TWI497076B

TWI497076B - 適合體及ｃ－反應蛋白檢測方法

Info

Publication number: TWI497076B
Application number: TW099120849A
Authority: TW
Inventors: Gwo Bin Lee; Shu Chu Shiesh; Chao June Huang; Hsin I Lin
Original assignee: Univ Nat Cheng Kung
Priority date: 2010-06-25
Filing date: 2010-06-25
Publication date: 2015-08-21
Also published as: TW201200874A; US8624008B2; US20110318846A1

Description

適合體及C-反應蛋白檢測方法

本發明是有關於一種適合體與檢測方法，且特別是有關於一種與C-反應蛋白相關的適合體與檢測方法。

C-反應蛋白(C-Reactive Protein,CRP)是一種由肝臟生成而存在於血漿中的蛋白質，其屬五聚環蛋白家族(pentraxin family)的一員，由5個相同的次單位(subunit)以非共價連結成五元體環形結構，其中各個次單位包含有224個胺基酸以及具有約為25kDa的分子量。C-反應蛋白主要是由對細胞激素具有反應的肝細胞所合成，其在血漿中的半衰期約為18~20小時。

在臨床上，C-反應蛋白被視為是人體發炎反應的指標，其臨床價值在於組織損傷之篩檢(Screening)與監測(Monitoring)。一般來說，正常人體內的C-反應蛋白濃度非常低，約小於10mg/L，且在新的刺激出現前，其濃度保持長期穩定。然而，當發生外傷、病毒感染、心肌梗塞等急性發炎反應時，C-反應蛋白的合成會在4~6小時內迅速增加，且在36~50小時達到高峰，使得體內的C-反應蛋白濃度會增加到正常值的100~1000倍以上的程度。一般來說，C-反應蛋白濃度的升高幅度通常與感染的程度呈正相關，因此在適當治癒後，C-反應蛋白濃度便會迅速地回到正常濃度。

由於C-反應蛋白濃度在發炎時會有激增現象，因此臨床上通常是以散射比濁法(Nephelometry)等靈敏度較低的方法來判斷與C-反應蛋白濃度相關的發炎病徵，其偵測極限約為5mg/L。然而，近來有越來越多的研究顯示，人體血漿內的C-反應蛋白濃度可能與心血管疾病的發生率呈正比關係。美國心臟協會(American Heart Association,AHA)和美國疾病管制中心(Center for Disease Control and Prevention,CDC)亦定義出C-反應蛋白濃度與罹患心血管疾病的關係，其中C-反應蛋白濃度小於1.0mg/L為低危險群，C-反應蛋白濃度介於1.0~3.0mg/L具有中等程度的危險，C-反應蛋白濃度超過3.0mg/L則為高危險群，其中高危險群罹患心血管疾病的風險將是低危險族群的兩倍。另一方面，由於在動脈硬化過程中會產生輕微的發炎反應，因此亦有研究顯示可以C-反應蛋白濃度作為動脈硬化的預測指標。因此，目前已在臨床上使用靈敏度較高的高敏感C-反應蛋白檢測法(High-sensitivity CRP,Hs-CRP)以及酵素連結免疫法等方式來檢測低濃度的C-反應蛋白，以應用於心血管疾病的風險評估與預測中。

也就是說，在疾病的診斷與預防上，C-反應蛋白的定性分析及定量分析已扮演了重要的角色。然而，以靈敏度較高的酵素連結免疫法來說，其高靈敏度來自於抗原與抗體之間的專一性鍵結，但檢測方法中所使用的抗體卻有變異性大、易受環境影響、不易保存以及潛在生物污染等缺點。如此一來，導致C-反應蛋白的偵測在臨床應用上受限，而無法廣泛地用來對疾病進行風險評估及預防。

本發明提供一種適合體，其特異性結合C-反應蛋白。

本發明另提供一種C-反應蛋白檢測方法，其具有高靈敏度。

本發明提出一種適合體，其特異性結合C-反應蛋白，且包括以下核苷酸序列：5’-angngggngnntgnnt-3’(SEQ ID NO：1)，其中n為選自於a、t、c、g中任一者的核苷酸。

在本發明之一實施例中，上述之適合體包括以下核苷酸序列：5’-atgggggggtatgatt-3’(SEQ ID NO：2)。

在本發明之一實施例中，上述之適合體包括以下核苷酸序列：5’-aagcgggtgggtgtgt-3’(SEQ ID NO：3)。

在本發明之一實施例中，上述之適合體與C-反應蛋白之間的結合親合力(Kd)介於0.3nM~30nM。

在本發明之一實施例中，上述之適合體的5’端經硫基、生物素、螢光以及酵素中任一者修飾。

在本發明之一實施例中，上述之適合體包括10~80個核苷酸。

本發明另提出一種C-反應蛋白檢測方法，適於檢測一檢體中的C-反應蛋白，所述檢測方法包括以下步驟。首先，提供前文所述之適合體。接著，混合檢體與適合體，使檢體中的C-反應蛋白與適合體結合成C-反應蛋白-適合體。然後，偵測C-反應蛋白-適合體中的C-反應蛋白或適合體。

在本發明之一實施例中，上述之適合體標記有一螢光或一冷光。

本發明提出另一種C-反應蛋白檢測方法，適於檢測一檢體中的C-反應蛋白，所述檢測方法包括以下步驟。首先，提供多個磁珠，磁珠已與前文所述之適合體進行非共價性鍵結。接著，混合磁珠與檢體，使磁珠上的適合體與檢體中的C-反應蛋白結合。然後，加入C-反應蛋白抗體，使C-反應蛋白抗體與接合於磁珠上的C-反應蛋白結合。而後，移除未與C-反應蛋白結合的C-反應蛋白抗體，並偵測藉由C-反應蛋白接合至磁珠上的C-反應蛋白抗體。

