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TWI788840B - 嗜酸乳桿菌ｔｗ０１菌株及其益生菌組合物與用途 - Google Patents

嗜酸乳桿菌ｔｗ０１菌株及其益生菌組合物與用途 Download PDF

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TWI788840B
TWI788840B TW110116826A TW110116826A TWI788840B TW I788840 B TWI788840 B TW I788840B TW 110116826 A TW110116826 A TW 110116826A TW 110116826 A TW110116826 A TW 110116826A TW I788840 B TWI788840 B TW I788840B
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Abstract

本發明是一種嗜酸乳桿菌株TW01及其組合物與用途，所使用的菌株源 自於咖啡發酵液中分離。該嗜酸乳桿菌株TW01(L.acidophilus)，在耐酸與耐膽鹽試驗中，都顯示有良好的耐受性，且對細胞激素的誘導能力佳，達到人體腸胃道菌相平衡的目標，其用途可以使用於，人體腸胃道免疫調節功能之保健功效益生菌。

Description

嗜酸乳桿菌TW01菌株及其益生菌組合物與用途
本發明是一種嗜酸乳桿菌株TW01及其組合物與用途，尤其是指一種由咖啡發酵液分離培養而成的乳桿菌株，該乳桿菌的菌株接種於Lactobacilli MRS broth(MRSB)，並於厭氧環境37℃以上，至少培養24小時後，置入冷凍櫃中保存；再由冷凍櫃中取出，進行二次活化，採集原始菌液，進行耐受性試驗。其中，嗜酸乳桿菌株TW01(L.acidophilus)，本身具備耐酸以及耐膽鹽的耐受性程度，均高於其他菌株，呈現良好的耐酸以及耐膽鹽的特質，其用途可以運用於增強人體腸胃道免疫調節功能，有開發為保健功效益生菌的高效潛力。
嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)是常見的益生菌菌種之一，是一種自然存在於人體體內的細菌，主要位於人體腸胃道中，其功能在於維持體內菌相平衡的環境，預防以及抑制有害細菌生長，避免有害細菌危害人體健康。嗜酸乳桿菌的生命週期都非常短暫，如果沒有經過其他因素的破壞，其生命周期平均為五天，但是現代人生活壓力大，導致飲食不正常，體內環境非常不利於嗜酸乳桿菌存活，因此會造成體內含量過低。為了改善此缺失，必須養成正常作息的習慣，培養適合嗜酸乳桿菌存活的體內環境，或者主動增加食用益生菌，由人體外部的補充，讓嗜酸乳桿菌順 利抵達腸胃道，尤其可以停留於小腸的器官發揮功效，才可以調整體內機能，維持腸胃道的平衡。
人體腸道中，有超過一千種以上的細菌、黴菌、酵母菌等，其中，嗜酸乳桿菌就是對於人體有益的菌種，當外在壓力或飲食習慣辛辣油膩造成體內負擔，形成壞菌增多的體內環境，導致腸胃道菌叢不平衡，尤其是小腸壞菌增加，會造成腹瀉、脹氣等不適感，造成急性發炎性腸道疾病，或者腸道長期慢性發炎等病症。目前要改善腸道疾病最有效的方法，是以藥物治療為主，主要是服用消炎藥、免疫調節劑、類固醇、抗生素等常用藥物，但是藥物服用過多，會造成藥物成癮，或者產生人體其他副作用，也有可能會誘發腸道微生物從藥物分解出毒性產物，對人體造成負擔，人類的腸道微生物，對於不同藥物代謝的差異程度，都會造成醫生用藥的評估與壓力。
