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TWI565473B - Ｈｊｕｒｐ胜肽與含此胜肽之疫苗 - Google Patents

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TWI565473B
TWI565473B TW100108048A TW100108048A TWI565473B TW I565473 B TWI565473 B TW I565473B TW 100108048 A TW100108048 A TW 100108048A TW 100108048 A TW100108048 A TW 100108048A TW I565473 B TWI565473 B TW I565473B
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中村祐輔
角田卓也
大澤龍司
吉村祥子
渡邊朝久
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腫瘤療法 科學股份有限公司
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Description

HJURP胜肽與含此胜肽之疫苗
本發明係關於生物科學的領域，更具體而言，係關於癌症療法的領域。特別是，本發明係關於新穎的胜肽，作為治療及預防腫瘤的癌症疫苗及藥物極為有用。
[優先權]
本申請案基於2010年3月11提申的美國臨時申請案號61/312,931及2010年3月18日提申的美國臨時申請案號61/315,320主張優惠，其全文完整併入本案作為參考。
已有人證明CD8+CTL會識別在主要組織相容性複合體(MHC)第I類分子上發現的腫瘤關聯抗原(TAA)所衍生的抗原決定基(epitope)胜肽，然後殺死腫瘤細胞。自從發現黑色素瘤抗原(MAGE)家族為TAA的第一例以來，已利用免疫學方法發現了許多其他的TAA(非專利文獻1,Boon T,Int J Cancer 1993 May 8,54(2): 177-80；非專利文獻2,Boon T & van der Bruggen P,J Exp Med 1996 Mar 1,183(3): 725-9)。此等TAA當中有些正作為免疫療法的標靶進行臨床開發當中。
有利的TAA係對於癌細胞的增殖與存活不可欠缺者。使用此種TAA當做免疫療法標靶使治療所驅使的免疫選擇所造成的癌細胞的逃脫導致TAA的刪除、突變或下調所形成周知的免疫風險降到最小。因此，能夠誘導有效及專一性抗腫瘤免疫反應的新穎TAA的鑑定正在進行，確保針對多種類型癌症的胜肽疫苗策略的臨床調查進一步的發展(非專利文獻3,Harris CC,J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16,88(20): 1442-55；非專利文獻4,Butterfield LH et al.,Cancer Res 1999 Jul 1,59(13): 3134-42；非專利文獻5,Vissers JL et al.,Cancer Res 1999 Nov 1,59(21): 5554-9；非專利文獻6,van der Burg SH et al.,J Immunol 1996 May 1,156(9): 3308-14；非專利文獻7,Tanaka F et al.,Cancer Res 1997 Oct 15,57(20): 4465-8；非專利文獻8,Fujie T et al.,Int J Cancer 1999 Jan 18,80(2): 169-72；非專利文獻9,Kikuchi M et al.,Int J Cancer 1999 May 5,81(3): 459-66；非專利文獻10,Oiso M et al.,Int J Cancer 1999 May 5,81(3): 387-94)。到目前，已有數個使用衍生自腫瘤關聯抗原的胜肽的臨床試驗之報告。不幸地，許多目前的癌症疫苗試驗顯示只有低目標反應率(非專利文獻11,Belli F et al.,J Clin Oncol 2002 Oct 15,20(20): 4169-80；非專利文獻12,Coulie PG et al.,Immunol Rev 2002 Oct,188: 33-42；非專利文獻13,Rosenberg SA et al.,Nat Med 2004 Sep,10(9): 909-15)。因此，仍需要新穎TAA當做免疫治療的標靶。
HJURP(參考序列顯示於GenBank存取號：NM_018410)，為Holliday junction recognizing protein的簡稱，係使用27,648個基因所構成的cDNA微陣列由非小細胞肺癌的全基因體表現概況分析而鑑別(非專利文獻14,Kato T et al.,Cancer Res. 2007 Sep 15;67(18):8544-53)。HJURP藉由與hMSH5(人類MutS同源物5)與NBS1(Ni jmegen斷裂症候群蛋白質1)交互作用，而涉及DSB(DNA雙股斷裂)修補處理的同源重組路徑，HJURP係MRN蛋白質複合體的一部分。以抗HJURP的小干擾RNA(siRNA)處理癌細胞會造成染色體異常融合，並導致基因體不安定及衰老。而且，在大部分人類肺癌中觀察到HJURP過度表現(專利文獻1,WO2004/031413)。歸納言之，這些資料顯示HJURP可能可應用於對病患的癌症免疫療法的標靶。
[引用列表] [非專利文獻]
[非專利文獻1] Boon T,Int J Cancer 1993 May 8,54(2): 177-80
[非專利文獻2] Boon T & van der Bruggen P,J Exp Med 1996 Mar 1,183(3): 725-9
[非專利文獻3] Harris CC,J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16,88(20): 1442-55
[非專利文獻4] Butterfield LH et al.,Cancer Res 1999 Jul 1,59(13): 3134-42
[非專利文獻5] Vissers JL et al.,Cancer Res 1999 Nov 1,59(21): 5554-9
[非專利文獻6] van der Burg SH et al.,J Immunol 1996 May 1,156(9): 3308-14
[非專利文獻7] Tanaka F et al.,Cancer Res 1997 Oct 15,57(20): 4465-8
[非專利文獻8] Fujie T et al.,Int J Cancer 1999 Jan 18,80(2): 169-72
[非專利文獻9] Kikuchi M et al.,Int J Cancer 1999 May 5,81(3): 459-66
[非專利文獻10] Oiso M et al.,Int J Cancer 1999 May 5,81(3): 387-94
[非專利文獻11] Belli F et al.,J Clin Oncol 2002 Oct 15,20(20): 4169-80
[非專利文獻12] Coulie PG et al.,Immunol Rev 2002 Oct,188: 33-42
[非專利文獻13] Rosenberg SA et al.,Nat Med 2004 Sep,10(9): 909-15
[非專利文獻14] Kato T et al.,Cancer Res. 2007 Sep 15;67(18):8544-53
[專利文獻]
[專利文獻1] WO2004/031413
本發明至少部分基於對於免疫療法的適當標靶的發現。由於TAA一般被免疫系統認知為「自我」，因此通常沒有免疫源性，適當標靶的發現極為重要。體認到HJURP(序列識別號：50)，典型由GenBank存取號NM_018410(序列識別號：49)基因所編碼，已被鑑別在下述的癌症中為向上調節，包括急性骨髓性白血病(AML)、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病(CML)、大腸直腸癌、食道癌、擴散型胃癌、肝癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、淋巴癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、小細胞肺癌(SCLC),軟組織腫瘤及睪丸腫瘤，但不限於此，本發明著眼於HJURP作為癌症/腫瘤免疫療法的標靶候選物，更特別是，著眼於可當做適當的免疫療法標靶的新穎HJURP抗原決定基胜肽。
為此，本發明至少部分係針對在具有誘導對HJURP專一的CTL的能力之HJURP基因產物中對專一性抗原決定基胜肽的鑑定。如以下將詳述，使用HLA-A*2402或HLA-A*0201連接的衍生自HJURP的候選胜肽，刺激獲自健康捐贈者的周邊血液單核細胞(PBMC)。然後，建立具有專一性細胞毒性的CTL細胞株，以對抗經各候選胜肽脈衝的HLA-A24-或HLA-A2-陽性目標細胞。此結果證明這些胜肽為HLA-A24或HLA-A2限制的抗原決定基胜肽，可誘導抗表現HJURP的細胞之有效及專一的免疫反應。這些結果進一步證明HJURP為強免疫源性，且其抗原決定基為癌症/腫瘤免疫療法的有效標靶。
因此，本發明的目的為提供一種連接於HLA抗原的單離胜肽，衍生自HJURP(序列識別號：50)及其免疫活性片段。此等胜肽預期具有CTL誘導能力，因此可用於離體(ex vivo)誘導CTL或投予個體以誘導抗癌的免疫反應，癌症例如AML、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、CML、大腸直腸癌、食道癌、擴散型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤及睪丸腫瘤，但不限於此。較佳的胜肽為九胜肽或十胜肽，更佳為具有選自序列識別號：2至24及26至48中的胺基酸序列的九胜肽或十胜肽。具有選自序列識別號：3、4、7、18、23、26、27、30、31、32、35、37、38及43的胺基酸序列之胜肽，顯示強CTL誘導能力，因此為特別佳者。
本發明亦考慮具有選自序列識別號：2至24及26至48的胺基酸序列的經修飾的胜肽，其中1、2個或以上的胺基酸可被取代、刪除或增加，只要該經修飾的胜肽保留必要的原始CTL誘導能力。
本發明更包含編碼任一任一本發明胜肽之單離的多核苷酸。這些多核苷酸可用於誘導或製造具有CTL誘導能力的APC，或如同上述本發明之胜肽，可投予個體投予以誘導抗癌的免疫反應。
當投予個體時，本發明之胜肽被呈現於APC表面以誘導目標各自胜肽的CTL。因此，本發明的一目的在於提供製劑、組合物或物質，其包括或包含本發明的任一胜肽或多核苷酸以誘導CTL。此製劑、組合物及/或物質可用於治療及/或預防及/或防止癌症術後復發，癌症例如AML、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、CML、大腸直腸癌、食道癌、擴散型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤及睪丸腫瘤，但不限於此。因此，本發明另一目的在於提供一種醫藥製劑、組合物或物質，用於治療及/或預防及/或癌症術後復發，其包括或包含本發明之任一胜肽或多核苷酸。除了本發明之胜肽或多核苷酸以外，本發明的醫藥製劑、組合物或物質可包括呈現任一本發明之胜肽的APC或外吐小體作為活性成分。
本發明之胜肽或多核苷酸藉由例如使衍生自個體的APC與該胜肽接觸或者將編碼本發明之胜肽的多核苷酸導入APC，誘導在表面呈現由HLA抗原與該胜肽所形成的複合體之APC。此APC對於目標胜肽具有高度CTL誘導能力，在癌症免疫療法發現其用途。因此本發明包含誘導具有CTL誘導能力的APC之方法及由此方法所獲得的APC。
本發明又一目的在於提供一種誘導CTL的方法，此方法包括以下步驟，將CD8+細胞與在表面上呈現本發明之胜肽的APC或外吐小體共同培養之步驟，或者導入一基因的步驟，該基因包括編碼連接於本發明胜肽的T細胞受體(TCR)次單元多胜肽之多核苷酸。此方法獲得的CTL發現有效於治療及/或預防癌症，癌症例如AML、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、CML、大腸直腸癌、食道癌、擴散型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤及睪丸腫瘤，但不包含於此。因此本發明另一目的在於提供由本發明之方法所獲得的CTL。
本發明的又一目的在於提供在個體中誘導對抗癌症的免疫反應之方法，此方法包括以下步驟，投予包含HJURP多胜肽或其免疫活性片段、編碼HJURP多胜肽的多核苷酸、呈現HJURP多胜肽的外吐小體或APC之組合物或物質。
本發明的應用性擴大至任何相關於或起因於HJURP過度表現的疾病，例如癌症，例如AML、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、CML、大腸直腸癌、食道癌、擴散型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤及睪丸腫瘤，但不限於此。
具體而言，本發明提供：
[1]　一種單離的胜肽，具有序列識別號：50的胺基酸序列或其免疫活性片段，該胜肽連接於HLA抗原及具有細胞毒性T淋巴球(CTL)誘導能力。
[2]　如[1]之單離的胜肽，其中該HLA抗原為HLA-A24。
[3]　如[1]之單離的胜肽，其中該HLA抗原為HLA-A2。
[4]　如[1]或[2]之單離的胜肽，其中該胜肽包含選自序列識別號：2至24的胺基酸序列。
[5]　如[1]或[3]之單離的胜肽，其中該胜肽包含選自序列識別號：26至48的胺基酸序列。
[6]　一種單離的胜肽，選自由以下構成的群組：
(a)　一單離的胜肽，其係連接於HLA抗原，具有細胞毒性T淋巴球(CTL)誘導能力，及由序列識別號：50的胺基酸序列或其免疫活性片段所構成；
(b)　如(a)之單離的胜肽，其中該HLA抗原為HLA-A24;
(c)　如(a)或(b)之單離的胜肽，其包含選自序列識別號：2至24的胺基酸序列；以及
(d)　如(a)或(b)之單離的胜肽，其中該胜肽包含具有選自序列識別號：2至24的胺基酸序列之經修飾的胜肽，其中1、2個或以上的胺基酸被取代、刪除或增加，但是該經修飾的胜肽保留原始胜肽的CTL誘導能力。
[7]　一種單離的胜肽，選自由以下構成的群組：
(a)　一單離的胜肽，其係連接於HLA抗原，具有細胞毒性T淋巴球(CTL)誘導能力，及由序列識別號：50的胺基酸序列或其免疫活性片段所構成；
(b)　如(a)之單離的胜肽，其中該HLA抗原為HLA-A2；
(c)　如(a)或(b)之單離的胜肽，其包含選自序列識別號：
26至48的胺基酸序列；以及
(d)　如(a)或(b)之單離的胜肽，其中該胜肽包含具有選自序列識別號：26至48的胺基酸序列之經修飾的胜肽，其中1、2個或以上的胺基酸被取代、刪除或增加，但是該經修飾的胜肽保留原始胜肽的CTL誘導能力。
[8]　如[6]之單離的胜肽，其係由選自序列識別號：2至24的胺基酸序列所構成，其中該胜肽具有1種或兩種下述特徵：
(a)　N端的第2個胺基酸為選自苯丙胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸及色胺酸；及
(b)　C端的胺基酸為選自苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸及甲硫胺酸。
[9]　如[7]之單離的胜肽，其係由選自序列識別號：26至48的胺基酸序列所構成，其中該胜肽具有1種或兩種下述特徵：
(a) N端的第2個胺基酸為選自苯丙胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸及色胺酸；
(b) C端的胺基酸為選自苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸及甲硫胺酸。
[10]　如[1]至[9]中任一項之單離的胜肽，其中該胜肽為九胜肽或十胜肽。
[11]　一種單離的多核苷酸，其係編碼如[1]至[10]中任一項之胜肽。
[12]　一種誘導CTL的組合物，其中該組合物包含1個或以上的如[1]至[10]中任一項之胜肽，或1個或以上的如[11]之多核苷酸。
[13]　一種用於治療及/或預防癌症及/或防止其術後復發之醫藥組合物，其中該組合物包含1個或以上的如[1]至[10]中任一項之胜肽，或1個或以上的如[11]之多核苷酸。
[14]　如[13]之醫藥組合物，其中該組合物調配為投予HLA抗原為HLA-A24的個體。
[15]　如[13]之醫藥組合物，其中該組合物調配為投予HLA抗原為HLA-A2的個體。
[16]如[13]至[15]中任一項之醫藥組合物，其中該組合物調配為癌症的治療。
[17]　一種誘導具有CTL誘導能力的抗原表現細胞(APC)的方法，包含選自下列的步驟：
(a)　使APC與如[1]至[10]中任一項之胜肽在體外(in vitro)、離體(ex vivo)或體內(in vivo)接觸；以及
(b)　將編碼如[1]至[10]中任一項之胜肽的多核苷酸導入APC。
[18]　一種誘導CTL的方法，包含選自下列的步驟：
(a)　共同培養CD8+T細胞與表面呈現由HLA抗原與如[1]至[10]中任一項之胜肽所形成的複合體之APC；
(b)　共同培養CD8+T細胞與表面呈現由HLA抗原與如[1]至[10]中任一項之胜肽所形成的複合體之外吐小體；以及
(c)　將包含編碼連接於如[1]至[10]中任一項之胜肽的T細胞受體(TCR)次單元多胜肽的多核苷酸之基因，導入T細胞。
[19]　一種單離的APC，係在表面上呈現由HLA抗原與如[1]至[10]中任一項之胜肽所形成的複合體。
[20]　如[19]之APC，其係由[17]之方法誘導。
[21]　一種單離的CTL，其以如[1]至[10]中任一項之胜肽為標靶。
[22]　如[21]之CTL，其係由[18]之方法誘導。
[23]　一種在個體中誘導對抗癌症的免疫反應知方法，該方法包括投予該個體投予一組合物之步驟，該組合物包括如[1]至[10]之胜肽的組合物、其免疫活性片段、或編碼該胜肽或片段的多核苷酸。
[24]　一種抗體或其免疫活性片段，其係對抗如[1]至[10]中任一項之胜肽。
[25]　一種載體，包含編碼如[1]至[10]中任一項之胜肽的核苷酸序列。
[26]　一種診斷套組，包含如[1]至[10]中任一項之胜肽、如[1]　之核苷酸，或如[24]之抗體。
[27]　如[1]、[2]、[4]、[6]、[8]及[10]中任一項的單離的胜肽，其中該胜肽由選自序列識別號:3、4、7、18及23的胺基酸序列所構成。
[28]　如[1]、[3]、[5]、[7]、[9]及[10]中任一項的單離的胜肽，其中該胜肽由選自序列識別號：26、27、30、31、32、35、37、38及43的胺基酸序列所構成。
[29]　一種外吐小體，其呈現包含如[1]至[10]中任一項之胜肽及HLA抗原的複合體。
[30]　一種寄主細胞，係經如[25]之表現載體轉形或轉染。
本發明的上述發明內容以及以下詳述的具體例，並不限定本發明或本發明的其他替代具體例。
除上述以外，本發明的其他目的及特性將由閱讀以下詳細敘述並參照圖式及實施例而更為顯明。然而，本發明的上述發明內容以及以下詳述的具體例僅為例示，不限定本發明或本發明的其他替代具體例。特別是，雖然本發明在此參照數個特定具體例說明，但是此等敘述係用於理解本發明，並非限定本發明。在不偏離本發明精神與範疇之下，如同後附的申請專利範圍，該技術領域中具有通常知識者可做各種修飾及應用。同樣地，本發明的其他目的、特性、益處及優點將由下述內容及特定具體例而顯明，且該技術領域中具有通常知識者容易清楚。此種目的、特性、益處及優點將由以上以及附帶的實施例、數據、圖式、及由此衍生的所有合理推論單獨或與納入於此的參考文獻而顯明。
雖然任何類似於或均等於在此所述的方法或材料可用於實施或測試本發明具體例，以下仍敘述較佳的材料、方法及裝置。然而，敘述該材料及方法前，應瞭解此等敘述僅為供理解而非意欲限制。應瞭解本發明不限於在此敘述的特定大小、形狀、方向、尺寸、材料、方法學、試驗步驟等，因為此等會由於例行的實驗及/或最適化而改變。再者，在敘述中使用的用語僅係用敘述特定版本或具體例，不意欲限制本發明的範圍，本發明範圍僅由附帶的申請專利範圍限制。
