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TWI552753B - 以ＲＮＡｉ抑制α-ＥＮａＣ表現 - Google Patents

以ＲＮＡｉ抑制α-ＥＮａＣ表現 Download PDF

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TWI552753B
TWI552753B TW103118914A TW103118914A TWI552753B TW I552753 B TWI552753 B TW I552753B TW 103118914 A TW103118914 A TW 103118914A TW 103118914 A TW103118914 A TW 103118914A TW I552753 B TWI552753 B TW I552753B
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艾瑪 西克曼
亨利 盧克 丹那漢
帕梅拉 坦
安克 蓋克
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Description

以RNAi抑制α-ENaC表現
本發明係關於ENaC-介導之氣管離子傳遞領域及用於調節α-ENaC表現之組合物及方法，且更特定言之係關於藉由寡核苷酸經由RNA干擾來下調α-ENaC，該等寡核苷酸係經由吸入/鼻內投與局部投與至肺及鼻腔，或例如藉由經靜脈內注射全身投與。
RNA干擾或"RNAi"為最初由Fire及合作者創造以描述雙股RNA(dsRNA)在引入蠕蟲中時可阻斷基因表現之觀測結果的術語(Fire等人，Nature 391 ：806-811,1998)。短dsRNA在許多生物體(包括脊椎動物)中引導基因特異性轉錄後沉默，且已提供用於研究基因功能之新穎工具。最近已多次評論此技術，例如參見Novina,C.D：，及Sharp,P.,Nature 2004,430：161，及Sandy,P.等人，Biotechniques 2005,39：215，其藉由引用之方式併入。
處於環境與身體之間的介面處之黏膜表面已逐漸形成多種保護性機制。該先天防禦之主要形式為以液體清潔此等表面。通常，黏膜表面之液體層數反映上皮液體分泌(通常反映與水(及陽離子抗衡離子)偶合之陰離子(Cl- 及/或HCO3 - )分泌)與上皮液體吸收(通常反映與水及抗衡陰離子(Cl- 及/或HCO3 - )偶合之Na+ 吸收)之間的平衡。黏膜表面之許多疾病係由彼等黏膜表面上由分泌(過少)與吸收(相對過多)之間的不平衡形成之保護性液體過少引起。表徵此等黏膜機能失調之缺陷鹽 傳遞過程存在於黏膜表面之上皮層中。一種補充黏膜表面上之保護性液體層之方法為藉由阻斷Na+ 通道介導之液體吸收使系統"再平衡"。介導Na+ 及液體吸收之速率限制步驟的上皮蛋白為上皮Na+ 通道(ENaC)。α-ENaC位於上皮細胞之頂面，亦即黏膜表面-環境之介面。α-ENaC介導之Na+ 介導之液體吸收的抑制可實現治療效用。因此，需要研發治療及預防牽連α-ENaC之疾病或病症(例如，人類及動物之囊腫性纖維化)之有效療法，及尤其具有高功效之療法。高效之一個前提為活性成份在生理環境中不會過快降解。
本發明提供適用於例如藉由吸入、鼻內或氣管內投與該等藥劑降低個體(例如哺乳動物，諸如人類)體內α-ENaC含量之特定組合物及方法。
本發明特定提供由至少15個或更多來自α-ENaC之連續核苷酸組成或基本上由其組成或包含其之iRNA藥劑，且更特定言之包含來自表1A-1D中提供之序列中之一者的15個或更多連續核苷酸之藥劑。iRNA藥劑較佳每股包含少於30個核苷酸，例如21-23個核苷酸，諸如彼等表1A-1D中提供者。雙股iRNA藥劑可具有鈍端或更佳具有來自藥劑3'端之一或兩者的1-4個核苷酸之懸垂物。
此外，iRNA藥劑可僅含有天然存在之核糖核苷酸子單元，或可經合成以含有藥劑中包括之核糖核苷酸子單元中之一或多者之糖、磷酸鹽或鹼基之一或多個修飾。iRNA藥劑可進一步經修飾以與經選擇以改良該藥劑之穩定性、分布或細胞攝取的配位體(例如，膽固醇)連接。iRNA藥劑可進一步為分離形式或可為用於本文所述方法之醫藥組合物之部分，尤其作為經調配以輸送至肺或鼻腔或經調配以雙親投與之醫藥組合物。醫藥組合物可含有一或多種iRNA藥劑，且在一些實施例中，將含有兩種或兩種以上iRNA藥劑，其各自針對α-ENaC基 因之不同區段。
本發明之一態樣係關於包含至少一個非天然核鹼基之雙股寡核苷酸。在某些實施例中，非天然核鹼基為二氟甲苯基、硝基吲哚基、硝基吡咯基或硝基咪唑基。在較佳實施例中，非天然核鹼基為二氟甲苯基。在某些實施例中，構成雙股寡核苷酸之兩個寡核苷酸股中僅一者含有非天然核鹼基。在某些實施例中，構成雙股寡核苷酸之兩個寡核苷酸股皆獨立地含有非天然核鹼基。
本發明進一步提供降低細胞中α-ENaC mRNA含量之方法。該等方法包含如下文進一步所述向個體投與本發明iRNA藥劑中之一者之步驟。本發明方法利用RNA干擾中涉及之細胞機制以使細胞中之標靶RNA選擇性降解且包含使細胞與本發明iRNA藥劑中之一者接觸之步驟。該等方法可直接對細胞進行或可藉由向個體投與本發明之iRNA藥劑/醫藥組合物中之一者對哺乳動物個體進行。使細胞中之標靶RNA減少導致所產生之編碼蛋白質之量減少，且在生物體中導致上皮電位差減少、降低之流體吸收及增加之黏膜纖毛清除。
本發明之方法及組合物，例如方法及iRNA藥劑組合物可以本文所述之任何劑量及/或調配物使用，以及以本文所述之任何投與途徑使用。
所附圖式及下文描述中闡述本發明之一或多個實施例的細節。本發明之其他特徵、目標及優勢將自本說明書、圖式及自申請專利範圍而變得顯而易見。本申請案將所有引用之參考案、專利及專利申請案藉由引用的方式以所有目的全部併入。
在圖中：圖1：經選殖食蟹猴α-EnaC之pXoon結構的限制性酶切圖。
圖2：食蟹猴α-EnaC之蛋白質及DNA序列。
圖3：將預測之脫靶及中靶鑑別位點選殖入AY535007雙螢光素酶報導體結構中。片段由5'及3'端之19nt預測標靶位點及10nt側接序列組成。
為便於說明，本文有時使用之術語"核苷酸"或"核糖核苷酸"係指RNA藥劑之一或多個單體子單元。應理解，如下文進一步描述，本文使用之術語"核糖核苷酸"或"核苷酸"在經修飾RNA或核苷酸代用品之狀況下亦可係指一或多個位置處的經修飾核苷酸或代用品置換部分。
本文所用之"RNA藥劑"為未經修飾之RNA、經修飾之RNA或核苷代用品，其各自描述於本文中或為RNA合成技術中熟知。儘管已描述眾多經修飾RNA及核苷代用品，但較佳實例包括彼等與未經修飾RNA相比，對核酸酶降解的抵抗性較大者。較佳實例包括彼等具有2'糖修飾、單股懸垂物修飾，較佳3'單股懸垂物或尤其(若單股)5'-修飾，其包括一或多個磷酸酯基或一或多個磷酸酯基類似物者。
本文所用之"iRNA藥劑"("干擾RNA藥劑"之縮寫)為RNA藥劑，其可下調標靶基因(例如ENaC基因SCNN1A)之表現。儘管不期望受理論約束，但iRNA藥劑可藉由多種機制中之一或多者起作用，包括標靶mRNA之轉錄後裂解(此項技術中有時稱為RNAi)或轉錄前或轉譯前機制。
如本文所用之"ds iRNA藥劑"("雙股iRNA藥劑"之縮寫)為包括一個以上，且較佳兩個股，其中股間雜交可形成雙鏈體結構區域之iRNA藥劑。本文之"股"係指核苷酸(包括非天然存在或經修飾之核苷酸)之鄰接序列。兩個或兩個以上股可為獨立分子或各自形成獨立分子之部分，或其可(例如)藉由連接子，例如聚乙二醇連接子共價地相互連接以形成一個分子。至少一個股可包括與標靶RNA充分互補之區域。該股稱為"反義股"。包含與反義股互補之區域的dsRNA藥劑之第 二股稱為"有意義股"。然而，亦可由至少部分自身互補形成(例如)髮夾或鍋柄結構(包括雙鏈體區域)之單RNA分子形成ds iRNA藥劑。後者在本文中稱為短髮夾RNA或shRNA。在該狀況下，術語"股"係指與同一RNA分子之另一區域互補之RNA分子區域之一者。
儘管在哺乳動物細胞中，長ds iRNA藥劑可誘發通常有害之干擾素反應，但短ds iRNA藥劑不激發干擾素反應，至少不激發至對細胞及/或宿主有害之程度(Manche等人，Mol.Cell.Biol. 12 ：5238,1992；Lee等人，Virology 199 ：491,1994；Castelli等人，J.Exp.Med. 186 ：967,1997；Zheng等人，RNA 10 ：1934,2004；Heidel等人，Nature Biotechnol.22 1579 )。本發明之iRNA藥劑包括足夠短以不在正常哺乳動物細胞中激發有害非特異性干擾素反應之分子。因此，向個體投與包括iRNA藥劑之組合物(例如， 如本文所述調配)可用於降低α-ENaC在個體體內之表現，同時防止干擾素反應。足夠短以不激發有害干擾素反應之分子在本文中稱為siRNA藥劑或siRNA。如本文所用之"siRNA藥劑"或"siRNA"係指iRNA藥劑(例如ds iRNA藥劑)，其足夠短以不誘發哺乳動物(且尤其人類)細胞中之有害干擾素反應，例如其具有小於60但較佳小於50、40或30個核苷酸對之雙鏈體區域。
包括ds iRNA藥劑及siRNA藥劑之本文所述之經分離iRNA藥劑可藉由RNA降解介導α-ENaC之降低之表現。為便利起見，該RNA在本文中亦係指待沉默之RNA。該核酸亦稱為"標靶RNA"，有時稱為"標靶RNA分子"或有時"標靶基因"。
如本文所用，短語"介導RNAi"係指藥劑以序列特異性方式使標靶基因沉默的能力。"使標靶基因沉默"意謂藉以使當不與藥劑接觸時含有及/或表現特定標靶基因產物之細胞在與藥劑接觸時相較於未與藥劑接觸之類似細胞將含有及/或少表現至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%該基因產物之方法。標靶基因之 該產物可(例如)為信使RNA(mRNA)、蛋白質或調節元件。
如本文所用，術語"互補"係用於表示足夠程度之互補使得本發明化合物與標靶RNA分子(例如，α-ENaC mRNA)之間發生穩定且特異之結合。特異性結合需要足夠程度之互補以避免寡聚化合物與非標靶序列在需要特異性結合之狀況下，亦即在活體內檢定或療法治療狀況下之生理學條件下或在活體外檢定狀況下之進行檢定之條件下的非特異性結合。非標靶序列與標靶序列的不一致之處通常達至少2個、3個或4個核苷酸。
如本文所用，若iRNA藥劑降低細胞中標靶RNA編碼之蛋白質的產量，則iRNA藥劑與標靶RNA，例如標靶mRNA(例如，α-ENaCmRNA)"充分互補"。iRNA藥劑亦可與標靶RNA"精確互補"，例如標靶RNA及iRNA藥劑退火，較佳形成由精確互補區域之瓦生克立克(Watson-Crick)鹼基對獨佔式製成的雜交物。"充分互補"iRNA藥劑可包括與標靶α-ENaC RNA精確互補之內部區域(例如，具有至少10個核苷酸)。此外，在一些實施例中，iRNA藥劑特異性判別單一核苷酸差異。在此狀況下，若在單一核苷酸差異區域(例如，7個核苷酸內)發現精確互補，則iRNA藥劑僅介導RNAi。較佳iRNA藥劑將基於表1A-1D中提供之有意義及反義序列或由其組成或包含其。
如本文所用，"基本上相同"當用來指稱相較於第二核苷酸序列之第一核苷酸序列時，意謂第一核苷酸序列與第二核苷酸序列相同，其中例外為至多一個、兩個或三個核苷酸取代(例如，由尿嘧啶置換之腺苷)。本文所用之"基本上保持抑制經培養人類細胞中之α-ENaC表現之能力"係指與表1A-1D之iRNA藥劑中之一者不同但藉由缺失、添加或取代核苷酸而由其衍生之iRNA藥劑，意謂所衍生之iRNA藥劑擁有不小於20%產生其之表1A-1D之iRNA藥劑的抑制活性之抑制活性。舉例而言，由將經培養人類細胞中存在之α-ENaC mRNA之量降低70%的 表1A-1D之iRNA藥劑衍生之iRNA藥劑本身可將經培養人類細胞中存在之mRNA量降低至少50%，從而認為係基本上保持抑制經培養人類細胞中α-ENaC複製之能力。視情況而言，本發明之iRNA藥劑可將經培養人類細胞中存在之α-ENaC mRNA之量降低至少50%。
如本文所用，"個體"係指經歷針對由α-ENaC介導之病症的治療之哺乳動物生物體。個體可為任何哺乳動物，諸如牛、馬、小鼠、大鼠、犬、豬、山羊或靈長類動物。在較佳實施例中，個體為人類。
iRNA藥劑之設計及選擇
如本文所用，"與α-ENaC表現有關之病症"係指任何生物或病理學狀態，其(1)至少部分由α-ENaC之存在介導，且(2)其結果可藉由降低α-ENaC存在之含量影響。下文述及與α-ENaC表現有關之特異性病症。
本發明係基於靶向α-ENaC及在活體外與iRNA藥劑一起培育後證明使經培養細胞中之α-ENaC基因沉默且引起針對α-ENaC介導之病症的保護性作用之iRNA藥劑的設計、合成及產生。
iRNA藥劑可基於序列資訊及所要特徵理性地設計。舉例而言，iRNA藥劑可根據候選雙鏈體之相對熔融溫度設計。一般而言，雙鏈體在反義股之5'端應具有比反義股之3'端低的熔融溫度。
本發明提供含有靶向一或多個α-ENaC轉錄物之siRNA及/或shRNA的組合物。
對於所選之任何特定基因標靶而言，根據本發明使用之siRNA或shRNA的設計較佳將遵循某些準則。在許多狀況下，本發明之傳遞至細胞的藥劑在成為活性抑制劑之前亦可經歷一或多個處理步驟(參看下文之進一步論述)；在該等狀況下，彼等一般熟習此項技術者將瞭解相關試劑將較佳經設計以包括為其處理所需的序列。
由上皮鈉通道障礙介導之疾病包含與調節跨越上皮膜之流體體 積相關之疾病。舉例而言，氣管表面液體體積為黏膜纖毛清除及維持肺健康之關鍵調節劑。上皮鈉通道之阻斷將促進氣管上皮之黏膜側上的流體積聚，進而促進黏液清除且防止黏液及痰在呼吸道組織(包含肺氣管)中之積聚。該等疾病包含呼吸道疾病，諸如囊腫性纖維化、原發性纖毛運動障礙、慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、呼吸道感染(急性及慢性；病毒性及細菌性)及肺癌瘤。藉由阻斷上皮鈉通道介導之疾病亦包括不同於呼吸道疾病之疾病，其與跨越上皮之異常流體調節相關，可能涉及其表面上之保護性表面液體之異常生理學，例如口乾症(口乾)或乾燥性角膜結膜炎(眼乾)。此外，腎臟中上皮鈉通道之阻斷可用以促進利尿且進而誘發降血壓效應。
根據本發明之治療可為症狀性或預防性治療。
哮喘包括內因性(非過敏性)哮喘及外因性(過敏性)哮喘、輕度哮喘、中度哮喘、嚴重哮喘、支氣管性哮喘、運動誘發性哮喘、職業性哮喘及細菌性感染之後所誘發之哮喘。亦應瞭解哮喘之治療涵蓋治療(例如)年齡小於4或5歲之個體，該等個體顯示出喘鳴性症狀且已診斷或可診斷為"喘鳴嬰兒"，其為已確立的主要醫學關注之患者類別且現在通常識別為初生或早期哮喘患者)。(為方便起見，將此特定哮喘病狀稱為"喘鳴嬰兒症候群"。)
哮喘治療中之預防性功效將藉由症狀發作之頻率或嚴重性，例如急性哮喘或支氣管收縮發作之頻率或嚴重性的降低，肺功能之改善或氣管過度反應性的改善來得以證明。其可另外藉由對於其他症狀療法，亦即用於或意欲當症狀發生時限制或中斷症狀發作之療法，例如抗發炎性療法(例如，皮質類固醇)或支氣管擴張療法的要求降低來得以證明。哮喘之預防性益處在傾向於"晨間肺功能下降"之個體中尤為明顯。"晨間肺功能下降"為已確認之哮喘症候群，其為相當大百分比之哮喘患者所常見且特徵為(例如)在約4-6am小時之間，亦即，在通 常大體上與任何先前所投與之症狀哮喘療法相隔甚遠之時間處的哮喘發作。
慢性阻塞性肺病包括慢性支氣管炎或與其相關之呼吸困難、氣腫以及其他藥物療法，尤其為其他吸入藥物療法所引起之氣管過度反應性之加重。本發明亦適用於治療任何類型或起源之支氣管炎，包括例如急性支氣管炎、花生吸入性支氣管炎(arachidic bronchitis)、卡他性(catarrhal)支氣管炎、哮吼性(croupus)支氣管炎、慢性支氣管炎或結核性支氣管炎。
基於本文所示之結果，本發明提供降低經培養細胞及個體，例如哺乳動物，例如人類體內之α-ENaC表現的iRNA藥劑。表1A-1D基於表A中給出之標準命名法縮寫提供靶向α-ENaC之例示性iRNA藥劑。
表1A、Seq Id No.305-608、表1B及表1D、Seq Id No.1519-1644列出不包含核苷酸修飾(例外為3'-末端與次末胸苷之間的一個硫代磷酸酯鍵聯)之siRNA。表1A-1D中之剩餘Seq Id列出siRNA，其中包含嘧啶鹼基之所有核苷酸為有意義股中之2'-O -甲基修飾之核苷酸，且5'-ua-3'之序列內容中之所有尿苷以及5'-ca-3'之序列內容中之所有胞苷為反義股中之2'-O -甲基-修飾之核苷酸。
基於此等結果，本發明特定提供包括具有表1A-1D中提供之藥劑的有意義股序列之至少15個連續核苷酸的有意義股，及具有表1A-1D中提供之藥劑的反義序列之至少15個連續核苷酸的反義股之iRNA藥劑。
表1A-1D中展示之iRNA藥劑係由與標靶序列互補或相同之兩個長度為19個核苷酸之股加上3'-TT懸垂物構成。本發明提供包含至少15個，或至少16個、17個或18個，或19個來自此等序列之連續核苷酸之藥劑。然而，儘管此等長度可潛在地最佳，但iRNA藥劑並不意欲 限於此等長度。熟習此項技術者完全瞭解，較短或較長之iRNA藥劑可具有類似的有效性，因為在特定長度範圍內，功效實際上隨核苷酸序列而變化而隨非股長度而變化。舉例而言，Yang等人，PNAS 99 ：9942-9947(2002)證明長度介於21與30個鹼基對之間的iRNA藥劑之類似功效。其他已展示藉由低至約15個鹼基對之長度之iRNA藥劑使基因有效沉默(Byrom等人，"Inducing RNAi with siRNA Cocktails Generated by RNase III"Tech Notes 10(1),Ambion,Inc.,Austin,TX)。
因此，本發明可能且預期自表1A-1D中提供之序列選擇介於15至19個核苷酸之間的部分序列以產生由表1A-1D中提供之序列中之一者衍生的iRNA藥劑。或者，較佳(但非必要)以所添加之核苷酸與標靶基因(例如，α-ENaC)之各別序列互補之方式向表1A-1D中提供之序列中之一者或包含來自此等藥劑中之一者的15個連續核苷酸之藥劑添加一或若干個核苷酸。舉例而言，來自藥劑中之一者的前15個核苷酸可與α-ENaC mRNA中之此等序列之5'處所出現的8個核苷酸組合以獲得在有意義股及反義股中具有23個核苷酸之藥劑。所有該等衍生之iRNA藥劑包括於本發明之iRNA藥劑中，其限制條件為其基本上保持抑制經培養人類細胞中之α-ENaC複製之能力。
iRNA藥劑之反義股長度應等於或至少為14個、15個、16個、17個、18個、19個、25個、29個、40個或50個核苷酸。長度應等於或小於60個、50個、40個或30個核苷酸。較佳範圍為15-30個、17-25個、19-23個及19-21個核苷酸之長度。
iRNA藥劑之有意義股長度應等於或至少為14個、15個、16個、17個、18個、19個、25個、29個、40個或50個核苷酸。長度應等於或小於60個、50個、40個或30個核苷酸。較佳範圍為15-30個、17-25個、19-23個及19-21個核苷酸之長度。
iRNA藥劑之雙股部分長度應等於或至少為15個、16個、17個、 18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、29個、40個或50個核苷酸對。長度應等於或小於60個、50個、40個或30個核苷酸對。較佳範圍為15-30個、17-25個、19-23個及19-21個核苷酸對之長度。
一般而言，本發明之iRNA藥劑包括與α-ENaC mRNA充分互補之區域，且就核苷酸而言為足夠長度，因此iRNA藥劑或其片段可介導α-ENaC基因之下調。在iRNA藥劑與標靶基因之間存在完美互補並非必要的，但一致性必須足夠以使iRNA藥劑或其裂解產物能藉由(例如)α-ENaC mRNA之RNAi裂解引導序列特異性沉默。
因此，本發明之iRNA藥劑所包括的藥劑包含各自包含至少16個、17個或18個核苷酸之序列的有意義股及反義股，除每股不超過1個、2個或3個核苷酸分別由其他核苷酸取代(例如，由尿嘧啶置換腺苷)外，該序列基本上與表1A-1D之序列中之一者相同(如下文定義)，同時該等藥劑基本上保持抑制經培養人類細胞中α-ENaC表現之能力。此等藥劑因此將擁有至少15個與表1A-1D之序列中之一者相同的核苷酸，但關於標靶α-ENaC序列或在有意義股與反義股之間引入1個、2個或3個鹼基錯配。與標靶α-ENaC RNA序列，尤其在反義股中之錯配在末端區域中最可耐受，且若存在則較佳在(例如)5'及/或3'末端之6個、5個、4個或3個核苷酸內，最佳在有意義股之5'-末端或反義股之3'-末端的6個、5個、4個或3個核苷酸內之末端區域中。有意義股僅需要與反義股充分互補以保持分子之整體雙股特徵。
較佳地，有意義股及反義股經選擇使得iRNA藥劑在分子之一端或兩端包括單股或未成對區。因此，iRNA藥劑含有有意義股及反義股，較佳經成對以含有懸垂物，例如1個或2個5'或3'懸垂物，但較佳2-3個核苷酸之3'懸垂物。多數實施例將具有3'懸垂物。較佳之siRNA藥劑在iRNA藥劑之一端或兩端將具有長度為1個至4個，或較佳2個或 3個核苷酸之單股懸垂物，較佳3'懸垂物。懸垂物可為一股比另一股長的結果，或相同長度之兩股交錯之結果。形成懸垂物之未成對之核苷酸可為核糖核苷酸，或其可為脫氧核糖核苷酸，較佳為胸苷。5'-端較佳經磷酸化，或其可未經磷酸化。
例如在上文所述之siRNA藥劑範圍中，雙鏈體區域之較佳長度介於15個與30個之間，最佳為18個、19個、20個、21個、22個及23個核苷酸長度。siRNA藥劑在長度及結構上可類似於來自長dsRNA之天然Dicer處理產物。亦包括siRNA藥劑之兩個股鍵聯(例如，共價鍵聯)之實施例。髮夾型或提供所要雙股區及較佳3'懸垂物之其他單股結構亦在本發明內。
候選iRNA藥劑之評估
如上文所述，本發明提供用於識別適用作α-ENaC抑制劑的siRNA之系統。因此如上文所述，shRNA經胞內處理以產生具有雙鏈體部分之siRNA，其具有與shRNA之主幹結構相同之序列，該系統同等用於識別適用作α-ENaC抑制劑之shRNA。為說明之目的，此部分將係指siRNA，但該系統亦涵蓋相應shRNA。特定言之，本發明表明靶向抑制α-ENaC活性之siRNA的成功製備。本文所述之技術及試劑可容易地應用以設計靶向其他基因或基因區之潛在新穎siRNA，且如本文所述測試其抑制α-ENaC之活性。
在本發明之各種實施例中，可藉由向細胞中引入候選siRNA(例如，藉由外源性投與或藉由向細胞中引入引導siRNA之內源性合成之載體或結構)或在實驗室動物體內藉由肺部或鼻內投與測試潛在α-ENaC抑制劑對內源性α-ENaC表現的抑制。或者，潛在α-ENaC抑制劑可藉由使候選siRNA以及α-ENaC-表現質體瞬時共轉染來活體外測試。接著評定候選siRNA降低標靶轉錄水準及/或抑制(inhibit或suppress)α-ENaC活性之一或多個態樣或特徵(諸如上皮電位差或氣管 表面液體吸收)之能力。
已傳輸本發明siRNA組合物之細胞或實驗室動物(測試細胞/動物)可與未接受本發明組合物之類似或相當細胞或實驗室動物(對照細胞/動物，例如未接受siRNA或已接受對照siRNA(諸如靶向諸如綠色螢光蛋白(GFP)之非內源性轉錄物之siRNA)之細胞/動物)比較。測試細胞/動物之離子傳遞表型可與對照細胞/動物之表型比較，限制條件為本發明siRNA與測試細胞類型/種類共享序列交叉反應性。α-ENaC蛋白及短路電流(活體外或離體)之產生可在測試細胞/動物體內相對於對照細胞/動物進行比較。α-ENaC活性之其他標誌(包括離體上皮電位差或活體內黏膜纖毛清除或全身磁共振成像(MRI))可類似地比較。一般而言，測試細胞/動物及對照細胞/動物將來自相同物種且對於細胞而言為類似或相同細胞類型。舉例而言，可使來自相同細胞系之細胞進行比較。當測試細胞為初級細胞時，對照細胞通常亦為初級細胞。
