TWI608844B

TWI608844B - Ｎｅｉｌ３胜肽及其疫苗

Info

Publication number: TWI608844B
Application number: TW104130737A
Authority: TW
Inventors: 角田卓也; 大澤龍司; 吉村祥子; 渡邊朝久; 中村祐輔; 古川洋一
Original assignee: 腫瘤療法科學股份有限公司
Priority date: 2009-03-18
Filing date: 2010-03-17
Publication date: 2017-12-21
Also published as: US9045557B2; US20150290307A1; BRPI1009301A2; NZ594198A; JP5799394B2; CN102356155B; KR101744514B1; RU2600888C2; SG2014013148A; CA2755342C; HUE030856T2; AU2010225997A1; US20160340398A1; CN105601725B; TWI568444B; US20180222954A1; CN102356155A; US20120093845A1; PL2408913T3; US9975935B2

Description

NEIL3胜肽及其疫苗

本發明係關於生物科學領域，更特別對於癌症治療領域。特別是，本發明係關於新穎之胜肽，其當作癌症疫苗及治療與避免腫瘤之藥物為非常有效。

已證實CD8+細胞毒殺性T淋巴球辨認來自建造於主要組織相容性抗原複合體(major histocompatibility complex,MHC)class I分子上之腫瘤相關抗原(tumor-associated antigens,TAAs)的抗原決定位胜肽，且之後殺死腫瘤細胞。自從發現黑色素瘤抗原(melanoma antigen,MAGE)家族為腫瘤相關抗原之第一個例子，主要藉由免疫方法，已發現許多其他腫瘤相關抗原(Boon T,Int J Cancer 1993 May 8,54(2)：177-80；Boon T & van der Bruggen P,J Exp Med 1996 Mar 1,183(3)：725-9)。一些腫瘤相關抗原目前為在臨床發展之過程中當作免疫治療標的。能誘導有效且專一之抗腫瘤免疫反應的新腫瘤相關抗原的辨認成為於多種形式癌症中之胜肽疫苗接種策略(vaccination strategies)之更進一步臨床應用的發展的根據(NPL 3/Harris CC,J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16,88(20)：1442-55；NPL 4/Butterfield LH et al.,Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13)：3134-42；NPL 5/Vissers JL et al.,Cancer Res 1999 Nov 1,59(21)：5554-9；NPL 6/van der Burg SH et al.,J Immunol 1996 May 1,156(9)：3308-14；NPL 7/Tanaka F et al.,Cancer Res 1997 Oct 15,57(20)：4465-8；NPL 8/Fujie T et al.,Int J Cancer 1999 Jan 18,80(2)：169-72；NPL 9/Kikuchi M et al.,Int J Cancer 1999 May 5,81(3)：459-66；NPL 10/Oiso M et al.,Int J Cancer 1999 May 5,81(3)：387-94)。迄今已報導許多使用這些腫瘤相關抗原衍生之胜肽的臨床試驗。不幸地，到目前為止，於這些癌症疫苗試驗中，僅可觀察到一低的客觀反應率(objective response rate)(NPL 11/Belli F et al.,J Clin Oncol 2002 Oct 15,20(20)：4169-80；NPL 12/Coulie PG et al.,Immunol Rev 2002 Oct,188：33-42；NPL 13/Rosenberg SA et al.,Nat Med 2004 Sep,10(9)：909-15)。

作為免疫治療標的，合適的腫瘤相關抗原係對於癌症細胞增殖與存活為必須的，由於使用此腫瘤相關抗原可將廣為敘述之癌細胞免疫逃脫(immune escape)的風險最小化，而癌細胞免疫逃脫為治療性驅使免疫篩選的結果，歸因於腫瘤相關抗原的刪除、突變或向下調控。另一方面，Nei內切酶VIII-like 3(Nei endonuclease VIII-like 3,NEIL3)已被分離為屬於與細菌Fpg/Nei家族同源之DNA糖基化酶(glycosylase)的一類(NPL 14/Bandaru et al.,DNA Repair(Amst).2002 Jul 17；1(7)：517-29)。這些糖基化酶起始於鹼基延伸修復中的第一步驟藉由分裂被活性氧分子(reactive oxygen species)損傷之鹼基且經由相關裂解酶(lyase)反應引入一DNA股斷裂(DNA strand break)。NEIL3似乎於DNA修復機制中扮演一重要角色，然而，其與致癌作用之關係仍未被解釋。

【引用文獻】

非專利文獻(Non Patent Literature)

[NPL 1] Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80

[NPL 2] Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9

[NPL 3] Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55

[NPL 4] Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42

[NPL 5] Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9

[NPL 6] van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14

[NPL 7] Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8

[NPL 8] Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72

[NPL 9] Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66

[NPL 10] Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94

[NPL 11] Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80

[NPL 12] Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42

[NPL 13] Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15

[NPL 14] Bandaru et al., DNA Repair (Amst). 2002 Jul 17;1(7):517-29

本發明部分基於發現免疫治療之適合標的。由於腫瘤相關抗原(tumor-associated antigens,TAAs)一般被免疫系統感知為“自身”且因此沒有天生的免疫抗原性(immunogenicity)，所以適合標的的發現極度重要。如上所提到，已確認NEIL3(序列辨識號：45，其藉由GEenBank獲得編號NM_018248(例如，序列辨識號：44)所編碼出)在癌症，例如，膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌(cholangiocellular carcinoma)、大腸癌、子宮內膜異位症(endometriosis)、食道癌、肝癌、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)、骨肉瘤(osteosarcoma)、胰臟癌、前列線癌、腎癌、小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)、軟組織腫瘤、急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)與慢性骨髓性白血病(chronic myeloid leukemia,CML)中為向上調控。因此NEIL3為一癌症/腫瘤免疫治療之標的的候選物。

本發明至少部分基於具有誘導專一於NEIL3之細胞毒殺性T淋巴球能力之NEIL3之基因產物的特定抗原決定位胜肽的確認。如下所討論，使用HLA(人類白血球組織抗原)-A^*2402或A^*0201與來自NEIL3之候選胜肽結合來刺激自健康提供者獲得之周邊血液單核球細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)。之後以抗經各候選胜肽脈衝(pulsed)之HLA-A24+或HLA-A2+目標細胞的專一細胞毒性建立細胞毒殺性T淋巴球。結果證明HLA-A24或HLA-A2限制之抗原決定位胜肽可誘導強而專一之抗表現NEIL3之細胞的免疫反應。此外，其指出NEIL3為強效致免疫性且其抗原決定位為癌症/腫瘤免疫治療之有效目標。

因此，本發明提供與HLA抗原結合之經分離的胜肽，其由NEIL3(序列辨識號：45)或其免疫活性片段所組成。這些胜肽被預期具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力且可被用於ex vivo誘導細胞毒殺性T淋巴球或被投予一個體以誘導抗癌症，例如膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、大腸癌、子宮內膜異位症、食道癌、肝癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌、前列線癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腫瘤、急性骨髓性白血病與慢性骨髓性白血病的免疫反應。較佳為那些胜肽為九胜肽或十胜肽，且更佳係由擇自序列辨識號：1至43之群組的胺基酸序列所組成。特別是，由擇自序列辨識號：3、4、5、6、11、15、17、21、22、24、33、35、41與43之群組的胺基酸序列所組成之胜肽其顯示強的細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。

本發明胜肽包括其中被取代、刪除或加入一、二或多個胺基酸的那些，只要經修飾之胜肽維持最初之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。此外，本發明提供編碼出本發明之任何胜肽之經分離的多核苷酸。這些多核苷酸可使用於誘導或製備具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞，或可被投予至一個體以誘導抗癌與抗本發明胜肽之免疫反應。

當投予一個體時，本發明胜肽被表現於抗原呈現細胞之表面，且之後誘導將分別之胜肽做為目標之細胞毒殺性T淋巴球。因此，根據本發明之一態樣，也提供含任何本發明胜肽或多核苷酸之組合物或物質以誘導細胞毒殺性T淋巴球。此外，含任何本發明胜肽或多核苷酸之組合物或物質可用於癌症，例如膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、大腸癌、子宮內膜異位症、食道癌、肝癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌、前列線癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腫瘤、急性骨髓性白血病與慢性骨髓性白血病之治療及/或預防，及/或其手術後復發之避免。因此，本發明也提供用於癌症之治療及/或預防，及/或其手術後復發之避免的藥學組合物或物質，而藥學組合物或物質包括任何本發明胜肽或多核苷酸。代替本發明胜肽或多核苷酸為活性成分/除了本發明胜肽或多核苷酸作為活性成分外，本發明藥學組合物或物質可包括表現本發明任何胜肽之抗原呈現細胞或外吐小體。

本發明之胜肽或多核苷酸可誘導於其表面呈現HLA抗原與本發明胜肽之複合物的抗原呈現細胞，例如，藉由將來自一個體之抗原呈現細胞與本發明胜肽接觸或將編碼出本發明之一胜肽的多核苷酸引入抗原呈現細胞。此種抗原呈現細胞具有高的抗目標胜肽之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力且於癌症免疫治療中提供用途。因此，本發明包括誘導具細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的方法與藉由此方法獲得之抗原呈現細胞。

本發明也提供包括將CD8+細胞與表現本發明一胜肽於其表面之抗原呈現細胞或外吐小體共培養之步驟或引入包括編碼出與本發明一胜肽結合之T細胞受體(T cell receptor,TCR)次單元多胜肽之多核苷酸之基因的步驟的誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法。藉由此方法獲得之細胞毒殺性T淋巴球也可提供用途於治療及/或避免癌症，例如膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、大腸癌、子宮內膜異位症、食道癌、肝癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌、前列線癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腫瘤、急性骨髓性白血病與慢性骨髓性白血病。因此，本發明包括藉由本發明方法獲得之細胞毒殺性T淋巴球。

此外，本發明提供誘導抗癌症之免疫反應的方法，方法包含投予一包括NEIL3多胜肽或其免疫活性片段、編碼出NEIL3多胜肽之多核苷酸、呈現NEIL3多胜肽之外吐小體或抗原呈現細胞之組合物或物質的步驟。本發明也可提供診斷癌症，包括，但不限於膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、大腸癌、子宮內膜異位症、食道癌、肝癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌、前列線癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腫瘤、急性骨髓性白血病與慢性骨髓性白血病的方法。本發明可應用於與NEIL3過度表現相關之任何疾病，與NEIL3過度表現相關之疾病包括，癌症，例如膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、大腸癌、子宮內膜異位症、食道癌、肝癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌、前列線癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腫瘤、急性骨髓性白血病與慢性骨髓性白血病。

[第1圖]

第1圖顯示照片，顯示於以來自NEIL3之胜肽誘導之細胞毒殺性T淋巴球上之IFN-γ酵素結合免疫斑點分析(ELISPOT)的結果。分別與控制組相較，於孔洞(well)編號#8中之以NEIL3-A2-9-585(序列辨識號：3)(a)、於孔洞編號#2中之以NEIL3-A2-9-127(序列辨識號：4)(b)、於孔洞編號#4與#5中之以NEIL3-A2-9-416(序列辨識號：5)(c)、於孔洞編號#3中之以NEIL3-A2-9-71(序列辨識號：6)(d)、於孔洞編號#1中之以NEIL3-A2-9-271(序列辨識號：11)(e)、於孔洞編號#3中之以NEIL3-A2-10-198(序列辨識號：15)(f)、於孔洞編號#1中之以NEIL3-A2-10-340(序列辨識號：17)(g)、於孔洞編號#2與#3中之以NEIL3-A2-10-590(序列辨識號：21)(h)、於孔洞編號#6中之以NEIL3-A2-10-378(序列辨識號：22)(i)與於孔洞編號#9、10、12與13中之以NEIL3-A2-9-416(序列辨識號：5)(用於HLA-A0206)(j)刺激的細胞毒殺性T淋巴球，顯示強有力之IFN-γ產生。於這些圖中之孔洞上的正方形指出來自對應孔洞中之細胞被擴張以建立細胞毒殺性T淋巴球細胞株。於圖中，“+”指出抗以適合之胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生，而“-”指出抗未以任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生。

[第2-1圖]

第2-1圖顯示線圖，顯示藉由IFN-γ酵素結合免疫吸附分析偵測之以NEIL3-A2-585(序列辨識號：3)(a)、NEIL3-A2-9-127(序列辨識號：4)(b)、NEIL3-A2-9-416(序列辨識號：5)(c)(d)與NEIL3-A2-9-71(序列辨識號：6)(e)刺激的細胞毒殺性T淋巴球細胞株的IFN-γ產生。其顯示與控制組相較，藉由以各胜肽刺激建立之細胞毒殺性T淋巴球細胞株顯示強而有力之IFN-γ產生。於圖中，“+”指出抗以適合之胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生，而“-”指出抗未以任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生。

[第2-2圖]

第2-2圖顯示線圖，顯示藉由IFN-γ酵素結合免疫吸附分析偵測之以NEIL3-A2-9-271(序列辨識號：11)(f),NEIL3-A2-10-198(序列辨識號：15)(g)、NEIL3-A2-10-590(序列辨識號：21)(h)(i)與NEIL3-A2-9-416(序列辨識號：5)(用於HLA-A0206)(j)(k)刺激的細胞毒殺性T淋巴球細胞株的IFN-γ產生。其顯示與控制組相較，藉由以各胜肽刺激建立之細胞毒殺性T淋巴球細胞株顯示強而有力之IFN-γ產生。於圖中，“+”指出抗以適合之胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生，而“-”指出抗未以任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生。

[第3圖]

第3圖顯示藉由自以NEIL3-A2-9-416(序列辨識號：5) (a)、NEIL3-A2-9-71(序列辨識號：6)(b)、NEIL3-A2-10-198(序列辨識號：15)(c)、NEIL3-A2-10-590(序列辨識號：21)(d)與NEIL3-A2-9-416(序列辨識號：5)(e)(用於HLA-A0206)刺激之細胞毒殺性T淋巴球細胞株的限制稀釋所建立的細胞毒殺性T淋巴球複製的IFN-γ產生。其顯示與控制組相較，藉由以以NEIL3-A2-9-416(序列辨識號：5)(a)、NEIL3-A2-9-71(序列辨識號：6)(b)、NEIL3-A2-10-198(序列辨識號：15)(c)、NEIL3-A2-10-590(序列辨識號：21)(d)與NEIL3-A2-9-416(序列辨識號：5)(e)(用於HLA-A0206)刺激建立之細胞毒殺性T淋巴球細胞株顯示強而有力之IFN-γ產生。於圖中，“+”指出抗以NEIL3-A2-9-416(序列辨識號：5)(a)、NEIL3-A2-9-71(序列辨識號：6)(b)、NEIL3-A2-10-198(序列辨識號：15)(c)、NEIL3-A2-10-590(序列辨識號：21)(d)與NEIL3-A2-9-416(序列辨識號：5)(用於HLA-A0206)(e)脈衝的目標細胞的IFN-γ產生，而“-”指出抗未以任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生。

[第4-1圖]

第4圖顯示線圖，顯示抗外生表現NEIL3與HLA-A^*0201或HLA-A^*0206之目標細胞的專一細胞毒殺性T淋巴球活性。將以HLA-A^*0201、HLA-A^*0206或以全長之NEIL3基因轉染之COS7細胞製備為控制組。以NEIL3-A2-9-416(序列辨識號：5)(a)、NEIL3-A2-9-71(序列辨識號：6)(b)與NEIL3-A2-10-198(序列辨識號：15)(c)之胜肽建立之細胞毒殺性T淋巴球複製顯示抗以NEIL3與HLA-A^*0201兩者轉染之COS7細胞(黑色菱形)的專一細胞毒殺性T淋巴球活性。另一方面，沒有偵測到顯著專一之細胞毒殺性T淋巴球活性，其抗表現HLA(三角形)或NEIL3(圓形)之目標細胞。

[第4-2圖]

第4圖顯示線圖，顯示抗外生表現NEIL3與HLA-A^*0201或HLA-A^*0206之目標細胞的專一細胞毒殺性T淋巴球活性。將以HLA-A^*0201、HLA-A^*0206或以全長之NEIL3基因轉染之COS7細胞製備為控制組。以NEIL3-A2-9-416(序列辨識號：5)(d)(用於HLA-A0206)之胜肽建立之細胞毒殺性T淋巴球複製顯示抗以NEIL3與HLA-A^*0206兩者轉染之COS7細胞(黑色菱形)的專一細胞毒殺性T淋巴球活性。另一方面，沒有偵測到顯著專一之細胞毒殺性T淋巴球活性，其抗表現HLA-(三角形)或NEIL3(圓形)之目標細胞。

[第5圖]

第5圖顯示照片其顯示於肝癌中之NEIL3的表現。部分A顯示藉由半定量RT-PCR檢驗於臨床肝癌細胞組織中的NEIL3的表現。部分B顯示藉由半定量RT-PCR檢驗於HCC細胞株中的NEIL3的表現。

[第6圖]

第6圖顯示照片，顯示於以來自NEIL3之胜肽誘導之細胞毒殺性T淋巴球上之IFN-γ酵素結合免疫斑點分析(ELISPOT)的結果。分別與控制組相較，於孔洞(well)編號#7中之以NEIL3-A24-9-545(序列辨識號：24)(a)、於孔洞編號#6中之以NEIL3-A24-9-362(序列辨識號：33)(b)、於孔洞編號#2 與#8中之以NEIL3-A24-10-320(序列辨識號：35)(c)、於孔洞編號#8中之以NEIL3-A24-10-544(序列辨識號：41)(d)與於孔洞編號#1與#4中之以NEIL3-A24-10-87(序列辨識號：43)(e)刺激的細胞毒殺性T淋巴球，顯示強有力之IFN-γ產生。於這些圖中之孔洞上的正方形指出來自對應孔洞中之細胞被擴張以建立細胞毒殺性T淋巴球細胞株。相對的，如負資料的典型例子，其並不被顯示抗胜肽脈衝之目標細胞之來自以NEIL3-A24-9-364(序列辨識號：25)(f)刺激的細胞毒殺性T淋巴球的專一IFN-γ產生。於圖中，“+”指出抗以適合之胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生，而“-”指出抗未以任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生。

[第7圖]

第7圖顯示線圖，顯示藉由IFN-γ酵素結合免疫吸附分析偵測之以NEIL3-A24-9-545(序列辨識號：24)(a)、NEIL3-A24-9-362(序列辨識號：33)(b)、NEIL3-A24-10-320(序列辨識號：35)(c)、NEIL3-A24-10-544(序列辨識號：41)(d)與NEIL3-A24-10-87(序列辨識號：43)(e)刺激的細胞毒殺性T淋巴球細胞株的IFN-γ產生。其顯示與控制組相較，藉由以各胜肽刺激建立之細胞毒殺性T淋巴球細胞株顯示強而有力之IFN-γ產生。於圖中，“+”指出抗以適合之胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生，而“-”指出抗未以任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生。

[第8圖]

第8圖顯示線圖，其顯示藉由自以NEIL3-A24-9-545(序列辨識號：24)(a)、NEIL3-A24-10-320(序列辨識號：35)(b)與NEIL3-A24-10-544(序列辨識號：41)(c)刺激之細胞毒殺性T淋巴球細胞株的限制稀釋所建立的細胞毒殺性T淋巴球複製的IFN-γ產生。其顯示與控制組相較，藉由以各胜肽刺激建立之細胞毒殺性T淋巴球細胞株顯示強而有力之IFN-γ產生。於圖中，“+”指出抗以適合之胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生，而“-”指出抗未以任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN-γ產生。

[第9圖]

