器，其經構形以檢測自輸入通道中之一部分第二流體發射之信號；及處理器，其經構形以：基於該信號向該部分分配值；且操作閥門。在一些態樣中，閥門係電致動閥門。
在各個態樣中，提供用於檢測流體試樣中之粒子之系統，該系統包括：(a)微流體晶片，其包括至少一個試樣輸入通道、至少一個定向流動通道及至少兩個輸出通道，其中至少一個定向流動通道與試樣輸入通道相交；(b)電致動閥門，其位於並非微流體晶片部分之器件上，其中電致動閥門藉由控制與至少一個定向流動通道或至少兩個輸出通道中之至少一者相交之輸入通道來控制流體流動；(c)至少一個檢測器，其能夠檢測流體試樣之等分試樣中之一或多種分析物；及(d)處理器，其能夠基於等分試樣中之分析物之存在、不存在、屬性、組成或量向等分試樣分配某一值，其中處理器與檢測器及電致動閥門連通。
在一些態樣中，電致動閥門係電磁閥。在某些態樣中，電致動閥門控制流體在至少一個定向流動通道中之流動。在其他態樣中，電致動閥門通常關閉且其中在自處理器接收信號之後打開電致動閥門。在其他態樣中，電致動閥門通常打開且其中在自處理器接收信號之後關閉電致動閥門。
在一些態樣中，至少一個定向流動通道包括至少兩個埠且其中電致動閥門控制流體穿過一個埠之流動。在某些態樣中，電致動閥門直接控制流體在至少一個定向流動通道中之流動。在一些態樣中，電致動閥門直接控制通道中供給至至少一個定向流動通道中之流體之流動。在某些態樣中，電致動閥門直接控制流體在僅一個定向流動通道中之流動。在其他態樣中，電致動閥門直接控制流體在輸出通道中之流動。在其他態樣中，電致動閥門直接控制通道中供給至輸出通道中之流體之流動。在一些態樣中，電致動閥門係壓電閥門。
在一些態樣中，定向流動通道與輸出通道在接面處相交。在某些態樣中，檢測器位於至少一個並非輸出通道之通道上。在一些態樣中，器件包括確認性雷射。在某些態樣中，確認性雷射位於至少一個並非輸入通道之通道上。在其他態樣中，該系統包括第二檢測器。在其他態樣中，至少一個通道與過濾器流體連通。
在各個態樣中，提供用於檢測流體試樣中之罕見粒子之器件，該等器件包括：輸入通道；第一輸出通道；第二輸出通道；檢測器，其經構形以檢測一部分流體試樣中粒子之存在或不存在；用於基於粒子之存在或不存在來引導該部分自輸入通道流向第一輸出通道、第二輸出通道或其組合之機構；及過濾器，其與第一輸出通道流體連通。在一些態樣中，過濾器包括孔口陣列。在某些態樣中，陣列中每一孔口之最小尺寸小於粒子之最小尺寸。
在各個態樣中，提供用於檢測流體試樣中之罕見粒子之器件，該等器件包括：(a)至少一個試樣輸入通道；(b)至少兩個輸出通道，其中兩個輸出通道中之至少一者與孔口陣列流體連通；(c)至少一個檢測器，其能夠檢測流體試樣之等分試樣中之一或多種罕見粒子；及(d)用於藉由引導含有一或多種罕見粒子之等分試樣流經第一輸出通道來分選一或多種罕見粒子之機構。
在一些態樣中，該器件包括第一輸出通道及第二輸出通道。在某些態樣中，若等分試樣不含罕見粒子，則該機構引導等分試樣流入第二輸出通道中。在某些態樣中，用於分選之機構包括電極、磁元件、聲音元件或電致動元件。
在一些態樣中，孔口陣列佈置於輸入通道與輸出通道之間。在某些態樣中，孔口陣列與輸入通道及輸出通道在同一平面中。在其他態樣中，孔口陣列佈置於第一輸出通道內。在其他態樣中，孔口陣列佈置於與第一輸出通道流體連通之室中。在一些態樣中，對孔口陣列進行構形，從而罕見粒子不能通過孔口，但至少一種其他粒子能夠通過孔口。在某些態樣中，對孔口陣列進行構形，從而罕見粒子能夠通過孔口，但至少一種其他粒子不能通過孔口。在其他態樣中，孔口陣列包括大於1000個孔口。
在某些態樣中，檢測器係選自由以下組成之群：照相機、電子倍增器、電荷耦合器件(CCD)影像感測器、光倍增管(PMT)、崩潰光二極體(APD)、單光子崩潰二極體(SPAD)、矽光倍增器(SiPM)及互補金屬氧化物半導體(CMOS)影像感測器。
在各個態樣中，提供用於實施分析之積體系統，該等系統包括：包括粒子之流體試樣，其中該粒子包括標記物；輸入通道；第一輸出通道；第二輸出通道；第一檢測器，其經構形以檢測一部分流體試樣中粒子之存在或不存在，該部分佈置於輸入通道內；用於基於粒子之存在或不存在來引導該部分自輸入通道流向第一輸出通道之機構；微腔，其與第一輸出通道流體連通且經構形以捕集粒子。微流體晶片之設計及製作
可製作微流體晶片以提供有效主動分選方案及後續純化(例如純化室)方案。微流體晶片可由矽母模上之兩個層構成且可藉由一步式複製模製至聚二甲基矽氧烷(PDMS)中來製作。微流體晶片可最終結合至玻璃基板。
在一些態樣中，可使用兩個光微影製程來製作矽母模(圖2)。可使用標準軟體(例如AutoCAD、Autodesk、San Rafael、CA)來設計特徵，且可寫於鉻遮罩上。在該等情形下，可使用正性抗蝕劑微影及深反應性離子蝕刻(DRIE)來形成第一層(圖2)。第一層可為微過濾特徵。在一些態樣中，藉由可包含DRIE製程之製程來達成正性光阻劑(例如AZ 1512)。DRIE製程可達成適用於各種特徵之深度(例如4.5-5 µm)。
在一些態樣中，可使用負性光阻劑(例如SU-8-3050，來自MicroChem, Newton, MA)來製作eDAR微流體晶片特徵之第二層，且可控制特徵之高度(例如50 µm)。可使用(例如)十三氟-1,1,2,2-四氫辛基-1-三氯矽烷(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)將母模矽烷化。可使用未固化PDMS塗覆矽烷化母模及矽晶圓並烘烤(例如在70℃下2小時)。在一些態樣中，可自矽母模剝離具有期望微特徵之PDMS片，且然後使用標準電漿氧化製程與一片蓋玻片結合以完成eDAR微流體晶片之製作。
微流體晶片可含有特定區域，包含染色區、成像區及其他區域。在一些態樣中，該等區域可為用於至少一種目的之相同區域。在其他情形下，該等區域可為用於一種目的之不同區域。在其他情形下，該等區域可為用於至少一種目的之不同區域。每一區域可用於一種以上目的。在一些態樣中，eDAR微流體晶片包含藉由標準微影方法製得之積體過濾區。在一些態樣中，微流體晶片可具有兩個積體功能區，亦即eDAR分選區及基於狹縫結構之過濾單元。微流體晶片中之通道
本文所提供之揭示內容闡述用於檢測流體試樣中之分析物(例如罕見粒子)之裝置，該裝置包括：(a)至少第一輸入通道；(b)至少兩個出口通道；(c)至少一個檢測器，其能夠檢測生物流體之等分試樣中之一或多種罕見粒子；(d)用於引導等分試樣之流動之機構；及(e)分級器件，其能夠基於等分試樣中之罕見粒子之存在、不存在、屬性、組成或量向等分試樣分配某一值，其中數位處理器(例如電腦)與檢測器及用於引導等分試樣流動之機構連通。
在一些態樣中，本文所提供之裝置可包括由壁包封且/或微製作於基板上之流動通道以及用以最小化對分析物(例如罕見細胞)之無意損害之設計特徵。減小罕見細胞之無意損害可減小引起錯誤患者診斷或預後之假陰性率。流動通道可進一步包括具有流體動力學設計孔口之通道以排除具有最小應力或損害之生物細胞。流動通道係如美國專利公開案第2007/0037172號及第2008/0248499號中所闡述。該等通道在上文所提及專利申請案中稱為一維(「1-D」)孔口之通道，其可減小在細胞排除過程期間細胞所經歷之流體動力學壓力且由此減小細胞裂解之可能性。具有1-D孔口之通道可在策略上根據如美國專利公開案第2008/0318324號中所闡述之「溢流過濾」構形配置成陣列以進一步再引導、分配、減弱或分散流動，從而減小在排除時細胞所經歷之衝擊力。可使用UV固化製程根據PCT/US2009/002426中所闡述之程序自生物相容基板材料(其係醫學器件等級聚合物)來製作包封流動通道之壁，從而eDAR裝置可符合管理醫學器件製造之條例。
分選區中可用於將流體引入分選接面之主通道可具有特定高度(例如50 µm)及特定寬度(例如150 µm)。在大部分情形下，其他通道(例如4個)可具有特定高度(例如50 µm)及特定寬度(例如200 µm)。過濾單元中之基於狹縫結構之過濾器可具有特定高度(例如5 µm)及特定寬度(例如5 µm)。微流體晶片可在狹縫結構中含有最多且可包含50,000個狹縫。
在一些態樣中，eDAR裝置可進一步包括用於基於該分級引導該等等分試樣之通道。可使用抗凝固劑化合物、優先結合至分析物(例如罕見生物粒子)之化合物、防止罕見生物粒子發生團聚之化合物或其組合來處理通道。
在一些態樣中，本文所提供之eDAR裝置可包括複數個流動通道，包含一或多個輸入流動通道(例如為檢測體積帶來等分試樣之通道)及一或多個輸出通道(例如自檢測體積帶走等分試樣之通道)。在一些態樣中，如本文所提供之eDAR裝置可包括至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多個輸入通道及至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多個輸出通道之組合。在一些態樣中，如本文所提供之eDAR裝置可包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多個輸入通道及至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多個輸出通道之組合。在一些態樣中，裝置可包括多個連結至主通道之流動通道以注入額外流體來改變局部速度。
在一些態樣中，將流體自係微流體晶片之一部分之通道遞送至與通道流體連通但位於微流體晶片外部之室中。在一些態樣中，室係小瓶。在其他態樣中，室係單一孔或孔板中之孔。在其他態樣中，室係微離心管。在其他態樣中，室係微離心管，其中微離心管係埃彭道夫管(Eppendorf tube)。任一適宜結構可用於小瓶且熟習此項技術者可易於鑑別用於本發明之適宜室。
在一些態樣中，經由管或其他用於傳輸流體之適宜結構將流體自通道遞送至與通道流體連通之室中。管可包括自生物相容聚合物構築之材料。在其他態樣中，室可經由毛細管(例如熔融二氧化矽毛細管，例如用於(例如)實施毛細管電泳)與通道流體連通。熟習此項技術者易於明瞭適於使通道與室流體連通之其他類型管道。
如本文中所使用，術語「與……流體連通」 (及其變化形式)係指在組件之間存在流體路徑。流體連通並不暗示或排除存在任何中間結構或組件。甚至在一些情況下兩個組件之間之路徑受阻且/或流體並不在之間流動，該等組件亦可流體連通。因此，間歇性流體流動涵蓋於存在流體連通之某些態樣中。
在一些態樣中，本文所提供之裝置可包括由自包含(但不限於)以下材料製得之壁包封之流動通道或室：聚合材料(聚二甲基矽氧烷(PDMS)、聚胺基甲酸酯-甲基丙烯酸酯(PUMA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯、聚酯(PET)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚碳酸酯、聚對二甲苯、聚氯乙烯、氟乙基丙烯、萊克桑(lexan)、聚苯乙烯、環狀烯烴共聚物、環狀烯烴聚合物、聚胺基甲酸酯、聚酯碳酸酯、聚丙烯、聚丁烯、聚丙烯酸酯、聚己內酯、聚酮、聚鄰苯二甲醯胺、乙酸纖維素、聚丙烯腈、聚碸、環氧聚合物、熱塑性材料、氟聚合物及聚二氟亞乙烯、聚醯胺、聚醯亞胺)、無機材料(玻璃、石英、矽、GaAs、氮化矽)、熔融二氧化矽、陶瓷、玻璃(有機物)、金屬及/或其他材料及其組合。
在一些態樣中，壁材料可由以下物質製得：多孔膜、織物或非織物羊毛纖維(例如布或網)、金屬(例如不銹鋼或Monel)、玻璃、紙或合成材料(例如耐綸(nylon)、聚丙烯、聚碳酸酯、聚對二甲苯及各種聚酯)、燒結不銹鋼及其他金屬以及多孔無機材料(例如氧化鋁、二氧化矽或碳)。
在一些態樣中，本文所提供之裝置可包括經化學分子或生物分子預處理之流動通道或室。舉例而言，可使用以下物質來處理通道或室：防止或減小流體試樣中之分析物(例如罕見粒子或細胞)之締合之抗凝固劑化合物、優先結合至分析物(例如罕見粒子或細胞)之化合物或防止或減小流體試樣中之分析物(例如罕見粒子或細胞)之團聚或聚集之化合物。
在一些態樣中，可使用抗凝固劑化合物、優先結合至循環腫瘤細胞之化合物或防止細胞黏附之化合物來處理通道或室表面。
在一些態樣中，可以化學方式改質通道或室表面以增強潤濕或有助於選擇細胞、粒子或分子之吸附。表面改質化學物質可包含(但不限於)矽烷，例如三甲基氯矽烷(TMCS)、六甲基二矽氮烷(HMDS)、(十三氟-1,1,2,2-四氫辛基)三氯矽烷、氯二甲基辛基矽烷、十八烷基三氯矽烷(OTS)或γ-甲基丙烯醯基氧基丙基三甲氧基-矽烷；聚合物，例如丙烯酸、丙烯醯胺、二甲基丙烯醯胺(DMA)、丙烯酸2-羥乙基酯、聚乙烯醇(PVA)、聚(乙烯基吡咯啶酮(PVP)、聚(乙烯亞胺) (PEI)、聚乙二醇(PEG)、環氧聚(二甲基丙烯醯胺(EPDMA)或PEG-單甲氧基丙烯酸酯；表面活性劑，例如Pluronic表面活性劑、基於聚(乙二醇) (PEG)之表面活性劑、十二烷基硫酸鈉(SDS)、十二烷基三甲基氯化銨(DTAC)、鯨蠟基三乙基溴化銨(CTAB)或聚凝胺(PB)；纖維素衍生物，例如羥丙基纖維素(HPC)或羥丙基甲基纖維素(HPMC)；胺，例如乙胺、二乙胺、三乙胺或三乙醇胺；含氟化合物，例如含有聚四氟乙烯(PTFE)或鐵氟龍(Teflon)者。過濾
本文所提供之eDAR裝置可進一步包括過濾元件。在一些態樣中，過濾元件可呈以下形式：微柱、微障壁、微衝擊器、微篩、孔口小於生物粒子之通道、具有使得可防止生物粒子進入孔口但可容許流體繞過生物粒子繼續流經孔口(「1-D通道」)之孔口之通道、微珠粒、多孔膜、壁突出、黏著劑塗層、織物或非織物羊毛纖維(例如布或網)、金屬(例如不銹鋼或Monel)、玻璃、紙或合成材料(例如耐綸、聚丙烯、聚碳酸酯、聚對二甲苯及聚酯)、燒結不銹鋼或其他金屬或多孔無機材料(例如氧化鋁、二氧化矽)。在一些情形下，可使用2層製作技術來形成過濾元件。
在一些態樣中，對過濾元件中之孔口陣列進行構形，從而所關注粒子(例如罕見粒子或細胞)不能通過過濾元件之孔口，而至少一種其他粒子能夠通過過濾元件之孔口。在其他態樣中，對過濾元件中之孔口陣列進行構形，從而所關注粒子(例如罕見粒子或細胞)能夠通過過濾元件之孔口，而至少一種其他粒子不能通過過濾元件之孔口。
在一些態樣中，可使用微狹縫製作eDAR微流體晶片(圖7A)。可使用微狹縫來捕獲罕見細胞且並不保留任何其他非特異性粒子(例如紅血球、RBC)。微狹縫之大小可有所變化。在一些態樣中，微狹縫之高度可小於或等於約0.1 μm、0.5 μm、1 μm、5 μm、10 μm、15 μm、20 μm、25 μm、30 μm、35 μm、40 μm、50 μm、75 μm或100 μm高。在一些態樣中，微狹縫之高度可在以下範圍內：約0.1- 5 μm、1- 10 μm、5-15 μm、10-30 μm、15-40 μm、20-50 μm、30-75 μm及50-100 μm高。在一些態樣中，微狹縫之寬度可小於或等於約0.1 μm、0.5 μm、1 μm、5 μm、10 μm、15 μm、20 μm、25 μm、30 μm、35 μm、40 μm、50 μm、75 μm或100 μm高。在一些態樣中，微狹縫之寬度可在以下範圍內：約0.1-5 μm、1- 10 μm、5-15 μm、10-30 μm、15-40 μm、20-50 μm、30-75 μm及50-100 μm高。舉例而言，微狹縫可具有5 μm高度及5 μm寬度(圖7B)。
在一些態樣中，微狹縫之高度可小於或等於0.1 μm、0.5 μm、1 μm、5 μm、10 μm、15 μm、20 μm、25 μm、30 μm、35 μm、40 μm、50 μm、75 μm或100 μm高。在一些態樣中，微狹縫之高度可在以下範圍內：0.1-5 μm、1-10 μm、5-15 μm、10-30 μm、15-40 μm、20-50 μm、30-75 μm及50-100 μm高。在一些態樣中，微狹縫之寬度可小於或等於0.1 μm、0.5 μm、1 μm、5 μm、10 μm、15 μm、20 μm、25 μm、30 μm、35 μm、40 μm、50 μm、75 μm或100 μm高。在一些態樣中，微狹縫之寬度可在以下範圍內：0.1- 5 μm、1- 10 μm、5-15 μm、10-30 μm、15-40 μm、20-50 μm、30-75 μm及50-100 μm高。
在一些態樣中，可使用100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、20,000、30,000、40,000,或50,000個孔口或微狹縫來製備微流體晶片。在其他態樣中，可使用大於100、大於200、大於300、大於400、大於500、大於600、大於700、大於800、大於900、大於1000、大於5000、大於20,000、大於30,000、大於40,000或大於50,000個孔口或微狹縫來製備微流體晶片。在一些態樣中，具有較多微狹縫之微流體晶片之壓力可較低。舉例而言，具有20,000個狹縫之eDAR微流體晶片在雙側緩衝通道上需要小於4 psi之壓力以平衡流體動力學切換過程。在一些態樣中，微過濾器中之較低壓力可最小化所分離罕見細胞之應力及變形。
微狹縫可用作過濾源。在一些態樣中，可自任一容許分選且在成像期間不引起像差之材料(例如PDMS)來製作微狹縫且與一片蓋玻片結合以用於成像系統(圖7C及7D)。在一些態樣中，微狹縫可為微過濾器之組件。舉例而言，微過濾器可為具有狹縫(例如微狹縫)、孔隙(例如微孔隙)或至少一個尺寸(例如寬度、高度、深度或直徑)為1微米及100微米之孔口之過濾元件。
在一些態樣中，使用微狹縫以用於過濾目的可改良成像準確度及所捕集細胞之列舉。在一些態樣中，微狹縫可增加所捕集罕見細胞上之第二輪標記之速度及效率。舉例而言，經抗EpCAM-PE標記之兩種癌細胞可捕集於微狹縫上(圖7E)。可固定細胞，滲透，且使用抗細胞角質蛋白-Alexa488、抗CD45-Alexa700、抗Her2-Alexa647及Hoechst標記。流體動力學分選
有助於eDAR平臺之特徵及性能之兩個關鍵因素係(1)有效及主動分選方案及(2)後續有效純化(例如純化室)方案。可最佳化微流體晶片及流體動力學切換機構之分析性能以達成特定回收效率(例如95%)、特定假正率(例如0)及特定通量(例如4.8 mL全血/小時)。
在一些態樣中，端視罕見粒子之屬性、組成或量，用於引導流動之機構引導含有罕見粒子之等分試樣流入複數個出口通道中之一者中。用於引導等分試樣流之機構可位於第一出口通道(若等分試樣含有罕見粒子)或第二出口通道(若等分試樣不含罕見粒子)中。
在一些態樣中，用於引導等分試樣流之機構可包括電極、磁元件、聲音元件、電致動元件、電場、壓電閥門或磁場。在其他情形下，用於引導等分試樣流之機構可包括一或多個電致動閥門或活塞，其中該等閥門或活塞控制液體至少在與第一輸入通道及兩個出口通道相交於第一接面之第一定向流動通道中之流動。
在一些態樣中，本文所提供之裝置可包括一或多個電極以追蹤及/或操縱粒子、等分試樣或流體試樣之軌跡或流動。在一些態樣中，本文所提供之裝置可包括一或多個電極以用於追蹤及/或操縱粒子或等分試樣之整體或組之軌跡或流動。在此情形下，電極可基於諸如介電電泳或電潤濕等現象來增強等分試樣分離。
在其他情形下，本文所提供之裝置可進一步包括用於分離結合至磁粒子或由磁粒子結合之罕見粒子(例如細胞)之磁元件。在其他情形下，本文所提供之裝置可進一步包括用於分離結合至至少一種磁粒子或由至少一種磁粒子結合之罕見粒子(例如細胞)之載體或組之磁元件。在一些態樣中，基於細胞或附接至粒子或細胞之微磁或奈米磁粒子之磁化率，磁元件可增強等分試樣、粒子或細胞之分離。在一些態樣中，基於細胞或附接至至少一種粒子或細胞之微磁或奈米磁粒子之磁化率，磁元件可增強粒子或細胞之整體或組之分離。
eDAR裝置可具有位於收集側之二線共焦檢測窗口以實時監測流體動力學切換之效率。在一些態樣中，eDAR裝置可與共焦成像配對。
在一些態樣中，可藉由電磁閥及兩側緩衝線中之壓力降來控制流體動力學切換。電磁閥可位於罕見細胞收集通道中。在一些態樣中，此電磁閥位於左側之關閉位置且「陰性」等分試樣流入右側之廢物通道中(圖1A)。在打開電磁閥時，兩個含有緩衝液之側通道之間之壓力降將血流自廢物通道切換至收集側。此切換可發生於小於10毫秒(例如2-3ms)內以收集罕見粒子(例如細胞)。
在一些態樣中，可使用各種流體動力學分選方案。本發明提供8種不同流體動力學分選方案(圖3)。可自主通道注入流體試樣(例如血液)且展示為深黑色流。緩衝液(微流體晶片中之淺灰色)可流入兩個側通道中，可將罕見細胞收集至左下通道中，且可將廢物引導至右下通道中。矩形區塊代表電磁閥(參見「電磁閥」)。電磁閥可設定為常開(N.O.)或常關(N.C.)，如分別由深灰色或淺灰色區塊所指示(圖3)。
微流體晶片之通道可在接面處相交。在一些態樣中，一個通道在接面處與不同通道相交。在一些態樣中，一個通道在接面處與一個以上不同通道相交。在一些態樣中，一個通道在接面處與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個不同通道相交。在一些態樣中，一個以上通道在接面處與不同通道相交。在一些態樣中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個不同通道在接面處與一個不同通道相交。
微流體晶片之通道可在接面處不相交。在一些態樣中，一個通道與不同通道相交於微流體晶片上之非接面位置。在一些態樣中，一個通道與一個以上不同通道相交於微流體晶片上之非接面位置。在一些態樣中，一個通道與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個不同通道相交於微流體晶片上之非接面位置。在一些態樣中，一個以上通道與不同通道相交於微流體晶片上之非接面位置。在一些態樣中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個不同通道與一個不同通道相交於微流體晶片上之非接面位置。電磁閥及流調控
eDAR裝置包含電磁閥以控制流體流動及流體動力學分選方案。在一些態樣中，電磁閥可為活塞。舉例而言，電磁閥活塞係電致動電磁閥之子組件。在一些態樣中，電致動電磁閥可為壓電閥門。在一些態樣中，電磁閥活塞可藉由模製包埋於裝置中。在一些態樣中，電磁閥可為閥門。舉例而言，經包埋電磁閥活塞可由經由管道流體連通之電磁閥代替。
在一些態樣中，eDAR裝置可含有一個電磁閥。在其他情形下，eDAR裝置可含有一個以上電磁閥。舉例而言，eDAR裝置可含有大於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50個電磁閥。在一些態樣中，可打開至少一個電磁閥。舉例而言，可使用打開之電磁閥來使流自微流體器件之一個部件傳送至微流體器件之不同部件。在一些態樣中，可打開大於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50個電磁閥。在一些態樣中，一個部件可為試樣進入點。在一些態樣中，一個部件可為廢物通道。在一些態樣中，一個部件可為分選室。在一些態樣中，至少一個電磁閥可為常開(N.O.)。在一些態樣中，大於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50個電磁閥可常開。
在一些態樣中，可關閉電磁閥。舉例而言，可使用關閉之電磁閥來防止流自微流體器件之一個部件傳送至微流體器件之不同部件。在一些態樣中，可關閉至少一個電磁閥。在一些態樣中，可關閉大於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50個電磁閥。在一些態樣中，一個部件可為試樣進入點。在一些態樣中，一個部件可為廢物通道。在一些態樣中，一個部件可為分選室。在一些態樣中，至少一個電磁閥可為常關(N.C.)。在一些態樣中，大於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50個電磁閥可常關。
在一些態樣中，電磁閥可自打開切換至關閉。舉例而言，關閉打開之電磁閥可用於防止流自微流體器件之一個部件傳送至微流體器件之不同部件。在一些態樣中，至少一個電磁閥可自打開切換至關閉。在一些態樣中，大於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50個電磁閥可自打開切換至關閉。在一些態樣中，一個部件可為試樣進入點。在一些態樣中，一個部件可為廢物通道。在一些態樣中，一個部件可為分選室。
