TWI642778B - 對卵巢癌具有專一性的適合體及卵巢癌檢測方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種對卵巢癌具有專一性的適合體及卵巢癌檢測方法。適合體包括以下核苷酸序列：5’-ncaaannncnnnnanncnnnnnnnnnnngaannnannngg-3’，其中n為獨立地選自於a、t、c及g中任一者的核苷酸。
Description
本發明是有關於一種適合體與檢測方法，且特別是有關於一種對卵巢癌具有專一性的適合體及卵巢癌檢測方法。
卵巢癌為常見的婦科癌症之一，通常早期發現會有不錯的治癒率。但是由於大部份的卵巢癌在早期都沒有明顯的症狀，所以大部份的婦女當被發現是卵巢癌的時候，通常都已經擴散，成為較晚期的癌症。晚期卵巢癌病人平均五年存活率約只有 10%~20%。卵巢癌可發生於任何年齡群，其發生率隨年齡逐年增高，而卵巢上皮細胞瘤，則主要發生於40歲以後的婦女，其中惡性的卵巢生殖細胞腫瘤最易發生於不滿20歲的病人。
對於惡性腫瘤的治療，如何早期發現和早期診斷是治療惡性腫瘤最首要的課題。而隨著國人的平均壽命的延長，癌症早期診斷也越來越受到重視。然而，到目前為止仍然沒有一種檢驗或檢查可有效幫助早期篩檢卵巢癌。臨床上對卵巢癌常用的篩檢方法有：（1）陰道超音波與都卜勒超音波。但因為早期卵巢癌的外形類似於正常大小、正常外觀的卵巢，顧利用超音波診斷存在相當難度與瓶頸；（2）血清腫瘤標誌，如 CA-125、溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acid，LPA）、A型胎兒蛋白 （alpha-fetoprotein，A-FP）、人類絨毛膜性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）、抑制素（inhibin）和中腎管抑制激素（Mullerian inhibiting substance，MIS）等等。目前的研究指出，血清腫瘤標誌的臨床用途，主要在於手術後追蹤及早期偵測復發性腫瘤。但由於專一性低，未來臨床研究與偵測上仍需要其他高專一性血清腫瘤標記的發展，以利卵巢癌早期快速偵測而增加預後（prognosis）存活率。
本發明提供一種適合體，其對卵巢癌具有專一性。
本發明提供一種卵巢癌的檢測方法，其具有高靈敏度及專一性。
本發明提出一種適合體，對卵巢癌具有專一性，其包括以下核苷酸序列：5’-ncaaannncnnnnanncnnnnnnnnnnngaannnannngg-3’（SEQ ID NO: 1），其中n為獨立地選自於a、t、c、g中任一者的核苷酸。
在本發明的一實施例中，上述的適合體包括以下核苷酸序列：5’-tcaaattacggaaaatcatgacggggtggaaccgaggggg-3’（SEQ ID NO: 2）。
在本發明的一實施例中，上述的適合體包括以下核苷酸序列：5’-gcaaacagctctgagacgaattccatgtgaaaacattcgg-3’（SEQ ID NO: 3）。
在本發明的一實施例中，上述的適合體的自由能變化（variation of the free energy，ΔG）例如是小於-5 kcal/mol。
在本發明的一實施例中，上述的適合體例如是具有主幹（stem）與環（loop）的二級結構。
在本發明的一實施例中，上述的適合體的5’端可經螢光、硫基、生物素以及酵素中任一者修飾。
本發明提出一種卵巢癌的檢測方法，所述檢測方法包括以下步驟。首先，提供至少一種上述的適合體。接著，混合待測樣本與適合體，使待測樣本與適合體結合。然後，偵測與待測樣本結合的適合體。
在本發明的一實施例中，上述的待測樣本例如是卵巢癌組織或卵巢癌細胞。
在本發明的一實施例中，上述的卵巢癌組織例如是漿液性卵巢癌組織、透明性卵巢癌組織、黏液性卵巢癌組織或子宮內膜樣的卵巢癌組織。
在本發明的一實施例中，上述的卵巢癌細胞例如是OVCAR-3。
基於上述，本發明的適合體對於不同組織學型態的卵巢癌組織及/或卵巢癌細胞具有高度專一性及親和力，因此使用所述適合體的卵巢癌檢測方法具有快速檢測、高靈敏度以及高專一性等優點。
為讓本發明的上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明如下。
本發明是藉由結合系統性配分子指數增益演繹程序（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）體外篩選技術與整合型微流體系統（integrated microfluidic system）以篩選出對卵巢癌具有結合專一性的適合體，所篩選得到的適合體對於不同型態的卵巢癌組織及細胞具有高的結合率。為了能徹底地了解本發明，將在以下實施例中詳盡描述所述適合體的篩選步驟。