第9圖顯示線圖，顯示抗外生表現NEIL3與HLA-A^*2402之目標細胞的專一細胞毒殺性T淋巴球活性。將以HLA-A^*2402或以全長之NEIL3基因轉染之COS7細胞製備為控制組。以NEIL3-A24-9-545(序列辨識號：24)之胜肽建立之細胞毒殺性T淋巴球複製顯示抗以NEIL3與HLA-A^*2402兩者轉染之COS7細胞(黑色菱形)的專一細胞毒殺性T淋巴球活性。另一方面，沒有偵測到顯著專一之細胞毒殺性T淋巴球活性，其抗表現HLA-A^*2402(三角形)或NEIL3(圓形)之目標細胞。

雖然於本發明實施例之實施或測試中可使用相似或等同於在此敘述之那些的任何方法與材料，但是現在敘述較佳之方法、元件與材料。然而在敘述本發明材料與方法之前，需瞭解的是，本發明並不限於敘述於此之特定大小、形狀、尺寸、材料、方法學、步驟等，例如按照慣例實驗法及/或最佳化可將其變更。也需瞭解的是，於此敘述中使用之專門用語僅是為了敘述特別之變化形式或實施例，且不傾向限制僅會受限於所附上之申請專利範圍的本發明範圍。

I. 定義

於此使用之單字“一”與“該”意指“至少一”除非以別的方式明確指出。於此可替換使用之用語“多胜肽”、“胜肽”與“蛋白質”意指胺基酸殘基之一聚合物。此用語適用於胺基酸聚合物，於其中一或多個胺基酸殘基可為經修飾之殘基或非自然發生之殘基，例如對應自然發生胺基酸之人工化學模仿物，與自然發生胺基酸聚合物。

於此使用之用語“胺基酸”意指自然發生與合成之胺基酸，及胺基酸類似物與胺基酸模仿物，其與自然發生之胺基酸起相似作用。胺基酸可為L-胺基酸或D-胺基酸。自然發生胺基酸為基因密碼所編碼的那些與於細胞中在轉譯後被修飾的那些(例如羥脯胺酸(hydroxyproline)、γ-羧基谷胺酸(gamma-carboxyglutamate)與O-磷絲胺酸(O-phosphoserine))。措辭“胺基酸類似物”意指具有與自然發生胺基酸相同之基礎化學結構(一α碳鍵結至一氫、一羧基、一胺基與一R基)的化合物，但具有一或多個經修飾之R基或經修飾之骨架(例如，同絲胺酸(homoserine)、降亮胺酸(norleucine)、甲硫胺酸(methionine)、亞碸(sulfoxide)、甲基硫氨磺(methionine methyl sulfonium))。措辭“胺基酸模仿物”意指化學化合物其與一般胺基酸具有不同結構，但有相似的功能。可藉由由IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission所建議之其一般所知的三字母符號或一字母符號來指出於此處之胺基酸。

於此可替換使用用語“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”與“核酸”，且除非以別的特別方式指出，其與胺基酸相似藉由其一般接受的單一字母編碼來指出。除非以別的方式定義，用語“癌症”意指過度表現NEIL3基因之癌症，其例子包括，但不限於膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌(cholangiocellular carcinoma)、大腸癌、子宮內膜異位症(endometriosis)、食道癌、肝癌、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)、骨肉瘤(osteosarcoma)、胰臟癌、前列線癌、腎癌、小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)、軟組織腫瘤、急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)與慢性骨髓性白血病(chronic myeloid leukemia,CML)。除非以別的方式定義，於此可替換使用且以別的方式特別指出用語“細胞毒殺性T淋巴球”、“細胞毒殺性T細胞”與“CTL”以意指T淋巴球之次族群，且除非以別的方式指出，意指T淋巴球之次群組(sub-group)可辨認非自身細胞(例如，腫瘤細胞、被病毒感染之細胞)，且誘導這些細胞死亡。

除非特別定義，用語“HLA-A24”意指含次型例如HLA-A^*2402之HLA-A24。除非特別定義，用語“HLA-A2”如此處所使用代表性意指次型，例如HLA-A^*0201與HLA-A^*0206。除非特別定義，於此使用之用語“套組”被使用於關於試劑與其他材料之組合。與此考慮之套組包括微陣列、晶片、標誌等。並無打算使用語“套組”限制於試劑及/或材料之特定組合。除非特別定義，於此使用屬與本發明之所有技術或科學用語為與熟悉此技藝人士所通常瞭解之意義相同。

II. 胜肽

為了證明來自NEIL3之胜肽作用如一被細胞毒殺性T淋巴球(CTLs)所辨認之抗原，分析來自NEIL3之胜肽(序列辨識號：45)以確定是否其為由一般遇到HLA對偶基因(allele)之HLA(人類白血球組織抗原)-24或A2所限制之抗原決定位(Date Y et al.,Tissue Antigens 47：93-101,1996；Kondo A et al.,J Immunol 155：4307-12,1995；Kubo RT et al.,J Immunol 152：3913-24,1994)。確認來自NEIL3之HLA-A2結合胜肽的候選物，藉由使用關於其對HLA-A2之結合親和力的資訊。候選胜肽為擇自由序列辨識號：1-23所組成之群組的胜肽。

此外，in vitro藉由以這些胜肽脈衝(載有)之樹突細胞(dendritic cell,DC)刺激T細胞後，使用下列胜肽之各個成功建立細胞毒殺性T淋巴球；NEIL3-A2-9-585(序列辨識號：3)

NEIL3-A2-9-127(序列辨識號：4)

NEIL3-A2-9-416(序列辨識號：5)

NEIL3-A2-9-71(序列辨識號：6)

NEIL3-A2-9-271(序列辨識號：11)

NEIL3-A2-10-198(序列辨識號：15)

NEIL3-A2-10-340(序列辨識號：17)

NEIL3-A2-10-590(序列辨識號：21)，與NEIL3-A2-10-378(序列辨識號：22)。

確認來自NEIL3之HLA-A24結合胜肽的候選物，根據其對HLA-A24之結合親和力。候選胜肽為擇自由序列辨識號：24-43所組成之群組的胜肽。

此外，於in vitro藉由以這些胜肽脈衝(載有)之樹突細胞(dendritic cell,DC)刺激T細胞後，使用下列胜肽之各個成功建立細胞毒殺性T淋巴球；NEIL3-A24-9-545(序列辨識號：24)

NEIL3-A24-9-362(序列辨識號：33)

NEIL3-A24-10-320(序列辨識號：35)

NEIL3-A24-10-544(序列辨識號：41)，與NEIL3-A24-10-87(序列辨識號：43)。

這些被建立的細胞毒殺性T淋巴球顯示強而專一之抗經分別之胜肽脈衝之目標細胞的細胞毒殺性T淋巴球活性。這些結果證明NEIL3為一由細胞毒殺性T淋巴球所辨認之抗原，且被測試之胜肽為由HLA-A24或HLA-A2所限制之NEIL3的抗原決定位胜肽。

由於NEIL3基因於癌症細胞，例如膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、大腸癌、子宮內膜異位症、食道癌、肝癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌、前列線癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腫瘤、急性骨髓性白血病與慢性骨髓性白血病之中被過度表現，且不在大部分正常器官中，所以其為一良好之免疫治療標的。因此，本發明提供來自NEIL3之細胞毒殺性T淋巴球辨認之抗原決定位的九胜肽(胜肽由九個胺基酸殘基所組成)與十胜肽(胜肽由十個胺基酸殘基所組成)。或者本發明提供一經分離之胜肽其與HLA抗原結合且誘導細胞毒殺性T淋巴球，其中胜肽係由序列辨識號：45之胺基酸序列所組成或為其免疫活性片段。更特別是，在一些實施例中，本發明提供由擇自序列辨識號：3、4、5、6、11、15、17、21、22、24、33、35、41與43所組成之群組之胺基酸序列所組成的胜肽。

通常可使用現今於例如網路可得之軟體程式，例如於Parker KC et al.,J Immunol 1994 Jan 1,152(1)：163-75與Nielsen M et al.,Protein Sci 2003；12：1007-17中所敘述的那些，來計算in silico介於各種胜肽與HLA抗原間之結合親和力。例如，如於概述於，例如，Lafuente EM et al.,Current Pharmaceutical Design,2009,15,3209-3220中之Parker KC et al.,J Immunol 1994 Jan 1,152(1)：163-75,Kuzushima K et al.,Blood 2001,98(6)：1872-81,Larsen MV et al.BMC Bioinformatics.2007 Oct 31；8：424,Buus S et al.Tissue Antigens.,62：378-84,2003,Nielsen M et al.,Protein Sci 2003；12：1007-17，與Nielsen M et al.PLoS ONE 2007；2：e796中所述可測量與HLA抗原之結合親和力。測量親和力之方法敘述於，例如於Journal of Immunological Methods,1995,185：181-190.；Protein Science,2000,9：1838-1846中。所以使用此種軟體程式可選擇來自NEIL3的片段，其具有與HLA抗原之高結合親和力。因此本發明包括由來自NEIL3之任何片段所組成之胜肽，其藉由此類已知程式確認與HLA結合。此外，此類胜肽也包括由全長之NEIL3所組成之胜肽。

本發明之胜肽可於側面具有額外之胺基酸殘基，只要胜肽維持其細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。額外之胺基酸殘基也可包括任何種類之胺基酸，只它們不減少原始胜肽之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。因此，本發明包含具有對HLA抗原之結合親和力的胜肽，其包括來自NEIL3之胜肽。此種胜肽，例如小於約40個胺基酸，時常小於約20個胺基酸，通常小於約15個胺基酸。

一般而言，已知於一胜肽中一或多個胺基酸之修飾，不會影響胜肽的功能，且在一些例子中，甚至增強原始蛋白質所需之功能。事實上，已知經修飾之胜肽(即，由藉由取代或加入一、二或數個胺基酸所修飾之胺基酸序列所組成之胜肽)維持原始胜肽的生物活性(Mark et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1984,81：5662-6；Zoller and Smith,Nucleic Acids Res 1982,10：6487-500；Dalbadie-McFarland et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1982,79：6409-13)。因此，根據本發明一實施例，本發明之具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力的胜肽，可由擇自由序列辨識號：3、4、5、6、11、15、17、21、22、24、33、35、41與43所組成之群組之胺基酸序列所組成的胜肽所構成，其中加入及/或取代一、二甚至更多個胺基酸。

熟悉此技藝人士認定改變一單一胺基酸或一小百分比之胺基酸的個別加入、刪除或取代至一胺基酸序列產生保存原始胺基酸支鏈的特性；其因此被意指為“保守取代(conservative substitutions)”或“保守修飾(conservative modifications)”，其中一蛋白質之改變導致一具有相似功能之蛋白質。提供功能相似胺基酸之保守取代表已為本技術領域所熟知。胺基酸支鏈之特徵的例子為疏水胺基酸(A,I,L,M,F,P, W,Y,V)、親水胺基酸(R,D,N,C,E,Q,G,H,K,S,T)與具有下列共同官能基或特徵之支鏈：一脂肪族支鏈(G,A,V,L,I,P)；一含羥基支鏈(S,T,Y)；含硫原子支鏈(C,M)；含羧酸與胺基支鏈(D,N,E,Q)；含鹼支鏈(R,K,H)；以及含芳香族支鏈(H,F,Y,W)。此外，下列八個族群各包含彼此為保守取代之胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天門冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天門冬醯胺(N)、麩胺醯胺(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫丁胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；以及8)半胱胺酸(C)、甲硫丁胺酸(M)(參見Creighton,Proteins 1984)。

此種經保守修飾胜肽也被視為本發明之胜肽。然而，本發明之胜肽並不限於此，且可包括非保守修飾，只要胜肽維持細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。更進一步而言，經修飾之胜肽不排除多形變體(polymorphic variant)之細胞毒殺性T淋巴球誘發的胜肽、種間同質體(interspecies homologues)與NEIL3對偶基因(alleles)。為了維持必須之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力，可修飾(加入或取代)一小數目(例如一、二或數個)或小百分比之胺基酸。此處用語“數個”指5或更少個胺基酸，例如3個或更少。被修飾之胺基酸之百分比較佳為20 %或更少，例如，15%或更少，例如，10%或1至5%。

此外，胜肽可被以此類胺基酸殘基來取代或加入以達到較高之結合親和力。當使用於文中之免疫治療時，本發明之胜肽被表現於一細胞或外吐小體之表面上作為一具有HLA抗原之複和物。除了自然表現之胜肽外，由於藉由結合至HLA抗原表現之胜肽序列的規則為已知(J Immunol 1994,152：3913；Immunogenetics 1995,41：178；J Immunol 1994,155：4307)，可將基於此規則之修飾引入本發明之致免疫性胜肽。例如，顯示高HLA-A2結合親和力之胜肽，具有以白胺酸或甲硫丁胺酸取代之N端的第二個胺基酸，且也可喜愛使用其C端胺基酸被以纈胺酸或白胺酸取代的胜肽。因此，胜肽具有胺基酸序列擇自由序列辨識號：3、4、5、6、11、15、17、21與22所組成之群組，其中上述序列辨識號之胺基酸序列之N端的第二個胺基酸被白胺酸或甲硫丁胺酸取代，及/或其中上述序列辨識號之胺基酸序列之C端胺基酸被纈胺酸或白胺酸取代也被本發明所包括。

另一方面，產生高HLA-A24結合親和力之胜肽，具有以苯丙胺酸、酪胺酸、甲硫丁胺酸或色胺酸取代之N端的第二個胺基酸，且C端胺基酸被以苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸或甲硫丁胺酸取代。因此，胜肽具有序列辨識號：24、33、35、41與43之胺基酸序列，其中N端的第二個胺基酸被苯丙胺酸、酪胺酸、甲硫丁胺酸或色胺酸取代，及/或其中C端被苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸或甲硫丁胺酸取代也被本發明所包括。

可將取代引入不止於末端胺基酸，也可於胜肽之潛在TCR辨認位置。一些研究已證實於一具有胺基酸取代之胜肽可具有等於或比原來更好的功能，例如CAP1、p53_(264-272)、Her-2/neu_(369-377)或gp100_(209-217)(Zaremba et al.Cancer Res.57,4570-4577,1997,T.K.Hoffmann et al.J Immunol.(2002)Feb 1；168(3)：1338-47.,S.O.Dionne et al.Cancer Immunol immunother.(2003)52：199-206 and S.O.Dionne et al.Cancer Immunology,Immunotherapy(2004)53,307-314)。此外，一、二個或數個胺基酸也可被加至所述胜肽之N及/或C端。本發明也包括具有高HLA抗原結合親和力且維持細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之此種經修飾的胜肽。

然而，當胜肽序列與一具有不同功能之外生或內生蛋白質之胺基酸序列的一部份相同時，可能誘導副作用，例如自體免疫疾病或抗特定物質之過敏症候群。因此，使用可得之資料庫執行同源搜尋以避免胜肽之胺基酸序列符合其他蛋白質之胺基酸序列的情況。當來自對於目標胜肽不止存在具有一或兩個胺基酸不同之胜肽的同源搜尋變得清楚時，為了增加其與HLA抗原之結合親和力，及/或增加其細胞毒殺性T淋巴球誘發能力而不具副作用之任何危險，可修飾目標胺基酸。

雖然如上述之具有對HLA抗原高結合親和力的胜肽被預期為高效能，但根據作為指示之高親和表現而被選擇之候選胜肽，更進一步被測試細胞毒殺性T淋巴球誘發能力的表現。此處措辭“細胞毒殺性T淋巴球誘發能力”意指當表現於抗原呈現細胞時，胜肽誘導細胞毒殺性T淋巴球的能力。此外， “細胞毒殺性T淋巴球誘發能力”包括胜肽誘導細胞毒殺性T淋巴球活化、細胞毒殺性T淋巴球增殖、促進細胞毒殺性T淋巴球分解目標細胞與增加細胞毒殺性T淋巴球IFN-γ產生的能力。藉由誘導攜帶人類MHC抗原之抗原呈現細胞(例如B-淋巴球、巨噬細胞與樹突細胞)或更專一地來自人類周邊血液單核細胞之樹突細胞，並在以胜肽刺激之後與CD8+細胞混合，且之後測量由抗目標細胞之細胞毒殺性T淋巴球產生並釋放之IFN-γ來達成細胞毒殺性T淋巴球誘發能力的確定。如此反應系統，可使用已被產生來表現人類HLA之基因轉殖動物(例如，於BenMohamed L,Krishnan R,Longmate J,Auge C,Low L,Primus J,Diamond DJ,Hum Immunol 2000 Aug,61(8)：764-79,Related Articles,Books,Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice：dependence on MHC(HLA)class II restricted T(H)response中的描述)。例如可以⁵¹Cr放射標示目標細胞，且可從自目標細胞釋放出的放射活性計算細胞毒殺活性。或者在攜帶經固定之胜肽之抗原呈現細胞存在下，其可藉由測量由細胞毒殺性T淋巴球產生並釋放的IFN-γ，且使用抗IFN-γ單株抗體來使於培養基上之抑制區可見來檢驗。

由於如上述測試胜肽之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力，擇自由序列辨識號：3、4、5、6、11、15、17、21、22、24、33、35、41與43所指出之胺基酸序列所組成之胜肽的九胜肽或十胜肽顯示特別高之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力與對HLA抗原之高結合親和力。因此以這些胜肽做為例子為本發明之較佳實施例。此外，同源分析之結果顯示這些胜肽不與來自任何其他已知人類基因產物之胜肽有顯著之同源性。此降低當用於免抑制治療時之未知可能性與非期望之免疫反應。因此，也來自此態樣，這些胜肽提供對於在癌症病患中引起抗NEIL3免疫反應的用途。因此本發明之胜肽較佳由擇自由序列辨識號：3、4、5、6、11、15、17、21、22、24、33、35、41與43所組成之群組的胺基酸序列所組成的胜肽。

除了上方討論之本發明胜肽的修飾之外，本發明胜肽可連接其他胜肽，只要它們維持細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。示範的其他胜肽包括：本發明胜肽或來自其他腫瘤相關抗原之細胞毒殺性T淋巴球誘發胜肽。介於兩胜肽之間的連結器為本技術領域所熟知，例如AAY(P.M.Daftarian et al.,J Trans Med 2007,5：26)、AAA、NKRK(R.P.M.Sutmuller et al.,J Immunol.2000,165：7308-7315)或K(S.Ota et al.,Can Res.62,1471-1476,K.S.Kawamura et al.,J Immunol.2002,168：5709-5715)。例如，也可實質同時使用非NEIL3腫瘤相關抗原胜肽以增加經由HLA class I及/或class II之免疫反應。其已相當確認，癌症細胞可表現多於一個腫瘤相關基因。其為在對於熟悉此技藝人士例行實驗之範圍中以確認是否一特定個體表現額外腫瘤相關基因，且之後包括來自此類基因之表現產物的HLA class I及/或class II結合胜肽於根據本發明之NEIL3組合物或疫苗中。

HLA class I與HLA class II結合胜肽之例子對於熟悉此技藝人是而言為已知(例如，參見Coulie,Stem Cells 13：393-403,1995)，且可以一如此處所述之那些的類似方式被使用於發明中。根據分子生物之標準程序，熟悉此技藝人士可製備包括一或多個NEIL3胜肽與一或多個非NEIL3胜肽的多胜肽，或編碼出此類多胜肽的核酸。因此，此類“多面體(polytope)”為兩個或多個潛在免疫原性(immunogenic)或免疫反應刺激胜肽的群組，胜肽可互相連接以多種排列(例如，連成一串或部分重疊)。多面體(或編碼出多面體的核酸)可以一標準免疫步驟被投予，例如至動物，以測試多面體於刺激、增強及/或誘導一免疫反應之功效。

