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TWI471139B - 抗－ｉｇｆ抗體 - Google Patents

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TWI471139B
TWI471139B TW98142592A TW98142592A TWI471139B TW I471139 B TWI471139 B TW I471139B TW 98142592 A TW98142592 A TW 98142592A TW 98142592 A TW98142592 A TW 98142592A TW I471139 B TWI471139 B TW I471139B
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保羅 亞當
艾瑞克 波傑斯
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百靈佳殷格翰國際股份有限公司
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Publication date
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Description

抗-IGF抗體
本發明係關於過度增生疾病之療法，特定言之，係關於癌症之療法。
類胰島素生長因子-1(IGF-1；70個胺基酸多肽)及類胰島素生長因子-2(IGF-2；67個胺基酸多肽)為存在於血清中的7.5kD可溶性因子，其可強烈刺激多種哺乳動物細胞之生長(回顧於Pollack等人，2004)。IGF在分泌進入血流中後即與IGFBP形成複合物，從而防止其在去往靶組織之途中、在血清中發生蛋白水解性降解且防止其與IGF受體結合。亦已知IGF可在靶組織自身中以自分泌或旁分泌方式分泌。已知此過程可在正常胎兒發育期間發生，其中IGF對組織、骨骼及器官的生長起重要作用。其亦發現於許多癌組織中，其中咸信在腫瘤細胞與基質細胞之間存在旁分泌信號傳導或腫瘤細胞自身產生自分泌IGF(回顧於LeRoith D,2003)。
IGF-1及IGF-2能夠結合許多正常組織上所表現的IGF-1受體(IGF-1R)，其在功能上為由具有相似親和力之二聚合α-次單位及β-次單位組成的460kD異四聚體(Rubin等人，1995)。IGF-2亦可結合IGF-2受體，咸信此可防止IGF-2結合IGF-1R及經由IGF-1R進行信號傳導。就此而言，IGF-2R已證明為腫瘤抑制蛋白。IGF-1R在結構上類似於呈兩種形式IR-A及IR-B存在的胰島素受體，不同之處在於IR-A胞外域缺失替代性剪接之12個胺基酸外顯子。IR-B為表現於大多數正常成人組織中的主要IR同功異型物，其作用為介導胰島素對代謝之影響。另一方面，已知IR-A高度表現於正發育的胎兒組織中，而非成人正常組織中。最近研究亦已顯示IR-A(而非IR-B)高度表現於某些癌症中。IR-A中缺失外顯子不影響胰島素結合，但引起小的構形變化，致使IGF-2結合其的親和力比結合IR-B的親和力高得多(Frasca等人，1999；Pandini等人，2002)。由於IR-A在癌組織中表現且更易與IGF-2結合，因此IR-A在癌症中介導IGF-2之促有絲分裂效應可同IGF1-R一樣重要。
IGF結合IGF-1R可觸發複雜的胞內信號傳導級聯，導致刺激增殖及存活之蛋白質的活化(回顧於Pollack等人，2004)。
不同於EGFR及Her2neu受體，已知癌症中不存在IGF1-R或IR-A受體之擴增，表明受體活化由活性配位體的存在控制。大量的科學、流行病學及臨床文獻顯示IGF在許多不同類型癌症之發展、進展及轉移中之作用(回顧於Jerome等人，2003及Pollack等人，2004)。
舉例而言，在結腸直腸癌中，IGF-2 mRNA及蛋白質在臨床結腸直腸腫瘤樣本中之表現高於在相鄰正常組織中之表現(Freier等人，1999；Li等人，2004)。在患有結腸直腸瘤之患者中，血清中高IGF含量亦與增殖細胞指數正相關(Zhao等人，2005)。另外，循環中高IGF-2含量與發展結腸直腸癌及腺瘤之高風險相關(Renehan等人，2000a)及b)；Hassan等人，2000)。IGF-2基因之親本印記喪失(LOI)(導致IGF-2高表現之後生變異)為最近已在結腸直腸瘤及其他腫瘤類型之患者中鑑別的可遺傳分子性狀。IGF-2印記喪失已顯示與結腸直腸瘤(Cui等人，2003；Cruz-Correa等人，2004)及腺瘤(Woodson等人，2004)之五倍風險相關。抗體靶向IGF-1R α-次單位、從而阻斷IGF結合且使受體內化已顯示可延緩異種移植之來源於結腸癌之細胞株(諸如COLO 205)的生長(Burtrum等人，2003)。
高IGF含量與人類肺腺癌的不良預後有關(Takanami等人，1996)且許多來源於SCLC及NSCLC之細胞株可表現及分泌IGF(Quinn等人，1996)。IGF-2之轉殖基因過度表現在鼠類模型中誘發自發性肺腫瘤(Moorhead等人，2003)。就肝細胞癌(HCC)而言，HCC之人類臨床樣本及動物模型表現IGF mRNA及蛋白質的程度高於相應正常組織且此與腫瘤生長增強相關(Wang等人，2003；Ng等人，1998)。亦已顯示IGF-2為HCC之血清學標記，與對照者相比，IGF-2在HCC患者血清中的含量更高(Tsai等人，2005)。
許多幼年期實體腫瘤(諸如尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)及橫紋肌肉瘤)之生長似乎特別依賴於IGF信號傳導路徑(Scotlandi等人，1996)。已顯示IGF-2基因之LOI為胚胎橫紋肌肉瘤發展中之初期遺傳事件(Fukuzawa等人，1999)。在1型EWS-FLI1嵌合轉錄因子經由染色體轉位加以表現(導致靶基因(包括IGF配位體及IGF-1R)之表現升高及IGFBP-3之表現降低)的情況下，亦認為自分泌IGF信號傳導可強烈影響尤文氏肉瘤生長。已顯示靶向IGF-1R之抗體及小分子化合物可降低異種移植之來源於小兒實體腫瘤之細胞株的生長(Kolb等人，2008；Manara等人，2007)。
已證明使用IGF配位體特異性抗體可抑制植入SCID小鼠中之成人骨中之人類前列腺癌細胞的生長(Goya等人，2004)。另外，已證明相同IGF配位體抗體可在鼠類異種移植系統中阻斷IGF之旁分泌補給且抑制人類結腸直腸癌細胞之肝轉移(Miyamoto等人，2005)。
亦有大量證據表明IGF信號傳導系統降低癌症對化學治療劑及輻射之敏感性。在此方面最早的發現之一為證實IGF-1R基因剔除小鼠胚胎難以藉由病毒、致癌基因及過度表現之生長因子受體轉型(Sell等人，1993；Sell等人，1994)及IGF-1R之過度表現可保護細胞防止紫外線照射及γ輻射誘發之細胞凋亡(Kulik等人，1997)。此外，使用分泌大量IGF-2之肝腫瘤細胞株，發現活體外中和IGF-2可明顯增強對化學治療劑(諸如順鉑(cisplatin)及依託泊苷(etoposide))的反應，尤其在較低抑制細胞的劑量，表明IGF-2可降低對化學治療劑的敏感性(Lund等人，2004)。與此等發現一致，已證明靶向IGF-1R之抗體可使腫瘤異種移植物對化學治療藥物及輻射之生長抑制作用的敏感性增強(Goetsch等人，2005)。
已報導許多抗體顯示與人類IGF-1及人類IGF-2交叉反應性結合。抗體sm1.2係針對人類IGF-1產生，顯示與人類IGF-2之40%交叉反應性，且顯示可抑制以20ng/mL人類IGF-1刺激之小鼠纖維母細胞株BALB/c3T3之增殖(Russell等人，1984)。在一項設計藉由產生針對完整IGF-1蛋白質及該蛋白質之一部分的單株抗體而在功能上對IGF-1抗原決定基定位的研究中，已鑑別出許多可與IGF-2交叉反應的抗體(Manes等人，1997)。與IGF-2交叉反應百分率範圍為0至800%，已鑑別出幾種與IGF-1及IGF-2相等反應的抗體。KM1486為可與人類IGF-1及IGF-2交叉反應之大鼠單株抗體，且已證實KM1486可抑制植入非肥胖糖尿病/嚴重複合型免疫缺陷小鼠中之成人骨中的人類前列腺癌細胞的生長(Goya等人，2004)。另外，已證實KM1486可抑制人類結腸直腸癌之肝轉移(Miyamoto等人，2005)。KM1486亦已描述於WO 03/093317、JP 2003-310275、WO 2005/018671、WO 2005/028515及WO 2005/027970中。