在本發明之一實施例中，上述之適合體與磁珠藉由生物素(biotin)-鏈親合素(strepavidin)進行非共價性鍵結。

基於上述，本發明之適合體能特異性結合C-反應蛋白，因此使用適合體的C-反應蛋白檢測方法對C-反應蛋白具有高靈敏度。

為讓本發明之上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明如下。

本發明提出一種適合體，其特異性結合C-反應蛋白，且包括以下核苷酸序列：5’-angngggngnntgnnt-3’(SEQ ID NO：1)，其中n為選自於腺嘌呤(adenine,a)、胸腺嘧啶(thymine,t)、胞嘧啶(cytosine,c)、鳥嘌呤(guanine,g)中任一者的核苷酸。換言之，此適合體為單股的去氧核糖核酸片段，其至少包括用以與C-反應蛋白特異性結合的序列5’-angngggngnntgnnt-3’(SEQ ID NO：1)。在一實施例中，適合體的總長可以包括10~80個核苷酸。在一實施例中，適合體包括5’-atgggggggtatgatt-3’(SEQ ID NO：2)之序列，且適合體的整體序列為5’-ggcaggaagacaaacacgatgggggggtatgatttgatgtggttgttgcatgatcgtggtctgtggtgctgt-3’(SEQ ID NO：4)，共包括72個核苷酸。在另一實施例中，適合體包括5’-aagcgggtgggtgtgt-3’(SEQ ID NO：3)之序列，且適合體的整體序列為5’-ggcaggaagacaaacacacaagcgggtgggtgtgtactattgcagtatctattctgt ggtctgtggtgctgt-3’(SEQ ID NO：5)，共包括72個核苷酸。

本發明之適合體能特異性結合C-反應蛋白，且適合體與C-反應蛋白之間的結合親合力(Kd)例如是介於0.3nM~30nM。在一實施例中，適合體與C-反應蛋白之間的結合親合力(Kd)例如是3.51nM。換言之，適合體與C-反應蛋白之間具有高親合力與高特異性。因此，本發明之適合體適於用以偵測C-反應蛋白。特別是，由於本發明之適合體例如是以化學合成的方式來製備，因此本發明之適合體相較於生物抗體而言具有以下優點：無須依賴在細胞或動物體內製造，因此其製備方式簡單、便宜且幾乎沒有批次的差異；標的物可以是毒素或沒有免疫源性的分子，不受生物體本身對於毒性耐受度以及免疫能力的影響；以及不易受外界溫度、濕度等環境因素影響，因此方便長期保存。此外，在一實施例中，本發明之適合體的5’端可以經硫基、生物素、螢光、冷光、酵素或其他物質修飾，使其易於與特定基質結合或具有發光等標記特性。其中，螢光包括異硫氰酸螢光素(FITC)、Cy3、Cy5等化學物質，冷光包括吖啶酯(acridinium esters)類化合物，以及酵素包括鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)等酵素。

特別一提的是，除了將本發明之適合體應用於偵測C-反應蛋白的用途以外，本發明之適合體與C-反應蛋白之間的高親合力與高特異性也可以應用於其他生物技術中，舉例來說，適合體可作為標靶藥物，用以攜帶藥物或直接至大量表現C-反應蛋白處且與C-反應蛋白結合，以在該處釋放藥物或者是直接抑制C-反應蛋白的表現，進而治療或預防與C-反應蛋白表現相關的疾病。當然，本發明之適合體除了應用於偵測或標靶藥物等用途以外，所屬領域中具有通常知識者應理解本發明之適合體還適用於其他仰賴與C-反應蛋白之間的高親合力與高特異性的生物技術中，於此不一一詳述。

本發明另提出一種C-反應蛋白檢測方法，適於檢測一檢體中的C-反應蛋白，所述檢測方法包括以下步驟。首先，提供本發明之適合體。接著，混合檢體與適合體，使檢體中的C-反應蛋白與適合體結合成C-反應蛋白-適合體。然後，偵測C-反應蛋白-適合體中的C-反應蛋白或適合體。在一實施例中，C-反應蛋白檢測方法例如是酵素連結免疫法(包括三明治酵素連結免疫分析法)、表面電漿共振生物感測法等偵測方法，且C-反應蛋白檢測方法能達到遠高於現有之檢驗方法對於C-反應蛋白的靈敏度，並增加這些檢測方法的穩定度及方便性。換言之，在一實施例中，由於適合體可用以取代C-反應蛋白抗體，因此本發明之C-反應蛋白檢測方法可以是使用C-反應蛋白抗體與抗原結合原理的任何偵測方法。