在一些態樣中，電磁閥可自關閉切換至打開。舉例而言，打開關閉之電磁閥可用於使流體自微流體器件之一個部件傳送至微流體器件之不同部件。在一些態樣中，至少一個電磁閥可自關閉切換至打開。在一些態樣中，大於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50個電磁閥可自關閉切換至打開。在一些態樣中，一個部件可為試樣進入點。在一些態樣中，一個部件可為廢物通道。在一些態樣中，一個部件可為分選室。
在一些態樣中，流體微流體晶片之結構及可用於eDAR之流體動力學分選之相應方案展示於圖3中。在單一通道上存在出口或入口時，可標誌電磁閥之位置。舉例而言，在圖3F中，第二電磁閥之位置可為「中心廢物」，此意味著其位於廢物收集通道之中心出口處。在每一方案中(圖3G中所展示除外)，在可檢測到「陽性」事件時，可改變施加於電磁閥之DC電壓以觸發分選，且在一定時間段之後可返回正常狀態。在一些態樣中，可使用4個個別步驟來控制分選(例如圖3G中所展示之方案)。可關閉兩個電磁閥且流體可流向廢物通道。可觸發分選，此可打開收集側之電磁閥以實施切換步驟。在收集細胞之後，可打開另一電磁閥以實施切回步驟。在流體流完全切回之後，可同時關閉兩個電磁閥以恢復正常狀態。本文所闡述8種不同流體動力學分選方案之流體構形及性能之匯總繪示於表1 (下文)中。在一些態樣中，可使用兩個電磁閥(例如圖3C、3E及3G中所展示之方案)。
Figure 107128510-A0304-0001
 表 1. 8種分選方案之流體構形及性能之匯總。
在一些態樣中，可使用晶片外電磁閥。在大部分方法中，可關閉晶片外電磁閥。為打開晶片外電磁閥，可施加電壓(例如5V DC電壓)。可快速(例如小於或等於三毫秒)打開晶片外電磁閥。在使用晶片外電磁閥之情形下，可修改微流體晶片之製備且電磁閥可與微通道連結。在一些態樣中，可使用晶片上電磁閥。在大部分方法中，可關閉晶片上電磁閥。為打開晶片上電磁閥，可施加電壓(例如5V DC電壓)。可快速(例如小於或等於三毫秒)打開晶片上電磁閥。在使用晶片上電磁閥之情形下，可修改微流體晶片之製備且電磁閥可與微通道連結。
舉例而言，在此方案中，使用晶片外電磁閥。可使用注射器幫浦將經標記流體試樣注入微流體晶片之頂部通道中(圖4A)。可使用緩衝液所流經之兩個側通道來控制主動分選步驟。兩個埠位於右側通道上，且二者連結至加壓緩衝液源。晶片外電磁閥可連結至靠近分選接面之埠以控制流體動力學切換。使用晶片外電磁閥之切換過程可較為穩定且可在105 個開關循環中維持穩定性。
在一些態樣中，可將在線電磁閥置於緩衝線上以防止流體試樣接觸電磁閥。此可消除試樣衰變及交叉污染之可能性。在使用eDAR裝置及方法期間，可在罕見細胞收集通道中存在恆定緩衝液流。晶片上電磁閥可改良後續純化(例如純化室)步驟之效率且可防止形成細胞聚集物。
在一些態樣中，可使用下列各項(位於檢測體積之上游或下游)中之一者來調控eDAR裝置中之流體流：電磁閥、閥門、氣泡、電場、磁場、光場、氣動壓力源、固體粒子、膜、不混溶液滴、重力差或用以改變通道表面張力之塗層。可使用下列各項(位於檢測體積上游或下游)中之一者來調控eDAR裝置中之流體流：第二電磁閥、第二閥門、第二氣泡、第二電場、第二磁場、第二光場、第二氣動壓力源、第二固體粒子、第二膜、第二不混溶液滴、第二重力差或用以改變通道表面張力之第二塗層。隨著細胞橫穿檢測體積，流動可停止，減速，或加速。
在一些態樣中，可在檢測期間維持流體試樣經由流動通道之連續流動。在一些態樣中，個別等分試樣可並不物理分離，而是可藉由光學檢測步驟及/或分選步驟進行界定。
舉例而言，可將流引導至可用於收集廢物之通道中(圖4B)。可在分選接面之後存在兩個通道。左通道可收集陽性等分試樣，將其遞送至過濾區及收集區以用於進一步純化(例如純化室)；右通道收集廢物(例如陰性等分試樣)。在此情形下，在等分試樣分級為「陰性」時，並不向電磁閥施加電壓且保持關閉(圖4B)。流動模式變化可發生於1號緩衝液源與3號緩衝液源之間之初始壓力降之後(圖4A)。可藉由第一檢測窗口檢測陽性事件。在此情形下，可向電磁閥施加DC電壓(例如5V)以自緩衝液儲槽(例如2號)打開緩衝液流。右側緩衝液通道之降低之流動阻力可生成較高流速。可將流體流自右側推向左側以收集陽性等分試樣(圖4C)。可收集等分試樣並藉由第二檢測窗口證實。在一些態樣中，可關閉電磁閥以將流體流切回廢物收集通道(圖4D)。切換及切回所需之時間可小於20毫秒，在一實例性情形下，時間為2-3毫秒或介於其間(表1及圖5；框速率= 1,918個框/秒)。在一些態樣中，可重複所用條件大於105 個開關循環。
在一些態樣中，可藉由(例如)誘導流體動力學流體壓力之方法及器件來遞送流，該等方法及器件(包含但不限於)基於以下原理來操作者：機械原理(例如外部注射器幫浦、氣動膜幫浦、振動膜幫浦、真空器件、離心力及毛細管作用)；電或磁原理(例如電滲流、電動力學幫浦壓電/超音波幫浦、鐵磁流體塞、電流體動力學幫浦及磁流體動力學幫浦)；熱動力學原理(例如氣泡生成/相變誘導性體積膨脹)；表面潤濕原理(例如電潤濕、化學、熱及放射誘導性表面張力梯度)。
在其他情形下，可藉由由以下各項所提供之流體驅動力來遞送或引導流體：重力供給、表面張力(如毛細管作用)、靜電力(電動力學流)、離心流(佈置於光碟上並旋轉之基板)、磁力(振盪離子引起流動)、磁流體動力學力及真空或壓力差。
在一些態樣中，流體流控制器件(例如針對用於誘導流體動力學流體壓力或流體驅動力之方法及器件所列舉者)可耦合至本發明標的物之輸入埠或輸出埠。在一些態樣中，在入口及出口中之任一者或二者處提供多個埠且使一或多個埠耦合至流體流控制器件。過渡時間
分析物(例如罕見細胞或循環腫瘤細胞(CTC))可自第一檢測窗口流向第二檢測窗口。可在記錄第一窗口中之決策APD峰與檢測證實信號之間經過之時間可為分選分析物之過渡時間。在一些態樣中，過渡時間可有所變化。在一些態樣中，線性流速可影響過渡時間。在一些態樣中，微通道之層流可影響過渡時間 。在一些態樣中，可將體積流速設定於40 μL/min (圖6B)。在一些態樣中，體積流速可約為1µL/min、2µL/min、3µL/min、4µL/min、5µL/min、6µL/min、7µL/min、8µL/min、9µL/min、10µL/min、11µL/min、12µL/min、13µL/min、14µL/min、15µL/min、16µL/min、17µL/min、18µL/min、19µL/min、20µL/min、21µL/min、22µL/min、23µL/min、24µL/min、25µL/min、30µL/min、35µL/min、40µL/min、45µL/min、50µL/min、55µL/min、60µL/min、65µL/min、70µL/min、75µL/min、80µL/min、85µL/min、90µL/min、95µL/min、100µL/min或200µL/min。
在一些態樣中，流速可在以下範圍內：約1µL/min - 5µL/min、3µL/min-10µL/min、5µL/min-15µL/min、10µL/min-20µL/min、15µL/min-30µL/min、20µL/min-40µL/min、30µL/min-50µL/min、40µL/min-60µL/min、50µL/min-70µL/min、60µL/min-80µL/min、70µL/min-90µL/min、80µL/min-100µL/min、90µL/min-100µL/min或90µL/min-200µL/min。在其他情形下，可將體積流速設定於80 μL/min (圖6B)。
在一些態樣中，體積流速可為1µL/min、2µL/min、3µL/min、4µL/min、5µL/min、6µL/min、7µL/min、8µL/min、9µL/min、10µL/min、11µL/min、12µL/min、13µL/min、14µL/min、15µL/min、16µL/min、17µL/min、18µL/min、19µL/min、20µL/min、21µL/min、22µL/min、23µL/min、24µL/min、25µL/min、30µL/min、35µL/min、40µL/min、45µL/min、50µL/min、55µL/min、60µL/min、65µL/min、70µL/min、75µL/min、80µL/min、85µL/min、90µL/min、95µL/min、100µL/min或200µL/min。
在一些態樣中，流速可在以下範圍內：1µL/min - 5µL/min、3µL/min-10µL/min、5µL/min-15µL/min、10µL/min-20µL/min、15µL/min-30µL/min、20µL/min-40µL/min、30µL/min-50µL/min、40µL/min-60µL/min、50µL/min-70µL/min、60µL/min-80µL/min、70µL/min-90µL/min、80µL/min-100µL/min、90µL/min-100µL/min或90µL/min-200µL/min。可使用較高流速來達成較低過渡時間(圖6C)。檢測
本發明提供使用微流體晶片之可配備有檢測系統之eDAR裝置。在一些態樣中，檢測系統可包含線共焦檢測方案。在線共焦檢測方案中，兩個雷射源(例如488 nm及633 nm)使用二色性鏡、圓柱形透鏡及光束分離器之系列形成檢測窗口(例如兩個)。第一檢測窗口可具有同時重疊之兩個雷射光束且可用於檢測來自經標記罕見細胞(例如CTC)之螢光信號。第二檢測窗口可用於證實經分選等分試樣中罕見細胞之屬性或罕見細胞之缺乏。第二檢測窗口可進一步用於監測分選效率。
在一些態樣中，可同時檢測兩種罕見粒子。可使每一罕見粒子與獨特檢測試劑接觸且可藉由兩個檢測器件中之一者來檢測每一檢測試劑。另外，其中檢測試劑包括螢光部分，可使用兩個在對應於不同螢光部分之激發波長之不同波長下產生輻射之訊問器件(例如兩個雷射)。可藉由兩個不同檢測器件來檢測各別螢光輻射。在一些態樣中，可藉由不同波長下之螢光來區分檢測試劑。
在一些態樣中，可連續檢測兩種或更多種罕見粒子。舉例而言，該方法可包括檢測eDAR裝置之第一位置之第一罕見粒子且檢測eDAR裝置之第二位置之第二罕見細胞。在此情形下，在第一檢測步驟之後、在第二檢測步驟之後或在兩個檢測步驟之後，可將第一粒子及第二粒子所貯存之等分試樣引導至新位置。
在某些態樣中，檢測事件可以規則頻率發生。頻率可與檢測體積之大小及流體試樣之流速相關。特定裝置之檢測體積可0.1-100 μL範圍內(例如10 μL)且包含該等限值且流體試樣可以在1-1000μL/秒範圍內(例如100 μL/秒)且包含該等限值之速率流經裝置，可在每0.001 – 1秒一次範圍內(例如0.1秒，包含該等限值)或以1-100 Hz範圍內(例如10 Hz)且包含該等限值之速率來檢測不同等分試樣。
在一些態樣中，裝置之幾何結構及擬處理流體之體積可影響速率。舉例而言，等分試樣可以在0.1 kHz至100 MHz範圍內且包含該等限值之速率橫穿檢測體積。在一些態樣中，等分試樣以在10 Hz至10MHz或約10MHz範圍內且包含該等限值之速率橫穿檢測體積。在一些態樣中，等分試樣可以以下頻率橫穿檢測體積：在0.1 kHz至100 MHz或約100 MHz範圍內且包含該等限值或在1 kHz或約1 kHz至10 MHz或約10 MHz範圍內且包含該等限值或在約1kHz至5 MHz或約5MHz範圍內且包含該等限值之頻率或在1 kHz或約1 kHz至1 MHz或約1 MHz範圍內且包含該等限值之頻率。在一些態樣中，等分試樣橫穿檢測體積之頻率可為至少約0.1 kHz或至少約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、400、500、600、700、800或900 kHz或至少約1 MHz或至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、或100 MHz。在一些態樣中，等分試樣橫穿檢測體積之頻率可為至少0.1 kHz或至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、400、500、600、700、800或900 kHz或至少1 MHz或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100 MHz。
在一些態樣中，可同時或隨時間累積檢測來自流體等分試樣中之分析物(例如細胞)整體之特性。舉例而言，可自含有分析物整體之較大等分試樣同時檢測特性。在同時模式期間，粒子可由具有可變速度之流攜載。在其他情形下，隨著粒子橫穿檢測體積，其可由穩定流攜載。
在各個態樣中，eDAR裝置及方法容許自複數個分析物(例如複數個細胞)同時檢測信號。在一些態樣中，基於自存在於等分試樣內之複數個分析物同時檢測之信號來將等分試樣分級。
在其他情形下，本文之方法提供自約為單一細胞之小檢測體積檢測可隨時間變化(「累積」)散發之細胞總體的特性，而多個細胞藉助流動穿過檢測體積。eDAR之累積模式不同於自單一生物粒子發出之連續信號或框之延時疊加；單一生物粒子之延時疊加並不構成生物粒子之整體。在同時及累積模式中，僅在已檢測到來自細胞整體之特性之後作出決策。
在一些態樣中，檢測器係選自由以下組成之群：照相機、電子倍增器、電荷耦合器件(CCD)影像感測器、光倍增管(PMT)、崩潰光二極體(APD)、單光子崩潰二極體(SPAD)、矽光倍增器(SiPM)及互補金屬氧化物半導體(CMOS)影像感測器。在一些態樣中，本文所提供之eDAR裝置可包括光、電、聲或磁檢測器以追蹤所選細胞之運動或列舉存在於等分試樣中之所選粒子或細胞。
在一些態樣中，本文所提供之裝置或方法可納入呈各種構形之螢光(單色或多色)顯微成像，該等構形包含(但不限於)亮視野、epi、共焦、透照、DIC (干涉相位差)、暗視野、Hoffman或相位對比。
在一些態樣中，本文所提供之裝置可包括複數個檢測器件，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個檢測器件。多個檢測器件可用於實施本發明方法，舉例而言，其中一種以上罕見粒子或細胞存在於流體試樣中，使用一種以上細胞標記物來區分不同細胞類型，或同時檢測多種檢測試劑。在一些態樣中，檢測器件可包含確認性雷射。舉例而言，可使用確認性雷射來訊問經分選等分試樣。在一些態樣中，藉由確認性雷射檢測之經分選等分試樣可為陽性等分試樣且在分選之後保留。在一些態樣中，藉由確認性雷射檢測之經分選等分試樣可為陰性等分試樣且可在分選之後棄除。舉例而言，可使用確認性雷射作為第二檢測方法來控制eDAR分選方案之準確度。輻射源及器件
本發明提供可包含檢測器件或成像器件及分級器件(例如電腦)之eDAR裝置。在一些態樣中，雷射(或一個以上雷射)可用作訊問器件。可使用具有光二極體、光倍增器或照相機之倒置顯微鏡作為檢測器件。可將遮罩置於通道與檢測器件之間之路徑中。
在一些態樣中，訊問器件(例如488 nm固態二極體激升雷射及633 nm HeNe雷射)可指向倒置顯微鏡。在進入顯微鏡物鏡之前，可使用圓柱形光學裝置或繞射光學裝置使兩個雷射光束成型以形成縱橫比為10:1之凖直橢圓形光束。使用半波板及偏振光束分離器之組合，可調節每一光束之強度，而鏡子獨立地使光轉向以產生空間共定位之激發區。可藉由兩個二色性鏡在通過帶通濾波器之前將來自生物粒子之螢光分成三個波長帶且再聚焦於三個單光子崩潰二極體(SPAD)上。一個SPAD可收集在560-610 nm波長範圍內之螢光，第二SPAD可收集在645-700 nm範圍內之螢光，且第三SPAD可收集在500-540 nm範圍內者。號SPAD輸出引導至具有計數/計時板之數位處理器(例如電腦)且使用若干算法進行分析。
在一些態樣中，數位處理器自檢測器件接受信號且經由某一算法來將等分試樣分級。數位處理器可基於分級值(例如流體試樣中之罕見粒子之存在、不存在、量、屬性或組成)將等分試樣引入適當通道中。eDAR可包括1、2、3、4、5或6個檢測器件及1、2、3、4、5或6個訊問器件或多個檢測器件及訊問器件。雙重捕獲 eDAR
本發明另外提供用於「雙重捕獲」形式之eDAR之裝置。雙重捕獲裝置可自混合流體之相同試樣分離罕見細胞之兩個不同亞群體。此可同時實施於單一微流體晶片上。兩個亞群體可進一步單獨捕集於微流體晶片上之兩個不同區域上。
雙重捕獲形式之微流體eDAR器件之一般結構繪示於圖8中。可使用至少兩種偶聯至獨特螢光標籤之獨特抗體來標記試樣。舉例而言，可使用第一標籤及第二標籤標記試樣(例如血液)，該第一標籤與結合試樣內分析物上之標記物(例如上皮、抗EpCAM-PE)之獨特螢光團偶聯，第二標籤與結合試樣內分析物上之標記物(例如間質、抗EGFR或抗波形蛋白)之獨特螢光團偶聯，其中每一螢光團可具有不同發射波長(例如FITC)。可將經標記血樣注入微流體晶片中。可使用線共焦方案(闡述於上文中)檢測表現EpCAM之罕見細胞且可在黃色通道中檢測峰。可觸發分選事件以將該特定等分試樣收集至收集通道(例如1號收集通道)中。在一些態樣中，可將等分試樣分級為間質標記物陽性，然後可將罕見細胞分選至不同收集通道(例如2號收集通道)中。可單獨捕集罕見細胞之兩個亞群體並富集於雙重捕獲eDAR微流體晶片上。
雙重捕獲eDAR裝置可使用流體切換方案(圖8)。可將經標記試樣引入頂部之主通道中。緩衝液可流入兩個側通道中以使用兩個電磁閥控制血流之流體動力學切換。在一些態樣中，可使用微狹縫(闡述於上文中)構建雙重捕獲eDAR之過濾區。可分離兩個CTC亞群體並捕集於相同微流體晶片上之兩個不同過濾區上。
雙重捕獲eDAR裝置可包含電磁閥。在一些態樣中，在等分試樣分級為陰性時，可關閉兩個電磁閥(圖9)。若壓力在兩個通道中平衡，則試樣可流向底部中心通道以作為廢物收集。在其他情形下，在等分試樣關於兩種標記物中之僅一者(例如上皮)分級為陽性時，則可打開2號電磁閥以使試樣流入左側收集通道中(圖9B)。在收集等分試樣之後，可再次關閉2號電磁閥且使試樣流返回中心通道。在一些態樣中，可針對僅一種標記物(例如上皮)將等分試樣分級為陽性且可打開1號電磁閥以使試樣流向右通道(圖9C)。在一些態樣中，雙重捕獲eDAR裝置中之兩類分選事件之反應時間較為迅速(例如小於或等於3毫秒)。分散
圖19展示實例性分散級。分散級可包括如本文所闡述之流動伸展體。分散級可包括使用抛物線型流動輪廓來分散細胞。分散級可包括使細胞向下流入多個流動路徑中以分散細胞。分散級可包括如本文所闡述之魚骨狀伸展體。分散級可包括如本文所闡述之堰伸展體。
可使用如本文所闡述之分散級自試樣(例如未分散試樣、第一分離試樣、第二分離試樣等)或其部分形成分散試樣。分散試樣可為其中試樣之兩種或更多種組分分開或分散之試樣。舉例而言，可使用分散級物理分開或分散包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10種類型或群體之細胞之試樣中之兩種類型或群體的細胞。
分散體積可包括分散試樣。舉例而言，可將包括試樣(或其部分)之流體體積傳送至分散級(例如來自第一分選級)且試樣(或試樣部分)可隨著其通過分散級而發生分散。包括分散試樣(例如在已通過分散級之後)之流體體積可為分散體積。
在一些情形下，分散試樣中分開或分散之兩種或更多種試樣組分可為相同流體體積之組分，或其可為不同流體體積之組分(例如在分散試樣期間自單一流體體積形成之複數個流體體積)。在分散時(例如在分散級中)，包括試樣之流體體積可形成兩個或更多個分散流體體積。在一些情形下，因兩個或更多個分散體積之間之流體不連續性，兩個或更多個分散體積彼此分離或分開。舉例而言，隨著單一流體體積通過分散級而自該流體體積形成之兩個分散體積可藉由第二流體(例如氣體或不混溶流體)來彼此分離(例如在通道中)。流動伸展
圖20A展示實例性流動伸展體之俯視圖。流動伸展體可包括一或多個直線流動區段。舉例而言，流動伸展體可包括第一直線流動區段，其中含有粒子之等分試樣或流體部分流向右側，如圖20A之上部所展示。流動伸展體可包括第二直線流動區段，其中含有粒子之等分試樣或流體體積部分以向下角度向左行進，如圖20A之中部及下部所展示。流動伸展體可包括任一數量之沿任一方向行進之直線流動區段。直線流動區段之寬度可小於10微米、小於20微米、小於50微米、小於100微米、小於200微米、小於500微米或小於1,000微米。直線流動區段之寬度可在由前述值中之任兩者界定之範圍內。
直線流動區段可藉由賦予含有粒子之等分試樣或流體體積流動分佈來伸展該等分試樣或流體體積。亦即，不同部分之等分試樣或流體體積可以不同速率流經直線流動區段，從而使得整體延長含有擬收集粒子之等分試樣或流體體積。直線流動區段可賦予等分試樣或流體體積側向流動分佈，從而直線流動區段之寬度中之流速有所變化。直線流動區段可賦予等分試樣或流體體積抛物線型流動分佈。直線流動區段之高度可小於10微米、小於20微米、小於50微米、小於100微米、小於200微米、小於500微米或小於1,000微米。直線流動區段之高度可在由前述值中之任兩者界定之範圍內。直線流動區段之寬度可小於10微米、小於20微米、小於50微米、小於100微米、小於200微米、小於500微米或小於1,000微米。直線流動區段之寬度可在由前述值中之任兩者界定之範圍內。魚骨狀 流動伸展
圖20B展示與直線流動區段組合之實例性魚骨狀流動伸展體之俯視圖。魚骨狀流動伸展體可包括一或多個直線流動區段。舉例而言，魚骨狀流動伸展體可包括第一直線流動區段，其中含有粒子之等分試樣或流體體積流向右側，如圖20B之上部所展示。直線流動區段可類似於針對圖20A所闡述之直線流動區段。魚骨狀流動伸展體可包括一或多個魚骨狀流動區段。舉例而言，魚骨狀流動伸展體可包括魚骨狀流動區段，其中含有粒子之等分試樣或流體體積以向下角度向左行進，如圖20B之中部及下部所展示。魚骨狀流動伸展體可包括任一數量之沿任一方向行進之直線流動區段及任一數量之沿任一方向行進之魚骨狀流動區段。魚骨狀流動區段之寬度可小於10微米、小於20微米、小於50微米、小於100微米、小於200微米、小於500微米或小於1,000微米。魚骨狀流動區段之寬度可在由前述值中之任兩者界定之範圍內。
魚骨狀流動區段可包括一或多個魚骨狀結構(v樣結構，如圖20B中所展示)。魚骨狀流動區段可包括1、2、5、10、20、50、100或大於100個魚骨狀結構。魚骨狀流動區段可包括在由前述值中之任兩者界定之範圍內之多個魚骨狀結構。每一魚骨狀流動區段可具有相同數量之魚骨狀結構。每一魚骨狀流動區段可具有不同數量之魚骨狀結構。魚骨狀結構之寬度可小於10微米、小於20微米、小於50微米、小於100微米、小於200微米、小於500微米或小於1,000微米。魚骨狀結構可具有在由前述值中之任兩者界定之範圍內之寬度。每一魚骨狀結構可與其他魚骨狀結構相隔小於10微米、小於20微米、小於50微米、小於100微米、小於200微米、小於500微米或小於1,000微米之距離。每一魚骨狀結構可與其他魚骨狀結構相隔在由前述值中之任兩者界定之範圍內之距離。
魚骨狀流動區段可藉由賦予含有擬收集粒子之等分試樣或流體體積無序混合來伸展該等分試樣或流體體積。魚骨狀流動區段之高度可小於10微米、小於20微米、小於50微米、小於100微米、小於200微米、小於500微米或小於1,000微米。魚骨狀流動區段之高度可在由前述值中之任兩者界定之範圍內。堰伸展
圖21A展示實例性堰伸展體之俯視圖。堰伸展體可包括一或多個直線流動區段。舉例而言，堰伸展體可包括第一直線流動區段，其中含有粒子之等分試樣或流體體積流向右側，如圖21A之上部所展示。直線流動區段可類似於針對圖21A所闡述之直線流動區段。堰伸展體可包括一或多個堰區段。舉例而言，堰伸展體可包括堰區段，其中含有粒子之等分試樣或流體體積以向下角度流動，如圖21A之中部及下部所展示。堰伸展體可包括任一數量之沿任一方向行進之直線流動區段及任一數量之沿任一方向行進之堰區段。堰區段之寬度可小於10微米、小於20微米、小於50微米、小於100微米、小於200微米、小於500微米或小於1,000微米。堰區段可具有在由前述值中之任兩者界定之範圍內之寬度。
