TWI516597B

TWI516597B - 活性高度磷酸化人類ｎ－乙醯半乳糖胺－６－硫酸酯酶之製備及其用途

Info

Publication number: TWI516597B
Application number: TW100126060A
Authority: TW
Inventors: 費許科帕卡; 米契克拉德斐拉德; 奧古斯特Ｏ歐哈馬菲; 琪迪絲蒂艾拉雅
Original assignee: 拜奧馬林製藥公司
Priority date: 2011-07-22
Filing date: 2011-07-22
Publication date: 2016-01-11
Also published as: TW201305343A

Description

活性高度磷酸化人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶之製備及其用途

本發明係關於細胞及分子生物學及醫藥技術領域，特定言之係關於活性高度磷酸化人類溶酶體硫酸酯酶之製備及其在管理與溶酶體硫酸酯酶缺乏相關之溶酶體儲積疾病中的用途。特定言之，本發明係關於活性高度磷酸化重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之製備及其在管理黏多醣病(Mucopolysaccharidosis)IVa(MPS IVa或莫奎歐A症候群)及與GALNS缺乏相關之其他溶酶體儲積疾病中的用途。

溶酶體儲積疾病(LSDs)由細胞內為溶酶體中細胞廢物降解所必需之特定溶酶體酶缺乏所致。此等溶酶體酶之缺乏導致未降解之「儲積物質」在溶酶體內累積，由此導致溶酶體膨脹及功能障礙且最終導致細胞及組織損傷。許多溶酶體酶已經鑑別且與其相關疾病關聯。一旦缺失酶已經鑑別，治療即可簡化成高效傳遞替代酶至患者之受影響組織的單一問題。

一種治療溶酶體儲積疾病之方式為靜脈內酶替代療法(ERT)(Kakkis,Expert Opin. Investig. Drugs 11(5): 675-685,2002)。ERT利用血管結構將酶自單一投藥位點運送至大多數組織。一旦該酶廣泛分佈，其必須被吸收至細胞中。在溶酶體酶之獨特特徵中發現攝取至細胞中之基礎。溶酶體酶構成單獨的一類由處於末端甘露糖殘基之6-位置之磷酸酯界定的醣蛋白。甘露糖-6-磷酸酯以高親和力及特異性由可見於大多數細胞之表面上的受體結合(Munier-Lehmann 等人,Biochem. Soc. Trans. 24(1): 133-136,1996；Marnell等人,J. Cell. Biol. 99(6): 1907-1916,1984)。每條多肽鏈具有2個甘露糖-6-磷酸酯結合位點的甘露糖-6-磷酸酯受體(MPR)(Tong等人,J. Biol. Chem. 264:7962-7969,1989)引導酶自血液攝取至組織接著介導細胞內向溶酶體中的運送。

大規模產生溶酶體酶涉及在哺乳動物細胞株中表現。目標在於使重組酶主要分泌至周圍生長培養基中以供收集及下游加工。在用於大規模產生溶酶體酶之理想系統中，酶將經高效磷酸化接著主要被引向細胞表面(亦即，用於分泌)而非主要引向溶酶體。如上所述，磷酸化溶酶體酶之此分配與正常細胞中發生之情形完全相反。製備用於產生溶酶體酶之細胞株集中在將每莫耳酶之甘露糖-6-磷酸酯的含量最大化，但特徵在於比產率較低。產生含有高含量甘露糖-6-磷酸酯部分之溶酶體酶之活體外嘗試成敗參半(Canfield等人，美國專利第6,537,785號)。活體外酶展現高含量之甘露糖-6-磷酸酯以及高含量之未經修飾之末端甘露糖。甘露糖-6-磷酸酯與甘露糖受體之間對溶酶體酶之競爭使得高劑量酶為達成有效性所必需，且可導致對所治療個體之損害物的較大免疫原性。

硫酸酯酶構成獨特的一小類溶酶體酶。硫酸酯酶使硫酸酯自各種受質，包括例如類固醇、碳水化合物、蛋白聚糖及糖脂裂解。所有已知真核硫酸酯酶皆在其催化位點處含有半胱胺酸殘基。硫酸酯酶活性需要將此半胱胺酸殘基轉譯後修飾成C_α-甲醯甘胺酸(FGly)。半胱胺酸至FGly轉譯後酶活化緊接於轉譯之後，在硫酸酯酶靶向溶酶體之前，在內質網內在未摺疊硫酸酯酶上發生(Dierks等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11963-11968,1997)。催化此反應之甲醯甘胺酸產生酶為硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)。SUMF1中之導致溶酶體硫酸酯酶中FGly形成異常之突變會導致人類的多種硫酸酯酶缺乏症(Multiple Sulfatase Deficiency，MSD)強調此獨特轉譯後修飾之重要性(Diez-Ruiz等人,Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 6:355-379,2005)。

因此，溶酶體硫酸酯酶製劑之治療有效性視彼製劑中甘露糖-6-磷酸酯之含量及活性酶之存在而定。

因此，此項技術中對用於大規模製備治療有效之活性高度磷酸化溶酶體硫酸酯酶以管理由此等溶酶體硫酸酯酶缺乏引起或與之相關之溶酶體儲存病症的高效多產系統存有需要。

本發明係關於發現當內體酸化有缺陷之CHO-K1細胞株衍生物(稱為G71)經工程改造成表現重組人類硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)時，經修飾之G71細胞部分地藉由防止物質流失至製備用細胞株之溶酶體隔室中來產生高產率之活性高度磷酸化重組溶酶體硫酸酯酶。在一實施例中，本發明提供一種END3互補群細胞株，其共表現重組人類SUMF1與重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)，從而產生高產率之活性高度磷酸化酶。例示性細胞株為G71、G71S及其衍生物，該等衍生物保留G71之所要性質，亦即能夠產生高產率之活性高度磷酸化重組溶酶體硫酸酯酶。共表現重組人類SUMF1與重組溶酶體硫酸酯酶的END3互補群修飾之CHO-K1細胞株之此應用將尤其適用於製備欲用於藉由酶替代療法(ERT)來管理溶酶體儲積疾病之活性高度磷酸化溶酶體硫酸酯酶。

在第一態樣中，本發明特徵在於一種在END3互補群CHO細胞或其衍生物中產生能夠達成治療用途之量的活性高度磷酸化重組人類溶酶體硫酸酯酶或其生物活性片段、突變體、變異體或衍生物的新穎方法。在一寬泛實施例中，該方法包含以下步驟：(a)培養CHO衍生之END3互補群細胞或其衍生物：(b)製備能夠在CHO衍生之END3互補群細胞或其衍生物中表現活性高度磷酸化重組人類溶酶體硫酸酯酶或其生物活性片段、突變體、變異體或衍生物之第一哺乳動物表現載體；(c)製備能夠在CHO衍生之END3互補群細胞或其衍生物中表現重組人類硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)或其生物活性片段、突變體、變異體或衍生物之第二哺乳動物表現載體；(d)以第一及第二表現載體轉染CHO衍生之END3互補群細胞或其衍生物；(e)選擇及選殖表現活性高度磷酸化重組人類溶酶體硫酸酯酶或其生物活性片段、突變體、變異體或衍生物的CHO衍生之END3互補群細胞或其衍生物之轉染物；及(f)使用於製備高度磷酸化重組人類溶酶體硫酸酯酶或其生物活性片段、突變體、變異體或衍生物之細胞培養加工方法最優化。重組人類溶酶體硫酸酯酶係選自由以下組成之群：芳基硫酸酯酶A(ARSA)、芳基硫酸酯酶B(ARSB)、艾杜糖醛酸(iduronate)-2-硫酸酯酶(IDS)、磺醯胺酶(sulfamidase)/肝素(heparin)-N-硫酸酯酶(SGSH)、N-乙醯葡糖胺-硫酸酯酶(G6S)及N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。

該方法涉及以下步驟：將編碼所有或部分溶酶體硫酸酯酶之cDNA及編碼所有或部分人類SUMF1之cDNA轉染至CHO衍生之END3互補群細胞或其衍生物中。在一些實施例中，將分別能夠表現編碼活性高度磷酸化重組人類溶酶體硫酸酯酶及人類SUMF1之第一及第二表現載體同時轉染至CHO衍生之END3互補群細胞或其衍生物中。在一些實施例中，將第一及第二表現載體依序轉染至CHO衍生之END3互補群細胞或其衍生物中。在一些實施例中，使用編碼全長人類溶酶體硫酸酯酶之cDNA，而在其他實施例中，使用編碼其生物活性片段、突變體、變異體或衍生物之cDNA。在一些實施例中，使用編碼全長人類SUMF1之cDNA，而在其他實施例中，使用編碼其生物活性片段、突變體、變異體或衍生物之cDNA。在一些實施例中，使用多個表現載體將人類溶酶體硫酸酯酶及人類SUMF1 cDNA同時或依序轉移至CHO衍生之END3互補群細胞或其衍生物中。在一些實施例中，使用單個表現載體將人類溶酶體硫酸酯酶及人類SUMF1 cDNA同時轉移至CHO衍生之END3互補群細胞或其衍生物中。在一較佳實施例中，CHO衍生之END3互補群細胞或其衍生物為G71細胞株、G71S細胞株，或G71或G71S衍生物。

在一較佳實施例中，該方法包含自END3互補群CHO細胞株或其衍生物產生活性高度磷酸化重組人類溶酶體硫酸酯酶，例如芳基硫酸酯酶A(ARSA)、芳基硫酸酯酶B(ARSB)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、磺醯胺酶/肝素-N-硫酸酯酶(SGSH)、N-乙醯葡糖胺-硫酸酯酶(G6S)或N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。在一尤其較佳實施例中，該方法包含自END3互補群CHO細胞株或其衍生物產生活性高度磷酸化重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。END3互補群細胞株為保留END3互補群細胞株性質(諸如內體酸化有缺陷)之任何經修飾的CHO細胞株。在一較佳實施例中，CHO衍生之END3互補群細胞或其衍生物為G71細胞株、G71S細胞株，或G71或G71S衍生物。

在第二態樣中，本發明提供一種內體酸化缺乏的哺乳動物細胞株，其特徵在於其能夠產生能夠達成溶酶體硫酸酯酶之治療性使用之量的活性高度磷酸化重組人類溶酶體硫酸酯酶。在較佳實施例中，本發明提供稱為G71、G71S或其衍生物之CHO-K1衍生之END3互補群細胞株，其能夠產生高產率之活性高度磷酸化重組人類溶酶體硫酸酯酶，藉此能夠達成此等治療性溶酶體硫酸酯酶之大規模產生。在更佳實施例中，細胞株以至少約0.5皮克/細胞/天、較佳至少約0.75皮克/細胞/天、更佳至少約1.0皮克/細胞/天且甚至更佳至少約1.25皮克/細胞/天之量表現且分泌重組人類溶酶體硫酸酯酶。

END3互補群細胞株為保留END3互補群細胞株性質(諸如內體酸化有缺陷)之任何經修飾的CHO細胞株。在一實施例中，END3互補群CHO細胞株衍生自G71或其衍生物且包含(a)重組人類硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)之表現載體及(b)重組人類溶酶體硫酸酯酶之表現載體，其中該重組人類溶酶體硫酸酯酶係選自由以下組成之群：芳基硫酸酯酶A(ARSA)、芳基硫酸酯酶B(ARSB)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、磺醯胺酶/肝素-N-硫酸酯酶(SGSH)、N-乙醯葡糖胺-硫酸酯酶(G6S)及N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。在一較佳實施例中，END3互補群CHO細胞株包含重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之表現載體。在一更佳實施例中，END3互補群CHO細胞株表現且分泌重組人類GALNS。在另一較佳實施例中，END3互補群CHO細胞株係選自由以下組成之群：純系4、純系5、純系C6、純系C2、純系C5、純系C7、純系C10、純系C11及純系C30。在一更佳實施例中，END3互補群CHO細胞株為純系C2。在另一較佳實施例中，END3互補群CHO細胞株適於在懸浮液中生長。

在第三態樣中，本發明提供根據本發明方法產生且藉此以能夠達成溶酶體硫酸酯酶之治療性使用之量存在的重組人類溶酶體硫酸酯酶。溶酶體硫酸酯酶可為全長蛋白質或其片段、突變體、變異體或衍生物。在一些實施例中，必要時可對本發明之溶酶體硫酸酯酶或其片段、突變體、變異體或衍生物進行修飾以增強其穩定性或藥物動力學性質(例如聚乙二醇化、突變誘發、融合、結合)。在較佳實施例中，酶為人類溶酶體硫酸酯酶、人類溶酶體硫酸酯酶之具有天然硫酸酯酶之生物活性的片段、或與人類溶酶體硫酸酯酶具有實質性胺基酸序列同源性的多肽。在一些實施例中，溶酶體硫酸酯酶為源於或衍生自人類或哺乳動物序列之蛋白質。在其他實施例中，溶酶體硫酸酯酶為其缺乏會導致諸如以下人類疾病之酶：異染性腦白質營養不良(Metachromic Leukodystrophy)或MLD(亦即芳基硫酸酯酶A(ARSA))、馬拉二氏症候群(Maroteaux-Lamy syndrome)或MPSVI(亦即芳基硫酸酯酶B(ARSB))、亨特症候群(Hunter syndrome)或MPS II(亦即艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS))、聖菲利柏(Sanfilippo)A症候群或MPS IIIa(亦即磺醯胺酶/肝素-N-硫酸酯酶(SGSH))、聖菲利柏D症候群或MPS IIId(亦即N-乙醯葡糖胺-硫酸酯酶(G6S))及莫奎歐A症候群或MPS IVa(亦即，N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS))。在一尤其較佳實施例中，溶酶體硫酸酯酶為其缺乏會導致莫奎歐A症候群或MPS IVa之酶(亦即N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS))。在另一尤其較佳實施例中，溶酶體硫酸酯酶為其缺乏與諸如多種硫酸酯酶缺乏症或MSD之人類疾病相關的酶(亦即N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS))。

溶酶體硫酸酯酶亦可源於或衍生自人類或哺乳動物序列。在本發明之其他實施例中，在其各態樣中，溶酶體硫酸酯酶之胺基酸序列與人類或哺乳動物溶酶體硫酸酯酶胺基酸序列之相應部分一致。在其他實施例中，多肽部分為來自人類或哺乳動物之天然溶酶體硫酸酯酶。在其他實施例中，溶酶體硫酸酯酶多肽在至少約25、50、100、150或200個胺基酸之長度或整個多肽長度範圍內與人類或哺乳動物酶之天然溶酶體硫酸酯酶胺基酸序列實質上同源(亦即胺基酸序列一致性為至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)。在一些實施例中，溶酶體硫酸酯酶為人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。人類GALNS之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO: 4中，其中胺基酸27至522對應於分泌性前驅蛋白。在一些實施例中，此GALNS酶包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 4之胺基酸27至522至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列；或與SEQ ID NO: 4之胺基酸27至522一致之序列。GALNS酶較佳保留對應於在分泌性前驅蛋白之位置53處的Cys(SEQ ID NO: 4之胺基酸79)之催化位點胺基酸，其能夠轉化成C_α-甲醯甘胺酸。GALNS酶亦可在活性位點空腔中保留其他胺基酸，包括至少1、2、3、4、5、6、7、8或所有帶電荷胺基酸：Asp288、Asn289、Asp39、Asp54、His236、Lys140、His142、Lys310及α螺旋：Arg83。Sukegawa,Human Molecular Genetics,2000,第9卷，第9期1283-1290，以全文引用的方式併入本文中，其描述使患者之GALNS活性降低之其他突變且將各種突變之嚴重性與其在酶內之各別3維位置相關聯。在其他實施例中，溶酶體硫酸酯酶所投與之個體為人類。

在較佳實施例中，溶酶體硫酸酯酶為由內體酸化缺乏的細胞株(例如CHO衍生之END3互補群細胞株)產生之高度磷酸化重組人類溶酶體硫酸酯酶。END3互補群細胞株為保留END3互補群細胞株性質(諸如內體酸化有缺陷)之任何經修飾的CHO細胞株。在一較佳實施例中，CHO衍生之END3互補群細胞或其衍生物為G71細胞株、G71S細胞株，或G71或G71S衍生物。或者，溶酶體硫酸酯酶可由在允許高度磷酸化重組溶酶體硫酸酯酶以相對較高產率，例如以至少約0.5皮克/細胞/天、至少約0.75皮克/細胞/天、至少約1.0皮克/細胞/天或至少約1.25皮克/細胞/天之量表現及分泌之條件下培養的任何宿主細胞，例如任何CHO細胞或CHO細胞衍生之株系產生。

在更佳實施例中，重組人類溶酶體硫酸酯酶具有高含量磷酸化寡醣(亦即每條蛋白質鏈大於約0.25條、較佳大於0.5條且更佳大於約0.75條雙磷酸化寡甘露糖鏈)。

在一些實施例中，本發明提供一種具有指定高含量磷酸化寡醣之重組人類溶酶體硫酸酯酶，例如GALNS。舉例而言，溶酶體硫酸酯酶具有每條單體蛋白質鏈0.5至1.0條雙磷酸化寡甘露糖鏈、或每條單體蛋白質鏈0.5至0.9條雙磷酸化寡甘露糖鏈、或每條單體蛋白質鏈0.5至0.8條雙磷酸化寡甘露糖鏈、或每條單體蛋白質鏈0.5至0.75條雙磷酸化寡甘露糖鏈、或每條單體蛋白質鏈0.54至0.75條雙磷酸化寡甘露糖鏈。涵蓋其他類似範圍，例如每條單體蛋白質鏈至少0.4、0.45、0.5、0.55、0.6或0.65條雙磷酸化寡甘露糖鏈，至多每條單體蛋白質鏈0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、0.98或1.0條雙磷酸化寡甘露糖鏈，或任何此等數目之任何組合。在較佳實施例中，酶為重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)，例如SEQ ID NO: 4之N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶。

在一些實施例中，重組人類溶酶體硫酸酯酶具有活性位點半胱胺酸殘基向C_α-甲醯甘胺酸(FGly)轉化的高百分比(亦即至少約50%、55%、60%或65%，較佳至少約70%、75%、80%、85%、90%或95%)。在較佳實施例中，酶為活性重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)且活性位點半胱胺酸殘基為在位置53(SEQ ID NO: 4之位置79)之Cys。

在特定實施例中，重組人類溶酶體硫酸酯酶具有高含量磷酸化寡醣，例如本文所述之每條單體蛋白質鏈任何範圍或含量之雙磷酸化寡甘露糖鏈；以及活性位點半胱胺酸殘基向C_α-甲醯甘胺酸(FGly)轉化之高百分比，例如本文所述之任何百分比。在較佳實施例中，酶為活性高度磷酸化重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)，例如SEQ ID NO: 4之N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶。

在任何前述實施例中，如在還原條件下進行SDS-PAGE時藉由庫馬斯藍(Coomassie Blue)染色或藉由SDS-毛細管凝膠電泳(SDS-CGE)所測定，至少99.5%、至少99%、至少98.5%、至少98%、至少97%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%或至少65%之重組人類溶酶體硫酸酯酶(例如GALNS(SEQ ID NO: 4))係呈前驅體形式。

此外，例如GALNS(SEQ ID NO: 4)之溶酶體硫酸酯酶視情況亦展現大於在不表現重組人類SUMF1之宿主細胞(例如CHO細胞或CHO衍生之細胞)中產生之具有相同胺基酸序列的對照溶酶體硫酸酯酶之比活性至少約30%(例如35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍或50倍)的比活性。

在任何前述實施例中，例如GALNS(SEQ ID NO: 4)之所述溶酶體硫酸酯酶展現至纖維母細胞中之比攝取量(specific uptake)(Kuptake)為約0.1至10 n M、或約0.1至7 nM、或約0.5至5 nM、或約1至5 nM、或約1至3.5 nM、約1 nM、約1.5 nM、約2 nM、約2.5 nM、約3 nM或約3.5 nM、或任何此等數目之任何組合。

在任何前述實施例中，至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%或至少約80%之重組人類溶酶體硫酸酯酶(例如GALNS(SEQ ID NO: 4)結合甘露糖-6-磷酸酯受體管柱。

根據此態樣，提供溶酶體硫酸酯酶之任何此等實施例之純化製劑，其中如在非還原條件下進行SDS-PAGE時藉由庫馬斯藍染色或藉由另一測定純度之方法(例如在還原或非還原條件下進行SDS-PAGE，隨後用庫馬斯藍或銀染色；或藉由HPLC(包括C4逆相(RP)或C3RP)或尺寸排阻層析(SEC)進行層析分離，)所測定，例如GALNS(SEQ ID NO: 4)之溶酶體硫酸酯酶組分具有至少約90%、95%、97%、98%或99%的純度。在一些實施例中，如在還原條件下進行SDS-PAGE時藉由庫馬斯藍染色或藉由另一偵測前驅體之方法(例如在還原條件下進行SDS-PAGE，以庫馬斯藍或銀染色；或藉由HPLC(例如C4逆相(RP)、C3RP)或尺寸排阻層析(SEC)進行層析分離；或電泳分離與層析分離之組合，例如依次進行SDS-PAGE及毛細管凝膠電泳(SDS-CGE))所測定，純化製劑之顯著量之溶酶體硫酸酯酶組分係呈分泌性前驅體形式(例如至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、98.5%、99%或99.5%前驅體)。

在特定實施例中，純化製劑之溶酶體硫酸酯酶組分具有高含量磷酸化寡醣，例如本文所述之每條單體蛋白質鏈任何範圍或含量之雙磷酸化寡甘露糖鏈；以及活性位點半胱胺酸殘基向C_α-甲醯甘胺酸(FGly)轉化的高百分比，例如本文所述之任何百分比。在更特定實施例中，純化製劑具有如本文所述之Kuptake。

在相關態樣中，本發明提供含有本文所述之任何溶酶體硫酸酯酶或純化製劑、以及無菌醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑及/或賦形劑的無菌組合物。此等無菌組合物可採用溶液或視情況於小瓶中之可藉由添加無菌稀釋劑復原之凍乾粉末形式。

在第四態樣中，本發明提供一種純化由本發明方法產生之重組人類溶酶體硫酸酯酶的方法。在一較佳實施例中，使用兩管柱方法(染料-配位體層析，例如藍色-瓊脂糖凝膠(Blue-Sepharose)；及陽離子交換層析，例如SE Hi-Cap)來純化溶酶體硫酸酯酶，該方法包含至少五個純化步驟：(1)過濾收集物，亦即表現人類硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)及重組人類溶酶體硫酸酯酶之END3互補群CHO細胞株或其衍生物之培養基；(2)將經過濾之收集物之pH值調整至pH 4.5(以誘導污染性蛋白質沈澱)；(3)將經pH值調整之經過濾收集物裝載於染料-配位體管柱(例如藍色-瓊脂糖凝膠管柱)上，洗滌該管柱且自該管柱溶離溶酶體硫酸酯酶；(4)將來自染料-配位體管柱之溶離液裝載於陽離子交換管柱(例如SE Hi-Cap管柱)上，洗滌該管柱且自該管柱溶離溶酶體硫酸酯酶；及(5)超濾且透濾來自陽離子交換之溶離液。視情況，藉由超濾將步驟(1)中過濾之收集物濃縮10-20倍，隨後調整pH值。視情況，在調配緩衝液中調配步驟(5)中經超濾及透濾之溶酶體硫酸酯酶。在一尤其較佳實施例中，溶酶體酶為重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。

在另一較佳實施例中，使用三管柱方法(捕捉層析，例如陽離子交換SE Hi-Cap；中間層析，例如染料-配位體Capto Blue、鋅螯合瓊脂糖凝膠FF或Capto Adhere；及精製(polishing)層析，例如ToyoPearl丁基650M、苯基瓊脂糖凝膠Hi-Sub或苯基瓊脂糖凝膠Low-Sub)來純化溶酶體硫酸酯酶，該方法包含至少五個純化步驟：(1)藉由例如Sartocon卡匣(Cassettes)(30 kDa，Hydrosart)超濾收集物，亦即表現人類硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)及重組人類溶酶體硫酸酯酶之END3互補群CHO細胞株或其衍生物之培養基；(2)將經過濾之收集物之pH值調整至pH 4.5(以誘導污染性蛋白質沈澱)；(3)將經pH值調整之經過濾收集物裝載於捕捉管柱(例如Fractogel EMD SE Hi-CAP(M)陽離子交換管柱)上，洗滌該管柱且自該管柱溶離溶酶體硫酸酯酶；(4)將來自捕捉管柱之溶離液裝載於中間管柱(例如染料-配位體Capto Blue、鋅螯合瓊脂糖凝膠FF或Capto Adhere)上，洗滌該管柱且自該管柱溶離溶酶體硫酸酯酶；及(5)將該溶離液裝載於精製管柱(例如ToyoPearl丁基650M、苯基瓊脂糖凝膠Hi-Sub或苯基瓊脂糖凝膠Low-Sub)上，洗滌該管柱且自該管柱溶離溶酶體硫酸酯酶。在調配緩衝液中調配來自步驟(5)之經溶離溶酶體硫酸酯酶。視情況，超濾來自步驟(5)之經溶離溶酶體硫酸酯酶接著調配於調配緩衝液中。視情況，使來自步驟(4)中之管柱之溶酶體硫酸酯酶暴露於pH 3.5之環境以達成低pH值病毒不活化，隨後裝載於步驟(5)中之精製管柱上。在一尤其較佳實施例中，溶酶體硫酸酯酶為重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。

在另一較佳實施例中，溶酶體硫酸酯酶係使用經設計以減少溶酶體硫酸酯酶之蛋白水解消化(亦即剪切(clipping))的不同三管柱方法(捕捉或固定金屬親和力層析(IMAC)，例如染料-配位體Capto Blue、鋅螯合瓊脂糖凝膠FF或Capto Adhere；中間層析，例如Fractogel EMD SE Hi-Cap陽離子交換；及精製層析，例如ToyoPearl丁基650M、苯基瓊脂糖凝膠Hi-Sub或苯基瓊脂糖凝膠Low-Sub)純化，該方法包含至少六個純化步驟：(1)過濾收集物，亦即表現人類硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)及重組人類溶酶體硫酸酯酶之哺乳動物細胞株，例如END3互補群CHO細胞株或其衍生物之培養基，經過濾之收集物藉由例如Sartocon卡匣(30 kDa，Hydrosart)超濾/透濾，產生濃縮過濾收集物，例如20倍濃縮，及木炭過濾該濃縮過濾收集物；(2)將經木炭過濾之濃縮收集物裝載於捕捉或IMAC管柱(例如染料-配位體Capto Blue、鋅螯合瓊脂糖凝膠FF或Capto Adhere)上，在使溶酶體硫酸酯酶保留在捕捉管柱上之條件下洗捕捉管柱，且自捕捉管柱溶離溶酶體硫酸酯酶；(3)視情況，用過濾器(例如Mustang Q過濾器)過濾捕捉管柱之溶離液以移除病毒；(4)調整捕捉管柱之溶離液或經過濾溶離液之pH至酸性pH，例如pH 4.5±0.1，接著過濾捕捉管柱之經調整為酸性pH之溶離液或經過濾溶離液；(5)將捕捉管柱之經過濾經調整為酸性pH之溶離液或經過濾溶離液裝載於中間管柱(例如Fractogel EMD SE Hi-CAP陽離子交換管柱)上，在使溶酶體硫酸酯酶保留在中間管柱上之條件下洗中間管柱，且自中間管柱溶離溶酶體硫酸酯酶；(6)調整中間管柱之溶離液之pH至低pH(例如pH 3.5±0.1)以使病毒不活化；及(7)將中間陽離子交換管柱之低pH病毒不活化的溶離液裝載於精製管柱(例如疏水性相互作用層析(HIC)管柱，例如ToyoPearl丁基650M、苯基瓊脂糖凝膠Hi-Sub或苯基瓊脂糖凝膠Low-Sub)上，在使溶酶體硫酸酯酶保留在精製管柱上之條件下洗精製管柱，且自精製管柱溶離溶酶體硫酸酯酶。在一個較佳實施例中，純化製程中包括步驟(3)。在另一較佳實施例中，純化製程中省略步驟(3)。視情況，(8)將步驟(7)之經溶離溶酶體硫酸酯酶經緩衝液交換至調配物中，例如包括(但不限於)本文所述之調配物，諸如20 mM NaOAc/HOAc、50 mM NaH₂PO₄、30 mM精胺酸HCl、2%(w/v)山梨糖醇(pH 5.4)，且將調配物中經溶離溶酶體硫酸酯酶之濃度調整至適當濃度，例如3 mg/ mL；(9)藉由經病毒過濾器及DNA過濾器過濾來移除存在經純化溶酶體硫酸酯酶之調配物中之任何殘餘病毒及DNA；及(10)非離子界面活性劑，例如聚山梨醇酯20(PS20或Tween-20)添加至經純化溶酶體硫酸酯酶之調配物中。經純化溶酶體硫酸酯酶之最終調配物(散裝藥物)儲存在2-8℃或冷凍。在一尤佳實施例中，純化製程中包括步驟(8)至(10)。在一尤佳實施例中，溶酶體硫酸酯酶為重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。

在一些實施例中，在步驟(1)中在約6.5之pH值下收集收集物。在一些實施例中，步驟(1)中之木炭過濾器為Zeta Plus R55活性碳過濾器。在一些實施例中，步驟(2)中之捕捉管柱為Zn-IMAC管柱。在一些實施例中，Zn-IMAC管柱為Zn螯合瓊脂糖凝膠FF管柱。在一些實施例中，步驟(3)中之過濾器為Mustang Q過濾器。在一些實施例中，來自步驟(2)或(3)之溶離液或經過濾溶離液之酸性pH值在步驟(4)中調整至約4.5±0.1。在一些實施例中，步驟(5)中之中間管柱為陽離子交換管柱。在一些實施例中，陽離子交換管柱為Fractogel EMD SE Hi-Cap管柱。在一些實施例中，步驟(6)之來自中間管柱之溶離液的低pH值在步驟(6)中調整至約3.5±0.1。在一些實施例中，步驟(7)中之精製管柱為疏水性相互作用層析(HIC)管柱。在一些實施例中，HIC管柱為ToyoPearl丁基650M管柱。

在一些實施例中，調配物包含20 mM NaOAc/HOAc、50 mM NaH₂PO₄、30 mM精胺酸HCl、2%(w/v)山梨糖醇(pH 5.4)。在一些實施例中，非離子界面活性劑為聚山梨醇酯20(PS20)。在一些實施例中，調配物中溶酶體硫酸酯酶之濃度調整至約3 mg/mL。在一些實施例中，病毒過濾器為DV20過濾器且DNA過濾器為Mustang Q過濾器。在一些實施例中，添加至調配物中之非離子界面活性劑為聚山梨醇酯20(PS20)，最終濃度為0.01%(w/v)。

在第五態樣中，本發明提供一種活性高度磷酸化重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)或其生物活性突變體、變異體或衍生物之純化製劑，其適用於治療罹患由GALNS酶缺乏引起(例如第IVa型黏多醣病(MPS IVa)或莫奎歐A症候群)或與GALNS酶缺乏相關(例如多種硫酸酯酶缺乏症(MSD))之溶酶體儲積疾病的個體。在一較佳實施例中，活性高度磷酸化重組人類GALNS之純化製劑具有GALNS酶組分，其具有(a)至少約90%、95%、97%、98%或99%之純度，如在非還原條件下進行SDS-PAGE時藉由庫馬斯藍染色或銀染色所測定；(b)位置53之半胱胺酸殘基向C_a-甲醯甘胺酸(FGly)(SEQ ID NO: 4之位置79)至少約80%、85%、90%或95%之轉化率；(c)在位置178及397之天冬醯胺殘基之N-連接糖基化，其中與位置178之天冬醯胺殘基連接之一些寡甘露糖鏈經雙磷酸化；(d)每條單體蛋白質鏈0.5至1.0、或0.5至0.9、或0.5至0.8、或0.5至0.75、或0.54至0.75條雙磷酸化寡甘露糖鏈(例如每條單體蛋白質鏈至少0.4、0.45、0.5、0.55、0.6或0.65且多達0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、0.98或1.0條雙磷酸化寡甘露糖鏈、或任何此等數目之任何組合)；及(e)至少65%或至少70%(例如至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、98.5%、99%或99.5%)之GALNS酶係呈前驅體形式，如在還原條件下進行SDS-PAGE時藉由庫馬斯藍染色或藉由SDS-毛細管凝膠電泳(SDS-CGE)所測定。此外，GALNS酶可視情況亦(f)展現大於在不表現重組人類SUMF1之宿主細胞(例如CHO細胞或CHO衍生之細胞)中產生之具有相同胺基酸序列的對照GALNS酶之比活性至少約30%(例如35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍或50倍)的比活性。視情況，GALNS酶展現至纖維母細胞中之比攝取量(Kuptake)為約0.1至10 nM、或約0.1至7 nM、或約0.5至5 nM、或約1至5 nM、或約1至3.5 nM、約1 nM、約1.5 nM、約2 nM、約2.5 nM、約3 nM或約3.5 nM、或任何此等數目之任何組合。

