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TWI578997B - 用於預防或治療菸鹼成癮之共軛體 - Google Patents

用於預防或治療菸鹼成癮之共軛體 Download PDF

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TWI578997B
TWI578997B TW103125297A TW103125297A TWI578997B TW I578997 B TWI578997 B TW I578997B TW 103125297 A TW103125297 A TW 103125297A TW 103125297 A TW103125297 A TW 103125297A TW I578997 B TWI578997 B TW I578997B
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尼可拉斯 安納斯達蘇
凱薩伯 巴塔加亞
加里 芬尼曼
帕拉格 寇何
保羅 梅何力克
艾琳 帕森斯
珍妮佛 松恩
艾倫 布朗
大衛 卓華斯
林恩 瓊斯
詹姆士 莫森
大衛 普瑞德
大衛 史戴德
海德 戴維斯
麥克 麥克魯斯基
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輝瑞疫苗有限責任公司
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Description

用於預防或治療菸鹼成癮之共軛體
本發明係關於菸鹼衍生之半抗原、半抗原間隔基共軛體和半抗原載體共軛體，其作為抗菸鹼疫苗中的抗原成分。本發明也關於用調配佐劑的含有該菸鹼衍生之半抗原載體共軛體抗原之疫苗組成物。該等組成物係用以提高戒菸和煙草/菸鹼依賴性治療努力之戒菸率或減少復發率。
吸菸對健康有許多嚴重的不良作用且由於許多減少或防止吸菸之政府創制，吸菸已經變得越來越不為社會所接受。因此，每年有許多吸菸者希望戒菸，並同時作出嘗試，只有少數完成戒菸者不復發。非常高的失敗率是菸鹼成癮性加上香煙容易取得的結果。
隨著吸菸，或使用其他形式之菸鹼(例如，竇道、貼片、口香糖)，菸鹼進入血流中且之後迅速進入腦中，其在腦中刺激菸鹼乙醯膽鹼受體，造成多巴胺之釋出，其轉而活化獎賞中心。隨著戒菸嘗試，有獎賞(reward)反應的損失，以及包括認知功能下降之戒斷症狀。復發的主要原 因是：獎賞的損失和令人不快的戒斷症狀可因吸菸而立即解除。
有各種用於戒菸的非疫苗療法。菸鹼替代療法，諸如含有菸鹼之口香糖或皮膚貼片，可以幫助戒除吸菸者隔斷香煙，但他們不打斷菸鹼原因之成癮週期。另一種方法是使用對準菸鹼乙醯膽鹼受體的藥物，諸如伐崙克林(varenicline)。此類藥物，降低由吸煙通常遇到的獎賞，已比較成功地幫助戒菸，然而藥物治療結束之後復發率都很高，因為失效(例如，吸單次菸)可以很容易地轉成完全復發與再活化獎賞中心。
最近的菸鹼戒菸戰略重點放在刺激免疫系統產生結合血液中的菸鹼之抗菸鹼抗體，從而減少菸鹼可以進入腦的量和比率的疫苗。此轉而防止中心被活化和幫助打斷成癮週期。因為由疫苗誘發的抗體可長期存活，所以抗菸鹼疫苗對於協助戒菸以及預防復發是有用的。此外，因為抗體作用於周邊，所以沒有中樞神經系統(CNS)副作用的風險。該等疫苗的例子係描述於WO 00/32239、WO 02/49667、WO 03/82329和US 2006/111271中。菸鹼衍生物係描述於EP-A-421762、WO 01/70730、WO 01/80844和US 2005/119480中。此外菸鹼衍生物已確認為註冊號136400-02-7、250683-10-4、861023-80-5和861025-04-9。菸鹼半抗原係描述於WO 99/61054、WO 02/58635、WO 03/82329、WO 2005/40338和EP-A-1849780中。
概述
本發明係關於菸鹼衍生之半抗原、半抗原間隔基共軛體、和可用以製備免疫性半抗原載體共軛體之共軛方法，該免疫性半抗原載體共軛體用於為了提高戒菸治療努力的戒菸率或降低復發率而設計的疫苗。本發明也關於含有上述共軛體與佐劑或賦形劑一起之疫苗調配物，其用以免疫接種吸菸者以便引起對抗半抗原之抗體，其轉而也將識別和特異性結合於菸鹼。本發明進一步係關於一種在戒菸治療努力中提高戒菸率或減少復發率之方法，其包含將半抗原載體共軛體投予至希望戒菸之吸菸者。在其他實施體系中疫苗可用於非吸菸者，以防止他們對菸鹼上癮，如果他們隨後因吸菸或其他手段而暴露於菸中。
本發明菸鹼衍生之半抗原載體共軛體具有優點為：它們比該技藝中已知的菸鹼衍生之半抗原載體共軛體更具有免疫性、更具特異性、更穩定、或具有其他更有用的性質。
本發明菸鹼衍生之半抗原載體共軛體使用於抗菸鹼疫苗中可比其他已知菸鹼衍生之半抗原載體共軛體為更具免疫性的抗原。同樣，包含本發明菸鹼-衍生之半抗原載體共軛體作為抗原與佐劑一起之疫苗調配物可比其他其通常添加佐劑氫氧化鋁之抗菸鹼疫苗調配物更具免疫性，且導致依賴於菸鹼/煙草和希望戒菸之病人較高戒菸率和較低復發率。由於較佳抗原內的固有免疫性，以及藉由佐劑之 增強，本發明之疫苗調配物也可更快速和用更少的劑量達成較高抗菸鹼抗體力價，相較於該技藝中已知的疫苗調配物，產生改良之順應性。
本發明菸鹼衍生之半抗原化合物的合成路徑可具有點為：它們提供增加的總合成產率(較佳增加總合成產率多達20倍)，包括合成步驟數的減少、導致所產生的菸鹼衍生之半抗原的純度增加(例如>99%純度)或具有其他比該技藝中已知的合成路徑更有用的性質。
序列表
SEQ ID號：1為免疫刺激寡核苷酸的核苷酸序列ODN CpG 24555。
詳細說明
在一觀點中，本發明係有關式一種(I)之半抗原： 其中W為-CH2-或-O-；且X為-NH2或-SH。
在一實施體系中，W係於吡啶環之位置2、5或6。
在另一實施體系中，W係於吡啶環之位置5。
在另一實施體系中，W為-O-。
在另一實施體系中，W為-O-；且W係於吡啶環之位置5。
在一另外實施體系中，該半抗原為
在另一實施體系中，該半抗原為
在一另外實施體系中，該半抗原為
在第二觀點中，本發明係有關一種式(II)之半抗原間隔基共軛體： 其中W為-CH2-或-O-；-(間隔基)-為C1-C8伸烷基、C3-C10伸環烷基或被1至4個氧原子插入及隨意被-N(H)C(O)-插入之C1-C12伸烷基；且X為-NH2或-SH。
如使用在本文中，‘伸烷基’是指-(CH2)n-基，其中n為所需要的碳原子。如使用在本文中，‘被1至4個氧原子插入之伸烷基’為(例如)-CH2CH2OCH2-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2-或-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-。如使用在本文中，‘被1至4個氧原子插入及被-N(H)C(O)-插入之伸烷基’為(例如)-CH2CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CH2NHCOCH2CH2-。
在一實施體系中，W係於吡啶環之位置2、5或6。
在另一實施體系中，W係於吡啶環之位置5。
在一另外實施體系中，W為-O-。
在另一實施體系中，W為-O-；且W係於吡啶環之位置5。
在一實施體系中，-(間隔基)-為C1-C6伸烷基。
在另一實施體系中，-(間隔基)-為被1至4個氧原子插入之C1-C10伸烷基。
在又另一實施體系中，-(間隔基)-為被3個氧原子插入且被-N(H)C(O)-插入之C1-C12伸烷基。
在一實施體系中，該半抗原間隔基共軛體為
意想下列進一步實施體系：(i)如上所述之式(II)半抗原間隔基共軛體，其中W為-O-；(ii)如上所述之式(II)半抗原間隔基共軛體，其中W為-CH2-；(iii)如上所述或在實施體系(i)和(ii)中之式(II)半抗原間隔基共軛體，其中X為-SH。
(iv)如上所述或在實施體系(i)至(iii)中之式(II)半抗原間隔基共軛體，其中W係於吡啶環之位置2、5或6；(v)如上所述或在實施體系(i)至(iv)中之式(II)半抗原 間隔基共軛體，其中W係於吡啶環之5位置；(vi)如上所述或在實施體系(i)至(v)中之式(II)半抗原間隔基共軛體，其中-(間隔基)-為C1-C8伸烷基、C6伸環烷基、或被1至4個氧原子插入及隨意被-N(H)C(O)-插入之C1-C12伸烷基；及(vii)如上所述或在實施體系(i)至(vi)中之式(II)半抗原間隔基共軛體，其中-(間隔基)-為C1-C8伸烷基。
在下列流程(其描述獲得式式(I)化合物的一般方法)中，取代基係如上述式(I)化合物其衍生物所定義，除非另有說明：
硼酸酯(ii)可由(S)-(-)-菸鹼(i)與適當銥觸媒(通常為甲氧基(環辛二烯)銥(I)二聚物)、配位子(諸如4,4'-二-第三-丁基-2,2'-聯吡啶)和硼來源(諸如聯硼酸頻那醇酯(bis(pinacolato)diboron)或4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊環)，在適當溶劑(諸如1,4-二噁烷或THF)中、於室溫和回流之間的溫度下之反應形成。硼酸酯(ii)然後使用溴化銅(II)在適當溶劑系統(諸如甲醇/水或乙醇/水)中、於通常介於60℃和回流之間的溫度下可轉化成溴化物(iii)。
溴化物(iii)然後與丙烯腈，在鈀偶合條件下，使用適當鈀來源(諸如乙酸鈀(II)或肆(三苯膦)鈀)、在適當膦配位子(諸如三(鄰-苯基)膦或三呋喃膦)存在下、在適當鹼(諸如碳酸鈉、三乙胺或N-二異丙基乙胺)存在下，在適當溶劑(諸如乙腈或1,4-二噁烷)中、通常在約回流之溫度可轉化成不飽和氰化物(iv)。
(iv)產生(v)之氫化通常使用適當觸媒(諸如鈀碳、氫氧化鈀碳或鉑活化炭)，在氫氛圍下、在適當溶劑(諸如甲醇、乙醇或乙酸乙酯)中、於通常約室溫之溫度下進行。
腈(v)至胺(vi)的還原作用通常使用適當觸媒(諸如雷氏鎳)、在氫氛圍(通常約50-100psi壓力)下在適當溶劑(諸如甲醇或乙醇)中、在濃氨存在下、於通常約40-70℃的溫度下進行。
(viii)類型之醯胺的形成在標準文獻條件下進行。酸(vii)可使用適當氯化劑(諸如草醯氯或亞硫醯氯)、在適當溶劑(諸如二氯甲烷或甲苯)中，隨意在催化DMF存在 下，於適當溫度(通常介於0℃和室溫之間)而轉化成醯氯。醯氯然後可與胺(vi)在鹼(諸如三乙胺或二異丙基乙胺)存在下，在適當溶劑(諸如二氯甲烷或甲苯)中、於0℃和室溫之間的溫度下反應。或者酸(vii)可在適當溶劑(諸如二氯甲烷或DMF)中用偶合試劑(諸如)T3P、EDCI.HCI、EDCI.MeI、HBTU、HATU、PyBop、DCC、或GDI轉化至適當活化成分。在EDCI.HCI或EDCI.MeI存在下，隨意添加HOBT。也使用適當鹼(諸如三乙胺或二異丙基乙胺)且反應通常在室溫下進行。
(i)之去質子化可用適當鹼(諸如超級鹼nBuLi-LiDMAE(藉由正丁基鋰與二甲基胺基乙醇的反應形成))、在適當溶劑(諸如己烷、甲苯、己烷/甲苯或己烷/THF)中、於適當溫度(通常介於-78℃和0℃)下進行。所產生的 陰離子可用適當氯來源(諸如六氯乙烷或N-氯丁二醯亞胺)、於-78℃和室溫之間的溫度下淬滅，以產生二種氯吡啶類似物(ix)和(x)。
氯吡啶類似物(ix)和(x)可使用乙醇胺(較佳作為溶劑和反應物)和使用適當強鹼(諸如氫化鈉或第三丁醇鉀)、在通常介於50-100℃之間的溫度而轉化成胺類(xi)和(xii)。
溴化物(iii)可與具有保護基之醇(例如苯甲醇或較佳，對-甲氧基苯甲醇)使用適當鹼(通常為氫化鈉)、在適當溶劑(諸如DMF或NMP)中、於通常約90-130℃的溫度下反應。除去保護基以產生(xiv)可使用標準文獻方法進行(例 如，關於對-甲氧基苯甲醇，可使用適當酸諸如三氟乙酸)。
醇(xiv)可使用適當烷化劑(xvi)(諸如鹵化物、甲磺酸鹽或對甲苯磺酸鹽)和鹼(諸如碳酸鉀或碳酸銫)、在適當溶劑(諸如乙腈或DMF)中、於通常介於80℃和回流之間的溫度而轉化成經保護之胺(xv)(保護基佳為BOC)。胺之脫保護作用可使用標準文獻方法進行，以產生(xvii)(例如，關於BOC保護基之情形，脫保護作用可使用適當酸來源(諸如三氟乙酸或氯化氫)在適當溶劑(諸如1,4-二噁烷、THF或二氯甲烷)中進行。
(xviii)類型之醯胺的形成可在標準文獻條件下進行。酸(vii)可使用適當氯化劑(諸如草醯氯或亞硫醯氯)、在適當溶劑(諸如二氯甲烷或甲苯)中，隨意在催化DMF存在下，於適當溫度(通常介於0℃和室溫之間)轉化成醯氯。醯氯然後可與胺(xvii)在鹼(諸如三乙胺或二異丙基乙胺)存在下，在適當溶劑(諸如二氯甲烷或甲苯)中、在介於0℃和室溫之間的溫度下反應。或者酸(vii)可在適當溶劑(諸如二氯甲烷或DMF)中用偶合試劑(諸如)T3P、EDCIl.HCI、EDCI.MeI、HBTU、HATU、PyBop、DCC、或GDI轉化至適當活化成分。在EDCI.HCI或EDCI.MeI存在下，隨意添加HOBT。也使用適當鹼(諸如三乙胺或二異丙基乙胺)且反應通常在室溫下進行。或者，胺(xvii)可與酸酐或內酯反應以製備另外一般結構(xviii)之衍生物。例如，在此步驟中g-丁內酯或g-硫代丁內酯可用作醯基 來源，或例如酸酐(諸如丁二酸酐或酞酸酐)以提供衍生物(xviii)。
醇(xiv)也可使用適當氧化劑(通常為過氧化氫)和適當酸(諸如乙酸)在適當溶劑(諸如THF或1,4-二噁烷)中經由硼酸酯(ii)製備。
第三個觀點中，本發明係有關一種式(III)之半抗原載體共軛體： 其中W為-CH2-或-O-；-(間隔基)-為C1-C8伸烷基、被1至4個氧原子插入及隨意被-N(H)C(O)-插入之C1-C12伸烷基、或C3-C10伸環烷基；m為0或1；X*為-N(H)-或-S-；n為從1至1000之整數；且Y為選自細菌類毒素、免疫性物質、病毒、病毒樣粒子、蛋白質複合物、蛋白質、多肽、脂質體及免疫刺激性複合物的隨意改性之載體蛋白。
在某些實施體系中，Y為白喉類毒素或CRM197。
關於半抗原連接至載體蛋白質，說明下列方法。載體蛋白，諸如白喉類毒素(DT)或CRM197，例如，可用酸酐(例如丁二酸酐)處理活化，以產生載體蛋白(xix)之衍生變型。此衍生物然後可在標準偶合試劑存在下，藉由用(例如)T3P、EDCI.HCI、EDCI.MeI、HBTU、HATU、PyBop、DCC、或GDI在適當溶劑或緩衝液(諸如Dulbeccos'磷酸鹽緩衝之鹽水)中轉化至適當活化成分，而偶合於半抗原(xvii)。在EDCI.HCI或EDCI.MeI、HOBT或N-羥基丁二醯亞胺(或及其硫酸化變型)存在下為隨意增加且反應通常在室溫下進行以提供共軛體(xx)。或者，丁二醯化/衍生化步驟可以省略，和半抗原直接偶合於載體蛋白上之自由羧基可使用上述方法進行以提供共軛體(xxiv)。或者，載體蛋白可用替代性衍生化試劑(諸如溴乙酸N-羥基丁二醯亞胺)處理以產生衍生之成分(xxi)，其可用含有硫醇之半抗原(xxii)處理以提供共軛體(xxiii)。
意想下列實施體系：(i)如上所述之式(III)半抗原載體共軛體，其中W為-O-；(ii)如上所述之式(III)半抗原載體共軛體，其中W為-CH2-；(iii)如上所述或在實施體系(i)和(ii)中之式(III)半抗原載體共軛體，其中W係於吡啶環之位置2、5或6；(iv)如上所述或在實施體系(i)至(iii)中之式(III)半抗原載體共軛體，其中W係於吡啶環之5位置為；(v)如上所述或在實施體系(i)至(iv)中之式(III)半抗原載體共軛體，其中-(間隔基)-為C1-C8伸烷基、C6伸環烷基或被1至4個氧原子插入及隨意被-N(H)C(O)-插入之 C1-C12伸烷基；(vi)如上所述或在實施體系(i)至(iv)中之式(III)半抗原載體共軛體，其中-(間隔基)-為C1-C8伸烷基；(vii)如上所述或根據實施體系(i)至(vi)之式(III)半抗原載體共軛體，其中m為0；(viii)如上所述或根據實施體系(i)至(vii)之式(III)半抗原載體共軛體，其中該載體為一種選自破傷風類毒素、白喉類毒素或其衍生物(諸如無毒基因突變性白喉類毒素CRM197)、鎖孔帽貝血藍蛋白(KLH)、血藍蛋白(hemocyanine)、白蛋白、來自腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)之外膜蛋白複合物(OMPC)、不耐熱性大腸桿菌毒素之B次單元、來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)(rEPA)之重組胞外蛋白質A、和病毒樣粒子(諸如該等由噬菌體Qb之重組外殼蛋白組裝者)的隨意改性之蛋白質；(ix)如上所述或根據實施體系(i)至(viii)之式(III)半抗原載體共軛體，其中該載體為選自隨意改性之白喉類毒素和CRM197的蛋白質；(x)如上所述或根據實施體系(i)至(ix)之式(III)半抗原載體共軛體，其中該載體為隨意改性之CRM197；(xi)如上所述或根據實施體系(i)至(x)之式(III)半抗原載體共軛體，其中n為在1至40範圍內之整數；(xii)如上所述或根據實施體系(i)至(x)之式(III)半抗原載體共軛體，其中n為在10至18範圍內之整數； (xiii)如上所述或根據實施體系(i)至(xii)或如上所述之式(III)半抗原載體共軛體，其中該載體蛋白為改性之丁二醯化蛋白質。
藉由在37℃下在甲醛和其他賦形劑存在下培養經歷4至6週將白喉毒素轉化成白喉類毒素。此治療產生異質分子量之高交聯蛋白質，致使蛋白質無毒但保留其免疫性。此蛋白質作為疫苗載體蛋白之使用有據可查，且已作為豬之抗性釋素釋放因子(GnRF)疫苗使用，作為替代手術去勢(ImprovacTM,Pfizer)。其也為市售抗白喉之人類疫苗的未共軛形式，分別作為治療白喉、破傷風和百日咳之DTaP疫苗的部分。
CRM197為一種白喉毒素的基因解毒變型，藉由甘胺酸殘基於位置52單點突變為麩胺酸殘基而呈現無毒。突變刪除蛋白質結合到NAD+的能力，且因此，蛋白質為酵素不活化的。由於沒有交聯，所以蛋白質為比白喉類毒素更均勻的分子量產物，白喉毒素之甲醛不活化製備。CRM197也已用作市售抗-肺炎雙球菌疫苗治療之載體蛋白(Prevnar®,Pfizer)。
在第四個觀點中，本發明係有關一種製造如上所述的菸鹼衍生之半抗原載體共軛體之方法，其包含使隨意改性之載體蛋白與如上所述之式(I)的菸鹼衍生之半抗原或式(II)的半抗原間隔基共軛體偶合。
在某些實施體系中，半抗原連接載體蛋白質可以將連結在一起之載體蛋白質數目最小化之方式進行。在某些實 施體系中，連結在一起之載體蛋白質數目為小於5%、小於10%、小於15%、小於20%、小於25%或小於30%之載體蛋白質總數。
在一較佳實施體系中，本發明係有關一種製造如上所述之式(III)的菸鹼衍生之半抗原載體共軛體的方法，其中X*為-NH-，其包含用磺酸基-N-羥基丁二醯亞胺，接著1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽處理隨意改性之載體蛋白，然後添加如上所述之式(I)半抗原或式(II)半抗原間隔基共軛體，其中X為-NH2。
在一替代性實施體系中，本發明係有關一種製造如上所述之式(III)的菸鹼衍生之半抗原載體共軛體的方法，其中X*為-NH-，其包含用丁二酸酐處理載體蛋白以產生改性之丁二醯化載體蛋白；用磺酸基-N-羥基丁二醯亞胺，接著1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽處理改性之丁二醯化載體蛋白，然後添加如上所述之式(I)半抗原或式(II)半抗原間隔基共軛體，其中X為-NH2。
在一替代性實施體系中，本發明係有關一種製造如上所述之式(III)的半抗原載體共軛體之方法，其中X*為-S-，其包含用溴乙酸N-羥基丁二醯亞胺酯處理載體蛋白，然後添加如上所述之式(I)半抗原或式(II)半抗原間隔基共軛體，其中X為-SH。
在第五個觀點中，本發明係有關疫苗(或疫苗組成物)，其包含多種如上述定義之式(III)半抗原載體共軛體，及一或多種佐劑。