舉例而言，候選siRNA抑制α-ENaC活性之能力可藉由(i)將候選siRNA輸送至細胞，(ii)相對於內源性表現之對照基因評定α-ENaC mRNA之表現水準，(iii)在活體外細胞模型中比較siRNA存在下產生之胺氯吡脒敏感性電流與不存在siRNA時產生之量來便利地測定。此後一檢定可用於測試靶向可間接影響α-ENaC活性的任何標靶轉錄物之siRNA，且不限於靶向編碼ENaC通道子單元之轉錄物的siRNA。
可藉由使用(例如)北方墨點法、核酸酶保護檢定、探針雜交、逆轉錄(RT)-PCR、即時RT-PCR、微陣列分析等量測標靶轉錄之量來評定候選siRNA降低標靶轉錄水準之能力。候選siRNA抑制由標靶轉錄物(在轉錄或轉錄後階層下)編碼之多肽之產生的能力可使用包括(但不限於)西方墨點法、免疫檢定、ELISA、流式細胞儀、蛋白微陣列等之多種基於抗體之方法量測。一般而言，可使用量測標靶轉錄物或由標靶轉錄物編碼之多肽之量的任何方法。
一般而言，某些較佳α-ENaC iRNA抑制劑將標靶轉錄水準相對於不存在抑制劑狀況下(例如，在缺乏抑制劑的相當對照細胞中)存在之水準降低至少約2倍，較佳至少約4倍，更佳至少約8倍，至少約16倍，至少約64倍或甚至更大之程度。一般而言，某些較佳α-ENaC iRNA抑制劑抑制ENaC通道活性，使得含有抑制劑之細胞中的活性比不含抑制劑之對照細胞中的活性低至少約2倍，較佳至少約4倍，更佳至少約8倍，至少約16倍，至少約64倍、至少約100倍，至少約200倍或甚至更大之程度。
某些較佳α-ENaC iRNA抑制劑在投與siRNA且感染細胞後抑制ENaC通道活性歷時至少12小時、至少24小時、至少36小時、至少48小時、至少60小時、至少72小時、至少96小時、至少120小時、至少144小時或至少168小時。某些較佳α-ENaC抑制劑在投與siRNA後防止(亦即，降低至不可偵測水準)或顯著降低α-ENaC活性歷時至少24小時、至少36小時、至少48小時或至少60小時。根據本發明之各種實施例，α-ENaC活性之顯著降低減少至小於不存在siRNA狀況下將存在之約90%水準，減少至小於不存在siRNA狀況下將存在之約75%水準，減少至小於不存在siRNA狀況下將存在之約50%水準，減少至小於不存在siRNA狀況下將存在之約25%水準，或減少至小於不存在siRNA狀況下將存在之約10%水準。α-ENaC活性之降低可使用任何合適方法量測，包括(但不限於)活體外胺氯吡脒敏感性之短路電流量測、離體上皮電位差或活體內黏膜纖毛清除率或全身/肺MRI。
iRNA藥劑之穩定性測試、修飾及再測試
可評估候選iRNA藥劑之穩定性，例如諸如當將iRNA藥劑引入個體身體時，其對藉由核酸內切酶或核酸外切酶之裂解的易感性。可採用方法識別對修飾，尤其裂解，例如藉由個體身體內發現之組份裂解敏感之位點。該等方法可包括分離及識別藉由在候選iRNA藥劑以經 分離生物介質(例如，血清、血漿、唾液、腦脊髓液或細胞或組織勻漿)活體外培育後或在使個體與候選iRNA藥劑活體內接觸後使其降解所形成之最豐富片段，藉此識別易於裂解之位點。該等方法例如(但不限於)2005年5月7日申請之國際專利申請公開案第WO2005115481號。
當識別出對裂解敏感之部位時，可設計及/或合成另一iRNA藥劑，其中(例如)藉由在裂解位點引入2'-修飾(例如2'-O-甲基)使潛在裂解位點對裂解具有抗性。可再測試此另一iRNA藥劑之穩定性，且可重複此方法直至發現iRNA藥劑展示所要穩定性。
活體內測試
可測試經識別能抑制α-ENaC基因表現之iRNA藥劑在動物模型中之活體內功能(例如，哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、豚鼠或靈長類動物)。舉例而言，可向動物投與iRNA藥劑，且評估iRNA藥劑之生物分布、穩定性及其抑制α-ENaC表現或調節生物學或病理學過程(其至少部分由α-ENaC介導)之能力。
iRNA藥劑可直接向標靶組織投與(諸如藉由注射)，或iRNA藥劑可以與向人類投與相同之方式向動物模型投與。較佳地，諸如藉由鼻內、吸入或氣管內投與將iRNA藥劑輸送至個體氣管。
亦可評估iRNA藥劑之胞內分布。評估可包括測定iRNA藥劑是否攝入至細胞中。評估亦可包括測定iRNA藥劑之穩定性(例如，半衰期)。iRNA藥劑之活體內評估可藉由使用與可示蹤標記(例如，螢光標記，諸如螢光素；放射性標記，諸如35 S、32 P、33 P或3 H；金顆粒；或用於免疫組織化學之抗原顆粒)結合之iRNA藥劑促進。
可評估iRNA藥劑下調α-α-ENaC表現之能力。可藉由(例如)原位雜交，或藉由在暴露於iRNA藥劑之前及之後自組織分離RNA量測活體內α-ENaC基因表現之水準。當需要將動物處死以採集組織時，將 未經處理之對照動物用於比較。α-ENaC RNA可藉由任何所要方法偵測，包括(但不限於)RT-PCR、北方墨點法、分支-DNA檢定或RNAase保護檢定。其他或另外，可藉由對以iRNA藥劑處理之組織提取物進行西方墨點分析或免疫染色來監測α-ENaC基因表現。
可使用已研發之任何多種動物模型測試潛在α-ENaC抑制劑。可向動物投與包含候選siRNA之組合物，能引導該等siRNA在宿主細胞內之合成的構築體或載體，或經工程設計或操作以含有候選siRNA之細胞。評定組合物抑制α-ENaC表現及/或改變ENaC-依賴性表型及/或相對於未接受潛在α-ENaC抑制劑之動物降低其嚴重性之能力。該等模型包括(但不限於)針對ENaC依賴性表型之鼠科動物、大鼠、豚鼠、綿羊及非人類靈長類動物模型，其均為此項技術中已知且用於測試潛在α-ENaC療法之功效。
使用所發明之系統識別候選治療性siRNA藥劑，合適治療劑係選自雙鏈體識別子ND-8302、ND-8332、ND-8348、ND-8356、ND-8357、ND-8373、ND-8381、ND-8396、ND-8450及ND-8453，更合適地係選自ND-8356、ND-8357及ND-8396。
iRNA化學
本文描述經分離之iRNA藥劑，例如介導RNAi抑制α-ENaC基因表現的ds RNA藥劑。
本文論述之RNA藥劑另外包括未經修飾之RNA以及已經修飾(例如)以改良功效之RNA及核苷代用品之聚合物。未經修飾之RNA係指核酸組份，亦即糖、鹼基及磷酸酯基部分與天然存在相同或基本上相同，較佳與人類身體內天然存在者相同或基本上相同之分子。此項技術已提及稀有或不一般，但天然存在之RNA作為經修飾RNA，例如參見Limbach等人Nucleic Acids Res. 22 ：2183-2196,1994。如本文所用，該等通常稱為經修飾RNA之稀有或不一般RNA(顯然因為其通常為轉 錄後修飾之結果)在術語未經修飾之RNA中。本文所用之經修飾RNA係指核酸組份之一或多者，亦即糖、鹼基及磷酸酯基部分與天然存在不同，較佳與人類身體內存在者不同之分子。當其稱為經修飾"RNA"時，其當然將因為修飾而包括並非RNA之分子。核苷代用品為核糖磷酸酯骨幹經非核糖磷酸酯結構置換之分子，該結構允許鹼基以正確空間關係存在使得雜交實質上類似於核糖磷酸酯骨幹中所見(例如核糖磷酸酯骨幹之無電荷模擬物)。本文論述上文之實例。
本文所述之修飾可併入本文所述之任何雙股RNA及RNA類分子(例如，iRNA藥劑)中。可能需要修飾iRNA藥劑之反義及有意義股的一或兩者。因為核酸為子單元或單體之聚合物，所以下文所述之許多修飾在核酸內重複之位置發生，例如鹼基或磷酸酯部分、或磷酸酯部分之非鍵聯氧之修飾。在一些狀況下，修飾將在核酸中之所有個體位置發生，但在許多狀況下且實際上在多數狀況下將不然。藉助於實例，修飾可僅發生於3'或5'末端位置，可僅發生於末端區域，例如在末端核苷酸位置或股之最後2個、3個、4個、5個或10個核苷酸處。修飾可發生於雙股區域，單股區域或兩者中。例如，非鍵聯O位置之硫代磷酸酯修飾可僅發生於一個或兩個末端，可僅發生於末端區域，例如末端核苷酸位置或股之最後2個、3個、4個、5個或10個核苷酸處，或可發生於雙股及單股區域，尤其末端處。類似地，修飾可發生於有意義股、反義股或其兩者。在一些狀況下，有意義股及反義股將具有相同修飾或相同類別之修飾，但在其他狀況下，有意義股及反義股將具有不同修飾，例如在一些狀況下其可能需要僅修飾一個股(例如，有意義股)。
向iRNA藥劑中引入修飾之兩個引子目標為其針對生物環境中之降解的穩定性及藥理學特性(例如藥效特性)之改良，其在下文中進一步論述。對iRNA藥劑之糖、鹼基或骨幹的其他合適修飾描述於2004 年1月16日申請之PCT申請案第PCT/US2004/01193號中。iRNA藥劑可包括非天然存在之鹼基，諸如2004年4月16日申請之PCT申請案第PCT/US2004/011822號中所述之鹼基。iRNA藥劑可包括非天然存在之糖，諸如非碳水化合物環狀載劑分子。用於iRNA藥劑之非天然存在之糖的例示性特徵描述於2003年4月16日申請之PCT申請案第PCT/US2004/11829號中。
iRNA藥劑可包括適用於增加核酸酶抗性之核苷酸內鍵聯(例如，對掌性硫代磷酸酯鍵聯)。此外或其他，iRNA藥劑可包括用於增加核酸酶抗性之核糖模擬物。用於增加核酸酶抗性之例示性核苷酸內鍵聯及核糖模擬物描述於2004年3月8日申請之PCT申請案第PCT/US2004/07070號中。
iRNA藥劑可包括配位體結合之單體子單元及用於寡核苷酸合成之單體。例示性單體描述於2004年8月10日申請之美國申請案第10/916,185號中。
iRNA藥劑可具有ZXY結構，諸如2004年3月8日申請之PCT申請案第PCT/US2004/07070號中所述。
iRNA藥劑可與兩性部分複合。用於iRNA藥劑之例示性兩性部分描述於2004年3月8日申請之PCT申請案第PCT/US2004/07070號中。
在另一實施例中，iRNA藥劑可與以模組複合物為特徵之輸送藥劑複合。複合物可包括與以下中之一或多者(較佳兩者或兩者以上，更佳其所有三者)鍵聯之載劑：(a)縮合劑(例如，能藉由(例如)離子或靜電相互作用吸引(例如結合)核酸之藥劑)；(b)促融劑(例如，能融合及/或經細胞膜傳遞之藥劑)；及(c)標靶基團，例如細胞或組織標靶藥劑，例如凝集素、醣蛋白、脂質或蛋白質，例如與特定細胞類型結合之抗體。與輸送藥劑複合之iRNA藥劑描述於2004年3月8日申請之PCT申請案第PCT/US2004/07070號中。
iRNA藥劑可具有不規則對，諸如介於iRNA雙鏈體之有意義與反義序列之間者。不規則iRNA藥劑之例示性特徵描述於2004年3月8日申請之PCT申請案第PCT/US2004/07070號中。
增強之核酸酶抗性
iRNA藥劑(例如，靶向α-ENaC之iRNA藥劑)對核酸酶可具有增強之抗性。
一種增加抗性之方法為識別裂解位點且修飾該等位點以抑制裂解，如2004年5月4日申請之美國申請案第60/559,917號中所述。舉例而言，二核苷酸5'-ua-3'、5'-ca-3'、5'-ug-3'、5'-uu-3'或5'-cc-3'可用作裂解位點。在某些實施例中，iRNA藥劑之所有嘧啶在有意義股、反義股或兩個股中攜帶2'-修飾，且iRNA藥劑因此對核酸內切酶具有增強之抗性。增強之核酸酶抗性亦可藉由以下步驟實現：修飾5'核苷酸，產生(例如)至少一個5'-尿苷-腺嘌呤-3'(5'-ua-3')二核苷酸，其中尿苷為2'-修飾之核苷酸；至少一個5'-胞苷-腺嘌呤-3'(5'-ca-3')二核苷酸，其中5'-胞苷為2'-修飾之核苷酸；至少一個5'-尿苷-鳥嘌呤-3'(5'-ug-3')二核苷酸，其中5'-尿苷為2'-修飾之核苷酸；至少一個5'-尿苷-尿苷-3'(5'-uu-3')二核苷酸，其中5'-尿苷為2'-修飾之核苷酸；或至少一個5'-胞苷-胞苷-3'(5'-cc-3')二核苷酸，其中5'-胞苷為2'-修飾之核苷酸，如2005年5月27日申請之國際申請案第PCT/US2005/018931號。iRNA藥劑可包括至少2個、至少3個、至少4個或至少5個該等二核苷酸。在特定較佳實施例中，有意義股、反義股或兩個股中之所有存在之序列基元5'-ua-3'及5'-ca-3'中的5'核苷酸為經修飾之核苷酸。較佳地，有意義股、反義股或兩個股中之所有存在之序列基元5'-ua-3'、5'-ca-3'及5'-ug-3'中的5'核苷酸為經修飾之核苷酸。更佳地，有意義股中之所有嘧啶核苷酸為經修飾核苷酸，且反義股中之所有存在之序列基元5'-ua-3'及5'-ca-3'中的5'核苷酸為經修飾核苷酸，或其中反義股在所有存 在之序列基元5'-ug-3'中不包含5'-ua-3'及5'-ca-3'基元。
較佳地，2'-修飾之核苷酸包括(例如)2'-改質之核糖單元，例如2'-羥基(OH)可經修飾或經多個不同"氧基"或"脫氧基"取代基置換。
"氧基"-2'羥基修飾之實例包括烷氧基或芳氧基(OR，例如R=H、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、O(CH2 CH2 O)n CH2 CH2 OR；"鎖"核酸(LNA)，其中2'羥基藉由(例如)亞甲基橋與同一核糖之4'碳連接；O-AMINE及胺基烷氧基、O(CH2 )n AMINE，(例如，AMINE=NH2 ；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基胺基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基、乙二胺、聚胺基)。值得注意的是，僅含有甲氧基乙基(MOE)之寡核苷酸(OCH2 CH2 OCH3 ，PEG衍生物)相較於彼等經穩固硫代磷酸酯修飾修飾者展示核酸酶穩定性。
"脫氧基"修飾包括氫(亦即，脫氧核糖，其與部分ds RNA之懸垂物部分尤其相關)；鹵基(例如，氟)；胺基(例如，NH2 ；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基或胺基酸)；NH(CH2 CH2 NH)n CH2 CH2 -AMINE(AMINE=NH2 ；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基胺基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基)、-NHC(O)R(R=烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)、氰基；巰基；烷基-硫基-烷基；硫基烷氧基；及烷基、環烷基、芳基、烯基及炔基，其可視情況經(例如)胺基官能基取代。
較佳取代基為2'-甲氧基乙基、2'-OCH3 、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基及2'-氟基。
寡核苷酸骨幹中呋喃醣之納入亦可減少內切核苷酸裂解。iRNA藥劑可藉由納入3'陽離子基團或藉由以3'-3'鍵聯轉化3'-末端之核苷酸進一步修飾。在另一替代中，3'-末端可經胺基烷基，例如3' C5-胺基 烷基dT阻斷。其他3'結合物可抑制3'-5'外切核苷酸裂解。不受理論約束，3'結合物(諸如萘普生(naproxen)或布洛芬(ibuprofen))可藉由空間上阻斷核酸外切酶與寡核苷酸之3'-端結合來抑制外切核苷酸裂解。甚至更小之烷基鏈、芳基或雜環結合物或經修飾糖(D-核糖、脫氧核糖、葡萄糖等)可阻斷3'-5'-核酸外切酶。
亦可藉由引入磷酸酯連接子修飾(例如硫代磷酸酯鍵聯)抑制溶核裂解。因此，較佳iRNA藥劑包括針對在通常由氧佔據之非橋位置含有雜原子之經修飾磷酸酯基的特定對掌形式富集或純化之核苷酸二聚體。雜原子可為S、Se、Nr2 或Br3 。當雜原子為S時，富集或對掌性純Sp鍵聯為較佳。富集意謂至少70、80、90、95或99%之較佳形式。當在iRNA藥劑之5'-或3'-末端位置且較佳5'-末端位置附近引入時，經修飾磷酸酯鍵聯特定有效於抑制外切核苷酸裂解。
5'結合物亦可抑制5'-3'外切核苷酸裂解。不受理論約束，5'結合物(諸如萘普生或布洛芬)可藉由空間上阻斷核酸外切酶與寡核苷酸之5'-端結合來抑制外切核苷酸裂解。甚至更小之烷基鏈、芳基或雜環結合物或經修飾糖(D-核糖、脫氧核糖、葡萄糖等)可阻斷3'-5'-核酸外切酶。
當雙鏈體iRNA藥劑在至少一端包括單股核苷酸懸垂物時，iRNA藥劑可對核酸酶具有增加之抗性。在較佳實施例中，核苷酸懸垂物包括1至4個，較佳2至3個未成對核苷酸。在較佳實施例中，與末端核苷酸對直接相鄰之單股懸垂物之未成對核苷酸含有嘌呤鹼基，且末端核苷酸對為G-C對，或最後四個互補核苷酸對中之至少兩個為G-C對。在其他實施例中，核苷酸懸垂物可具有1個或2個未成對核苷酸，且在例示性實施例中核苷酸懸垂物為5'-gc-3'。在較佳實施例中，核苷酸懸垂物烯在反義股之3'-端。在一實施例中，iRNA藥劑包括反義股3'-端之基元5'-cgc-3'，使得形成2-nt懸垂物5'-gc-3'。
因此，iRNA藥劑可包括修飾以抑制個體體內發現之(例如)藉由核酸酶(例如核酸內切酶或核酸外切酶)所進行之降解。此等單體在本文中稱為NRM，或核酸酶抗性促進單體，相應修飾為NRM修飾。在許多狀況下，此等修飾亦將調節iRNA藥劑之其他特性，例如與蛋白質(例如，轉運蛋白，例如血清白蛋白)或RISC之成員相互作用之能力，或第一及第二序列彼此形成雙鏈體之能力或與另一序列(例如，標靶分子)形成雙鏈體之能力。
可將一或多個不同NRM修飾引入iRNA藥劑或iRNA藥劑之序列中。NRM修飾在序列或iRNA藥劑中可使用一次以上。
NRM修飾包括僅可置於末端之一些修飾及可在任何位置出現之其他修飾。一些NRM修飾可抑制雜交，因此較佳僅將其用於末端區域，且較佳不要將其用於(尤其在反義股上)靶向個體序列或基因的序列之裂解位點或裂解區域。其可用於有意義股之任何處，限制條件為在ds iRNA藥劑之兩股之間保持充分雜交。在一些實施例中，需要將NRM置於有意義股之裂解位點或裂解區域，因為其可使脫靶沉默最小化。
在多數狀況下，NRM修飾將視其係包含於有意義或反義股而不同地分布。若在反義股上，則不應將干擾或抑制核酸內切酶裂解之修飾插入經受RISC介導之裂解的區域，例如裂解位點或裂解區域(如Elbashir等人，2001,Genes and Dev.15：188中所述，其藉由引用的方式併入本文中)。標靶之裂解大致發生於20或21nt反義股中間，或與反義股互補之標靶mRNA上第一核苷酸上游之約10或11個核苷酸。如本文所用，裂解位點係指標靶或與其雜交之iRNA藥劑股上裂解位點任一側之核苷酸。裂解區域意謂裂解位點之1個、2個或3個核苷酸內之核苷酸(任一方向)。
可向有意義或反義股之末端區域(例如，在末端位置或在末端之2 個、3個、4個或5個位置)中引入該等修飾。
栓系配位體
iRNA藥劑之特性(包括其藥理學特性)可(例如)由配位體(例如，栓系配位體)之引入來影響及定製。此外，iRNA藥劑之藥理學特性可藉由在iRNA藥劑具有或確實具有栓系配位體時將配位體併入iRNA藥劑之調配物而改良。
廣泛範圍之實體(例如，配位體)可與iRNA藥劑栓系，或用作(例如)配位體結合之單體子單元之載劑的調配結合物或添加劑。實例描述於下文之配位體結合之單體子單元的內容中，但彼僅為較佳地，實體可於其他點與iRNA藥劑偶合。
較佳部分為配位體，其直接或經由插入栓系間接與載劑偶合(較佳為共價的)。在較佳實施例中，配位體經由插入栓系與載劑連接。當配位體結合之單體併入生長股中時，配位體或栓系配位體可存在於配位體結合單體上。在一些實施例中，在"前驅物"配位體結合單體子單元已併入至生長股後，配位體可併入至"前驅物"配位體結合單體子單元。舉例而言，具有(例如)胺基末端栓系(例如，TAP-(CH2 )n NH2 )之單體可併入至生長股或反義股中。在隨後操作中，亦即將前驅物單體子單元併入股中後，具有親電子基團(例如，五氟苯基酯或醛基)之配位體可隨後藉由使配位體之親電子基團與前驅物配位體結合之單體子單元栓系之末端親核性基團偶合而與前驅物配位體結合單體連接。
在較佳實施例中，配位體改變其所併入之iRNA藥劑之分布、靶向或半衰期。在較佳實施例中，配位體提供如相較於(例如)不存在該等配位體之物種的針對所選標靶(例如，分子、細胞或細胞類型、隔室(例如，細胞或器官隔室)、組織、器官或身體區域)的增強之親和力。
較佳配位體可改良傳遞、雜交及特異性特性且亦可改良所得天 然或經修飾寡核糖核苷酸，或包含本文所述之單體的任何組合及/或天然或經修飾核糖核苷酸之聚合分子的核酸酶抗性。
配位體一般可包括(例如)增強攝取之治療改質劑；(例如)用於監測分布之診斷化合物或報導基團；交聯劑；核酸酶-抗性賦予部分；及天然或不尋常核鹼基。一般實例包括親脂性分子、脂質、凝集素、類固醇(例如，熊果醇、賀西格寧(hecigenin)、薯蕷皂素)、萜類(例如，三萜，例如知母皂苷元、木栓酮、表無羈萜醇衍生之石膽酸)、維生素、碳水化合物(例如，葡聚糖、支鏈澱粉、甲殼素、聚葡萄胺糖、合成(例如，寡乳酸酯15-mer)及天然(例如，低分子量及中等分子量)聚合物、菊糖、環糊精或玻尿酸)、蛋白質、蛋白結合藥劑、整合素標靶分子、聚陽離子劑、肽、多元胺及肽模擬物。其他實例包括葉酸或上皮細胞受體配位體，諸如轉移素。
配位體可為天然存在或重組或合成分子，諸如合成聚合物，例如合成聚胺基酸。聚胺基酸之實例包括聚離胺酸(PLL)、聚L-天冬胺酸、聚L-麩胺酸、苯乙烯-順丁烯二酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-順丁烯二酸酐共聚物、N-(2-羥基丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚胺基甲酸酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物或聚磷嗪。多元胺之實例包括：聚伸乙基亞胺、聚離胺酸(PLL)、精胺、亞精胺、多元胺、假肽-多元胺、肽模擬物多元胺、樹狀體多元胺、精胺酸、甲脒、魚精蛋白、陽離子部分(例如，陽離子脂質、陽離子卟啉)、多元胺之第四鹽或α螺旋狀肽。
配位體亦可包括靶向基團，例如細胞或組織靶向藥劑，例如促甲狀腺素、促黑素、界面活性劑蛋白A、黏液素碳水化合物、糖基化聚胺基酸、轉移素、雙膦酸酯、聚麩胺酸、聚天冬胺酸或Arg-Gly-Asp(RGD)肽或RGD肽模擬物。
配位體可為蛋白質，例如醣蛋白、脂蛋白，例如低密度脂蛋白(LDL)；或白蛋白，例如人類血清白蛋白(HSA)；或肽，例如對共配位體具有特異性親和力之分子；或抗體，例如與特定細胞類型(諸如，癌細胞、內皮細胞或骨骼細胞)結合之抗體。配位體亦可包括激素及激素受體。其亦可包括非肽物質，諸如輔因子、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-葡糖胺、多價甘露糖或多價海藻糖。
配位體可為(例如)藉由中斷細胞骨架((例如)藉由中斷細胞微管、微絲及/或中間長絲)增加iRNA藥劑至細胞中之攝取的物質(例如，藥物)。藥物可為(例如)分類素(taxon)、長春新鹼、長春鹼、細胞遲緩素、諾考達唑(nocodazole)、傑斯普拉克立德(japlakinolide)、紅海海綿素A、鬼筆環肽、斯氏肽A(swinholide A)、微管結合性茚酮(indanocine)、麥歐色文(myoservin)、四環黴素。