在本說明書中提到的各出版物、專利或專利申請案的揭示係特別完整納入於此作為參考。但是，並非承認本發明在早於此揭示或先前發明尚未完成。
除非特別指明，在此使用的所有技術及科學用語與本發明所屬技術領域中具有通常知識者一般使用的含意相同。若有抵觸，依本說明書，包括定義為準。此外，材料、方法及實施例僅供理解並不意欲限定。
I.　定義
除非特別指明，此處使用的「一」及「該」意指「至少一」。
用語「多胜肽」、「胜肽」及「蛋白質」在此可互換地指胺基酸殘基的聚合物。此用語適用於胺基酸聚合物，其中一個或以上的胺基酸殘基可為經修飾的殘基，或非天然產生的殘基，例如對應天然產生的胺基酸及對應天然產生的胺基酸聚合物之人造化學擬似物。
有時用在本說明書的「寡胜肽」，係指本發明之胜肽的長度為20個殘基或以下，通常為15個殘基或以下，且典型由約8個至約11個殘基所構成，通常為9或10個殘基。
用語「胺基酸」在此意指天然產生及合成的胺基酸，及胺基酸類似物及與天然尺產生的胺基酸作用類似的胺基酸擬似物。胺基酸可為L-胺基酸或D-胺基酸。天然產生的胺基酸係由遺傳碼所編碼者，以及於細胞中轉譯後經修飾者(例如羥基脯胺酸、gamma-羧基麩胺酸，及O-磷絲胺酸)。用詞「胺基酸類似物」意指與天然產生的胺基酸具有相同基本化學結構(鍵結於氫的alpha碳、羧基、胺基及R基)，但是具有一個以上經過修飾的R基或經過修釋的骨架(例如高絲胺酸、降白胺酸、甲硫胺酸、亞碸、甲硫胺酸甲基鎏)。用詞「胺基酸擬似物」意指與一般胺基酸具有不同結構但有類似功能的化學化合物。
胺基酸在此可使用其通用的三字母符號或由IUPAC-IUB生化命名協會建議的單字母符號指明。
用語「基因」、「多核苷酸」、「核苷酸」及「核酸」在此可互換使用，且如無特別指明，係類似於胺基酸以其通用的單字碼所指明者。
用語「製劑」、「物質」及「組合物」在此可互換使用，意指含有特定量特定成分的產品，以及將該特定成分以特定量直接或間接組合得到的產品。加上修飾語「醫藥的」係意欲包含含活性成分及成為載載體的惰性成分的產品，及由直接或間接組合、複合或聚集該之2種或以上的成分所獲得的產品，或由1種或以上的成分溶解所得到的產品，或由1種或以上的成分的其他類型的反應或交互作用所得到的產品。因此本發明本文中，用語「醫藥製劑」及「醫藥組合物」在此可互換使用，意指藉由混合本發明產品及醫藥上或生理上可接受載體所製作的製劑、物質或組合物。
用詞「醫藥上可接受的載體」或「生理上可接受的載體」在此意指醫藥上或生理上可接受的材料、組合物、物質或載具，包括但不限於液體、或固體填料、稀釋劑、賦形劑、溶劑或膠囊化材料，其涉及將對象支架聚藥效團(subject scaffolded polypharmacophores)從一器官、或身體部分攜帶或運送到其他器官或身體部分。
本發明的醫藥製劑或組合物當作疫苗特別有用。本文中，用語「疫苗」(也稱為「免疫原性組合物」)係指在接種動物時具有誘導抗腫瘤免疫性的功能之物質。
除非另外定義，用語「癌症」意指過度表現HJURP基因的癌症，例如包括但不限於AML、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、CML、大腸直腸癌、食道癌、擴散型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤及睪丸腫瘤。
除非另外定義，用語「細胞毒性T淋巴球」、「細胞毒性T細胞」及「CTL」，在此可互換使用，且除非特別指明，意指T淋巴球的次群組，其能識別非己細胞(例如腫瘤/癌細胞、受病毒感染的細胞)，並誘導此種細胞的死亡。
除非特別定義，用語「HLA-A24」意指含次型之HLA-A24，次型包括但不限於HLA-A＊2401、HLA-A＊2402、HLA-A＊2403、HLA-A＊2404、HLA-A＊2407、HLA-A＊2408、HLA-A＊2420、HLA-A＊2425及HLA-A＊2488。
除非另外定義，用語「HLA-A2」在此代表性地意指次型，次型例如包括但不限於HLA-A＊0201、HLA-A＊0202、HLA-A＊0203、HLA-A＊0204、HLA-A＊0205、HLA-A＊0206、HLA-A＊0207、HLA-A＊0210、HLA-A＊0211、HLA-A＊0213、HLA-A＊0216、HLA-A＊0218、HLA-A＊0219、HLA-A＊0228及HLA-A＊0250。
除非另外定義，於此使用之用語「套組」被使用於關於試劑與其他材料之組合。於此考慮之套組包括微陣列、晶片、標誌物等。並無打算使用語「套組」限制於試劑及/或材料之特定組合。
在個體或病患的內容中，用詞「HLA-A2陽性」意指該個體或病患以同型合子或異型合子帶有HLA-A2抗原基因，及HLA-A2抗原在該個體或病患的細胞中表現為HLA抗原。
同樣地，在個體或病患的內容中，用詞「HLA-A24陽性」意指該個體或病患以同型合子或異型合子帶有HLA-A24抗原基因，及HLA-A24抗原在該個體或病患的細胞中表現為HLA抗原。
當本發明的方法與組合物在上下文中指出用於癌症的「治療」，當其造成臨床上的益處，例如在個體中的HJURP基因表現降低、腫瘤的體積減小、癌症的廣泛程度或轉移潛力降低，則治療係視為「有效」。當該治療為預防性使用時，「有效」意指其阻礙或防止癌症形成或預防或減輕癌症的臨床症狀。有效性係利用任何已知用於診斷或治療特定腫瘤形式的方法來決定。
若本發明的材料與方法與組合物在上下文中指出有用於癌症的「防止」及「預防」，此等用語係在此可互換地意指任何減低由於疾病導致的死亡率或發病率的活性。防止及預防可發生於「初級、次級及三級的預防水平」。初級的防止及預防避免疾病的發展，次級及三級的防止及預防水平包含目標為防止及預防疾病進展、展現出症狀、及藉由回復功能及減少疾病相關併發症以減少已建立的疾病的影響的活性。或者，防止及預防可包括廣泛的預防性療法，其目標減輕特定病症的嚴重度，例如減少腫瘤的增殖及轉移。
本文中，癌症的治療及/或預防及/或防止其術後再發，包括以下步驟：例如以外科手術移除癌細胞、抑制癌化細胞的生長、腫瘤退化或復原、誘導緩解及抑制腫瘤發生、腫瘤退化，及減少或抑制轉移。有效的癌症治療及/或預防可減少死亡率並改善患癌個體的預後，減少腫瘤標記物在血液中的濃度，並減輕伴隨癌症的可偵測症狀。例如，減少或改善症狀構成有效治療及/或預防，包括10%、20%、30%或以上的減少，或穩定的疾病。
本文中，用語「抗體」意指對特定蛋白質或其胜肽具有專一性反應的免疫球蛋白及其片段。抗體可包括人類抗體、靈長猿抗體、嵌合抗體、人型化抗體、與其他蛋白質或放射性標記融合的抗體，及抗體片段。再者抗體在此係以最廣的含意使用，具體含蓋單株抗體、多株抗體、由至少兩個完整無缺的抗體所形成的多專一性抗體(例如雙專一性抗體)，及抗體片段，只要能顯現所欲的生物學活性即可。「抗體」代表所有族(class)者(例如IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)。
除非另外定義，在此使用的所有技術及科學用語與本發明所屬技術領域中具有通常知識者一般了解的含意相同。
II.　胜肽
為了證明衍生自HJURP之胜肽作用如被CTL所辨認之抗原，分析衍生自HJURP(序列識別號：50)的胜肽，確定是否為一般常見的HLA對偶基因之HLA-A24或A2所限制的抗原決定基(Date Y et al.,Tissue Antigens 47: 93-101,1996;Kondo A et al.,J Immunol 155: 4307-12,1995;Kubo RT et al.,J Immunol 152: 3913-24,1994)。
衍生自HJURP之HLA-A24連接胜肽的候選物，使用對HLA-A24之連接親和力的資訊鑑別。鑑別出以下的候選胜肽：
HJURP-A24-9-576(序列識別號：2)
HJURP-A24-9-28(序列識別號：3)
HJURP-A24-9-263(序列識別號：4)
HJURP-A24-9-403(序列識別號：5)
HJURP-A24-9-388(序列識別號：6)
HJURP-A24-9-408(序列識別號：7)
HJURP-A24-9-544(序列識別號：8)
HJURP-A24-9-280(序列識別號：9)
HJURP-A24-10-149(序列識別號：10)
HJURP-A24-10-395(序列識別號：11)
HJURP-A24-10-729(序列識別號：12)
HJURP-A24-10-56(序列識別號：13)
HJURP-A24-10-590(序列識別號：14)
HJURP-A24-10-635(序列識別號：15)
HJURP-A24-10-389(序列識別號：16)
HJURP-A24-10-28(序列識別號：17)
HJURP-A24-10-383(序列識別號：18)
HJURP-A24-10-379(序列識別號：19)
HJURP-A24-10-235(序列識別號：20)
HJURP-A24-10-218(序列識別號：21)
HJURP-A24-10-388(序列識別號：22)
HJURP-A24-10-162(序列識別號：23)及
HJURP-A24-10-627(序列識別號：24)。
再者，利用經此等胜肽脈衝(載入)的樹狀細胞(DC)體外刺激T-細胞之後，由下列各胜肽刺激DC，成功地建立了CTL:
HJURP-A24-9-28(序列識別號：3)
HJURP-A24-9-263(序列識別號：4)
HJURP-A24-9-408(序列識別號：7)
HJURP-A24-10-383(序列識別號：18)及
HJURP-A24-10-162(序列識別號：23)。
這些建立的CTL顯示有效的專一性的CTL活性對抗經各胜肽脈衝的目標細胞。此結果證明HJURP為CTL所識別的抗原，且所測試的胜肽為HLA-A24所限制的HJURP的抗原決定基胜肽。
從HJURP衍生的HLA-A2連接胜肽的候選者，依據對HLA-A2的連接親和性來鑑別。鑑別出以下的候選胜肽：
HJURP-A2-9-496(序列識別號：26)
HJURP-A2-9-354(序列識別號：27)
JURP-A2-9-266(序列識別號：28)
HJURP-A2-9-51(序列識別號：29)
HJURP-A2-9-406(序列識別號：30)
HJURP-A2-9-129(序列識別號：31)
HJURP-A2-9-599(序列識別號：32)
HJURP-A2-9-226(序列識別號：33)
HJURP-A2-9-274(序列識別號：34)
HJURP-A2-9-386(序列識別號：35)
HJURP-A2-9-244(序列識別號：36)
HJURP-A2-10-405(序列識別號：37)
HJURP-A2-10-128(序列識別號：38)
HJURP-A2-10-649(序列識別號：39)
HJURP-A2-10-273(序列識別號：40)
HJURP-A2-10-266(序列識別號：41)
HJURP-A2-10-598(序列識別號：42)
HJURP-A2-10-54(序列識別號：43)
HJURP-A2-10-731(序列識別號：44)
HJURP-A2-10-397(序列識別號：45)
HJURP-A2-10-157(序列識別號：46)
HJURP-A2-10-455(序列識別號：47)及
HJURP-A2-10-156(序列識別號：48)。
再者，利用經這些胜肽脈衝(載入)的樹狀細胞(DC)體外刺激T-細胞之後，使用下列各胜肽成功地建立了CTL:
HJURP-A2-9-496(序列識別號：26)
HJURP-A2-9-354(序列識別號：27)
HJURP-A2-9-406(序列識別號：30)
HJURP-A2-9-129(序列識別號：31)
HJURP-A2-9-599(序列識別號：32)
HJURP-A2-9-386(序列識別號：35)
HJURP-A2-10-405(序列識別號：37)
HJURP-A2-10-128(序列識別號：38)及
HJURP-A2-10-54(序列識別號：43)。
此建立的CTL顯示有效的專一性的CTL活性對抗經各胜肽脈衝的目標細胞。此結果證明HJURP為CTL所識別的抗原，且所測試的胜肽為由HLA-A2限制的HJURP的抗原決定基胜肽。
由於該HJURP基因在癌細胞中過度表現，該癌症例如AML、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、CML、大腸直腸癌、食道癌、擴散型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤及睪丸腫瘤，且未表現於大多數的正常器官，HJURP基因為癌症免疫療法的良好標靶。因此本發明提供來自HJURP的CTL-識別的抗原決定基之九胜肽(由9個胺基酸殘基構成的胜肽)及十胜肽(由10個胺基酸殘基構成的胜肽)。或者，本發明提供單離的胜肽，其連接於HLA抗原並誘導細胞毒性T淋巴球(CTL)，其中該胜肽具有選自序列識別號：50的胺基酸序列或為其免疫活性片段。更具體而言，在一些具體例中，本發明提供具有選自序列識別號：2至24及26至48的胺基酸序列的胜肽。
一般而言，在網際網路上已可獲取軟體程式，例如記載於Parker KC et al.,J Immunol 1994 Jan 1,152(1): 163-75及Nielsen M et al.,Protein Sci 2003;12: 1007-17，可用於以電腦模擬計算各種胜肽與HLA抗原之間的連接親和性。與HLA抗原的連接親和性可被測量，例如記載於Parker KC et al.,J Immunol 1994 Jan 1,152(1): 163-75,Kuzushima K et al.,Blood 2001,98(6): 1872-81,Larsen MV et al. BMC Bioinformatics. 2007 Oct 31;8: 424,Buus S et al. Tissue antigens.,62:378-84,2003,Nielsen M et al.,Protein Sci 2003;12: 1007-17,and Nielsen M et al. PLoS ONE 2007;2: e796，整理於例如Lafuente EM et al.,Current Pharmaceutical Design,2009,15,3209-3220。確定連接親和性的方法，敘述於例如Journal of Immunological Methods(1995,185: 181-190)及Protein Science(2000,9: 1838-1846)。因此，可使用此等軟體程式選擇與HLA抗原具有高度連接親和性的衍生自HJURP的片段。因此本發明包含由衍生自HJURP的片段所構成的胜肽，係由此已知程式確認與HLA抗原連接。再者此胜肽可包括由HJURP全長所構成的胜肽。
本發明之胜肽，特別是本發明之九胜肽與十胜肽，可有額外的胺基酸殘基在其側面，只要此胜肽保留其CTL誘導能力即可。該特定的額外胺基酸殘基可由任何種類胺基酸所構成，只要其不損及原始胜肽的CTL誘導能力即可。因此本發明包含具有與HLA抗原連接親和性的胜肽，包括從HJURP衍生的胜肽。此種胜肽例如少於約40個胺基酸，通常少於約20個胺基酸，更通常少於約15個胺基酸。
一般而言，已知在胜肽中修飾一個或以上的胺基酸不會影響該胜肽的功能，或有時甚至會增強原始蛋白質的所欲功能。事實上，經修飾的胜肽(即，在原始參考序列由取代、刪除、插入或增加一、二或數個胺基酸殘基的修飾之胺基酸序列所構成的胜肽)已知會保留原始胜肽的生物學活性(Mark et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1984,81: 5662-6;Zoller and Smith,Nucleic Acids Res 1982,10: 6487-500;Dalbadie-McFarland et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1982,79: 6409-13)。因此，依照本發明一具體例，本發明之具有CTL誘導能力的胜肽可由具有選自序列識別號:2至24及26至48中的胺基酸序列所構成，其中一、二或更多胺基酸經增加、刪除及/或取代。
該技術領域中具有通常知識者了解對於一胺基酸序列的個別增加、刪除、插入或取代，即改變單一胺基酸或小比例的胺基酸，造成原始胺基酸側鏈性質的保留性，因此稱為「保留性取代」或「保留性修飾」，其中蛋白質的改變造成類似功能的蛋白質。保留性取代的表列提供功能類似的胺基酸，在該技術領域中係為人所熟知。胺基酸側鏈的性質例如疏水性胺基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性胺基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，及具有
以下共通的官能基或特性的側鏈：脂肪族側鏈(G、A、V、L、I、P)；含羥基的側鏈(S、T、Y)；含硫原子的側鏈(C、M)；含羧酸及醯胺的側鏈(D、N、E、Q)；含鹼的側鏈(R,K,H)；含芳香族基的側鏈(H、F、Y、W)。而且，以下8個群組各包含互為保留性取代的胺基酸：
1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；
2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；
3)天冬醯胺酸(N)、麩醯胺酸(Q)；
4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；
5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；
6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；
7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；及
8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參見例如Creighton,Proteins 1984)。
此種經保留性修飾的胜肽也被認為是本發明之胜肽。但是本發明之胜肽不限於此，可包括非保留性修飾，只要獲得的經修飾的胜肽保留原始胜肽的CTL誘導能力即可。再者，該經修飾的胜肽不應排除CTL可誘導胜肽的多型變異體、種間同源體、及HJURP的對偶基因。
胺基酸殘基可插入、取代或增加本發明之胜肽，或者，胺基酸殘基可從本發明胜肽刪除，以達到更高的連接親和性。為了保留必要的CTL誘導能力，較佳僅修飾(插入、刪除增加及/或取代)小數目(例如1、2或數個)或小比例的胺基酸。在此用語「數個」意指5個或以下胺基酸，例如4個或3個或以下。欲修飾的胺基酸比例可為20%或以下，例如15%或以下，又更佳為10%或以下，例如1至5%。
當使用在癌症免疫療法時，本發明胜肽與HLA抗原形成複合體被呈現在細胞或外吐小體的表面。因此，較佳選擇不僅會誘導CTL還具有對HLA抗原高度連接親和性的胜肽。為此，胜肽可以取代、插入及/或增加胺基酸殘基進行修飾，以產生具有改良的連接親和性的經修飾胜肽。除了自然被顯示的胜肽以外，由於因連接於HLA抗原而被呈現的胜肽序列的規則性為已知(J Immunol 1994,152: 3913;Immunogenetics 1995,41: 178;J Immunol 1994,155: 4307)，因此本發明之免疫原性胜肽可基於此規則性進行修飾。
例如有高度HLA-A24連接親和性的胜肽，傾向於在N端起算的第2個胺基酸被取代為苯丙胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸或色胺酸。同樣地，在C端的胺基酸被取代為苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸或甲硫胺酸的胜肽也是較佳使用者。因此，具有選自序列識別號：2至24的胺基酸序列的胜肽，其中該序列識別號的胺基酸序列中從N端起算第2個胺基酸取代為苯丙胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸或色胺酸，及/或該序列識別號的胺基酸序列中的C端的胺基酸取代為苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸或甲硫胺酸，皆包含於本發明中。