適當佐劑的例子為該等已知當其偶合於載體分子時，增強抗體反應抗原者，包括抗體對菸鹼半抗原反應。佐劑為此項技藝中所熟知的(J.C.Aguilar，例如Rodriguez,Review：Vaccine Adjuvants Revisited,2007,Vaccine,25,3752-3762)。佐劑可由一或多種機制作用，包括直接先天免疫活化作用、產生儲藏所、或作為抗原之遞送媒介物。藉由直接先天免疫活化作用之佐劑可為類鐸受體(Toll-like receptor)(TLR)之促效劑，包括但不限於：活化TLR3之穩定聚I：C、經由TLR4活化之脂多醣之衍生物諸如單磷醯基-脂質A(MPL)或吡喃葡萄苷基(Glycopyranosyl)脂質佐劑(GLA)、經由TLR5活化之鞭毛蛋白、經由TLR7或TLR8或TLR7和TLR8二者活化之咪唑并喹啉家族的小分子諸如咪喹莫特(Imiquimod)或雷西莫特(resiquimod)、經由TLR7及/或TLR8活化之寡核糖核苷酸類(ORN)、和經由TLR9活化之含有CpG基序(motifs)的寡脫氧核苷酸類(ODN)。CpG ODN TLR9促效劑可為A-類、B-類、C-類或P-類，有或無稱為E改性之5'T的鹵化，和可由全磷酸二酯主鏈、全硫代磷酸酯主鏈、嵌合主鏈、除介於CpG基序的胞嘧啶和鳥苷之間以外的全硫代磷酸酯之“半軟”主鏈製造。藉由直接先天免疫活化作用之佐劑可透過非TLR機制，諸如QS21或其他皂苷類作用。
佐劑可為作為儲藏系統以及經由發炎體(inflammasome)之先天免疫活化劑的鋁鹽。鋁鹽優先選自氫氧化鋁或磷酸鋁。氫氧化鋁優先為原始Alhydrogel或 Alhydrogel'85。
透過免疫活化作用和遞送媒介物二者作用之佐劑可為免疫刺激性複合物(ISCOM)諸如ISCOMATRIX。
具有遞送媒介物性質之佐劑可為大分子複合物、奈米膠囊、奈米粒子、微球、微粒，或仿病毒顆粒(virosome)且這些在其表面上都可具有對準特定細胞類型之目的的部分。佐劑可為以脂質為主之系統，包括水中油型乳液、油中水型乳液、微胞、混合微胞、和脂質體。脂質體可為單層或多層。乳液可為以鯊烯主者諸如MF-59。
佐劑可為仿病毒顆粒(virosome)。
較佳佐劑係選自CpG寡脫氧核苷酸類(CpG ODN)、鋁鹽類、QS21和ISCOMS。
較佳CpG ODN為優先活化B細胞之B類。在本發明之觀點中，CpG ODN具有核酸序列5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T3’(SEQ ID NO：1)，其中*指示硫代磷酸酯連結。此序列之CpG ODN已知為CpG 24555。
如使用在本文中，術語“寡脫氧核苷酸”(ODN)表示多種核苷酸(即，包含連結於磷酸基和於可交換有機鹼之去氧核糖糖的分子，其為經取代之嘧啶(例如，胞嘧啶(C)或胸苷(T))或經取代之嘌呤(例如，腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G))。核酸分子可得自現存核酸來源(例如，基因組或cDNA)，但較佳為合成(例如，藉由核酸合成製備)。具有硫代磷酸酯連結之寡核苷酸類在活體內相對耐降解(例 如，經由內-和外-核酸酶)，提供活體內增強之活性。
用於合成和化學改性寡核苷酸之方法為熟習該項技術者已知的且描述於(例如)Uhlmann E.等人(1990),Chem Rev.90：543；"Protocols for Oligonucleotides and Analogs"Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques,S.Agrawal,Ed.,Humana Press,Totowa,USA 1993；Crooke,S.T.等人，(1996)Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.36：107-129；及Hunziker J.等人，(1995),Mod.Synth.Methods 7：331-417中。本發明之寡核苷酸類可使用許多該項技術者已知的步驟之任一者重新合成。例如，b-氰乙基亞磷醯胺(phosphoramidite)方法(Beaucage,S.L.,和Caruthers,M.H.,(1981)Tet.Let.22：1859)；核苷酸H-膦酸酯方法(Garegg等人，(1986)Tet.Let.27：4051-4054；Froehler等人，(1986)Nucl.Acid Res.14：5399-5407；Garegg等人，(1986)27：4055-4058；Gaffney等人，(1988)Tet.Let.29：2619-2622)。這些化學物質可藉由市場上各種自動化核酸合成器進行。這些寡核苷酸係指合成寡核苷酸類。改性之主鏈諸如硫代磷酸酯可使用採用胺基磷酸酯(phosphoramidate)或H-膦酸酯化學之自動化技術合成。例如，如美國專利第4,469,863號中所述可製造芳基-和烷基-膦酸酯類，和烷基磷酸三酯類(其中帶電氧部分係如美國專利第5,023,243號中所述烷基化)可藉由使用市售試劑製備之自動化固相合成。已描述製造其他DNA主鏈改性和取代之方法(例如Uhlmann,E.和Peyman,A., Chem.Rev.90：544,1990；Goodchild,J.,Bioconjugate Chem.1：165,1990)。
最佳佐劑為與氫氧化鋁鹽諸如Alhydrogel一起使用之CpG 24555(如同在申請中的申請案號PCT/IB2009/055444中所述，特此以其全文引用方式納入本文中)。因此，在一實施體系中，有提供一種疫苗(或疫苗組成物)，其包含如上述定義之式(III)半抗原載體共軛體，和CpG 24555。在一另外實施體系中，有提供一種疫苗(或疫苗組成物)，其包含如上所述之式(III)半抗原載體共軛體、CpG 24555和氫氧化鋁鹽。在另一實施體系中，有提供一種疫苗(或疫苗組成物)，其包含CpG 24555和多種式(IV)之半抗原載體共軛體：
其中，Y為白喉類毒素或CRM197和n為在1至40範圍內之整數。
在又另一實施體系中，有提供一種疫苗(或疫苗組成物)，其包含CpG 24555、氫氧化鋁鹽和多種式(IV)之半抗原載體共軛體：
其中，Y為白喉類毒素或CRM197和n為在1至40範圍內之整數。
在又另一實施體系中，有提供一種疫苗(或疫苗組成物)，其包含氫氧化鋁鹽(例如Alhydrogel)、和多種式(IV)之半抗原載體共軛體：
其中，Y為白喉類毒素或CRM197和n為在1至40範圍內之整數。
在某些實施體系中，n為在1至30(含)範圍內之整數。在某些實施體系中，n為在5至23(含)範圍內之整。在某些實施體系中，n為在10至18(含)範圍內之整數。在某些實施體系中，n為10。在某些實施體系中，n為11。在某些實施體系中，n為12。在某些實施體系中，n為13。在某些實施體系中，n為14。在某些實施體系中，n為15。在某些實施體系中，n為16。在某些實施體系中，n為17。在某些實施體系中，n為18。
藉由改變形成半抗原載體共軛體的偶合條件，參見下述範例，載體蛋白質之交叉偶合可最小化。當載體蛋白質交叉偶合時，所產生的半抗原載體共軛體包含多種載體蛋白質共價或非共價鍵結在一起且在此稱為"高分子質量成分"。相比之下，"低分子質量成分"如使用本文中係指半抗原載體共軛體，其中在共軛體製備期間損失一部分之載體蛋白。在某些實施體系中已觀察到：高分子量成分導致有效性較低的疫苗。因此，在某些實施體系中，本發明係關於任何上述疫苗組成物，其中小於5%、小於10%、小於15%、小於20%、小於25%或小於30%的載體蛋白質(其為半抗原載體共軛體之一部分)被交叉偶合(即是高分子質量成分)。
在某些實施體系中、本發明係關於任何上述疫苗組成物，其中至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之載體蛋白質(其為半抗原載體共軛體之一部分)不交叉偶合。
在某些實施體系中，大於70%、大於75%、大於80%、大於85%、大於90%或大於95%的上述疫苗組成物之抗原成分任一者為式IV之半抗原載體共軛體。
在某些實施體系中，本發明係關於任何上述疫苗組成物，其中至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%或載體蛋白質具有介於50,000道耳頓和70,000道耳頓之分子量。在某些實施體系中，本發明係關於任何上述疫苗組成物，其中至少70%、至少75%、 至少80%、至少85%、至少90%或至少95%或載體蛋白質具有約58,000道耳頓之分子量。
本發明之疫苗組成物可隨意包含一或多種醫藥上可接受的賦形劑。適當賦形劑包括無菌水、鹽溶液和緩衝液。在一實施體系中，該半抗原載體共軛體溶解於鹽水溶液於醫藥上可接受的pH。疫苗組成物也可隨意包含至少一種輔助劑，諸如分散介質、塗料、界面活性劑、防腐劑和穩定劑。本發明之疫苗組成物較佳為無菌。
本發明之疫苗組成物一般將灌注(priming)和增加(boosting)劑量二者投予。預計：最初系列將包括間隔幾週的幾個劑量，且額外的增加(boosting)劑量間隔幾個月或幾年，或在該循環抗體的含量下降至低於所要含量(臨床上已顯示與加強戒菸率相關)之時間。較佳地本發明之疫苗組成物以經過6至24週投予之3至6劑量的最初系列和之後每3至12個月投予增加(boosting)劑量。
本發明之疫苗組成物可藉由腸胃外的路徑投予，例如經由肌肉內(IM)、皮內(ID)或皮下(SC)注射、或若使用適當裝置，藉由局部投予於皮膚(經皮)或黏膜表面。
在某些實施體系中，本發明之半抗原載體共軛體及/或疫苗可透過使用微針裝置以皮內投予(ID)。在一觀點中，本發明提供一種微針裝置，其包含一或多種塗布或包含或有效遞送本發明菸鹼衍生之半抗原載體共軛體或疫苗組成物的微針。在某些實施體系中，一或多種微針可製備成貼片，其中微針允許簡單的非侵入性投予於皮膚。本發 明之另一觀點考慮使用微針技術以遞送本發明菸鹼衍生之半抗原載體共軛體或疫苗組成物。
微針遞送技術使用短陣列(例如，長度小於4毫米)針可促進包含菸鹼衍生之半抗原載體共軛體的疫苗組成物遞送至特定和所要之皮膚深度。該等微針刺穿角質層和表皮下層，本藥物直接進入表皮或相鄰真皮。由於微針之小尺寸，施用相對上較不痛，與最小(如果有的話)出血或施用部位反應。在此，術語“微針”係指延長結構，其足夠長而可穿透皮膚角質層和進入表皮/真皮層，但足夠短而沒有由於活化神經末梢所造成的實質疼痛。
促進經皮遞送之微針係描述於Prausnitz,Advanced Drug Delivery Reviews 56(2004)581-587；Zahn等人，Biomed.Microdevices 6(2004)183-190；Shirkhandeh J.Materials Sci.16(2005)37-45；Park,J.Controlled Release 104(2005)51-66；美國專利第3,964,482、6,503,231、6,745,211；6,611,707；6,334,856號；且美國專利申請案第2005/0209565、2004/0106904、2004/0186419、2002/0193754和2010/0196445號中；其全部特此以其全文引用方式入本文中。適當微針已由許多材料(包括矽、金屬和聚合物)製造。Davis等人描述微針插入皮膚的力學(Davis等人，J.Biomech.37(2004)1155-1163)。
實心或空心微針可使用於本文中所述之實施體系。在一實施體系中，用於本發明之微針為實心。例如，通道可用微針陣列穿透皮膚製造，接著去除針和隨後施用藥物 (參見例如，Martanto等人，Pharm.Res.21(2004)和McAllister等人，PNAS 100(2003)13755-13760)。包含根據本發明治療劑之調配物可以凝膠、水凝膠、局部用乳膏、油膏、軟膏、或其他局部用調配物；且/或藉由使用遞送裝置諸如繃帶、閉塞體、貼片及/或類似者施用於微針治療之部位。
在另一實施體系中，實心(無孔)微針在施用於皮膚之前以根據本發明菸鹼衍生之半抗原載體共軛體或疫苗組成物塗布。然後使用微針穿刺表皮，其保持與皮膚表面接觸足夠的時間，從而使半抗原載體共軛體或疫苗組成物擴散到周圍的皮膚組織。(關於以該方式投予治療劑，參見Prausnitz,Advanced Drug Delivery Reviews 56(2004)581-587)。在另一實施體系中，使用空心(有孔)微針，其包含儲存本發明半抗原載體共軛體或疫苗組成物之通道。一旦施用於皮膚，半抗原載體共軛體或疫苗組成物藉由擴散或壓力驅動流擴散到皮膚組織。(關於以該方式投予治療劑，參見參見Zahn等人，Biomed.Microdevices6(2004)183-190)。
在又另一實施體系中，相對於習用空心針技術，某些本發明之觀點係有關可用以遞送本發明之疫苗組成物的由可溶性及/或生物降解材料之固體基質形成的微針。關於實心微針的例子參見美國專利和公開申請案第6,945,952、7,611,481、2002/0082543、2005/0197308和2008/0269685號，其全部描述由生物分解性聚合物製成的 微針陣列且特此以其全文引用方納入本文中。
在某些實施體系中，該等實心微針可由快速溶解及/或膨脹的材料組成，包括合成及/或天然衍生之熱成形聚合物材料。在某些實施體系中，該等實心微針可由適當生物相容性、生物分解性聚合物諸如聚(乳酸交酯)類、聚(乙交酯)、聚(乳酸交酯-共-乙交酯)類、聚酐類、聚原酸酯類、聚醚酯類、聚己內酯類、聚酯醯胺類、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚胺甲酸酯類及其共聚物和摻合物形成。在其他實施體系中，該等實心微針可由非生物分解性聚合物諸如聚丙烯酸酯類、乙烯-乙酸乙烯酯之聚合物和其他醯基取代之乙酸織維素類、非分解性聚胺甲酸酯類、聚苯乙烯類、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯咪唑)、氯磺酸酯聚烯烴類、聚環氧乙烷、其摻合物及共聚物形成。
微針可單獨使用或以大於一個微針之陣列使用。各種大小的陣列適合與本發明使用。在一實施體系中，使用1-10個微針。在其他實施體系中，使用包含10-25、10-50、25-50、25-200、25-100或50-100個針之微針陣列。微針之陣列可根據幾個因素(包括但不限於所用微針之長度、直徑、針內距離、銳度和總數)而改變。在一範例實施體系中，微針之陣列包含10×10矩陣。在另一實施體系中，微針之陣列包含20×20矩陣。在一些實施體系中，在陣列中各微針之間的距離為從約100微米至約400微米。在一實施體系中，可視所要皮膚滲透性之增強選擇特定的陣列尺寸。
在一些實施體系中，微針具有從20微米至約1000微米之長度，例如從約50微米至約150微米，或從約150微米至約500微米，或從500微米至約1000微米，或從600微米至約800微米。在其他實施體系中，微針長度為約50、100、250、500、600、700、800、900或1000微米。在又一其他實施體系中，微針長度為至少50、100、250、500、600、700、800、900或1000微米。在其他實施體系中，微針長度為小於50、100、250、500、600、700、800、900或1000微米。在一實施體系中，微針長度為約700微米。在一些實施體系中，微針穿透皮膚於約400微米至約700微米之深度。在一實施體系中，微針穿透皮膚至約相當角質層底部的深度。在另一實施體系中，微針穿透皮膚至約皮層頂端。又在其他實施體系中，微針穿透皮膚最多達約角質層底部和皮層頂端之間的深度。微針可為任何保持效力需要的各種直徑。在一些實施體系中，微針之外徑可為從約20微米至約100微米。在其他實施體系中，微針之外徑可為從約10微米至約50微米。在一些實施體系中空心微針之內徑可為從約5微米至約70微米。此外微針之外或內徑可最多達10、20、30、40、50、60、70、80、90或100微米。如需要時可使用上述微針尺寸與本文中所述之系統和方法的任何組合。
微針可從各種材料(包括但不限於矽、金屬、聚合物和玻璃)製造。在一些實施體系中，使用矽微針。矽微針，無論實心或空心，可從矽片蝕刻。例如，標記各微針 之位置並蝕刻掉周圍的矽，產生連接到共同底座之微針陣列。在一些實施體系中，矽片的厚度介於約300-600微米之間。
在其他實施體系中，微針由金屬(包括但不限於鎳、鈦和合金諸如不銹鋼)製造。在一些實施體系中，金屬微針由環氧樹脂模具製造，其然後用所選擇的金屬電鍍，同時隨後將環氧樹脂模具蝕刻掉。所產生的微針可為可重複使用或一次性使用。微針也可得自商業來源，包括Zosano Pharma,Inc.,Corium和3M。Zosano和3M二者皆已開發含經塗布之微針貼片。Corium已開發生物分解性微針。3M已開發空心微針(例如lntanza®/Idflu®)。
半抗原載體共軛體或疫苗組成物可使用各種方法施加於微針。在一實施體系中，製備包含半抗原載體共軛體或疫苗組成物之溶液並將溶液沉積在微針上/內，接著乾燥溶液。或者，將微陣列浸在包含半抗原載體共軛體或疫苗組成物之溶液中，致使微針以半抗原載體共軛體或疫苗組成物塗布。當另外蛋白質或成分欲塗布在本發明之微針上或內時，可進行額外的塗布步驟。或者，將溶液的幾個或所有成分混合成溶液，然後沈積在微針上/內。可使用浸塗、噴塗或該技藝中已的其他技術，例如該等PCT公開號WO 2006/138719中所描述者，特此納入其全文以供參考。塗料可為固體或半固體。
在各疫苗劑量中半抗原-共軛體之載體蛋白的量選擇為在典型疫苗中誘發免疫保護反應而沒有顯著不良副作用 的量。合適的劑量範圍為0.01至10毫克/劑量，較佳0.1至1.0毫克/劑量。一般人在單一疫苗劑量之後需要兩或更多週來產生扺抗外來抗原的抗體，和一般需要經歷數週投予幾個疫苗劑量，以誘發高持續抗體力價諸如該等想要用於抗菸鹼疫苗以幫助在戒菸者。可藉由使用技術人員眾所周知的技術(諸如ELISA、放射免疫分析、表面電漿共振和西方墨點法)監控在人血中的抗體之產生。
因此，在第六個觀中，本發明係關於一種用作醫藥的如上述定義之半抗原載體共軛體或疫苗組成物。
在又一另外觀點中，本發明係關於一種如上述定義之半抗原載體共軛體、或疫苗組成物，其係用於增加希望戒菸之吸菸者之戒菸率或減少復發率、曾經吸菸者希望避免復發、或用於預防菸鹼成癮。
在又一另外觀點中，本發明係關於一種如上述定義之菸鹼衍生之半抗原載體共軛體，或疫苗組成物，其係用於製造治療或預防需要此治療的人士之菸鹼依賴性的醫藥。
在又一另外觀點中，本發明係關於一種如上述定義之菸鹼衍生之半抗原載體共軛體、或疫苗組成物，其係用於治療或預防需要此治療的人士之菸鹼成癮。
在又一另外觀點中，本發明係關於一種幫助希望戒菸之吸菸者戒菸、或預防已戒菸之吸菸者復發、或預防可能暴露於吸菸或來自其他來源之菸鹼的人士菸鹼成癮之治療方法，該方法包含將如上述定義之半抗原載體共軛體或疫苗組成物投予至該等人士。
在一實施體系中，該方法另外包含將另一非疫苗戒菸產物投予至人。合適的產物包括對準菸鹼乙醯膽鹼受體的藥物產品，諸如伐崙克林、或安非他酮(bupropion)，隨意於緩釋形式。其他可使用於本發明方法中之產品包括可尼丁(clonidine)和去甲替林(nortriptyline)。另外合適的產品包括菸鹼替代療法(NRT)產品，於(例如)貼片(16小時和24小時)、口香糖、噴鼻劑或吸入器之形式。
在又一另外觀點中，本發明係關於一種製造根據本發明半抗原載體共軛體之方法，其包含偶合隨意改性之載體蛋白與根據本發明之半抗原或根據本發明之半抗原間隔基共軛體。
在又一另外觀點中，本發明係關於一種製造式(III)半抗原載體共軛體之方法： 其中W為-CH2-或-O-；-(間隔基)-為C1-C8伸烷基、C3-C10伸環烷基或被1至4個氧原子插入及隨意被-N(H)C(O)-插入之C1-C12伸烷基；X*為-NH-；m為0或1；n為從1至1000之整數；且Y為選自細菌類毒素、免疫性物質、病毒、病毒樣粒子、蛋白質複合物、蛋白質、多肽、脂質體 及免疫刺激性複合物的隨意改性之載體蛋白；其包含用磺酸基-N-羥基丁二醯亞胺，接著1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽處理隨意改性之載體蛋白，然後添加式(I)之半抗原： 其中W為-CH2-或-O-；且X為-NH2；或根據式(II)之半抗原間隔基共軛體： 其中W為-CH2-或-O-；-(間隔基)-為C1-C8伸烷基、C3-C10伸環烷基或被1至4個氧原子插入及隨意被-N(H)C(O)-插入之C1-C12伸烷基；X為-NH2。