其次，要改善腸道疾病的方法，是以定期定量服用嗜酸乳桿菌株及其組合物，該益生菌已長期安全廣泛使用在食品製造過程，國內外掌管健康食品的政府機關部門，以及具備專業知識能力的人，都已透過檢查其感染性、代謝活性、內生活性、藥物動力學、致病性與致病力等實驗，來確認其安全性，實驗數據顯示在健康的人身上，使用益生菌發生有害作用的報告幾乎趨近於零。但是，目前業界所遇到的問題點在於，益生菌對酸鹼值、溫度、濕度、空氣與光線等環境因素非常敏感，一旦做成製劑，活的菌落形成單位(CFU，colony-forming unit)的數量，就會隨著益生菌菌種的自然生命週期而減少，為了要讓益生菌有效，必須讓益生菌能在胃腸道存活、叢生與複製，否則益生菌無法發揮既有的功效，或者原本既有的功效，會因為益生菌對於酸鹼值的高度敏感性，而造成功效急速遞減或完全滅失。
先前技術所遇到的困難，在於嗜酸乳桿菌存活率低落，在外在自然界環境或者內在人體腸道環境，都會受到酸鹼值、溫度、濕度、空氣與光線等環境因素影響，該情況是嗜酸乳桿菌典型的先天特徵，無法透過後天實驗進行改善。因此，導致市售嗜酸乳桿菌產品成分與效用差異很大，相對而言，會直接影響到市場售價，甚至高單價的嗜酸乳桿菌產品，並不代表是高效用的保證，消費者不具備專業知識，很難辨識嗜酸乳桿菌是否為好的益生菌。實際上，嗜酸乳桿菌的效用，必須溯源到該嗜酸乳桿菌的菌株，該菌株本身是否具備有高度耐酸、耐膽鹽的耐受性，可以順利停留在小腸器官，是一個重要的指標，原因在於當食物進入小腸，小腸會刺激膽穰排出膽汁，而胰臟分泌胰液、小腸腺分泌腸液，膽汁與胰液。膽汁、胰液、小腸液呈強鹼性可中和胃酸的強酸性，由此可知，良好的嗜酸乳桿菌特徵，必須要有高度的耐酸、耐鹼性，才能夠順利在小腸發揮功效。
嗜酸乳桿菌本身對於環境的敏感程度高，很容易因為所處的環境因素而大幅影響其效用，所以在源頭培養並篩選高度具備耐酸、耐鹼能力的嗜酸乳桿菌，是非常重要的實驗過程，高度耐酸、耐鹼的嗜酸乳桿菌，可以經由口中服用，順利抵達腸道並且發揮效用，不受人體內部高酸鹼度的影響，才是良好的嗜酸乳桿菌，此嗜酸乳桿菌可以運用於益生菌產品的製程。經由研究顯示，益生菌劑量需要108CFU以上，才能增加益生菌在胃腸道生存與叢生到適合數量，如果未達108CFU，該益生菌的功效無法發揮，甚至無法達到菌種叢生的最低數量，無法達到既定的成效；倘若無法發揮功效，縱然每天定時定量服用具有嗜酸乳桿菌的保健產品，甚至加量服用，其成效也會無法彰顯，其效用等同於沒有服用。
有鑑於先前技術的缺失，以及先前技術所面臨的困難，本發明內容著重於培養以及篩選具備高度耐酸、耐膽鹽的嗜酸乳桿菌TW01，並且將該菌株運用在腸道健康與免疫調節功能的保健食品。本發明的嗜酸乳桿菌TW01，所使用的菌株自咖啡發酵液中分離，該咖啡發酵液是由台灣古坑咖啡渣進行發酵處理，再由其咖啡發酵液進行分離，所取得的特定菌株。
本發明之嗜酸乳桿菌TW01，為財團法人食品工業發展研究所寄存編號BCRC911039之生物寄存材料，名稱為嗜酸乳桿菌Lactobacillus acidophilus TW01，該嗜酸乳桿菌TW01特徵在於有良好的耐受性，尤其在耐酸以及耐膽鹽的試驗中，有顯著的良好存活反應，其中，該菌株對於細胞激素的誘導能力佳，本身具備高效潛力可以開發為腸道健康與免疫調節功能的益生菌產品。
本發明的嗜酸乳桿菌TW01，所使用的菌株自咖啡發酵液中分離，該菌種的分離與初步篩選，是以生理食鹽水依照序列稀釋，並塗抹於培養基上，需要於厭氧環境中37℃以上，至少培養24小時，再進行初步篩選、染色，並且完成實驗菌株的純化培養。