胜肽可被直接連接或經由使用位於側面之序列以形成多面體，且多面體為疫苗之用途為本技術領域所熟知(參見，Thomson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA 92(13)：5845-5849,1995；Gilbert et al.,Nature Biotechnol.15(12)：1280-1284,1997；Thomson et al.,J Immunol.157(2)：822-826,1996；Tarn et al.,J Exp.Med.171(1)：299-306,1990)。製備並含有抗原決定位之不同數目與組合的多面體並為了藉由細胞毒殺性T淋巴球的辨認與為了於增加免疫反應中之功效將其進行測試。此外，本發明之胜肽可更進一步被連接至其他物質，只要它們維持細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。此類物質可包括，胜肽、脂質、糖與糖鏈、乙醯基，天然與合成之聚合物等。本發明胜肽可包含修飾，例如醣基化、支鏈氧化及/或磷酸化，只要修飾不損壞此處所述胜肽之生物活性。此修飾可被執行以授予額外之功能(例如目標功能與傳送功能)或穩定多胜肽。

例如，為了in vivo增加多胜肽之穩定度，本技術領域已知引入D-胺基酸、胺基酸模仿物或非天然胺基酸；此內容也適合本發明之多胜肽。可以一些方法分析一多胜肽的穩定度。例如，可使用肽酶與多種生物培養基，例如人類血漿與血清，來測試穩定度(參見，例如Verhoef et al.,Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11：291-302)。

此外，如上所提到，在藉由一、二或數個胺基酸殘基取代、刪除或加入之經修飾的胜肽中，可篩選或選擇與原始胜肽相較具有相同或較高之活性的那些。因此本發明也提供一篩選或選擇與原始相較具有相同或較高之活性的經修飾胜肽的方法。例如方法可包括如下步驟：a：將至少一個本發明胜肽之胺基酸殘基取代、刪除或加入；b：確定該胜肽的活性；以及c：選擇與原始相較具有相同或較高之活性的胜肽。

此處，活性可包括MHC結合活性、抗原呈現細胞或細胞毒殺性T淋巴球誘發能力與細胞毒性活性。

此處，本發明之胜肽也可被描述為“NEIL3胜肽”或“NEIL3多胜肽”。

III. NEIL3胜肽之製備

使用熟知之技術可製備本發明之胜肽。例如，使用重組DNA技術或化學合成可以合成方法地製備胜肽。本發明胜肽可單獨合成或包括兩或多個胜肽之較長多胜肽。可分離此胜肽，即純化或分離實質上無其他自然發生之宿主細胞蛋白質與其片段或任何其他化學物質。本發明胜肽可包含修飾，例如醣基化、支鏈氧化或磷酸化；只要修飾不損壞此處所述胜肽之生物活性。其他修飾包括可用來，例如增加胜肽之血清半衰期之D-胺基酸或其他胺基酸模仿物的合併。

藉由根據經選擇之胺基酸序列的化學合成可獲得本發明之胜肽。例如，適合此合成之一般胜肽合成方法包括：(i)胜肽合成(Peptide Synthesis)Interscience,New York,1966；(ii)蛋白質(The Proteins),Vol.2,Academic Press,New York,1976；(iii)胜肽合成(Peptide Synthesis)(in Japanese),Maruzen Co.,1975；(iv)胜肽合成之基礎與實驗(Basics and Experiment of Peptide Synthesis)(in Japanese),Maruzen Co.,1985；(v)藥學的發展(Development of Pharmaceuticals)(second volume)(in Japanese),Vol.14(peptide synthesis),Hirokawa,1991；(vi)WO99/67288；以及(vii)Barany G.& Merrifield R.B.,Peptides Vol.2,“Solid Phase Peptide Synthesis”,Academic Press,New York,1980,100-118。

或者，藉由適應任何已知產生胜肽之基因工程方法可獲得本發明之胜肽(例如，Morrison J,J Bacteriology 1977,132：349-51；Clark-Curtiss & Curtiss,Methods in Enzymology(eds.Wu et al.)1983,101：347-62)。例如，首先製備一適合之載體，其懷有一多核苷酸其編碼出目標胜肽於一可表達的形式中(例如，調控序列之下游相當於啟動子序列)，並將載體轉殖進入適合之宿主細胞。此類載體與宿主細胞也可由本發明所提供。之後培養宿主細胞以產生感興趣之胜肽。使用一in vitro轉譯系統可in vitro產生胜肽。

IV. 多核苷酸

本發明提供多核苷酸，其編碼出任何本發明上述之胜肽。這些包括來自自然發生之NEIL3基因(GenBank Accession No.NM_018248(序列辨識號：44))的核苷酸序列與具有其之保守修飾之核苷酸序列的那些。此處措辭“保守修飾之核苷酸序列”指序列其編碼出相同或實質上相同之胺基酸序列。由於基因密碼的退化，一大份之功能相同之核酸編碼出任何已知蛋白質。例如，密碼GCA、GCC、GCG與GCU皆編碼出胺基酸丙胺酸。因此，於藉由一密碼具體指定丙胺酸之每個位置，可改變密碼成為任何上述不會改變編碼出之胜肽的對應密碼。此核酸變化為“沈默變化(silent variation)”，其為保守修飾變化的一種。此處編碼出一胜肽之每個核酸序列也描述核酸之每種可能的沈默變化。熟悉此技藝人士明白於一核酸中各密碼(除了AUG，其原本為甲硫胺酸之唯一密碼、與TGG其原本為色胺酸之唯一密碼)可被修飾以產生一功能相同分子。因此編碼出一胜肽之核酸的各沈默變化係為於各所揭露之序列中被暗示性描述。

本發明之多核苷酸可由DNA、RNA或其衍生物所組成。如本技術領域所熟知，DNA由鹼基，例如自然發生之鹼基A、T、C、G所適合地組成，而T於RNA中為U所取代。熟悉此技藝人士認定非自然發生鹼基也可包括於多核苷酸中。本發明之多核苷酸可編碼出本發明之多個胜肽，具有或不具有介於中間之胺基酸序列。例如介於中間之胺基酸序列可提供多核苷酸或經轉譯之胜肽一裂解位(例如酵素辨認序列)。更進一步而言，多核苷酸可包括任何額外之序列至編碼出本發明胜肽之編碼序列。例如，多核苷酸可為一重組多核苷酸，其包括胜肽表現所需之調控序列，或可為一具有標誌基因與此類之表現載體(質體)。一般而言，可製備此重組多核苷酸，藉由經由使用一般重組技術，例如聚合酶與內切酶之多核苷酸操作。

可使用重組與化學合成技術兩者以產生本發明之多核苷酸。例如，藉由插進入一適合之載體可產生一多核苷酸，當轉染進入一勝任細胞時，其可被表現。或者，使用PCR技術或表現於適合的宿主可將一多核苷酸放大(參見，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1989)。或者，使用固態技術如於Beaucage SL & Iyer RP,Tetrahedron 1992,48：2223-311；Matthes et al.,EMBO J 1984,3：801-5中所敘述，可合成多核苷酸。

V. 外吐小體(exosomes)

本發明進一步地提供稱為外吐小體的胞間囊泡(intracellular vesicles)，其呈現形成於本發明之胜肽與人類白血球抗原表面之間的複合物。利用例如Japanese Patent Application Kohyo Publications Nos.Hei 11-510507與WO99/03499所詳述的方法以及從接受治療和/或預防之病人所得的抗原表現細胞可製備外吐小體。本發明之外吐小體可如疫苗般地接種，類似於本發明的胜肽。

包含在複合物中的人類白血球抗原形式必須與需要治療和/或預防之個體的人類白血球抗原形式相符。例如，對於日本族群來說，HLA-A24或HLA-A2，特別是HLA-A^*2402與HLA-A^*0201與HLA-A^*0206為通常適合的。高度表現於日本人與高加索人之中的A-24型或A2型之使用有助於獲得有效的結果，且次型A^*2402、A^*0201與A^*0206也提供用途。一般在臨床上，需接受治療之病患的人類白血球抗原形式係進行預先的研究，這可適當地選擇對此抗原具有高度結合親合力的胜肽或經由抗原表現具有細胞毒性T淋巴細胞誘發性的胜肽。此外，為了獲得表現高度結合親合力與細胞毒性T淋巴細胞誘發性的胜肽，可以天然產生之NEIL3部分胜肽的胺基酸序列為基礎，然後進行1、2或數個胺基酸的取代、刪除或添加。如果使用A2型人類白血球抗原於本發明的外吐小體，包括序列辨識號：3、4、5、6、11、15、17、21與22之序列的胜肽提供其效用。或者，如果使用A24型人類白血球抗原於本發明的外吐小體，具有序列辨識號：24、33、35、41與43之任一的序列的胜肽提供其效用。

VI. 抗原呈現細胞

本發明也提供抗經分離之原呈現細胞，其表現以HLA抗原與本發明胜肽形成之複合物於其表面。抗原呈現細胞可來自受到治療及/或避免之病患，且藉由其本身或與包括本發明之胜肽、外吐小體或細胞毒殺性T淋巴球之其他藥物結合可被投予如一疫苗。抗原呈現細胞並不限於特定種類之細胞，且包括樹突細胞、蘭格罕細胞(Langerhans cell)、巨嗜細胞、B細胞與活化之T細胞，已知其表現蛋白質(proteinaceous)抗原於其細胞表面以被淋巴球所辨認。由於樹突細胞為一典型抗原呈現細胞，其於抗原呈現細胞中具最強之細胞毒殺性T淋巴球誘導活性，樹突細胞供給使用為本發明之抗原呈現細胞。

例如，藉由誘導來自周邊血液單核細胞之樹突細胞與之後in vitro、ex vivo或in vivo以本發明胜肽接觸(刺激)其可獲得一抗原呈現細胞。當本發明之胜肽投予至一個體，於個體身體內誘導表現本發明胜肽之抗原呈現細胞。因此，藉由在將本發明胜肽投予至一個體後，自此個體收集抗原呈現細胞可獲得本發明之抗原呈現細胞。或者，藉由將自個體收集之抗原呈現細胞與本發明胜肽接觸可獲得本發明之抗原呈現細胞。

可將本發明之抗原呈現細胞投予至一個體以誘導於個體中之抗癌免疫反應，藉由其本身或與包括本發明之胜肽、外吐小體或細胞毒殺性T淋巴球之其他藥物結合。例如，ex vivo投予可包括步驟：a：自一第一個體收集抗原呈現細胞；b：以胜肽接觸步驟a之抗原呈現細胞；以及c：將步驟b之抗原呈現細胞投予一第二個體。

第一個體與第二個體可為相同個體或可為不同個體。自步驟b獲得之抗原呈現細胞可做為疫苗被投予以治療及 /或預防癌症，例如膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、大腸癌、子宮內膜異位症、食道癌、肝癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌、前列線癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腫瘤、急性骨髓性白血病與慢性骨髓性白血病。

根據本發明一方面，本發明之抗原呈現細胞具高程度細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。在用語“高程度細胞毒殺性T淋巴球誘發能力”中，高程度相對於藉由抗原呈現細胞沒有與胜肽接觸或與無法誘導細胞毒殺性T淋巴球之胜肽接觸的程度。藉由包括in vitro將編碼出本發明胜肽之多核苷酸轉移至抗原呈現細胞的步驟的方法與上述之方法，可製備此種具高程度細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞。此經引入之基因可為DNA或RNA形式。引入方法的例子包括，並無特別限制，可使用各種於此領域一般被執行的方法，例如可使用脂質體轉染(lipofection)、電穿孔法(electroporation)或磷酸鈣方法。更特別地，可執行其如Cancer Res 1996,56：5672-7；J Immunol 1998,161：5607-13；J Exp Med 1996,184：465-72；Published Japanese Translation of International Publication No.2000-509281中所述。藉由轉移基因進入抗原呈現細胞，基因遭遇轉錄、轉譯與此類於細胞中，且之後所獲得之蛋白質藉由MHC Class I或Class II處理，並經由一呈現途徑進行以與呈現胜肽。

VII. 細胞毒殺性T淋巴球

抗任何本發明胜肽誘導之細胞毒殺性T淋巴球增強in vivo以癌症細胞為標的之免疫反應，且因此可使用為一相似於胜肽之疫苗。因此本發明提供經分離之細胞毒殺性T淋巴球其藉由任何本發明之胜肽專一地被誘導或活化。可獲得此種細胞毒殺性T淋巴球，藉由(1)將本發明胜肽投予至一個體；或(2)將來自個體之抗原呈現細胞與CD8+細胞或周邊血液單核淋巴球與本發明之胜肽in vivo接觸(刺激)且之後分離細胞毒殺性T淋巴球或(3)將CD8+細胞或周邊血液單核淋巴球與表現HLA抗原與胜肽之複合物於其表面上之抗原呈現細胞或外吐小體接觸或(4)引入包括編碼出與本發明胜肽結合之T細胞受體次單元多胜肽之多核苷酸的基因。藉由上述方法可製備此類抗原呈現細胞或外吐小體，且(4)之方法之詳細被敘述於下方“VIII.T細胞受體(TCR)”的段落中。

本發明細胞毒殺性T淋巴球可來自一受到治療及/或避免之病患，且藉由其身或與包括本發明之胜肽或為了調節作用之外吐小體的其他藥物結合可被投予。所獲得之細胞毒殺性T淋巴球起專一抗目標細胞的作用，而目標細胞其表現本發明胜肽，例如用於誘導之相同胜肽。目標細胞可為細胞其內生性表現NEIL3，例如癌細胞，或被以NEIL3基因轉殖之細胞；且由於藉由胜肽刺激表現本發明胜肽於細胞表面之細胞，也可做為經活化之細胞毒殺性T淋巴球攻擊的目標。

VIII. T細胞受體(TCR)

本發明也提供一組合物其包括由編碼出可形成T細胞受體之次單位之多胜肽的核酸，與其使用方法。T細胞受體之次單位具有能力形成T細胞受體，其授與專一性至抗腫瘤細胞的T細胞，腫瘤細胞表現NEIL3。藉由使用本技術領域所知的方法可確認作為細胞毒殺性T淋巴球中之T細胞受體次單位的α-與β-支鏈之核酸，而細胞毒殺性T淋巴球以一或多個本發明之胜肽所誘導(WO2007/032255與Morgan et al.,J Immunol,171,3288(2003))。例如，喜好以聚合酶鏈鎖反應方法來分析T細胞受體。用於分析之聚合酶鏈鎖反應引子可為，例如5’-R引子(5’-gtctaccaggcattcgcttcat-3’)為5’端引子(序列辨識號：48)與3-TRa-C引子(5’-tcagctggaccacagccgcagcgt-3’)專一於T細胞受體alpha鏈C區(序列辨識號：49)、3-TRb-C1引子(5’-tcagaaatcctttctcttgac-3’)專一於T細胞受體beta鏈C1區(序列辨識號：50)或3-TRbeta-C2引子(5’-ctagcctctggaatcctttctctt-3’)專一於T細胞受體beta鏈C2區(序列辨識號：51)為3’端引子，但不限於其。引出之T細胞受體可以高親合力結合表現NEIL3胜肽之目標細胞，且視需要in vivo與in vitro居中有效殺死表現NEIL3之目標細胞。

編碼出T細胞受體次單位的核酸序列可合併進入適合之載體，例如反轉錄病毒載體。這些載體為本技術領域所熟知。通常包含其之核酸或載體可被轉移至一T細胞，例如一來自一病患之T細胞。有用地，本發明提供一現成(off-the-shelf)的組合物允許快速修飾病人所擁有之T細胞(或其他哺乳動物之那些)以快速簡單產生具有優秀之癌症細胞殺死特性的經修飾T細胞。

特定之T細胞受體可專一地辨認本發明之一胜肽與HLA分子之複合物，當T細胞受體於T細胞表面時，給予T細胞抗目標細胞之專一活性。藉由任何已知方法可確認上述複合物之專一辨認，且較佳方法包括，例如使用HLA分子與本發明胜肽之HLA多聚體(multimer)分析，與ELISPOT分析。藉由執行ELISPOT分析，其可確認表現T細胞受體於細胞表面上之T細胞藉由T細胞受體辨認一細胞，且訊息傳送於細胞內。當複合物存在於T細胞表面時藉由已知方法也可執行上述複合物可給予一T細胞細胞毒性活性的確認。較佳方法包括，例如，抗HLA+目標細胞之細胞毒性活性測定，例如鉻(chromium)釋放分析。

本發明也提供細胞毒殺性T淋巴球，其藉由以編碼出在HLA-2存在下與例如序列辨識號：3、4、5、6、11、15、17、21與22之NEIL3胜肽結合，與在HLA-24存在下與序列辨識號：24、33、35、41與43之胜肽結合的T細胞受體次單位多胜肽的核酸轉導來製備。經轉導之細胞毒殺性T淋巴球可in vivo自引導至癌症細胞，且可藉由熟知的培養方法in vivo擴張(例如Kawakami et al.,J Immunol.,142,3452-3461(1989))。本發明細胞毒殺性T淋巴球也可用來形成一致免疫組合物，其於一需要治療或保護之病患中治療或避免癌症為有效(WO2006/031221)。

IX. 藥學物質或組合物

避免與預防包括任何活性，其減少死亡率之負載或來自疾病之死亡率。避免與預防可方生於“初期、第二期與第三期避免層級”。初期避免與預防避免了疾病之發展，而第二期與第三期層級之避免與預防包括藉由恢復功能與減少疾病相關併發症，以疾病之發展與症狀之浮現及減少已建立之疾病之負向發展的避免與預防為目的。或者，治療或避免包括一廣範圍之預防疾病治療，其以減緩特別疾病之嚴重度為目標，例如減少腫瘤之增殖與轉移、減少血管新生。

癌症之治療及/或預防，或，及/或其手術後復發的避免包括任何下列步驟，例如癌細胞之手術移除、似癌細胞之生長抑制、腫瘤之衰退或退化、癌發生之減緩與抑制的誘導、腫瘤退化與血管新生抑制的誘導。癌症之有效治療及/或預防減少致死率與改善具有癌症之個體的預後、減低癌症標記於血液中的程度與減緩伴隨著癌症之可偵測症狀。例如，症狀之減輕或改善構成有效治療及/或預防，其包括10%、20%、30%或更加減輕，或穩定疾病。

由於與正常組織相較，NEIL3表現於癌症中特別被提高，癌症例如膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、大腸癌、子宮內膜異位症、食道癌、肝癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌、前列線癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腫瘤、急性骨髓性白血病與慢性骨髓性白血病，本發明之胜肽或多核苷酸可用來癌症之治療及/或預防，及/或用來避免其手術後之復發。因此，本發明提供一藥學物質或組合物用來癌症之治療及/或預防，及/或避免其手術後之復發，其包括一或多個本發明胜肽或多核苷酸作為活性成分。或者，本發明之胜肽可表現於任何前述外吐小體或細胞表面，例如抗原呈現細胞，以用來作為藥學物質或組合物。此外，上述以本發明任何胜肽為標的之細胞毒殺性T淋巴球也可用來作為本發明藥學物質或組合物之活性成分。

