TWI491616B

TWI491616B - 色素上皮衍生因子衍生之多胜肽於促進肌肉或肌腱再生或動脈血管生成之用途

Info

Publication number: TWI491616B
Application number: TW101128705A
Authority: TW
Inventors: Yeou Ping Tsao; Tsung Chuan Ho
Original assignee: Mackay Memorial Hospital
Priority date: 2012-08-09
Filing date: 2012-08-09
Publication date: 2015-07-11
Also published as: TW201406777A

Description

色素上皮衍生因子衍生之多胜肽於促進肌肉或肌腱再生或動脈血管生成之用途

本發明是關於組織損傷的治療，且特別是關於利用來自色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，簡稱PEDF)的合成胜肽來促進肌肉或肌腱組織再生或促進動脈血管生成，以治療組織損傷。

肌肉組織可分為骨骼肌、心肌或平滑肌。肌肉能夠修復其所受到的損傷。以骨骼肌為例，在受傷後，骨骼肌會藉由自發的過程來移除受損的肌纖維，並合成新的肌纖維。然而，在某些組織損傷的情形下，可能不會發生這種自發性的組織修復機制，或其修復程度不足以完全修復組織所受的損傷。舉例來說，某些病理因素或遺傳缺陷可能導致組織無法完全癒合；常見的病理因素如重傷、年邁、肌肉廢用(muscle disuse)、癌症與組織缺血(tissue ischemia)；上述遺傳缺陷如肌肉萎縮症(muscular dystrophy)。組織無法修復可能會導致肌肉質量(muscle mass)的永久損失、疾病進展與組織功能缺失。

肌腱是有韌性且成束狀的纖維性結締組織，通常用於將肌肉連接至骨骼。肌腱損傷通常會導致發炎以及肌腱退化或弱化，最終可能導致肌腱斷裂。肌腱修復是漫長且複雜的過程，通常要花上數個月甚至超過一年，在這段時間中，肌腱組織會由纖維狀慢慢變成疤狀。這種疤狀組織可能會使得肌腱的彈性與可動性降低，且使得再次受傷的可能性偏高。肌腱幹細胞(tendon-derived stem cell，簡稱TSC)與骨髓間葉幹細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell，簡稱BM-MSC)對於肌腱炎病變所提供的自體療癒效果有限。

缺血現象也是造成明顯組織損傷的常見原因。缺血現象引起的組織損傷會造成心肌梗塞、中風與其他疾病。細胞通常能夠修復因短暫缺血現象所造成的輕微損傷；然而長時間缺血通常會造成不可回復的細胞損傷，進而導致細胞死亡。在長時間缺血的情形下，就算之後重新建立血液循環，仍無法完全回復受損細胞的功能。此外，功能喪失通常會早於細胞死亡而發生。

到目前為止，仍未發展出能有效治療受損且失去功能的組織或協助此類組織再生的方法。因此，相關領域亟需提出一種促進組織再生的方法。具體來說，需提供能夠促進動脈血管生成的藥學組合物與方法，以便促進損傷組織區域附近或其中的血流量，進而使得組織功能回復到近乎正常的程度。

發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

本發明至少部分是基於發現PEDF衍生合成胜肽能夠促進一個體體內的肌肉再生、肌腱再生或動脈血管生成。因此，此處所述的PEDF衍生合成胜肽可作為治療組織損傷(特別是由缺血現象引發的組織損傷)的製劑或藥劑。

有鑑於上述，本發明的一態樣是關於一種用以促進一個體體內肌肉或肌腱再生的合成胜肽。

根據本說明書多個實施例，所述的合成胜肽長度為20-39個胺基酸殘基，且其序列至少80%與序列編號：1相同。此外，上述胺基酸序列包含至少20個連續胺基酸殘基，其序列至少90%與序列編號：1的胺基酸殘基11-30相同，而使得此合成胜肽可用於促進一個體體內肌肉或肌腱再生。

在可任選的實施例中，上述合成胜肽中有至少四個連續的胺基酸，其序列與序列編號：1的胺基酸殘基11-14相同。此種合成胜肽的非限制性例示包括胺基酸序列如序列編號：1(39-mer)、序列編號：2(34-mer)、序列編號：3(29-mer)、序列編號：5(24-mer)、序列編號：6(20-mer)、序列編號：8(MO 29-mer)與序列編號：9(MO 20-mer)所示者。根據本發明某些實施例，上述合成胜肽的胺基酸序列為序列編號：3(29-mer)、序列編號：5(24-mer)或序列編號：6(20-mer)任一者所示。

在本發明另一態樣中，提出一種用以促進一個體體內肌肉或肌腱再生的藥學組合物。所述的個體/患者可以是任何哺乳類動物，包括人類。

根據本發明一實施方式，上述藥學組合物包含任一根據本發明上述態樣/實施例的合成胜肽，且此合成胜肽的含量足以促進該個體體內的肌肉或肌腱再生。此藥學組合物亦包含可用以攜帶該合成胜肽的一藥學上可接受載體。

在本發明的可任選實施例中，上述藥學上可接受載體可為一高分子材料，譬如海藻酸鹽(alginate)、明膠(gelatin)、膠原蛋白(collagen)或聚乳酸/甘醇酸共聚物(poly(lactide-co-glycolide)，簡稱PLGA)。

根據本發明的可任選實施例，此藥學組合物中所述合成胜肽的含量為約1-100 μM；較佳為約10 μM。

在本發明的又另一個態樣中，提出了一種方法，其可用以促進個體體內於鄰近一損傷區域或該損傷區域中的肌肉或肌腱再生。所述的個體/患者可以是任何哺乳類動物，包括人類。

於一實施例中，上述方法包含對該個體體內的一治療區域投予一治療有效量的根據本發明上述態樣/實施例之合成胜肽，其中上述治療區域係鄰近該損傷區域，藉以促進該個體體內於鄰近該損傷區域或其中的肌肉或肌腱再生。

於可任選的實施例中，可將上述合成胜肽調製成根據本發明上述態樣/實施例所述的藥學組合物。在實際操作時，可透過肌肉內注射(intradermal injection)的方式來投予該組合物。

根據某些實施例，該個體可能因為肌肉損傷、肌肉廢用、肌肉萎縮症、肌萎縮性側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)、肌腱損傷、組織缺血、腦缺血(cerebral ischemia)、周邊動脈疾病(peripheral arterial diseases)或心肌梗塞等原因，而使損傷區域中的肌肉或肌腱受損。

此外，本發明於另一態樣中提出了一種用以促進一個體體內動脈血管生成的合成胜肽。

根據本說明書多個實施例，所述的合成胜肽長度為20-39個胺基酸殘基，且其序列至少80%與序列編號：1相同。此外，上述胺基酸序列包含至少20個連續胺基酸殘基，其序列至少90%與序列編號：1的胺基酸殘基11-30相同，而使得此合成胜肽可用於促進一個體體內動脈血管生成。

在本發明另一態樣中，提出一種用以促進一個體體內動脈血管生成的藥學組合物。所述的個體/患者可以是任何哺乳類動物，包括人類。

根據本發明一實施方式，上述藥學組合物包含任一根據本發明上述態樣/實施例的合成胜肽，且此合成胜肽的含量足以促進該個體體內的動脈血管生成。此藥學組合物亦包含可用以攜帶該合成胜肽的一藥學上可接受載體。

在本發明的又另一個態樣中，提出了一種方法，其可用以促進個體體內於鄰近一缺血區域或該缺血區域中的動脈血管生成。所述的個體/患者可以是任何哺乳類動物，包括人類。

於一實施例中，上述方法包含對該個體體內的一治療區域投予一治療有效量的根據本發明上述態樣/實施例之合成胜肽，其中上述治療區域係鄰近該缺血區域，藉以促進該個體體內於鄰近該缺血區域或其中的動脈血管生成。

根據某些實施例，該個體可能因為肌肉損傷、肌肉廢用、肌肉萎縮症、肌萎縮性側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)、肌腱損傷、組織缺血、腦缺血(cerebral ischemia)、周邊動脈疾病(peripheral arterial diseases)或心肌梗塞等原因，而使缺血區域中的血流受阻。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數界是約略的數值，已盡可能精確地呈現具體實施例的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。

在此處「胜肽」(peptide)一詞係指胺基酸殘基所組成的高分子。「合成胜肽」(synthetic peptide)一詞則代表此胜肽並未包含存在於自然界的完整蛋白質分子。此種胜肽之所以是「合成的」，表示其乃是由人類利用技術手段所得，譬如化學合成、重組遺傳技術或將整個抗原切段。於本說明書中，任何胺基酸殘基於一胜肽中的位置係由該胜肽的N端起算。

「幹細胞」(stem cell)一詞在此係指此細胞在某些條件下保有能夠增殖而不實質分化的能力，且亦能夠在某些條件下分化成更專一或分化程度較高的細胞。

在此處「增殖」的各種詞性(如proliferate或proliferation)係指族群中的細胞數目透過細胞分裂而增加之情形。

「肌肉細胞」(muscle cells)一詞在此係指任何對肌肉組織有貢獻的細胞，且包含肌母細胞(myoblasts)、衛星細胞(satellite cells)、肌小管細胞(myotubes)及肌原纖維組織(myofibril tissues)。「肌肉再生」(muscle regeneration)一詞在此是指由肌肉先驅細胞(muscle progenitor cells)形成新的肌纖維之任何過程。可透過多種指標來評估肌肉在損傷區域中或鄰近區域的再生情形，這些指標如在損傷區域中或附近的肌纖維數目、直徑(大小)、濕重和/或蛋白質含量等。此外，亦可透過損傷區域中或附近之肌肉細胞和/或衛星細胞的增殖活性，來觀察肌肉再生之情形。

