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TWI586957B - 多通道螢光檢測系統及其方法 - Google Patents

多通道螢光檢測系統及其方法 Download PDF

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TWI586957B
TWI586957B TW105120034A TW105120034A TWI586957B TW I586957 B TWI586957 B TW I586957B TW 105120034 A TW105120034 A TW 105120034A TW 105120034 A TW105120034 A TW 105120034A TW I586957 B TWI586957 B TW I586957B
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高弘任
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Description

多通道螢光檢測系統及其方法
本發明係關於一種多通道螢光檢測系統及其方法，特別是用於生化領域，用於檢測對特定波長帶反應的檢體。
在生化領域上，運用螢光檢測技術來進行樣品的檢測是常見的。由於螢光檢測方法無需與檢測樣品接觸，可避免操作人員曝露在高傳染性的環境下，對檢測樣品進行非破壞性的定量或定性的量測，使得該技術被廣泛地使用。
螢光檢測是利用分析物(analyte)的某些成分會與特定的螢光染劑產生鍵結，而該螢光染劑會對光譜中特定波長有光激發光(Photoluminescence)的特性，故分析樣品照射固定強度的入射光下，量測樣品的發射光譜，可進行樣品種類或濃度的分析。常見的螢光染劑有藍光波段的FAM，綠光波段的HEX、黃光波段的TAMRA、橘光波段的ROX、紅光段波的CY5、深紅光波段的Red670。
聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)技術，是一種分子生物學技術，搭配合適的藥劑與熱循環設備，可用於擴增特定的DNA片段，而在每次熱循環後，以一螢 光檢測系統對反應物進行檢測時，可定性辨別或定量析分反應物中特定產物總量的方法，即為即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time polymerase chain reaction，Real-time PCR、QPCR)。
在生化領域中，多通道螢光檢測通常採用即時/定量聚合酶連鎖反應(Real time polymerase chain reaction,real-time PCR or QPCR)法，由於檢測樣品與試劑的多樣性，這些儀器的光源通常包含概一種或多種以上的紫外光、可見光或紅外光波段。
參考第1圖，繪示現有技術的螢光檢測系統10的示意圖。該螢光檢測系統10包括一光源11、一激發光通道12、一已被螢光標記的分析物13、一發射光通道14、一發射光濾光片15、一檢測器16。操作流程如下：該光源11發出一激發光17(excitation light)；接著，該激發光17進入該激發光通道12；接著，該激發光17照射該已被螢光標記的分析物13以產生一發射光18(emission light)；然後，該發射光18進入該發射光通道14；該發射光18通過該發射光濾光片15進入該檢測器16；最後，該檢測器16判斷該發射光18的種類。一般而言，在本領域中，該激發光17是指用於照射該已被螢光標記的分析物13的光線；該發射光18是指從該已被螢光標記的分析物13反射的光線。一般而言，該激發光通道12以及該發射光通道14是兩個獨立的通道，其會增加該螢光檢測系統10的組裝難度。
為了加速以及簡化螢光檢測流程，該光源11能夠提供多種波長帶，該發射光濾光片15是一多波長帶通濾光片(multiband emission filter)。
一般而言，現有技術的螢光檢測系統為了快速地進行檢測，該光源11會採用白光，因為該已被螢光標記的分析物13可能會對多種波長帶產生光致發光。當該激發光17照射該已被螢光標記的分析物13進而產生該發射光時，該發射光就會產生相對應該多種波長帶的該發射光18。換句話說，該發射光18會包括多種波長帶的光線；接著，再通過該發射光濾光片15過濾後以產生多組不同波長帶的光線。因此，當該已被螢光標記的分析物13對多組不同波長帶的光線均有反應時，可以同時偵測，進而減少花費的時間。