在菌種耐酸性測試中，因為乳桿菌的存活率易受pH值影響，特別是在pH3以下會對菌體產生最大傷害，所以在相關研究中，乳桿菌的耐酸性實驗，是最重要第一階段應完成的試驗，目的在於乳桿菌的菌體對於酸性環境的耐受度，以pH3之體外試驗進行乳桿菌的耐酸之研究，結果如圖1所示。
本發明的用途在於將該嗜酸乳桿菌TW01，運用於保健腸道的益生菌產品，在腸道中會有膽鹽(又稱為膽汁酸鹽)，原因在於膽鹽會排入腸道，被腸道重吸收，重吸收的膽鹽，經門脈系統入肝，彌補肝細胞合成 膽汁酸能力的不足，經由肝細胞重新攝取，轉化為結合型膽汁酸再次排入腸道，於是形成腸肝循環。由此可知，在菌種耐膽鹽測試中，是第二階段應完成的試驗，才可以知悉本發明之嗜酸乳桿菌TW01是否具備耐膽鹽的特性。
膽鹽在消化系統中，具有界面活性劑之特性，該特性對於微生物而言，是一種抑制生長的因子。本實驗以0.3%膽鹽進行體外膽鹽耐受性試驗，結果如圖1所示，除了K1-2的耐受性較差，大多菌株對0.3%膽鹽具有一定程度的耐受性，經240分鐘0.3%膽鹽溶液反應後，菌株存活量在都至少有105CFU/mL以上。
最後，益生菌對於細胞激素影響的測定，以數組測試乳桿菌是否能刺激分化之RAW264.7細胞產生MIL-10、MIL-12 p40為專題，進行乳桿菌培養與篩選，並且配置不同乳桿菌樣品或LPS，依組別加入孔盤中，也在負面控制組(negative control)中加入100ul的培養基作為空白對照組，所進行的實驗，其收集的樣品顯示，以酵素結合免疫吸附分析法Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)，分析其細胞激素MIL-I0、MIL-12 p40。ELISA是常用的一種分子生物檢測技術，其特點在於只需要少量樣品(100ul)即可進行檢測，精準度與敏感性高。
在細胞激素誘導實驗中，將巨噬細胞分別加入L.plantarum(F3-4)、L.rhamnosus(S2-1)、L.acidophilus(B-1)、L.rhamnosus(D-1)等菌株，經歷24或48小時的培養，測定細胞激素IL-10及IL-12之濃度，並計算IL-10及IL-12之比值，藉此初步篩選具有免疫功效潛力之應用菌株。由圖9、圖10可知悉，菌株B(L.acidophilus)之濃度最高，請以顯著性高於其他菌株，也高於LPS所誘導的濃度，顯示菌株B為最佳的試驗結果，具備高度耐膽鹽的耐受性，可以在高濃度的膽鹽中具備高存活率，本發明之嗜酸乳桿菌TW01及 其組合物，可以運用在腸道益生菌以及免疫調節功能產品的開發與生產。
圖1係為本發明之乳桿菌株腸胃道耐性試驗結果。
圖2係為本發明之菌種鑑定結果。
圖3係為本發明之F2-2菌株16S rRNA gene sequences鑑定結果。
圖4係為本發明之F3-4菌株16S rRNA gene sequences鑑定結果。
圖5係為本發明之S2-1菌株16S rRNA gene sequences鑑定結果。
圖6係為本發明之K1-2菌株16S rRNA gene sequences鑑定結果。
圖7係為本發明之B-1菌株16S rRNA gene sequences鑑定結果。
圖8係為本發明之D-1菌株16S rRNA gene sequences鑑定結果。
圖9係為本發明之不同益生菌對誘導細胞激素IL-10(A)的結果。
圖10係為本發明之不同益生菌對誘導細胞激素IL-12(B)的結果。