在一態樣中，配位體為脂質或基於脂質之分子。該脂質或基於脂質之分子較佳與血清蛋白質，例如人類血清白蛋白(HSA)結合。HSA結合配位體允許將結合物分布於標靶組織，例如肝組織，包括肝臟之實質性細胞。可結合HSA之其他分子亦可用作配位體。舉例而言，可使用萘普生或阿司匹林。脂質或基於脂質之配位體可(a)增加對結合物降解之抗性，(b)增加向標靶細胞或細胞膜之靶向或傳遞，及/或(c)可用於調節與血清蛋白質(例如，HSA)之結合。
基於脂質之配位體可用於調節(例如，控制)結合物與標靶組織之結合。舉例而言，與HSA更強力結合之脂質或基於脂質之配位體將較不太可能靶向輸送至腎臟且因此較不太可能自身體清除。
在較佳實施例中，基於脂質之配位體與HSA結合。較佳地，其以足夠親和力與HSA結合使得結合物較佳將分布於非腎臟組織。然而，親和力較佳不強至使HSA-配位體結合不可逆。
在另一態樣中，配位體為標靶細胞(例如，增殖細胞)攝取之部分(例如，維生素或營養)。此等尤其適用於治療特徵為非所要細胞增殖(例如，惡性或非惡性類型，例如癌細胞)之病症。例示性維生素包括維生素A、E及K。其他例示性維生素包括維生素B，例如葉酸、B12、核黃素、生物素、吡哆醛或由癌細胞攝取之其他維生素或營養。
在另一態樣中，配位體為細胞滲透藥劑，較佳為螺旋狀細胞滲透藥劑。較佳地，藥劑為兩性的。例示性藥劑為肽，諸如tat或觸角足。若藥劑為肽，則其可經修飾，包括擬肽、反演體、非肽或假肽鍵聯，及使用D-胺基酸。螺旋狀藥劑較佳為α-螺旋狀藥劑，其較佳具有親脂及疏脂相。細胞滲透劑可與iRNA藥劑共價鍵聯或為iRNA-肽複合物之部分。
5'-磷酸酯修飾
在較佳實施例中，iRNA藥劑經5'磷酸化或在5'引子末端包括磷醯基類似物。反義股之5'-磷酸酯修飾包括彼等與RISC-介導之基因沉默相容者。合適修飾包括：5'-單磷酸酯((HO)2(O)P-O-5')；5'-二磷酸酯((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'-三磷酸酯((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'-鳥苷帽(7-甲基化或未甲基化)(7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'-腺苷帽(Appp)及任何經修飾或未經修飾之核苷酸帽結構(N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'-單硫代磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO)2(S)P-O-5')；5'-單二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-O-5')，5'-硫代磷酸酯((HO)2(O)P-S-5')；氧/硫置換之單磷酸酯、二磷酸酯及三磷酸酯(例如，5'-α-硫代三磷酸酯、5'-γ-硫代三磷酸酯等)、5'-胺基磷酸酯((HO)2(O)P-NH-5'、(HO)(NH2)(O)P-O-5')、5'-烷基膦酸酯(R=烷基=甲基、乙基、異丙基、丙基等，例如RP(OH)(O)-O-5'-、(OH)2(O)P-5'- CH2-)、5'-烷基醚膦酸酯(R=烷基醚=甲氧基甲基(MeOCH2-)、乙氧基甲基等，例如RP(OH)(O)-O-5'-)之任何其他組合。
有意義股可經修飾以使有意義股鈍化且防止形成活性RISC，藉此潛在地降低脫靶作用。此可藉由防止有意義股5'-磷酸化之修飾(例如藉由以5'-O-甲基核糖核苷酸修飾)實現(參見Nykänen等人，(2001)ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway.Cell 107,309-321.)。亦可使用防止磷酸化之其他修飾，例如藉由H而非O-Me簡單取代5'-OH。或者，可向5'-磷酸酯中添加較大龐大基團將其轉化為磷酸二酯鍵聯。
非天然核鹼基
硝基吡咯基及硝基吲哚基為非天然核鹼基，其為已知為通用鹼基之化合物類之成員。通用鹼基為可置換四種天然存在鹼基中之任一者而不實質上影響寡核苷酸雙鏈體之熔融行為或活性的彼等化合物。與天然存在之核鹼基有關之穩定化氫鍵結相互作用形成對比，假設含有3-硝基吡咯基核鹼基之寡核苷酸雙鏈體僅藉由堆疊相互作用穩定化。不存在與硝基吡咯基核鹼基的顯著氫鍵結相互作用排除特異互補鹼基之特異性。此外，多種報導確認4-、5-及6-硝基吲哚基對四種天然鹼基呈現極小特異性。有趣的是，含有5-硝基吲哚基之寡核苷酸雙鏈體比含有4-硝基吲哚基及6-硝基吲哚基之相應寡核苷酸更穩定。製備1-(2'-O-甲基-β-D-呋喃核糖基)-5-硝基吲哚之程序描述於Gaubert,G.；Wengel,J.Tetrahedron Letters 2004 ,45 ,5629中。適合於本發明之其他通用鹼基包括次黃嘌呤基、異肌苷基、2-氮雜-肌苷基、7-脫氮-肌苷基、硝基咪唑基、硝基吡唑基、硝基苯并咪唑基、硝基吲唑基、胺基吲哚基、吡咯并嘧啶基及其結構衍生物。上文所述之硝基吡咯基、硝基吲哚基及其他通用鹼基的更詳細論述(包括合成程序)參見Vallone等人，Nucleic Acids Research,27(17)：3589-3596(1999)； Loakes等人，J.Mol.Bio.,270：426-436(1997)；Loakes等人，Nucleic Acids Research,22(20)：4039-4043(1994)；Oliver等人，Organic Letters，第3卷(13)：1977-1980(2001)；Amosova等人，Nucleic Acids Research,25(10)：1930-1934(1997)；Loakes等人，Nucleic Acids Research,29(12)：2437-2447(2001)；Bergstrom等人，J.Am.Chem.Soc.,117：1201-1209(1995)；Franchetti等人，Biorg.Med.Chem.Lett.11：67-69(2001)；及Nair等人，Nucelosides,Nucleotides & Nucleic Acids,20(4-7)：735-738(2001)。
二氟甲苯基為用作通用鹼基之非天然核鹼基。二氟甲苯基為天然核鹼基胸腺嘧啶之等配物。但與胸腺嘧啶不同，二氟甲苯基對任何天然鹼基不展示顯著選擇性。用作通用鹼基且適合於本發明之其他芳族化合物為4-氟-6-甲基苯并咪唑及4-甲基苯并咪唑。此外，相對疏水性異喹喏酮基衍生物3-甲基異喹喏酮基、5-甲基異喹喏酮基及3-甲基-7-丙炔基異喹喏酮基為相較於僅含有天然鹼基之寡核苷酸序列僅引起寡核苷酸雙鏈體略微不穩定之通用鹼基。本發明涵蓋之其他非天然核鹼基包括7-氮雜吲哚基、6-甲基-7-氮雜吲哚基、咪唑并吡啶基、9-甲基-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、異喹喏酮基、7-丙炔基異喹喏酮基、丙炔基-7-氮雜吲哚基、2,4,5-三甲基苯基、4-甲基吲哚基、4,6-二甲基吲哚基、苯基、萘基、蒽基、苯蒽基、芘基、芪基、并四苯基、稠五苯基及其結構衍生物。上文提及之二氟甲苯基、4-氟-6-甲基苯并咪唑、4-甲基苯并咪唑及其他非天然鹼基之更詳細論述(包括合成程序)參見Schweitzer等人，J.Org.Chem.,59：7238-7242(1994)；Berger等人，Nucleic Acids Research,28(15)：2911-2914(2000)；Moran等人，J.Am.Chem.Soc.,119：2056-2057(1997)；Morales等人，J.Am.Chem.Soc.,121：2323-2324(1999)；Guckian等人，J.Am.Chem.Soc.,118：8182-8183(1996)；Morales等人，J.Am.Chem.Soc.,122(6)：1001- 1007(2000)；McMinn等人，J.Am.Chem.Soc.,121：11585-11586(1999)；Guckian等人，J.Org.Chem.,63：9652-9656(1998)；Moran等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,94：10506-10511(1997)；Das等人，J.Chem.Soc.,Perkin Trans.,1：197-206(2002)；Shibata等人，J.Chem.Soc.,Perkin Trans.,1：1605-1611(2001)；Wu等人，J.Am.Chem.Soc.,122(32)：7621-7632(2000)；O'Neill等人，J.Org.Chem.,67：5869-5875(2002)；Chaudhuri等人，J.Am.Chem.Soc.,117：10434-10442(1995)；及美國專利第6,218,108號。
iRNA藥劑至細胞中之傳遞
不期望受任何理論束縛，膽固醇結合之iRNA藥劑及脂蛋白之某些組份(例如，膽固醇、膽固醇酯、磷脂)之間的化學類似性可導致iRNA藥劑與脂蛋白(例如，LDL、HDL)在血液中締合及/或iRNA藥劑與對膽固醇具有親和力之細胞組份(例如，膽固醇傳遞路徑之組份)的相互作用。脂蛋白以及其組份藉由各種主動及被動傳遞機制由細胞攝取及處理，例如(但不限於)LDL-受體結合之LDL的內飲作用、氧化或另外經修飾LDL藉由與淨化劑受體A相互作用之內飲作用、肝臟中淨化劑受體B1-介導之HDL膽固醇攝取、胞飲作用或膽固醇藉由ABC(ATP-結合序列匣)傳遞蛋白(例如，ABC-A1、ABC-G1或ABC-G4)經膜之傳遞。因此，膽固醇結合之iRNA藥劑可享受具有該等傳遞機制之細胞(例如肝細胞)的促進之攝取。因此，本發明提供藉由使該組份之天然配位體(例如，膽固醇)與iRNA藥劑結合或藉由使組份之天然配位體(例如，LDL、HDL)締合或結合的化學部分(例如，膽固醇)與iRNA藥劑結合，從而使iRNA藥劑靶向輸送至表現某些細胞表面組份(例如，受體)之細胞的明顯及一般方法。
其他實施例
iRNA藥劑可在細胞內由(例如)輸送至細胞中之外源性DNA模板 活體內產生。舉例而言，可將DNA模板插入至載體中且用作基因治療載體。可藉由(例如)靜脈內注射、局部投與(美國專利第5,328,470號)或藉由立體定向注射(參見例如，Chen等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3054-3057,1994)將基因治療載體輸送至個體。基因治療載體之醫藥製劑可包括可接受稀釋劑中之基因治療載體，或可包含埋藏有基因輸送媒劑之緩慢釋放基質。DNA模板可(例如)包括兩個轉錄單元，一個產生包括iRNA藥劑之頂股的轉錄物且一個產生iRNA藥劑之底股的轉錄物。當模板經轉錄時，產生iRNA藥劑且將其處理為介導基因沉默之siRNA藥劑片段。
調配物
本發明亦包括包括本發明之dsRNA化合物的醫藥組合物及調配物。視需要局部或全身性治療及待治療之區域而定，本發明之醫藥組合物可以多種方式投與。投與可為局部、肺部(例如藉由吸入或吹入散劑或氣溶膠，包括藉由噴霧器)；氣管內、鼻內、表皮及經皮、經口或非經腸投與。非經腸投藥包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌內注射或輸注；或顱內，例如鞘內或心室內投與。
用於局部投藥之醫藥組合物及調配物可包括經皮貼片、軟膏、洗液、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體及散劑。習知醫藥載劑、水溶液、散劑或油性基質、稠化劑及其類似物可為必需或合意的。包衣安全套、手套及其類似物亦可適用。較佳局部調配物包括本發明之dsRNA與諸如脂質、脂質體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑及界面活性劑之局部傳遞藥劑混雜之彼等。較佳脂質及脂質體包括中性(例如，二油醯基磷脂醯基乙醇胺=DOPE、二肉豆蔻醯基磷脂醯基膽鹼=DMPC、二硬脂醯基磷脂醯基膽鹼)、陰性(例如，二肉豆蔻醯基磷脂醯基甘油=DMPG)及陽離子性(例如，二油醯基四甲基胺基丙基=DOTAP及二油醯基磷脂醯基乙醇胺=DOTMA)，例如(+/-)-N-(3-胺 基丙基)-N,N-二甲基-2,3-雙(十二烷氧基)-1-丙銨溴化物=GAP-DLRIE)。本發明之DsRNA可囊封於脂質體內或可與其(尤其與陽離子脂質體)形成複合物。或者，dsRNA可與脂質，尤其與陽離子脂質複合。較佳脂肪酸及酯包括(但不限於)花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油單油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼或C1-10 烷基酯(例如，十四烷酸異丙酯IPM)、單甘油酯、二甘油酯或其醫藥學上可接受之鹽。局部調配物詳細描述於1999年5月20日申請之美國專利申請案第09/315,298號，其係以引用的方式全部併入本文中。
用於經口投與之組合物及調配物包括散劑或顆粒劑、微粒、奈米粒子、水或非水性介質中之懸浮液或溶液、膠囊、凝膠膠囊、藥囊、錠劑或微錠劑。可能需要增稠劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑。較佳經口調配物為本發明之dsRNA與一或多種穿透增強劑、界面活性劑及螯合劑結合投與之彼等。較佳界面活性劑包括脂肪酸及/或其酯或鹽、膽汁酸及/或其鹽。較佳膽汁酸/鹽包括鵝脫氧膽酸(CDCA)及熊脫氧鵝脫氧膽酸(UDCA)、膽酸、脫氫膽酸、脫氧膽酸、葡糖膽酸(glucholic acid)、甘胺膽酸、甘胺脫氧膽酸、牛磺膽酸、牛磺脫氧膽酸、牛磺-24,25-二氫-夫西地酸鈉及甘油二氫夫西地酸鈉。較佳脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油單油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼或單甘油酯、二甘油酯或其醫藥學上可接受之鹽(例如，鈉)。亦較佳為穿透增強劑之組合，例如與膽汁酸/鹽組合之脂肪酸/鹽。特定較佳組合為月桂酸、癸酸及UDCA之鈉鹽。其他穿透增強劑包括聚氧伸乙基-9-月桂基醚、 聚氧伸乙基-20-鯨蠟基醚。本發明之DsRNA可以包括噴塗乾燥粒子之顆粒形式經口輸送，或經複合形成微粒子或奈米粒子。DsRNA複合劑包括聚胺基酸；聚亞胺；聚丙烯酸酯；聚烷基丙烯酸酯、聚氧乙烷(polyoxethane)、聚氰基丙烯酸烷酯；陽離子化明膠、白蛋白、澱粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)及澱粉；聚氰基丙烯酸烷酯；DEAE-衍生之聚亞胺、短梗黴多糖、纖維素及澱粉。尤其較佳之複合劑包括聚葡萄胺糖、N-三甲基聚葡萄胺糖、聚-L-離胺酸、聚組胺酸、聚鳥胺酸、聚精胺、魚精蛋白、聚乙烯基吡啶、聚硫代二乙基胺基甲基伸乙基P(TDAE)、聚胺基苯乙烯(例如，對胺基)、聚(氰基丙烯酸甲酯)、聚(氰基丙烯酸乙酯)、聚(氰基丙烯酸丁酯)、聚(氰基丙烯酸異丁酯)、聚(氰基丙烯酸異己酯)、DEAE-甲基丙烯酸酯、DEAE-己基丙烯酸酯、DEAE-丙烯醯胺、DEAE-白蛋白及DEAE-葡聚糖、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸己酯、聚(D,L-乳酸)、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、海藻酸鹽及聚乙二醇(PEG)。dsRNA及其製劑之經口調配物詳細描述於美國申請案第08/886,829號(1997年7月1日申請)、第09/108,673號(1998年7月1日申請)、第09/256,515號(1999年2月23日申請)、第09/082,624號(1998年5月21日申請)及第09/315,298號(1999年5月20日申請)，其係藉由引用之方式全部併入本文中。
用於非經腸、鞘內或心室內投與之組合物及調配物可包括無菌水溶液，其亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他合適添加劑，諸如(但不限於)穿透增強劑、載劑化合物及其他醫藥上可接受之載劑或賦形劑。
本發明之醫藥組合物包括(但不限於)溶液、乳液及含有脂質體之調配物。此等組合物可自包括(但不限於)預製液體、自身乳化固體及自身乳化半固體之多種組份產生。
可便利地以單位劑型存在之本發明醫藥調配物可根據醫藥工業 中熟知之習知技術製備。該等技術包括使活性成分與醫藥載劑或賦形劑締合之步驟。一般而言，該等調配物係藉由下述步驟製備：使活性成份均勻且精細地與液體載劑或經細分之固體載劑或兩者締合，且隨後(若需要)使該產物成型。
本發明之組合物可調配為許多可能劑型中之任一者，諸如(但不限於)錠劑、膠囊、凝膠膠囊、液體糖漿、軟凝膠、栓劑及灌腸劑。本發明之組合物亦可調配為水性介質、非水性介質或混合介質中之懸浮液。水性懸浮液可進一步含有增加懸浮液黏度之物質，包括(例如)羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇及/或葡聚糖。該懸浮液亦可含有穩定劑。
在本發明之一實施例中，醫藥組合物可經調配且用作發泡體。醫藥發泡體包括調配物，諸如(但不限於)乳液、微乳液、乳膏、凝膠劑及脂質體。儘管此等調配物之性質基本類似，但最終產品之組份及稠度不同。該等組合物及調配物之製備一般為彼等熟習醫藥及調配技術者已知且可應用於本發明之組合物的調配。
乳液
本發明組合物可製備且調配為乳液。乳液通常為一種液體分散於另一者中的非均質系統，其為直徑一般超過0.1μm之小液滴形式(Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(編),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第199頁；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(編),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第245頁；Block in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(編),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第2卷，第335頁；Higuchi等人，in Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985，第301頁)。乳液通常為包含彼此密 切混合且分散之兩個不可混溶液相的雙相系統。一般而言，乳液可為油中水(w/o)或水中油(o/w)種類。當水相經細分且作為精細液滴分散於主體油性相時，所得組合物稱為油中水(w/o)乳液。或者，當油性相經細分且作為精細液滴分散於主體水相時，所得組合物稱為水中油(o/w)乳液。除分散相外，乳液可含有其他組份，及可作為水相、油性相中之溶液或其本身作為獨立相存在之活性藥物。諸如乳化劑、穩定劑、染料及抗氧化劑之醫藥賦形劑亦可視需要存在於乳液中。醫藥乳液亦可為多元乳液，其(諸如)在油中水中油(o/w/o)及水中油中水(w/o/w)乳液狀況下包含兩個以上相。該等複合調配物通常提供簡單二元乳液不具有的某些優勢。o/w乳液之個別油滴封住小水滴的多元乳液組成w/o/w乳液。同樣，在油性連續相中穩定之封於水球中之油滴的系統提供o/w/o乳液。
乳液特徵為幾乎無或無熱力學穩定性。通常，乳液之分散或不連續相良好分散於外部或連續相中且藉助於乳化劑或調配物黏度保持此形式。如乳液型軟膏基質及乳膏之狀況下，乳液之任一相可為半固體或固體。使乳液穩定之其他方式需要使用可併入乳液之任一相中的乳化劑。乳化劑可廣泛分為四類：合成界面活性劑、天然存在之乳化劑、吸收基質及精細分散之固體(Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(編),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第199頁)。
已發現合成界面活性劑(亦稱為表面活性劑)可廣泛應用於乳液調配物中且已在文獻中加以評論(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(編),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第285頁；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(編),Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988，第1卷，第199頁)。界面活性劑通常為兩性的且包 含親水性部分及疏水性部分。界面活性劑之親水性與疏水性比例已稱為親水/親油平衡(HLB)且為調配物製備中將界面活性劑分類及選擇之重要工具。界面活性劑可基於親水性基團性質分為不同類別：非離子、陰離子、陽離子及兩性離子(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(編),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第285頁)。
乳液調配物中所用之天然存在之乳化劑包括羊毛脂、蜂蠟、磷脂、卵磷脂及阿拉伯膠。吸收基質具有親水性特性使得其可吸收水以形成w/o乳液而仍保持其半固體稠度，諸如無水羊毛脂及親水性凡士林。細分固體亦已尤其與界面活性劑組合及在黏性製劑中用作良好乳化劑。此等包括極性無機固體(諸如重金屬氫氧化物)、不膨脹黏土(諸如，膨潤土、凹凸棒土、鋰皂石、高嶺土、蒙脫石、膠體矽酸鋁及膠體矽酸鎂鋁、顏料及非極性固體，諸如碳或三硬脂酸甘油酯。
多種非乳化材料亦包括於乳液調配物中且造成乳液之特性。此等包括脂肪、油、蠟、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、保濕劑、親水性膠體、防腐劑及抗氧化劑(Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(編),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第335頁；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(編),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第199頁)。
親水性膠體或水膠體包括天然存在之膠狀物及合成聚合物，諸如多醣(例如，阿拉伯膠、瓊脂、褐藻酸、角叉菜膠、瓜爾膠、梧桐膠及黃耆膠)、纖維素衍生物(例如，羧甲基纖維素及羧丙基纖維素)及合成聚合物(例如，卡波姆(carbomer)、纖維素醚及羧基乙烯基聚合物)。此等在水中分散或膨脹形成藉由在分散相液滴周圍形成強界面膜且藉由增加外部相之黏度使乳液穩定的膠體溶液。
因為乳液通常含有可容易地支持微生物生長之多種成份，諸如碳水化合物、蛋白質、類固醇及磷脂，此等調配物通常併有防腐劑。乳液調配物中包括的通常所用之防腐劑包括對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、第四銨鹽、氯化苯甲烴銨、對羥基苯甲酸之酯及硼酸。通常亦向乳液調配物中添加抗氧化劑以防止調配物變質。所用之抗氧化劑可為自由基捕獲劑，諸如生育酚、沒食子酸烷基酯、丁基化羥基大茴香醚、丁基化羥基甲苯或還原劑，諸如抗壞血酸及焦亞硫酸鈉，及抗氧化性增效劑，諸如檸檬酸、酒石酸及卵磷脂。