就治療人類疾病而言，非常需要具有完全人類序列之抗體以使產生人類抗抗體反應及中和抗體之風險減至最低程度，產生人類抗抗體反應及中和抗體會快速消除體內所投與之抗體且因此降低治療作用。因此(假定IGF-1及IGF-2依賴性信號傳導在癌症發展及進展中起作用)，需要獲得完全人類抗體。WO 2007/070432描述共中和兩種配位體之促有絲分裂效應的完全人類抗體。
本發明之目標係提供具有高親和力之替代性人類抗IGF抗體。
本發明之另一目標係獲得不影響胰島素與其受體結合之抗體。
藉由藥物活性之藥效學生物標記可有助於臨床開發治療劑。使用靶向IGF-1R之抗體的臨床研究已證明血清中總IGF-1含量之增加可為此等藥劑之適用藥效學標記(Pollack等人，2007)。血清中總IGF-1含量增加的原因可能係由於涉及垂體生長激素(GH)分泌的反饋機制，該反饋機制促使IGF-1與IGFBP自肝臟釋放。事實上，已在人類中證明佔總IGF-1含量僅約1%之游離或生物活性IGF-1決定該反饋反應(Chen等人，2005)。
因此本發明之另一目標係提供一種伴有生物標記之療法(該生物標記容許對該療法之有效性進行藥理學監測)，用於治療疾病發展及/或進展在病因上與IGF相關的疾病。
在本發明實驗中，可證明血清中總IGF-1含量隨本發明抗IGF抗體之施用而升高。因此，總IGF-1含量為抗IGF抗體療法之有效性的適用藥效學標記。因此非常有利的是本發明之抗體與適合動物物種(例如小鼠或大鼠)之IGF發生交叉反應，使得藥效學效應已可在臨床前進行測試。
「總IGF-1含量」係指血漿或血清中IGF-1之相加量，包含結合血清結合蛋白之IGF-1加上游離(未結合)IGF-1之量。
因此，在另一態樣中，本發明係關於一種測定可結合IGF-1及IGF-2之抗體分子治療癌症患者之有效性的方法。在該方法第一步驟中，測量患者生物樣本(例如血清或血漿)中總IGF-1含量。接著投與抗體分子且隨後經過一段足以使治療性抗體發揮其效應的時間後，再次測定總IGF-1含量。總IGF-1含量比第一步驟中所測得之總IGF-1含量相增加之量指示患者對該抗IGF抗體分子發生反應的程度。此方法較佳用於監測投與本發明抗體之療法。
本發明係關於一種分離之人類抗體分子，其
a)可結合人類IGF-1及IGF-2，以便
i)　防止IGF-1及IGF-2與IGF-1受體結合，及
ii)　抑制IGF-1受體介導之信號傳導，
b)可結合鼠類及大鼠IGF-1及IGF-2，
c)不結合人類胰島素；
其中該抗體分子係選自包含以下之群：
i)　重鏈CDR包含SEQ ID NO:1(CDR1)、SEQ ID NO:2(CDR2)及SEQ ID NO:3(CDR3)之胺基酸序列且輕鏈CDR包含SEQ ID NO:4(CDR1)、SEQ ID NO:5(CDR2)及SEQ ID NO:6(CDR3)之胺基酸序列的抗體分子；
ii)　重鏈CDR包含SEQ ID NO:11(CDR1)、SEQ ID NO:12(CDR2)及SEQ ID NO:13(CDR3)之胺基酸序列且輕鏈CDR包含SEQ ID NO:14(CDR1)、SEQ ID NO:15(CDR2)及SEQ ID NO:16(CDR3)之胺基酸序列的抗體分子；
iii)　重鏈CDR包含SEQ ID NO:21(CDR1)、SEQ ID NO:22(CDR2)及SEQ ID NO:23(CDR3)之胺基酸序列且輕鏈CDR包含SEQ ID NO:24(CDR1)、SEQ ID NO:25(CDR2)及SEQ ID NO:26(CDR3)之胺基酸序列的抗體分子。
抗體之結合係定義為經由非共價鍵發生的相互作用，該等非共價鍵使抗原(或結構上相似之蛋白質或其片段)佔據抗體結合位點，亦即與適當抗原(或結構上相似的蛋白質)之決定子結合之免疫球蛋白區域。
親和力(亦即抗體上之單個抗原結合位點與單個抗原決定基之間的相互作用)係藉由結合常數KA =kass /kdiss 或解離常數KD =kdiss /kass 表示。
根據a)，抗體以約0.2nM至約2nM範圍內之KD 值之親和力，尤其以約0.8nM之親和力結合各種IGF蛋白，如藉由表面電漿共振分析所測定。基於此性質實現IGF功能信號傳導之中和。
根據c)，在為結合人類IGF-1或IGF-2所需之最小濃度之至少100倍的濃度下，抗體不結合人類胰島素。
c)中定義之抗IGF抗體分子之性質可如下表徵：抗IGF抗體分子對IGF-1及IGF-2之親和力分別為其對胰島素之親和力的至少100倍及甚至1000倍以上。若不能完全排除弱結合，則抗IGF抗體分子在治療性劑量下不結合胰島素，即使在極高劑量(例如超過100mg/kg)下。
本發明之抗體分子不影響人類胰島素藉由與胰島素受體結合所介導之促有絲分裂性質。(一般而言，促有絲分裂性質係定義為化合物能夠促進細胞開始細胞分裂、從而觸發有絲分裂，例如就胰島素而言，其能夠促進細胞生長)。
本發明之抗體除能夠抑制經由IGF-1受體介導之IGF信號傳導之外，亦能夠抑制經由胰島素受體IR-A介導之IGF-2信號傳導。
在下文中，可結合人類IGF-1及IGF-2之本發明抗體分子係稱為「抗IGF抗體分子」。
術語「抗IGF抗體分子」涵蓋人類抗IGF抗體、抗IGF抗體片段、類抗IGF抗體分子及任何上述抗體分子之結合物。抗體在本發明中之含義中包括(但不限於)單株抗體、嵌合單株抗體及雙特異性或多特異性抗體。術語「抗體」涵蓋由淋巴細胞產生且例如存在於血清中之完整免疫球蛋白、由融合瘤細胞株分泌之單株抗體、由宿主細胞中重組表現產生的具有免疫球蛋白或單株抗體之結合特異性之多肽，及來源於該等免疫球蛋白、單株抗體或多肽、經進一步加工且同時保持其結合特異性之分子。
詳言之，術語「抗體分子」較佳包括包含兩個重鏈及兩個輕鏈之完全人類完整免疫球蛋白。
在另一態樣中，抗體分子為具有抗原結合區之抗IGF抗體片段。為獲得抗體片段(例如Fab片段)，可藉助於常規技術(例如使用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)進行消化。木瓜蛋白酶消化之實例係描述於WO 94/29348及US 4,342,566中。木瓜蛋白酶消化抗體通常產生兩個各自具有單個抗原結合位點的相同抗原結合片段(所謂Fab片段)，及殘餘Fc片段。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原結合位點且仍然能與抗原交聯之F(ab')2 片段。抗體片段亦可由產生相應編碼DNA片段之分子生物學方法生成。
Fab片段亦含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(CH1 )。Fab'片段不同於Fab片段之處在於，其在重鏈CH1 域之羧基末端含有其他殘基，包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。Fab'-SH在本文中係指其中恆定域之半胱胺酸殘基帶有游離硫醇基之Fab'。F(ab')2 抗體片段最初呈其間具有鉸鏈半胱胺酸的Fab'片段對之形式產生。
結合抗原之抗體片段或類抗體分子(包括單鏈抗體及線性抗體，如Zapata等人，1995中所述)可在單一多肽上包含單獨之可變區或與以下之整體或一部分組合之可變區：輕鏈之恆定域、CH1、鉸鏈區、CH2及CH3域，例如所謂「SMIP」(「小模組免疫藥物(Small Modular Immunopharmaceutical)」)，其為採用單一多肽鏈作為其結合域Fv之類抗體分子，該單一多肽鏈連接至單鏈鉸鏈區及缺少恆定域CH1之效應域(WO 02/056910)。SMIP可呈單體或二聚體形式製備，但其並不呈現傳統抗體之二聚體之二聚體結構。本發明亦包括包含可變區與輕鏈之恆定域區、VH1、CH1、鉸鏈區、CH2及CH3域之任何組合的抗原結合片段。