本發明之藥學物質或組合物提供使用如一疫苗。在本發明中，措辭“疫苗”(也指一致免疫組合物)意指一物質，其藉由接種至動物具有誘導抗腫瘤免疫力。本發明之藥學試劑或組合物可用於治療及/或避免癌症或腫瘤，及/或其手術後復發的避免於一個體或病患中，個體或病患包括人類與任何其他哺乳動物，其包括，但不限於小鼠、大鼠、天竺鼠、兔子、貓、狗、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴子、狒狒與黑猩猩，特別是一商業上重要動物或被馴養了的動物。在另一實施例中，本發明也在製造用以治療或避免癌症或腫瘤之藥學組合物或物質中提供一活性成分的使用，其擇自：(a)本發明胜肽；(b)於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜肽的核酸；(c)表現本發明一胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或外吐小體；以及(d)本發明之細胞毒殺性T淋巴球。

或者，本發明更提供一用以治療或避免癌症或腫瘤的活性成分擇自：(a)本發明胜肽；(b)於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜肽的核酸；(c)表現本發明一胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或外吐小體；以及(d)本發明之細胞毒殺性T淋巴球。

或者，本發明更提供一製造用以治療或避免癌症或腫瘤之藥學組合物或物質的方法或製程，其中方法或製程包括將一藥學上或生理上可接受之載體與一活性成分一起配製的步驟，活性成分擇自：(a)本發明胜肽；(b)於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜肽的核酸；(c)表現本發明一胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或外吐小體；以及(d)本發明之細胞毒殺性T淋巴球，為活性成分。

在另一實施例中，本發明也提供一製造用以治療或避免癌症或腫瘤之藥學組合物或物質的方法或製程，其中方法或製程包括將一藥學上或生理上可接受之載體與一活性成分一起混合的步驟，其中活性成分擇自：(a)本發明胜肽；(b)於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜肽的核酸；(c)表現本發明一胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或外吐小體；以及(d)本發明之細胞毒殺性T淋巴球。

根據本發明，已發現包括序列辨識號：3、4、5、6、11、15、17、21、22、24、33、35、41與43之胺基酸序列的胜肽為HLA-A24或HLA-A2限制之抗原決定位胜肽或候選物，其可誘導強而專一之免疫反應。因此包括任何具有序列辨識號：3、4、5、6、11、15、17、21、22、24、33、35、41與43之胺基酸序列之這些多胜肽的本發明藥學物質或組合物特別適合投予HLA抗原為HLA-A24或HLA-A2之個體。相同實施至包括編碼出任何這些胜肽之多核苷酸(即，本發明之多核苷酸)的藥學物質或組合物。

由本發明藥學物質或組合物治療之癌症不限於，且包括其中關於NEIL3之任何癌症(例如，被過度表現)，例如膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、大腸癌、子宮內膜異位症、食道癌、肝癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌、前列線癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腫瘤、急性骨髓性白血病與慢性骨髓性白血病。本發明藥學物質或組合物可包括除了上述活性成分外，具有誘導細胞毒殺性T淋巴球抗似癌細胞之能力的其他胜肽、編碼出此其他胜肽之其他多核苷酸、其他表現此其他胜肽之細胞或此類。於此，具有誘導細胞毒殺性T淋巴球抗似癌細胞之能力的其他胜肽由癌症專一抗原所例示(例如，經定義之腫瘤相關抗原)，但不限於此。

若需要，本發明之藥學物質或組合物可視需要包括其他治療物質為一活性成分，只要此物質不抑制活性成分之抗腫瘤功效，活性成分例如任何本發明胜肽。例如，配方可包括抗發炎物質或組合物、止痛劑、化學治療與其類似。除了其他治療物質或組合物於藥劑其本身中，也可將本發明之藥劑與一或多個其他生理物質或組合物相繼或同時投予。藥劑與生理物質或組合物的量依照，例如使用何種生理物質或組合物、要治療之疾病與投藥的計畫與方式。應瞭解的是，除了此處特別提及之成分外，本發明之藥學物質與組合物可包括本技術領域一般之其他物質或組合物，其具有關於討論中之配方形式。

在本發明一實施例中，本發明之藥學物質或組合物可被包含於製造之商品與套組，其包含對於要被治療之疾病，例如癌症的病理情況有用之材料。製造之商品可包含具有一標籤之任何本發明藥學物質或組合物的容器。適合的容器包括瓶、小瓶(vial)與試管。容器可形成自各種材料，例如玻璃或塑膠。於容器上之標籤需指出物質或組合物為用來治療或避免疾病之一或多個情況。標籤也可指出投藥指示等。

除了上述容器外，套組包括本發明藥學物質或組合物可視需要更進一步包括一第二容器，其儲藏一藥學上可接受之稀釋液。其可更包括商業或使用者觀點需要之其他材料，包括其他緩衝溶液、稀釋液、濾器、針、注射器與具有使用說明之包裝插入物。藥學組合物若需要可被呈現於一包(pack)或一分配器，其可包含含有活性成分之一或多單位劑量形式。包裝可例如包括金屬或塑膠箔，例如一泡棉箱(blister pack)。包或分配器可伴隨著投藥指示。

(1)藥學物質或組合物包含胜肽作為活性成分

可直接投予本發明胜肽為一藥學物質或組合物，若需要的話，其已被一般配方方法所配製。在之後的例子，除了本發明胜肽外、若適合可包括載體、賦形劑與原始做為藥物使用之此類而無特別限制。上述載體的例子為滅菌水生理食鹽水、磷酸緩衝溶液與培養液體(culture fluid)與此類。更進一步而言，若必須，藥學物質或組合物可含安定劑、懸液劑、防腐劑、界面活性劑與此類。本發明之藥學物質或組合物可用來抗癌目的。

可將本發明之胜肽製備為一組合，其包括兩或更多個本發明之胜肽，以in vivo誘導細胞毒殺性T淋巴球。胜肽可以雞尾酒形式或可使用標準技術彼此結合。例如，胜肽可被化學連接或表現如一單一融合多胜肽序列，其可具有一或一些胺基酸為連接器(例如，Lysine linker：K.S.Kawamura et al.J.Immunol.2002,168：5709-5715)。結合之胜肽可為相同或不同。藉由投予本發明之胜肽，藉由HLA抗原，高密度呈現胜肽於抗原呈現細胞上，之後對形成於呈現胜肽與HLA抗原之間的複合物專一反應之細胞毒殺性T淋巴球被誘導。或者，抗原呈現細胞(例如，樹突細胞)自一個體移出且之後以本發明胜肽刺激以獲得表現任何本發明之胜肽於其細胞表面之抗原呈現細胞。將這些抗原呈現細胞再投予至該個體以於該個體中誘導細胞毒殺性T淋巴球，且因此可增加朝向腫瘤相關內皮的侵犯。

治療及/或避免癌症之藥學物質或組合物，其包括本發明任何胜肽為活性成分，可包括一佐劑以使細胞免疫力被有效建立，或者它們可與其他活性成分一起被投予，並且它們可以配製成細粒被投予。佐劑指任何化合物、物質或組合物，當與具有免疫活性之蛋白質一起投予(或依次)時，其增強抗蛋白質之免疫反應。可被實施之佐劑，包括於文獻(Clin Microbiol Rev 1994,7：277-89)中所描述的那些。示範之佐劑的包括磷酸鋁、氫氧化鋁、明礬、霍亂毒素、沙門氏菌毒素、佛氏不完全佐劑(Incomplete Freund's adjuvant,IFA)、佛氏完全佐劑(Complete Freund's adjuvant,CFA)、ISCOMatrix、GM-CSF、CpG、O/W乳劑與此類但不限於此。更進一步而言，於微脂體(liposome)配方與細粒配方中，胜肽連結至幾個微米直徑之小珠，且於配方中，可便利地使用連結至胜肽之脂質。

在本發明另一實施例中，本發明胜肽也可以一藥學上可接受之鹽類被投予。鹽類之較佳例子包括具有鹼金屬之鹽、具金屬之鹽、具有機鹼之鹽、具有機酸之鹽與具無機酸之鹽。在一些實施例中，本發明之藥學物質或組合物包括一成分其啟動細胞毒殺性T淋巴球。已定義脂質為可in vivo啟動抗病毒抗原之細胞毒殺性T淋巴球的物質或組合物。例如，可將棕櫚酸殘基黏附至離胺酸殘基之ε-與α-胺基，且之後連結至本發明之一胜肽。之後脂質胜肽可被直接投予於微胞或顆粒中、併入微脂體或乳化於一佐劑中。如脂質啟動細胞毒殺性T淋巴球反應之另一例子，E.coli脂蛋白，例如三軟脂酸-S甘油半胱氨酰-絲氨酰基絲氨酸(tripalmitoyl-S-glycerylcysternyl-seryl-serine)可使用來啟動細胞毒殺性T淋巴球，當共價附加至一合適之胜肽(參見，例如Deres et al.,Nature 1989,342：561-4)。

投藥之方法可為口服、皮膚內、皮下、靜脈內注射或此類，以及全身投藥或局部投藥至標的位置的鄰近區域。可執行單次投藥或藉由多次投藥追加。本發明之胜肽劑量可適合地調整根據要治療之疾病、病患年紀、體重、投藥方法、與此類，且本發明之胜肽劑量一般為0.001mg至1000mg，例如 0.001mg至1000mg，例如0.1mg至10mg，且可於數天至數個月投藥一次。熟悉此技藝人士可適合地選擇一合適的劑量。

(2)藥學物質或組合物包含多核苷酸為活性成分

本發明之藥學物質或組合物也可包括編碼出此處揭露之胜肽的核酸於一可表達之形式中。此處措辭“於一可表達之形式中”意指多核苷酸，當引入一細胞，in vivo會被表現成一誘導抗腫瘤免疫力之多胜肽。在一代表實施例中，感興趣之多核苷酸的核酸序列包括對於表現多核苷酸而言必須之調控要素。可裝配多核苷酸以達到穩定插入目標細胞之基因體(參見，例如敘述同源重組盒式載體(cassette vector)的Thomas KR & Capecchi MR,Cell 1987,51：503-12。也參見，例如Wolff et al.,Science 1990,247：1465-8；U.S.Patent Nos.5,580,859；5,589,466；5,804,566；5,739,118；5,736,524；5,679,647；and WO 98/04720)。DNA輸送技術的例子包括“裸DNA”、經促進(bupivacaine、聚合物、胜肽居中之)之輸送、陽離子脂質複合物與顆粒居中之(“基因槍”)或壓力居中之傳送(參見，例如U.S.Patent No.5,922,687)。

本發明之胜肽也可藉由病毒或細菌載體來表現。表現載體的例子包括減弱病毒宿主，例如牛痘或禽痘。此方法包括使用牛痘病毒，例如為一載體以表現編碼胜肽之核苷酸序列。藉由引入一宿主，此重組之牛痘病毒表現致免疫胜肽且因此引起一免疫反應。於免疫步驟中為有效之牛痘載體與方法敘述於，例如U.S.Patent No.4,722,848。另一載體包括BCG(Bacille Calmette Guerin)。BCG載體敘述於Stover et al., Nature 1991,351：456-60中。對於治療投藥或免疫有用之其他多種載體，例如腺與腺病毒相關之載體、反轉錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、經解毒之炭疽毒素載體與其類似為明顯的。參見，例如Shata et al.,Mol Med Today 2000,6：66-71；Shedlock et al.,J Leukoc Biol 2000,68：793-806；Hipp et al.,In Vivo 2000,14：571-85。

輸送多核苷酸進入一個體可為直接，於其例子中，病患直接暴露於一攜帶多核苷酸之載體，或為間接，於其例子中，細胞首先in vitro以感興趣之多核苷酸轉形，之後將細胞轉殖進入病患。此兩方法分別為已知，為in vivo與ex vivo基因治療。基因治療之方法之大體回顧，參見Goldspiel et al.,Clinical Pharmacy 1993,12：488-505；Wu and Wu,Biotherapy 1991,3：87-95；Tolstoshev,Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993,33：573-96；Mulligan,Science 1993,260：926-32；Morgan & Anderson,Ann Rev Biochem 1993,62：191-217；Trends in Biotechnology 1993,11(5)：155-215)。也可用於本發明之於重組DNA技術中一般熟知的方法如於eds.Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY,1993；and Krieger,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY,1990中所述。

投藥之方法可為口服、皮膚內、皮下、靜脈內注射或此類，以及全身投藥或局部投藥至標的位置的鄰近區域提供使用。可執行單次投藥或藉由多次投藥追加。於適合載體中或於以編碼出本發明之胜肽的多核苷酸轉形之細胞中的多核苷酸的劑量可適合地調整，根據要治療之疾病、病患年紀、體重、投藥方法、與此類，且本發明之胜肽劑量一般為0.001mg至1000mg，例如0.001mg至1000mg，例如0.1mg至10mg,且可於每數天一次至每數個月一次投藥。熟悉此技藝人士可適合地選擇一合適的劑量。

X. 使用胜肽、外吐小體、抗原呈現細胞與細胞毒殺性T淋巴球的方法

可使用本發明之胜肽與多核苷酸來製備或誘導抗原呈現細胞與細胞毒殺性T淋巴球。也可使用本發明之外吐小體與抗原呈現細胞來誘導細胞毒殺性T淋巴球。胜肽、多核苷酸、外吐小體與抗原呈現細胞可與任何其他化合物結合使用，只要化合物不抑制其細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。因此，任何上述之本發明藥學物質或組合物可用來誘導細胞毒殺性T淋巴球，且除此之外，包括胜肽與多核苷酸的那些也可用來誘導抗原呈現細胞，如下所解釋。

(1)誘導抗原呈現細胞的方法

本發明提供使用本發明之胜肽或多核苷酸來誘導具有高細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的方法。本發明之方法包括in vitro、ex vivo或in vivo將抗原呈現細胞與本發明胜肽接觸的步驟。例如，ex vivo將抗原呈現細胞與胜肽接觸的方法可包括步驟：a：自一個體收集抗原呈現細胞；以及b：將步驟a之抗原呈現細胞與胜肽接觸。

抗原呈現細胞並不限於特定種類之細胞，且包括樹突細胞、蘭格罕細胞(Langerhans cell)、巨嗜細胞、B細胞與活化之T細胞，已知其表現蛋白質(proteinaceous)抗原於其細胞表面以被淋巴球所辨認。較佳為可使用樹突細胞，由於它們於抗原呈現細胞中具有最強的細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。可使用本發明任何胜肽以它們本身或與本發明其他胜肽一起。

另一方面，當投予本發明一胜肽至一個體時，抗原呈現細胞in vivo與胜肽接觸，因此可於個體之體內誘導具有高細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞。因此，本發明包括投予本發明胜肽至一個體。相似地，當本發明之多核苷酸投予至一個體於一可表達之形式中時，本發明一胜肽被表現且in vivo與抗原呈現細胞接觸，以因此於個體之體內誘導具有高細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞。因此，本發明也包括投予本發明多核苷酸至一個體。“可表達之形式”被定義於上述段落“IX. 藥學物質或組合物(2)藥學物質或組合物包含多核苷酸為活性成分”中。

此外，本發明包括將本發明一多核苷酸引入一抗原呈現細胞以誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞。例如方法可包括步驟：a：自一個體收集抗原呈現細胞；以及b：將編碼出本發明胜肽之一多核苷酸引入。

可如前述段落“VI. 抗原呈現細胞”中所述來執行步驟b。

或者本發明提供一製備一專一誘導抗NEIL3之細胞毒殺性T淋巴球活性的抗原呈現細胞的方法，其中該方法包括下列步驟之一：(a)將抗原呈現細胞與本發明一胜肽in vitro、ex vivo或in vivo接觸；以及(b)將編碼出本發明胜肽之一多核苷酸引入抗原呈現細胞。

(2)誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法

更進一步而言，本發明提供使用本發明胜肽、多核苷酸、外吐小體或抗原呈現細胞來誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法。本發明也提供使用編碼出一多胜肽之多核苷酸來誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法，此多胜肽具形成一T細胞受體次單位的能力，而此T細胞受體次單位辨認一本發明胜肽與HLA抗原之複合物。較佳為，誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法包括至少一步驟擇自由下列所組成之群組：a)將一CD8+ T細胞與一抗原呈現細胞及/或一外吐小體接觸，該抗原呈現細胞及/或該外吐小體表現一HLA抗原與本發明胜肽之複合物於其表面，以及b)將一多核苷酸引入一CD8+ T細胞，其中該多核苷酸編碼出一多胜肽，該多胜肽具形成一T細胞受體次單位的能力，而該T細胞受體次單位辨認一本發明胜肽與HLA抗原之複合物。當本發明之胜肽、多核苷酸、抗原呈現細胞或外吐小體被投予至一個體時，於個體體內誘導細胞毒殺性T淋巴球，且以癌細胞為目標之免疫反應的強度增強。因此，本發明方法包括將本發明之胜肽、多核苷酸、抗原呈現細胞或外吐小體投予至一個體的步驟。

或者，藉由ex vivo使用它們，也可誘導細胞毒殺性T淋巴球，且在誘導細胞毒殺性T淋巴球後，經活化之細胞毒殺性T淋巴球可返回至個體。例如，方法可包括步驟：a：自一個體收集抗原呈現細胞；b：將步驟a之抗原呈現細胞與胜肽接觸；以及c：將步驟b之抗原呈現細胞與CD8+細胞共培養。

於上述步驟c中要與CD8+細胞共培養之抗原呈現細胞也可藉由將一包括本發明多核苷酸之基因轉移進入抗原呈現細胞，如於前述段落“VI. 抗原呈現細胞”中所述來製備；但不限於此，且任何有效表現一HLA抗原與本發明胜肽之複合物於其表面的抗原呈現細胞可被使用於本方法。

代替此種抗原呈現細胞，也可使用呈現一HLA抗原與本發明胜肽之複合物於其表面的外吐小體。換句話說，本發明包括，與呈現一HLA抗原與本發明胜肽之複合物於其表面的外吐小體共培養之步驟。此種外吐小體可藉由前述於段落“V. 外吐小體”中之方法來製備。此外，藉由將一包括編碼出與本發明一胜肽結合之T細胞受體次單元的多核苷酸的基因引入CD8+細胞也可誘導細胞毒殺性T淋巴球。如於前述段落“VIII. T細胞受體(TCR)”中所述可執行此轉導。此外，本發明也提供製造一誘導細胞毒殺性T淋巴球之藥學物質或組合物的方法或製程，其中該方法包括將本發明之胜肽與藥學上接受之載體一起混合或配製的步驟。

(3)誘導免疫反應的方法

又，本發明提供誘導抗NEIL3相關疾病之免疫反應的方法。適合的疾病可包括癌症，例如，但不限於膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、大腸癌、子宮內膜異位症、食道癌、肝癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌、前列線癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腫瘤、急性骨髓性白血病與慢性骨髓性白血病。方法包括投予含任何本發明胜肽或編碼出其之多核苷酸的物質或組合物的步驟。本發明方法也考慮投予表現任何本發明胜肽之外吐小體或抗原呈現細胞。細節參見“IX. 藥學物質或組合物”之項目，特別是敘述本發明物質或組合物為疫苗之用途的部分。此外，可被使用於本發明誘導免疫反應之方法的本發明外吐小體與抗原呈現細胞，被詳細描述在前之於“V. 外吐小體”、“VI. 抗原呈現細胞”與“X. 使用胜肽、外吐小體、抗原呈現細胞與細胞毒殺性T淋巴球的方法”之(1)與(2)的項目。

本發明也提供製造一誘導免疫反應之藥學物質或組合物的方法或製程，其中該方法包括將本發明之胜肽與藥學上接受之載體一起混合或配製的步驟。

或者，本發明方法可包括投予一疫苗或藥學組合物的步驟，疫苗或藥學組合物包含：(a)本發明胜肽；(b)於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜肽的核酸；(c)表現本發明一胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或外吐小體；或(d)本發明之細胞毒殺性T淋巴球。