堰區段可包括一或多個堰結構(含有複數個用於結構支撐之柱之流動區段，如圖21A中所展示)。堰區段可包括1、2、5、10、20、50、100或大於100個堰結構。堰區段可包括在由前述值中之任兩者界定之範圍內之多個堰結構。每一堰區段可具有相同數量之堰結構。每一堰區段可具有不同數量之魚骨狀結構。堰結構寬度之可小於10微米、小於20微米、小於50微米、小於100微米、小於200微米、小於500微米或小於1,000微米。魚骨狀結構可具有在由前述值中之任兩者界定之範圍內之寬度。堰結構之長度可小於10微米、小於20微米、小於50微米、小於100微米、小於200微米、小於500微米、小於1,000微米、小於2,000微米、小於5,000微米或小於10,000微米。堰結構可具有在由前述值中之任兩者界定之範圍內之寬度。每一堰結構可與其他堰結構相隔小於10微米、小於20微米、小於50微米、小於100微米、小於200微米、小於500微米、小於1,000微米、小於2,000微米、小於5,000微米或小於10,000微米之距離。每一堰結構可與其他堰結構相隔在由前述值中之任兩者界定之範圍內之距離。
堰區段可藉由基於細胞大小、形狀或可變形性賦予不同程度之抗細胞移動性來伸展粒子。堰區段之高度可小於10微米、小於20微米、小於50微米、小於100微米、小於200微米、小於500微米或小於1,000微米。堰區段可具有在由前述值中之任兩者界定之範圍內之高度。
圖21B展示實例性長堰伸展體之俯視圖。堰伸展體可包括單一長堰區段。長堰區段可類似於針對圖21A所闡述之任一堰區段。
圖22展示實例性基於障壁或過濾器之細胞伸展體之俯視圖。藉由障礙物或多個流動路徑進行之流動伸展
圖11展示連結至第二分選級之實例性第一分選級之俯視圖，該第一分選級具有包括含有障礙物或多個不同設計之流動路徑之通道之分散級。
圖11A展示在寬流動通道內包括複數個障礙物之分散級。如圖11A中所展示，第一分選級可實施第一分選，如本文所闡述。第一分選級可將等分試樣或流體體積傳送至在寬流動通道內包括複數個障礙物之分散級。分散級可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10個寬流動通道。舉例而言，分散級可包括1個寬流動通道，如圖11A中所展示。障礙物可具有圓形形狀，如圖11A中所展示。障礙物可具有卵形形狀、正方形形狀、矩形形狀、五角形形狀、六角形形狀或任一其他形狀。障礙物可增加或減小等分試樣或流體體積之一或多個子體積之流體路徑長度。等分試樣或流體體積之不同子體積所經歷之不同路徑長度可增加粒子在各個子體積之間的平均距離。舉例而言，可增加等分試樣或流體體積之擬收集粒子與其他粒子之間之距離。障礙物可為沿流動通道之高度伸展之柱。該等柱可支撐通道且可幫助防止通道在用於構築通道之材料之重量下發生塌陷。分散級可將分散體積傳送至第二分選級。第二分選級可實施第二分選，如本文所闡述。
圖11B展示包括複數個分支位置之分散級。如圖11B中所展示，第一分選級可實施第一分選，如本文所闡述。第一分選級可將等分試樣或流體體積傳送至在通道中包括複數個分支位置之分散級。分散級可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10個分支位置。舉例而言，分散級可包括4個分支位置，如圖11B中所展示。在每一分支位置，等分試樣或流體體積之不同子體積可採用不同流動路徑。舉例而言，第一子體積可採用由以下部分組成之流動路徑(在圖11B中自頂部至底部)：左、右、左、右。第二子體積可採用由以下部分組成之流動路徑：右、左、右、左。第一子體積可採用長於第二子體積之路徑。第一子體積可由此較第二子體積耗費較長時間自第一分選級行進至第二分選級。等分試樣或流體體積之任一子體積可採用任一可能路徑。複數個分支位置可增加或減小等分試樣或流體體積之一或多個子體積之流體路徑長度。等分試樣或流體體積之不同子體積所經歷之不同路徑長度可增加粒子在各個子體積之間的平均距離。舉例而言，可增加等分試樣或流體體積之擬收集粒子與其他粒子之間之距離。分支可包括沿流動通道之高度伸展之柱(在圖11B中展示為半圓)。該等柱可支撐通道且可幫助防止通道在用於構築通道之材料之重量下發生塌陷。分散級可將分散體積傳送至第二分選級。第二分選級可實施第二分選，如本文所闡述。
圖11C展示包括複數個隨後變寬且變窄之流動區段之分散級。如圖11C中所展示，第一分選級可實施第一分選，如本文所闡述。第一分選級可將等分試樣或流體體積傳送至包括複數個隨後變寬且變窄之流動區段之分散級。分散級可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10個隨後變寬且變窄之流動區段。舉例而言，分散級可包括3個隨後變寬且變窄之流動區段，如圖11C中所展示。變寬且變窄之流動區段可具有菱形樣形狀，如圖11C中所展示。流動區段可具有圓形形狀、卵形形狀、正方形形狀、矩形形狀、五角形形狀、六角形形狀或任一其他形狀。流動區段可增加或減小等分試樣或流體體積之一或多個子體積之流體路徑長度。等分試樣或流體體積之不同子體積所經歷之不同路徑長度可增加粒子在各個子體積之間的平均距離。舉例而言，可增加等分試樣或流體體積之擬收集粒子與其他粒子之間之距離。隨後變寬且變窄之區段可進一步包括沿流動通道之高度伸展之柱(在圖11C中展示為圓)。該等柱可支撐通道且可幫助防止通道在用於構築通道之材料之重量下發生塌陷。分散級可將分散體積傳送至第二分選級。第二分選級可實施第二分選，如本文所闡述。
圖11D展示包括複數個多分支通道之分散級。如圖11D中所展示，第一分選級可實施第一分選，如本文所闡述。第一分選級可將等分試樣或流體體積傳送至在通道中包括複數個多分支位置之分散級。每一多分支位置可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多於兩個分支。舉例而言，每一多分支可包括4個分支，如圖11D中所展示。分散級可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10個多分支位置。舉例而言，分散級可包括2個多分支位置，如圖11D中所展示。在每一多分支位置，等分試樣或流體體積之不同子體積可採用多個不同流動路徑。舉例而言，第一子體積可採用由以下部分組成之流動路徑(在圖11D中自頂部至底部)：最右側、最右側。第二子體積可採用由以下部分組成之流動路徑：最左側、最左側。第一子體積可採用長於第二子體積之路徑。第一子體積可由此較第二子體積耗費較長時間自第一分選級行進至第二分選級。等分試樣或流體體積之任一子體積可採用任一可能路徑。複數個多分支位置可增加或減小等分試樣或流體體積之一或多個子體積之流體路徑長度。等分試樣或流體體積之不同子體積所經歷之不同路徑長度可增加粒子在各個子體積之間的平均距離。舉例而言，可增加等分試樣或流體體積之擬收集粒子與其他粒子之間之距離。分支可包括沿流動通道之高度伸展之柱(在圖11D中展示為大致腎形)。該等柱可支撐通道且可幫助防止通道在用於構築通道之材料之重量下發生塌陷。分散級可將分散體積傳送至第二分選級。第二分選級可實施第二分選，如本文所闡述。
圖12展示連結至第二分選級且具有不同幾何結構之通道之實例性第一分選級之俯視圖。
圖12A展示包括複數個形成蛇形通道之彎曲流動區段之分散級。如圖12A中所展示，第一分選級可實施第一分選，如本文所闡述。第一分選級可將等分試樣或流體體積傳送至包括複數個形成整體蛇形形狀之彎曲流動區段之分散級。分散級可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10個彎曲區段。舉例而言，分散級可包括5個彎曲區段，如圖12A中所展示。彎曲區段可增加或減小等分試樣或流體體積之一或多個子體積之流體路徑長度。等分試樣或流體體積之不同子體積所經歷之不同路徑長度可增加粒子在各個子體積之間的平均距離。舉例而言，可增加等分試樣或流體體積之擬收集粒子與其他粒子之間之距離。分散級可將分散體積傳送至第二分選級。第二分選級可實施第二分選，如本文所闡述。
圖12B展示包括複數個隨後變寬且變窄之藉由複數個直線流動區段連結之流動區段之分散級。如圖12B中所展示，第一分選級可實施第一分選，如本文所闡述。第一分選級可將等分試樣或流體體積傳送至包括複數個隨後變寬且變窄之藉由複數個直線流動區段連結之流動區段之分散級。分散級可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10個隨後變寬且變窄之流動區段。舉例而言，分散級可包括4個隨後變寬且變窄之流動區段，如圖12B中所展示。變寬且變窄之流動區段可具有圓形形狀，如圖12B中所展示。變寬且變窄之流動區段可具有卵形形狀、正方形形狀、矩形形狀、五角形形狀、六角形形狀或任一其他形狀。變寬且變窄之流動區段可具有在變寬且變窄之流動區段之長度上有所變化的寬度(舉例而言，流動區段可自第一縱向位置之寬度「w1 」變寬至第二縱向位置之寬度「w2 」，如圖12B中所展示)。變寬且變窄之流動區段可增加或減小等分試樣或流體體積之一或多個子體積之流體路徑長度。等分試樣或流體體積之不同子體積所經歷之不同路徑長度可增加粒子在各個子體積之間的平均距離。舉例而言，可增加等分試樣或流體體積之擬收集粒子與其他粒子之間之距離。分散級可將分散體積傳送至第二分選級。第二分選級可實施第二分選，如本文所闡述。
圖12C展示包括複數個隨後變寬且變窄之流動區段之分散級。如圖12C中所展示，第一分選級可實施第一分選，如本文所闡述。第一分選級可將等分試樣或流體體積傳送至包括複數個隨後變寬且變窄之流動區段之分散級。分散級可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10個隨後變寬且變窄之流動區段。舉例而言，分散級可包括3個隨後變寬且變窄之流動區段，如圖12C中所展示。變寬且變窄之流動區段可具有大致菱形樣形狀，如圖12C中所展示。流動區段可具有在流動區段之長度中有所變化之寬度(「w」，如圖12C中所展示) (舉例而言，流動區段可自第一縱向位置之寬度「w1 」變寬至第二縱向位置之寬度「w2 」)。在菱形樣流動區段之此情形下，菱形兩側可以任一角度相會(θ，如圖12C中所展示)。該角度可大於0度。該角度可小於180度。流動區段可增加或減小等分試樣或流體體積之一或多個子體積之流體路徑長度。等分試樣或流體體積之不同子體積所經歷之不同路徑長度可增加粒子在各個子體積之間的平均距離。舉例而言，可增加等分試樣或流體體積之擬收集粒子與其他粒子之間之距離。分散級可將分散體積傳送至第二分選級。第二分選級可實施第二分選，如本文所闡述。多分散策略
分散級可組合本文所闡述之兩種或更多種分散策略。舉例而言，分散級可組合2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10種分散策略。分散級可以任一可能組合及任一可能順序來組合分散策略。
圖13展示與具有抛物線型流動輪廓之直線通道組合之實例性魚骨狀伸展體之俯視圖。魚骨狀伸展體可類似於本文所闡述之任一魚骨狀伸展體，例如本文關於圖20B所闡述之魚骨狀伸展體。直線通道可類似於本文所闡述之任一直線通道，例如本文關於圖20A所闡述之直線通道。魚骨狀伸展體及直線通道可以任一可能順序出現。
圖14展示與多個直線通道組合之實例性多個魚骨狀伸展體之俯視圖。該器件可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10個魚骨狀伸展體。每一魚骨狀伸展體可類似於本文所闡述之任一魚骨狀伸展體，例如本文關於圖20B所闡述之魚骨狀伸展體。該器件可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10個直線通道。每一直線通道可類似於本文所闡述之任一直線通道，例如本文關於圖20A所闡述之直線通道。魚骨狀伸展體及直線通道可以任一可能順序出現。
圖15展示與直線通道及堰伸展體組合之實例性魚骨狀伸展體之俯視圖。堰伸展體可進一步包括結構柱。結構柱可防止通道發生塌陷，如本文所闡述。該器件可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10個魚骨狀伸展體。每一魚骨狀伸展體可類似於本文所闡述之任一魚骨狀伸展體，例如本文關於圖20B所闡述之魚骨狀伸展體。該器件可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10個直線通道。每一直線通道可類似於本文所闡述之任一直線通道，例如本文關於圖20A所闡述之直線通道。該器件可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10個堰伸展體。每一堰伸展體可類似於本文所闡述之任一堰伸展體，例如本文關於圖21A所闡述之堰伸展體。魚骨狀伸展體、直線通道及堰伸展體可以任一可能順序出現。
圖16展示與魚骨狀伸展體組合之具有多個流體路徑之實例性流動伸展體之俯視圖。該器件可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10個多流體路徑區段。每一多流體路徑區段可類似於本文所闡述之任一多流體路徑，例如本文關於圖11D所闡述之多流體路徑。該器件可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10個魚骨狀伸展體。每一魚骨狀伸展體可類似於本文所闡述之任一魚骨狀伸展體，例如本文關於圖20B所闡述之魚骨狀伸展體。多流體路徑區段及魚骨狀伸展體可以任一可能順序出現。
圖17展示與多個魚骨狀伸展體及堰伸展體組合之具有多個流體路徑之實例性流動伸展體之俯視圖。該器件可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10個多流體路徑區段。每一多流體路徑區段可類似於本文所闡述之任一多流體路徑，例如本文關於圖11D所闡述之多流體路徑。該器件可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10個魚骨狀伸展體。每一魚骨狀伸展體可類似於本文所闡述之任一魚骨狀伸展體，例如本文關於圖20B所闡述之魚骨狀伸展體。該器件可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10個堰伸展體。每一堰伸展體可類似於本文所闡述之任一堰伸展體，例如本文關於圖21A所闡述之堰伸展體。多流體路徑區段、魚骨狀伸展體及堰伸展體可以任一可能順序出現。流動伸展微器件
圖23A展示穿過利用魚骨狀結構之微流體器件之流動路徑之示意圖。含有粒子之等分試樣或流體體積可沿流動通道自第一eDAR級進入魚骨狀區段。等分試樣或流體體積可遇到一或多個魚骨狀流動區段。舉例而言，等分試樣或流體體積可遇到包括複數個直線魚骨狀結構之第一魚骨狀流動區段，如圖23A之右上部分中所展示。等分試樣或流體體積可然後遇到包括複數個v型魚骨狀結構之第二魚骨狀區段，該等v型魚骨狀結構自流動通道之中心發生偏移，如圖23A之右下部分中所展示。等分試樣或流體體積可然後遇到包括複數個v型魚骨狀結構之第三魚骨狀區段，該等v型魚骨狀結構自流動通道之中心在第二魚骨狀區段之相反方向上發生偏移。魚骨狀區段及結構可為如本文所闡述之任何魚骨狀區段及結構。
圖23B展示利用魚骨狀結構之微流體器件中之流動通道層之側視圖。微流體器件可包括特徵層及封閉層。特徵層及封閉層可藉由流動通道隔開。流動通道可具有小於10微米、小於20微米、小於50微米、小於100微米、小於200微米、小於500微米或小於1,000微米之高度。流動通道可具有在由前述值中之任兩者界定之範圍內之高度。特徵層可包括聚二甲基矽氧烷(PDMS)。可使用軟微影技術產生PDMS特徵層。特徵層可包括固化光阻劑，例如SU8。可使用光微影技術產生特徵層。特徵層可包括矽。可使用半導體蝕刻技術(例如濕式蝕刻、鹼性蝕刻、乾式蝕刻、反應性離子蝕刻或深反應性離子蝕刻)來產生特徵層。特徵層可包括玻璃。可使用玻璃蝕刻技術(例如氫氟酸蝕刻)產生特徵層。特徵層可包括塑膠，例如環烯烴共聚物(COC)、環烯烴聚合物(COP)或聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。可使用壓印微影產生特徵層。可使用注入模製產生特徵層。可使用3D印刷技術產生特徵層。可使用本文所闡述之任一微流體產生方法來產生特徵層。
特徵層可包括一或多個魚骨狀結構。魚骨狀結構可包括複數個孔及隆脊。魚骨狀結構可為本文所闡述之任一魚骨狀結構。
可使用一或多種結合技術將封閉層密封至特徵層。封閉層可包括玻璃。可使用電漿結合技術將玻璃封閉層密封至PDMS特徵層。可使用熔融結合技術將玻璃封閉層密封至玻璃特徵層。可使用熔融結合技術或陽極結合技術將玻璃封閉層密封至矽特徵層。封閉層可包括塑膠，例如COC、COP或PMMA。可使用熔融結合技術將塑膠封閉層密封至塑膠特徵層。可使用溶劑結合技術將塑膠封閉層密封至塑膠特徵層。
圖10A展示實例性多級螢光活化分選裝置之俯視圖。多級裝置可為如本文所闡述之微流體裝置。多級裝置可包括利用本文所闡述之eDAR分選原理之第一分選級。多級裝置可在eDAR級後進一步包括分散級，如本文所闡述。分散級可包括如本文所闡述之流動伸展體。多級裝置可在分散級後進一步包括第二分選級，如本文所闡述。第二分選級可為如本文所闡述之螢光活化分選級。
圖10C展示實例性第一分選級。第一分選級可為如本文所闡述之eDAR級。舉例而言，第一分選級可類似於本文關於圖18A所闡述之第一eDAR級。
圖10B展示實例性第二分選級。第二分選級可本文所闡述之任一螢光活化分選級。舉例而言，第二分選級可類似於本文關於圖18A所闡述之第二分選級。
圖10D及E展示在第一分選級與第二分選級之間包括流動伸展體之分散級之部分。如圖10E中所展示，複數個粒子(在圖10中標記為1、2、3、4、5、6及7，但複數個可包括8個粒子、9個粒子、10個粒子、大於10個粒子、大於20個粒子、大於50個粒子、大於100個粒子、大於200個粒子、大於500個粒子、大於1,000個粒子或在由前述值中之任兩者界定之範圍內之數量之粒子)可流經分散級。流動伸展體可作用於流體流，從而粒子(例如在圖10E中之流動伸展體頂部標記為1至7之粒子)在流經流動伸展體所消耗之給定量時間之後止於不同位置。因此，粒子可以不同時間點到達第二分選級。在圖10E中所展示之實例中，粒子2可到達第二分選級，隨後係粒子3，然後係粒子6，然後係粒子1，然後係粒子4，然後係粒子7，然後係粒子5。流動伸展體可作用於流體，從而粒子以任一可能順序及任一可能時間量到達第二分選級。不同到達時間可增加任兩個粒子之間之距離量。因此，可因增加之距離而獨立分選粒子。細胞伸展
分散級中之伸展亦可包括細胞伸展。可藉由流動通道中之障壁來賦予細胞伸展。障壁可基於含於等分試樣或流體體積中之粒子(例如細胞)之物理屬性來改變粒子速度。舉例而言，障壁可基於粒子之體積、形狀或可變形性來改變其速度。在粒子係細胞時，障壁可基於細胞體積、細胞形狀或細胞可變形性來改變細胞速度。障壁可包括過濾器結構、堰結構或通道橫截面尺寸之收縮/減小。在一些情形下，分散級可利用流動伸展及細胞伸展。第二分離
在分散後，可使用分離程序(例如分離技術)來進一步分離擬收集粒子與含於等分試樣或流體體積中之其他粒子。在一較佳實施例中，擬收集粒子可經受第二eDAR製程。第二eDAR製程可進一步分離擬收集之粒子或細胞，如本文所闡述。
分離程序(例如第二分離)可為主動分離程序或被動分離程序。可對分離試樣或分散試樣(例如已經受第一分離或第一分離及分散程序之試樣)實施第二分離程序(例如實施於第一分離(例如eDAR)之後之分離程序)。
可使用被動分離程序進一步分離擬收集粒子與其他粒子(例如在第一分離(例如eDAR)及/或分散程序(例如藉由使傳粒子或細胞通過分散級所實施者)後)。在一些情形下，被動分離可包括分散程序。包括分散程序之被動分離可包括使粒子或細胞(例如分離試樣或分散試樣之粒子或細胞)通過分散級。在一些情形下，被動分離包括使用魚骨狀伸展體、堰、包括多個流動路徑之通道(或通道部分)及/或具有能夠以本文所闡述流速產生抛物線型流體流動之尺寸之通道。
可使用主動分離程序進一步分離擬收集粒子與其他粒子(例如在第一分離之後)。舉例而言，分離程序(例如第二分離程序)可包括螢光活化分選。在一些情形下，螢光活化分選可包括分選流體體積中之單一細胞或流體體積中之一組細胞。螢光活化分選可包含分選流體體積中可不呈等分試樣形式之一小組細胞(舉例而言，螢光活化分選可包括分選不隨機分散於流體體積中之一小組細胞，如eDAR中之情形)或分選單一細胞。第二分離(其可為第二螢光活化分選)可將擬收集粒子濃縮成小於藉由第一分離程序(其可包括eDAR分選)產生之等分試樣之體積。以此方式，與藉由第一eDAR級產生之等分試樣相比，第二級螢光活化分選可進一步增加含有擬收集粒子之等分試樣或流體體積之純度。視情況且替代地或另外，可使用其他分離技術進一步分離擬收集粒子與其他粒子。可在第一分離(例如實施於裝置之eDAR分選級中之第一eDAR分選)之後藉由採用流式細胞術操作或技術進一步分離擬收集粒子。流式細胞術操作可為螢光活化細胞分選(FACS)操作，其可包括基於單一粒子或單一細胞來分選分離試樣或分散試樣之複數個粒子或細胞。流式細胞術操作可藉由使含有靶粒子及非靶粒子之分散等分試樣或流體體積流經流動槽來分離擬收集靶粒子與非靶粒子。流動槽可對準等分試樣或流體體積，以使粒子單行流動穿過流動槽。流動槽可經構形以便兩個粒子之間之距離顯著大於粒子直徑。
在處於流動槽中時，可使用一或多個光源照射等分試樣或流體體積。舉例而言，可使用一或多個雷射照射等分試樣或流體體積。由光源發射之光可與靶粒子及非靶粒子相互作用。舉例而言，由光源發射之光可誘導靶粒子或非靶粒子之螢光。粒子可為自身螢光性。在此情形下，螢光可源自光與粒子之內源性組分之間之相互作用。可使用螢光分子將粒子加標籤。在此情形下，螢光可源自光與附接至粒子之外源性螢光團之間之相互作用。外源性螢光團可基於粒子之物理或化學性質附接至粒子。舉例而言，可藉由使共價結合至抗體之外源性螢光團靶向相應細胞表面抗原來將外源性螢光團附接至細胞。不同螢光團可結合至不同類型之粒子。以此方式，可藉由不同螢光信號來區分不同類型之粒子。可藉由光學檢測器(例如光二極體)檢測螢光相互作用並藉由處理器進行處理。
流動槽可經構形以自等分試樣或流體體積產生小液滴。舉例而言，流動槽可包括產生小液滴之振動機構。振動機構可經構形以產生每一液滴含有0或１個粒子之液滴。振動機構可經構形以極低機率產生含有一個以上粒子之液滴。
液滴可通過向液滴施加電荷之器件。舉例而言，液滴可通過帶電環。施加於液滴之電荷可取決於藉由光學檢測器檢測且藉由處理器處理之螢光信號。舉例而言，靶粒子在由特定色彩光照射時可產生螢光信號，而非靶粒子在由該色彩光照射時則不能產生螢光信號。因此，與施加於含有非靶粒子之液滴之電荷相比，可將不同電荷施加於含有靶粒子之液滴上。帶電液滴可通過電場，其中其可基於其電荷發生偏轉。舉例而言，含有靶粒子之液滴可基於其電荷沿一個方向偏轉，而含有非靶粒子之液滴可基於其不同電荷沿不同方向偏轉。液滴可收集於(例如)一或多個小瓶或孔板中。
分離程序(例如分離操作)可包括磁分離操作。分離操作可包括磁活化細胞分選(MACS)。磁分離操作可利用磁粒子來分離靶粒子與非靶粒子。磁粒子可包括超順磁粒子。磁粒子可包括超順磁微粒子。磁粒子可包括超順磁奈米粒子。磁粒子可經構形以對靶粒子或非靶粒子加標籤。磁粒子可基於粒子之物理或化學性質附接至粒子。舉例而言，可藉由使共價結合至抗體之磁粒子靶向相應細胞表面抗原來使磁粒子附接至細胞。磁粒子可經構形以結合至靶粒子。或者， 磁粒子可經構形以結合至非靶粒子。可使粒子通過管柱。管柱可位於磁場內。加磁粒子標籤之粒子可因與磁場之相互作用而黏附至管柱。未加標籤之粒子可通過管柱。若靶粒子已加標籤，則可藉由將收集容器(例如小瓶或孔板)置於管柱末端且在使非靶粒子通過管柱之後關斷磁場來進行收集。若靶粒子未加標籤，則可藉由在磁分離操作期間將收集容器置於管柱末端來進行收集。第一級 eDAR 分選之後之多級螢光活化分選
本發明另外提供用於在第一級eDAR後進行多級螢光活化分選之裝置，其在每一組螢光活化分選與第一eDAR級之間利用分散性分離級。與單級eDAR裝置，該裝置可進一步純化試樣。該裝置可實施於單一微流體晶片上。