在本說明書中，「肌腱」(tendon)一詞係指由平行排列且緊密相接的膠原蛋白纖維所形成的纖維狀組織，其可將肌肉連接至骨骼。肌腱損傷的復原過程非常緩慢的過程，且通常會形成疤痕，因而使得肌腱產生缺陷，而無法回復正常或原本的肌腱功能。在此處「肌腱再生」(tendon regeneration)一詞係指在肌腱復原的過程中，產生第一型膠原蛋白(type I ollagen)，且新形成的膠原蛋白纖維平行於張力方向，因而將復原過程中的疤痕形成降至最低。在損傷區域之中或附近呈有組織排列的膠原蛋白原纖維(fibrils)之數目，可用以評估肌腱再生之程度。此外，亦可透過損傷區域中或附近之肌腱幹細胞的增殖活性，來觀察肌腱再生之情形。

於本說明書中，「動脈血管生成」(arteriogenesis)一詞與「血管新生」(angiogenesis)並不相同。血管新生是指由既有血管分枝形成微血管的過程；這些新生成的微血管並沒有脈管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，簡稱vSMCs)，因此較為脆弱且容易破裂。此種微血管無法進行血管重塑(vasculature remodeling)過程，且因而不能對損傷區域或鄰近區域供應和/或回復適當的血流循環。與血管新生相較之下，動脈血管生成係指由既有動脈管路的內皮細胞與平滑肌細胞增殖，而在原地補充與擴展動脈或側枝動脈(collateral arteries)。這些新形成的動脈或側枝動脈可發展成動脈(或側枝動脈)網路，而能夠形成天然的繞道已供應足夠的血液至受損或缺血組織或發炎部位。

「缺血」(ischemia)一詞係指在任何組織和/或器官中，因為缺乏氧氣供應和/或因為代謝物不正常累積，而導致的狀況。此種情形通常是由於不正常的灌流(perfusion)，而使得氧氣供需不平衡所引起。已知有多種情況可能會引發上述不正常的灌流，如動脈粥狀硬化(atherosclerosis)、血管狹窄(restenotic lesions)、貧血(anemia)、中風(stroke)或動脈阻塞(clogged arteries)等，這些情況會導致組織(如，肌肉心臟或腦部)的氧氣量不足。然而，缺血狀況不限於上述器官或組織，而可能發生在任何器官/組織。

「促進」及其各種時態(如promote或promoting)在此係指一種正面的改變；特別是指在統計上具有顯著意義的正面改變。在一實施例中，正面的改變係指相較於一參考標準，增加了至少10%。

此處針對合成胜肽序列所述的「胺基酸序列相似度百分比」(Percent% amino acid sequence identity)係指該候選合成胜肽之胺基酸殘基與一參考多胜肽之胺基酸殘基完全相同的百分比。於進行上述比對時，可將該候選合成胜肽與該參考多胜肽並排，並於必要時引入間隙，以使二序列形成最高的序列相似度，且在計算相似度時，並未將保守性置換之胺基酸殘基納入考量。相關領域已有多種方法可供進行上述並排，譬如可公開取得的軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)等。本發明所屬技術領域中具有通常知識者在進行並排時，可選擇適當的參數與計算方式，以得到最佳的排列方式。在本說明書中，二胺基酸序列間的序列比較是採用美國國家生物科技資訊中心(Nation Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI)所提供的蛋白質-蛋白質BLAST分析軟體Blastp來進行。一候選胺基酸序列A相較於一參考胺基酸序列B的胺基酸序列相似度(在本說明書中亦稱之為序列A與序列B具有特定百分比(%)的胺基酸序列相似度)的計算方式如下：其中X是利用Blastp軟體對序列A、B進行排列後所得到的相同胺基酸殘基數目(identical matches)，而Y是A、B二序列中較短者的胺基酸殘基總數。

在此處「藥學上可接受載體」(pharmaceutically acceptable carrier)係指一種藥學上可接受的材料、組合物或媒劑(vehicle)，諸如液體或固體填充物(liquid or solid filler)、稀釋劑(diluent)、賦型劑(excipient)、溶劑(solvent)或包覆材料(encapsulating material)，其可用以攜帶或運送標的成分由身體的一器官或部分到達身體的另一器官或部份。「可接受」的載體係指其可含組合物中的其他成分相容。載體可為固態、半固態、液態、乳霜或膠囊等形式。

於本說明書中，「治療」一詞的各種詞性與時態(如treat、treating或treatment)係指預防性(如，預防用藥)、療癒性或緩和性的處置。「治療」一詞可用以指稱將此處提出的組合物投予或施用於一個體，此個體可能有一醫療疾患、症狀、疾病或與疾患相關的異常或易於罹患一疾患，以期能部分地或完全地緩和、改善、減輕一特定異常和/或病症的一或多種症狀或特徵，或延緩其發生、阻礙其進展、減輕其嚴重性和/或減低發生率。亦可對並未表出現疾病、異常和/或病症之徵兆的個體和/或呈現早期徵兆的個體進行治療，以期降低發展出與該疾病、異常和/或病症相關之病理變化的風險。在本說明書中，當一或更多種症狀或臨床指標減少時，通常認為該治療是「有效」的。或者是，有效的治療意味著一疾病的進展減少或暫停。亦即，「治療」不僅包含改善症狀或降低疾病指標，還涵蓋了使得原本在不進行治療的情形下，極有可能發生的疾病進展或症狀惡化等情形停止或減緩。有益的或的臨床結果包括，但不限於：一或多種症狀的緩解、疾病程度的縮減、疾病狀態的穩定(如，並未惡化)、疾病進程的延遲或延緩、疾病狀態的部分或完全改善或緩和，以上所述包含可偵測或不可偵測的症狀、程度、狀態或進程。

在此處，「有效量」一詞係指一成分的用量足以招致所欲的反應或效果。「治療有效量」一詞則是指藥學組合物中的治療藥劑之含量足以產生上文定義的所欲「有效治療」。具體的治療有效量取決於多種因素，諸如欲治療的特定狀況、個體的生理條件(如，個體體重、年齡或性別)、接受治療的哺乳動物或動物的類型、治療持續時間、目前療法(如果有的話)的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。治療有效量亦指於此用量下，該化合物或組合物的毒性或負面效果不及於其所帶來的正面療效。

「患者」或「個體」等詞在此係指可接受本發明之合成胜肽、藥學組合物和/或方法來進行治療的哺乳類動物(包括人類)。除非另有指明，「個體」一般包含雄性與雌性。

色素上皮衍生因子(Pigment epithelium-derived factor，簡稱PEDF)是一種多功能的分泌性蛋白質，其具有抗血管新生(anti-angiogenic)、抗腫瘤生成(anti-tumorigenic)與神經滋養(neurotrophic)等功能。人類PEDF蛋白質(序列編號：14)是一種大小約50 kDa 的分泌性蛋白質，具有418個胺基酸。已知PEDF的34-mer片段(相當於PEDF之第44-77號殘基)與44-mer片段(相當於PEDF之第78-121號殘基)分別具有抗血管新生與神經滋養性質。

本說明書至少部分是基於發現來自PEDF的合成胜肽能夠促進一個體體內的肌肉或肌腱再生與動脈血管生成。特別是，本發明率先發現局部施用此PEDF衍生合成胜肽與受損或缺血的肌肉或肌腱組織的復原以及在缺血區域中或附近的動脈(或側枝動脈)生成之間的關聯。本發明的另一創新特徵在於此處所提出的合成胜肽最長只有39個胺基酸殘基，比起先前技術所述的全長PEDF短了許多；因此，本發明克服了傳統蛋白質在臨床使用上經常面臨的困境，諸如製造成本高昂、生體可用率(bioavailability)低落與藥物動力學(pharmacokinetics)表現不佳等。因此，這些合成胜肽可用以治療肌肉或肌腱損傷以及缺血的組織或器官。

因此，本發明的一態樣是關於用以促進一個體體內肌肉或肌腱再生的合成胜肽。本發明的另一態樣則是關於用以促進一個體體內動脈血管生成的合成胜肽。下文敘述了適用於上述兩種態樣或其中之一的實施例。

根據本說明書多個實施例，此合成胜肽有20-39個胺基酸殘基，且其胺基酸序列與序列編號：1(LSVATALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT)有至少80%的胺基酸序列相似度。舉例來說，此合成胜肽與序列編號：1的胺基酸序列相似度可為約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。另外，此合成胜肽包含至少20個連續的胺基酸殘基，其與序列編號：1第11-30個殘基有至少90%的胺基酸序列相似度。具體來說，這20個連續胺基酸殘基與序列編號：1第11-30個殘基的胺基酸序列相似度可為約90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。

在本發明一實施例中，所述的合成胜肽有39個胺基酸殘基，其序列即如序列編號：1所示。在下文實驗例中，亦將此合成胜肽稱為39-mer。此種39-mer胜肽是來自人類PEDF的已知44-mer片段(PEDF第78-121號殘基)的一種較短的變形。

本案發明人先前所做的實驗(如，審查中的美國專利申請號13/428996，在此將該先申請案的內容一併納入為本說明書的一部分)與本說明書所提供的實驗例顯示還有其他數種來自此39-mer的短PEDF合成胜肽能夠有效促進一個體體內的肌肉或肌腱再生和/或動脈血管生成。

舉例來說，由下文與先申請案的實驗例可知，如序列編號：2(ALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT)所示的34-mer合成胜肽能夠有效促進個體體內的肌肉或肌腱再生和/或動脈血管生成。34-mer合成胜肽相當於人類PEDF的第88-121號胺基酸殘基；根據上文所述的胺基酸序列相似度的計算方法，此34-mer與39-mer的胺基酸序列相似度為100%，且34-mer的第6-25號胺基酸殘基與39-mer的第11-30號胺基酸殘基的胺基酸序列相似度也是100%。