文獻中已評論乳液調配物經由皮膚、經口及非經腸途徑之應用及其製造方法(Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(編),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第199頁)。已極廣泛使用經口輸送之乳液調配物，因為易於調配以及自吸收及生物可用性觀點之功效(Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(編),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第245頁；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(編),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第199頁)。礦物油基質輕瀉劑、油溶性維生素及高脂肪營養製劑係在已通常作為o/w乳液經口投與之材料中。
在本發明之一實施例中，dsRNA及核酸之組合物係作為微乳液調配。微乳液可定義為水、油及兩性分子之系統，其為單獨光學各向同性且熱力學穩定液體溶液(Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(編),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第245頁)。微乳液通常為首先將油分散於水性界面活性劑溶液中且接著添加足量之第四組份，一般中間物鏈長度醇以形成透明系統而製備的系統。因此，微乳液亦描述為兩種不可混溶液 體的熱力學穩定、各向同性清澈分散液，其藉由表面活性分子之界面膜為穩定的(Leung and Shah,in：Controlled Release of Drugs：Polymers and Aggregate Systems,Rosoff,M.，編，1989,VCH Publishers,New York，第185-215頁)。微乳液通常係經由使3至5種組份(包括油、水、界面活性劑、助界面活性劑及電解質)組合而製備。微乳液為油中水(w/o)或水中油(o/w)型係視所用之油及界面活性劑的特性而定且視界面活性劑分子之極性頭及烴尾的結構及幾何封裝而定(Schott,in Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985，第271頁)。
已廣泛研究利用相圖之現象學方法且熟習此項技術者已產生如何調配微乳液的全面知識(Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(編),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第245頁；Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(編),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第335頁)。相較於習知乳液，微乳液提供使水不可溶藥物在自發形成之熱力學穩定液滴之調配物中穩定化之優勢。
用於製備微乳液之界面活性劑包括(但不限於)離子界面活性劑、非離子界面活性劑、Brij 96、聚氧伸乙基油基醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油單月桂酸酯(ML310)、四甘油單油酸酯(MO310)、六甘油單油酸酯(PO310)、六甘油五油酸酯(PO500)、十甘油單癸酸酯(MCA750)、十甘油單油酸酯(MO750)、十甘油倍半油酸酯(SO750)、十甘油十油酸酯(DAO750)，其為單獨的或與助界面活性劑組合。助界面活性劑(一般為短鏈醇，諸如乙醇、1-丙醇及1-丁醇)用於藉由穿透入界面活性劑膜且隨後形成無序膜(因為在界面活性劑分子之間產生空隙)而增加界面流動性。然而，可不使用助界面活性劑來製備微乳液且無醇自身乳化微乳液系統為此項技術中已知。水相通常可為 (但不限於)水、藥物之水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇及乙二醇之衍生物。油相可包括(但不限於)諸如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯、中鏈(C8 -C12 )單、二及三甘油酯、脂肪酸聚氧乙烯甘油酯、脂肪醇、聚乙二醇化甘油酯、飽和聚乙二醇化C8 -C10 甘油酯、植物油及矽油之材料。
出於藥物溶解及增強藥物吸收之觀點，微乳液尤其受關注。已提議基於脂質之微乳液(o/w及w/o兩者)增強藥物(包括肽)之經口生物可用性(Constantinides等人，Pharmaceutical Research,1994,11,1385-1390；Ritschel,Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.,1993,13,205)。微乳液提供以下優勢：改良之藥物溶解、保護藥物免於酶水解、由於界面活性劑引發之膜流動性及滲透性之改變可能增強藥物吸收、易於製備、易於經固體劑型經口投與、改良之臨床功效及降低之毒性(Constantinides等人，Pharmaceutical Research,1994,11,1385；Ho等人，J.Pharm.Sci.,1996,85,138-143)。當微乳液之組份在環境溫度下聚在一起時微乳液通常可自發形成。當調配不耐熱藥物、肽或dsRNA時此可為尤其有利的。微乳液在化妝品及醫藥應用中亦有效於經皮輸送活性組份。預期本發明之微乳液組合物及調配物將促進dsRNA及核酸自胃腸道的增加之全身吸收，以及改良胃腸道、陰道、口腔及其他投藥區域內dsRNA及核酸之局部細胞攝取。
本發明之微乳液亦可含有其他組份及添加劑(諸如脫水山梨糖醇單硬脂酸酯(Grill 3)、Labrasol及穿透增強劑)以改良調配物特性及增強本發明dsRNA及核酸的吸收。本發明之微乳液中所用之滲透增強劑可分類為屬於5個廣泛類別中之一者，界面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑及非螯合非界面活性劑(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991，第92頁)。上文已論述此等類別中之每一者。
脂質體
除已研究且用於藥物調配之微乳液之外，存在許多組織化界面活性劑結構。此等包括單層、膠束、雙層及微脂粒。諸如脂質體之微脂粒已吸引極大關注，因為其特異性及其出於藥物輸送之觀點提供之持續作用。如本發明所用，術語"脂質體"意謂由排列於球形雙層中之兩性液體構成之微脂粒。
脂質體為單層或多層微脂粒，其具有由親脂性材料形成之膜及水性內部。水性部分含有待輸送之組合物。陽離子脂質體擁有能與細胞壁融合之優勢。儘管不能與細胞膜充分融合，非陽離子脂質體係由巨噬細胞活體內吸收。
為了橫穿完整哺乳動物皮膚，脂質微脂粒必須在合適經皮梯度影響下穿過一系列微孔，該等孔各自具有小於50nm之直徑。因此，需要使用高度可變形且能穿過該等微孔之脂質體。
脂質體之其他優勢包括：由天然磷脂獲得之脂質體為生物相容的且生物可降解的；脂質體中可併入廣範圍之水及脂質可溶性藥物；脂質體可保護其內部隔室中之囊封藥物免於代謝及降解(Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(編),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第245頁)。脂質體調配物之製備中的重要考慮為脂質表面電荷、微脂粒尺寸及脂質體之含水體積。
脂質體適用於將活性成份轉移且輸送至作用位點。因為脂質膜結構上類似於生物膜，所以當脂質體應用於組織時，脂質體開始與細胞膜合併且隨著脂質體與細胞合併之進行，脂質內容物進入活性藥劑可起作用之細胞。
脂質調配物為許多藥物輸送模式之廣泛研究的焦點。存在對於局部投藥而言，脂質體提供優於其他調配物之若干優勢的增長之證 據。該等優勢包括與所投與藥物之高全身性吸收有關的降低之副作用，所投與藥物在所要標靶處增加之積累及向皮膚投與多種藥物(親水性及疏水性兩者)之能力。
若干報導已詳述脂質體向皮膚中輸送藥劑(包括高分子量DNA)之能力。已向皮膚投與包括止痛劑、抗體、激素及高分子量DNA之化合物。多數應用導致靶向上部表皮。
脂質體分為兩個廣泛類別。陽離子脂質體為帶正電之脂質體，其與帶負電DNA分子相互作用形成穩定複合物。帶正電DNA/脂質體複合物與帶負電細胞表面結合且在內體中內化。由於內體中之酸性pH，因此脂質體破裂，將其內容物釋放入細胞質中(Wang等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.,1987,147,980-985)。
對pH值敏感或帶負電之脂質體誘捕DNA而非與其複合。因為DNA及脂質皆帶類似電荷，出現排斥而非形成複合物。然而，一些DNA誘捕於此等脂質體之水性內部中。已使用pH敏感性脂質體將編碼胸苷激酶基因之DNA輸送至培養物中之細胞單層。在標靶細胞中偵測外因性基因之表現(Zhou等人，Journal of Controlled Release,1992,19,269-274)。
脂質組合物之一種主要類型包括磷脂而非天然產生之磷脂醯膽鹼。中性脂質體組合物(例如)可由二豆蔻醯磷脂醯膽鹼(DMPC)或二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)形成。陰離子脂質體組合物一般由二肉豆蔻醯磷脂醯甘油形成，而陰離子融合脂質體主要由二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)形成。脂質組合物之另一類型係由磷脂醯膽鹼(PC)，諸如大豆PC及蛋PC形成。另一類型係由磷脂及/或磷脂醯膽鹼及/或膽固醇之混合物形成。
若干研究已評定脂質藥物調配物至皮膚的局部輸送。向豚鼠皮膚應用含有干擾素之脂質體導致皮膚疱疹腫痛降低，而經由其他方式 (例如，作為溶液或作為乳液)輸送干擾素為無效的(Weiner等人，Journal of Drug Targeting,1992,2,405-410)。此外，額外研究測試作為脂質調配物之部分投與的干擾素相對於使用水性系統投與干擾素之功效，且推斷脂質調配物優於水性投與(du Plessis等人，Antiviral Research,1992,18,259-265)。
亦已檢驗非離子脂質體系統以測定其向皮膚輸送藥物之效用，尤其包含非離子界面活性劑及膽固醇之系統。包含Novasome.TM.I(二月桂酸甘油酯/膽固醇/聚氧伸乙基-10-十八烷醯醚)及Novasome.TM.II(二硬脂酸甘油酯/膽固醇/聚氧伸乙基-10-十八烷醯醚)之非離子脂質體調配物係用於將環孢素-A輸送至小鼠皮膚之真皮。結果表明該等非離子脂質體系統有效於促進環孢素-A至不同皮膚層之沈積(Hu等人。S.T.P.Pharma.Sci.,1994,4,6,466)。
脂質體亦包括"空間上穩定"脂質體，其為本文所用之術語，係指包括一或多種專用脂質之脂質體，該等脂質在併入脂質體中時導致相對於缺乏該等專用脂質之脂質體的增加之循環壽命。空間上穩定之脂質體之實例為脂質體之形成微脂粒之脂質部分的部分(A)包含一或多種糖脂，諸如單唾液酸神經節苷脂Gm 1，或(B)經一或多個親水性聚合物(諸如，聚乙二醇(PEG)部分)衍生之彼等。儘管不期望受任何特定理論限制，在此項技術中認為至少對於含有神經節苷脂、神經鞘磷脂或PEG衍生之脂質的空間上穩定之脂質體而言，此等空間上穩定之脂質體之增強之循環半衰期由網狀內皮系統(RES)之細胞中的攝取降低而產生(Allen等人，FEBS Letters,1987,223,42；Wu等人，Cancer Research,1993,53,3765)。
此項技術中已知多種包含一或多種糖脂之脂質體。Papahadjopoulos等人(Ann.N.Y.Acad.Sci.,1987,507,64)報導單唾液酸神經節苷脂Gm 1、半乳糖腦苷脂硫酸鹽及磷脂醯肌醇改良脂質體之 血液半衰期的能力。此等發現由Gabizon等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1988,85,6949)詳細說明。Allen等人之美國專利第4,837,028號及WO 88/04924揭示脂質體包含(1)神經鞘磷脂及(2)神經節苷脂Gm 1或半乳糖腦苷脂硫酸酯。美國專利第5,543,152號(Webb等人)揭示包含神經鞘磷脂之脂質體。包含1,2-sn-二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼之脂質體揭示於WO 97/13499(Lim等人)中。
此項技術中已知許多包含一或多種親水性聚合物衍化之脂質的脂質體及其製備方法。Sunamoto等人(Bull.Chem.Soc.Jpn.,1980,53,2778)描述包含非離子清潔劑2C1215G (含有PEG部分)之脂質體。Illum等人(FEBS Lett.,1984,167,79)提出具有聚二醇之聚苯乙烯粒子的親水性塗層導致顯著增強之血液半衰期。藉由連接聚烷基二醇(例如PEG)之羧基修飾之合成磷脂由Sears(美國專利第4,426,330號及第4,534,899號)描述。Klibanov等人(FEBS Lett.,1990,268,235)描述證明包含PEG或PEG硬脂酸酯衍化之磷脂醯乙醇胺(PE)的脂質體具有顯著增加之血液循環半衰期的實驗。Blume等人(Biochimica et Biophysica Acta,1990,1029,91)將該等觀察擴展至由二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(DSPE)及PEG組合所形成之其他PEG衍化之磷脂(例如DSPE-PEG)。外部表面具有共價結合之PEG部分的脂質體描述於Fisher之歐洲專利第EP 0 445 131 B1號及第WO 90/04384號中。含有1-20莫耳% PEG衍化之PE的脂質體組合物及其使用方法由Woodle等人(美國專利第5,013,556號及第5,356,633號)及Martin等人(美國專利第5,213,804號及歐洲專利第EP 0 496 813 B1號)描述。包含許多其他脂質聚合物結合物之脂質體描述於WO 91/05545及美國專利第5,225,212號(Martin等人)及WO 94/20073(Zalipsky等人)中。包含PEG-修飾之神經醯胺脂質之脂質體描述於WO 96/10391(Choi等人)中。美國專利第5,540,935號(Miyazaki等人)及美國專利第5,556,948號(Tagawa等人)描述含有PEG之脂質體， 其表面可以官能部分進一步衍化。
有限數目之包含核酸的脂質體為此項技術中已知。Thierry等人之WO 96/40062揭示將高分子量核酸囊封於脂質體中的方法。Tagawa等人之美國專利第5,264,221號揭示蛋白質結合之脂質體且確定該等脂質體之內容物可包括dsRNA。Rahman等人之美國專利第5,665,710號描述某些將寡脫氧核苷酸囊封於脂質體之方法。Love等人之WO 97/04787揭示包含靶向raf基因之dsRNA的脂質體。
轉移體為另一類型之脂質體，且為高度可變形脂質聚集體，其為藥物輸送媒劑之誘人候選物。轉移體可描述為脂質小液滴，其高度可變形使得能容易地穿透比液滴小之孔。轉移體可適用於其所使用之環境，例如其自身最優化(適應皮膚中孔之形狀)、自身修復、通常到達其標靶而不分段且通常自身加載。為製造轉移體，可向標準脂質體組合物中添加表面邊緣活化劑(一般為界面活性劑)。轉移體已用於向皮膚輸送血清白蛋白。已展示轉移體介導之血清白蛋白輸送與皮下注射含有血清白蛋白之溶液一樣有效。
發現界面活性劑在調配物(諸如乳液，包括微乳液)及脂質體中之廣泛應用。將許多不同類型界面活性劑(天然及合成)之特性分類及分等級之最常見方式為藉由使用親水/親油平衡(HLB)。親水性基團(亦稱為"頭")之性質提供使調配中所用之不同界面活性劑分類之最適用方式(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988，第285頁)。
若界面活性劑分子未經離子化，則將其分類為非離子界面活性劑。發現非離子界面活性劑在醫藥及化妝品產品中之廣泛應用且可用於廣泛範圍之pH值。一般而言，其HLB值視其結構而定範圍為2至約18。非離子界面活性劑包括非離子酯，諸如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脫水山梨糖醇酯、蔗糖酯及乙氧基化酯。此類別中 亦包括非離子烷醇醯胺及醚，諸如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇及乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物。聚氧伸乙基界面活性劑為非離子界面活性劑類之最普遍成員。
若界面活性劑分子在溶解或分散於水中時攜帶負電荷，則該界面活性劑分類為陰離子。陰離子界面活性劑包括羧酸酯(諸如肥皂)、乳酸醯基酯、胺基酸之醯基醯胺、硫酸之酯(諸如硫酸烷基酯及硫酸乙氧基化烷基酯)、磺酸酯(諸如烷基苯磺酸酯、羥乙基磺酸醯基酯)、牛磺酸醯基酯及磺基琥珀酸酯及磷酸酯。陰離子界面活性劑類別之最重要成員為磺酸烷基酯及肥皂。
若界面活性劑分子在溶解或分散於水中時攜帶正電荷，則該界面活性劑分類為陽離子。陽離子界面活性劑包括第四銨鹽及乙氧基化胺。第四銨鹽為此類別之最常用成員。
若界面活性劑分子具有攜帶正電荷或負電荷之能力，則界面活性劑分類為兩性的。兩性界面活性劑包括丙烯酸衍生物、經取代之烷基醯銨、N-烷基甜菜鹼及磷脂。
已評論界面活性劑於藥物、調配物及乳液中之用途(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988，第285頁)。
穿透增強劑
在一實施例中，本發明採用各種穿透增強劑實現核酸，尤其dsRNA至動物皮膚之有效輸送。多數藥物以離子化及非離子化形式存在於溶液中。然而，一般僅脂質可溶或親脂藥物可容易地穿過細胞膜。已發現若待穿過之細胞膜經穿透增強劑處理，則即使非親脂藥物亦可穿過細胞膜。除了幫助非親脂藥物穿過細胞膜擴散之外，滲透增強劑亦增強親脂藥物滲透性。
滲透增強劑可分類為屬於5個廣泛類別中之一者，亦即界面活性 劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑及非螯合非界面活性劑(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991，第92頁)。上述穿透增強劑類別中之任一者在下文中更詳細描述。
界面活性劑：與本發明有關，界面活性劑(或"表面活性劑")為化學實體，其當溶解於水溶液中時降低溶液之表面張力或水溶液與另一液體之間的界面張力，結果為增強經黏膜之dsRNA吸收。除了膽汁鹽及脂肪酸之外，此等滲透增強劑包括(例如)月桂基硫酸鈉、聚氧伸乙基-9-月桂基醚及聚氧伸乙基-20-鯨蠟基醚)(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991，第92頁)；及全氟化學乳液，諸如FC-43(Takahashi等人，J.Pharm.Pharmacol.,1988,40,252)。
脂肪酸：用作穿透增強劑之多種脂肪酸及其衍生物包括(例如)油酸、月桂酸、癸酸(正-癸酸)、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油單油酸酯(1-單油基-rac-甘油)、甘油二月桂酸酯、辛酸、花生四烯酸、甘油1-單癸酸酯、1-十二烷基氮雜環庚烷-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼、其C1 -C10 烷基酯(例如甲基、異丙基及第三丁基)及其單甘油酯及二甘油酯(亦即，油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、十四酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯、亞麻油酸酯等)。(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carryier Systems,1991，第92頁；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；El Hariri等人，J.Pharm.Pharmacol.,1992,44,651-654)。
膽汁鹽：膽汁之生理學角色包括促進脂質及脂溶性維生素之分散及吸收(Brunton,Chapter 38 in：Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics，第9版，Hardman等人。編，McGraw-Hill,New York,1996，第934-935頁)。各種天然膽汁鹽及其 合成衍生物用作穿透增強劑。因此，術語"膽汁鹽"包括膽汁之天然存在之組份中之任一者以及其合成衍生物中之任一者。本發明之膽汁鹽包括(例如)膽酸(或其醫藥學上可接受之鈉鹽、膽酸鈉)、脫氫膽酸(脫氫膽酸鈉)、脫氧膽酸(脫氧膽酸鈉)、葡糖膽酸(glucholic acid)(葡糖膽酸鈉)、甘胺膽酸(甘胺膽酸鈉)、甘胺脫氧膽酸(甘胺脫氧膽酸鈉)、牛磺膽酸(牛磺膽酸鈉)、牛磺脫氧膽酸(牛磺脫氧膽酸鈉)、鵝脫氧膽酸(鵝脫氧膽酸鈉)、熊脫氧膽酸(UDCA)、牛磺-24,25-二氫-夫西地酸鈉(STDHF)、甘油二氫夫西地酸鈉及聚氧伸乙基-9-月桂基醚(POE)(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991，第92頁；Swinyard,Chapter 39 In：Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Gennaro，編，Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990，第782-783頁；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；Yamamoto等人，J.Pharm.Exp.Ther.,1992,263,25；Yamashita等人，J.Pharm.Sci.,1990,79,579-583)。
螯合劑：與本發明結合使用之螯合劑可定義為藉由與金屬離子形成錯合物而將其自溶液移除之化合物，結果為dsRNA經黏膜之吸收增強。關於其在本發明中作為穿透增強劑之用途，螯合劑具有亦用作DNase抑制劑之額外優勢，因為多數特徵之DNA核酸酶需要用於催化之二價金屬離子且因此由螯合劑抑制(Jarrett,J.Chromatogr.,1993,618,315-339)。本發明之螯合劑包括(但不限於)乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、檸檬酸、水楊酸酯(例如，水楊酸鈉、5-甲氧基水楊酸酯及均香蘭酸)、膠原蛋白之N-醯基衍生物、月桂醇醚-9及β-二酮之N-胺基醯基衍生物(烯胺)(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991，第92頁；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；Buur等人，J.Control Rel.,1990,14,43-51)。