在一實施例中，C-反應蛋白檢測方法例如是酵素連結免疫法，其例如是包括以下步驟。首先，將本發明之適合體固著(coating)於塑膠孔盤上，並洗去多餘的適合體。在此步驟中，固著適合體的方法例如是修飾鏈親合素或是硫氫基(Sulfhydryl group)。接著，加入待測檢體，若檢體中含有C-反應蛋白，則檢體中的C-反應蛋白會與塑膠孔盤上的適合體接合。然後，洗去多餘的待測檢體，並加入帶有酵素之抗體，其中帶有酵素之抗體能與C-反應蛋白鍵結。而後，洗去多餘未鍵結之帶有酵素之抗體，並加入酵素受質使酵素呈色。然後，以儀器測定塑膠盤中的吸光值，進而評估有色終產物的含量即可測量待測檢體中的C-反應蛋白含量。在本實施例中，由於適合體與C-反應蛋白之間具有高親合力與高特異性，因此適合體能將檢體中的C-反應蛋白固定於孔盤上，以利於進行後續偵測C-反應蛋白的步驟。特別是，由於適合體的本質為去氧核糖核酸片段，因此其不易受外界溫度、濕度等環境因素影響，故本實施例之C-反應蛋白檢測方法具有高靈敏度、高穩定性以及高準確性。

在一實施例中，C-反應蛋白檢測方法例如是三明治酵素連結免疫分析法，其例如是包括以下步驟。請參照圖1，首先，例如是先以生物素(Biotin)102修飾適合體100的5’端。接著，使適合體100與表面修飾有鏈親合素(Streptavidin)112的磁珠110進行非共價性鍵結，使適合體100接在磁珠110上。在此步驟中，由於生物素102與鏈親合素112之間具有相當高的親合力，因此適合體100與磁珠110之間能迅速地鍵結成適合體-磁珠複合物，且兩者之間非共價性鍵結不易受到pH、溫度、有機溶劑或變性劑的影響，當然，在其他實施例中，也有可能藉由生物素與鏈親合素以外的鍵結方式來結合適合體100與磁珠110，本發明未加以限制。然後，將接有適合體100的磁珠110和一系列稀釋之C-反應蛋白標準液或檢體置於離心管(eppendrof)140內混合以進行結合反應。在此步驟中，由於適合體100對C-反應蛋白130具有高親合力與專一性，因此磁珠110上的適合體100便會與C-反應蛋白標準液或檢體中的C-反應蛋白130結合，以形成C-反應蛋白-適合體-磁珠複合物。而後，利用外加的磁場150將磁珠110固定於離心管140的側壁上，並以沖洗液去除未與磁珠110接合的雜質。然後，加入標記有諸如冷光或螢光等標記物質的C-反應蛋白抗體160，並以沖洗液去除未與磁珠110接合的C-反應蛋白抗體160，其中冷光可以是吖啶酯。在此步驟中，C-反應蛋白抗體160會與接合於磁珠110上的 C-反應蛋白130結合。接著，藉由光學系統偵測C-反應蛋白抗體160的冷光強度170，以建立C-反應蛋白標準液的標準曲線，進而計算出檢體中的C-反應蛋白濃度。在本實施例中，由於適合體100與C-反應蛋白130之間具有高親合力與高特異性，因此適合體100能將檢體中的C-反應蛋白130固定於磁珠110上，以利於進行後續偵測C-反應蛋白的步驟。特別是，由於適合體的本質為去氧核糖核酸片段，因此其不易受外界溫度、濕度等環境因素影響，故本實施例之C-反應蛋白檢測方法具有高靈敏度、高穩定性以及高準確性。

在一實施例中，C-反應蛋白檢測方法例如是表面電漿共振生物感測法，其包括以下步驟。首先，將本發明之適合體固定於金屬薄膜表面。接著，使檢體中的C-反應蛋白與適合體進行結合反應。在此步驟中，C-反應蛋白與適合體的結合會產生共振角之改變，因此可藉由偵測此共振角之改變而獲得適合體與檢體中的C-反應蛋白之間的結合與解離等親合性反應之完整過程。在本實施例中，由於適合體與C-反應蛋白之間具有高親合力與高特異性，因此適合體能捕捉檢體中的C-反應蛋白以與其結合，以藉由共振角之改變來偵測C-反應蛋白的存在。特別是，由於適合體的本質為去氧核糖核酸片段，因此其不易受外界溫度、濕度等環境因素影響，故本實施例之C-反應蛋白檢測方法具有高靈敏度、高穩定性以及高準確性。

特別注意的是，雖然在上述的實施例中是以將本發明之C-反應蛋白應用於酵素連結免疫分析法與表面電漿共振生物感測法中為例，但本發明之C-反應蛋白檢測方法不限於此，換句話說，由於本發明之適合體對於C-反應蛋白具有高親合力與高特異性，因此本發明之適合體可應用於任何偵測C-反應蛋白的偵測方法中，特別是由於本發明之適合體能取代C-反應蛋白抗體，故可應用於使用C-反應蛋白抗體與抗原結合原理來偵測C-反應蛋白的任何偵測方法中，而這些方法為所屬領域中具有通常知識者所周知，故於此不詳述。

接下來將以實驗例來說明本發明之適合體的篩選方法並驗證本發明之適合體對C-反應蛋白具有高親合力與高特異性，以及說明本發明之C-反應蛋白檢測方法的實際應用。以下之說明是用來詳述本發明以使此熟習該項技術者能夠據以實施，但並非用以限定本發明之範圍。