該裝置可包括第一eDAR級、分散級及第二螢光活化分選級，如圖18A中所展示。分散級可實施於第一eDAR級與第二螢光活化分選級之間。儘管在圖18A中展示為三級裝置，但多級裝置可進一步包括第二分散級及第三螢光活化分選級。第二分散級可實施於第二螢光活化分選級與第三螢光活化分選級之間。多級裝置可進一步包括第三分散級及第四螢光活化分選級。第三分散級可實施於第三螢光活化分選級與第四螢光活化分選級之間。多級裝置可進一步包括第四分散級及第五螢光活化分選級。第三分散級可實施於第四螢光活化分選級與第五螢光活化分選級之間。一般而言，多級裝置可在第一級eDAR之後包括n個螢光活化分選級及n個分散級，其中n係正整數。第n個分散級可實施於第n螢光活化分選級與第n螢光活化分選級之間及第一級eDAR之後。
在第一eDAR級中，流體試樣進入流動通道。流體試樣可為血樣。流體試樣可為如本文所闡述之任一流體試樣。流體試樣可包括一或多種擬收集粒子。粒子可為罕見粒子。粒子可為細胞。細胞可為罕見細胞。罕見細胞可為癌細胞。癌細胞可為循環腫瘤細胞(CTC)。罕見細胞可為白血球。粒子可為如本文所闡述之任一擬收集粒子。隨著流體試樣流經流動通道之第一區段，流體試樣通過檢測裝置。檢測裝置可連續檢測來自在一系列時間點通過檢測裝置之流體試樣之一系列等分試樣之一系列信號。每一信號可指示給定等分試樣中之擬收集粒子之存在(或不存在)。檢測裝置可為如本文所闡述之任一檢測裝置。
檢測裝置可藉由使用電磁輻射源訊問每一組流體試樣細胞來檢測擬收集粒子之存在。在擬收集粒子存在於藉由檢測裝置訊問之細胞組中時，檢測裝置可檢測電磁輻射與該組細胞中之粒子之相互作用。特定而言，檢測裝置可發射呈光形式之電磁輻射。光可為紫外光、可見光或紅外光。光可具有在以下範圍內之波長：100 nm至400 nm、400 nm至700 nm、700 nm至1,000 nm、1 µm至10 µm、10 µm至100 µm或100 µm至1,000 µm。光可由一或多個發光二極體(LED)或雷射發射。光可由一或多個以下雷射來發射：氣體雷射、準分子雷射、染料雷射、固態雷射、纖維雷射、摻雜纖維雷射、稀土元素摻雜之纖維雷射、半導體雷射、二極體雷射、二極體激升雷射、垂直空腔表面發射雷射(VCSEL)或任何其他雷射。
光可經由任一光學相互作用(例如光學反射、光學透射、彈性光學散射、非彈性光學散射、瑞利散射、拉曼散射、表面增強式拉曼散射、米氏散射、布里淵散射、螢光、自發螢光、雷射誘導螢光、生物發光或化學發光)與粒子相互作用。可藉由使用光學檢測器檢測光學信號來推斷粒子與光之間之光學相互作用，該光學檢測器係(例如)光二極體、光二極體陣列、光倍增器、崩潰光倍增器、照相機、電荷耦合器件(CCD)照相機、互補金屬氧化物半導體(CMOS)照相機、光譜儀、分散式光譜儀、光柵光譜儀、傅裡葉轉變光譜儀(Fourier transform spectrometer)或顯微鏡。檢測裝置可利用如本文所闡述之任一光學檢測技術。
流動通道可分成兩個通道。一個通道(展示於圖18A右側)可構成廢物通道。在檢測器不能檢測擬收集粒子之存在時，流體試樣可流向廢物通道。另一通道(展示於圖18A左側)可流向如本文所闡述之分散級。在檢測到等分試樣中之粒子時，檢測裝置可向控制器(未展示)發送信號以激活流動切換機構(未展示)來切換流動方向，從而含有擬收集粒子之等分試樣流向分散級。流動切換機構可包括電磁閥(未展示)。在擬收集粒子已移動通過流動通道與通向分散級之通道之間之接面後，流動切換機構可立即將流動方向切換回廢物通道。可(例如)藉由將第二檢測裝置(未展示)置於接面與分散級之間來檢測擬收集粒子通過接面之移動。以此方式，僅含有擬收集粒子之較小流體等分試樣可流向分散級。
在分散級中，可對含有擬收集粒子之等分試樣或流體體積實施伸展。伸展可增加含有擬收集粒子之等分試樣或流體體積中之擬收集粒子與其他粒子之間的平均距離。可藉由本文所闡述之任一伸展方法來達成伸展。舉例而言，如本文所闡述，可藉由以下方式來達成伸展：等分試樣或流體體積穿過直線通道之流動、等分試樣或流體體積穿過流動伸展體之流動、等分試樣或流體體積穿過魚骨狀伸展體之流動、等分試樣或流體體積穿過與直線通道組合之魚骨狀伸展體之流動、等分試樣或流體體積穿過多個流動路徑之流動、等分試樣或流體體積穿過與多個流動路徑組合之魚骨狀伸展體之流動、等分試樣或流體體積穿過與多個流動路徑組合之直線通道之流動或等分試樣或流體體積穿過堰伸展體之流動。可藉由等分試樣或流體體積穿過微通道之抛物線型流動、魚骨狀混合或經由多個流動路徑來賦予伸展，如本文所闡述。
在分散級中之流動伸展後，含有擬收集粒子之等分試樣或流體體積可流向第二級螢光活化分選。第二級螢光活化分選可經構形以類似於第一eDAR級。第二級螢光活化分選可與第一eDAR級相同。第二eDAR級可不同於第一eDAR級；舉例而言，第二級可分選流體體積中之複數個粒子或細胞，其中複數個粒子或細胞隨機分佈於整個流體體積中(例如如等分試樣中之情形)；或第二級可分選流體體積中之一組細胞，其中複數個粒子或細胞並不隨機分佈於整個流體體積中(例如如分離試樣或分散試樣中之情形)。第二級螢光活化分選可利用如本文關於第一eDAR級所闡述之任一分離方法。第二級螢光活化分選可將擬收集粒子濃縮成小於藉由第一eDAR級所產生之等分試樣之體積。以此方式，與藉由第一eDAR級產生之等分試樣相比，第二級螢光活化分選可進一步增加含有擬收集粒子之等分試樣或流體體積之純度。
儘管圖18A闡述包括第一eDAR級以及隨後之第二級螢光活化分選及一個分散級之裝置，但所研發原理可用於產生利用以下級之裝置：在第一eDAR級後具有兩個螢光活化分選級及兩個分散級、在第一eDAR級後具有三個螢光活化分選級及三個分散級、在第一eDAR級後具有4個螢光活化分選級及4個分散級或在第一eDAR級後具有n個螢光活化分選級及n個分散級，其中n係正整數。
圖18B展示根據一些實施例操作在第一eDAR級後具有多個螢光活化分選及分散級之裝置之方法。在第一步驟中，試樣流入具有具有第一緩衝液流(在圖18B中表示為「L」)及第二緩衝液流(在圖18B中表示為「R」)之接面中。第一緩衝液流及第二緩衝液流可包括任一緩衝液。舉例而言，第一緩衝液流及第二緩衝液流可包括水性緩衝液。第一緩衝液流及第二緩衝液流可包括有機緩衝液。第一緩衝液流及第二緩衝液流可包括兩性離子緩衝液。第一緩衝液流及第二緩衝液流可包括細胞生長培養基。第一緩衝液流及第二緩衝液流可包括最低細胞生長培養基。第一緩衝液流及第二緩衝液流可包括相同緩衝液。第一緩衝液流及第二緩衝液流可包括不同緩衝液。
在檢測擬收集粒子(例如於非靶細胞群體中之靶細胞，例如循環腫瘤細胞或於紅血球及/或白血球之群體中之白血球)之前，可選擇第一緩衝液流及第二緩衝液流之流速，從而試樣流向廢物通道。舉例而言，第一緩衝液流之流速可選擇高於第二緩衝液流之流速。
在第二步驟中，可藉由檢測裝置檢測擬收集粒子。檢測裝置可為如本文所闡述之任一檢測裝置。檢測裝置可為如本文所闡述之光學檢測裝置。
在第三步驟中，在檢測到擬收集粒子時，可打開流體切換閥門。可藉由改變第一緩衝液流或第二緩衝液流之流速來打開流體切換閥門。可降低第一緩衝液流之流速，從而流體試樣流離廢物通道且流向分散級。可增加第二緩衝液流之流速，從而流體試樣流離廢物通道且流向分散通道。
在第四步驟中，可關閉流體切換閥門(例如藉由改變第一緩衝液流或第二緩衝液流之流速以與在打開流體切換閥門之前具有相同流速)。此可使得流體試樣再次流向廢物通道。以此方式，可形成流體試樣(含有擬收集粒子)之小等分試樣或流體體積且流向分散級。流體切換閥門可在打開之後不久即關閉。可因應於藉由位於下游之第二檢測裝置檢測到擬收集粒子而關閉流體切換閥門。流體切換閥門可在預定量時間之後(例如在自檢測裝置至廢物通道之計算流動時間之後)關閉。流體切換閥門可在小於1 ms、小於2 ms、小於5 ms、小於10 ms、小於20 ms、小於50 ms、小於100 ms、小於200 ms、小於500 ms或小於1,000 ms之時段之後關閉。流體切換閥門可在由任兩個前述值界定之範圍內之時段之後關閉。
在第五步驟中，可藉由如本文所闡述之分散級伸展含有擬收集粒子之等分試樣或流體體積。伸展等分試樣或流體體積可使得增加等分試樣或流體體積中之擬收集粒子與非靶粒子與之間之平均間隔。可藉由本文所闡述之任一伸展裝置或方法來伸展等分試樣或流體體積。
在第六、第七及第八及第九步驟中，可藉由第二螢光活化分選級進一步分選經伸展等分試樣或流體體積。第六步驟可類似於第一步驟。第七步驟可類似於第二步驟。第八步驟可類似於第三步驟。第九步驟可類似於第四步驟。在第二螢光活化分選級後，可以小於在第一eDAR級後所產生等分試樣之等分試樣或流體體積來收集擬收集粒子。可在第二螢光活化分選級下游收集等分試樣或流體體積。舉例而言，可使等分試樣或流體體積流向孔板(例如96孔板)以用於收集。可使等分試樣或流體體積流向小瓶以用於收集。可使等分試樣或流體體積流向過濾體積以用於收集。
關於圖18B所闡述之方法可擴展至包含第二分散級及第三螢光活化分選級。第二分散級可實施類似於本文所闡述之第五步驟之步驟。第三螢光活化分選級可實施類似於本文所闡述之第六、第七、第八及第九步驟之步驟。關於圖18B所闡述之方法可擴展至包含第三分散級及第四螢光活化分選級。第三分散級可實施類似於本文所闡述之第五步驟之步驟。第四螢光活化分選級可實施類似於本文所闡述之第六、第七、第八及第九步驟之步驟。關於圖18B所闡述之方法可擴展至包含第四分散級及第五螢光活化分選級。第四分散級可實施類似於本文所闡述之第五步驟之步驟。第五螢光活化分選級可實施類似於本文所闡述之第六、第七、第八及第九步驟之步驟。一般而言，關於圖18B所闡述之方法可擴展至包含第n分散級及第(n+1)螢光活化分選級，其中n係正整數。第n分散級可實施類似於本文所闡述之第五步驟之步驟。第(n+1)螢光活化分選級可實施類似於本文所闡述之第六、第七、第八及第九步驟之步驟。
基於關於圖18B所闡述方法之許多變化、改變及改編係可能的。舉例而言，可改變關於圖18B所闡述方法之步驟順序，去除一些步驟，重複一些步驟，且在適當時添加其他步驟。可連續實施一些步驟。可並行實施一些步驟。可實施一些步驟一次。可實施一些步驟一次以上。一些步驟可包括子步驟。一些步驟可自動進行且一些步驟可人工進行。如本文所闡述之處理器可包括一或多個指令以實施關於圖18B所闡述方法之一或多個步驟之至少一部分。粒子捕獲及收集
在兩級分選(且視情況經受一或多個分散操作)期間分離一或多種粒子(例如細胞，例如靶細胞)且/或濃縮之後，可使用過濾元件捕獲或收集粒子(例如如圖7A及圖29A-圖31中所展示)。舉例而言，可在多級分選之後使用過濾元件自一或多個粒子或一或多種類型粒子純化複數個粒子(例如靶細胞)。在一些情形下，濃縮複數個粒子以減小其中存在複數個粒子之流體體積之最終體積。
現參照圖29A及29B，可將包括一或多種粒子(例如靶細胞)之流體體積引入過濾區中(例如在通過第二分選級之後)。可使用過濾區來進一步分離存在於流體體積中之一或多種靶粒子與一或多種非靶粒子或予以純化。
過濾區可包括與輸出通道或第二分選級之流動路徑流體連通之輸入流動路徑。過濾區可進一步包括具有一或多個孔口(例如狹縫、微狹縫、孔隙、微孔隙或間隙)之過濾元件。在一些情形下，一或多個孔口(或狹縫、孔隙或間隙)之至少一個尺寸可經定大小以防止粒子通過孔口到達位於過濾器之相對側(例如過濾器之下游側)之濾液區。舉例而言，一或多個孔口(或狹縫、孔隙或間隙)可具有經定大小以防止靶細胞通過孔口之寬度、高度、直徑或橫截面面積。在一些情形下，孔口尺寸小於靶細胞之直徑或半徑以防止靶粒子通過孔口。在一些情形下，孔口尺寸經定大小以容許一或多種非靶粒子通過孔口(同時變形或未變形)，而不允許粒子完整通過孔口(同時變形或未變形)。可藉由以下方式藉由過濾區之過濾元件(例如如圖29A及29B中所展示)來捕獲靶粒子(例如靶細胞)：向包括靶粒子之流體體積施加流體壓力(例如來自上游流動路徑，例如輸入來自第二分選級或一或多個在過濾元件上游側連結至過濾區之其他上游流動路徑)，從而使靶粒子與過濾器接觸(例如附著)且防止其通過過濾器孔口(例如因孔口之大小及/或形狀)。
濾液區可連結至相對於來自過濾區分選級上游之輸入流動路徑在過濾器之相對側之一或多個流動路徑。在一些情形下，連結至輸入流動路徑之過濾器相對側之過濾區之流動路徑可包括輸出通道(例如主要流體出口)。在通過過濾器之後，非靶細胞可通過此一輸出通道並到達收集小瓶或到達廢物貯器。舉例而言，圖29A展示通過孔口之白血球(WBC)，該孔口之寬度小於細胞直徑(例如藉由使WBC因過濾元件中之流體壓力差而變形)。圖29亦展示通過孔口之直徑小於孔口寬度之紅血球(RBC)。因孔口寬度相對於CTC直徑之大小及/或CTC可變形性，循環腫瘤細胞(CTC；例如靶細胞)不能通過孔口。
在一些情形下，連結至輸入流動路徑之過濾器相對側之過濾區之流動路徑可為流體輸入通道。舉例而言，可經由過濾區之過濾元件之流動路徑下游將額外流體注入過濾區中(例如如圖29A及圖29B中所展示)。
在一些情形下，向過濾元件施加下游流體壓力(例如藉由經由過濾元件之流動路徑下游將流體注入過濾區)可使得一或多種粒子(例如靶粒子)自過濾元件釋放(例如變得與過濾元件不附著)。
可經由額外流體將複數個珠粒引入過濾區中，該額外流體係經由連結至過濾元件下游側之過濾區之流動路徑所注入。如圖29B中所展示，珠粒(其可為剛性珠粒)可附著至過濾元件之一或多個孔口且阻斷穿過一或多個孔口之流動。在一些情形下，一或多個珠粒與過濾區之過濾元件之一或多個孔口之附著可改變過濾元件中的壓力差，且使得一或多種靶粒子自過濾元件釋放(例如變得脫離)。在一些情形下，一或多個珠粒與過濾元件之一或多個孔口之附著可使得增加穿過過濾元件之一或多個孔口的逆行性流體流動(例如自過濾器下游側至過濾期上游側之流體流動)，此可有助於自過濾元件之上游側釋放一或多種靶粒子。在一些情形下，一或多個珠粒與過濾元件之一或多個孔口之附著可使得降低過濾元件中之壓力差，此可有助於自過濾元件之上游側釋放一或多種靶粒子。
在自過濾元件上游側之過濾元件釋放粒子或複數個粒子之後，粒子或複數個粒子可流經與收集小瓶或收集區流體連通之流動路徑(例如出口流動路徑) (例如如圖29A及圖31中所展示)。
在一些情形下，在通過分選級之後、在捕獲並釋放於過濾區中之後及/或在收集之前，粒子可濃縮於流體體積中。可藉由操作閥門(例如藉由電腦控制)以容許較小體積包括粒子之流體體積通過流動路徑來將粒子濃縮於流體體積中。舉例而言，閥門可用於藉由僅打開短暫時間段以容許靶粒子通過閥門位置之流動路徑來將粒子濃縮於流體體積中。在一些情形下，每次打開閥門時，閥門可僅打開2-3毫秒、2至20毫秒或20毫秒至50毫秒，且可容許1至3毫微升、3至5毫微升、5至10毫微升、10至20毫微升或20至30毫微升通過流動路徑。閥門可為電磁閥，其可用於濃縮粒子，此乃因其可在極短之可重現時間段內(例如2-3毫秒、2毫秒至20毫秒或20毫秒至50毫秒)打開及關閉。
可藉由電腦控制閥門之開口及/或關閉。舉例而言，在連結至電腦之檢測器檢測到靶粒子時，可打開用於將粒子濃縮於流體體積中之閥門。藉由僅在檢測到靶粒子時打開閥門，可容許最小量流體與容許通過流動路徑之每一靶粒子一起穿過流動路徑。
如圖30A-30C中所展示，閥門可為在線閥門、雙向夾管閥或外部閥門。在線閥門或雙向夾管閥可整合至微流體晶片中。外部閥門可連結至微流體晶片(例如藉由緊固件)。在一些情形下，可自微流體晶片去除外部閥門。外部閥門在關閉時可藉由夾斷流動路徑(例如管道長度)來進行操作。
如圖30C中所展示，包括閥門(例如收集閥門)之流動路徑可與第二分選級之出口、微流體晶片(例如微流體分選晶片)及/或收集管道之長度流體連通。在一些情形下，在所分選粒子存在於第二分選級與收集閥門之間之流動路徑中(例如在微流體晶片之一或多個流動路徑中或在第二分選級與收集閥門之間之管道中)時，收集閥門可與流動路徑斷開且流動路徑(例如先前連結至收集閥門之管道)可與收集小瓶流體連通。在流動路徑連結至收集小瓶之後，流動路徑中之分選粒子可流入收集小瓶中。
現參照圖31，過濾區可包括可用於被動減小包括一或多種靶粒子之流體體積之體積之結構。過濾區可包括與第二分選級之出口流體連通且與粒子收集區或結構(例如收集小瓶)流體連通之輸入流動路徑或通道。連結第二分選級之出口與粒子收集區之流動路徑可包括一或多個具有複數個孔口3120 (或狹縫、微狹縫、孔隙、微孔隙或間隙)之過濾元件3110，該等孔口之尺寸(例如寬度、高度、直徑或橫截面)經定大小以便不允許一或多種靶粒子完整通過孔口，而流體及視情況一或多種非靶粒子則能夠通過孔口。過濾區可包括一或多個濾液區3130，該濾液區相對於連結第二分選級與粒子收集區或結構之流動路徑位於過濾元件3110之相對側。濾液區可與一或多個流體出口(例如與出口或廢物流體連通之流動路徑)流體連通。
經由向流動路徑之上游端施加流體壓力(例如在過濾區之輸入流動路徑或通道處或上游施加流體壓力)，自第二分選級引入過濾區中之流體體積中之一或多種粒子可與過濾元件3110接觸(例如附著)。此流體壓力可使得一部分包括一或多種粒子之流體體積通過過濾元件3110之孔口進入濾液區3130中。在一些情形下，流體體積部分跨越過濾元件3110之此移動可使得包括一或多種粒子之流體體積之大小有所降低。在一些情形下，一部分流體體積移動跨越過濾元件3110可使得一或多種粒子(例如一或多種非靶粒子)通過過濾元件3110之一或多個孔口3120到達濾液區3130。在一些情形下，毛細管力及/或濾液區3130與連結第二分選級與收集區之流動路徑之間之體積差可足以使得一部分流體體積及/或一或多種粒子(例如非靶粒子)移動跨越過濾元件3110到達濾液區3130 (例如經由過濾元件3110之一或多個孔口3120)。標記物 / 生物標記物
該方法提供複數個可由分析物(例如捕集粒子)表現、位於其上或其附近之生物標記物。可藉由本發明檢測之複數個生物標記物經受數輪可實施於捕集粒子之免疫染色及光漂白。每輪免疫染色可包含0個標籤、1個標籤、2個標籤、3個標籤、4個標籤、5個標籤、6個標籤、7個標籤、8個標籤、9個標籤或10個標籤。每一輪免疫染色之標籤範圍可包含1-10個標籤(例如4個)。
在一些態樣中，藉由由標籤發射之信號來指示標記物(例如生物標記物)之存在，其中標籤對標記物具有親和力。如本文中所使用，片語「對……具有親和力」在廣義上涵蓋標籤對標記物之直接分子結合親和力以及間接親和力(例如標籤及標記物能夠經由涉及一或多種其他結構之分子複合物發生相互作用)。舉例而言，在一些態樣中，標籤可為對標記物具有直接親和力之一級抗體，而在其他態樣中，標籤可為對標記物具有間接親和力之二級抗體。
在一些態樣中，根據特定標記物或生物標記物特徵來分離細胞，從而給定細胞展現獨特及/或可鑑別之標記物或生物標記物特徵。在某些態樣中，標記物或生物標記物特徵係一或多種、兩種或更多種、三種或更多種、4種或更多種、5種或更多種、6種或更多種、7種或更多種、8種或更多種、9種或更多種或10種或更多種標記物或生物標記物之特定組合，其可用於定義及鑑別細胞或細胞類型。在一些態樣中，可使用標記物或生物標記物特徵將細胞鑑別為具有一組特定性質之特定細胞群體之部分。
在一些態樣中，生物標記物係細胞外生物標記物。在其他情形下，生物標記物可為細胞內、細胞質、細胞質內、細胞表面、細胞核外、細胞核內、溶酶體、粒線體、內質網狀生物標記物及諸如此類。在其他情形下，生物標記物可附接至粒子但並不貫穿粒子。
在一些態樣中，生物標記物可為胺基酸、肽、多肽、蛋白質、變性蛋白。在該等情形下，結構可為天然或變性結構。
在一些態樣中，生物標記物可為核酸、寡核酸、核糖核酸、轉移核糖核酸、信使核糖核酸、微小核糖核酸或去氧核糖核酸。在該等情形下，酸可為單鏈或雙鏈。
在其他情形下，罕見粒子可為細胞、蛋白質、蛋白質複合物、核酸、核蛋白複合物、碳水化合物、代謝物、分解代謝物及諸如此類。在一些態樣中，罕見粒子係細胞。在一些態樣中，細胞可為癌細胞、循環腫瘤細胞(CTC)、癌症幹細胞、顯示癌症表面抗原(例如選自由CD44、CD2、CD3、CD10、CD14、CD16、CD24、CD31、CD45、CD64、CD140b或其組合組成之群者)之癌細胞。。
在一些態樣中，細胞係胎兒細胞。在一些態樣中，胎兒細胞可位於母液中。母液可包含全血、分餾血、血清、血漿、汗液、淚液、耳流、痰、淋巴液、骨髓懸浮液、淋巴液、尿、唾液、精液、經液、糞便、經子宮頸灌洗液、腦脊髓液、腦液、腹水液、乳液、玻璃體液、水狀液、皮脂、內淋巴液、腹膜液、胸膜液、耳垢、心外膜液以及呼吸道分泌液、腸道分泌液及泌尿生殖道分泌液。
在一些態樣中，分析物係未連結至其他細胞或細胞外基質或包埋於組織內之解離細胞。
在一些態樣中，可藉由灌注其他選擇性結合至生物標記物(其可包含(但不限於) CD44、CD2、CD3、CD10、CD14、CD16、CD24、CD31、CD45、CD64、CD140b或CD166)之試劑來區分癌症幹細胞與普通癌細胞。
舉例而言，標籤可經設計以檢測EGFR及CD166之表現，從而顯示腫瘤細胞之間質特性。可在此組中使用其他相關標記物，例如波形蛋白及鈣黏蛋白。
在其他情形下，可使用指示粒子存活性之生物標記物。在該等情形下，可使用指示細胞凋亡、壞死、有絲分裂、有絲分裂階段、減數分裂及諸如此類之生物標記物。
在一些態樣中，每一組標記物可包含核染色劑(Hoechst) (作為陽性對照生物標記物)、與FITC偶聯之CD45 (作為陰性對照生物標記物)及兩種與PE或Alexa 647偶聯之蛋白質生物標記物。在一些態樣中，Hoechst染色劑不能進行光漂白。在此情形下，Hoechst係陽性對照。在此情形下，Hoechst不能使用標準光源進行光漂白。在此情形下，可使用UV暴露來漂白染色劑。試樣
在本文所提供之揭示內容中，試樣可包含流體試樣。流體試樣可源自各種來源。在一些態樣中，來源可為人類、哺乳動物、動物、微生物、細菌、真菌、酵母、病毒、齧齒類動物、昆蟲、兩棲動物及魚。
本發明中所提供之流體試樣可為可或可不含有所關注罕見粒子之液體。在一些態樣中，試樣可為(例如)來自湖、河、海洋、池塘、溪流、泉、沼澤、水庫或諸如此類之環境流體試樣。在其他情形下，試樣可為(例如)來自去鹽工廠、水處理工廠、水庫、泉、溪流、冰川水流、水塔或其他可涵蓋作為飲用水來源之水源之水試樣。
在一些態樣中，本發明提供分析物，包含係罕見粒子之分析物。罕見粒子可為以低含量存在於流體試樣中之細胞或大分子。在某些態樣中，罕見粒子可為細胞、蛋白質、蛋白質複合物、核酸、核蛋白複合物、碳水化合物、代謝物、分解代謝物及諸如此類。在某些態樣中，若以佔流體中總粒子群體小於約10%或佔流體中總粒子群體小於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%或更小之濃度存在於流體試樣中，則粒子可視為罕見。在其他情形下，罕見粒子可以小於約1份/103 個流體中總粒子群體或以小於約1份/104 、105 、106 、107 、108 、109 、1010 、1011 、1012 個流體中總粒子群體或更小濃度存在於流體試樣中。在某些態樣中，若以佔流體中總粒子群體小於10%或佔流體中總粒子群體小於9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%或更小之濃度存在於流體試樣中，則粒子可視為罕見。在其他情形下，罕見粒子可以小於1份/103 個流體中總粒子群體或以小於1份/104 、105 、106 、107 、108 、109 、1010 、1011 、1012 個流體中總粒子群體或更小濃度存在於流體試樣中。
在一些態樣中，流體試樣可含有某一百分比之水及/或其他要素。舉例而言，流體試樣可為含有血漿以及其他材料之血液。通常，血漿主要係水且可含有蛋白質、離子、維他命、酶、激素及身體中之其他化學物質。
在一些態樣中，流體試樣可為體液。體液通常係液體中之生物粒子之複雜懸浮液。舉例而言，體液可為血液。在一些態樣中，血液可包含血漿及/或細胞(例如紅血球、白血球、循環罕見細胞)及血小板。在一些態樣中，55%之血液流體體積可為細胞。在一些態樣中，可濃縮血樣，從而至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%之血液係細胞。在一些態樣中，血樣含有消耗一或多種細胞類型之血液。在一些態樣中，血樣含有富集一或多種細胞類型之血液。在一些態樣中，可稀釋血樣，從而至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%之血液係細胞。在一些態樣中，血樣含有異質、均質或近均質細胞混合物。
體液可包含(但不限於)全血、分餾血、血清、血漿、汗液、淚液、耳流、痰、淋巴液、骨髓懸浮液、淋巴液、尿、唾液、精液、經液、糞便、經子宮頸灌洗液、腦脊髓液、腦液、腹水液、乳液、玻璃體液、水狀液、皮脂、內淋巴液、腹膜液、胸膜液、耳垢、心外膜液以及呼吸道分泌液、腸道分泌液及泌尿生殖道分泌液。在一些態樣中，體液可與含有細胞及生物粒子之混合物之各種器官(例如肺)接觸。