此外，下文多個實驗例證明如序列編號：3(SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT)所示的29-mer合成胜肽能夠有效促進個體體內的肌肉或肌腱再生，還能促進動脈血管生成。此29-mer合成胜肽相當於人類PEDF的第93-121號胺基酸殘基；其與39-mer的胺基酸序列相似度為100%，且29-mer的第1-20號胺基酸殘基與39-mer的第11-30號胺基酸殘基的胺基酸序列相似度亦為100%。

某些實驗例證實，一24-mer合成胜肽亦可有效促進個體體內的肌肉或肌腱再生以及動脈血管生成；此24-mer的序列如序列編號：5(SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSP)所示，且相當於人類PEDF第93-116號胺基酸殘基。此外，24-mer序列與39-mer的第11-30號胺基酸殘基完全相同(胺基酸序列相似度：100%)且其相較於39-mer的胺基酸序列相似度同樣也是100%。

某些實驗例證實，如序列編號：6(SLGAEQRTESIIHRALYYDL)所示的20-mer亦可有效促進個體體內的肌肉或肌腱再生以及動脈血管生成。此20-mer的序列相當於人類PEDF第93-112號胺基酸殘基，其與39-mer的第11-30號胺基酸殘基完全相同(胺基酸序列相似度：100%)且其相較於39-mer的胺基酸序列相似度同樣也是100%。

本案與先申請案所揭載的實驗例亦顯示，另外有兩種衍生自小鼠PEDF的短、合成胜肽同樣也能夠有效地促進個體體內的肌肉或肌腱再生和/或動脈血管生成。第一種衍生自小鼠的合成胜肽在本說明書中稱為Mo 29-mer，其序列如序列編號：8(SLGAEHRTESVIHRALYYDLITNPDIHST)所示，此序列與39-mer的胺基酸序列相似度為83%，且其前20個胺基酸殘基與39-mer第11-30個殘基的胺基酸序列相似度為90%。另一種衍生自小鼠PEDF的合成胜肽稱為Mo 20-mer，其序列如序列編號：9(SLGAEHRTESVIHRALYYDL)所示。Mo 20-mer與39-mer或39-mer的第11-30號胺基酸殘基的胺基酸序列相似度皆為90%。

在可任選的實施例中，上述合成胜肽中有至少四個連續的胺基酸，其序列與序列編號：1的胺基酸殘基11-14相同。本案發明人所進行的實驗結果顯示，序列編號：1所示序列的第11-14號胺基酸殘基(即，SLGA)對於維持短PEDF合成胜肽之生理功能扮演的重要的角色。舉例來說，下文提出的多個實驗例顯示，不具有此SLGA片段的18-mer合成胜肽(EQRTESIIHRALYYDLIS；序列編號：7)無法促進個體體內的動脈血管生成。此外，由本案與先申請案所載的實驗例可以發現，25-mer合成胜肽(EQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT；序列編號：4)無法有效促進個體體內的肌肉或肌腱再生和/或動脈血管生成。

可利用任何習用的技術來合成此處所述的合成胜肽，譬如t-BOC或FMOC來保護α-氨基(alpha-amino groups)。這兩種方法都採用了逐步合成法，其係由該胜肽的C端開始，每次加上一個胺基酸。亦可利用其他已知的固態胜肽合成(solid phase peptide synthesis，簡稱SPPS)法來合成此處所述的合成胜肽。

本發明之範圍亦涵蓋了其他相較於39-mer具有保守性置換的合成胜肽。在此處，「保守性置換」一詞係指利用另一種在生物學上相似的殘基來取代某一殘基。保守性置換的例示包括親水性殘基(如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸與甲硫胺酸)彼此間的置換，或相近極性殘基(如精胺酸與離胺酸；或麩胺酸與天冬胺酸)彼此間的置換，以及其他類似的置換模式。「保守性置換」在此亦指利用一具有取代基的胺基酸來取代一不具有取代基的原始胺基酸，只要可和此具有取代基之胺基酸反應的抗體亦可和原始胺基酸進行免疫反應即可。

亦可將上述實施方式所述的各種合成胜肽調製成用以促進個體體內的肌肉或肌腱再生和/或動脈血管生成之藥學組合物，此藥學組合物即屬於本發明另一態樣之範圍。

根據本發明一實施例，上述藥學組合物包含根據本發明上述態樣/實施方式所述的任一種合成胜肽，且此合成胜肽的含量足以促進個體體內的肌肉或肌腱再生和/或動脈血管生成。此藥學組合物亦包適用於該合成胜肽的藥學上可接受載體。

在選擇適用於投遞合成胜肽之藥學上可接受載體時，主要需考量該藥學組合物的給藥途徑。根據本發明的可任選實施例，此藥學組合物可透過肌肉內注射的方式來給藥。在此種情形中，可利用無菌水溶液作為藥學上可接受載體，此水溶液較佳為與接受者血液等張的溶液。舉例來說，可將活性成分溶解或懸浮於含有生理可相容物質的水中，所述的生理可相容物質如氯化鈉、甘胺酸及與其相似者，且其pH值經緩衝可與生理條件相容，以得到一水溶液，而後再進行滅菌。

於可任選的實施例中，亦可將所述合成胜肽調製於一緩釋劑型中，以確保該藥學組合物可提供較長效的治療效果。已知有多種高分子材料可延長藥物的釋放，其實施例包括但不限於：海藻酸鹽、明膠、膠原蛋白及聚乳酸/甘醇酸共聚物。

根據本發明某些實驗例，所述的合成胜肽係包埋於由經交聯的海藻膠所組成的基質中，此時該合成胜肽的最終濃度約為1-100 μM；且較佳為約10 μM。舉例來說，上述合成胜肽的濃度可為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100 μM。

本發明之組合物亦可包含各種本領域習知的添加物。舉例來說，可使用溶劑(包括少量乙醇)來穩定某些藥物。其他可任選的藥學上可接受添加物包括：乳白劑、抗氧化劑、香料、色素、膠化劑、增稠劑、安定劑、界面活性劑及與其相似者。亦可添加其他物質以防止組合物因儲存而變質，譬如可添加抗菌劑來抑制微生物(如酵母菌與霉菌)的生長。本發明的組合物中亦可包括滲透促進劑和/或降低刺激性的添加物。

在又一態樣中，本發明提出了一種用以於一個體的損傷區域中或鄰近處促進肌肉或肌腱再生的方法；且本發明的另一態樣是關於用以於一個體的缺血區域中或鄰近處促進動脈血管生成的方法。在以上任一種實施態樣中，所述個體/患者可以是任何哺乳類動物，包括人類。下文敘述了適用於上述兩種態樣或其中之一的實施例。

於一實施例中，上述用以促進肌肉或肌腱再生的方法包含對該個體體內的一治療區域投予一治療有效量的根據本發明上述態樣/實施例之合成胜肽，其中上述治療區域係鄰近該損傷區域，藉以促進該個體體內於鄰近該損傷區域或其中的肌肉或肌腱再生。

於另一實施例中，上述促進動脈血管生成的方法包含對該個體體內的一治療區域投予一治療有效量的根據本發明上述態樣/實施例之合成胜肽，其中上述治療區域係鄰近該缺血區域，藉以促進該個體體內於鄰近該缺血區域或其中的動脈血管生成。

於可任選的實施例中，可將所述合成胜肽調製為上述本發明態樣/實施例所述的藥學組合物。在實際操作時，可透過肌肉內注射(intradermal injection)的方式來投予該組合物。

根據某些實施例，該個體可能因為肌肉損傷、肌肉廢用、肌肉萎縮症、肌萎縮性側索硬化、肌腱損傷、組織缺血、腦缺血、周邊動脈疾病或心肌梗塞等原因，而使缺血區域中的血流受阻。

下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明。不應將這些實施例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。

實驗例 材料與方法

<材料>

經HEPES緩衝的DMEM培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、0.25%胰蛋白酶，抗-BrdU抗體、MCDB131培養基、TRIzol與Dynabeads皆購自Invitrogen(Carlsbad,CA)。超純海藻酸鹽(6000 Da)、二甲亞碸(dimethyl sulfoxide，DMSO)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、5-溴-2'-去氧尿苷(5-bromo-2'-deoxyuridine，BrdU)、Hoechst 33258染料與曼森氏三色染劑(Masson's Trichrome)皆購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。第一型膠原蛋白酶(collagenase type I)與第二型中性蛋白酶(dispase II)係購自Roche(Indianapolis,IN)。各種螢光染料-結合二級抗體皆購自BioLegend(San Diego,CA)。蘇木色素與伊紅(Hematoxylin and eosin，簡稱H&E)染料購自Merck(Rayway,NJ,USA)。抗-膠原蛋白1A1抗體係購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)。基質膠(Matrigel)係購自BD Biosciences(Bedford,MA)。抗-α-平滑肌肌動蛋白(anti-α-smooth muscle actin，簡稱anti-α-SMA)抗體(ab5694)與抗-核幹細胞因子(anti-nucleostemin)抗體係購自Abcam(Cambridge,MA)。抗-Pax7抗體(GTX62311)購自GeneTex(Taipei,Taiwan)。凝集素B4(Isolectin B4，簡稱IB4)-Alexa Fluor 568螢光耦合物係購自Molecular Probes(Eugene,OR)。

短合成胜肽(包括29-mer(序列編號：3)、25-mer(序列編號：4)、24-mer(序列編號：5)、20-mer(序列編號：6)、18-mer(序列編號：7)、Mo 29-mer(序列編號：8)與Mo 20-mer(序列編號：9))係購自GenScript(Piscataway,NJ)，於合成後，將其N端醯化(acetylated)並將C端醯胺化(amidated)以提升安定性，並以質譜儀定性(純度>95%)。