或者，於顯示高度HLA-A2連接親和性的胜肽，理想為將從N端起算的第2個胺基酸取代為白胺酸或甲硫胺酸，或將C端胺基酸取代為纈胺酸或白胺酸。因此，具有選自序列識別號：26至48的胺基酸序列的胜肽，其中該序列識別號的胺基酸序列中從N端起算第2個胺基酸取代為白胺酸或甲硫胺酸，及/或其中該序列識別號的胺基酸序列中的C端胺基酸取代為纈胺酸或白胺酸，皆包含於本發明中。
取代不僅可在末端胺基酸，也可在胜肽潛在的T細胞受體(TCR)辨識部位。已有一些研究證明具有胺基酸取代的胜肽，與原始胺基酸有同等或更好的功能，例如CAP1、p53(264-272),Her-2/neu(369-377)或gp100(209-217)(Zaremba et al. Cancer Res. 57,4570-4577,1997,T. K. Hoffmann et al. J Immunol.(2002)Feb 1;168(3): 1338-47.,S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother.(2003)52: 199-206 and S. O. Dionne et al. Cancer Immunology,Immunotherapy(2004)53,307-314)。
本發明也考量增加一、二或數個胺基酸到本發明之胜肽的N及/或C端。該具有高度HLA抗原連接親和性及保留CTL誘導能力的修飾胜肽，也包括於本發明。例如本發明提供長度小於14、13、12、11或10個胺基酸的單離的胜肽，包含選自以下構成的群組的胺基酸序列：
(i)　一胺基酸序列，選自序列識別號：2至9及26至36，其中1、2或數個胺基酸經取代，其中該胜肽連接於HLA抗原並誘導細胞毒性T淋巴球，以及
(ii)如(i)之胺基酸序列，其中該胺基酸序列有以下一或兩種特性者：
(a)　從該序列識別號的N端起算的第2個胺基酸為選自白胺酸或甲硫胺酸；
(b)　該序列識別號的C端胺基酸為選自纈胺酸或白胺酸。
再者，本發明亦提供長度小於15、14、13、12或11個胺基酸的單離的胜肽，包含選自以下構成的群組的胺基酸序列：
(i’)一胺基酸序列，選自序列識別號：10至24及37至48，其中1、2或數個胺基酸經取代，其中該胜肽連接於HLA抗原並誘導細胞毒性T淋巴球，以及
(ii’)如(i’)之胺基酸序列，其中該胺基酸序列有以下一或兩種特性者：
(a)　從該序列識別號的N端起算的第2個胺基酸為選自白胺酸或甲硫胺酸；以及
(b)　該序列識別號的C端胺基酸為選自纈胺酸或白胺酸。
當此等胜肽與APC接觸或導入APC時，此等胜肽在APC中經處理而將(i)、(ii)、(i’)及(ii’)的胜肽呈現於其上。
但是，當該胜肽序列與具有不同功能的內生性或外生性蛋白質的胺基酸序列有一部分相同時，可能會引起副作用，例如產生自體免疫病症或對於特定物質產生過敏症狀。因此，可使用可得的資料庫進行同源性檢索，以避免該胜肽的序列符合其他蛋白質的胺基酸序列。當同源性檢索顯示沒有與目標胜肽有1或2個胺基酸差異的胜肽時，可修飾該目標胜肽以增強與HLA抗原的連接親和性，及/或增強其CTL誘導能力而不會有這些副作用的風險。
雖然預期上述與HLA抗原具有高度連接親和性的胜肽高度有效，但是仍然進一步檢驗依高度連接親和性的存在做為指標所篩選的候選胜肽，是否存在CTL誘導能力。在此，用詞「CTL誘導能力」代表當胜肽被抗原表現細胞(APC)呈現時，該胜肽誘導CTL的能力。又，「CTL誘導能力」包括誘導CTL活化、CTL增殖、目標細胞的促進CTL溶解及增加CTL的IFN-gamma生產之胜肽能力。
CTL誘導能力的確認係由以下方式達成，誘導攜帶人類MHC抗原的APC(例如B-淋巴球、巨噬體、及樹狀細胞(DC))，或更具體而言，由人類周邊血液單核白血球衍生的DC，以該胜肽刺激後，與CD8+細胞混合，然後測量對抗該目標細胞的IFN-gamma生產與CTL的釋出。反應系可使用已生產用於表現人類HLA抗原的基因轉殖動物(例如BenMohamed L,Krishnan R,Longmate J,Auge C,Low L,Primus J,Diamond DJ,Hum Immunol 2000 Aug,61(8): 764-79,Related Articles,Books,Linkout Induction of CTL response by a minimal isotope vaccine in HLA A*02 01/DR1 transgenic mice: dependent on MHC(HLA) class II restricted T(H) response)。例如以51Cr等放射性標定目標細胞，從該目標細胞釋出的放射性活性計算細胞毒性。或者，可測量在攜帶固定化胜肽的APC存在下，CTL所生產及釋出的IFN-gamma，並使用抗IFN-gamma單株抗體使培養基上的抑制區可見化而檢驗。
如上所述檢驗胜肽的CTL誘導能力的結果，發現選自具有序列識別號：2至24及26至48所示的胺基酸序列的胜肽之九胜肽或十胜肽，顯示特別高的CTL誘導能力及對HLA抗原的高連接親和性。因此，這些胜肽為本發明較佳具體例。
再者，同源性分析結果證明這些胜肽與其他任何已知人類基因產物所衍生的胜肽不具有顯著的同源性。此可降低因使用於免疫療法所發生未知或不欲的免疫反應的可能性。因此，也是從此方面來看，這些胜肽有效於誘出癌症病患中對抗HJURP的免疫性。因此，本發明之胜肽較佳為具有選自序列識別號：2至24及26至48之胺基酸序列的胜肽。
除了本發明胜肽的修飾以外，如上所討論，本發明之胜肽可連結於其他胜肽，只要得到的連接胜肽保留必要的原始胜肽的CTL誘導能力即可，且更佳為，也保留必要的HLA連接。「其他」胜肽包括例如：本發明之胜肽，或由其他TAA所衍生的CTL誘導性胜肽。胜肽間的連結子(linker)為該技術領域中所熟知，例如AAY(P. M. Daftarian et al.,J Trans Med 2007,5:26)、AAA、NKRK(R. P. M. Sutmuller et al.,J Immunol. 2000,165: 7308-7315)或K(S. Ota et al.,Can Res. 62,1471-1476,K. S. Kawamura et al.,J Immunol. 2002,168: 5709-5715)。
例如也可實質上同時使用非HJURP腫瘤關聯性抗原的胜肽，以增強經由HLA第I類及/或第II類的免疫反應。已知癌細胞能表現多於一種的腫瘤關聯基因。該技術領域中具有通常知識者在例行實驗中會檢查是否特定個體表現額外的腫瘤關聯基因，然後將衍生自此種基因的表現產物的HLA第I類及/或HLA第II類連接胜肽包括於本發明的HJURP組合物或疫苗中。
HLA第I類及HLA第II類連接胜肽之例為該技術領域中具通常知識者所周知(例如見Coulie,Stem Cells 13:393-403,1995)，且可以此述之方式使用於本發明。該技術領域中具通常知識者可依照分子生物學的標準程序，製備包括一個或以上HJURP胜肽及一個或以上非HJURP胜肽的多胜肽、或編碼此多胜肽的核酸。
上述連結的胜肽在此係指為「多胞型(polytope)」，即兩種或以上有潛力的免疫原性或免疫反應刺激的胜肽，可利用各種排列接合在一起(例如連鎖、重疊)。該多胞型(或編碼該多胞型的核酸)，可以標準免疫實驗步驟投予到例如動物，以測試該多胞型在刺激、增強及/或誘起免疫反應的能力。
該胜肽可以直接接合在一起，或經由使用側翼序列(flanking sequence)以形成多胞型，且使用多胞型做為疫苗為周知(參見例如Thomson et al.,Proc. Natl. Acad.Sci USA 92(13):5845-5849,1995;Gilbert et al.,Nature Biotechnol. 15(12):1280-1284,1997;Thomson et al.,J Immunol. 157(2):822-826,1996;Tarn et al.,J Exp. Med. 171(1):299-306,1990)。可製備含有不同數目及組合的抗原決定基之多胞型，並測試CTL的識別性及增加免疫反應的效果。
再者，本發明之胜肽可進一步連結於其他物質，只要其保留CTL誘導能力即可。此種物質可包括:胜肽、脂質、糖類及糖鏈、乙醯基、天然及合成的聚合物等。該胜肽可包含經修飾者，例如糖化、側鏈氧化或磷酸化.;只要此修飾不會損害此處所述的胜肽的生物學活性即可。此等種類可修飾實施以用於提供額外的功能(例如標靶功能，及傳遞功能)，或使該多胜肽穩定化。
例如，為了增加多胜肽的體內穩定性，該技術領域中已知導入D-胺基酸、胺基酸擬似物或非天然胺基酸;此概念也可被採用於本發明之多胜肽。多胜肽的穩定性可以用多種方式分析。例如可使用胜肽酶及各種生物學介質，例如人類血漿及血清，以測試穩定性(參見例如Verhoef et al.,Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11: 291-302)。
再者，如上所述，在經取代、刪除或增加一、二或數個胺基酸殘基的修飾胜肽中，可篩選或選擇具有與原始胜肽相同或更高活性者。因此，本發明也提供篩選或選擇具有與原始胜肽相同或更高活性之經修飾的胜肽的方法。例如該方法包括以下步驟:
a：取代、刪除或增加本發明之胜肽的至少一個胺基酸殘基；
b：確定該胜肽的活性；及
c：篩選或選擇具有與原始胜肽相同或更高活性的胜肽。
在此活性可包括MHC連接活性、APC或CTL誘導能力及細胞毒性活性。
在此，本發明之胜肽也可稱為「HJURP胜肽」或「HJURP多胜肽」。
III.　製備HJURP胜肽
本發明之胜肽可使用周知的技術製備。例如該胜肽可藉由合成、重組DNA技術或化學合成所製備。本發明之胜肽可個別合成，或製成包括兩個或以上之胜肽的較長多胜肽。該胜肽可單離，例如經純化或單離成實質上不含其他天然產生的寄主蛋白質及其片段、或其他任何化學物質。本發明之胜肽可包含經修飾者，例如糖化、側鏈氧化或磷酸化；只要此等修飾不損害原始胜肽的生物學活性即可。其他的修飾，包括可使用例如併入D-胺基酸或其他胺基酸擬似物，例如以增加該胜肽的血清半衰期。
本發明之胜肽可依據選擇的胺基酸序列由化學合成獲得。例如可採用於合成的習知胜肽合成方法包括：
(i)Peptide Synthesis,Interscience,New York,1966;
(ii)TheProteins,Vol. 2,Academic Press,New York,1976;
(iii)Peptide Synthesis(日文),Maruzen Co.,1975;
(iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis(日文),Maruzen Co.,1985;
(v)Development of Pharmaceuticals(second volume)(日文),Vol. 14(Peptide synthesis),Hirokawa,1991;
(vi)WO99/67288；及
(vii)Barany G. & Merrifield R.B.,Peptide Vol. 2,“Solid Phase Peptide Synthesis”,Academic Press,New York,1980,100-118
或者，本發明之胜肽可採用任何已知用於生產胜肽的的遺傳工程方法獲得(例如Morrison J,J Bacteriology 1977,132: 349-51;Clark-Curtiss & Curtiss,Methods in Enzymology(eds. Wu et al.)1983,101: 347-62)。例如先製備帶有編碼可表現形式的目標胜肽(例如對應於啟動子序列的調節序列的下游)之多核苷酸的適當載體，轉形到適當的寄主細胞中。本發明也提供此種載體及寄主細胞。然後培養該寄主細胞以生產受關注的胜肽。該胜肽也可採用體外轉譯系統於體外生產。
IV.　多核苷酸
本發明提供編碼前述本發明之任一胜肽的多核苷酸。此包括衍生自天然產生的HJURP基因(GenBank存取號NM_018410(例如序列識別號：49))衍生的多核苷酸，及具有其保留性修飾的核苷酸序列之多核苷酸。在此，用詞「經保留性修飾的核苷酸序列」係指編碼為相同或基本上相同的胺基酸序列之序列。因為遺傳密碼的退化，大量的功能上相同的核酸編碼任一特定的蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG及GCU都編碼胺基酸丙胺酸。因此，在以密碼子確定為丙胺酸的每一位置，該密碼子可改變成上述任一對應的密碼子而不改變所編碼的多胜肽。此種核酸變異為「靜默變異」，為一種保留性修飾的變異。此述的每一編碼胜肽的核酸也說明該核酸的所有可能的靜默變異。該技術領域中具有通常知識者將體認到一核酸中的每一密碼子(除了AUG及TGG以外，AUG通常為甲硫胺酸的唯一密碼子，TGG通常為色胺酸的唯一密碼子)可經修飾以產生功能上相同的分子。因此編碼胜肽的核酸的各靜默變異隱含在各揭露的序列中。
本發明之多核苷酸可由DNA、RNA及其衍生物所構成。如該技術領域中所知，DNA分子係適當的由鹼基，例如天然發生的鹼基A、T、C及G所構成，在RNA中T取代為U。該技術領域之人士將體認非天然產生的鹼基也包括在多核苷酸中。
本發明之多核苷酸可編碼具有或沒有中介胺基酸序列的多種本發明之胜肽。例如，該中介胺基酸序列可提供該多核苷酸或該經轉譯的胜肽的切斷部位(例如酵素識別序列)。再者，該多核苷酸可包括編碼本發明之胜肽的編碼序列之額外的序列。例如該多核苷酸可為一重組多核苷酸，其包括表現該胜肽所需的調節序列，或可為具有標記基因等的表現載體(質體)。一般而言，此種重組多核苷酸可利用習知的重組技術，使用例如聚合酶及內切核酸酶的多核苷酸操作而製備。
重組及化學合成技術均可使用於生產本發明之多核苷酸。例如多核苷酸可藉由插到適當載體中而生產，該載體當轉染到勝任細胞內時可表現該多核苷酸。或者，多核苷酸可使用PCR技術擴增，或在適當寄主中表現(參見例如Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1989)。或者，多核苷酸可使用固相技術合成，如Beaucage SL & Iyer RP,Tetrahedron 1992,48: 2223-311;Matthes et al.,EMBO J 1984,3: 801-5所敘述。
V.　外吐小體
本發明更提供胞外的囊泡，稱為外吐小體，其會在表面呈現由本發明之胜肽及HLA抗原所形成的複合體。外吐小體可利用例如使用在日本專利申請案公表號平11-510507及在WO99/03499詳述的方法，可使用獲自需治療及/或預防的病患之APC來製備。本發明的外吐小體可當做疫苗接種，類似本發明之胜肽。
該複合體中所包括的HLA抗原類型必需符合需要治療及/或預防的個體的HLA抗原類型。例如於日本族群中，HLA-A24或HLA-A2，特別是HLA-A*2402及HLA-A*0201及HLA-A*0206通常為適當的。使用在日本人及白種人中高度表現的A24型或A2型，有利於獲得有效的結果，其次型，如A*0201與A*0206也發現有用。通常，臨床上，會預先對於需要治療的病患調查HLA抗原類型，此調查能適當選擇對此抗原具有高度親和性的胜肽或藉由抗原呈現而具有CTL誘導能力的胜肽。再者，為了獲得顯示高度連接親和性及CTL誘導能力的胜肽，可依據天然產生的HJURP部分胜肽的胺基酸序列實施1、2或數個胺基酸取代、刪除或增加。
當針對本發明的外吐小體使用A24型HLA抗原，具有序列識別號：2至24中任一序列的胜肽特別有用。
或者當針對本發明的外吐小體使用A2型HLA抗原，具有序列識別號：26至48中任一序列的胜肽為有用。
VI.抗原表現細胞(APC)
本發明也提供單離的APC，其在表面上呈現由HLA抗原與本發明之胜肽所形成的複合體。該APC可來自需治療及/或預防的病患，且本身可當做疫苗投予，或與其他包括本發明之胜肽、外吐小體或CTL的藥物組合投予。
該APC不限於特定種類的細胞，且包括樹狀細胞(DC)、蘭氏(Langerhans)細胞、巨噬體、B細胞及經活化的T細胞，已知會在表面上呈現蛋白質性抗原，因此被淋巴球所識別。因為DC係APC中具有最強的CTL誘導活性的代表性APC，發現DC用作為本發明的APC。
例如，本發明之APC可獲得自從周邊血液單核球誘導DC，然後使其與本發明之胜肽在體外(in vitro)、離體(ex vivo)或體內(in vivo)接觸(刺激)而獲得。當本發明之胜肽投予該個體時，呈現本發明之胜肽的APC在該個體內被誘發。因此，本發明之APC可在投予該個體本發明之胜肽後，從該個體收集APC而獲得。或者本發明的APC可使從個體收集到的APC與本發明之胜肽接觸而獲得。
本發明之APC可投予個體以誘導在個體內由其所引起的對抗癌症的免疫反應，或與其他包括本發明之胜肽、外吐小體或CTL組合投予。例如離體投予可包括以下步驟：
a：　從第一個體收集APC，
b：　使步驟a的APC接觸該胜肽，以及
c：　投予第二個體步驟b的APC。
該第一個體及第二個體可為同一個體或不同個體。由步驟b獲得的APC可當做疫苗投予以供治療及/或預防癌症，癌症例如包括但不限於AML、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、CML、大腸直腸癌、食道癌、擴散型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤及睪丸腫瘤，但不限於此。
本發明也提供一種用於誘導APC的醫藥組合物之製造方法或過程，該方法包括將本發明的胜肽與醫藥上可接受的載體混合或調配。
本發明一方面，APC具有高水平的CTL誘導能力。用語「高水平的CTL誘導能力」中，高水平係關於APC與非胜肽或不會誘導CTL的胜肽接觸時的誘導CTL的程度。具有高水平的CTL誘導能力的APC可由在體外將編碼本發明之胜肽的多核苷酸轉移到APC的步驟及上述方法來製造。導入基因可為DNA或RNA形式。導入的方法無特別限制，
可使用各種在該領域中實施的習知方法，例如脂染、電穿孔或磷酸鈣法。更具體而言，可依照Cancer Res 1996,56: 5672-7;J Immunol 1998,161: 5607-13;J Exp Med 1996,184: 465-72；國際公開號2000-509281的已公開的日文翻譯所述實施。藉由將該基因轉移至APC中，使該基因在細胞中進行轉錄、轉譯等，然後獲得的蛋白質經MRC第I類或第II類處理，並經過表現路徑而呈現部分胜肽。
VII.　細胞毒性T淋巴球(CTL)
對抗任一本發明之胜肽所誘導的CTL在體內強化以癌細胞為目標的免疫反應，因此可作為類似該胜肽的疫苗。因此，本發明提供單離的CTL，其係由任一本發明之胜肽專一性誘導或活化。
此種CTL可藉由以下獲得(1)投予個體本發明之胜肽，或(2)使個體衍生的APC及CD8+細胞、或周邊血液單核白血球在體外與本發明胜肽接觸(刺激)，或(3)使CD8+細胞或周邊血液單核白血球在體外與表面呈現由HLA抗原與該胜肽所形成的複合體的APC或外吐小體，或(4)導入一基因，該基因包括編碼連接於本發明之胜肽的T細胞受體(TCR)次單元的多核苷酸。此種APC或外吐小體可藉由上述方法製備，且(4)的方法的細節敘述於「VIII. T細胞受體(TCR)」項。
本發明之CTL可由受治療及/或預防的病患獲得，且可自身投予或與其他包括本發明之胜肽、外吐小體組合投予，以達到調節效果。獲得的CTL專一性地對抗呈現本發明之胜肽(例如用於誘導的相同胜肽)的目標細胞。該目標細胞可為內生性表現HJURP的細胞，例如癌細胞或是經轉染該HJURP基因的細胞；及由於該胜肽刺激而在表面呈現本發明之胜肽的細胞，也可作為活化的CTL攻擊的目標。
VIII. T細胞受體(TCR)