實驗例1 對CRP具有親合性的適合體的初步篩選 1. 寡核苷酸存庫(oligonucleotide library)的建立：

寡核苷酸存庫包含有4⁴⁰種寡核苷酸，該等寡核苷酸是由美得科技有限公司(Medclub Scientific Co.Ltd.,Taiwan)所合成，並且各自具有一如下面SEQ ID NO：6所示的72-員核苷酸序列(72-mer nucleotide sequence)。所述72-員核苷酸序列包括由40個核苷酸(以n來表示)所構成的隨機序列(random sequence)、由16個核苷酸所構成的5’-引子區域(5’-primer region)以及由16個核苷酸所構成的3’- 引子區域(3’-primer region)：5’-ggcaggaagacaaaca-[n]₄₀-tggtctgtggtgctgt-3’(SEQ ID NO：6)，其中n表示任一個選自於腺嘌呤(adenine,a)、胸腺嘧啶(thymine,t)、胞嘧啶(cytosine,c)以及鳥嘌呤(guanine,g)的核苷酸，且5’引子區域以及3’引子區域分別被設計成具有可被Super-Therm Gold DNA聚合酶(Super-Therm Gold DNA polymerase)(Bertec Enterprise Co.Ltd.,Taiwan)辨識的核苷酸序列以供進行聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)。

將適量的寡核苷酸存庫溶於去離子水中，以得到濃度為10μM的寡核苷酸存庫原液(oligonucleotide library stock solution)備用。

2. CRP-綴合磁珠(CRP-conjugated beads)的製備：

以磷酸緩衝鹽液(phosphate buffered saline,PBS)將配於去離子水中的Dynabeads M-450 Epoxy(Cat.No.140.11,Invitrogen,USA，濃度為4×10⁸磁珠/mL)稀釋20倍。接著，以吸量管(pipette)將100μL經稀釋的Dynabeads M-450 Epoxy吸取至一離心管中並將此離心管置於一磁體(magnet,Dynal MPC^TM,Invitrogen,USA)中，使得Dynabeads M-450 Epoxy受到磁體吸引而往該磁體移動並貼附於該離心管的內壁面。然後，移除離心管中沒有被磁場吸引的殘餘物(residues)，繼而將100μL碳酸鹽緩衝液(carbonate buffer,pH=9.7)以及20μg的CRP(調配於Tris 緩衝液(Tris buffer)(含有10mM Tris、50mM NaCl以及2mM CaCl₂)中)加入至離心管中並予以混合均勻。之後，將離心管從磁體中移出並置於4℃下反應過夜，藉此使得CRP被綴合至Dynabeads M-450 Epoxy上以形成CRP-綴合磁珠(稱為磁珠A)。

之後，取出離心管並置於磁體中，使得磁珠A貼附於該離心管的內壁面，繼而移除離心管中沒有被磁場吸引的殘餘物並以PBS予以清洗3次。然後，將離心管從磁體中移出並於4℃下以1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)進行封阻處理(blocking)過夜，繼而以PBS予以清洗3次。最後，將200μL的Tris緩衝液加入至離心管中以充分懸浮磁珠A，藉此而得到具有一濃度為10⁷磁珠/mL的磁珠溶液A並儲存於4℃下備用。

3. 以整合型微流體晶片系統(integrated microfluidic chip system)篩選對CRP具有親合性的適合體：

提供整合型微流體晶片系統，整合型微流體晶片系統由一層玻璃板以及兩層聚二甲基矽氧烷基材所組成，其中聚二甲基矽氧烷基材的厚度小於聚二甲基矽氧烷基材的厚度。整合型微流體晶片系統包括反應槽、位在反應槽上方的混合/輸送單元、廢液槽、用以連接廢液槽以及反應槽的廢液流道、儲存洗滌緩衝液A(PBST，含有155mM NaCl以及0.2% Tween 20的0.01M磷酸鈉緩衝液(sodium phosphate buffer)，pH=7.4)的洗滌液儲存槽、用以連接反應槽以及洗滌液儲存槽的洗滌液流道、位在洗滌液儲存槽上方且用以將洗滌液輸出至洗滌液流道的洗滌液混合/輸送單元、聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)試劑(其內容物如下面表1所示)的試劑儲存槽、用以連接反應槽以及試劑儲存槽的試劑流道、位在試劑儲存槽上方且用於將試劑輸出至試劑流道的混合/輸送單元、位在反應槽下方且用於對反應槽進行加熱與溫度感測的溫度控制單元以及位在反應槽下方且用以產生磁場的磁場產生單元。

將以前述方法獲得的寡核苷酸存庫原液(3μL)、磁珠溶液A(17μL)以及1% BSA溶液(20μL)加入至整合型微流體晶片系統的反應槽中，繼而以混合/輸送單元予以混合歷時約5分鐘，使得對CRP具有親合性的寡核苷酸分別結合至磁珠A上的CRP而形成不同的寡核苷酸-CPR-磁珠複合物。接著，開啟磁場產生單元，寡核苷酸-CPR-磁珠複合物受到磁場作用而貼附於反應槽底部。之後，啟動洗滌液混合/輸送單元，使洗滌液儲存槽中的洗滌緩衝液A經由洗滌液流道被輸送至反應槽。接著，再次啟動洗滌液混合/輸送單元，使得對CRP不具有親合性的寡核苷酸以及反應槽中的殘餘溶液經由廢液流道流至廢液槽中。接著，關閉磁場產生單元並且啟動試劑混合/輸送單元，使30μL之具有下面表1所示的內容物的溶液、依前述體積所配製的PCR試劑以及12μL之礦物油流入反應槽內，繼而關閉試劑混合/輸送單元。

之後，啟動溫度控制單元，以對CRP具有親合性的寡核苷酸作為模版(template)，並且使用一組針對寡核苷酸的5’-引子區域以及3’-引子區域的核苷酸序列所設計之具有以下所示之核苷酸序列的前向引子F1(forward primer)以及反向引子R1(reverse primer)來進行使用下面表1中所示之反應條件的聚合酶鏈反應，以擴增出含有對CRP具有親合性的寡核苷酸的核苷酸序列的DNA片段。