在還原條件下進行SDS-PAGE時或如藉由SDS-CGE所測定，經純化活性高度磷酸化重組人類GALNS由以下組成：約55-60 kDa之主帶(亦即佔可見蛋白質至少約75%、或至少80%、較佳至少約85%、更佳至少約90%、且甚至更佳至少約95%、至少97%、至少98%、至少98.5%、至少99%或至少99.5%之前驅體人類GALNS)及在約39 kDa及約19 kDa之次帶(亦即佔可見蛋白質小於約25%、小於約20%、較佳小於約15%、更佳小於約10%、且甚至更佳小於約5%、小於約3%、小於約2%、小於約1.5%、小於約1%或小於約0.5%之成熟或經加工人類GALNS)。在一尤其較佳實施例中，在還原條件下進行SDS-PAGE時或如藉由SDS-CGE所測定，經純化活性高度磷酸化重組人類GALNS基本上由以下組成：約55-60 kDa之單一帶(亦即前驅體人類GALNS)。在一實施例中，經純化活性高度磷酸化重組人類GALNS適用於治療MPS IVa或莫奎歐A症候群。在一實施例中，經純化活性高度磷酸化重組人類GALNS適用於治療MSD。

在第六態樣中，本發明提供一種治療完全或部分由溶酶體硫酸酯酶缺乏引起或與溶酶體硫酸酯酶缺乏相關之疾病的方法。該方法包含投與由本發明方法產生之治療性重組人類溶酶體硫酸酯酶，其中該溶酶體硫酸酯酶與MPR受體結合且跨越細胞膜輸送，進入細胞中且傳遞至細胞內之溶酶體。

在一實施例中，該方法包含治療罹患溶酶體硫酸酯酶缺乏症之個體，其包含向有需要之個體投與治療有效量之該溶酶體硫酸酯酶，其中該溶酶體硫酸酯酶為由CHO衍生之END3互補群細胞或其衍生物產生之重組人類溶酶體硫酸酯酶或其生物活性片段、突變體、變異體或衍生物。在一些實施例中，該方法包含單獨或與醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑組合投與治療性重組人類溶酶體硫酸酯酶或其生物活性片段、突變體、變異體或衍生物。較佳實施例包括針對待治療個體(較佳哺乳動物且最佳人類)之需要來最優化劑量以最有效地改善溶酶體硫酸酯酶缺乏症。

此等治療性溶酶體硫酸酯酶尤其適用於例如治療罹患由溶酶體硫酸酯酶缺乏引起之溶酶體儲積疾病的患者，諸如罹患異染性腦白質營養不良或MLD、第VI型黏多醣病(MPS VI)或馬拉二氏症候群、第II型黏多醣病(MPS II)或亨特症候群、第IIIa型黏多醣病(MPS IIIa)或聖菲利柏A症候群、第IIId型黏多醣病(MPS IIId)或聖菲利柏D症候群及第IVa型黏多醣病(MPS IVa)或莫奎歐A症候群之患者。在一尤其較佳實施例中，溶酶體儲積疾病為MPS IVa或莫奎歐A症候群且溶酶體硫酸酯酶為重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。在其他實施例中，本發明亦提供包含引起溶酶體儲積疾病之缺乏的溶酶體硫酸酯酶及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑的醫藥組合物。

在另一實施例中，該方法包含治療罹患與一或多種溶酶體硫酸酯酶缺乏相關之溶酶體儲積疾病之個體，該治療包含向有需要之個體投與治療有效量之溶酶體硫酸酯酶，其中該溶酶體硫酸酯酶為由CHO衍生之END3互補群細胞或其衍生物產生之重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)或其生物活性片段、突變體、變異體或衍生物。在一些實施例中，該方法包含單獨或與醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑組合投與治療性重組人類GALNS酶或其生物活性片段、突變體、變異體或衍生物。在一尤其較佳實施例中，溶酶體儲積疾病為多種硫酸酯酶缺乏症(MSD)。

在尤其較佳實施例中，CHO衍生之END3互補群細胞或其衍生物為G71細胞株、G71S細胞株，或其G71或G71S衍生物。

在另一實施例中，本發明提供一種酶替代療法之方法，該方法係藉由向需要該酶替代療法之個體投與治療有效量之溶酶體硫酸酯酶來達成，其中患者之細胞具有含有不足以防止或減少對細胞之損害之量的溶酶體硫酸酯酶之溶酶體，藉此足以防止或減少對細胞之損害之量的溶酶體硫酸酯酶進入溶酶體中。細胞可在CNS之內或之外或無需由毛細管壁與血液分開，該等毛細管壁之內皮細胞藉由緊密接合而緊密密封以防止活性劑擴散。

在一特定實施例中，本發明提供包含具有生物活性之活性重組人類溶酶體硫酸酯酶之組合物及醫藥組合物，該活性重組人類溶酶體硫酸酯酶在目標溶酶體中減少、缺乏或不存在，且被投與個體。較佳活性人類溶酶體硫酸酯酶包括(但不限於)芳基硫酸酯酶A、芳基硫酸酯酶B、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、磺醯胺酶/乙醯肝素-N-硫酸酯酶、N-乙醯葡糖胺-6-硫酸酯酶及N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶。在一較佳實施例中，N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶為活性重組人類溶酶體硫酸酯酶。

在一較佳實施例中，本發明提供一種藉由向罹患MPS IVa或莫奎歐A症候群或MSD之個體投與治療有效量之本文所述之任何重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)、純化製劑及/或無菌組合物來治療該個體的方法。

在一更佳實施例中，本發明提供一種藉由向罹患MPS IVa或莫奎歐A症候群或MSD之個體投與治療有效量之由END3互補群細胞產生之重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)來治療該個體的方法，其中該重組人類GALNS之活性位點半胱胺酸殘基向C_α-甲醯甘胺酸(FGly)之轉化程度較高(亦即至少約50%、較佳至少約70%、更佳至少約90%，甚至更佳至少約95%轉化率)且該重組人類GALNS之磷酸化程度較高(亦即每條蛋白質鏈大於約0.25條、較佳大於0.5條且更佳大於約0.75條雙磷酸化寡甘露糖鏈)。

在一尤其較佳實施例中，本發明提供一種藉由向罹患MPS IVa或莫奎歐A症候群或MSD之個體投與治療有效量之具有GALNS酶組分之經純化活性高度磷酸化重組人類GALNS製劑來治療該個體的方法，該GALNS酶組分具有：(a)至少約90%、95%、97%、98%或99%之純度，如在非還原條件下進行SDS-PAGE時藉由庫馬斯藍染色或銀染色所測定；(b)位置53之半胱胺酸殘基向C_α-甲醯甘胺酸(FGly)(SEQ ID NO: 4之位置79)至少約80%、85%、90%或95%之轉化率；(c)每條單體蛋白質鏈0.5至1.0、或0.5至0.9、或0.5至0.8、或0.5至0.75、或0.54至0.75條雙磷酸化寡甘露糖鏈(例如每條單體蛋白質鏈至少0.4、0.45、0.5、0.55、0.6或0.65且至多0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、0.98或1.0條雙磷酸化寡甘露糖鏈、或任何此等數目之任何組合)；及(d)至少65%或至少70%(例如至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、98.5%、99%或99.5%)之GALNS酶係呈前驅體形式，如在還原條件下進行SDS-PAGE時藉由庫馬斯藍染色或藉由SDS-毛細管凝膠電泳(SDS-CGE)所測定。此外，GALNS酶可視情況亦(e)展現大於在不表現重組人類SUMF1之宿主細胞(例如CHO細胞或CHO衍生之細胞)中產生之具有相同胺基酸序列的對照GALNS酶之比活性至少約30%(例如35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍或50倍)的比活性。視情況，GALNS酶展現至纖維母細胞中之比攝取量(Kuptake)為約0.1至10 nM、或約0.1至7 nM、或約0.5至5 nM、或約1至5 nM、或約1至3.5 nM、約1 nM、約1.5 nM、約2 nM、約2.5 nM、約3 nM或約3.5 nM、或任何此等數目之任何組合。

在還原條件下進行SDS-PAGE時或如藉由SDS-CGE所測定，經純化活性高度磷酸化重組人類GALNS由以下組成：約55-60 kDa之主帶(亦即佔可見蛋白質至少約75%、或至少約80%、較佳至少約85%、更佳至少約90%、且甚至更佳至少約95%、至少約97%、至少約98%、至少約98.5%、至少約99%或至少約99.5%之前驅體人類GALNS)及在約39 kDa及約19 kDa之次帶(亦即佔可見蛋白質小於約25%、或小於約20%、較佳小於約15%、更佳小於約10%、且甚至更佳小於約5%、小於約3%、小於約2%、小於約1.5%、小於約1%或小於約0.5%之成熟或經加工人類GALNS)。在還原條件下進行SDS-PAGE時或如藉由SDS-CGE所測定，在一更尤其較佳實施例中，經純化活性高度磷酸化重組人類GALNS基本上由約55-60 kDa之單一帶(亦即前驅體人類GALNS)組成。

在一些實施例中，個體罹患MPS IVa或莫奎歐A症候群。在一些實施例中，個體罹患MSD。

亦涵蓋較佳藉由本發明方法產生的本發明之活性高度磷酸化溶酶體硫酸酯酶在製備用於治療上述溶酶體儲積疾病之藥劑中的相應用途。

在第七態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含如上文所描述之適用於治療完全或部分由此溶酶體硫酸酯酶缺乏引起或與此溶酶體硫酸酯酶缺乏相關之疾病的活性高度磷酸化重組人類溶酶體硫酸酯酶，及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。在一較佳實施例中，該醫藥組合物包含藉由本發明方法產生的活性高度磷酸化重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)或其生物活性片段、突變體、變異體或衍生物，及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。此等醫藥組合物可適於藉由若干途徑，諸如鞘內、非經腸、表面、鼻內、吸入或經口投藥來投與。在一較佳實施例中，醫藥組合物適於非經腸投藥。此態樣之範疇內涵蓋特徵在於編碼全長溶酶體硫酸酯酶或其片段、突變體、變異體或衍生物之核酸序列的實施例，其可在活體內投入受溶酶體酶缺乏影響之細胞中。

在一更佳實施例中，醫藥組合物包含藉由本發明方法產生之活性高度磷酸化重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)或其生物活性片段、突變體、變異體或衍生物，及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑於包含一或多種緩衝劑及一或多種穩定劑之調配物中。在某些實施例中，該組合物包含可有效減少該GALNS酶去磷酸化之量之磷酸鹽緩衝劑；及穩定量之一或多種選自由以下組成之群的穩定劑：胺基酸鹽、胺基酸緩衝劑、界面活性劑及多元醇；其中該調配物之pH值為約5.0-5.8。

在一些實施例中，GALNS酶包含與SEQ ID NO:4之胺基酸27至522至少95%一致之胺基酸序列，且具有：(i)至少約95%之純度，如在非還原條件下進行SDS-PAGE時藉由庫馬斯藍染色所測定，(ii)位置53之半胱胺酸殘基向C_α-甲醯甘胺酸(FGly)至少約80%之轉化率，及(iii)視情況，每條單體蛋白質鏈0.5至0.8條雙磷酸化寡甘露糖鏈，其中至少70%之該GALNS酶係呈前驅體形式，如在還原條件下進行SDS-PAGE時藉由庫馬斯藍染色所測定。在一些實施例中，GALNS酶之純度為至少95%，如藉由RP-HPLC所測定。在一些實施例中，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少98.5%、至少99%或至少99.5%之GALNS酶係呈前驅體形式，如在還原條件下進行SDS-PAGE時藉由庫馬斯藍染色所測定。在一些實施例中，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少98.5%、至少99%或至少99.5%之GALNS酶係呈前驅體形式，如藉由SDS-毛細管凝膠電泳所測定。在一些實施例中，GALNS酶在位置53之半胱胺酸殘基有至少約90%轉化成C_α-甲醯甘胺酸(FGly)。在一些實施例中，50%至80%GALNS酶結合至甘露糖-6-磷酸酯受體管柱。在一些實施例中，GALNS酶展現至纖維母細胞中之比攝取量(Kuptake)為約1至5 nM。在一些實施例中，GALNS酶展現至纖維母細胞中之比攝取量(Kuptake)為約1至3.5 nM。

調配物中GALNS或其生物活性片段、突變體、變異體或衍生物之濃度為約0.1至10 mg/mL、較佳約0.5至5 mg/mL且更佳約0.5至1.5 mg/mL。

在某些實施例中，調配物包含可有效減少該GALNS酶去磷酸化之量之磷酸鹽緩衝劑。在相關實施例中，磷酸鹽緩衝劑為NaH₂PO₄或其等效物。在另一實施例中，調配物另外包含第二緩衝劑。在一實施例中，第二緩衝劑為乙酸鹽緩衝劑。在另一實施例中，乙酸鹽緩衝劑為NaOAc/HOAc或其等效物。例示性緩衝劑更詳細描述於[實施方式]中。

意欲調配物中NaOAc/HOAc或其等效物之濃度為約5至100 mM、較佳約5至50 mM、且更佳約10至30 mM。在一相關實施例中，調配物中NaH₂PO₄或其等效物之濃度為約5至100 mM、較佳約25至100 mM、且更佳約25至75 mM。在某些實施例中，調配物之pH值為約pH 4.5-6.5、較佳約pH 5.0-6.0、且更佳約pH 5.0-5.8。

在另一實施例中，調配物包含穩定量之一或多種選自由以下組成之群的穩定劑：胺基酸鹽、胺基酸緩衝劑、界面活性劑及多元醇。在一實施例中，穩定劑為精胺酸或組胺酸鹽或緩衝劑，視情況為精胺酸鹽酸鹽。在一相關實施例中，穩定劑為聚山梨醇酯，視情況為聚山梨醇酯20。在另一實施例中，穩定劑為三元或三元以上糖醇，視情況為山梨糖醇。例示性穩定劑更詳細描述於[實施方式]中。

在某些實施例中，穩定劑係選自精胺酸鹽酸鹽或其等效物、Tween-20(聚山梨醇酯20)或其等效物、及山梨糖醇或其等效物。在一些實施例中，調配物中精胺酸鹽酸鹽或其等效物之濃度為約5至200 mM、較佳約10至100 mM、且更佳約10至50 mM。在另一實施例中，調配物中Tween-20或其等效物之濃度為約0.001至1.0%(w/v)、較佳約0.005至0.2%(w/v)、且更佳約0.005至0.015%(w/v)。在一相關實施例中，調配物中山梨糖醇或其等效物之濃度為約0.1至10%(w/v)、較佳約0.5至5%(w/v)、且更佳約1.0至3.0%(w/v)。在一實施例中，調配物包含精胺酸鹽或緩衝劑、聚山梨醇酯及多元醇。

本發明另外提供一種防止重組人類GALNS酶去磷酸化之方法，其包含混合GALNS酶與磷酸鹽緩衝劑以使磷酸鹽緩衝劑之最終濃度介於約25 mM與75 mM之間。在例示性實施例中，例如當在室溫(例如25℃)下儲存1週、2週、3週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月或6個月之後測試時，相較於相同酶於1 mM磷酸鹽緩衝液中之調配物，去磷酸化之量得以降低。

在一尤其較佳實施例中，醫藥組合物包含藉由本發明方法產生之活性高度磷酸化重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)或其生物活性片段、突變體、變異體或衍生物，及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑於包含NaOAc/HOAc及NaH₂PO₄作為緩衝劑，及精胺酸鹽酸鹽、Tween-20(聚山梨醇酯20)及山梨糖醇作為穩定劑之調配物中。調配物中GALNS之濃度為約1.0 +/- 0.5 mg/mL。調配物中NaOAc/HOAc之濃度為約20 +/-10 mM，且調配物中NaH₂PO₄之濃度為約50 +/- 25 mM。調配物之pH值為pH 5.4 +/- 0.4。調配物中精胺酸鹽酸鹽之濃度為約30 +/- 20 mM。調配物中Tween-20之濃度為約0.01 +/- 0.005%(w/v)。調配物中山梨糖醇之濃度為約2.0 +/- 1.0%(w/v)。

在另一態樣中，本發明提供一種偵測溶酶體硫酸酯酶活性之方法，其包含(a)在促進維持軟骨細胞分化之條件下培養來自罹患溶酶體硫酸酯酶缺乏症之患者(例如罹患莫奎歐症候群之患者)的軟骨細胞；(b)使該等軟骨細胞與降解硫酸角質素(keratan sulfate)之溶酶體硫酸酯酶接觸；及(c)偵測細胞中硫酸角質素之含量，其中相較於未與溶酶體硫酸酯酶接觸之細胞，與溶酶體硫酸酯酶接觸之細胞中之硫酸角質素含量降低指示溶酶體硫酸酯酶活性。在一些實施例中，溶酶體硫酸酯酶為N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。在一些實施例中，在包含胰島素生長因子1(IGF1)、轉型生長因子β(TGF-β)、運鐵蛋白(transferrin)、胰島素及抗壞血酸之培養基中進行培養。在一些實施例中，藉由共焦顯微術或經由與抗硫酸角質素抗體結合來偵測硫酸角質素。該方法可用任何溶酶體硫酸酯酶來進行，該酶包括天然存在或重組人類酶或其片段或變異體，包括包含與無信號序列之前驅體人類酶或其成熟形式至少80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列的變異體。

在另一態樣中，本發明提供一種用於量測重組人類溶酶體酶降解天然受質之活性的細胞基檢定。該方法包含(a)在溶酶體酶之天然受質累積之條件下培養溶酶體酶缺乏的經分離人類細胞；(b)使該細胞與該溶酶體酶接觸；(c)溶解該細胞；(d)向細胞溶解產物中添加酶，該酶(i)對該等天然受質具有特異性，且(ii)使小寡醣自該等天然受質裂解；(e)以可偵測部分標記該等小寡醣；(f)視情況分離該等經標記之小寡醣；(g)偵測該等經標記之小寡醣；及(h)藉由比較(i)來自與該溶酶體酶接觸之細胞的經標記小寡醣之量與(ii)來自未與該溶酶體酶接觸之細胞的經標記小寡醣之量來測定該溶酶體酶降解天然受質之活性，其中(h)(i)相較於(h)(ii)降低指示該溶酶體酶降解天然受質之活性。在一實施例中，小寡醣為單醣、雙醣或三醣。在一相關實施例中，小寡醣為雙醣。在一些實施例中，溶酶體酶係選自由以下組成之群：芳基硫酸酯酶B(ARSB)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、磺醯胺酶/肝素-N-硫酸酯酶(SGSH)、N-乙醯葡糖胺-硫酸酯酶(G6S)及N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。在一些實施例中，溶酶體酶為α-L-艾杜糖醛酸酶(α-L-iduronidase，IDU)。在一些實施例中，溶酶體酶為酸性α-葡糖苷酶(α-glucosidase，GAA)。在一些實施例中，溶酶體酶為β-葡萄糖苷酸酶(β-glucoronidase，GUSB)。在一些實施例中，溶酶體酶為β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，GLB1)。

可用於細胞基檢定中之適合人類細胞包括待測試之溶酶體酶缺乏，因此可累積溶酶體酶之天然受質的任何人類細胞。舉例而言，可使用天然展現活性完全(100%)或部分缺乏(例如活性降低30%、50%、70%、80%、90%、95%或95%以上)之細胞。可使用表現活性減弱之突變酶的細胞、或源於罹患溶酶體儲積疾病(例如黏多醣病)之患者的細胞。可使用例如經由向編碼基因或其啟動子或其他調控區引入突變而經重組改變以剔除或降低溶酶體酶活性之細胞。可使用經處理以降低溶酶體酶活性(例如用反義物(antisense)或RNAi處理以降低酶表現)之細胞。

使小寡醣自碳水化合物裂解(消化)且對溶酶體酶之天然受質具有「特異性」(亦即主要消化該等天然受質)之適合酶可由一般技術者加以選擇。舉例而言，對於偵測GALNS或GLB1(降解硫酸角質素之酶)之活性，步驟(d)之酶可為角質素酶II(Keratanase II)或主要對硫酸角質素起作用之任何酶。作為另一實例，對於偵測IDU、ARSB、IDS或GUSB(降解硫酸皮膚素(dermatan sulfate)之酶)，步驟(d)之酶可為軟骨素酶ABC(Chondroitinase ABC)或主要對硫酸皮膚素起作用之任何酶。作為另一實例，對於偵測IDU、IDS、SGHS、G6S或GUSB(降解硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)之酶)，步驟(d)之酶可為乙醯肝素酶(Heparanase)I或乙醯肝素酶II或兩者。作為另一實例，對於偵測GAA(降解肝糖之酶)，步驟(d)之酶可為α-澱粉酶或主要對肝糖起作用之任何酶。

此細胞基方法在偵測溶酶體酶活性方面具有極大靈敏性。在一些實施例中，當溶酶體酶之濃度低至約10 nM、或約5 nM、或約1 nM、或約0.75 nM、或約0.5 nM、或約0.25 nM、或約0.1 nM、或約0.05 nM、或約0.01 nM、或約0.005 nM、或約1 pM、或約0.5 pM時，溶酶體酶活性可偵測。

本發明之其他特徵及優點將根據以下[實施方式]而變得顯而易知。然而，應瞭解儘管[實施方式]及特定實例指示本發明之較佳實施例，但其僅以說明方式給出，因為根據此[實施方式]，在本發明之精神及範疇內之各種變化及修改將變得為熟習此項技術者顯而易知。

本發明係關於發現一種方法，其使對大規模製備重組溶酶體硫酸酯酶之需要與對高效靶向溶酶體且因此具治療有效性之活性高度磷酸化溶酶體硫酸酯酶產物之需求一致。

溶酶體酶製劑之治療有效性視彼製劑中甘露糖-6-磷酸酯之含量而定。藉由內質網及早期高基氏體(Golgi)中之轉譯後修飾來將磷酸酯添加至目標醣蛋白中。摺疊之溶酶體酶顯示由寡醣修飾酶所識別之獨特三級決定子(tertiary determinant)。該決定子由一組逐一隔開之離胺酸構成且見於大多數溶酶體酶上，即使不存在一級序列同源性。修飾酶UDP-GlcNAc磷酸轉移酶與蛋白質決定子結合且向寡醣上鄰近於結合位點之末端甘露糖殘基之6-位置添加GlcNAc-1-磷酸酯：第二酶磷酸二酯α-GlcNAc酶接著裂解GlcNAc-磷酸酯鍵以產生甘露糖-6-磷酸酯末端寡醣(Canfield等人，美國專利第6,537,785號)。甘露糖-6-磷酸酯修飾之目的在於使溶酶體酶自分泌途徑轉向細胞內之溶酶體途徑。攜帶甘露糖-6-磷酸酯之酶由反式高基氏體中之MPR結合且運送至溶酶體而非細胞表面。

除在溶酶體酶寡醣上存在甘露糖-6-磷酸酯標記外，酶之溶酶體運送視自反式高基氏體堆疊之末端出現的運輸內體之酸化而定。用可擴散鹼性分子化學淬滅此等內體內之酸性環境會使囊泡內含物(包括溶酶體酶)排出進入細胞外環境中(Braulke等人,Eur. J. Cell Biol. 43(3): 316-321,1987)。酸化需要包埋在內體膜內之特定液泡ATP酶(Nishi等人,Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3(2): 94-103,2002)。預期此ATP酶之失效會以損害溶酶體運送為代價來增加溶酶體酶之分泌。預期攜帶液泡ATP酶缺陷之製備用細胞株將會防止磷酸化重組酶非產生性地轉移至細胞內溶酶體隔室。

1984年，產生並表徵內體酸化有特定缺陷之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞突變體(Park等人,Somat. Cell Mol. Genet. 17(2): 137-150,1991)。對CHO-K1細胞進行化學突變誘發且針對在毒素存在下在高溫下之存活進行選擇。此等毒素需要內體酸化來完全表現其致死性(Marnell等人,J. Cell. Biol. 99(6): 1907-1916,1984)。在先前研究中，選擇作用機制不同之兩種毒素之混合物以避免選擇毒素特異性抗性。原理為儘管導致對一種特定毒素具有抗性之偶然突變之概率較小，但對兩種完全不同之毒素具有特異性的兩種同時偶然突變之概率為不存在的。在高溫下進行選擇以允許溫度敏感性突變。此遺傳篩檢產生兩種突變體，其中一者稱為G.7.1(G71)，其在高溫下對毒素具有抗性。G71中之損害並非歸因於兩種毒素之攝取或作用機制，而係由純系不能在高溫下酸化內體所引起。此不能在許可溫度(34℃)下亦明顯，但程度較小。亦發現G71細胞在高溫下為鐵營養缺陷型，儘管自培養基正常攝取轉鐵蛋白(Timchak等人,J. Biol. Chem. 261(30): 14154-14159,1986)。因為鐵僅在低pH值下自運鐵蛋白釋放，所以儘管運鐵蛋白攝取正常，但仍存在鐵營養缺陷指示內體酸化障礙。另一研究證明酸化缺陷主要在內體而非溶酶體中顯現(Stone等人,J. Biol. Chem. 262(20): 9883-9886,1987)。關於G71之資料與突變導致負責內體酸化之液泡ATP酶去穩定的結論一致。去穩定在高溫(39.5℃)下最明顯，但即便在較低溫度(34℃)下亦部分表現。對兩種內源性溶酶體酶組織蛋白酶D(cathepsin D)及α-葡糖苷酶在G71細胞中之運輸之研究(Park等人,Somat. Cell Mol. Genet. 17(2):137-150,1991)顯示兩種酶在高溫下均定量分泌，且酶之糖基化未受影響。磷酸化酸性α-葡糖苷酶之分泌在非許可溫度下顯著增強。

溶酶體硫酸酯酶製劑之治療有效性不僅視甘露糖-6-磷酸酯之含量而定，而且視彼製劑中活性酶之存在而定。所有已知硫酸酯酶皆在其催化位點處含有半胱胺酸殘基；此半胱胺酸殘基經轉譯後修飾成C_α-甲醯甘胺酸(FGly)以使酶活化。由硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)催化之此半胱胺酸至FGly轉譯後酶活化緊接於轉譯之後，在硫酸酯酶靶向溶酶體之前，在內質網內在未摺疊硫酸酯酶上發生(Dierks等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11963-11968,1997)。SUMF1中之導致溶酶體硫酸酯酶中FGly形成異常之突變會導致人類的多種硫酸酯酶缺乏症(MSD)強調此獨特轉譯後修飾之重要性(Diez-Ruiz等人,Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 6:355-379,2005)。

因此，G71細胞，亦即內體酸化有缺陷之突變CHO細胞共表現重組人類硫酸酯酶修飾酶(SUMF1)與人類溶酶體硫酸酯酶之能力為大規模產生適用於管理由此等溶酶體硫酸酯酶缺乏引起或與此等溶酶體硫酸酯酶缺乏相關之溶酶體儲存病症的活性高度磷酸化重組人類溶酶體硫酸酯酶提供機制。

I.定義

除非另外定義，否則本文使用之所有技術及科學術語皆具有與本發明所屬技術中之一般技術者通常理解相同的含義。以下參考書目為熟習此項技術者提供本發明中使用之許多術語的一般定義：Singleton等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(第2版1994)；THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker編,1988)；THE GLOSSARY OF GENETICS,5TH ED.,R. Rieger等人(編),Springer Verlag(1991)；及Hale及Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY(1991)。

本文中所引用之各公開案、專利申請案、專利及其他參考文獻在不與本發明不一致之限度內以全文引用的方式併入本文中。

此處應注意，除非上下文中另外明確規定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一」及「該」包括複數個指示物。

如本文所使用，除非另有規定，否則以下術語具有屬於其之含義。

「對偶基因變異體」係指某一基因之佔據相同遺傳基因座(genetic locus)之兩種或兩種以上多形性形式的任一者。對偶基因變異通常經由突變產生，且可導致群體內之表型多形現象(phenotypic polymorphism)。基因突變可為沉默的(亦即編碼之多肽無變化)或可編碼胺基酸序列改變之多肽。「對偶基因變異體」亦指源於遺傳對偶基因變異體之mRNA轉錄物的cDNA，以及由其編碼之蛋白質。

「擴增」係指複製聚核苷酸序列且從而擴大為較多數目之聚核苷酸分子所用的任何手段，例如藉由反轉錄、聚合酶鏈反應及連接酶鏈反應。

若序列為第一序列之聚核苷酸與序列為第二序列之聚核苷酸特異性雜交，則相對於第二序列而言，第一序列為「反義序列」。

「cDNA」係指呈單股或雙股形式之與mRNA互補或一致之DNA。

在本文中使用習知記法來描述聚核苷酸序列：單股聚核苷酸序列之左手端為5'端；雙股聚核苷酸序列之左手方向稱為5'方向。5'至3'添加核苷酸至新生RNA轉錄物之方向稱為轉錄方向。序列與mRNA相同之DNA股稱為「編碼股」；在序列與自DNA轉錄之mRNA相同的DNA股上且位於5'至RNA轉錄物之5'端的序列稱為「上游序列」；在序列與RNA相同之DNA股上且為3'至編碼RNA轉錄物之3'端的序列稱為「下游序列」。

「互補」係指兩個聚核苷酸之相互作用表面之拓撲相容性或該等表面匹配在一起。因此，該兩個分子可描述為互補的，且此外，接觸面特徵彼此互補。若第一聚核苷酸之核苷酸序列與第二聚核苷酸之聚核苷酸結合搭配物之核苷酸序列一致，則第一聚核苷酸與第二聚核苷酸互補。因此，序列為5'-TATAC-3'之聚核苷酸與序列為5'-GTATA-3'之聚核苷酸互補。若與標的核苷酸序列互補之序列與參考核苷酸序列實質上一致，則核苷酸序列與參考核苷酸序列「實質上互補」。

「保守性取代」係指用功能類似胺基酸取代多肽中之胺基酸。以下六組各自含有對於彼此而言為保守性取代之胺基酸：

1)丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；

2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；

3)天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)；

4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；

5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；及

6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)。

術語「片段」在關於多肽使用時係指由於在蛋白質之N端或C端或兩端截斷及/或藉由缺失蛋白質之內部部分或區域而短於全長多肽的多肽。多肽之片段可藉由此項技術中已知之方法產生。

術語「突變體」在關於多肽使用時係指蛋白質之一或多個胺基酸已經不同胺基酸取代之多肽。胺基酸取代可為如上定義之保守性取代，或可為非保守性取代。突變多肽可藉由此項技術中已知之方法產生。

術語「衍生物」在關於多肽使用時係指藉由諸如(但不限於)以下之技術加以化學修飾之多肽：泛素化(ubiquitination)、標記(例如用放射性核種或各種酶)、諸如聚乙二醇化(亦即用聚乙二醇衍生)之共價聚合物連接及藉由化學合成諸如鳥胺酸之通常不存在於人類蛋白質中的胺基酸來進行插入或取代。衍生多肽可藉由此項技術中已知之方法產生。

術語「衍生物」在關於細胞株使用時係指為親本細胞株之後代的細胞株；舉例而言，此術語包括自親本細胞傳代或次選殖且保留所要性質之細胞、親本細胞株之已經突變且針對所要性質之保留加以選擇的後代，及親本細胞株之已經改變成含有不同表現載體或不同外源添加之核酸的後代。

「偵測」係指測定樣品中分析物之存在、不存在或量，且可包括定量樣品中或樣品中每個細胞中分析物之量。

「可偵測部分」或「標記」係指可藉由光譜、光化學、生物化學、免疫化學或化學手段來偵測之組成。舉例而言，適用標記包括³²P、³⁵S、螢光染料、電子緻密試劑、酶(例如在ELISA中通常所用)、生物素-抗生蛋白鏈菌素(streptavadin)、地高辛(digoxigenin)、可利用抗血清或單株抗體之半抗原及蛋白質，或序列與目標互補之核酸分子。可偵測部分常產生可用於定量樣品中經結合之可偵測部分之量的可量測信號，諸如放射性信號、產色性信號或螢光信號。可偵測部分可以共價方式或經由離子、凡得瓦爾力(van der Waals)或氫鍵併入引子或探針中或與引子或探針連接，例如併入放射性核苷酸，或可由抗生蛋白鏈菌素識別之經生物素標記之核苷酸。可偵測部分可為可直接或間接偵測的。間接偵測可涉及第二可直接或間接偵測部分與可偵測部分結合。舉例而言，可偵測部分可為結合搭配物之配位體，該結合搭配物諸如生物素，其為抗生蛋白鏈菌素之結合搭配物；或核苷酸序列，其為其可特異性雜交之互補序列的結合搭配物。結合搭配物本身可為可直接偵測的，舉例而言，抗體本身可用螢光分子標記。結合搭配物亦可為可間接偵測的，舉例而言，具有互補核苷酸序列之核酸可為分支DNA分子之一部分，該分支DNA分子又可經由與其他經標記之核酸分子雜交來偵測。(參見例如Fahrlander等人,Bio/Technology 6:1165,1988)。藉由例如閃爍計數、密度測定法或流動式細胞測量術來達成信號之定量。

「診斷」意謂鑑別病理病狀之存在或性質。診斷方法在其特異性及選擇性方面有所不同。儘管特定診斷方法可能不會提供對病狀之確定性診斷，但若該方法提供有助於診斷之正向指示(positive indication)則足矣。

術語「有效量」意謂足以對個體之健康狀況、病變及疾病產生所要結果或足以達成診斷目的之劑量。所要結果可包含劑量接受者之主觀或客觀改善。「治療有效量」係指可對健康有效產生預定有益效應之藥劑的量。

「編碼」係指聚核苷酸(諸如基因、cDNA或mRNA)中之特定核苷酸序列充當生物過程中用於合成具有確定核苷酸序列(亦即rRNA、tRNA及mRNA)或確定胺基酸序列的其他聚合物及巨分子之模板的固有性質及由此產生之生物性質。因此，若由基因產生之mRNA之轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白質，則彼基因編碼蛋白質。基因或cDNA之編碼股(其核苷酸序列與mRNA序列一致且通常提供於序列表中)與用作轉錄模板之非編碼股兩者可稱為編碼彼基因或cDNA之蛋白質或其他產物。除非另外規定，否則「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包括為彼此之簡併形式且編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。編碼蛋白質及RNA之核苷酸序列可包括內含子。