[單股DNA資料庫（single-stranded DNA library）]
單股DNA資料庫包含有440
種單股DNA，該些單股DNA是由每得科技有限公司（Medclub Scientific Co. Ltd., Taiwan）所合成。單股DNA資料庫中的每一個單股DNA均為由72個核苷酸組成的核苷酸序列。具體來說，每一個單股DNA包括由40個核苷酸（以n來表示）所組成的隨機序列（random sequence）、由16個核苷酸所構成的5’-引子區域（5’-primer region）以及由16個核苷酸所構成的3’-引子區域（3’- primer region）： 5’-ggcaggaagacaaaca-[n]40
-tggtctgtggtgctgt-3’(SEQ ID NO: 6)，其中n表示任一個選自於腺嘌呤（adenine，a）、胸腺嘧啶（thymine，t）、胞嘧啶（cytosine，c）、鳥嘌呤（guanine，g）中任一者的核苷酸。在本實施例中，5’引子區域以及3’引子區域分別被設計成具有可被Super-Therm Gold DNA聚合酶（Super-Therm Gold DNA polymerase)(Bertec Enterprise Co. Ltd., Taiwan）辨識的核苷酸序列以供進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）。
將適量的單股DNA資料庫溶於去離子水中，以得到濃度為100 μM的單股DNA資料庫原液（oligonucleotide library stock solution）備用。
[整合型微流體晶片]
本實施例的整合型微流體晶片典型地包括反應槽、儲存槽、流體控制模組、閥門以及微流體管道等。在本實施例中，流體控制模組可包括管道、氣室以及氣動式閥門，可藉由控制氣室來產生正壓或負壓使氣動式閥門開啟或關閉以及控制流體的流動方式。上述整合型微流體晶片可自動化地執行SELEX，分離出對卵巢癌具有結合專一性的適合體。
[以整合型微流體系統執行SELEX以篩選適合體的流程]
圖1為依照本發明之一實施例的篩選對卵巢癌具有結合專一性的適合體的流程步驟圖。
請參照圖1，並提供篩選適合體步驟的詳細敘述如下。
首先，執行步驟S100：將單股DNA資料庫與非目標疾病組織切片進行結合反應以進行負篩選（negative selection）。具體來說，將單股DNA資料庫提供至放置有非目標疾病組織切片的反應槽中，以使單股DNA資料庫與非目標疾病組織切片混合。在本實施例中，非目標疾病組織切片例如是正常的組織切片，但本發明不限於此，只要是非卵巢癌的組織切片即可作為本發明的非目標疾病組織切片。在單股DNA資料庫與非目標疾病組織切片進行結合反應的過程中，單股DNA資料庫中與非目標疾病組織切片具有專一性的單股DNA會與非目標疾病組織切片結合。在本實施例中，進行結合反應的時間例如是1分鐘至60分鐘，較佳為30分鐘。
接著，執行步驟S110：清洗非目標疾病組織切片，以分離出未與非目標疾病組織切片結合的單股DNA。具體來說，將清洗緩衝液傳送至反應槽中並對非目標疾病組織切片進行清洗。在沖洗的過程中，由於與非目標疾病組織切片結合的單股DNA會殘留在非目標疾病組織切片上，藉此可分離出未與非目標疾病組織切片結合的單股DNA。
然後，執行步驟S120：將未與非目標疾病組織切片結合的單股DNA與卵巢癌組織切片進行結合反應以進行正篩選（positive selection）。具體來說，將未與非目標疾病組織切片結合的單股DNA提供至放置有卵巢癌組織切片的反應槽中，以使未與非目標疾病組織切片結合的單股DNA與卵巢癌組織切片混合。在本實施例中，卵巢癌組織的型態例如是漿液性腫瘤（serous carcinoma）、透明性腫瘤（clear cell carcinoma）、黏液性腫瘤（mucinous carcinoma）或子宮內膜樣腫瘤（endometrioid carcinoma）。在上述該些單股DNA與卵巢癌組織切片進行結合反應的過程中，與卵巢癌組織切片具有高度專一性的單股DNA會與卵巢癌組織切片結合。在本實施例中，進行結合反應的時間例如是5分鐘至60分鐘，較佳為30分鐘。