在又一另外觀點中，本發明係關於一種製造式(III)共軛體之方法： 其中W為-CH2-或-O-；-(間隔基)-為C1-C8伸烷基、C3-C10伸環烷基或被1至4個氧原子插入及隨意被-N(H)C(O)-插入之C1-C12伸烷基；X*為-NH-；m為0或1；n為從1至1000之整數；且Y為選自細菌類毒素、免疫性物質、病毒、病毒樣粒子、蛋白質複合物、蛋白質、多肽、脂質體及免疫刺激性複合物的隨意改性之載體蛋白；其包含用丁二酸酐處理載體蛋白，以產生改性之丁二醯化載體蛋白；用磺酸基-N-羥基丁二醯亞胺，接著1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽處理改性之丁二醯化載體蛋白，然後添加式(I)之半抗原： 其中W為-CH2-或-O-；且X為-NH2；或根據式(II)之半抗原間隔基共軛體： 其中W為-CH2-或-O-；-(間隔基)-為C1-C8伸烷基、C3-C10伸環烷基或被1至4個氧原子插入及隨意被-N(H)C(O)-插入之C1-C12伸烷基；且X為-NH2。
生物分析
抗菸鹼抗體ELISA。如下使用ELISA分析定量抗菸鹼抗體在小鼠血漿中之含量。因為菸鹼分子不適合於塗布於ELISA盤，因此將其連結至具有生物黏著性質之較大分子(牛血清白蛋白)。菸鹼衍生物(rac-反3'-硫甲基菸鹼)係共軛於牛血清白蛋白且以1微克/毫升在碳酸鹽緩衝液(Sigma-Aldrich)中之最終濃度將所得之菸鹼-BSA共軛體用於塗布96孔Immuno Maxi-Sorp ELISA盤(VWR)(100微升/孔)，並在4℃下培養過夜。然後將該盤吸出和用含有0.05% Tween® 20(Sigma-Aldrich,P3563)之磷酸鹽緩衝鹽水洗滌。將該等盤在37℃下用200微升封閉緩衝液(碳酸鹽緩衝液+10% Bovine Calf Serum,Fisher)封閉1小時且然後如上所述洗滌。將試樣和參考血漿連續稀釋於稀釋緩衝液(1X PBS與0.05% Tween® 20+10% BCS)中並加至該等盤(100微升/孔)。將該等盤在37℃下培養2小時。將其再次洗滌且然後用以稀緩衝液(1X PBS與0.05% Tween® 20+10% BCS)稀釋之羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotech)在37℃下培養1小時。然後將該等盤再次洗滌且用鄰苯二胺二鹽酸鹽(OPD)基質(溶解在磷酸鹽檸檬酸緩衝液中之1×5毫克OPD錠，Sigma-Aldrich)於黑暗中在室溫下培養30min。藉由將50微升4N硫酸(VWR)加至各孔停止反應並使用自動化盤讀數器於450nm讀數。將試樣以最高血漿稀釋定量，其導致抗體吸收值(OD 450)二倍大於非免疫血漿之抗體吸收值，具有0.05的截止值。
抗菸鹼抗體之結合性的測量。如下使用以硫氰酸銨溶析為主之ELISA方法測量抗菸鹼抗體之結合性。用菸鹼-BSA抗原溶液以1微克/毫升在碳酸鹽緩衝液(Sigma-Aldrich)之濃度塗布(100微升/孔)96孔Immuno Maxi-Sorp ELISA盤(VWR)並在4℃下培養過夜。將該等盤用含有0.05% Tween® 20(Sigma-Aldrich)之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌，且然後在37℃下用200微升碳酸鹽緩衝液+10%胎牛血清(Fisher)封閉1小時。將該等盤再次洗滌。將血漿試樣(先前測定包含抗菸鹼抗體)稀釋於含有0.05% Tween® 20+10%胎牛血清(BCS)之PBS中以達到於450nm的約1.0之最佳抗體吸收值，且然後以100微升/孔加至該等盤。將該等盤在37℃下培養2小時且然後洗滌。其次，藉由添加於從0至2.0M的稀釋於PBS/0.05% Tween® 20之濃度範圍的硫氰酸銨(NH4SCN)(100微升/孔)進行溶析並在室溫下培養15min。然後將該等盤洗滌並使用以稀緩衝液(1X PBS與0.05% Tween® 20+10% BCS)稀釋之羊抗小鼠 IgG-HRP(Southern Biotech)在37℃下檢測抗體結合經1小時。然後將該等盤再次洗滌且用鄰苯二胺二鹽酸鹽(OPD)基質(溶解在磷酸鹽檸檬酸緩衝液中之1×5毫克OPD錠，Sigma-Aldrich)於黑暗中在室溫下培養30min。藉由將50微升4N硫酸(VWR)加至各孔停止反應並使用自動化盤讀數器於450nm讀數。然後將結果表示為在NH4SCN存在下抗原-抗體之結合的百分比減少(OD之%減少)和對NH4SCN之濃度莫耳作圖計算。結合性指數為產生結合之50%減少所需的NH4SCN之濃度。
在血漿和腦中之菸鹼分佈的評估。免疫接種對血漿和腦中之菸鹼分佈的影響係藉由經由尾靜脈灌注將0.05毫克/公斤之含有3μCi 3H-菸鹼的(-)菸鹼酒石酸氫鹽在100微升PBS中投予至動物(預先用抗菸鹼疫苗免疫接種)經10秒測定。5分鐘後經由心臟穿刺獲得血液並收集血漿。藉由將20毫升注入心臟左心室立刻用PBS灌注小鼠經過1至2分鐘和收穫腦並稱重。將腦在1毫升消化緩衝液(100mM氯化鈉，25mM Tris，25mM EDTA，0.5% Igepal CA-630和0.3毫克/毫升蛋白酶K，每100毫克組織)中於~50℃下消化72小時。將腦消化物或血漿之100微升等分試樣與5毫升液體閃爍液混合且藉由液體閃爍計數測定放射性標記菸鹼之含量。
測定由抗菸鹼疫苗誘發之抗體的特異性之競爭ELISA。如下使用競爭ELISA測定抗菸鹼抗體的特異性。將96孔Immuno Maxi-Sorp ELISA盤(VWR)(100微升/孔) 用菸鹼-BSA抗原溶液以1微克/毫升在碳酸鹽緩衝液(Sigma-Aldrich)中之濃度塗布並在4℃下培養過夜。將該等盤用含有0.05% Tween® 20(Sigma-Aldrich)之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌，用200微升碳酸鹽緩衝液+10%胎牛血清(Fisher)在37℃下封閉1小時和然後再次洗滌。在此培養期間，將血漿試樣(先前測定包含抗菸鹼抗體)稀釋於含有0.05% Tween® 20+10%胎牛血清(BCS)之PBS中以達到於450nm的約1.0至1.5之最佳抗體吸收值，並將不同抑制劑(菸鹼、可丁寧、乙醯膽鹼、伐崙克林)連續稀釋，開始於20,000μM。將相同等體積(65微升)之稀釋試樣和所選擇之抑制劑加至非塗布96孔盤之孔中並允許在37℃下培養1小時。培養之後，將血漿/抑制劑混合物以100微升/孔加至先前封閉菸鹼-BSA塗布盤中。將該等盤在37℃下培養30min且然後再次洗滌。使用以稀緩衝液(1X PBS與0.05% Tween® 20+10% BCS)稀釋之羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotech)在37℃下檢測抗體結合經1小時。然後將該等盤再次洗滌且用鄰苯二胺二鹽酸鹽(OPD)基質(溶解在磷酸鹽檸檬酸緩衝液中之1×5毫克OPD錠，Sigma-Aldrich)於黑暗中在室溫下培養30min。藉由將50微升4N硫酸(VWR)加至各孔停止反應並使用自動化盤讀數器於450nm讀數。於450nm之OD讀數對抑制劑之莫耳濃度作圖並外推每個測試試樣之50%抑制。
圖1顯示用包含本發明菸鹼衍生之半抗原共軛體與佐劑之疫苗免疫接種的小鼠在不同的時間點對在血漿中抗菸鹼抗體含量的影響。藉由肌肉內接種(在第0、28、42天)用共軛於白喉類毒素(DT；10微克)的菸鹼衍生之半抗原(得自製備4、7、8和12)在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和CpG 24555，含有免疫刺激之CpG基序(motifs)的21-mer TLR9促效劑(50微克)存在下將BALB/c小鼠(n=12每組)免疫接種。以ELISA測量血漿中之抗菸鹼抗體含量(總計IgG)。
圖2顯示用含有包含本發明半抗原之共軛體抗原的抗菸鹼疫苗免疫接種之小鼠在不同的時間點對所產生之抗菸鹼抗體在血漿中的結合性的影響。藉由肌肉內接種(在第0、28、42天)用共軛於白喉類毒素(DT；10微克)的菸鹼衍生之半抗原(得自製備4、7、8和12)在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和CpG 24555(50微克)存在下將BALB/c小鼠(n=12每組)免疫接種。結合性指數對應於從菸鹼-BSA塗布板溶析50%之抗菸鹼抗體所需要的硫氰酸銨之濃度且高濃度的要求，指示具有較高的結合性抗體。
圖3顯示以含有包含本發明半抗原的共軛體抗原之抗菸鹼疫苗免疫接種的小鼠對靜脈內(IV)投予之3H-菸鹼在腦和血液中之分佈的影響。藉由肌肉內注射(在第0、28、42天)用共軛於白喉類毒素(DT；10微克)的菸鹼衍生之半抗原(得自製備4、7、8和12)在氫氧化鋁(alum； Alhydrogel-85：40微克Al3+)和CpG 24555(50微克)存在下將BALB/c小鼠(n=6每組)免疫接種。在最後增加(boost)2週之後，藉由IV注射投予3H-菸鹼(0.05毫克/公斤菸鹼包含3μCi 3H-nic)，收集取血，灌注動物，移除大腦，定量3H之含量和測定3H之血漿/腦的比例。
圖4顯示用得自本發明半抗原之疫苗免疫接種小鼠後與抗菸鹼抗體之菸鹼的交互作用。藉由肌肉內接種(在第0、28、42天)用共軛於白喉類毒素(DT；10微克)的菸鹼衍生之半抗原(得自製備4、7、8和12)在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和CpG 24555(50微克)存在下將BALB/c小鼠(n=12每組)免疫接種。在最後增加2週之後，以競爭ELISA證明抗菸鹼抗體與菸鹼之交互作用。
圖5顯示小鼠用含有本發明半抗原之疫苗免疫接種之後抗菸鹼抗體的特異性。藉由肌肉內注射(在第0、28、42天)用共軛於白喉類毒素(DT；10微克)的菸鹼衍生之半抗原(得自製備4和12)在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和CpG 24555(50微克)存在下將BALB/c小鼠(n=12每組)免疫接種。在最後增加2週之後，抗菸鹼抗體對對菸鹼、可丁寧(cotinine)、乙醯膽鹼和伐崙克林的特異性以競爭ELISA測量。
圖6顯示以使用不同間隔基將本發明菸鹼衍生之半抗原共軛於載體的抗菸鹼疫苗免疫接種的小鼠在不同的時間點對血漿中之抗菸鹼抗體含量的影響。藉由肌肉內注射 (在第0、28、42天)用共軛於白喉類毒素(DT；10微克)且共軛體使用不同連接子(得自製備24-34)的菸鹼衍生之半抗原(製備4；5'胺基丙基菸鹼)在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和CpG 24555(50微克)存在下將BALB/c小鼠(n=12每組)免疫接種。以ELISA測量血漿中之抗菸鹼IgG Ab含量。
圖7顯示以使用不同間隔基將本發明菸鹼衍生之半抗原共軛於載體的抗菸鹼疫苗免疫接種的小鼠對血漿中抗菸鹼抗體之含量和結合性及對血漿和腦中3H-菸鹼之分佈的影響。藉由肌肉內接種(在第0、28、42天)用共軛於白喉類毒素(DT；10微克)且共軛體使用不同連接子(得自製備24-34)的菸鹼衍生之半抗原(製備4；5'胺基丙基菸鹼)在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和CpG 24555(50微克)存在下將BALB/c小鼠(n=12每組)免疫接種。在第三次免疫接種2週之後，以ELISA測量血漿中的抗菸鹼IgG Ab含量及以硫氰酸銨分析測量結合性。藉由IV注射投予3H-菸鹼(0.05毫克/公斤菸鹼包含3μCi 3H-nic)，收集取血，灌注動物，移除大腦，定量3H之含量和測定3H之血漿/腦的比例。
圖8顯示以使用不同間隔基將本發明菸鹼衍生之半抗原共軛於載體的抗菸鹼疫苗免疫接種的小鼠在不同的時間點對血漿中抗菸鹼抗體之含量的影響。藉由肌肉內接種(在第0、28、42天)用共軛於白喉類毒素(DT；10微克)且共軛體使用不同連接子(製備24-34)的菸鹼衍生之半抗原 (製備12；5'胺基乙氧基菸鹼)在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和CpG 24555(50微克)存在下將BALB/c小鼠(n=12每組)免疫接種。以ELISA測量血漿中之抗菸鹼抗體含量(總計IgG)。
圖9顯示以使用不同間隔基將本發明菸鹼衍生之半抗原共軛於載體的抗菸鹼疫苗免疫接種的小鼠對血漿中抗菸鹼抗體之含量和結合性及對血漿和腦中3H-菸鹼之分佈的影響。藉由肌肉內接種(在第0、28、42天)用共軛於白喉類毒素(DT；10微克)且共軛體使用不同連接子(得自製備24-34)的菸鹼衍生之半抗原(製備12；5'胺基乙氧基菸鹼)在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和CpG 24555(50微克)存在下將BALB/c小鼠(n=12每組)免疫接種。在第三次免疫接種2週之後，以ELISA測量血漿中的抗菸鹼IgG Ab含量及以硫氰酸銨分析測量結合性。藉由IV注射投予3H-菸鹼(0.05毫克/公斤菸鹼包含3μCi 3H-nic)，收集取血，灌注動物，移除大腦，定量3H之含量和測定3H之血漿/腦的比例。
圖10顯示本發明半抗原載體共軛體之丁二醯化在不同的時間點對血漿中抗菸鹼抗體含量的影響。藉由肌肉內接種(在第0、28、42天)用共軛於白喉類毒素(DT；10微克)且共軛體係使用2種不同條件製備(各為有或沒有丁二酸酐步驟)的菸鹼衍生之半抗原(製備4；5'胺基丙基菸鹼)在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和CpG 24555(50微克)存在下將BALB/c小鼠(n=12每組)免疫接 種。以ELISA測量血漿中之抗菸鹼抗體含量(總計IgG)。
圖11顯示本發明半抗原載體共軛體之丁二醯化對3H-菸鹼在血液和腦中之分佈的影響。藉由肌肉內接種(在第0、28、42天)用共軛於白喉類毒素(DT；10微克)且共軛體係使用2種不同條件製備(各為有或沒有丁二酸酐步驟)的菸鹼衍生之半抗原(製備4；5'胺基丙基菸鹼)在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和CpG 24555(50微克)存在下將BALB/c小鼠(n=12每組)免疫接種。在最後增加2週之後，藉由IV注射投予3H-菸鹼(0.05毫克/公斤菸鹼包含3μCi 3H-nic)，收集取血，灌注動物，移除大腦，定量3H在腦和血漿中之含量。
圖12顯示以使用不同間隔基將本發明菸鹼衍生之半抗原共軛於載體的抗菸鹼疫苗免疫接種的小鼠在不同的時間點對血漿中抗菸鹼抗體含量的影響。藉由肌肉內接種(在第0、28、42天)用共軛於白喉類毒素(DT；10微克)或CRM197(10微克)且共軛體使用不同連接子(製備24-34)的菸鹼衍生之半抗原(製備12；5'胺基乙氧基菸鹼)在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和CpG 24555(50微克)存在下將BALB/c小鼠(n=12每組)免疫接種。以ELISA測量血漿中之抗菸鹼抗體含量(總計IgG)。
圖13顯示用抗菸鹼疫苗免疫接種的小鼠對3H-菸鹼在小鼠中之分佈的影響。藉由肌肉內接種(在第0、28、42天)用共軛於白喉類毒素(DT；10微克)或CRM197(10微克)的菸鹼衍生之半抗原(製備12；5'胺基乙氧基菸鹼)在氫氧 化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和CpG 24555(50微克)存在下將BALB/c小鼠(n=12每組)免疫接種。在第三次免疫接種二週之後，藉由IV注射投予3H-菸鹼(0.05毫克/公斤菸鹼包含3μCi 3H-nic)，收集取血，灌注動物，移除大腦，定量3H之含量和測定相對於對照組動物之3H-菸鹼在腦中的%改變。
圖14顯示用抗菸鹼疫苗免疫接種的小鼠在不同的時間點對血漿中之抗菸鹼抗體含量的影響。藉由肌肉內接種(在第0、28、42天)用共軛於白喉類毒素(DT；10微克)或CRM197(10微克)的菸鹼衍生之半抗原(製備12；5'胺基乙氧基菸鹼)在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和CpG 24555(50微克)存在下將BALB/c小鼠(n=12每組)免疫接種。評估不同半抗原裝載之範圍。以ELISA測量血漿中之抗菸鹼抗體含量(總計IgG)。
圖15顯示用抗菸鹼疫苗免疫接種的小鼠對小鼠中之3H-菸鹼分佈的影響。藉由肌肉內接種(在第0、28、42天)用共軛於白喉類毒素(DT；10微克)或CRM197(10微克)的菸鹼衍生之半抗原(製備12；5'胺基乙氧基菸鹼)在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和CpG 24555(50微克)存在下將BALB/c小鼠(n=12每組)免疫接種。評估不同半抗原裝載之範圍。在第三次免疫接種二週之後，藉由IV注射投予3H-菸鹼(0.05毫克/公斤菸鹼包含3μCi 3H-nic)，收集取血，灌注動物，移除大腦，定量3H之含量和測定相對於對照組動物之3H-菸鹼在腦中的%改變。
圖16-18顯示用抗菸鹼疫苗免疫接種的小鼠在不同的時間點對血漿中之抗菸鹼抗體含量和結合性的影響。藉由肌肉內接種用共軛於CRM197(10微克)的菸鹼衍生之半抗原(製備12；5'胺基乙氧基菸鹼)在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和CpG 24555(50微克)存在下或在ISCOMATRIX(IMX；0.1至3.0單位)存在下將BALB/c小鼠(n=10每組)免疫接種。以ELISA(第21和28天)測量血漿中之抗菸鹼抗體含量(總計IgG)和以抑制ELISA測量結合性。圖16[i]顯示第1次劑量3週後的結果；且[ii]顯示示第2次劑量1週後的結果。圖17顯示在第二次劑量一週後的結合性(IC50)。圖18顯示菸鹼在血漿中之螯合(上)；菸鹼吸收於腦中(下)。
圖19和20顯示表6的菸鹼衍生之半抗原載體共軛體的共軛條件對抗菸鹼抗體含量和對應IC50值的影響。藉由肌肉內接種用菸鹼衍生之半抗原在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和CpG 24555(50微克)存在下將BALB/c小鼠(n=10每組)免疫接種。以ELISA測量血漿中之抗菸鹼抗體含量(總計IgG)和以抑制ELISA測量結合性。
圖21和22顯示關於表6的菸鹼衍生之半抗原載體共軛體的3H-菸鹼在血液和腦中之分佈。藉由肌肉內接種用菸鹼衍生之半抗原在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和CpG 24555(50微克)存在下將BALB/c小鼠(n=10每組)免疫接種。在第二次免疫接種一週之後，藉由 IV注射投予3H-菸鹼(0.05毫克/公斤菸鹼包含3μCi 3H-nic)，收集取血，灌注動物，移除大腦，定量3H之含量和測定相對於對照組動物之3H-菸鹼在血液和腦中之%改變。
圖23顯示測試具有不同百分比單體載體蛋白之半抗原載體共軛體結合於CpG/Alhydrogel的結果。用已知量的半抗原載體共軛體培養CpG/Alhydrogel和然後測量培養之後留在溶液之共軛體濃度來測定結合。共軛體之濃度的%減少等同於結合至CpG/Alhydrogel之%共軛體。藉由肌肉內注射用10微克之不同共軛體將BALB/c小鼠(n=10每組)在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和10微克CpG 24555存在下免疫接種。在第二次免疫接種一週之後，藉由IV注射投予3H-菸鹼(0.05毫克/公斤菸鹼包含3μCi 3H-nic)，收集取血，灌注動物，移除大腦，定量3H之含量和測定相對於對照組動物之3H-菸鹼在血液和腦中之%改變。
範例
本發明以下例製備和實例說明，但不限制於該等製備和實例，其中使用下例縮寫：
1H NMR在所有情況下，與提出的結構一致。特性化學位移(δ)以距離四甲基矽烷的低磁場百萬分之一給予，使用主要峰分之名稱的習知縮寫：例如，s，單峰；d，雙峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰；br，寬；brm，寬多重峰；brt寬三重峰。
LCMS，除非另有說明，否則在下列條件下進行：Waters XBridge C18 5奈米，2.1×30毫米管柱，0：100至95：5經過3.1min，MeCN：(10mM(NH4)2HCO3 aq)。