非螯合非界面活性劑：如本文所用，非螯合非界面活性劑穿透增強化合物可定義為表明作為螯合劑或作為界面活性劑之無價值活性但增強dsRNA經營養黏膜之吸收的化合物(Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33)。此類穿透增強劑包括(例如)不飽和環狀脲、1-烷基-及1-烯基氮雜環烷酮衍生物(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991，第92頁)；及非類固醇消炎劑，諸如雙氯芬酸鈉、吲哚美辛及苯基丁氮酮(Yamashita等人，J.Pharm.Pharmacol.,1987,39,621-626)。
亦可向本發明之醫藥及其他組合物中添加增強細胞水準之dsRNA攝取的藥劑。舉例而言，已知陽離子脂質，諸如脂質體(Junichi等人，美國專利第5,705,188號)、陽離子甘油衍生物及聚陽離子分子，諸如聚離胺酸(Lollo等人，PCT申請案WO 97/30731)及其他肽亦增強dsRNA之細胞攝取。
可利用其他藥劑增強所投與核酸之穿透，包括二醇類(諸如乙二醇及丙二醇)，吡咯類(諸如2-吡咯)，氮酮，及諸如萜類(諸如檸檬烯及薄荷酮)。
載劑
本發明之某些組合物亦在調配物中併入載劑化合物。如本文所用，"載劑化合物"或"載劑"係指核酸或其類似物，其為惰性的(亦即，本身不具有生物活性)但藉由(例如)使生物學活性核酸降解或促進其自循環移除而降低具有生物活性之核酸的生物可用性之活體內方法鑑別為核酸。將核酸與載劑化合物共投與(通常後一種物質過量)可導致肝臟、腎臟或其他循環外儲集器中回收之核酸量實質降低，此大概係由於載劑化合物與核酸之間對共同受體之競爭。舉例而言，當與聚肌苷酸、硫酸葡聚糖、聚胞苷酸或4-乙醯胺基-4'異硫氰基-芪-2,2'-二磺酸共投與時，部分硫代磷酸酯dsRNA在肝組織中之回收可降低(Miyao等 人，Antisense Res.Dev.,1995,5,115-121；Takakura等人，Antisense & Nucl.Acid Drug Dev.,1996,6,177-183。
賦形劑
與載劑化合物形成對比，"醫藥載劑"或"賦形劑"為醫藥學上可接受之溶劑、懸浮劑或用於向動物輸送一或多種核酸之任何其他藥理學惰性媒劑。賦形劑可為液體或固體且設定計劃投與方式的情況下經選擇以在與核酸及給定醫藥組合物之其他組份組合時提供所要體積、黏度等。典型醫藥載劑包括(但不限於)結合劑(例如，預糊化玉米澱粉、聚乙烯吡咯啶酮或羥基丙基甲基纖維素等)；填充劑(例如，乳糖及其他糖、微晶纖維素、果膠、明膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙烯酸酯或磷酸氫鈣等)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石、矽石、膠體二氧化矽、硬脂酸、硬脂酸金屬鹽、氫化植物油、玉米澱粉、聚乙二醇、苯甲酸鈉、乙酸鈉等)；崩解劑(例如，澱粉、羥基乙酸澱粉鈉等)；及濕潤劑(例如月桂基硫酸鈉等)。
適於經腸投與之不與核酸有害反應之醫藥學上可接受之有機或無機賦形劑亦可用於調配本發明之組合物。合適醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、葡哌喃聚醣、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏性石蠟、羥基甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮及其類似物。
用於局部投與核酸之調配物可包括無菌及非無菌水溶液、常見溶劑(諸如乙醇)中之非水溶液或核酸於液體或固體油基質中之溶液。溶液亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他合適添加劑。可適於經腸投與之醫藥學上可接受之有機或無機賦形劑，其不與核酸有害反應。
合適醫藥學上可接受之賦形劑包括(但不限於)水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、葡哌喃聚醣、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏性石蠟、羥基甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮及其類似物。
用於向呼吸道輸送之醫藥組合物
本發明之另一態樣提供iRNA藥劑向呼吸道之輸送，尤其對囊腫性纖維化之治療。呼吸道包括上呼吸道(包括口咽及喉)，隨後下呼吸道，其包括氣管，隨後分為支氣管及細支氣管。上及下呼吸道稱為傳導呼吸道。末端細支氣管接著分為呼吸細支氣管，其接著導向最終呼吸區、肺泡或深肺。導氣氣管之上皮細胞為用於輸送iRNA藥劑(諸如α-ENaC iRNA藥劑)之吸入治療性氣溶膠之主要標靶。
肺輸送組合物可藉由患者吸入分散液而輸送，使得分散液內之組合物(較佳iRNA藥劑)可到達肺部，其中該組合物可(例如)直接經肺泡區容易地吸收至血液循環中。肺輸送對全身性輸送及局部輸送以治療肺部疾病可為有效的。
可藉由不同方法實現肺部輸送，包括使用基於噴霧、氣霧、膠束及乾粉之調配物；藉由吸入之投與可為經口及/或經鼻。傳送可經液體噴霧器、基於氣溶膠之吸入器及乾粉分散裝置實現。計量給藥裝置為較佳的。使用霧化器或吸入器之一種益處為污染之可能性因裝置為自身容納而經最小化。乾粉分散裝置(例如)輸送可容易地調配為乾粉之藥物。iRNA組合物可獨自或與合適粉末載劑組合作為凍乾或噴霧乾燥粉末穩定儲存。吸入組合物之輸送可藉由給藥計時元件介導，其可包括計時器、劑量計量器、時間量測器或時間指示器，其當併入裝置中時在投與氣溶膠藥物期間使得可進行劑量跟蹤、順應性監測及/或向患者給藥激發。
用於氣溶膠輸送之醫藥裝置之實例包括定量劑量吸入器(MDI)、乾粉吸入器(DPI)及空氣噴射噴霧器。可容易地適用於輸送個體iRNA藥劑之例示性吸入輸送系統描述於(例如)美國專利第5,756,353號；第5,858,784號；及PCT申請案WO 98/31346；WO 98/10796；WO 00/27359；WO 01/54664；WO 02/060412。可用於輸送iRNA藥劑之其 他氣溶膠調配物描述於美國專利第6,294,153號；第6,344,194號；第6,071,497號及PCT申請案WO 02/066078；WO 02/053190；WO 01/60420；WO 00/66206。此外，輸送iRNA藥劑之方法可適用於彼等用於藉由吸入輸送其他寡核苷酸(例如，反義寡核苷酸)者，諸如Templin等人，Antisense Nucleic Acid Drug Dev,2000,10：359-68；Sandrasagra等人，Expert Opin Biol Ther,2001,1：979-83；Sandrasagra等人，Antisense Nucleic Acid Drug Dev,2002,12：177-81中所述。
本發明藥劑之輸送亦可涉及投與所謂"前藥"，亦即治療物質之調配物或化學修飾物，其需要藉由個體生物體固有之系統進行某種形式之處理或傳遞以較佳在需要其作用之部位釋放治療物質；此後一實施例可用於與呼吸道輸送結合，但亦與本發明之其他實施例一起。舉例而言，人類肺部可經數分鐘至數小時的時間範圍移除或迅速水解降解可裂解之沈積氣溶膠。在上呼吸道中，纖毛上皮細胞造成粒子藉以自氣管向嘴部清掃之"黏膜纖毛活動梯"。Pavia,D.,"Lung Mucociliary Clearance,"in Aerosols and the Lung：Clinical and Experimental Aspects,Clarke,S.W.及Pavia,D.，編，Butterworths,London,1984。在深肺中，肺泡巨噬細胞能在粒子沈積後迅速將其吞噬。Warheit等人。Microscopy Res.Tech.,26：412-422(1993)；及Brain,J.D.,"Physiology and Pathophysiology of Pulmonary Macrophages,"in The Reticuloendothelial System,S.M.Reichard及J.Filkins，編，Plenum,New.York.，第315-327頁，1985。
在較佳實施例中，尤其需要iRNA藥劑之全身給藥的實施例中，將氣溶膠化iRNA藥劑調配為微粒子。直徑介於0.5與10μm之間的微粒可穿透肺部，穿過多數天然障壁。需要小於10μm之直徑以繞過咽喉；需要0.5μm或更大之直徑以避免呼出。
其他組份
本發明之組合物可另外含有醫藥組合物中習知存在的技術中確認之使用水準的其他佐劑組份。因此，例如，該等組合物可含有額外、相容性醫藥活性材料，諸如止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或消炎劑，或可含有可用於實體調配本發明組合物之各種劑型的額外材料，諸如染料、調味劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑及穩定劑。然而，該等材料在添加時不應不當地干擾本發明組合物之組份的生物活性。該等調配物可經滅菌，且(若需要)可與助劑混合，該等助劑例如為不與調配物之核酸發生有害相互作用之潤滑劑、防腐劑、穩定劑、濕潤劑、乳化劑、影響滲透壓之鹽、緩衝劑、著色劑、調味劑及/或芳族物質及其類似物。
水性懸浮液可含有增加懸浮液黏度之物質，其包括(例如)羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇及/或葡聚糖。該懸浮液亦可含有穩定劑。
本發明之某些實施例提供含有(a)一或多種dsRNA藥劑及(b)一或多種藉由非RNA干擾機制起作用的其他治療劑之醫藥組合及組合物。
因此，本發明包括本發明之iRNA與消炎劑、支氣管擴張劑、抗組胺劑、抗咳嗽劑、抗生素或DNase藥物物質之組合，該上皮鈉通道阻斷劑及該藥物物質係在相同或不同醫藥組合物中。
合適抗生素包括大環內酯抗生素，例如托普黴素(tobramycin)(TOBITM )。
合適DNase藥物包括阿法鏈道酶(dornase alfa)(PulmozymeTM )，其為一種重組人類脫氧核糖核酸酶I(rhDNase)之高度純化溶液，其選擇性地裂解DNA。阿法鏈道酶(Dornase alfa)係用以治療囊腫性纖維化。
上皮鈉通道阻斷劑與消炎藥物之其他適用組合為彼等與趨化因子受體(例如CCR-1、CCR-2、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9及CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5)之拮抗劑的彼等組合，尤其CCR-5拮抗劑(諸如先靈 葆雅(Schering-Plough)拮抗劑SC-351125、SCH-55700及SCH-D)、Takeda拮抗劑(諸如N-[[4-[[[6,7-二氫-2-(4-甲基-苯基)-5H-苯并-環庚烯-8-基]羰基]胺基]苯基]-甲基]四氫-N,N-二甲基-2H-哌喃-4-氯化銨(TAK-770)及在US 6,166,037(尤其請求項18及19)、WO 00/66558(尤其請求項8)、WO 00/66559(尤其請求項9)、WO 04/018425及WO 04/026873中所述之CCR-5拮抗劑。
合適消炎藥物包括類固醇，尤其糖皮類固醇，諸如布地奈德(budesonide)、二丙酸倍氯米松(beclamethasone dipropionate)、氟替卡松丙酸酯(fluticasone propionate)、環索奈德(ciclesonide)或糠酸莫米他松(mometasone furoate)或WO 02/88167、WO 02/12266、WO 02/100879、WO 02/00679(尤其實例3、11、14、17、19、26、34、37、39、51、60、67、72、73、90、99及101之彼等)、WO 03/35668、WO 03/48181、WO 03/62259、WO 03/64445、WO 03/72592、WO 04/39827及WO 04/66920中所述之類固醇；非類固醇糖皮質激素受體促效劑，諸如DE 10261874、WO 00/00531、WO 02/10143、WO 03/82280、WO 03/82787、WO 03/86294、WO 03/104195、WO 03/101932、WO 04/05229、WO 04/18429、WO 04/19935及WO 04/26248中所述之彼等；LTD4拮抗劑，諸如孟魯司特(montelukast)及紮魯司特(zafirlukast)；PDE4抑制劑，諸如西洛司特(cilomilast)(Ariflo® GlaxoSmithKline)、羅氟司特(Roflumilast)(Byk Gulden)、V-11294A(Napp)、BAY19-8004(Bayer)、SCH-351591(Schering-Plough)、阿羅茶鹼(Arofylline)(Almirall Prodesfarma)、PD189659/PD168787(Parke-Davis)、AWD-12-281(Asta Medica)、CDC-801(Celgene)、SelCID(TM)CC-10004(Celgene)、VM554/UM565(Vernalis)、T-440(Tanabe)、KW-4490(Kyowa Hakko Kogyo)及WO 92/19594、WO 93/19749、WO 93/19750、WO 93/19751、WO 98/18796、WO 99/16766、WO 01/13953、WO 03/104204、WO 03/104205、WO 03/39544、WO 04/000814、WO 04/000839、WO 04/005258、WO 04/018450、WO 04/018451、WO 04/018457、WO 04/018465、WO 04/018431、WO 04/018449、WO 04/018450、WO 04/018451、WO 04/018457、WO 04/018465、WO 04/019944、WO 04/019945、WO 04/045607及WO 04/037805中所揭示之彼等；腺苷A2B受體拮抗劑，諸如WO 02/42298中所述之彼等；及β-2腎上腺素受體促效劑，諸如沙丁胺醇(albuterol，salbutamol)、奧西那林(metaproterenol)、特布他林(terbutaline)、沙美特羅(salmeterol)、非諾特羅(fenoterol)、丙卡特羅(procaterol)及尤其福莫特羅(formoterol)、卡莫特羅(carmoterol)及其醫藥學上可接受之鹽，及WO 0075114之式(I)化合物(游離形式或鹽形式或溶劑合物形式)，該文獻係以引用的方式併入本文中，其實例之較佳化合物、尤其茚達特羅(indacaterol)及其醫藥學上可接受之鹽，以及WO 04/16601之式(I)化合物(游離形式或鹽形式或溶劑合物形式)，亦及EP 1440966、JP 05025045、WO 93/18007、WO 99/64035、USP 2002/0055651、WO 01/42193、WO 01/83462、WO 02/66422、WO 02/70490、WO 02/76933、WO 03/24439、WO 03/42160、WO 03/42164、WO 03/72539、WO 03/91204、WO 03/99764、WO 04/16578、WO 04/22547、WO 04/32921、WO 04/33412、WO 04/37768、WO 04/37773、WO 04/37807、WO 04/39762、WO 04/39766、WO 04/45618、WO 04/46083、WO 04/80964、WO 04/108765及WO 04/108676之化合物。
合適支氣管擴張藥亦包括抗膽鹼能或抗毒蕈鹼藥劑，尤其異丙托溴銨(ipratropium bromide)、氧托溴銨(oxitropium bromide)、噻托銨鹽(tiotropium salt)及CHF 4226(Chiesi)及格隆溴銨(glycopyrrolate)，但 亦包括EP 424021、US 3,714,357、US 5,171,744、WO 01/04118、WO 02/00652、WO 02/51841、WO 02/53564、WO 03/00840、WO 03/33495、WO 03/53966、WO 03/87094、WO 04/018422及WO 04/05285中所述之彼等。
合適雙重消炎及支氣管擴張藥物包括雙重β-2腎上腺素能受體促效劑/蕈毒鹼拮抗劑，諸如US 2004/0167167、WO 04/74246及WO 04/74812中所揭示之彼等。
合適抗組織胺劑藥物包括西替利嗪鹽酸鹽(cetirizine hydrochloride)、乙醯胺苯酚、反丁烯二酸氯馬斯汀(clemastine fumarate)、異丙嗪(promethazine)、氯雷他定(loratidine)、地氯雷他定(desloratidine)、苯海拉明(diphenhydramine)及弗克芬德鹽酸鹽(fexofenadine hydrochloride)、艾提斯汀(activastine)、阿司咪唑(astemizole)、氮拉斯汀(azelastine)、依巴斯汀(ebastine)、依匹斯汀(epinastine)、咪唑斯汀(mizolastine)及特非拉丁(tefenadine)以及JP 2004107299、WO 03/099807及WO 04/026841中所揭示之彼等。
本發明之藥劑與消炎藥物之其它適用組合係與趨化因子受體(例如CCR-1、CCR-2、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9及CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5)之拮抗劑的彼等，尤其CCR-5拮抗劑(諸如先靈葆雅拮抗劑SC-351125、SCH-55700及SCH-D)、Takeda拮抗劑(例如N-[[4-[[[6,7-二氫-2-(4-甲基苯基)-5H-苯并-環庚烯-8-基]羰基]胺基]苯基]-甲基]四氫-N,N-二甲基-2H-哌喃-4-氯化銨(TAK-770)及在USP 6,166,037(尤其請求項18及19)、WO 00/66558(尤其請求項8)、WO 00/66559(尤其請求項9)、WO 04/018425及WO 04/026873中所述之CCR-5拮抗劑。
其他適用之額外治療劑亦可選自由以下各物組成之群：細胞因子結合分子，尤其為其他細胞因子之抗體，詳言之為與抗IL4抗體(諸 如PCT/EP2005/00836中所述)、抗IgE抗體(諸如Xolair®)、抗IL31抗體、抗IL31R抗體、抗TSLP抗體、抗TSLP受體抗體、抗endoglin(內皮細胞表面與增殖有關的抗原)抗體、抗ILlb抗體或抗IL13抗體(諸如WO 05/007699中所述)之組合。
兩種或兩種以上組合化合物可單獨、伴隨或相繼地一起用於單個調配物中。
該等化合物之毒性及治療功效可藉由標準醫藥程序在細胞培養或實驗動物中測定，以測定LD50(群體50%致死劑量)及ED50(群體50%治療有效劑量)。在毒性作用與治療效果之間的劑量比為治療指數且其可表示為比率LD50/ED50。展示高治療指數之化合物較佳。
自細胞培養檢定及動物研究中所獲之資料可用於調配適用於人類之劑量範圍。本發明組合物之劑量一般在包括幾乎不具有或不具有毒性之ED50之循環濃度範圍中。劑量可視所用劑型及所用投藥途徑而在此範圍內變化。對於任何用於本發明方法中之化合物而言，治療有效劑量可首先由細胞培養檢定來評估。可在動物模型中調配劑量以實現化合物之循環血漿濃度範圍，或(若適當)包括如細胞培養物中所測定之IC50(亦即，實現症狀之最大抑制的一半之測試化合物濃度)的標靶序列之多肽產物(例如，實現降低濃度之多肽)。該資訊可用於更準確判定適用於人類之劑量。可(例如)藉由高效液相層析來量測血漿含量。
如上文所述，除了其個別投與或作為複數投與，本發明之dsRNA可與有效治療ENaC相關病症之其他已知藥劑組合投與。在任何事件中，投藥醫師可基於使用此項技術中已知或本文所述之功效的標準量測所觀測之結果來調整dsRNA投與之量及計時。
治療方法及輸送途徑
可藉由多種途徑將包括iRNA藥劑，例如靶向α-ENaC之iRNA藥劑 之組合物輸送至個體以實現至作用部位之局部輸送或至個體之全身輸送。例示性途徑包括直接局部投與至治療部位，諸如肺及鼻腔以及靜脈內、經鼻、經口及經眼睛輸送。投與本發明之iRNA藥劑的較佳方式係藉由作為液體、氣溶膠或霧化溶液直接向肺部或鼻腔投與。
用於吸入或非經腸投與之調配物為此項技術中熟知。該調配物可包括無菌水溶液，其亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他合適添加劑。對於靜脈內使用而言，應控制溶質之總濃度以使製劑等滲。
本文所揭示之活性化合物較佳藉由任何合適方式向個體之肺部或鼻腔投與。可藉由投與個體吸入之包含活性化合物的可吸入粒子之氣溶膠懸浮液來投與活性化合物。活性化合物可霧化為多種形式，諸如(但不限於)乾粉吸入劑、定量吸入劑或液體/液體懸浮液。可吸入粒子可為液體或固體。粒子可視情況含有其他治療成份，諸如胺氯吡脒(amiloride)、苯紮米勒(benzamil或phenamil)，其中所選擇之化合物以有效抑制水自氣管黏膜分泌物再吸收的量包括於其中，如美國專利第4,501,729號中所述。
粒子醫藥組合物可視情況與載劑組合以幫助分散或傳遞。諸如糖(亦即，乳糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖醇)之合適載劑可以任何合適比率(例如，以重量計之1：1比率)與活性化合物摻合。
用於實踐本發明之由活性化合物構成之粒子應包括可吸入尺寸之粒子，亦即足夠小以在吸入時穿過口或鼻及喉且進入肺部支氣管及肺泡的粒子。一般而言，尺寸範圍為約1至10μm(更特定言之，尺寸小於約5μm)之粒子為可吸入的。氣溶膠中所包括之非可吸入尺寸之粒子傾向於沈積於咽喉且經吞咽，且氣溶膠中非可吸入粒子之量較佳經最小化。對於經鼻投與而言，10-500μM範圍之粒徑為較佳的，以確保保留於鼻腔內。
用於製造氣溶膠之活性化合物之液體醫藥組合物可藉由使活性 化合物於合適媒劑(諸如無菌無熱原質之水)組合而製備。用於進行本發明之高滲透壓生理食鹽水溶液較佳為無菌、無熱原質溶液，其包含1-15%(重量)生理學上可接受之鹽，且更佳3-7重量%生理學上可接受之鹽。
包含活性化合物之液體粒子之氣溶膠可藉由任何合適方式製造，諸如以壓力驅動噴射噴霧器或超音噴霧器。例如參見美國專利第4,501,729號。噴霧器為藉助於使壓縮氣體(通常為空氣或氧氣)經狹窄文氏管口加速或藉由超音攪拌將活性成份之溶液或懸浮液轉化為治療性氣溶膠薄霧的市售裝置。