雖然現有技術可以通過同時檢測多個波長帶，但是存在幾個問題：1.當光線是白光時，會產生多餘的發射光；2.因為該通過該發射光濾光片15時，該發射光可能會被過濾不需被過濾的波長，進而影響後續檢測的準確率；3.該發射光濾光片15的是採用多層濾片以特殊方式製作於同一片玻璃上，其製作工藝以及生產成本較高；4.雖然採用白光可以同時產生多種波長帶的發射光，然而，也可能會造成該發射光18產生不必要的波長的光，造成誤判。
參考第2圖，繪示另一現有技術的螢光檢測系統20的示意圖。該螢光檢測系統20與該螢光檢測系統10的差異在 於：在該激發光17照射到該已被螢光標記的分析物13之前增加一激發光濾光片19。更明確地說，該另一現有技術係將該激發光濾光片19設置在該光源11以及該激發光通道12之間。
雖然該螢光檢測系統20通過設置該激發光濾光片19改善該螢光檢測系統10的效能；然而，因為該通過該發射光濾光片15時，該發射光可能會被過濾不需被過濾的波長，進而影響後續檢測的準確率，然其卻仍舊無法解決其他技術問題。
再者，在另一現有技術中，一螢光檢測系統20會採用多個感測器，以便快速的執行檢測作業，然而多個感測器同樣會造成系統的成本以及組裝難度上升。
綜上所述，現有技術為了能夠增加檢測效率皆採用能夠產生多波長帶的光源(即白光)，但是卻降低對單一波長帶偵測的準確性。
如Thermo Fisher QuantStudio 12K Flex及Roche LightCycler 480等產品，皆使用在可見光波段的白光LED做為螢光檢測系統的燈源，此種白光LED的發光波長可含蓋可見光波波段、發光亮度足夠、價格便宜、重量輕、尺寸小、低電能消耗、耐震動，已成為可見光波段的主流光源。
白光發光二極體的白光產生的機制是將一電壓施加於會發出藍光的氮化鎵(GaN)PN二極體晶片，並在藍光晶片前方配置可被該藍光激發的螢光物質，使螢光物質受激後產生相對應的螢光，如綠、黃、紅，以達到白光的產生。該白光發 光二極體的光譜分佈主取決藍光LED晶片的發光波長，及各螢光物質產生的各色螢光所疊加，當白光LED一通電啟動時，會得到固定光譜分佈的可見光，即光譜中各波長的光強度已經固定，無法控制各波長、顏色的亮度。因此，在real time PCR運用上，若要加強某一顏色的激發光光強度，僅能對藍光LED晶片施與更高的電壓，使整體白光LED發光波段同時變亮，再讓光源通過filter才可得到更高亮度的單色光。使得此種白光LED光源的整體能量運用效率低，易造成不必要的光能與電能的浪費，且LED晶片通以更大電流時，會產生較多的熱，使電轉光能的效率降底，也加速光源老化。另外，白光LED在深紅光波段一直沒有合適的螢光物質搭配，一直以來成為白光LED在紅光波段應用上的困擾。
為補足單一白光LED的缺點，一些real time PCR檢測儀製造商，如德國Bimetra的TOptical Thermocycler，其螢光檢測區的光源，除使用白光LED外，也在光路上增加了各一顆紅、藍LED，以補足光源發光波段不足的問題，卻也使得光學光路設計變得複雜，增加儀器的不穩定性。
在另一現有技術的螢光檢測系統，其採用四個感測器，產生的四通道real time PCR檢測儀，可在一次掃掃描的行程中進行四個螢光通道的掃描，可減少檢測時間。然而同步檢測的設計，不僅增加了光學感測器與光路的成本，也使得整體感測區的體積變得龐大且複雜。
如同前述，現有技術中已經存在通過複數LED去合成白光，然而，因為現有技術的螢光檢測系統為了要同時檢測所有的螢光標記，所以該複數LED都是需要同時開啟的，否則便無法達到同步偵測的目的。
考量大部分的檢測均是針對特定物，因此如何有效地增加對特定波長帶偵測的準確性、有效的增加特定波長帶的光通量(在不需要增加全波長的光通量的前提下)、簡化螢光檢測系統的結構以及降低製作成本，是亟需解決的技術問題。
故，有必要提出一種多通道螢光檢測系統及其方法以解決上述技術問題。
為解決上述習知技術的問題，本發明的目的在於提供一種多通道螢光檢測系統，用於檢測複數已被螢光標記的分析物。本發明通過使用多個能夠產生彼此不重疊波長帶的光的光源，增加檢測特定分析物的準確率、有效的增加特定波長帶的光通量(在不需要增加全波長的光通量的前提下)、簡化螢光檢測系統的結構以及降低製作成本，進而解決了現有技術的技術問題(如上述)。
為達上述目的，本發明提供一種多通道螢光檢測系統，用於檢測複數已被螢光標記的分析物。該多通道螢光檢測系統包括一光源、一濾光片裝置、一雙股型光導管及一檢測器。