「等效劑量」係指含有相同量之活性劑之劑量。

「表現控制序列」係指聚核苷酸中之調控與之可操作地連接之核苷酸序列之表現(轉錄及/或轉譯)的核苷酸序列。「可操作地連接」係指兩部分之間的功能關係，其中一部分之活性(例如調控轉錄之能力)會對另一部分產生作用(例如序列之轉錄)。表現控制序列可包括例如(但不限於)啟動子(例如誘導性或組成性啟動子)、增強子、轉錄終止子、起始密碼子(亦即ATG)、內含子之拼接信號及終止密碼子之序列。

「表現載體」係指包含重組聚核苷酸之載體，該重組聚核苷酸包含表現控制序列與欲經表現之核苷酸序列可操作地連接。表現載體包含足以用於表現之順式作用元件；用於表現之其他元件可由宿主細胞或活體外表現系統供給。表現載體包括此項技術中已知之所有表現載體，諸如黏質體、質體(例如裸質體或含於脂質體中之質體)及併有重組聚核苷酸之病毒。

「高度磷酸化」、「高程度磷酸化」及「高含量磷酸化寡醣」係指至少50%溶酶體硫酸酯酶經由磷酸化寡醣與陽離子非依賴性甘露糖-6-磷酸酯受體結合之溶酶體硫酸酯酶製劑。結合之特徵進一步在於對與甘露糖-6-磷酸酯之競爭的敏感性。高度磷酸化溶酶體硫酸酯酶亦可指每條蛋白質鏈具有至少0.25條、較佳至少0.5條且更佳至少0.75條雙磷酸化寡甘露糖鏈之溶酶體硫酸酯酶。或者，高度磷酸化溶酶體硫酸酯酶(GALNS)可指在纖維母細胞中之比攝取量Kuptake(產生半數最大攝取值之酶/配位體之濃度)為約0.1至10 nM、或約0.1至7 nM、或約0.5至5 nM、或約1至5 nM、或約1至3.5 nM、約1 nM、約1.5 nM、約2 nM、約2.5 nM、約3 nM或約3.5 nM、或任何此等數目之任何組合的酶。

如本文所用之「雙磷酸化寡甘露糖鏈」係指含有甘露糖之寡醣鏈，其與溶酶體硫酸酯酶中之天冬醯胺殘基N-連接且包含兩個甘露糖-6-磷酸酯殘基。通常，雙磷酸化寡甘露糖鏈具有7個甘露糖殘基，亦即雙磷酸甘露糖7(BPM7)，其與兩個G1cNAc殘基連接，該兩個G1cNAc殘基又與溶酶體硫酸酯酶中之天冬醯胺殘基連接。

「活性」、「活化」及「高程度活化」係指至少50%、55%、60%、65%、較佳至少70%、75%、80%、85%、90%或95%之蛋白質活性位點半胱胺酸殘基已經轉譯後修飾成Cα-甲醯甘胺酸(FGly)的溶酶體硫酸酯酶製劑。或者，「活性」、「活化」及「高程度活化」係指展現比活性大於在不表現重組人類SUMF1之宿主細胞(例如CHO細胞或CHO衍生之細胞)中產生之具有相同胺基酸序列之對照溶酶體硫酸酯酶的比活性至少約30%(例如35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍或50倍)之溶酶體硫酸酯酶製劑。溶酶體硫酸酯酶之適合對照製劑較佳具有與高度活性製劑相同之胺基酸序列，且在相同宿主細胞(例外之處為宿主細胞不表現重組人類SUMF1)中由相同基因使用相同啟動子或調控序列表現，在相同或類似培養條件(包括持續相同培養時期)下產生，且視情況純化至與高度活性製劑相同或類似之程度。

「活性高度磷酸化」係指至少50%、較佳至少70%、更佳至少90%且甚至更佳至少95%之蛋白質活性位點半胱胺酸殘基已經轉譯後修飾成C_α-甲醯甘胺酸(FGly)且每條蛋白質鏈具有至少0.25條、較佳至少0.5條且更佳至少0.75條雙磷酸化寡甘露糖鏈的溶酶體硫酸酯酶製劑。

術語「生物活性」係指保留全長多肽之至少實質量(例如至少約50%、較佳至少約70%且更佳至少約90%)之一或多種生物活性的多肽(亦即酶)片段、其突變體、變異體或衍生物。當關於溶酶體硫酸酯酶使用時，其生物活性片段、突變體、變異體或衍生物保留至少實質量之硫酸酯酶活性(亦即硫酸酯自其目標受質裂解)。當關於硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)使用時，其生物活性片段、突變體、變異體或衍生物保留至少實質量之產生甲醯甘胺酸之活性(亦即將溶酶體硫酸酯酶之活性位點半胱胺酸殘基修飾成C_α-甲醯甘胺酸(FGly))。

術語「純度」或「純」在關於多肽使用時係指所分析之多肽相較於可使用特定方法偵測之任何污染物質的量。對於本發明之重組溶酶體硫酸酯酶，「純度」可藉由使硫酸酯酶製劑在還原或非還原條件下進行SDS-PAGE電泳分離，隨後用庫馬斯藍或銀染色，或藉由HPLC層析分離(例如C4逆相(RP)、C3 RP)或藉由任何其他層析分離(例如尺寸排除(SEC)及其類似方法)測定。使用此等方法之任一者，本發明之經純化重組溶酶體硫酸酯酶之純度為至少約80%或至少約85%、較佳至少約90%、更佳至少約95%、且甚至更佳至少約97%、98%或99%。

術語「前驅體」或「前驅體形式」係指哺乳動物細胞所分泌之重組溶酶體硫酸酯酶形式，亦即缺乏信號序列，但缺乏通常存在於溶酶體中之某些修飾，例如蛋白質之內部裂解。術語「成熟」、「成熟形式」、「經加工」或「經加工形式」係指通常存在於溶酶體中之重組溶酶體硫酸酯酶形式。對於本發明之重組溶酶體硫酸酯酶，「前驅體」或「前驅體形式」及「成熟」、「成熟形式」、「經加工」或「經加工形式」之相對豐度可藉由使硫酸酯酶製劑在還原條件下進行SDS-PAGE電泳分離，隨後用庫馬斯藍或銀染色，或藉由HPLC層析分離(例如C4逆相(RP)、C3RP)或藉由任何其他層析分離(例如尺寸排除(SEC)及其類似方法)、或電泳分離與層析分離之組合(例如SDS-PAGE接著毛細管凝膠電泳(SDS-CGE))來測定。使用此等方法，本發明之經純化重組溶酶體硫酸酯酶由至少約65%、70%或75%、較佳至少約80%或85%、更佳至少約90%、且甚至更佳至少約95%、97%、98%、98.5%、99%或99.5%之「前驅體」或「前驅體形式」組成。或者，使用此等方法，本發明之經純化重組溶酶體硫酸酯酶由小於約35%、30%或25%、較佳小於約20%或15%、更佳小於約10%、且甚至更佳小於約5%、3%、2%、1.5%、1%或0.5%之「成熟」、「成熟形式」、「經加工」或「經加工形式」組成。在一些實施例中，僅偵測到「前驅體」或「前驅體形式」，亦即硫酸酯酶製劑在還原條件下進行SDS-PAGE時或藉由SDS-CGE測定，基本上由單一可偵測帶組成；或藉由HPLC分析時，基本上由單一峰組成。

在兩個或兩個以上聚核苷酸或多肽序列之情形下，術語「一致」或「一致性」百分比係指當就最大對應加以比較及比對時，兩個或兩個以上序列或子序列相同或具有指定百分比之相同核苷酸或胺基酸殘基，如使用以下序列比較演算法之一或藉由目視檢查所量測。

「連接子」係指以共價方式或經由離子、凡得瓦爾力或氫鍵聯接兩個其他分子之分子，例如在5'端與一個互補序列雜交且在3'端與另一互補序列雜交，由此聯接兩個非互補序列之核酸分子。

「低程度磷酸化」或「低磷酸化」係指如下溶酶體硫酸酯酶製劑，其中至纖維母細胞中之攝取量具有大於10 nM之半數最大濃度或結合甘露糖-6-磷酸酯受體管柱之溶酶體硫酸酯酶之分數小於約25%。

「天然存在」當應用於物體時係指該物體可見於自然界中。舉例而言，存在於可自自然界中之來源分離之生物體(包括病毒)中且未由人類在實驗室中有意修飾的多肽或聚核苷酸序列為天然存在的。

「醫藥組合物」係指適於用於目標動物(包括人類及哺乳動物)中之醫藥用途的組合物。醫藥組合物包含藥理學上有效量之治療性溶酶體硫酸酯酶且亦包含一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。醫藥組合物涵蓋如下組合物，其包含活性成分及組成載劑、稀釋劑或賦形劑之惰性成分、以及由任何兩種或兩種以上成分組合、複合或聚集或由一或多種成分解離或由一或多種成分之其他類型之反應或相互作用直接或間接產生的任何產物。因此，本發明之醫藥組合物涵蓋藉由摻和本發明之溶酶體硫酸酯酶與一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑加以製備之任何組合物。

「醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑」係指任何標準醫藥載劑、稀釋劑、緩衝劑及賦形劑，諸如(但不限於)磷酸鹽緩衝生理食鹽水溶液、5%右旋糖水溶液、及乳液(諸如油/水或水/油乳液)、以及各種類型之濕潤劑及/或佐劑。適合醫藥載劑、稀釋劑或賦形劑及調配物描述於Remington's Pharmaceutical Sciences,第19版(Mack Publishing Co.,Easton,1995)中。較佳醫藥載劑、稀釋劑或賦形劑視活性劑之預定投藥模式而定。典型投藥模式包括例如(但不限於)經腸(例如經口)或非經腸(例如皮下、肌肉內、靜脈內或腹膜內)注射；或表面、經皮或經黏膜投藥。

「醫藥學上可接受之鹽」為可調配至溶酶體硫酸酯酶中以達成醫藥用途之鹽，包括例如金屬鹽(鈉、鉀、鎂、鈣等)及氨或有機胺之鹽。

「聚核苷酸」係指由核苷酸單元構成之聚合物。聚核苷酸包括天然存在之核酸，諸如去氧核糖核酸(「DNA」)及核糖核酸(「RNA」)以及核酸類似物。核酸類似物包含包括非天然存在之鹼基、參與與其他核苷酸之鍵聯(除天然存在之磷酸二酯鍵之外)的核苷酸或包括經由除磷酸二酯鍵外之鍵連接之鹼基的核酸類似物。因此，核苷酸類似物包括例如(但不限於)硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯(phosphorotriester)、胺基磷酸酯(phosphoramidate)、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、膦酸甲酯、對掌性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)及其類似物。此等聚核苷酸可例如使用自動DNA合成器加以合成。術語「核酸」通常係指較大聚核苷酸。術語「寡核苷酸」通常係指一般不超過約50個核苷酸之較短聚核苷酸。應瞭解當用DNA序列(亦即A、T、G、C)表示核苷酸序列時，此亦包括RNA序列(亦即A、U、G、C)，其中「U」置換「T」。

「多肽」係指由胺基酸殘基、其相關天然存在之結構變異體及合成非天然存在之類似物經由肽鍵連接所構成的聚合物、其相關天然存在之結構變異體及合成非天然存在之類似物。合成多肽可例如使用自動多肽合成器加以合成。術語「蛋白質」通常係指較大多肽。術語「肽」通常係指較短多肽。在本文中使用習知記法來描繪多肽序列：多肽序列之左手端為胺基端；多肽序列之右手端為羧基端。

「引子」係指能夠與指定聚核苷酸模板特異性雜交且為互補聚核苷酸之合成提供起始點的聚核苷酸。當將聚核苷酸引子置於誘導合成之條件下(亦即在核苷酸、互補聚核苷酸模板，及諸如DNA聚合酶之聚合用試劑存在下)時發生此合成。引子通常為單股，但可為雙股。引子通常為去氧核糖核酸，但多種合成及天然存在之引子亦適用於許多應用。引子與模板互補(引子經設計以與該模板雜交來充當合成之起始位點)，但無需反映模板之精確序列。在該種情況下，引子與模板之特異性雜交視雜交條件之嚴格性而定。引子可用例如產色性、放射性或螢光部分加以標記且用作可偵測部分。

「探針」在關於聚核苷酸使用時係指能夠與另一聚核苷酸之指定序列特異性雜交的聚核苷酸。探針與目標互補聚核苷酸特異性雜交，但無需反映模板之精確互補序列。在該種情況下，探針與目標之特異性雜交視雜交條件之嚴格性而定。探針可用例如產色性、放射性或螢光部分加以標記且用作可偵測部分。

「防治性」治療為出於降低顯現病變之風險之目的而向不展現疾病徵象或僅展現早期徵象之個體投與的治療。本發明化合物可作為防治性治療來給與以降低顯現病變之可能性或若顯現，則使病變之嚴重性最小。

「重組聚核苷酸」係指具有不天然聯接在一起之序列的聚核苷酸。經擴增或組裝之重組聚核苷酸可包括在適合載體中，且該載體可用於轉型適合宿主細胞。包含重組聚核苷酸之宿主細胞稱為「重組宿主細胞」。接著在重組宿主細胞中表現基因以產生例如「重組多肽」。重組聚核苷酸亦可發揮非編碼功能(例如啟動子、複製起點、核糖體結合位點等)。

「與...特異性雜交」、「特異性雜交」或「與...選擇性雜交」係指當特定核苷酸序列存在於複雜混合物(例如總細胞)DNA或RNA中時，核酸分子在嚴格條件下優先與彼序列結合、雙螺旋化(duplexing)或雜交。

術語「嚴格條件」係指探針將優先與其目標子序列雜交且在較小程度上與其他序列雜交或完全不與其他序列雜交所處的條件。在諸如南方及北方雜交(Southern and Northern hybridization)之核酸雜交實驗的情形下，「嚴格雜交」及「嚴格雜交洗滌條件」視序列而定，且在不同環境參數下不同。關於核酸雜交之廣泛指南見於Tijssen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes第2章第I部分「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays」,Elsevier,New York中。一般而言，選擇高度嚴格雜交及洗滌條件為在確定離子強度及pH值下比特定序列之熱熔點(Tm)低約5℃。Tm為50%目標序列與完全匹配之探針雜交之溫度(在確定離子強度及pH值下)。極嚴格條件選擇為等於特定探針之Tm。

在南方或北方墨點法中使在過濾器上具有超過100個互補殘基之互補核酸雜交之嚴格雜交條件的一實例為：含有1 mg肝素之50%福馬林(formalin)，在42℃下，進行雜交隔夜。高度嚴格洗滌條件之一實例為：在72℃下，0.15 M NaCl，持續約15分鐘。嚴格洗滌條件之一實例為：在65℃下0.2×SSC洗滌15分鐘(關於SSC緩衝液之描述，參見Sambrook等人)。通常，在高嚴格性洗滌之前進行低嚴格性洗滌以移除背景探針信號。例如超過100個核苷酸之雙螺旋之例示性中等嚴格性洗滌為：在45℃下，1×SSC，持續15分鐘。例如超過100個核苷酸之雙螺旋之例示性低嚴格性洗滌為：在40℃下，4-6×SSC，持續15分鐘。一般而言，在特定雜交檢定中，信雜比為對於無關探針觀測到之信雜比的2倍(或2倍以上)指示偵測到特異性雜交。

診斷或治療之「個體」為人類或非人類動物，包括哺乳動物或靈長類動物。

在兩種核酸或多肽之情形下，片語「實質上同源」或「實質上一致」一般係指當就最大對應加以比較及比對時，兩個或兩個以上序列或子序列具有至少40%、60%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%核苷酸或胺基酸殘基一致性，如使用以下序列比較演算法之一或藉由目視檢查所量測。較佳地，實質一致性在長度為至少約50個殘基之序列區域範圍內，更佳在至少約100個殘基之區域範圍內存在，且最佳地，序列在至少約150個殘基範圍內為實質上一致。在一最佳實施例中，序列在比較生物聚合物之任一者或兩者之整個長度範圍內為實質上一致。

對於序列比較，通常一個序列充當測試序列與之比較的參考序列。當使用序列比較演算法時，將測試及參考序列輸入電腦中，必要時指定子序列座標，且指定序列演算法程式參數。接著序列比較演算法基於指定之程式參數，計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。

可例如藉由Smith及Waterman,Adv. Appl. Math. 2:482,1981之局部同源性演算法，藉由Needleman及Wunsch,J. Mol. Biol. 48:443,1970之同源性比對演算法，藉由Pearson 及Lipman,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444,1988之相似性搜尋法，藉由此等演算法之電腦化工具(威斯康星遺傳學套裝軟體(Wisconsin Genetics Software Package),Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI中之GAP、BESTFTT、FASTA及TFASTA)或藉由目視檢查來進行序列之最佳比對以作比較。

適用演算法之一實例為PILEUP。PILEUP使用漸進性成對比對產生一組相關序列的多重序列比對以顯示關係及序列一致性百分比。其亦繪製顯示用於產生比對之叢集關係的樹或樹形圖。PILEUP使用Feng及Doolittle,J. Mol. Evol. 35:351-360,1987之漸進性比對方法之簡化形式。所用方法類似於由Higgins及Sharp,CABIOS 5:151-153,1989描述之方法。程式可比對多達300個序列，各者可具有5,000個核苷酸或胺基酸之最大長度。多重比對程序始於兩個最類似序列之成對比對，產生兩個經比對序列之叢集。此叢集接著與下一最相關序列或經比對序列之叢集比對。兩個序列叢集藉由簡單延伸兩個個別序列之成對比對來進行比對。藉由一系列漸進成對比對來達成最終比對。藉由指定特定序列及其用於序列比較之區域的胺基酸或核苷酸座標且藉由指定程式參數來執行程式。舉例而言，可使用以下參數來將參考序列與其他測試序列比較以測定序列一致性百分比關係：預設空隙權重(3.00)、預設空隙長度權重(0.10)及加權末端空隙。適用於產生序列之多重比對之另一演算法為Clustal W(Thompson等人,Nucleic Acids Research 22: 4673-4680,1994)。

適用於測定序列一致性及序列相似性百分比之演算法之另一實例為BLAST演算法，其描述於Altschul等人，J. Mol. Biol. 215:403-410,1990中。用於進行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。此演算法涉及首先藉由鑑別查詢序列中長度W之短字來鑑別高得分序列對(HSP)，其在與資料庫序列中相同長度之字比對時匹配或滿足某一正值臨限計分T。T稱為鄰近字計分臨限值(Altschul等人,J. Mol. Biol. 215:403-410,1990)。此等初始鄰近字匹配充當起始搜尋之種子以發現含有其之較長HSP。字匹配接著沿各序列雙向延伸直至累積比對計分可增加。對於核苷酸序列，使用參數M(一對匹配殘基之獎賞計分；始終>0)及N(錯配殘基之處罰計分；始終<0)來計算累積計分。對於胺基酸序列，使用計分矩陣來計算累積計分。各方向之字匹配之延伸在下列情況下停止：累積比對計分自其所達成之最大值減少量X；歸因於一或多個負計分殘基比對之累積，累積計分變為0或0以下；或達到任一序列之末端。BLAST演算法參數W、T及X決定比對之敏感性及速度。BLASTN程式(對於核苷酸序列)使用字長(W)11、預期值(E)10、M=5、N=-4、及兩股之比較作為預設值。對於胺基酸序列，BLASTP程式使用字長(W)3、預期值(E)10，及BLOSUM62計分矩陣作為預設值(參見Henikoff及Henikoff,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915,1989)。

除計算序列一致性百分比外，BLAST算法亦進行兩個序列之間類似性的統計分析(參見例如Karlin & Altschul,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787,1993)。BLAST演算法提供之一個類似性量度為最小和概率(P(N))，其提供兩個核苷酸或胺基酸序列之間將偶然發生匹配之概率的指標。舉例而言，若在測試核酸與參考核酸之比較中，最小和概率小於約0.1、更佳小於約0.01、且最佳小於約0.001，則認為核酸與參考序列類似。

如下所述，兩個核酸序列或多肽為實質上一致之另一指標為由第一核酸編碼之多肽可與由第二核酸編碼之多肽起免疫交叉反應。因此，舉例而言，當兩個肽僅在保守性取代方面不同時，多肽通常與第二多肽實質上一致。如本文所述，兩個核酸序列為實質上一致之另一指標為兩個分子在嚴格條件下彼此雜交。

「實質上純」或「經分離」意謂目標物質為所存在之主要物質(亦即以莫耳計，在組合物中量大於任何其他個別大分子物質)，且實質上純化之部分為目標物質佔所有存在之大分子物質的至少約50%(以莫耳計)的組合物。一般而言，實質上純之組合物意謂約80%至90%或90%以上之存在於組合物中之大分子物質為相關純化物質。若組合物基本上係由單一大分子物質組成，則目標物質經純化至基本均質(藉由習知偵測方法不能偵測出組合物中之污染物質)。出於此定義之目的，溶劑物質、小分子(<500道爾頓)、穩定劑(例如BSA)及元素離子物質不視為大分子物質。在一些實施例中，本發明之溶酶體硫酸酯酶為實質上純的或經分離。在一些實施例中，本發明之溶酶體硫酸酯酶相對於用於其合成之大分子起始物質而言為實質上純的或經分離。在一些實施例中，本發明之醫藥組合物包含實質上純化或分離之治療性溶酶體硫酸酯酶與一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑摻和。

「治療性」治療為出於減弱或消除病變徵象或症狀之目的而向展現彼等徵象或症狀之個體投與之治療。徵象或症狀可為生物化學、細胞、組織、功能、主觀或客觀徵象或症狀。本發明之溶酶體硫酸酯酶可作為治療性治療劑或為達成診斷而給與。

「治療指數」係指高於最小治療量且低於不可接受之毒性量的劑量範圍(量及/或時序)。

「治療」係指預防性治療或治療性治療或診斷性治療。

如本文所用之術語「單位劑型」係指適於作為單一劑量用於人類及動物個體的物理個別單元，各單元含有預定量之本發明之溶酶體硫酸酯酶，該預定量係以在與一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑聯合的情況下足以產生所要效應之量來計算。本發明之新穎單位劑型的規格視所用特定溶酶體硫酸酯酶及欲達成之效應以及與宿主中各溶酶體硫酸酯酶相關之藥效學而定。

II.產生溶酶體硫酸酯酶

在一態樣中，本發明之特徵在於一種產生能夠達成活性高度磷酸化溶酶體硫酸酯酶之治療性使用之量的此等酶之新穎方法。一般而言，該方法之特徵在於用編碼人類硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)或其生物活性片段、突變體、變異體或衍生物之cDNA及編碼全長溶酶體硫酸酯酶或其生物活性片段、突變體、變異體或衍生物之cDNA轉型適合細胞株。熟習此項技術者可製備除本文中明確描述之表現構築體以外的表現構築體以達成在適合經轉染細胞株中最佳產生此等溶酶體硫酸酯酶。此外，熟習此項技術者可容易地設計編碼天然存在之SUMF1或與天然存在之全長酶具有相同或類似生物活性之溶酶體硫酸酯酶之生物活性片段、變異體、突變體或衍生物的cDNA之片段。

宿主細胞

用於產生重組溶酶體硫酸酯酶之宿主細胞為內體酸化缺乏之細胞株，其特徵在於其能夠產生能夠達成此等溶酶體硫酸酯酶之治療性使用之量的此等溶酶體硫酸酯酶。本發明提供一種CHO-K1衍生之END3互補群細胞株，稱為G71。本發明亦提供一種適合於在無血清懸浮培養物中生長之G71細胞株，稱為G71S。本發明亦提供已經進一步次選殖或含有不同表現質體之G71及G71S細胞株之衍生物。

含有且表現編碼重組蛋白質之DNA或RNA的細胞在本文中稱為經遺傳修飾之細胞。含有且表現編碼重組蛋白質之DNA或RNA之哺乳動物細胞稱為經遺傳修飾之哺乳動物細胞。將DNA或RNA引入至細胞中係藉由已知轉染方法，諸如(但不限於)電穿孔、顯微注射、微彈轟擊(microprojectile bombardment)、磷酸鈣沈澱、改進型磷酸鈣沈澱、陽離子脂質處理、光穿孔(photoporation)、融合方法、受體介導之轉移或聚凝胺(polybrene)沈澱來達成。或者，DNA或RNA可藉由用病毒載體感染來引入。產生表現編碼重組蛋白質之DNA或RNA的細胞(包括哺乳動物細胞)的方法描述於以下申請案中：同在申請中之Richard F Selden、Douglas A. Treco及Michael W. Heartlein(1994年11月4日申請)之標題為「In Vivo Protein Production and Delivery System for Gene Therapy」之美國專利申請案第08/334,797號；Richard F Selden、Douglas A. Treco及Michael W. Heartlein(1994年11月4日申請)之標題為「In Vivo Production and Delivery of Erythropoietin or Insulinotropin for Gene Therapy」之美國專利申請案第08/334,455號；及Douglas A. Treco、Michael W. Heartlein及Richard F Selden(1994年4月20日申請)之標題為「Targeted Introduction of DNA Into Primary or Secondary Cells and Their Use for Gene Therapy」之美國專利申請案第08/231,439號。此等申請案各自之教示以全文引用的方式明確併入本文中。

在較佳實施例中，用於產生重組溶酶體硫酸酯酶之宿主細胞為內體酸化缺乏之細胞株，其特徵在於其能夠產生能夠達成此等溶酶體硫酸酯酶之治療性使用之量的此等溶酶體硫酸酯酶。在較佳實施例中，本發明提供一種稱為G71之由CHO-K1衍生之END3互補群細胞株，及一種稱為G71S之適合於在無血清懸浮培養物中生長之G71細胞株，該等細胞株共表現人類硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)與重組溶酶體硫酸酯酶，且因此能夠產生高產率之如「定義」中所指定之活性高度磷酸化溶酶體硫酸酯酶，藉此能夠達成治療性溶酶體硫酸酯酶之大規模產生。在最佳實施例中，G71或G71S細胞株或其衍生物以至少約0.5皮克/細胞/天、較佳至少約0.75皮克/細胞/天、更佳至少約1.0皮克/細胞/天且甚至更佳至少約1.25皮克/細胞/天之量表現及分泌重組溶酶體硫酸酯酶。

載體及核酸構築體

用於表現重組蛋白質(人類硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)或溶酶體硫酸酯酶或兩者)之核酸構築體可為於經轉染哺乳動物細胞中染色體外(游離)表現之核酸構築體或隨機地或在預先選定之靶向位點處經由同源重組整合至受者細胞之基因組中的核酸構築體。除重組蛋白質編碼序列外，染色體外表現之構築體亦包含足以在細胞中表現該蛋白質及視情況構築體複製之序列。其通常包括啟動子、重組蛋白質編碼DNA及聚腺苷酸化位點。編碼重組蛋白質之DNA以使其表現處於啟動子之控制下的方式定位於構築體中。視情況，構築體可含有其他組分，諸如以下一或多者：拼接位點、增強子序列、在適當啟動子控制下之選擇標記基因、在適當啟動子控制下之可擴增標記基因及基質附著區(matrix attachment region，MAR)或此項技術中已知之會增強其所插入之區域之表現的其他元件。

在DNA構築體整合至細胞之基因組中的彼等實施例中，其需僅包括重組蛋白質編碼核酸序列。視情況，其可包括啟動子及增強子序列、聚腺苷酸化位點、拼接位點、編碼選擇標記之核酸序列、編碼可擴增標記之核酸序列、基質附著區(MAR)或此項技術中已知之會增強其所插入之區域之表現的其他元件，及/或與受者細胞中之基因組DNA同源之DNA，以使DNA之整合靶向基因組中之選定位點(以靶向DNA或DNA序列)。

細胞培養方法

在適於細胞生長及DNA或RNA表現之條件下培養含有編碼重組蛋白質之DNA或RNA的哺乳動物細胞。可使用已知方法及本文所述之方法鑑別表現重組蛋白質之彼等細胞，且可使用已知方法及本文亦描述之方法分離及純化重組蛋白質，在存在或不存在擴大重組蛋白質產生之情況下。可例如經由篩檢(諸如PCR篩檢、藉由南方墨點分析進行篩檢或針對重組蛋白質之表現進行篩檢)顯示指示存在編碼重組蛋白質之DNA或RNA之表型的經遺傳修飾哺乳動物細胞來進行鑑別。含有經合併之重組蛋白質編碼DNA之細胞的選擇可藉由以下達成：在DNA構築體中包括選擇標記，隨後在僅適於表現選擇標記基因之彼等細胞存活之條件下培養含有選擇標記基因的經轉染或經感染細胞。所引入之DNA構築體之進一步擴增可藉由以下來實現：在適當條件下培養經遺傳修飾哺乳動物細胞(例如在僅有含有可擴增標記基因之多個複本之細胞可存活的藥物濃度存在下培養含有可擴增標記基因之經遺傳修飾哺乳動物細胞)。

如本文所述，可藉由偵測表現產物來鑑別表現重組蛋白質之經遺傳修飾哺乳動物細胞。舉例而言，表現活性高度磷酸化溶酶體硫酸酯酶之哺乳動物細胞可藉由夾心式酶免疫檢定來鑑別。抗體可被引向活性劑部分。

溶酶體硫酸酯酶之變異體

在某些實施例中，活性高度磷酸化溶酶體硫酸酯酶突變體或變異體可經製備且將適用於可使用活性高度磷酸化溶酶體硫酸酯酶之多種應用。多肽之胺基酸序列突變體或變異體可為取代型、插入型或缺失型突變體或變異體。缺失型突變體或變異體缺乏天然蛋白質之並非為功能或免疫原性活性所必需之一或多個殘基。一種常見類型之缺失型突變體或變異體為缺乏分泌信號序列或引導蛋白質與細胞之特定部分結合之信號序列的缺失型突變體或變異體。插入型突變體或變異體通常涉及在多肽中之非端點處添加物質。此可包括插入免疫反應性抗原決定基或僅單一殘基。下文論述亦稱為融合蛋白之末端添加物。

變異體可與如上所述之未經修飾溶酶體硫酸酯酶實質上同源或實質上一致。較佳變異體為以下變異體：其為保留溶酶體硫酸酯酶之至少一些生物活性(例如硫酸酯酶活性)的活性高度磷酸化溶酶體硫酸酯酶多肽變異體。其他較佳變異體包括保留人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶之至少一些硫酸酯酶活性的人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶多肽變異體。

取代型突變體或變異體通常在蛋白質內之一或多個位點處將野生型多肽之一個胺基酸交換為另一胺基酸，且可經設計成在不損失其他功能或性質之情況下調節多肽之一或多種特性，諸如(但不限於)對抗蛋白水解裂解之穩定性。此類取代較佳為保守性的，亦即一個胺基酸經具有類似形狀及電荷之胺基酸置換。保守性取代在此項技術中為熟知的且包括例如以下變化：丙胺酸至絲胺酸；精胺酸至離胺酸；天冬醯胺至麩醯胺酸或組胺酸；天冬胺酸至麩胺酸；半胱胺酸至絲胺酸；麩醯胺酸至天冬醯胺；麩胺酸至天冬胺酸；甘胺酸至脯胺酸；組胺酸至天冬醯胺或麩醯胺酸；異白胺酸至白胺酸或纈胺酸；白胺酸至纈胺酸或異白胺酸；離胺酸至精胺酸；甲硫胺酸至白胺酸或異白胺酸；苯丙胺酸至酪胺酸、白胺酸或甲硫胺酸；絲胺酸至蘇胺酸；蘇胺酸至絲胺酸；色胺酸至酪胺酸；酪胺酸至色胺酸或苯丙胺酸；及纈胺酸至異白胺酸或白胺酸。

本發明之一態樣涵蓋產生糖基化位點突變體或變異體，其中溶酶體硫酸酯酶之O-連接或N-連接糖基化位點已經突變。此等突變體或變異體將產生關於活性高度磷酸化溶酶體硫酸酯酶之生物活性、物理結構及受質結合潛力之重要資訊。在特定態樣中，預期可產生活性高度磷酸化溶酶體硫酸酯酶多肽之其他突變體或變異體，其保留生物活性但受質結合活性增大或減小。同樣，特別涵蓋活性位點或催化區域之突變以產生受質結合活性改變之蛋白質突變體或變異體。在此等實施例中，將活性高度磷酸化溶酶體硫酸酯酶之序列與其他相關酶之序列進行比較且使選定殘基特異性突變。

自作為1號胺基酸之推定胺基末端對成熟蛋白質之胺基酸進行編號，可適用之例示性突變包括例如取代所有或一些可能經糖基化之天冬醯胺，包括重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之位置178及397(參見圖5)。

受質結合可由在溶酶體硫酸酯酶之活性位點處/附近之突變來改變。考慮到此等突變為例示性的，熟習此項技術者將認識到可使酶序列發生其他突變以提供關於此蛋白質及其活性之其他結構及功能資訊。

為了構築諸如上述之突變體或變異體，熟習此項技術者可採用熟知標準技術。特別涵蓋N端缺失、C端缺失、內部缺失以及隨機及點突變誘發。

N端及C端缺失為缺失突變誘發形式，其利用例如在C端或N端區域之末端附近存在適合單一限制位點。DNA在該位點處裂解且切割末端由諸如BAL31、外切核酸酶III、DNase I及S1核酸酶之核酸酶降解。再聯接兩末端會產生一系列在限制位點周圍具有不同尺寸之缺失的DNA。可使用此項技術中之標準技術及本說明書中所述之技術來檢定由此突變體表現之蛋白質的適當生物功能，例如酶活性。對內部缺失突變體可採用類似技術，藉由使用兩個經適當置放之限制位點，藉此允許產生精確確定之缺失，且使末端如上所述再連接。