製備 製備1：(S)-3-溴-5-(1-甲基吡咯啶-2-基)吡啶(或5-溴菸鹼)
此化合物係依照J.Am.Chem.Soc.,2007,50,15434-15435中所述之方法製備。
將聯硼酸頻那醇酯(bis(pinacolato)diboron)(7.16克，28.21毫莫耳)溶解在1,4-二噁烷(60毫升)中，然後藉由通過氬氣來脫氣。添加(S)-(-)-菸鹼(6.48毫升，40.3毫莫耳)，接著4,4'-二-第三-丁基-2,2'-聯吡啶(650毫克，2.42毫莫耳)。繼續脫氣10min，然後添加甲氧基(環辛二烯)銥(I)二聚物(753毫克，1.21毫莫耳)。將反應混合物在回流溫度下加熱18小時。蒸發溶劑且將殘餘物溶解在MeOH(100毫升)中。添加在水(100毫升)中之溴化銅(II)(27.0克，120.9毫莫耳)並將反應混合物於80℃下加熱3小時。將氨溶液(10% aq.，100毫升)加至反應混合物， 其然後用乙酸乙酯萃取並經過MgSO4乾燥。蒸發溶劑和藉由急驟層析法(在DCM中的5% MeOH)純化粗製產物以產生呈橙色油之標題化合物(6.14克，63%)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.68-1.70(m，1H)，1.80-1.82(m，1H)，1.92-1.94(m，1H)，1.99-2.02(m，1H)，2.03(s，3H)，2.20-2.34(m，1H)，3.08(t，1H)，3.20(t，1H)，7.86(s，1H)，8.42(s，1H)，8.54(s，1H)。
製備2：(S)-3-(5-(1-甲基吡咯啶-2-基)吡啶-3-基)丙烯腈
藉由通過氬氣將(S)-3-溴-5-(1-甲基吡咯啶-2-基)吡啶(製備1)(300毫克，1.24毫莫耳)，乙酸鈀(II)(14毫克，0.06毫莫耳)、三(鄰甲苯基)膦(75毫克，0.25毫莫耳)和三乙胺(0.35毫升，2.48毫莫耳)在MeCN(10毫升)的混合物脫氣。然後添加丙烯腈(0.12毫升，1.87毫莫耳)和反應混合物在回流溫度下加熱18小時。將反應混合物冷卻至室溫，通過Celite過濾，和蒸發溶劑以產生棕色固體。藉由急驟層析法(在DCM中的2%[在MeOH中之20%氨])純化粗製產物以產生呈紅棕色油之標題化合物(188毫克，71%，順和反異構物之混合物)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.60-1.79(m，1H)，1.80- 1.90(m，1H)，1.90-2.04(m，1H)，2.17及2.19((2xs，3H)，2.16-2.40(m，2H)，3.11-3.30(m，2H)，5.57及6.00(2xd，1H)，7.16及7.40(2xd，1H(，7.80及8.26(2xs，1H)，8.57(s，1H)，8.60及8.71(2xs，1H)。
製備3：(S)-3-(5-(1-甲基吡咯啶-2-基)吡啶-3-基)丙腈
將(S)-3-(5-(1-甲基吡咯啶-2-基)吡啶-3-基)丙烯腈(製備2)(185毫克，0.87毫莫耳)和5% Pd/C(50毫克)在MeOH(5毫升)中在氫氛圍下攪拌72小時。將反應混合物通過Celite過濾，然後蒸發溶劑。藉由急驟層析法(在DCM中的5%[在MeOH中之20%氨])純化粗製產物以產生呈淡黃色油之標題化合物(141毫克，75%)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.66-1.78(m，1H)，1.78-1.89(m，1H)，1.89-2.02(m，1H(，2.17(s，3H)，2.17-2.25(m，1H)，2.31(q，1H)，2.65(t，2H)，2.97(t，2H)，3.10(t，1H)，4=3.24(t，1H)，7.61(d，1H)，8.38(s，1H)，8.44(s，1H)。
製備4：(S)-3-(5-(1-甲基吡咯啶-2-基)吡啶-3-基)丙-1-胺
將(S)-3-(5-(1-甲基吡咯啶-2-基)吡啶-3-基)丙腈(製備3)(140毫克，0.65毫莫耳)和雷氏鎳(50毫克)於在MeOH(50毫升)中之20%氨中在50psi氫下於50℃攪拌4小時。將反應混合物通過Celite過濾，然後蒸發溶劑。藉由急驟層析法(在DCM中的7%[在MeOH中之20%氨])純化粗製產物以產生呈淡黃色油之標題化合物(126毫克，88%)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.70-1.85(m，3H)，1.85-2.03(m，2H)，2.15(s，3H)，2.35(q，2H)，2.59-2.78(m，4H)，3.12-3.37(m，2H)，7.70(s，1H)，8.31(br s，2H)。LCMS：1.91min(97%)，m/z=220.16[M+H]+
製備5和6：(S)-2-氯-5-(1-甲基吡咯啶-2-基)吡啶(或6-氯菸鹼)和(S)-2-氯-3-(1-甲基吡咯啶-2-基)吡啶(或2-氯菸鹼)
這些化合物係依照Eur.J.Org.Chem.,2006,3562-3565中所述之方法製備。
將丁基鋰(2M在己烷中，83毫升，166毫莫耳)加至 二甲胺基乙醇(9.3毫升，92.5毫莫耳)在己烷(70毫升)中於-20℃下的溶液。添加在己烷(30毫升)中的(S)-(-)-菸鹼(5.0克，30.8毫莫耳)並將反應混合物在-20℃下攪拌1小時。然後將綠色溶液冷卻至-78℃並添加六氯乙烷(29.1克，123毫莫耳)。將反應混合物在-78℃下攪拌30min，然後藉由添加氯化銨(飽和水溶液)停止反應。添加DCM和2M HCl(aq.)。將水層DCM用洗滌(x2)，然後以添加冰/氨(水溶液)鹼化。將水層用DCM萃取(x2)，經過MgSO4乾燥和蒸發。藉由急驟層析法(在己烷中之20%乙酸乙酯)純化粗製產物以產生6-氯菸鹼(製備5)(2.2克，36%)和2-氯菸鹼(製備6)(120毫克，2%)，二者皆呈黃色油。
6-氯菸鹼：1H NMR(300MHz，CDCl3)δ=1.58-2.01(m，3H)，2.14(s，3H)，2.10-2.23(m，1H)，2.28(q，1H)，3.05(t，1H)，3.19(dt，1H)，7.26(d，1H)，7.64(dd，1H)，8.27(d，1H)。
2-氯菸鹼：1H NMR(300MHz，CDCl3)δ=1.45-1.60(m，1H)，1.76-1.98(m，2H)，2.22(s，3H)，2.31-2.49(m，2H)，3.24(t，1H)，3.55(t，1H)，7.20-7.29(m，1H)，7.93(d，1H)，8.24(dd，1H)。
製備7：(S)-2-(5-(1-甲基吡咯啶-2-基)吡啶-2-基氧基)乙胺
將氫化鈉(在油中之60%，~500毫克)加至在乙醇胺(3毫升)中之6-氯菸鹼(製備5)(690毫克，3.5毫莫耳)。在室溫下15min之後，將反應混合物於80℃下加熱16小時。將反應混合物分溶在乙酸乙酯和水之間。將水層用乙酸乙酯萃取，經過MgSO4乾燥和蒸發。藉由急驟層析法(在DCM中的5%[在MeOH中之20%氨])純化粗製產物以產生呈無色油之標題化合物(44毫克，6%)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.71-2.00(m，3H)，2.17(s，3H)，2.17-2.23(m，1H)，2.31(q，1H)，2.99(t，2H)，3.09(t，1H)，3.20(t，1H)，4.26(t，2H)，6.83(d，1H)，7.68(d，1H)，8.02(d，1H)。
LCMS：2.02min(100%)，m/z=222.1[M+H]+
製備8：(S)-2-(3-(1-甲基吡咯啶-2-基)吡啶-2-基氧基)乙胺
將氫化鈉(在油中之60%，~200毫克)加至在乙醇胺(2毫升)中之2-氯菸鹼(製備6)(120毫克，0.61毫莫耳)。在室溫下15min之後，將反應混合物於80℃下加熱16小時。將反應混合物分溶在乙酸乙酯和水之間。將水層用乙 酸乙酯萃取，經過MgSO4乾燥和蒸發。藉由急驟層析法(在DCM中的5%[在MeOH中之20%氨])純化粗製產物以產生呈無色油之標題化合物(8.5毫克，6%)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.60-1.70(m，1H)，1.81-1.99(m，2H)，2.20(s，3H)，2.23-2.40(m，2H)，3.03(t，2H)，3.19(t，1H)，3.53(t，1H)，4.27-4.41(m，2H)，6.96(d，1H)，7.74(d，1H)，8.00(d，1H)。
LCMS：2.03min(99%)，m/z=222.1[M+H]+
製備9：(S)-3-(4-甲氧基苯甲氧基)-5-(1-甲基吡咯啶-2-基)吡啶
將氫化鈉(在油中之60%，650毫克，32.5毫莫耳)加至在DMF(10毫升)中之4-甲氧基苯甲醇(1.4克，11.6毫莫耳)。在室溫下30min之後，添加在DMF中(2毫升)之5-溴菸鹼(製備1)(1.4克，11.6毫莫耳)。將反應混合物於90℃下加熱16小時。將反應混合物分溶在乙酸乙酯和水之間。將水層用乙酸乙酯萃取，將有機層合併，經過MgSO4乾燥和蒸發。藉由急驟層析法(在DCM中的2.5%→5% MeOH)純化粗製產物以產生呈黃色油之標題化合 物，與~30%之另一異構物混合(402毫克，23%)。
製備10：(S)-5-(1-甲基吡咯啶-2-基)吡啶-3-醇(或5-羥菸鹼)
製備10a：將(S)-3-(4-甲氧基苯甲氧基)-5-(1-甲基吡咯啶-2-基)吡啶(製備9)(400毫克，1.34毫莫耳)在三氟乙酸(2毫升)和DCM(5毫升)中攪拌2小時。將反應混合物蒸發，然後與DCM和在MeOH中之20%氨共蒸發(x5)。藉由急驟層析法(在DCM中的10%MeOH)純化粗製產物以產生呈黃色油之標題化合物(225毫克，94%)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=2.20-2.39(m，3H)，2.48-2.59(m，1H)，2.76(s，3H)，3.83(br s，1H)，4.38(br s，1H)，7.42(d，1H)，8.16(s，1H)，8.20(s，1H)。
LCMS：1.26min(100%)，m/z=179.1[M+H]+
製備10b：將(S)-菸鹼(54毫升，336.2毫莫耳)和4,4'-二-第三丁基-2,2'-聯吡啶(5.41克，20.2毫莫耳)陸續添加至聯硼酸頻那醇酯(bis(pinacolato)diboron)(59.8克，235.5毫莫耳)在1,4-二噁烷(218毫升)中的溶液。將所產生的溶液在真空下於室溫脫氣15至20分鐘且然後釋放於氮。然後將該步驟重複兩次以上。
將[Ir(cod)(OMe)]2(6.7克，10.1毫莫耳)進料至反應容器中且將反應混合物在真空下於室溫脫氣5分鐘且然後釋放於氮。然後將該步驟重複兩次以上。
將所產生的溶液在85℃下加熱16小時，之後分析指示完全反應。將反應混合物冷卻至室溫並在減壓下於50至55℃濃縮至乾。將所產生的橙色殘餘物溶解在四氫呋喃(740毫升)中並將溶液冷卻至介於0和5℃之間。將乙酸(52.1毫升，908.8毫莫耳)進料至容器，接著慢慢添加過氧化氫溶液(30%，43.1毫升，454.4毫莫耳)，維持溫度介於0和10℃之間。將所產生的混合物在室溫下攪拌16小時，之後分析指示完全反應。
然後反應混合物冷卻至介於0和5℃之間，和藉由添加偏亞硫酸氫鈉水溶液(30%，50毫升)停止反應。藉由添加濃氫氧化銨溶液(130毫升)調整所產生的混合物之pH。分離所產生的二相混合物和用四氫呋喃(300毫升)再萃取水層。濃縮合併之有機層以產生呈橙色膠之粗製化合物。此以管柱層析在矽凝膠(在DCM中的MeOH，5至20%)上純化以除去大多數的雜質，接著另外的管柱層析(100% THF)以除去異構物雜質。單離呈黃色固體之純5-羥菸鹼(26克，48%產率)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.70-2.05(m，4H)，2.21(s，3H)，2.31(m，1H)，3.11(t，1H)，3.25(m，1H)，7.32(d，1H)，8.01(s，1H)，8.05(s，1H)。
製備11：2-(5-(1-甲基吡咯啶-2-基)吡啶-3-基氧基)乙基胺甲酸(S)-第三-丁酯
(S)-5-(1-甲基吡咯啶-2-基)吡啶-3-醇(製備10)(175毫克，0.98毫莫耳)、2-溴乙基胺甲酸第三-丁酯(550毫克，2.45毫莫耳)和碳酸鉀(676毫克，4.9毫莫耳)在DMF(7毫升)中於90℃下加熱16小時。將反應混合物分溶在乙酸乙酯和水之間。將水層用乙酸乙酯萃取，經過MgSO4乾燥和蒸發。藉由急驟層析法(在DCM中的5%→10% MeOH)純化粗製產物以產生呈黃色油之標題化合物(108毫克，34%)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.42(s，9H)，1.70-2.00(m，3H)，2.17(s，3H)，2.09(2.20(m，1H)，2.20-2.30(q，1H)，3.15-3.26(m，2H)，3.45(t，2H)，4.08(t，2H)，7.43(d，1H)，8.07(s，1H)，8.13(s，1H)。
LCMS：2.62min(100%)，m/z=322.15[M+H]+
製備12：(S)-2-(5-(1-甲基吡咯啶-2-基)吡啶-3-基氧基)乙胺
製備12a：(2-(5-(1-甲基吡咯啶-2-基)吡啶-3-基氧基)乙基胺甲酸S)-第三-丁酯(製備11)(105毫克，0.33毫莫耳)在三氟乙酸(1毫升)和DCM(5毫升)中攪拌1.5h。將反應混合物蒸發，然後與DCM(x5)和在MeOH中之20%氨共蒸發。藉由急驟層析法(在DCM中的5%[在MeOH中之20%氨])純化粗製產物以產生呈黃色油之標題化合物(62毫克，85%)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.70-2.01(m，3H)，2.17(s，3H)，2.18-2.30(m，1H)，2.30-2.40(m，1H)，3.03(t，2H)，3.14-3.28(m，2H)，4.08(t，2H)，7.44(d，1H)，8.08(s，1H)，8.16(s，1H)。
LCMS：1.87min(100%)，m/z=222.12[M+H]+
製備12b：將甲醇鉀(3.37克，46.2毫莫耳)，在甲醇(40毫升)中，進料至5-羥菸鹼(製備10b)(8.0克，44.0毫莫耳)在甲醇(40毫升)中的溶液，在介於0和5℃下。將所產生的混合物攪拌90分鐘且然後在減壓下於45℃濃縮至乾。
將在二甲基甲醯胺(80毫升)中之Boc-1-胺基-2-溴乙烷(14.8克，66.0毫莫耳)在氮氣下加熱至50℃，此時將先前製備之5-羥菸鹼的鉀鹽進料至容器，緊隨其後加入碳酸鉀(6.7克，48.4毫莫耳)。
將所產生的溶液在85℃下加熱4小時，然後冷卻至室溫。其在減壓下於50℃濃縮且所產生的橙色混合物在1,4-二噁烷(50毫升)中攪拌15分鐘。然後將溶液過濾且將液體冷卻至介於0和5℃之間，然後用在1,4-二噁烷中之4M HCl(65毫升)酸化。混合物在減壓下於50℃濃縮且將所產生的殘餘物溶解在四氫呋喃(30毫升)中。此混合物然後冷卻至介於0和5℃之間，並用氫氧化鈉溶液(10M，45毫升)調整pH。將所產生的二相混合物的層分離且用四氫呋喃(2×50毫升)再萃取水層。濃縮合併之有機層以產生呈紅色油之粗製化合物。將粗製產物溶解在DCM中並攪拌10分鐘，然後過濾及將液體裝載在矽石管柱上並用在乙酸乙酯中之5至30%甲醇(包含20%氫氧化銨)溶析純化。獲得呈黃色油之標題化合物，7.15克(73%產率)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.65-1.80(m，3H)，1.85(m，1H)，1.95(m，1H)，2.19(s，3H)，2.21(m，1H)，2.35(q，1H)，3.12(m，3H)，3.28(t，1H)，4.08(t，2H)，7.28(s，1H)，8.15(s，1H)，8.23(s，1H)。
製備13：{反-4-[(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}丙基)胺甲醯基]環己基}胺甲酸第三-丁酯
將3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}丙-1-胺(製備4)(100毫克，0.45毫莫耳)在2-甲基四氫呋喃(2毫升)中的溶液用反-4-第三-丁氧羰基-環己烷羧酸(132毫克，0.502毫莫耳)接著T3P(580微升，0.91毫莫耳)和然後Et3N(118微升，0.91毫莫耳)處理並攪拌。攪拌3小時之後，用T3P(240微升，0.38毫莫耳)處理。攪拌18小時之後，在真空下濃縮溶液並將殘餘物溶解在MeOH中且施加至SCX-2筒，其用MeOH接著在MeOH中之氨(~2M)溶析。將包含產物之部分在真空下濃縮並藉由管柱層析在矽凝膠上用EtOAc：MeOH：NH3(梯度從1：0：0至90：10：1)溶析純化殘餘物以產生呈膠之標題化合物(130毫克，64%)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.04-1.14(m，2H)，1.42(s，9H)，1.48-1.59(m，2H)，1.65-1.74(m，H)，1.79-2.02(m，7H)，2.05-2.09(brm，2H)，2.13-2.22(m，4H)，2.26-2.33(m，H)，2.60-2.64(t，2H)，3.04-3.08(t，H)，3.20-3.30(m，3H)，3.40(brm，H)，4.39(brm，H)5.56(brt，H)，7.50(t，H)，8.30-8.31(d，H)，8.34-8.35(d，H)。
MS，m/z=568ES+[M+H]+，567Cl[M+H]+
製備14：(19-{5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}-15-側氧-3,6,9,12-四氧雜-16-氮雜十九-1-基)胺甲酸第三-丁酯
標題化合物係藉由上述製備13之一般方法，使用3-(2-{2-[2-(2-第三-丁氧羰胺基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸替代反-4-第三-丁氧羰基-環己烷羧酸，以產生淡黃色膠(180毫克，70%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.41(s，9H)，1.65-1.76(m，H)，1.78-1.86(m，3H)，1.88-2.01(m，H)，2.13-2.21(m，4H)，2.25-2.32(m，H)，2.44-2.47(t，2H)，2.61-2.65(t，2H)，3.03-3.07(t，H)，3.19-3.29(m，6H)，3.49-3.52(t，2H)，3.57-3.62(m，11H)，3.70-3.73(t，2H)，5.21(brm，H)，6.66(brm，H)，7.51(t，H)，8.30-8.31(d，H)，8.33(d，H)。
MS，m/z=445ES+[M+H]+，445 Cl[M+H]+
製備15：{2-[(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}丙基)胺基]-2-側氧乙基}胺甲酸第三-丁酯
標題化合物係藉由上述製備13之一般方法，使用第三-丁氧羰胺基-乙酸替代反-4-第三-丁氧羰基-環己烷羧酸，以產生淡黃色膠(133毫克，77%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.45(s，9H)，1.66-1.77(m，H)，1.79-1.90(m，3H)，1.91-2.02(m，H)，2.14-2.23(m，4H)，2.27-2.34(q，H)，2.62-2.66(m，2H)，3.04-3.09(t，H)，3.21-3.26(m，H)，3.28-3.34(m，2H)，3.75-3.76(d，2H)，5.21(brm，H)，6.29(brm，H)，7.52(t，H)，8.31-8.32(d，H)，8.34-8.35(d，H)。