在本發明中，以這些活性成份可治療過度表現NEIL3之癌症。癌症包括，但不限於膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、大腸癌、子宮內膜異位症、食道癌、肝癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌、前列線癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腫瘤、急性骨髓性白血病與慢性骨髓性白血病。因此，在包括活性成分之疫苗或藥學組合物的投予前，其較佳為確認與相同器官之正常組織相較，NEIL3之表現程度於要被治療之細胞或組織中是否被提高。因此，在一實施例中，本發明提供治療(過度)表現NEIL3之癌症的方法，其方法可包括步驟：i)測定獲得自具有癌症要治療之個體的細胞或組織中的NEIL3表現程度；ii)與正常控制組比較NEIL3表現程度；以及iii)投予擇自由上述(a)至(d)所組成之群組的至少一成份至與正常控制組相較具有過度表現NEIL3之癌症的個體。

或者，本發明也可提供包含擇自由上述(a)至(d)所組成之群組的至少一成份的疫苗或藥學組合物，於投予至具有過度表現NEIL3之癌症的個體的用途。換句話說，本發明更提供鑑定要被以本發明NEIL3多胜肽治療之個體的方法，其方法可包括測定來自個體之癌細胞或組織中的NEIL3表現程度的步驟，其中與基因之正常控制組相較，此程度增加指出個體具有可以本發明NEIL3多胜肽治療之癌症。本發明之治療癌的方法將於以下更詳細敘述。

本發明之內容中，測定自已知為非癌症之生物樣本的控制組程度被意指為一“正常控制組程度”。另一方面，若控制組程度測定自一癌的生物組織，其意指為一“癌的控制組程度”。要藉由本發明治療之個體較佳為一哺乳類動物。示範之哺乳類動物包括，但不限於，例如，人類、非人類靈長類動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬與牛。

根據本發明，測定獲得自一個體之癌症細胞或組織中的NEIL3表現程度。使用本技術領域已知方法可於轉錄(核酸)產物程度測定表現程度。例如，藉由雜合方法(例如，北方雜合)使用探針可將NEIL3的mRNA定量。可於一晶片、一陣列或此類執行偵測。陣列之使用可較佳為用於偵測NEIL3表現程度。利用NEIL3的序列資訊，熟悉此技藝人士可製備此種探針。例如，NEIL3的cDNA可被使用為探針。若需要，可以適合之標誌來標誌探針，例如染劑、螢光物質與同位素，且基因的表現程度可被偵測為雜合標誌的強度。

此外，藉由擴大偵測方法(amplification-base detectin method)(例如，RT-PCR)使用引子可將NEIL3(序列辨識號：45)的轉錄產物進行定量。根據基因之可獲得序列資訊可製備此種引子。特別是，用於本方法之探針或引子於嚴厲(stringent)、適度嚴厲、低嚴厲條件下雜合至NEIL3的mRNA。如此處使用，措辭“嚴厲(雜合)條件”意指在此在條件下探針或引子會雜合至其目標序列，而不是其他序列。嚴厲條件為序列依賴(sequence-dependent)，且在不同環境下會不同。比起較短之序列，於較高溫度下觀察到較長序列之特定雜合。一般而言，在一定義之離子強度與pH下所選擇之嚴格條件的溫度為低於一特定序列之熔點(Tm)約5℃。Tm為溫度(在一定義之離子強度與pH與核酸濃度下)，於其下在平衡下50%之互補至目標序列的探針雜合至目標序列。由於目標序列通常存在過量，所以於Tm，在平衡下50%之探針被佔據。一般而言，嚴苛條件為於其中鹽濃度低於1.0M鈉離子，一般約0.01至1.0M鈉離子(或其他鹽)於pH 7.0至8.3，且對於短探針或引子(例如，10至50個核苷酸)而言溫度為至少約30℃，對於較長探針或引子而言溫度為至少約60℃。也可以添加去穩定物質(destabilizing substances)，例如甲醯胺(formamide)來達到嚴苛條件。

或者，為了本發明之診斷可偵測轉譯產物。例如，可偵測NEIL3蛋白質(序列辨識號：45)或其免疫片段之量。測定作為轉錄產物之蛋白質的量的方法包括免疫分析方法，其使用一抗體專一辨認此蛋白質。抗體可為單株或多株。此外，抗體之任何片段或修飾(例如嵌合型抗體(chimeric antibody)、scFv、Fab、F(ab’)₂、Fv等)可被用來偵測，只要片段或經修飾之抗體維持對NEIL3蛋白質的結合能力。本發明也提供此類抗本發明胜肽與其片段之抗體。這些用於蛋白質偵測之這些種類的抗體的製備方法為本技術領域所熟知，且任何方法可被使用於本發明中以製備此種抗體與其等同物(equivalent)。

如根據NEIL3基因轉譯產物偵測NEIL3基因之表現程度的另一方法，使用抗NEIL3蛋白質之抗體經由免疫組織化學(immunohistochemical)分析可測量到染色強度。即，於此測量中，強的染色指出蛋白質/程度之增加的存在，且同時NEIL3基因之高表現程度。可確認於癌症細胞中包括NEIL3 基因之目標基因的表現程度為被提升，若其相較於目標基因之控制組程度(例如，於正常細胞中的程度)增加，例如10%、25%、或50%，或增加大於1.1倍、大於1.5倍、大於2.0倍、大於5倍、大於10倍或更多。

藉由使用先前自一其疾病階段(癌的或非癌的)為已知的個體收集並儲存的樣本控制組織程度可與癌細胞同時測定。此外，獲得自具有癌症要被治療之一器官的非癌區域的正常細胞被使用為正常控制組。或者，根據獲得自分析先前測定之來自其疾病程度已知之個體之樣本中之NEIL3基因的表現程度的結果，藉由統計方法，可測定控制組之程度。此外，控制組程度可為來自自先前測試細胞之表現輪廓的資料庫。並且，根據本發明一方面於一生物樣本中之NEIL3基因的表現程度，可與多個控制組程度比較，其程度被測定自多個參考樣本。較佳為使用一控制組程度測定自一參考樣本，其來自一組織形式相似於源自個體生物樣本之組織形式。此外，較佳為使用具有已知疾病階段之群組中的NEIL3基因的表現程度的標準值(standard value)。標準值可獲得自本技術領域任何已知的方法。例如，平均值+/-2標準差或平均值+/-3標準差，可被使用為標準值。

當與正常控制組程度相較NEIL3基因的表現程度被增加或相似/等同於癌控制組程度，可診斷個體為具有癌症要被治療。更特別地，本發明提供(i)診斷是否一個體具有要被治療之癌症，及/或(ii)選擇要癌症治療之個體的方法，其方法可包括步驟： a)測定在癌症細胞或組織中，NEIL3的表現程度，癌症細胞或組織獲得自被懷疑具有要被治療之癌症的個體；b)與正常控制組比較NEIL3之表現程度；c)若NEIL3之表現程度與正常控制組程度相較被增加，則診斷個體為具有要被治療之癌症；以及d)若個體於步驟c)中被診斷為具有要被治療之癌症，則選擇要癌症治療之個體。

或者，此種方法可包括步驟：a)測定在癌症細胞或組織中，NEIL3的表現程度，癌症細胞或組織獲得自被懷疑具有要被治療之癌症的個體；b)與癌症控制組比較NEIL3之表現程度；c)若NEIL3之表現程度相似或等於癌症控制組程度，則診斷個體為具有要被治療之癌症；以及d)若個體於步驟c)中被診斷為具有要被治療之癌症，則選擇要癌症治療之個體。

本發明也提供一診斷套組以診斷或測定一個體其為或被懷疑遭受可被以本發明NEIL3多胜肽治療之癌症，其也在評估及/或監控癌症之免疫治療的功效與適用性中為有用的。較佳為，癌症包括，但不限於膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、大腸癌、子宮內膜異位症、食道癌、肝癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌、前列線癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腫瘤、急性骨髓性白血病與慢性骨髓性白血病。更特別的是，套組較佳包括至少一用以偵測來自個體癌細胞中之NEIL3基因的表現程度的試劑，其試劑可擇自： (a)一試劑用以偵測NEIL3基因的mRNA；(b)一試劑用以偵測NEIL3基因的蛋白質或其免疫活性片段；以及(c)一試劑用以偵測NEIL3基因之蛋白質的生物活性。

用以偵測NEIL3基因之mRNA的適合試劑包括核酸其專一結合或辨認NEIL3 mRNA，例如，具有對於NEIL3 mRNA之一部分互補的序列的寡核苷酸。這些種類之寡核苷酸以專一於NEIL3 mRNA之引子與探針為例子。根據本技術領域所熟知的方法可製備這些種類之寡核苷酸。若需要，用以偵測NEIL3 mRNA之試劑可被固定於固體基質(matrix)上。此外，大於一個之用以偵測NEIL3 mRNA的試劑可被包含於套組中。

另一方面，用以偵測NEIL3蛋白質或其免疫活性片段之適合試劑可包括對於NEIL3蛋白質或其免疫活性片段的抗體。抗體可為單株或多株。此外，抗體之任何片段或修飾(例如嵌合型抗體(chimeric antibody)、scFv、Fab、F(ab’)₂、Fv等)可被用來作為試劑，只要片段或經修飾之抗體維持對NEIL3蛋白質或其免疫活性片段的結合能力。這些用於蛋白質偵測之這些種類的抗體的製備方法為本技術領域所熟知，且任何方法可被使用於本發明中以製備此種抗體與其等同物(equivalent)。另外，可以訊號產生分子經由直接連接或一間接標誌技術來將抗體進行標誌。標誌與標誌抗體之方法與偵測抗體對其目標的結合為本技術領域所熟知，且任何標誌與方法可被使用於本發明。另外，大於一個之用於偵測NEIL3蛋白質的試劑可被包括於套組中。

套組可包含大於一個之前述試劑。例如，獲得自沒有癌症或遭受癌症之個體的組織樣本可作為有用的控制組試劑。本發明之套組可更包括商業或使用者角度所需之其他材料，包括緩衝溶液、稀釋液、濾器、注射針、注射器與具有使用之操作指南的包裝插入物(例如，書面、磁帶或CD-ROM等)。這些試劑或此類可保持於一具有標誌之容器。適合之容器包括瓶子、小玻璃瓶(vial)與試驗試管。容器可形成自多樣化之材料，例如玻璃或塑膠。

在本發明一實施例中，當試劑為抗NEIL3 mRNA之探針時，試劑可被固定於一固體基質上，例如一多孔條(porous strip)以形成至少一偵測位。多孔條之測量或偵測區可包括複數個位置，各含有一核酸(探針)。一測試條也可含有負及/或正控制組的位置。或者，控制組之位置可位於與測試條分離之一條。視需要而定，不同之偵測位可包含不同量之經固定之核酸，即一較高量於第一偵測位中且一較低含量於隨後之位置中。藉由測試樣本的加入，顯示可偵測訊號之一些位置提供一於樣本中NEIL3 mRNA存在之量的定量指示。偵測位可被設置於任何適合之可偵測形狀且一般為在橫跨一測試條之寬度的條狀物或點的形狀中。

本發明之套組可更包括一正控制組樣本或NEIL3標準樣本。藉由收集NEIL3正之樣本可製備本發明之正控制組樣本且之後分析它們的NEIL3程度。或者，可將經純化之NEIL3蛋白質或多核苷酸加至不表現NEIL3之細胞以形成正樣本(positive sample)或NEIL3標準樣本。於本發明中，經純化之NEIL3可為重組蛋白質。正控制組樣本之NEIL3程度為，例如，大於臨界值(cut off value)。

在一實施例中，本發明更提供一診斷套組，包括一蛋白質或其一部份蛋白質，專一辨認本發明抗體或其片段之能力。本發明之蛋白質之部分胜肽的例子包括多胜肽，其係由在本發明蛋白質之胺基酸序列中之至少8個，較佳15個、更佳20個連續胺基酸所組成。使用本發明之一蛋白質或一胜肽(多胜肽)，藉由偵測於一樣本(例如，血液、組織)中之一抗體可診斷癌症。製備本發明蛋白質與胜肽的方法如上所述。

如上所述，藉由測定介於抗NEIL3抗體與其在對應控制組中之的量的差異可執行癌症的診斷方法。若個體之細胞或組織含有抗基因之表現產物(NEIL3)抗體且抗NEIL3抗體的量被測定大於在相較於其在正常控制組之程度中的截斷值時，被體被懷疑遭受癌症。在另一實施例中，本發明之診斷套組可包括本發明之胜肽與結合至其之HLA分子。使用抗原胜肽與HLA分子偵測抗原專一細胞毒殺性T淋巴球的方法已被建立(例如，Altman JD et al.,Science.1996,274(5284)：94-6)。因此，本發明之胜肽與HLA分子的複合物可應用至偵測腫瘤抗原專一細胞毒殺性T淋巴球的偵測方法，藉此使早期偵測癌症之復發及/或轉移為可能。此外，其可被用來個體之篩選，個體適合包含本發明胜肽為一活性成分的藥物，或藥物治療功效的評估。

特別是，根據已知方法(參見，例如Altman JD et al.,Science.1996,274(5284)：94-6)，可製備放射標誌之HLA 分子與本發明胜肽之寡聚複合物，例如四聚體。藉由使用複合物，可執行診斷，例如藉由將於來自被懷疑遭受癌症之個體的周邊血液淋巴球(peripheral blood lymphocytes)中之抗原-胜肽專一細胞毒殺性T淋巴球進行定量。

本發明更提供藉由使用此處敘述之胜肽抗原決定位，用以評估免疫反應之診斷試劑。在本發明一實施例中，如上述之HLA-A24限制胜肽被使用來評估或預測一個體之免疫反應。藉由將免疫抗原(immunogen)與免疫活性細胞(immunocompetent)in vivo或in vitro接觸來誘導要被評估之免疫反應。在一些實施例中，任何物質或組合物其可導致辨認與結合至胜肽抗原決定位之抗原專一細胞毒殺性T淋巴球的產生可使用為試劑。胜肽試劑必須不被使用為免疫抗原。用於此類分析之分析系統包括相當新近之技術發展，例如四聚體，對細胞內淋巴激素(lymphokines)之染色與干擾素釋放分析或ELISPOT分析。在較佳實施例中，要與胜肽試劑接觸之免疫活性細胞可為包括樹突細胞之抗原呈現細胞。

例如，本發明胜肽可使用於四聚體染色分析以評估為了抗原專一細胞毒殺性T淋巴球存在之周邊血液單核細胞，在暴露至腫瘤抗原或一免疫抗原後。HLA四聚體複合物可被使用來直接顯現抗原專一細胞毒殺性T淋巴球(參見，例如Ogg et al.,Science 279：2103-2106,1998；and Altman et al,Science 174：94-96,1996)，並測定於周邊血液單核細胞之樣本中的抗原專一細胞毒殺性T淋巴球族群的頻率。使用本發明胜肽之四聚體試劑可如下被產生：在對應之HLA重鏈與β2-微球蛋白存在下重新折疊結合至HLA之胜肽，以產生三分子複合物。在複合物中，重鏈之縮端為經生物素化於一預先設計進入蛋白質之位置。將卵白素加至複合物以形成由三分子複合物與卵白素(streptavidin)所組成之四聚體。藉由以螢光標誌卵白素，可使用四聚體來對抗原呈現細胞染色。之後可鑑定細胞，例如藉由流式細胞技術。此類分析可被用於診斷與預後(prognostic)目的。藉由此程序之細胞鑑定也可備用於治療目的。

本發明也提供評估免疫收回反應(immune recall responses)之試劑(參見，例如Bertoni etaL,J.Clin.Invest.100：503-513,1997 and Penna et aL,J Exp.Med.174：1565-1570,1991)，其包括本發明之胜肽。例如，為了抗原-專一細胞毒殺性T淋巴球，使用特定專一胜肽，分析來自具有要被治療之癌症之個體的病患PBMC樣本。藉由培養PBMC與以本發明胜肽刺激細胞可評估含單核細胞之血液樣本。在適合之培養期間後，例如為了細胞毒殺性T淋巴球活性，分析經擴張之細胞族群。

胜肽也可使用為評估一疫苗功效之試劑。使用例如上述方法可分析獲自一以一免疫抗原接種之病患的PBMC。病患為經HLA分型，且選擇辨認表現於病患中之對偶基因(allelespecific)分子的胜肽抗原試劑以分析。藉由於PBMC樣本中之抗原決定位-專一細胞毒殺性T淋巴球的存在，可指出疫苗之免疫抗原性(immunogenicity)。本發明之胜肽也可用來製造抗體，使用本技術領域已熟知的技術(參見，例如， CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY,Wiley/Greene,NY；與Antibodies A Laboratory Manual,Harlow and Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)，其可有效作為診斷或監測癌症之試劑。此類抗體可包括辨認於HLA分子內容中之胜肽的那些，即，結合至胜肽-MHC複合物的抗體。

或者，本發明也提供一些用途，其之一些為此處所述。例如，本發明提供診斷或偵測以NEIL3免疫活性胜肽之表現為特徵的一疾病。這些方法包含測定於一生物樣本中之NEIL3 HLA結合胜肽的表現或NEIL3 HLA結合胜肽之一複合物與HLA class I分子。藉由以對於胜肽或複合物之結合伙伴(binding partner)分析可測定或偵測一胜肽之表現或胜肽與HLA class I分子之複合物。在一較佳實施例中，對於胜肽或複合物之結合伙伴為一抗體其辨認且專一結合至胜肽。藉由使用NEIL3引子之標準PCR放大步驟也可測試於一生物樣本，例如一腫瘤切片中之NEIL3的表現。腫瘤表現之例子於此被呈現且示範之用於NEIL3放大的條件與引子的更進一步揭露可被發現於WO2003/27322中。

較佳為，診斷方法包含將分離自一個體的生物樣本與專一於NEIL3 HLA結合胜肽之一試劑接觸以偵測於生物樣本中之NEIL3 HLA結合胜肽的存在。如此處所使用“接觸”意指以有效接近試劑方式放置生物樣本且在適合之例如，濃度、溫度、時間、離子強度條件下，以允許介於試劑與存在生物樣本中之NEIL3 HLA結合胜肽的專一互相作用。一般而言，將試劑接觸生物樣本之條件為熟悉此技藝人是所知之條件以促進介於分子及於生物樣本中之其同類物(cognate)(例如，一蛋白質與其受體同類物、一抗體與其蛋白質抗原同類物、一核酸與其互補序列同類物)之間的專一互相作用。促進介於分子與其同類物之間的專一互相作用的示範條件敘述於Low et al所提出之U.S.Patent No.5,108,921。

可在in vivo或in vitro之一或兩者執行本發明之診斷方法。因此，在本發明中生物樣本可位於in vivo或in vitro中。例如，生物樣本可為一in vivo組織且專一於NEIL3免疫活性多胜肽的試劑可被用來偵測於組織中此類分子的存在。或者，可in vivo收集或分離生物樣本(例如血液樣本、腫瘤切片、組織萃取物)。在一特別較佳實施例中，生物樣本可為一含細胞樣本，更佳為一樣本含有收集自要被診斷或測試之個體的腫瘤細胞。

或者，藉由一方法可執行診斷，此方法藉由以螢光素(fluorescein)標誌HLA多聚複合物染色允許抗原-專一T細胞的直接定量(例如，Altman,J.D.et al.,1996,Science 274：94；Altman,J.D.et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10330；)。也已提供細胞內淋巴激素(lymphokines)之染色與干擾素釋放分析或ELISPOT分析。多聚體染色、細胞內淋巴激素染色與ELISPOT分析皆顯露比一般分析靈敏至少多10倍。(Murali-Krishna,K.et al.,1998,Immunity 8：177；Lalvani,A.et al.,1997,J.Exp.Med.186：859；Dunbar,P.R.et al.,1998,Curr.Biol.8：413)。也可使用五聚體(例如，US 2004-209295A)、右聚體(dextramer)(例如，WO 02/072631)、鏈聚體(streptamer)(例如，Nature medicine 6.631-637(2002))。