亦涵蓋局部消化突變體。在此等情況下，熟習此項技術者將採用「高頻切酶(frequent cutter)」，其視反應時間之長短而定在眾多位置切割DNA。因此，藉由改變反應條件，將有可能產生一系列不同尺寸之突變體，接著可針對活性對其進行篩檢。

亦可藉由用例如DNase I切割DNA序列且插入編碼3、6、9、12(等)個胺基酸之一段核苷酸並再連接末端來進行隨機插入型突變。一旦產生此種突變，即可針對由野生型蛋白質所呈現之各種活性對突變體進行篩檢。

亦可採用點突變誘發以特定鑑別哪些胺基酸殘基在與溶酶體硫酸酯酶生物活性相關之特定活性方面為重要的。因此，熟習此項技術者將能夠在DNA股中產生單鹼基變化以產生改變的密碼子及誤義突變。

可改變特定蛋白質之胺基酸以產生等效物，或甚至改良之第二代分子。此等改變涵蓋在不明顯損失與諸如抗體之抗原結合區域或受質分子或受體上之結合位點之結構之相互作用結合能力的情況下取代蛋白質之既定胺基酸。因為蛋白質之相互作用能力及性質限定彼蛋白質之生物功能活性，所以可在蛋白質序列及其潛在DNA編碼序列中進行某些胺基酸取代，且仍獲得具有類似性質之蛋白質。因此，如下文所論述，可在不明顯損失生物效用或活性之情況下，在基因之DNA序列中作出各種變化。

在作出此等變化時，可考慮胺基酸之親水性指數(hydropathic index)。公認胺基酸之相對親水性特性促成所得蛋白質之二級結構，該二級結構又限定蛋白質與其他分子(例如酶、受質、受體、DNA、抗體、抗原及其類似物)之相互作用。各胺基酸已基於其疏水性及電荷特徵被賦予親水性指數(Kyte及Doolittle,J. Mol. Biol.,157(1):105-132,1982，以引用的方式併入本文中)。一般而言，胺基酸可經具有類似親水性指數或計分之其他胺基酸取代且仍會產生具有類似生物活性之蛋白質，亦即仍獲得生物功能等效之蛋白質。

另外，可基於親水性有效進行類似胺基酸之取代。以引用的方式併入本文中之美國專利4,554,101指出蛋白質受鄰近胺基酸之親水性支配之最大局部平均親水性與該蛋白質之生物性質相關。同樣，胺基酸可經取代成具有類似親水性值之另一胺基酸且仍獲得生物等效且免疫等效之蛋白質。

可用於本發明之此情形中的例示性胺基酸取代包括(但不限於)交換精胺酸及離胺酸；麩胺酸及天冬胺酸；絲胺酸及蘇胺酸；麩醯胺酸及天冬醯胺；及纈胺酸、白胺酸及異白胺酸。熟習此項技術者將熟知考慮需要保留一些或所有生物活性同時改變蛋白質之二級結構的其他此種取代。

預期用於製備本發明之多肽之另一類型的變異體為使用肽模擬物。模擬物為模擬蛋白質二級結構之元件的含肽分子。參見例如Johnson等人,「Peptide Turn Mimetics」,BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY,Pezzuto等人編,Chapman and Hall,New York(1993)。在使用肽模擬物背後之潛在基本原理為蛋白質之肽骨架主要以有助於分子相互作用(諸如抗體與抗原之分子相互作用)之方式存在以定向胺基酸側鏈。預期肽模擬物允許類似於天然分子之分子相互作用。此等原理可連同上述原理一起使用以工程改造具有溶酶體硫酸酯酶之許多天然性質但特徵改變且甚至改良的第二代分子。

溶酶體硫酸酯酶之經修飾糖基化

亦可產生糖基化樣式相對於親本多肽經修飾的活性高度磷酸化溶酶體硫酸酯酶變異體，例如缺失一或多個碳水化合物部分及/或添加一或多個不存在於天然多肽中之糖基化位點。

糖基化通常為N-連接或O-連接。N-連接係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸(X為除脯胺酸以外之任何胺基酸)為碳水化合物部分與天冬醯胺側鏈之酶促連接的識別序列。在多肽中存在此等三肽序列之任一者皆會產生潛在糖基化位點。因此，可藉由改變胺基酸序列以使其含有此等三肽序列之一或多者來添加N-連接糖基化位點至多肽中。O-連接糖基化係指糖N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖之一連接至羥基胺基酸，最常見為絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。O-連接糖基化位點可藉由在原始多肽之序列中插入或取代一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基來添加。

域轉換

溶酶體硫酸酯酶蛋白質之各種部分具有大量序列同源性。可鑑別溶酶體硫酸酯酶多肽中可改變其功能之突變。此等研究因至少兩個原因而可能為重要的。首先，其提供以下合理期望：此基因之其他同源物、對偶基因變異體及突變體可存在於相關物種，諸如大鼠、兔、猴、巨臂猿(gibbon)、黑猩猩、猿、狒狒、母牛、豬、馬、綿羊及貓中。在分離此等同源物、變異體及突變體後，且連同其他分析，可鑑別某些活性或功能域。其次，此將為對如上所述之分子進行進一步突變分析提供起點。一種可利用此資訊之方式係在於「域轉換」。

域轉換涉及使用不同但相關之多肽產生重組分子。舉例而言，藉由將溶酶體硫酸酯酶(例如N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶)之序列與來自另一來源之類似溶酶體硫酸酯酶之序列進行比較，且與此等多肽之突變體及對偶基因變異體進行比較，可關於此等分子之功能重要區域進行預測。接著有可能轉換此等分子之相關域以試圖確定此等區域在溶酶體儲存病症中對酶功能及效應的關鍵程度。此等分子可具有其他價值，因為此等「嵌合體」儘管不同於天然分子，但可能提供相同或甚至增強之功能。

基於目前鑑別之眾多溶酶體硫酸酯酶，對突變及其對二級結構之預測影響的進一步分析將加深此理解。預期轉換介於溶酶體硫酸酯酶之間的域之突變體將提供關於此等分子與其所相互作用之多肽之結構/功能關係的適用資訊。

融合蛋白

除上述突變之外，本發明另外涵蓋產生稱為融合蛋白之特定種類之插入型變異體。此分子通常具有天然分子之所有或實質部分，其在N端或C端與第二多肽之所有部分或一部分連接。舉例而言，融合通常採用來自其他物種之前導序列(leader sequence)以允許蛋白質在異源宿主中重組表現。另一適用融合包括添加諸如抗體抗原決定基之免疫活性域以有助於融合蛋白之純化。在融合接合處或附近包括裂解位點將有助於在純化後移除外來多肽。其他適用融合包括功能域(諸如來自酶之活性位點)、糖基化域、細胞靶向信號或跨膜區域之連接。

有各種市售融合蛋白表現系統可用於本發明中。尤其適用之系統包括(但不限於)麩胱甘肽S-轉移酶(GST)系統(Pharmacia,Piscataway,NJ)、麥芽糖結合蛋白系統(NEB,Beverley,MA)、FLAG系統(IBI,New Haven,CT)、6×His系統(Qiagen,Chatsworth,CA)。此等系統能夠產生僅攜帶少量不可能影響重組多肽之抗原性能力之其他胺基酸的重組多肽。舉例而言，FLAG系統與6×His系統均僅添加短序列，已知兩者均具弱抗原性且不會不利地影響多肽摺疊成其天然構形。預期適用之另一N端融合為在蛋白質或肽之N端區域處Met-Lys二肽之融合。該種融合可使蛋白質表現或活性有利地增加。

一種尤其適用之融合構築體可為活性高度磷酸化溶酶體硫酸酯酶多肽或其片段與半抗原融合以增強溶酶體硫酸酯酶融合構築體之免疫原性的融合構築體。此可適用於產生針對活性高度磷酸化溶酶體硫酸酯酶之抗體以能夠達成蛋白質之偵測。在其他實施例中，可製備將增強溶酶體硫酸酯酶相關組合物靶向特定位點或細胞的融合構築體。

其他融合構築體包括具有所要性質之異源肽，例如使溶酶體硫酸酯酶靶向特定器官、組織或細胞類型之基元。在一較佳實施例中，包括靶向骨骼之肽的融合構築體，例如與溶酶體硫酸酯酶融合之6個天冬胺酸殘基(6×Asp或6D)可使酶靶向骨骼中之特定部位。

亦涵蓋包括具有所要性質之異源多肽(例如延長血清半衰期之Ig恆定區或供靶向之抗體或其片段)的其他融合構築體。其他融合系統產生多肽雜合體，其中需要自所要多肽切除融合搭配物。在一實施例中，融合搭配物由含有蛋白酶特異性識別序列之肽序列與重組活性高度磷酸化溶酶體硫酸酯酶多肽連接。適合序列之實例為由菸草蝕刻病毒蛋白酶(Tobacco Etch Virus protease)(Life Technologies,Gaithersburg,MD)或因子Xa(New England Biolabs,Beverley,MA)所識別之序列。

衍生物

如上所述，衍生物係指藉由諸如(但不限於)以下之技術加以化學修飾之多肽：泛素化、標記(例如用放射性核種或各種酶)、諸如聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生)之共價聚合物連接及藉由化學合成諸如鳥胺酸之胺基酸來進行插入或取代。溶酶體硫酸酯酶之衍生物亦適用作治療劑且可藉由本發明方法產生。

聚乙二醇(PEG)可與藉由本發明方法產生之溶酶體硫酸酯酶連接以提供較長活體內半衰期。PEG基團可具有任何適宜分子量且可為直鏈或分支鏈。PEG之平均分子量將較佳介於約2千道爾頓(「kDa」)至約100 kDa、更佳約5 kDa至約50 kDa、最佳約5 kDa至約10 kDa之範圍內。PEG基團將一般經由PEG部分上之反應性基團(例如醛基、胺基、硫醇基或酯基)與蛋白質部分上之反應性基團(例如醛基、胺基或酯基)進行醯化或還原性烷基化來與本發明之溶酶體硫酸酯酶連接。添加PEG部分至相關多肽可使用此項技術中熟知之技術進行。參見例如國際公開案第WO 96/11953號及美國專利第4,179,337號。

溶酶體硫酸酯酶多肽與PEG之連接通常發生在水相中且可易於藉由逆相分析HPLC來監測。聚乙二醇化肽可易於藉由製備HPLC純化且藉由分析HPLC、胺基酸分析及雷射脫附質譜分析表徵。

標記

在一些實施例中，治療性溶酶體硫酸酯酶經標記以有助於其偵測。「標記」或「可偵測部分」為可藉由光譜、光化學、生物化學、免疫化學、化學或其他物理手段來偵測之組成。舉例而言，適用於本發明中之標記包括(但不限於)放射性標記(例如³²P)、螢光團(例如螢光素)、電子緻密劑、酶(例如ELISA中通常所用)、生物素、地高辛、或半抗原以及蛋白質，該等半抗原以及蛋白質可例如藉由將放射性標記併入半抗原或肽中變得可偵測，或用於偵測可與半抗原或肽起特異性反應之抗體。

適用於本發明中之標記的實例包括(但不限於)螢光染料(例如異硫氰酸螢光素、德克薩斯紅(Texas red)、若丹明(rhodamine)及其類似物)、放射性標記(例如³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P)、酶(例如辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase)、鹼性磷酸酯酶(alkaline phosphatase)及通常用於ELISA中之其他酶)及比色標記(諸如膠態金、有色玻璃或塑料珠粒(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等))。

可根據此項技術中熟知之方法使標記與溶酶體硫酸酯酶之所要組分直接或間接偶合。較佳地，在一實施例中，使用異氰酸酯試劑結合本發明之活性劑來使標記與溶酶體硫酸酯酶共價結合。在本發明之一態樣中，本發明之雙官能異氰酸酯試劑可用於使標記與溶酶體硫酸酯酶結合以形成不連接活性劑的標記溶酶體硫酸酯酶結合物。標記溶酶體硫酸酯酶結合物可用作合成本發明之經標記結合物的中間物或可用於偵測溶酶體硫酸酯酶結合物。如上所指示，可使用多種標記，其中標記之選擇視所需敏感性、與溶酶體硫酸酯酶之所要組分結合之容易性、穩定性要求、可用儀器及處置規定而定。非放射性標記常常藉由間接手段連接。一般而言，配位體分子(例如生物素)與溶酶體硫酸酯酶共價結合。接著配位體與另一分子(例如抗生蛋白鏈菌素)結合，該另一分子固有地為可偵測的或與信號系統(諸如可偵測酶、螢光化合物或化學發光化合物)共價結合。

本發明之溶酶體硫酸酯酶亦可與信號產生化合物直接結合，例如與酶或螢光團結合。適用作標記之酶包括(但不限於)水解酶，特定言之磷酸酶、酯酶及醣苷酶(glycosidase)；或氧化酶，特定言之過氧化酶。適用作標記之螢光化合物(亦即螢光團)包括(但不限於)螢光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹磺醯基、傘酮(umbelliferone)等。適合螢光團之其他實例包括(但不限於)曙紅(eosin)、TRITC-胺、奎寧(quinine)、螢光素W、吖啶黃(acridine yellow)、麗絲胺若丹明(lissamine rhodamine)、B磺醯氯赤蘚紅(B sulfonyl chloride erythroscein)、釕(參，聯吡錠)、德克薩斯紅、菸醯胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide)、黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide)等。適用作標記之化學發光化合物包括(但不限於)螢光素及2,3-二氫酞嗪二酮，例如魯米諾(luminol)。關於可用於本發明方法中之各種標記系統或信號產生系統之評述，參見美國專利第4,391,904號。

用於偵測標記之手段為熟習此項技術者所熟知。因此，舉例而言，當標記具放射性時，偵測手段包括閃爍計數器或如自動放射攝影術中之照相膠片。當標記為螢光標記時，其可藉由用適當波長之光激發螢光染料並偵測所得螢光來偵測。可藉由使用諸如電荷耦合器件(charge coupled device，CCD)或光電倍增器(photomultiplier)及其類似物之電子偵測器來目視偵測螢光。類似地，可藉由提供酶之適當受質並偵測所得反應產物來偵測酶標記。可簡單地藉由觀測與標記相關之顏色來偵測比色標記或化學發光標記。適用於本發明方法中之其他標記及偵測系統將易於為熟習此項技術者顯而易知。此等經標記之調節劑及配位體可用於診斷疾病或健康狀況。

在一較佳實施例中，方法包含自內體運輸有缺陷之細胞株產生活性高度磷酸化溶酶體硫酸酯酶之步驟。在一尤其較佳實施例中，方法包含自CHO細胞株G71或其衍生物產生活性高度磷酸化重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之步驟。諸如(但不限於)GALNS之溶酶體硫酸酯酶之產生包含以下步驟：(a)產生共表現重組人類溶酶體硫酸酯酶(例如N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS))與重組人類硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)之G71或G71衍生物細胞株；(b)培養人類溶酶體硫酸酯酶與SUMF1共表現細胞株；及(c)按比例放大人類溶酶體硫酸酯酶與SUMF1共表現細胞株至生物反應器中以產生溶酶體硫酸酯酶。在較佳實施例中，基本上如本文在以下所述，將人類溶酶體硫酸酯酶(例如N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS))及人類SUMF1 cDNA次選殖至哺乳動物表現載體中。

為產生細胞株，用人類GALNS哺乳動物表現載體、人類SUMF1哺乳動物表現載體及選擇標記基因共轉染G71或G71S(適應於在無血清懸浮培養物中生長之G71純系)，且選擇穩定轉型體。在穩定轉染物之第一輪次選殖後，使用螢光受質選擇細胞株且明確指定。分別分析G71或G71S細胞株在具有微載體(microcarrier)之旋轉器中或在懸浮培養物中之細胞比產率(皮克產物/細胞)。鑑別人類GALNS之最佳產生者且按比例放大至生物反應器中以產生臨床前物質。

在另一實施例中，本發明提供一種量測重組人類溶酶體酶降解天然受質之活性的細胞基檢定。該方法包含(a)在溶酶體酶之天然受質累積之條件下培養溶酶體酶缺乏的經分離人類細胞；(b)使該細胞與該溶酶體酶接觸；(c)溶解該細胞；(d)向細胞溶解產物中添加酶，該酶(i)對該等天然受質具有特異性，且(ii)使小寡醣自該等天然受質裂解；(e)以可偵測部分標記該等小寡醣；(f)視情況分離該等經標記之小寡醣；(g)偵測該等經標記之小寡醣；及(h)藉由比較(i)來自與該溶酶體酶接觸之細胞的經標記小寡醣之量與(ii)來自未與該溶酶體酶接觸之細胞的經標記小寡醣之量來測定該溶酶體酶降解天然受質之活性，其中(h)(i)相較於(h)(ii)之降低指示該溶酶體酶降解天然受質之活性。在一實施例中，小寡醣為單醣、雙醣或三醣。在一相關實施例中，小寡醣為雙醣。

在一些實施例中，溶酶體酶係選自由以下組成之群：芳基硫酸酯酶B(ARSB)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、磺醯胺酶/肝素-N-硫酸酯酶(SGSH)、N-乙醯葡糖胺-硫酸酯酶(G6S)及N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。在一些實施例中，溶酶體酶為α-L-艾杜糖醛酸酶(IDU)。在一些實施例中，溶酶體酶為酸性α-葡糖苷酶(GAA)。在一些實施例中，溶酶體酶為β-葡萄糖苷酸酶(GUSB)。在一些實施例中，溶酶體酶為β-半乳糖苷酶(GLB1)。

可用於細胞基檢定中之適合人類細胞包括待測試之溶酶體酶缺乏，因此可累積溶酶體酶之天然受質的任何人類細胞。舉例而言，可使用天然展現活性完全(100%)或部分缺乏(例如活性降低30%、50%、70%、80%、90%、95%或95%以上)之細胞。可使用表現活性減弱之突變酶的細胞、或源於罹患溶酶體儲積疾病(例如黏多醣病)之患者的細胞。可使用例如經由向編碼基因或其啟動子或其他調控區引入突變而經重組改變以剔除或降低溶酶體酶活性之細胞。可使用經處理以降低溶酶體酶活性(例如用反義物或RNAi處理以降低酶表現)之細胞。

使小寡醣自碳水化合物裂解(消化)且對溶酶體酶之天然受質具有「特異性」(亦即主要消化該等天然受質)之適合酶可由一般技術者加以選擇。舉例而言，對於偵測GALNS或GLB1(降解硫酸角質素之酶)之活性，步驟(d)之酶可為硫酸角質素酶II或主要對硫酸角質素起作用之任何酶。作為另一實例，對於偵測IDU、ARSB、IDS或GUSB(降解硫酸皮膚素之酶)，步驟(d)之酶可為軟骨素酶ABC或主要對硫酸皮膚素起作用之任何酶。作為另一實例，對於偵測IDU、IDS、SGHS、G6S或GUSB(降解硫酸乙醯肝素之酶)，步驟(d)之酶可為乙醯肝素酶I或乙醯肝素酶II或兩者。作為另一實例，對於偵測GAA(降解肝糖之酶)，步驟(d)之酶可為α-澱粉酶或主要對肝糖起作用之任何酶。

III.純化溶酶體硫酸酯酶

含有重組人類GALNS之生物反應器物質經0.2 μm無菌過濾且保持在4℃下。將生物反應器物質直接裝載於捕捉管柱上，或藉由超濾濃縮10至20倍，隨後裝載於捕捉管柱上。將生物反應器物質或經濃縮生物反應器物質之pH值調整至pH 4.5，接著裝載於藍色-瓊脂糖凝膠管柱上，依序用20 mM乙酸鹽/磷酸鹽、50 mM NaCl(pH 4.5)及20 mM乙酸鹽/磷酸鹽、50 mM NaCl(pH 6.0)洗滌，且用20 mM乙酸鹽/磷酸鹽、100 mM NaCl(pH 7.0)溶離。接著將藍色-瓊脂糖凝膠管柱溶離液裝載於Fractogel SE Hi-Cap上，依序用20 mM乙酸鹽/磷酸鹽、50 mM NaCl(pH 5.0)及20 mM乙酸鹽/磷酸鹽、50 mM NaCl(pH 5.5)洗滌，且用20 mM乙酸鹽/磷酸鹽、50-350 mM NaCl梯度(pH 5.5)溶離。在10 mM NaOAc、1 mM NaH₂PO₄、0.005% Tween-80(Tween-80)(pH 5.5)中調配Fractogel SE Hi-Cap溶離液。

或者，將含有重組人類GALNS之生物反應器物質藉由超濾濃縮20倍，隨後裝載於捕捉管柱上。將經濃縮生物反應器物質之pH值調整至pH 4.5，過濾接著裝載於Fractogel SE Hi-Cap管柱上，依序用10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、50 mM NaCl(pH 4.5)及10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、50 mM NaCl(pH 5.0)洗滌，且用10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、140 mM NaCl(pH 5.0)溶離。接著將Fractogel SE Hi-Cap管柱溶離液調整至500 mM NaCl(pH 7.0)且裝載於Zn螯合瓊脂糖凝膠(Zn-IMAC)管柱上，用10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、125 mM NaCl、10 mM咪唑(pH 7.0)洗滌，且用10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、125 mM NaCl、90 mM咪唑(pH 7.0)溶離。將Zn螯合瓊脂糖凝膠(Zn-IMAC)管柱溶離液調整至pH 3.5以達成低pH值病毒不活化，調整至10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、2 M NaCl(pH 5.0)，接著裝載於ToyoPearl丁基650M管柱上，用10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、2 M NaCl(pH 5.0)洗滌，且以10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、0.7 M NaCl(pH 5.0)溶離。將ToyoPearl丁基650M溶離液超濾且透濾於20 mM乙酸鹽、1 mM磷酸鹽、150 mM NaCl(pH 5.5)中，接著在20 mM乙酸鹽、1 mM磷酸鹽、150 mM NaCl、0.01% Tween-20(pH 5.5)中調配。

或者，過濾含有重組人類GALNS之生物反應器物質，藉由超濾/透濾濃縮20倍，接著經活性碳過濾，隨後裝載於捕捉管柱上。經濃縮之生物反應器物質在電導率約55±5 mS/cm下裝載於Zn螯合瓊脂糖凝膠FF(Zn-IMAC)管柱上，依序用10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、500 mM NaCl(pH 7.0)及10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、125 mM NaCl(pH 7.0)(緩衝液A)洗滌，接著用70%緩衝液A與30% 10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、125 mM NaCl、300 mM咪唑(pH 7.0)(緩衝液B)之混合物溶離。Zn螯合瓊脂糖凝膠FF(Zn-IMAC)管柱溶離液調整至電導率約6.0±0.5 mS/cm及pH 7.0且裝載於Mustang Q過濾器上以潛在移除病毒。Mustang Q濾液調整至pH 4.5±0.1，依次經CUNO 60ZA過濾器及0.2 μm線內過濾器過濾，接著裝載於Fractogel EMD SE Hi-Cap(M)管柱上，依序用10 mM乙酸鹽1磷酸鹽、50 mM NaCl(pH 4.5)及80%緩衝液A(10 mM乙酸鹽/磷酸鹽(pH5.0))與20%緩衝液B(10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、250 mM NaCl(pH 5.0))之混合物洗滌，且用20%-75%緩衝液B(於80%-25%緩衝液A中)之線性梯度溶離。Fractogel EMD SE Hi-Cap管柱溶離液接著藉由添加0.2 M檸檬酸鹽緩衝液(pH 3.4)調整至pH 3.5±0.1以達成低pH值病毒不活化。低pH值病毒不活化之Fractogel EMD SE Hi-Cap管柱溶離液調整至2 M NaCl及pH 5.0(藉由添加0.2 M檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0))，接著裝載於ToyoPearl丁基650M管柱上，用10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、2 M NaCl(pH 5.0)(緩衝液A)洗滌，接著用35%緩衝液A與65%緩衝液B(10 mM乙酸鹽/磷酸鹽(pH 5.0))之混合物溶離。ToyoPearl丁基650M溶離液緩衝液交換至20 mM NaOAc/HOAc、50 mM NaH₂PO₄、30 mM精胺酸鹽酸鹽、2%(w/v)山梨糖醇(pH 5.4)中，且視情況調整至3 mg/mL GALNS之最終濃度。經緩衝液交換且濃度經調整之GALNS經病毒過濾器(DV20)及DNA過濾器(Mustang Q)過濾以移除任何殘餘病毒及DNA。添加Tween-20(亦稱為聚山梨醇酯20或PS20)至最終濃度0.01%(w/v)，從而產生散裝原料藥(BDS)。BDS儲存在2-8℃下或冷凍。

或者，過濾含有重組人類GALNS之生物反應器物質，藉由超濾/透濾濃縮20倍，接著經活性碳過濾，隨後裝載於捕捉管柱上。經濃縮之生物反應器物質在電導率約50±5 mS/cm下裝載於Zn螯合瓊脂糖凝膠FF(Zn-IMAC)管柱上，依序用10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、500 mM NaCl(pH 7.0)及10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、125 mM NaCl(pH 7.0)(緩衝液A)洗滌，接著用70%緩衝液A與30% 10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、125 mM NaCl、300 mM咪唑(pH 7.0)(緩衝液B)之混合物溶離。Zn螯合瓊脂糖凝膠FF(Zn-IMAC)管柱溶離液用1.75 M乙酸鹽(pH 4.0)調整至pH 4.5±0.1，經Millipore COHC過濾器過濾，以30:70(v/v)比率與10 mM乙酸鹽/磷酸鹽(pH 4.5)摻合，接著在電導率<7 mS/cm下裝載於Fractogel EMD SE Hi-Cap(M)管柱上，依序用10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、50 mM NaCl(pH 4.5)及80%緩衝液A(10 mM乙酸鹽/磷酸鹽(pH 5.0))與20%緩衝液B(10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、250 mM NaCl(pH 5.0))之混合物洗滌，且用20%-75%緩衝液B(於80%-25%緩衝液A中)之線性梯度溶離。Fractogel EMD SE Hi-Cap管柱溶離液接著藉由添加0.4 M檸檬酸鹽緩衝液(pH 3.4)調整至pH 3.5±0.1以達成低pH值病毒不活化。低pH值病毒不活化之Fractogel EMD SE Hi-Cap管柱溶離液調整至2 M NaCl及pH 5.05±0.1(藉由添加0.4 M檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0))，與10 mM乙酸鹽/磷酸鹽(pH 5)(含有5 M NaCl以達成2 M NaCl濃度)摻合，接著裝載於ToyoPearl丁基650M管柱上，依序用10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、2 M NaCl(pH 4.4±0.1)及10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、2.5 M NaCl(pH 5.0)(緩衝液A)洗滌，接著依次用100%至32%緩衝液A及0%至68%緩衝液B(10 mM乙酸鹽/磷酸鹽(pH 5.0))之線性梯度及32%緩衝液A與68%緩衝液B之混合物溶離。ToyoPearl丁基650M溶離液緩衝液交換至20 mM NaOAc/HOAc、50 mM NaH₂PO₄、30 mM精胺酸鹽酸鹽、2%(w/v)山梨糖醇(pH 5.4)中，且視情況調整至3 mg/mL GALNS之最終濃度。經緩衝液交換且濃度經調整之GALNS經病毒過濾器(DV20)及DNA過濾器(Mustang Q)過濾以移除任何殘餘病毒及DNA。添加Tween-20(亦稱為聚山梨醇酯20或PS20)至最終濃度0.01%(w/v)，從而產生散裝原料藥(BDS)。BDS儲存在2-8℃下或冷凍。

下文詳述重組人類GALNS之純化，且下文詳述根據自以上方案修改之程序純化重組人類GALNS。

重組人類GALNS酶如實例III中所述表現於G71S細胞中且如實例V或實例VI中所述加以純化。本發明之經純化重組人類GALNS可與文獻報導之其他GALNS製劑進行比較。Masue等人,J. Biochem. 110:965-970,1991描述來自人類胎盤之GALNS的純化及表徵。發現經純化酶之分子質量為120 kDa，由40 kDa及15 kDa之多肽組成，後者顯示為醣蛋白。因此，Masue等人GALNS酶似乎對應於圖5中描述之經加工形式。Bielicki等人,Biochem. J. 279:515-520,1991描述來自人類肝之GALNS的純化及表徵。當藉由SDS-PAGE分析時，酶在非還原條件下具有70 kDa之分子質量且在還原條件下具有分子質量57 kDa、39 kDa及19kDa。Bielicki等人,Biochem J. 311: 333-339,1995描述來自中國倉鼠卵巢細胞之重組人類GALNS的純化及表徵。在進行SDS-PAGE時，發現經純化酶在非還原條件下具有58-60 kDa之分子質量且在還原條件下具有55-57 kDa、39 kDa及38 kDa之分子質量。因此，Bielicki等人GALNS酶似乎對應於圖5中描述的酶之加工前(前驅體)形式與經加工形式的混合物。相比較而言，本發明之重組人類GALNS酶幾乎完全由酶之前驅體形式組成(參見圖9及圖12)，或主要(亦即至少約85%)由酶之前驅體形式組成(參見圖10)。

IV.溶酶體硫酸酯酶及溶酶體儲積疾病

溶酶體硫酸酯酶為全長酶或其至少保留酶之實質量(例如至少約50%、較佳至少約75%、且更佳至少約90%)之實質上所有或所有治療活性或生物活性(例如硫酸酯酶活性)的任何片段、突變體、變異體或衍生物。

在一些實施例中，溶酶體硫酸酯酶為若未經表現或產生，或若表現或產生實質上降低，則將導致疾病，包括(但不限於)溶酶體儲積疾病的溶酶體硫酸酯酶。在一些實施例中，溶酶體硫酸酯酶為若不經表現或產生，或若表現或產生實質上降低，可能不會導致疾病，但其不存在或表現或產生降低與疾病，包括(但不限於)溶酶體儲積疾病相關的溶酶體硫酸酯酶。較佳地，溶酶體硫酸酯酶源於人類或自人類獲得。

較佳地，在溶酶體儲積疾病之治療中，溶酶體硫酸酯酶為見於細胞中之酶，其若未經表現或產生，或表現或產生實質上降低，則將導致溶酶體儲積疾病。或者，在溶酶體儲積疾病之治療中，溶酶體硫酸酯酶為如下酶，其不存在或表現或產生實質上降低與疾病相關，但其不存在或表現或產生實質上降低本身可能不會導致疾病。較佳地，溶酶體硫酸酯酶源於人類或自人類獲得。

較佳地，酶為溶酶體硫酸酯酶，諸如芳基硫酸酯酶A(ARSA)(Genbank寄存編號NP_000478(同功異型物a)、Genbank寄存編號NP_001078897(同功異型物b)及其他變異體)、芳基硫酸酯酶B/N-乙醯葡糖胺4-硫酸酯酶(ARSB)(Genbank寄存編號P15848)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)(Genbank寄存編號NP_000193(同功異型物a)、Genbank寄存編號NP_006114(同功異型物b))、磺醯胺酶/肝素-N-硫酸酯酶(SGSH)(Genbank寄存編號NP_000190)、N-乙醯葡糖胺-硫酸酯酶(G6S)(Genbank寄存編號NP_002067)及半乳糖6-硫酸酯酶/N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)(Genbank寄存編號NP_000503)。溶酶體儲積疾病及其中缺乏之適用作治療劑之溶酶體硫酸酯酶的表格如下：

在較佳實施例中，溶酶體硫酸酯酶為由內體酸化缺乏之細胞株產生的重組人類溶酶體硫酸酯酶。在更佳實施例中，重組人類溶酶體硫酸酯酶具有活性且具有高含量之如在「定義」下指定之磷酸化寡醣。在最佳實施例中，溶酶體硫酸酯酶為活性高度磷酸化重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。

因此，可使用本發明方法來治療或預防之溶酶體儲積疾病包括(但不限於)異染性腦白質營養不良或MLD、馬拉二氏症候群或MPS VI、亨特症候群或MPS II、聖菲利柏A症候群或MPS IIIa、聖菲利柏D症候群或MPS IIId，及莫奎歐A症候群或MPS IVa。在一尤其較佳實施例中，溶酶體硫酸酯酶為其缺乏會引起莫奎歐A症候群或MPS IVa之溶酶體硫酸酯酶。在另一尤其較佳實施例中，溶酶體硫酸酯酶為其缺乏與人類溶酶體儲積疾病，諸如多種硫酸酯酶缺乏症或MSD相關之溶酶體硫酸酯酶。

因此，根據上表，對於各疾病，溶酶體硫酸酯酶將較佳包含疾病中缺乏之特定活性溶酶體硫酸酯酶。舉例而言，對於涉及MPS II之方法，較佳酶為艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。對於涉及MPS IIIA之方法，較佳酶為磺醯胺酶/肝素-N-硫酸酯酶。對於涉及MPS IIID之方法，較佳酶為N-乙醯葡糖胺6-硫酸酯酶。對於涉及MPS IVA之方法，較佳酶為半乳糖6-硫酸酯酶/N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶。對於涉及MPSVI之方法，較佳酶為N-乙醯半乳糖胺4-硫酸酯酶。對於涉及異染性腦白質營養不良(MLD)之方法，較佳酶為芳基硫酸酯酶A。對於涉及多種硫酸酯酶缺乏症(MSD)之方法，酶可為芳基硫酸酯酶A、芳基硫酸酯酶B/N-乙醯葡糖胺4-硫酸酯酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、磺醯胺酶/肝素-N-硫酸酯酶、N-乙醯葡糖胺-硫酸酯酶或半乳糖6-硫酸酯酶/N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶，且較佳酶為半乳糖6-硫酸酯酶/N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶。