用於噴霧器之合適調配物由液體載劑中之活性成份組成，該活性成份佔調配物之高達40重量%，但較佳少於20重量%。載劑通常為水(且最佳為無菌、無熱原質水)或稀釋水性醇溶液，較佳使其與體液等滲，但可藉由添加(例如)氯化鈉變得相對於體液為高滲透壓的。可選添加劑包括防腐劑(若調配物並非無菌的)，例如對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑；調味劑；揮發性油；緩衝劑及界面活性劑。
包含活性化合物之固體粒子之氣溶膠同樣可以任何固體粒子治療性氣溶膠產生器製造。用於向個體投與固體粒子治療劑之氣溶膠產生器產生可吸入之粒子且以適於人類投與之速率產生一定體積之氣溶膠(含有預定劑量之治療劑)。固體粒子氣溶膠產生器之一說明性類型為吹入器。用於藉由吹入投與之合適調配物包括精細粉碎之粉末，其可藉助於吹入器輸送或以吹入方式進入鼻腔中。在吹入器中，粉末(例如，其有效於進行本文所述之治療的定量之劑量)容納於通常由明膠或塑膠製成之膠囊或濾筒中，其經原位刺穿或打開且經吸入時自裝置抽吸之空氣或藉由手動操作之泵輸送粉末。吹入器中採用之粉末僅由活性成份組成或由包含活性成份、合適粉末稀釋劑(諸如，乳糖)及可選之界面活性劑的粉末摻合物組成。活性成份通常包含0.1至100重 量比之調配物。
說明性氣溶膠產生器之第二類型包含定量吸入器。定量吸入器為加壓氣溶膠施配器，通常含有活性成份於液化推進劑中之懸浮液或溶液調配物。使用期間，此等裝置經適於輸送定量體積(通常10至200μl)之閥釋放調配物以產生含有活性成份之精細粒子噴霧。合適推進劑包括某些氯氟碳化物化合物，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷及其混合物。調配物可另外含有一或多種共溶劑(例如乙醇)、界面活性劑(諸如，油酸或脫水山梨糖醇三油酸酯)、抗氧化劑及合適調味劑。
iRNA藥劑可併入至適於投與之醫藥組合物中。舉例而言，組合物可包括iRNA藥劑之一或多種物質及醫藥學上可接受之載劑。如本文所使用，"醫藥學上可接受之載劑"意欲包括任何及所有與醫藥投與相容之溶劑、分散液介質、塗層、抗細菌及抗真菌藥劑、等滲及吸收延遲藥劑及其類似物。該等介質及藥劑用於醫藥活性物質之用途為此項技術中熟知。除任何習知介質或藥劑與活性化合物不相容之外，涵蓋其在組合物中之用途。補充活性化合物亦可併入該等組合物中。
可藉由個體或另一個人(例如，護理者)提供投與。護理者可為向人類提供護理中所涉及之任何實體：例如，醫院、臨終關懷醫院、醫生診所、門診醫務所；健康護理工作者，諸如醫生、護士或其他從業者；或配偶或監護人，諸如父母。可以經量測劑量或輸送定量劑量之施配器中提供藥物。
術語"治療有效量"為在待治療患者體內提供所要含量藥物以產生預期生理學反應所需要的組合物中存在之量。
術語"生理學有效量"為輸送至個體以產生所要緩解或治療效果之量。
術語"醫藥學上可接受之載劑"意謂可吸入至肺部而對肺部無顯著 不利毒性作用之載劑。
術語"共投與"係指向個體投與兩種或兩種以上藥劑及尤其兩種或兩種以上iRNA藥劑。藥劑可容納於單個醫藥組合物中且在相同時間投與，或藥劑可容納於單獨調配物中且向個體連續投與。只要可在個體體內同時偵測到兩種藥劑，則稱兩種藥劑共投與。
適用作載劑之醫藥賦形劑之類型包括穩定劑，諸如人類血清白蛋白(HSA)、膨化劑(諸如碳水化合物，胺基酸及多肽)；pH調節劑或緩衝劑；鹽，諸如氯化鈉；及其類似物。此等載劑可為結晶或非晶形形式或可為兩者之混合物。
尤其有價值之膨化劑包括相容碳水化合物、多肽、胺基酸或其組合。合適碳水化合物包括單醣，諸如半乳糖、D-甘露糖、山梨糖及其類似物；雙醣，諸如乳糖、海藻糖及其類似物；環糊精，諸如2-羥基丙基-β-環糊精；及多醣，諸如棉子糖、麥芽糊精、葡聚糖及其類似物；醛醣醇，諸如甘露糖醇、木糖醇及其類似物。碳水化合物之較佳群包括乳糖、海藻糖、棉子糖麥芽糊精及甘露糖醇。合適多肽包括阿斯巴甜糖。胺基酸包括丙胺酸及甘胺酸，甘胺酸為較佳的。
合適pH值調節劑或緩衝劑包括有機酸及鹼製成之有機鹽，諸如檸檬酸鈉、抗壞血酸鈉及其類似物。檸檬酸鈉為較佳的。
劑量
iRNA藥劑可以每公斤體重小於約75mg，或每公斤體重小於約70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001或0.0005mg，且每公斤體重小於200nmol iRNA藥劑(例如，約4.4×1016 個副本)，或每公斤體重小於1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075、0.00015nmol iRNA藥劑之單位劑量投與。例如，單位劑量可藉由注射(例如，靜脈內或肌肉內、胸內或直接注射入器官)、吸入 給藥或局部應用而投與。
劑量可為有效治療或預防疾病或病症之量。其可預防地給藥或作為治療方案之主要或部分給藥。
在一實施例中，單位劑量比每天一次低之頻率投與，例如小於每2、4、8或30天一次。在另一實施例中，單位劑量不以頻率(例如，並非規則頻率)投與。舉例而言，單位劑量可以單次投與。因為iRNA藥劑介導之沉默在投與iRNA藥劑組合物後可持續若干天，在許多狀況下，可能以小於每天一次之頻率投與組合物或對一些狀況而言，在整個治療方案期間僅一次。
在一實施例中，個體經投與初始劑量，及一或多個維持劑量之iRNA藥劑，例如雙股iRNA藥劑，或siRNA藥劑(例如，前驅物，例如可處理為siRNA藥劑之較大iRNA藥劑，或編碼iRNA藥劑(例如，雙股iRNA藥劑，或siRNA藥劑或其前驅物)之DNA)。維持劑量一般低於初始劑量，例如比初始劑量低一半。維持方案可包括以每天每公斤體重0.01至75mg範圍，例如每天每公斤體重70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001或0.0005mg之劑量治療個體。維持劑量較佳不超過每5、10或30天投與一次。此外，治療方案可持續將視特定疾病之種類、其嚴重程度及患者之總體病況而定之時期。在較佳實施例中，劑量可輸送每天不超過1次，例如不超過每24、36、48或更多小時一次，例如不超過每5至8天一次。在治療後，可監測患者之病況改變及疾病狀態之症狀的減緩。化合物之劑量在患者對當前劑量水準不顯著反應之事件中增加，或若觀測到疾病狀態之症狀減緩、若疾病狀態已消除或若觀測到非所要副作用則可降低劑量。
如特定環境下所要或認為適當，有效劑量可以單次劑量或以兩次或兩次以上劑量投與。若需要便於重複或頻繁輸注，植入輸送裝 置，例如泵、半永久支架(例如，靜脈內、腹膜內、腦池內或囊內)或儲集層可為明智的。
在成功治療後，可能需要使患者經歷維持療法以防止疾病狀態復發，其中本發明化合物係以每公斤體重0.001g至100g範圍之維持劑量投與(參見US 6,107,094)。
iRNA藥劑組合物之濃度為足以有效於在人體內治療或預防病症或調節生理病況之量。所投與之iRNA藥劑之濃度或量將視針對藥劑測定之參數及投藥方法(例如，經鼻、經頰或經肺)而定。舉例而言，經鼻調配物傾向於需要較低濃度之一些成份以避免刺激或燒傷鼻腔。有時需要將經口調配物稀釋高達10-100倍以提供合適經鼻調配物。
某些因素可影響有效治療個體所需之劑量，包括(但不限於)疾病或病症之嚴重程度，先前治療、個體之一般健康及/或年齡及所存在之其他疾病。亦將瞭解有效劑量之iRNA藥劑(諸如用於治療之siRNA)經特定治療過程可增加或降低。可導致劑量改變且由診斷檢定結果可顯而易見。舉例而言，在投與iRNA藥劑組合物後可對個體進行監測。基於來自監測之資訊，可投與額外量之iRNA藥劑組合物。
劑量係視待治療之疾病狀況之嚴重程度及反應性而定，治療過程持續數天至數月，或直至實現治癒或實現疾病狀態之減少。可自患者體內之藥物積累量測計算最佳給藥時程。一般熟習此項技術者可容易地測定最佳劑量，給藥方法及循環速率。最佳劑量將視個別化合物之相對效能而改變，且一般可基於有效於上文所述之活體外及活體內動物模型之EC50評定。
如本文所述之本發明iRNA藥劑可適用於治療及(若適當)預防以下疾病/病症中之任一者；囊腫性纖維化、利德爾(Liddles)症候群、腎功能不全、高血壓、電解質失衡。
尤其在一些實施例中，本發明之iRNA藥劑可用於治療及/或預防此等疾病/病症之不利臨床表現。
本發明藉由以下非限制性實例進一步說明。
實例
試劑來源
儘管本文未特定給出試劑來源，但該試劑可以應用於分子生物學之一定品質/純度標準購自任何分子生物學試劑供應商。
實例1：序列選擇
為了識別下調上皮鈉通道ENaC之α子單元(α-ENaC)之表現的治療性siRNA，基於生物資訊分析定義篩選設定。篩選設定之設計的關鍵驅動為特定預測針對相關物種之轉錄的siRNA。對識別α-ENaC siRNA及有效輸送系統而言，使用三叉式方法：選擇大鼠作為測試物種以解決氣管內輸送後活體內沉默功效，選擇豚鼠作為疾病模型生物體以證明導致可量測功能效應之α-ENaC mRNA降低。治療性siRNA分子必須靶向人類α-ENaC以及至少一種毒物學相關物種(在此狀況下，恆河猴)之α-ENaC序列。
相關α-ENaC mRNA序列之初始分析揭示幾乎未識別出實現特定性需要且同時靶向所有相關物種之α-ENaC mRNA的序列。因此決定設計針對相關疾病模型(表1A、1B、1C及1D)中待測定之治療性siRNA及代用分子的獨立篩選設定。
所有siRNA識別人類α-ENaC序列，選擇人類細胞培養系統以測定活體外活性(H441，參見下文)。因此，可使用所有siRNA以靶向治療組中之人類α-ENaC mRNA。
治療性篩選組經設計以僅含有siRNA序列，其與人類及恆河猴α-ENaC序列完全互補。
靶向α-ENaC之siRNA的設計及電子雜交(in silico )選擇(SCNN1A)
進行siRNA設計以識別針對四種先前定義之組的siRNA(參見上文)
a)"初始篩選組"
b)"延長之篩選組"
c)"大鼠之活體內代用組"
d)"豚鼠之活體內代用組"
初始篩選組
初始篩選組之電子雜交選擇之目的為識別特異性靶向人類α-ENaC以及其恆河猴直系同源物之siRNA。人類標靶mRNA(NM_001038.4)係在完成siRNA選擇程序期間自NCBI來源下載(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？CMD=search&DB=nucleotide)。為了識別α-ENaC恆河猴(Macaca mulatta )直系同源物，在Baylor College of Medicine將人類序列針對2004 10 01之Mmulatta重疊群用於blastn研究(http：//www.hgsc.bcm.tmc.edu/blast/？organism=Mmulatta)。提取所有撞擊區且藉由CAP組裝工具組裝以產生第一組裝序列。此外，在UCSC以人類序列進行針對Rhesus freeze 2005年3月12日之BLAST研究(http：//genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat？command=start&org=Rhesus&db=rheMac2&hgsid=84859356)。骨架撞擊84554經下載且藉由CAP與第一組裝序列一起使用以產生恆河猴α-ENaC的最終一致序列。
在自人類mRNA提取出所有重疊19mer序列後，識別在組裝恆河猴一致序列中具有相同序列之保守19mer。彼等19mer序列定義為由1185 19mer表示之人類-恆河猴交叉反應性siRNA(有意義)序列之集合。
在人體內產生相應反義序列且測試特異性。為此，將其與不相 關標靶mRNA相互作用之預測潛力(脫靶潛力)作為參數。具有低脫靶潛力之序列定義為較佳且預測其更具有特異性。
對進一步選擇而言，候選siRNA根據其與其他宿主序列(本文(非限制性的)為人類)相互作用之預測潛力分等級。假定具有低脫靶潛力之siRNA活體內更特異。對預測siRNA特異性脫靶潛力而言，進行以下假定：
1)可自脫靶之錯配數目及分布推算股之脫靶潛力
2)最相關脫靶，亦即由於錯配耐受、經預測具有待沉默之最高可能性的基因決定股脫靶潛力
3)股(種子區域)之位置2至9(計數5'至3')可比序列之其餘部分(亦即，非種子及裂解位點區域)造成更多脫靶潛力(Haley,B.，及Zamore,P.D.,Nat Struct Mol Biol.2004,11：599)。
4)股(裂解位點區域)之位置10及11(計數5'至3')可比非種子區域(亦即位置12至18，計數5'至3')造成更多脫靶潛力
5)各股之位置1及19不與脫靶相互作用相關
6)脫靶潛力可藉由最相關脫靶之脫靶計分表示，其係基於股與脫靶基因中最同源區域(鑒於假定3至5)之錯配之數目及位置計算
7)假定有意義股活性藉由所引入內部修飾之潛在中斷，僅反義股之脫靶潛力將相關
為識別潛在脫靶基因，19mer反義序列經受針對公眾可得之人類mRNA序列的同源性研究，假定呈現人類全面轉錄。
為此目的，以針對人類RefSeq資料庫之所有19mer序列進行fastA(第3.4版)研究(來自ftp：//ftp.ncbi.nih.gov/refseq/on Nov.,18 2005之可利用版本)。以參數-值-對-f 30 -g 30實施FastA研究以考慮無任何間隙之19mer全長的同源性。此外，為了確保fastA輸出檔案中所有相關脫靶碰撞之清單，使用參數-E 15000。
研究產生藉由整個19mer上之遞減序列同源性列出之各輸入序列的潛在脫靶之清單。
為根據假定3至5將所有潛在脫靶分等級，且藉此識別最相關脫靶基因及其脫靶計分，藉由perl指令碼分析fastA輸出檔案。
指令碼提取以下針對各19mer輸入序列及各脫靶基因之脫靶特性以計算脫靶計分：
●非種子區域中之錯配數目
●種子區域中之錯配數目
●裂解位點區域中之錯配數目
脫靶計分係藉由如下之鑒於假定3至5計算：脫靶計分=種子錯配數目* 10+裂解位點錯配數目* 1.2+非種子錯配數目* 1
各19mer序列之最相關脫靶基因定義為具有最低脫靶計分之基因。因此，最低脫靶計分定義為各siRNA之脫靶潛力的代表，其係由所分析之19mer反義序列表示。
所計算之脫靶潛力係用作分類參數(根據脫靶計分遞減)以產生所有人類-恆河猴交叉反應性siRNA序列之分等級。
3或3以上之脫靶計分定義為siRNA選擇之必備條件，而排除在列中含有4個或更多G'(聚-G序列)之所有序列，導致選擇總共152個靶向人類及恆河猴ENaC α之siRNA(參見表1a)。
延長之篩選組
延長之篩選組之電子雜交選擇之目的為識別所有其他以充足特異性靶向人類α-ENaC之siRNA，其由於失去與恆河猴之交叉反應性而自起始組排除。獲取來自由先前未經分析之人類α-ENaC產生之19mer的集合之剩餘序列且產生相應反義序列。如"初始篩選組"部分中所述 計算最相關脫靶基因及其相應脫靶計分。
為測定與小鼠及豚鼠(Cavia porcellus /cobya)之交叉反應性，自NCBI核苷酸資料庫1 (寄存編號分別為NM_011324.1及AF071230(全長)/DQ109811(部分cds))下載此等物種之α-ENaC序列。將兩種豚鼠序列用於產生豚鼠α-ENaC一致序列。在小鼠及豚鼠序列中測試每個人類19mer序列之存在。向人類-小鼠交叉反應性siRNA(有意義)序列或人類-豚鼠交叉反應性siRNA(有意義)序列池中分配陽性序列。在排除所有聚-G序列之後，選擇脫靶計分為3或更高以及彼等脫靶計分為2.2或2.4且與小鼠、恆河猴或豚鼠具有交叉反應性之序列。延長篩選池中siRNA之總數為344(參見表1b)。
活體內大鼠代用組
活體內大鼠代用組之電子雜交選擇的目的為識別大鼠體內所有以充足特異性靶向人類及大鼠α-ENaC之siRNA。為識別人類-大鼠交叉反應性siRNA，自NCBI核苷酸資料庫(寄存編號，NM_031548.2)下載大鼠α-ENaC mRNA序列，且測試表示人類-大鼠交叉反應性(有意義)序列池之大鼠序列中人類19mer池之所有序列的存在。
在大鼠內產生相應反義序列且測試特異性。為此，如"初始篩選組"部分中所述使用大鼠mRNA組(RefSeq資料庫)代替人類轉錄子計算大鼠體內之最相關脫靶基因及其相應脫靶計分。在排除所有聚-G序列之後，優先考慮大鼠脫靶計分且其次考慮人類脫靶計分產生分等級。最終選擇來自清單頂部之彼等表示活體內大鼠代用設定(參見表1c)之48個序列。
活體內豚鼠代用設定
活體內豚鼠代用設定之電子雜交選擇的目標為識別所有先前設定中未經選擇之靶向人類及豚鼠α-ENaC之siRNA。根據人類脫靶計分將先前測定之人類-豚鼠交叉反應性siRNA(有意義)序列之設定的剩餘 siRNA分等級。選擇頂部63個序列(排除聚-G序列)，其表示活體內豚鼠代用設定(參見表1d)。
實例2：siRNA合成
包含天然鹼基之核苷酸的合成
因為來自篩選設定之siRNA均潛在地意欲用於活體內投與，以保護siRNA免於在生物環境中經核酸內切酶及核酸外切酶降解的修飾策略合成siRNA。在此策略中，藉由3'-端最後兩個核鹼基之間的硫代磷酸酯鍵聯保護兩個股之3'-端的3'->5'-外切核苷酸活性。為了抑制siRNA之內切核苷酸降解，將siRNA有意義股中之所有嘧啶以相應2'-O -甲基-修飾之核糖核苷酸置換。為減少反義股(其為更具活性之股且因此對修飾更敏感)中之修飾數，吾人僅在先前識別之主要核酸酶裂解位點內容中以2'-O -甲基修飾嘧啶。主要裂解位點為以下兩個序列基元：5'-UA-3'及5'-CA-3'。
因為亦考慮在潛在保護RNA免於肺部核苷酸生物環境之調配物中使用siRNA，亦合成相同siRNA設定而無任何內切核苷酸降解之保護。
儘管本文未特定給出試劑來源，但該試劑可以應用於分子生物學之一定品質/純度標準購自任何分子生物學試劑供應商。
藉由固相合成使用Expedite 8909合成器(Applied Biosystems,Applera Deutschland GmbH,Darmstadt,Germany)及受控微孔玻璃(CPG,500Å,Proligo Biochemie GmbH,Hamburg,Germany)作為固體支撐物以1μmol之規模產生單股RNA。藉由固相合成分別採用相應胺基磷酸酯及胺基磷酸2'-O-甲基酯(Proligo Biochemie GmbH,Hamburg,Germany)產生RNA及含有2'-O-甲基核苷酸之RNA。在寡核糖核苷酸鏈之序列內所選擇位點處使用標準核苷胺基磷酸酯化學併入此等架構基塊，諸如Current protocols in nucleic acid chemistry,Beaucage,S.L. 等人。(編),John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY,USA中所述。藉由以Beaucage試劑(Chruachem Ltd,Glasgow,UK)於乙腈(1%)中之溶液置換碘氧化劑溶液而引入硫代磷酸酯鍵聯。自Mallinckrodt Baker(Griesheim,Germany)購得其他輔助試劑。
根據已確立之程序藉由陰離子交換HPLC進行粗寡核糖核苷酸之去保護及純化。藉由各別RNA溶液在260nm波長下之UV吸收使用光譜儀(DU 640B,Beckman Coulter GmbH,Unterschleißheim,Germany)測定產量及濃度。藉由在退火緩衝液(20mM磷酸鈉，pH 6.8；100mM氯化鈉)中混合等莫耳量之互補股溶液，在水浴中在85-90℃下加熱3分鐘且3-4小時之時期冷卻至室溫產生雙股RNA。將退火RNA溶液稀釋至50μmol雙股RNA/L之濃度且在-20℃下儲存直至使用。
實例3：活體外siRNA測試
在人類細胞系中活體外測試或在大鼠中活體內測試iRNA藥劑抑制α-ENaC表現之能力。將iRNA藥劑(例如藉由轉染)轉染至細胞中，使其對細胞作用一段時間(例如24小時)，且藉由分支DNA分析測定α-ENaC mRNA含量。或者，經由氣管內途徑活體內測定iRNA藥劑且藉由對標靶器官之分支DNA分析測定α-ENaC mRNA表現之抑制。與此等直接檢定互補，吾人藉由針對重組表現於哺乳動物宿主細胞中之α-ENaC mRNA之RNAi藥劑測試標靶基因表現之抑制。
細胞系
自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)(ATCC-編號：HTB-174,LCG Promochem GmbH,Wesel,Germany)購得H441細胞且使其在37℃下在5% CO2 /95%空氣氣氛下在RPMI 1640、10%胎牛血清、100μ盤尼西林(penicillin)/100μg/mL鏈黴素、2mM L-麩胺醯胺、10nM Hepes及1mM丙酮酸鈉(所有均購自Biochrom AG,Berlin,Germany)生長。
原始人類支氣管上皮細胞係購自Cambrex(Cat # CC-2540)且在BEGM介質中與singlequots(Cambrex Cat # CC-3170減去三碘蘇胺酸)一起常規生長。對於在空氣液體介面極化及生長而言，使細胞在補足有4.5g/L D-葡萄糖(Gibco BRL Cat # 41965-039)且補足有singlequots(Cambrex Cat # CC-4175)之BEGM：DMEM 1：1混合物中，如上文所述但減去三碘基蘇胺酸及GA1000等分試樣且在50μg/mL慶大黴素(Gentamycin)(Gibco Brl Cat # 10131-015)存在下生長。在細胞保持於無血清介質中時，在繼代步驟期間使用胰蛋白酶中和溶液(Cambrex Cat # CC-5002)。對於在空氣-液體介面極化及培養而言，使細胞在半透性(0.4μm)聚碳酸酯支撐物(Corning Costar Cat # 3407 #3460)上生長且在37℃下在5% CO2 /95%空氣氣氛下培養。
使Cos-1非洲綠猴腎細胞(ATCC # CRL-1650)在杜貝卡氏MEM、4.5g/L葡萄糖、10%胎牛血清、2mM L-麩胺醯胺、1.5g/L碳酸氫鈉(Gibco BRL)、100μ盤尼西林/100μg/mL鏈黴素中生長。
實例3.1：活性α-ENaC siRNA之活體外篩選及H441中之IC50測定
在轉染前一天，藉由添加100nM地塞米松在H441細胞中(ATCC-編號：HTB-174,LCG Promochem GmbH,Wesel,Germany)誘發ENaC-α表現。在即將轉染之前，將細胞以每孔1.5×104 個細胞在75μL生長培養基(RPMI 1640，10%胎牛血清，100μ盤尼西林/100μg/ml鏈黴素、2mM L-麩胺醯胺、10nM Hepes及1mM丙酮酸鈉，均購自Biochrom AG,Berlin,Germany)中接種於96-孔培養盤(Greiner Bio-One GmbH,Frickenhausen,Germany)上。將轉染進行四次。對於各孔而言，將0.5μL Lipofectamine2000(Invitrogen GmbH,Karlsruhe,Germany)與12μL Opti-MEM(Invitrogen)混合且在室溫下培育15分鐘。對於100μL轉染體積中siRNA濃度為50nM而言，使每孔1μL 5 μM siRNA與11.5μL Opti-MEM混合，與Lipofectamine2000-Opti-MEM混合物組合且在室溫下再培育15分鐘。將siRNA-Lipofectamine2000-複合物完全施用(每孔各25μL)至細胞且將細胞在37℃下及5% CO2 中在增濕培育器(Heraeus GmbH,Hanau)中培育24小時。