本說明書所載實施例所用的所有動物皆飼育於有溫度與濕度控制的飼養籠中，飼養溫度約24℃至25℃，光暗循環為12小時。試驗過程中提供飲水與標準齧齒類飼料供任食。實驗計畫皆通過馬偕紀念醫院(新北市，台灣)倫理委員會核准，並遵循國家動物保護相關規範。

<PEDF合成胜肽/海藻膠配方及丸劑配方>

以DMSO分別將每一合成胜肽(29-mer、25-mer、24-mer、20-mer、18-mer、MO 29-mer或MO 20-mer)復水備用(5 mM)。之後，將備用液與超純海藻酸鹽混合，以得到濃度2%(重量/體積)的海藻酸鹽溶液，其中PEDF合成胜肽的最終濃度約10 μM。接著以薄膜過濾器(孔洞大小：0.22 μm)過濾海藻酸鹽溶液，並和經過濾的硫酸鈣漿液(每毫升蒸餾水含0.21克硫酸鈣)以25：1的比例混合(每毫升經過濾的海藻酸鹽溶液和40 μL的硫酸鈣漿液混合)。將混合物靜置於室溫下1小時，以使海藻酸鹽進行交聯反應。所得到的緩釋配方之後可用以治療肌肉或肌腱損傷與缺血。

欲進行一次大量給藥(bolus delivery)時，將5 mM備用液連續稀釋，以得到PEDF胜肽最終濃度為10 μM的丸劑配方(bolus formulation)。

<組織學、免疫螢光與定量分析>

股薄肌(gracilis)、內收長肌(adductor magnus)、比目魚肌(soleus)與脛骨肌(tibialis)分別以4%三聚甲醛(paraformaldehyde)固定，之後以梯度乙醇脫水，接著以石蠟包埋。經固定的樣本以二甲苯(xylene)脫臘，並以梯度乙醇復水。將組織切成約5-μm的切片。利用H&E染料進行一般組織學分析。

脫臘的組織切片以10%山羊血清處理約1小時以進行阻斷。在4℃下利用BrdU初級抗體(GTX42641；稀釋比例1：50)或抗第一型膠原蛋白1A1初級抗體稀釋比例1：50)染色一夜，之後在室溫下先和適當的過氧化物酶-標記驢免疫球蛋白(peroxidase-labeled donkey immunoglobulin)反應約30分鐘，而後和顯色原基質(chromogen substrate)3,3-二氨基聯苯胺(3，3’-diaminobenzidine，簡稱DAB)反應2分鐘，接著利用蘇木色素進行對比染色。利用Nikon Eclipse 80i光學顯微鏡擷取高品質影像(解析度1208 X 960畫素)，以供進行定量分析。

利用經H&E染色之肌肉切片來決定肌纖維直徑，並以與顆粒邊緣(particle borders)相切的一對平行線之間的最小距離進行定量，此即「最小費里特直徑」(minimal Feret’s diameter)。利用Nikon Eclipse 80i光學顯微鏡擷取影像後，以Image-Pro Plus 4.5.1軟體(Media Cybernetics)來計算最小費里特直徑。以每一張照片中肌纖維總數為基準，將各纖維費里特群組(以每5 μm為單位)中的纖維數目標準化。

為了確認細胞核中心移位(centrally nucleated)肌纖維的數目，切片樣本以H&E染色後，以上述裝置擷取影像。於每一照片中隨機選擇至少100條經染色之纖維；若該纖維中有一或多細胞核並未處於靠近纖維周圍的位置，則將該肌纖維判定為細胞核中心移位纖維。將數據表示為所計算之總纖維數的百分比。每一實驗組別10隻老鼠，每一肌肉部位中選擇6個切片進行計算。

根據製造商的指示，以曼森氏三色染劑將脫臘的肌腱組織染色。對膠原蛋白面積進行半定量(semi-quantitative)分析時，在光學顯微鏡下，由每一玻片樣本中隨機選擇10個視野(field)，並以Image-Pro Plus 4.5.1軟體來計算樣本中修復區域面積佔未受損肌腱面積的比例(mm² /mm² )。

<肌腱幹細胞的分離與培養>

本實驗採用紐西蘭白兔(6-8個月大，3.0-4.0 kg)。順著兔子的肌腱韌帶骨附著處(bony attachment)切下，以取得阿基里斯肌腱。剝除腱翹後，將肌腱芯部切成小片。於DMEM-高葡萄糖溶液中加入3 mg/ml的第一型膠原蛋白酶與4 mg/ml的中性蛋白酶，將每100 mg的肌腱芯部片段加入1 ml上述溶液中，於37℃下進行2小時的水解反應。之後將所得細胞懸浮液在1,000 rpm的轉速下離心15分鐘，取出細胞沈澱物後重新懸浮於DMEM生長培養基中，此培養基添加了10%經熱不活化胎牛血清(FBS)、100 μM的2-巰乙醇(2-mercaptoethanol)與100 U/ml的青黴素(Penicillin)及100 μg/ml的鏈黴素(streptomycin)。欲進行繼代時，利用0.25%胰蛋白來收集幾近長滿的細胞，且之後將密度1 X 10⁵ 的繼代培養細胞培養於培養基中。

<肌腱幹細胞增殖分析>

將繼代4的肌腱幹細胞以每孔2 X 10⁵ 個細胞的密度植入經明膠塗覆玻片上置於六孔盤中，並加入生長培養基 (DMEM+10% FBS)培養24小時，而後將培養基置換成僅含5% FBS的基礎生長培養基(對照組)或含有5% FBS加上50 nM的PEDF合成胜肽(即，29-mer、24-mer、20-mer、18-mer、Mo 29-mer或Mo 20-mer)並培養24小時。欲進行BrdU標記分析時，將BrdU(最終濃度10 μM)加入培養系統中約4小時。在以4%三聚甲醛固定後，將細胞置於冷的甲醇中約2分鐘，而後在室溫下以1N氯化氫處理約1小時，而後再進行免疫螢光分析。透過核幹細胞因子(nucleostemin)與第一型膠原蛋白的免疫化學分析，來決定繼代4的肌腱幹細胞的表現型。幾乎所有經增殖的肌腱幹細胞都是核幹細胞因子與第一型膠原蛋白-雙陽性細胞。

<DNA合成的活體偵測>

欲偵測細胞增殖時，將BrdU重新溶於DMSO中備用(80 mM)。將10 μl的BrdU備用液和90 μl的PBS混合後經腹膜內注射至小鼠體內，並於16小時後將小鼠進行安樂死。大白鼠則是經腹膜內注射150 μl的BrdU備用液與350 μl的PBS，並同樣於16小時後安樂死。利用抗-BrdU抗體來標記BrdU，評估以DNA合成。

<免疫螢光分析>

脫臘組織切片或經4%三聚甲醛固定的兔子肌腱幹細胞(TSC)以10%山羊血清與5% BSA處理約1小時以進行阻斷。利用抗α-SMA(稀釋比例1：100)、IB4(5 μg/ml)、 Pax7(稀釋比例1：100)、核幹細胞因子(稀釋比例1：100)或第一型膠原蛋白1A1(稀釋比例1：50)的初級抗體於37℃下染色2小時，之後在室溫下和適當的玫紅-或FITC-結合驢免疫球蛋白反應約1小時。利用Hoechst 33258對細胞核進行對比染色(約7分鐘)。利用帶有CCD相機的蔡司(Zeiss)螢光顯微鏡來擷取影像，並利用Axiovert軟體照相。

每一內收長肌樣本中，隨機選取10個區域來擷取影像(放大倍率：200×)，並據以計算小動脈(圍繞於血管整個周邊的α-SMA陽性細胞)之密度。以事先不知處理組別的實驗人員來計算各樣本中的陽性細胞，並重複三次；之後將來自五個樣本的數值平均，並表示成每平方公釐的小動脈(arteriole)密度。

<骨髓間葉幹細胞的分離、培養與處理>

由雄性Sprague-Dawley大鼠(300-450 g)的股骨(femur)分離出初級大鼠骨髓間葉幹細胞(BM-MSC)。在無菌環境下移出股骨，並切除附著(adhering)組織，之後將DMEM培養基注入骨髓腔內沖洗。將收集到的骨髓細胞培養於100×15-mm的Petri碟中，使用DMEM培養基(添加10% FBS、100 U/ml青黴素與100 μg/ml鏈黴素)在5%二氧化碳與37℃的環境下培養2週，並每2-3天更換新鮮培養基。欲進行繼代時，利用0.25%胰蛋白來收集幾近長滿的細胞，且之後將2 X 10⁵ 的繼代培養細胞培植於6孔盤的每一孔中，並培養於10% FBS-DMEM培養基中。在進行處理前，改用添加1% FBS的DMEM培養基使細胞飢餓12小時，而後在新鮮的1% FBS-DMEM中加入50 nM的PEDF合成胜肽(29-mer或20-mer)，並培養24或48小時。

<RNA萃取與反轉錄聚合酶連鎖反應>

利用TRIzol自細胞內萃取出全RNA，並以不含核糖核酸水解酶(Rnase-free)的第一型去氧核糖核酸水解酶(DNase I)(Qiagen,Santa Clarita,CA)處理以移除基因組DNA，之後以RNA純化套組Dynabeads進行純化。在20 μl的反應緩衝液(含0.25 μg的隨機引子與0.8 mM去氧核糖核苷三磷酸鹽(dNTPs))中加入1 μg取自BM-MSC的全RNA與200單位的反轉錄酶(Roche,Mannheim,Germany)，於42℃下反應1小時，以將RNA反轉錄為cDNA。在後續的PCR反應中，取2 μl的cDNA作為反應模板。