V.第IVA型黏多醣病(莫奎歐症候群，MPS IVA)

第IVA型黏多醣病(莫奎歐症候群，MPS IVa)為屬於黏多醣儲積疾病群的遺傳性常染色體隱性疾病。莫奎歐症候群係由為降解兩種葡糖胺聚糖(GAG)硫酸角質素(KS)及軟骨素-6-硫酸酯(C6S)所需之溶酶體酶缺乏所引起。詳言之，MPS IVa之特徵在於不存在酶N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)及KS在尿中排泄。GALNS之缺乏導致異常大量之黏多醣在骨骼組織之主要組分透明軟骨中累積。所有患者皆患有全身性骨骼結構不良。其他症狀在不同患者間的嚴重性有所不同，且尤其可包括聽力喪失、白內障、脊椎不穩定性、心臟瓣膜疾病及呼吸道問題。

GALNS使KS之半乳糖-6-硫酸酯及C6S之N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯的硫酸酯鍵水解。人類GALNS表現為僅具有2個潛在天冬醯胺連接之糖基化位點之55-60 kDa前驅蛋白。甘露糖-6-磷酸酯(M6P)為存在於GALNS分子上之寡醣的一部分。M6P由溶酶體細胞表面之受體所識別且因此對於GALNS的高效攝取至關重要。

如同所有硫酸酯酶，GALNS需要由硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)基因所編碼之甲醯甘胺酸-活化酶(FGE)加工以獲得活性。由於此活化步驟涉及將活性位點半胱胺酸殘基轉譯後修飾成C_α-甲醯甘胺酸(FGly)，所以重組硫酸酯酶之過度表現會導致產生具有低比活性之硫酸酯酶(亦即經活化與未經活化硫酸酯酶之混合物)與具有低產生效價(亦即未經活化之硫酸酯酶降解及/或不分泌)之硫酸酯酶兩者。

本發明之一目標在於提供一種適用於治療莫奎歐症候群及由酶N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶缺乏引起或與酶N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶缺乏相關之其他疾病(例如多種硫酸酯酶缺乏症(MSD))的活性高度磷酸化人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶。該種活性高度磷酸化人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶能夠定位於KS及C6S累積之組織，具有足夠M6P含量以供高效攝取，具有足夠高之FGly百分比以達成酶活性，且具有相對較高之產生程度。

應瞭解本文所述之本發明方法適用於產生其他溶酶體硫酸酯酶，例如芳基硫酸酯酶A(ARSA)、芳基硫酸酯酶B/N-乙醯葡糖胺4-硫酸酯酶(ARSB)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、磺醯胺酶/肝素-N-硫酸酯酶(SGSH)及N-乙醯葡糖胺-硫酸酯酶(G6S)，該等其他溶酶體硫酸酯酶適用於治療由其缺乏引起或特徵在於其缺乏之溶酶體儲積疾病。

VI.醫藥組合物及投藥

本發明之溶酶體硫酸酯酶可藉由多種途徑來投與。對於口服製劑，溶酶體硫酸酯酶可單獨使用或與適當添加劑組合使用以製備錠劑、散劑、顆粒劑或膠囊劑，例如與習知添加劑，諸如乳糖、甘露糖醇、玉米澱粉或馬鈴薯澱粉；與黏合劑，諸如結晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯膠、玉米澱粉或明膠；與崩解劑，諸如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉或羧甲基纖維素鈉；與潤滑劑，諸如滑石或硬脂酸鎂；及必要時與稀釋劑、緩衝劑、濕潤劑、防腐劑及調味劑組合。

可藉由將本發明之溶酶體硫酸酯酶溶解、懸浮或乳化於水性或非水性溶劑(諸如植物油或其他類似油、合成脂族酸甘油酯、高碳脂族酸酯或丙二醇)中；且必要時與習知添加劑(諸如增溶劑、等張劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑及防腐劑)一起調配來將本發明之溶酶體硫酸酯酶調配成注射製劑。

本發明之溶酶體硫酸酯酶可以欲經由吸入投與之氣溶膠調配物形式加以利用。本發明之溶酶體硫酸酯酶可經調配於經加壓之可接受的推進劑，諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣及其類似物中。

此外，本發明之溶酶體硫酸酯酶可藉由與多種基質，諸如乳化基質或水溶性基質混合而製成栓劑。本發明之溶酶體硫酸酯酶可經由栓劑經直腸投與。栓劑可包括諸如可可脂、卡波蠟(carbowax)及聚乙二醇之媒劑，其在體溫下熔融，但在室溫下凝固。

可提供用於經口或經直腸投藥之本發明之溶酶體硫酸酯酶的單位劑型，諸如糖漿、酏劑及懸浮液，其中各劑量單位(例如，一茶匙量、一湯匙量、錠劑或栓劑)含有預定量之含有溶酶體硫酸酯酶之活性劑。類似地，用於注射或靜脈內投藥之單位劑型可包含呈於無菌水、生理食鹽水或另一醫藥學上可接受之載劑中之溶液形式的溶酶體硫酸酯酶。

在實際使用中，可根據習知醫藥混配技術使本發明之溶酶體硫酸酯酶作為活性成分與一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑一起組合成均勻混雜物。載劑、稀釋劑或賦形劑可視投藥(例如經口或非經腸(包括靜脈內))所需之較佳製劑形式而定採用多種形式。在製備用於口服劑型之溶酶體硫酸酯酶組合物時，可採用任何常用醫藥介質，諸如，在口服液體製劑(例如懸浮液、酏劑及溶液)之情況下為水、二醇、油、醇、調味劑、防腐劑、著色劑及其類似物；或在口服固體製劑(例如散劑、硬膠囊及軟膠囊及錠劑)之情況下的載劑，諸如澱粉、糖、微晶纖維素、稀釋劑、造粒劑、潤滑劑、黏合劑、崩解劑及其類似物，其中固體口服製劑優於液體製劑。

本發明提供本文所述之任何GALNS酶製劑之調配物，視情況蛋白質濃度為約0.1至5 mg/mL(或0.5至1.5 mg/mL)，且視情況pH值為約5-5.8，該等調配物包含(i)可有效減少該GALNS酶去磷酸化之量之磷酸鹽緩衝劑；及(ii)穩定量之一或多種選自由以下組成之群的穩定劑：胺基酸鹽、胺基酸緩衝劑、界面活性劑及多元醇。在一些實施例中，調配物可包含第二緩衝劑。在某些實施例中，調配物包含本文所述之任何經純化重組人類GALNS酶製劑、濃度介於約25 mM與約75 mM之間的磷酸鹽緩衝劑、濃度介於約10 mM與約30 mM之間的乙酸鹽緩衝劑、及會減少蛋白質聚集之穩定劑。在一些實施例中，調配物包含精胺酸或組胺酸鹽或緩衝劑、及視情況非離子界面活性劑、及視情況三元或三元以上多元醇(糖醇)。在特定實施例中，調配物包含精胺酸鹽或緩衝劑、聚山梨醇酯(視情況聚山梨醇酯20)及山梨糖醇。在任何此等實施例中，磷酸鹽緩衝劑可為NaH₂PO₄。在任何此等實施例中，乙酸鹽緩衝劑可為NaOAc/HOAc。

第二緩衝劑可為適於維持pH值在所要範圍內之任何試劑。適合緩衝劑包括Tris、檸檬酸鹽、丁二酸鹽、乙酸鹽、葡糖酸鹽或其他有機酸緩衝劑。在一些實施例中，穩定劑為胺基酸鹽或緩衝劑，視情況為精胺酸、離胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、丙胺酸、鳥胺酸、白胺酸、2-苯丙胺酸或麩胺酸之鹽或緩衝劑。在一些實施例中，穩定劑為界面活性劑，視情況為非離子界面活性劑。適合界面活性劑包括聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)、泊洛沙姆(poloxamer)(例如泊洛沙姆188或184)、聚氧乙烯衍生物、聚氧丙烯衍生物、單月桂酸鈉及SDS。已知非離子界面活性劑之非限制性實例包括具有環氧烷(通常環氧乙烷且通常6-30個環氧乙烷基團)之脂族一級或二級直鏈或分支鏈醇或酚。其他已知非離子界面活性劑包括單烷基或二烷基烷醇醯胺、烷基聚葡糖苷及多羥基脂肪酸醯胺。已知陰離子界面活性劑之非限制性實例包括烷基硫酸、烷基醚硫酸、烷芳基磺酸、烷基丁二酸、烷基磺基丁二酸、N-烷氧基肌胺酸、烷基磷酸、烷基醚磷酸、烷基醚羧酸及α-烯烴磺酸之鈉鹽、銨鹽及單乙醇胺鹽、二乙醇胺鹽及三乙醇胺鹽。烷基通常含有8至18個碳原子且可不飽和。烷基醚硫酸鹽、烷基醚磷酸鹽及烷基醚羧酸鹽可含有每個分子1至10個環氧乙烷或環氧丙烷單元且較佳含有每個分子2至3個環氧乙烷單元。已知陰離子界面活性劑包括月桂基硫酸鈉或月桂基硫酸銨及月桂基醚硫酸鈉或月桂基醚硫酸銨。已知兩性界面活性劑之非限制性實例包括烷基胺氧化物、烷基甜菜鹼、烷基醯胺基丙基甜菜鹼、烷基磺基甜菜鹼、烷基甘胺酸鹽、烷基羧基甘胺酸鹽、烷基兩性丙酸鹽、烷基醯胺基丙基羥磺酸甜菜鹼、醯基牛磺酸鹽及醯基麩胺酸鹽，其中烷基及醯基具有8至18個碳原子。

在一些實施例中，穩定劑為多元醇或糖，較佳三元或三元以上糖醇。適合多元醇包括赤藻糖醇(erythritol)、阿拉伯糖醇(arabitol)、麥芽糖醇、纖維二糖醇(cellobiitol)、乳糖醇、甘露糖醇、蘇糖醇(threitol)、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、內消旋肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油(glycerol)及丙三醇(glycerin)。已知多元醇亦包括衍生自乳糖、海藻糖(trehalose)及水蘇糖(stachyose)之醇。已知非還原糖包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖(melezitose)及棉子糖(raffinose)。已知糖亦包括木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；雙醣，諸如乳糖、麥芽糖、蔗糖；三醣，諸如棉子糖；及多醣，諸如葡聚糖。

本發明亦提供一種防止經純化重組人類GALNS酶去磷酸化之方法，其包含混合該GALNS酶與可有效減少去磷酸化之量之磷酸鹽緩衝劑，視情況達到介於約25 mM與約75 mM之間的磷酸鹽緩衝劑最終濃度。在一些實施例中，經純化重組人類GALNS酶亦與第二緩衝劑，包括上述任何試劑混合。在一些實施例中，酶亦與穩定量之一或多種選自由以下組成之群的穩定劑混合：胺基酸鹽、胺基酸緩衝劑、界面活性劑及多元醇。在例示性實施例中，例如當在室溫(例如25℃)下儲存1週、2週、3週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月或6個月之後測試時，相較於相同酶於1 mM磷酸鹽緩衝液中之調配物，去磷酸化之量得以減少。在特定實施例中，在40℃下儲存此等時期之後進行加速穩定性測試。

在某些實施例中，GALNS調配物中去磷酸化之減少(相較於1 mM磷酸鹽緩衝液)可為至少約2%、約3%、約4%、約5%、約10%、約15%、約20%、約30%、約40%或約50%或50%以上。在另一實施例中，GALNS上雙磷酸化甘露糖7(BPM7)在調配物中之含量為約25%至約40%、或約30%至35%。

在任何前述調配物或方法之實施例中，GALNS酶皆可為重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)，其包含與SEQ ID NO:4之胺基酸27至522至少95%一致之胺基酸序列，且(i)具有至少約95%之純度，如在非還原條件下進行SDS-PAGE時藉由庫馬斯藍染色所測定，(ii)具有位置53之半胱胺酸殘基向Cα-甲醯甘胺酸(FGly)至少約80%之轉化率，及(iii)具有每條單體蛋白質鏈0.5至0.8條雙磷酸化寡甘露糖鏈，其中至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少98.5%、至少99%或至少99.5%之該GALNS酶係呈前驅體形式，如在還原條件下進行SDS-PAGE時藉由庫馬斯藍染色，或藉由SDS-毛細管凝膠電泳(SDS-CGE)所測定。

就經皮投藥途徑而言，經皮投與藥物之方法揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版(Gennaro等人編Mack Publishing Co.,1985)中。真皮或皮膚貼片為用於經皮傳遞本發明之溶酶體硫酸酯酶的較佳手段。貼片較佳提供諸如DMSO之吸收增強劑以增加溶酶體硫酸酯酶之吸收。用於經皮藥物傳遞之其他方法揭示於美國專利第5,962,012號、第6,261,595號及第6,261,595號中，該等專利各以全文引用的方式併入本文中。

醫藥學上可接受之賦形劑(諸如媒劑、佐劑、載劑或稀釋劑)為市售的。此外，醫藥學上可接受之輔助物質，諸如pH值調整劑及緩衝劑、張力調整劑、穩定劑、濕潤劑及其類似物亦為市售的。

在此等態樣之各者中，溶酶體硫酸酯酶組合物包括(但不限於)適於經口、經直腸、表面、非經腸(包括皮下、肌肉內及靜脈內)、經肺(經鼻或經頰吸入)或經鼻投藥之組合物，但在任何既定情況下，最適合途徑皆將部分取決於所治療病狀的性質及嚴重性及活性成分之性質。例示性投藥途徑為經口及靜脈內途徑。溶酶體硫酸酯酶組合物可便利地以單位劑型提供且藉由製藥技術中熟知之任何方法來製備。

由於錠劑及膠囊劑易於投與，故其代表最有利之口服單位劑型，在該情況下明顯會採用固體醫藥載劑。必要時，錠劑可藉由標準水性或非水性技術進行包衣。活性溶酶體硫酸酯酶在此等組合物中之百分比當然可變化且宜介於該單位之重量的約2%至約60%之間。

本發明之溶酶體硫酸酯酶組合物可囊封於病毒包膜或微脂粒中或與病毒包膜或微脂粒連接或併入細胞中加以投與。微脂粒為微胞(micellular)顆粒，其通常為球形且常為脂質。脂質體為由雙層膜形成之微脂粒。適合微脂粒包括(但不限於)單層微脂粒及多層脂質微脂粒或脂質體。可使用諸如在例如美國專利第4,394,448號中所述之技術的標準技術自多種脂質或磷脂化合物製備此等微脂粒及脂質體，該等脂質或磷脂化合物諸如磷脂醯膽鹼、磷脂酸、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯乙醇胺、鞘磷脂、糖脂、神經節苷脂等。此等微脂粒或脂質體可用於以細胞內方式投與溶酶體硫酸酯酶且傳遞溶酶體硫酸酯酶至目標器官。相關溶酶體硫酸酯酶之控制釋放亦可使用囊封達成(參見例如美國專利第5,186,941號)。

可使用使溶酶體硫酸酯酶組合物稀釋至血流中或較佳至少在血腦障壁外的任何投藥途徑。較佳地，溶酶體硫酸酯酶組合物經周邊、最佳經靜脈內或藉由心導管(cardiac catheter)來投與。頸靜脈內及頸動脈內注射亦適用。溶酶體硫酸酯酶組合物可局部或區域性投與，諸如腹膜內、皮下或肌肉內投與。在一態樣中，溶酶體硫酸酯酶組合物與一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑一起投與。

熟習此項技術者將易於瞭解劑量可隨特定溶酶體硫酸酯酶、症狀嚴重性及個體對副作用之易感性而變化。既定溶酶體硫酸酯酶之較佳劑量可易於由熟習此項技術者利用各種手段來確定，該等手段包括(但不限於)在患者、測試動物體內及在活體外進行之劑量反應及藥物動力學評估。

欲經投與之劑量亦可視個體需要、所要效應、所用特定溶酶體硫酸酯酶及所選投藥途徑而定。溶酶體硫酸酯酶之劑量在約0.2 pmol/kg至約20 nmol/kg之範圍內，較佳劑量在2 pmol/kg至2 nmol/kg之範圍內，且尤其較佳劑量在2 pmol/kg至200 pmol/kg之範圍內。或者，溶酶體硫酸酯酶之劑量可在0.01 mg/kg至1000 mg/kg之範圍內，較佳劑量可在0.1 mg/kg至100 mg/kg之範圍內，且尤其較佳劑量在0.1 mg/kg至10 mg/kg之範圍內。此等劑量將受例如(但不限於)特定溶酶體硫酸酯酶、醫藥組合物之形式、投藥途徑及特定溶酶體硫酸酯酶之作用部位的影響。

本發明之溶酶體硫酸酯酶適用於動物且特定言之人類之治療性、防治性及診斷性介入。溶酶體硫酸酯酶可顯示在特定組織優先累積。對於診斷性用途而言，較佳醫學適應症包括例如與相關目標器官(例如肺、肝、腎、脾)相關之任何病狀。

本發明方法可用於治療多種不同疾病病狀。在某些實施例中，特別關注在疾病病狀中使用本發明方法，在該等疾病病狀中，先前已鑑別具有所要活性之溶酶體硫酸酯酶，但其中溶酶體硫酸酯酶未充分地傳遞至目標部位、區域或隔室而不能產生完全令人滿意的治療結果。就此等溶酶體硫酸酯酶而言，產生活性高度磷酸化溶酶體硫酸酯酶之本發明方法可用於增強溶酶體硫酸酯酶之治療功效及治療指數。

治療意欲涵蓋與投與溶酶體硫酸酯酶相關之對個體有益之任何結果，包括患上疾病之可能性降低、預防疾病、減緩、阻止或逆轉疾病之進展或改善與折磨宿主之疾病病狀相關之症狀，其中改善或益處在廣義上加以使用以至少指代某一參數(例如與所治療之病理學病狀相關之症狀，諸如與其相關之發炎及疼痛)量值之減小。同樣，治療亦包括以下情況：完全抑制(例如防止發生或阻止，例如終止)病理學病狀或至少與其相關之症狀，以使宿主不再罹患該病理學病狀或至少不再罹患表徵該病理學病狀之症狀。

根據本發明方法，多種宿主或個體為可治療的。此等宿主一般為「哺乳動物」，其中此等術語用以廣泛地描述屬於哺乳綱(class mammalia)內之有機體，包括食肉目動物(例如狗及貓)、嚙齒目動物(例如小鼠、天竺鼠(guinea pig)及大鼠)及靈長目動物(例如人類、黑猩猩及猴)。在許多實施例中，宿主將為人類。

目前已大體地描述了本發明，經由以下參考以下實例，可更容易地瞭解本發明，該等實例提供用於產生及純化活性高度磷酸化溶酶體硫酸酯酶之例示性方案及其在治療溶酶體儲積疾病中之用途。該等實例僅出於說明性目的提供，而並不意欲以任何方式限制本發明之範疇。已作出努力來確保關於所用數字(例如量、溫度等)之準確性，但當然應允許一些實驗誤差及偏差。

實例 實例I 人類硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)及人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之哺乳動物表現載體

目標在於構築適於在經穩定轉染之細胞中產生足夠量之具有改良磷酸化程度之活性溶酶體硫酸酯酶的哺乳動物表現載體。

編碼含374個胺基酸之多肽的全長人類硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)cDNA(參見美國專利申請案第US 20005/0123949號，公開日期2005年6月9日；及第US 2004/0229250號，公開日期2004年11月8日，兩者均以全文引用的方式併入本文中)選殖至含有人類CMV增強子-啟動子及多重選殖位點之哺乳動物表現載體cDNA4(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。藉由存在牛生長激素聚腺苷酸化序列來確保高效之轉錄終止。選擇標記為在EM-7啟動子及SV40早期聚腺苷酸化序列控制下之勻黴素(zeocin)抗性基因。所得質體稱為pcDNA4 SUMF1。圖1及圖2中分別展示人類SUMF1聚核苷酸(SEQ ID NO:1)及多肽(SEQ ID NO:2)序列。

編碼含522個胺基酸之多肽(包括含26個胺基酸之信號肽)的全長人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)cDNA(參見Tomatsu等人,Biochem. Biophys. Res. Commun. 181(2):677-683,1991)選殖至含有與兔β-血球蛋白(globin)IVS2內含子連接之人類CMV強化子-啟動子及多重選殖位點的哺乳動物表現載體pCIN(BioMarin)中。藉由存在牛生長激素聚腺苷酸化序列來確保高效之轉錄終止。選擇標記為攜帶點突變以降低酶效率之新黴素(neomycin)磷酸轉移酶基因。以弱HSV-tk啟動子進一步阻止減弱之標記。所得質體稱為pCIN 4A。圖3及圖4中分別展示人類GALNS聚核苷酸(SEQ ID NO:3)及多肽(SEQ ID NO:4)序列。

為了增加SUMF1及GALNS之表現量，骨架/基質附著區(MAR)元件(參見Mermod等人，美國專利第7,129,062號)選殖至SUMF1及GALNS表現質體中。

藉由用BamHI及HincII消化經P<1_68 X_X NcoI填充之MAR(Selexis)，接著將釋放之MAR片段插入用BglII及NruI消化之pcDNA4 SUMF1中來製備BMAR SUMF1。

用HindIII及XbaI消化經P<1_68 NcoI填充之(MAR)SV40EGFP(Selexis)以移除EGFP基因，接著插入藉由用HindIII及XbaI消化而自pcDNA4 SUMF1釋放的SUMF1基因來製備PMAR SUMF1。

藉由用PmeI及SpeI消化BMAR SUMF1以移除SUMF1基因，接著插入藉由用PmeI及SpeI消化而自pCIN 4A釋放之GALNS基因來製備BMAR 4A。

藉由用HindIII及XbaI消化經P<1_68 NcoI填充之(MAR)SV40 EGFP(Selexis)以移除EGFP基因，接著插入藉由用HindIII及XbaI消化而自pCIN 4A釋放之GALNS基因來製備PMAR 4A。

全長人類GALNS cDNA亦選殖至哺乳動物表現載體pcDNA4(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。用HindIII及XbaI消化pCDNA4 SUMF1以移除SUMF1 cDNA，且用HindIII及XbaI消化pCIN 4A以分離GALNS cDNA。GALNS cDNA HindIII/XbaI片段連接至pcDNA4載體HindIII/XbaI片段中。所得質體稱為pcDNA4-4A。

藉由使用自New England Biolabs獲得之酶進行限制定位(restriction mapping)來確認pCIN 4A、BMAR及pCDNA4-4A表現載體中GALNS基因之完整性。PMAR 4A表現載體未經定位。

圖5中描述人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之經完全加工形式的結構。GALNS表現為具有含26個胺基酸之信號肽序列之含522個胺基酸的多肽。含496個胺基酸之GALNS多肽以該酶之分子量約55-60 kDa的加工前(前驅體)形式分泌。在活性GALNS中，在前驅體或經完全加工之GALNS多肽之位置53(對應於全長GALNS多肽之位置79)處的半胱胺酸殘基已由硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)轉化成C_α-甲醯甘胺酸(FGly)。在溶酶體中，GALNS在經完全加工之GALNS多肽之位置325之後裂解，從而產生約40 kDa及19 kDa之GALNS肽片段。此等GALNS肽係由經完全加工之GALNS多肽之位置282及393處的半胱胺酸(C)殘基之間的二硫橋鍵來聯接。在經完全加工之GALNS多肽之位置178及397處存在兩個典型N-連接糖基化位點。N178上已發現包含2個甘露糖-6-磷酸酯殘基之雙磷酸化甘露糖7(BPM7)，但N397上未有發現。

實例II 共表現人類硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)與人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之G71S細胞株

目標在於產生能夠產生具有改良磷酸化程度之活性溶酶體硫酸酯酶的細胞株。

G71細胞(Rockford K. Draper)係直接源於CHO-K1(ATCC CCL-61)。G71細胞株為內體酸化溫度敏感之CHO-K1突變體，已觀測到在高溫下，該突變體會產生若干酶之總蛋白質分泌及甘露糖殘基上磷酸化的差異(Park等人,Somat. Cell Mol. Genet. 17(2): 137-150,1991；Marnell等人,J. Cell. Biol. 99(6): 1907-1916,1984)。

將G71細胞維持於34℃下補充有2.5%胎牛血清、2 mM麩醯胺酸、健大黴素(gentamycin)及兩性黴素(amphotericin)之BioWhittaker UltraCHO培養基中。

為允許更容易使用細胞株產生蛋白質，使用使固著依賴性血清依賴性哺乳動物細胞適於高密度無血清懸浮培養之方案(Sinacore等人,Mol. Biotechnol. 15(3):249-257,2000)使黏著G71細胞預先適應於無血清生長培養基，從而產生無血清懸浮培養適應性細胞株G71S。或者，如Sinacore等人所概述，可使黏著G71細胞在如下文所述經穩定轉染之後適應於無血清生長培養基。

根據如Selexis所述之MARtech II方案將人類SUMF1與人類GALNS表現載體(實例I)之成對組合(pcDNA4 SUMF1加pCIN4 4A、BMAR SUMF1加BMAR 4A或PMAR SUMF1加PMAR 4A)轉染至生長於補充有抗生素-抗黴劑溶液(Antibiotic-Antimycotic Solution)(100 IU青黴素(Penicillin)、10 mg鏈黴素(Streptomycin)、25 μg兩性黴素B，Cellgro)之培養基中的G71S細胞中。使轉染物池在補充有5%經γ照射之胎牛血清(FBS，JRH)、200 μg/mL G418(AG Scientific)及200 μg/mL勻黴素(Invitrogen)之UltraCHO培養基(Cambrex)中生長，且藉由於96孔板中於相同生長培養基中進行限制稀釋加以選殖。藉由細胞篩檢(Cell Screen，Innovatis)成像來監測純系生長。使用酶捕捉活性ELISA針對活性GALNS篩檢所有純系(參見實例IV)。藉由用GALNS活性之酶捕捉活性ELISA值除以歷經4天之期間每天之細胞生長量(Vi-細胞,Beckman Coulter)來計算細胞產率。

產生以下202個G71S純系且針對活性GALNS加以篩檢：用pcDNA4 SUMF1加pCIN 4A共轉染之86個純系、用BMAR SUMF1加BMAR 4A共轉染之65個純系、及用PMAR SUMF1加PMAR 4A共轉染之51個純系。最初基於高含量活性GALNS自96孔組織培養板選擇純系(圖6A)。使用酶捕捉活性ELISA來量測GALNS活性且用ng/mL(y軸)表示。x軸展示用於SUMF1及GALNS表現之3個共轉染條件：hCMV啟動子，無MAR；hCMV啟動子，有MAR；及SV40啟動子，有MAR。各條柱表示來自各別群體之單一純系。在此96孔純系篩檢中未說明細胞密度且並非所有共轉染之G71S純系皆顯示於此圖中。

選擇產生最高活性GALNS之G71S純系進行產率分析(圖6B)。每日細胞產率以皮克/細胞/天計且藉由用GALNS活性除以該天之細胞密度來獲得。此圖顯示在以每個燒瓶5×10⁵個細胞接種之後的第四天(96小時)。使用酶捕捉活性ELISA來檢定純系之GALNS，(以皮克/細胞/天計)(y軸)。陽性對照由表現GALNS之BHK及CHO純系(BioMarin)組成。各垂直條柱表示單一純系。由pCIN 4A純系產生活性GALNS，但僅少量在檢定背景以上。

藉由96孔篩檢及4天產率檢定進行之純系分析說明相較於無MAR元件之表現載體的共轉染，具有MAR元件之表現載體之共轉染使G71S純系之產率增加。經BMAR 4A+BMAR SUMF1共轉染之純系顯示池快速產生、純系快速生長、及能夠比最高產生性PMAR 4A純系產生2倍以上活性GALNS，且相較於缺乏MAR元件之CHO 4A與BHK 4A純系增加多達10倍。

使用Sinacore等人,Mol. Biotechnol. 15(3):249-257,2000中概述之方案使表現GALNS之G71S純系適應於無血清生長培養基。整個適應過程皆在選擇試劑(200 μg/mL勻黴素及200 μg/mL新黴素)存在下進行。在T燒瓶中培養之表現GALNS之G71純系如下進行劃分：(1)至含有Cambrex UltraCHO培養基及5% FBS(批號8L2242)之125 mL振盪器中；(2)至含有JRH 302M培養基(產生培養基)及5% FBS之125 mL振盪器中；及(3)至T燒瓶中作為備用(UltraCHO、5% FBS)。一旦產生懸浮培養物，即丟棄黏著細胞，且起始FBS之中斷。當3代之生長率返回至>0.5(1/天)且活力>95%時，FBS濃度降低50%。使細胞處於任何既定FBS濃度下至少3代。一旦適應於在2.5% FBS中生長，細胞即直接置於無血清培養基中。使細胞堆積於含有10%(v/v)DMSO之新鮮培養基中。測試試驗解凍物以確保細胞經受得住冷凍製程。來自BMAR 4A+BMAR SUMF1轉染之表現GALNS的兩個G71S純系(純系4及5)需要約15代來適應於無血清懸浮培養。亦分離來自pcDNA4 SUMF1加pCIN 4A轉染之表現GALNS之純系C6且使其適應於無血清培養。

基本上如上所述將人類SUMF1與人類GALNS表現載體(實例I)之成對組合(pcDNA4 SUMF1加pCDNA4-4A)轉染至G71S細胞中，例外之處為使用200 μg/mL勻黴素(Invitrogen)進行選擇。基本上如上所述，分離表現GALNS 之六個純系C2、C5、C7、C10、C11及C30且使其適應於無血清懸浮培養。

實例III 大規模培養表現人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之G71S細胞株

目標在於量測來自表現人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之G71S純系的酶產量。大規模培養共表現人類SUMF1與人類GALNS之適應無血清懸浮培養的G71S細胞株且評估其活性GALNS酶產量。

因為對於G71S宿主細胞株，適應無血清懸浮培養相對較快，所以確定可在以灌注模式操作之WAVE生物反應器中進行產生。WAVE生物反應器在接種體積方面允許較大靈活性，因為按比例放大可直接在袋中進行，從而降低污染風險且加快物質產生。圖7展示WAVE生物反應器配置之示意圖。該圖展示測力計(load cell)以灌注模式藉由測定袋重並調整饋料及收集速率以維持所要體積來監測袋中之培養基體積。在10 L袋中，亦藉由插入至袋中之探針控制pH值為所要設定點。

以1 L規模產生來自表現GALNS之G71S純系4及5之物質。在此等操作中未控制培養物pH值。WAVE袋之操作限制為一天3個容器體積之產量(VV/天)。為了防止物質之任何不活化，目標細胞特定灌注速率(CSPR)為0.3奈升/細胞/天，從而使GALNS酶之平均滯留時間為八小時。因此，維持袋中之細胞密度在每毫升約10-12×10⁶個細胞。表現GALNS之G71S純系4及5之生長率分別為0.16及0.20。直接自袋進行滲移(Bleed)以維持目標細胞密度。

因為先前已顯示GALNS在pH 6下穩定，所以收集流體pH值調整至介於5.5與6.5之間的pH值以維持酶活性。此藉由定時快速添加與離開反應器之收集物線內混合之5體積% pH 4.0檸檬酸鈉緩衝液來達成。將經調整之收集流體儲存在4℃下，隨後進行下游加工。表現GALNS之兩個G71S純系4與5之平均效價為約4.2 mg/L，相關比產率為約1.25皮克/細胞/天。

以類似方式大規模培養表現GALNS之G71S純系C2、C5、C6、C7、C10、C11及C30且評估其活性GALNS酶產量。

實例IV 量測人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之濃度及活性

開發酶聯免疫吸附檢定(ELISA)來量測共表現人類SUMF1與人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之G71S純系的GALNS酶濃度及活性。

酶捕捉活性ELISA

在經與ELISA板結合之抗GALNS特異性抗體捕捉之後，酶捕捉活性ELISA量測固相中GALNS酶的活性。

緩衝液。緩衝液A(碳酸鹽緩衝液)：將3.09公克Na₂CO₃及5.88公克NaHCO₃溶解於900 mL去離子(DI)H₂O中，接著添加DI H₂O至1000 mL之最終體積。檢查pH值處於9.4與9.6之間，接著過濾-滅菌。為用每孔100 μL完全塗佈一個96孔微板，將19 μL抗GALNS抗體稀釋至一個管(12 mL)中。緩衝液B(ELISA阻斷緩衝液及連續稀釋緩衝液)：1×酸性PBS、0.05% Tween-20及2% BSA，用乙酸調整至pH 6.5。緩衝液B^W(洗滌緩衝液)：100 mM NaOAc及0.05% Tween-20，用乙酸調整至pH 6.5。緩衝液C(受質緩衝液)：25 mM乙酸鈉、1 mM NaCl、0.5 mg/mL脫鹽BSA及0.01%疊氮化鈉，用冰乙酸調整至pH 4.0。緩衝液D(β-半乳糖苷酶緩衝液)：300 mM磷酸氫二鈉、0.1 mg/mL BSA、0.01%疊氮化鈉及0.01% Tween-20，用磷酸調整至pH 7.2。緩衝液E(終止緩衝液)：350 mM甘胺酸及440 mM碳酸鹽緩衝液，用6 M NaOH調整至pH 10.7。