只要抗體片段或類抗體分子顯示與IGF-1/IGF-2抗原之相關部分特異性結合，則該等抗體片段或類抗體分子可含有恆定區之全部或僅一部分。若不需要諸如補體結合或抗體依賴型細胞毒性之效應功能，則選擇恆定區類型及長度主要視抗體蛋白之所需藥理學性質而定。抗體分子通常為由兩個輕鏈/重鏈對組成之四聚體，但亦可為二聚體，亦即由一個輕鏈/重鏈對組成之二聚體，例如Fab或Fv片段，或其可為單體單鏈抗體(scFv)。
類抗IGF抗體分子亦可為單域抗體(例如所謂「奈米抗體」)，其在類單Ig域中包含抗原結合位點(描述於例如WO 03/050531及Revets等人，2005中)。類抗體分子之其他實例為免疫球蛋白超家族抗體(IgSF；Srinivasan及Roeske,2005)或含有CDR或CDR移植之分子或「域抗體」(dAb)。dAB為抗體之功能結合單位，相當於人類抗體重鏈可變區(VH)或輕鏈可變區(VL)。域抗體具有約13 kDa之分子量或小於完整抗體尺寸之十分之一。已開發出一系列大型且功能齊全的完全人類VH及VL dAb文庫。dAB亦可用於「雙重靶向」，亦即除IGF-1/IGF-2外，dAb亦可結合一個分子中之另一標靶。dAb文庫、選擇及篩檢方法、用於雙重靶向及延長血清半衰期之dAb形式描述於例如US 6,696,245、WO 04/058821、WO 04/003019及WO 03/002609中。
一般而言，抗體片段及類抗體分子較好地表現於細菌、酵母及哺乳動物細胞系統中。
在一個較佳實施例中，如上文i)中所定義之本發明抗體分子具有包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列(此序列可在其C末端含有額外的Gln。根據Kabat編號方案，此胺基酸位置可視為可變區之C末端，或者，根據序列表中之序列，其可表示恆定輕鏈的第一個胺基酸，參見SEQ ID NO:34)的可變輕鏈。
可變重鏈包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列且可變輕鏈包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列的抗體較佳具有IgG1恆定重鏈區。該抗體較佳具有Igλ恆定輕鏈區。該抗體較佳為命名為60814之抗體，其具有包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列的重鏈恆定區及包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列的輕鏈恆定區。命名為60814之抗體的完整胺基酸序列描述於SEQ ID NO:35(重鏈)及SEQ ID NO:36(輕鏈)中。
在另一個較佳實施例中，如上文ii)中所定義之本發明抗體分子具有包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列(此序列可在其C末端含有額外的Gln。根據Kabat編號方案，此胺基酸位置可視為可變區之C末端，或者，根據序列表中之序列，其可表示恆定輕鏈的第一個胺基酸，參見SEQ ID NO:34)的可變輕鏈。
可變重鏈包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列且可變輕鏈包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列的抗體較佳具有IgG1恆定重鏈區。該抗體較佳具有Igλ恆定輕鏈區。該抗體較佳為命名為60819之抗體，其具有包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列的重鏈恆定區及包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列的輕鏈恆定區。命名為60819之抗體的完整胺基酸序列描述於SEQ ID NO:37(重鏈)及SEQ ID NO:38(輕鏈)中。
在另一個較佳實施例中，如上文iii)中所定義之本發明抗體具有包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列(此序列可在其C末端含有額外的Gln。根據Kabat編號方案，此胺基酸位置可視為可變區之C末端，或者，根據序列表中之序列，其可表示恆定輕鏈的第一個胺基酸，參見SEQ ID NO:34)的可變輕鏈。
可變重鏈包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列且可變輕鏈包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列的抗體較佳具有IgG1恆定重鏈區。該抗體較佳具有Igλ恆定輕鏈區。該抗體較佳為命名為60833之抗體，其具有包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列的重鏈恆定區及包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列的輕鏈恆定區。命名為60833之抗體的完整胺基酸序列描述於SEQ ID NO:39(重鏈)及SEQ ID NO:40(輕鏈)中。
本發明抗體與鼠類及大鼠IGF-1交叉反應可容許檢查其在此等物種中的內分泌影響，例如對生長激素路徑的影響。由於大鼠為較佳用於藥物開發以研究毒理學效應的優良動物模型，因此可與大鼠IGF交叉反應尤其有利。
可能由於移除游離IGF-1引起經由生長激素路徑反饋調節、導致肝臟分泌IGF-1增加，因此所觀察到的抗體對總IGF-1含量之藥效學效應為適用之藥效學標記。在動物物種中利用該標記(容許在藥物開發早期判定劑量/效應關係)有助於準備I期臨床研究，其中除PK分析之外，亦監測患者對總IGF-1含量的藥效學反應。
本發明之抗IGF抗體分子亦可為序列表中所示之胺基酸序列所定義之抗體的變異體。因此，本發明亦包含作為具有上文a)至c)所定義之特徵之此等多肽變異體的抗體。熟習此項技術者使用常用技術將可製備、測試及使用抗體60814、60819及60833之功能性變異體。實例為CDR及/或構架中至少一個位置改變之變異抗體；構架區中存在與生殖系序列不符之單胺基酸取代之變異抗體；具有保守胺基取代之抗體；由在嚴格條件下與序列表中所述之編碼60814、60819或60833抗體鏈可變區之DNA分子雜交之DNA分子所編碼之抗體；60814、60819及60833之功能上等效之密碼子最優化變異體。
亦可藉由使用本發明之抗體作為最優化之起始點且改變一或多個胺基酸殘基，較佳改變一或多個CDR中之胺基酸殘基並針對性質改良之變異體篩檢所得抗體變異體群來獲得變異體。尤其較佳為改變可變輕鏈之CDR3、可變重鏈之CDR3、可變輕鏈之CDR1及/或可變重鏈之CDR2中的一或多個胺基酸殘基。可藉由此項技術中已知之方法進行改變，例如WO 2007/042309中提及之所謂TRIM技術。
在給定個別胺基酸性質的情況下，可進行合理取代以獲得保留抗體60814、60819或60833整體分子結構之抗體變異體。胺基酸取代(意即「保守取代」)可例如基於各別胺基酸之極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性及/或兩性性質之相似性進行。熟習此項技術者熟知通常實施之胺基酸取代(例如WO 2007/042309中所描述)及獲得如此經修飾之抗體的方法。在給定遺傳密碼子與重組及合成DNA技術的情況下，可常規地設計編碼具有一或多個保守胺基酸交換之變異抗體的DNA分子且容易獲得各別抗體。
較佳抗體變異體在可變區中具有至少60%，更佳至少70%或80%，仍更佳至少90%且最佳至少95%之序列一致性。較佳抗體在可變區中亦具有至少80%，更佳為90%且最佳為95%之序列相似性。
(兩個多肽序列間之「序列一致性」表示兩個序列間相同胺基酸的百分比。「序列相似性」表示相同胺基酸的百分比或顯示保守胺基酸取代之胺基酸的百分比。)
在另一個實施例中，本發明之抗IGF抗體分子為「親和力成熟」抗體。