前向引子F1

5’-ggcaggaagacaaaca-3’(SEQ ID NO：7)

反向引子R1

5’-acagcaccacagacca-3’(SEQ ID NO：8)

於PCR完成後，以吸量管吸取反應槽中針對各個對CRP具有親合性的寡核苷酸而擴增出的PCR產物。以75%乙醇清潔整合型微流體晶片系統之後，將所收取的PCR產物(3μL)、磁珠溶液A(17μL)以及1% BSA溶液(20μL)加入至反應槽中並重複上面的PCR步驟共計4次。最後，收取反應槽中的最終產物來進行下面的實驗。

實驗例2 對CRP具有親合性的適合體的選殖(cloning)

將實驗例1中的PCR產物(1μL)、pGEM^®-T Easy載體(1μL)、2X快速接合緩衝液(5μL)以及T4 DNA接合酶(1μL)混合均勻並以去離子水將體積補至10μL，繼而置於冰上過夜。接著，於上述溶液中加入50μL JM 109大腸桿菌勝任細胞並混合均勻，繼而置於冰上作用歷時20分鐘。之後，於42℃水浴中進行熱休克歷時45至50秒之後，予以快速地轉移至冰上並靜置歷時2分鐘。之後，加入950μL的SOC培養基，並於37℃下以150rpm進行震盪培養歷時1.5小時。接著，將所形成的培養物均勻地塗佈於含有1mg/mL胺芐青黴素(ampicillin)、0.5mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)以及 80μg/mL X-Gal的LB平盤(LB plates)上，繼而於37℃下培養過夜。之後，由LB平盤上挑出15個抗-胺芐青黴素菌落(ampicillin-resistant colonies)並予以分別接種至含有1mg/mL胺芐青黴素的LB肉湯培養基(LB broth)內，繼而於37℃下培養歷時16小時。之後，取15個培養物並且委託明欣生物科技有限公司(Mission Biotech,Taiwan)分別就對CRP具有親合性的寡核苷酸的核苷酸序列來進行定序。

實驗例3 對CRP具有高親合性的適合體的篩選

首先，將人類血清CRP與BSA以及分別溶於0.05M碳酸鹽緩衝液，以配製具有一濃度為50mg/L的CRP溶液以及具有一濃度為1%的BSA溶液。接著，將50μL之所得到的CRP溶液加入至0.2mL的PCR離心管中並置於4℃下進行包覆(coating)過夜。接著，取出內壁面被包覆有CRP的離心管並以0.01M磷酸緩衝鹽液予以清洗3次，繼而予以加入50μL之1% BSA溶液並於室溫下反應歷時1小時。之後，取出離心管並以0.01M磷酸緩衝鹽液予以清洗內壁面3次，即可得到內壁面被包覆有CRP的離心管A備用。

另外，將50μL之所得到的BSA溶液加入至0.2mL的PCR離心管中並置於4℃下進行包覆過夜。之後，取出內壁面被包覆有BSA的離心管並以0.01M磷酸緩衝鹽液(phosphate buffer)予以清洗3次，即可得到內壁面被包覆有BSA的離心管B備用。

將實施例2中所得到的15個PCR產物隨機分為5組，以形成5組寡核苷酸混合物(寡核苷酸混合物1~5)，其中每組寡核苷酸混合物包括等體積混合均勻的3個PCR產物。各組的寡核苷酸混合物(寡核苷酸混合物1~5)被拿來進行下面的競爭型試驗(competitive test)。

將10μL之寡核苷酸混合物1~5分別與40μL之50mg/L的CRP溶液混合均勻，繼而於25℃下以200rpm進行培育歷時1小時。之後，將50μL之所形成的反應物加入至離心管A並於25℃下以200rpm進行培育歷時1小時，並將之使用作為實驗組。另外，將10μL寡核苷酸混合物1~5分別與40μL Tris緩衝液混合並予以分別加入至離心管A以及離心管B中，以供作為各組的正對照組(positive control)以及負對照組(negative control)。再者，以一個僅含有水的PCR離心管(其內壁面上未被包覆有任何物質)作為空白對照組(blank control)。所有的組別於25℃下以200rpm進行培育歷時1小時。之後，以含有0.5M NaCl以及1% Tween 20的0.01M磷酸鈉緩衝液(pH=7.4)予以洗滌3次，繼而使用實施例1中的引子對(包括前向引子F1與反向引子R1)並參照表1中所示之反應條件來進行聚合酶鏈反應。由此而得到的PCR產物是藉由在一個8%的瓊脂糖凝膠(agarose gel)上的電泳而被分離，並以溴化乙錠染色(ethidium bromide staining)於紫外光下來進行觀察。