試劑。抗GALNS IgG抗體：多株兔抗體為自血清純化之蛋白G。在D-PBS中，總蛋白質=3.17 mg/mL(BCA)。等分試樣(19 μL)儲存在-20℃下，各自使用一次。4MU-Gal-6-S受質(固體；440 MW)：於DI水中製備100 mM儲備物且儲存在4℃下。β-半乳糖苷酶(Sigma G-4155)：在使用之前於緩衝液D中稀釋成12 μg/mL。

方案：使抗GALNS抗體與板結合：Nunc MaxiSorp ELISA板(Nalge/Nunc International,Fisher編號12-565-135)用於緩衝液A中之最終蛋白質濃度為5 μg/mL的抗GALNS抗體塗佈。為了製備此溶液，使一個19 μL等分試樣解凍，於微量離心機中簡短旋轉(10秒)以收集液體。將19 μL全部轉移至12 mL緩衝液A中。藉由反轉來劇烈混合，接著傾入儲集器中，隨後使用多通道移液器裝載板(每孔100 μL)。覆蓋板且在4℃下培育隔夜。移除未結合之抗GALNS抗體：藉由用緩衝液B^W澆注三次來洗滌板。阻斷：用緩衝液B(每孔320 μL)阻斷板，接著覆蓋板且在37℃下培育1小時。在阻斷步驟期間製備經純化GALNS標準物及測試樣品(未知)之一系列稀釋液：在緩衝液B中將標準物稀釋至檢定之線性範圍的高端(A列中之128 ng/mL)，接著在96孔板上之B-G列中連續稀釋(2倍)。泳道H為緩衝液空白(亦即無GALNS酶)。首先，製備500 μL於緩衝液B中之128 ng/mL濃度。接著，在緩衝液B中進行2倍連續稀釋(250 μL至250 μL中)直至達到2 ng/mL。移除阻斷緩衝液：在阻斷步驟之後，丟棄緩衝液B。使GALNS酶標準物及測試樣品與抗GALNS抗體結合：用每孔100 μL之經連續稀釋之標準物及測試樣品(一式兩份操作)裝載板。覆蓋板且在37℃下培育1小時。移除GALNS抑制劑：藉由用緩衝液B^W澆注三次來洗滌板。添加GALNS受質(第一反應)：製備足夠用於每孔裝載100 μL之最終受質溶液(在使用前1小時之內製備)。於緩衝液C中將4MU-Gal-6-S儲備溶液(100 mM)稀釋至1 mM。每孔裝載100 μL。覆蓋板且在37℃下培育30分鐘。添加β-半乳糖苷酶(第二反應)：向各孔中添加50 μL含12 μg/ml β-半乳糖苷酶之緩衝液D。覆蓋板且在37℃下培育15分鐘。終止反應：向各孔中添加100 μL緩衝液E(終止緩衝液)以使釋放之4MU離子化。轉移至螢光板：轉移(一次8個孔)來自ELISA板之各孔之250 μL中的200 μL至黑色未處理平底微量滴定板(螢光板,Costar編號3915)。讀取螢光：使用SOFTmax PRO程式(366 nm激發，446 nm發射，435 nm截止)在Gemini板讀取器(Molecular Devices Corporation)中讀取板。

GALNS ELISA

GALNS ELISA使用夾心式免疫檢定量測細胞培養條件培養基或其他製程樣品中GALNS酶的濃度。

緩衝液。緩衝液A(碳酸鹽緩衝液)：將3.09公克Na₂CO₃及5.88公克NaHCO₃溶解於900 mL去離子(DI)H₂O中，接著添加DIH₂O至1000 mL之最終體積。檢查pH值處於9.4與9.6之間，接著過濾-滅菌。為用每孔100 μL完全塗佈一個96孔微板，將19 μL抗GALNS抗體稀釋至一個管(12 mL)中。緩衝液B(ELISA阻斷緩衝液及連續稀釋緩衝液)：1×酸性PBS、0.05% Tween-20及2% BSA，用乙酸調整至pH 6.5。緩衝液B^W(洗滌緩衝液)：100 mM NaOAc及0.05% Tween-20，用乙酸調整至pH 6.5。緩衝液F(終止緩衝液)：2 N H₂SO₄：總計600 mL，添加100 mL 12 N H₂SO₄及500 mL MilliQ水。

試劑。抗GALNS IgG抗體：兔多株抗體為自血清純化之蛋白G。在D-PBS中，總蛋白質=3.17 mg/mL(BCA)。等分試樣(19 μL)儲存在-20℃下，各自使用一次。經HRP結合之偵測抗體(RIVAH)：最終經結合抗體1:100稀釋至D-PBS/1% BSA中且以120 μL等分試樣儲存在-20℃下以供使用一次。TMB EIA受質套組(BioRad編號172-1067)。

方案。使抗GALNS抗體與板結合：Nunc MaxiSorp ELISA板(Nalge/Nunc International,Fisher編號12-565-135)經於緩衝液A中之最終蛋白質濃度為5 μg/mL的抗GALNS抗體塗佈。為了製備此溶液，使一個19 μL等分試樣解凍，於微量離心機中簡短旋轉(10秒)以收集液體。將19 μL全部轉移至12 mL緩衝液A中。藉由反轉來劇烈混合，接著傾入儲集器中，隨後使用多通道移液器裝載板(每孔100 μL)。覆蓋板且在37℃下(對流培育箱)培育2小時。不使用熱阻斷。移除未結合之抗GALNS抗體：藉由用緩衝液B^W澆注三次來洗滌板。阻斷：用緩衝液B(每孔320 μL)阻斷板，接著覆蓋板且在37℃下培育1小時。在阻斷步驟期間製備經純化GALNS標準物及測試樣品(未知)之一系列稀釋液：在緩衝液B中將標準物稀釋至檢定之線性範圍的高端(A列中之40 ng/mL)，接著在96孔板上之B-G列中連續稀釋(2倍)。泳道H為緩衝液空白(亦即無GALNS酶)。首先，製備500 μL於緩衝液B中之40 ng/mL濃度。接著，在緩衝液B中進行2倍連續稀釋(250 μL至250 μL中)直至達到0.625 ng/mL。移除阻斷緩衝液：在阻斷步驟之後，丟棄緩衝液B。使GALNS酶標準物及測試樣品與抗GALNS抗體結合：用每孔100 μL之經連續稀釋之標準物及測試樣品(一式兩份操作)裝載板。覆蓋板且在37℃下培育1小時。洗滌：藉由用緩衝液B^W澆注三次來洗滌板。結合偵測抗體結合物：使抗體RIVAH之一個等分試樣(120 μL)解凍，於微量離心機中簡短旋轉(10秒)以收集液體。將120 μL全部稀釋至11.9 mL緩衝液B中且將管劇烈反轉以進行混合。傾至儲集器中且用多通道移液器每孔添加100 μL。覆蓋板且在37℃下培育30分鐘。洗滌：藉由用緩衝液B^W澆注三次來洗滌板。TMB受質：藉由混合1.2 mL溶液B與10.8 mL溶液A來製備最終受質溶液。傾至儲集器中且用多通道移液器每孔添加100 μL。覆蓋板且在37℃下培育15分鐘。終止溶液：將12 mL 2 N H₂SO₄終止溶液吸移至儲集器中且用多通道移液器每孔添加100 μL。溫和地輕拍以進行混合。讀取A450：在板讀取器中讀取板。

GALNS比活性檢定

GALNS比活性檢定使用GALNS特異性受質量測GALNS於溶液中之酶活性。

緩衝液。所有緩衝液均使用MilliQ H₂O。稀釋緩衝液(DB)：對於1 L DB，將1.74 mL乙酸、0.75 g乙酸鈉、233.6 mg NaCl、2 mL 50% Tween-20及10 mL 1%疊氮化鈉溶解於MilliQ H₂O中，且若pH值小於3.95則用0.1 M NaOH，若pH值大於4.05則用0.1 M乙酸調整pH值至4.0 +/- 0.5。最終濃度為：19.5 mM乙酸、5.5 mM乙酸鈉、1 mM NaCl、0.1% Tween-20及0.01%疊氮化鈉。磷酸鹽緩衝液(PB)：對於1 L PB，將13.9 g NaH₂PO₄-H₂O及55 g NaHPO₄-7H₂O溶解於MilliQ H₂O中，且調整pH值至7.2。最終濃度為300 mM NaPi。終止緩衝液(SB)：對於1 L SB，將26.2 g甘胺酸及46.6 g碳酸鈉溶解於MilliQ H₂O中，且用NaOH調整pH值至10.6。檢定緩衝液(AB)：於DB中1:50稀釋4MU-Gal-6S儲備物(最終2 mM)。β-半乳糖苷酶緩衝液(βGB)：25 μg/mL β-半乳糖苷酶於300 mM NaPi中，pH7.2。

試劑。4MU-Gal-6S：100 mM於H₂O中(Toronto Research Chemicals目錄號M334480)。β-半乳糖苷酶：Sigma G-4155。4-甲基傘酮(4MU標準物)：Sigma M-1381(於DMSO中之10 mM儲備溶液)。

方案。對GALNS酶進行連續稀釋。對於經純化及經調配之GALNS(約1.5 mg/ml)，於含有DB之低蛋白黏著微量離心管(USA Scientific目錄號1415-2600)中1:10,000稀釋樣品，隨後進行1:1連續稀釋。將100 μL DB置於低蛋白結合96孔板中。在第一列中，吸移100 μL GALNS樣品。此刻沿板向下(96孔板上之A-G)進行連續稀釋(1:1)。孔H中不添加樣品(空白)。此檢定之線性範圍為1-75 ng/mL。使用相同程序來製備4MU標準曲線。於DB中1:100稀釋10 mM 4MU之DMSO儲備溶液。藉由在第一孔中添加50 μL 50 μM 4MU來起始4MU標準曲線，接著連續稀釋。向96孔螢光板中添加50 μL於AB中稀釋之受質(2 mM 4MU-半乳糖-6S於DB中)。在37℃下預培育受質10分鐘。向50 μL含受質之AB中添加100 μL GALNS及4MU標準物之連續稀釋液中的50 μL。在37℃下培育30分鐘(此第一反應自受質移除硫酸鹽)，淬滅第一反應且藉由添加50 μL β-半乳糖苷酶(於βGB中稀釋β-半乳糖苷酶儲備物至25 μg/mL)來起始第二反應。磷酸鹽抑制GALNS且pH值增加亦會終止GALNS反應。所得pH值此刻處於β-半乳糖苷酶之最佳pH值範圍。在37℃下培育此第二反應15分鐘。藉由添加100 μL SB來使釋放之4MU離子化。在96孔螢光板讀取器上讀取Ex355 Em460。酶活性計算(在37℃下於pH 4.0緩衝液中)：1單位=μmol釋放之4MU/min；活性=μmol 4MU/min/mL；比活性=μmol 4MU/min/mg。蛋白質濃度計算：使用GALNS之消光係數(在280 nm下，1 mg/mL=1.708個吸光度單位)。

實例V 純化人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)

目標在於獲得大量重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。使共表現人類SUMF1及人類GALNS之經穩定轉染之G71細胞在生物反應器培養條件下生長，且自細胞培養基純化活性GALNS酶。

液相層析裝置。Amersham Pharmacia Biotech AKTA explorer 900系統，利用Unicorn控制軟體。

蛋白質分析方法。遵循SDS-PAGE、庫馬斯藍染色(B101-02-COOM)、西方墨點法及布萊德福(Bradford)蛋白質檢定之標準程序。藉由活性產生來評估純化操作，且GALNS產物之純度藉由SDS-PAGE目視評估。藉由使用抗GALNS抗體之西方墨點法來偵測經加工之雜質的存在。使用布萊德福蛋白質檢定量測蛋白質濃度。藉由使用1.708之消光係數進行A₂₈₀量測來對最終經純化GALNS蛋白之濃度進行量測。

層析樹脂。藍色瓊脂糖凝膠6 FF(GE Healthcare,批號306346)及Fractogel SE Hi-Cap(Merck KgaA,FC040894449)。

GALNS酶活性測定。使用小螢光受質4-甲基傘酮醯基-6-S-GAL(4-MU-6-S-GAL)來測定GALNS比活性。GALNS比活性檢定涉及兩步反應，其中在將GALNS與受質一起培育某一時間以釋放螢光標籤之後必需添加β-半乳糖苷酶。使用螢光板讀取器進行量測。

用平衡緩衝液(EQB，50 mM NaOAc、10 mM NaCl(pH 5.8))平衡10DG脫鹽管柱(Bio-RAD)。所有緩衝液均使用MilliQ H₂O。將三(3)mL經純化GALNS(0.5-2 mg/mL)裝載於脫鹽管柱上，溶離且使用EQB以4 mL等分試樣收集於單獨試管中。使用GALNS之消光係數(在280 nm下，1 mg/mL=1.708個吸光度單位)來計算蛋白質濃度。

將經脫鹽GALNS樣品連續稀釋(1:1)於稀釋緩衝液(DB，50 mM NaOAc、1 mM NaCl(pH 4.0)+0.5 mg/mL BSA)中。在使用之前藉由將50 mg/mL BSA儲備物(不超過5% CV)裝載於先前用milliQ H₂O平衡之G25管柱上來將BSA儲備物脫鹽。將100 μL經脫鹽GALNS樣品吸移於低蛋白結合96孔板之第一列中，且沿板向下(96孔板上之A-G列)吸移連續稀釋之GALNS樣品。100 μL DB吸移至最後一個孔(H)中。此檢定之線性範圍的頂端為200 ng/mL，且線性範圍為3-200 ng/mL。進行相同程序以用4-甲基傘酮(4MU)(Sigma M-1381，於DMSO中之10 mM儲備物)製備標準曲線。100 μL GALNS及4MU之連續稀釋液中的50 μL轉移至新96孔螢光板(黑底板)中。添加50 μL 2 mM 4MU-半乳糖-6S(於milliQ H₂O中)至欲經檢定之樣品中，且在37℃下培育30分鐘。淬滅此第一反應，且藉由添加50 μL β-半乳糖苷酶(Sigma G-4155，儲備物於300 mM NaPi(pH 7.2)中稀釋至12 μg/mL)，且在37℃下培育15分鐘。藉由添加100 μL終止緩衝液(甘胺酸/碳酸鹽(pH 10.6))使釋放之4MU離子化。在96孔螢光板讀取器(激發355 nm，發射460 nm)上讀取板。1單位定義為1 μmol釋放之4MU/min，酶活性以μmol 4MU/min/mL給出，且比活性以μmol 4MU/min/mg給出，所有皆在37℃下，於pH 4.0緩衝液中。

第一純化製程。第一純化製程包括超濾(UF)步驟，接著為2管柱純化製程。

1.收集物過濾(HF)：使生物反應器物質經0.2 μm無菌過濾。

2.超濾(UF)：生物反應器物質藉由經30 kD Sartocon膜超濾而濃縮10-20倍。

3.pH 4.5調整：在室溫下用pH值調整緩衝液(1.75 M NaOAc(pH 4.0))將濃縮之生物反應器物質(UF(20倍))調整至pH 4.5且無菌過濾，隨後裝載於藍色瓊脂糖凝膠管柱上。

4.藍色瓊脂糖凝膠6速流(FF)：將經調整為pH 4.5之UF(20倍)裝載於藍色瓊脂糖凝膠管柱上且如表1及圖9A中所示來溶離GALNS蛋白。

*CV：管柱體積。流速=92 cm hr^-1

5.Fractogel SE Hi-Cap：將來自藍色瓊脂糖凝膠管柱之溶離液調整至pH 4.3且裝載於Fractogel SE Hi-Cap管柱上且如表2及圖9B中所示來溶離GALNS蛋白。

*CV：管柱體積。流速=150 cm hr^-1

藉由分級、丟棄溶離前之「肩」(pre-elution shoulder)及溶離後之「尾」(post-elution tail)來收集溶離液中之GALNS蛋白。

6.最終UF/HF：如上所述，來自Fractogel SE Hi-CAP管柱之溶離液藉由超濾加以濃縮且無菌過濾。

調配。在10 mM NaOAc、1 mM NaH₂PO₄、0.005% Tween-80(pH 5.5)中調配經純化GALNS蛋白。

穩定性研究。藉由在4℃及-70℃下於各別溫度下儲存GALNS樣品之小等分試樣來監測最終調配之經純化GALNS隨時間的穩定性。在某些時間點，在37℃水浴中快速解凍冷凍樣品之等分試樣，隨後量測活性。圖8顯示經純化GALNS在4℃及-70℃下於調配緩衝液中穩定多達至少79天之時期。

第一純化製程結果。表3顯示由懸浮培養生物反應器中之G71S純系4產生之3種GALNS蛋白製劑的純化產率。在所有情況下，藉由SDS-PAGE目檢估計純度皆為約95%。

圖9展示藉由(A)藍色瓊脂糖凝膠6速流層析、隨後(B)Fractogel SE Hi-CAP層析分離之GALNS蛋白的SDS-PAGE。凝膠用庫馬斯藍(左)或抗GALNS抗體(右)染色。對於西方墨點法，1:5000稀釋抗GALNS兔抗體，且二次抗體為抗鹼性磷酸酯酶兔抗體。GALNS蛋白在SDS-PAGE上具有約55-60 kDa之表觀分子量，此與該酶之缺乏含26個胺基酸殘基之信號肽以及在325位置後缺乏裂解的分泌性加工前(前驅體)形式的預期尺寸一致。

N端表徵。藉由LC/MS確定經純化GALNS蛋白之N端。N端序列為APQPPN，其對應於GALNS之缺乏含26個胺基酸殘基之信號肽的分泌形式之預測N端(比較圖4及圖5中之人類GALNS多肽序列)。

第二純化製程。第二純化製程包括超濾/透濾(UF/DF)步驟，接著為3管柱純化製程。

1.超濾(UF/DF)：藉由在pH 5.5下經30 kD Sartocon膜超濾/透濾將生物反應器物質濃縮20倍。

2. pH 4.5調整：在室溫下用pH值調整緩衝液(1.75 M NaOAc(pH 4.0))將濃縮之生物反應器物質(UF/DF(20倍))調整至pH 4.5且無菌過濾，隨後裝載於Fractogel EMD SE Hi-Cap管柱上。

3. Fractogel EMD SE Hi-Cap：將調整為pH 4.5之UF/DF(20倍)裝載於Fractogel EMD SE Hi-Cap管柱上，依序用10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、50 mM NaCl(pH 4.5)及10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、50 mM NaCl(pH 5.0)洗滌，且用10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、140 mM NaCl(pH 5.0)溶離GALNS蛋白。

5. Zn螯合瓊脂糖凝膠FF：將來自Fractogel EMD SE Hi-Cap管柱之溶離液調整至500 mM NaCl(pH 7.0)且裝載於Zn螯合瓊脂糖凝膠FF(Zn-IMAC)管柱上，用10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、125 mM NaCl、10 mM咪唑(pH 7.0)洗滌，且用10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、125 mM NaCl、90 mM咪唑(pH 7.0)溶離GALNS蛋白。

6. pH值3.5調整：將來自Zn螯合瓊脂糖凝膠FF管柱之含有GALNS蛋白之溶離液調整至pH 3.5以達成低pH值病毒不活化，接著調整至10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、2 M NaCl(pH 5.0)。

7. ToyoPearl丁基650M：將來自Zn螯合瓊脂糖凝膠FF管柱之經調整為低pH值之溶離液裝載於ToyoPearl丁基650M管柱上，用10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、2 M NaCl(pH 5.0)洗滌，且用10 mM乙酸鹽/磷酸鹽、0.7 M NaCl(pH 5.0)溶離GALNS蛋白。

8.最終UF/HF：將來自ToyoPearl丁基650M溶離液之溶離液超濾且透濾於20 mM乙酸鹽、1 mM磷酸鹽、150 mM NaCl(pH 5.5)中。

調配。在10 mM NaOAc/HOAc、1 mM NaH₂PO₄、150 mM NaCl、0.01% Tween-20(pH 5.5)中調配經純化GALNS蛋白。

第二純化製程結果。表4顯示使用第二純化製程由懸浮培養生物反應器中之G71S純系C2產生之GALNS蛋白的回收率。如藉由C3 RP-HPLC所測定，經調配之GALNS酶(亦即前驅體與成熟或經加工形式一起)的純度為約98%。如藉由SDS-毛細管凝膠電泳所測定，GALNS酶之前驅體形式的百分比為約85%。

圖10顯示藉由超濾/透濾(UF/DF)、Fractogel SE Hi-CAP層析、Zn螯合瓊脂糖凝膠FF層析及ToyoPearl丁基650 M層析分離之GALNS酶的SDS-PAGE。凝膠用庫馬斯藍(左上)、抗GALNS抗體(右上)、抗組織蛋白酶L(左下)及抗CHO蛋白(CHOP，右下)染色。對於西方墨點法，1:5000稀釋抗GALNS兔多株抗體，且二次抗體為抗兔AP結合物；1:1000稀釋抗組織蛋白酶L山羊多株抗體，且二次抗體為抗山羊HRP結合物；且1:1000稀釋抗CHOP兔多株抗體，且二次抗體為抗兔HRP結合物。前驅體GALNS酶在SDS-PAGE上具有約55-60 kDa之表觀分子量，且GALNS酶之成熟或經加工形式在SDS-PAGE上具有約39 kDa及約19 kDa之表觀分子量。

第一純化製程之概述。使用已自標準組列(standard train)改進之純化組列(purification train)(參見表5)來純化GALNS酶。生物反應器收集物質經0.2 μm無菌過濾且保持在4℃下，隨後裝載於藍色瓊脂糖凝膠捕捉管柱上。經過濾之生物反應器物質直接裝載或藉由超濾濃縮多達15倍。因為下游純化步驟(即SP瓊脂糖凝膠層析，隨後為苯基瓊脂糖凝膠層析)不產生足夠純之GALNS，所以必須改進純化組列。使用SEHi-Cap層析作為對兩個下游純化管柱之替代產生2管柱純化製程，最終物質之純度得以顯著改良，且總GALNS回收率自約22%顯著增加至約80%。如藉由C4-RP層析所測定，GALNS酶(基本上由前驅體形式組成，參見圖9)之純度粗略估計為>95%，且經純化之GALNS酶在4℃下及在-70℃下均在調配緩衝液中保持穩定達79天以上。

*此步驟視情況選用。

第二純化製程之概述。GALNS酶亦使用第二純化組列(參見表6)加以純化。總GALNS回收率為約70%且如藉由C4-RP層析所測定，GALNS酶(包括前驅體與成熟或經加工形式兩者，參見圖10)之純度粗略估計為約97%。

此等檢定指示上述用於製備重組溶酶體硫酸酯酶之方案提供一種高效產生大量高度純化酶(特定言之人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之分泌性加工前(前驅體)形式)的方法。

實例VI 在剪切最小之情況下純化人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)

對重組酶之蛋白水解消化的控制為產生及調配蛋白質基治療劑中所關心的問題。目標在於獲得大量呈分泌性加工前(前驅體)形式之重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。開發一種允許在由蛋白酶(特定言之組織蛋白酶L)所致之剪切最小之情況下大規模製備人類GALNS的產生方法。

如本文所用，「最小剪切」意謂如藉由在還原條件下進行SDS-PAGE，隨後進行庫馬斯藍染色，或藉由SDS-毛細管凝膠電泳(SDS-CGE)所判斷，在最終經純化調配物中GALNS為至少98%、至少98.5%、至少99%或至少99.5%完整。

在開發用於大規模製備GALNS之產生方法期間，發現酶之約55 kDa分泌性前驅體形式易經在酸性pH值下具有活性之蛋白酶(特定言之組織蛋白酶L)蛋白水解降解。蛋白酶降解GALNS會產生GALNS之成熟剪切形式，其可在還原條件下進行之SDS-PAGE上作為約40 kDa及約19 kDa之兩條帶被觀察到。此蛋白水解剪切由陽離子交換管柱捕捉步驟所需之低pH值(亦即4.5至5.0)加劇。此pH值範圍提供有利於細胞培養收集物中存在之酸性蛋白酶(諸如組織蛋白酶)之活性的條件。

在GALNS回收及純化製程中作出變化以使可剪切分泌至細胞培養基中之GALNS之蛋白酶的存在及/或活性最小。

描述用於大規模製備GALNS之例示性回收及純化製程之流程圖展示於圖11中。左邊之製程顯示第I/II階段製程中使用之類似於以上實例V中所述純化組列的回收及純化製程，其產生可變量之歸因於組織蛋白酶L活化之剪切，在約6-30%肽鏈之範圍內，如藉由在還原條件下操作SDS-PAGE，隨後進行庫馬斯藍染色(參見圖12，泳道3)所測定；或在65.3%至93.7%之範圍內的GALNS完整前驅體形式，如藉由SDS-CGE所判斷(參見表8)。SDS-PAGE方法提供目視但更定性之蛋白質降解資訊，而SDS-CGE方法提供關於最終經純化調配物中存在之完整蛋白質%的更定量資訊。

圖11中右邊之製程顯示第III階段製程中使用之回收及純化製程，其產生最小剪切，在98%至99.6%之範圍內的GALNS完整前驅體形式，如藉由在還原條件下操作SDS-PAGE，隨後進行庫馬斯藍染色(參見圖12，泳道5)，或藉由SDS-CGE(參見表8)所判斷。

製程變化之概述。為了降低GALNS剪切之程度及可變性，考慮2個因素：(i)在中性pH值下蛋白酶活性顯著較小；及(ii)陽離子交換層析與固定金屬親和力層析(IMAC)兩種步驟均使蛋白酶與GALNS分離。第III階段製程(參見圖11，右邊)利用此等因素且幫助降低純化程序期間GALNS之剪切。此係藉由轉換前2個管柱步驟之順序，且在pH 6.5至7.0下捕捉於Zn-IMAC管柱上來達成。轉換前2個管柱亦使得相較於在第I/II階段製程(參見圖11，左邊)中使用之較具酸性之pH值(亦即pH 5.5)，在較高pH值(亦即pH 6.5)下收集及儲存細胞培養收集物較便利。在pH 6.5下儲存無細胞收集物會降低細胞培養流體中存在之蛋白酶(例如組織蛋白酶)活化的可能性，藉此防止或降低GALNS之剪切。

第III階段製程。以下概述GALNS之例示性第III階段製程回收及純化中的各步驟。

1.無細胞收集物(1×)。使共表現人類SUMF1與人類GALNS之經穩定轉染之G71細胞如實例III中所述在生物反應器培養條件下生長。在pH 6.5下收集含有GALNS之生物反應器物質(亦即細胞培養流體)，且使用依次為CUNO30SP02A、CUNO 90ZA08A及0.2 μm CUNO BioAssure過濾器之過濾組列加以過濾。

2.　UF/DF(20×)。細胞培養流體經超濾/透濾(UF/DF)至電導率7 mS/cm之10 mM磷酸鹽/乙酸鹽、50 mM NaCl(pH 6.5)中。使用Sartocon 30 kDa Hydrosart卡匣進行UF/DF步驟。將細胞培養流體濃縮20倍。為了進行比較，在pH 5.5下進行第I/II階段製程UF/DF步驟。第III階段製程中之較高pH值會降低GALNS經無細胞收集物中存在之蛋白酶剪切的可能性。

3.木炭過濾器。UF/DF(20×)物質經Zeta Plus R55活性碳(Z1274)過濾，接著使用0.2 μm過濾器加以無菌過濾，隨後儲存在2-8℃下。木炭過濾器顯著降低在裝載隨後Zn-IMAC管柱後之壓力。

4.固定金屬親和力層析(IMAC)。Zn固定金屬親和力層析(Zn-IMAC)管柱用10 mM磷酸鹽/乙酸鹽、500 mM NaCl(pH 7.0)平衡，且在約55±5 mS/cm之電導率下用經木炭過濾之UF/DF(20×)物質(藉由添加含有2.5 M NaCl之50 mM磷酸鹽緩衝液(pH 9.2)維持在pH 7.0±0.1下)裝載。經裝載之管柱依次用10 mM磷酸鹽/乙酸鹽、500 mM NaCl(pH 7.0)及10 mM磷酸鹽/乙酸鹽、125 mM NaCl(pH 7.0)(緩衝液A)洗滌。用70%緩衝液A與30%緩衝液B(10 mM磷酸鹽/乙酸鹽、125 mM NaCl、300 mM咪唑，pH 7.0)之混合物自管柱溶離GALNS。

5.　Mustang Q過濾器。Zn-IMAC管柱溶離液調整至約6.0±0.5 mS/cm之電導率，pH 7.0，且裝載於Mustang Q過濾器上以移除病毒。

6. pH值調整及過濾。Mustang Q濾液調整至pH 4.5±0.1，依次使用CUNO 60ZA過濾器及0.2 μm線內過濾器過濾，接著裝載於陽離子交換管柱上。

7.陽離子交換層析。Fractogel SE HiCap陽離子交換管柱用10 mM磷酸鹽/乙酸鹽、50 mM NaCl(pH 4.5)平衡，且在<7 mS/cm之電導率下用調整至pH 4.5±0.1之經過濾的Mustang Q濾液裝載。經裝載之管柱依次用10 mM磷酸鹽/乙酸鹽、50 mM NaCl(pH 4.5)；及10 mM磷酸鹽/乙酸鹽(pH 5.0)(緩衝液A)與10 mM磷酸鹽/乙酸鹽、250 mM NaCl(pH 5.0)(緩衝液B)之80%:20%混合物洗滌。用20至75%緩衝液B於80%至25%緩衝液A中之線性梯度(亦即50至190 mM NaCl)自管柱溶離GALNS。

8.保持低pH值以達成病毒不活化。Fractogel SE HiCap溶離液藉由添加0.2 M檸檬酸鹽緩衝液(pH 3.4)而酸化至pH 3.5±0.1以達成病毒不活化，在低pH值下保持約1小時，藉由添加0.2 M檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)再調整至pH 5.0±0.1，接著裝載於疏水性相互作用層析(HIC)精製管柱上。

9.疏水性相互作用層析(HIC)。ToyoPearl丁基650M HIC管柱用10 mM磷酸鹽/乙酸鹽、2 M NaCl(pH 5.0)平衡，且用調整至2 M NaCl(pH 5.0)之低pH值病毒不活化之Fractogel SE HiCap溶離液裝載。經裝載之管柱用10 mM磷酸鹽/乙酸鹽、2 M NaCl(pH 5.0)(緩衝液A)洗滌。用35%緩衝液A與65%緩衝液B(10 mM磷酸鹽/乙酸鹽pH 5.0)之混合物自管柱溶離GALNS。

10.緩衝液交換及調整rhGALNS至3 mg/mL。ToyoPearl丁基650M HIC溶離液緩衝液交換至20 mM乙酸鹽、50 mM磷酸鹽、30 mM精胺酸、2%(v/v)山梨糖醇(pH 5.4)中，接著於相同緩衝液中調整至3 mg/mL之最終GALNS濃度。

11.藉由過濾移除病毒及DNA。使用病毒過濾器(DV20)及DNA過濾器(Mustang Q)過濾經緩衝液交換之ToyoPearl丁基650M HIC溶離液以移除任何殘餘病毒及DNA。

12.添加PS20至0.01%。病毒及DNA經過濾之經緩衝液交換的ToyoPearl丁基650M HIC溶離液調整至0.01%(v/v)聚山梨醇酯20(PS20或Tween-20)。

13.BDS儲存在2-8℃下或冷凍。經純化GALNS之最終調配物，亦即散裝原料藥(BDS)儲存在2-8℃下或冷凍。

結果。如SDS-PAGE結果(參見圖12泳道5)中所見，主帶之表觀分子質量為約55 kDa，與對GALNS單體之預期值一致。使用第I/II階段製程產生之批號AP400802(泳道3)中在約40 kDa及約19 kDa之表觀分子質量下遷移的條帶為GALNS之由Q348與G349之間的蛋白水解剪切所產生之降解產物。在使用第III階段製程產生之批號BMN110-0110-001(泳道5)中此剪切大大降低。在兩種製劑中均存在遷移略微慢於約40 kDa裂解產物之次帶。

其他製程變化之概述。開發一種改進之第III階段製程以處理某些挑戰：(i)在濃縮收集物中形成沈澱；(ii)在Zn-IMAC捕捉步驟GALNS損失；(iii)在ToyoPearl丁基步驟期間洗滌部分中GALNS損失；及(iv)在ToyoPearl丁基步驟之溶離液中存在高含量CHOP雜質。

改進之第III階段製程。以下概述GALNS之例示性第III階段製程回收及純化中的各步驟。

1.無細胞收集物(1×)。使共表現人類SUMF1與人類GALNS之經穩定轉染之G71細胞如實例III中所述在生物反應器培養條件下生長。在pH 6.5下收集含有GALNS之生物反應器物質(亦即細胞培養流體)，且使用依次為Millipore DOHC、Millipore XOHC及0.2 μm Millipore SHC過濾器之過濾組列加以過濾。

2. UF/DF(20×)。細胞培養流體經超濾/透濾(UF/DF)至電導率7 mS/cm之10 mM磷酸鹽/乙酸鹽、50 mM NaCl(pH 6.5)中。使用Sartocon 30 kDa Hydrosart卡匣進行UF/DF步驟。將細胞培養流體濃縮20倍。