PCR反應的反應體積為30 μl，其中含有15 μl的EconoTaq® PLUS GREEN 2× Master Mix(Lucigen® Corp.)、1 μM的各種引子以2 μl的模板DNA。合成cDNA的增殖反應約18-22個循環(變性：20秒、94℃；黏合：30秒、57℃：以及聚合：40秒、72℃)。每種引子組所用的循環數落在擴充的線性範圍內。用以增殖大鼠腱調蛋白(Tenomodulin，簡稱TNMD)基因(註冊號：NM_022290)的引子組包含正向引子(AGAATGAGCAATGGGTGGTC；序列編號：10)與反向引子(CTCGACCTCCTTGGTAGCAG；序列編號：11)，其PCR產物大小約240 bp。另外以大鼠甘油醛3-磷酸去氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，簡稱GAPDH)基因(註冊號：X02231.1)作為管家基因(housekeeping gene)，以將基因表現量標準化。用以增殖GAPDH基因的引子組包括正向引子(AGACAGCCGCATCTTCTTGT；序列編號：12)與反向引子(CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT；序列編號：13)，而PCR產物的大小約207 bp。

利用含有溴化乙錠(ethidium bromide)的2%洋菜膠對PCR產物進行電泳分析，並以UV光照使其顯影。利用FUJI LAS-3000系統與Multi Gauge Ver.1.01軟體(Fujifilm,Tokyo,Japan)對PCR產物進行光密度法定量分析。

<統計分析>

將結果表示為平均值±平均值的標準差(standard error of the mean，SEM)。利用單向(one-way)ANOVA分析來進行統計比較。除非另有說明，P <0.05時具有統計上的顯著差異。

實驗例1

PEDF合成胜肽可自海藻膠基質中持續釋放

為了決定29-mer與20mer的釋放動力學，將100 μg的FITC-結合PEDF合成胜肽與100μL的海藻酸鹽溶液混合，之後根據「材料與方法」中所述的步驟製備水凝膠。其後，在微量離心管中加入100 mg的水凝膠與1.5 ml的PBS(pH 7.4)，並於迴轉式振盪培養箱(orbital shaking incubator)中在37℃下培養6天。分別在預定的時間點將微量離心管離心後取出200 μL的上清液並儲存於-80℃下以供後續分析，同時將200 μL的新鮮PBS加入離心管中，以補足所抽取的上清液。利用96孔的螢光計(fluorimeter)來測定所收取之上清液中FITC-結合PEDF合成胜肽的含量。利用已知濃度且未經包埋之FITC-胜肽來產生一標準曲線。本分析採用三次重複實驗所得數據，並整理於第1圖。

如第1圖所示，在6天的試驗過程中，經包埋的PEDF合成胜肽會自海藻膠基質持續地釋出。更明確地說，在試驗開始後24小時，海藻膠基質中仍有約48%的29-mer與35%的20-mer合成胜肽。大多數(約90%)的29-mer合成胜肽會在試驗前四天釋出，其後釋放速率會明顯減緩，因而在累積釋放曲線中可以觀察到一個平線區(plateau)。20-mer合成胜肽的釋放速率比起29-mer稍微快了一些，在試驗前三天就釋出了約90%的20-mer。

實驗例2

緩釋PEDF合成胜肽可降低缺血損傷

缺血性肌肉損傷通常會導致局部壞死(necrosis)以及組織與功能的喪失。因此，以下實驗例中採用缺血性動物模型，以探究局部投予PEDF合成胜肽/海藻膠配方(下稱「緩釋配方」)是否能促進遭受缺血性損傷之組織或器官的組織或器官功能的回復。在下文的實驗例中，分別分析了與缺血性損傷相關的多種情形，例如，肢體灌流(limb perfusion)、組織壞死、動脈血管生成與新血管分枝(neovessel sprouting)等。

本實驗採用六週大的雌性C57BL/6野生型小鼠，動物經腹腔內注射舒泰(zoletil，用量為每公斤體重6毫克)與若朋(xylazine，用量為每公斤體重3毫克)混合液，以進行麻醉。以脫毛霜移除後腿與臀部的毛髮。將單邊外腸股動脈(external iliac artery)和股動脈(femoral artery)及周邊血管紮起並切除，以得到後肢缺血小鼠。手術後，將小鼠隨機分成數個實驗群組(每一群組樣本數為6)並分別給予如下處置。在空白對照組中，小鼠給予50 μl的空白海藻膠；而在丸劑對照組中，小鼠接受含有29-mer的丸劑配方。在PEDF合成胜肽/海藻膠處理組中，小鼠接受50 μl的緩釋配方，其分別含有29-mer、24-mer或20-mer。此外，於PEDF 18-mer對照組中，小鼠接受含PEDF 18-mer合成胜肽的緩釋配方。在手術後，立刻以單一劑肌肉內注射的方式將藥物投遞至股薄肌。傷口以無菌生理食鹽水沖洗後縫合。

實驗例2.1

緩釋PEDF合成胜肽可增加肢體灌流

利用雷射都卜勒灌流影像(Laser Doppler Perfusion imaging，簡稱LDPI)分析儀(Moor Instruments,USA)來定量手術前(術前；pre OP)、手術後即時(術後；post OP)以及手術後一段時間的血液灌流情形。為了最小化因麻醉熱損失(anesthetic heat loss)所造成的血管收縮，在測量前將動物置於37℃的加熱板上5分鐘。第2圖為代表性的LDPI照片，這些照片顯示了在手術後四週間缺血性後肢的血液灌流情形，其中深藍色代表血流量較低。另外，以LDPI指數來表示血液灌流情形，此一數值為同一動物之經手術(缺血性)後肢相對於未經手術(非缺血性)後肢的血流量比例，其結果摘要整理於第3圖與表1(n6)。以雷射頻率(不同顏色的像素)的改變來表示血流量。

如第3圖所示，一如預期地，在所有處理組別中，局部血流在手術後(術後)都立刻下降為同一動物非缺血性後肢的約8%。在空白對照組(僅以海藻膠處理)中，可以觀察到重新灌流隨著時間緩慢成長的現象。另外，可注意到丸劑給藥的效果與空白對照組相似，意味著PEDF合成胜肽的持續釋出可能是這些PEDF合成胜肽產生保護效果所必須的。再者，相較於空白對照組或丸劑對照組而言，以含有18-mer合成胜肽之緩釋配方處理的小鼠並未觀察到血液灌流提升之現象；代表18-mer合成胜肽無法有效治療缺血損傷。相較之下，以本發明實施例提出的PEDF合成胜肽處理的小鼠，其血液灌流皆有顯著的提升(相較於空白對照組、丸劑對照組與PEDF 18-mer對照組。具體來說，經含有29-mer、24-mer或20-mer的緩釋配方處理的動物，在手術後約第二週開始，皆可觀察到血流量有明顯的提升(至少為正常肢體的約60%)。在術後第4週，經含有29-mer、24-mer或20-mer的緩釋配方處理的動物，其灌流狀況的復原情形良好，分別達到正常肢體的約105%、92%與93%；相較之下，空白對照組的灌流比例只有約50%，而丸劑對照組的灌流比例也只有約55%。

實驗例2.2

緩釋PEDF合成胜肽可預防缺血誘發的組織壞死

在大多數的後肢缺血模型中，位於膝蓋下方的肌肉通常會發生組織壞死的情形。舉例來說，在股動脈切除後，位於投予治療之股薄肌遠端的脛骨前肌(tibialis anterior muscle)通常會出現大量肌肉壞死與再生的情形。樣本經曼森氏三色染劑後，藍色染料的強度取決於樣本組織中膠原蛋白纖維的含量，而壞死則會導致這種纖維化的情形。因此，在手術與治療後第二週與第七週分別自脛骨前肌取得組織樣本，並以曼森氏三色染劑染色，以評估纖維化(與壞死)程度。第4A與4B圖提供了代表性樣本的照片。

如第4A圖所示，在術後兩週，空白對照組動物的肌肉組織出現大量纖維化的情形(藍色染色區域)，而經本發明提出之緩釋配方處理的動物，其肌肉組織中纖維化區域相對較小。此外，在第4A圖中還可發現，於術後七週，此處提出之緩釋配方可有效降低壞死與纖維化區域，且因而可使肌肉組織完全復原。

在缺血性損傷之後，可透過衛星細胞增殖來進行肌纖維再生。新生成的肌纖維的特點之一為中心位移的細胞核。此外，壞死區域中出現壞死肌原纖維，其呈現淺色嗜伊紅細胞質且具有水腫與欠缺周邊細胞核等現象。如第4B圖所示，於手術後兩週，經本緩釋配方處理的小鼠中，具有中心位移之細胞核的肌原纖維之再生情形比起空白對照組小鼠更為明顯。參照第4B圖上方照片，空白對照組之樣本中的較大淺紅色區域(相較於經20-mer治療之樣本)代表此處提出的緩釋配方能夠有效地預防組織壞死。在手術後7週，空白對照組之動物的脛骨前肌中，還有15%的肌肉區域可見到小型的肌纖維束，且有脂肪滴交錯分布於其間(第4B圖；左下方)。

針對術後兩週的損傷區域(壞死區域與纖維化區域)以及細胞核中心移位之纖維數目進行統計分析，結果摘要整理於表2。將損傷區域面積表示成總染色區域面積的百分比(%)，而將細胞核中心移位之纖維表示成所計算之肌纖維總數的百分比(%)。

由表2所載的數據可以看出，注射此處提出的緩釋配方可實質降低組織損傷(相較於空白或丸劑對照組)。具體來說，經PEDF處理之群組損傷區域可降低至空白或丸劑對照組的約45-48%。此外，這些資料顯示以29-mer、24-mer或20-mer配方治療會使得脛骨前肌中細胞核中心移位之纖維數目增加約3-3.7倍(相較於空白或丸劑對照組)。