本發明也提供一種組合物，其包含編碼可形成T細胞受體(TCR)次單元的多胜肽之核酸；及其使用方法。TCR次單元具有形成TCR的能力，TCR對於對抗呈現HJURP的腫瘤細胞之T細胞具有專一性。藉由使用該技術領域中的已知方法，可鑑別作為以一個或以上本發明之胜肽所誘導的CTL的TCR次單元之alpha-與beta-鏈的核酸(WO2007/032255與Morgan et al.,J Immunol,171,3288(2003))。例如分析TCR較佳為使用PCR法。供分析的PCR引子可為例如5’-R引子(5’-gtctaccaggcattcgcttcat-3’)作為5’側引子(序列識別號：51)，及3-TRa-C引子(5’-tcagctggaccacagccgcagcgt-3’)，其係專一於TCR alpha鏈C區(序列識別號：52)、3-TRb-C1引子(5’-tcagaaatcctttctcttgac-3’)，其係專一於TCR beta鏈C1區(序列識別號：53)，或3-TRbeta-C2引子(5’-ctagcctctggaatcctttctctt-3’)，其係專一於TCR beta鏈C2區(序列識別號：54)，作為3’側引子，但不限於此。衍生物TCR可能以高親和力連接於顯示該HJURP胜肽的目標細胞，且選擇性地媒介有效地殺死在體內及體外呈現HJURP胜肽的目標細胞。
編碼TCR次單元的核酸可以併入適當載體，例如反轉錄病毒載體。此載體為此技術領域周知。該核酸或包含該核酸的載體，通常可傳送到T細胞，例如來自病患的T細胞。有利地，本發明提供一種現成的組合物，允許病患本身的T細胞(或另一哺乳動物的T細胞)快速修飾，以快速及簡單地產生具有優異的癌細胞殺死性質的修飾T細胞。
該專一性TCR為一受體，能專一性識別由本發明之胜肽與HLA分子所形成的複合體，當TCR被呈現在T細胞表面時，提供對抗目標細胞的T細胞專一性活性。上述複合體的專一性識別可由任何已知方法確認，較佳的方法包括例如：使用HLA分子與本發明之胜肽的HLA多聚體染色分析及ELISPOT分析法。藉由實施ELISPOT分析法，可確認在細胞表面表現TCR的T細胞經該TCR而識別一細胞，且該訊息會在胞內傳遞。確認當複合體存在於T細胞表面時，上述複合體會造成T細胞細胞毒性活性的情形，也可由已知方法進行。較佳方法，包括例如對抗HLA+目標細胞的細胞毒性活性的確定，例如鉻釋出分析法。
本發明也提供CTL，其由以編碼連接於HJURP胜肽之TCR次單元多胜肽的核酸轉導(transduction)而製備，該HJURP胜肽例如序列識別號：2至24對於HLA-A24，及序列識別號：26至48的胜肽對於HLA-A2。
經轉導的CTL能在體內導引至癌細胞，且可在體外以周知的培養方法擴增(例如Kawakami et al.,J Immunol.,142,3452-3461(1989))。本發明之CTL可用於形成免疫原性組合物，用於需要療法或保護的病患之癌症治療或預防(WO2006/031221)。
IX.　醫藥物質或組合物
因為HJURP的表現，相較於在正常組織，在癌症中特異地升高，癌症例如AML、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、CML、大腸直腸癌、食道癌、擴散型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤及睪丸腫瘤，因此本發明的胜肽或多核苷酸可用於治療及/或預防癌症及/或防止其術後復發。因此本發明提供一種醫藥製劑、物質或組合物供治療及/或預防癌症及/或預防其術後復發，及提供含有1種或以上之本發明胜肽或多核苷酸為活性成分之製劑、物質或組合物。或者，本發明之胜肽可表現在任何上述之外吐小體或細胞的表面上，例如APC，以供當作醫藥物質或組合物。而且，目標本發明之任一胜肽的上述CTL，也可做為本發明之醫藥物質或組合物的活性成分。
本發明中，用詞「活性成分」意指在製劑或組合物中具有生物學活性或生理活性的物質。特別是，在醫藥製劑或組合物中，「活性成分」係指顯示目標的藥理作用的物質。例如，當醫藥製劑或組合物用於癌症治療或預防時，製劑或組合物中的活性成分可直接或間接導致至少一種作用在癌細胞及/或組織的生物學或生理學作用。較佳為，該作用包括減少或抑制癌細胞生長、損害或殺死癌細胞及/或組織等。在調製配方前，「活性成分」也稱為「散裝物質(bulk)」、「藥物物質」或「技術產品」。
本發明之醫藥製劑或組合物可作為疫苗，本發明中，用詞「疫苗」(也稱為免疫原性組合物)係指當在動物接種時具有誘導抗腫瘤免疫性的功能的物質。
本發明之醫藥製劑或組合物可用於個體或病患之治療及/或預防癌症，及/或防止其術後復發，個體或病患包括人類及其他哺乳動物，包括小鼠、大鼠、天竺鼠、兔、貓、犬、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴、狒狒及黑猩猩，但不限於此，特別是商業上重要的動物或馴養動物。
於其他具體例，本發明也提供以活性成分製造供治療癌症或腫瘤的醫藥組合物或製劑的用途，該活性成分選自以下：
(a)　本發明之胜肽；
(b)　以可表現形式編碼為此述之胜肽的核酸；
(c)　在表面上呈現本發明之胜肽的APC或外吐小體；及
(d)　本發明之細胞毒性T細胞。
或者本發明更提供一種活性成分，用於治療或預防癌症或腫瘤，該活性成分選自以下：
(a)　本發明之胜肽；
(b)　以可表現形式編碼此述之胜肽的核酸；
(c)　在表面上呈現本發明之胜肽的APC或外吐小體；及
(d)本發明之細胞毒性T細胞。
或者本發明更提供用於治療癌症或腫瘤的醫藥組合物或物質的製造方法或過程，其中該方法或過程包括將醫藥上或生理上可接受的載體與選自以下的活性成分調配的步驟：
(a)本發明之胜肽；
(b)以可表現形式編碼此述之胜肽的核酸；
(c)在表面上呈現本發明之胜肽的APC或外吐小體；及
(d)本發明之細胞毒性T細胞。
於其他具體例，本發明更提供用於治療或預防癌症或腫瘤的醫藥組合物或物質的製造方法或過程，其中該方法或過程包括將活性成分與醫藥上或生理上可接受的載體混合的步驟，其中該活性成分選自以下：
(a)本發明之胜肽；
(b)以可表現形式編碼此述之胜肽的核酸；
(c)在表面上呈現本發明之胜肽的APC或外吐小體；及
(d)本發明之細胞毒性T細胞。
本發明之醫藥製劑、物質或組合物可用於個體或病患中治療及/或預防癌症或腫瘤，及/或防止其術後復發，個體或病患包括人類及其他哺乳動物，包括但不限於小鼠、大鼠、天竺鼠、兔、貓、犬、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴、狒狒及黑猩猩，特別是商業上重要的動物或馴養動物。
依照本發明，具有選自序列識別號：2至24之胺基酸序列的胜肽已發現為HLA-A24限制的抗原決定基胜肽或候選者，又，具有選自序列識別號：26至48之胺基酸序列的胜肽已發現為HLA-A2限制的抗原決定基胜肽或候選者，上述胜肽可誘導有效且專一性的免疫反應。因此包括具有序列識別號：2至24及26至48之胺基酸序列的胜肽之本發明之醫藥物質或組合物，尤適於投予HLA抗原為HLA-A24或HLA-A2的個體。同樣適用於包括編碼此等胜肽中任一多核苷酸(即本發明之多核苷酸)的醫藥物質或組合物。
本發明之醫藥物質或組合物所治療的癌症包括涉及HJURP(例如過度表現)的任何癌症，但不限於此，癌症包括AML、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、CML、大腸直腸癌、食道癌、擴散型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤及睪丸腫瘤，但不限於此。
本發明之醫藥物質或組合物除了含有上述活性成分，也可含有其他具有誘導對抗癌細胞的CTL的能力的胜肽、編碼為其他胜肽的其他多核苷酸、呈現其他胜肽的其他細胞等。在此，具有誘導對抗癌細胞的CTL的能力的其他胜肽，例如癌症專一性抗原(例如，經鑑別的TAA)，但不限於此。
可視需要，本發明之醫藥物質或組合物可選擇性地包括其他治療物質作為活性成分，只要該物質不會抑制該活性成分的抗腫瘤作用即可，例如任一本發明之胜肽。例如，配方可包括抗發炎物質或組合物、止痛劑、化學療劑等。除了在藥劑本身當中的其他治療物質，本發明的藥劑也可與一種或以上的其他藥理物質或組合物依序或同時投予。藥劑及藥理物質或組合物的量，取決於例如使用的藥理物質或組合物的形式、欲治療的疾病及投予的時程及路徑。
應瞭解除了此處特別提及的成分以外，本發明之醫藥物質或組合物可包括在該技術領域中關於配方形式所使用的習知的物質或組合物。
本發明之一具體例中，本發明之醫藥製劑、物質或組合物可包含在製造品及套組中，該製造品及套組含有有效治療欲治療的疾病(例如癌症)的病況的物質。製造品可包括附有標記的本發明之醫藥物質或組合物的容器。適當的容器包括瓶、小玻璃瓶及試管。該試管可由各種材料製作，例如玻璃或塑膠。容器上的標記必需指示該物質或組合物係用於治療或預防該疾病的一種以上的病況。該標記也可顯示投予指示等。
除了上述容器以外，包含本發明的醫藥製劑、物質或組合物的套組可以視情形更包括第二容器，盛裝醫藥上可容許的稀釋劑。從商業及使用者角度，可更包括其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、濾器、針、針筒及使用指示。
該醫藥組合物可視需要放在包裝或分配裝置中，其可包含一種或更多含有該活性成分的單位的劑量。該包裝例
如包括金屬或塑膠箔，例如泡殼包裝。該包裝或分配裝置可以隨附投予指示。
(1)　含有該胜肽當做活性成分之醫藥物質或組合物
本發明之胜肽可作為醫藥製劑、物質或組合物直接投予，或視需要以習知調配方法製劑。後者，除了本發明之胜肽，可適當使用通常使用於藥物的載體、賦形劑等而無特殊限制。載體的例子有無菌水、生理食鹽水、磷酸鹽緩衝液、培養液等。再者該醫藥物質或組合物視需要可包含安定劑、懸浮劑、保存劑、界面活性劑等。本發明之醫藥製劑、物質或組合物可用於抗癌症目的。
本發明之胜肽可組合製備成包括兩種或以上的本發明之胜肽，以在體內誘導CTL。該胜肽可為混合(雞尾酒)或利用標準技術彼此接合。例如該胜肽可以化學連結或表現成單一融合的多胜肽序列，以一或數個胺基酸當做連結子(例如Lysine linker: K. S. Kawamura et al. J. Immunol. 2002,168: 5709-5715)。組合的胜肽可相同或不同。藉由投予本發明之胜肽，該胜肽由APC上的HLA抗原高密度呈現，然後誘導對由所呈現的胜肽與HLA抗原所形成的複合體專一性反應的CTL。或者從個體移出APC(例如DC)，然後以本發明之胜肽刺激以獲得在細胞表面呈現本發明之胜肽的APC。再次投予個體這些APC以誘導該個體中的CTL，結果可增加對於腫瘤關聯內皮的侵犯性。
用於治療及/或預防癌症的醫藥物質或組合物，包括本發明之任一胜肽作為活性成分，可包括一佐劑以使細胞免疫有效建立，或可與其他活性成分一起投予，及可藉由配方為顆粒投予。佐劑意指當與具有免疫學活性的蛋白質一起(或連續)投予時，會增強對抗該蛋白質的免疫反應之任何化合物、物質或組合物。可適用的佐劑包括文獻中敘述者(Clin Microbiol Rev 1994,7:277-89)。例示的佐劑包括磷酸鋁、氫氧化鋁、明礬、霍亂毒素、沙門毒素、不完全弗氏佐劑(IFA)、完全弗氏佐劑(CFA)、ISCOMatrix、GM-CSF、CpG、O/W乳劑等，但不限於此。
再者，可便利地使用微脂體配方、顆粒配方，其中該胜肽連接於數微米直徑的珠子、及脂質連接於該胜肽的配方。
本發明之其他具體例，本發明之胜肽也可以醫藥上可接受鹽的形式投予。較佳的鹽例如包括鹼金屬的鹽類、金屬鹽類、有機鹼的鹽類、有機酸的鹽類及無機酸的鹽類。如述所使用的「醫藥上可接受的鹽」係指保留該化合物的生物學效力與性質的鹽類，且係藉由與無機酸或鹼例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸等反應所獲得者。此述鹽的較佳例包括鹼金屬的鹽類、金屬鹽類、有機鹼的鹽類、有機酸的鹽類及無機酸的鹽類。
一些具體例中，本發明之醫藥製劑、物質或組合物包括啟動CTL的成分。脂質已被確認為能夠於體內啟動CTL對抗病毒抗原的物質或組合物。例如棕櫚酸殘基可附著在離胺酸殘基的epsilon-及alpha-胺基，然後連結到本發明之胜肽。然後該脂質化的胜肽可直接以微胞或微粒投予、包入微脂體、或於佐劑中乳化投予。另一脂質啟動CTL反應的例子，當E. coli脂蛋白共價附著於一適當胜肽時，E. coli脂蛋白例如三棕櫚醯基-S-甘胺醯基半胱胺醯基-絲胺醯基-絲胺酸(P3CSS)可用於啟動CTL(參見例如Deres et al.,Nature 1989,342:561-4)。
投予方法可為口服、皮內、皮下、靜脈內及全身性投予或對於目標部位的鄰近處局部投予。該投予可藉由單一投予或以多次投予追加實施。本發明之胜肽的劑量可依照欲治療的疾病、病患年紀、體重、投予方法等適當調整，且通常為0.001 mg 至 1,000 mg，例如0.01 mg至100 mg，例如0.1 mg至10 mg，且可數天至數月投予一次。該技術領域中具有通常知識者可適當選擇適合的劑量。
(2)　含有多核苷酸為活性成分的醫藥物質或組合物
本發明之醫藥物質或組合物也可包含以可表現形式編碼此述胜肽之核酸。此述「可表現的形式」意指當多核苷酸導入細胞中，會在體內表現為誘導抗腫瘤免疫的多胜肽。在例示的具體例中，關注的多核苷酸的核酸序列包括表現該多核苷酸所需要的調節要件。該多核苷酸可經裝備以達到穩定插入在目標細胞的基因體中(參見例如Thomas KR & Capecchi MR,Cell 1987,51: 503-12 for a description of homologous recombination cassette vectors。亦參見例如wolff et al.,Science 1990,247: 1465-8;U.S. Patent Nos. 5,580,859;5,589,466;5,804,566;5,739,118;5,736,524;5,679,647;and WO 98/04720)。DNA-為主的遞送技術例，包括「裸DNA」、加速的(bupivacaine、聚合物、胜肽-媒介的)遞送、陽離子性脂質複合體及微粒媒介的(「基因槍」)或壓力媒介的遞送(參見例如U.S. Patent No. 5,922,687)。
本發明之胜肽也可藉由病毒或細菌載體表現。表現載體例如減毒病毒寄主，例如牛痘或禽痘。此方法涉及使用牛痘病毒，例如當作載體以表現編碼該胜肽的核苷酸序列。當導入寄主時，該重組牛痘病毒會表現該免疫原性胜肽，因而引起免疫反應。用於免疫實驗步驟的牛痘載體與方法敘述於例如U.S. Patent No. 4,722,848。另一載體為BCG(Bacille Calmette Guerin)。BCG載體敘述於Stover et al.,Nature 1991,351: 456-60。其他許多有用於治療性投予或免疫的載體例如腺病毒及腺病毒相關的病毒載體、反轉錄病毒載體、傷寒載體、去毒炭疽毒素載體等。參見例如Shata et al.,Mol Med Today 2000,6: 66-71;Shedlock et al.,J Leukoc Biol 2000,68: 793-806;Hipp et al.,In Vivo 2000,14: 571-85。
將多核苷酸遞送到病患可直接進行，此情形為使病患直接暴露於攜帶多核苷酸的載體，或間接進行，此情形為關注的多核苷酸先於體外轉形於細胞，然後將該細胞移殖到病患中。此兩種方法各已知為體內及離體的基因療法。
對於基因治療的方法的一般評論，參見Goldspiel et al.,Clinical Pharmacy 1993,12: 488-505;Wu and Wu,Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev,Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993,33: 573-96;Mulligan,Science 1993,260: 926-32;Morgan & Anderson,Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217;Trends in Biotechnology 1993,11(5): 155-215)。可適用於本發明該技術領域中普通已知的的重組DNA技術的方法，敘述於Ausubel et al.,in Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY,1993；及Krieger,in Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY,1990。
投予方法可為口服、皮內、真皮下、靜脈內注射等，而且全身性投予或對於目標部位的鄰近處局部投予皆有用。該投予可藉由單一投予或以多次投予追加實施。於適合載體中的多核苷酸量或以編碼本發明胜肽之多核苷酸轉形的細胞中的多核苷酸量，可依照欲治療的疾病、病患年紀、體重、投予方法等適當調整，且通常為0.001 mg至1,000 mg，例如0.01 mg至100 mg，例如0.1 mg至10 mg，且可數天至數月投予一次。該技術領域中具有通常知識者可適當選擇適合的劑量。
X.　使用該胜肽、外吐小體、APC及CTL的方法
本發明之胜肽及多核苷酸可用於製備或誘導APC及CTL。本發明之外吐小體及APC也可用於誘導CTL。該胜肽、多核苷酸、外吐小體及APC可與其他任何化合物組合使用，只要該額外的化合物不會抑制CTL誘導能力即可。因此上述本發明之醫藥物質或組合物皆可用於誘導CTL。除此之外，可用於誘導APC之包括該胜肽及多核苷酸者，說明如下。
(1)　誘導抗原表現細胞(APC)的方法
本發明提供使用本發明之胜肽或多核苷酸誘導有高度CTL誘導能力的APC之方法。
本發明之方法包括使APC與本發明之胜肽於體外、離體或體內接觸的步驟。例如使APC與該胜肽在離體接觸的方法可包括以下步驟：
a：從一個體收集APC，及
b：使步驟a的APC與該胜肽接觸。
該APC不限於特定種類的細胞，包括樹狀細胞(DC)、蘭氏(Langerhans)細胞、巨噬體、B細胞及經活化的T細胞，這些皆已知會在表面上呈現蛋白質性抗原，而被淋巴球所識別。因為DC在APC中具有最強的CTL誘導活性，故較佳使用DC。任何本發明之胜肽可單獨使用或與其他本發明的胜肽一起使用。
另一方面，當投予個體本發明之胜肽時，APC於體內與該胜肽接觸，因此具有高度CTL誘導能力的APC在該個體體內被誘導。因此本發明包括投予個體本發明之胜肽。同樣地，當本發明之多核苷酸係以可表現形式投予個體時，本發明之胜肽會在體內表現並與APC接觸，因此具有高度CTL誘導能力的APC在該個體體內被誘導。因此，本發明也可包括投予個體本發明之多核苷酸。「可表現的形式」在上述「IX.醫藥物質或組合物項中(2)含有多核苷酸作為活性成分的醫藥物質或組合物」已有敘述。
再者，本發明可包括將本發明之多核苷酸導入一APC以誘導具有CTL誘導能力的APC。例如，該方法可包括以下步驟:
a:從一個體收集APC，及
b:導入編碼本發明之胜肽的多核苷酸。
步驟b可如上述「VI.抗原表現細胞」項中所述實施。
或者，本發明提供一種製備抗原表現細胞(APC)的方法，該APC專一地誘導對抗HJURP的CTL活性，其中，該方法可包括以下步驟其中之一：
(a)　使APC與本發明之胜肽於體內、離體或體內接觸；及
(b)　將編碼本發明之胜肽的多核苷酸導入APC中。
(2)　誘導CTL的方法
本發明也提供使用本發明之胜肽、多核苷酸、外吐小體或APC誘導CTL的方法。
本發明也提供使用編碼多胜肽的多核苷酸誘導CTL的方法，該多胜肽能形成識別由本發明之胜肽與HLA抗原所形成的複合體之T細胞受體(TCR)次單元。較佳為，誘導CTL的方法可包括至少一個下列步驟：
a)使CD8+T細胞與抗原表現細胞及/或外吐小體接觸，該抗原表現細胞及/或外吐小體在其表面呈現HLA抗原與本發明胜肽所形成的複合體;
b)將編碼能形成識別由本發明之胜肽與HLA抗原所形成的複合體之TCR次單元的多胜肽之多核苷酸導入CD8+細胞。
當投予本發明之胜肽、多核苷酸、APC或外吐小體到個體時，CTL在該個體體內被誘導，且以該癌細胞為目標的免疫反應強度增強。因此本發明的方法包括投予個體本發明的胜肽、多核苷酸、APC或外吐小體之步驟。
或者，CTL也可使用其於離體誘導，於誘導CTL後，可使已活化的CTL回到該個體。例如，該方法可包括以下步驟：
a:從一個體收集APC；
b:使步驟a的APC接觸該胜肽；及
c:共同培養步驟b的APC及CD8+細胞
在上述步驟c中，與CD8+細胞共同培養的APC也可利用將包含本發明之多核苷酸的基因轉移到APC中而製備，如上述「VI.抗原表現細胞」項中所述；但本發明不限於此，包含任何有效在表面呈現HLA抗原與本發明之胜肽的複合體之APC。
除APC以外，也可使用在表面呈現HLA抗原與本發明之胜肽的複合體的外吐小體。亦即，本發明可包括共同培養在表面呈現HLA抗原與本發明之胜肽的複合體之外吐小體的步驟。外吐小體可藉由上述在「V.外吐小體」項中所述者製備。