3.木炭過濾器。UF/DF(20×)物質經Zeta Plus R55活性碳(Z1274)過濾，接著使用0.2 μm過濾器加以無菌過濾，隨後儲存在2-8℃下。

4.固定金屬親和力層析(IMAC)。Zn固定金屬親和力層析(Zn-IMAC)管柱用50 mM乙酸鹽緩衝液(pH 5.0)沖洗，以50 mM ZnSO₄裝料，用50 mM乙酸鹽緩衝液(pH 5.0)沖洗，接著用含有5 mM咪唑之10 mM磷酸鹽/乙酸鹽、500 mM NaCl(pH 7.0)平衡。經平衡之Zn-IMAC在約50±5 mS/cm之電導率下用經木炭過濾之UF/DF(20×)物質(在裝載Zn-IMAC管柱期間，藉由以75:25(v/v)比率與含有2.5 M NaCl之50 mM磷酸鹽緩衝液(pH9.2±0.1)線內摻合而維持在pH7.0±0.1下)裝載。經裝載之管柱依次用10 mM磷酸鹽/乙酸鹽、500 mM NaCl(pH 7.0)及10 mM磷酸鹽/乙酸鹽、125 mM NaCl(pH 7.0)(緩衝液A)洗滌。用70%緩衝液A與30%緩衝液B(10 mM磷酸鹽/乙酸鹽、125 mM NaCl、300 mM咪唑，pH 7.0)之混合物自管柱溶離GALNS。

5.pH值調整及過濾。Zn-IMAC管柱溶離液用1.75 M乙酸鹽(pH 4.0)調整至pH 4.5±0.1，接著使用Millipore COHC過濾器加以過濾。在裝載陽離子交換管柱期間，經過濾物質以30:70(v/v)比率與10 mM磷酸鹽/乙酸鹽(pH 4.5)線內摻合。

6.陽離子交換層析。Fractogel SE HiCap陽離子交換管柱用10 mM磷酸鹽/乙酸鹽、50 mM NaCl(pH 4.5)平衡，且在<7 mS/cm之電導率下用經調整為pH 4.5且過濾之Zn-IMAC管柱溶離液裝載。經裝載之管柱依次用10 mM磷酸鹽/乙酸鹽、50 mM NaCl(pH 4.5)；及10 mM磷酸鹽/乙酸鹽(pH 5.0)(緩衝液A)與10 mM磷酸鹽/乙酸鹽、250 mM NaCl(pH 5.0)(緩衝液B)之80%:20%混合物洗滌。用20%至75%緩衝液B於80%至25%緩衝液A中之線性梯度(亦即50至190 mM NaCl)自管柱溶離GALNS。

7.保持低pH值以達成病毒不活化。Fractogel SE HiCap溶離液藉由添加0.4 M檸檬酸鹽緩衝液(pH 3.4)而酸化至pH 3.5±0.1以達成病毒不活化，保持在低pH值下約1小時(在12-23℃之溫度下)，藉由添加0.4 M檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)再調整至pH 5.0±0.1，與含有5 M NaCl之10mM磷酸鹽/乙酸鹽緩衝液(pH 5)摻合以達成2 M NaCl之最終濃度，接著經0.2 μm過濾器過濾，隨後裝載於疏水性相互作用層析(HIC)精製管柱上。

8.疏水性相互作用層析(HIC)。ToyoPearl丁基650M HIC管柱用10 mM磷酸鹽/乙酸鹽、2 M NaCl(pH 4.4)平衡，且用調整至2 M NaCl(pH 4.3-4.4)之經過濾之低pH值病毒不活化的Fractogel SE HiCap溶離液裝載。經裝載之管柱依次用10 mM磷酸鹽/乙酸鹽、2 M NaCl(pH 4.4)；及10 mM磷酸鹽/乙酸鹽、2.5 M NaCl(pH 5.0)(緩衝液A)洗滌。依次用100%至32%緩衝液A於0至68%緩衝液B(10 mM磷酸鹽/乙酸鹽(pH 5.0))中之線性梯度(亦即2.5至0.8 M NaCl)；及32%緩衝液A與68%緩衝液B之混合物(亦即0.8 M NaCl)自管柱溶離GALNS。

9.緩衝液交換、藉由過濾移除DNA及病毒、及調整rhGALNS至3 mg/mL。ToyoPearl丁基650M HIC溶離液經緩衝液交換至20 mM乙酸鈉、50 mM磷酸鈉、30 mM精胺酸鹽酸鹽、2%(w/v)山梨糖醇(pH 5.4)中。使用DNA過濾器(Mustang Q)及病毒過濾器(DV20)過濾經緩衝液交換之ToyoPearl丁基650M HIC溶離液以移除任何殘餘DNA及病毒。經過濾且經緩衝液交換的ToyoPearl丁基650M HIC溶離液接著於與以上相同之緩衝液中調整至3 mg/mL之最終GALNS濃度。

10.添加PS20至0.01%。DNA及病毒經過濾之經緩衝液交換的ToyoPearl丁基650M HIC溶離液調整至0.01%(v/v)聚山梨醇酯20(PS20或Tween-20)。

11. BDS儲存在2-8℃下或冷凍。經純化GALNS之最終調配物，亦即散裝原料藥(BDS)通過0.2 μm Millipak 200過濾器進入最終儲存容器中且在袋中在2-8℃下儲存或冷凍。

結果。在此改進之第III階段製程之後，GALNS與Zn-IMAC及ToyoPearl丁基管柱之結合得以改良，且ToyoPearl丁基溶離液中之CHOP雜質減少。藉由此改進第III階段製程純化之GALNS在測試之所有性質(例如下表7中之性質)方面皆類似於藉由上述第III階段製程純化之酶。

表徵藉由第III階段回收及純化製程製備之rhGALNS。使用第III階段製程純化之GALNS與藉由第I/II階段製程純化之酶進行比較。表徵結果在表7中給出。儘管兩種GALNS製劑看起來在測試之所有性質方面均類似，但相較於藉由第I/II階段製程純化之酶，藉由第III階段製程純化之酶顯示顯著較少之剪切。

*CHOP：中國倉鼠卵巢宿主細胞蛋白質污染物

**使用第III階段製程自得自相同200 L cMFG反應器之物質純化之其他rhGALNS批次的SEC-HPLC資料顯示>99%之完整蛋白質。

表8比較使用第I/II階段製程(65.3-93.7%)或第III階段製程(98-99.6%)製備之批次中最終經純化調配物中完整GALNS的百分比，使用SDS-CGE方法。此處獲得之值支持自SDS-PAGE方法獲得之結果且顯示由於對純化製程所作之改進，剪切程度得以顯著降低。

此等檢定指示上述用於在剪切最小之情況下製備重組溶酶體硫酸酯酶之方案提供一種高效產生大量高度純化酶(特定言之人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之分泌性加工前(前驅體)形式)的方法。

實例VII 表徵經純化人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)

G71細胞株會產生高甘露糖磷酸化程度大於在普通哺乳動物細胞株中所注意到之高甘露糖磷酸化程度且未經磷酸化之高甘露糖寡醣含量相應較低的蛋白質(例如溶酶體酶)。將如本文定義之包含高含量雙磷酸化高甘露糖寡醣的溶酶體硫酸酯酶(例如重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS))與Canfield等人，美國專利6,537,785中獲得之不包含複合寡醣且僅展現高甘露糖寡醣的分子進行比較。

為測定溶酶體硫酸酯酶上未經磷酸化之高甘露糖的含量，熟習此項技術者可使用所釋放寡醣之外切醣苷酶定序(exoglycosidase sequencing)(「FACE定序」)來確定未經磷酸化之高甘露糖寡醣鏈之百分比。在正常批次-釋放FACE概況分析凝膠上，未經磷酸化之高甘露糖與特定複合寡醣(例如寡甘露糖6及完全唾液酸化之雙觸複合物)共遷移。接著藉由酶促定序來區分未經磷酸化之高甘露糖與其他寡醣。

為確定表現於G71S細胞中之經純化之溶酶體硫酸酯酶(例如重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS))是否展現磷酸化增加，測定溶酶體硫酸酯酶上甘露糖-6-磷酸酯(M6P)之含量、以及該酶與M6P受體(MPR)結合之能力。

藉由螢光輔助碳水化合物電泳(FACE)及藉由MPR-瓊脂糖凝膠樹脂層析來分析表現於G71S細胞中且經純化之重組人類GALNS酶。FACE系統使用聚丙烯醯胺凝膠電泳來分離、定量及測定自醣蛋白釋放之寡醣的序列。FACE上寡甘露糖7雙磷酸酯(O7P)帶之相對強度(Hague等人,Electrophoresis 19(15): 2612-20,1998)及保留在MPR管柱上之活性百分比(Cacia等人,Biochemistry 37(43): 15154-61,1998)給出每莫耳蛋白質之磷酸化程度的可靠量度。

比活性。在37℃下，使用小螢光受質4-甲基傘酮醯基-6-S-GAL(4MU-Gal-6S)測定重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之比活性。使用此檢定，經純化GALNS之比活性為165 μmol/min/mg(0.165 U/mg)。

人類血清穩定性。測定GALNS之離體血清穩定性。人類血清(Sigma H-4522)經0.2 μm PES過濾器過濾滅菌，且於T-25細胞培養燒瓶中在37℃下在10% CO₂氛圍中預培育4 mL經過濾滅菌之人類血清1小時(此時pH值為7.4±0.1)。添加0.4 mL脫鹽經純化GALNS(使用Bio-RAD 10DG管柱使2 mg/mL經純化GALNS脫鹽至PBS中)至預培育之人類血清或含有0.5 mg/L BSA之PBS對照中。在指定時間點(例如0、1、3.5、7.5及26小時)取出100 μL樣品且添加至900 mL淬滅緩衝液(QB，50 mM NaOAc(pH 5.6)+150 mM NaCl+0.5 mg/mL BSA+0.001% Tween-80)中。樣品儲存在4℃下直至準備量測GALNS酶活性。

使用酶捕捉活性ELISA量測GALNS酶活性。藉由外推殘餘GALNS酶活性%之指數衰減曲線，經純化GALNS之離體血清半衰期估計為217小時。

攝取至滑膜細胞(軟骨細胞)中。測定GALNS吸收至滑膜細胞(軟骨細胞)中之能力。

在37℃下在5% CO₂中於12孔盤中在生長培養基(漢姆氏(Ham's)F12+10% FBS)中培養軟骨細胞(ATCC編號CRL-1832)。對3個樣品之攝取分析需要4×12孔板。經純化GALNS樣品及GALNS參考物於acPBS/BSA(酸性PBS+200 μg/mL BSA)中稀釋至1 μM。自1 μM儲備物，製備GALNS樣品及參考物之攝取稀釋曲線：50.5 μL(1 μM rhASB)至5 mL攝取檢定稀釋液(UAD，DMEM+2 mM L-麩醯胺酸+0.5 mg/mL BSA)中，從而產生10 nM GALNS樣品及參考物，其藉由於UAD中進行連續2倍稀釋而進一步連續稀釋至5、2.5、1.25、0.62、0.31及0.16 nM。吸出來自匯合軟骨細胞之12孔盤的生長培養基，添加1 mL UAD(空白)或GALNS樣品或參考物之連續稀釋液至孔中，且在37℃下在10%CO₂培育箱中培育4小時。吸出攝取培養基，傾斜各盤完全吸出，且各孔用1 mL PBS沖洗一次。吸出PBS且藉由每孔添加0.5 mL胰蛋白酶(trypsin)/EDTA(0.25%胰蛋白酶/0.1% EDTA(Mediatech 25-053-CI，批次25053025))使軟骨細胞脫離。在自板脫離後，軟骨細胞經等分至在冰上預冷之Eppendorf管中(總計30個管)。冷卻經胰蛋白酶處理之軟骨細胞，接著在微量離心機(microfuge)中在低速下集結(4000 rpm，3分鐘)。完全吸出胰蛋白酶，用1 mL PBS沖洗細胞集結塊，重複微量離心及吸出步驟一次。添加200 μL細胞溶解緩衝液(CLB，50 mM乙酸鈉(pH 5.6)+0.1% Triton X-100)至各管中。藉由脈衝渦旋三次使細胞集結塊再懸浮。再懸浮之後，細胞溶解混合物在-80℃下儲存隔夜，或直接加以分析。

在室溫下解凍細胞溶解產物且當解凍時轉移至冰中。渦旋細胞溶解產物以再懸浮任何可見固體物質，接著在微量離心機中在4℃下在14 Krpm下旋轉10分鐘以集結不溶性物質。上清液轉移至一組新鮮管中且丟棄集結塊。接著對上清液進行GALNS活性檢定。通常作七點稀釋曲線(以10 nM開始且以0.16 nM結束，連續兩倍稀釋)，其包括在兩側上相當均一之預期K_uptake。藉由使用單獨蛋白質(protein-only)分子量來計算起始樣品之莫耳濃度。

基於單一位點配位體結合，經純化GALNS攝取至滑膜細胞中之Kd為4.9 nM。

甘露糖-6-磷酸酯(M6P)受體板結合檢定。在板結合檢定中測定GALNS與甘露糖-6-磷酸酯(M6P)受體結合之能力。用4 μg/mL M6P受體塗佈FluoroNunc高結合板。經塗佈之板用每孔250 μL洗滌緩衝液(WB，TBS+0.05% Tween20)洗滌兩次，且用每孔200 μL阻斷及稀釋緩衝液(BDB，Pierce SuperBlock緩衝液，批號CA 46485)阻斷非特異性結合。在室溫(RT)下培育板1小時。在此阻斷步驟期間，經純化GALNS樣品(0.5-2 mg/mL，在4℃下儲存2週)於BDB中稀釋至10 nM，接著於稀釋緩衝液(DB，50 mM NaOAc、1 mM NaCl(pH 4.0)+0.5 mg/mL BSA)中連續稀釋(250 μL+250 μL)至5、2.5、1.25、0.62、0.31及0.16 nM。如上用WB洗滌經阻斷之板，且將經稀釋之GALNS樣品以每孔100 μL一式兩份地分配至孔中且在室溫下培育1小時。在此培育步驟期間，藉由將0.1 mL 100 mM 6S-半乳糖-4MU儲備物(儲存於H₂O中，-20℃)稀釋至5 mL DB中來製備2 mM活性受質，且在37℃水浴中預溫熱。在培育之後，如上用WB將板洗滌兩次，且添加100 μL經稀釋之受質並測定GALNS比活性。

使用該檢定，基於單一位點結合，經純化GALNS與M6P受體結合之Kd為2.4 nM。

甘露糖-6-磷酸酯(M6P)受體管柱結合。在管柱結合檢定中測定GALNS與甘露糖-6-磷酸酯(M6P)受體結合之能力。根據製造商之說明書製備M6P受體管柱。M6P受體來自Peter Lobel實驗室，管柱樹脂為NHS活化樹脂(Bio-RAD Affi-Gel 15)，且管柱尺寸為0.7 mL。用10管柱體積(CV)之平衡緩衝液(EQ，酸性PBS(pH 6.0)，其含有5 mM β-甘油磷酸酯、0.05% Tween20、5 mM葡萄糖-1-磷酸酯及0.02% NaN₃)以0.25 ml/min之流速平衡M6P受體管柱。將6 μg經純化GALNS(每200 μl)以0.1 ml/min之流速裝載於M6P受體管柱上。以10 CV EQ以0.25 mL/min之流速將未結合之GALNS洗出管柱。使用0-100%溶離緩衝液(EL，酸性PBS(pH 6.0)，其含有5 mM β-甘油磷酸酯、0.05% Tween20、5 mM甘露糖-6-磷酸酯及0.02% NaN3)梯度(10 CV)，接著2 CV之100% EL將結合之GALNS溶離出管柱。用3 CV EQ再平衡管柱。

使用GALNS ELISA，與M6P受體結合之經純化GALNS之百分比測定為56%。

藉由毛細管電泳(CE)進行總寡醣分析。為了測定GALNS上之甘露糖-6-磷酸化程度，如Ma等人,Anal. Chem. 71(22):5185-5192,1999中所述藉由毛細管電泳(CE)確定GALNS上總寡醣之N-連接碳水化合物概況。該方法使用PNG酶F裂解天冬醯胺N-連接寡醣。分離裂解之寡醣且用螢光染料衍生，且施加於G10旋轉管柱以移除過量染料。電泳分離經純化之經螢光標記之寡醣，隨後使用MDQ-CE軟體(32 Karat 7.0版)對峰進行定量。

使用此檢定，經純化GALNS之雙磷酸化甘露糖7(BPM7)、單磷酸化甘露糖6(MPM6)及含有寡醣之唾液酸之量分別為每莫耳酶0.58莫耳、每莫耳酶0.08莫耳及不可偵測。含有BPM7之GALNS蛋白之百分比估計為29%。

Bis7寡醣表徵。確定雙磷酸化甘露糖7(BPM7)寡醣在GALNS上之位置。位置178之天冬醯胺(Asn)殘基經N-連接糖基化成BPM7。位置397之Asn殘基未經N-連接糖基化成BPM7，但發現其主要為寡甘露糖型糖。

羥基磷灰石親和力。開發一種確定GALNS是否具有靶向骨骼之能力的活體外骨骼模型。製備4 mg/mL HTP-DNA等級羥基磷灰石(Bio-RAD)懸浮液且於DBS+50 μg/mL BSA(pH 7.4)中平衡。在添加50 μg/mL BSA之後，經純化GALNS於DBS(pH 7.4)中脫鹽。在96孔板中於DBS+50 μg/mL BSA(pH 7.4)中連續稀釋脫鹽之GALNS，最終濃度為約2 mg/mL。50 μL經連續稀釋之GALNS轉移至96孔過濾板(Millipore編號MSGVN2210，親水性PVDF，低蛋白結合，22 μm微孔尺寸)中。添加50 μL羥基磷灰石懸浮液至過濾板之含有經連續稀釋之GALNS的孔中且在37℃下在適度震盪下培育1小時。對板進行真空過濾。

藉由如上所述之HPLC或GALNS酶活性來分析真空過濾上清液。經純化GALNS對羥基磷灰石之Kd為3-4.0 μM。

表現人類硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)之G71S細胞株產生具有較高活化量(亦即活性位點半胱胺酸殘基向C_α-甲醯甘胺酸(FGly)之轉化率)之溶酶體硫酸酯酶。

為了確定與SUMF1共表現於G71S細胞中之經純化重組溶酶體硫酸酯酶(例如人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS))是否展現增加之活化，測定經純化溶酶體硫酸酯酶上活性位點半胱胺酸殘基向FGly之轉化量。

GALNS活化。藉由LC/MS(TFA)測定GALNS之活化百分比，亦即活性位點半胱胺酸(Cys)殘基向C_α-甲醯甘胺酸(FGly)之轉化百分比。Cys、FGly及Gly之TIC/1000分別為39、1840及183，指示約90%之經純化GALNS係呈活性(亦即FGly)形式。

概述。表9展示表現於G71S純系4細胞中之重組GALNS之表徵的概述。表10展示表現於G71S純系C2細胞中之重組GALNS之表徵的概述。

此等結果證明經純化重組人類GALNS具有高程度活化及高程度甘露糖6-磷酸酯磷酸化。因此，共表現SUMF1與溶酶體硫酸酯酶(亦即GALNS)之G71S細胞高效產生活性高度磷酸化溶酶體硫酸酯酶。此等溶酶體硫酸酯酶上之高甘露糖殘基的含量增加使得經細胞上之MPR攝取增加。

實例VIII 重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)在活體外莫奎歐軟骨細胞中之攝取及活性

評估活體外莫奎歐軟骨細胞之溶酶體對重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之攝取及GALNS降解硫酸角質素(KS)之能力。

來自罹患第IVa型黏多醣病(MPS IVa，莫奎歐症候群)之患者的軟骨細胞之GALNS活性降低且展現KS之溶酶體累積。使用自MPS IVa患者之骼脊(iliac crest)活檢體分離之軟骨細胞來建立MPS IVa之活體外模型。然而，初級軟骨細胞在培養中去分化(de-differentiate)且喪失其軟骨細胞特徵。因此，建立培養條件以誘導軟骨細胞活體外分化。

在IGF-1、TGF-β、運鐵蛋白、胰島素及抗壞血酸(軟骨細胞生長培養基，Lonza編號CC-3225)存在下在海藻酸鹽珠粒中培養自MPS IVa患者分離之軟骨細胞，稱為MQCH。每週更換兩次培養基，持續6至15週之實驗持續時間。此等培養條件誘導軟骨細胞表型表現及分化。此等MQCH細胞表現軟骨細胞標記，包括性別決定區Y-盒9(Sox 9)、膠原蛋白II、膠原蛋白X、軟骨寡聚基質蛋白質及聚集蛋白聚糖mRNA，如藉由使用自MQCH細胞培養物分離之RNA進行定量RT-PCR分析所量測。此等經培養之MQCH細胞亦產生細胞外基質。

執行共焦顯微檢查以確認MQCH細胞累積KS。8週培養物中之MQCH細胞經胰蛋白酶處理，細胞旋塗(cytospun)於玻璃載片上，固定於丙酮中，且冷凍直至使用。在解凍之後，細胞經再水合且分別使用抗KS單株抗體(Chemicon)及Alexa-488(綠色)結合之山羊抗兔抗體作為一次及二次抗體進行染色。MQ-CH細胞顯示與溶酶體KS累積一致之點狀細胞內染色。

為確定經純化重組人類GALNS是否可由MQCH細胞吸收至溶酶體中且降解KS，每週兩次使6週MQCH細胞培養物與10 nM重組人類GALNS一起培育9週。藉由共焦顯微法量測GALNS攝取量及KS清除率。所用一次抗體為：(a)抗GALNS兔多株抗體及抗溶酶體相關膜蛋白-1(LAMP-1)單株抗體，或(b)抗KS單株抗體及抗LAMP-1多株抗體。所用二次抗體為：Alexa-488(綠色)結合之抗體用以偵測抗GALNS或抗KS抗體，或Alexa-555或Alexa-594(紅色)結合之抗體用以偵測抗LAMP-1抗體)。將MQCH細胞製劑固定於含有將核染色之DAPI的封固劑(mountant)中。

觀測到在經GALNS處理之MQCH細胞中，GALNS酶及KS與溶酶體標記LAMP-1顯著共定位。在MQCH暴露於重組人類GALNS後，細胞內KS之量降低。

亦使用GALNS酶捕捉ELISA及GALNS比活性ELISA(均描述於以上實例IV中)來量測GALNS攝取量。表現GALNS之正常人類軟骨細胞(NHKC)用作陽性對照。如表11及12中所示，未經處理之MQCH細胞不具有可偵測之GALNS酶或活性，而用10 nM GALNS處理9週之MQCH細胞具有顯著GALNS酶及活性。

^a未偵測；^b ng GALNS抗原/μg總蛋白質

^a未偵測；^b GALNS活性/ng抗原

此等結果證明活體外經純化重組人類GALNS由莫奎歐軟骨細胞吸收至溶酶體中且可降解溶酶體KS。此等莫奎歐軟骨細胞適用作活體外功效模型來測試會降解KS之溶酶體硫酸酯酶，諸如GALNS。

實例IX 活體外細胞基檢定中重組人類溶酶體酶降解天然受質之活性

開發活體外細胞基檢定來量測重組人類溶酶體酶(例如溶酶體硫酸酯酶)降解天然受質之活性。

重組人類溶酶體酶(例如溶酶體硫酸酯酶)之酶活性通常藉由使用人工螢光受質進行無細胞活體外檢定加以量測(對於GALNS，參見實例4)。然而，量測之酶活性視人工受質之尺寸(亦即單醣單元之數目)而定。此外，量測酶在不反映活體內情況之環境中之活性。因此，無細胞活體外檢定並不考慮溶酶體酶裂解天然受質之能力或其經吸收至目標細胞中且定位於溶酶體之能力。

開發一種細胞基活體外檢定來量測兩種重組人類溶酶體酶(α-L-艾杜糖醛酸酶(IDU)及芳基硫酸酯酶B(ARSB))降解其天然受質(亦即細胞內含硫酸皮膚素(DS)之受質)的活性。DS含有可變硫酸化之艾杜糖醛酸g(1-3)-N-乙醯基-半乳糖胺β(1-4)雙醣單元。

在12孔板中培養ARSB缺乏之GM00519人類纖維母細胞或IDU缺乏之GM01391人類纖維母細胞至匯合，且培養物在匯合後維持3-6週以允許細胞內DS累積。

匯合後之GM00519或GM01391細胞接著分別暴露於飽和劑量之重組人類ARSB(10 nM)或重組人類IDU(25 nM)中4-5天。收集、溶解並離心未經處理及經溶酶體硫酸酯酶處理之細胞。

細胞溶解產物中之溶酶體酶活性藉由測定細胞之殘餘DS含量來量測，該測定包括以下步驟：(1)溶解細胞；(2)使用細胞溶解產物中之軟骨素ABC裂解酶(EC 4.2.2.4)使含DS受質特異性消化至雙醣中；(3)用螢光染料(例如2-胺基-吖啶酮，AMAC)標記DS雙醣；(4)分離DS雙醣(例如藉由毛細管區電泳，CZE)；及(5)偵測經標記之DS雙醣(例如藉由雷射誘導螢光，LIF)。此等方法描述於例如Zinellu等人，Electrophoresis 2:2439-2447,2007及Lamari等人,J. Chromatogr. B 730:129-133,1999中(評述於Volpi等人,Electrophoresis 29:3095-3106,2008中)。

表13展示使用經ARSB處理之GM00519細胞時DS之降解百分比，如藉由量測作為主要DS雙醣之含有N-乙醯半乳糖胺-4-硫酸酯之雙醣(4S雙醣)的量所測定。使用經IDU處理之GM01391細胞獲得類似結果。

^a降解百分比係藉由量測在CZE-LIF掃描中偵測到之來自經ARSB處理之細胞相較於未經處理之細胞之溶解產物中的4S雙醣之曲線下面積來計算

以上檢定指示目標細胞吸收重組人類ARSB及IDU，其接著經定位至溶酶體，在此處其降解其天然受質細胞內DS。

進行劑量尋找實驗以確定在此細胞基檢定中IDU變為速率限制時的濃度。GM01391細胞於12孔板中培養。在匯合後4週時，細胞暴露於各種濃度(0.8 nM至25 nM)之IDU中6或26小時。如上所述製備及加工細胞溶解產物。經測定，IDU在1 nM以下未變為速率限制。

在第二劑量尋找實驗中，在匯合後3週時之GM01391細胞暴露於各種濃度(0.01 nM至0.2 nM)之IDU中2天。如上所述製備及加工細胞溶解產物。在此實驗中，將已知量之內標單醣GlcNAc-6S摻入細胞溶解產物中以在加工期間控制回收率。如圖13中所示，觀測到經IDU處理之GM01391細胞中DS受質之量劑量依賴性降低。

在類似之劑量尋找實驗中，在匯合後3週時之GM00519細胞暴露於各種濃度(0.001 nM至0.06 nM)之ARSB中5天。如上所述製備及加工細胞溶解產物。在此實驗中，將已知量之內標單醣GlcNAc-6S摻入細胞溶解產物中以在加工期間控制回收率。如圖14中所示，觀測到經ARSB處理之GM00519細胞中DS受質之量劑量依賴性降低。

開發一種細胞基活體外檢定來量測重組人類溶酶體硫酸酯酶GALNS降解其天然受質(亦即細胞內含硫酸角質素(KS)之受質)的活性。

如以上實例8中所述來培養GALNS缺乏之MQCH細胞且用1 nM或10 nM之重組人類GALNS處理。在處理之後，製備MQCH細胞溶解產物且用使較大KS寡醣裂解成KS雙醣之硫酸角質素酶II(EC 3.2.1)消化。如以上關於DS雙醣所述，KS雙醣用AMAC標記，藉由CZE分離且藉由LIF偵測。將GlcNAc-6S(一種KS單醣)作為內標摻入細胞溶解產物中以在加工期間控制回收率。量測兩種特徵性KS雙醣(Gal6S-GlcNAc6S及Gal-GlcNAc6S)之量，且由所回收之GlcNAc6S之量修正所得數據。表14展示使用經GALNS處理之MQCH細胞時KS之降解百分比，如藉由量測兩種特徵性KS雙醣之量所測定。

^a,b降解百分比藉由量測在CZE-LIF掃描中偵測到之來自經GALNS處理之細胞相較於未經處理之MQCH細胞之溶解產物中的Gal6S-GlcNAc6S及Gal-GlcNAc6S之曲線下面積，且針對摻加對照GlcNAc6S之曲線下面積進行調整來計算。

以上檢定指示目標細胞吸收重組人類GALNS，其接著經定位至溶酶體，在此處GALNS降解其天然受質細胞內KS。

總之，此等結果證明重組人類溶酶體酶ARSB、IDU及GALNS降解其天然受質之活性可在細胞基活體外檢定中加以量測及定量。應瞭解此細胞基活體外檢定可容易地加以改進以量測及定量其他溶酶體硫酸酯酶以及多種重組溶酶體酶之活性。

實例X 重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)向特定組織中之傳遞

評估表現於G71細胞中且經純化之重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)在其投與小鼠後傳遞至受GALNS缺乏影響或與GALNS缺乏相關之特定組織的能力。

硫酸角質素之高度特異性分佈產生第IVa型黏多醣病(MPS IVA)或莫奎歐症候群之極具特徵性之表型。硫酸角質素主要見於軟骨(關節骨生長板、心瓣膜、喉及鼻中隔)及角膜中，且此等組織在MPS IVA患者中展現硫酸角質素累積。因此，對於MPS IVA或莫奎歐症候群中缺乏之N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)，重要的是顯示GALNS酶向長骨生長板、心瓣膜、角膜、喉及鼻之傳遞。為檢查作為不良血管化目標之此等特定組織，在小鼠中研究螢光GALNS之傳遞。

在小鼠中測試兩種免疫組織化學染色法：(1)與Alexa 488結合之人類GALNS及(2)未結合之人類GALNS。使用Molecular Probes Alexa Fluor 488 C₅順丁烯二醯亞胺標記套組(A-10254)來進行人類GALNS與Alexa 488之結合。順丁烯二醯亞胺結合化學產生1:1之標記與蛋白質之比率。

為了確認螢光標籤並不干擾GALNS之攝取，使用經培養之滑膜細胞(ATCC編號CRL-1832)進行免疫細胞化學實驗。使用標準攝取檢定來比較未結合之GALNS與結合之GALNS(GALNS-A488或GALNS-A555)。細胞與GALNS酶一起培育4小時，隨後用α-L-艾杜糖醛酸酶(IDU)追蹤2小時。結果顯示Alexa 488結合並不干擾細胞攝取。圖15展示GALNS、GALNS-A488及GALNS-A555之估計Kd值。因為標記使酶不活化，所以藉由細胞溶解產物而非酶活性之抗原ELISA來量測攝取量。測出未結合及結合之GALNS酶之Kd值大約相等。

為了測定螢光標籤之穩定性，一旦GALNS酶併入細胞中後，即對未結合及結合之GALNS進行免疫染色。用於染色之一次抗體為蛋白G純化之抗GALNS兔抗體，濃度為1 μg/mL。使用MetaMorph軟體，在Leica IRE2寬視場落射螢光(epi-fluorescent)顯微鏡上獲取所有影像。由於存在平面外光，因此需要對影像堆疊解卷積(Deconvolution)以量測此等影像中之共定位。使用AutoQuant/AutoDeblur觀測軟體，使用理論點散佈函數(盲演算法)來進行解卷積。

免疫染色顯示與經GALNS-A488物質放大之信號相當良好之重疊。所觀測到之敏感性增加係由於一次抗體及二次抗體均為多株抗體之故。

為確定GALNS酶是否靶向溶酶體，用Molecular Probes Lysotracker或定位於溶酶體中之另一酶對經培養之滑膜細胞進行免疫染色。Lysotracker似乎顯示與GALNS-488酶有一定程度之重疊；然而，染色並不均一。用重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(rhASB)(一種溶酶體酶)追蹤2小時確實顯示與GALNS有一定程度之共定位。

以上實驗顯示GALNS-A488酶由細胞吸收且定位至溶酶體，且可用於測定活體內生物分佈。

進行兩項活體內研究。第一預備研究為在正常Balb/c小鼠之尾靜脈中進行單次劑量(10 mg/kg)快速注射，接著每隔一天在正常Balb/c小鼠之尾靜脈中多次(5次)注射10 mg/kg進行第二研究。表15及表16分別描述第一及第二研究之實驗計劃。

在第一預備研究中，在2小時及24小時時間點收集心臟、肝及胺骨/股骨關節。在第二研究中，在2小時、4小時及8小時時間點收集心臟、腎、肝，及帶有四頭肌及比目魚肌之骨骼。對於兩項研究，心臟、腎及肝均浸漬固定於4%多聚甲醛(PFA)中4天，以石蠟包埋，接著切片成7 μm厚度。第二研究中包括肌肉之骨骼浸漬固定於4% PFA中8天，脫鈣，以石蠟包埋，且切片成7 μm厚度。

用Zeiss雷射掃描共焦顯微鏡獲得經GALNS-A488注射之小鼠的影像。對於第一預備研究中之分析，每個心瓣膜及肝臟樣品獲得一個共焦堆疊且用於體積分析。每個生長板樣品獲得兩個共焦堆疊且用於體積分析。在第二研究中，每個心瓣膜、腎及肝樣品獲得一個共焦堆疊且用於體積分析；每個生長板及靜息軟骨區(zone of rest cartilage，zrc)樣品獲得兩個共焦堆疊且用於體積分析。