本發明之嗜酸乳桿菌TW01，是一種耐酸、耐膽鹽的益生菌株，命名為嗜酸乳桿菌Lactobacillus acidophilus TW01，已於民國110年3月5日寄存於財團法人食品工業發展研究所，其寄存編號是BCRC911039，該菌株有其獨特性與新穎性，可以廣泛運用在腸道益生菌產品，因此名稱當中特別註明TW01，意指Taiwan NO.1、臺灣第一的雙關涵義，為臺灣第一株具有高度耐酸、耐膽鹽的嗜酸乳桿菌TW01，也是益生菌株的一種。
本發明經由體外實驗，證實本發明之嗜酸乳桿菌TW01(Lactobacillus acidophilus TW01)、其代謝產物、以及經由細胞激素誘導試驗，藉此篩選具有免疫功效之應用菌株，顯示本發明之嗜酸乳桿 菌TW01(Lactobacillus acidophilus TW01)、其代謝產物，於酸性與膽鹽性的環境中，都有良好的耐受性，可用於備製腸道益生菌組合物的用途，該組合物是一醫藥品，或一保健食品，或一食品，經由口服方式給予一個體，在腸道發生功效。
依據本發明，有關細菌培養的操作程序與參數條件、有關混合物之化學分離、化學結構分析的操作程序與參數條件，是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。本文中所使用的，用語「代謝產物」意為培養細菌時，經該細菌代謝後所分泌至細菌培養液中之物質，包含培養該菌的培養液。
本發明所使用的菌株F2-2、F3-4、S2-1、K1-2、B-1、D-1，皆自咖啡發酵液中分離，實驗中所使用的藥品Ox-bile dehydrated,purified、Sodium chloride、Glycerol購自Sigma-Aldrich；Agar、Lactobacilli MRS broth、Tryptic soy broth購自Difco；厭氧產氣包、API 50 CHL檢驗套組購自啟新生物科技公司。
在菌種分離的步驟，以拍擊式均質器(鐵胃機)，將原料均質後，秤取所需樣品量，以生理食鹽水進行序列稀釋，並且取0.1mL稀釋液，塗抹於Lactobacilli MRS agar(MRSA)培養基上，完成後於厭氧環境下37℃以上，培養至少72小時。
在菌種篩選的步驟，第一步驟，以菌體顯微特徵觀察，將菌種製作成抹片，並且以光學顯微鏡，進行400~1000倍放大觀察其菌體特徵，形狀、外部構造；第二步驟，以格蘭氏染色(Gram stain)，進行菌種的鑑別，將菌體製成抹片後，依結晶紫、碘液、95%乙醇、番紅的順序進行格蘭氏染色，並於光學顯微鏡下觀察染色結果，即可完成菌種初步篩選的行為。
在實驗菌株的純化培養步驟，自菌種分離之培養皿中，依據菌落外觀挑選數個單一菌落(colony)，於MRSA培養基上，進行畫線分離，並置入37℃以上厭氧培養箱中，培養至少72小時，培養完成後，再自培養基上挑選單一菌落，進行畫線分離，至新的MRSA培養基上，重複2次，得到純菌株。
在菌株保存的步驟，第一步驟，是乳桿菌株之保存，將乳桿菌菌株接種於Lactobacilli MRS broth(MRSB)，並且於厭氧環境下37℃以上，培養至少24小時，將培養液離心(1200g、10分鐘)分離出菌體，去除上清液後，以無菌生理食鹽水懸浮並再次離心(1200g、10分鐘)分離，以去除殘留之培養基，重複2次後，將菌體懸浮於凍存液(無菌甘油與MRSB以1：1比例混合)後，吸取2ml於冷凍小管中，置於-80℃冷凍櫃中保存；第二步驟，菌株之活化，將-80℃冷凍櫃中之冷凍小管取出後置入37℃水域槽中回溫，取100μL接種於50mL MRSB中，於厭氧環境下37℃以上，培養至少24小時，再進行二次活化，為實驗用原始菌液。
在耐受性測試的步驟，第一步驟，測試菌液配置，將實驗用原始菌液，離心(1200g、10分鐘)分離出菌體，去除上清液後，以無菌生理食鹽水懸浮並再次離心(1200g、10分鐘)分離，以去除殘留之培養基，重複2次後，以生理食鹽水回溶至菌液濃度大約108CFU/mL，即為測試菌液。