「親和力成熟」抗IGF抗體為來源於親本抗IGF抗體(例如60814、60819或60833)的抗IGF抗體，其在一或多個CDR中具有一或多個變異或其中一或多個完整CDR已置換，引起對抗原之親和力改良(與各別親本抗體相比)。產生該等抗體突變體之程序之一包括噬菌體呈現(Hawkins等人，1992及Lowman等人，1991)。簡言之，使多個高變區位點(例如6-7個位點)發生突變以在各位點產生所有可能之胺基酸取代。如此所產生之抗體突變體以單價方式、以與封裝於各粒子中之M13之基因III產物之融合體形式自絲狀噬菌體粒子中呈現。接著如本文所揭示，針對突變體之生物活性(例如結合親和力)篩檢噬菌體呈現之突變體。
亦可藉由以下文獻中所述之方法產生親和力成熟抗體：例如Marks等人，1992(藉由可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)改組進行親和力成熟)；或Barbas等人，1994；Shier等人，1995；Yelton等人，1995；Jackson等人，1995及Hawkins等人，1992(CDR及/或構架殘基之隨機突變誘發)。較佳親和力成熟抗體將具有針對靶抗原之極高親和力，例如低皮莫耳濃度。
本發明亦關於編碼本發明抗IGF抗體分子之DNA分子。此等序列包括(但不限於)如序列表中所示之編碼抗體60814、60819及60833之彼等DNA分子：分別編碼抗體60814重鏈可變區及輕鏈可變區之SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:9；分別編碼抗體60819重鏈可變區及輕鏈可變區之SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:19；分別編碼抗體60833重鏈可變區及輕鏈可變區之SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:29。
編碼可變輕鏈之SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:19及29中所示之序列可在其3'端含有額外的Gln密碼子。
因此，本發明亦關於可在高嚴格度之結合及洗滌條件(如WO 2007/042309中所定義)下與序列表中所述之DNA分子雜交的核酸分子，其中該等核酸分子編碼具有等效於或優於抗體60814、60819或60833之性質的抗體或其功能片段。較佳分子(自mRNA角度)為與本文所述之DNA分子之一具有至少75%或80%(較佳至少85%，更佳至少90%且最佳至少95%)同源性或序列一致性之彼等分子。
屬於本發明範疇內之又一類DNA變異體可參照其編碼之多肽來定義。此等DNA分子就其序列而言有別於序列表中所述之彼等序列(分別為SEQ ID NO:7、17及27，或9、19、29)，但由於遺傳密碼之簡並，此等DNA分子分別編碼之抗體具有抗體60814、60819或60833之相同胺基酸序列。舉例而言，由於在真核細胞中表現抗體60814、60819或60833，編碼可變輕鏈之最後三個胺基酸的最後九個核苷酸可分別設計成匹配真核細胞所用密碼子。若需要在大腸桿菌中表現抗體，則可改變此等序列以匹配大腸桿菌所用密碼子。
本發明之DNA分子變異體可以WO 2007/042309中所述之多種不同方法建構。
產生本發明之重組抗IGF抗體分子時，將編碼全長輕鏈(在抗體60814的情況下，序列包含SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:33)及重鏈(在抗體60814的情況下，序列包含SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:31)之DNA分子(cDNA及/或基因組DNA)或其片段插入表現載體內以使得序列可操作地連接至轉錄及轉譯控制序列。在抗體60819的情況下，序列分別為SEQ ID NO:19與SEQ ID NO:33以及SEQ ID NO:17與SEQ ID NO:31之彼等序列；在抗體60833的情況下，序列分別為SEQ ID NO:29與SEQ ID NO:33以及SEQ ID NO:27與SEQ ID NO:31之彼等序列。
製造本發明之抗體時，熟習此項技術者可自此項技術中熟知之多種表現系統(例如Kipriyanow及Le Gall,2004所評述之彼等表現系統)中選擇。
表現載體包括質體、反轉錄病毒、黏質體、來源於EBV之游離基因體及其類似物。表現載體及表現控制序列經選擇可與宿主細胞相容。可將抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因插入獨立載體中。在某些實施例中，將兩種DNA序列插入同一表現載體中。適宜之載體為編碼功能完整之人類CH(重鏈恆定區)或CL(輕鏈恆定區)免疫球蛋白序列之彼等載體，其中限制性位點經適當工程改造以使任何VH(重鏈可變區)或VL(輕鏈可變區)序列可如上所述容易插入及表現。在抗體具有60814、60819及60833之可變區的情況下，對於抗體輕鏈而言，恆定鏈通常為κ或λ鏈，對於抗體重鏈而言，其可為(不限於)任何IgG同型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)或其他免疫球蛋白(包括對偶基因變異體)。
重組表現載體亦可編碼促進宿主細胞分泌抗體鏈之信號肽。編碼抗體鏈之DNA可選殖於載體中以使信號肽同框連接至成熟抗體鏈DNA之胺基端。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或非免疫球蛋白之異源肽。或者，編碼抗體鏈之DNA序列可已含有信號肽序列。
除抗體鏈DNA序列外，重組表現載體含有調控序列，包括啟動子、強化子、終止及聚腺苷酸化信號及其他控制宿主細胞中抗體鏈表現之表現控制元件。啟動子序列之實例(針對在哺乳動物細胞中表現來例示)為來源於CMV之啟動子及/或強化子(諸如CMV猿猴病毒40(SV40)啟動子/強化子)、來源於腺病毒之啟動子及/或強化子(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))、多形瘤及強哺乳動物啟動子(諸如原生免疫球蛋白及肌動蛋白啟動子)。聚腺苷酸化信號之實例為BGH聚腺苷酸化信號、SV40晚期或早期聚腺苷酸化信號；或者，可使用免疫球蛋白基因等之3' UTR。
重組表現載體亦可含有調控宿主細胞中載體複製之序列(例如複製起點)及可選擇之標記基因。編碼抗IGF抗體重鏈或其抗原結合部分及/或抗IGF抗體輕鏈或其抗原結合部分之核酸分子及包含此等DNA分子之載體可根據此項技術中熟知之轉染方法(包括脂質體介導之轉染、聚陽離子介導之轉染、原生質體融合、顯微注射、磷酸鈣沈澱、電穿孔法或藉由病毒載體轉移)引入宿主細胞(例如細菌細胞或高等真核細胞，例如哺乳動物細胞)中。
編碼重鏈及輕鏈之DNA分子較佳存在於兩個共轉染至宿主細胞(較佳為哺乳動物細胞)中之載體中。
可用作表現宿主之哺乳動物細胞株在此項技術中已熟知且尤其包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0、SP2/0細胞、海拉細胞(HeLa cell)、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類癌細胞(例如Hep G2及A-549細胞)、3T3細胞或任何該類細胞株之衍生物/子代。可使用其他哺乳動物細胞，包括(但不限於)人類、小鼠、大鼠、猴及齧齒動物細胞株，或其他真核細胞，包括(但不限於)酵母、昆蟲及植物細胞，或諸如細菌之原核細胞。藉由將宿主細胞培養足以使抗體分子在宿主細胞中表現之時間來產生本發明之抗IGF抗體分子。
抗體分子較佳作為分泌型多肽自培養基中回收，或若例如表現時無分泌信號，則其可自宿主細胞溶胞物中回收。必須使用重組蛋白及宿主細胞蛋白所用之標準蛋白質純化方法、以獲得實質上均質之抗體製劑的方式純化抗體分子。舉例而言，適用於獲得本發明抗IGF抗體分子之最新純化方法包括自培養基或溶胞物中移除細胞及/或微粒細胞碎片作為第一步驟。接著自污染之可溶蛋白質、多肽及核酸中純化抗體，例如在免疫親和或離子交換管柱上部分分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、葡聚糖凝膠層析(Sephadex chromatography)、在二氧化矽或陽離子交換樹脂上層析。在獲得抗IGF抗體分子製劑之過程中，作為最後步驟，可如下所述乾燥(例如凍乾)純化之抗體分子以用於治療應用。