綜上所述，實驗例2.2所述的結果顯示以含29-mer、24-mer或20-mer之緩釋配方進行處置，可預防缺血所引發的組織壞死與纖維化，且因而可促進肌肉組織的復原。此外，以此處提出之緩釋配方治療的小鼠，其脛骨肌復原情形較佳，可進一步佐證此緩釋配方於促進缺血性肢體中血液灌流的效果(參見上文實驗例2.1)。

實驗例2.3

緩釋PEDF合成胜肽可刺激動脈血管生成而藉由側枝循環供應血流至缺血性組織

在主要動脈(如冠狀動脈或股動脈)急性阻塞的情形中，可以運用既有的動脈連接來繞過阻塞部位。此一過程稱為「動脈血管生成」，且和「血管新生」過程有諸多不同之處。從解剖學的角度來看，這些既有的側枝動脈是由一內皮細胞層(endothelial lining)、一內彈性層(internal elastic lamina)以及一或兩層平滑肌細胞所組成的具有薄管壁的微型血管管路；此一結構與血管新生過程中生成的微血管不同。在一般的情形下，不會使用這些原生的既有小動脈來提供血液灌流。然而，在主要動脈阻塞後，這些血管會經由生長作用而大幅提升其管腔容量，並繞過阻塞區域，而能提供較高的血液灌流至受損的缺血區域。在動物體內許多器官或組織(如後肢、心臟、腦、腎等)中，當主要動脈發生慢性或急性阻塞時，這些側枝動脈可緩減隨後可能發生的各種不利狀況。當注意到，動脈血管生成血管新生並非使既有側枝動脈被動擴張的簡單過程；反之，動脈血管生成涉及將既有動脈連結經主動增殖與重塑而形成真正的側枝動脈。已知血管半徑對血流量具有關鍵性的影響；因此，側枝動脈在經過適應性的生長後，能夠在單位時間內輸送相對大量的血液。因而，刺激動脈血管生成比起管新生能夠更有效率地保護缺血的後肢或其他器官(如心臟、腦等)。相較之下，血管新生指由既有血管形成內皮細胞結構的微血管過程，其對於提供較高的血液灌流至受損的缺血區域沒有幫助。因此，新形成的微血管，不論數量有多少，其供應血流至可能缺血組織的能力，都比不上二或三條側枝動脈所增加的血流量。

為了探究此處提出的緩釋配方對動脈血管生成的效果，於術後兩週取得每一處理組別之動物的內收長肌(其深度與股動脈切除位置相同，且預期該處會出現用以建立側枝循環之動脈血管生成)。對脈管平滑肌細胞(α-SMA；褐色)染色，以標記肌肉剖面中的小動脈，並以蘇木色素來標記細胞核；代表性照片見第5圖。此外，亦進行定量分析，其結果表示為損傷區域周邊(peri-injury region)內每平方公釐(mm² )的α-SMA-陽性小動脈之數目，如表3所示。

這些資料顯示，相較於空白與丸劑對照組，給予此處提供的緩釋配方能夠增加鄰近股動脈移除處之內收長肌內的小動脈密度。因而，在急性阻斷血液供應後，PEDF合成胜肽的持續釋出能夠提供動脈血管生成活性，以建立側枝循環。透過生長作用而大幅提升這些血管的管腔容量，能夠促進受損之缺血區域的灌流；而此種發展良好的側枝循環使得組織或器官能夠自缺血情況中復原。

實驗例2.4

PEDF合成胜肽可刺激完整組織培養(ex vivo )之新血管分枝

為了進一步確認由PEDF合成胜肽促進之新血管發展，進行大鼠主動脈環分枝(aortic ring sprouting)分析。自安樂死的大鼠取出胸主動脈(thoracic aortas)，並輕輕地剝除大動脈周邊的纖維脂肪(fibroadipose)組織。將大動脈切片成長度約2 mm的環，之後將其嵌入於低生長因子基質膠(growth factor-reduced Matrigel)中。將含有主動脈環的膠體置於12孔的孔盤內，在37℃下培育30分鐘使膠體聚合。將1 ml的MCDB131培養基加入含有基質膠的培植體中，上述培養基內添加了100 U/ml的青黴素、100 ng/ml的鏈黴素、1% FBS以及不同的添加劑(50 ng/ml的VEGF-A、20 ng/ml的FGF-2；或50 ng/ml的29-mer、24-mer、20-mer、Mo 29-mer、Mo 20-mer、25-mer或18-mer)。將培植體置於有濕度調節的保溫箱中在37℃下培養4天，並每2天更換新鮮培養基。在培養後第4天，利用具有明視野鏡頭(bright-field optics)的倒立顯微鏡(inverted microscope)平台(Leica)來觀察新血管分枝的情形；代表性照片見第6圖。此外，利用Image-Pro Plus 6.0軟體(Dendrites program)對新血管分枝進行定量分析，結果表示成相對於未經處理之主動脈環的倍數，如表4所示。本實驗重複三次。

在未經處理的對照組(UT)中，培養基並未添加任何生長因子，在第4天僅可觀察到少量的新血管分枝情形。可注意到，相較於未經處理的對照組，添加對照組PEDF合成胜肽(即，25-mer及18-mer)並未實質促進新血管分枝。

一如預期地，已知的血管新生因子包括VEGF與FGF2皆可實質提升新血管分枝。經VEGF或FGF-2處理之樣本的新血管分枝分別是未經處理之對照組的約3.4倍與約3.5倍。

表4的資料亦顯示，此處提出的PEDF合成胜肽(包括29-mer、24-mer、20-mer、Mo 29-mer與Mo 20-mer)於刺激新血管分枝的效果更勝於VEGF或FGF2。此外，對這些新血管進行雙重染色免疫分析，分別標記α-平滑肌肌動蛋白(小動脈壁平滑肌肉細胞(SMC)的標記)與凝集素B4(IB4，內皮細胞的標記)，代表性照片見第7圖。由第7圖可以看出，以此處提出之PEDF合成胜肽(29-mer或20-mer)處理的樣本顯現出小動脈的表現型而具有SMC披覆。相反地，在以對照組PEDF 18-mer處理的樣本中，幾乎很難觀察到初級管狀構造(endothelial tube)的形成與及SMC增殖的情形。此一結果顯示根據本發明實施例的PEDF合成胜肽能夠刺激新血管生成，而不僅止於只含內皮細胞之微血管的血管新生。此外，此實驗結果亦可支持此處提出的PEDF合成胜肽可於活體內刺激動脈血管生成之論述。

總結來說，實驗例2(包含實驗例2.1至2.4)所記載的結果顯示此處提出的PEDF合成胜肽可有效促進肢體灌流、減少組織壞死與纖維化以及促進動脈血管生成與新血管分枝；且因而投予上述PEDF合成胜肽(特別是含有任一種所述PEDF合成胜肽的緩釋配方)能夠降低缺血性損傷並有助於組織或器官之結構與功能的復原。當注意到，先前研究顯示人類PEDF有一34-mer片段(PEDF第44-77 號殘基)具有抗血管新生(anti-angiogenic)性質，且人類PEDF另有一44-mer片段(PEDF第78-121號殘基)具有神經滋養(neurotrophic)性質。然而，本發明首度證實，短的PEDF片段(至少包含上述29-mer、24-mer、20-mer、Mo 29-mer與Mo 20-mer)具有促進動脈血管生成(arteriogenic)的活性。

實驗例3

緩釋PEDF合成胜肽可促進肌肉再生

將單一劑丁胍卡因(bupivacaine)注射至大鼠之比目魚肌，致使大鼠肌肉壞死(myonecrosis)，並用此模型探究此處提出的PEDF合成胜肽對於肌肉再生的影響。本實驗採用十週大的雄性Sprague-Dawley大鼠(試驗開始的平均體重為312±11 g)，動物經腹腔內注射舒泰(zoletil，用量為每公斤體重10毫克)以進行麻醉。以脫毛霜移除後腿與臀部的毛髮。之後，以拋棄式注射器與26號(26-gauge)針頭將0.5 ml的丁胍卡因(AstraZeneca)單邊注射到動物的比目魚肌中。簡言之，將針頭插入至比目魚肌的遠端，且之後縱向收回針頭至進端，同時均勻地注射丁胍卡因溶液。在緩慢收回針頭的過程中，使溶液注射於肌肉的全長範圍中。

在注射丁胍卡因之後，將大鼠平均分成四個實驗群組(每群樣本數為10隻)，並分別給予以下處理。在空白對照組中，給予小鼠50 μl的空白海藻膠。在治療組中，給予小鼠50 μl的緩釋配方(含29-mer或20-mer)。丸劑對照組之小鼠則接受丸劑配方(含29-mer)。在丁胍卡因灌流後，立刻以單一劑肌肉內注射的方式，將不同的處理施用至動物的比目魚肌。

在注射丁胍卡因後第4天，取比目魚肌的切片進行組織學分析，結果顯示不同組別皆出現一般肌肉壞死的情形，比目魚肌樣本中可見到肌纖維崩解與大量浸潤發炎細胞(照片未示出)。只有在周邊區域還有少數肌纖維保有相對正常的結構；在空白對照組與經PEDF胜肽處理的組別中，肌纖維壞死的程度都很相近。以上結果顯示丁胍卡因對不同組別的原有肌纖維引起相同程度的肌纖維崩解。

