TWI598360B

TWI598360B - Ｆｓｂｍ重組蛋白及其用途

Info

Publication number: TWI598360B
Application number: TW105142098A
Authority: TW
Inventors: 郭志峯; 曹妮娜
Original assignee: 義守大學
Priority date: 2016-12-19
Filing date: 2016-12-19
Publication date: 2017-09-11
Also published as: US10391161B2; TW201823271A; US20180169209A1

Description

FSBM重組蛋白及其用途

本發明係關於一種FSBM重組蛋白，特別關於一種用以製備C群鏈球菌之疫苗的FSBM重組蛋白；本發明另關於該FSBM重組蛋白用以製備C群鏈球菌之疫苗的用途。

鏈球菌(Streptococcus)為一種球形的革蘭氏陽性細菌(Gram-positive bacteria)，屬於厚壁菌門(Firmicutes)的一個屬，此類細菌會沿單一個軸進行細胞分裂，所以通常成對或鏈狀生長，因此被稱為鏈球菌。

在家禽及家畜中的鏈球菌感染，主要由B、C群鏈球菌(group B atreptococcus、group C streptococcus)所造成，例如C群鏈球菌的感染會引起馬腺疫(strangles)以及羊、豬的敗血型鏈球菌感染(septic streptococcus infection)。

一般而言，當動物遭到C群鏈球菌感染時，可以利用青霉素G(penicillin G)、頭孢菌素(cephalosporin)等抗生素來進行治療；然而抗生素的大量使用不僅是導致食用者攝取動物副產品而發生過敏的原因，亦可能會誘發病原菌產生抗藥性，因此仍需要提供一種C群鏈球菌芝疫苗，以降低豬隻感染C群鏈球菌的風險。

為解決上述問題，本發明提供一種FSBM重組蛋白及其用以製備C群鏈球菌之疫苗的用途，以有效提升生物體對C群鏈球菌之抵抗力者。

本發明之一種FSBM重組蛋白，係包含：一第一胜肽片段，具有如SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列；一第二胜肽片段，具有如SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列；一第三胜肽片段，具有如SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列；及一第四胜肽片段，具有如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列；該FSBM重組蛋白較佳可以具有如SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列；如此，該FSBM重組蛋白係可以有效誘發該生物體產生對抗C群鏈球菌之抗體，而可以降低該生物體受到C群鏈球菌感染的風險，亦可以使該生物體縱使遭受C群鏈球菌的感染仍不致發生死亡的現象，為本發明之功效。

基於相同的技術概念，本發明之FSBM重組蛋白的用途，係用以製備C群鏈球菌之疫苗，其中，係將如前述之FSBM重組蛋白作為抗原，以投予一生物體，使該生物體產生對抗C群鏈球菌之抗體；如此，該FSBM重組蛋白係可以有效誘發該生物體產生對抗C群鏈球菌之抗體，而可以降低該生物體受到C群鏈球菌感染的風險，亦可以使該生物體縱使遭受C群鏈球菌的感染仍不致發生死亡的現象，為本發明之功效。

本發明之FSBM重組蛋白的用途，其中，該FSBM重組蛋白係以肌肉注射或皮下注射方式投予該生物體。

本發明之FSBM重組蛋白的用途，其中，該FSBM重組蛋白之投予劑量係每七天一次，每次每公斤之該生物體體重投予每公斤1毫克，並連續投予3次。

第1a圖：本發明之FSBM重組蛋白的SDS-PAGE分析結果。

第1b圖：本發明之FSBM重組蛋白的西方墨點法分析結果。

第1c圖：本發明之FSBM重組蛋白的酶聯免疫吸附試驗分析結果。

第2圖：免疫本發明之FSBM重組蛋白對感染C群鏈球菌之小鼠的存活率之影響。

第3a圖：以SDS-PAGE分離之豬的心臟肌凝蛋白。

第3b圖：以經該FSBM重組蛋白免疫所獲得之小鼠血清進行西方墨點法分析結果。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明之FSBM重組蛋白係包含：一第一胜肽片段、一第二胜肽片段、一第三胜肽片段及一第四胜肽片段，該第一胜肽片段係衍生自Sfb1蛋白之FnBR結構域(FnBR domain)的部分片段，該第二胜肽片段則衍生自SLS蛋白之免疫原結構域(immunogenic domain)的部分片段，該第三胜肽片段係衍生自SPE B蛋白之C3結合結構模組(C3-binding motif)的部分片段，該第四胜肽片段係衍生自M蛋白之C端保守區段(conserved segment)的部分片段。