在一些態樣中，體液可含有罕見粒子。在一些態樣中，罕見粒子係罕見細胞。罕見細胞可有核或無核。罕見細胞包含(但不限於)表現惡性表型之細胞；胎兒細胞，例如母體末梢血中之胎兒細胞；腫瘤細胞，例如自腫瘤散佈至血液或其他體液中之腫瘤細胞；感染病毒之細胞，例如感染HIV之細胞；經所關注基因轉染之細胞；及存在於患有自體反應病症之個體之末梢血中之T細胞或B細胞之異常亞型。
在一些態樣中，體液可為血液且含有罕見細胞。罕見細胞可為紅血球、白血球(white blood cell)、白血球(leukocyte)、淋巴球、B細胞、T細胞、肥大細胞、單核球、巨噬球、嗜中性球、嗜酸性球、樹突狀細胞、幹細胞、類紅血球、癌細胞、腫瘤細胞或自源自內胚層、中胚層、外胚層或神經脊組織之任一組織分離之細胞。罕見細胞可來自一級來源或來自二級來源(例如細胞系)。
存在於特定體液(例如血液)中之細胞及生物粒子之類型及量可揭示關於生物體健康之資訊。舉例而言，患有癌症之個體可在體液中具有癌細胞。來自患有感染之個體之試樣可含有增加數量之指示感染的免疫細胞(例如淋巴球、嗜中性球、B細胞、T細胞、樹突狀細胞等)或可含有病原性材料(例如微生物細胞或核酸)。來自懷孕女性之試樣可含有指示胎兒之基因型或核型之胎兒細胞。
一些細胞或生物粒子可相對於正常量以罕見量存在於體液中。該等罕見細胞可包含循環腫瘤細胞、癌症幹細胞等。該等細胞可因發生於身體某一區域中之事件(例如癌症)而出現於體液中。細胞可源自含有體液之器官或靠近體液之器官。舉例而言，罕見乳癌細胞可存在於位於乳房腺附近之血液或淋巴液中。在一些態樣中，細胞源自較遠端器官。舉例而言，源自睪丸腫瘤之細胞可存在於自手臂獲取之血樣中。分析
本發明另外提供可藉此實施分析之方法。在一些態樣中，該分析可包含用於訊問等分試樣或流體體積之來源。在其他情形下，其中等分試樣含有可固有地展現化學發光或生物發光之分析物(例如罕見粒子)，該裝置可無需用於訊問等分試樣之來源。
在一些態樣中，分級器件可選自電腦、處理器、控制器、具有積體電路之晶片、電路板、電子元件、軟體、算法或其組合。在一些態樣中，處理器可為數位處理器(例如FGPA、ASIC或RT)。在一些態樣中，電腦自檢測器件接收信號且經由算法來將等分試樣分級。分級器件可基於分級值(例如流體試樣中之罕見粒子之存在、不存在、量、屬性或組成)將等分試樣引導至適當通道中。
在一些態樣中，可分析來自第一檢測器之資訊。可分析來自第一檢測器之資訊且結果可展示分析物係陽性。在一些態樣中，可分析來自檢測器之資訊且結果可展示分析物係陰性。在一些態樣中，分級器件向流體動力學切換元件(例如電磁閥)發送信號(其指示陽性或陰性分析物)以分選分析物。在一些態樣中，可將陽性分析物移動至微流體晶片之獨特通道。在一些態樣中，可將陽性分析物移動至微流體晶片之獨特室。在一些態樣中，可將陽性分析物移動至微流體晶片之廢物室。在一些態樣中，可將陰性分析物移動至微流體晶片之獨特通道。在一些態樣中，可將陰性分析物移動至微流體晶片之獨特室。在一些態樣中，可將陰性分析物移動至微流體晶片之廢物室。在一些態樣中，使陽性分析物與陰性分析物分離。
在一些態樣中，可使用自第二檢測器中繼之資訊實施分析。可使用第二檢測器來證實使用第一檢測器獲得之資訊。在一些態樣中，第二檢測器可位於微流體晶片上。在一些態樣中，第二檢測器可不位於微流體晶片上。在一些態樣中，第二檢測器可自基於藉由第一檢測器檢測之信號分選之細胞獲得信號。在一些態樣中，第二檢測器自分選細胞接收檢測信號且可向電腦發送關於信號之資訊。可使用電腦測定是否分選適當細胞。應用
本發明提供用於各種應用中之方法。在一些態樣中，該方法可診斷或預後個體中與存在流體試樣(例如生物流體，例如血樣)中之罕見粒子有關之病狀。
本文所闡述之方法及裝置可包括一些步驟：(a)使來自個體之生物流體與標籤在適於將標籤轉變成包括該標籤及分析物之複合物之條件下接觸；(b)檢測生物流體之等分試樣中在步驟(a)中形成之複合物之存在或不存在；(c)基於步驟(a)中所形成複合物之存在或不存在向等分試樣分配某一值；及(d)基於所分離等分試樣之分析向個體提供診斷或預後。在一些態樣中，步驟(b)可包括使用輻射源訊問等分試樣並檢測藉由結合至分析物之標籤發射之信號。
在各個態樣中，提供鑑別存在於流體內分析物上之複數個標記物之方法，其中該方法包括：(a)使用輻射源檢測來自第一標籤之信號，其中第一標籤附接至結合至分析物上之第一標記物之第一結構；(b)基於第一標籤之存在分配分析物；(c)減小第一標籤之信號強度；(d)使分析物與結合至第二標記物之第二結構接觸，其中第二結構附接至第二標籤；及(e)檢測第二標籤。
在一些態樣中，步驟(b)之分配係基於第一標籤及第三標籤之存在。在其他態樣中，使用微流體器件來實施步驟(b)之分配。在其他態樣中，步驟(b)之分配及步驟(b)或步驟(e)中之至少一者中之檢測發生於同一微流體器件內。
在各個態樣中，提供檢測存在於分析物上之複數個標記物之方法，該方法包括：使分析物與第一標籤接觸，其中該分析物包括第一標記物且第一標籤對第一標記物具有親和力；檢測藉由第一標籤發射之第一信號，其中第一信號之存在指示第一標記物之存在；基於第一信號之存在來分配包括分析物之流體；減小第一信號之強度；使分析物與第二標籤接觸，其中該分析物包括第二標記物且第二標籤對第二標記物具有親和力；及檢測藉由第二標籤發射之第二信號，其中第二信號之存在指示存在第二標記物。
在一些態樣中，將第一標籤之信號減小50%以上。在某些態樣中，藉由向分析物施加輻射來減小信號強度。在其他態樣中，使用白光來減小信號強度。在其他態樣中，使用雷射來減小信號強度。在其他態樣中，使用發光二極體來減小信號強度。在一些態樣中，藉由向第一標籤施加化學物質來減小信號強度。在某些態樣中，化學物質係還原劑。在其他態樣中，還原劑係二硫蘇糖醇。
在一些態樣中，流體分配係基於第一信號及第三信號之存在。在其他態樣中，使用微流體器件來檢測第一信號、檢測第二信號、分配流體或實施其組合。
在一些態樣中，分析物係細胞。在某些態樣中，細胞係癌細胞。在其他態樣中，癌細胞係罕見細胞。在一些態樣中，分析物係循環腫瘤細胞。在某些態樣中，細胞係細菌細胞、免疫細胞、胎兒細胞、指示在治療之後保留疾病之細胞或幹細胞。在其他態樣中，細胞係罕見細胞，其佔流體中之總細胞群體之小於1%。在某些態樣中，分析物係解離細胞。
在一些態樣中，流體係選自由以下組成之群：全血、分餾血、血清、血漿、汗液、淚液、耳流、痰、淋巴液、骨髓懸浮液、淋巴液、尿、唾液、精液、經液、糞便、經子宮頸灌洗液、腦脊髓液、腦液、腹水液、乳液、玻璃體液、水狀液、皮脂、內淋巴液、腹膜液、胸膜液、耳垢、心外膜液以及呼吸道、腸道及泌尿生殖道分泌液。在某些態樣中，流體係全血。在其他態樣中，流體係經分級分離之全血。
在一些態樣中，第一標籤係螢光團。在其他態樣中，第一標籤係抗體。在其他態樣中，第一標籤係包括核酸之探針。在某些態樣中，該等方法進一步包括使來自第一標籤及第二標籤之信號成像。在一些態樣中，分析物存在於流體中，且流體係較大體積之流體之等分試樣。在其他態樣中，對複數種分析物同時檢測藉由第一標籤發射之第一信號。
在某些態樣中，半自動或自動實施分配。在某些態樣中，藉由整體決策等分試樣分級來實施分配。在一些態樣中，並不使用流式細胞儀來分配分析物。
在其他態樣中，分析物包括複數個標記物。在一些態樣中，複數個標記物中之每一者係生物標記物。在某些態樣中，分析物包括表現特徵，其中表現特徵係藉由複數種標記物來定義。
在其他態樣中，該方法進一步包括使分析物與緩衝液接觸。在另一些態樣中，緩衝液含有固定劑。在某些態樣中，緩衝液含有滲透劑。在其他態樣中，緩衝液係洗滌緩衝液。
在各個態樣中，提供自包括第一細胞類型及第二細胞類型之試樣分離細胞之方法，該方法包括：(a)經由一組管道將試樣引入微流體晶片中，其中微流體晶片包括：(i)至少一個流體通道，其連結至管道組；(ii)檢測器，其經構形以檢測至少一個通道內之細胞信號；及(iii)至少一個室，其流體連結至至少一個通道；(b)使一部分試樣流經檢測器；(c)使用檢測器檢測該部分試樣內第一細胞類型之存在或不存在；(d)若在該部分試樣內檢測到第一細胞類型，將試樣之等分試樣引導至室中，其中等分試樣包括第一細胞類型；及(e)重複步驟(b)、(c)及(d)，由此分離室中之多個等分試樣，從而該室包括大於80%之試樣內第一細胞類型總數量及小於5%之試樣內第二細胞類型總數量。
在各個態樣中，提供自試樣分離細胞之方法，該方法包括：(a)將試樣引入微流體晶片中，其中該試樣包括第一細胞類型及第二細胞類型，且其中微流體晶片包括：通道；檢測器，其經構形以檢測發射於通道內之信號；室，其與通道流體連通；(b)使一部分試樣流經通道，其中該部分包括複數個第一細胞類型、複數個第二細胞類型或其組合；(c)使用檢測器檢測該部分內第一細胞類型之存在或不存在；(d)若第一細胞類型存在於該部分內，則將該部分引導至室中；及(e)重複(b)、(c)及(d)足夠次數，從而該室包括大於80%之存在於試樣內之第一細胞類型總數量及小於5%之存在於試樣內之第二細胞類型總數量。
在一些態樣中，第一細胞類型及第二細胞類型中之至少一者係癌細胞。在某些態樣中，癌細胞係罕見細胞。在其他態樣中，第一細胞類型及第二細胞類型中之至少一者係循環腫瘤細胞。在其他態樣中，第一細胞類型及第二細胞類型中之至少一者係細菌細胞、免疫細胞、胎兒細胞、指示在治療之後保留疾病之細胞或幹細胞。在一些態樣中，第一細胞類型及第二細胞類型中之至少一者係罕見細胞，其佔試樣中之總細胞群體之小於1%。
在一些態樣中，試樣係選自由以下組成之群：全血、分餾血、血清、血漿、汗液、淚液、耳流、痰、淋巴液、骨髓懸浮液、淋巴液、尿、唾液、精液、經液、糞便、經子宮頸灌洗液、腦脊髓液、腦液、腹水液、乳液、玻璃體液、水狀液、皮脂、內淋巴液、腹膜液、胸膜液、耳垢、心外膜液以及呼吸道、腸道及泌尿生殖道分泌液。在某些態樣中，試樣係全血。在其他態樣中，試樣係經分級分離之全血。
在一些態樣中，該室位於微流體晶片外部。在某些態樣中，該室係小瓶、微離心管或孔板中之孔。在其他態樣中，該室與通道經由管道流體連通。在其他態樣中，該室與通道經由毛細管流體連通。
在各個態樣中，提供分離微流體晶片內之流體試樣之等分試樣或流體體積之方法，其中該等分試樣或流體體積包括罕見粒子，該方法包括以下步驟：(a)檢測等分試樣中之罕見粒子之存在或不存在；(b)基於罕見粒子之存在或不存在向等分試樣分配某一值；及(c)基於分配值藉由打開電致動閥門來引導等分試樣之流動，其中電致動閥門位於微流體晶片之外部器件上。在一些態樣中，微流體晶片包括試樣輸入通道、至少兩個輸出通道及至少一個定向流動通道，且其中電致動閥門控制定向流動通道內之流體流動。
在各個態樣中，可藉由電腦之處理器來控制或實施以下步驟：將標籤、試樣(例如包括粒子(例如分析物，其可為(例如)細胞或分子)之試樣)或試樣部分引入通道、微流體晶片或分選器件中，使標籤、試樣或試樣部分流經通道或流動路徑，使試樣或其部分逆轉其流動方向，訊問標籤、試樣或試樣部分(例如藉由操作輻射源)，調節試樣或其部分在流動路徑或通道中之流動，調節流動路徑或通道內之流動輪廓。在各個態樣中，可藉由電腦之處理器來控制以下步驟：操作一或多個檢測器，檢測罕見粒子之存在或不存在，基於罕見粒子之存在或不存在向等分試樣(例如試樣部分，其可包括分析物(例如細胞或分子))分配某一值，使等分試樣或試樣進行分配，對等分試樣實施分離程序(例如基於分配值藉由打開電致動閥門來引導等分試樣之流動)，實施分離程序，操作閥門，捕獲粒子(例如分析物，例如細胞或分子)，釋放粒子(例如分析物)，過濾試樣或其部分，或收集試樣或其部分。疾病診斷
在一些態樣中，可進一步對使用本發明方法分離之分析物(例如細胞)實施亞群體分析(例如根據基因型或表型)以研發靶向治療。舉例而言，可將經分離細胞(例如腫瘤細胞)與結合特定生物標記物(例如藥物靶)之標籤(例如螢光抗體)一起培育以測定藥物靶之存在或表現程度。在證實藥物靶之表現後，可立即選擇經特定研發以靶向特定藥物靶之表現之藥物用於療法中。在一實例中，可將經分離腫瘤細胞與特異性結合Her2受體之螢光抗體一起培育以測定乳房腫瘤脫落CTC是否係Her2-陽性。若經分離腫瘤細胞展現高Her2表現，則可使用赫賽汀(Herceptin) (曲妥珠單抗(trastuzumab))療法，此乃因此藥物經設計以靶向且阻斷HER2蛋白質過度表現之功能。在開出適當化學療法方案之前，亦可類似地自經分離腫瘤細胞篩選其他已知藥物靶，包含BCR-ABL或PDGFR (由藥物Gleevec靶向)、ERBB2 (由赫賽汀靶向)、EFGR (由Iressa、Tarceva靶向)、RAR-α (由ATRA靶向)、雌激素受體(由他莫昔芬(Tamoxifen)靶向)、芳香酶(由來曲唑(Letrazole)靶向)、雄激素受體(由氟他胺(Flutamide)、比卡魯胺(Biclutamide)靶向)、CD20 (由利妥昔單抗(Rituximab)靶向)、VEGF受體(由阿瓦斯丁(Avastin)靶向)。
在一些態樣中，分析物可為罕見粒子(例如癌細胞或循環腫瘤細胞(CTC))。在其他情形下，罕見粒子可為寄生蟲細胞或生物體，例如梨形鞭毛蟲或隱孢子蟲屬、經瘧原蟲屬(Plasmodium )感染之紅血球、經HIV感染之淋巴球或白血球、母血中之胎兒細胞、幹細胞、普里昂蛋白感染細胞、CD4+ T細胞及諸如此類。
在一些態樣中，該方法可包括檢測來自個體之血樣中之循環腫瘤細胞。該方法可包含eDAR。在某些態樣中，個體可為經診斷患有癌症之患者。在一些態樣中，癌症可為階段I、階段II、階段III或階段IV。在一些態樣中，可在來自先前經診斷患有癌症之患者之血樣中檢測到循環腫瘤細胞(CTC)。在該等情形下，患者可另外經診斷患有轉移性癌症。
在一些態樣中，該方法可用於診斷先前經診斷患有實體腫瘤之個體之轉移性癌症，該方法包括以下步驟：(a)檢測個體血樣之等分試樣中之CTC之存在或不存在；(b)基於CTC之存在或不存在向等分試樣分配某一值；及(c)基於分配值來引導等分試樣之流動或收集。
在一些態樣中，血樣中CTC之不存在可代表個體未患有轉移性癌症。血樣中至少一種CTC之存在可代表個體患有轉移性癌症。在一些態樣中，血液中至少諸多CTC之存在可代表個體患有轉移性癌症。該方法可進一步包括步驟(d)：若在血樣中檢測到並無CTC，則將個體診斷為未患有轉移性癌症；或若在血樣中檢測到至少一種CTC，則將個體診斷為患有轉移性癌症。
本發明亦提供監測診經斷患有癌症之個體之方法。該方法可包括使用本文所提供之eDAR方法檢測個體血樣之等分試樣中CTC之存在或不存在。在一些態樣中，可以規則間隔監測患者癌症至轉移性癌症之進展，該規則間隔係(例如)至少每年一次、至少每年兩次、至少每年3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次或至少每年約3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。在一些態樣中，可每月監測個體一次，或每月監測至少2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。在一些態樣中，可每月監測個體約一次，或每月監測至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。血樣中CTC之不存在可代表個體未患有轉移性癌症。血樣中至少一種CTC之存在可代表個體患有轉移性癌症。血液中至少諸多CTC之存在可代表個體患有轉移性癌症。
在檢測血樣中之CTC之情形下，該方法可進一步包括以下步驟：對一或多種鑑別為含有CTC之等分試樣進一步實施分析以鑑別一或多種CTC細胞之一或多種特性。舉例而言，可使含有CTC之等分試樣或等分試樣池與一或多種對一或多種癌症特異性表面抗原具有特異性之檢測試劑接觸。可分析之癌症特異性表面抗原之非限制性實例包含(但不限於) BCR-ABL或PDGFR (由藥物Gleevec靶向)、ERBB2 (由赫賽汀靶向)、EFGR (由Iressa、Tarceva靶向)、RAR-α (由ATRA靶向)、雌激素受體(由他莫昔芬靶向)、芳香酶(由來曲唑靶向)、雄激素受體(由氟他胺、比卡魯胺靶向)、CD20 (由利妥昔單抗靶向)、VEGF-受體(由阿瓦斯丁靶向)及諸如此類。本文所提供之方法及器件可用於診斷除癌症外之疾病。在一些態樣中，可診斷瘧疾，該方法包括檢測經瘧原蟲屬感染之紅血球。 在另一情形下，提供診斷HIV感染之方法，該方法包括使用本文所提供之eDAR方法及/或裝置來檢測經HIV病毒感染之淋巴球或白血球。在又一情形下，提供診斷與普里昂蛋白有關之疾病之方法，該方法包括檢測來自人類或其他動物之生物流體中之普里昂蛋白。
在一些態樣中，分析物係罕見細胞且罕見細胞係細菌細胞。在一些態樣中，細菌細胞存在於全血試樣中。在其他態樣中，使用器件、方法、系統或裝置來檢測全血中罕見細菌細胞之存在。在一些態樣中，使用器件、方法、系統或裝置來檢測全血試樣中罕見細菌細胞之存在以提供與表徵或管控細菌感染或敗血症相關之診斷、預後或其他治療參數。疾病預後
本發明提供預後與流體中分析物之存在有關之疾病或病狀之方法。在一些態樣中，分析物可為生物粒子。在一些態樣中，流體可為生物流體。在一些態樣中，該方法包括以下步驟：(a)檢測個體試樣之等分試樣中分析物之存在或不存在；(b)基於分析物之存在或不存在向等分試樣分配某一值；(c)基於分配值來引導等分試樣之流動或收集；及(d)若在試樣中檢測到不含分析物，則提供良好預後，或若在試樣中檢測到分析物，則提供較差預後。
在一些態樣中，可基於等分試樣中之分析物之量或屬性來向等分試樣分配某一值。在一些態樣中，可基於試樣中之分析物之量來提供良好或較差預後。舉例而言，若試樣中之分析物之量小於預定參考值，則可提供良好預後，且若試樣中之分析物之量等於或大於參考值，則提供較差預後。在一些態樣中，預定參考值可與對特定療法之反應可能性或在一定時間段(例如至少6個月或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更多年)內之整體或無疾病存活可能性有關。
在一些態樣中，本文所提供之方法可用於預後任一與罕見粒子有關之疾病。在一些態樣中，提供預後瘧疾之方法，該方法可包括用本文所提供之eDAR方法及/或裝置測定個體血樣中經瘧原蟲屬感染之紅血球之數量使。在一些態樣中，可提供良好預後(若在血樣中檢測到之經感染紅血球總數小於預定參考值)或較差預後(若在試樣中檢測到之經感染紅血球總數等於或大於參考值)。在一些態樣中，提供預後HIV感染之方法，該方法可包括：使用本文所提供之eDAR方法及/或裝置測定個體血樣中經HIV病毒感染之淋巴球或白血球之數量，及提供良好預後(若在血樣中檢測到之感染細胞總數小於預定參考值)或較差預後(若在試樣中檢測到之感染細胞總數等於或大於參考值)。在一些態樣中，提供預後與普里昂蛋白有關之疾病之方法，該方法可包括：使用本文所提供之eDAR方法及/或裝置測定個體生物流體試樣中之普里昂蛋白數量，及提供良好預後(若在試樣中檢測到之普里昂蛋白總數小於預定參考值)或較差預後(若在試樣中檢測到之普里昂蛋白總數等於或大於參考值)。
在一些態樣中，本發明提供預後診經斷患有實體腫瘤之個體之方法。在一些態樣中，該方法包括以下步驟：(a)檢測個體血樣之等分試樣中CTC之存在或不存在；(b)基於CTC之存在或不存在向等分試樣分配某一值；(c)基於分配值來引導等分試樣之流動或收集；及(d)提供良好預後(若檢測到並無CTC)或較差預後(若檢測到CTC)。
在一些態樣中，提供預後診經斷患有轉移性癌症之個體之方法。在一些態樣中，該方法包括以下步驟：(a)檢測個體血樣之等分試樣中CTC之存在或不存在；(b)基於在等分試樣中檢測到之CTC數量向等分試樣分配某一值；(c)基於分配值來引導等分試樣之流動或收集；及(d)提供良好預後(若在血樣中檢測到之CTC總數小於預定參考值)或較差預後(若在試樣中檢測到之CTC總數等於或大於參考值)。
在一些態樣中，預定參考值可與對特定療法之反應可能性或在一定時間段(例如至少6個月或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更多年)內之整體或無疾病存活可能性有關。疾病對治療之反應
本發明提供監測疾病進展或療法反應之方法。在一些態樣中，該方法可包括檢測流體試樣中之分析物。在一些態樣中，該方法包括以下步驟：(a)檢測在第一時間自個體獲取之第一生物試樣之複數個等分試樣中分析物之存在或不存在；(b)基於罕見粒子之存在、不存在、量或屬性向等分試樣分配某一值；(c)測定來自第一試樣之所有等分試樣之總值；(d)檢測在第二時間自個體獲取之第二生物試樣之複數個等分試樣中分析物之存在或不存在；(e)基於分析物之存在、不存在、量或屬性向等分試樣分配某一值；(f)測定來自第二試樣之所有等分試樣之總值；及(g)比較分配至第一試樣之總值與分配至第二試樣之總值，其中分配至第二試樣之與第一試樣相比之增加值與疾病進展及/或較差療法反應相關且/或分配至第二試樣之與第一試樣相比之降低值與疾病消退及/或良好療法反應相關。在一些態樣中，可基於分配值將等分試樣進一步引導至特定通道或室中(引入)以用於收集、進一步富集或進一步分析。
在一些態樣中，可在診斷疾病或開始治療方案之後規則地採用監測疾病進展或療法反應之方法。舉例而言，可至少每年一次、至少每年兩次、至少每年3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次或至少每年約3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次自個體收集試樣。在一些態樣中，可每月監測個體一次，或每月監測至少2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。在一些態樣中，可每月監測個體約一次，或每月監測至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。
在發現疾病進展或較差療法反應之一些態樣中，該方法可進一步包括以下步驟：分配療法，增加劑量方案，改變治療方案，及諸如此類。在一些態樣中，與罕見粒子有關之疾病或病狀可為癌症、瘧疾、HIV/Aids、普里昂蛋白相關疾病或諸如此類。數位處理器件
在一些實施例中，本文所闡述之平臺、系統、媒體及方法包含數位處理器件或其用途。在其他實施例中，數位處理器件包含實施器件功能之一或多個硬體中心處理單元(CPU)、一般用途圖形處理單元(GPGPU)或場效可程式閘陣列(FPGA)。在其他實施例中，數位處理器件進一步包括經構形以實施可執行指令之操作系統。在一些實施例中，數位處理器件視情況連結電腦網路。在其他實施例中，數位處理器件視情況連結至網際網路，從而其可訪問全球資訊網(World Wide Web)。在其他實施例中，數位處理器件視情況連結至雲端計算基礎結構。在其他實施例中，數位處理器件視情況連結至內部網路。在其他實施例中，數位處理器件視情況連結至數據儲存器件。
根據本文之闡述，適宜數位處理器件包含(藉由非限制性實例方式)伺服器電腦、桌上式電腦、膝上式電腦、筆記本電腦、分筆記本電腦、迷你筆記型電腦、平板電腦、機頂電腦、媒體流器件、手持式電腦、網際網路電器、移動智慧電話、輸入板電腦、個人數位助理、視訊遊戲控制台及媒介。熟習此項技術者將認識到，許多智慧電話適用於本文所闡述之系統。熟習此項技術者亦將認識到，選擇具有可選電腦網路連結性之電視、視訊播放器及數位音樂播放器適用於本文所闡述之系統。適宜輸入板電腦包含熟習此項技術者已知之具有小冊、層片及可摺疊構形者。