結果：

圖2為寡核苷酸混合物1~5在經過競爭型試驗之後使用引子對來進行PCR所獲得之PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果，其中M表示DNA階梯標記(DNA ladder marker)、B表示空白組、P表示正對照組、C表示實驗組以及N表示負對照組。由圖2可知，在寡核苷酸混合物1中，負對照組、實驗組以及正對照組在50bp至100bp之間皆有出現亮帶(band)(大小約為72bp)，且實驗組的亮帶比正對照組的亮帶還要微弱，這顯示在進行預培育時，在寡核苷酸混合物1中所含有的3個PCR產物確實會與CRP溶液中的CRP結合而形成CRP-PCR產物複合物，因此當預培育所形成的CRP-PCR產物複合物被加入至離心管A時，已結合至PCR產物的CRP會與被包覆於離心管A之內壁面上的CRP發生競爭現象。此外，負對照組的亮帶可能是因為洗滌不完全，而造成寡核苷酸混合物1中的3個PCR產物與離心管A內的BSA產生非特異性結合所致。另外，在寡核苷酸混合物2~5的實驗結果中，由於正對照組並沒有產生亮帶或者是正對照組的亮帶比競爭型試驗的亮帶還要微弱，顯示這些寡核苷酸混合物2~5對CRP不具有特異性結合能力。換言之，實驗結果顯示寡核苷酸混合物1中含有對CRP具有較高結合親和性的適合體。

接著，將寡核苷酸混合物1中的3個PCR產物分別拿來進行競爭型試驗，以確認3個PCR產物中的哪一個或哪些個為對CRP具有較高結合親合性的適合體。圖3為寡核苷酸混合物1所含有的3個PCR產物在分別經過競爭型試驗之後使用引子對來進行PCR所獲得之PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果，其中M表示DNA階梯標記、B表示空白組、P表示正對照組、C表示實驗組以及N表示負對照組。由圖3可知，PCR產物1以及PCR產物3對CRP均具有較高的親和性，因此將PCR產物1以及PCR產物3分別稱為適合體A以及適合體B。適合體A以及適合體B是委託明欣科技有限公司來進行定序分析，而被證實分別具有一如下所示的核苷酸序列：

適合體A：

5’-ggcaggaagacaaacacgatgggggggtatgatttgatgtggttgttgcatgatcgtggtctgtggtgctgt-3’(SEQ ID NO：4)

適合體B：

5’-ggcaggaagacaaacacacaagcgggtgggtgtgtactattgcagtatctattctgtggtctgtggtgctgt-3’(SEQ ID NO：5)

藉由比對適合體A與適合體B的核苷酸序列，申請人推論出如下所示之16個核苷酸的中心序列(central sequence)對於適合體與CRP的結合親合性是重要的：5’-angngggngnntgnnt-3’(SEQ ID NO：1)，其中n表示一個選自於腺嘌呤(adenine,a)、胸腺嘧啶(thymine,t)、胞嘧啶(cytosine,c)以及鳥嘌呤(guanine,g)的核苷酸。

實驗例4 適合體對CRP的親合力的評估

在本實驗例中，對實驗例3中所篩選出的適合體A進行表面電漿共振分析(surface plasmon resonance assay,SPR assay)，以藉由表面電漿共振分析結果所得的CRP-適合體 A的解離常數(dissociation constant,K _D)來評估適合體A對CRP的親合力。特別是，本實驗例是以Biacore X系統來評估CRP-適合體A的解離常數，且若無特別的說明，下面的實驗操作步驟皆是在25℃以及20μL/min的流速下進行。

首先，適合體A是委託美得科技有限公司(Medclub Scientific Co.Ltd.,Taoyuan,Taiwan)來進行生物素化(biotinylation)，以獲得5’端經生物素化的適合體A。接著，將適合體A溶於去離子水中，以得到濃度為0.1μM的適合體溶液A。然後，將所得到的適合體溶液A置於94℃下進行加熱歷時1分鐘，之後，將適合體溶液A迅速地轉移至4℃下備用。另外，同時對實施例2中的反向引子R1進行相同的生物素化處理，並將適量的經生物素化的反向引子R1溶於去離子水中，以得到濃度為0.1μM的反向引子溶液。

接著，將經鏈親合素蛋白表面改質的SA感測晶片(streptavidin-surface modified SA sensor chip)置於Biacore X系統中，繼而將5X SSCT緩衝液(SSCT buffer)(含有750mM NaCl、75mM檸檬酸鈉(sodium citrate)以及0.05% Tween 20，pH=7.0)注入至Biacore X系統中並通過SA感測晶片的表面，以洗滌SA感測晶片。在SA感測晶片的表面電漿共振反應(surface plasmon resonance response)達到平衡之後，以一含有50mM NaOH以及1M NaCl的洗滌緩衝液B洗滌至SA感測晶片共計3次，每次歷時1分鐘，藉此而活化SA感測晶片。接著，以適量的5X SSCT緩衝液洗滌SA感測晶片直到表面電漿共振反應再次達到平衡。

然後，取90μL之被降溫至4℃的適合體溶液A，並將適合體溶液A注射通過SA感測晶片的表面，使得適合體溶液A中的適合體A被固著至SA感測晶片的表面。接著，將90μL的反向引子溶液注射通過SA感測晶片的表面以進行封阻作用(blocking)，繼而以5X SSCT緩衝液洗滌SA感測晶片的表面直到表面電漿共振反應達到平衡。

之後，進行5次如下所述的循環，其中每一個循環包括：(1)將90μL的試驗溶液注射通過SA感測晶片的表面；(2)以90μL洗滌緩衝液C(含有50mM NaCl以及2mM CaCl₂的10mM Tris緩衝液)洗滌SA感測晶片的表面；(3)紀錄SA感測晶片的表面電漿共振反應歷時5分鐘；以及(4)將90μL的100mM NaOH注射通經SA感測晶片的表面，使得SA感測晶片的表面被再生(regenerated)。5個循環中所使用的試驗溶液分別為CRP濃度為0、0.01、0.05、0.1以及0.5mg/L的洗滌緩衝液C。