在另一態樣中，本發明係關於一種醫藥組合物，其含有本發明之抗IGF抗體分子、較佳完全抗體作為活性成份。
為在治療中使用，將抗IGF抗體分子包括於適當醫藥組合物中以便於投與動物或人類。典型之抗IGF抗體分子調配物可藉由使抗IGF抗體分子與生理學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合而製備為凍乾或其他乾燥調配物或水溶液或水性或非水性懸浮液之形式。在所用劑量及濃度下，載劑、賦形劑、調節劑或穩定劑係無毒的。其包括緩衝系統，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽及其他無機或有機酸及其鹽；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑，諸如氯化十八烷基二甲基苄基銨、氯化六甲季銨、氯化苯甲烴銨、苄索氯銨(benzethonium chloride)、苯酚、丁醇或苄醇、對羥基苯甲酸烷基酯(諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯)、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間甲酚；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮或聚乙二醇(PEG)；胺基酸，諸如甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣、寡醣或多醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、糊精或葡聚糖；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露醇或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)及/或離子或非離子界面活性劑，諸如TWEENTM (聚山梨醇酯)、PLURONICSTM 或脂肪酸酯、脂肪酸醚或糖酯。抗體調配物亦可含有諸如乙醇或異丙醇之有機溶劑。賦形劑亦可具有釋放調節或吸收調節功能。
抗IGF抗體分子亦可乾燥(冷凍乾燥、噴霧乾燥、噴霧冷凍乾燥、藉由近臨界或超臨界氣體乾燥、真空乾燥、風乾)、沈澱或結晶，或截留於微膠囊(分別使用例如羥基甲基纖維素或明膠及聚(甲基丙烯酸甲酯)、例如藉由凝聚技術或界面聚合而製得)中、於膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中、於巨乳液中，或沈澱或固著於載劑或表面上，例如pcmc技術(蛋白質包被微晶(protein coated microcrystal))。該等技術揭示於Remington,2005中。
用於活體內投藥之調配物當然必須為無菌的；可藉由習知技術(例如經由無菌過濾膜過濾)實現滅菌。
增大抗IGF抗體之濃度可用於達成所謂的高濃度液體調配物(HCLF)；各種產生該等HCLF之方法已有描述。
抗IGF抗體分子亦可含於持續釋放型製劑中。該等製劑包括疏水或親水聚合物之固體、半固體或液體基質，且可呈成形製品之形式(例如膜、藥捲或微膠囊)且可經施藥裝置施加。持續釋放型基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯或蔗糖乙酸丁酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(US 3,773,919)、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOTTM (由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)構成的可注射微球體))及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。儘管諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚合物能夠釋放分子超過100天，但某些水凝膠在更短時期內釋放蛋白質。當囊封抗體長時間留於體內時，其因在37℃下暴露於水分而會變性或聚集，導致生物活性損失及可能之免疫原性變化。視所涉及機制而定，可設計合理策略來實現穩定化。舉例而言，若發現聚集機制為經由硫基-二硫化物互換形成分子間S-S鍵，則可藉由修飾氫硫基殘基、由酸性溶液凍乾(例如WO 89/011297中所述)、控制水分含量、使用適當添加劑及形成特定聚合物基質組合物來達成穩定。
US 7,060,268及US 6,991,790中描述的調配物亦可用於本發明抗IGF抗體分子。
IGF抗體分子亦可併入其他施藥形式，諸如分散液、懸浮液或脂質體、錠劑、膠囊、散劑、噴霧劑、有或無滲透增強裝置之經皮或皮內貼片或乳膏、糯米紙、鼻內、頰內或肺部調配物，或可藉由植入之細胞產生，或在基因治療後藉由個體自身細胞產生。
抗IGF抗體亦可用化學基團(諸如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基或碳水化合物基團)衍生化。該等基團可適用於改進抗體之生物學特徵，例如延長血清半衰期或增加組織結合。
較佳施藥模式為非經腸(靜脈內、肌內、皮下、腹膜內、皮內)輸注或注射，但其他施藥模式(諸如吸入、經皮、鼻內、頰內、經口)亦可適用。
在一個較佳實施例中，本發明之醫藥組合物含有10mg/ml濃度之抗IGF抗體(例如抗體60814、60819或60833)且進一步包含25mM檸檬酸鈉pH 6、115mM NaCl、0.02% Tween(聚山梨醇酯20)。
預防或治療疾病時，抗體之適當劑量將視以下因素而定：欲治療之疾病類型、疾病之嚴重程度及病程、抗體投與係出於預防或治療目的、先前療法、患者臨床病史及對抗體之反應及主治醫師之判斷。抗體宜一次性或經一系列治療而投與患者。
視疾病之類型及嚴重程度而定，無論例如經一或多次分開投與或連續輸注，約1μg/kg至20mg/kg(例如0.1mg/kg-15mg/kg)抗體為向患者投與之最初候選劑量。視上述因素而定，典型治療進度通常包括以約0.1μg/kg至約20mg/kg或20mg/kg以上範圍內之劑量每週投與抗體一次至每三週投與一次。該療法之進程易由習知技術及檢定監測。
欲投與之抗體之「治療有效量」為預防、改善或治療疾病或病症所需之最低量。
本發明之抗IGF抗體分子及含有其之醫藥組合物適用於治療過度增生病症。
在某些實施例中，過度增生病症為癌症。
癌症係依兩種方式分類：癌症發生之組織之類型(組織類型)及癌症首先發生之原發部位或體內位置。癌症發生之最常見部位包括皮膚、肺、乳房、前列腺、結腸及直腸、子宮頸及子宮。
本發明之抗IGF抗體分子適用於治療各種癌症，包括(但不限於)以下各種癌症：
●AIDS相關之癌症，諸如卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)；
●骨相關癌症，諸如尤文氏家族之腫瘤及骨肉瘤；
●腦相關癌症，諸如成人腦瘤、幼年期腦幹神經膠質瘤、幼年期小腦星形細胞瘤、幼年期大腦星形細胞瘤/惡性神經膠質瘤、幼年期室管膜瘤、幼年期神經管胚細胞瘤、幼年期幕上原始神經外胚層瘤、幼年期視路及下丘腦神經膠質瘤及其他幼年期腦瘤；
●乳癌；
●消化道/胃腸相關癌症，諸如肛門癌、肝外膽管癌、胃腸類癌瘤、膽管癌、結腸癌、食道癌、膽囊癌、成人原發性肝癌(肝細胞癌、肝母細胞瘤)、幼年期肝癌、胰臟癌、直腸癌、小腸癌及胃癌；
‧內分泌相關癌症，諸如腎上腺皮質癌、胃腸類癌瘤、胰島細胞癌(內分泌胰臟)、甲狀旁腺癌、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤及甲狀腺癌；
‧眼睛相關癌症，諸如眼內黑色素瘤及視網膜母細胞瘤；
‧泌尿生殖器相關癌症，諸如膀胱癌、腎臟(腎細胞)癌、陰莖癌、前列腺癌、移行細胞腎盂及輸尿管癌、睾丸癌、尿道癌、威爾姆氏腫瘤(Wilms' tumour)及其他幼年期腎臟腫瘤；
‧生殖細胞相關癌症，諸如幼年期顱外生殖細胞瘤、性腺外生殖細胞瘤、卵巢生殖細胞瘤及睾丸癌；