在一些實施例中，數位處理器件包含經構形以實施可執行指令之操作系統。操作系統係(例如)軟體(包含程式及數據)，其管控器件硬體且提供服務以用於執行應用。熟習此項技術者將認識到，適宜伺服器操作系統包含(藉由非限制性實例方式) FreeBSD、OpenBSD、NetBSD® 、Linux、Apple® Mac OS X Server® 、Oracle® Solaris® 、Windows Server® 及Novell® NetWare® 。熟習此項技術者將認識到，適宜個人電腦操作系統包含(藉由非限制性實例方式) Microsoft® Windows® 、Apple® Mac OS X® 、UNIX® 及UNIX樣操作系統(例如GNU/Linux® )。在一些實施例中，藉由雲端計算來提供操作系統。熟習此項技術者亦將認識到，適宜移動智慧電話操作系統包含(藉由非限制性實例方式) Nokia® Symbian® OS、Apple® iOS® 、Research In Motion® BlackBerry OS® 、Google® Android® 、Microsoft® Windows Phone® OS、Microsoft® Windows Mobile® OS、Linux® 及Palm® WebOS® 。熟習此項技術者亦將認識到，適宜媒體流器件操作系統包含(藉由非限制性實例方式) Apple TV® 、Roku® 、Boxee® 、Google TV® 、Google Chromecast® 、Amazon Fire® 及Samsung® HomeSync® 。熟習此項技術者亦將認識到，適宜視訊遊戲控制台操作系統包含(藉由非限制性實例方式) Sony® PS3® 、Sony® PS4® 、Microsoft® Xbox 360® 、Microsoft Xbox One、Nintendo® Wii® 、Nintendo® Wii U® 及Ouya® 。
在一些實施例中，器件包含儲存器件及/或記憶體器件。儲存器件及/或記憶體器件係一或多種用於暫時性或永久性儲存數據或程式之物理裝置。在一些實施例中，器件係揮發性記憶體且需要功率來維持所儲存資訊。在一些實施例中，器件係非揮發性記憶體且在數位處理器件未驅動時保留所儲存資訊。在其他實施例中，非揮發性記憶體包括快閃記憶體。在一些實施例中，非揮發性記憶體包括動態隨機存取記憶體(DRAM)。在一些實施例中，非揮發性記憶體包括鐵電隨機存取記憶體(FRAM)。在一些實施例中，非揮發性記憶體包括相變隨機存取記憶體(PRAM)。在其他實施例中，器件係儲存器件，包含(藉由非限制性實例方式) CD-ROM、DVD、快閃記憶體器件、磁碟驅動機、磁帶驅動機、光碟驅動機及基於雲端計算之儲存器。在其他實施例中，儲存器件及/或記憶體器件係器件組合，例如本文所揭示者。
在一些實施例中，數位處理器件包含顯示器來向使用者發送視覺資訊。在一些實施例中，顯示器係陰極射線管(CRT)。在一些實施例中，顯示器係液晶顯示器(LCD)。在其他實施例中，顯示器係薄膜電晶體液晶顯示器(TFT-LCD)。在一些實施例中，顯示器係有機發光二極體(OLED)顯示器。在各個其他實施例中，OLED顯示器係被動矩陣OLED (PMOLED)或主動矩陣OLED (AMOLED)顯示器。在一些實施例中，顯示器係電漿顯示器。在其他實施例中，顯示器係視訊投影機。在其他實施例中，顯示器係器件組合，例如本文所揭示者。
在一些實施例中，數位處理器件包含輸入器件來接收來自使用者之資訊。在一些實施例中，輸入器件係鍵盤。在一些實施例中，輸入器件係指向器件，包含(藉由非限制性實例方式)鼠標、軌跡球、軌跡墊、操縱桿、遊戲控制器或手寫筆。在一些實施例中，輸入器件係觸控螢幕或多觸控螢幕。在其他實施例中，輸入器件係用以捕獲語音或其他聲音輸入之麥克風。在其他實施例中，輸入器件係用以捕獲運動或視覺輸入之攝影機或其他感測器。在其他實施例中，輸入器件係Kinect、Leap Motion或諸如此類。在其他實施例中，輸入器件係器件組合，例如本文所揭示者。
參照圖28，在一特定實施例中，實例性數位處理器件2801經程式化或進一步經構形以操作粒子收集器件。器件2801可調控本發明之粒子收集器件之各個態樣(例如實施處理步驟)。在此實施例中，數位處理器件2801包含中央處理單元(CPU，在本文中亦為「處理器」及「電腦處理器」) 2805，其可為單核或多核處理器或複數個用於平行處理之處理器。數位處理器件2801亦包含記憶體或記憶體位置2810 (例如隨機存取記憶體、唯讀記憶體、快閃記憶體)、電子儲存單元2815 (例如硬碟)、與一或多個其他系統通訊之通訊介面2820 (例如網路配接器)及周邊器件2825 (例如快取記憶體、其他記憶體、數據儲存及/或電子顯示配接器)。記憶體2810、儲存單元2815、介面2820及周邊器件2825經由通訊匯流排(實線) (例如母版)與CPU 2805通訊。儲存單元2815可為用於儲存數據之數據儲存單元(或數據複位器)。數位處理器件2801可在通訊介面2820之輔助下以操作方式耦合至電腦網路(「網路」) 2830。網路2830可為網際網路、網際網路及/或外部網路或與網際網路通訊之內部網路及/或外部網路。網路2830在一些情形下係電信及/或數據網路。網路2830可包含一或多個電腦伺服器，此可使得能夠進行分散式計算，例如雲端計算。網路2830在一些情形下在器件2801之輔助下可實施對等式網路，此可使得器件能夠耦合至器件2801以充當用戶端或伺服器。
繼續參照圖28，CPU 2805可執行機器可讀指令之序列，此可以程式或軟體體現。可將指令儲存在記憶體位置(例如記憶體2810)中。可將指令導向至CPU 2805，該CPU可隨後程式化CPU 2805或以其他方式將CPU 2805構形以實施本發明方法。藉由CPU 2805實施之操作之實例可包含擷取、解碼、執行及回寫。CPU 2805可為電路(例如積體電路)之一部分。在電路中可包含器件2801之一或多個其他組件。在一些情形下，電路係專用積體電路(ASIC)或場效可程式閘陣列(FPGA)。
繼續參照圖28，儲存單元2815可儲存文件(例如驅動程序、庫及保存程式)。儲存單元2815可儲存用戶數據(例如使用者優先權及使用者程式)。在一些情形下，數位處理器件2801可包含一或多個其他外部數據儲存單元，例如位於經由內部網路或網際網路通訊之遠程伺服器上。
繼續參照圖28，數位處理器件2801可經由網路2830與一或多個遠程電腦系統通訊。舉例而言，器件2801可與使用者之遠程電腦系統通訊。遠程電腦系統之實例包含個人電腦(例如可攜式PC)、層片PC或輸入板PC (例如Apple® iPad、Samsung® Galaxy Tab)、電話、智慧電話(例如Apple® iPhone、啟用Android之器件、Blackberry®)或個人數位助理。
如本文所闡述之方法可藉助儲存於數位處理器件2801之電子儲存位置上(例如於記憶體2810或電子儲存單元2815上)之機器(例如電腦處理器)可執行代碼來實施。機器可執行或機器可讀代碼可以軟體形式提供。在使用期間，可藉由處理器2805執行代碼。在一些情形下，可自儲存單元2815檢索代碼並將其儲存於記憶體2810上以供處理器2805就緒存取。在一些情形下，可消除電子儲存單元1315，且機器可執行指令係儲存於記憶體2810上。非暫時性電腦可讀儲存媒體
在一些實施例中，本文所揭示之平臺、系統、媒體及方法包含一或多個非暫時性電腦可讀儲存媒體，該等媒體經包含可藉由視情況網路連接之數位處理器件之操作系統執行之指令的程式編碼。在其他實施例中，電腦可讀儲存媒體係數位處理器件之有形組件。在其他實施例中，可視情況自數位處理器件去除電腦可讀儲存媒體。在一些實施例中，電腦可讀儲存媒體包含(藉由非限制性實例方式) CD-ROM、DVD、快閃記憶體器件、固態記憶體、磁碟驅動機、磁帶驅動機、光碟驅動機、雲端計算系統及服務及諸如此類。在一些情形下，程式及指令係永久性、實質上永久性、半永久性或非暫時性地編碼於媒體上。電腦程式
在一些實施例中，本文所揭示之平臺、系統、媒體及方法包含至少一種電腦程式或其用途。電腦程式包含可執行於數位處理器件之CPU中且經書寫以實施指定任務之指令序列。電腦可讀指令可實施為實施特定任務或實施特定抽象數據類型之程式模組，例如函數、物件、應用程式化介面(API)、數據結構及諸如此類。鑒於本文所提供之揭示內容，熟習此項技術者將認識到，電腦程式可以各種語言之各種版本來書寫。
可視需要在各種環境中組合或分散電腦可讀指令之功能性。在一些實施例中，電腦程式包括一個指令序列。在一些實施例中，電腦程式包括複數個指令序列。在一些實施例中，電腦程式係自一個位置提供。在其他實施例中，電腦程式係自複數個位置提供。在各個實施例中，電腦程式包含一或多個軟體模組。在各個實施例中，電腦程式包含(部分地或全部)一或多個網頁應用程式、一或多個行動應用程式、一或多個獨立應用程式、一或多個網頁瀏覽器插件、擴展項、增益集或附加項或其組合。網頁應用
在一些實施例中，電腦程式包含網頁應用。鑒於本文所提供之揭示內容，熟習此項技術者將認識到，在各個實施例中，網頁應用利用一或多個軟體框架及一或多個資料庫系統。在一些實施例中，網頁應用係產生於軟體框架(例如Microsoft® .NET或Ruby on Rails (RoR))上。在一些實施例中，網頁應用利用一或多個包含(藉由非限制性實例方式)關聯式資料庫系統、非關聯式資料庫系統、物件導向式資料庫系統、相關式資料庫系統及XML資料庫系統之資料庫系統。在其他實施例中，適宜關聯式資料庫系統包含(藉由非限制性實例方式) Microsoft® SQL伺服器、mySQL™及Oracle® 。熟習此項技術者亦將認識到，在各個實施例中，網頁應用係以一或多種語言之一或多種版本來書寫。可以一或多種以下語言來書寫網頁應用：標記語言、報告定義語言、用戶端腳本語言、伺服器端編碼語言、資料庫查詢語言或其組合。在一些實施例中，在一定程度上以標記語言(例如超文本標記語言(Hypertext Markup Language，HTML)、可擴展超文本標記語言(Extensible Hypertext Markup Language，XHTML)或可擴展標記語言(eXtensible Markup Language，XML))來書寫網頁應用。在一些實施例中，在一定程度上以報告定義語言(例如級聯樣式表(Cascading Style Sheet，CSS))來書寫網頁應用。在一些實施例中，在一定程度上以用戶端腳本語言(例如Asynchronous Javascript and XML (AJAX)、Flash® Actionscript、Javascript或Silverlight® )來書寫網頁應用。在一些實施例中，在一定程度上以伺服器端編碼語言(例如主動伺服器頁(Active Server Page，ASP)、ColdFusion® 、Perl、Java™、JavaServer Pages (JSP)、Hypertext Preprocessor (PHP)、Python™、Ruby、Tcl、Smalltalk、WebDNA® 或Groovy)來書寫網頁應用。在一些實施例中，在一定程度上以資料庫查詢語言(例如結構化查詢語言(Structured Query Language，SQL))來書寫網頁應用。在一些實施例中，網頁應用納入企業伺服器產品，例如IBM® Lotus Domino® 。在一些實施例中，網頁應用包含媒體播放器元件。在各個其他實施例中，媒體播放器元件利用許多適宜多媒體技術中之一或多者，包含(藉由非限制性實例方式) Adobe® Flash® 、HTML 5、Apple® QuickTime® 、Microsoft® Silverlight® 、Java™及Unity® 。移動應用
在一些實施例中，電腦程式包含經提供以移動數位處理器件之移動應用。在一些實施例中，在製造時向移動數位處理器件提供移動應用。在其他實施例中，經由本文所闡述之電腦網路向移動數位處理器件提供移動應用。
鑒於本文所提供之揭示內容，藉由熟習此項技術者已知之技術使用業內已知之硬體、語言及研發環境來產生移動應用。熟習此項技術者將認識到，以若干語言來書寫移動應用。適宜程式化語言包含(藉由非限制性實例方式) C、C++、C#、Objective-C、Java™、Javascript、Pascal、Object Pascal、Python™、Ruby、VB.NET、WML及XHTML/HTML (含有或不含CSS)或其組合。
適宜移動應用研發環境可自若干來源獲得。市售研發環境包含(藉由非限制性實例方式) AirplaySDK、alcheMo、Appcelerator® 、Celsius、Bedrock、Flash Lite、.NET Compact Framework、Rhomobile及WorkLight Mobile Platform。可免費獲得其他研發環境，包含(藉由非限制性實例方式) Lazarus、MobiFlex、MoSync及Phonegap。同樣，移動器件製造商分發軟體研發套組，該等軟體研發套組包含(藉由非限制性實例方式) iPhone及 iPad (iOS) SDK、Android™ SDK、BlackBerry® SDK、BREW SDK、Palm® OS SDK、Symbian SDK、webOS SDK及Windows® Mobile SDK。
熟習此項技術者將認識到，若干商業論壇可用於分發移動應用，該等移動應用包含(藉由非限制性實例方式) Apple® App商店、Google® Play、Chrome WebStore、BlackBerry® App World、用於掌上器件之App商店、用於webOS之App目錄、Windows® 移動商場、用於Nokia® 器件之Ovi商店、Samsung® App及Nintendo® DSi商店。獨立應用
在一些實施例中，電腦程式包含獨立應用，該應用係作為獨立電腦過程而非現有過程之附加項(例如非插件)運行之程式。熟習此項技術者將認識到，通常編譯獨立應用。編譯器係將以程式化語言書寫之源代碼轉變成二進制目標代碼(例如匯編語言或機器代碼)之電腦程式。適宜經編譯程式化語言包含(藉由非限制性實例方式) C、C++、Objective-C、COBOL、Delphi、Eiffel、Java™、Lisp、Python™、Visual Basic及VB .NET或其組合。通常至少地部分實施編譯以產生可執行程式。在一些實施例中，電腦程式包含一或多個可執行編譯應用。網頁瀏覽器插件
在一些實施例中，電腦程式包含網頁瀏覽器插件(例如擴展項等)。在計算時，插件係一或多個增加較大軟體應用之特定功能性之軟體組件。軟體應用之製造商支持插件，以使得第三方研發者能夠創建擴展應用程式之能力，支持容易地添加新特徵，及減小應用程式之大小。在支持時，插件使得能夠設定軟體應用之功能性。舉例而言，插件通常用於網頁瀏覽器中以播放視訊，生成相互作用，掃描病毒，且顯示特定文件類型。熟習此項技術者熟知若干網頁瀏覽器插件，包含Adobe® Flash® 播放器、Microsoft® Silverlight® 及Apple® QuickTime® 。在一些實施例中，工具欄包括一或多個網頁瀏覽器擴展項、增益集或附加項。在一些實施例中，工具欄包括一或多個瀏覽器欄、工具帶或桌面帶。
鑒於本文所提供之揭示內容，熟習此項技術者將認識到，可利用使得能夠以各種程式化語言研發插件之若干插件框架，該等程式化語言包含(藉由非限制性實例方式) C++、Delphi、Java™、PHP、Python™及VB .NET或其組合。
網頁瀏覽器(亦稱為網際網路瀏覽器)係經設計以與連結網路之數位處理器件一起用於檢索、呈現及遍歷全球資訊網上之資訊資源之軟體應用。適宜網頁瀏覽器包含(藉由非限制性實例方式) Microsoft® Internet Explorer® 、Mozilla® Firefox® 、Google® Chrome、Apple® Safari® 、Opera Software® Opera® 及KDE Konqueror。在一些實施例中，網頁瀏覽器係移動網頁瀏覽器。移動網頁瀏覽器(亦稱為微瀏覽器、迷你瀏覽器及無線瀏覽器)經設計以用於移動數位處理器件(包含(藉由非限制性實例方式)手持式電腦、輸入板電腦、迷你筆記型電腦、分筆記本電腦、智慧電話、音樂播放器、個人數位助理(PDA)及手持式視訊遊戲系統)上。適宜移動網頁瀏覽器包含(藉由非限制性實例方式) Google® Android® 瀏覽器、RIM BlackBerry® 瀏覽器、Apple® Safari® 、Palm® Blazer、Palm® WebOS® 瀏覽器、移動Mozilla® Firefox® 、Microsoft® Internet Explorer® Mobile、Amazon® Kindle® 基礎網路、Nokia® 瀏覽器、Opera Software® Opera® Mobile及Sony® PSP™瀏覽器。軟體模組
在一些實施例中，本文所揭示之平臺、系統、媒體及方法包含軟體、伺服器及/或資料庫模組或其用途。鑒於本文所提供之揭示內容，藉由熟習此項技術者已知之技術使用業內已知之機器、軟體及語言來產生軟體模組。以多種方式來實施本文所揭示之軟體模組。在各個實施例中，軟體模組包括文件、代碼區段、程式化物件、程式化結構或其組合。在其他各個實施例中，軟體模組包括複數個文件、複數個代碼區段、複數個程式化目標、複數個程式化結構或其組合。在各個實施例中，一或多個軟體模組包括(藉由非限制性實例方式)網頁應用、移動應用及獨立應用。在一些實施例中，軟體模組位於一個電腦程式或應用中。在其他實施例中，軟體模組位於一個以上電腦程式或應用中。在一些實施例中，軟體模組寄存於一個機器上。在其他實施例中，軟體模組寄存於一個以上機器上。在其他實施例中，軟體模組寄存於雲端計算平臺上。在一些實施例中，軟體模組寄存於一個位置之一或多個機器上。在其他實施例中，軟體模組寄存於一種以上位置之一或多個機器上。資料庫
在一些實施例中，本文所揭示之平臺、系統、媒體及方法包含一或多個資料庫或其用途。鑒於本文所提供之揭示內容，熟習此項技術者將認識到，許多資料庫適於儲存及檢索資訊。在各個實施例中，適宜資料庫包含(藉由非限制性實例方式)關聯式資料庫、非關聯式資料庫、物件導向式資料庫、物件資料庫、實體關聯模型資料庫、相關式資料庫及XML資料庫。其他非限制性實例包含SQL、PostgreSQL、MySQL、Oracle、DB2及Sybase。在一些實施例中，資料庫係基於網際網路。在其他實施例中，資料庫係基於網頁。在其他實施例中，資料庫係基於雲端計算。在其他實施例中， 資料庫係基於一或多個局部電腦儲存器件。
範圍在本文中可表達為自「約」一個特定值及/或至「約」另一特定值。在表達此一範圍時，另一實施例包含自該一個特定值及/或至另一特定值。類似地，在值藉由使用先行詞「約」表達為近似值時，應理解，特定值形成另一實施例。應進一步理解，每一範圍之端點在與另一端點有關及與另一端點無關兩種情況下皆重要。本文所用之術語「約」係指在特定使用之背景下自所述數值加上或減去15%之範圍。舉例而言，約10可包含8.5至11.5之範圍。
儘管已在本文中展示並闡述了本發明之較佳實施例，但熟習此項技術者將顯而易見，該等實施例僅作為實例來提供。熟習此項技術者現將構想出多種變化形式、改變形式及取代形式，此並不背離本發明。應理解，可在實踐本發明中採用本文所闡述之本發明實施例之各種替代形式。下列申請專利範圍意欲界定本發明範圍並由此覆蓋該等申請專利範圍及其等效形式範圍內之方法及結構。
本文所示之詳情係作為實例且僅用於闡釋性討論本發明之較佳實施例之目的且為提供據信最有用且易於理解本發明各個實施例之原理及概念性態樣之闡述而呈現。為此，僅詳細地展示為了基本上理解本發明所必需之本發明之結構細節，結合附圖及/或實例進行之闡述可使熟習此項技術者明瞭如何在實踐中體現本發明之若干種形式。除非清晰且明確地在下列實例中修改或在含義之應用使得任何構造無意義或基本上無意義時，否則下列定義及闡釋意欲且打算在任何未來構造中進行控制。在術語之構造使得其無意義或基本上無意義之情形下，定義應來自韋氏辭典(Webster's Dictionary)第3版或熟習此項技術者已知之辭典，例如牛津生物化學與分子生物學詞典(Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology) (Anthony Smith編輯，Oxford University Press, Oxford, 2004)。
如本文中所使用且除非另外指示，否則術語「一個(a及an)」意指「一個」、「至少一個」或「一或多個」。除非上下文另外需要，否則本文所用之單數術語應包含複數且複數術語應包含單數。
除非上下文另外明確要求，否則在說明及申請專利範圍通篇中，詞語「包括(comprise、comprising)」及諸如此類應解釋為在與排他性或窮盡性意義相反之包含性意義上；亦即，在「包含(但不限於)」之意義上。
除非另外指定，否則本文所闡述之方法及製程可以任一順序來實施。舉例而言，闡述步驟(a)、(b)及(c)之方法可以首先步驟(a)、隨後步驟(b)且然後步驟(c)來實施。或者，該方法可以不同順序來實施，例如首先步驟(b)、隨後步驟(c)且然後步驟(a)。另外，除非另外具體指定，否則等步驟可同時或單獨實施。
使用單數或複數個數量之詞語亦分別包含複數個及單數個數量。另外，在本申請案中使用時，詞語「本文中」、「上文」及「下文」及類似意思之詞語應將本申請案視為整體而非本申請案之任何特定部分。實例
包含下列實例以進一步闡述本發明之一些態樣，且不應用於限制本發明範圍。實例 1 用於大容量捕集循環腫瘤細胞之基於微流體組件之整體決策等分試樣分級
此實例闡述及驗證根據本發明一態樣用於分離粒子(包含細胞)之新穎eDAR平臺。
決定eDAR平臺之特徵及性能之兩個因素係有效及主動分選方案以及後續有效純化(例如純化室)方案。本發明之eDAR-平臺最佳化該兩個分量。在一實例中，eDAR平臺可包含藉由標準微影方法製得之積體過濾區。微流體晶片可由矽母模上之兩個層構成且可藉由一步式複製模製至聚二甲基矽氧烷(PDMS)中來製作。微流體晶片可最終結合至玻璃基板。整個系統可包含主動分選方案。可最佳化微流體晶片及流體動力學切換機構之分析性能以達成特定回收效率(例如95%)、特定假正率(例如0)及特定通量(例如4.8 mL全血/小時)。微流體晶片
此實例中所用之微流體晶片具有整合至同一設計中之兩個功能區，亦即eDAR分選區及基於狹縫結構之過濾單元。分選單元中之主通道(其將血液引入分選接面中)具有50 µm高度及150 µm寬度；所有其他4個通道皆係50 µm高及200 µm寬。狹縫過濾器為5 µm高及5 µm寬。所測試狹縫之最大數量為20,000。
使用兩個光微影製程來製作矽母模(圖5、20及21)。使用AutoCAD (Autodesk, San Rafael, CA)來設計特徵，並書寫於鉻遮罩(TRICR Corporation, SF, CA)上。選擇正性抗蝕劑微影及深反應性離子蝕刻(DRIE)來形成第一層(微過濾特徵)。使用AZ 1512作為正性光阻劑，其係由The University of Washington處之Micromanufacturing Facility (MMF)來提供。將DRIE製程最佳化以達成在4.5-5 µm範圍內之深度。使用SU-8-3050作為負性光阻劑(MicroChem, Newton, MA)來製作eDAR特徵之第二層，且將特徵高度控制於50 µm。在使用十三氟-1,1,2,2-四氫辛基-1-三氯矽烷(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)將母模矽烷化之後，將未固化PDMS傾倒於矽晶圓上並在70℃下烘烤2小時。自矽母模剝離具有期望微特徵之PDMS片，且然後使用標準電漿氧化製程與一片蓋玻片結合。生物及臨床試樣
使用三種乳癌細胞系SKBr-3、MCF-7及MDA-MB-231細胞(美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC), Manassas, VA)來表徵及最佳化eDAR系統。在McCoy’s 5中培養SKBr-3細胞，在伊格爾氏最低必需培養基(Eagle’s Minimum Essential Medium，EMEM)中培養MCF-7，且在達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM) (ATCC, Manassas, VA)中培養MDA-MB-231。所有細胞培養基亦含有2 mM L-麩醯胺酸、10%胎牛血清(FBS) (ATCC, Manassas, VA)及50 μg/mL青黴素(penicillin)/鏈黴素(streptomycin) (ATCC, Manassas, VA)。在37℃、5% CO2 下於加濕環境中進行培育。藉由Tuffs University處之Prof. Gail Sonenshein提供MDA-MB-231-GFP細胞系且培養於含有10% FBS及1 μg/mL嘌呤黴素(puromycin)之DMEM培養基(Life Technologies, Carlsbad, CA)中。自血漿國際實驗室(Plasma International Lab，Everett, WA)購買來自健康供體之對照血液；棄除第一管抽血以防止來自皮膚細胞之任一可能污染。基於由Fred Hutchinson Cancer Research Center’s institutional review board批准之方案自轉移性胰臟癌患者抽取全血試樣。在Seattle Cancer Care Alliance (SCCA)處使用含有EDTA作為抗凝血劑之Vacutainer管(BD, Franklin Lakes, NJ)收集患者試樣，儲存於4℃下，並在4小時內分析。試樣製備及 eDAR 分析