來自共焦顯微成像研究之結論為：(1)有可能偵測活體內螢光GALNS；(2)信號具有特異性(不存在背景)且定位為溶酶體；(3)證明在肝臟中之竇狀隙細胞(sinusoidal cell)中存在GALNS；(5)在心臟中，GALNS酶存在於隔膜及心房中，但更重要的是其在心瓣膜層面上清楚可見，在此處在多次注射之後其分佈更深；(6)在股骨/脛骨接合處，GALNS酶存在於骨骼(骺)之礦化部分以及骨髓中。GALNS存在於生長板中。更特定言之，GALNS富集於靜息區(或儲備軟骨區)之軟骨細胞中，存在於增殖區之起始處，且在生長板末端之骨化區中大量再現。儘管難以定量多次注射之累積效應，但第二研究似乎顯示較寬分佈。表17展示共焦顯微成像研究之概述。

對於二次染色，初始步驟為使GALNS一次抗體最優化。用含蛋白G純化之抗GALNS兔抗體之1:100至1:400稀釋液對各種組織染色。第一預備研究中之結果指示對於高信雜比1:100之稀釋液為最佳。此結果在第二研究中經確認。以1:100之一次抗體稀釋液及1:1000之二次抗體稀釋液加工其餘載片。

當用蛋白G純化之抗GALNS抗體染色時，用GALNS給藥之Balb/c小鼠之信號超過對照(亦即用PBS-Cys給藥之小鼠)之信號。為確認GALNS酶定位於溶酶體中，用抗LAMP1 抗體將切片染色。LAMP1為溶酶體之標記。影像顯示在抗LAMP1抗體與抗GALNS抗體之間有重疊，從而指示GALNS酶定位於溶酶體中。

總之，兩項活體內研究指示GALNS生物分佈與血管形成有關，亦即較多血管化組織含有較多螢光信號。更重要地，研究證明在莫奎歐症候群中之硫酸角質素累積部位存在GALNS，即使此等部位經不良血管化亦然。

實例XI 人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之調配物

目標在於研究各種賦形劑(例如緩衝劑、等張劑及穩定劑)對本發明調配物中重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之活性及結構的影響。

如實例V中所述製備GALNS酶。

如實例VII中所述對GALNS酶進行表徵。

在實例V中，經純化重組人類GALNS酶調配於10 mM NaOAc/HOAc、1 mM NaH₂PO₄、150 mM NaCl及0.005%或0.01% Tween-20(pH5.5)中。應注意在低濃度磷酸鹽緩衝液儲存後，GALNS酶發生去磷酸化。因此，磷酸鹽緩衝劑濃度增加至100 mM NaH₂PO₄。在高濃度磷酸鹽緩衝液中儲存後，未觀測到GALNS酶之顯著去磷酸化。然而，在5℃、25℃或40℃下儲存後觀測到可溶性GALNS聚集體，且在40℃下儲存後觀測到不溶性GALNS聚集體。

在第一研究中，評估穩定劑濃度及pH值對重組GALNS之穩定性的影響。經純化重組GALNS酶調配於20 mMNaOAc/HOAc、50 mM NaH₂PO₄、0.01% Tween-20及4%蔗糖或2%山梨糖醇中。測試之穩定劑：15 mM或30 mM精胺酸鹽酸鹽(精胺酸HCl)；及15 mM或30 mM NaCl。測試之pH值：5.0、5.4及5.8。pH 5.8調配物經測定在pH 5.8至6.0範圍內。酶調配物在5℃、25℃或40℃下儲存長達2個月之後，使用實例VI中描述之各種檢定分析GALNS酶。

藉由用尺寸排阻層析-高效液相層析(SEC-HPLC)對GALNS酶進行概況分析來確定各種調配物中可溶性聚集體之形成。15 mM與30 mM精胺酸鹽酸鹽兩者之存在均抑制可溶性聚集體之增長，如藉由SEC-HPLC所確定(圖16)。

使用活體外酶活性檢定量測調配物中GALNS酶活性之穩定性。在5℃下，在精胺酸鹽酸鹽或NaCl存在下，GALNS酶活性穩定；在25℃下，在精胺酸鹽酸鹽或NaCl存在下，GALNS酶活性略微降低；且在40℃下，含有NaCl之調配物中之GALNS酶活性展現最小穩定性(圖17)。

在用PNG酶F消化酶以裂解天冬醯胺N-連接寡醣之後，藉由毛細管電泳(CE)量測雙磷酸化甘露糖7(BPM7)之百分比來研究調配物中GALNS酶之去磷酸化。在5℃、25℃或40℃下2個月之後，所有酶調配物中之GALNS酶在BPM 7%方面的糖基化概況皆類似於用於I期臨床調配物中之參考批次GALNS之糖基化概況(圖18)。

藉由用逆相高效液相層析(RP-HPLC)對GALNS酶進行概況分析來測定GALNS酶在調配物中之純度。在5℃或25℃下2個月之後，調配物均不展現任何峰面積變化；在40℃下，含有精胺酸鹽酸鹽之調配物在pH 5.0及pH 5.4下亦不展現任何峰面積變化，但含有NaCl之調配物在pH 5.0及pH 5.4下及所有調配物在pH 5.8下展現峰面積減小(圖19)。在RP-HPLC層析圖中，調配物中觀測到峰後肩(post-peak shoulder)。含有30 mM精胺酸鹽酸鹽之GALNS調配物展現最不顯著之峰後肩。

實例XII 人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之例示性調配物

以下實例提供關於欲用於調配包含重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)或其生物活性片段、突變體、變異體或類似物之組合物之參數的導則，該等組合物適用於治療莫奎歐症候群或MPS IVa。欲用於調配本發明之GALNS組合物之參數包括(但不限於)維持pH值之緩衝劑、等張性調整劑、不存在或存在穩定劑、及不存在或存在其他賦形劑、媒劑、稀釋劑及其類似物。

在實例XI中，重組GALNS以約1 mg/mL之濃度加以調配。較佳GALNS以在約0.1至10 mg/mL、較佳約0.5至5 mg/mL、且更佳約0.5至1.5 mg/mL之範圍內的濃度加以調配。在一實施例中，本發明之GALNS組合物之調配物具有約1 +/- 0.5 mg/mL之GALNS酶濃度。

在實例XI中，重組GALNS酶在pH 5.0、5.4及5.8下調配於20 mM NaOAc/HOAc、50 mM NaH₂PO₄中。較佳緩衝劑為NaOAc/HOAc或其等效物；及NaH₂PO₄或其等效物，其中NaOAc/HOAc濃度範圍為約5至100 mM、較佳約5至50 mM、且更佳約10至30 mM，且NaH₂PO₄濃度範圍為約5至100 mM、較佳約25至100 mM、且更佳約25至75 mM。在一例示性實施例中，本發明之GALNS組合物之調配物具有約20 +/- 10 mM之NaOAc/HOAc緩衝劑濃度及約50 +/- 25 mM之NaH₂PO₄緩衝劑濃度。

調配物之較佳pH值為約pH 4.5-6.5、較佳約pH 5.0-6.0、且更佳約pH 5.0-5.8。在一實施例中，本發明之GALNS組合物之調配物具有約pH 5.4 +/- 0.4之pH值。

在實例XI中，重組GALNS酶調配於15 mM或30 mM精胺酸鹽酸鹽或NaCl中。較佳穩定劑為精胺酸鹽酸鹽或其等效物，其中濃度範圍為約5至200 mM、較佳約10至100 mM、且更佳約10至50 mM。在一例示性實施例中，本發明之GALNS組合物之調配物具有約30 +/- 20 mM之精胺酸鹽酸鹽濃度。

在實例XI中，重組GALNS酶調配於0.01% Tween-20中。較佳穩定劑為Tween-20(亦稱為聚山梨醇酯-20)或其等效物，其中濃度範圍為約0.001至1.0%(w/v)、較佳約0.005至0.2%(w/v)、且更佳約0.005至0.015%(w/v)。在一實施例中，本發明之GALNS組合物之調配物具有約0.01% +/- 0.005%(w/v)之Tween-20濃度。

在實例XI中，重組GALNS酶調配於4%蔗糖或2%山梨糖醇中。較佳穩定/低溫保護劑/張力劑為山梨糖醇或其等效物，其中濃度範圍為約0.1至10%(w/v)、較佳約0.5至5%(w/v)、且更佳約1.0至3.0%(w/v)。本發明之GALNS組合物之一例示性調配物具有約2.0% +/- 1.0%(w/v)之山梨糖醇濃度。

因此，本發明之GALNS酶組合物之一例示性調配物展示於表18中。

*pH值係藉由用冰乙酸(HOAc)或1 N氫氧化鈉(NaOH)滴定來調整。

實例XIII 重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)及其他溶酶體硫酸酯酶在溶酶體硫酸酯酶活性缺乏之小鼠中之效應

評估本發明之活性高度磷酸化人類溶酶體硫酸酯酶(例如重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS))在溶酶體硫酸酯酶活性缺乏之小鼠中之效應。

重組人類GALNS蛋白在G71S細胞中表現且加以純化。其他重組人類溶酶體硫酸酯酶可基本上根據本文所述之方法或藉由此項技術中已知之程序加以表現及純化。

已描述人類溶酶體硫酸酯酶缺乏症之若干小鼠模型，包括：異染性腦白質營養不良(MLD)(芳基硫酸酯酶A缺乏症)(Hess等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14821-14826,1996)、第VI型黏多醣病(MPS VI)或馬拉二氏症候群(芳基硫酸酯酶B缺乏症)(Evers等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8214-8219,1996)、第II型黏多醣病(MPS II)或亨特症候群(艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶缺乏症)(Muenzer等人,Acta Paediatr.增刊91(439):98-99,2002；Cardone等人,Hum. Mol. Genet. 15:1225-1236,2006)、第IIIa型黏多醣病(MPS IIIa)或聖菲利柏A症候群(磺醯胺酶/乙醯肝素-N-硫酸酯酶缺乏症)(Bhaumik等人,Glycobiology 9(12):1389-1396,1999)、第IVa型黏多醣病(MPS IVa)或莫奎歐A症候群(N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶缺乏症)(Tomatsu等人,Hum. Mol. Genet. 12:3349-3358,2003)及多種硫酸酯酶缺乏症(MSD)(硫酸酯酶修飾因子1缺乏症)(Settembre等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:4506-4511,2007)。第IIId型(MPS IIId)黏多醣病或聖菲利柏D症候群(N-乙醯葡糖胺-6-硫酸酯酶缺乏症)之小鼠模型尚待描述。

人類溶酶體硫酸酯酶缺乏症之小鼠模型可用於評估酶替代療法(ERT)作為治療溶酶體儲存病症之手段的可行性。舉例而言，MPS IVa基因剔除小鼠(GALNS ^-/-小鼠；Tomatsu等人,Hum. Mol. Genet. 12:3349-3358,2003)不具有可偵測之GALNS酶活性且顯示增加之尿葡糖胺聚糖(GAG)(亦即硫酸角蛋白(keratin sulfate)及軟骨素-6-硫酸酯)及GAG在多個組織及器官(例如肝、腎、脾、心臟、腦、骨髓及軟骨)中之累積。然而，GALNS ^-/-小鼠並不顯示與人類疾病相關之骨骼異常。已開發另一MPS IVa小鼠模型，其表現非活性人類GALNS及突變之非活性內源小鼠GALNS(GALNS ^{tm(hC79S.mC76S)slu}小鼠；Tomatsu等人,Hum. Mol. Genet. 14:3321-3335,2005)。在不具有可偵測之GALNS酶活性的GALNS ^{tm(hC79S.mC76S)slu}小鼠中，尿GAG排泄量增加，GAG在多個組織(包括內臟器官、腦、角膜、骨骼、韌帶及骨髓)中累積，溶酶體儲存在多個組織中為顯著的且骨骼儲存為明顯的。GALNS ^{tm(hC79S.mC76S)slu}小鼠中之病理性變化不同於在GALNS ^-/-小鼠中觀測到之彼等變化。然而，與GALNS ^-/-小鼠類似，GALNS ^{tm(hC79S.mC76S)slu}小鼠不顯示與人類疾病相關之骨骼異常。因此，GALNS ^-/-或GALNS ^{tm(hC79S.mC76S)slu}小鼠可用於研究投與重組人類GALNS對增加之尿GAG及GAG在組織中之累積的影響。

每週給與4週齡GALNS ^-/-、GALNS ^{tm(hC79S.mC76S)slu}或野生型小鼠靜脈內注射(n=每組至少6或8隻小鼠)各種劑量之重組人類GALNS(例如0.1、0.3、1、3、10 mg/kg)或媒劑對照直至16-20週齡，接著處死以進行組織學檢查。收集小鼠之尿且如所述測定尿GAG排泄量(Tomatsu等人,Hum. Mol. Genet. 12:3349-3358,2003)。如所述進行各種組織之病理學檢查(Tomatsu等人,Hum. Mol. Genet. 12:3349-3358,2003)。

使用GALNS ^-/-或GALNS ^{tm(hC79S.mC76S)slu}小鼠，預期本發明之重組人類GALNS會顯示能夠降低：(1)尿GAG排泄量；(2)GAG在多個組織(例如內臟器官、腦、角膜、骨骼、韌帶及骨髓)中之累積；(3)溶酶體在多個組織中之儲存；及(4)骨骼儲存。

研究重組人類GALNS在多種硫酸酯酶缺乏症(MSD)之小鼠模型中之效應(SUMF1 ^-/-小鼠；Settembre等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:4506-4511,2007)。因為SUMF1 ^-/-小鼠顯示常在生命早期死亡，所以早於以上關於GALNS ^-/-小鼠所述之時間，起始用重組人類GALNS注射此等小鼠。

遵循此項技術中已知之程序，研究其他重組人類溶酶體硫酸酯酶(亦即芳基硫酸酯酶A、芳基硫酸酯酶B、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、磺醯胺酶/乙醯肝素-N-硫酸酯酶及N-乙醯葡糖胺-6-硫酸酯酶)在MLD(ASA ^-/-小鼠；Hess等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14821-14826,1996)、MPS VI(As1-s ^-/-小鼠；Evers等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8214-8219,1996)、MPS II(ids ^y/-小鼠；Cardone等人,Hum. Mol. Genet. 15:1225-1236,2006)、MPS IIIa(Bhaumik等人,Glycobiology 9(12):1389-1396,1999)及MSD(SUMF1 ^- ^/-小鼠；Settembre等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:4506-4511,2007)之小鼠模型中之效應。

實例XIV 用重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)及其他溶酶體硫酸酯酶治療患有第IVA型黏多醣病(或莫奎歐症候群)或其他溶酶體硫酸酯酶缺乏症之人類患者

預期顯現諸如經診斷有第IVA型黏多醣病(MPS IVa或莫奎歐症候群)之患者之溶酶體硫酸酯酶缺乏症之臨床表型的人類患者用重組酶(亦即人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS))進行酶替代療法。所有罹患溶酶體硫酸酯酶缺乏症之患者皆顯現以下一些臨床跡象：其溶酶體中之儲積物質在內臟及軟組織中過度或有害累積，此如由不同程度之與特定溶酶體儲積疾病相關的功能障礙或惡化之健康狀況所顯現。所有MPS IVa患者皆顯現以下一些臨床跡象：骨骼畸形、身材矮小及步態異常、及/或葡糖胺聚糖(GAG)在血液或尿中累積，以及不同程度之功能障礙。

較佳地，在罹患溶酶體硫酸酯酶缺乏症之患者中監測酶含量以確認在其組織中溶酶體硫酸酯酶不存在或活性降低。溶酶體酶活性為另一正常個體之10%以下、較佳5%以下、更佳2%以下且甚至更佳1%以下的患者為適於用適當溶酶體硫酸酯酶治療之候選者。可在實施療法之前、期間及之後收集資料以測定患者之溶酶體硫酸酯酶活性。

藉由量測溶酶體硫酸酯酶之受質(亦即葡糖胺聚糖(GAG))之尿排泄量隨時間的降低百分比來測定功效。將罹患溶酶體硫酸酯酶缺乏症之患者的尿GAG含量與正常排泄含量及/或罹患相同溶酶體硫酸酯酶缺乏症之未經治療之患者的含量及/或相同患者在實施溶酶體硫酸酯酶療法之前的含量進行比較。在實施溶酶體硫酸酯酶療法之後未降解GAG之排泄量有超過25%之降低、較佳超過50%之降低為量測個體對療法之反應的有效手段。

亦可根據與溶酶體儲積疾病相關之病變之徵象及症狀的減輕來測定功效。可藉由用於測定溶酶體、細胞或組織中GAG之降低程度之組織生檢及細胞及/或溶酶體之檢查來測定功效。功效可藉由功能評估來測定，該等功能評估可為客觀或主觀的(例如疼痛或功能困難之減輕、肌力或精力之增加、心輸出量之增加、運動耐久性、體重變化、高度或外貌之變化及其類似功能評估)。

醫藥組合物包含表現於G71S細胞中且經純化之重組人類GALNS，且根據此項技術中已知之程序來加以調配。較佳靜脈內投與本發明之醫藥組合物。

研究向MPS IVa患者投與重組人類GALNS之效應之初始臨床研究的基本設計涉及開放標記之劑量增加安全性/功效研究，其中以固定時間間隔向患者靜脈內投與各種劑量之酶(例如(但不限於)每週進行酶注射)。

對於MPS IVa患者，藉由量測例如減少之血液或尿GAG(其可能在ERT之數週內觀測到)、在心、肺及/或運動功能測試中增大之耐久性(其可能在ERT之數月內觀測到)及/或骨骼變化及/或身體生長(其可能在ERT之數年內觀測到)來測定功效。

尿GAG量測適用於確定適當劑量方案，以及藉由量測尿GAG排泄量隨時間之降低百分比來測定功效。

可採用各種耐久性測試，包括例如(但不限於)行走測試(6或12分鐘內行走之距離)、爬樓梯(梯級數/分鐘)及肺/呼吸功能，包括心臟功能(ECG，超音心動圖(echocardiogram))、肺功能(FVC，FEV₁，峰值流量)。

對於經受長時期治療之較年輕患者，可量測生長(高度)。

可使用本發明方法治療或預防之與溶酶體硫酸酯酶活性缺乏相關之溶酶體儲積疾病為：異染性腦白質營養不良(MLD)、第VI型黏多醣病(MPS VI)或馬拉二氏症候群、第II型黏多醣病(MPS II)或亨特症候群、第IIIa型黏多醣病(MPS IIIa)或聖菲利柏A症候群、第IIId型黏多醣病(MPS IIId)或聖菲利柏D症候群、第IVa型黏多醣病(MPS IVa)或莫奎歐A症候群、或多種硫酸酯酶缺乏症(MSD)。對於各溶酶體儲積疾病，重組溶酶體硫酸酯酶將包含特定溶酶體硫酸酯酶。

對於涉及MLD之方法，較佳溶酶體硫酸酯酶為芳基硫酸酯酶A。對於涉及MPS VI之方法，較佳溶酶體硫酸酯酶為芳基硫酸酯酶B。對於涉及MPS II之方法，較佳溶酶體硫酸酯酶為艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。對於涉及MPS IIIA之方法，較佳溶酶體硫酸酯酶為磺醯胺酶/乙醯肝素-N-硫酸酯酶。對於涉及MPS IIID之方法，較佳溶酶體硫酸酯酶為N-乙醯葡糖胺-6-硫酸酯酶。對於涉及MPS IVA之方法，較佳溶酶體硫酸酯酶為N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶。對於涉及MSD之方法，較佳溶酶體硫酸酯酶為N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶。

*****

預期熟習此項技術者能想到如以上說明性實例中所闡述之本發明的眾多修改及變化。因此僅應對本發明施以如隨附申請專利範圍中出現之此等限制。

<110>　美商拜奧馬林製藥公司

<120>　活性高度磷酸化人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶之製備及其用途

<130>　30610/45573A

<140>　100126060

<141>　2011-07-22

<150>　61/366,714

<151>　2010-07-22

<160>　5

<170>　PatentIn version 3.5

<210>　1

<211>　1125

<212>　DNA

<213>　智人

<220>

<221>　misc_feature

<223>　人類硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)聚核苷酸序列

<400>　1

<210>　2

<211>　374

<212>　PRT

<213>　智人

<220>

<221>　MISC_FEATURE

<223>　人類硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)多肽序列

<400>　2

<210>　3

<211>　1569

<212>　DNA

<213>　智人

<220>

<221>　misc_feature

<223>　人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)聚核苷酸序列

<400>　3

<210>　4

<211>　522

<212>　PRT

<213>　智人

<220>

<221>　MISC_FEATURE

<223>　人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)多肽序列

<400>　4

<210>　5

<211>　496

<212>　PRT

<213>　智人

<400>　5

圖1描述人類硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)之核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。

圖2描述人類硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)之胺基酸序列(SEQ ID NO:2)。

圖3描述人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之核苷酸序列(SEQ ID NO:3)。

圖4描述人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之胺基酸序列(SEQ ID NO:4)。經加工之GALNS中不存在N端之含26個胺基酸之信號肽。

圖5描述經加工之人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)(SEQ ID NO: 5)之結構及特徵。1)加工前酶之分子量為約55 kDa，2)轉化成C_α-甲醯甘胺酸之半胱胺酸在位置53處，3)溶酶體中之經加工形式由二硫橋鍵聯接，4)2N連接之糖基化位點在位置178及397處，且5)BisP見於Asn178而非Asn397上。

圖6展示來自用人類硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)與人類GALNS表現載體共轉染之G71S細胞之人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的表現。(A)在96孔中針對活性GALNS之G71S純系篩檢。(B)G71S純系GALNS產率，以皮克/細胞/天計。

圖7說明用於大規模產生表現人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)及其變異體之G71S細胞之WAVE生物反應器控制器的示意圖。

圖8展示在4℃(菱形)或-70℃(三角形)下儲存後，經純化人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)酶活性之穩定性。

圖9展示依次藉由(A)藍色瓊脂糖凝膠6速流層析及(B)Fractogel SE Hi-CAP層析對人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之純化。純度係藉由SDS-PAGE之庫馬斯藍染色(左)及藉由使用抗GALNS(IVA)抗體進行之西方墨點法(右)加以測定。

圖10展示藉由超濾/透濾(UF/DF)、Fractogel SE Hi-Cap層析、Zn螯合瓊脂糖凝膠層析及ToyoPearl丁基650M層析對人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之純化。純度係藉由SDS-PAGE之庫馬斯藍染色(左上)及藉由使用抗GALNS抗體(右上)、抗組織蛋白酶L抗體(左下)及抗CHOP(中國倉鼠卵巢細胞蛋白)(右下)進行之西方墨點法加以測定。

圖 11展示用於第I/II階段製程(左邊)及第III階段製程(右邊)之人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)回收及純化製程的流程圖。

圖12展示根據第I/II階段製程(泳道3)或第III階段製程(泳道5)純化之人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的比較。藉由在還原條件下進行SDS-PAGE來分離5微克(5 μg)經純化GALNS，且凝膠用庫馬斯藍染色。泳道1對應於15 μL SeeBlue Plus2標記。以kDa計之分子量在經染色凝膠之左邊加以指示。

圖13顯示觀測到在經IDU處理之GM01391細胞中硫酸皮膚素受質之量劑量依賴性降低。

圖14顯示觀測到在經ARSB處理之GM00519細胞中硫酸皮膚素受質之量劑量依賴性降低。

圖15展示經培養之滑膜細胞對未標記(圓圈)或與A488(正方形)或A555(三角形)結合之人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的攝取。

圖16展示在5℃、25℃或40℃下儲存1或2個月後經純化人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之穩定性，如在包含15 mM精胺酸鹽酸鹽、30 mM精胺酸鹽酸鹽、15 mM NaCl或30 mM NaCl(版面分別指定為51、52、54或55)之調配物中在pH 5.0、pH 5.4或pH 5.8(版面分別指定為A、B或C)下所指示。藉由在儲存之後調配物中GALNS聚集體之峰面積百分比(%)來度量穩定性，該百分比係如藉由尺寸排阻層析-高效液相層析(SEC-HPLC)所測定。

圖17展示在5℃、25℃或40℃下儲存2個月後經純化人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)酶活性之穩定性，如在包含15 mM精胺酸鹽酸鹽、30 mM精胺酸鹽酸鹽、15 mM NaCl或30 mM NaCl(版面分別指定為51、52、54或55)之調配物中在pH 5.0、pH 5.4或pH 5.8(版面分別指定為A、B或C)下所指示。

圖18展示在5℃、25℃或40℃下儲存2個月後經純化人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之糖基化概況，如在如所指示之包含15 mM精胺酸鹽酸鹽、30 mM精胺酸鹽酸鹽、15 mM NaCl或30 mM NaCl之調配物中在pH 5.0、pH 5.4或pH 5.8下所指示。在用PNG酶F消化GALNS酶以裂解天冬醯胺N-連接寡醣之後，藉由毛細管電泳(CE)量測雙磷酸化甘露糖7(BPM7)之百分比。參考物指示在5℃、25℃或40℃下儲存2個月之參考批次GALNS的BPM7百分比，如在包含100 mM磷酸鹽緩衝劑之調配物中所指示。

圖19展示在5℃、25℃或40℃下儲存2個月後經純化人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)之穩定性，如在包含15 mM精胺酸鹽酸鹽、30 mM精胺酸鹽酸鹽、15 mM NaCl或30 mM NaCl(版面分別指定為51、52、54或55)之調配物中在pH 5.0、pH 5.4或pH 5.8(版面分別指定為A、B或C)下所指示。藉由在儲存之後調配物中GALNS酶之峰面積百分比(%)來度量GALNS酶之穩定性，該百分比係如逆相高效液相層析(RP-HPLC)所測定。

(無元件符號說明)

Claims

一種純化重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的方法，該GALNS酶包含與SEQ ID NO：4之胺基酸27至522至少95%一致之胺基酸序列，其中該GALNS酶：(i)具有至少95%之純度，其係在非還原條件下進行SDS-PAGE時藉由庫馬斯藍染色所測定，(ii)具有位置53之半胱胺酸殘基轉化為C_α-甲醯甘胺酸(FGly)之至少50%轉化率，及(iii)每條單體蛋白質鏈具有0.5至0.8條雙磷酸化寡甘露糖鏈，且其中至少98%之該GALNS酶係呈前驅體形式，其係藉由SDS-CGE所測定，該方法包含：a)過濾含有自表現人類硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)及該重組人類GALNS酶之哺乳動物細胞株分泌之該GALNS酶的培養基，超濾及/或透濾該經過濾之培養基，藉此該經超濾及/或透濾之培養基濃縮20倍，及木炭過濾該濃縮20倍之經超濾及/或透濾之培養基；b)將步驟a)之該經木炭過濾之經20倍超濾及/或透濾之培養基裝載於Zn螯合瓊脂糖凝膠FF捕捉管柱上，在使該GALNS酶保留在該管柱上之條件下洗該管柱，及自該管柱溶離該GALNS酶；c)視需要，將步驟b)中之該Zn螯合瓊脂糖凝膠FF捕捉管柱之溶離液以過濾器過濾來移除病毒；d)調整步驟b)之該Zn螯合瓊脂糖凝膠FF捕捉管柱之溶離液或步驟c)之濾液的pH至pH 4.5±0.1，且過濾該經調整為pH 4.5±0.1之該Zn螯合瓊脂糖凝膠FF捕捉管柱之溶離液或該經調整為pH 4.5±0.1之該濾液；e)將來自步驟d)之該經調整為pH 4.5±0.1之該Zn螯合FF捕捉管柱之溶離液或該經調整為pH 4.5±0.1之濾液裝載於Fractogel EMD SE Hi-Cap陽離子交換管柱上，在使該GALNS酶保留在該管柱上之條件下洗該管柱，且自該管柱溶離該GALNS酶；f)調整步驟e)之該Fractogel EMD SE Hi-Cap陽離子交換管柱之溶離液的pH至pH 3.5±0.1以使病毒不活化；g)調整步驟f)之該pH 3.5±0.1病毒不活化之溶離液的pH至pH 5.0，再裝載該經調整為pH5.0之病毒不活化之溶離液於ToyoPearl丁基650M精製管柱上，在使該GALNS酶保留在該管柱上之條件下洗該管柱，且自該管柱溶離該GALNS酶；h)使步驟g)之該ToyoPearl丁基650M精製管柱之溶離液經緩衝液交換至包含20mM NaOAc/HOAc、50mM NaH₂PO₄、30mM精胺酸鹽酸鹽、2%(w/v)山梨糖醇及pH 5.4之調配物中，且調整該GALNS酶在該調配物中之濃度至3mg/mL；i)藉由DV20過濾器及Mustang Q過濾器過濾步驟h)中該經緩衝液交換之調配物來移除任何殘餘病毒及/或DNA；及j)添加聚山梨醇酯20(PS20)至步驟i)中之該調配物中達到0.01%(w/v)之最終濃度。
一種調配物，其包含：(a)如請求項1之方法純化之重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)，該GALNS酶包含與SEQ ID NO：4之胺基酸27至522至少95%一致之胺基酸序列，其中該GALNS酶：(i)具有至少95%之純度，其係在非還原條件下進行SDS-PAGE時藉由庫馬斯藍染色所測定，(ii)具有位置53之半胱胺酸殘基轉化為C_α-甲醯甘胺酸(FGly)之至少50%轉化率，及(iii)每條單體蛋白質鏈具有0.5至0.8條雙磷酸化寡甘露糖鏈，且其中至少98%之該GALNS酶係呈前驅體形式，其係在還原條件下進行SDS-PAGE時藉由庫馬斯藍染色所測定，及(b)一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑，其實質上由以下所組成：(i)NaOAc/HOAc，其中該NaOAc/HOAc之濃度為20 +/- 10mM；(ii)NaH₂PO₄，其中該NaH₂PO₄之濃度為50 +/- 25mM；(iii)精胺酸鹽酸鹽、Tween-20及山梨糖醇作為穩定劑，其中該精胺酸鹽酸鹽之濃度為30 +/- 20mM，該Tween-20之濃度為0.01% +/- 0.005%(w/v)，及該山梨糖醇之濃度為2.0% +/- 1.0%(w/v)；及(iv)pH為5.4 +/- 0.4。。
一種調配物，其包含：(a)如請求項1之方法純化之重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)，該GALNS酶包含與SEQ ID NO：4之胺基酸27至522至少95%一致之胺基酸序列，且(i)具有至少95%之純度，其係在非還原條件下進行SDS-PAGE時藉由庫馬斯藍染色所測定，(ii)具有位置53之半胱胺酸殘基轉化為C_α-甲醯甘胺酸(FGly)之至少50%轉化率，及(iii)每條單體蛋白質鏈具有0.5至0.8條雙磷酸化寡甘露糖鏈，其中至少98%之該GALNS酶係呈前驅體形式，其係藉由SDS-CGE所測定，及(b)一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑，其包含：(i)可有效減少該GALNS酶去磷酸化之量之磷酸鹽緩衝劑，其中該磷酸鹽緩衝劑係濃度為25mM至75mM之NaH₂PO₄；及(ii)如下之穩定量的穩定劑：精胺酸鹽或緩衝劑，其中該精胺酸鹽或緩衝劑之濃度為10mM至50mM；聚山梨醇酯及三元或三元以上糖醇；其中該調配物之pH為5.0-5.8。
如請求項3之調配物，其中該調配物進一步包含乙酸鹽緩衝劑，其中該乙酸鹽緩衝劑係濃度為10mM至30mM之NaOAc/HOAc。
如請求項3之調配物，其中該精胺酸鹽或緩衝劑係精胺酸鹽酸鹽，該聚山梨醇酯係聚山梨醇酯20(Tween-20)，及該三元或三元以上糖醇係山梨糖醇。
如請求項3之調配物，其中該GALNS酶之純度為至少95%，其係藉由RP-HPLC所測定。
如請求項3之調配物，其中50%至80%的該GALNS酶結合至甘露糖-6-磷酸酯受體管柱。
如請求項3之調配物，其中該GALNS酶展現於纖維母細胞中之比攝取量(specific uptake)(Kuptake)為1至5nM。
如請求項3之調配物，其中該GALNS酶展現於纖維母細胞中之比攝取量(Kuptake)為1至3.5nM。
如請求項3之調配物，其中GALNS酶之濃度為0.5至1.5mg/mL。
如請求項5之調配物，其中該Tween-20之濃度為0.005%至0.015%(w/v)，及該山梨糖醇之濃度為1.0%至3.0%(w/v)。
一種調配物，其包含：(a)如請求項1之方法純化之重組人類N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)，該GALNS酶包含與SEQ ID NO：4之胺基酸27至522至少95%一致之胺基酸序列，且(i)具有至少95%之純度，其係在非還原條件下進行SDS-PAGE時藉由庫馬斯藍染色所測定， (ii)具有位置53之半胱胺酸殘基轉化為C_α-甲醯甘胺酸(FGly)之至少50%轉化率，及(iii)每條單體蛋白質鏈具有0.5至0.8條雙磷酸化寡甘露糖鏈，其中至少98%之該GALNS酶係呈前驅體形式，其係在還原條件下進行SDS-PAGE時藉由庫馬斯藍染色所測定，及(b)一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑，其包含：(i)NaOAc/HOAc及NaH₂PO₄作為緩衝劑，其中該NaOAc/HOAc之濃度為20 +/- 10mM，及該NaH₂PO₄之濃度為50 +/- 25mM；(ii)精胺酸鹽酸鹽、Tween-20及山梨糖醇作為穩定劑，其中該精胺酸鹽酸鹽之濃度為30 +/- 20mM，該Tween-20之濃度為0.01% +/- 0.005%(w/v)，及該山梨糖醇之濃度為2.0% +/- 1.0%(w/v)；及(iii)pH為5.4 +/- 0.4。
一種如請求項3之調配物之用途，其係用於製備供治療罹患黏多醣病Iva(MPS Iva)或莫奎歐A症候群之個體之藥物。