Biacore X系統所測得的表面電漿共振反應是共振角度變化的函數(以相對單位(arbitrary units,a.u.)來表示)，將Biacore X系統所測得的表面電漿共振反應與其相對應時間作圖。另外，亦使用BIA評估程式(BIA evaluation program)(版本3.2，GE Healthcare)將Biacore X系統所測得的表面電漿共振反應代入一具有一為1：1的計量比 (stoichiometry)的朗謬爾結合模型(Langmuir binding model)，以計算出CRP-適合體A的締合速率常數(association rate constant)k _on(以M^-1s^-1來表示)以及解離速率常數(dissociation rate constant)k _off(以s^-1來表示)，而CRP-適合體A的解離常數(K _D)是經由k _off相對於k _on的比值而被決定。

結果：

圖4為在Biacore X系統中使用固著有適合體A的SA感測晶片所測得之不同CRP濃度下隨著時間所測得的表面電漿共振反應。由圖4可知，適合體A與CRP之間的結合程度會隨著CRP濃度的增加而增加，特別是在一為0.5mg/L的CRP濃度下，CRP與適合體A的結合作用會隨著時間的增加而更趨於明顯，表示適合體A對於CRP具有很強之結合能力。此外，進一步將所測得的表面電漿共振反應結果代入朗謬爾結合模型中而得知CRP-適合體A的解離常數(K _D)為3.51nM，顯示適合體A與CRP之間具有高親合力。

實驗例5 應用適合體A的C-反應蛋白檢測方法 1. 適合體A-綴合磁珠(aptamer-conjugated beads)的製備：

首先，以吸量管分別吸取500μL的E170鏈親合素-披覆磁珠(E170 Streptavidin-coated beads)至兩離心管中，並將離心管置於一磁體中，使得E170鏈親合素-披覆磁珠受到磁體吸引而往磁體移動並貼附於離心管的內壁面。移除離心管中沒有被磁場吸引的殘餘物，並以500μL之5x SSCT溶液(750mM NaCl,75mM Sodium Citrate,0.05% TWEEN 20,pH 7.0)沖洗離心管3次備用。

接著，將5μL之加溫後冷卻的經生物素化的適合體A(10μM)與495μL之5x SSCT溶液加入至該離心管中並予以混合均勻。之後，將該離心管從磁體中移出並置於室溫歷時1小時，藉此使得經生物素化的適合體A被綴合至E170鏈親合素-披覆磁珠上以形成適合體A-綴合磁珠(稱為磁珠B)。

之後，取出離心管並置於該磁體中，使得磁珠B貼附於該離心管的內壁面，繼而移除離心管中沒有被磁場吸引的殘餘物並以500μL之2x SSCT予以清洗3次。然後，將離心管從磁體中移出並於4℃下以1000μL Tris buffer(含1%牛血清白蛋白)進行封阻處理過夜。

2. 適合體A的免疫分析(immunoassay)：

將10μL之待測血清檢體(經成大醫院病理部測定之CRP濃度為1.41mg/L)以及190μL的磁珠B加入至一離心管中，繼而在室溫下以平板式震盪器(1,200rpm)進行混合歷時120分鐘，藉此使得具有經生物素化的適合體A的磁珠B與血清檢體中的CRP結合。接著，將離心管置於磁體中以使得磁珠B貼附於離心管的內壁面，繼而以洗滌緩衝液D(含有0.5M NaCl以及0.1% Tween 20的0.01M磷酸鈉緩衝液(sodium phosphate buffer)，pH=7.4)予以清洗共計3次。

之後，於離心管中加入標示有吖啶C2NHS酯(acridinium C2NHS ester)的抗-CRP抗體(200μL)並在室溫下以平板式震盪器(1,200rpm)進行混合歷時60分鐘。接著，將離心管置於磁體中以使得磁珠貼附於離心管的內壁面，繼而以洗滌緩衝液D予以清洗共計3次。然後，加入200μL之硝酸(含有0.6% H₂O₂)並混合均勻，繼而加入100μL之0.75N氫氧化鈉(含有1.5%的Triton X-100)。而後，以AutoLumat LB 953光度計來進行相對螢光單位(RLU)的測定。重複進行前述實驗3次。

另一方面，測量具有已知濃度(0.0125、0.0625、0.125、0.625、2.5以及10mg/L)的CRP標準溶液的相對螢光單位(RLU)，並以CRP標準溶液之濃度的Log值(Log mg/L)與相對應之相對螢光單位的Log值(Log RLU)作圖，以得到一標準曲線，並藉由該標準曲線以該待測血清檢體的相對螢光單位(RLU)換算出待測血清檢體的CRP濃度(mg/L)。

結果：

圖5為以具有已知濃度(0.0125、0.0625、0.125、0.625、2.5以及10mg/L)的CRP標準溶液的濃度的Log值相對於與其相應之相對螢光單位的Log值(Log RLU)作圖所獲得的標準曲線。根據該標準曲線可得到：CRP標準溶液的濃度的Log值相對於相對冷光單位(RLU)的Log值的線性關係是落在一從0.0125mg/L至10mg/L的範圍內(R²=0.9694)，且適合體A對於CRP濃度的偵測極限為 0.0125mg/L。