除非另外指定，否則使用Isoton (Beckman Coulter Inc., Chino, CA)作為所有實驗之緩衝液。在典型eDAR實驗中，使用與藻紅素(PE)偶聯之抗EpCAM (批號515776，Abnova, Walnut, CA)將1 mL全血試樣在室溫下於暗處標記30分鐘。所有標記參數已最佳化。將經標記試樣稀釋至14 mL且然後離心以去除游離抗體。將最終體積調節至與初始體積相同。接下來，使用注射器幫浦將所製備試樣注入微流體晶片中。藉由PCI資料獲取卡(PCI 6602, National Instruments, Austin, TX)收集來自纖維耦合性崩潰光二極體(APD) (Excelitas Technologies, Waltham, MA)之跡線。使用自寫LabVIEW (National Instruments, Austin, TX)腳本及自製場效可程式閘陣列(FPGA)器件自動控制eDAR之分選製程。藉由購自Lee Company (Westbrook, CT)之電磁閥(INKA1226212H)控制流體動力學切換(其收集所分選等分試樣)。
在將所有陽性等分試樣收集於過濾區上之後，使用isoton在小於1分鐘內迅速洗滌過濾區。若使用任何細胞質標記物進行二級標記，則將4%低聚甲醛(PFA)加載至過濾區中以固定細胞。使用Surfynol® 465 (Air product, Allentown, PA)滲透固定細胞。通常使用抗EpCAM-PE及抗細胞角質蛋白-APC (批號MAB5131, Abnova, Walnut, CA)及抗CD45-螢光黃異硫氰酸酯(FITC) (批號B116314, BioLegend San Diego, CA,)作為抗體用於二級標記。亦使用Hoechst (Life Technologies, Carlsbad, CA)作為核染劑來驗證經標記靶實際係有核細胞。
eDAR方法如下：將血樣注入微流體晶片中並分成等分試樣。然後應用線共焦檢測方案以將等分試樣分級為「陽性」或「陰性」，此係藉由標記方案來決定。舉例而言，在許多應用中，使用抗EpCAM-PE標記血液，從而僅將具有來自偶聯至該抗體之特定染料之螢光信號之等分試樣分級為陽性事件。應用自動反饋方案以切換血流方向，此使得可迅速收集陽性等分試樣。因CTC之濃度極低，故因不存在期望螢光信號而棄除大於99.999%之等分試樣。將彼等產生正螢光信號之等分試樣轉移至微流體晶片上之另一區域中以進一步純化且然後計數。可在所捕集細胞上實施一系列下游分析。再設計之流體動力學分選方案 。
先前，eDAR具有機械閥門來控制主動分選步驟，此方式與所報導其他切換機制(例如電滲透流動或溶膠-凝膠轉變)相比較為迅速(約2毫秒反應時間)且穩定。儘管有前景，但此機械閥門方案之一些設計因素潛在地限制了eDAR之潛在應用。為在微流體晶片上形成機械閥門，需要3個體結構層－電磁閥、其PDMS螺紋及150 μm PDMS膜上之微通道。此使得微流體晶片製備較為複雜且耗時。另一缺點係所捕獲血液等分試樣與機械閥門之間直接接觸，此潛在地增加了損失或損害CTC之風險。在本實例中，使用晶片外模型代替電磁閥，前者通常關閉但可在施加5V DC電壓時於2至3毫秒內打開。因該在線電磁閥並非微流體晶片之一部分，故微流體器件之製備顯著簡化。電磁閥可容易地與任一微通道連結以測試流體動力學分選方案。設計8種不同方案並測試(圖3)以驅動流體切換。因此類電磁閥之結構及PDMS之彈性性質，故流體性能有所變化(表1)，且表徵每一方案之最佳性能。
在表徵及最佳化之後，選擇用於eDAR之平臺結構及流體動力學分選之相應方案(圖4)。使用注射器幫浦將經標記血樣注入微流體晶片之頂部通道中(圖4A)。使用緩衝液所流經之兩個側通道來控制主動分選步驟。兩個埠位於右側通道上，且二者皆連結至加壓緩衝液源。常關電磁閥連結至靠近分選接面之埠以控制流體動力學切換。在分選接面之後存在兩個通道。左側通道係用於收集陽性等分試樣且將其遞送至過濾區及收集區以進一步純化(例如純化室)；右側通道係所有陰性等分試樣皆流經之廢物收集通道。
在將彼等等分試樣分級為「陰性」時(圖4B)，並不向電磁閥施加電壓，因此其係關閉的。在1號緩衝液源與3號緩衝液源之間設置初始壓力降，從而血液可僅流入收集廢物之通道中，此亦展示於圖4B中之亮視野影像中。在藉由第一檢測窗口檢測到陽性事件時，立即向電磁閥施加5V DC電壓以打開來自2號緩衝液儲槽之緩衝液流。此降低了右側通道中之緩衝液之流動抗性且在此生成較高流速。將血流自右側推向左側以收集陽性等分試樣(圖4C)。在收集此等分試樣且藉由第二檢測窗口證實之後，關閉電磁閥將血流切換回廢物收集通道(圖4D)。經測定，每次切換及切回所需之時間為2至3毫秒(圖5)。此過程對於eDAR而言足夠穩定，即使在測試大於105 個開關循環之後。將在線電磁閥置於緩衝線上，從而血液不能與電磁閥接觸，此消除了凝血及交叉污染之可能性。此外，在此方案中，在eDAR製程期間於CTC收集通道中存在恆定緩衝液流動。此改良了後續純化(例如純化室)步驟之效率且防止形成細胞聚集物。
在本實例之一些態樣中，可將陽性等分試樣收集於過濾區中且使用isoton在小於1分鐘內洗滌過濾區。可使用細胞質標記物進行二級標記且可涉及將4%低聚甲醛加載至過濾區中以固定細胞。可使用Surfynol® 465 (Air product, Allentown, PA)滲透固定細胞。可使用抗EpCAM-PE及抗細胞角質蛋白-APC (Abnova, Walnut, CA)及抗CD45-螢光黃異硫氰酸酯(FITC) (BioLegend San Diego, CA)進行二級標記。可使用Hoechst (Life Technologies, Carlsbad, CA)作為核染劑來驗證有核細胞。純化 ( 例如純化室 ) 機制之設計
該實例之又一態樣可包含基於晶片上過濾之微狹縫結構之新方案，該結構可由PDMS製得且可無需其他層(圖7A)。圖7A展示該等微狹縫之一實例之基本結構，其用於捕獲CTC且不保留任何紅血球(RBC)。將狹縫大小最佳化至5 μm高及5 μm寬(圖7B)以避免損失任何小CTC。使用此大小之過濾器未捕獲到許多WBC，該過濾器小於用於大部分基於過濾之CTC方法中者。因微過濾器係由PDMS製得且與一片蓋玻片結合，故成像品質與聚碳酸酯過濾器(其並不完全透明且可生成散射及像差)相比得到顯著改良(圖7C及7D)。此外，因可僅沿狹縫陣列捕集細胞，故細胞可容易地參照及追蹤；在許多其他方法中，細胞隨機分佈於表面上。沿狹縫之此捕集使得成像程序更為迅速且列舉結果更為準確。狹縫亦使得更迅速且更有效地對所捕集CTC實施二級標記。圖7E展示，將經抗EpCAM-PE標記之兩種癌細胞捕集於微狹縫上。固定細胞，滲透，並使用抗細胞角質蛋白-Alexa488、抗Her2-Alexa647及Hoechst標記。螢光影像明確展示該等標記物在該兩種細胞上之表現，且亮視野影像亦證實其形態。亦使用抗CD45-Alexa700作為陰性對照標記物來標記兩種細胞，且並無對應於此標籤之來自色彩通道之信號。eDAR 之表徵及分析性能
實時監測主動分選步驟之效率。圖6展示來自胰臟癌患者試樣之小部分APD數據。「決策APD跡線」係來自分級等分試樣且控制分選之第一檢測窗口。978毫秒及1298毫秒下之兩個峰代表兩種經觸發等分試樣分選之抗EpCAM-PE標記之CTC。「證實APD跡線」之兩個峰展示，兩種癌細胞流經位於收集通道上之第二檢測窗口，從而證實實際上分選兩種陽性等分試樣。值得指出的是，自第二檢測器之背景變化(圖6A)亦證實，藉由eDAR僅收集小部分血液，從而產生高CTC富集比率(相對於典型臨床試樣最高為一百萬倍)。
因經標記CTC自第一檢測窗口流向第二檢測窗口，故觀察到決策APD峰與其證實信號之間之時間差。此時間差定義為分選CTC之過渡時間，其可有所變化，此乃因CTC可因微通道中之層流性質而具有不同線性流速。圖6B展示在40 μL/min及80 μL/min流速下之過渡時間之分佈直方圖。通常，血液之較高體積流速可縮短分選CTC之過渡時間(圖6C)。在流速為90 μL/min時，平均過渡時間降至4毫秒，此極接近分選方案之切換時間(2至3毫秒)，從而暗示此係eDAR設計之此特定實施例之通量限值。在其他實施例中，本發明eDAR設計可產生小於2毫秒之過渡時間。
若分選CTC之過渡時間短於流體動力學切換時間，則不能在該平臺上可靠地分選細胞。分選效率由此定義為收集事件數對觸發分選之總事件數之比率。圖6D展示在30 μL/min至100 μL/min之流速下之分選效率值。在流速為30 μL/min時，分選效率幾乎為100%，此乃因該流速下之平均過渡時間約為10毫秒(圖6D)。此過渡時間對於主動分選步驟而言足夠長以收集CTC。分選效率在80 μL/min流速下降至90%，且然後在流速為90 μL/min時跌至49%。圖6D亦展示在不同流速下之eDAR回收效率，其與分選效率具有類似趨勢。然而，回收效率定義為內參細胞數對使用多色螢光成像在微流體晶片上計數之回收細胞數之比率。此性能係許多因素之組合，包含抗體標記效率、線共焦檢測效率及分選效率。此闡釋了回收效率及分選效率之間在相同流速下之差異。因此，對於當前這一代eDAR而言，通量上限為80 μL/min (12.5分鐘/1 mL血液)且回收比率為88%。儘管此通量高於用於分析全血之大部分CTC技術，但其可藉由設計較寬血液入口通道或將第一檢測光束向上移動來進一步改良。
將3至975個MCF-7細胞摻加至1 mL健康血液中以在50 μL/min流速下分析回收效率。為確保下端細胞數量之準確度，在濃度低於100個細胞/mL時，使用毛細管計數方法來精確摻加培養細胞。平均回收比率為95%且R2 值為0.998 (圖6E)，其略高於第一代eDAR (93%)。因CTC濃度通常極低，故列舉結果受帕松分佈影響。在此情形下，以可接受之通量及回收比率分析較大體積之全血試樣之能力極為重要。將相同數量之MCF-7細胞摻加至1、5及10 mL健康血液中，且然後在50 μL/min流速下分析該三個試樣。其回收比率並無顯著變化(圖6F)，此展示該方法能夠以較高之效率及通量運行大量全血。
儘管在大部分CTC研究中使用EpCAM來選擇腫瘤細胞，但愈來愈多之研究已報導，具有低EpCAM表現之CTC具有較高間質特性且更具攻擊性。最新eDAR平臺足夠靈活地使用任一標記方案來選擇罕見細胞，從而使用除EpCAM外之生物標記物來捕獲腫瘤細胞。設計三種方案來選擇不同經培養乳癌細胞系(圖6G)。使用EpCAM來選擇MCF-7細胞，使用Her-2來選擇SKBr-3細胞，且使用EGFR來選擇MDA-MB-231細胞。所有該三個方案皆以高於88%之回收比率來分離及捕集靶向細胞。eDAR之另一獨特及重要特徵係標記物位置之獨立性。舉例而言，在其他技術(例如表面捕獲方法或免疫磁性方法)中，僅可捕獲細胞表面上之抗原。本發明方法能夠選擇具有細胞內標記物(例如GFP)之細胞(圖6D)。摻加至人類全血中之MDA-MB-231-GFP細胞之回收比率為91% (圖6G)。因螢光蛋白廣泛用於動物模型中以研究轉移之進展及機制，故eDAR係在該等模型中選擇CTC之理想工具。實例 2 雙重捕獲 eDAR
此實例根據本發明一態樣闡述eDAR之「雙重捕獲」形式。雙重捕獲eDAR可自同一微流體器件上之同一人類血樣同時分離兩種不同亞群體之CTC。該兩個亞群體可分別以較高之回收率及純度單獨捕集於微流體晶片上之兩個不同區域中。
圖8展示微流體器件之一般結構。使用與不同螢光標籤偶聯之兩類抗體預標記血樣。舉例而言，使用上皮標記物(例如與PE偶聯之抗EpCAM)以及間質標記物(例如與另一具有不同於PE之發射波長之螢光團(例如FITC)偶聯之抗EGFR或抗波形蛋白)標記血樣。將經標記血樣注入微流體晶片中，可使用在黃色通道中具有峰之線共焦方案來檢測具有EpCAM表現之CTC，且然後觸發主動分選事件以將該等分試樣收集至1號收集通道中。類似地，若將等分試樣針對間質標記物分級為陽性，則將其分選至2號收集通道中。然後捕集兩個亞群體並單獨富集於微流體晶片上。使用用於第二生代eDAR中之相同微狹縫設計來構築過濾區。
流體切換方案匯總如下。在等分試樣針對所施加任一標記物分級為陰性時，然後關閉圖8中之兩個電磁閥。若兩個側通道上之壓力得以平衡，則血樣流向用於收集廢物之底部中心通道。在將等分試樣僅針對上皮標記物分級為陽性時，立即打開2號電磁閥，由此將血流推向左側之收集通道(圖9B)。在收集等分試樣之後，再次關閉2號電磁閥，由此血流切回中心。在將等分試樣僅針對上皮標記物分級為陽性時，立即打開1號電磁閥，由此將血流推向右側(圖9C)。兩類eDAR分選事件之反應時間約為2至3毫秒。
圖8展示「雙重捕獲」 eDAR之一般結構。將經標記血液引入頂部之主通道中。緩衝液流入兩個側通道中以使用兩個電磁閥控制血流之流體動力學切換。分離兩個亞群體之CTC並捕集於相同微流體晶片上之兩個不同過濾區中。
圖9繪示三個血流狀態之亮視野影像。A)血液流入廢物收集通道中，此乃因等分試樣針對任一標記物分級為陰性。B)血液切換至1號收集通道中，且第一亞群體之CTC轉移至其中。C)血液切換至2號收集通道中，且第二亞群體之CTC轉移至其中。實例 3 多級分選及分散
自美國模式培養物保藏所(ATCC, Manassas, VA)獲得MCF-7細胞系。在37℃及5% CO2 下於EMEM培養基(ATCC)中培養細胞。培養基補充有5% v/v胎牛血清(FBS)及1% v/v青黴素/鏈黴素(皆來自Sigma, St. Louis, MO)。
自PlasmaLab International (Everett, WA)獲得健康全血試樣。
除藻紅素(PE)-抗EpCAM (Abcam, Cambridge, MA)外，自BioLegend, Inc. (San Diego, CA)購買抗體。自Beckman Coulter (Brea, CA)購買Isoton II緩衝液(用作eDAR之鞘流)。自Sigma (St. Louis, MO)購買牛血清白蛋白(BSA)及TWEEN 20。在isoton中製備兩種溶液：一種溶液含有0.1% BSA w/w並用於標記且第二溶液含有1%BSA/0.05% TWEEN20 w/w並用於預處理材料。自EMD (Billerica, MA)購買甘油且在Isoton中製備25% w/w溶液以模擬用於分選實驗之血液之流體特性。以30/70比率混合此溶液與綠色食品染料(COV Extract Company, Rockford OH)以用於需要分選影像之實驗。
使用標準光微影技術且使用SU-8 2050 (MicroChem, Westborough, MA)來製備矽母模以用於旋塗。以1:10之前體對聚合物基質比率自PDMS來製備晶片，完全固化，並在暴露於O2 電漿一分鐘後立即密封至玻璃基板。若未立即使用，則覆蓋晶片並儲存直至使用，但不能長於一個月。
為測試不同晶片設計伸展等分試樣之能力，將10 µl PE-山羊-抗小鼠抗體添加至離心過濾管(EMD Millipore, Billerica, MA)中之40 µl經過濾isoton中並在14,000 RPM下旋轉5 min以去除聚集物。將此部分添加至於isoton中之1 ml 25%甘油溶液(w/w)中。添加大約10µm之1500個黃色螢光珠粒(Duke Scientific, Palo Alto, CA)。在確立第一級eDAR分選晶片及分選之後，在多級螢光活化分選中運行試樣。收集APD跡線，使用珠粒觸發分選事件，且分析經分選染料峰。
使用30 µl PE-抗EpCAM將MCF7細胞標記3小時。在洗滌之後，將細胞計數且將大約100個細胞摻加至0.5 ml血液中。在晶片上分選血液。在確立分選後，將經1% BSA/0.05% TWEEN20預處理之新鮮管插入收集出口並置入經預處理之15ml離心管中。在分選之後，將所收集細胞在450 RCF下旋轉10 min，且去除上清液。添加15 µl PE-抗CD45 (旋轉以去除聚集物) 3小時。使用isoton + 0.1% BSA洗滌試樣並在僅在入口及出口穿孔以便於使用之新晶片上運行。收集跡線且使用MATLAB分析對總PE標記細胞進行計數。作為對照，重複上述製程且不添加PE-抗CD45，且對PE峰計數並證實與來自第一分選實驗之PE峰數相匹配。
使用30 µl PE-抗EpCAM將MCF7細胞標記(旋轉以去除聚集物) 3小時。在洗滌之後，將細胞計數且將已知量(約100個細胞)摻加至0.5 ml血液中。在晶片上分選血液。在確立分選後，將經1% BSA/0.05% TWEEN20預處理之新鮮管插入收集出口並置入經預處理之96孔板中。將細胞收集至96孔板之各孔中，在體積達到約250 µl時，將管人工移動至新孔中。在完成分選後，將孔板在450 rcf下旋轉10 min。使細胞成像並在具有20×、0.75 NA物鏡之Nikon TE 2000 U顯微鏡(Nikon, Tokyo, Japan)上計數。
因eDAR分選全血之等分試樣以代替分析細胞單一隊列，故試樣運行時間與其他螢光分選方法相比大大減小。然而，在此方法中固有地，使用所關注經標記細胞來分選血細胞。對於eDAR之先前迭代，使用晶片上過濾器來收集細胞，且狹縫寬5 µm。此容許所有紅血球及大部分白血球通過，而即使最小之CTC亦得以保留。然而，保留於過濾器上之細胞之去除較為耗時，且若在分選之後直接準備收集細胞，則需要改良其純度。為此，設計在第一分選接面之後包含第二分選接面之新晶片(參見圖18A)。分選塞在其向下穿過分隔兩個接面之通道(分散區)時伸展，且一旦細胞到達第二接面，即進行第二檢測及分選。存在兩個檢測點，其恰在每一分選接面之前，如圖18A中所展示。
圖24A及圖24B展示在分選期間來自兩個接面之檢測跡線。在兩個接面中檢測細胞，如可在繪圖上所見。圖24C展示來自第一分選接面及第二分選接面(分別以綠色及藍色展示)之APD數據之組合跡線之較短區段。在分選之間存在延遲時間，在此期間伸展等分試樣或流體體積並稀釋。此意味著，血細胞濃度有所減小且細胞之間之平均距離有所增加，且第二次分選之該等細胞之數量極低，由此可改良純度，例如如藉由每一試樣中分選之CTC數量除以所收集之總有核細胞所量測。
為量化此改良，使用PE-抗EpCAM標記MCF7細胞，洗滌，計數，並摻加至0.5 ml健康血液中。使血液以30 µl/min速率流入依序分選晶片中並藉由調節流動壓力確立分選。在設定穩定分選壓力後，去除收集出口管道且插入預處理管道(於Isoton中之1% BSA及0.05% tween20)。將此管道之出口置於經預處理15-ml離心管中且收集整個分選體積(其含有所分選MCF7細胞、在每一等分試樣中分選之血細胞及isoton緩衝液鞘流)。對於使用0.5 ml血液之分選實驗而言，此體積大約為1 ml。在分選之後，將所收集體積在450 rcf下離心10 min並小心去除約300 µl上清液。添加15 µl PE-抗CD45且將細胞標記3小時，洗滌，且去除1 ml上清液。此經由僅在入口及一個出口處穿孔之清潔晶片來運行，且收集APD跡線並分析。作為對照，實施上述製程且不添加PE-抗CD45抗體，且PE峰數與第一分選實驗之PE峰數相關，由此證實該細胞在標記過程期間並無損失。
跡線中之峰數得到總分選有核細胞，亦即來自初始分選之經PE標記之MCF7細胞及在分選之後標記之經PE標記之白血球。為計算純度，將所分選MCF7細胞數除以總有核細胞。自第一分選實驗中之分選事件數獲得所分選MCF7細胞數。對於1級分選而言，所計算純度約為1%。對於藉由3-cm通道分隔兩個接面之2級分選而言，達成約15%之純度。
上文針對分隔兩個接面之3-cm直線通道所呈現數據展示，純度增加約15倍。此係藉由在等分試樣或流體體積在兩個分選接面之間行進時將其伸展並稀釋所促進。因微通道之層流中之混合較低，故需要較長通道來達成實質性混合。因此，改良純度之最容易方式增長兩個接面之間之通道。設計晶片並使用分隔兩個接面之5.5 cm通道來製造，且如先前所闡述來量測純度。發現此設計具有約21%之純度。進一步增長應產生甚至更大之純度。
儘管增長接面間通道可改良伸展及純度，但顯著改良純度且接近單細胞分離所需之通道長度可不切實際。因此，需要更積極之混合或分離策略。可採用三種方式來伸展等分試樣或流體體積且改良純度。在一種方式中，設計「流動伸展體」，其包括藉由一系列較小通道連結之長通道(圖20)，從而一部分等分試樣向下進入第一小通道且一部分繼續下行至主通道中，直至等分試樣已完全分離成許多較小等分試樣或流體體積為止。
為測試此情形，使PE染料流入於含有螢光珠粒之甘油溶液中之晶片中並確立分選。經分選等分試樣或流體體積含有黃色螢光珠粒及染料塞，且可自染料等分試樣或流體體積之伸展來估計純度改良，如在第二分選接面之前即刻藉由APD跡線所觀察。儘管此方式並不得到絕對純度，但其係比較器件設計之有用方法。第二接面處之等分試樣或流體體積愈長，則其伸展程度愈大，從而較少血細胞分選成新等分試樣或流體體積。使用經分選染料等分試樣或流體體積之結果似乎係有前景的(參見圖25A-C)，但所需側通道之較小大小使得可能產生阻塞及潛在細胞損失。圖25展示流動伸展體伸展測試之結果，該等流動伸展體係直線通道流動伸展體(圖25A-B)及使用魚骨狀特徵(圖25C)來使等分試樣或流體體積側向擴散穿過通道之流動伸展體。
第二策略涉及沿分隔接面之通道佈置之堰，堰係其中通道之高度短暫減小至5-30 µm高之區段。可假設，CTC或一些罕見細胞(較大及/或較小變形性)在堰處實質上放緩，且其他血細胞則繼續前進。測試另一堰樣結構，其中採用堰過濾器側向穿過通道，且具有30-35 µm狹縫。
圖26A展示第一堰伸展體處之細胞之影像。圖26A中之左側影像係通道區段之亮視野圖片。狹縫跨越通道之長度，且寬35 µm。圖26A中之右側影像係PE標記細胞之螢光影像。圖26B展示第二堰伸展體處之細胞之影像。圖26B中之左側影像係通道區段之亮視野圖片，在此情形下具有30 µm寬狹縫。圖26B中之右側影像係PE標記細胞之螢光影像。
最後，採用在分離通道開始使用魚骨狀特徵之無序混合設計來側向擴散等分試樣或流體體積，然後使其行進至通道之其餘部分。將此設計添加至5.5 cm直線通道設計中，且沿通道之前0.7 cm使用魚骨狀特徵。出於若干原因，魚骨狀特徵作為混合策略具有吸引力。首先，其製作較為簡單，僅需要SU-8微製作之一個額外層且無需任何閥門或複雜特徵。其次，其已證實適用於眾多種應用。最後，其不添加可捕集細胞之收縮段。
採用包括以下三個魚骨狀區段之魚骨狀設計(參見圖23A)：三個初始魚骨狀特徵，其自內壁至外壁成角度，此乃因可觀察到等分試樣或流體體積中之細胞主要沿內壁向下行進；與中心錯開且更靠近外壁之12個魚骨狀特徵之區段；且然後係以相反方向錯開之12個魚骨狀特徵。魚骨狀高度為30 µm。直線魚骨狀之第一區段係80 µm寬且相隔95 µm。第二魚骨狀區段係70 µm寬且相隔180 µm。混合區段係0.7 cm長，且隨後係4.8 cm直線通道。此設計容許充分混合，從而細胞並非沿外壁以塞流行進，而係穿過通道側向分離。直線通道之長區段然後容許細胞進一步縱向分離，此乃因靠近通道中心之細胞因抛物線型流動輪廓而較外邊緣上細胞更迅速地行進。在如先前闡述進行測試時，此設計產生30%之純度。此意味著，對於第一接面中之每一分選CTC或罕見細胞而言，在第二接面中再次分選時，存在大約2.5個白血球。在無第二分選時，在每一CTC中分選出大約100個白血球。在平均分選90個MCF7細胞時，在第二分選之後收集到約225個白血球。因總分選體積約為1 ml，故此對應於白血球消耗速率為2.2 × 104 或4.3 log (5 × 106 個白血球/ml全血對225個白血球/ml分選體積)。具有極長通道之較多魚骨狀特徵可進一步改良此結果。藉由所測試設計獲得之純度結果匯總於表2中。表 2.