藉由向含有100μL生長培養基之各孔施用50μL溶解混合物(購自Genospectra,Fremont,USA之QuantiGene bDNA套組的內容物)採集細胞且在53℃下溶解30分鐘。隨後，將50μL溶解物與對人類ENaC-α及人類GAPDH特異之探針組(探針組之序列參見下文)一起培育且根據QuantiGene之製造商方案進行。最後，在Victor2-Light(Perkin Elmer,Wiesbaden,Germany)中作為RLU(相對發光單位)測定化學發光，且hENaC探針組獲得之值標準化為各孔的各別GAPDH值。針對ENaC-α之siRNA獲得之值與設定為100%之非特異性siRNA(針對HCV)獲得的值有關。siRNA實例之α-ENaC的百分比殘基表現展示於表1A-1D中。
來自篩選之有效siRNA進一步藉由劑量反應曲線表徵。劑量反應曲線之轉染係以以下濃度進行：100nM、16.7nM、2.8nM、0.46nM、77pM、12.8pM、2.1pM、0.35pM、59.5fM、9.9fM及模擬(無siRNA)且根據上述方案以Opti-MEM稀釋至最終濃度12.5μl。使用Microsoft Excel插件(add-in)軟體XL-fit 4.2(IDBS,Guildford,Surrey,UK)進行資料分析且應用S形模型數606。
探針組：
人類α-ENaC：
siRNA實例之IC50 展示於表2A及2B。
實例3.2：原始人類支氣管上皮模型中之瞬時α-ENaC敲除：
在轉染前一天將人類支氣管上皮細胞(供體稱為4F1499)以每孔1×105 個細胞在0.5mL生長培養基中置於24孔培養盤中。在siRNA轉染當天細胞70%融合。
將各siRNA以100nM懸浮於1mL OptimemI(Invitrogen)且在單獨試管中，將Lipofectamine 2000(Invitrogen)在Optimem中稀釋至6μL/mL，產生足以在24孔培養盤中轉染四次之量。在室溫下5分鐘後，將混合物組合產生50nM siRNA之所要最終濃度及3mL/mL Lipofectamine 2000。將轉染混合物在室溫下再培育20分鐘且如實驗 設計所示向各孔中添加420μL siRNA/試劑複合物。將培養盤溫和搖動以確保完全混合且接著在培育器中在37℃下在5% CO2 /95%空氣下培育4小時。隨後，吸入轉染混合物且將細胞恢復至正常培養狀態再歷時20小時。
製備細胞溶解物用於分支-DNA分析。製備2：1培養基：溶解緩衝液(Panomics)混合物且將細胞在53℃下溶解於200μL中歷時30分鐘。視覺檢查完全溶解後，將細胞溶解物儲存於-80℃下用於隨後分析。如上文所述進行分支DNA分析，使α-ENaC表現針對GAPDH標準化。所用分支DNA分析方案與上文不同之處僅在於在此狀況下將20μL樣本應用於各孔中。
表2C展示原始HBEC中針對siRNA樣本之α-ENaC表現。
實例3.3：細胞中所選RNAi藥劑之外源性表現之經選殖食蟹猴α-ENaC基因表現的活體外抑制
食蟹猴α-ENaC序列之選殖
5'-UTR及CDS(對應於恆河猴α-ENaC cDNA序列之括號中所展示的核苷酸)之擴增的引子序列：
P745：5'-CTCCATGTTCTGCGGCCGCGGATAGAAG-3'(nt 1427)(SEQ.I.D.NO：1674)
P733：5'-CCGGCCGGCGGGCGGGCT-3'(nt 1)(SEQ.I.D.NO：1675)
P734：5-CTCCCCAGCCCGGCCGCT-3'(nt 17)(SEQ.I.D.NO：1676)
P735：5'-GGCCGCTGCACCTGTAGGG-3'(nt 28)(SEQ.I.D.NO：1677)
CDS及3'-UTR之擴增的引子序列：
P737：5'-ATGGAGTACTGTGACTACAGG-3'(nt 1422)(SEQ.I.D.NO：1678)
P740：5'-TTGAGCATCTGCCTACTTG-3'(nt 3113)(SEQ.I.D.NO：1679)
CDS之內部部分擴增的引子序列：
P713：5'-5'-ATGGATGATGGTGGCTTTAACTTGCGG-3'(nt 1182) (SEQ.I.D.NO：1679)
P715：5'-5'-TCAGGGCCCCCCCAGAGG-3'(nt 2108)(SEQ.I.D.NO：1680)
食蟹猴(Macaca fascicularis )肺部總RNA(#R1534152-Cy-BC)係購自BioCat(Germany)。cDNA之合成係使用SuperScript III第一股合成系統(Invitrogen)進行。cDNA之合成係使用隨機六聚體或寡dT引子進行。此外，食蟹猴肺部第一股cDNA亦係購自BioCat/#C1534160-Cy-BC)。對於PCR擴增而言，使用Advantage 2 PCR套組(# K1910-1,Clontech)。5'-UTR及CDS部分之擴增係使用P745及P733、P734與P735之等莫耳混合物進行。對於CDS及3'-UTR之PCR擴增而言，使用引子P737及P740。將引子P713及P715用於CDS部分之擴增。
藉由瓊脂糖凝膠電泳分析所有PCR產物且接著在TOP10細菌中使用TOPO TA選殖套組(Invitrogen)選殖入pCR2.1載體。接著揀選純系且使用Qiagen Miniprep套組分離DNA。在EcoRI 之限制酶消化及瓊脂糖凝膠電泳分析之後，使來自適當純系之DNA經受定序。
接著使序列與恆河猴之α-ENaC cDNA序列比對，且使個體純系之序列彼此比對。接著藉由以EcoR I 及Not I 消化5'-部分(5'-UTR及CDS，純系55)，藉由Not I 及BstE II (純系15)消化CDS之中間部分，及藉由BstE II 及EcoR V (純系80)消化3'-部分(CDS及3'-UTR)選殖全長食蟹猴α-ENaC cDNA。接著將經消化之DNA片段次選殖入pcDNA3.1中，以EcoR I 及EcoR V 消化。接著使pcDNA3.1中之全長食蟹猴α-ENaC cDNA經受全長定序(Ingenetix,Vienna,Austria)。食蟹猴α-ENaC cDNA序列對應於恆河猴α-ENaC cDNA序列之nt 28-3113。最終藉由以BamH I 及EcoR V 消化且次選殖入載體pXOON中自pcDNA3.1-食蟹猴α-ENaC切除食蟹猴α-ENaC cDNA。質體圖說明於圖1中。圖2描繪食蟹猴α-ENaC之蛋白質(SEQ.I.D.NO：1681)及DNA(SEQ.I.D.NO：1682)序列。
轉染：
將COS-1細胞以每孔6×104 個細胞接種於24孔培養盤中，其各自在0.5mL生長培養基中。接種1天後，將細胞以pXOON食蟹猴α-ENaC表現質體及所指示之siRNA共轉染。對於各孔而言，4ng α-ENaC表現質體及600ng載劑質體(pNFAT-luc)如下文所述以相關siRNA(最終濃度45nM)使用X-treme基因轉染試劑(Roche)以每孔3.75μL以每孔720μL總體積之Opti-MEM(Invitrogen)共轉染。
各樣本進行三次轉染。如下製備質體/siRNA預混製劑(各用於3.5個孔)：總體積210μL之14ng α-ENaC表現質體、2.1μg載劑質體及112pm相關siRNA(Opti-MEM)。由全轉染(對於8個三次轉染樣本而言105μL脂質加1575μL Opti-MEM)製備質體預混製劑。質體/siRNA與脂質等體積混合產生每三倍樣本(3.5x)總體積420μL轉染混合物。在室溫下培育20分鐘後，向細胞之各孔中添加120μL相關轉染混合物，最終轉染體積為720μL(Opti-MEM)。將細胞在37℃下且在5% CO2 下在潮濕培育器(Heraeus GmbH,Hanau,Germany)中轉染24小時且採集用於分支-DNA分析。
製備細胞溶解物用於分支-DNA分析。製備2：1培養基：溶解物緩衝液(Panomics)混合物且將細胞在53℃下溶解於200μL中歷時30分鐘。視覺檢查完全溶解後，將細胞溶解物儲存於-80℃下用於隨後分析。如上文所述進行分支-DNA分析，針對來自表現質體之eGFP使食蟹猴α-ENaC表現標準化。所用分支DNA分析方案與上文不同之處僅在於在此狀況下將20μL樣本應用於各孔中。
探針組：
食蟹猴α-ENaC：
表2C展示食蟹猴物種中針對siRNA樣本之α-ENaC表現。
實例3.4篩選干擾素-α誘發
為評估siRNA刺激干擾素-α(IFNα)釋放之能力，以新鮮純化之周邊血液單核細胞(PBMC)活體外培育siRNA歷時24小時。將siRNA直接添加至PBMC中，或首先與脂質轉染藥劑(GenePorter 2或Lipofectamine 2000或DOTAP轉染藥劑)複合且接著以PBMC培育。作為IFNα誘發之陽性對照，包括未經修飾之對照序列DI_A_2216及DI_A_5167。
DI_A_2216：為單股反義DNA分子
5'-dGsdGsdGdGdGdAdCdGdAdTdCdGdTdCdGsdGsdGsdGsdGsdG-3'(SEQ.I.D.NO：1707)
DI_A_5167為膽固醇結合之siRNA
5'-GUCAUCACACUGAAUACCAAU-s -chol-3'
3'-CsAsC AGUAGUGUGACUUAUGGUUA-5'(SEQ.I.D.NO：1708)
24小時後，藉由ELISA量測IFNα。測定未經處理之細胞的基礎IFNα水準且其總是極接近僅水之對照物。單獨添加轉染藥劑幾乎不產生或產生少量IFNα水準之增加。向細胞中直接或在轉染劑存在下添加已知刺激寡核苷酸，且觀測到IFNα之預期增加。此配置允許測定IFNα在人類PBMC中藉由siRNA(或其他寡核苷酸)之刺激。
人類PBMC之分離： 白血球(白血球層)之濃縮餾份係購自Blood Bank Suhl,Institute for Transfusion Medicine,Germany。此等細胞對於多種病原體(包括HIV、HCV及其他)呈陰性。將白血球層以PBS 1：1稀釋，添加至含有Ficoll之試管中，且在2200rpm下離心20分鐘以允許分餾。此後為移除白血球之混濁層且轉移至具有新鮮PBS及Ficoll之試管中，將其在2200rpm下離心15分鐘。再次移除白血球之混濁層，轉移至RPMI 1640培養基且在1,200rpm下離心5分鐘將白血球壓丸。將細胞再懸浮於RPMI中，如上文壓丸且再懸浮於具有10% FCS之介質中直至每毫升1×106 個。
干擾素-α 量測：在37℃下將培養物中之細胞與500nM(或1μM)Optimem中之寡核苷酸或GP2中之133nM寡核苷酸或Lipofectamine2000或DOTAP轉染藥劑合併歷時24小時。使用Bender Med Systems(Vienna,Austria)即時ELISA套組根據製造商說明量測干擾素-α。
前導治療劑序列之選擇係基於小於15%陽性對照之IFNα誘發之水準。
實例3.5在CF患者唾液中測定siRNA穩定性
由Dr.Ahmet Uluer,Children's Hospital Boston收集唾液樣本。收集後，將唾液樣本以抗生素處理且UV-照射以減少細菌含量。為測定 唾液樣本中之siRNA穩定性，將siRNA在30μL唾液中以5μM之濃度在37℃下培育指定次數。藉由添加蛋白酶K使反應中止且將樣本在42℃下再培育20分鐘。添加由對核酸酶降解具有抗性之L-核苷酸("Spiegelmer")製成之40-mer RNA分子且用作校正標準。使樣本經0.2μm膜過濾以移除剩餘碎片。使用供溶離之高氯酸鈉梯度使pH 11.0之DNAPac PA 200管柱(Dionex)上之離子交換HPLC變性對樣本進行分析。藉由測定各樣本峰下之面積對siRNA及降解產物進行定量。將濃度標準化為未經培育樣本之濃度。
前導治療性序列(ND8356、ND8357及ND8396)之選擇係基於半衰期大於60分鐘之CF唾液中活體外穩定性之觀測。
實例3.6針對人類SCNN1A基因之已知多肽現象之前導治療性序列之交叉檢驗
為自前導候選物之標靶位點排除已知多態現象，針對NCBI單個核苷酸多態現象(SNP)資料庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？CMD=search&DB=snp)檢驗前導siRNA序列。人類SCNN1A基因之10個已知外顯子多態現象中，無一者展示存在於10個最有效前導治療候選物任一者之標靶位點中。
實例3.7：頂部5個預測脫靶序列之活體外概況
各序列之比對清單係藉由19-mer區之同源性分類。脫靶係基於錯配數目及位置根據實例1中所述之準則計分。識別頂部5個脫靶序列之各前導治療性序列(ND8356、ND8357及ND8396)。將中靶及脫靶序列個別地選殖入二重螢光素酶報導系統中。各經選殖片段除10個核苷酸旁側區之外涵蓋標靶19個核苷酸，標靶序列之5'及3'兩者。在SV40啟動子之控制下，將片段選殖入Renilla螢光素酶序列的多個選殖位點3'中。針對中靶及脫靶序列之各siRNA活性係藉由螢火蟲螢光素酶之標靶Renilla螢光素酶的相對螢光測定，後者由HSV-TK啟動子獨立控 制。初始，以50nM之siRNA濃度在COS-7細胞中進行轉染。在轉染24小時後獲取螢光素酶讀數。在此siRNA高濃度下，針對三前導siRNA中任一者之任何脫靶序列未觀測到大於30%之敲除。以Renilla螢光素酶活性中約80%之相對減少證明針對中靶序列之活性。亦產生各siRNA之IC50 曲線，其係針對中靶序列且經上文識別之脫靶序列控制。對於各前導siRNA，在此報導檢定中之中靶IC50 與針對H441中之內因性標靶(實例3.3)獲得之IC50 為相同數量級(10-50pM)，表明ND8356、ND8357及ND8396針對中靶序列之效能比預測脫靶序列中之任一者高至少1000-5000倍。
實例3.8：遺傳毒性概況
遺傳毒性測定：藉由使用評定培養細胞數之細胞計數測定遺傳毒性。
熟知活體外測試細胞毒性濃度可誘發諸如微核形成之遺傳毒性作用。因此，若在至多展示中等毒性之濃度下不可觀測到微核細胞中之劑量依賴性增加，則吾人認為增加數目之含有微核之細胞呈現細胞毒性相關約50%或更低(與目前之陰性對照相比)之細胞計數。調節活體外哺乳動物細胞檢定(進行染色體畸變測試之OECD及ICH原則)之原則需要展示至少50%細胞計數減少之濃度分析。此外，OECD方案需要測試無毒化合物以包括至少一種沈澱濃度(只要此不超過10mM或5mg/ml，無論哪一個較低)。因為活體外微核測試目標為預測調節檢定之結果，亦即活體外染色體畸變測試，活體外微核測試之方案經設計以滿足此等測試之需要。
測試系統：TK6細胞為伊普斯坦-巴耳病毒(Ebstein-Barr-Virus)感染且永生化之細胞(由脾臟產生之人類淋巴母細胞起源)。活體外微核測試利用來自雄性大鼠(經Aroclor 1254預處理)的具有/不具有S9-肝組織勻漿(2%)的TK6細胞測定誘裂及/或細胞分裂電位。治療時間：20 h(-S9)、3h(+S9)。取樣時間：3小時治療開始後24小時，20小時治療開始後48小時。對於各物質而言，對至少三種濃度(每濃度兩種培養物)及每濃度2000個細胞進行分析。
若微核細胞之頻率為：>=2%且展示並行溶劑對照值至少加倍，或<2%且展示並行溶劑對照值的至少3倍增加，則認為誘發所測試濃度之作用的微核係陽性的。
為推斷實驗為陽性的，必須考慮劑量作用相互關係及細胞毒性。
總結：前導治療性序列ND8396、ND8356、ND8357既不在20小時治療無新陳代謝活化狀況下又不在3小時治療後具有或不具有S9之狀況下誘發增加數目之含有微核的細胞。經分析無細胞毒素濃度可高達5mg/ml之測試極限。
實例3.9 H441：ND8396之活體外功能功效
為了證明前導siRNA針對αENaC之活體外功能功效，H441細胞以siRNA轉染且製備用於離子運輸之尤斯室分析(Ussings chamber analysis)。對於轉染，H441細胞以每燒瓶2×106 個細胞塗於補充有200nM地塞米松之培養基之T25燒瓶中。各燒瓶中之細胞以ND8396或非靶向對照siRNA以30nM siRNA及4mL/mL Lipofectamine 2000之5mL總體積(無血清培養基)轉染。轉染1天後，將細胞塗於1cm2 Snapwell插入物上鋪滿(confluency)(每插入物2×105 個細胞)以使分化及緊密接合物形成所需之時間最小，且提供培養基於頂端及基底(basolateral)腔室中。再培養1天後，移除頂端培養基且置換基底培養基，因此使細胞到達空氣-液體介面(ALI)培養。細胞在ALI再保持6天，隨後進行離子運輸分析。
對於尤斯室中之功能分析，將Snapwell插入物置於垂直擴散室 (Costar)中，且以連續充氣之林格溶液(Ringer solution)(5% CO2 於O2 中；pH 7.4)，保持於37℃，含有：120mM NaCl、25mM NaHCO3 、3.3mM KH2 PO4 、0.8mM K2 HPO4 、1.2mM CaCl2 、1.2mM MgCl2 及10mM葡萄糖浸浴。測定溶液滲透壓在280與300mosmol/kgH2 O範圍內。細胞電壓夾至0mV(模型EVC4000；WPI)。跨上皮電阻(transepithelial resistance)(RT )係由30s間隔施用1或2mV脈衝，或使用所測量之跨細胞之初始電位差及初始電流，接著以Ohm定律計算RT 來測量。使用PowerLab工作台(ADInstrument)記錄資料。在siRNA處理後，記錄細胞之基礎特徵及胺氯吡脒(amiloride)敏感短路電流(施用10μM胺氯吡脒後之ISC ；僅頂端)。在各狀況下，藉由胺氯吡脒敏感之ISC 測定各培養物中之ENaC通道活性。
檢定後，溶解個別插入物上之細胞用於RNA分析。檢定時RNA含量之75%敲除(knockdown)(ND8396與非靶向對照相比)與胺氯吡脒敏感電流之功能敲除約30%(ND8396與非靶向對照相比)有關。
使用標準命名法及表A中之特定縮寫在下文中表示核酸序列。
表1A：初始篩選設定中之經選擇siRNA(人類-恆河猴ENaC α交叉反應性siRNA)。總共152個iRNA序列識別為初始篩選設定，其具有(序列股1-304)及不具有(序列股305-608)骨架修飾。根據實例部分所
<110> 瑞士商諾華公司
<120> 以RNAi抑制α-ENaC表現
<130> 50662-WO-PCT
<140> 103118914
<141> 2008-06-13
<150> EP 07110376.6
<151> 2007-06-15
<150> EP 07114265.7
<151> 2007-08-13
<160> 1710
<170> PatentIn version 3.3
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<222> (20)..(20)
<223> t為2prime-去氧-胸？-5prime-硫代磷酸酯
<400> 1631
<210> 1632
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：人類-天竺鼠交叉反應siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> t為2prime-去氧-胸？-5prime-硫代磷酸酯
<400> 1632
<210> 1633
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：人類-天竺鼠交叉反應siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> t為2prime-去氧-胸？-5prime-硫代磷酸酯
<400> 1633
<210> 1634
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：人類-天竺鼠交叉反應siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> t為2prime-去氧-胸？-5prime-硫代磷酸酯
<400> 1634
<210> 1635
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：人類-天竺鼠交叉反應siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> t為2prime-去氧-胸？-5prime-硫代磷酸酯
<400> 1635
<210> 1636
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：人類-天竺鼠交叉反應siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> t為2prime-去氧-胸？-5prime-硫代磷酸酯
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<210> 1637
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：人類-天竺鼠交叉反應siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> t為2prime-去氧-胸？-5prime-硫代磷酸酯
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<210> 1638
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：人類-天竺鼠交叉反應siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> t為2prime-去氧-胸？-5prime-硫代磷酸酯
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<210> 1639
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：人類-天竺鼠交叉反應siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> t為2prime-去氧-胸？-5prime-硫代磷酸酯
<400> 1639
<210> 1640
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：人類-天竺鼠交叉反應siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> t為2prime-去氧-胸？-5prime-硫代磷酸酯
<400> 1640
<210> 1641
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：人類-天竺鼠交叉反應siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> t為2prime-去氧-胸？-5prime-硫代磷酸酯
<400> 1641
<210> 1642
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：人類-天竺鼠交叉反應siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> t為2prime-去氧-胸？-5prime-硫代磷酸酯
<400> 1642
<210> 1643