之後，執行步驟S130：清洗卵巢癌組織切片，以移除與卵巢癌組織切片具低親和力及/或未結合的單股DNA。具體來說，將清洗緩衝液傳送至反應槽中並對卵巢癌組織切片進行清洗。在沖洗的過程中，由於與卵巢癌組織切片高度結合的單股DNA會殘留在卵巢癌組織切片上，藉此可移除與卵巢癌組織切片具低親和力及/或未結合的單股DNA。在本實施例中，僅進行一次清洗步驟，但本發明不限於此，可視需求而增加清洗步驟的次數。
然後，執行步驟S140：加熱結合有單股DNA的卵巢癌組織切片，以使單股DNA釋出。在本實施例中，加熱的溫度例如是92℃至98℃，較佳為95℃。由於所釋出的單股DNA對卵巢癌組織切片具有高度專一性，因此該些單股DNA可視為對卵巢癌具有專一性的適合體。
之後，執行步驟S150：將所釋出的單股DNA進行增幅。在本實施例中，將所釋出的單股DNA進行增幅的方法例如是聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction；PCR），其中以所釋出的單股DNA作為模板，以及單股DNA的5’-引子區域序列及3’-引子區域序列作為引子。此外，在本實施例中，整合型微流體晶片的反應槽可作為聚合酶連鎖反應槽。
在本實施例中，可將上述所得到的PCR產物進行多次的循環篩選（例如三次）。具體來說，可將所得到PCR產物作為下一次循環篩選的單股DNA資料庫，並重複進行步驟S100至S150，以篩選出對卵巢癌組織切片更具專一性的單股DNA。經過多次篩選循環後，可將所得到PCR產物進行選殖（cloning）與基因定序，以得到對卵巢癌具有高度專一性的適合體。
根據上述實施例，篩選出對卵巢癌具有高度專一性的適合體A與適合體B。適合體A的整體序列為5’-acagcaccacagaccatcaaattacggaaaatcatgacggggtggaaccgagggggtgtttgtcttcctgcc-3’（SEQ ID NO: 4），共包括72個核苷酸。
適合體A的中心區域的序列為5’-tcaaattacggaaaatcatgacggggtggaaccgaggggg-3’（SEQ ID NO: 2），共包括40個核苷酸。
適合體B的整體序列為5’-acagcaccacagaccagcaaacagctctgagacgaattccatgtgaaaacattcggtgtttgtcttcctgcc-3’（SEQ ID NO: 5），共包括72個核苷酸。
適合體B的中心區域的序列為5’-gcaaacagctctgagacgaattccatgtgaaaacattcgg-3’（SEQ ID NO: 3），共包括40個核苷酸。
將適合體A與適合體B的整體序列（SEQ ID NO: 4與SEQ ID NO: 5）以兩種生物資訊軟體（WEBLOGO (http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)以及T COFFEE (http://tcoffee.vital-it.ch/apps/tcoffee/index.html)）進行比對分析，申請人推論出如下所示的40個核苷酸的保守性的中心區域（conserved central region）對於適合體與卵巢癌細胞及/或卵巢癌組織的親和力是極重要的： 5’-ncaaannncnnnnanncnnnnnnnnnnngaannnannngg-3’（SEQ ID NO: 1），其中n為獨立地選自於腺嘌呤（adenine，a）、胸腺嘧啶（thymine，t）、胞嘧啶（cytosine，c）、鳥嘌呤（guanine，g）中任一者的核苷酸。
將適合體A與適合體B的整體序列（SEQ ID NO: 4與SEQ ID NO: 5）以MFOLD程式進行二級結構預測，其結果如圖2所示。本實施例的適合體A與適合體B例如是具有主幹與環的二級結構。此外，SEQ ID NO: 4與SEQ ID NO: 5的自由能變化小於-5 kcal/mol。具體來說，SEQ ID NO: 4的自由能變化為-6.88 kcal/mol，SEQ ID NO: 5的自由能變化為-8.60 kcal/mol。自由能變化為一熱力學的特性，可藉由自由能變化的值來預測逆反應是否可自發性地發生。當自由能變化為負值時，表示該反應為自發性反應，反之則為非自發性反應。在此實施例中，由於對卵巢癌具有專一性的適合體A與適合體B具有負值的自由能變化，因此表示適合體A與適合體B形成立體結構的反應為自發性反應。此外，對卵巢癌具有專一性的適合體的自由能變化小（小於-5 kcal/mol），表示所形成的立體結構較穩定，因此本實施例的適合體適合作為檢測卵巢癌的生物標記（Biomarker）。
在本實施例中，適合體的5’端可以經螢光、硫基、生物素以及酵素中任一者修飾，使其易於與特定基質結合或具有發光等標記特性。