該光源包括複數子光源個別用於提供一激發光。該濾光片裝置包括至少一濾光片組。每一該至少一濾光片組包括一激發光濾光片以及一發射光濾光片。該激發光濾光片用於接收該激發光。該雙股型光導管包括一發射光導管以及一激發光導管。該激發光導管用於接收通過該激發光濾光片的該激發光。該發射光導管用於接收經過該激發光照射該複數已被螢光標記的分析物，進而產生相對應該激發光的發射光。該檢測器用於接收通過該發射光導管和該發射光濾光片傳送的該發射光，以確認該發射光的種類。
在一較佳實施例中，該發射光導管以及該激發光導管以同心圓方式配置。
在一較佳實施例中，該雙股型光導管還包括一掃瞄頭，用於讓該激發光照射該複數已被螢光標記的分析物以及接收該發射光。
在一較佳實施例中，該多通道螢光檢測系統還包括一控制器，用於控制該光源、該濾光片裝置、該雙股型光導管以及該檢測器的相對作動。
在一較佳實施例中，該濾光片裝置還包括一控制裝置用於配合該激發光以及該發射光轉動該至少一濾光片組。
在一較佳實施例中，該複數子光源為可選擇性地開啟的複數單色LED。
在一較佳實施例中，該光源產生複數光具有不重 疊的全寬半高(full width at half maximum,FWHM)波長。
為達上述目的，本發明提供一種多通道螢光檢測方法，用於檢測複數已被螢光標記的分析物。該多通道螢光檢測方法包括：首先，一光源的複數子光源提供一激發光；接著，該激發光通過一濾光片裝置的至少一濾光片組的一激發光濾光片進入一雙股型光導管的一激發光導管；接著，該激發光從該雙股型光導管的一掃瞄頭照射該複數已被螢光標記的分析物，進而產生一發射光；接著，該發射光從該掃瞄頭進入該雙股型光導管的一發射光導管；接著，該發射光從該發射光導管進入該濾光片裝置的該至少一濾光片組的一發射光濾光片；最後，該發射光進入一檢測器，以確認該發射光的種類。
在一較佳實施例中，該方法還包括：接著，一控制器根據該複數已被螢光標記的分析物的種類控制該光源、該濾光片裝置、該雙股型光導管以及該檢測器的相對作動。
在一較佳實施例中，該雙股型光導管還包括一掃瞄頭，用於讓該激發光照射該複數已被螢光標記的分析物以及接收該發射光。
在一較佳實施例中，該光源為可以單獨/同時開啟的複數單色LED光源。
在一較佳實施例中，該濾光片裝置還包括一控制裝置用於配合該激發光以及該發射光轉動該至少一濾光片組。
在一較佳實施例中，該複數子光源為可選擇性地開 啟的複數單色LED。
在一較佳實施例中，該光源產生複數不重疊的全高半寬。
相較習知技術，通過使用多個能夠產生具彼此不重疊的全寬半高(FWHM)波長的光的光源，增加檢測特定分析物的準確率、有效的增加特定波長帶的光通量(在不需要增加全波長的光通量的前提下)、簡化螢光檢測系統的結構以及降低製作成本，進而解決了現有技術的技術問題。
10、20、100‧‧‧螢光檢測系統
11、120‧‧‧光源
12、141‧‧‧激發光通道
13、110‧‧‧分析物
14、142‧‧‧發射光通道
15、1312‧‧‧發射光濾光片
16、150‧‧‧檢測器
17、161‧‧‧激發光
18、162‧‧‧發射光
19、1311‧‧‧激發光濾光片
130‧‧‧濾光片裝置
131‧‧‧濾光片組
132‧‧‧控制裝置
140‧‧‧雙股型光導管
143‧‧‧掃描頭
170‧‧‧控制器
AA’‧‧‧線段
S01-S07‧‧‧步驟
第1圖繪示現有技術的螢光檢測系統的示意圖；第2圖繪示另一現有技術的螢光檢測系統的示意圖；第3圖繪示本發明的螢光檢測系統的示意圖；第4圖繪示第3圖中的沿線段AA’的剖視圖；第5圖繪示第3圖中的光源120的細部圖；第6圖繪示本發明的螢光檢測方法的流程圖；以及第7圖繪示本發明的螢光檢測方法的第二較佳實施例的流程圖。
以下各實施例的說明是參考圖式，用以說明本發明可用以實施的特定實施例。本發明所提到的方向用語，例如「上」、「下」、「前」、「後」、「左」、「右」、「內」、「外」、「側面」 等，僅是參考圖式的方向。因此，使用的方向用語是用以說明及理解本發明，而非用以限制本發明。
參考第3圖以及第4圖。第3圖繪示本發明的螢光檢測系統100的示意圖。第4圖繪示第3圖中的沿線段AA’的剖視圖。該多通道螢光檢測系統100用於檢測複數已被螢光標記的分析物110。該多通道螢光檢測系統100包括一光源120、一濾光片裝置130、一雙股型光導管140、一檢測器150及一控制器170。請注意，該控制器170是以虛線的方式連接該光源120、該濾光片裝置130、該雙股型光導管140以及該檢測器150，表示該多通道螢光檢測系統100亦可根據不同的要求採用手動控制該光源120、該濾光片裝置130、該雙股型光導管140以及該檢測器150當中的一或多個。本較佳實施例中僅以一個已被螢光標記的分析物110為例，在實際自動化操作中，該多通道螢光檢測系統100可以用於檢測複數個已被螢光標記的分析物110。