再者，CTL可藉由將包括編碼連接於本發明之胜肽之
TCR次單元的多核苷酸的基因導入CD8+細胞而被誘導。此轉導可如上述「VIII. T細胞受體(TCR)」項中所述者實施。
而且，本發明提供誘導CTL的醫藥製劑、物質或組合物的製造方法或過程，其中該方法或過程包括混合或調配本發明之胜肽與醫藥上可接受的載體的步驟。
(3)　誘導免疫反應的方法
本發明提供誘導對抗HJURP相關疾病的免疫反應之方法。適當的疾病可包括癌症，例如包括但不限於AML、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、CML、大腸直腸癌、食道癌、擴散型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤及睪丸腫瘤。
本發明之方法可包括投予含有任一本發明之胜肽的物質或組合物或編碼該等多核苷酸的步驟。本發明方法也可投予呈現本發明之任一胜肽的外吐小體或APC。關於細節，參見「IX.醫藥物質或組合物」項，特別是敘述使用本發明之醫藥物質或組合物當作為疫苗的部分。再者，在本發明所採用於誘導免疫反應的外吐小體與APC詳述於「V.外吐小體」、「VI.抗原表現細胞(APC)」及「X.使用該胜肽、外吐小體、APC及CTL的方法」的(1)及(2)。
本發明也提供誘導免疫反應的醫藥製劑、物質或組合物的製造方法或過程，其中該方法可包括混合或調配本發明之胜肽與醫藥上可接受的載體的步驟。
或者本發明之方法可包括投予本發明之疫苗或醫藥組合物之步驟，該疫苗或醫藥組合物包括：
(a)　本發明之胜肽；
(b)　以可表現形式編碼此述的胜肽之核酸；
(c)　在表面上呈現本發明之胜肽的APC或外吐小體；及
(d)　本發明之細胞毒性T細胞。
本文中，過度表現HJURP的癌症可利用此等活性成分治療。此種癌症例如包括但不限於AML、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、CML、大腸直腸癌、食道癌、擴散型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤及睪丸腫瘤。因此在投予包括該活性成分的疫苗或醫藥組合物之前，宜確認是否欲治療的生物樣本中的HJURP表現水平比同器官的正常細胞為增強。因此，於一具體例，本發明提供治療(過度)表現HJURP的癌症的方法，該方法可包括以下步驟：
i)　確認取自於患有欲治療的癌症之個體的生物樣本中的HJURP表現水平；
ii)　與正常對照組比較HJURP表現水平；及
iii)　對於比正常對照組過度表現HJURP的癌症個體，投予至少一種選自上述(a)至(d)的成分。
或者，本發明也提供包括至少一種選自上述(a)至(d)的成分的疫苗或醫藥組合物，用於投予患有過度表現HJURP的癌症個體。換言之，本發明更提供一種用於鑑別欲以本發明HJURP胜肽治療的個體的方法，該方法包括確認從個體取得的生物樣本中HJURP的表現水平之步驟，其中該基因表現比起正常對照組的表現水平增加，代表該個體可能患有可以本發明之HJURP多胜肽治療的癌症。本發明之治療癌症的方法，將詳述如下。
可使用任何由個體而來的細胞或組織確定HJURP表現，只要其包括HJURP的目標轉錄或轉譯產物即可。適合的樣本例如包括但不限於體組織及體液，例如血、唾液及尿。較佳為，來自個體的細胞或組織樣本含有包括上皮細胞的細胞族群，更佳為癌樣的上皮細胞或由懷疑為癌的組織所衍生的上皮細胞。又，視需要可從獲得的體組織及體液純化該細胞，然後用做為個體衍生的樣本。
以本發明方法治療的個體較佳為哺乳動物。哺乳動物例如包括但不限於例如人、非人類靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬及牛。
依照本發明，可確定由一個體獲得的生物樣本中的HJURP表現水平。該表現水平可根據轉錄(核酸)產物的水平，使用該技術領域已知的方法確認。例如可以藉由雜交法使用探針定量HJURP的mRNA(例如北方雜交法)。該檢測可於晶片上、陣列上等實施。較佳使用陣列偵測HJURP的表現水平。該技術領域中具有通常知識者可利用HJURP的序列資訊製備此種探針。例如可使用HJURP的cDNA當做探針。視需要，可將該探針以適合的標記，例如染料、螢光物質及同位素標記，且該基因的表現水平可以該雜交的標記的強度檢測。
再者，HJURP的轉錄產物(例如序列識別號：49)，可藉由擴增為主的檢測方法(例如RT-PCR)使用引子定量。此種引子可依照該基因可得的序列資訊製備。
具體而言，將供本發明方法使用的探針或引子於嚴苛、中度嚴苛或低嚴苛條件下，與HJURP之mRNA雜交。此處使用的用詞「嚴苛(雜交)條件」係指在此條件下，探針或引子會雜交於其目標序列，但不會與其他序列雜交。嚴苛條件為序列依存性，且在不同狀況下會不同。較長序列的特定雜交比起較短的序列會在較高溫觀察到。一般而言，嚴苛條件的溫度係選自比起特定序列在一定義的離子強度及pH時的熱熔點(Tm)低約攝氏5度的溫度。該Tm係指50%互補於其目標序列的探針與該目標序列之雜交達到平衡的溫度(於一定義的離子強度、pH及核酸濃度)。由於該目標序列一般係過量存在，於Tm，50%的探針會平衡地存在。通常嚴苛條件為pH 7.0至8.3鹽濃度少於約1.0 M鈉離子，通常約0.01至1.0 M鈉離子(或其他鹽)，對於短的探針或引子(例如10至50個核苷酸)，溫度至少約攝氏30度，對於較長的探針或引子，至少約攝氏60度。嚴苛條件可藉由添加去安定物質例如甲醯胺而達到。
本發明之探針或引子通常為實質上經純化的寡核苷酸。該寡核苷酸通常包括在嚴苛條件下與至少約2000、1000、500、400、350、300、250、200、150、100、50或25個核酸雜交的核苷酸序列的區域、包括HJURP序列的核酸之連續有義股核苷酸序列、或包括HJURP序列的核酸的反義股核苷酸序列、或這些序列的天然發生的突變。特別例如於較佳具體例中，可使用長度為5-50的寡核苷酸當做放大欲偵測的基因用的引子。更佳者，HJURP的基因的mRNA或cDNA可以利用有特定大小、通常長度為15-30b的寡核苷酸探針或引子偵測。於較佳具體例中，可從15-25選擇寡核苷酸探針或引子的長度。使用此種寡核苷酸探針或引子偵測基因的試驗程序、裝置或試劑為周知(例如，寡核苷酸微陣列或PCR)。於此等試驗中，探針或引子也可包括標籤(tag)或連結子序列。又，可將探針或引子以欲捕捉的可偵測標記或親和性配體修飾。或者於以雜交為主的偵測程序中，可使用長度為數百(例如約100-200)鹼基至數千(例如約1000-2000)鹼基的多核苷酸當做探針(例如北方墨點分析或cDNA微陣列分析)。
或者可偵測轉譯產物為本發明之診斷。例如可決定HJURP蛋白質(序列識別號：50)的量或其免疫學片段的量。決定轉譯產物的蛋白質量的方法，包括使用專一性識別該蛋白質的抗體的免疫分析方法。該抗體可為單株抗體或多株抗體。再者可使用抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)以供偵測，只要該片段或修飾抗體保留對於該HJURP蛋白質的連接能力即可。本發明也提供此種對抗本發明之胜肽的抗體及其片段。製備此種用於偵測蛋白質的抗體的方法在該技術領域中為周知，且可採用任一方法於本發明中以製備此種抗體及其均等物。
就基於轉譯產物偵測HJURP基因的表現水平的另一方法而言，染色強度可使用對抗該HJURP蛋白質的抗體，利用免疫組織化學分析測定。亦即，於該測量中，強染色代表該蛋白質的存在/水平增加，及同時，HJURP基因的高表現水平。
目標基因例如HJURP基因於癌細胞中的表現水平，若水平比起該目標細胞的對照組水平(例如於正常細胞中的水平細胞)增加例如10%、25%或50%；或增加超過1.1倍、高於1.5倍、高於2.0倍、高於5.0倍、高於10.0倍或更多，則確認為增加。
該對照水平可與癌細胞同時確定，藉由使用預先從個體收集並保存的樣本實施，該個體的疾病狀態(有罹癌或未罹癌)為已知。而且，從具有欲治療的癌的器官的非癌化區獲得的正常細胞可當做正常對照。或者該對照水平可依據先前對於疾病狀態已知的個體得到的樣本中HJURP基因的表現水平所確定的結果分析的統計方法而確定。再者，該對照水平可從來自先前測試的細胞的表現樣式的資料庫衍生。又，依照本發明一態樣，於一生物學樣本中的HJURP基因表現水平可以與從多個參考樣本所決定的多個對照水平比較。較佳為使用從衍生自與該個體得到的生物學樣本類似的組織類型的參考樣本所決定的對照水平。再者，較佳為使用疾病狀態已知的群體當中的HJURP基因的表現水平的標準值。該標準值可由該技術領域中已知的任一方法獲得。例如平均值+/- 2 S.D.或平均值+/- 3 S.D.的範圍可當作該標準值。
本發明文中，由已知非癌化的生物學樣本所決定的對照水平，稱為「正常對照水平」。另一方面，若該對照水平係從癌化的生物學樣本所決定者，稱為「癌化的對照水平」。樣本表現水平與對照水平之間的差異可常態化為對照核酸例如管家基因的表現水平，對照核酸的表現水平已知不會因細胞的癌化或非癌化狀態而不同。對照基因例如包括但不限於beta-肌動蛋白、甘油醛3磷酸去氫酶及核糖體蛋白質P1。
當HJURP基因的表現水平比起正常對照水平為增加時，或者相近/均等於癌化對照水平時，該個體可診斷為患有欲治療的癌症。
本發明也提供一種方法，係(i)診斷一個體是否疑似患有欲治療的癌症；及/或(ii)選擇供癌症治療的個體，該方法可包括以下步驟：
a)確定來自疑似患有欲治療的癌症的個體的生物學樣本中HJURP的表現水平；
b)比較其HJURP表現水平與正常對照水平；
c)若HJURP的表現水平比起正常對照水平為增加，則診斷該個體患有欲治療的癌症；以及
d)若步驟c)中診斷該個體患有欲治療的癌症時，選擇該個體進行癌症治療。
或者該方法可包括以下步驟：
a)確定來自疑似患有欲治療的癌症的個體獲得的生物學樣本中HJURP的表現水平；
b)　比較其HJURP表現水平與癌化對照水平；
c)　若HJURP的表現水平相似或均等於癌化對照水平，則診斷該個體是患有欲治療的癌症；以及
d)　若步驟c)中診斷該個體患有欲治療的癌症時，選擇該個體進行癌症治療。
本發明也提供一種診斷套組，係用於診斷或確定患有或懷疑患有可利用本發明之HJURP多胜肽治療的癌症的個體，其也有用於評估及/或監控癌症免疫療法的效力或適用性。較佳者，該癌症包括但不限於AML、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、CML、大腸直腸癌、食道癌、擴散型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤及睪丸腫瘤。特別，該套組較佳為可包括偵測個體衍生的細胞中的HJURP基因的表現的至少一種試劑，該試劑可選自以下群組：
(a)　偵測該HJURP基因之mRNA的試劑；
(b)　偵測該HJURP蛋白質或其在免疫學上的片段的試劑；及
(c)　偵測該HJURP蛋白質的生物學活性的試劑。
適合偵測該HJURP基因之mRNA的試劑例如可包括專一性連接於該HJURP mRNA或鑑別該HJURP mRNA的核酸，例如具有互補於HJURP mRNA的序列的寡核苷酸。此等種類的寡核苷酸例如專一於該HJURP mRNA的引子及探針。這些種類的寡核苷酸可依照該技術領域周知的方法製備。視需要，可將偵測該HJURP mRNA的試劑固定在固體基質上。又，該套組中可包括一種以上偵測該HJURP mRNA的試劑。
另一方面，適合偵測該HJURP蛋白質或其在免疫學上的片段的試劑，例如可包括對於該HJURP蛋白質或其在免疫學上的片段的抗體。該抗體可為單株抗體或多株抗體。再者，可使用抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)當做該試劑，只要該片段或修飾抗體保留對於該HJURP蛋白質或其在免疫學上的片段的連接能力即可。製備這些種類的偵測蛋白質的抗體的方法，在該技術領域為人周知，且可在本發明中採用任意方法以製備此種抗體及其均等物。再者，該抗體可經由直接連結或間接標定技術而以訊號產生分子標記。標記抗體及偵測該抗體連接於其目標的標記及方法，在該技術領域係為人周知，且在本發明可使用任意標記及方法。又，該套組中可包括多於一種偵測該HJURP蛋白質的試劑。
該套組可含有一種以上的上述試劑。該套組可更包括一固體基質；一試劑，該試劑用於連接對抗HJURP基因的探針或連接於對抗HJURP胜肽的抗體；一介質；一容器，用於培養細胞；陽性及陰性對照試劑；及二次抗體，用於偵測對抗HJURP胜肽的抗體。例如獲自沒有癌症或患有癌症的個體的組織樣本，可當做有用的對照試劑。本發明的套組從商業及使用者角度，可更包括其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、濾器、針、注射筒及有使用指示的包裝插入物(例如紙、錄音帶、CD-ROM等)。這些試劑保存在有標籤的容器中。適合的容器包括瓶、小玻璃瓶及試管。這些容器可由各種材料形成，例如玻璃或塑膠。
本發明之一具體例中，當該試劑為對抗該HJURP mRNA的探針時，該試劑可固定在固體基質上，例如多孔條，以形成至少一個偵測部位。該多孔條的測量或偵測區可包括多個部位，各含有核酸(探針)。試條也可含有供陰性及/或陽性對照的部位。或者對照部位可位在與試條分開的條片上。視情形，該不同的偵測部位可含有不同量的固定化核酸，亦即在第一偵測部位為較高量，而在接續的部位為較低量。當添加測試樣本時，顯示可偵測訊號的部位的數目提供該樣本中所存在的HJURP mRNA量的定量指示。該偵測部位可為任何適於偵測的形狀，通常為桿狀或跨越試條寬度方向的點狀。
本發明的套組可更包含陽性對照樣本或HJURP標準樣本。本發明的陽性對照樣本可藉由收集HJURP陽性樣本，然後分析其HJURP水平而製備。或者可對不表現HJURP的細胞添加純化的HJURP蛋白質或多核苷酸，以形成該陽性樣本或該HJURP標準樣本。本發明中，純化的HJURP可為重組蛋白質。該陽性對照樣本的HJURP水平例如高於截止值。
於一具體例中，本發明更提供一種診斷套組，包括能夠專一性識別本發明抗體或其片段的蛋白質或其部分的蛋白質。
本發明的蛋白質或其部分的胜肽，例如包括由本發明蛋白質的胺基酸序列中的至少8個，較佳為15個，更佳為20個連續胺基酸構成的多胜肽。藉由使用本發明的蛋白質或胜肽(多胜肽)偵測樣本(例如血液、組織)中的抗體，可診斷癌症。製備本發明蛋白質及胜肽的方法敘述如下。
本發明之診斷癌症的方法，如上所述，可藉由確定抗HJURP抗體與對應的對照樣本中的量的差異而實施。若該個體的生物樣本含有對抗該基因的表現產物(HJURP)的抗體及該抗HJURP抗體的量確認其水平超過正常對照的截止值，則懷疑該個體患有癌症。
於其他具體例，本發明的診斷套組可包括本發明之胜肽及與其連接的HLA分子。使用抗原性胜肽與HLA分子偵測抗原專一性CTL的方法已經建立(例如Altman JD et al.,Science. 1996,274(5284): 94-6)。因此本發明之胜肽與該HLA分子的複合體可用於偵測方法以偵測腫瘤抗原專一性CTL，從而能早期偵測到癌症、復發及/或轉移。又，可用於適用包括本發明之胜肽當做活性成分的醫藥的個體的選擇，或評估該醫藥的治療效果。
特別是，依照已知方法(參見例如Altman JD et al.,Science. 1996,274(5284): 94-6)，可製備放射標定的HLA分子與本發明之胜肽的寡聚物複合體，例如四聚體。使用該複合體，藉由定量懷疑患有癌症的個體衍生的周邊血液淋巴球中的抗原-胜肽專一性CTL可進行診斷。
本發明更提供使用此述胜肽抗原決定基評估個體的免疫反應的方法或診斷製劑。本發明一具體例中，可使用此
述的HLA-A24或HLA-A02限制胜肽當做評估或預測個體免疫反應的試劑。欲評估的免疫反應可藉由使免疫原與免疫勝任細胞於體外或體內接觸而誘導。於較佳具體例中，用於評估免疫反應的免疫勝任細胞可從周邊血液、周邊血液淋巴球(PBL)及周邊血液單核球(PBMC)中選擇。用於收集或單離此種免疫勝任細胞的方法為該技術領域中周知。一些具體例中，可採用能產生識別及連接於該胜肽抗原決定基的抗原專一性CTL的任意物質或組合物當作該試劑。該胜肽試劑不一定要用作免疫原。用於此種分析的分析系統包括相當先進的技術發展，例如四聚體、胞內淋巴激素染色及干擾素釋放分析法，或ELISPOT分析法。一較佳具體例中，與胜肽試劑接觸的免疫勝任細胞，可為包括樹狀細胞的抗原表現細胞。
例如本發明之胜肽可使用在四聚體染色分析法中，以評估在暴露於腫瘤細胞抗原或免疫原後，周邊血液單核細胞是否存在抗原專一性CTL。該HLA四聚體複合體可直接用於使抗原專一性CTL可見化(參見例如Ogg et al.,Science 279: 2103-2106,1998;and Altman et al,Science 174: 94-96,1996)，並確認周邊血液單核細胞的樣本中的抗原專一性CTL群體的頻率。使用本發明胜肽的四聚體試劑，可如下述產生。
將連接於HLA分子的胜肽於對應的HLA重鏈及beta 2-微球蛋白存在下，重新折疊(refold)以產生三分子複合體。此複合體中，重鏈的羧基端於先前加工到該蛋白質的
部位生物素化(biotinylated)。然後添加鏈黴親和素(streptavidin)於該複合體，以形成由該三分子複合體與鏈黴親和素構成的四聚體。利用螢光標定的鏈黴親和素，該四聚體可用於將抗原專一性細胞染色。然後利用例如流式細胞儀鑑別該細胞。此種分析可用於診斷或預測用途。由此程序鑑別的細胞也可用於治療用途。
本發明也提供用於評估免疫召回(recall)反應的試劑(參見例如Bertoni et al,J. Clin. Invest. 100:503-513,1997 and Penna et al., J Exp. Med. 174：1565-1570,1991)，其包括本發明之胜肽。例如可從患有欲治療癌症的個體得到病患PBMC樣本，使用專一性胜肽分析是否存在抗原專一性CTL。含有單核細胞的血液樣本，可藉由培養PBMC並以本發明胜肽刺激該細胞而評估。於適當培養期間之後，增殖的細胞群體可分析例如CTL活性。
該胜肽也可當做評估疫苗效力的試劑。從接種免疫原的病患獲得的PBMC，可使用例如上述之一的方法分析。病患經HLA分型，及選定用於該分析中的識別該病患中存在的對偶基因專一性分子的胜肽抗原決定基試劑。該疫苗的免疫原性可利用在PBMC樣本中抗原決定基專一性CTL的存在而被指示出來。使用該技術領域周知的技術，本發明的胜肽也可用於製作抗體(參見例如CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY,wiley/Greene, NY; and Antibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)，本發明的胜肽也可用於當做試劑以診斷、偵測或監控癌症。此種抗體可包括識別HLA分子中的胜肽，亦即連接於胜肽-MHC複合體的抗體。
本發明之胜肽及組合物具有數個額外的用途，有些在此敘述。比如，本發明提供診斷或偵測病症的方法，該病症的特徵為表現或呈現HJURP免疫原性多胜肽。這些方法涉及確認在生物樣本中，HJURP HLA連接胜肽、或HJURP HLA連接胜肽與HLA第I類分子的複合體的表現或呈現。胜肽或胜肽與HLA第I類分子的複合體的表現或呈現，可利用分析該胜肽或複合體的連接夥伴而確定或偵測。於一較佳具體例，該胜肽或複合體的連接夥伴可為識別及專一性連接於該胜肽或該複合體的抗體。生物樣本例如腫瘤切片中的HJURP表現，也可使用HJURP引子利用標準PCR擴增實驗步驟確定。此述呈現腫瘤表現的一例，例示的條件及HJURP擴增用的引子的進一步揭示可參見WO2003/27322。
較佳者，該診斷方法涉及使從一個體單離生物樣本與對HJURP HLA連接胜肽專一的物質接觸，以偵測在該生物樣本中該HJURP HLA連接胜肽的存在。此處使用的「接觸」，係指將該生物樣本放置於充分接近該製劑及於適當條件例如濃度、溫度、時間、離子強度下，使該製劑與生物樣本中存在的HJURP HLA連接胜肽能專一的交互作用。一般而言，使製劑與生物樣本接觸的條件，為該技術領域中具通常知識者所知促進分子及其在生物樣本中的同源物(例如蛋白質與其受體同族物、抗體及其蛋白質抗原同族物、核酸與其互補序列同族物)間的專一性交互作用。促進分子及其同源物間的專一性交互作用的條件，敘述於Low等人的美國專利號5,108,921。