MS，m/z=377ES+[M+H]+，377Cl[M+H]+
製備16：{3-[(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}丙基)胺基]-3-側氧丙基}胺甲酸第三-丁酯
標題化合物係藉由上述製備13之一般方法，使用第三-丁氧羰胺基-丙酸替代反-4-第三-丁氧羰基-環己烷羧酸，以產生淡黃色膠(130毫克，73%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.41(s，9H)，1.67-1.75(m，H)，1.79-1.88(m，3H)，1.91-2.00(m，H)，2.14- 2.23(m，4H)，2.27-2.33(q，H)，2.37-2.40(t，2H)，2.62-2.66(m，2H)，3.04-3.08(t，H)，3.20-3.30(m，3H)，3.37-3.41(q，2H)，5.26(brm，H)，6.00(brm，H)，7.52(t，H)，8.31-8.32(d，H)，8.34(d，H)。
MS，m/z=391ES+[M+H]+，391Cl[M+H]+
製備17：{4-[(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}丙基)胺基]-4-側氧丁基}胺甲酸第三-丁酯
標題化合物係藉由上述製備13之一般方法，使用第三-丁氧羰胺基-丁酸替代反-4-第三-丁氧羰基-環己烷羧酸，以產生淡黃色膠(140毫克，76%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.40(s，9H)，1.64-1.72(m，H)，1.74-1.87(m，5H)，1.87-1.89(m，H)，2.12-2.20(m，6H)，2.24-2.31(q，H)，2.62-2.66(m，2H)，3.02-3.06(t，H)，3.11-3.16(q，2H)，3.18-3.29(m，3H)，4.91(brm，H)，6.57(brm，H)，7.51(t，H)，8.30(d，H)，8.32(d，H)。
MS，m/z=405ES+[M+H]+，405Cl[M+H]+
製備18：[2-(2-{2-[(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}丙基)胺基]-2-側氧乙氧基}乙氧基)乙基]胺甲酸第三-丁酯
標題化合物係藉由上述製備13之一般方法，使用[2-(2-第三-丁氧羰胺基-乙氧基)-乙氧基]-乙酸(如Angew.Chemie Int.Ed.(2006),45(30),4936-4940中所述製備)替代反-4-第三-丁氧羰基-環己烷羧酸，以產生無色膠(60毫克，28%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.42(s，9H)，1.67-1.98(m，7H)，2.14-2.23(m，4H)，2.27-2.33(q，H)，2.64-2.68(m，2H)，3.04-3.09(t，H)，3.21-3.26(m，H)，3.29-3.37(m，3H)，3.53-3.56(t，2H)，3.62-3.68(m，4H)，3.98(s，2H)，4.99(brm，H)，6.88(brm，H)，7.53(t，H)，8.33(d，H)，8.35(d，H)。
MS，m/z=465ES+[M+H]+，465Cl[M+H]+
製備19：(2-{2-[(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}丙基)胺基]-2-側氧乙氧基}乙基)胺甲酸第三-丁酯
標題化合物係藉由上述製備13之一般方法，使用(2-第三-丁氧羰胺基-乙氧基)-乙酸替代反-4-第三-丁氧羰基-環己烷羧酸，以產生淡黃色膠(105毫克，55%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.43(s，9H)，2.16-2.24(m，5H)，2.31(q，4H)，2.66(t，1H)，3.07(t，2H)，3.24(t，1H)，m，1H)，3.32-3.37(m，4H)，3.56(t，2H)，3.94(s，2H)，4.98(br，1H)，6.69(br，1H)，7.54(t，1H)，8.33-8.36(m，2H)。
MS，m/z=421ES+[M+H]+
製備20：{5-[(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}丙基)胺基]-5-側氧戊基}胺甲酸第三-丁酯
標題化合物係藉由上述製備13之一般方法，使用第三-丁氧羰胺基-戊酸替代反-4-第三-丁氧羰基-環己烷羧酸，以產生淡黃色膠(191毫克，64%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.43(s，9H)，1.47- 1.53(m，2H)，1.63-1.75(m，3H)，1.80-1.89(m，4H)，1.94-2.05(m，H)，2.16(s，3H)，2.16-2.23(m，2H)，2.31(q，H)，2.65(t，2H)，3.07(t，H)，3.14-31.6(m，2H)，3.22-3.30(m，3H)，5.30(br，H)，5.80(br，H)，7.53(t，H)，8.33(m，H)，8.35(m，H)。
MS m/z=420ES+[M+H]+
製備21：{6-[(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}丙基)胺基]-6-側氧己基}胺甲酸第三-丁酯
標題化合物係藉由上述製備13之一般方法，使用第三-丁氧羰胺基-己酸替代反-4-第三-丁氧羰基-環己烷羧酸，以產生淡黃色膠(197毫克，50%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.32-1.37(m，2H)，1.43(s，9H)，1.46-1.54(m，2H)，1.61-1.69(m，2H)，1.69-1.77(m，H)，1.81-1.89(m，5H)，1.95-2.00(m，H)，2.14-2.22((m，5H)，2.30(q，H)，2.65(t，2H)，3.05-3.13(m，3H)，3.22-3.33(m，3H)，4.62(br，H)，5.63(br，H)，7.53(t，H)，8.33(m，H)，8.35(m，H)。
MS m/z=434ES+[M+H]+
製備22：{7-[(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}丙基)胺基]-7-側氧庚基}胺甲酸第三-丁酯
標題化合物係藉由上述製備13之一般方法，使用第三-丁氧羰胺基-庚酸替代反-4-第三-丁氧羰基-環己烷羧酸，以產生淡黃色膠(204毫克，55%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.31-1.35(m，4H)，1.44(s，9H)，1.44-1.49(m，2H)，1.60-1.67(m，2H)，1.70-1.77(m，H)，1.81-1.89(m，5H)，1.94-1.99(m，H)，2.13-2.23(m，5H)，2.30(q，H)，2.65(t，2H)，3.05-3.12(m，3H)，3.22-3.33(m，3H)，4.37(br，H)，5.68(br，H)，7.53(t，H)，8.33(m，H)，8.35(m，H)。
MS m/z=448ES+[M+H]+
製備23：(22-{5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}-15,18-二側氧-4,7,10-三氧雜-14,19-二氮雜二十二烷-1-基)胺甲酸第三-丁酯
標題化合物係藉由上述製備13之一般方法，使用N-(3-{2-[2-(3-第三-丁氧羰胺基-丙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙基)-丁醯胺酸替代反-4-第三-丁氧羰基-環己烷羧酸，以產生淡黃色膠(284毫克，53%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.43(s，9H)，1.71-1.77(m，9H)，1.87-2.02(m，4H)，2.16-2.22(m，4H)，2.30(q，H)，2.63(t，2H)，3.06(t，H)，3.19-3.28(m，5H)，3.33-3.37(m，2H)，3.51-3.65(m，12H)，5.09(br，H)，6.64(br，H)，7.52(t，H)，8.32(m，H)，8.35(m，H)。
MS m/z=622ES+[M+H]+
製備24：反-4-胺基-N-(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}丙基)環己烷甲醯胺
將{反-4-[(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}丙基)胺甲醯基]環己基}胺甲酸第三-丁酯(製備13)(130毫克，0.29毫莫耳)在DCM(3毫升)中的溶液用三氟乙酸(1毫升)處理。將所產生的溶液在周圍溫度下攪拌2小時， 之後使其在真空中濃縮。將殘餘物溶解在MeOH中和施用於SCX-2筒中並用MeOH接著在MeOH中之氨(2M)溶析。將包含產物之部分在真空下濃縮以產生呈無色膠之標題化合物(98毫克，97%)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.02-1.12(m，2H)，1.45-1.76(m，5H)，1.77-2.03(m，9H)，2.12-2.21(m，4H)，2.25-2.32(q，H)，2.59-2.68(m，3H)，3.02-3.06(t，H)，3.19-3.29(m，3H)，5.66(bt，H)，7.49(t，H)，8.29(d，H)，8.33(d，H)。
MS，m/z=345及367ES+[M+H]+及[M+Na]+，345Cl[M+H]+
製備25：1-胺基-N-(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}丙基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺
標題化合物係藉由上述製備24之一般方法，從製備14開始，以產生無色膠(149毫克，100%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.64-1.75(m，H)，1.77-1.99(m，7H)，2.12-2.21(m，4H)，2.25-2.32(q，H)，2.44-2.46(t，2H)，2.60-2.64(t，2H)，2.82-2.85(t，2H)，3.02- 3.06(t，H)，3.19-3.29(m，3H)，3.47-3.50(t，2H)，3.59-3.61(m，11H)，3.69-3.72(t，2H)，6.76(brm，H)，7.50(t，H)，8.30-8.31(d，H)，8.33(d，H)。
MS，m/z=467及489ES+[M+H]+及[M+Na]+，467Cl[M+H]+
製備26：N-(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}丙基)甘胺醯胺
標題化合物係藉由上述製備24之一般方法，從製備15開始，以產生無色膠(99毫克，100%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.66-2.01(m，7H)，2.13-2.22(m，4H)，2.27-2.33(q，H)，2.62-2.66(t，2H)，3.05-3.09(t，H)，3.21-3.26(t，H)，3.29-3.34(m，4H)，7.35(brm，H)，7.53(t，H)，8.32(d，H)，8.33-8.34(d，H)。
MS，m/z=277及291ES+[M+H]+及[M+Na]+，277Cl[M+H]+
製備27：N-(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}丙 基)-β-丙胺醯胺
標題化合物係藉由上述製備24之一般方法，從製備16開始，以產生無色膠(99毫克，100%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.65-1.76(m，H)，1.77-2.00(m，6H)，2.13-2.22(m，4H)，2.26-2.32(m，3H)，2.62-2.66(t，2H)，2.98-3.01(t，2H)，3.03-3.08(t，2H)，3.20-3.31(m，3H)，7.26(brm，H)，7.51(t，H)，8.31-8.32(d，H)，8.33-8.34(d，H)。
MS，m/z=291及313ES+[M+H]+及[M+Na]+，291Cl[M+H]+
製備28：4-胺基-N-(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}丙基)丁醯胺
標題化合物係藉由上述製備24之一般方法，從製備 17開始，以產生無色膠(104毫克，99%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.65-2.00(m，9H)，2.13-2.32(m，7H)，2.61-2.65(t，2H)，2.72-2.76(t，2H)，3.03-3.07(t，H)，3.20-3.30(m，3H)，6.22(brm，H)，7.50(t，H)，8.30-8.31(d，H)，8.33-8.34(d，H)。
MS，m/z=305及327ES+[M+H]+及[M+Na]+，305Cl[M+H]+
製備29：2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]-N-(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}丙基)乙醯胺
標題化合物係藉由上述製備24之一般方法，從製備18開始，以產生無色膠(49毫克，100%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.67-1.78(m，H)，1.79-2.02(m，4H)，2.15-2.34(m，7H)，2.64-2.67(t，2H)，2.88-2.91(t，2H)，3.06-3.10(t，1H)，3.22-3.27(t，1H)，3.31-3.36(q，2H)，3.54-3.57(t，2H)，3.63-3.70(m，4H)，3.99(s，2H)，7.02(dm，2H)，7.54(t，H)，8.33-8.34(d，H)，8.35(d，H)。
MS，m/z=365及387ES+[M+H]+及[M+Na]+，365Cl[M+H]+
製備30：2-(2-胺基乙氧基)-N-(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}丙基)乙醯胺
標題化合物係藉由上述製備24之一般方法，從製備19開始，產生淡黃色膠(87毫克，100%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.70-1.97(m，6H)，2.17(s，3H)，2.18-2.23(m，H)，2.31(q，H)，2.67(t，2H)，2.94(m，2H)，3.08(t，H)，3.26(m，H)，3.35(q，2H)，3.56(t，2H)，3.98(s，2H)，7.35(br，H)，7.55(t，H)，8.34(d，H)，8.35(d，H)。
MS，m/z=321ES+[M+H]+
製備31 5-胺基-N-(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}丙基)戊醯胺
標題化合物係藉由上述製備24之一般方法，從製備20開始，產生淡黃色膠(78毫克，54%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.46-1.52(m，H)，1.64-1.72(m，3H)，1.81-2.02(m，7H)，2.15-2.24(m，5H)，2.31(q，H)，2.65(t，2H)，2.72(t，H)，3.07(t，H)，3.20-3.32(m，4H)，5.79(br，H)，6.25(br，H)，7.53(s，H)，8.33(m，H)，8.35(m，H)。
MS，m/z=319ES+[M+H]+
製備32：6-胺基-N-(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}丙基)已醯胺
標題化合物係藉由上述製備24之一般方法，從製備21開始，產生淡黃色膠(70毫克，46%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.32-1.41(m，2H)，1.50-1.57(m，H)，1.59-1.70(m，4H)，1.81-1.85(m，3H)，1.87-2.01(m，2H)，2.15(s，3H)，2.15-23(m，3H)，2.30(q，H)，2.63(t，2H)，2.765(t，H)，3.06(t，H)，3.19-2.29(m，3H)。
MS，m/z=333ES+[M+H]+
製備33：7-胺基-N-(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}丙基)庚醯胺
標題化合物係藉由上述製備24之一般方法，從製備22開始，產生淡黃色膠(59毫克，37%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.32-1.29(m，3H)，1.46-1.50(m，H)，1.61-1.66(m，2H)，1.70-1.74(m，H)，1.82-1.89(m，3H)，1.94-2.04(m，3H)，2.17(s，3H)，2.15-2.23(m，3H)，2.32(q，H)，2.65(t，2H)，2.71(t，H)，3.08(t，H)，3.18-3.33(m，4H)，5.58(br，H)，5.65(br，H)，7.53(d，H)，8.34(m，H)，8.36(m，H)。
MS，m/z=347ES+[M+H]+
製備34：N-(3-{2-[2-(3-胺基丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基)-N'-(3-{5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}丙基)丁二醯胺
標題化合物係藉由上述製備24之一般方法，從製備23開始，產生淡黃色膠(120毫克，51%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.71-1.87(m，6H)，1.90-2.02(m，H)，2.16(s，3H)，2.17-2.24(m，H)，2.30(q，H)，2.40-2.51(m，6H)，2.61-2.67(m，2H)，2.87(t，2H)，3.22-3.29(m，3H)，3.31(q，2H)，3.51-3.65(m，12H)，6.85(br，H)，6.95(br，H)，7.53(s，H)，8.33(m，H)，8.35(m，H)。
MS，m/z=522ES+[M+H]+
製備35：(反-4-{[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]胺甲醯基}環己基)胺甲酸第三-丁酯