本發明另提出一種卵巢癌檢測方法，所述檢測方法包括以下步驟。首先，提供至少一種上述適合體。接著，混合待測樣本與適合體，使待測樣本與適合體結合。然後，偵測與待測樣本結合的適合體。在本實施例中，待測樣本例如是卵巢癌組織或卵巢癌細胞。卵巢癌組織例如是漿液性卵巢癌組織、透明性卵巢癌組織、黏液性卵巢癌組織或子宮內膜樣的卵巢癌組織。卵巢癌細胞例如是OVCAR-3。由於上述實施例的適合體可專一性地與卵巢癌組織以及卵巢癌細胞結合，因此可藉由偵測與待測樣本結合的適合體來確定待測樣本中是否有卵巢癌組織或卵巢癌細胞存在。
以下，列舉本揭露的實驗例以更具體證實本發明的適合體對於對卵巢癌具有高度專一性。然而，在不脫離本發明的精神，可適當地對以下的實驗例中所示的材料、使用方法等進行變更。因此，本發明的範圍不應以以下所示的實驗例來限定解釋。
[實驗例1]
在本實驗例中，利用化學合成的方法來合成適合體A的中心區域的核苷酸序列（SEQ ID NO: 2），以作為本實驗例的適合體（以下稱適合體A-1）。接著，於適合體A-1的5’端修飾羧基螢光素（carboxyfluorescein，FAM），且FAM在藍光激發下會產生綠色螢光訊號。然後，將經修飾的適合體A-1分別與正常組織切片（作為非目標疾病組織切片）以及各種不同型態的卵巢癌組織切片（漿液性（serous）、透明性（clear cell）、黏液性（mucinous）以及子宮內膜樣（endometrioid）的卵巢癌組織切片）混合以進行螢光染色，接著使用螢光顯微鏡（fluorescent microscope）觀察螢光訊號。
[實驗例2]
在本實驗例中，利用化學合成的方法來合成適合體B的中心區域的核苷酸序列（SEQ ID NO: 3），以作為本實驗例的適合體（以下稱適合體B-1）。接著，於適合體B-1的5’端修飾羧基螢光素。然後，將經修飾的適合體B-1分別與各種不同型態的卵巢癌組織切片（透明性、黏液性以及子宮內膜樣的卵巢癌組織切片）混合以進行螢光染色，接著使用螢光顯微鏡觀察螢光訊號。
圖3為適合體A-1對正常組織切片與不同型態卵巢癌組織切片進行螢光染色的影像分析圖。圖4為適合體B-1對不同型態卵巢癌組織切片進行螢光染色的影像分析圖。
圖3與圖4顯示了正常組織切片與不同型態卵巢癌組織切片進行螢光染色後的可見光影像、FAM螢光影像以及可見光影像與FAM螢光影像的重疊影像。在螢光顯微鏡的觀察下，僅有在卵巢癌組織切片中看到綠色螢光的訊號，而在正常組織切片則未看到綠色螢光訊號。此外，圖3與圖4還顯示了正常組織切片與不同型態卵巢癌組織切片進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色法後的影像。可藉由可見光影像與FAM螢光影像的重疊影像以及進行HE染色法所得到的影像來判斷適合體A-1以及適合體B-1在卵巢癌組織切片中所結合的具體位置。由上述可知，適合體A-1與適合體B-1可專一性地與不同型態卵巢癌組織切片結合。
[實驗例3]
在本實驗例中，使用實驗例1的經FAM修飾後的適合體A-1作為本實驗例的適合體。將修飾後的適合體A-1分別與正常子宮頸上皮細胞（cervical epithelial cell）（作為非目標疾病細胞）以及卵巢癌細胞株OVCAR-3混合以進行螢光染色。然後，使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）對經適合體A-1處理後的細胞進行細胞核螢光染色，DAPI在紫外光激發下會產生藍色螢光訊號。接著，接著使用螢光顯微鏡觀察螢光訊號。
圖5為適合體A-1對正常細胞與卵巢癌細胞株OVCAR-3進行螢光染色的影像分析圖。
圖5顯示了正常細胞與卵巢癌細胞株OVCAR-3進行螢光染色後的可見光影像、FAM螢光影像、DAPI螢光影像以及可見光影像與FAM螢光影像及DAPI螢光影像的重疊影像。在螢光顯微鏡的觀察下，僅有在卵巢癌細胞株OVCAR-3中看到綠色螢光的訊號，而在正常細胞則未看到綠色螢光訊號。由上述可知，適合體A-1可專一性地與卵巢癌細胞結合。
綜上所述，上述實施例的適合體對於不同型態的卵巢癌組織及/或卵巢癌細胞具有高度專一性及親和力，因此使用上述實施例的適合體的卵巢癌檢測方法具有快速檢測、高靈敏度以及高度專一性等優點。
雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作些許的更動與潤飾，故本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