本發明的診斷方法可在體內及體外其中之一或兩者實施。因此本發明中，生物樣本可位在體內或體外。例如該生物樣本可為體內的組織，專一於該HJURP免疫原性多胜肽的製劑可用於偵測組織中該分子的存在。或者可在體外收集或分離該生物樣本或(例如血液樣本、腫瘤切片、組織萃取物)。於較佳具體例中，該生物學樣本可為含細胞樣本，更佳為含有從欲診斷或治療的個體收集的腫瘤細胞的樣本。
或者，該診斷可藉由以螢光素標定的HLA多聚複合體允許直接定量抗原專一性T細胞的方法實施(例如Altman,J. D. et al.,1996,Science 274:94;Altman,J. D. et al.,1993,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10330)。也已有人提供染色胞內淋巴激素、及干擾素-gamma釋出分析法或ELISPOT分析法。多聚體染色、胞內淋巴激素染色及ELISPOT分析法均比習知分析法有至少10倍以上的靈敏度(Murali-Krishna,K. et al.,1998,Immunity 8: 177;Lalvani,A. et al.,1997,J. Exp. Med. 186: 859;Dunbar,P. R. et al.,1998,Curr. Biol. 8: 413)。也可使用五聚體(例如US 2004-209295A)、dextramer(例如WO 02/072631)及streptamers(例如Nature medicine 6.631-637(2002))。
例如，一些具體例中，本發明提供診斷或評估已投予至少一種本發明之HJURP胜肽的個體的免疫反應的方法，該方法包括以下步驟：
(a)　使免疫原與免疫勝任細胞在適於誘導專一於該免疫原的CTL的條件下接觸；
(b)　偵測或確定步驟(a)誘導的CTL的誘導水平；
(c)　使該個體的免疫反應與CTL誘導水平產生相關。
本發明中，該免疫原為(a)選自序列識別號：2至24及26至48的胺基酸序列的HJURP胜肽、具有此胺基酸序列的胜肽、及具有此胺基酸序列之胜肽且其中有1、2或更多胺基酸被取代的修飾，的至少一種。目前，適於誘導免疫原專一性CTL的條件在該技術領域中為人周知。例如可將免疫勝任細胞免疫原存在下於體外培養以誘導免疫原專一性CTL。為了誘導免疫原專一性CTL，可對該細胞培養物添加任何刺激。例如IL-2為對CTL誘導用的較佳刺激因子。
一些具體例中，監控或評估欲以胜肽癌症療法治療的個體的免疫反應的步驟，可在治療前、期間及/或後實施。一般而言，癌症治療的步驟，係對於欲治療的個體重複投予免疫原性胜肽。例如可每週投予免疫原性胜肽持續3-10週。因此該個體的免疫反應可在癌症治療的步驟期間受評估或監控。或評估或監控對於癌症治療的免疫反應的步驟可於治療步驟完成後實施。
依照本發明，比起對照組，免疫原誘導性CTL的誘導
增強，代表欲評估或診斷的個體對於已投予的免疫原有免疫反應。評估該免疫反應的適合對照可包括例如：當該免疫勝任細胞與非胜肽接觸時的CTL誘導水平，或具有HJURP胜肽以外的胺基酸序列的對照胜肽(例如，隨機的胺基酸序列)。於一較佳具體例中，該個體的免疫反應係藉由比較投予個體各免疫原間的免疫反應，以序列專一性方式評估。特別是，即便當投予個體某些種類的HJURP胜肽的混合物時，免疫反應仍取決於該胜肽而不同。於此情形，藉由比較各胜肽之間的免疫反應，可鑑別個體顯示較高反應的胜肽。
XI.　抗體
本發明更提供連接於本發明之胜肽的抗體。較佳的抗體係專一性連接於本發明之胜肽的抗體且不會連接於(或微弱連接於)非本發明之胜肽。或者，抗體連接於本發明的胜肽的及其同系物。對抗本發明胜肽的抗體可用於癌症診斷及預後分析及造影法。同樣地，此種抗體可用於其他癌症的治療、診斷及/或預後方面，只要HJURP在癌症病患中也有表現或過度表現。又，細胞內表現的抗體(例如單鏈抗體)在治療上可用於涉及HJURP表現的癌症治療，癌症包括但不限於AML、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、CML、大腸直腸癌、食道癌、擴散型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤及睪丸腫瘤。
本發明也提供偵測及/或定量HJURP蛋白質(序列識別號：50)或其包含具有選自序列識別號：2至24及26至48的胺基酸序列的多胜肽之片段的各種免疫分析法。此種分析法可包括一種以上的抗HJURP抗體，該抗體能適當識別及連接HJURP蛋白質或其片段。本發明中，連接於HJURP多胜肽的抗-HJURP抗體較佳識別具有選自序列識別號：2至24及26至48的胺基酸序列的多胜肽。抗體的連接專一性可利用抑制試驗確認。即，當欲分析的抗體與全長HJURP多胜肽間的連接在具有選自序列識別號：2至24及26至48的胺基酸序列的任何片段多胜肽存在時受到抑制，表示該抗體專一性地連接於該片段。本發明中，此種免疫分析法係以該技術領域中周知的各種免疫分析法實施，包括但不限於各種放射免疫分析法、免疫層析技術、酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)、酵素連結免疫螢光分析法(ELIFA)等。
本發明的相關免疫學但非抗體分析法也可包括T細胞免疫原性分析法(抑制性或刺激性)及MHC結合分析法。而且，本發明也提供能偵測表現HJURP的癌症的免疫造影法，包括但不限於使用本發明之經標記抗體的放射閃爍攝影造影法。此種分析法在臨床上可用於偵測、監控及預測HJURP表現的癌症，癌症包括但不限於AML、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、CML、大腸直腸癌、食道癌、擴散型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤及睪丸腫瘤。
本發明也提供連接於本發明胜肽的抗體。本發明的抗體可以任意形式使用，例如單株抗體或多株抗體，包括以本發明胜肽使動物例如兔子免疫所得的抗血清、所有類型的多株及及單株抗體、人類抗體與由基因重組產生的人類化抗體。
作為抗原以獲得抗體的本發明的胜肽，可來自任何動物種類，但較佳為來自哺乳動物，例如人、小鼠、大鼠，更佳為人。人類衍生的胜肽可由此處所揭露的核苷酸或胺基酸序列獲得。
依照本發明，當做免疫抗原使用的胜肽，可為完整蛋白質或該蛋白質的部分胜肽。部分胜肽可包括例如本發明胜肽的胺基(N)端或羧基(C)端片段。
在此，抗體定義為與HJURP胜肽的全長或片段反應的蛋白質。於一較佳具體例，本發明抗體可識別具有選自序列識別號：2至24及26至48之胺基酸序列的HJURP片段胜肽。用於合成寡胜肽的方法在該技術領域為周知。合成後，在使用作為免疫原之前可視情形將胜肽純化。本發明中，該寡胜肽(例如9-或10胜肽)可以與載體接合或連結以增進免疫原性。鑰孔血藍蛋白(Keyhole-limpet hemocyanin，KLH)為周知的載體。連接KLH與胜肽的方法，也是該技術領域中周知的。
或者可將編碼本發明胜肽或其片段的基因插入已知的表現載體，然後該表現載體用於轉形於此述的寄主細胞。所望的胜肽或其片段可從該寄主細胞外或內以標準方法復原，接著可當做抗原。或者可將表現該胜肽的整個細胞或其溶解物或化學合成的胜肽當做抗原。
可將任何哺乳動物以該抗原免疫，但較佳考量與用在細胞融合的母細胞的相容性。一般而言，可使用囓齒科動物、兔或靈長科動物。囓齒科的動物包括例如小鼠、大鼠、倉鼠。。兔科動物包括例如兔子。靈長科動物例如狹鼻小目(Catarrhini)猴(舊世界猴、例如食蟹猴(Macaca fascicularis)、獼猴，狒狒、黑猩猩。
以抗原免疫動物的方法為該技術領域中已知。腹膜內注射或皮下注射抗原為免疫動物的標準方法。具體而言，可將抗原稀釋及懸浮於適當量的磷酸鹽緩衝鹽液(PBS)、生理鹽液等。視需要，可將抗原懸浮液與適量的標準佐劑混合，例如Freund完全佐劑，形成乳劑後投予哺乳動物投予。較佳者，每4至21天數次投予與適量Freund不完全佐劑混合的抗原。適當的載體也可用於進行免疫。如上免疫進行後，可藉由標準方法檢驗血清中所望抗體量的增加。
對抗本發明胜肽的多株抗體可獲得自藉由從檢查血清中所望抗體增加的經免疫的哺乳動物收集血液，並從血液以習知方法分離血清而製備。多株抗體包括含有多株抗體的血清及可從血清中分離含有該多株抗體的級分。免疫球蛋白G或M可獲得自僅識別本發明胜肽的級分，使用例如偶聯於本發明胜肽的親和性管柱，及使用蛋白質A或蛋白質G管柱進一步純化該級分。
為了製備單株抗體，從以該抗原免疫的哺乳動物收集免疫細胞，並如上述檢查血清中所望抗體的水平是否增加，之後進行細胞融合。用於細胞融合的免疫細胞較佳從脾臟取得。其他較佳的與上述免疫細胞融合的母細胞，包括例如哺乳動物的骨髓瘤細胞，更佳為具有以藥物選擇融合細胞的所需性質的骨髓瘤細胞。
上述免疫細胞及骨髓瘤細胞可依照已知方法融合，該方法例如Milstein等人的方法(Galfre and Milstein,Methods Enzymo 173: 3-46(1981))。
由細胞融合得到的融合瘤可藉由將其在標準選擇培養基例如HAT培養基(含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培養基)中培養而選擇。通常該細胞培養物係在該HAT培養基中繼續培養數天至數週，時間足以使除了所望融合瘤以外的其他細胞(非融合細胞)死亡。然後，可實施標準極限稀釋以篩選並選殖生產所望抗體的融合瘤細胞。
除了上述方法，其中非人類動物係以抗原免疫以製備融合瘤，可將人類淋巴球例如受EB病毒感染者，以胜肽、胜肽表現細胞或其溶解物於體外免疫。然後，將經免疫的淋巴球與能無限分裂的人類來源的骨髓瘤細胞例如U266融合，以得到生產能連接於該胜肽的所望人類抗體的融合瘤(未審查的日本公開專利申請案號昭63-17688)。
接著將獲得的融合瘤移殖到小鼠的腹腔，並抽取腹水。獲得的單株抗體可利用例如硫酸銨沉澱、蛋白質A或蛋白質G管柱、DEAE離子交換層析或偶聯有本發明胜肽的親和性管柱純化。本發明抗體不僅可用於純化及偵測本發明胜肽，也可當成本發明胜肽的協同劑及拮抗劑。
或者可將免疫細胞例如經免疫的淋巴球、生產抗體利用致癌基因使不死化並用於製備單株抗體。
獲得的單株抗體也可使用遺傳工程技術以重組方式製備(參見例如Borrebaeck and Larrick,Therapeutic Monoclonal Antibodies,於英國由MacMillan Publishers LTD(1990)出版)。例如可從免疫細胞例如融合瘤或經免疫的生產該抗體的淋巴球選擇編碼為抗體的DNA，插入適當載體，並導入寄主細胞以製備重組抗體。本發明也提供如上述製備的重組抗體。
再者本發明抗體可為抗體片段或經修飾的抗體，只要其連接於一個或更多本發明的胜肽即可。例如，該抗體片段可為Fab、F(ab’)2、Fv或單鏈Fv(scFv)，其中來自H及L鏈的Fv片段以適當連結子連接(Huston et al.,Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83(1988))。具體而言，可利用以酵素例如木瓜酵素或胃蛋白酶處理抗體而產生抗體片段。或者可構建編碼為該抗體片段的基因，插入表現載體並於適當的寄主中表現(參見例如,Co et al.,J Immunol 152: 2968-76(1994); Better與Horwitz,Methods Enzymol 178: 476-96(1989);Pluckthun and Skerra,Methods Enzymol 178: 497-515(1989);Lamoyi,Methods Enzymol 121: 652-63(1986);Rousseaux et al.,Methods Enzymol 121: 663-9(1986);Bird and walker,Trends Biotechnol 9: 132-7(1991))。
抗體可藉由與各種分子例如聚乙二醇(PEG)接合而修飾。本發明提供此種經修飾的抗體。該經修飾的抗體可藉由將抗體化學修飾而獲得。此等修飾方法在該領域為習知。
或者本發明抗體可為：來自非人類抗體的可變區與來自人類抗體的恆定區的嵌合抗體，或人類化抗體，其包括來自非人類抗體的互補決定區(CDR)、框架區(FR)及來自人類抗體的不變區。此種抗體可依照已知技術製備。人類化可藉由取代囓齒類CDR或CDR序列為人類抗體的對應序列而實施(參見例如Verhoeyen et al.,Science 239:1534-1536(1988))。因此此種人類化抗體為嵌合抗體，其中實質上少於完整的人類可變區已取代成來自非人類種的對應序列。
除了人類框架及恆定區外，也可使用包括人類可變區的完全人類抗體。此種抗體可使用該技術領域已知的各種技術製造。例如體外方法涉及使用呈現在噬菌體的人類抗體片段的重組庫(例如Hoogenboom & Winter,J. Mol. Biol. 227:381(1991)。同樣地，可藉由將人類免疫球蛋白基因位導入基因轉殖動物例如內生免疫球蛋白已部分或全部失活的小鼠中，而製備人類抗體。此方法敘述於例如美國專利號6,150,584、5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016。
如上獲得的抗體可純化成同質。例如可依照一般蛋白質使用的分離及純化方法將抗體分離及純化。例如可利用適當選擇及合併使用的管柱層析分離及單離抗體，管柱層析例如親和性層析、過濾、超過濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳及等電點集中法(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但不限於此等。可使用蛋白質A管柱及蛋白質G管柱當做該親和性管柱。可使用的蛋白質A管柱包括例如Hyper D、POROS及Sepharose F.F.(Pharmacia)。
親和性以外的層析，包括例如離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾、反相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。該等層析程序可利用液相層析，例如HPLC與FPLC實施。
例如可使用測量吸光度、酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)、酵素免疫分析法(EIA)、放射免疫分析法(RIA)及/或免疫螢光以測量本發明抗體的抗原連接活性。ELISA中，係將本發明抗體固定化在一平板上，塗佈本發明胜肽於該平板，然後塗佈含有所望抗體的樣本，例如抗體產生細胞的培養上清或純化的抗體。然後，將識別該初級抗體的二次抗體以酵素例如鹼性磷解酶標記，然後溫育該平板。清洗後，添加酵素受質例如對硝基苯基磷酸酯到該平板，測量吸光度以評估該樣本的抗原連接活性。可使用該胜肽的片段例如C端或N端片段當做抗原以評估該抗體的連接活性。可使用BIAcore(Pharmacia)來評估本發明抗體的活性。
上述方法，藉由使本發明抗體暴露於假定含有本發明胜肽的樣本，並偵測或測量該抗體與該胜肽所形成的免疫複合體，能偵測或測量本發明的胜肽。
由於偵測或測量本發明胜肽的方法能夠專一性偵測或測量一胜肽，故該方法有用於使用該胜肽的許多實驗中。
XII.　載體與寄主細胞
本發明也提供導入有本發明胜肽的載體與寄主細胞。本發明的載體可用於保存本發明核苷酸，特別是DNA，於寄主細胞，以表現本發明之胜肽，或投予本發明核苷酸供基因治療。
當寄主細胞為E. coli且載體在E. coli(例如JM109、DH5 alpha、HB101或XL1Blue)中大量擴增及生產時，該載體應具有欲在E. coli中放大的「ori」以及用於選擇經轉形的E. coli的標誌基因(例如由安皮西林、四環黴素、嘉那黴素、氯黴素等藥物選擇的抗藥性基因)。例如，可使用M13系列載體、pUC系列載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。此外，也可使用pGEM-T、pDIRECT及pT7次選殖及萃取cDNA及上述載體。當使用載體產生本發明蛋白質時，表現載體為有用。例如欲在E. coli中表現的載體應具有上述欲在E. coli中擴增所需要的特性。當使用E. coli例如JM109、DH5 alpha、HB101或XL1 Blue當做寄主細胞，該載體應具有啟動子例如lacZ啟動子(Ward et al.,Nature 341: 544-6(1989);FASEB J 6: 2422-7(1992))、araB啟動子(Better et al.,Science 240: 1041-3(1988))、T7啟動子等。其能有效率地在E. coli中表現所望的基因。於此方面，可使用pGEX-5X-1(Pharmacia)、「QIAexpress system」(Qiagen)、pEGFP及pET(於此情形，寄主較佳為表現T7 RNA聚合酶的BL21)取代上述載體。此外，該載體也可含有訊號序列以供胜肽分泌。引導該胜肽分泌到E. coli胞間質的訊號序列之例，為pelB訊號序列(Lei et al.,J Bacteriol 169: 4379(1987))。將該等載體導入目標寄主細胞的方法包括例如氯化鈣法及電穿孔法。
除了E. coli，例如可使用來自哺乳動物的表現載體(例如pcDNA3(Invitrogen)及pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18(17): 5322(1990))、pEF、pCDM8)、來自昆蟲細胞的表現載體(例如「Bac-to-BAC baculovirus expression system」(GIBCO BRL)、pBacPAK8)、來自植物的表現載體(例如pMH1、pMH2)、來自動物組織的表現載體(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、來自反轉錄病毒的表現載體(例如pZIpneo)、來自酵母菌的表現載體(例如「Pichia Expression Kit」(Invitrogen)、pNV11、SP-Q01)，及來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的表現載體(例如pPL608、pKTH50)，用於生產本發明之多胜肽。
為了於動物細胞例如CHO、COS或NIH3T3細胞中表現載體，該載體應具有對於在此種細胞中表現所需要的啟動子，例如SV40啟動子(Mulligan et al.,Nature 277: 108(1979))、MMLV-LTR啟動子、EF1 alpha啟動子(Mizushima et al.,Nucleic Acids Res 18:5322(1990))、CMV啟動子等，較佳為具有用於選擇轉形體的標記基因(例如由藥物(例如新黴素、G418)選擇的抗藥性基因)。具有此等特性的已知載體例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV及pOP13。
以下呈現實施例以說明本發明，並協助該技術領域中具有通常知識者製造及使用。此等實施例並未意欲限制本發明範圍。
實施例1 材料及方法 細胞株
TISI、HLA-A*2402-陽性B-類淋巴母細胞株，係從IHWG Cell與Gene Bank(Seattle,WA)購買。COS7，一非洲綠猴腎細胞株，係從ATCC購買。
從HJURP衍生的胜肽的候選者篩選
使用結合預測軟體「BIMAS」(www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind)(Parker et al. (J Immunol 1994,152(1): 163-75),Kuzushima et al.(Blood 2001,98(6): 1872-81))及「NetMHC3.0」(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)(Buus et al.(Tissue Antigens.,62:378-84,2003)、Nielsen et al.(Protein Sci., 12:1007-17,2003,Bioinformatics,20(9):1388-97,2004))，預測連接於HLA-A*2402分子之衍生自HJURP的九胜肽及十胜肽。這些胜肽係依照標準固相合成法以生物合成(Lewisville,Texas)，並經反相高效能液體層析(HPLC)純化。該胜肽的純度(>90%)及同一性係分別利用分析性HPLC及質量分光分析確認。將胜肽溶於二甲基亞碸(DMSO)使濃度為20 mg/ml並保存在攝氏-80度。