XI. 抗體

本發明提供抗體其結合至本發明胜肽。較佳抗體專一結合至本發明胜肽且不會結合(或微弱結合)至非本發明胜肽。或者抗體結合本發明胜肽與其同源物(homologs)。抗本發明胜肽之抗體可提供用途於癌症診斷與預後分析及成像方法(imaging methodologies)。相似地，對於在癌症病患中也表現或過度表現NEIL3程度而言，此類抗體可提供使用於其他癌症之治療、診斷，及/或預後。此外，細胞內表現之抗體(例如，單鏈抗體)可治療性提供用途於關於NEIL3之表現的癌症中，例如，如膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、大腸癌、子宮內膜異位症、食道癌、肝癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌、前列線癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腫瘤、急性骨髓性白血病與慢性骨髓性白血病。

本發明也提供NEIL3蛋白質(序列辨識號：45)或其片段之偵測或定量的各種免疫活性分析，NEIL3蛋白質或其片段包括由擇自由序列辨識號：3、4、5、6、11、15、17、21、22、24、33、35、41與43。此類分析可包括一或多個具辨認及結合NEIL3蛋白質或其片段之抗NEIL3抗體為適當的。在本發明中，與NEIL3多胜肽結合之NEIL3抗體，較佳為辨認多胜肽，多胜肽由擇自由序列辨識號：3、4、5、6、11、15、17、21、22、24、33、35、41與43所組成之群組的胺基酸序列所組成。以抑制測試(inhibition test)可確認抗體之結合專一性。其為，在由序列辨識號：3、4、5、6、11、15、17、21、22、24、33、35、41與43之胺基酸序列所組成之任何片段多胜肽存在下，當介於要被分析之抗體與全長之NEIL3胜肽之間的結合被抑制時，其顯示此抗體專一結合至片段。在本發明中，在包括，但不限於放射免疫分析(radioimmunoassays)、免疫色層分析技術(immuno-chromatgraph technique)、酵素連結免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)、酵素連結免疫螢光分析(enzyme-linked immunofluorescent assays,ELIFA)等之多種本技術領域熟知之免疫分析形式中執行此類免疫分析。

本發明之關於免疫，但非抗體分析也包括T細胞致免疫性分析(immunogenicity assay)(抑制或刺激)與MHC結合分析。此外，本發明也提供具偵測表現NEIL3之癌症之能力的免疫成像分析，包括，但不限於使用本發明之經標誌的抗體的放射顯像成像(radio scintigraphic imaging)方法。此類分析在NEIL3表現之癌症偵測、監控與預後的為臨床有效的，NEIL3表現之癌症，例如，膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、大腸癌、子宮內膜異位症、食道癌、肝癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌、前列線癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腫瘤、急性骨髓性白血病與慢性骨髓性白血病。

本發明提供結合至本發明胜肽。本發明胜肽可使用於任何形式中，例如單株或多株抗體，且包括獲得自將動物，例如兔子，以本發明胜肽進行免疫之抗血清、所有類型之多株或單株抗體、人類抗體與由基因重組產生之人源化抗體。使用為一抗原以獲得一抗體之本發明胜肽可來自任何動物種類，但較佳為來自哺乳動物，例如，人類、老鼠或大鼠，更佳為一人類。人類來源胜肽可獲得自此處揭露之核苷酸或胺基酸序列。

根據本發明，使用為免疫抗原之胜肽可為一完整之蛋白質或部分胜肽之蛋白質。部分胜肽可包括，例如，本發明之一胜肽之胺基(N)端或羧基(C)端片段。此處，一抗體被定義為一蛋白質其與NEIL3胜肽之全長或片段反應。在一較佳實施例中，本發明之抗體辨認NEIL3片段胜肽，其擇自由序列辨識號：3、4、5、6、11、15、17、21、22、24、33、35、41與43所組成之群組的胺基酸序列所組成。合成寡胜肽的方法為本技術領域所熟知。在合成後，胜肽可在使用為免疫抗原(immunogen)之前視需要被純化。在本發明中，寡胜肽(例如9或10員)可與載體結合或連結以增強致免疫性。鑰孔血藍蛋白(Keyhole-limpet hemocyanin,KLH)被熟知為載體。結合鑰孔血藍蛋白與胜肽的方法為本技術領域所熟知。

或者，可將編碼出本發明一胜肽或其片段的一基因插入一已知的表現載體，其之後被轉形至一宿主細胞，如於此所敘述。藉由任何標準方法，所需之胜肽或其片段可自宿主細胞之外部或內部被重新獲得，且之後可被使用為一抗原。或者，可將表現胜肽之整個細胞或其細胞萃出物或一化學合成胜肽使用為抗原。可以抗原將任何哺乳動物進行免疫，但較佳為考慮與用來細胞融合之親代細胞的相容性。一般而言，使用囓齒目(Rodentia)、兔形目(Lagomorpha)或靈長目(Primates)。囓齒目的動物包括，例如小鼠、大鼠與倉鼠。兔形目的動物包括，例如兔子。靈長目的動物包括，例如狹鼻類(舊世界猴)猴子，例如馬來猴(Macaca fascicularis)、獼猴(rhesus monkey)、聖狒狒(sacred baboon)與黑猩猩(chimpanzees)。

以抗原免疫動物之方法為本技術領域所熟知。抗原之腹腔內注射(intraperitoneal injection)或皮下注射(subcutaneous injection)為免疫哺乳動物之一標準方法。更特別地，可將抗原稀釋或懸浮於一適合量的磷酸鹽緩衝溶液、生理食鹽水等。若需要，可將抗原懸浮液與適合量之標準佐劑，例如佛氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)混合，製成乳狀液(emulsion)並且之後投予至哺乳動物。較佳為其之後投予與適合量之佛氏不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant)混合的抗原每4至21天。也可使用一適合之載體來免疫。於上述免疫後，藉由為了增加所需之抗體量標準方法來檢驗血清。

藉由自被檢驗以增加於血清中之抗體量的經免疫動物收集血液解藉由以任何一般方法自血液分離血清，可製備抗本發明胜肽之多株抗體。多株抗體包括含多株抗體的血清，與可自血清分離含多株抗體的部分(fraction)。使用例如與本發明胜肽結合之親合管柱且更進一步使用蛋白質A或蛋白質G管柱純化此部分，可自僅辨認本發明胜肽之部分純化免疫球蛋白G或M。

為了製備單株抗體，自如上所述經以抗原免疫並確認於血清中所需抗體之增加程度的哺乳動物收集免疫細胞且使免疫細胞遭遇細胞融合。用來細胞融合之免疫細胞，較佳可為獲自脾臟。其他要被與上述免疫細胞融合之親代細胞包括，例如，哺乳動物之骨髓瘤(myeloma)，且較佳為具有以藥物篩選之融合細胞之獲得特性的骨髓瘤細胞。根據已知方法，例如Milstein et al.(Galfre and Milstein,Methods Enzymol 73：3-46(1981))的方法，可將上述免疫細胞與骨髓瘤細胞融合。

獲自細胞融合之產生的融合瘤，藉由將它們培養於標準篩選培養基，例如HAT培養基(含亞黃嘌呤(hypoxanthine)、氨蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶(thymidine)之培養基)，可被篩選。通常持續細胞培養於HAT培養基數天至數週，時間為允許除了所需融合瘤外之其他細胞(非融合細胞)死亡。之後，可執行標準限制稀釋以篩選並複製產生所需抗體之融合瘤。除了於其中為了製備融合瘤、以一抗原免疫一非人類動物的上述方法，可以胜肽、表現胜肽之細胞或其細胞萃取物in vitro免疫人類淋巴細胞，例如被EB病毒感染的那些。之後，將經免疫之淋巴細胞與具不明確分裂能力之來自人類之骨髓瘤，例如U266融合，以產生一產生所需人類抗體之融合瘤，所需之人類抗體可與可被獲得之胜肽結合(Unexamined Published Japanese Patent Application No.(JP-A)Sho 63-17688)。將所獲得之融合瘤之後轉植進入小鼠之腹腔且萃取腹水。可純化所獲得之單株抗體，藉由例如硫酸銨沉澱、一蛋白質A或蛋白質G管柱、DEAE離子交換色層分析或一與本發明胜肽結合之親和管柱。本發明抗體不只可被使用來純化偵測本發明胜肽，也可作為本發明胜肽之促進劑與拮抗劑的候選物。

或者，一產生抗體之免疫細胞，例如一經免疫之淋巴細胞可藉由一致癌基因以永生或被使用來製備單株抗體。也可使用基因工程技術來重組製備因此獲得之單株抗體(參見，例如Borrebaeck and Larrick,Therapeutic Monoclonal Antibodies,published in the United Kingdom by MacMillan Publishers LTD(1990))。例如，一編碼出抗體的DNA可自一免疫細胞，例如產生抗體之一融合瘤或一經免疫的淋巴細胞被複製，直入一適合之載體，且引入一宿主細胞以製備重組抗體。本發明也提供如上述製備之重組抗體。

此外，本發明抗體可為一抗體之片段或經修飾之抗體，只要其結合一或多個本發明之胜肽。例如，抗體片段可為Fab、F(ab')2、Fv或單鏈Fv(scFv)，於其中來自重與輕鏈的Fv片段藉由合適的連結器來連接(Huston et al.,Proc Natl Acad Sci USA 85：5879-83(1988))。更特別是，藉由以酵素例如木瓜酵素或胃蛋白酶處理抗體可產生抗體片段。或者，編碼出抗體之基因可被構築、插入一表現載體且表現於一適合的宿主細胞中(參見，例如Co et al.,J Immunol 152：2968-76(1994)；Better and Horwitz,Methods Enzymol 178：476-96(1989)；Pluckthun and Skerra,Methods Enzymol 178：497-515(1989)；Lamoyi,Methods Enzymol 121：652-63(1986)；Rousseaux et al.,Methods Enzymol 121：663-9(1986)；Bird and Walker,Trends Biotechnol 9：132-7(1991))。

藉由與各種分子，例如聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)結合可修飾抗體。本發明提供此類經修飾之抗體。藉由化學修飾一抗體可獲得經修飾之抗體。這些修飾方法為本技術領域中所常見。或者，本發明之抗體可被獲得為嵌合抗體，介於來自非人抗體之可變區與來自人類抗體之固定區之間，或為人源化抗體，包括來自非人抗體之互補決定區、架構作用區(frame work region,FR)與來自人類抗體之固定區。根據已知方法可製備此類抗體。藉由齧齒類互補決定區之序列取代人類抗體對應之互補序列可執行人源化(參見，例如Verhoeyen et al.,Science 239：1534-1536(1988))。因此，此類人源化抗體為嵌合抗體，其中實質上少於完整之人類可變區已被以來自非人種類之對應序列取代。

也可使用包括人類可變區、架構作用區與固定區的全人類抗體。使用各種本技術領域所知的技術可產生此類抗體。例如，in vitro方法包括呈現於噬菌體上之人類抗體片段的重組資料庫的使用(例如，Hoogenboom & Winter,J.Mol.Biol.227：381(1991))。相似地，藉由將人類免疫球蛋白基因座(loci)引入轉殖動物，例如於其中內生免疫球蛋白基因已被部分或完全去活化的小鼠，可製造人類抗體。此方法被敘述，例如於U.S.Patent Nos.6,150,584,5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016。獲自上述之抗體可被純化至同質(homogeneity)。例如，根據用於一般蛋白質的分離與純化方法可執行抗體之分離與純化。例如，藉由合適地選擇與結合管柱色層分析、過濾、超過濾、鹽析、透析、對鈉十二烷基的硫酸鹽聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis)、等電焦集法(isoelectric focusing)的使用可分開與分離抗體(Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但不限於其。可使用蛋白質A管柱與蛋白質G管柱為親和管柱。要被使用之示範蛋白質A管柱包括，例如Hyper D、POROS與Sepharose F.F.(Pharmacia)。

除了親合，示範之色層分析包括，例如離子交換色層分析、疏水色層分析、膠體過濾、逆向色層分析、吸附色層分析等(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。藉由液相色層分析，例如HPLC與FPLC可執行色層分析步驟。例如，可使用吸收之測量、酵素連結免疫吸附分析(ELISA)、酵素免疫分析(EIA)、放射免疫分析及/或免疫螢光以測量本發明抗體之抗原結合活性。在酵素連結免疫吸附分析中，本發明抗體為固定於一培養盤上，提供本發明胜肽至一培養盤，且之後提供含所需抗體之樣本，產生抗體之細胞的培養懸浮液或經純化的抗體。之後，提供辨認第一抗體且被標誌酵素，例如鹼性磷酸酶之第二抗體，且之後培養培養盤。接著，在清洗後，將酵素受質，例如對硝基苯磷酸(p-nitrophenyl phosphate)，加至培養盤，並測量吸收以評估樣本之抗原結合活性。胜肽之片段，例如C端或N端之片段可被使用為抗原以評估抗原結合活性。根據本發明，可使用BIAcore(Pharmacia)來評估抗原結合活性。

上述方法允許本發明胜肽之偵測或測量，藉由露出本發明抗體至假定含本發明胜肽之樣本並偵測或測量由抗體與胜肽之免疫複合物。由於根據本發明之偵測或測量方法可專一偵測或測量胜肽，方法在使用胜肽之各種實驗中為有用的。

XII. 載體與宿主細胞

本發明也提供載體與宿主細胞，於其中將編碼出本發明胜肽之核苷酸引入。本發明之載體可提供用途於對於維持本發明核苷酸，特別是DNA於宿主細胞中以表現本發明胜肽，或為基因治療以投予本發明本發明核苷酸。當E.coli為宿主細胞且載體被放大且大量製造於E.coli(例如，JM109、DH5 alpha、HB101或XL1Blue)中時，載體具有要被放大於E.coli中之“ori”且篩選轉形E.coli之標誌基因(例如，藉由安比西林(ampicillin)、四環黴素(tetracycline)、卡那黴素(kanamycin)、氯黴素(chloramphenicol)或類似物篩選之一抗藥基因)。例如，可使用M13-系列載體、pUC-系列載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。此外，pGEM-T、pDIRECT與pT7也可被用來次複製與萃取cDNA與上述載體。當載體被用來產生本發明蛋白質時，一表現載體可提供用途。例如，要被表現於E.coli中之一表現載體應具有上述特徵以被放大於E.coli中。當使用E.coli，例如JM109、DH5 alpha、HB101或XL1Blue為宿主細胞時，載體應具有啟動子(promoter)，例如lacZ啟動子(Ward et al.,Nature 341：544-6(1989)；FASEB J 6：2422-7(1992))、araB啟動子(Better et al.,Science 240：1041-3(1988))、T7啟動子或類似物，其可有效表現所需基因於E.coli. 中。基於那方面，可使用，例如pGEX-5X-1(Pharmacia),"QIAexpress system"(Qiagen)、pEGFP與pET(於此例子，宿主較佳為BL21，其表現T7 RNA聚合酶)，取代上述載體。另外，載體也可含用於胜肽分泌之訊號序列。一引導要被分泌之胜肽至E.coli的胞膜間區(periplasm)的示範之訊號序列為pelB訊號序列(Lei et al.,J Bacteriol 169：4379(1987))。將載體引入目標宿主細胞的方式包括，例如，氯化鈣方法，與電穿孔(electroporation)方法。

除了E.coli，例如來自哺乳動物之表現載體(例如pcDNA3(Invitrogen)與pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18(17)：5322(1990))、pEF、pCDM8)、來自昆蟲細胞之表現載體(例如、"Bac-to-BAC桿狀病毒表現系統(baculovirus expression system)"(GIBCO BRL)、pBacPAK8)、來自植物之表現載體(例如，pMH1、pMH2)、來自動物病毒之表現載體(例如、pHSV、pMV、pAdexLcw)、來自反轉錄病毒之表現載體(例如，pZIpneo)、來自酵母菌之表現載體(例如，"Pichia Expression Kit"(Invitrogen)、pNV11、SP-Q01)與來自枯草桿菌(Bacillus subtilis)之表現載體(例如，pPL608,pKTH50)可被用來產生本發明之多胜肽。

為了於動物細胞，例如CHO、COS或NIH3T3細胞中表現載體，載體應具有表現於此類細胞中所必須的啟動子，例如SV40啟動子(Mulligan et al.,Nature 277：108(1979))、MMLV-LTR啟動子、EF1 alpha啟動子(Mizushima et al.,Nucleic Acids Res 18：5322(1990))、CMV啟動子等，與篩選轉形物的標誌基因(例如藉由藥物篩選(例如，新黴素(neomycin)、G418之抗藥基因)較佳。具又這些載體特徵的已知載體的例子包括，例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV與pOP13。

XIII. 診斷癌症的方法

本發明也提供一種診斷癌症的方法。NEIL3的表現被發現特別被提高於一些種類的癌症中(表1與第5圖)。因此，此處所定義之基因與其轉錄與轉譯產物提供診斷效用為癌症之標誌，且藉由測量於一生物樣本(例如，一細胞樣本)中NEIL3的表現，可診斷癌症。特別是，本發明提供藉由於個體中測定NEIL3的表現程度來診斷癌症的方法。藉由本發明方法可被診斷之癌症包括，但不限於膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、大腸癌、子宮內膜異位症、食道癌、肝癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌、前列線癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腫瘤、急性骨髓性白血病與慢性骨髓性白血病。此外，藉由本發明方法，也可診斷或偵測非小細胞肺癌包括肺腺癌(lung adenocarcinoma)與肺鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)。

根據本發明方法，也提供檢驗一個體之情況(condition)的一中間結果。此種中間結果可與額外之資訊結合以協助醫師、護士或其他開業者(practitioner)來診斷出個體遭受疾病。或者，本發明可被用來偵測於一來自個體之組織中的癌細胞，並提供醫師有用的資訊以診斷出個體遭受疾病。

特別是，本發明提供下列方法[1]至[10]：

[1]一種診斷癌症的方法，該方法包括步驟：(a)偵測於一生物樣本中編碼出NEIL3之胺基酸序列之基因的表現程度；及(b)使與基因之正常控制程度比較時於所偵測之表現程度中的增加與疾病之存在成關聯。

[2][1]之方法，其中表現程度至少10%大於正常控制組。

[3][1]之方法，其中表現程度藉由擇自(a)偵測包括NEIL3之序列的一mRNA；(b)偵測包括NEIL3之胺基酸序列的一蛋白質；以及(c)偵測包括NEIL3之胺基酸序列的蛋白質的一生物活性。

[4][1]之方法，其中癌症係擇自膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、大腸癌、子宮內膜異位症、食道癌、肝癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌、前列線癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腫瘤、急性骨髓性白血病與慢性骨髓性白血病的群組。