將2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙胺(製備12)(55毫克，0.25毫莫耳)在2-甲基四氫呋喃(2毫升)中的溶液用反-4-第三-丁氧羰基-環己烷羧酸(91毫克，0.373毫莫耳)接者T3P(317微升，0.498毫莫耳)和Et3N(118微升，0.91毫莫耳)處理並攪拌。攪拌3小時之後，將溶液用T3P(69微升，0.498毫莫耳)處理。攪拌18小時之後在真空下濃縮溶液並將殘餘物溶解在MeOH中且施加於SCX-2筒，其以甲醇接著在MeOH中之氨(~2M)用溶析。將包含產物之部分在真空下濃縮且藉由在矽凝膠 上用EtOAc：MeOH：NH3(梯度從1：0：0至90：10：1)溶析之管柱層析法純化殘餘物。然後將此材料溶解在DCM中並用PS-異氰酸酯樹脂處理3小時，然後過濾且在真空中蒸發以產生呈淡黃色膠之標題化合物(35毫克，35%)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.14-1.25(m，2H)，1.42(d，9H)，1.47-1.58(m，2H)，1.75-1.85(m，3H)，1.87-2.06(m，4H)，2.09-2.18(m，1H)，2.21(s，3H)，2.23-2.32(m，1H)，2.38-2.45(q，1H)，3.24-3.29(m，3H)，3.55-3.58(t，2H)，4.11-4.14(t，2H)，7.45-7.43(m，1H)，8.10(d，1H)，8.15-8.16(d，1H)。
MS m/z=447ES+[M+H]+，447Cl[M+H]+
製備36：{2-[2-(2-{[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]胺基}-2-側氧乙氧基)乙氧基]乙基}胺甲酸第三-丁酯
標題化合物係藉由上述製備35之一般方法，使用[2-(2-第三-丁氧羰胺基-乙氧基)-乙氧基]-乙酸(如Angew.Chemie Int.Ed.(2006),45(30),4936-4940中所述製備)替 代反-4-第三-丁氧羰基-環己烷羧酸，以產生淡黃色膠(50毫克，43%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.41(s，9H)，1.72-1.81(m，1H)，1.84-2.01(m，2H)，2.18(s，3H)，2.21-2.30(m，1H)，2.33-2.40(q，1H)，3.16-3.26(m，4H)，3.50-3.52(t，2H)，3.62-3.69(m，6H)，4.01(s，2H)，4.16-4.19(t，2H)，7.44-7.45(m，1H)，8.10(d，1H)，8.15-8.16(d，1H)。
MS m/z=467ES+[M+H]+，467Cl[M+H]+
製備37：(2-{[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]胺基}-2-側氧乙基)胺甲酸第三-丁酯
標題化合物係藉由上述製備35之一般方法，使用第三-丁氧羰胺基-乙酸替代反-4-第三-丁氧羰基-環己烷羧酸，以產生淡黃色膠(50毫克，53%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.42(s，9H)，1.87-2.09(m，3H)，2.30-2.38(m，4H)，2.60-2.67(q，1H)，3.37-3.43(brt，1H)，3.52-3.56(brt，1H)，3.61-3.64(t，2H)，3.70(s，2H)，4.14-4.17(t，2H)，7.49-7.50(m， 1H)，8.14-8.15(d，1H)，8.20-8.21(d，1H)。
MS m/z=379ES+[M+H]+，379Cl[M+H]+
製備38：(3-{[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]胺基}-3-側氧丙基)胺甲酸第三-丁酯
標題化合物係藉由上述製備35之一般方法，使用第三-丁氧羰胺基-丙酸替代反-4-第三-丁氧羰基-環己烷羧酸，以產生淡黃色膠(70毫克，72%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.39(s，9H)，1.75-1.84(m，1H)，1.87-2.04(m，2H)，2.21(s，3H)，2.23-2.31(m，1H)，2.37-2.47(m，3H)，3.24-3.33(m，4H)，3.58-3.61(t，2H)，4.12-4.15(t，2H)，7.44-7.45(m，1H)，8.10-8.11(d，1H)，8.16-8.17(d，1H)。
MS m/z=393ES+[M+H]+，393Cl[M+H]+
製備39：(4-{[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]胺基}-4-側氧丁基)胺甲酸第三-丁酯
標題化合物係藉由上述製備35之一般方法，使用第三-丁氧羰胺基-丁酸替代反-4-第三-丁氧羰基-環己烷羧酸，以產生淡黃色膠(43毫克，42%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.41(s，9H)，1.70-1.78(m，2H)，1.96-2.12(m，3H)，2.21-2.24(t，2H)，2.33-2.42(m，4H)，2.69-2.76(q，1H)，3.02-3.07(m，2H)，3.43-3.49(brt，1H)，3.58-3.61(t，2H)，3.64-3.69(brt，1H)，4.15-4.18(t，2H)，7.51-7.52(m，1H)，8.16-8.17(d，1H)，8.23-8.24(d，1H)。
MS m/z=407ES+[M+H]+，407Cl[M+H]+
製備40：(5-{[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]胺基}-5-側氧戊基)胺甲酸第三-丁酯
標題化合物係藉由上述製備35之一般方法，使用第三-丁氧羰胺基-戊酸替代反-4-第三-丁氧羰基-環己烷羧酸，以產生淡黃色膠(49毫克，47%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.41-1.50(m，11H)，1.57-1.65(m，2H)，2.01-2.18(m，3H)，2.20-2.24(t，2H)，2.37-2.44(m，1H)，2.46(s，3H)，2.78-2.85(q，1H)，3.00-3.05(m，2H)，3.49-3.55(m，1H)，3.58-3.61(t，2H)，3.76-3.80(brt，1H)，4.15-4.16(t，2H)，7.55-7.56(m，1H)，8.18-8.19(d，1H)，8.25-8.26(d，1H)。
MS m/z=421ES+[M+H]+，421Cl[M+H]+
製備41：(6-{[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]胺基}-6-側氧己基)胺甲酸第三-丁酯
標題化合物係藉由上述製備35之一般方法，使用第三-丁氧羰胺基-己酸替代反-4-第三-丁氧羰基-環己烷羧酸，以產生淡黃色膠(65毫克，60%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.29-1.35(m，2H)，1.42-1.49(m，11H)，1.57-1.65(m，2H)，2.05-2.15(m，3H)，2.19-2.23(t，2H)，2.38-2.46(m，1H)，2.48(s，3H)，2.82-2.89(m，1H)，2.96-3.00(t，2H)，3.53-3.61(m，3H)，3.62-3.66(brt，1H)，4.15-4.18(t，2H)，7.55-7.56(m，1H)，8.19-8.20(d，1H)，8.26-8.27(d，1H)。
MS m/z=435ES+[M+H]+，435Cl[M+H]+
製備42：(7-{[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]胺基}-7-側氧庚基)胺甲酸第三-丁酯
標題化合物係藉由上述製備35之一般方法，使用第三-丁氧羰胺基-庚酸替代反-4-第三-丁氧羰基-環己烷羧酸，以產生淡黃色膠(67毫克，60%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.28-1.34(m，4H)，1.39-1.45(m，11H)，1.55-1.64(m，2H)，2.03-2.15(m，3H)，2.19-2.22(t，2H)，2.38-2.46(m，1H)，2.48(s，3H)，2.81-2.88(m，1H)，2.97-3.00(t，2H)，3.51-3.57(m，1H)，3.58-3.61(t，2H)，3.80-3.84(m，1H)，4.15-4.18(t，2H)，7.55-7.57(m，1H)，8.19(d，1H)，8.16(d，1H)。
MS m/z=449ES+[M+H]+，449Cl[M+H]+
製備43：[2-(2-{[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]胺基}-2-側氧乙氧基)乙基]胺甲酸第三-丁酯
標題化合物係藉由上述製備35之一般方法，使用(2-第三-丁氧羰胺基-乙氧基)-乙酸替代反-4-第三-丁氧羰基-環己烷羧酸，以產生淡黃色膠(42毫克，42%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.42(s，9H)，2.15-2.32(m，3H)，2.43-2.52(s，1H)，2.61(s，3H)，3.03-3.10(m，1H)，3.24-3.29(m，2H)，3.52-3.55(t，2H)，3.66-3.69(m，3H)，3.98(s，2H)，4.06-4.13(m，1H)，4.21-4.24(t，2H)，7.62-7.63(m，1H)，8.24(d，1H)，8.32-8.33(d，1H)。
MS m/z=423ES+[M+H]+，423Cl[M+H]+
製備44：[21-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)-15,18-二側氧-4,7,10-三氧雜-14,19-二氮雜二十一碳-1-基]胺甲酸第三-丁酯
標題化合物係藉由上述製備35之一般方法，使用N-(3-{2-[2-(3-第三-丁氧羰胺基-丙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-丙 基)-丁醯胺酸替代反-4-第三-丁氧羰基-環己烷羧酸，以產生橙色膠(80毫克，51%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.42(s，9H)，1.68-1.76(m，4H)，1.97-2.15(m，3H)，2.35-2.52(m，9H)，2.71-2.80(m，1H)，3.09-3.14(m，2H)，3.20-3.26(m，2H)，3.48-3.51(t，5H)，3.55-3.64(m，10H)，3.66-3.76(m，1H)，4.14-4.17(t，2H)，7.53-7.54(m，1H)，8.17-8.18(d，1H)，8.24-8.25(d，1H)。
MS m/z=625ES+[M+H]+，625Cl[M+H]+
製備45：[18-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)-15-側氧-3,6,9,12-四氧雜-16-氮雜十八-1-基]胺甲酸第三-丁酯
標題化合物係藉由上述製備35之一般方法，使用3-(2-{2-[2-(2-第三-丁氧羰胺基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酸替代反-4-第三-丁氧羰基-環己烷羧酸，以產生橙色膠(80毫克，56%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.42(s，9H)，2.03-2.20(m，3H)，2.38-2.50(m，6H)，2.85-2.91(m，1H)，3.19-3.22(m，2H)，3.47-3.50(t，2H)，3.53-3.63(m， 15H)，3.71-3.74(t，2H)，3.84-3.92(m，1H)，4.17-4.19(t，2H)，7.58-7.59(m，1H)，8.20-8.21(d，1H)，8.28(d，1H)。
MS m/z=570ES+[M+H]+，570Cl[M+H]+
製備46：反-4-胺基-N-[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]環己烷甲醯胺
將(反-4-{[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]胺甲醯基}環己基)胺甲酸第三-丁酯(製備35)(35毫克，0.078毫莫耳)在DCM(3毫升)中的溶液用三氟乙酸(1毫升)處理。將所產生的溶液在周圍溫度下攪拌過夜，之後在真空下將其濃縮。將殘餘物溶解在MeOH中且施用於SCX-2筒並用MeOH接著在MeOH中之氨(2M)溶析。將包含產物之部分在真空下濃縮以產生呈橙色膠之標題化合物(17毫克，62%)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.16-1.26(m，2H)，1.47-1.57(m，2H)，1.71-2.01(m，8H)，2.13-2.30(m，4H)，2.33-2.40(q，1H)，2.68-2.76(m，1H)，3.18-3.26(m，2H)，3.56-3.59(t，1H)，4.12-4.14(t，2H)，7.43-7.44(m，1H)，8.09-8.10(d，1H)，8.14-8.15(d，1H)。
MS m/z=347ES+[M+H]+，347Cl[M+H]+
製備47：2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]-N-[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]乙醯胺
標題化合物係藉由上述製備46之一般方法，從製備36開始，以產生橙色膠(37毫克，95%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.72-1.81(m，1H)，1.84-2.03(m，2H)，2.18(s，3H)，2.22-2.30(m，1H)，2.34-2.41(q，1H)，2.83-2.86(t，2H)，3.19-3.26(m，2H)，3.54-3.57(t，2H)，3.65-3.71(m，6H)，4.02(s，2H)，4.16-4.19(t，2H)，7.44-7.45(m，1H)，8.10-8.11(d，1H)，8.15(d，1H)。
MS m/z=367ES+[M+H]+，367Cl[M+H]+
製備48：N-[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]甘胺醯胺
標題化合物係藉由上述製備46之一般方法，從製備37開始，以產生橙色膠(37毫克，100%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.74-1.84(m，1H)，1.87-2.05(m，2H)，2.20(s，3H)，2.23-2.32(m，1H)，2.38-2.44(q，1H)，3.23-3.28(m，2H)，3.37(s，2H)，3.63-3.66(t，2H)，4.15-4.17(t，2H)，7.45-7.47(m，1H)，8.10-8.11(d，1H)，8.15-8.16(d，1H)。
MS m/z=279ES+[M+H]+，279Cl[M+H]+
製備49：N-[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]-β-丙胺醯胺
標題化合物係藉由上述製備46之一般方法，從製備38開始，以產生橙色膠(52毫克，100%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.72-1.81(m，1H)，1.84-2.03(m，2H)，2.18(s，3H)，2.21-2.30(m，1H)，2.33- 2.44(m，3H)，2.93-2.96(t，2H)，3.16-3.26(m，2H)，3.60-3.62(t，2H)，4.13-4.16(t，2H)，7.43-7.44(m，1H)，8.10(d，1H)，8.14-8.15(d，1H)。
MS m/z=293ES+[M+H]+，293Cl[M+H]+
製備50：4-胺基-N-[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]丁醯胺
標題化合物係藉由上述製備46之一般方法，從製備39開始，以產生橙色膠(28毫克，88%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.73-1.82(m，3H)，1.84-2.03(m，2H)，2.18(s，3H)，2.21-2.30(m，3H)，2.33-2.40(q，1H)，2.68-2.72(t，2H)，3.18-3.26(m，2H)，3.58-3.61(t，2H)，4.12-4.15(t，2H)7.43-7.44(m，1H)，8.10(d，1H)，8.14-8.15(d，1H)。
MS m/z=307ES+[M+H]+，307Cl[M+H]+
製備51：5-胺基-N-[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]戊醯胺
標題化合物係藉由上述製備46之一般方法，從製備40開始，以產生橙色膠(30毫克，81%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.48-1.56(m，2H)，1.61-1.68(m，2H)，1.71-1.81(m，1H)，1.85-2.03(m，2H)，2.18(s，3H)，2.22-2.30(m，3H)，2.33-2.40(q，1H)，2.68-2.72(t，2H)，3.18-3.26(m，2H)，3.58-3.61(t，2H)，4.12-4.15(t，2H)，7.43-7.44(m，1H)，8.10(d，1H)，8.14-8.15(d，1H)。
MS m/z=321ES+[M+H]+，321Cl[M+H]+
製備52：6-胺基-N-[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]已醯胺
標題化合物係藉由上述製備46之一般方法，從製備41開始，以產生橙色膠(38毫克，76%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.31-1.39(m，2H)，1.48-1.55(m，2H)，1.59-1.66(m，2H)，1.72-1.81(m，1H)， 1.84-2.03(m，2H)，2.18(s，3H)，2.21-2.30(m，3H)，2.33-2.40(q，1H)，2.65-2.69(t，2H)，3.18-3.26(m，2H)，3.57-3.60(t，2H)，4.15-4.12(t，2H)，7.43-7.44(m，1H)，8.09-8.10(d，1H)，8.14-8.15(d，1H)。
MS m/z=335ES+[M+H]+，335Cl[M+H]+
製備53：7-胺基-N-[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]庚醯胺
標題化合物係藉由上述製備46之一般方法，從製備42開始，以產生橙色膠(37毫克，72%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.32-1.37(m，4H)，1.44-1.51(m，2H)，1.57-1.65(m，2H)，1.72-1.82(m，1H)，1.83-2.03(m，2H)，2.18-2.30(m，6H)，2.33-2.40(q，1H)，2.65-2.68(t，2H)，3.18-3.26(m，2H)，3.57-3.60(t，2H)，4.12-4.15(t，2H)，7.43-7.44(m，1H)，8.09-8.10(d，1H)，8.14-8.15(d，1H)。
MS m/z=349ES+[M+H]+，349Cl[M+H]+
製備54：2-(2-胺基乙氧基)-N-[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]乙醯胺