體外CTL誘導
使用單核球衍生的樹狀細胞(DC)當做抗原表現細胞(APC)以誘導對抗呈現於人類白血球抗原(HLA)上的胜肽的細胞毒性T淋巴球(CTL)反應。DC係於體外以另外敘述的方法產生(Nakahara S et al.,Cancer Res 2003 Jul 15,63(14): 4112-8)。具體而言，從正常的自願者(HLA-A＊2402陽性)利用Ficoll-Plaque溶液(Pharmacia)分離周邊血液單核細胞(PBMC)，以黏附於塑膠組織培養皿(Becton Dickinson)而分離，以將其富化成單核球級分(fraction)。將該單核球富化的群體培養於存在有1,000 U/ml的顆粒球-巨噬體群落-刺激因子(GM-CSF)(R&D System)及1,000U/ml介白質(IL)-4(R&D System)的含2%熱失活的自體血清(AS)的AIM-V培養基(Invitrogen)。培養7天後，將細胞激素誘導的DC在3 micro-g/ml beta 2-微球蛋白存在下，於AIM-V培養基中、攝氏37度下，以各合成胜肽20 micro-g/ml脈衝3小時。所產生的細胞在表面上會表現DC相關分子，例如CD80、CD83、CD86與HLA第II類(資料未顯示)。然後將這些經胜肽脈衝的DC以X-照射(20 Gy)使失活，並以1:20比例與由以CD8+Isolation Kit(Dynal)陽性選擇獲得的自體CD8+ T細胞混合。將該等培養基安置於48孔盤(Corning)；各孔含有於0.5 ml AIM-V/2% AS培養基中的1.5 x 104胜肽脈衝的DC、3 x 105 CD8+ T細胞及10 ng/ml IL-7(R&D System)。3天後，這些培養物補充IL-2(CHIRON)，形成最終濃度為20 IU/ml。第7天及第14天，再將這些T細胞以自體胜肽脈衝過的DC刺激。該DC每次皆依照上述同樣方法製備。於第21天，在第3回合的胜肽刺激後，測試對抗胜肽脈衝過的TISI細胞的CTL(Tanaka H et al.,Br J Cancer2001 Jan 5,84(1): 94-9;Umano Y et al.,Br J Cancer2001 Apr 20,84(8): 1052-7;Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24): 8577-86;Suda T et al.,Cancer Sci 2006 May,97(5): 411-9;Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005 Aug,96(8): 498-506)。
CTL擴張程序
使用類似於Riddell等人所述方法在培養中擴張CTL(Walter EA et al.,N Engl J Med 1995 Oct 19,333(16): 1038-44;Riddell SR et al.,Nat Med 1996 Feb,2(2): 216-23)。將總共5 x 104 CTL與2種人類B-類淋巴母細胞株懸浮於25 ml AIM-V/5% AS培養基，於40 ng/ml抗CD3單株抗體(Pharmingen)存在下以Mitomycin C去活。開始培養1天後，對培養物添加120 IU/ml IL-2。於第5、8及11天對該培養物饋加新鮮的含30 IU/ml IL-2的AIM-V/5% AS培養基(Tanaka H et al.,Br J Cancer2001Jan 5,84(1): 94-9;Umano Y et al.,Br J Cancer2001 Apr 20,84(8): 1052-7;Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24): 8577-86;Suda T et al.,Cancer Sci 2006 May,97(5): 411-9;Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005 Aug,96(8): 498-506)。
建立CTL選殖體
在96圓底微滴定盤(Nalge Nunc International)中,稀釋成每孔0.3、1及3 CTLs。將CTL與1×104細胞/孔的2種人類B-類母淋巴球細胞株、30ng/ml抗CD3抗體及125 U/ml IL-2於總共150 micro-l/孔的含5%ASAIM-V培養基中培養。10天後對該培養基加入50 micro-l/孔IL-2，以達最終濃度125 U/ml IL-2。於第14天測試CTL活性，如上述同樣方法將CTL選殖體擴張(Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24): 8577-86;Suda T et al.,Cancer Sci 2006 May,97(5): 411-9;Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005 Aug,96(8): 498-506)。
專一性CTL活性
為了檢查專一性CTL活性，實施干擾素(IFN)-gamma酵素連結免疫墨點(ELISPOT)分析法及IFN-gamma酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)。具體而言，製備胜肽-脈衝的TISI(1 x 104細胞/孔)當做刺激細胞。於48孔培養的細胞當做回應細胞。IFN-gamma ELISPOT分析法及IFN-gamma ELISA分析法係依製造商流程實施。
質體轉染
將編碼目標基因的開放讀取框或HLA-A*2402的cDNA以PCR擴增。將PCR擴增的產物選殖到一載體及pIRES載體(Clontech Laboratories,Inc.,Cat. No. 631605)。使用lipofectamine 2000(Invitrogen)依照製造商建議的程序將該質體轉染到COS7中，COS為目標基因及HLA-A24陰性細胞株。轉染後2天，以versene(Invitrogen)收集經轉染的細胞，並當成目標細胞(5×104細胞/孔)供CTL活性分析。
結果 於癌症中增強的HJURP表現
獲得自各種癌症的全球基因表現概況資料使用cDNA微陣列顯示HJURP(GenBank存取號NM_018410；序列識別號：49)的表現提高。HJURP的表現，在15例AML中有3例、26例膀胱癌中有25例、33例乳癌中有29例、9例子宮頸癌中有8例、11例膽管細胞癌中有11例、33例CML中有25例、12例大腸直腸癌中有4例、40例食道癌中有29例、3例擴散型胃癌中有1例、4例肝癌中有4例、12例NSCLC中有12例、3例淋巴癌中有2例、11例骨肉瘤中有8例、5例卵巢癌中有3例、4例胰臟癌中有4例、18例前列腺癌中有12例、7例腎癌中有4例、13例SCLC中有13例、14例軟組織腫瘤中有8例、9例睪丸腫瘤中有6例，比起對應的正常組織明確地提高(表1)。
[表1]比起正常的對應組織，於癌化組織中觀察到的HJURP上調的案例比例
預測衍生自HJURP的HLA-A24連接胜肽
表2a與2b顯示依照高親和性排列的該HLA-A24連接的九胜肽及十胜肽的HJURP胜肽。使用BIMAS選擇15胜肽(序列識別號:1-6及序列識別號:10-18)，使用NetMHC3.0預測9個胜肽(序列識別號：7-9與序列識別號：19-24)。總共選出24個胜肽具有HLA-A24連接潛力，並檢查以確定該抗原決定基胜肽。
起始位置代表從HJURP的N端起算的胺基酸殘基數連接分數及解離常數[Kd(nM)]係得自「BIMAS」與「NetMHC3.0」
以預測的衍生自經HLA-A*2402限制的HJURP之胜肽誘導CTL，及建立以HJURP衍生胜肽刺激的CTL細胞株
針對衍生自HJURP的胜肽的CTL，係依照如「材料與方法」敘述的實驗步驟獲得。胜肽專一性CTL活性，係以IFN-gamma ELISPOT分析法決定(圖1a-e)。以HJURP-A24-9-28(序列識別號：3)刺激的孔號碼#4(a)、以HJURP-A24-9-263(序列識別號：4)刺激的孔號碼#4(b)、以HJURP-A24-9-408(序列識別號：7)刺激的孔號碼#4(c)、以HJURP-A24-10-383(序列識別號：18)刺激的孔號碼#6(d)、以HJURP-A24-10-162(序列識別號：23)刺激的孔號碼#4(e)，證明相較於對照的孔，IFN-gamma有效的製造。另一方面，以表2a與2b所示的其他胜肽的刺激，雖然這些胜肽與HLA-A*2402可能有連接活性，但未檢測到有效的IFN-gamma製造。作為典型的陰性資料，以HJURP-A24-9-149(序列識別號：1)(f)刺激的胜肽脈衝的目標細胞，未觀察到專一性CTL反應。結果，5個衍生自HJURP的胜肽經鑑別具有潛力誘導有效的CTL。
建立對抗HJURP專一性胜肽的CTL細胞株及選殖體
以IFN-gamma ELISPOT分析法偵測在有HJURP-A24-9-263(序列識別號：4)的　孔號碼#4及有HJURP-A24-9-408(序列識別號：7)的孔號碼#4中顯示胜肽專一性CTL活性的細胞擴張，並利用上述「材料與方法」項所述極限稀釋法建立CTL細胞株。這些CTL細胞株的CTL活性，以IFN-gamma ELISA分析法決定(圖2a與b)。比起未有胜肽脈衝的目標細胞，這些CTL細胞株證明有效的產生對抗以對應胜肽脈衝的目標細胞的IFN-gamma。再者，從CTL細胞株以極限稀釋建立CTL選殖體，來自對抗目標細胞脈衝的胜肽之CTL選殖體的IFN-gamma　的製造，以IFN-gamma ELISA分析法決定。IFN-gamma的有效製造，係從以HJURP-A24-9-408(序列識別號：7)刺激的CTL選殖體確定，如圖3。
對抗外生性表現HJURP與HLA-A*2402的目標細胞的專一性CTL活性
對抗此等胜肽所建立的CTL細胞株，檢驗其識別內生性表現HJURP與HLA-A*2402基因的能力。對抗以全長HJURP與HLA-A*2402基因轉染的COS7細胞(內生性表現HJURP與HLA-A*2402基因的目標細胞的特定模式)的專一性CTL活性，使用以做為效應子細胞的對應胜肽所形成的CTL細胞測試。製備以全長HJURP基因或HLA-A*2402其中之一轉染的COS7細胞當做對照。於圖　4，以HJURP-A24-9-408(序列識別號：7)(a)與HJURP-A24-9-263(序列識別號：4)(b)刺激的CTL，顯示對於表現HJURP與HLA-A*2402兩者的COS7細胞具有有效的CTL活性。另一方面，對照組未偵測到顯著的專一性CTL活性。因此，這些數據清楚證明HJURP-A24-9-408(序列識別號：7)與HJURP-A24-9-263(序列識別號：4)的胜肽，係內生性處理並表現在帶有HLA-A*2402分子的目標細胞上，並由CTL識別。此結果代表從HJURP衍生的胜肽，適於當做癌症疫苗以治療患有HJURP表現腫瘤的病患。
抗原胜肽的同源性分析
以HJURP-A24-9-28(序列識別號：3)、HJURP-A24-9-263(序列識別號：4)、HJURP-A24-9-408(序列識別號：7)、HJURP-A24-10-383(序列識別號：18)與HJURP-A24-10-162(序列識別號：23)刺激的CTL顯示顯著且專一的CTL活性。此結果可能由於HJURP-A24-9-28(序列識別號：3)、HJURP-A24-9-263(序列識別號：4)、HJURP-A24-9-408(序列識別號：7)、HJURP-A24-10-383(序列識別號：18)與HJURP-A24-10-162(序列識別號：23)的序列與從已知會敏化人類免疫系統的其他分子衍生的胜肽為同源。為了排除此可能性，對此等胜肽序列使用BLAST演算法(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)進行同源性分析，詢問條件是無序列有顯著的同源性。同源性分析的結果顯示HJURP-A24-9-28(序列識別號：3)、HJURP-A24-9-263(序列識別號：4)、HJURP-A24-9-408(序列識別號：7)、HJURP-A24-10-383(序列識別號：18)與 HJURP-A24-10-162(序列識別號：23)的序列為唯一，因此吾人最佳知識下，這些分子只有很少可能性會引起對於無關分子的不欲免疫反應。
總言之，鑑別出衍生自HJURP的新穎HLA-A24抗原決定基胜肽。再者，在此的結果證明HJURP的抗原決定基胜肽適於用在癌症免疫療法。
實施例2 材料及方法 細胞株
T2、HLA-A*0201-陽性B-類淋巴母細胞株、COS7、非洲綠猴腎細胞株，係從ATCC購買。
HJURP衍生的胜肽的候選者篩選
使用結合預測軟體「NetMHC3.0」(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)(Buus et al.(Tissue Antigens.,62：378-84,2003),Nielsen et al.(Protein Sci.,12：1007-17,2003,Bioinformatics,20(9)：1388-97,2004))，預測連接於HLA-A*0201分子的衍生自HJURP的九胜肽及十胜肽。這些胜肽係依照標準固相合成法以生物合成(Lewisville,Texas)，並經反相高效能液體層析(HPLC)純化。該胜肽的純度(>90%)及同一性係分別利用分析性HPLC及質量分光分析確認。將胜肽溶於二甲基亞碸(DMSO)使濃度為20mg/ml並保存在攝氏-80度。
體外CTL誘導
使用單核球衍生的樹狀細胞(DC)當做抗原表現細胞(APC)以誘導對抗呈現於人類白血球抗原(HLA)上的胜肽的細胞毒性T淋巴球(CTL)反應。DC係於體外以另外敘述的方法產生(Nakahara S et al.,Cancer Res 2003 Jul 15,63(14): 4112-8)。具體而言，從正常的自願者(HLA-A*0201陽性)利用Ficoll-Plaque溶液(Pharmacia)分離周邊血液單核細胞(PBMC)，以黏附於塑膠組織培養皿(Becton Dickinson)而分離，以將其富化成單核球級分。將該單核球富化的群體於1,000 U/ml的顆粒球-巨噬體群落-刺激因子(R&D System)及1,000 U/ml介白質(1L)-4(R&D System)存在下，於含2%熱失活的自體血清(AS)的AIM-V培養基(Invitrogen)中培養。培養7天後，將細胞激素誘導的DC於3 micro-g/ml beta 2-微球蛋白存在下，以各合成胜肽20 micro-g/ml於AIM-V培養基中、攝氏37度脈衝3小時。所產生的細胞表面上會表現DC相關分子，例如CD80、CD83、CD86與HLA第II類(資料未顯示)。然後將這些經胜肽脈衝的DC以X-照射(20 Gy)使失活，並以1:20比例與由以CD8+ Isolation Kit(Dynal)陽性選擇獲得的自體CD8+ T細胞混合。將這些培養基安置於48孔盤(Corning)；各孔包含於0.5 ml AIM-V/2% AS培養基中含有1.5 x 104胜肽脈衝的DC、3 x 105 CD8+ T細胞及10 ng/ml IL-7(R&D System)。3天後，對這些培養物補充IL-2(CHIRON)，形成最終濃度為20 IU/ml。第7天及第14天，再將該T細胞以自體胜肽脈衝過的DC刺激。該DC係每次依照上述同樣方法製備。於第21天，在第3回合的胜肽刺激後，測試對抗胜肽脈衝過的T2細胞的CTL(Tanaka H et al.,Br J Cancer2001 Jan 5,84(1): 94-9;Umano Y et al.,Br J Cancer2001 Apr 20,84(8): 1052-7;Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24): 8577-86;Suda T et al.,Cancer Sci 2006 May,97(5): 411-9;Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005 Aug,96(8): 498-506)。
CTL擴張程序
使用類似於Riddell等人所述方法在培養中擴張CTL(Walter EA et al.,N Engl J Med 1995 Oct 19,333(16): 1038-44;Riddell SR et al.,Nat Med 1996 Feb,2(2): 216-23)。將總共5 x 104 CTL與2種人類B-類淋巴母細胞株懸浮於25 ml AIM-V/5% AS培養基，於40 ng/ml抗CD3單株抗體(Pharmingen)存在下以MitomycinC去活。開始培養1天後,對培養物添加120 IU/ml IL-2。於第5、8及11天對該培養物饋加新鮮的含30 IU/ml IL-2的AIM-V/5% AS培養基(Tanaka H et al.,Br J Cancer2001 Jan 5,84(1): 94-9;Umano Y et al.,Br J Cancer2001 Apr 20,84(8): 1052-7;Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24): 8577-86;Suda T et al.,CancerSci 2006 May,97(5): 411-9;Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005 Aug,96(8): 498-506)。
建立CTL選殖體
在96圓底微滴定盤(Nalge Nunc International)中，稀釋成每孔0.3、1及3 CTLs。將CTL與1×104細胞/孔的2種人類B-類母淋巴球細胞株、30ng/ml抗CD3抗體及125 U/ml IL-2於總共150 micro-l/孔的含5%AS的AIM-V培養基中培養。10天後對該培養基加入50 micro-l/孔IL-2，以達最終濃度125 U/ml IL-2。於第14天測試CTL活性，如上述同樣方法使CTL選殖體擴張(Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24): 8577-86;Suda T et al.,Cancer Sci 2006 May,97(5): 411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005 Aug,96(8): 498-506)。
專一性CTL活性
為了檢查專一性CTL活性，實施干擾素(IFN)-gamma酵素連結免疫墨點(ELISPOT)分析法及IFN-gamma酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)。具體而言，製備胜肽-脈衝的T2(1 x 104細胞/孔)當做刺激細胞。於48孔培養的細胞當做回應細胞。IFN-gamma ELISPOT分析法及IFN-gamma ELISA分析法係依製造商流程實施。
建立強力表現目標基因與HLA-A02其中之一或兩者的細胞
將編碼目標基因的開放讀取框或HLA-A*0201的cDNA以PCR擴增。將PCR擴增過的產物選殖到一載體及pIRES載體(Clontech Laboratories,Inc.,Cat. No. 631605)。使用lipofectamine 2000(Invitrogen)依照製造商建議的程序將該質體轉染到COS7中，COS7為目標基因及HLA-A02陰性細胞株。轉染後2天，以versene(Invitrogen)收獲經轉染的細胞，並當成目標細胞(5×104細胞/孔)供CTL活性分析。
結果 預測衍生自HJURP的HLA-A*0201連接胜肽
表3a與3b顯示依照高連接親和性排列該HLA-A2連接的HJURP的九胜肽及十胜肽。總共選出24個胜肽具有HLA-A2連接潛力，並檢查以確定該抗原決定基胜肽。
起始位置代表從HJURP的N端起算的胺基酸殘基數解離常數[Kd(nM)]係得自「NetMHC3.0」