[5][3]之方法，其中藉由偵測探針至基因之基因轉錄體的雜合來測定表現程度。

[6][3]之方法，其中藉由偵測抗體對基因所編碼出之蛋白質的結合作為基因之表現程度來測定表現程度。

[7][1]之方法，其中生物樣本包括切片、唾液、血液、肋膜積液(pleural effusion)或尿液。

[8][1]之方法，其中來自個體之生物樣本包括一上皮細胞。

[9][1]之方法，其中來自個體之生物樣本包括一癌症細胞。

[10][1]之方法，其中來自個體之生物樣本包括一癌症上皮細胞。

或者，本發明提供偵測或鑑定於一來自個體之組織樣本中之癌症細胞的方法，該方法包括測定於一來自個體之生物樣本中之NEIL3基因的表現程度的步驟，其中與該基因之正常控制組程度相較於該表現程度中之增加表示於組織中之癌細胞的存在或嫌疑。此種結果可與額外之資訊結合以協助醫師、護士或其他健康照顧開業者於診斷出一個體為受此疾病之苦惱。換句話說，本發明可以一有用的資訊提供醫師以診斷出一個體為受此疾病之苦惱。例如，根據本發明，當在於獲得自個體的組織中有關於癌症細胞出現的懷疑時，藉由考慮NEIL3基因的表現程度，加上包括病患組織病理學、血液中已知腫瘤標誌的程度與臨床分數等的疾病的不同方面，可達成臨床決定。

例如，一些於血液中已知診斷膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、大腸癌、子宮內膜異位症、食道癌、肝癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌、前列線癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腫瘤、急性骨髓性白血病與慢性骨髓性白血病標誌如下列：膀胱癌；SCC、TPA或IAP

乳癌；BCA225、TPA、CEA、IAP或CA15-3

子宮頸癌；SCC、TPA或CA125

膽管細胞癌；CA19-9或CEA

大腸癌；CEA

子宮內膜異位症；CA125

食道癌；CEA、DUPAN-2、IAP、NSE、SCC、SLX或Span-1

肝癌；AFP或ICDH

非小細胞肺癌；CEA

骨肉瘤；ALP

胰臟癌；BFP、CA19-9、CA125或CEA

前列線癌；PSA或PAP

腎癌；IAP

小細胞肺癌；ProGRP或NSE

急性骨髓性白血病；TK活性

慢性骨髓性白血病；TK活性

即，於本發明之此特別實施例中，將基因表現分析之結果作為病患之疾病狀態之更進一步診斷的一中間結果。在另一實施例中，本發明提供偵測癌症之診斷標誌的方法，該方法包括偵測於一來自個體之生物樣本中之NEIL3基因的表現為膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、大腸癌、子宮內膜異位症、食道癌、肝癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌、前列線癌、腎癌、小細胞肺癌、軟組織腫瘤、急性骨髓性白血病與慢性骨髓性白血病之診斷標誌，但不限於此。

診斷癌症的方法將於以下更詳細敘述。一要被藉由本發明方法診斷之之個體較佳為一哺乳動物。示範之哺乳動物包括，但不限於，例如人類、非人靈長動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬與牛。較佳為自要被診斷之個體收集生物樣本以執行診斷。可使用任何生物材料為用於測定之生物樣本，只要其包括NEIL3之目標轉錄或轉譯產物。生物樣本包括，但不限於身體組織或液體、例如血液、唾液與尿液。在一些實施例中，生物樣本包含一細胞族群，其包括一上皮細胞，更佳為一癌症上皮細胞或一來自被懷疑癌化之組織的上皮細胞。此外，若需要，細胞可自所獲得之身體組織或液體被純化，且之後使用為生物樣本。

根據本發明，測定於來自個體之生物樣本中之NEIL3的表現程度。使用本技術領域已知方法，可測定表現程度於轉錄(核酸)產物程度。例如，藉由雜合方法(，例如北方雜合)使用探針可將NEIL3之mRNA進行定量。可執行偵測於一晶片或陣列上。一陣列之用途較佳為用已偵測包括NEIL3之複數個基因(例如，各種癌症特定基因)的表現程度。利用NEIL3之序列資訊(序列辨識號：44；GenBank accession number：NM_018248)熟悉此技藝人士可製備此種探針。例如，可使用NEIL3的cDNA為探針。若需要，可以適合之標誌，例如染料、螢光與同位素來標誌探針，且基因之表現程度可被偵測為經雜合標誌的強度。

此外，藉由擴大偵測方法(例如，RT-PCR)使用引子可將NEIL3的轉錄產物進行定量。根據基因之可得序列資訊也可製備此類引子。例如，使用於實施例中引子(序列辨識號：46與47)藉由RT-RCR或北方墨點法可被使用於偵測，但本發明並不限於此。特別是，用於本發明之探針或引子在嚴苛、中度嚴苛與低度嚴苛條件下雜合至NEIL3的mRNA。

或者，為本發明之診斷，可偵測轉譯產物。例如，可測定NEIL3蛋白質之量。測定為轉譯產物之蛋白質之量的方法，包括使用專一辨認此蛋白質之抗體的免疫分析方法。抗體可為單株或多株。此外，抗體之任何片段或修飾(例如嵌合型抗體(chimeric antibody)、scFv、Fab、F(ab’)₂、Fv等)可被用來偵測，只要片段或經修飾之抗體維持對NEIL3蛋白質的結合能力。這些用於蛋白質偵測之這些種類的抗體的製備方法為本技術領域所熟知，且任何方法可被使用於本發明中以製備此種抗體與其等同物(equivalent)。如根據NEIL3基因轉譯產物偵測NEIL3基因之表現程度的另一方法，使用抗NEIL3蛋白質之抗體經由免疫組織化學(immunohistochemical)分析可觀察到染色強度。即，強之染色的觀察指出蛋白質之增加的存在，與同時NEIL3基因之高表現程度。

此外，除了NEIL3基因之表現程度，測定其他癌症相關基因，例如已知於癌症中被差別表現之基因的表現程度以改善診斷之準確度。可認為於生物樣本中包括NEIL3基因之癌症標誌基因的表現程度為被提升，若其相較於對應癌症標誌基因之控制組程度增加，例如10%、25%、或50%，或增加大於1.1倍、大於1.5倍、大於2.0倍、大於5倍、大於10倍或更多。

藉由使用先前自一個體/其疾病階段(癌的或非癌的)為已知的個體收集並儲存的樣本控制組織程度可與生物樣本同時測定。或者，根據獲得自分析先前測定之來自其疾病程度已知之個體之樣本中之NEIL3基因的表現程度的結果，藉由統計方法，可測定控制組之程度。此外，控制組程度可為自先前測試細胞之表現輪廓的資料庫。並且，根據本發明一方面於一生物樣本中之NEIL3基因的表現程度，可與多個控制組程度比較，其控制組程度被測定自多個參考樣本。較佳為使用一控制組程度測定自一參考樣本，其來自一組織形式相似於源自病患生物樣本之組織形式。此外，較佳為使用具有已知疾病階段之群組中的NEIL3基因的表現程度的標準值(standard value)。標準值可獲得自本技術領域任何已知的方法。例如，平均值+/-2標準差或平均值+/-3標準差，可被使用為標準值。

當與正常控制組程度相較NEIL3基因的表現程度被增加或相似/等同於癌控制組程度，可診斷個體為遭受癌症或於發展癌症之風險。此外，在一例子中，多個癌症相關基因之表現程度被比較，介於樣本與為癌症之參考樣本間的基因表現形式中的相似度指出個體為遭受癌症癌症或於發展癌症之風險。可將介於測試生物樣本之表現程度與控制程度間的不同標準化至控制核酸的表現程度，例如管家基因(housekeeping gene)，根據細胞之癌症與非癌程度已知其表現程度並無不同。示範之控制基因包括，但不限於β肌動蛋白(beta actin)、甘油醛-3-磷酸去氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)與核糖蛋白P1。

雖然於本發明之實施或測試中可使用相似或等同於在此敘述之那些的方法與材料，但是以下敘述適合之方法與材料。於此所提之所有刊物、專利申請、專利或其他參考文獻被引入參考於其內容中。如果發生抵觸，本發明說明書，包括定義，將會控制。此外，材料、方法與實施例僅為說明，並不傾向於限制。

於以下實施例將更進一步敘述本發明，其不限制敘述於申請專利範圍中之本發明範圍。

【實施例】材料與方法細胞株

T2(HLA-A2)、人類B淋巴母細胞株(lymphoblastoid cell line)、COS7與非洲綠猴腎細胞株為自ATCC所購得而PSCCA0922(HLA-^*A0206)為自日本健康科學基金會(Japan Health Sciences Foundation)所購得。TISI、HLA-A^*2402+B淋巴母細胞株為購自IHWG細胞與基因銀行(Seattle,WA)。

來自NEIL3之胜肽的候選物選擇

使用結合預測軟體“BIMAS”(www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind)(Parker KC et al.(J Immunol 1994,152(1)：163-75)、Kuzushima K et al.(Blood 2001,98(6)：1872-81))預測來自NEIL3之9-員與10員胜肽，其結合至HLA-A^*0201分子。使用"NetMHC3.0"結合預測軟體(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)(Buus et al.(Tissue Antigens.,62：378-84,2003),Nielsen et al.(Protein Sci.,12：1007-17,2003,Bioinformatics,20(9)：1388-97,2004))預測來自NEIL3與HLA-A^*2402分子結合之9-員與10員胜肽。這些胜肽係根據一標準固相合成方法由Biosynthesis Inc.(Lewisville,TX)來合成且藉由逆相高效能液體層析(reversed phase high performance liquid chromatography,HPLC)來純化。分別藉由分析型HLPC與質譜分析確認這些胜肽之純度(>90%)與身份(identity)。將胜肽溶解於二甲基亞碸(dimethylsulfoxide,DMSO)中於20mg/ml且儲存於-80℃。

In vitro細胞毒殺性T淋巴球誘導

使用來自單核白血球之樹突細胞做為抗原呈現細胞以誘導抗表現於人類白血球組織抗原(HLA)上之胜肽的細胞毒殺性T淋巴球反應。In vitro產生樹突細胞如別處所述(Nakahara S et al.,Cancer Res 2003 Jul 15,63(14)：4112-8)。特別地，由Ficoll-Plaque(Pharmacia)溶液分離自一正常自願者(HLA-A^*0201或HLA-A^*0206+)之周邊血液單核細胞，藉由貼附至一塑膠組織培養盤(Becton Dickinson)來分離以豐富其如一單核白血球部分。將經豐富單核白血球之族群培養在1000U/ml之人類顆粒-巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)(R&D System)與1000U/ml之白細胞介素(interleukin,IL)-4(R&D System)存在下於含2%之熱去活性自身取得血清(autologous serum,AS)之AIM-V培養基(Invitrogen)中。培養7天後，於AIM-V培養基中，於3μg/ml之β-2微球蛋白(beta 2-microglobulin)存在下以20μg/ml之各合成胜肽脈衝(pulsed)細胞激素誘導之樹突細胞3小時於37℃。所產生之細胞顯示表現樹突細胞相關分子，例如CD80、CD83、CD86與HLA Class II於其細胞表面(資料未顯示)。之後以X-射線(20Gy)將這些胜肽脈衝之樹突細胞去活性且將其以1：20之比例與自身取得CD8+T細胞混合，CD8+T細胞藉由以CD8 Positive Isolation Kit(Dynal)正選擇獲得。這些培養物設置於48孔盤(Corning)；各孔含1.5 x 10⁴胜肽脈衝之樹突細胞、3 x 10⁵ CD8+ T細胞與10ng/ml之IL-7(R&D System)於0.5ml之AIM-V/2%自身取得血清培養基中。三天之後，以IL-2(CHIRON)添加至培養物至終濃度為20IU/ml。第7天與第14天更以自身取得胜肽脈衝之樹突細胞進一步刺激T細胞。以與上述相同之方法每次製備樹突細胞。於第21天，第三輪之胜肽刺激後，將細胞毒殺性T淋巴球進行抗胜肽脈衝之T2或PSCCA0922細胞測試(Tanaka H et al.,Br J Cancer 2001 Jan 5,84(1)：94-9；Umano Y et al.,Br J Cancer 2001 Apr 20,84(8)：1052-7；Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24)：8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci 2006May,97(5)：411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005 Aug,96(8)：498-506)。

細胞毒殺性T淋巴球擴張步驟

使用與由Riddell et al.(Walter EA et al.,N Engl J Med 1995 Oct 19,333(16)：1038-44；Riddell SR et al.,Nat Med 1996 Feb,2(2)：216-23)敘述之相似方法於培養中擴張細胞毒殺性T淋巴球。全部5 x 10⁴細胞毒殺性T淋巴球懸浮於25ml之含有由MMC去活化之兩種人類B類淋巴母細胞株之AIM-V/5%自身取得血清培養基，在40ng/ml之抗-CD3單株抗體(Pharmingen)存在下。在開始培養1天後，120IU/ml之IL-2加入培養中。於第5、8、11天以新鮮之含30IU/ml之IL-2的AIM-V/5%自身取得血清培養基提供給培養物(Tanaka H et al.,Br J Cancer 2001 Jan 5,84(1)：94-9；Umano Y et al.,Br J Cancer 2001 Apr 20,84(8)：1052-7；Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24)：8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci 2006 May,97(5)：411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005 Aug,96(8)：498-506)。

細胞毒殺性T淋巴球複製的建立

稀釋以使細胞毒殺性T淋巴球以0.3、1與3細胞毒殺性T淋巴球/孔的含量於96 round-bottomed微效價盤(Nalge Nunc International)中。細胞毒殺性T淋巴球與1 x 10⁴細胞/孔之2種兩種人類B類淋巴母細胞株、30ng/ml之抗-CD抗體與125U/ml之IL-2於全部150μl/孔之含5%自身取得之血清的AIM-V培養基中一起培養。10天後將50μl/孔之IL-2加入培養基中以達到125U/ml IL-2之終濃度。於第14天測試細胞毒殺性T淋巴球之活性，且使用上述相同方法擴張細胞毒殺性T淋巴球複製(Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24)：8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci 2006 May,97(5)：411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005 Aug,96(8)：498-506)。

專一之細胞毒殺性T淋巴球活性

為了測試專一之細胞毒殺性T淋巴球活性，執行IFN-γ酵素結合免疫斑點(ELISPOT)分析與IFN-γ酵素結合免疫吸附(ELISA)分析。特別地，製備胜肽脈衝之T2(1 x 10⁴/well)為刺激細胞。培養之細胞於48孔中做為應答細胞。在製造商步驟下執行IFN-γ酵素結合免疫斑點分析與IFN-γ酵素結合免疫吸附分析。

質體轉染

藉由PCR將編碼出目標基因之開放讀框或HLA-A^*0201、HLA-A^*0206或HLA-A^*2402之cDNA放大。將PCR放大產物複製進pCAGGS載體。使用lipofectamine 2000(Invitrogen)，根據製造商建議步驟將質體轉染進COS7，其為一目標基因與HLA-A2、A24-(負)細胞株。於自轉染後2天，以versene(Invitrogen)收集經轉染的細胞且使用為細胞毒殺性T淋巴球活性分析之目標細胞(5 x 10⁴/well)。

半定量RT-PCR分析

以Qiagen RNeasy kit(Qiagen)或Trizol reagent(Life Technologies,Inc.)，根據製造商建議步驟來萃取總RNA。使用多dT12-18引子(Amersham Pharmacia Biotech)及Superscript II反轉錄酶(reverse transcriptase)(Life Technologies)將總RNA之十微克份(ten-microgram aliquots)反轉錄為單股cDNA。將各單股cDNA製備稀釋，為了接下來藉由將股RT-PCR實驗執行於12μl之PCR緩衝溶液(TAKARA)之PCR放大。放大執行4分鐘於94℃以變性，接著94℃，30秒，28循環、60℃，30秒，與72℃，60秒，在GeneAmp PCR system 9700(Perkin-Elmer,Foster City,CA)中。對於NEIL3的引子序列為順向5'-TTGGTCCTCCTCTGTTTCATAGA-3'(序列辨識號：46)與逆向5'-GCTTCTCCCCAGTTACAAGAGAC-3'(序列辨識號：47)。

結果於癌症中增強之NEIL3表現

使用c-DNA微陣列獲得自各種癌症之總體基因表現概況 (profile)顯示NEIL3(GenBank Accession No.NM_018248；序列辨識號：44)被提升。與對應之正常組織比較，急性骨髓性白血病中20個有4個、膀胱癌中6個有5個、乳癌中11個有10個、子宮頸癌中8個有8個、膽管細胞癌中1個有1個、慢性骨髓性白血病中12個有12個、大腸癌中6個有3個、子宮內膜異位症中1個有1個、食道癌中8個有4個、肝癌中10個有6個、非小細胞肺癌中7個有7個、骨肉瘤中16個有16個、胰臟癌中1個有1個、前列腺癌中10個有10個、腎癌中2個有2個、小細胞肺癌中12個有12個與軟組織腫瘤中12個有12個，有根據地提升NEIL3表現(表1)。

(實驗1) 來自NEIL3之HLA-A2結合胜肽的預測

表2以最高之結合親和力之順序顯示NEIL3之HLA-A2結合員胜肽。總共23個具有潛在HLA-A2結合能力之胜肽被選擇且將其試驗以確定抗原決定位胜肽(表2)。

起始位置指自NEIL3之N端的胺基酸殘基數目。結合分數來自“BIMAS”。

以HLA-A^*0201或0206限制之來自NEIL3之預測胜肽誘導細胞毒殺性T淋巴球與經以來自NEIL3之胜肽刺激的細胞毒殺性T淋巴球株的建立

根據敘述於“材料與方法”之步驟產生對於那些來自NEIL3之胜肽的細胞毒殺性T淋巴球。藉由IFN-γ酵素結合免疫斑點分析測定胜肽專一細胞毒殺性T淋巴球活性(第1a-j圖)。其顯示與控制組孔洞相較以NEIL3-A2-9-585(序列辨識號：3)刺激之#8(a)、以NEIL3-A2-9-127(序列辨識號：4)刺激之#2(b)、以NEIL3-A2-9-416(序列辨識號：5)刺激之#4與#5(c)、以NEIL3-A2-9-71(序列辨識號：6)刺激之#3(d)、以NEIL3-A2-9-271(序列辨識號：11)刺激之#1(e)、以NEIL3-A2-10-198(序列辨識號：15)刺激之#3(f)、以NEIL3-A2-10-340(序列辨識號：17)刺激之#1(g)、以NEIL3-A2-10-590(序列辨識號：21)刺激之#2與#3(h)與以NEIL3-A2-10-378(序列辨識號：22)刺激之#6(i)顯示強而有力的IFN-γ產生。另外，具有NEIL3-A2-9-416(序列辨識號：5)之孔洞#9、10、12與13顯示強而有力之抗經胜肽脈衝之A0206+的PSCCA0922細胞。此外，以NEIL3-A2-9-585(序列辨識號：3)刺激於正孔洞編號#8中、以NEIL3-A2-9-127(序列辨識號：4)刺激於#2中、以NEIL3-A2-9-416(序列辨識號：5)刺激於#4與#5中、以NEIL3-A2-9-71(序列辨識號：6)刺激於#3中、以NEIL3-A2-9-271(序列辨識號：11)刺激於#1中、以NEIL3-A2-10-198(序列辨識號：15)刺激於#3中與以NEIL3-A2-10-590(序列辨識號：21)刺激於#2與#3中的細胞被擴張並建立細胞毒殺性T淋巴球細胞株，且以對於A0206之NEIL3-A2-9-416(序列辨識號：5)刺激之#10與12也被擴張並建立細胞毒殺性T淋巴球細胞株。藉由IFN-γ酵素結合免疫吸附分析測定那些細胞毒殺性T淋巴球細胞株的細胞毒殺性T淋巴球活性(第2a-k圖)。其顯示與無胜肽脈衝之目標細胞相較，所有細胞毒殺性T淋巴球細胞株顯示強的抗以對應胜肽脈衝之目標細胞的IFN-γ產生。另一方面，藉由顯示於表2中之其他胜肽的刺激沒有建立細胞毒殺性T淋巴球細胞株，儘管這些胜肽具有與HLA-A^*0201之可能結合能力。因此，其指出篩選來自NEIL3之7個胜肽為可誘導強而有力之細胞毒殺性T淋巴球的胜肽。