第二步驟，進入耐酸性測試，以5N鹽酸溶液及0.1N無菌氫氧化鈉溶液，將生理食鹽水調整至pH 2.0、pH 3.0，此即為耐酸性測試溶液。取試驗菌液1mL，加入1.5mL無菌生理食鹽水，再加入5mL耐酸性測試溶液，於37℃以上，培養至少30與60分鐘後，採樣並進行乳桿菌菌數分析，以log CFU/mL表示。
第三步驟，進入耐膽鹽測試，以無菌生理食鹽水中加入 0.3%、0.5%(w/v)牛膽汁(Ox-bile dehydrated,purified)，並且以0.1N無菌氫氧化鈉溶液調整至pH 8.0，製備成模擬膽鹽溶液。取試驗菌液1mL，加入1.5mL無菌生理食鹽水，再加入5mL模擬膽鹽溶液，於37℃以上，培養至少240分鐘後，採樣並進行乳桿菌菌數分析，以log CFU/mL表示。存活率以Log最終菌數/Log起始菌數×100%表示。
在菌種鑑定的方式，第一種方式，採用API套組，使用之套組為API 50 CHL，將實驗用原始菌液離心(1200g,10分鐘)分離出菌體，去除上清液後，以無菌生理食鹽水懸浮並再次離心(1200g,10分鐘)分離，以去除殘留之培養基，重複2次後，以生理食鹽水回溶至菌液濃度大約6X10^10CFU/mL。取此菌液0.1mL分別加入10mL API 50CHL Medium中，即為API測試菌液。再培養盒中加入10mL無菌水將API測試條放入盒中，並於測試條中的50個測試孔內注入API測試菌液，並以無菌礦物油密封各個測試孔。放入35℃以上培養箱培養，並於至少24、48小時觀察結果並記錄。由此實驗結果與API web資料庫進行比對，得知菌種鑑定結果。
第二種方式，採用16S rRNA鑑定，取測試菌液1mL至2mL至eppendorf中，離心並去除上清液，加入萃取液，並震盪混合後靜置10分鐘。吸取上清液至新的eppendorf中，另外配置100被稀釋液於另一eppendorf中，並加入引子及dNTP，以用於PCR反應。經多次循環後離心分離產物並純化，跑膠後切取16S rRNA所在位置並進行定序。
在益生菌對細胞激素影響之測定中，測試乳桿菌S2-1、F3-4、B-1、D-1是否能刺激分化之RAW264.7細胞產生MIL-10、MIL-12 p40。將RAW264.7細胞從平板刮下，離心後以培養基回溶並計數細胞濃度，配置成6.25×105cell/孔；400μl/孔，依組別種入孔盤中(400μl/孔)。第二天，配置不同乳桿菌樣品或LPS，各取100及200pg/mL，依組別加入孔盤中 (100μl/孔)，並在負面控制組(negative control)中加入100ul的培養基，作為空白對照組。培養至少24小時或48小時後，在倒立螢光顯微鏡下觀察，並且將上清液以10000rpm離心10分鐘，取上清液至-20℃凍存備用。取24小時及48小時收集之樣品，以ELISA分析其細胞激素MIL-10、MIL-12 p40，繪製成圖表後得出圖9及圖10所示之結果。
由實驗結果得知，本發明嗜酸乳桿菌TW01，自8種原料樣品中，篩選出28株發酵菌株，經初步篩選後，選出F2-2、F3-4、S2-1、B-1、D-1、K1-2等6株菌株進行試驗，其外觀皆屬於白色圓頂菌落，菌體顯微觀察皆屬於球菌至桿菌，格蘭氏染色結果均為陽性，觸媒反應為陰性，皆符合乳桿菌的基本特徵。