該FSBM重組蛋白係可以由大腸桿菌所表現，例如能夠構築可以表現該FSBM重組蛋白之一質體，藉由將該質體轉型(transform)至一大腸桿菌菌株，使該大腸桿菌菌株表現該FSBM重組蛋白，另可以經由純化獲得經純化之FSBM重組蛋白。

詳言之，該質體係包含對應該第一胜肽片段之一第一核苷酸片段、對應該第二胜肽片段之一第二核苷酸片段、對應該第三胜肽片段之一第三核苷酸片段、對應該第四胜肽片段之一第四核苷酸片段，且為了提升大腸桿菌之表現效率，該第一核苷酸片段、該第二核苷酸片段、該第三核苷酸片段及該第四核苷酸片段較佳係可以採用大腸桿菌之密碼使用 (codon usage)；於本實施例中，該第一核苷酸片段係具有如SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列、該第二核苷酸片段則具有如SEQ ID NO：2所示之核苷酸序列、該第三核苷酸片段係具有如SEQ ID NO：3所示之核苷酸序列、該第四核苷酸片段則具有如SEQ ID NO：4所示之核苷酸序列，且藉由大腸桿菌之表現產生之第一胜肽片段、第二胜肽片段、第三胜肽片段及第四胜肽片段分別具有如SEQ ID NO：5、6、7及8所示之胺基酸序列。

又，該第一核苷酸片段及該第二核苷酸片段之間、該第二核苷酸片段及該第三核苷酸片段之間，以及該第三核苷酸片段及該第四核苷酸片段之間更可以分別利用一連接片段(linker fragment)所連接，該連接片段之序列設計為本發明所屬技術領域之通常知識，於此不再贅述。於本實施例中，該質體係包含如SEQ ID NO：9所示之核苷酸序列，且以大腸桿菌所表現出之FSBM重組蛋白則為由如SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列所組成。

該質體之構築為本發明所屬技術領域之通常知識，於此僅揭露本實施例之構築流程，並不以此為限。本實施例中，係人工合成由如SEQ ID NO：9所示之核苷酸序列之核苷酸片段，將該核苷酸片段以限制酶(restriction enzyme)辨識切割後，續以接合酶(ligase)接合於pET-24a載體，以完成該質體之構築。

本實施例中，該質體係轉型進入大腸桿菌菌株BL21(DE)pLysS後，係可以藉由IPTG之誘導，使該大腸桿菌菌株BL21(DE)pLysS表現出帶有6x His標記之融合蛋白，並藉由鎳離子管柱(Ni²⁺ chelating chromatography)進行純化，即可以獲得純化之FSBM重組蛋白。

前述經純化之FSBM重組蛋白可以作為抗原並投予一生物體，以誘發該生物體產生對抗C群鏈球菌之抗體，提升該生物體對C群鏈球菌之抵抗能力，舉例而言，該FSBM重組蛋白之投予劑量係每七天一次，每次每公斤之該生物體體重投予每公斤1毫克(1mg/kg)，並以肌肉注射或皮下注射方式連續投予3次。

此外，前述經純化之FSBM重組蛋白亦可以混合一醫藥學上可接受之佐劑，以共同形成一C群鏈球菌之疫苗，藉由該醫藥學上可接受之佐劑提升該FSBM重組蛋白於該生物體體內之穩定度，或提升該FSBM重組蛋白之力價，使該FSBM重組蛋白具有較佳促進該生物體產生抗體之能力。該醫藥學上可接受之佐劑可以為油質佐劑(oil-based adjuvant)或水包油形式之佐劑(oil-in-water adjuvant)；舉例而言，該油質佐劑可以為佛氏完全佐劑(Complete Freund's adjuvant，簡稱CFA)或佛氏不完全佐劑(Incomplete Freund's adjuvant，簡稱IFA)；該水包油形式之佐劑可以為AddaVax^TM。

為證實本發明用以對抗C群鏈球菌之FSBM重組蛋白確實可以作為抗原，使生物體產生足以對抗C群鏈球菌之抗體，而不會因為C群鏈球菌的感染而死亡，遂進行以下試驗：

(A)FSBM重組蛋白之確認

本試驗係將如上述之質體轉型進入大腸桿菌菌株BL21(DE)pLysS後，以0.5mM之IPTG誘導該FSBM重組蛋白之表現，續以鎳離子管柱進行純化後，進行SDS-PAGE分析，其結果如第1a圖所示，該FSBM重組蛋白(第A1組)之分子量約為18kDa。

續利用抗SPE B之血清(mouse anti-SPE B serum)進行西方墨點法，其結果如第1b圖所示，該FSBM重組蛋白確實可以由抗SPE B之血清所辨識(第A1組)；另利用抗SPE B之血清(mouse anti-SPE B serum)進行酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，其結果如第1c圖所示，該FSBM重組蛋白仍可以由抗SPE B之血清所辨識(第A1組)，且無法由控制組血清(取自僅注射佐劑之小鼠的血清)所辨識(第A0組)。