實驗例3.1

緩釋PEDF合成胜肽可促進細胞增殖

肌肉再生過程涉及了肌纖維或肌肉細胞的增殖；於本實驗例中，將BrdU引入增殖的細胞核中，以觀察肌纖維增殖之情形。衛星細胞的增殖是肌肉再生的關鍵；因此，亦對比目魚肌進行染色，藉由偵測衛星細胞標記Pax7來探究肌肉再生活性。詳細的檢測方法如「材料與方法」一節所述。以標記指數(labeling index)來表示BrdU-陽性細胞的數量，此一數值是將經標記的細胞數目除以細胞總數，並以百分比(%)表示。Pax7-陽性細胞的標記指數(%)則是將經標記的細胞數目除以具有細胞核的細胞總數。自每一實驗群組的10隻小鼠分別取得肌肉切片，且每一切片取六個部分進行定量分析，結果摘要整理於表5。

由表5可以看出，經含有29-mer或20-mer之緩釋配方治療的小鼠傷口中，有明顯較多的BrdU-陽性細胞(相較於經空白或丸劑對照組處理的小鼠)。關於衛星細胞的增殖活性，表5的數據顯示，相較於空白與丸劑對照組，此處提出的緩釋配方可導致較高的Pax7-陽性細胞比例。總結來看，這些資料顯示給予此處提出的緩釋配方能夠提升肌纖維和/或衛星細胞的增殖活性，而此一特性又能夠促進肌肉再生。

實驗例3.2

緩釋PEDF合成胜肽可促進肌纖維再生

在肌肉再生的過程中，新生成的肌纖維的細胞核通常位於中心。因此，這種細胞核中心移位之肌纖維的百分比亦可作為肌肉之再生活性的指標。在注射丁胍卡因後第7天，對細胞核中心移位之纖維數目進行統計分析，結果摘要整理於表6。

由表6可以看出，相較於空白或丸劑對照組，經含有29-mer或20-mer之緩釋配方處理的動物中，含有中心位移之細胞核的肌纖維比例較高。這些結果顯示給予此處提出的緩釋配方能夠有效促進肌肉再生。

此外，在注射丁胍卡因後第14天，在所有實驗群組中，比目魚肌內都形成了新的肌肉細胞來取代已壞死的肌纖維。然而，在以空白或丸劑對照組處理的動物中，其再生肌肉仍可見到許多細胞核中心移位之纖維(第8圖)，這意味著這些群組中的肌肉再生尚未完成。相反地，在經過含有29-mer或20-mer之緩釋配方處理的動物中，其肌肉切片內的細胞核中心移位之纖維明顯少了許多。總結來看，這些資料顯示PEDF合成胜肽的持續釋放有利於肌纖維的再生。

實驗例3.3

緩釋PEDF合成胜肽可促進再生之肌纖維的成熟

在肌肉再生過程的後期，新生成的肌纖維會開始變大。於受傷後第14天取得肌肉樣本，並根據「材料與方法」一節所述的步驟，分別測量纖維直徑，結果摘要整理於第9圖。

平均來看，以含有29-mer或20-mer之緩釋配方處理的動物之肌肉纖維直徑大於空白或丸劑對照組中之動物。此外，經20-mer治療的動物肌肉之尺寸分布非常接近未受傷的完整肌肉之尺寸分布。具體來說，經20-mer治療的動物約有56.6%的肌纖維其最小費里特直徑為15-25 μm，而未受傷的動物則有約53.2%的肌纖維落於此一範圍中；相較之下，空白及丸劑對照組則分別有約59.6%與約56.2%的再生纖維的丸劑對照組最小費里特直徑介於約10-20 μm之間。這些資料顯示與此處提出的緩釋配方能夠有效增加再生之肌肉的質量。

總結而論，實驗例3(包括實驗例3.1至3.3)所提出的資料證實此處提出的PEDF合成胜肽能夠有效促進肌纖維與衛星細胞的增殖、肌纖維的再生以及再生之肌纖維的成熟；且因而投予所述PEDF合成胜肽(特別是含有任一種所述PEDF合成胜肽之緩釋配方)能夠有效促進肌肉再生過程並有助於肌肉組織結構與功能的復原。本發明率先發現短的PEDF片段(至少包含29-mer與20-mer)能夠促進肌肉再生。

實驗例4

緩釋PEDF合成胜肽可促進肌腱再生

本實驗例採用大鼠肌腱損傷模型來探究此處提出的PEDF合成胜肽對肌腱再生的效果。採用十週大的成年雄性Sprague-Dawley大鼠(總樣本數50隻，試驗開始的平均體重為312±11 g)，動物經腹腔內注射若朋(用量為每公斤體重10毫克)以進行麻醉。接著，將18號(18-gauge)針頭插入穿過大鼠左腿阿基里斯腱的完整厚度，並在跟骨(calcaneum)上方約1公分處將阿基里斯腱橫切切斷，以得到左阿基里斯腱缺損的動物模型。此一方式所得到的水平傷口兩側有完整的肌腱組織，可防止兩斷裂端的收縮。

將大鼠隨機分派於五個實驗群組(每群樣本數為10隻)，並分別接受以下處置。空白對照組的小鼠接受150 μl的空白海藻膠。丸劑對照組的小鼠給予150 μl的丸劑配方(29-mer)。在PEDF處理組中，小鼠分別接受150 μl的緩釋配方(含29-mer、24-mer或20-mer)。傷後立刻將各處理以皮下注射的方式注射至鄰近肌腱損傷處，傷口以無菌生理食鹽水沖洗後縫合。

實驗例4.1

緩釋PEDF合成胜肽可促進肌腱癒合

在肌腱損傷後第3週，進行組織學分析以觀察肌腱復原的情形，代表性照片如第10圖所示。第10圖上方為空白對照組之動物的復原情形，由圖中可看到在兩斷裂端之間，形成了由不規則的纖維所組成的疤痕組織，且在此疤痕組織中經染色的膠原蛋白束(粉紅色)非常少。相較之下，經含有29-mer之緩釋配方處理後，肌腱二斷裂端之間形成的癒合組織中的疤痕組織較少(相較於空白對照組樣本)，且有成熟膠原蛋白束(粉紅色)延伸至肌腱損傷處；此外，在某些區域中，來自二斷裂端的肌腱纖維似乎有接合的情形(第10圖下方照片)。再者，經29-mer處理處理的群組中，疤痕中的纖維組織似乎較為規則，且平行排列。

第11圖為較高倍率的組織學分析照片。由照片中可以看出，正常肌腱在膠原蛋白纖維之間所含的細胞數相對較少，且細胞核幾乎都呈狹長形。在空白與丸劑對照組中，在經過三週的復原後，可在肌腱中觀察到較多的纖維母細胞(fibroblast，其特徵在於有圓形或紡錘形的似纖維母細胞細胞核)，且新形成的膠原蛋白纖維結構較不規則(照片中未損傷組織以星號(*)標記)。這些型態學上的改變顯示空白及丸劑對照組中的肌腱傷口癒合較差。

相較之下，第11圖顯示在以此處提出之緩釋配方處理的肌腱中，癒合區域可見到較薄、細長形的細胞核，其型態近似成熟肌腱細胞(tenocyte)的細胞核，而其中的膠原蛋白纖維排列規則且和原生肌腱(深粉紅色deep pink)相平行；以上型態代表著肌腱傷口的癒合情形較佳。這些結果顯示此處提出的緩釋配方有利於肌腱傷口之癒合。

此外，樣本經曼森氏三色染劑染色，以評估膠原蛋白纖維的結構與排置，代表性樣本照片如第12圖所示。在未受傷的肌腱中，膠原蛋白纖維實質上彼此平行(第12圖左方)。相反地，在空白對照組中，受傷肌腱之復原區域內的膠原蛋白纖維成不規則排列(第12圖中；傷口邊緣以星號(*)標記)。然而，以此處提出的緩釋配方處理的受傷肌腱中，可觀察到排列規則的膠原蛋白纖維，且其方向與受傷邊緣之外的未受傷肌腱組織大致相同(第12圖右方；傷口邊緣以星號(*)標記)。這些高度規則排列的膠原蛋白纖維意味著經此處提出的緩釋配方處理的動物，其肌腱傷口復原情形較佳。

此外，以定量分析來評估於再生區域中的膠原蛋白百分比(%)，結果摘要整於表7。

由表7可以看出，PEDF(29-mer、24-mer或20-mer)處理組中的動物其再生區域內的膠原蛋白含量較高(相較於空白或丸劑對照組)。這些數據顯示，施用此處提出的緩釋配方能夠促進創傷區域內的膠原蛋白生合成。

此外，對樣本中的第一型膠原蛋白進行免疫染色，並以蘇木色素來染色細胞核，代表性的樣本照片如第13圖所示，其中下方圖式為上方圖式虛線部分的放大圖。當可想見，未受傷肌腱中的膠原蛋白纖維彼此有良好的交鏈，且因而抗-膠原蛋白1A1抗體可能不易辨識這些膠原蛋白纖維。因此，在第13圖左方照片中，僅可觀察到非常少量的第一型膠原蛋白(褐色)。藉由比較空白對照組的照片(第13圖中)與PEDF處理組的照片(第13圖右方)，可以發現經PEDF處理的動物中，第一型膠原蛋白(褐色)的含量高於空白對照組之動物。

總結來看，這些結果顯示投予含有所述PEDF合成胜肽之緩釋配方能夠刺激受傷肌腱組織內的細胞之第一型膠原蛋白的生合成，有助於癒合損傷組織膠原蛋白的沈積，且可促使膠原蛋白纖維排列更為規則，因而有利於肌腱再生。

實驗例4.2

PEDF合成胜肽可誘導活體外(in vitro )肌腱幹細胞增殖

已知在肌腱癒合的過程中，肌腱幹細胞(tendon stem cell，簡稱TSC)會擴增並分化為肌腱細胞。為了探討此處提出的PEDF合成胜肽是否可誘使肌腱幹細胞於活體外增殖，利用「材料與方法」一節所述的步驟來分離並培養肌腱幹細胞。並利用肌腱幹細胞標記(核幹細胞因子)以及肌腱幹細胞可表現第一型膠原蛋白的特性來確認肌腱幹細胞的純度(近百分之百；資料未示出)。再利用BrdU脈衝標記2小時，來確認細胞增殖。採用上文所述的方法對BrdU-陽性細胞進行定量分析，結果摘要整理於表8。