由耐酸性實驗結果得知，乳桿菌的存活率，非常容易受pH值影響，特別是在pH3以下，會對菌體產生最大傷害。在相關研究中，大多以pH3之體外試驗進行乳桿菌的耐酸之研究，結果如圖1所示，經初步篩選之6株菌株與對照菌株，在對pH 2耐酸性測試溶液的表現上，均不甚理想，在30分鐘時，大多數菌株存活量皆下降了4~5個log值，在反應60分鐘後，F2-2、S2-1、D-1等菌株已經完全死亡，其餘3株則具有較佳的低pH值耐性。其中，表現最好的菌株為F3-4，其在30分鐘時，存活量的表現不如B-1，然而在60分鐘時，存活量仍能保持在103CFU/mL以上，耐酸能力明顯高於其他菌株。
由耐膽鹽實驗結果得知，膽鹽在消化系統中，具有界面活性劑之特性，對微生物而言，是一種抑制生長的因子。本發明的耐膽鹽實驗，是以0.3%膽鹽進行體外膽鹽耐受性試驗，結果如圖1所示，除了K1-2的耐受性較差，大多菌株對0.3%膽鹽，具有一定程度的耐受性，經240分鐘0.3%膽鹽溶液反應後，菌株存活量在都至少有105CFU/mL以上。
由菌種鑑定的結果得知，本發明使用API 50 CHL套組進行菌種的鑑定，鑑定結果如圖2所示，6株菌株皆屬於Lactobacillus屬，分別為Lactobacillus pentosus(F2-2)與L.plantarum(F3-4)、L.rhamnosus(S2-1)、L.rhamnosus(K1-2)、L.acidophilus(B-1)、L.rhamnosus(D-1)。
在使用API套組初步鑑定後，再採用16S rRNA gene sequences鑑定，定序結果經NCBI Blest比對結果(圖3至圖8)，發現F2-2、F3-4、K1-2三株比對結果，與API試驗不同，分別為Leuconostoc mesenteroides(F2-2)、L.citreum(K1-2)、L.paraplantarum(F3-4)。由於菌種的生化特性，會因分離來源不同而有所差異，而16S rRNA gene sequences鑑定，是利用微生物基因中的保守片段進行鑑定，較API具有可回溯性，因此將16S rRNA gene sequences鑑定結果視為最終鑑定結果。
由細胞激素測定的結果得知，細胞激素誘導試驗，是將巨噬細胞RAW 264.7培養至濃度6.25×105cell/孔後，分別加入100或200pg/mL的L.plantarum(F3-4)、L.rhamnosus(S2-1)、L.acidophilus(B-1)、L.rhamnosus(D-1)等菌株，共培養至少24或48小時，測定細胞激素IL-10及IL-12之濃度，並計算IL-10及IL-12之比值，藉此初步篩選具有免疫功效潛力之應用菌株。
由圖9、圖10可得而知，菌株B(L.acidophilus)不管是濃度100或200pg/mL所提升IL-10的濃度最高，該顯著性高於其他菌株，也高於LPS所誘導的濃度，而共培養至少48小時後，會略低於24小時之誘導濃度。而在IL-12之誘導結果，與IL-10有類似的結果，菌株B(L.acidophilus)可誘導最高的IL-12濃度，在24小時與48小時的情況，都沒有顯著性差異，而菌株D(L.rhamnosus)雖然在IL-10與IL-12都低於菌株B(L.acidophilus)，但仍顯著性高於菌株F(L.plantarum)與S(L.rhamnosus)。
綜上所述，顯示菌株B在耐酸與耐膽鹽試驗中，都顯示良好的耐受 性，且對細胞激素的誘導能力最佳，該菌株(L.acidophilus)具有開發為腸道健康與免疫調節功能之保健功效益生菌潛力；本發明之嗜酸乳桿菌株TW01及其組合物，其用途得與一醫藥品、或一保健食品，或一食品結合製成藥錠、粉末、食品等產出物。