以來自經HLA-A*0201限制的HJURP所預測的胜肽誘導CTL，及建立以HJURP衍生胜肽刺激的CTL細胞株
針對衍生自HJURP的胜肽的CTL，係依照如「材料與方法」敘述的實驗步驟獲得。胜肽專一性CTL活性，係以IFN-gamma ELISPOT分析法決定(圖5a-i)。下列孔證明比起對照孔有效地製造IFN-gamma：以HJURP-A02-9-496(序列識別號：26)刺激的孔#4(a)、以HJURP-A02-9-354(序列識別號：27)刺激的孔#2(b)、以HJURP-A02-9-406(序列識別號：30)刺激的孔#4(c)、以HJURP-A02-9-129(序列識別號：31)刺激的孔#5(d)、以HJURP-A02-9-599(序列識別號：32)刺激的孔#3(e)、以HJURP-A02-9-386(序列識別號：35)刺激的孔#1(f)、以HJURP-A02-10-405(序列識別號：37)刺激的孔#5(g)、以HJURP-A02-10-128(序列識別號：38)刺激的孔#3(h)，及以HJURP-A02-10-54(序列識別號：43)刺激的孔#6(i)。另一方面，以表3a與3b所示的其他胜肽刺激時，雖然這些胜肽與HLA-A*0201可能有連接活性，但未檢測到有效的IFN-gamma產生。作為典型的陰性資料，以HJURP-A02-9-150(序列識別號：25)(j)刺激的經胜肽脈衝的目標細胞，未觀察到專一性CTL反應。結果，鑑別有9個衍生自HJURP的胜肽有潛力誘導有效的CTL。
建立對抗HJURP專一性胜肽的CTL細胞株及選殖體
將由IFN-gamma ELISPOT分析法偵測到有胜肽專一性CTL活性的以HJURP-A02-9-496(序列識別號：26)刺激的孔#4(a)、以HJURP-A02-9-406(序列識別號：30)刺激的孔#4(b)、以HJURP-A02-9-129(序列識別號：31)刺激的孔#5(c)、以HJURP-A02-10-405(序列識別號：37)刺激的孔#5(d)，及以HJURP-A02-10-128(序列識別號：38)刺激的孔#3(e)的細胞擴張，並利用上述「材料與方法」項所述極限稀釋法建立CTL細胞株。這些CTL細胞株的CTL活性，以IFN-gamma ELISA分析法決定(圖6a-e)。比起未有胜肽脈衝的目標細胞，這些CTL細胞株證明具有有效製造IFN-gamma對抗以對應胜肽脈衝的目標細胞。
再者，從CTL細胞株以極限稀釋如「材料與方法」所述建立CTL選殖體，且CTL選殖體之對抗目標細胞脈衝的胜肽的IFN-gamma製造以IFN-gamma ELISA分析法決定。有效的IFN-gamma產生從以HJURP-A02-9-406(序列識別號：30)(a)、HJURP-A02-9-129(序列識別號：31)(b)、HJURP-A02-10-405(序列識別號:37)(c)與HJURP-A02-10-128(序列識別號:38)(d)刺激的CTL選殖體而確定(圖7a-d)。
對抗外生性表現HJURP與HLA-A*0201的目標細胞之專一性CTL活性
對抗此述胜肽所建立的CTL細胞株及選植體，檢驗其識別內生性表現HJURP與HLA-A*0201分子的能力。對抗以全長HJURP與HLA-A*0201分子轉染的COS7細胞(內生性表現HJURP與HLA-A*0201基因的目標細胞之特定模式)的專一性CTL活性，使用以對應胜肽誘導的CTL細胞株當做效應子細胞測試。以全長HJURP基因或HLA-A*0201其中之一轉染的COS7細胞當做對照。於圖8，以HJURP-A02-10-128(序列識別號:38)刺激的CTL選植體，顯示對抗表現HJURP與HLA-A*0201兩者的COS7細胞具有有效的CTL活性。另一方面，對照組未偵測到顯著的專一性CTL活性。因此，這些數據明確證明HJURP-A02-10-128(序列識別號:38)的胜肽，係內生性處理並表現在帶有HLA-A*0201分子的目標細胞上，並由CTL識別。此結果代表衍生自HJURP的胜肽，適於當做癌症疫苗治療患有HJURP表現腫瘤的病患。
抗原胜肽的同源性分析
以HJURP-A02-9-496(序列識別號:26)、HJURP-A02-9-354(序列識別號:27)、HJURP-A02-9-406(序列識別號:30)、HJURP-A02-9-129(序列識別號：31)、HJURP-A02-9-599(序列識別號：32),HJURP-A02-9-386(SEQ ID:35)、HJURP-A02-10-405(序列識別號：37)、HJURP-A02-10-128(序列識別號：38)與HJURP-A02-10-54(序列識別號：43)刺激的CTL顯示顯著且專一的CTL活性。此結果可能由於HJURP-A02-9-496(序列識別號：26)、HJURP-A02-9-354(序列識別號：27)、HJURP-A02-9-406(序列識別號：30)、HJURP-A02-9-129(序列識別號：31)、HJURP-A02-9-599(序列識別號：32)、HJURP-A02-9-386(SEQ ID:35)、HJURP-A02-10-405(SEQ ID:37)、HJURP-A02-10-128(SEQ ID:38)與HJURP-A02-10-54(序列識別號：43)的序列與從已知會敏化人類免疫系統的其他分子衍生的胜肽為同源。為了排除此可能性，對這些胜肽序列使用BLAST演算法(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)進行同源性分析，詢問條件是無序列有顯著的同源性。同源性分析的結果顯示HJURP-A02-9-496(序列識別號：26)、HJURP-A02-9-354(序列識別號：27)、HJURP-A02-9-406(序列識別號：30)、HJURP-A02-9-129(序列識別號：31)、HJURP-A02-9-599(序列識別號：32)、HJURP-A02-9-386(序列識別號：35)、HJURP-A02-10-405(序列識別號：37)、HJURP-A02-10-128(序列識別號：38)與HJURP-A02-10-54(序列識別號：43)的序列為唯一，因此吾人最佳知識下，此等分子只有很少的可能性會引起對於有些無關分子的不欲免疫反應。
總言之，鑑別出衍生自HJURP的新穎的HLA-A＊0201抗原決定基胜肽。再者，在此的結果證明HJURP的抗原決定基胜肽適於用在癌症免疫療法。
[產業利用性]
本發明提供新的TAA，特別衍生自HJURP者會誘導有效且專一的抗腫瘤免疫反應，對於廣泛的癌症類型有用。此種TAA可當成對抗與HJURP有關的疾病的胜肽疫苗，該疾病例如癌症，具體而言，AML、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、CML、大腸直腸癌、食道癌、擴散型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤及睪丸腫瘤。
雖本發明在此已詳述並參照特定的實施例，應了解以上的敘述為例示及說明的用意，且意欲使人理解本發明及其較佳具體例。經由例行的實驗，該技術領域中具有通常知識者當能輕易理解可在不偏離本發明精神及範圍之下進行各種改變及修飾，本發明的邊界與界線定義於附帶的申請專利範圍。
<110>　腫瘤療法‧科學股份有限公司
<120>　HJURP胜肽與含此胜肽之疫苗
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對於該技術領域具有通常知識的人士而言，本發明的各種態樣與應用在考量本發明的圖式簡單說明及本發明的詳細敘述後，將會更為顯明。
圖1由一系列照片(a)-(f)構成，顯示以衍生自HJURP的胜肽誘導的CTL之IFN-gamma ELISPOT分析法的結果。(a)於孔#4的CTLs以HJURP-A24-9-28(序列識別號：3)刺激、(b)於孔#4的CTLs以HJURP-A24-9-263(序列識別號：4)刺激、(c)於孔#4(c)的CTLs以HJURP-A24-9-408(序列識別號：7)刺激、(d)於孔#6的CTLs以HJURP-A24-10-383(序列識別號：18)刺激，及(e)於孔#4的CTLs以HJURP-A24-10-162(序列識別號：23)刺激，與對照組相比，分別顯示有效的IFN-gamma生產。圖中以方型框出的孔代表對應該孔的細胞擴張以建立CTL細胞株。相反地，(f)以對抗胜肽脈衝的目標細胞的HJURP-A24-9-149(序列識別號：1)刺激CTL，未觀察到特異的IFN-gamma生產，當做負相資料的典型案例。圖中以方型框出的孔代表對應該孔的細胞擴張以建立CTL細胞株。圖中，「+」代表對抗經適當胜肽脈衝的目標細胞的IFN-gamma生產，「-」代表對抗未經任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN-gamma生產。
圖2由一系列折線圖(a)與(b)構成，顯示IFN-gamma ELISA分析法的結果，依序證明以HJURP-A24-9-263(序列識別號：4)(a)與HJURP-A24-9-408(序列識別號：7)(b)刺激的CTL細胞株生產IFN-gamma。結果證明以各胜肽刺激建立的CTL細胞株，比起對照組，顯示有效的IFN-gamma生產。圖中，「+」代表對抗經適當胜肽脈衝的目標細胞的IFN-gamma生產，「-」代表對抗未經任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN-gamma生產。
圖3為一折線圖，顯示從經HJURP-A24-9-408(序列識別號：7)刺激的CTL細胞株以極限稀釋所建立的CTL選殖體的IFN-gamma生產(a)。結果證明以HJURP-A24-9-408(序列識別號：7)刺激建立的CTL選殖體，比起對照組，顯示有效的IFN-gamma生產。圖中，「+」代表對抗經各胜肽脈衝的目標細胞的IFN-gamma生產，「-」代表對抗未經任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN-gamma生產。
圖4由一系列折線圖(a)與(b)構成，顯示對抗外生性表現HJURP與HLA-A*2402的目標細胞的專一性CTL活性。製備經HLA-A*2402轉染或全長HJURP基因轉染的COS7細胞當做對照組。以HJURP-A24-9-408(序列識別號：7)(a)與HJURP-A24-9-263(序列識別號：4)(b)所建立的CTL細胞株，顯示專一性CTL活性對抗以HJURP與HLA-A*2402兩者轉染的COS7細胞(黑色菱形)。另一方面，在對抗表現HLA-A*2402(三角形)或HJURP(圓形)的目標細胞，未偵測到的顯著的專一性CTL活性。
圖5由一系列照片(a)-(i)構成，顯示對於以衍生自HJURP的胜肽誘導的CTL進行IFN-gamma ELISPOT分析法的結果。(a)於孔#4以HJURP-A02-9-496(序列識別號：26)刺激、(b)於孔#2以HJURP-A02-9-354(序列識別號：27)刺激、(c)於孔#4以HJURP-A02-9-406(序列識別號：30)刺激、(d)於孔#5以HJURP-A02-9-129(序列識別號：31)刺激，(e)於孔#3以HJURP-A02-9-599(序列識別號：32)刺激、(f)於孔#1以HJURP-A02-9-386(序列識別號：35)刺激、(g)於孔#5以HJURP-A02-10-405(序列識別號：37)刺激、(h)於孔#3以HJURP-A02-10-128(序列識別號：38)刺激，及(i)於孔#6以HJURP-A02-10-54(序列識別號：43)刺激，與對照組相比，顯示有效的IFN-gamma生產。圖中以方型框出的孔代表對應該孔的細胞擴張以建立CTL細胞株。相反地，(j)以對抗胜肽脈衝的目標細胞的經HJURP-A02-9-150(序列識別號：25)(j)刺激的CTL，未觀察到專一性IFN-gamma生產，當做負相資料的典型案例。圖中，「+」代表對抗經適當胜肽脈衝的目標細胞的IFN-gamma生產，「-」代表對抗未經任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN-gamma生產。
圖6由一系列折線圖(a)-(e)構成，顯示IFN-gamma ELISA分析法的結果，依序證明以HJURP-A02-9-496(序列識別號：26)(a)、HJURP-A02-9-406(序列識別號：30)(b)、HJURP-A02-9-129(序列識別號：31)(c)、HJURP-A02-10-405(序列識別號：37)(d)與HJURP-A02-10-128(序列識別號：38)(e)刺激的CTL細胞株生產IFN-gamma。結果證明以各胜肽刺激建立的CTL細胞株，比起對照組，顯示有效的IFN-gamma生產。圖中，「+」代表對抗經適當胜肽脈衝的目標細胞的IFN-gamma生產，「-」代表對抗未經任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN-gamma生產。
圖7由一系列折線圖(a)-(d)構成，顯示從經HJURP-A02-9-406(序列識別號：30)(a)、HJURP-A02-9-129(序列識別號：31)(b)、HJURP-A02-10-405(序列識別號：37)(c)與HJURP-A02-10-128(序列識別號：38)(d)刺激的CTL細胞株以極限稀釋所建立的CTL選殖體的IFN-gamma生產。結果證明以各胜肽刺激建立的CTL選殖體，比起對照組，顯示有效的IFN-gamma生產。圖中，「+」代表對抗經各胜肽脈衝的目標細胞的IFN-gamma生產，「-」代表對抗未經任何胜肽脈衝的目標細胞的IFN-gamma生產。
圖8由一折線圖構成，顯示對抗外生性表現HJURP與HLA-A*0201的目標細胞的專一性CTL活性。製備經HLA-A*0201轉染或全長HJURP基因轉染的COS7細胞當做對照組。以HJURP-A02-10-128(序列識別號：38)所建立的CTL細胞株對於以HJURP與HLA-A*0201兩者轉染的COS7細胞顯示專一性CTL活性(黑色菱形)。另一方面，在對抗表現HLA-A*0201(三角形)或HJURP(圓形)的目標細胞，未偵測到顯著的專一性CTL活性。

Claims (24)

  1. 一種單離的胜肽，該胜肽具有細胞毒性T淋巴球(CTL)誘導能力，其由選自序列識別號：7、3、4、18及23所組成之群組的胺基酸序列所組成。
  2. 一種單離的胜肽，該胜肽具有細胞毒性T淋巴球(CTL)誘導能力，其由選自序列識別號：38、26、27、30、31、32、35、37及43所組成之群組的胺基酸序列所組成。
  3. 一種單離的胜肽，該胜肽具有細胞毒性T淋巴球(CTL)誘導能力，其由藉由取代選自序列識別號：7、3、4、18及23所組成之群組的胺基酸序列之1或2個胺基酸殘基而修飾之一胺基酸序列所組成，其中該取代為下述之1種或2種特徵：(a)序列識別號：7、3、4、18或23的胺基酸序列的N端起算的第2個胺基酸被取代為選自苯丙胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸及色胺酸所組成之群組的胺基酸；及(b)序列識別號：7、3、4、18或23的胺基酸序列的C端的胺基酸被取代為選自苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、色胺酸及甲硫胺酸所組成之群組的胺基酸。
  4. 一種單離的胜肽，該胜肽具有細胞毒性T淋巴球(CTL)誘導能力，其由藉由取代選自序列識別號：38、26、27、30、31、32、35、37及43所組成之群組的胺基酸序列之1或2個胺基酸殘基而修飾之一胺基酸序列所組成，其中該取代為下述之1種或2種特徵：(a)序列識別號：38、26、27、30、31、32、35、37 或43的胺基酸序列的N端起算的第2個胺基酸被取代為選自白胺酸及甲硫胺酸所組成之群組的胺基酸；(b)序列識別號：38、26、27、30、31、32、35、37或43的胺基酸序列的C端的胺基酸被取代為選自纈胺酸及白胺酸所組成之群組的胺基酸。
  5. 一種單離的多核苷酸，其係編碼如申請專利範圍第1至4項任一項所述之胜肽。
  6. 一種誘導細胞毒性T淋巴球(CTL)的組合物，其中該組合物包含1個或以上的申請專利範圍第1至4項任一項所述之胜肽或1個或以上的申請專利範圍第5項所述之多核苷酸。
  7. 一種用於治療及/或預防癌症及/或防止其術後復發之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含1個或以上的申請專利範圍第1至4項任一項所述之胜肽或1個或以上的申請專利範圍第5項所述之多核苷酸。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之醫藥組合物，其中該醫藥組合物調配為投予HLA抗原為HLA-A24或HLA-A2的個體。
  9. 如申請專利範圍第7或8項所述之醫藥組合物，其中該醫藥組合物調配為癌症的治療。
  10. 一種體外誘導具有細胞毒性T淋巴球(CTL)誘導能力的抗原表現細胞(APC)的方法，該方法包含選自下列所組成之群組的步驟：(a)使抗原表現細胞(APC)與申請專利範圍第1至4 項任一項之胜肽在體外(in vitro)接觸；以及(b)將編碼申請專利範圍第1至4項任一項之胜肽的多核苷酸導入抗原表現細胞(APC)。
  11. 一種體外誘導細胞毒性T淋巴球(CTL)的方法，該方法包含選自下列所組成之群組的步驟：(a)共同培養CD8+ T細胞與表面呈現由HLA抗原與申請專利範圍第1至4項任一項之胜肽所形成的複合體之抗原表現細胞(APC)；(b)共同培養CD8+ T細胞與表面呈現由HLA抗原與申請專利範圍第1至4項任一項之胜肽所形成的複合體之外吐小體；以及(c)將包含編碼連接於申請專利範圍第1至4項任一項之胜肽的T細胞受體(TCR)次單元多胜肽的多核苷酸之基因，導入T細胞。
  12. 一種單離的抗原表現細胞(APC)，係在表面上呈現由HLA抗原與申請專利範圍第1至4項任一項之胜肽所形成的複合體。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之抗原表現細胞(APC)，其係由申請專利範圍第10項之方法所誘導。
  14. 一種單離的細胞毒性T淋巴球(CTL)，其以申請專利範圍第1至4項任一項之胜肽當做目標。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之細胞毒性T淋巴球(CTL)，其係由申請專利範圍第11項之方法所誘導。
  16. 一種申請專利範圍第1至4項任一項之單離的胜 肽、或編碼該胜肽的多核苷酸在製備有需要的個體中誘導對抗癌症的免疫反應之組合物的用途。
  17. 一種抗體或其免疫活性片段，其係對抗申請專利範圍第1至4項任一項之胜肽。
  18. 一種載體，包含編碼申請專利範圍第1至4項任一項之胜肽的多核苷酸。
  19. 一種診斷套組，包含如申請專利範圍第1至4項任一項之胜肽、如申請專利範圍第5項之核苷酸、或如申請專利範圍第17項之抗體。
  20. 一種外吐小體，其呈現包含如申請專利範圍第1至4項任一項之胜肽及HLA抗原的複合體。
  21. 一種寄主細胞，係經如申請專利範圍第18項之表現載體轉形或轉染。
  22. 一種下列(a)或(b)在製備誘導具有細胞毒性T淋巴球(CTL)誘導活性的抗原表現細胞(APC)之組合物的用途：(a)如申請專利範圍第1至4項任一項之胜肽；或(b)編碼如申請專利範圍第1至4項任一項之胜肽的多核苷酸。
  23. 一種下列(a)至(c)任一項在製備誘導細胞毒性T淋巴球(CTL)之組合物的用途：(a)如申請專利範圍第1至4項任一項之胜肽；(b)編碼如申請專利範圍第1至4項任一項之胜肽的多核苷酸；或 (c)在表面上呈現由HLA抗原與申請專利範圍第1至4項任一項之胜肽所形成的複合體之抗原表現細胞(APC)。
  24. 一種選自由下列(a)至(d)所組成之群組的至少一種成分作為活性成分在製備治療或預防癌症或腫瘤之醫藥劑或醫藥組成物的用途：(a)如申請專利範圍第1至4項任一項之胜肽；(b)以可表現形式編碼如申請專利範圍第1至4項任一項之胜肽的核酸；(c)呈現如申請專利範圍第1至4項任一項之胜肽之抗原表現細胞(APC)；及(d)以如申請專利範圍第1至4項任一項之胜肽為目標的細胞毒性T淋巴球。
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