這些結果顯示，相較於培養於對照組培養基中的肌腱幹細胞，培養於含此處提出之PEDF合成胜肽(29-mer、24-mer、20-mer、Mo 29-mer或Mo 20-mer)之培養基中的肌腱幹細胞的增殖活性較佳。此外，亦可注意到，此處所用的Mo 29-mer與Mo 20-mer是來自老鼠PEDF胜肽，且這兩個序列和39-mer的11-30個胺基酸殘基的序列相似度並非100%；然而，這兩個序列促進有絲分裂的效果與來自人類PEDF的短PEDF合成胜肽(如，29-mer、24-mer與20-mer)不相上下。

實驗例4.3

緩釋PEDF合成胜肽於肌腱損傷後可促進活體內(in vivo )肌腱幹細胞增殖

由實驗例4.1中的各組動物身上取得樣本，並對核幹細胞因子進行染色(綠色)，以探究此處提出的緩釋配方在肌腱傷口復原的過程中，是否能夠促進活體內的肌腱幹細胞增殖。進行定量分析時，由每一實驗群組的樣本中隨機選取10個顯微視野並擷取影像，接著計算在所有細胞中(以Hoechst 33258進行對比染色；藍色)，核幹細胞因子-陽性細胞的百分，結果摘要整理於表9。

這些資料顯示，在經過29-mer、24-mer或20-mer處理的動物中，呈核幹細胞因子-陽性之肌腱幹細胞較多(相較於空白與丸劑對照組中之動物)。將實驗例4.1與4.3的實驗結果綜合分析，可以發現藉由給予此處提出的緩釋配方而促進活體內肌腱幹細胞擴增的現象，和肌腱復原情形較佳(相較於自然的復原過程)的現象可互相呼應。

實驗例4.4

PEDF合成胜肽可誘導由骨髓間葉幹細胞產生似肌腱細胞

近來研究顯示，可利用成體間葉幹(mesenchymal stem cell，簡稱MSC)來再生具有功能的肌腱。於本實驗例中，將骨髓間葉幹細胞培養於對照組培養基或含有PEDF 29-mer或20-mer的培養基中，以探究此處提出的PEDF合成胜肽於促進骨髓間葉幹細胞分化為肌腱細胞的能力。腱調蛋白(TNMD)基因大量表現於肌腱中，且被認為是肌腱細胞系(lineage)最可靠的表現型標記之一。因此，本實驗藉由TNMD的表現量，來評估肌腱細胞的分化。RT-PCR分析的代表性照片見第14圖。

分析結果顯示，在體外培養的骨髓間葉幹細胞內，此處提出的PEDF合成胜肽(如29-mer或20-mer)可有效地誘導似肌腱細胞的細胞分化。由於骨髓間葉幹細胞的移動(mobilization)與分化是活體內肌腱修復的可能機制之一，上述結果意味著此處提出的PEDF合成胜肽似乎能夠藉由促進骨髓間葉幹細胞分化為肌腱細胞，而修復肌腱損傷。這些結果亦顯示出，此處提出的PEDF合成胜肽有潛力用於由骨髓間葉幹細胞組成的骨架基質培養系統(scaffold matrix culture)中，以促進人工肌腱的合成。

總結而論，實驗例4(包括實驗例4.1至4.4)所示的資料顯示此處提出的PEDF合成胜肽能夠有效促進規則排列之膠原蛋白(特別是第一型膠原蛋白)纖維的生合成以及肌腱幹細胞的增殖；且因而投予此處提出的PEDF合成胜肽(特別是，含有任一種所述PEDF合成胜肽之緩釋配方)能夠促進肌腱再生過程，且有利肌腱組織在結構與功能方面的復原。本發明率先證實短的PEDF胜肽片段(至少29-mer與20-mer)能夠促進肌腱再生，亦能促使骨髓間葉幹細胞分化為肌腱細胞。

綜上所述，上開實施例所載的結果證實此處提出的PEDF合成胜肽(例如29-mer、24-mer、20-mer、Mo 29-mer、與Mo 20-mer)能夠促進缺血區域中或其鄰近區域內的動脈血管生成，亦能促進損傷區域中或其鄰近區域內的肌肉與肌腱再生。因而，此處提出的PEDF合成胜肽可作為一種用以促進肌肉與肌腱傷口復原以及降低缺血性損傷的治療藥劑。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下。

第1圖以折線圖繪示在37℃下，海藻膠將PEDF合成胜肽於活體外釋放至PBS中的累積釋放量。結果以三次獨立試驗結果的平均值±標準差來表示。

第2圖為雷射都卜勒灌流影像(LDPI)，繪示缺血後肢在手術後4週內的血流灌注情形。

第3圖以折線圖繪示小鼠經單獨海藻膠(空白對照)、含29-mer、24-mer、20-mer或18-mer之緩釋配方以及含29-mer的丸劑配方處理後，其後肢血流灌注分析的結果。果以三次獨立試驗結果的平均值±標準差來表示；n6。*P <0.05；相較於空白對照組。

第4A圖為經曼森氏三色染劑染色後之脛骨肌樣本的代表性照片(原始倍率：×40)；而第4B圖為相同樣本在較高倍率下的照片，以更清楚地呈現以手術誘發後肢缺血後2週與7週的肌肉壞死程度(原始倍率：×200)。

第5圖為缺血後兩週於內收長肌中之小動脈的代表性免疫顯微照片。小動脈以抗-α-SMA(褐色)標記，而細胞核以蘇木色素標記。

第6圖為經過不同培養基培養四天後之主動脈環培植體的代表性照片，所用的培養基分別為：基礎MCDB131培養基(未處理對照組，UT)以及添加了已知血管新生因子(FGF2或VEGF)、對照組PEDF合成胜肽(25-mer或18-mer)或根據本發明實施例之PEDF合成胜肽(29-mer、24-mer、20-mer、Mo 29-mer或Mo 20-mer)的培養基。

第7圖為經過不同培養基培養四天後之主動脈環培植體的代表性雙重免疫染色照片，以觀察在添加了不同PEDF合成胜肽(29-mer、20-mer或18-mer)的培養基中，由主動脈環向外長出脈管平滑肌細胞(vSMCs)的情形。照片中內皮細胞係以Alexa Fluor 594-標記之凝集素B4(IB4；紅色，左方)標記，而vSMCs則以抗-α-SMA(綠色；中間)標記。右方為合併圖式(黃色)。以Hoechst 33258來染色細胞核。原始倍率：×400。所示照片為四次獨立實驗的代表性照片。

第8圖為注射丁胍卡因後第14天之比目魚肌的代表性H&E染色照片。

第9圖為折線圖，繪示了在不同實驗狀況下的肌肉之肌纖維直徑分布。

第10圖為受傷後3週之肌腱內部之再生組織(↑)的代表性照片。原始倍率：×100。

第11圖為受傷後3週阿基里斯(Achillis)肌腱的代表性H&E染色照片。原始倍率：×400；比例尺：50 μM。所示照片為三次獨立實驗的代表性照片。

第12圖為受傷後3週經曼森氏三色染劑染色以呈現膠原蛋白纖維之組織切片的代表性照片。星號(*)代表肌腱中未受傷的區域。原始倍率：×400；比例尺：50 μM。所示照片為三次獨立實驗的代表性照片。

第13圖為受傷後3週的第一型膠原蛋白(褐色)的代表性免疫染色照片。細胞核以蘇木色素標記。下方以較高倍率顯示方塊區域。比例尺：50 μM。所示照片為三次獨立實驗的代表性照片。

第14圖為根據本發明一實驗例的代表性電泳照片，其顯示此處提出的PEDF合成胜肽(29-mer與20-mer)可促進腱調蛋白(TNMD)基因的表現。腱調蛋白(TNMD)基因的表現顯示BM-MSC分化為肌腱細胞。所示照片為三次獨立實驗的代表性照片。

<110> 財團法人台灣基督長老教會馬偕紀念社會事業基金會馬偕紀念醫院<120> 色素上皮衍生因子衍生之多胜肽於促進肌肉或肌腱再生或動脈血管生成之用途<130> P2717-US <160> 14 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成胜肽<400> 1<210> 2 <211> 34 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成胜肽<400> 2<210> 3 <211> 29 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成胜肽<400> 3<210> 4 <211> 25 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成胜肽<400> 4<210> 5 <211> 24 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成胜肽<400> 5<210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成胜肽<400> 6<210> 7 <211> 18 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成胜肽<400> 7<210> 8 <211> 29 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成胜肽<400> 8<210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成胜肽<400> 9<210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> Primer <400> 10<210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> Primer <400> 11<210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> Primer <400> 12<210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> Primer <400> 13<210> 14 <211> 418 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14

Claims

一種合成胜肽之用途，其係用以製備可促進一個體體內肌肉再生、肌腱再生或血管動脈生成之藥學組合物，該合成胜肽係由一長度為20-39個胺基酸殘基的胺基酸序列所組成，其中該胺基酸序列包含至少20個連續胺基酸殘基，其與序列編號：1的第11-30個胺基酸殘基具有至少95%的胺基酸序列相似度，且至少四個連續胺基酸殘基與序列編號：1的第11-14個胺基酸殘基相同。
如請求項1所述的合成胜肽之用途，其中該合成胜肽的該胺基酸序列為序列編號：1(39-mer)、序列編號：2(34-mer)、序列編號：3(29-mer)、序列編號：5(24-mer)或序列編號：6(20-mer)所示的胺基酸序列。