抗NEIL3特定胜肽之細胞毒殺性T淋巴球細胞株的建立

如於“材料與方法”所述藉由來自細胞毒殺性T淋巴球細胞株的限制稀釋建立細胞毒殺性T淋巴球複製，且藉由IFN-γ酵素結合免疫吸附分析測定來自抗經胜肽脈衝目標細胞之細胞毒殺性T淋巴球複製的IFN-γ產生。測定強的IFN-γ產生來自以序列辨識號：5、序列辨識號：6、序列辨識號：15與序列辨識號：21刺激之細胞毒殺性T淋巴球複製於第3圖中。

抗外生表現NEIL3與HLA-A^*0201或HLA-A^*0206之目標細胞的專一細胞毒殺性T淋巴球活性

測試經提升抗這些胜肽之所建立的細胞毒殺性T淋巴球細胞株與複製其對於辨認外生表現NEIL3與HLA-A^*0201或HLA-A^*0206分子之目標細胞的能力。使用由對應之胜肽提升的細胞毒殺性T淋巴球細胞株與複製做為影響細胞來測試抗COS7細胞的專一細胞毒殺性T淋巴球活性，而COS7細胞經全長之NEIL3與HLA-A^*0201或HLA-A^*0206分子基因轉染(對於外生表現NEIL3與HLA-A^*0201或HLA-A^*0206基因之目標細胞的特定模式)。COS7細胞以全長NEIL3或HLA-A^*0201或HLA-A^*0206基因轉染製備為控制組。於第4圖中，以序列辨識號：5、序列辨識號：6與序列辨識號：15刺激之細胞毒殺性T淋巴球顯示強的抗表現NEIL3與HLA-A^*0201兩者之COS7細胞的能力，且以序列辨識號：5刺激之細胞毒殺性T淋巴球也顯示強的抗表現NEIL3與HLA-A^*0206兩者之COS7細胞的能力。另一方面，沒有偵測到抗控制組之顯著專一之細胞毒殺性T淋巴球活性。因此，這些資料清楚證明NEIL3-A2-9-416(序列辨識號：5)、NEIL3-A2-9-71(序列辨識號：6)與NEIL3-A2-10-198(序列辨識號：15)之胜肽被自然表現於具有HLA-A^*0201分子之目標細胞上且由細胞毒殺性T淋巴球所辨認，又NEIL3-A2-9-416(序列辨識號：5)也被自然表現於具有HLA-A^*0206分子之目標細胞上且由細胞毒殺性T淋巴球所辨認。這些結果顯示此來自NEIL3之胜肽為可得以提供具NEIL3表現之腫瘤之病患的癌症疫苗。

抗原胜肽之同源分析

以NEIL3-A2-9-585(序列辨識號：3)、NEIL3-A2-9-127(序列辨識號：4)、NEIL3-A2-9-416(序列辨識號：5)、NEIL3-A2-9-71(序列辨識號：6)、NEIL3-A2-9-271(序列辨識號：11)、NEIL3-A2-10-198(序列辨識號：15)、NEIL3-A2-10-340(序列辨識號：17)、NEIL3-A2-10-590(序列辨識號：21)與NEIL3-A2-10-378(序列辨識號：22)刺激之細胞毒殺性T淋巴球顯示顯著且專一之細胞毒殺性T淋巴球活性。此結果可能起因於NEIL3-A2-9-585(序列辨識號：3)、NEIL3-A2-9-127(序列辨識號：4)、NEIL3-A2-9-416(序列辨識號：5)、NEIL3-A2-9-71(序列辨識號：6)、NEIL3-A2-9-271(序列辨識號：11)、NEIL3-A2-10-198(序列辨識號：15)、NEIL3-A2-10-340(序列辨識號：17)、NEIL3-A2-10-590(序列辨識號：21)與NEIL3-A2-10-378(序列辨識號：22)之胜肽序列為與源自已知使人類免疫系統敏感之其他分子的胜肽同源的事實。為了排除此可能性，對於使用為關鍵字向BLAST演算法(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)查詢之這些胜肽序列執行同源性分析，而BLAST演算法顯示沒有序列顯示顯著之同源性。同源性分析之結果指出NEIL3-A2-9-585(序列辨識號：3)、NEIL3-A2-9-127(序列辨識號：4)、NEIL3-A2-9-416(序列辨識號：5)、NEIL3-A2-9-71(序列辨識號：6)、NEIL3-A2-9-271(序列辨識號：11)、NEIL3-A2-10-198(序列辨識號：15)、NEIL3-A2-10-340(序列辨識號：17)、NEIL3-A2-10-590(序列辨識號：21)與NEIL3-A2-10-378(序列辨識號：22)之序列為獨特的，且因此只有很小可能性分子會對於一些非相關分子提高非傾向之免疫反應。

因此，確認新穎之來自NEIL3之HLA-A2抗原決定位胜肽。此外證明NEIL3之抗原決定位胜肽對癌症免疫治療而言可為適用。

於人類癌症之一寬範圍中之NEIL3的提升表現

接下來之半定量RT-PCR分析顯示經增強之NEIL3表現於 8個遭受微陣列分析之ICC中的7個中(第5a圖)。為了確認於肝癌中此基因的表現輪廓，發明人使用臨床肝癌切片與包括正常肝細胞之正常人類組織來執行半定量RT-PCR分析。結果，發明人發現相較於正常肝組織，於8個臨床肝癌樣本(低區別度切片)中的7個中之其表現顯示被提升之表現的NEIL3(第5a圖)，且NEIL3過渡表現於5個HCC細胞中的5個，且不表現於其他正常組織中(第5b圖)。

(實驗2) 來自NEIL3之HLA-A24結合胜肽的預測

表3a與3b以最高之結合親和力之順序顯示NEIL3之HLA-A24結合9員與10員胜肽。總共21個具有潛在HLA-A24結合能力之胜肽被選擇且將其試驗以確定抗原決定位胜肽。

起始位置指自NEIL3之N端的胺基酸殘基數目。

結合分數與分離常數(dissociation constant)[Kd(nM)]來自“BIMAS”與“NetMHC 3.0”。

以HLA-A^*2402限制之來自NEIL3之預測胜肽誘導細胞毒殺性T淋巴球

根據敘述於“材料與方法”之步驟產生對於那些來自NEIL3之胜肽的細胞毒殺性T淋巴球。藉由IFN-γ酵素結合免疫斑點分析測定胜肽專一細胞毒殺性T淋巴球活性(第6a-e圖)。其顯示與控制組孔洞相較，以NEIL3-A24-9-545(序列辨識號：24)刺激之#7(a)、以NEIL3-A24-9-362(序列辨識號：33)刺激之#6(b)、以NEIL3-A24-10-320(序列辨識號：35)刺激之#2與#8(c)、以NEIL3-A24-10-544(序列辨識號：41)刺激之#8(d)與以NEIL3-A24-10-87(序列辨識號：43)刺激之#1與#4(e)顯示強而有力的IFN-γ產生。另一方面，藉由顯示於表3a與3b中之其他胜肽的刺激沒有測定到專一之細胞毒殺性T淋巴球活性，儘管這些胜肽具有與HLA-A^*2402之可能結合能力。例如，以NEIL3-A24-9-364(序列辨識號：25)刺激之抗胜肽脈衝目標細胞的細胞毒殺性T淋巴球反應的典型負資料(f)。因此，其指出篩選來自NEIL3之5個胜肽為可誘導強而有力之細胞毒殺性T淋巴球的胜肽。

抗NEIL3衍生胜肽之細胞毒殺性T淋巴球細胞株與複製的建立

於具有NEIL3-A24-9-545(序列辨識號：24)之孔洞編號#7(a)、具有NEIL3-A24-9-362(序列辨識號：33)之孔洞編號#6(b)、具有NEIL3-A24-10-320(序列辨識號：35)之孔洞編號#8(c)、具有NEIL3-A24-10-544(序列辨識號：41)之孔洞編號#8(d)與具有NEIL3-A24-10-87(序列辨識號：43)之孔洞編號#1(e)中藉由IFN-γELISPOT分析偵測顯示胜肽專一細胞毒殺性T淋巴球活性的細胞被擴張與建立細胞毒殺性T淋巴球細胞株。藉由IFN-γ酵素結合免疫吸附分析測定那些細胞毒殺性T淋巴球細胞株的細胞毒殺性T淋巴球活性(第7 a-e圖)。其顯示與無胜肽脈衝之目標細胞相較，所有細胞毒殺性T淋巴球細胞株顯示強的抗以對應胜肽脈衝之目標細胞的IFN-γ產生。此外，藉由來自細胞毒殺性T淋巴球細胞株的限制稀釋建立細胞毒殺性T淋巴球複製，且藉由IFN-γ酵素結合免疫吸附分析測定來自抗經胜肽脈衝目標細胞之細胞毒殺性T淋巴球複製的IFN-γ產生。測定強的IFN-γ產生來自以NEIL3-A24-9-545(序列辨識號：24)(a)、NEIL3-A24-10-320(序列辨識號：35)(b)與NEIL3-A24-10-544(序列辨識號：41)刺激之細胞毒殺性T淋巴球複製於第8圖中。

抗外生表現NEIL3與HLA-A^*2402之目標細胞的專一細胞毒殺性T淋巴球活性

測試經提升抗這些胜肽之所建立的細胞毒殺性T淋巴球細胞株與複製其對於辨認外生表現NEIL3與HLA-A^*2402分子之目標細胞的能力。使用由對應之胜肽提升的細胞毒殺性T淋巴球細胞株與複製做為影響細胞來測試抗COS7細胞的專一細胞毒殺性T淋巴球活性，而COS7細胞經全長之NEIL3與HLA-A^*2402分子基因轉染(對於外生表現NEIL3與HLA-A^*2402基因之目標細胞的特定模式)。COS7細胞以全長NEIL3基因或HLA-A^*2402轉染製備為控制組。於第9圖中，以NEIL3-A24-9-545(序列辨識號：24)刺激之細胞毒殺性T淋巴球顯示強的抗表現NEIL3與HLA-A^*2402兩者之COS7細胞的能力。另一方面，沒有偵測到抗控制組之顯著專一之細胞毒殺性T淋巴球活性。因此，這些資料清楚證明NEIL3-A24-9-545(序列辨識號：24)被自然表現於具有HLA-A^*2402分子之目標細胞上，且由細胞毒殺性T淋巴球所辨認。這些結果顯示此來自NEIL3之胜肽為可得以提供具NEIL3表現之腫瘤之病患的癌症疫苗。

抗原胜肽之同源分析

以NEIL3-A24-9-545(序列辨識號：24)、NEIL3-A24-9-362(序列辨識號：33)、NEIL3-A24-10-320(序列辨識號：35)、NEIL3-A24-10-544(序列辨識號：41)與NEIL3-A24-10-87(序列辨識號：43)刺激之細胞毒殺性T淋巴球顯示顯著且專一之細胞毒殺性T淋巴球活性。此結果可能起因於NEIL3-A24-9-545(序列辨識號：24)、NEIL3-A24-9-362(序列辨識號：33)、NEIL3-A24-10-320(序列辨識號：35)、NEIL3-A24-10-544(序列辨識號：41)與NEIL3-A24-10-87(序列辨識號：43)之胜肽序列為與源自已知使人類免疫系統敏感之其他分子的胜肽同源的事實。為了排除此可能性，對於使用為關鍵字向BLAST演算法(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)查詢之這些胜肽序列執行同源性分析，而BLAST演算法顯示沒有序列顯示顯著之同源性。同源性分析之結果指出NEIL3-A24-9-545(序列辨識號：24)、NEIL3-A24-9-362(序列辨識號：33)、NEIL3-A24-10-320(序列辨識號：35)、NEIL3-A24-10-544(序列辨識號：41)與NEIL3-A24-10-87(序列辨識號：43)之序列為獨特的，且因此只有很小可能性分子會對於一些非相關分子提高非傾向之免疫反應。

因此，確認新穎之來自NEIL3之HLA-A^*2402抗原決定位胜肽。此外證明NEIL3之抗原決定位胜肽對癌症免疫治療而言可為適用。

產業利用性

本發明敘述新的腫瘤相關抗原，特別是來自NEIL3的那些，其誘導強且專一的抗腫瘤免疫反應，且對於癌症形式之廣泛系列而言具有應用性。此腫瘤相關抗原提供用途於癌症之診斷與治療。

<110> 腫瘤療法．科學股份有限公司

<120> NEIL3胜肽及其疫苗

<130> ONC-A0905-TW

<150> US 61/210,512

<151> 2009-03-18

<160> 51

<170> PatentIn version 3.5

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<213> 人工

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<223> 人工合成胜肽序列

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<213> 人工

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 8

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 9

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 10

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 11

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 12

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 13

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 14

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 15

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 16

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 17

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 18

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 19

<210> 20

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 20

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 21

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 22

<210> 23

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 23

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 24

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 25

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 26

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 27

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> Artichoke mottled cr inkle virus

<400> 28

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 29

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 30

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 31

<210> 32

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 32

<210> 33

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 33

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 34

<210> 35

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 35

<210> 36

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 36

<210> 37

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 37

<210> 38

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 38

<210> 39

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 39

<210> 40

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 40

<210> 41

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 41

<210> 42

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 42

<210> 43

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成胜肽序列

<400> 43

<210> 44

<211> 2402

<212> DNA

<213> 人類

<220>

<221> CDS

<222> (118)..(1935)

<400> 44

<210> 45

<211> 605

<212> PRT

<213> 人類

<400> 45

<210> 46

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 人工合成引子序列

<400> 46

<210> 47

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 人工合成引子序列

<400> 47

<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 48

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 49

<210> 50

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 50

<210> 51

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 51

Claims

一種經分離的胜肽，擇自由下列(i)與(ii)所組成之群組，其中該胜肽具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力：(i)下列(a)或(b)之一經分離的胜肽：(a)一經分離的胜肽，由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列係擇自由序列辨識號：5、3、4、6、11、15、17、21與22所組成之群組；或(b)一經分離的胜肽，由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列係擇自由序列辨識號：5、3、4、6、11、15、17、21與22所組成之群組，於其中1或2個胺基酸被取代或加入，其中該取代係擇自以下所組成之群組：(1)自序列辨識號：5、3、4、6、11、15、17、21或22之胺基酸序列之N端的第二個胺基酸被擇自由白胺酸與甲硫丁胺酸組成之群組的胺基酸所取代；以及(2)序列辨識號：5、3、4、6、11、15、17、21或22之胺基酸序列的C端胺基酸被擇自由纈胺酸與白胺酸所組成之群組的胺基酸所取代；以及(ii)下列(c)或(d)之一經分離的胜肽：(c)一經分離的胜肽，由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列係擇自由序列辨識號：33、35、41與43所組成之群組；或(d)一經分離的胜肽，由一胺基酸序列所組成，該係擇自由序列辨識號：33、35、41與43所組成之群組，於其中1或2個胺基酸被取代或加入，其中該取代係擇自以下所組成之群組：(1)自序列辨識號：33、35、41或43之胺基酸序列之N端的第二個胺基酸被擇自由苯丙胺酸、酪胺酸、甲硫丁胺酸與色胺酸組成之群組的胺基酸所取代；以及(2)序列辨識號：33、35、41或43之胺基酸序列的C端胺基酸被擇自由苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸與甲硫丁胺酸所組成之群組的胺基酸所取代。
如申請專利範圍第1項所述之經分離的胜肽，係由擇自由序列辨識號：5、3、4、6、11、15、17、21、22、33、35、41與43所組成之群組的胺基酸序列所組成。
一種經分離之多核苷酸，其編碼出申請專利範圍第1至2項之任一項的該胜肽。
一種誘發細胞毒殺性T淋巴球之組合物，其中該組合物包括申請專利範圍第1至2項之任一項的一或多個胜肽，或編碼出該胜肽之一或多個多核苷酸。
一種藥學組合物，用於癌症之治療及/或預防，及/或避免其手術後復發，其中該組合物包括申請專利範圍第1至2項之任一項的一或多個胜肽，或編碼出該胜肽之一或多個多核苷酸。
如申請專利範圍第5項所述之藥學組合物，其被準備來用以投予一個體，其人類白血球組織抗原為人類白血球組織抗原-A24或人類白血球組織抗原-A2。
如申請專利範圍第5項所述之藥學組合物，其被準備來用以治療癌症。
一種活體外誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的方法，其包括一步驟係擇自由下列所組成之群組：(a)活體外將一抗原呈現細胞與申請專利範圍第1至2項之任一項之該胜肽接觸；以及(b)將編碼出申請專利範圍第1至2項之任一項之該胜肽的一多核苷酸引入一抗原呈現細胞。
一種活體外誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法，包括擇自由下列所組成之群組的一步驟：(a)將CD8+T細胞與抗原呈現細胞共培養，抗原呈現細胞表現一人類白血球組織抗原與申請專利範圍第1至2項之任一項之該胜肽的複合物於其表面上；(b)將CD8+T細胞與外吐小體共培養，外吐小體表現一人類白血球組織抗原與申請專利範圍第1至2項之任一項之該胜肽的複合物於其表面上；以及(c)將一包括編碼出一T細胞受體次單元多胜肽之多核苷酸的基因引入一T細胞，該T細胞受體次單元多胜肽與申請專利範圍第1至2項之任一項的該胜肽結合。
一種經分離之抗原呈現細胞，其表現一人類白血球組織抗原與申請專利範圍第1至2項之任一項之該胜肽的複合物於其表面上。
如申請專利範圍第10項所述之抗原呈現細胞，其藉由方法來誘導，其中該方法包括一步驟，其係擇自由下列所組成之群組： (a)活體外將一抗原呈現細胞與申請專利範圍第1至2項之任一項之該胜肽接觸；以及(b)將編碼出申請專利範圍第1至2項之任一項之該胜肽的一多核苷酸引入一抗原呈現細胞。
一種經分離之細胞毒殺性T淋巴球，其以申請專利範圍第1至2項之任一項之該胜肽的任一個為標的。
如申請專利範圍第12項所述之細胞毒殺性T淋巴球，其藉由方法來誘導，其中該方法包括一步驟，其係擇自由下列所組成之群組：(a)將一CD8+T細胞與一抗原呈現細胞共培養，抗原呈現細胞表現一人類白血球組織抗原與申請專利範圍第1至2項之任一項之該胜肽的複合物於其表面上；(b)將一CD8+T細胞與一外吐小體共培養，外吐小體表現一人類白血球組織抗原與申請專利範圍第1至2項之任一項之該胜肽的複合物於其表面上；以及(c)將一包括編碼出一T細胞受體次單元多胜肽之多核苷酸的基因引入一T細胞，該T細胞受體次單元多胜肽與申請專利範圍第1至2項之任一項的該胜肽結合。
一種申請專利範圍第1至2項之任一項的胜肽或編碼出該胜肽之一多核苷酸於製造用於誘導抗癌症之免疫反應之一組合物中的用途。
一種外吐小體，其表現包括申請專利範圍第1至2項之該胜肽的任一個與人類白血球組織抗原的一複合物。
一種抗體，其抗申請專利範圍第1至2項之該胜肽的任一個。
一種載體，包括編碼出申請專利範圍第1至2項之該胜肽的任一個的一核苷酸序列。
一種宿主細胞，其被以申請專利範圍第17項所述之一表現載體所轉形或轉染。