標題化合物係藉由上述製備46之一般方法，從製備43開始，以產生橙色膠(27毫克，84%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.72-1.82(m，1H)，1.84-2.03(m，2H)，2.18(s，3H)，2.22-2.30(m，1H)，2.34-2.40(q，1H)，2.86-2.89(t，2H)，3.18-3.26(m，2H)，3.55-3.58(t，2H)，3.66-3.68(t，2H)，4.00(s，2H)，4.16-4.19(t，2H)，7.44-7.45(m，1H)，8.10(d，1H)，8.15(d，1H)。
MS m/z=323ES+[M+H]+，323Cl[M+H]+
製備55：N-(3-{2-[2-(3-胺基丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基)-N'-[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]丁二醯胺
標題化合物係藉由上述製備46之一般方法，從製備44開始，以產生橙色膠(59毫克，88%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.70-1.80(m，5H)，1.86-2.03(m，2H)，2.18(s，3H)，2.21-2.30(m，1H)，2.33-2.40(q，1H)，2.44-2.52(m，4H)，2.76-2.80(t，2H)，3.18-3.26(m，4H)，3.48-3.51(t，2H)，3.55-3.63(m，12H)，4.11-4.14(t，2H)，7.43-7.44(m，1H)，8.10(d，1H)，8.15(d，1H)。
MS m/z=524ES+[M+H]+，524Cl[M+H]+
製備56：1-胺基-N-[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺
標題化合物係藉由上述製備46之一般方法，從製備45開始，以產生橙色膠(55毫克，85%)而製得。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ=1.71-1.81(m，1H)，1.84-2.03(m，2H)，2.18(s，3H)，2.22-2.30(m，1H)，2.33-2.40(q，1H)，2.45-2.48(t，2H)，2.78-2.80(t，2H)，3.18-3.25(m，2H)，3.50-3.53(t，2H)，3.58-3.62(m，14H)，3.71-3.74(t，2H)，4.13-4.15(t，2H)，7.44-7.45(m，1H)，8.10(d，1H)，8.15-8.16(d，1H)。
MS m/z=469ES+[M+H]+，469Cl[M+H]+
製備57：4-巰-N-[2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙基]丁醯胺。
將2-({5-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]吡啶-3-基}氧基)乙胺(製備12)(1100毫克，4.971毫莫耳)在水(10毫升)中的溶液用γ-硫代丁內酯(861微升，9.94毫莫耳)處理且將反應混合物熱至60℃過夜。然後在真空中將其蒸發而留下無色膠，其從MeOH預吸附到矽石上。然後將此在40克ISCO管柱上，用EtOAc至EtOAc：MeOH：NH3 80：20：1溶析來進行層析。在真空中蒸發適當部分以產生呈無色膠之標題化合物，690毫克。產率=43%。
1H NMR(400Mhz，CDCl3)δ=1.77-2.06(m，6H)，2.22-2.35(m，6H)，2.41-2.51(m，3H)，3.26-3.32(m，H)，3.58-3.61(t，2H)，4.13-4.15(t，2H)，7.45-7.47(m，H)，8.11-8.12(d，H)，8.17(d，H)。MS m/z=324ES+[M+H]+，322Cl-[M+H]-
實例 實例1. 使用下列步驟將製備4之半抗原偶合於白喉類毒素蛋白質。
a)獲得呈黃色油之半抗原並儲存在2-8℃下直到使用 當天(長達一個星期，較長的儲存係在-20℃)。以每毫升溶液50毫克半抗原將此油溶解在沒有Ca或Mg之Dulbeccos'磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)或去離子水中。結果為黃棕色懸浮液或溶液。
b)分別地，獲得濃白喉類毒素(DT)之等分試樣並使用凝膠過濾脫鹽管柱(Bio-Rad)，將DT之緩衝液改變成DPBS。來自管柱的析出液為4毫升溶液，當以使用牛血清白蛋白標準曲線之Bradford分析(Coomassie亮藍試劑，Pierce Chemical)測定時於約11毫克/毫升。此之等分試樣用另外的DPBS稀釋以產生4毫升溶液，於在DPBS中之5毫克/毫升蛋白質)。
c)使此DT之等分試樣與丁二酸酐反應以產生改性之丁二醯化白喉類毒素。4毫升DT在DPBS之等分試樣與80毫克呈固體之丁二酸酐合併，並在室溫下放在管輥上以提供輕輕搖動經歷3小時。應指出，使用此方法，終產物不是透明溶液。在3小時反應時間結束時，將等分試樣施加於凝膠過濾脫鹽管柱且溶析於DPBS，以除去未反應的小分子成分。此將試樣的體積總計增加至6毫升。
d)將28毫克的磺酸基-N-羥基丁二醯亞胺(s-NHS)，呈固體，加至6毫升丁二醯化DT等分試樣，並藉由反轉試管及溫和混合使s-NHS溶解。然後將28毫克的1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)加至混合物，呈固體，並藉由反轉試管及溫和混合來溶解。將反應混合物(丁二醯化DT/EDC/s-NHS)在室溫下培養10分鐘，添加 200微升的上述製備之半抗原溶液及使用Vortex將反應混合物略略攪拌以混合。
e)將混合物在室溫下在管輥上並輕輕搖動反應3至4小時。在反應時間結束時，將等分試樣施用於凝膠過濾脫鹽管柱且溶析於DPBS，以除去未反應的小分子成分。此將共軛體試樣的體積總計增加至8毫升。然後使用3k MWCO離心超過濾器(Millipore)將此8毫升析出液濃縮至約3.0-3.5毫升。
f)使用牛血清白蛋白標準品，使用Bradford(Pierce Coomassie亮藍試劑)分析檢測最終共軛體之蛋白質含量，和最終濃度測定為2.3毫克/毫升。使用紫外光譜法在250-270奈米區對正規化蛋白質含量之非共軛對照組分析共軛體之半抗原結合，且發現相較於原生類毒素，在此區有更強的抗體吸附(antibodiesorb)。也藉由SDS-PAGE電泳檢測共軛體和使用LAL分析檢測內毒素含量。最後，使用逆相HPLC水解和分析100微克之共軛體試樣以測定每個蛋白質分子中所結合之半抗原的數目。發現半抗原-DT共軛體每蛋白質單體具有19個半抗原。
g)最後將試樣通過0.22微米注射過濾器無菌過濾且在無菌條件下再分成0.5毫升等分試樣。這些無菌等分試樣分別儲存在-80℃直至運到在乾冰上的研究位置。
實例2. 使用上述實例1的一般方法將製備12之半抗原偶合於白喉類毒素蛋白質，具有下列改變：在步驟d)中，將186微升之半抗原溶液加至反應混合物；且在步驟 f)中，最終濃度測定為3.3毫克/毫升，且發現半抗原-DT共軛體每個蛋白質單體具有13個半抗原。
實例3. 使用上述實例1的一般方法將製備7之半抗原偶合於白喉類毒素蛋白質，在步驟c、e和f中具有下列改變。
在步驟c)中，將3毫升部分之等分試樣施加於凝膠過濾脫鹽管柱且溶析於DPBS，以除去未反應的小分子成分，藉此純化試樣之體積總計被增加至4毫升；步驟d)係如下進行：將80微升之半抗原溶液加至4毫升丁二醯化DT等分試樣，並輕輕反轉以混合。然後，將28毫克的磺酸基-N-羥基丁二醯亞胺(s-NHS)加至混合物，呈固體，並藉由反轉試管及溫和混合來溶解。最後，將28毫克的1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)加至混合物，呈固體，並藉由反轉試管及溫和混合來溶解。
在步驟e)中，使混合物反應2小時，溶析之後共軛體試樣之體積總計被增加至6毫升，和然後使用10k MWCO離心超過濾器(Millipore)將6毫升析出液濃縮至2.5-3.0毫升。
在步驟f)中，最終濃度測定為2.4毫克/毫升，且發現半抗原-DT共軛體每個蛋白質單體具有14.5個半抗原。
實例4. 使用上述實例1的一般方法將製備8之半抗原偶合於白喉類毒素蛋白質，具有下列改變：如下進行步驟d)：將120微升之半抗原溶液加至6毫升丁二醯化DT等分試樣。用Vortex將反應混合物略略攪拌。然後加28 毫克的磺酸基-N-羥基丁二醯亞胺(s-NHS)，呈固體，並藉由反轉試管及溫和混合來溶解。最後，將28毫克的1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)加至混合物，呈固體，並藉由反轉試管及溫和混合來溶解；且在步驟中f)，最終濃度測定為2.5毫克/毫升，且發現半抗原-DT共軛體每個蛋白質單體具有19.3個半抗原。
實例5. 如下述方法所述將得自製備24至34和46至56之半抗原間隔基共軛體偶合於白喉類毒素蛋白質。
a)獲得呈黃色油之半抗原並儲存在2至8℃下直到使用當天(長達一個星期，較長的儲存係在-20℃)。以每毫升溶液50毫克半抗原將此油溶解在沒有Ca或Mg之Dulbeccos'磷酸鹽緩衝液(DPBS)中。結果為黃棕色懸浮液或溶液。製備33不完全溶解在去離子水中，所以進一步溶解在50%甲醇中至每毫升溶液25毫克半抗原間隔基共軛體之最終濃度。
b)分別地，獲得濃白喉類毒素(DT)之等分試樣並使用凝膠過濾脫鹽管柱(Bio-Rad)，將DT之緩衝液改變成DPBS。來自管柱的析出液為4毫升溶液，當以使用牛血清白蛋白標準曲線之Bradford分析(Coomassie亮藍試劑，Pierce Chemical)測定時於約11毫克/毫升。此之等分試樣用另外的DPBS稀釋以產生2毫升溶液，於在DPBS中之5毫克/毫升蛋白質)。
c)使此DT之等分試樣與丁二酸酐反應以產生改性之丁二醯化白喉類毒素。2毫升DT在DPBS之等分試樣與 40毫克呈固體之丁二酸酐合併，並在室溫下放在管輥上以提供輕輕搖動經歷3小時。應指出，使用此方法，終產物不是透明溶液。在3小時反應時間結束時，將等分試樣施加於凝膠過濾脫鹽管柱且溶析於DPBS，以除去未反應的小分子成分。此將試樣的體積總計增加至3毫升。
d)將9毫克的磺酸基-N-羥基丁二醯亞胺(s-NHS)，呈固體，加至3毫升DT等分試樣，並藉由反轉試管及溫和混合使s-NHS溶解。然後將9毫克的1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)加至混合物，呈固體，並藉由反轉試管及溫和混合來溶解。將50微升的上述製得之半抗原間隔基共軛體溶液(製備33為100微升)加至反應混合物(丁二醯化DT/EDC/s-NHS)。
e)將混合物在室溫下在管輥上並輕輕搖動反應3至4小時。在反應時間結束時，將等分試樣施用於凝膠過濾脫鹽管柱且溶析於DPBS，以除去未反應的小分子成分。此將共軛體試樣之體積總計增加至4毫升。
f)使用牛血清白蛋白標準品，使用Bradford(Pierce Coomassie亮藍試劑)分析檢測最終共軛體之蛋白質含量，和最終濃度測定如表1中所指示。使用紫外光譜法在250至270奈米區對正規化蛋白質含量之非共軛對照組分析共軛體之半抗原結合，且發現相較於原生類毒素，在此區有更強的抗體吸附(antibodiesorb)。也藉由SDS-PAGE電泳檢測共軛體和使用LAL分析檢測內毒素含量。最後，使用逆相HPLC水解和分析100微克之共軛體試樣以測定每 個蛋白質分子中所結合之半抗原的數目。試驗試樣之半抗原裝載詳述於下表1和2中。
g)最後，將試樣通過0.22微米注射過濾器無菌過濾且在無菌條件下再分成1.0毫升等分試樣。這些無菌等分試樣儲存在-80℃直至運到在乾冰上的研究位置。
實例6. 半具有反應性胺基之抗原也可共軛於白喉類毒素而沒有添加丁二酸酐。製備12之半抗原共軛於白喉類毒素的一實例係描述於下，但也可使用製備4、7、8、24-34和46-56進行。
a)獲得呈黃色油之半抗原並儲存在2至8℃下直到使用當天(長達一個星期，較長的儲存係在-20℃)。以每毫升溶液50毫克半抗原將此油溶解在沒有Ca或Mg之Dulbeccos'磷酸鹽緩衝液(DPBS)中。結果為黃棕色懸浮液或溶液。
b)分別地，獲得濃白喉類毒素(DT)之等分試樣並使用凝膠過濾脫鹽管柱(Bio-Rad)，將DT之緩衝液改變成DPBS。來自管柱的析出液為4毫升溶液，當以使用牛血 清白蛋白標準曲線之Bradford分析(Coomassie亮藍試劑，Pierce Chemical)測定時於約11毫克/毫升。此之等分試樣用另外的DPBS稀釋以產生2毫升溶液，於在DPBS中之5毫克/毫升蛋白質。
c)將9毫克的磺酸基-N-羥基丁二醯亞胺(s-NHS)，呈固體，加至2毫升DT等分試樣，並藉由反轉試管及溫和混合使s-NHS溶解。然後將9毫克的1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)加至混合物，呈固體，並藉由反轉試管及溫和混合來溶解。將50微升的上述製得之半抗原溶液加至反應混合物(DT/EDC/s-NHS)。在此階段以逐滴加入1M HCl將pH調降至pH 5.6。
d)將混合物在室溫下在管輥上並輕輕搖動反應3至4小時。在反應時間結束時，將等分試樣施加於凝膠過濾脫鹽管柱且溶析於DPBS，以除去未反應的小分子成分。此將共軛體試樣之體積總計增加至3毫升。
e)使用牛血清白蛋白標準品，使用Bradford(Pierce Coomassic亮藍試劑)分析檢測最終共軛體之蛋白質含量，和最終濃度測定為3.01毫克/毫升。使用紫外光譜法在280奈米區對正規化蛋白質含量之非共軛對照組分析共軛體之半抗原結合，且發現相較於原生類毒素，在此區有更強的抗體吸附(antibodiesorb)。也藉由SDS-PAGE電泳檢測共軛體和使用LAL分析檢測內毒素含量。最後，使用逆相HPLC水解和分析100微克之共軛體試樣以測定每個蛋白質分子中所結合之半抗原的數目。發現半抗原-DT共 軛體每蛋白質單體具有11.6個半抗原。
g)最後，將試樣通過0.22微米注射過濾器無菌過濾且在無菌條件下再分成1.0毫升等分試樣。這些無菌等分試樣儲存在-80℃直至運到在乾冰上的研究位置。
實例7. 製備12可偶合於CRM197，以及共軛於白喉類毒素。諸如共軛之實例給予於下。雖然沒有顯示，但同樣的方法也可以應用於其他含胺半抗原諸如4、7、8、24-34和46-56。
a)獲得呈黃色油之來自製備12的半抗原並儲存在-20℃下。以每毫升溶液50毫克半抗原將此油溶解在沒有Ca或Mg之Dulbeccos'磷酸鹽緩衝液(DPBS)中。結果為黃棕色懸浮液或溶液。
b)分別地，將20毫升濃CRM197(5.91毫克/毫升)之等分試樣從-80℃解凍至2-8℃。取得8.62毫升的解凍材料之等分試樣和用1.38毫升的DPBS稀釋以產生10毫升溶液，於在DPBS中之5毫克/毫升蛋白質。
c)將500微升上述製得之半抗原溶液加至10毫升CRM197溶液，這係慢慢且逐滴加入，然後留在管輥上反應5分鐘。
d)在此時間之後，然後將90毫克的磺酸基-N-羥基丁二醯亞胺(s-NHS)，呈固體，加至10毫升CRM197溶液。藉由反轉試管與溫和混合使s-NHS溶解。溶液然後留在管輥上反應5分鐘。
e)5分鐘之後，將90毫克的1-乙基-3-(3-二甲胺基丙 基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)加至CRM197溶液，再次，呈固體，並藉由反轉試管及溫和混合使其溶解。在此階段以逐滴加入1M HCl將pH調降至pH 5.6。
f)然後將反應混合物轉移到冷房(2-8℃)，並留在管輥上反應6小時。
g)在反應時間結束時使用5 x NAP25管柱將試樣脫鹽於dPBS以除去多餘的未反應試劑(開：2毫升，關：3毫升)。最終體積增加至15毫升。
h)使用牛血清白蛋白標準品，使用Bradford(Pierce Coomassie亮藍試劑)分析檢測最終共軛體之蛋白質含量，和最終濃度測定為2.88毫克/毫升。使用紫外光譜法在280奈米區對正規化蛋白質含量之非共軛對照組分析共軛體之半抗原結合，且發現相較於原生類毒素，在此區有更強的抗體吸附(antibodiesorb)。也藉由SDS-PAGE電泳檢測共軛體和使用LAL分析檢測內毒素含量。最後，使用逆相HPLC水解和分析100微克之共軛體試樣以測定每個蛋白質分子中所結合之半抗原的數目。發現半抗原-CRM197共軛體每蛋白質單體具有8.0個半抗原。
i)最後，將試樣通過0.22微米注射過濾器無菌過濾且在無菌條件下再分成1.0毫升等分試樣。這些無菌等分試樣儲存在-80℃直至運到在乾冰上的研究位置。
實例8. 頃發現藉由增加反應混合物之sNHS/EDC濃度，裝載於載體蛋白之半抗原的量可被控制。製備7共軛於白喉類毒素之實例顯示於下。該方如實例6中所述，但 在步驟中c和e具有下列改變。
在步驟中c)：在此階段中磺酸基-N-羥基丁二醯亞胺(s-NHS)和1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)加至2毫升脫鹽DT之等分試樣的量可改變。在此實驗中，將9毫克的sNHS和EDC加至一等分試樣(此稱為條件2)和將36毫克之sNHS和EDC加至另一等分試樣(此稱為條件4)。試樣沒有以逐滴加入1M HCl將pH調降至pH 5.6。
在步驟e)中：關於使用條件2製造之共軛體，最終濃度測定為3.14毫克/毫升，且發現半抗原-DT共軛體每個蛋白質單體具有8.3個半抗原。關於使用條件4製造之共軛體，最終濃度測定為2.46毫克/毫升，且發現半抗原-DT共軛體每個蛋白質單體具有13.2個半抗原。
實例9. 經由溴乙酸N-羥基丁二醯亞胺酯(BAANS)共軛化學製備在CRM197和福馬林不活化白喉類毒素(DT)上之巰基化半抗原間隔基共軛物。
a)使用10DG脫鹽管柱(Pierce)(開：3毫升，關：4毫升)將3毫升的CRM197(17.73毫克於5.91毫克/毫升)和3毫升的DT(24毫克於8毫克/毫升)解凍和脫鹽於100mM磷酸鹽緩衝液，pH 8.0。使用相同的緩衝液將濃度調整至4毫克/毫升。
b)取得1毫升脫鹽CRM197之等分試樣和DT試樣並冷卻至2-8℃。
c)將20毫克製備57之半抗原間隔基共軛體溶解在 300微升DMSO和700微升dPBS中至20毫克/毫升之最終濃度。
d)將500微升(10毫克)之半抗原間隔基共軛體溶液加至500微升之預洗TCEP((參(2-羧乙基)膦))凝膠(Pierce)及在室溫下培養3小時並攪攪拌。將其餘半抗原溶液冷凍於-20℃長期貯存。
e)90分鐘到步驟(d)，將10毫克之BAANS(Sigma)溶解在500微升DMSO中至20毫克/毫升之最終濃度。
f)將1.5毫克(75微升)之BAANS慢慢且逐滴地加至1毫升之DT/CRM197，(於4毫克/毫升)。其在<11℃下反應90分鐘。(每毫克CRM197/DT添加0.375毫克BAANS)。
g)90分鐘之後，仍在<11℃下操作，使用NAP 10管柱(1毫升開，1.5毫升關)將溴乙醯化CRM197/DT脫鹽於冷100mM碳酸鈉/碳酸氫鈉緩衝液中，pH 9.1。
h)從TCEP凝膠吸出半抗原間隔基共軛體，並再次慢慢且逐滴地將250微升(5毫克)之半抗原間隔基共軛體加進活化CRM197/DT試樣二者，並混合以防止形成濃度梯度。
i)添加半抗原間隔基共軛體之後，如果需要，檢查pH並滴加0.1M的氫氧化鈉/HCl調整至9.1。
j)將反應混合物保持於無光下(antibodiesence of light)，並攪拌18小時。
k)在此時間之後，將2微升N-乙醯基半胱胺(NAC) 加至各反應混合物且再次在無光下(antibodiesence of light)反應3小時並攪拌(每克CRM197/DT之0.5毫升)。
l)反應之後，使用10DG脫鹽管柱(BioRad)(3毫升開，4毫升關)將其脫鹽於Dulbecco's PBS中。
m)最後，將試樣通過0.22微米注射過濾器無菌過濾且在無菌條件下等分試樣。將這些無菌等分試樣儲存在2-8℃直至運到研究位置。