S100、S110、S120、S130、S140、S150‧‧‧步驟
圖1為依照本發明之一實施例的篩選對卵巢癌具有結合專一性的適合體的流程步驟圖。 圖2為本發明的適合體的二級結構圖。 圖3為適合體A-1對正常組織切片與不同型態卵巢癌組織切片進行螢光染色的影像分析圖。 圖4為適合體B-1對不同型態卵巢癌組織切片進行螢光染色的影像分析圖。 圖5為適合體A-1對正常細胞與卵巢癌細胞株OVCAR-3進行螢光染色的影像分析圖。
＜110＞ 國立清華大學
＜120＞ 對卵巢癌具有專一性的適合體及卵巢癌檢測方法
＜160＞ 6
＜210＞ 1
＜211＞ 40
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工序列
＜220＞
＜221＞ Misc_feature
＜222＞ (1, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 32, 33, 34, 36, 37, 38)
＜223＞ n=a或g或c或t
＜400＞ 1 ncaaannncn nnnanncnnn nnnnnnnnga annnannngg 40
＜210＞ 2
＜211＞ 40
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工序列
＜400＞ 2 tcaaattacg gaaaatcatg acggggtgga accgaggggg 40
＜210＞ 3
＜211＞ 40
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工序列
＜400＞ 3 gcaaacagct ctgagacgaa ttccatgtga aaacattcgg 40
＜210＞ 4
＜211＞ 72
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工序列
＜400＞ 4 acagcaccac agaccatcaa attacggaaa atcatgacgg ggtggaaccg agggggtgtt 60 tgtcttcctg cc 72
＜210＞ 5
＜211＞ 72
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工序列
＜400＞ 5 acagcaccac agaccagcaa acagctctga gacgaattcc atgtgaaaac attcggtgtt 60 tgtcttcctg cc 72
＜210＞ 6
＜211＞ 72
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工序列
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(16)
<223> 5’引子區域
<220>
<221> Misc_feature
<222> (17)..(56)
<223> n=a或g或c或t
<220>
<221> primer_bind
<222> (57)..(72)
<223> 3’引子區域
<400> 6
Claims (8)
- 一種適合體，對卵巢癌具有專一性，所述適合體的核苷酸序列為SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。
- 如申請專利範圍第1項所述的適合體，其中所述適合體的自由能變化小於-5kcal/mol。
- 如申請專利範圍第1項所述的適合體，其中所述適合體為具有主幹與環的二級結構。
- 如申請專利範圍第1項所述的適合體，其中所述適合體的5’端經螢光、硫基、生物素以及酵素中任一者修飾。
- 一種活體外卵巢癌檢測方法，包括：提供至少一種如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述的適合體；混合待測樣本與所述適合體，使所述待測樣本與所述適合體結合；以及偵測與所述待測樣本結合的所述適合體。
- 如申請專利範圍第5項所述的活體外卵巢癌檢測方法，其中所述待測樣本包括卵巢癌組織或卵巢癌細胞。
- 如申請專利範圍第6項所述的活體外卵巢癌檢測方法，其中所述卵巢癌組織包括漿液性卵巢癌組織、透明性卵巢癌組織、黏液性卵巢癌組織或子宮內膜樣的卵巢癌組織。
- 如申請專利範圍第6項所述的活體外卵巢癌檢測方法，其中所述卵巢癌細胞包括OVCAR-3。
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