依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者，所詳知的技術，而被製造成一適合於經腸道投藥的劑型，這包括，但不限於：錠劑、咀嚼錠、膜衣錠、口溶錠、舌下錠、膠囊、緩釋口服劑型、腸溶口服劑型、粉末、溶液、注射品、外部製劑(external preparation)以及類似之物。
依據本發明，食品產品可被當作食品添加物(food additive)，藉由習知方法於原料製備時添加，或是於食品的製作過程中添加，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。食品產品的種類，這包括，但不限於：飲料、發酵乳、優酪乳、發酵食品、烘培產品、健康食品以及膳食補充品、營養補充品。
【生物材料寄存】
國內寄存資訊
財團法人食品工業發展研究所、2021年3月5日、BCRC 911039

Claims (10)

  1. 一種嗜酸乳桿菌TW01(Lactobacillus acidophilus TW01)菌株，寄存於財團法人食品工業發展研究所，其寄存編號為BCRC911039。
  2. 如申請專利範圍第1項之嗜酸乳桿菌TW01(Lactobacillus acidophilus TW01)菌株，其中該嗜酸乳桿菌之菌體屬球菌至桿菌，外觀屬白色圓頂菌落。
  3. 如申請專利範圍第1項之嗜酸乳桿菌TW01(Lactobacillus acidophilus TW01)菌株，能夠經受耐酸性測試至少30分鐘且具有存活量，所述的耐酸性測試，是將PH 2.0到PH 3.0之間的溶液與該菌株結合，培養在37℃以上的環境。
  4. 如申請專利範圍第1項之嗜酸乳桿菌TW01(Lactobacillus acidophilus TW01)菌株，能夠經受耐膽鹽測試至少240分鐘且具有存活量，所述的耐膽鹽測試，是將PH 8.0到PH 9.0之間的溶液與該菌株結合，培養在37℃以上的環境。
  5. 如申請專利範圍第1項之嗜酸乳桿菌TW01(Lactobacillus acidophilus TW01)菌株，係以一篩選方法獲得，該篩選方法包括：採集菌體並提供至一培養基中，培養在37℃以上的環境，至少72小時，重複數次，得到若干純菌株；將該若干純菌株分別先後經受耐酸性測試及耐膽鹽測試，觀察篩選出具存活量之純菌株，其中所述的耐酸性測試，是將PH 2.0到PH 3.0之間的溶液與該菌株結合，培養在37℃以上的環境至少30分鐘，其中所述的耐膽鹽測試，是將PH 8.0到PH 9.0之間的溶液與該菌株結合，培養在37℃以上的環境至少240分鐘。
  6. 如申請專利範圍第5項之嗜酸乳桿菌TW01(Lactobacillus acidophilus TW01)菌株，其中的菌體採集自咖啡發酵液。
  7. 一種益生菌組合物，包含如申請專利範圍第1項之嗜酸乳桿菌TW01(Lactobacillus acidophilus TW01)菌株。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之益生菌組合物，該益生菌組合物為醫藥品、食品或食品添加物。
  9. 一種如申請專利範圍第1項之嗜酸乳桿菌TW01(Lactobacillus acidophilus TW01)菌株的用途，係用以製備益生菌組合物。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之嗜酸乳桿菌TW01(Lactobacillus acidophilus TW01)菌株的用途，該益生菌組合物為醫藥品、食品或食品添加物。
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