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為使此方法在臨床上有用，細胞需要以可容易列舉之方式來收集，且需要實施內參回收(驗證CTC或罕見細胞分離技術之傳統方法)。先前已使用來自不同細胞系以及臨床試樣之回收來驗證eDAR平臺。此方法引入其中可發生細胞損失之兩個新元件：第二分選接面及96孔收集板。因此，實施回收以驗證該等元件不生成細胞損失。
簡明起見，使用預標記之MCF7細胞實施回收。已實施血液中細胞標記步驟之先前測試，由此在此報告中決定僅分離系統之新特徵。該等測試中之第一者係新流體方案：其在晶片上包含兩個分選接面。以類似於先前晶片之方式來平衡流動，現在以下三個位置調節流動壓力：(1)在沿第一廢物通道向下流動時，關斷1號及2號電磁閥(圖27A及圖27B中之第一框)，(2)在沿第一收集通道向下流動時，打開1號電磁閥且關閉2號電磁閥(展示於圖27A中)，且(3)在沿第二收集通道向下流動時，關閉1號電磁閥且打開2號電磁閥以收集細胞(圖27B)。依序晶片上之分選更為穩定，此乃因不存在引入潛在阻塞之晶片上過濾器。
圖27A展示繪示依序分選流體裝置之第一接面中之分選之影像框。比例尺為200 µm。溶液係30%甘油溶液(於Isoton中之25%w/w甘油)及70%綠色食品染料。三個框自左向右展示：不打開電磁閥；打開電磁閥且流開始移向左側；流完全沿收集通道向下。圖27B展示繪示依序分選流體裝置之第二接面中之分選之三個影像框。比例尺為200 µm。溶液係30%甘油溶液(於Isoton中之25%w/w甘油)及70%綠色食品染料。三個框自左向右展示：不打開電磁閥，打開電磁閥且流開始移向左側，流完全沿收集通道向下。
為在第二接面處分選之後收集PE-抗EpCAM標記之MCF7細胞，在確立分選之後將預處理管道插入收集出口且將管道出口安裝於經預處理之96孔板上方。使用1% BSA + 0.05% Tween20於Isoton中之溶液預處理管道及用於收集之96孔板以防止細胞黏附。將輸出體積收集於孔中直至其達到約250 µl為止，然後將管道人工移動至下一孔中。分選0.5 ml血液之總輸出為約4個孔或約1ml。為列舉孔中之細胞，將板在板離心機上以450 rcf旋轉10 min以將所有細胞分離至孔底部。然後可在具有20×、0.75 NA物鏡之螢光顯微鏡上將細胞計數。在該級中，若需要進一步標記，則可去除期望標記體積之上清液且添加抗體或固定/滲透溶液。為驗證此步驟並不引入細胞損失，將細胞旋轉額外時間，去除上清液，添加200 µl isoton緩衝液+ 0.1% BSA，再次旋轉板且對孔進行再計數。據觀察，並無細胞損失。所有三個設計(3 cm通道、5.5 cm通道及具有魚骨狀特徵之5.5 cm通道)之平均回收率約為91%，從而指示在新設計中引入最小細胞損失。實例 4 使用粒子捕獲及釋放之多級分選及分散
此實例闡述根據本發明一態樣多級分選裝置之「捕獲及釋放」形式及根據本發明一態樣實施粒子捕獲及釋放之方法。在分選期間或之後自過濾器或障壁捕獲及釋放粒子或細胞容許對所發現粒子實施較大數量之分析。舉例而言，可捕獲高純度CTC，使用多個螢光加標籤抗體標記，實施螢光成像，然後釋放至小瓶中並使用諸如聚合酶鏈反應及/或基因測序等技術進行分析。粒子捕獲
在純化粒子(例如細胞)並藉由兩級分選及一或多個分散操作使用兩個分選級及至少一個分散級濃縮之後，使用過濾元件收集粒子，如圖7A及圖29A中所展示。
將預定數量之SKBr-3乳癌細胞系細胞添加至4 mL全血(其例如在添加SKBR-3細胞之前含有複數個細胞，但不含SKBr-3細胞或其他CTC)中且使用與藻紅素偶聯之抗EpCAM抗體進行標記。使用如本文所闡述包括分散操作之兩級分選來分離摻加SKBr-3細胞之全血(例如試樣)，並引入如圖29A中之過濾區中以捕獲粒子。
經由來自第二分選級之流動路徑將細胞引入過濾區中。預計除圖29A中所展示之構形外，連結第二分選級及過濾區之流動路徑(經由其將細胞引入過濾區中)可相對於過濾區之過濾器平行、垂直或以一定角度來進行定向。在將細胞引入過濾區中之後，藉由在陽性流體流動條件下附著(例如接觸)過濾器來捕獲細胞。
除連結第二分選級與過濾區之流動路徑外，圖29A亦展示連結至過濾器上游過濾區之兩個單獨流動路徑(例如第二流動路徑及第三流動路徑)。過濾區預計可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或大於10個連結至過濾器上游過濾區之流動路徑。在經由連結第二分選級與過濾區之流動路徑將細胞引入過濾區中期間，關閉第二流動路徑及第三流動路徑。除用於將細胞引入過濾區中之流動路徑外，預計可在細胞捕獲期間打開至少一個流動路徑。
在分選細胞且捕獲於過濾器中之後，使包括抗細胞角質蛋白-APC之緩衝液(例如額外流體)經由第二流動路徑流入過濾區中，第二流動路徑包括注入埠且與連結第二分選級與過濾區之流動路徑隔開。在一些情形下，經由與用於將細胞引入過濾區中之流動路徑相同的流動路徑，將包括抗體之額外流體引入過濾器中。
實施螢光成像以對過濾器中所捕獲之靶細胞數進行計數。簡言之，使用具有20X、0.75 NA物鏡(Nikon, Tokyo, Japan)、檢測器及電磁輻射源之Nikon TE 2000 U顯微鏡(例如Nikon TE 2000 U顯微鏡、MiSelect R儀器(MiCareo Taiwan Co., Ltd., Taipei Taiwan)或諸如此類)使過濾器中所捕獲之細胞成像並計數。藉由比較在捕獲(例如成像於過濾區中之靶細胞，如圖29A、29B及31中所展示)或收集之後檢測之靶細胞數與添加至血液中之已知靶細胞數來測定回收比率(例如回收效率)。平均回收比率展示自分選級之回收比率並無顯著變化，從而指示細胞捕獲過濾器100%地成功保留離開分選級之靶細胞或基本上100%地成功保留離開分選級之靶細胞。
在一些情形下，在注入第一分選級中之前存在於血樣中但在所捕獲或收集細胞群體中未檢測到之靶細胞在注入第一分選級中之前捕集於死亡體積中或發生細胞黏附。該等方式中之細胞損失會影響所計算回收比率；然而，在注入第一分選級中之後觀察到並無可量化細胞損失。端視在將細胞注入第一分選級中之前死亡體積及/或細胞黏附之量，所觀察回收比率為69%至100%、75%至100%、81%至100%、94%至100%或100%。若在注入第一分選級中之前未發生細胞損失，則具有第一分選級、分散級及第二分選級之系統中之回收比率為99.5%至100%。粒子釋放
在捕獲粒子或細胞(例如靶粒子或靶細胞)、成像於過濾元件中並分析之後，可使用不同技術來釋放細胞(例如用於收集及/或進一步處理，例如成像於單獨晶片、孔板、載玻片或小瓶上或測序或PCR分析)。為增加細胞釋放效率，存在多個流體設計及試樣治療選擇。
在細胞所經歷迫使其離開過濾器之流體壓力高於使其與過濾器附著(例如使其接觸過濾器)之流體壓力時，細胞自過濾元件達成有效釋放。達成此結果之一種方法係逆轉流體流經過濾器之方向以推動細胞離開過濾器。藉由相對於過濾器上游之流體壓力增加過濾器下游之流體壓力來逆轉流體流動方向。藉由向一或多個連結至過濾器下游(例如流體出口或額外流體入口)之過濾區之流動路徑施加壓力來增加過濾器下游之壓力，如圖29A中所展示。在一些情形下，藉由在過濾器上游位置施加負壓(例如真空)以相對於過濾器下游之流體壓力降低過濾器上游之流體壓力來逆轉流體流動方向。在增加過濾器下游之流體壓力且降低過濾器上游之流體壓力時，預計可自過濾器有效釋放細胞。在逆轉流體流動方向之前，關閉位於過濾器上游及上游分選級下游之經構形以防止或控制流體回流之結構或器件(例如閥門，如圖30A中所展示)，從而流體不能返回分選級，而打開過濾器上游之閥門以使細胞穿過流動路徑到達小瓶以用於收集。
增加過濾器之一或多個特定部分中之壓力差(例如局部壓力增加)有助於自過濾器釋放細胞。藉由阻斷一部分過濾器(例如阻斷過濾器中包括一或多個孔口之部分)以減小允許流體流動之過濾器橫截面積來達成局部壓力增加。藉由經由連結至過濾區之流動路徑向過濾器下游之過濾區中添加聚苯乙烯珠粒來阻斷過濾器孔口。
最初，過濾元件中不具有以物理方式附著孔口之靶細胞(例如完全或部分地阻斷孔口上游側之靶細胞)之孔口具有大於附著有細胞之孔口之允許流體流動的橫截面，且將較具有一或多個附著孔口上游側之靶細胞之過濾器孔口經歷較高流體流速，此乃因一或多個孔口附著細胞部分地或完全阻斷穿過孔口之流體路徑。藉由引入能夠在流體流動反轉期間阻斷過濾器下游側之一或多個過濾器孔口之材料(例如粒子，例如珠粒)，推動一或多種附著過濾器孔口上游側之靶細胞離開過濾器之壓力更明確地增加且增加程度大於未向過濾器下游側引入材料時，從而改良靶細胞自過濾器釋放之機會。儘管使用聚苯乙烯珠粒來阻斷過濾器孔口且增加過濾器中之局部壓力，但預計可使用任一阻斷過濾孔口器之方式，例如在過濾器下游引入具有其他形狀之粒子。
圖29B圖解說明向過濾器下游部分引入複數個珠粒以增加過濾器孔口中之局部壓力，從而改良細胞(例如靶細胞)自過濾器上游側之釋放。在逆轉穿過器件之流體流動之後，向過濾器中引入包括聚苯乙烯珠粒之溶液(例如額外流體)。穿過部分地或完全藉由過濾器上游側中一或多個細胞阻斷之過濾器孔口之流量最初低於穿過並未部分地或完全藉由過濾器上游側中一或多個細胞阻斷之過濾器孔口的流量。因較低抗性及較高流速，聚苯乙烯珠粒優先附著過濾器下游側中未附著細胞或具有藉由過濾器上游側之細胞阻斷之較小橫截面面積之孔口。在逆向流體流動期間，未部分地或完全藉由過濾器下游側之珠粒阻斷之孔口(例如附著過濾器上游側之一或多個細胞之孔口)中之流體流動及壓力有所增加，從而使得針對細胞之壓力有所增加且有助於自過濾器釋放細胞。
在最小化穿過過濾器之逆向流體流動時(例如在逆轉流體流動下小細胞可穿過過濾器自下游側返回上游側之情形下)，藉由向過濾器下游施加正壓、向過濾器上游施加負壓或其組合以自過濾器釋放細胞來均衡過濾器中之流體壓力。
在細胞自過濾區之過濾器釋放之後，將細胞自過濾區之上游部分(例如過濾器上游之過濾區部分)吹掃至連結過濾區與收集小瓶之流動路徑中。實例 5 具有高粒子濃度之多級分選及分散
此實例闡述根據本發明一態樣之多級分選裝置之「高濃度」形式。包括高濃度形式之多級分選裝置及其用途之方法及系統可幫助避免細胞損失(例如經由減小流體體積)，細胞損失常見於以下步驟中：收集，離心，及/或將細胞過濾至適於經受後續製備步驟及分析之流體體積中。流體收集體積減小
圖30A展示多級分選裝置(例如多級eDAR系統)之流動路徑之閥門之實例，其可用於其中可關閉流動路徑之任一方法或任一系統中，包含涉及流體體積中之罕見粒子之濃度者。在高濃度形式之多級分選裝置中，閥門位於多級分選裝置之第二分選級之下游。在一些情形下，將閥門整合至包括多級分選裝置之微流體晶片中(例如如圖30A中所展示)，且在一些情形下，閥門位於微流體晶片外部(例如如圖30C中所展示)。除在靶細胞以流體體積自第二分選級行進至閥門(其位於閥門上游)時，閥門經構形以保持關閉。閥門係電磁閥且經構形以短暫打開並再次迅速關閉以容許含有靶細胞之流體體積穿過流動路徑。使用來自與經構形以檢測細胞(例如靶細胞)之上游檢測器通訊之電腦之信號來控制閥門開口。
在許多情形下，電磁閥經構形以在2-3毫秒或更短時間內打開及關閉。端視含有靶粒子之流體在到達閥門時之壓力及速度，此閥門之反應時間足夠迅速以容許僅幾毫微升或更少流體通過閥門所處於之流動路徑(例如用於收集靶細胞)。在流動路徑中之流體流速為5µL/min之情形下，可足夠迅速地打開閥門並關閉，從而在打開閥門之每一事件中0.17nL至0.25 nL流體通過閥門。在流動路徑中之流體流速為1000µL/min之情形下，可足夠迅速地打開閥門並關閉，從而在打開閥門之每一事件中34 nL至50 nL流體通過閥門。因此，在打開閥門以使靶細胞通過之每一事件中，閥門可容許0.17nL至50 nL流體通過閥門所處於之流動路徑。高濃度形式之多級分選裝置能夠使用位於第二分選級下游之流動路徑中之某一點的電磁閥將16個SKBr-3細胞自2 mL血液原始體積分選至30 µL最終流體體積中。在通過閥門所處於之流動路徑之後，將濃縮體積收集於與流動路徑流體連通之收集小瓶中。對於系統之許多應用及構形而言，在自第二分選級接收時，對流體體積實施流體體積減小。
圖30B展示高濃度系統之構形之示意圖，該高濃度系統可用於在自第二分選級接收包括靶細胞之流體體積時濃縮流體體積中之經分選靶細胞。在該實例中，圖30B中所展示之流動路徑構形連結至微流體晶片之多級分選裝置下游。引自分選級之第一流動路徑分成第二流動路徑(其包括可變形管道且連結至粒子收集小瓶)及第三流動路徑(其包括可變性管道且連結至廢物小瓶)。相對於第二流動路徑及第三流動路徑來定位雙向電磁閥夾管閥，從而雙向夾管閥在其預設狀態下關閉(例如夾斷)第二流動路徑且打開第三流動路徑，但在激活時關閉第三流動路徑且打開第二流動路徑。
位於第二分選級中之與檢測器通訊之電腦控制雙向夾管閥之激活。預計電腦可替代地或另外連結至多級分選裝置之第一分選級中之檢測器或多級分選裝置之過濾區中之檢測器以控制雙向夾管閥。在藉由檢測器檢測到靶粒子(亦即此實例中之靶細胞)時，電腦激活雙向夾管閥，且夾管閥狀態發生切換以容許流體流經第二流動路徑並到達收集小瓶且關閉穿過第三流動路徑之流體流動。
可藉由在包括撓性管道之第二流動路徑中納入在線雙向電磁閥來改良靶細胞收集，該撓性管道連結微流體晶片與收集小瓶。在預設狀態下，在線雙向閥門經構形以夾斷(或關閉)第二流動路徑下游位置之一部分第二流動路徑(藉由壓縮撓性管道)，且容許流經第二流動路徑上游位置之一部分第二流動路徑。在激活時，在線雙向閥門經構形以夾斷(或關閉)第二流動路徑上游位置之第二流動路徑部分且容許流經下游位置之第二流動路徑部分。在藉由多級分選裝置之第二分選級中及/或多級分選裝置之微流體晶片中之檢測器檢測到靶細胞且靶細胞進入第二流動路徑上游位置與下游位置之間的流動路徑部分中時，激活在線雙向電磁閥容許包括靶細胞之小體積(約1-30 nL)傳送至收集小瓶中。容許通過在線雙向閥門之流體體積取決於第二流動路徑之上游位置與下游位置之間之距離及第二流動路徑之直徑。
在另一實例中，閥門位於第二分選級與微流體晶片下游之多級分選裝置出口之間之流動路徑中，從而使得靶粒子收集於第二分選級與微流體晶片之間之流動路徑中。在完成分選之後，使流動路徑與收集小瓶界接(例如藉由連結收集小瓶與出口埠或藉由將出口物理移動至小瓶)。然後打開閥門且將靶粒子吹掃出流動路徑出口。
將已知數量之SKBr-3細胞添加至2、4或8 mL血液中且如本文所闡述使用兩級分選裝置進行處理並分離。對收集於收集小瓶中之細胞進行計數且將數量與在每一實驗中添加之細胞數量進行比較。在使用此構形濃縮流體體積中之粒子時，細胞回收效率介於50%至100%之間，且中值為77%。在流體體積減小後收集細胞之最終流體體積介於20 uL至150 uL之間。
藉由獨立地於多級分選裝置之檢測器觸發閥門激活(例如切換閥門狀態且關閉及打開流動路徑)來較大程度地控制粒子移動及自該等實例中之多級分選裝置所收集之體積。可以各種方式(包含使用來自計時器、壓力感測器或使用者輸入器件之信號)來控制雙向夾管閥(或多級分選裝置中之任一其他閥門)之獨立激活。
圖30C展示其中可用於濃縮及/或收集所分選靶細胞或複數個所分選靶細胞之閥門位於包括多級分選裝置之微流體晶片外部之系統構形。電磁閥可用於此目的。用於濃縮一或多種靶細胞之外部閥門與流動路徑流體連通且經構形以短暫打開並再次迅速關閉以容許含有靶細胞之流體體積穿過流動路徑。使用來自與經構形以檢測細胞(例如靶細胞)之上游檢測器通訊之電腦之信號來控制外部閥門之開口。外部閥門經構形以在第二分選級中檢測到每一細胞時短暫(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20毫秒、小於2毫秒、2毫秒至20毫秒或20毫秒至50毫秒)打開。在閥門打開2毫秒至20毫秒之時間時，1至30毫微升(nL)流體通過閥門，從而使流體中之細胞沿流體路徑向下移動。
如圖30C中所展示，閥門(例如外部收集閥門)連結至具有管道之微流體分選晶片之出口。在第二分選級中分選細胞之後，分選細胞存在於第二分選級與閥門之間之流體體積中(舉例而言，細胞位於第二分選級與閥門之間之晶片及/或管道(例如收集管道)之流動路徑中)。使管道自閥門斷開且使其與收集小瓶流體連通(例如人工或經由藉由電腦控制之機械置換)。藉由在一或兩個分選級上游施加流體壓力，將存在於第二分選級與閥門之間之流體體積中之細胞吹掃離開流動路徑及/或管道並進入收集小瓶中。使用額外流體路徑之流體收集體積減小
在本文所闡述之方法及裝置之某些實施例中，使用用於減小其中收集靶粒子之流體體積之被動方法及器件。如圖31中所展示，藉由構形流體體積在離開第二分選級之後所通過流動路徑之幾何結構以促進交叉流過濾(亦即切向過濾)，在包括靶細胞之流體體積通過多級分選裝置之第二分選級之後，流體體積中之靶細胞(例如靶粒子)之濃度有所增加。在該實例中，一部分流動路徑包括分隔含有靶細胞之流體體積及與流體出口(例如主要流體出口)流體連通之濾液區3130之過濾器。在該等情形下，流動路徑可與複數個區域及流體出口藉由具有狹縫(或孔隙、節距、間隙及/或孔口) 3120之過濾器3110隔開，該等狹縫之至少一個尺寸經定大小以防止靶細胞穿過過濾器，而容許具有較小尺寸或較大變形程度之流體及/或細胞通過過濾器之狹縫(或孔隙、節距、間隙及/或孔口) 3120。
如圖31中所展示，濾液區3130之體積可大於包括過濾器之流動路徑之體積。隨著流體體積進入流動路徑中具有該等特徵之部分，一部分流體體積通過過濾器進入濾液區3130。在靶細胞通過包括過濾器之流動路徑部分時，可防止靶細胞通過過濾器之狹縫(例如，此乃因過濾器狹縫之一或多個尺寸經定大小以防止細胞通過過濾器之任一狹縫)且保留於相對於濾液區3130之過濾器相對側上。如圖31中所展示，流動路徑可與一個以上濾液區3130流體連通，每一濾液區可與一或多個流體出口流體連通。
儘管靶細胞所處於之流動路徑部分與濾液區3130之間之體積差足以使得一部分流體體積擴散穿過過濾器並到達濾液區3130之較大體積中，但濃縮流體體積中之細胞之其他被動方式亦可用於實踐本文所闡述之方法及裝置。
舉例而言，在一實例中，流動路徑並非直線且在非直線流動路徑部分處包括佈置於流動路徑之外側壁之過濾器。隨著包括靶細胞之流體體積朝向非直線流動路徑部分行進，流體體積之動量向過濾器施加力，且一部分流體體積通過過濾器孔口並到達位於相對於細胞之過濾器相對側之流動路徑部分(例如濾液區)中。過濾器之孔口經定大小以不允許細胞通過過濾器，且阻斷流體體積之細胞通過過濾器。在該實例中，藉由容許流體體積之慣性以使一部分流體體積通過過濾器而不容許細胞通過來減小流體體積。
預計細胞因穿過具有此結構及幾何形狀之流動路徑區段而接觸過濾器會對細胞施加力，此可影響細胞表型或存活率。此情形最通常見於非直線流動路徑部分在流動路徑中包括自其原始方向為90度或更大角度之角度或彎曲時。在尤其關注側向移位或慣性力對細胞表型或存活率之效應時，使流動路徑中之角度或彎曲包括自其原始方向小於90度之角度或彎曲。在任一事件中，用於分選後流體體積減小之流動路徑中之彎曲角度係基於以下考慮：流體體積(及含於流體體積中之細胞)之速度以及細胞之大小、可變形性及形態。
用於該等實例之被動流體體積減小中之過濾器包括具有類似形狀及大小之孔口；然而，亦預計，包括各種形狀或大小之孔口之連續過濾器或複數個包括不同形狀或大小之孔口之過濾器可用於分離具有不同大小或屬性的細胞。在一實例中，包括螺旋型彎曲之流動路徑部分中之過濾器孔口在過濾器上游部分之橫截面面積小於過濾器下游部分的過濾器孔口。在包括細胞異質混合物之流體體積通過流動路徑時，較小細胞將通過過濾器上游部分，而較大細胞將通過過濾器下游，從而僅留下最大細胞，其不能通過過濾原始側之任一過濾器孔口。在此情形下，流動路徑在沿流動路徑長度之不同點連結至複數個出口通道，從而可藉由複數個出口通道之不同通道來單獨收集在沿流動路徑長度之不同點通過過濾器之不同大小之細胞。
2801‧‧‧數位處理器件2805‧‧‧中央處理單元2810‧‧‧記憶體或記憶體位置2815‧‧‧電子儲存單元2820‧‧‧通訊介面2825‧‧‧周邊器件2830‧‧‧電腦網路3110‧‧‧過濾元件/過濾器3120‧‧‧狹縫(或孔隙、節距、間隙及/或孔口)3130‧‧‧濾液區w1‧‧‧寬度w2‧‧‧寬度
本發明之新穎特徵詳細陳述於隨附申請專利範圍中。參照陳述利用本發明原理之闡釋性實施例及以下附圖可更佳地理解本發明之特徵及優點，在附圖中：
圖1A係根據本發明一態樣之eDAR之概述。
圖1B展示根據本發明之一些實施例之檢測跡線。
圖1C展示根據本發明之一些實施例之螢光及亮視野成像數據。
圖2圖解說明根據本發明一態樣用於微製作eDAR微流體晶片之製程流程之實例。
圖3A-3H圖解說明根據本發明之一些實施例之實例性 流體動力學分選方案。
圖4A-4D展示根據本發明一態樣之eDAR之微流體晶片及流體動力學切換方案。
圖5繪示根據本發明一態樣由高速照相機記錄之當前流體方案之切換時間之實例。
圖6A-6G展示根據本發明一態樣之eDAR之表徵及分析性能。
圖7A-7E展示根據本發明一態樣所捕獲CTC之微狹縫及多色螢光成像。
圖8繪示根據本發明一態樣之「雙重捕獲」 eDAR之一般結構。
圖9A-9C展示根據本發明之一些實施例流動切換之亮視野影像。
圖10A展示多級分選裝置，其包括第一eDAR級、分散級及第二螢光活化分選級。
圖10B展示實例性第二分選級。
圖10C展示實例性第一分選級。
圖10D及E展示分散級流動伸展體在第一分選級與第二分選級之間之部分。
圖11A-11D展示根據本發明之一些實施例連結至第二分選級之實例性第一分選級之俯視圖，該第一分選級具有含有障礙物或多個不同設計之流動路徑之通道。
圖12A-12C展示連結至第二分選級且具有不同幾何結構之通道之實例性第一分選級之俯視圖。
圖13展示與具有抛物線型流動輪廓之直線通道組合之實例性魚骨狀伸展體之俯視圖。
圖14展示與多個直線通道組合之實例性多個魚骨狀伸展體之俯視圖。
圖15展示與直線通道及堰伸展體組合之實例性魚骨狀伸展體之俯視圖。
圖16展示與魚骨狀伸展體組合之具有多個流體路徑之實例性流動伸展體之俯視圖。
圖17展示與多個魚骨狀伸展體及堰伸展體組合之具有多個流體路徑之實例性流動伸展體之俯視圖。
圖18A展示包括第一eDAR級、分散級及螢光活化分選第二級之多級分選裝置。
圖18B展示操作多級分選裝置之方法。
圖19展示實例性分散級。
圖20A展示實例性流動伸展體之俯視圖。
圖20B展示實例性魚骨狀流動伸展體之俯視圖。
圖21A展示實例性堰伸展體之俯視圖。
圖21B展示實例性長堰伸展體之俯視圖。
圖22A-22C展示實例性二維堰及過濾器伸展體之俯視圖。
圖23A展示穿過利用魚骨狀結構之微流體器件之流動路徑之示意圖。
圖23B展示利用魚骨狀結構之微流體器件中之流動通道層之側視圖。
圖24A展示在分選期間來自第一分選接面之檢測跡線。
圖24B展示在分選期間來自第二分選接面之檢測跡線。
圖24C展示來自第一分選接面及第二分選接面之APD數據之組合跡線之較短區段。
圖25A-25C展示流動伸展體伸展測試之結果。
圖26A-26B展示過濾伸展體中之細胞之影像。
圖27A-27B展示繪示依序分選流體裝置中之分選之影像框。
圖28展示經程式化或進一步經構形以操作粒子收集器件之實例性數位處理器件。
圖29A展示經構形用於捕獲及釋放靶粒子之實例性流動路徑。
圖29B展示使用珠粒及過濾器中之流動反轉自過濾器釋放細胞之方法。
圖30A展示使用閥門限制穿過流動路徑之流之實例性流動路徑之俯視圖。
圖30B展示包括用於減小收集粒子之流體體積之閥門之實例性流動路徑。
圖30C展示用於在多級分選之後收集濃縮粒子之裝置。
圖31展示用於減小在分離之後收集粒子之流體體積之實例性流動路徑。

Claims (19)

  1. 一種收集流體試樣中之粒子之方法，該方法包括：檢測該試樣之第一等分試樣中該粒子之第一存在；在該第一等分試樣中檢測到該粒子之該存在後，將該第一等分試樣之流引導至第一體積中以形成第一分離試樣；分散該第一分離試樣以形成分散試樣；及對該分散試樣實施分離程序，其中該粒子係細胞。
  2. 如請求項1之方法，其中該分離程序係主動分離程序或被動分離程序。
  3. 如請求項1之方法，其中檢測該粒子之該第一存在包括：使用第一電磁輻射源訊問該第一等分試樣中之該粒子；及檢測該第一電磁輻射與該第一等分試樣中之該粒子之第一相互作用。
  4. 如請求項1之方法，其中在該流體試樣之連續流動期間檢測該第一等分試樣中該粒子之該第一存在。
  5. 如請求項1之方法，其中該粒子係罕見粒子，其中該罕見粒子係以小於1份/103個流體中總粒子群體存在於該流體試樣中。
  6. 如請求項1之方法，其中分散該第一分離試樣包括流動伸展第一收集試樣。
  7. 如請求項6之方法，其中藉由該第一收集試樣穿過流動路徑之抛物線型流動或藉由該第一收集試樣之魚骨狀混合來賦予該流動伸展。
  8. 如請求項6之方法，其中該分散該第一分離試樣包括堰混合該第一分離試樣。
  9. 如請求項6之方法，其中藉由使該第一分離試樣流動穿過複數個流動路徑來賦予該流動伸展。
  10. 如請求項1之方法，其中分散該第一分離試樣包括細胞伸展該第一分離試樣。
  11. 如請求項10之方法，其中藉由障壁賦予該細胞伸展，該障壁包括過濾器結構或通道收縮段。
  12. 如請求項11之方法，其中該障壁基於該細胞之物理屬性來改變細胞速度，該細胞之該物理屬性選自由以下組成之群：細胞體積、細胞形狀及細胞可變形性。
  13. 如請求項1之方法，其中該分離程序包括： 使用第二電磁輻射源訊問該粒子；及檢測該第二電磁輻射與該粒子之第二相互作用。
  14. 如請求項1之方法，其中該分離程序包括選自由以下組成之群之程序：螢光活化等分試樣分選、eDAR、流式細胞術、螢光活化細胞分選(FACS)及磁活化細胞分選(MACS)。
  15. 如請求項13之方法，其中在該流體試樣之連續流動期間檢測該粒子之第二存在。
  16. 如請求項1之方法，其進一步包括在選自由以下組成之群之結構中收集該粒子：小瓶、孔板及過濾體積。
  17. 如請求項1之方法，其進一步包括使用一或多個障壁、一或多個堰伸展體、一或多個微狹縫或一或多個微過濾器分散該粒子。
  18. 如請求項1之方法，其進一步包括使用被動流體結構純化該粒子。
  19. 一種用於收集流體試樣中之粒子之裝置，該裝置包括：輸入通道；檢測器，其經構形以檢測該輸入通道中之該粒子；定向流動通道，其與該輸入通道流體連通；閥門，其經構形以調節該定向流動通道中之流體流動； 輸出通道，其與該輸入通道流體連通；分散級(dispersion stage)，其與該輸出通道流體連通；及電腦，其包括處理器及上面儲存有可執行指令之非暫時性記憶體，該等可執行指令在由該處理器執行時使得該裝置：操作該檢測器以檢測該試樣之第一等分試樣中該粒子之第一存在；在該第一等分試樣中檢測到該粒子之該存在後，操作該閥門來將該第一等分試樣之流引導至第一體積中以形成第一分離試樣；將該第一分離試樣引導至該分散級以形成分散試樣；且對該分散試樣實施分離程序，其中該粒子係細胞。
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