該光源120包括複數子光源個別用於提供一激發光161。該濾光片裝置130包括至少一濾光片組131。每一該至少一濾光片組131包括一激發光濾光片1311、一發射光濾光片1312以及一控制裝置132。該控制裝置132用於配合該激發光161以及該發射光162轉動該至少一濾光片組131。請注意，該控制裝置132是以虛線表示，表示該多通道螢光檢測系統100亦可根據不同的要求採用手動轉動該至少一濾光片組131。
該激發光濾光片1311用於接收該激發光161。該雙 股型光導管140包括一發射光導管142、一激發光導管141以及一掃瞄頭143。該激發光導管141用於接收通過該激發光濾光片1311的該激發光161。該發射光導管142用於接收經過該激發光161照射該複數已被螢光標記的分析物110，進而產生相對應該激發光161的發射光162。該檢測器150用於接收通過該發射光導管142傳送的該發射光162，以確認該發射光162的種類。較佳地，如同第4圖所示，該發射光導管141以及該激發光導管142以同心圓方式配置。然而，亦可以根據不同要求做不同形狀的設計，並不以此為限。
該控制器170用於控制該光源120、該濾光片裝置130、該雙股型光導管140以及該檢測器150的相對作動。舉例而言，當需要檢測該已被螢光標記的分析物110對一特定波長的光(比如一全寬半高波長：430nm-500nm)是否有反應時，該控制器170可以控制該光源120僅發出全寬半高波長介於450nm-470nm的該激發光161；該控制器170可以控制該控制裝置132轉動至適當的該濾光片組131，該濾光片組131的該激發光濾光片1311僅讓波長介於450nm-460nm的光通過(窄化該激發光161的波長帶，避免產生不必要的發射光)，該濾光片組131的該發射光濾光片1312僅讓波長介於490nm-520nm的該發射光162通過(通過該發射光濾光片1312的波長是根據需求改變)，該控制器170可以控制該雙股型光導管140逐一掃瞄偵測每一該已被螢光標記的分析物110。詳細地，本發明中的該激發光濾光 片1311以及該發射光濾光片1312分別地只能讓一個波長帶的光線通過，以求降低製作成本以及提高準確率。
第5圖繪示第3圖中的光源120的細部圖。該光源120包括六個子光源121。該六個子光源121是能夠可選擇性地開啟的複數單色LED。舉例而言，第一子光源121的全寬半高波長為450nm至470nm；第二子光源121的全寬半高波長為512nm至538nm；第三子光源121的全寬半高波長為547nm至576nm；第四子光源121的全寬半高波長為579nm至591nm；第五子光源121的全寬半高波長為615nm至628nm；第六子光源121的全寬半高波長為657nm至672nm。也可以根據不同的需求增加其他不同全寬半高波長的子光源，惟該複數子光源121產生的全寬半高波長是不重疊的。因為不重疊的全寬半高波長表示能夠更加準確地針對會對特定波長產生反應的該已被螢光標記的分析物110進行檢測。
因為該複數子光源121可以選擇性地開啟，換句話說，針對不同的該已被螢光標記的分析物110，可以只開啟第一至第二子光源或者第三至第五子光源，端看不同的使用需求。
第6圖繪示本發明的螢光檢測方法的第一較佳實施例的流程圖。關於本流程圖中使用的元件編號，請參考第3-5圖。首先執行步驟S01，一光源120的複數子光源121提供一激發光161；接著執行步驟S02，該激發光161通過一濾光片裝置130的至少一濾光片組131的一激發光濾光片1311進入一雙股型 光導管140的一激發光導管141；接著執行步驟S03，該激發光161從該雙股型光導管140的一掃瞄頭143照射該複數已被螢光標記的分析物110，進而產生一發射光162；接著執行步驟S04，該發射光162從該掃瞄頭143進入該雙股型光導管140的一發射光導管142；接著執行步驟S05，該發射光162從該發射光導管142進入該濾光片裝置130的該至少一濾光片組131的一發射光濾光片1312；最後執行步驟S06，該發射光162進入一檢測器150，以確認該發射光162的種類。