(B)小鼠死亡率的降低

本試驗係將該FSBM重組蛋白(25μg)混合等體積之醫藥學上可接受之佐劑後，以腹腔注射的方式免疫BALB/c小鼠(每7天免疫一次，共免疫3次)，並於試驗開始後第21天(即第3次免疫當天)以腹腔注射的方式使該BALB/c小鼠感染C群鏈球菌(9×10⁸CFU，ATCC 43078)，持續觀察感染C群鏈球菌之BALB/c小鼠的存活率；其結果如第2圖所示，未免疫FSBM重組蛋白之BALB/c小鼠(第B0組)於第2天已全數死亡，免疫FSBM重組蛋白之BALB/c小鼠(第B1組)直到第14天的存活率仍達100%，顯示本發明FSBM重組蛋白可以有效誘發足以對抗C群鏈球菌之抗體的產生，使生物體不會因為C群鏈球菌的感染而死亡。

(C)誘發自體免疫反應的可能性

本試驗係收集經該FSBM重組蛋白免疫所獲得之小鼠血清，並將該小鼠血清與以SDS-PAGE分離之豬的心臟肌凝蛋白(第C1組)進行反應，其結果如第3a、3b圖所示，該小鼠血清雖可以辨識第C2組之FSBM蛋白，卻無法與第C1組之豬的心臟肌凝蛋白發生反應，顯示本發明FSBM重組蛋白投予該生物體以使該生物體產生對抗C群鏈球菌之抗體時，並不會與心臟肌凝蛋白發生反應，進而誘發心臟組織的自體免疫反應或導致風濕性心臟病(rheumatic heart disease)的發生。

綜合上述，本發明之FSBM重組蛋白及其用以製備C群鏈球菌之疫苗的用途，可以有效誘發該生物體產生對抗C群鏈球菌之抗體，而可以降低該生物體受到C群鏈球菌感染的風險，亦可以使該生物體縱使遭受C群鏈球菌的感染仍不致發生死亡的現象，為本發明之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

<110> 義守大學

<120> FSBM重組蛋白及其用途

<130> PK14699

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一核苷酸片段之核苷酸序列，其所表現之胜肽係對應Sfb1蛋白之FnBR結構域之部分胺基酸序列

<400> 1

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第二核苷酸片段之核苷酸序列，其所表現之胜肽係對應SLS蛋白之免疫原結構域之部分胺基酸序列

<400> 2

<210> 3

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第三核苷酸片段之核苷酸序列，其所表現之胜肽係對應SPE B蛋白之C3結合結構模組之部分胺基酸序列

<400> 3

<210> 4

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第四核苷酸片段之核苷酸序列，其所表現之胜肽係對應M蛋白之C端保守區段之部分胺基酸序列

<400> 4

<210> 5

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一胜肽片段之胺基酸序列，對應sfb1蛋白之FnBR結構之部分胺基酸序列

<400> 5

<210> 6

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第二胜肽片段之胺基酸序列，對應SLS蛋白之免疫原結構域之部分胺基酸序列

<400> 6

<210> 7

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第三胜肽片段之胺基酸序列，對應SPE B蛋白之C3結合結構模組之部分胺基酸序列

<400> 7

<210> 8

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第四胜肽片段之胺基酸序列，對應M蛋白之C端保守區段之部分胺基酸序列

<400> 8

<210> 9

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用以表現本發明FSBM重組蛋白之核苷酸序列

<400> 9

<210> 10

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 本發明FSBM重組蛋白之胺基酸序列

<400> 10

Claims

一種FSBM重組蛋白，係包含：一第一胜肽片段，具有如SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列；一第二胜肽片段，具有如SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列；一第三胜肽片段，具有如SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列；及一第四胜肽片段，具有如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項所述之FSBM重組蛋白，其中，該FSBM重組蛋白具有如SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列。
一種FSBM重組蛋白的用途，係用以製備C群鏈球菌之疫苗，其中，係將如申請專利範圍第1或2項所述之FSBM重組蛋白作為抗原，以投予一生物體，使該生物體產生對抗C群鏈球菌之抗體。
如申請專利範圍第3項所述之FSBM重組蛋白的用途，其中，該FSBM重組蛋白係以肌肉注射或皮下注射方式投予該生物體。
如申請專利範圍第4項所述之FSBM重組蛋白的用途，其中，該FSBM重組蛋白之投予劑量係每七天一次，每次每公斤之該生物體體重投予1毫克。