n)使用牛血清白蛋白標準品，使用Bradford(Pierce Coomassie亮藍試劑)分析檢測最終共軛體之蛋白質含量，和最終濃度測定為1.59毫克/毫升。也藉由SDS-PAGE電泳檢測共軛體和使用LAL分析檢測內毒素含量。最後，使用逆相HPLC水解和分析共軛體之150微克試樣以測定每個蛋白質分子中所結合之半抗原的數目。發現半抗原-CRM197共軛體每蛋白質單體具有11.6個半抗原。
實例10. 頃發現藉由增加反應混合物之BAANS濃度，裝載於載體蛋白上之半抗原/半抗原間隔基共軛體的量可被控制。製備57共軛於CRM197之實例顯示於下。
a)使用10DG脫鹽管柱(BioRad)(開：3毫升，關：4毫升)將9毫升的CRM197(53.19毫克於5.91毫克/毫升)解凍和脫鹽於100mM磷酸鹽緩衝液，pH 8.0。使用相同的緩衝液將濃度調整至4毫克/毫升。
b)將30毫克製備57之半抗原間隔基共軛體溶解在1.5毫升DMSO中(最終濃度20毫克/毫升)。
c)藉在添加1.5毫升含半抗原間隔基共軛體的溶液 之前，由在dulbecco's PBS中清洗二次製備1毫升TCEP凝膠(Pierce)。然後將其於2-8℃下在旋轉台上培養2小時。
d)TCEP培養1小時之後，將10毫升的4毫克/毫升CRM197溶液分成5 x 2毫升在不同的反應容器之等分試樣，並在冷房儲存30分鐘以將溶液之溫度調整至2-8℃。將來所有的步驟在2-8℃下進行。
e)同時，藉由將20毫克BAANS溶解在1毫升DMSO中製備BAANS的儲備溶液。將5個反應容器標記為條件1、2、3、4或5。CRM197等分試樣的溫度調整至2-8℃之後，將改變量之BAANS溶液(50微升、100微升、150微升、225微升和300微升)加至5×2毫升反應容器，如表2中所指示。慢慢地(逐滴)添加BAANS溶液並攪拌。
f)使分試樣在旋轉台上於2-8℃下反應30分鐘。
g)30分鐘培養之後，使用NAP25(Gibco)管柱(開：2毫升，關：3毫升)將5×2毫升溴乙醯化CRM197脫鹽於100mM碳酸鈉/碳酸氫鈉緩衝液中，pH 9.1。
h)將TCEP凝膠從半抗原試樣分離出來並將5.6毫克(280微升)之半抗原間隔基共軛體加(慢慢地，逐滴)各脫鹽溴乙醯化CRM197試樣，並攪拌。將反應容器覆蓋鋁箔，防止內容物受到光。
i)使混合物在旋轉台上反應18小時。
j)藉由將0.5毫升NAC每克CRM197(因此每反應4 微升)加至反應混合物淬滅未反應之BrAc基。使混合物在旋轉台上反應3小時(仍覆蓋在鋁箔中以防光)。
k)最後，使用DG10管柱(開：3毫升，關：4毫升)將各反應脫鹽於dulbecco's PBS。最終體積為4毫升。
i)最後，將試樣通過0.22微米注射過濾器無菌過濾且在無菌條件下等分試樣。將這些無菌等分試樣儲存在2-8℃直至運到研究位置。
m)使用牛血清白蛋白標準品，使用Bradford(Pierce Coomassie亮藍試劑)分析檢測最終共軛體之蛋白質含量，和最終濃度測定顯示於表3中。也藉由SDS-PAGE電泳檢測共軛體和使用LAL分析檢測內毒素含量。最後，使用逆相HPLC(N=3)水解和分析450微克之各共軛體試樣以測定每個蛋白質分子所結合之半抗原的數目(半抗原裝載數據顯示於表5中)。
實例11.藉由肌肉內注射(在第0、28、42天)用10微克的實例1至4之共軛體在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和50微克CpG 24555存在下將BALB/c小鼠(Charles River,Montreal,QC.)(n=12每組)免疫接種。如上所述以ELISA測量血漿中之抗菸鹼IgG抗體含量。
結果顯示於圖1中，從其可知：獲得各測試共軛體的強抗菸鹼抗體反應，灌注注射4週之後，其反應是持續的或各第一和第二增加注射2週之後增加。
實例12. 藉由肌肉內注射(在第0、28、42天)用10微克的實例1至4之共軛體在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和50微克CpG 24555存在下將BALB/c小鼠(n=12每組)免疫接種。如上所述，活性指數對應於從菸鹼-BSA塗布板上溶析50%之抗菸鹼抗體所需要的硫氰酸銨之濃度。
結果顯示於圖2中，從其可知：藉由試驗共軛體，抗體在小鼠中呈現高活性，灌注注射4週之後，其為持續的或各第一和第二增加注射2週之後增加。
實例13.藉由肌肉內注射(在第0、28、42天)用10微克的實例1至4之共軛體在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和50微克CpG 24555存在下將BALB/c小鼠(n=6每組)免疫接種。在最後增加2週之後，如上所述，藉由靜脈內注射投予3H-菸鹼(0.05毫克/公斤菸鹼包含3μCi 3H-nic)，收集取血，灌注動物，移除大腦，定量3H含量和所測定3H之腦/血漿的比例。
結果顯示於圖3中，從其可知：試驗共軛體之血漿/腦比顯著大於對照組，指示由試驗共軛體誘發之抗體對菸鹼具有特異性且螯合在血液中的菸鹼並防止菸鹼吸入腦中。
實例14.藉由肌肉內注射(在第0、28、42天)用10微克的實例1至4之共軛體在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和50微克CpG 24555存在下將BALB/c小鼠(n=12每組)免疫接種。如上所述，在第二次增加2週之後，藉由競爭ELISA證明抗菸鹼抗體與菸鹼之交互作用。
結果顯示於圖4中，從其可知：由試驗共軛體誘發之抗體認出且共軛於菸鹼。
實例15.藉由肌肉內注射(在第0、28、42天)用10微克的實例1和2之共軛體在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和50微克CpG 24555存在下將BALB/c小鼠(n=12每組)免疫接種。如上所述，在第二次增加2週之後，藉由競爭ELISA測量抗菸鹼抗體對菸鹼、可丁寧(cotinine)、乙醯膽鹼和伐崙克林之特異性。
結果顯示於圖5中，從其可知：當所加菸鹼之量增加時，有抗菸鹼抗體共軛於菸鹼-塗布之ELISA板的劑量依賴性抑制。然而，用伐崙克林、可丁寧或乙醯膽鹼沒有觀察到該效果，指示由試驗共軛體誘發之抗體對菸鹼有特異性且對可丁寧、伐崙克林或乙醯膽鹼沒有特異性。
實例16.藉由肌肉內注射(在第0、28、42天)用10微 克的實例5之共軛體在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和50微克CpG 24555存在下將BALB/c小鼠(n=12每組)免疫接種。如上所述，藉由ELISA測量血漿中的抗菸鹼抗體含量(總計IgG)。
結果顯示於圖6、7、8和9中，從其可知：各測試共軛體獲得非常強的抗菸鹼抗體反應，灌注注射4週之後，其反應在增加2週後提高。此外，抗菸鹼抗體之含量以及抗菸鹼抗體之結合性二者皆取決於所使用之間隔基。另外，所有試驗共軛體產生高於對照組之血漿/腦比，指示由試驗共軛體誘發之抗體可螯合血液中的菸鹼和防止菸鹼吸入腦中至大於對照組動物中之程度。
實例17.藉由肌肉內注射(在第0、28、42天)用10微克的實例6和7之共軛體在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和50微克CpG 24555存在下將BALB/c小鼠(n=12每組)免疫接種。藉由ELISA測量血漿中的抗菸鹼抗體含量(總計IgG)。如上所述，在最後增加2週之後，藉由靜脈內注射投予3H-菸鹼(0.05毫克/公斤菸鹼包含3μCi 3H-nic)，收集取血，灌注動物，移除大腦，定量3H含量和測定3H相對於對照組動物之含量%改變。
結果顯示於圖12中(抗菸鹼抗體含量)和13(3H之含量%改變)，從其可知：各試驗共軛體獲得免疫反應，其以劑量依賴性方式反應增加。此指示DT和CRM197二者皆為菸鹼衍生之半抗原的適合載體。此外，所有試驗共軛體導致進入腦之3H-菸鹼含量低於對照組動物，指示由試驗共 軛體誘發之抗體可螯合血液中的菸鹼和防止菸鹼吸入腦中至大於對照組動物中之程度。
實例18.藉由肌肉內注射(在第0、28、42天)用10微克的實例6、7和8之共軛體在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和50微克CpG 24555存在下將BALB/c小鼠(n=12每組)免疫接種。藉由ELISA測量血漿中的抗菸鹼IgG Ab含量。如上所述，在最後增加2週之後，藉由iv注射投予3H-菸鹼(0.05毫克/公斤菸鹼包含3μCi 3H-nic)，收集取血，灌注動物，移除大腦，定量3H含量和測定相對於對照組動物之3H含量的%改變。
結果顯示於圖14中(抗菸鹼抗體含量)和15(3H之含量%改變)，從其可知：各試驗共軛體獲得免疫反應，其隨半抗原裝載而反應增加。此外，所有試驗共軛體導致進入腦中之3H-菸鹼含量低於對照組動物，指示由試驗共軛體誘發之抗體可螯合血液中的菸鹼且防止菸鹼吸入腦中至大於對照組動物中之程度。
實例19. 藉由肌肉內注射用10微克的實例7之共軛體在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和10微克CpG 24555存在下或在ISCOMATRIX(IMX；0.1至3.0單位)存在下將BALB/c小鼠(n=10每組)免疫接種。藉由ELISA測量血漿中的抗菸鹼IgG Ab含量(第21和28天)和藉抑制ELISA測量結合性。結果顯示於圖16和17中，從其可知：使用CpG 24555和氫氧化鋁作為組合佐劑，或使用ISCOMATRIX作為唯一佐劑獲得免疫反應(Ab 含量和結合性)，其隨ISCOMATRIX劑量而反應增加。
在第2次免疫接種1週後，藉由IV注射投予3H-菸鹼(0.05毫克/公斤菸鹼包含3μCi 3H-nic)，收集取血，灌注動物，移除大腦，定量3H含量和測定相對於對照組動物之3H-菸鹼在血液和腦中的%改變。結果顯示於圖18中，從其可知：使用CpG 24555和氫氧化鋁作為組合佐劑，或使用ISCOMATRIX作為唯一佐劑導致進入腦之3H-菸鹼含量低於對照組動物，指示由試驗共軛體誘發之抗體可螯合血液中的菸鹼並防止菸鹼吸入腦中至大於未接受免疫接種之對照組動物中之程度。
實例20. 如下製備下表6中所述之試樣。
a)將冷凍CRM197(200毫升於5.9毫克/毫升)的在4℃下解凍過夜。
b)一旦解凍，藉由使用具有10kD分子量截留之Kvick Start聚醚碸(PES)膜的超過濾(UF)將CRM197從200毫升濃縮至100毫升。
c)使用50mM MOPS(3-(N-啉基)丙烷磺酸)、50mM NaCl，pH 7.2將濃縮之CRM197透濾(diafiltered)(DF)8TOVs(轉換體積)。使用SARTOPORE 2 150無菌膠囊式過濾器將後UF/DF CRM197過濾。
d)藉由使用0.942之消光係數於A280下測量吸光度來確定CRM197之濃度。濃度測定為9.65毫克/毫升。
f)使用50mM MOPS，50mM NaCl，pH 7.2將後 UF/DF CRM197從9.65毫克/毫升稀釋至7.18毫克/毫升。
g)在另外的容器中，將6M HCl溶液(7.46毫升)慢慢加至7460毫克的製備12之半抗原且同時在冰浴中冷卻。然後添加50mM MOPS，50mM NaCl,pH 7.2緩衝液(2.00毫升)並以pH試紙檢查pH。PH為約9。以小增量添加6M鹽酸，直至達pH值7.5(添加1.70毫升HCl)。溶液之體積總計為18.65毫升，導致400毫克/毫升之製備12之半抗原的濃度。
h)在另外的容器中，將7000毫克的磺酸基-N-羥基丁二醯亞胺(sNHS)溶解在50mM MOPS，50mM NaCl，pH 7.2溶液(14毫升)中並以小增量添加19.25M NaOH溶液直至達7.13之pH(添加1.44毫升的NaOH)。溶液之體積總計為18.50毫升，導致378毫克/毫升之sNHS的濃度。
i)在另外的容器中，將8000毫克的1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶解在5毫升的50mM MOPS,50mM NaCl,pH 7.2中。溶液之體積總計為12.0毫升，導致666毫克/毫升之EDC的濃度。最後，僅在共軛反應之前製造EDC溶液。
j)以產生表6中所列之24個試樣的方式組合後UF/DF CRM197、製備12之半抗原、sNHS和EDC溶液。關於24個試樣，正確計算量的溶液以下列方式混合在一起：合併UF/DF CRM197、製備12之半抗原和sNHS且檢查將混合物之pH。對於試樣號10和18，使用1N NaOH 將pH進一步調整以使pH至約7.5。最後，將EDC加至試樣。將每個反應管短暫振盪並在15℃下在水浴中培養18小時。
k)培養18小時之後，使用具有30kD的分子量截斷之Amicon超離心濃縮機將試樣進行緩衝液交換。所使用之緩衝液為20mM磷酸鉀、20mM組胺酸、pH 7.0。使用市售微BCA套組測量蛋白質濃度。
l)將200毫克/毫升蔗糖溶解在水中並以1：1(體積)比加至24個各共軛試樣。隨後添加PS80至0.2毫克/毫升之最終濃度。將試樣短期儲存於4℃適用，長期儲存於-20℃。
用以檢查試樣1-24之分析方法詳於細下。
SELDI-MS。表面增强雷射脫附游離(SELDI)為用於分析蛋白質混合物之質譜的電離質譜法。分析報告透過共軛方法對CRM197支架(scaffold)的淨增重。質量改變報告為支架的加成物。理想的情況下，加成物應等同於半抗原特異性抗原決定區密度分析。加成物=(質量共軛體-質量支架)/質量半抗原。請注意：超過ED值之加成物含量指示：半抗原以外質量加至支架；且試樣在加成物中高也在HMMS中高。
尺寸篩除層析。開發用以解析HMMS(高分子質量成分)、二聚物、單體和LMMS(低分子質量成分)之尺寸篩除分析傾向於了解影響這些成分的相對豐度之方法參數。該方法報告HMMS峰群、二聚物、單體和LMMS峰群之相對面積百分比。請注意：起始材料的方法化學計量和比例影響HMMS、二聚物、單體和LMMS之間的峰面積之明顯分佈。
抗原決定區密度。開發偶合於酸水解試樣製備之逆向液相層析分析以測定半抗原共軛於CRM197載體蛋白之量。半抗原分子係經由醯胺鍵共軛於CRM197支架；根據標準水解化學此鍵被水解而釋出半抗原連同取代基胺基酸。共軛半抗原7之量為方法一致性、產物質量和效力之測量。
試樣1-24之定性結果顯示於表7中。此數據顯示效力和偶合於CRM197之半抗原抗原決定區密度之間的密切 關係。此外，顯示最佳抗原決定區密度值與高單體、低HMMS和低加成物有關。
實例21. 藉由肌肉內注射用10微克的試樣1-24(參見實例20，表6和7)在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和10微克CpG 24555存在下將BALB/c小鼠(n=10每組)免疫接種。藉由ELISA(在第21和28天)測量血漿中的抗菸鹼IgG Ab含量，和藉由抑制ELISA測量結合性。結果顯示於圖19和20中，從其可知：各試驗共軛 體獲得免疫反應，其反應隨%單體而增加及其最佳使用每單位載體介於10至18個半抗原之間的半抗原裝載。
在第二次免疫接種1週後，藉由IV投予3H-菸鹼(0.05毫克/公斤菸鹼包含3μCi 3H-nic)，收集取血，灌注動物，移除大腦，定量3H含量和測定相對於對照組動物之3H-菸鹼在血液和腦中之含量%改變。結果顯示於圖21和22中，從其可知：所有試驗共軛體導致進入腦中之3H-菸鹼含量低於非免疫接種之對照組動物，指示由試驗共軛體誘發之抗體可螯合血液中的菸鹼和防止菸鹼吸入腦中至大於對照組動物中的程度，且效力隨%單體增加(圖21)及最佳使用每單位載體介於10至18個半抗原之間的半抗原裝載(圖22)。
實例22. 測試試樣1-24(參見實例20，表6和7)共軛於Alhydrogel。藉由肌肉內注射用10微克的該等不同共軛體在氫氧化鋁(alum；Alhydrogel-85：40微克Al3+)和10微克CpG 24555存在下將BALB/c小鼠(n=10每組)免疫接種。在第二次免疫接種1週後，藉由IV注射投予3H-菸鹼(0.05毫克/公斤菸鹼包含3μCi 3H-nic)，收集取血，灌注動物，移除大腦，定量3H含量和測定相對於對照組動物之3H-菸鹼在血液和腦中之含量%改變。結果顯示於圖23中，從其可知：具有較高%單體含量之共軛體，具有較高%結合於Alhydrogel和此與較大效力有關，以3H-菸鹼在腦中之量減少較大證明。
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之寡核苷酸
<400> 1

Claims (20)

  1. 一種式(III)之半抗原載體共軛體： 其中W為-CH2-或-O-；-(間隔基)-為C1-C8伸烷基、C3-C10伸環烷基或被1至4個氧原子插入及隨意被-N(H)C(O)-插入之C1-C12伸烷基；X*為-NH-或-S-；m為0或1；n為從1至1000之整數；且Y為選自細菌類毒素、免疫性物質、病毒、病毒樣粒子、蛋白質複合物、蛋白質、多肽、脂質體及免疫刺激性複合物的隨意改性之載體蛋白，但當W為-O-時，則W係於吡啶環之位置2或6。
  2. 根據申請專利範圍第1項之半抗原載體共軛體，其中W係於吡啶環之位置2或6。
  3. 根據申請專利範圍第1項之半抗原載體共軛體，其中m為0且X*為-NH-。
  4. 根據申請專利範圍第1至3項中任一項之半抗原 載體共軛體，其中該載體蛋白質為一種選自破傷風毒素之衍生物、白喉毒素之衍生物、鎖孔帽貝血藍蛋白(KLH)、血藍蛋白(hemocyanine)、來自腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)之外膜蛋白複合物(OMPC)、不耐熱性大腸桿菌毒素之B次單元、來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)之重組胞外蛋白質A(rEPA)、和其他病毒樣粒子的隨意改性之蛋白質。
  5. 根據申請專利範圍第4項之半抗原載體共軛體，其中該破傷風毒素之衍生物為化學不活化破傷風類毒素。
  6. 根據申請專利範圍第4項之半抗原載體共軛體，其中該白喉毒素之衍生物為化學不活化白喉類毒素或無毒基因突變體CRM197。
  7. 根據申請專利範圍第4項之半抗原載體共軛體，其中該其他病毒樣粒子為由噬菌體Qb、B型肝炎表面抗原、B型肝炎核心抗原或仿病毒顆粒(virosome)之重組外殼蛋白組裝者。
  8. 根據申請專利範圍第1至3項中任一項之式(III)半抗原載體共軛體，其中該載體為一種選自白喉類毒素和CRM197的隨意改性之蛋白質。
  9. 根據申請專利範圍第1至3項中任一項之式(III)半抗原載體共軛體，其中該載體蛋白為一種改性之丁二醯化蛋白質。
  10. 根據申請專利範圍第1至3項中任一項之半抗原 載體共軛體，其中n為在10至18(含)範圍內之整數。
  11. 一種疫苗組成物，其包含：多種根據申請專利範圍第1至10項中任一項之半抗原載體共軛體；及一或多種佐劑。
  12. 根據申請專利範圍第11項之疫苗組成物，其中該一或多種佐劑之一者為CpG 24555(即SEQ ID號：1之寡核苷酸)。
  13. 根據申請專利範圍第11項之疫苗組成物，其中該一或多種佐劑之一者為鋁鹽。
  14. 根據申請專利範圍第13項之疫苗組成物，其中該鋁鹽為氫氧化鋁。
  15. 根據申請專利範圍第14項之疫苗組成物，其中該等佐劑為CpG 24555和氫氧化鋁。
  16. 一種疫苗組成物，其包含CpG 24555和多種式(IV)之半抗原載體共軛體： 其中Y為白喉類毒素或CRM197；且n為在1至40(含)範圍內之整數。
  17. 一種疫苗組成物，其包含CpG 24555、氫氧化鋁和 多種式(IV)之半抗原載體共軛體： 其中Y為白喉類毒素或CRM197；且n為在1至40(含)範圍內之整數。
  18. 根據申請專利範圍第17項之疫苗組成物，其中n為在10至18(含)範圍內之整數。
  19. 根據申請專利範圍第1至3項中任一項之半抗原載體共軛體或根據申請專利範圍第11至18項中任一項之疫苗組成物，其係用作醫藥。
  20. 根據申請專利範圍第1至3項中任一項之半抗原載體共軛體或根據申請專利範圍第11至18項中任一項之疫苗組成物，其係用於增加希望戒菸之吸菸者的戒菸率和減少已透過接種抗菸鹼疫苗或透過先前使用藥物療法之治療或自我戒菸而成功地戒菸之曾經吸菸者的復發率；或用於治療或預防需要此治療的人士之菸鹼依賴性。
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