‧婦科癌症，諸如子宮頸癌、子宮內膜癌、妊娠滋養母細胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖細胞瘤、低惡性潛在卵巢瘤(ovarian low malignant potential tumour)、子宮肉瘤、陰道癌及陰門癌；
‧頭頸相關癌症，諸如下嚥癌、喉癌、唇及口腔癌、原發隱匿之轉移性鱗狀頸癌、鼻咽癌、口咽癌、鼻副竇及鼻腔癌、甲狀旁腺癌及唾液腺癌；
‧血液學/血液相關癌症，諸如白血病，諸如成人急性淋巴母細胞白血病、幼年期急性淋巴母細胞白血病、成人急性骨髓白血病、幼年期急性骨髓白血病、慢性淋巴細胞白血病、慢性骨髓性白血病及毛細胞白血病；及淋巴瘤，諸如AIDS相關淋巴瘤、皮膚T-細胞淋巴瘤、成人霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、幼年期霍奇金氏淋巴瘤、妊娠期間霍奇金氏淋巴瘤、蕈樣真菌病、成人非霍奇金氏淋巴瘤、幼年期非霍奇金氏淋巴瘤、妊娠期間非霍奇金氏淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、西紮利症候群(Sezary syndrome)、皮膚T-細胞淋巴瘤及華氏巨球蛋白血症(Waldenstrm's macroglobulinemia)及其他血液學/血液相關癌症，諸如慢性骨髓增生病症、多發性骨髓瘤/漿細胞瘤、骨髓發育不良症候群及骨髓發育不良/骨髓增生病；
●肌肉骨骼相關癌症，諸如尤文氏家族腫瘤、骨肉瘤、骨惡性纖維組織細胞瘤、幼年期橫紋肌肉瘤、成人軟組織肉瘤、幼年期軟組織肉瘤及子宮肉瘤；血管瘤及血管肉瘤；
●神經相關癌症，諸如成人腦瘤、幼年期腦瘤、腦幹神經膠質瘤、小腦星形細胞瘤、大腦星形細胞瘤/惡性神經膠質瘤、室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、幕上原始神經外胚層瘤、視路及下丘腦神經膠質瘤及其他腦瘤，諸如神經母細胞瘤、垂體瘤及原發性中樞神經系統淋巴瘤；
●呼吸/胸相關癌症，諸如非小細胞肺癌、小細胞肺癌、惡性間皮瘤、胸腺瘤及胸腺癌；
●皮膚相關癌症，諸如皮膚T-細胞淋巴瘤、卡波西氏肉瘤、黑色素瘤、梅克爾細胞癌(Merkel cell carcinoma)及皮膚癌。
詳言之，本發明之抗IGF抗體分子及含彼等之醫藥組合物有利於治療以下癌症：造血系統之癌症，包括白血病、淋巴瘤及骨髓瘤；胃腸道之癌症，包括食道癌、胃癌、結腸直腸癌、胰臟癌、肝癌及膽囊癌與膽管癌；腎臟癌、前列腺癌及膀胱癌；婦科癌，包括乳房癌、卵巢癌、子宮頸癌及子宮內膜癌；皮膚癌及頭頸癌，包括惡性黑色素瘤；兒科癌症，諸如威爾姆氏腫瘤、神經母細胞瘤及尤文氏肉瘤；腦癌，諸如神經膠母細胞瘤；肉瘤，諸如骨肉瘤、軟組織肉瘤、橫紋肌肉瘤、血管肉瘤；肺癌、間皮瘤及甲狀腺癌。
在另一個實施例中，抗IGF抗體分子及含彼等之醫藥組合物適用於非癌性過度增生病症，諸如(但不限於)牛皮癬及血管成形術後再狹窄。另外，根據最近的觀察結果(Reinberg,2008)：減小IGF-1活性之基因突變對於壽命具有正效應，本發明抗體當在治療中施用於成人時具有適用於減緩衰老及預防年齡相關疾病的潛能。
視欲治療之病症而定，本發明之抗IGF抗體分子可單獨或與一或多種其他治療劑(尤其選自DNA損傷劑或抑制癌細胞中血管生成、信號轉導路徑或有絲分裂檢查點之治療活性化合物)組合使用。
其他治療劑可視情況作為相同醫藥製劑之組份、在投與抗IGF抗體分子同時或之前或之後投與。
在某些實施例中，其他治療劑可為(但不限於)一或多種選自以下群組之抑制劑：EGFR、VEGFR、HER2-neu、AuroraA、AuroraB、PLK及PI3激酶、FGFR、PDGFR、Raf、KSP或PDK1之抑制劑。
其他治療劑之其他實例為CDK、Akt、src/bcr-abl、cKit、cMet/HGF、c-Myc、Flt3、HSP90之抑制劑、刺蝟(hedgehog)拮抗劑、JAK/STAT抑制劑、Mek、mTor、NFKB、蛋白酶體、Rho、wnt信號傳導抑制劑或泛素化路徑抑制劑。
Aurora抑制劑之實例為(但不限於)PHA-739358、AZD-1152、AT-9283、CYC-116、R-763、VX-667、MLN-8045、PF-3814735、SNS-314、VX-689、GSK-1070916、TTP-607、PHA-680626、MLN-8237及ENMD-2076。
PLK抑制劑之實例為GSK-461364。
raf抑制劑之實例為BAY-73-4506(亦為VEGFR抑制劑)、PLX-4032、RAF-265(亦為VEGFR抑制劑)、索拉非尼(Sorafenib)(亦為VEGFR抑制劑)、XL-281及Nevavar(亦為VEGFR抑制劑)。
KSP抑制劑之實例為伊斯平斯(ispinesib)、ARRY-520、AZD-4877、CK-1122697、GSK-246053A、GSK-923295、MK-0731、SB-743921、LY-2523355及EMD-534085。
src及/或bcr-abl抑制劑之實例為達沙替尼(dasatinib)、AZD-0530、伯舒替尼(bosutinib)、XL-228(亦為IGF-1R抑制劑)、尼羅替尼(nilotinib)(亦為PDGFR及cKit抑制劑)、伊馬替尼(imatinib；亦為cKit抑制劑)、NS-187、KX2-391、AP-24534(亦為EGFR、FGFR、Tie2、Flt3之抑制劑)、KM-80及LS-104(亦為F1t3、Jak2之抑制劑)。
PDK1抑制劑之實例為AR-12。
Rho抑制劑之實例為BA-210。
PI3激酶抑制劑之實例為PX-866、PX-867、BEZ-235(亦為mTor抑制劑)、XL-147、XL-765(亦為mTor抑制劑)、BGT-226、CDC-0941、GSK-1059615。
cMet或 HGF抑制劑之實例為XL-184(亦為VEGFR、cKit、Flt3之抑制劑)、PF-2341066、MK-2461、XL-880(亦為VEGFR抑制劑)、MGCD-265(亦為VEGFR、Ron、Tie2之抑制劑)、SU-11274、PHA-665752、AMG-102、AV-299、ARQ-197、MetMAb、CGEN-241、BMS-777607、JNJ-38877605、PF-4217903、SGX-126、CEP-17940、AMG-458、INCB-028060及E-7050。
c-Myc抑制劑之實例為CX-3543。
Flt3抑制劑之實例為AC-220(亦為cKit及PDGFR之抑制劑)、KW-2449、LS-104(亦為bcr-abl及Jak2之抑制劑)、MC-2002、SB-1317、來他替尼(lestaurtinib)(亦為VEGFR、PDGFR、PKC之抑制劑)、TG-101348(亦為JAK2抑制劑)、XL-999(亦為cKit、FGFR、PDGFR及VEGFR之抑制劑)、舒尼替尼(sunitinib)(亦為PDGFR、VEGFR及cKit之抑制劑)及坦度替尼(tandutinib)(亦為PDGFR及cKit之抑制劑)。
HSP90抑制劑之實例為坦螺旋黴素(tanespimycin)、阿螺旋黴素(alvespimycin)、IPI-504、STA-9090、MEDI-561、AUY-922、CNF-2024及SNX-5422。
JAK/STAT抑制劑之實例為CYT-997(亦與微管蛋白相互作用)、TG-101348(亦為Flt3抑制劑)及XL-019。
Mek抑制劑之實例為ARRY-142886、AS-703026、PD-325901、AZD-8330、ARRY-704、RDEA-119及XL-518。
mTor抑制劑之實例為雷帕黴素(rapamycin)、西羅莫司(temsirolimus)、德羅莫司(deforolimus)(亦充當VEGF抑制劑)、依維莫司(everolimus)(亦為VEGF抑制劑)、XL-765(亦為PI3激酶抑制劑)及BEZ-235(亦為PI3激酶抑制劑)。
Akt抑制劑之實例為哌立福新(perifosine)、GSK-690693、RX-0201及曲西立濱(triciribine)。