第7圖繪示本發明的螢光檢測方法的第二較佳實施例的流程圖。本較佳實施例與第一較佳實施例的差異在於：在步驟S01之前預先執行步驟S07，一控制器170根據該複數已被螢光標記的分析物110的種類控制該光源120、該濾光片裝置130、該雙股型光導管140以及該檢測器150的相對作動。
以上僅是本發明的較佳實施方式，應當指出，對於熟悉本技術領域的技術人員，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。
100‧‧‧螢光檢測系統
110‧‧‧分析物
120‧‧‧光源
130‧‧‧濾光片裝置
131‧‧‧濾光片組
132‧‧‧控制裝置
140‧‧‧雙股型光導管
141‧‧‧激發光通道
142‧‧‧發射光通道
143‧‧‧掃描頭
150‧‧‧檢測器
161‧‧‧激發光
162‧‧‧發射光
170‧‧‧控制器
1311‧‧‧激發光濾光片
1312‧‧‧發射光濾光片
AA’‧‧‧線段

Claims (11)

  1. 一種多通道螢光檢測系統，用於檢測複數已被螢光標記的分析物，該多通道螢光檢測系統包括：一光源，包括複數子光源個別用於提供一激發光；一濾光片裝置，包括至少一濾光片組，每一該至少一濾光片組包括一激發光濾光片以及一發射光濾光片，該激發光濾光片用於接收該激發光；一雙股型光導管，包括一發射光導管以及一激發光導管，該激發光導管用於接收通過該激發光濾光片的該激發光，該發射光導管用於接收經過該激發光照射該複數已被螢光標記的分析物，進而產生相對應該激發光的發射光；一檢測器，用於接收通過該發射光導管和該發射光濾光片傳送的該發射光，以確認該發射光的種類；其中該濾光片裝置還包括一控制裝置用於配合該激發光以及該發射光轉動該至少一濾光片組。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的多通道螢光檢測系統，其中該發射光導管以及該激發光導管以同心圓方式配置。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的多通道螢光檢測系統，其中該雙股型光導管還包括一掃瞄頭，用於讓該激發光照射該複數已被螢光標記的分析物以及接收該發射光。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的多通道螢光檢測系統，還包括一控制器，用於控制該光源提供該激發光、控制該濾光片裝置轉動至該至少一濾光片組、及控制該雙股型光導管逐一掃瞄該複數已被螢光標記的分析物。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的多通道螢光檢測系統，其中該複數子光源 為可選擇性地開啟的複數單色LED。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的多通道螢光檢測系統，其中該光源產生複數光具有不重疊的全寬半高(full width at half maximum,FWHM)波長。
  7. 一種多通道螢光檢測方法，用於檢測複數已被螢光標記的分析物，包括：一光源的複數子光源提供一激發光；該激發光通過一濾光片裝置的至少一濾光片組的一激發光濾光片進入一雙股型光導管的一激發光導管；該激發光從該雙股型光導管的一掃瞄頭照射該複數已被螢光標記的分析物，進而產生一發射光；該發射光從該掃瞄頭進入該雙股型光導管的一發射光導管；該發射光從該發射光導管進入該濾光片裝置的該至少一濾光片組的一發射光濾光片；該發射光進入一檢測器，以確認該發射光的種類；其中該濾光片裝置還包括一控制裝置用於配合該激發光以及該發射光轉動該至少一濾光片組。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的多通道螢光檢測方法，該方法還包括：一控制器根據該複數已被螢光標記的分析物的種類控制該光源提供該激發光、控制該濾光片裝置轉動至該至少一濾光片組、該雙股型光導管逐一掃瞄該複數已被螢光標記的分析物。
  9. 如申請專利範圍第7項所述的多通道螢光檢測方法，其中該雙股型光導管還包括一掃瞄頭，用於讓該激發光照射該複數已被螢光標記的分析物以及接收該發射光。
  10. 如申請專利範圍第7項所述的多通道螢光檢測方法，其中該複數子光源 為可選擇性地開啟的複數單色LED。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的多通道螢光檢測方法，其中該光源產生複數光具有不重疊的全寬半高波長。
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