經由該標準曲線可推演出下列公式：Y=0.4484X+4.591，其中X為相對冷光單位(RLU)的Log值，Y為CRP濃度的Log值，將血清檢體所測得的螢光單位(RLU)帶入上述公式可得到血清檢體的CRP濃度的Log值。接著，將所得到的CRP濃度的Log值進行反運算(inverse operation)以得到血清檢體的CRP濃度，並將3次實驗所求得到的CRP濃度予以平均而得到血清檢體的平均CRP濃度為1.85mg/L，此數值與成大醫院病理部所測得者(1.41mg/L)相近。這個實驗結果顯示：使用適合體A的CRP檢測方法的偵測極限可達到0.0125mg/L且對CRP具有相當高的靈敏度，此外，使用適合體A的CRP檢測方法具有極佳的可靠度，故使用適合體的C-反應蛋白檢測方法確實適於對臨床血清檢體進行CRP的定性與定量分析。

綜上所述，本發明之適合體能特異性結合C-反應蛋白，且對C-反應蛋白具有高親合力，因此本發明之適合體能廣泛地應用於C-反應蛋白檢測方法、C-反應蛋白標靶藥物等生物技術中。特別是，由於本發明之適合體具有製備方式簡單、便宜、幾乎沒有批次差異以及儲存穩定等優點，因此使用適合體的C-反應蛋白檢測方法具有高靈敏度、高穩定性以及高準確性，能用於臨床檢驗與學術研究中，以對疾病進行風險評估及預防。

雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，故本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

100‧‧‧適合體

102‧‧‧生物素

110‧‧‧磁珠

112‧‧‧鏈親合素

130‧‧‧C-反應蛋白

140‧‧‧離心管

150‧‧‧磁場

160‧‧‧C-反應蛋白抗體

170‧‧‧冷光強度

圖1為本發明之一實施例的一種C-反應蛋白檢測方法的流程示意圖。

圖2為寡核苷酸混合物1~5在經過競爭型試驗之後使用引子對來進行PCR所獲得之PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果，其中M表示DNA階梯標記、B表示空白組、P表示正對照組、C表示實驗組以及N表示負對照組。

圖3為寡核苷酸混合物1所含有的3個PCR產物在分別經過競爭型試驗之後使用引子對來進行PCR所獲得之PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果，其中M表示DNA階梯標記、B表示空白組、P表示正對照組、C表示實驗組以及N表示負對照組。

圖4為在Biacore X系統中使用固著有適合體A的SA感測晶片所測得之不同CRP濃度下隨著時間所測得的表面電漿共振反應。

圖5為以具有已知濃度(0.0125、0.0625、0.125、0.625、2.5以及10mg/L)的CRP標準溶液的濃度的Log值相對於與其相應之相對螢光單位的Log值(Log RLU)作圖所獲得的標準曲線。

<110> National Cheng Kung University

<120> APTAMER AND DETECTION METHOD FOR C-REACTIVE PROTEIN

<160> 8

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特異性結合C-反應蛋白

<220>

<221> Misc_feature

<222> (2,4,8,10,11,14,15)

<223> n=a或g或c或t

<400> 1

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特異性結合C-反應蛋白

<400> 2

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特異性結合C-反應蛋白

<400> 3

<210> 4

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適合體A

<400> 4

<210> 5

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適合體B

<400> 5

<210> 6

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸存庫的寡核苷酸

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(16)

<223> 5'引子區域

<220>

<221> Misc_feature

<222> (17)..(56)

<223> n=a或g或c或t

<220>

<221> primer_bind

<222> (57)..(72)

<223> 3'引子區域

<400> 6

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 前向引子F1

<400> 7

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引子R1

<400> 8

100‧‧‧適合體

102‧‧‧生物素

110‧‧‧磁珠

112‧‧‧鏈親合素

130‧‧‧C-反應蛋白

140‧‧‧離心管

150‧‧‧磁場

160‧‧‧C-反應蛋白抗體

170‧‧‧冷光強度

Claims

一種適合體，其特異性結合C-反應蛋白，且包括以下核苷酸序列：5’-acacacaagcgggtgggtgtgtactattgcagtatctattctgtgg-3’。
如申請專利範圍第1項所述之適合體，其5’端經硫基、生物素、螢光以及酵素中任一者修飾。
如申請專利範圍第1項所述之適合體，其包括以下核苷酸序列：5’-ggcaggaagacaaacacacaagcgggtgggtgtgtactattgcagtatctattctgt ggtctgtggtgctgt-3’(SEQ ID NO：5)。
一種C-反應蛋白檢測方法，適於檢測一檢體中的C-反應蛋白，該檢測方法包括：提供如申請專利範圍第1項所述之適合體；混合該檢體與該適合體，使該檢體中的C-反應蛋白與該適合體結合成C-反應蛋白-適合體；以及偵測C-反應蛋白-適合體中的C-反應蛋白或該適合體。
如申請專利範圍第4項所述之C-反應蛋白檢測方法，其中該適合體標記有一螢光或一冷光。
一種C-反應蛋白檢測方法，適於檢測一檢體中的C-反應蛋白，該檢測方法包括：提供多個磁珠，該些磁珠已與如申請專利範圍第1項所述之適合體進行非共價性鍵結；混合該些磁珠與該檢體，使該些磁珠上的適合體與該檢體中的C-反應蛋白結合；加入C-反應蛋白抗體，使C-反應蛋白抗體與接合於該些磁珠上的C-反應蛋白結合；以及移除未與C-反應蛋白結合的C-反應蛋白抗體，並偵測藉由C-反應蛋白接合至該些磁珠上的C-反應蛋白抗體。
如申請專利範圍第6項所述之C-反應蛋白檢測方法，其中該適合體與該磁珠藉由生物素-鏈親合素進行非共價性鍵結。