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：人類-天竺鼠交叉反應siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> t為2prime-去氧-胸？-5prime-硫代磷酸酯
<400> 1643
<210> 1644
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：人類-天竺鼠交叉反應siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> t為2prime-去氧-胸？-5prime-硫代磷酸酯
<400> 1644
<210> 1645
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human ENaC-alpha
<400> 1645
<210> 1646
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human ENaC-alpha
<400> 1646
<210> 1647
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human ENaC-a lpha
<400> 1647
<210> 1648
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human ENaC-alpha
<400> 1648
<210> 1649
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human ENaC-alpha
<400> 1649
<210> 1650
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human ENaC-alpha
<400> 1650
<210> 1651
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human ENaC-alpha
<400> 1651
<210> 1652
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human ENaC-alpha
<400> 1652
<210> 1653
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human ENaC-alpha
<400> 1653
<210> 1654
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human ENaC-alpha
<400> 1654
<210> 1655
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human ENaC-alpha
<400> 1655
<210> 1656
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human ENaC-alpha
<400> 1656
<210> 1657
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human ENaC-alpha
<400> 1657
<210> 1658
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human ENaC-alpha
<400> 1658
<210> 1659
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human ENaC-alpha
<400> 1659
<210> 1660
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human ENaC-alpha
<400> 1660
<210> 1661
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human ENaC-alpha
<400> 1661
<210> 1662
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human ENaC-alpha
<400> 1662
<210> 1663
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human GAPDH
<400> 1663
<210> 1664
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human GAPDH
<400> 1664
<210> 1665
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human GAPDH
<400> 1665
<210> 1666
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human GAPDH
<400> 1666
<210> 1667
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human GAPDH
<400> 1667
<210> 1668
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human GAPDH
<400> 1668
<210> 1669
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human GAPDH
<400> 1669
<210> 1670
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human GAPDH
<400> 1670
<210> 1671
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human GAPDH
<400> 1671
<210> 1672
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human GAPDH
<400> 1672
<210> 1673
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to human GAPDH
<400> 1673
<210> 1674
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：引子P745
<400> 1674
<210> 1675
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：引子P733
<400> 1675
<210> 1676
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：引子P734
<400> 1676
<210> 1677
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：引子P735
<400> 1677
<210> 1678
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：引子P737
<400> 1678
<210> 1679
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：引子P740
<400> 1679
<210> 1680
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：引子P715
<400> 1680
<210> 1681
<211> 669
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
<400> 1681
<210> 1682
<211> 3120
<212> DNA
<213> 食蟹獼猴
<400> 1682
<210> 1683
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to cynomolgous alpha-ENac
<400> 1683
<210> 1684
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to cynomolgous alpha-ENac
<400> 1684
<210> 1685
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to cynomolgous alpha-ENac
<400> 1685
<210> 1686
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to cynomolgous alpha-ENac
<400> 1686
<210> 1687
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to cynomolgous alpha-ENac
<400> 1687
<210> 1688
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to cynomolgous alpha-ENac
<400> 1688
<210> 1689
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to cynomolgous alpha-ENac
<400> 1689
<210> 1690
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to cynomolgous alpha-ENac
<400> 1690
<210> 1691
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to cynomolgous alpha-ENac
<400> 1691
<210> 1692
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to cynomolgous alpha-ENac
<400> 1692
<210> 1693
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：Probe specific to cynomolgous alpha-ENac
<400> 1693
<210> 1694
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：對eGFP具專一性之探針
<400> 1694
<210> 1695
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：對eGFP具專一性之探針
<400> 1695
<210> 1696
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：對eGFP具專一性之探針
<400> 1696
<210> 1697
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：對eGFP具專一性之探針
<400> 1697
<210> 1698
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：對eGFP具專一性之探針
<400> 1698
<210> 1699
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：對eGFP具專一性之探針
<400> 1699
<210> 1700
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：對eGFP具專一性之探針
<400> 1700
<210> 1701
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：對eGFP具專一性之探針
<400> 1701
<210> 1702
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：對eGFP具專一性之探針
<400> 1702
<210> 1703
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：對eGFP具專一性之探針
<400> 1703
<210> 1704
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：對eGFP具專一性之探針
<400> 1704
<210> 1705
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：對eGFP具專一性之探針
<400> 1705
<210> 1706
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：對eGFP具專一性之探針
<400> 1706
<210> 1707
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：未經修飾之對照序列DI_A_2216,a single-stranded antisense DNA molecule
<220>
<221> misc_feature
<222> 1,2,15..19
<223> g is guanosine-5prime-phosphorothioate
<400> 1707
<210> 1708
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：未經修飾之對照序列DI_A_5167,a 結合膽固醇之siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> 21
<223> c為胞？-5prime-硫代磷酸酯
<220>
<221> misc_feature
<222> 22
<223> a為腺？-5prime-硫代磷酸酯
<400> 1708
<210> 1709
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：未經修飾之對照序列DI_A_5167，結合膽固醇之siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 終端u連結至膽固醇衍生物
<220>
<221> misc_feature
<222> 21
<223> u為尿？-5prime-硫代磷酸酯
<400> 1709
<210> 1710
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：引子P713
<400> 1710

Claims (20)

  1. 一種組合物，其包含iRNA製劑，該iRNA製劑包含第一股及第二股，其中該第一股及該第二股各自少於30個核苷酸之長度，且其中：a.該第一股之序列包含SEQ ID NO：223之核苷酸1-19的序列，及該第二股之序列包含SEQ ID NO：224之核苷酸1-19的序列；或b.該第一股之序列包含SEQ ID NO：527之核苷酸1-19的序列，及該第二股之序列包含SEQ ID NO：528之核苷酸1-19的序列；或c.該第一股之序列包含SEQ ID NO：1281之核苷酸1-19的序列，及該第二股之序列包含SEQ ID NO：1282之核苷酸1-19的序列。
  2. 如請求項1之組合物，其中該iRNA製劑包含使該iRNA製劑在生物樣本中具有增加之穩定性之修飾。
  3. 如請求項1之組合物，其中該iRNA製劑包含硫代磷酸酯或2'-經修飾之核苷酸。
  4. 如請求項1之組合物，其中該iRNA製劑包含：至少一個5'-尿苷-腺嘌呤-3'(5'-ua-3')二核苷酸，其中該尿苷為2'-經修飾之核苷酸；至少一個5'-尿苷-鳥嘌呤-3'(5'-ug-3')二核苷酸，其中該5'-尿苷為2'-經修飾之核苷酸；至少一個5'-胞苷-腺嘌呤-3'(5'-ca-3')二核苷酸，其中該5'-胞苷為2'-經修飾之核苷酸；或至少一個5'-尿苷-尿苷-3'(5'-uu-3')二核苷酸，其中該5'-尿苷為2'-經修飾之核苷酸。
  5. 如請求項1之組合物，其中該iRNA製劑包含選自由以下組成之群之2'-修飾：2'-脫氧基、2'-脫氧基-2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基 乙基(2'-O-MOE)、2'-O-胺基丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基胺基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基胺基丙基(2'-O-DMAP)、2'-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)及2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)。
  6. 如請求項1之組合物，其中該iRNA製劑係接合至一或多種診斷化合物、報導基團、交聯劑、核酸酶-抗性賦予部分、天然或不尋常核鹼基、親脂性分子、膽固醇、脂質、凝集素、類固醇、熊果醇(uvaol)、賀西格寧(hecigenin)、薯蕷皂素(diosgenin)、萜類、三萜、知母皂苷元(sarsasapogenin)、木栓酮(Friedelin)、表無羈萜醇衍生之石膽酸(epifriedelanol-derivatized lithocholic acid)、維生素、碳水化合物、葡聚糖、支鏈澱粉、甲殼素、聚葡萄胺糖、合成碳水化合物、寡乳酸酯15-mer、天然聚合物、低分子量或中等分子量聚合物、菊糖、環糊精、玻尿酸、蛋白質、蛋白結合藥劑、整合素標靶分子、聚陽離子劑、肽、多元胺、肽模擬物及/或轉移素。
  7. 一種組合物，其包含iRNA製劑，該iRNA製劑包含第一股及第二股，其中該第一股及該第二股各自少於30個核苷酸之長度，且其中該第一股及第二股之序列分別包含SEQ ID NOs：223及224之核苷酸1-19的序列。
  8. 如請求項7之組合物，其中該iRNA製劑包含硫代磷酸酯或2'-經修飾之核苷酸。
  9. 如請求項7之組合物，其中該iRNA製劑包含：至少一個5'-尿苷-腺嘌呤-3'(5'-ua-3')二核苷酸，其中該尿苷為2'-經修飾之核苷酸；至少一個5'-尿苷-鳥嘌呤-3'(5'-ug-3')二核苷酸，其中該5'-尿苷為2'-經修飾之核苷酸；至少一個5'-胞苷-腺嘌呤-3'(5'-ca-3')二核苷酸，其中該5'-胞苷為2'-經修飾之核苷酸；或至少一個5'-尿苷-尿 苷-3'(5'-uu-3')二核苷酸，其中該5'-尿苷為2'-經修飾之核苷酸。
  10. 一種組合物，其包含iRNA製劑，該iRNA製劑包含第一股及第二股，其中該第一股及該第二股各自少於30個核苷酸之長度，且其中該第一股及第二股之序列分別包含SEQ ID NOs：527及528之核苷酸1-19的序列。
  11. 如請求項10之組合物，其中該iRNA製劑包含硫代磷酸酯或2'-經修飾之核苷酸。
  12. 如請求項10之組合物，其中該iRNA製劑包含：至少一個5'-尿苷-腺嘌呤-3'(5'-ua-3')二核苷酸，其中該尿苷為2'-經修飾之核苷酸；至少一個5'-尿苷-鳥嘌呤-3'(5'-ug-3')二核苷酸，其中該5'-尿苷為2'-經修飾之核苷酸；至少一個5'-胞苷-腺嘌呤-3'(5'-ca-3')二核苷酸，其中該5'-胞苷為2'-經修飾之核苷酸；或至少一個5'-尿苷-尿苷-3'(5'-uu-3')二核苷酸，其中該5'-尿苷為2'-經修飾之核苷酸。
  13. 一種組合物，其包含iRNA製劑，該iRNA製劑包含第一股及第二股，其中該第一股及該第二股各自少於30個核苷酸之長度，且其中該第一股及第二股之序列分別包含SEQ ID NO：1281及1282之核苷酸1-19的序列。
  14. 如請求項13之組合物，其中該iRNA製劑包含硫代磷酸酯或2'-經修飾之核苷酸。
  15. 如請求項13之組合物，其中該iRNA製劑包含：至少一個5'-尿苷-腺嘌呤-3'(5'-ua-3')二核苷酸，其中該尿苷為2'-經修飾之核苷酸；至少一個5'-尿苷-鳥嘌呤-3'(5'-ug-3')二核苷酸，其中該5'-尿苷為2'-經修飾之核苷酸；至少一個5'-胞苷-腺嘌呤-3'(5'-ca-3')二核苷酸，其中該5'-胞苷為2'-經修飾之核苷酸；或至少一個5'-尿苷-尿苷-3'(5'-uu-3')二核苷酸，其中該5'-尿苷為2'-經修飾之核苷酸。
  16. 一種組合物，其包含針對α-ENaC之iRNA製劑，其中該iRNA製劑 包含第一股及第二股，其中該第一股及該第二股各自少於30個核苷酸之長度，且其中：a.該第一股之序列包含SEQ ID NO：223之核苷酸1-19的序列，及該第二股之序列包含SEQ ID NO：224之核苷酸1-19的序列；或b.該第一股之序列包含SEQ ID NO：527之核苷酸1-19的序列，及該第二股之序列包含SEQ ID NO：528之核苷酸1-19的序列；或c.該第一股之序列包含SEQ ID NO：1281之核苷酸1-19的序列，及該第二股之序列包含SEQ ID NO：1282之核苷酸1-19的序列，且其中該組合物另外包含上皮細胞受體配位體。
  17. 如請求項16之組合物，其中該上皮細胞受體配位體為(i)轉移素或(ii)葉酸。
  18. 一種組合物之用途，其係用於製備治療患有至少部分由α-ENaC表現所介導之病理學狀態之人類個體的藥物，其中該組合物包含iRNA製劑，該iRNA製劑包含第一股及第二股，其中該第一股及該第二股各自少於30個核苷酸之長度，且其中：a.該第一股之序列包含SEQ ID NO：223之核苷酸1-19的序列，及該第二股之序列包含SEQ ID NO：224之核苷酸1-19的序列；或b.該第一股之序列包含SEQ ID NO：527之核苷酸1-19的序列，及該第二股之序列包含SEQ ID NO：528之核苷酸1-19的序列；或c.該第一股之序列包含SEQ ID NO：1281之核苷酸1-19的序列，及該第二股之序列包含SEQ ID NO：1282之核苷酸1-19 的序列。
  19. 如請求項18之用途，其中該藥物係以足以降低該人類個體之細胞或組織中α-ENaC表現量的量投與。
  20. 如請求項18之用途，其中該人類個體患有選自由以下所組成之群之病理學狀態：囊腫性纖維化、原發性纖毛運動障礙、慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、呼吸道感染、肺癌瘤、利德爾(Liddles)症候群、高血壓、腎功能不全及電解質失衡。
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