cKit抑制劑之實例為馬賽替尼(masitinib)、OSI-930(亦充當VEGFR抑制劑)、AC-220(亦為Flt3及PDGFR之抑制劑)、坦度替尼(亦為Flt3及PDGFR之抑制劑)、阿西替尼(axitinib)(亦為VEGFR及PDGFR之抑制劑)、舒尼替尼(亦為Flt3、PDGFR、VEGFR之抑制劑)及XL-820(亦充當VEGFR及PDGFR之抑制劑)、伊馬替尼(亦為bcr-abl抑制劑)、尼羅替尼(nilotinib)(亦為bcr-abl及PDGFR之抑制劑)。
刺蝟拮抗劑之實例為IPI-609、CUR-61414、GDC-0449、IPI-926及XL-139。
CDK抑制劑之實例為賽立西尼(seliciclib)、AT-7519、P-276、ZK-CDK(亦為VEGFR2及PDGFR之抑制劑)、PD-332991、R-547、SNS-032、PHA-690509、PHA-848125及SCH-727965。
蛋白酶體抑制劑/NFκB路徑抑制劑之實例為硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib)、NPI-0052、CEP-18770、MLN-2238、PR-047、PR-957、AVE-8680及SPC-839。
泛素化路徑抑制劑之實例為HBX-41108。
抗血管生成劑之實例為FGFR、PDGFR及VEGF(R)之抑制劑及沙力度胺(thalidomide)，該等藥劑選自(不限於)貝伐株單抗(bevacizumab)、莫特沙尼(motesanib)、CDP-791、SU-14813、替拉替尼(telatinib)、KRN-951、ZK-CDK(亦為CDK抑制劑)、ABT-869、BMS-690514、RAF-265、IMC-KDR、IMC-18F1、IMiDs、沙力度胺、CC-4047、來那度胺(lenalidomide)、ENMD-0995、IMC-D11、Ki-23057、博瑞拉尼(brivanib)、西地尼布(cediranib)、1B3、CP-868596、IMC-3G3、R-1530(亦為Flt3抑制劑)、舒尼替尼(亦為cKit及Flt3之抑制劑)、阿西替尼(亦為cKit抑制劑)、來他替尼(亦為Flt3及PKC之抑制劑)、瓦他拉尼(vatalanib)、坦度替尼(亦為Flt3及cKit之抑制劑)、帕唑帕尼(pazopanib)、PF-337210、阿非博賽(aflibercept)、E-7080、CHIR-258、索拉非尼甲苯磺酸鹽(亦為Raf抑制劑)、凡德他尼(vandetanib)、CP-547632、OSI-930、AEE-788(亦為EGFR及Her2之抑制劑)、BAY-57-9352(亦為Raf抑制劑)、BAY-73-4506(亦為Raf抑制劑)、XL-880(亦為cMet抑制劑)、XL-647(亦為EGFR及EphB4之抑制劑)、XL-820(亦為cKit抑制劑)、尼羅替尼(亦為cKit及brc-abl之抑制劑)、CYT-116、PTC-299、BMS-584622、CEP-11981、多韋替尼(dovitinib)、CY-2401401及ENMD-2976。
其他治療劑亦可選自EGFR抑制劑，其可為小分子EGFR抑制劑或抗EGFR抗體。抗EGFR抗體之實例為(不限於)西妥昔單抗(cetuximab)、盤尼圖單抗(panitumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、紮魯突木單抗(zalutumumab)；小分子EGFR抑制劑之實例為吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)及凡德他尼(亦為VEGFR抑制劑)。EGFR調節劑之另一實例為EGF融合毒素。
適合與本發明之抗IGF抗體分子組合使用之其他EGFR及/或Her2抑制劑為拉帕替尼(lapatinib)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、XL-647、來那替尼(neratinib)、BMS-599626、ARRY-334543、AV-412、mAB-806、BMS-690514、JNJ-26483327、AEE-788(亦為VEGFR抑制劑)、AZD-8931、ARRY-380、ARRY-333786、IMC-11F8、Zemab、TAK-285、AZD-4769。
宜與本發明之抗IGF抗體分子組合治療之其他藥劑為托西莫單抗(tositumumab)及替坦異貝莫單抗(ibritumomab tiuxetan)(兩種放射性標記之抗CD20抗體)、奧伏托默單抗(ofatumumab)、利妥昔單抗(rituximab)、LY-2469298、歐瑞立單抗(ocrelizumab)、TRU-015、PRO-131921、FBT-A05、維爾托佐單抗(veltuzumab)、R-7159(CD20抑制劑)、阿倫單抗(alemtuzumab)(抗CD52抗體)、德諾單抗(denosumab)(破骨細胞分化因子配位體抑制劑)、加利昔單抗(galiximab)(CD80拮抗劑)、紮木單抗(zanolimumab)(CD4拮抗劑)、SGN40(CD40配位體受體調節劑)、XmAb-5485、Chi Lob 7/4、路卡木單抗(lucatumumab)、CP-870893(CD40抑制劑)、CAT-8015、依帕珠單抗(epratuzumab)、Y90-依帕珠單抗、吉妥珠單抗奧唑米星(inotuzumab ozogamicin)(CD22抑制劑)、魯昔單抗(lumiliximab)(CD23抑制劑)、TRU-016(CD37抑制劑)、MDX-1342、SAR-3419、MT-103(CD19抑制劑)或邁帕突莫單抗(mapatumumab)、替加珠單抗(tigatuzumab)、來沙木單抗(lexatumumab)、Apomab、AMG-951及AMG-655(TRAIL受體調節劑)。
可與本發明之抗IGF抗體分子組合使用之其他化學治療藥物係選自(但不限於)激素、激素類似物及抗激素(例如他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(ra1oxifene)、氟維司群(fulvestrant)、乙酸甲地孕酮(megestrolacetate)、氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、醋酸環丙氯地孕酮(cyproterone acetate)、柔沛(finasteride)、醋酸丁瑞林(buserelin acetate)、氟氫可的松(fludrocortinsone)、氟甲睪酮(fluoxymesterone)、甲羥孕酮(medroxyprogesterone)、奧曲肽(octreotide)、阿佐普芬(arzoxifene)、帕瑞肽(pasireotide)、伐普肽(vapreotide))、芳香酶抑制劑(例如安美達錠(anastrozole)、來曲唑(letrozole)、利阿唑(liarozole)、依西美坦(exemestane)、阿他美坦(atamestane)、福美司坦(formestane))、LHRH促效劑及拮抗劑(例如乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、亮丙立德(leuprolide)、阿巴瑞克(abarelix)、西曲瑞克(cetrorelix)、地洛瑞林(deslorelin)、組胺瑞林(histrelin)、曲普瑞林(triptorelin))、抗代謝物(例如抗葉酸物，諸如甲胺喋呤(methotrexate)、培美曲唑(pemetrexed)；嘧啶類似物，諸如5-氟尿嘧啶、卡培他濱(capecitabine)、地西他濱(decitabine)、奈拉濱(nelarabine)及吉西他濱(gemcitabine)；嘌呤及腺苷類似物，諸如巰嘌呤(mercaptopurine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、克拉屈濱(cladribine)及噴司他丁(pentostatin)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟達拉濱(fludarabine))、抗腫瘤抗生素(例如蒽環黴素(anthracycline)，諸如小紅莓(doxorubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)及伊達比星(idarubicin)、絲裂黴素-C(mitomycin-C)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、普卡黴素(plicamycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、匹克生瓊(pixantrone)、鏈佐星(streptozocin))、鉑衍生物(例如順鉑(cisplatin)、奧賽力鉑(oxaliplatin)、卡鉑(carboplatin)、洛鉑(lobaplatin)、撒塔鉑(satraplatin))、烷基化劑(例如雌莫司汀(estramustine)、甲二氯二乙胺(meclorethamine)、美法侖(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulphan)、達卡巴嗪(dacarbazine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、異環磷醯胺(ifosfamide)、羥基尿素(hydroxyurea)、替莫唑胺(temozolomide)、亞硝基脲諸如卡莫司汀(carmustine)及洛莫司汀(lomustine)、塞替派(thiotepa))、抗有絲分裂劑(例如長春花生物鹼(vinca alkaloid)，諸如長春鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞賓(vinorelbine)、長春氟寧(vinflunine)及長春新鹼(vincristine)；及紫杉烷，諸如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)及其調配物、拉洛他賽(larotaxel)；司莫紫杉醇(simotaxel)及埃坡黴素(epothilone)，諸如伊沙匹隆(ixabepilone)、帕妥匹隆(patupilone)、ZK-EPO)、拓撲異構酶抑制劑(例如表鬼臼素(epipodophyllotoxin)，諸如依託泊苷(etoposide)及凡畢複(etopophos)、替尼泊苷(teniposide)、安吖啶(amsacrine)、拓朴替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan))及各種化學治療藥物(諸如胺磷汀(amifostine)、阿那格雷(anagrelide)、干擾素α、丙卡巴肼(procarbazine)、米托坦(mitotane)及普非莫(porfimer)、貝瑟羅汀(bexarotene)、賽利克西(celecoxib))。
本發明之抗IGF抗體分子例如當在較低濃度下使用時，亦可與靶向IGF-1R之藥劑組合。該等藥劑包括可結合IGF-1R之抗體(例如CP-751871、AMG-479、IMC-A12、MK-0646、AVE-1642、R-1507、BIIB-022、SCH-717454、rhu Mab IGFR)及靶向IGF1-R激酶域之新穎化學體(例如OSI-906或BMS-554417、XL-228、BMS-754807)。
本發明之抗IGF抗體分子亦可與其他療法(包括手術、放射療法、內分泌療法、生物反應調節劑、發熱及冷凍療法)及減弱任何副作用之藥劑(例如止吐藥，及在一個較佳實施例中為糖尿病藥，例如二甲雙胍(metformin))組合使用。
本發明之抗IGF抗體分子亦適用於診斷癌症，其中血清中高IGF-1及/或IGF-2含量與疾病之發展或進展相關，例如測定因印記損失(LOI)(影響類胰島素生長因子II基因(IGF2 )之後生變異)所致之高IGF-2含量。在某些實施例中，用於診斷應用(例如藉由免疫組織染色偵測人類組織切片中之IGF-1)之抗體為來源於人類抗體之嵌合抗體。在該抗體中，恆定區或其一部分已由另一物種(例如小鼠)抗體之各別序列置換。使用該嵌合抗體作為一次抗體，二次抗體(例如與鼠類Fc部分發生特異性反應之山羊抗體)將特異性識別一次嵌合抗體之鼠類序列且不與存在於人類組織樣本中之其他人類免疫球蛋白分子之Fc部分結合。從而可避免不希望有的背景染色。
藉由阻斷IGF-1及IGF-2介導之信號轉導，本發明抗體亦可用於控制體重及脂肪組織形成。為此目的，本發明之抗體可單獨或與其他減肥藥物組合投與。
材料與方法 選擇可結合IGF-1之高親和力完全人類抗體
用三輪淘選自人類組合抗體文庫(HuCAL Gold)(Knappik 等人，2000)中選擇可以低奈莫耳濃度親和力結合人類IGF-1之特異性Fab片段純系，基本上如Rauchenberger等人，2003所述。為鑑別對人類IGF-1之親和力改良之Fab片段，使多種此等「親本」Fab純系進行「活體外親和力成熟」，基本上如Nagy等人，2002所述。各純系之L-CDR3(輕鏈CDR3)及H-CDR2(重鏈CDR2)序列分別以約108 個選自HuCAL之L-CDR3及H-CDR2卡匣取代親本序列來多樣化(Knappik等人，2000)。自所得「成熟文庫」製備噬菌體且針對人類IGF-1對各文庫進行溶液淘選。為選擇最大親和力之人類IGF-1結合劑，根據此項技術中已知之方法，在一般及高嚴格度之洗滌條件下，在抗原減少以及在人類胰島素阻斷及不阻斷的情況下進行溶液淘選。將三輪噬菌體淘選後的淘選產物次選殖於Fab表現載體中且藉由BioVeris(Witney,Oxfordshire,UK)開發之基於電化學發光之平衡滴定技術測定各Fab對人類IGF-1之親和力，基本上如Haenel等人，2005所述。對具有最佳IGF-1親和力之Fab純系定序，接著如Krebs等人，2001所述、轉型為人類IgG1抗體，其對人類IGF-1具有次奈莫耳親和力且與親本抗體相比，特異性沒有任何改變。
選殖及重組表現IgG1抗體
藉由限制酶消化自Fab表現載體中切取可變重鏈區(VH)及可變輕鏈區(VL)且接合至分別含有人類IgG1重鏈及人類Igλ輕鏈恆定區之基於pcDNA3.1之質體的相容限制酶位點。製備EndoFree質體製劑(Qiagen)且根據供應商之方案，在各質體1mg/L的濃度下將重鏈及輕鏈質體共轉染至HEK293 freestyle細胞(Invitrogen)中。72小時後，收集上清液且藉由ELISA測定IgG濃度。在經改質之蛋白質A管柱(GE Healthcare)上純化抗體，溶離至檸檬酸鹽緩衝液中且隨後於PBS中滲析直至2.5mg/ml之濃度。或者，產生與抗體表現質體穩定整合之CHO細胞株且用於生產抗體。
表面電漿共振分析以測定親和力常數 a)　抗體捕捉方法
使用胺偶合套組中之偶合試劑將感測晶片在流動室1中塗布約1000 RU之參考抗體及在流動室2中塗布約1000 RU之兔抗人類Fc-γ特異性抗體。利用Biacore 3000軟體之表面製備嚮導，將1000 RU之標靶以5μl/min之流速定位。所用操作緩衝液為HBS-EP。使用以下參數進行親和力測量：20μl/min流速(HCB操作緩衝液：)；25℃偵測溫度；Fc1、Fc2流動路徑；Fc1、Fc2偵測；抗IGF-huMAb捕捉：1μg/ml溶液3分鐘；5分鐘IGF-Ag結合；5分鐘IGF-Ag解離；再生：以50mM HCl進行30秒脈衝。IGF抗原於操作緩衝液(HCB)中稀釋至500nM、250nM、125nM、62.5nM及31.3nM且以隨機次序在Fc1及Fc2上單獨進行不同抗原稀釋操作。其間進行僅使用操作緩衝液之空白操作。在親和力分析前，自各結合曲線減去空白操作曲線。使用BIAevaluation軟體(4.1版,Biacore,Freiburg,Germany)進行數據評估。單獨擬合解離及結合階段之動力學數據。單獨擬合kdiss 值時，使用解離階段初始200-300秒之時間範圍(信號穩定減弱之範圍)。單獨擬合kass 值時，使用約100秒之初始時間範圍(信號穩定增強之範圍)且計算時以1:1朗繆爾結合模型(Langmuir association model)使用個別kdiss 值。使用動力學數據之標準偏差以及相應解離常數(KD )及結合常數(KA )計算平均值。
b) IGF塗布方法
當以IGF配位體塗布感測晶片時，基本如上所述測定IGF抗體對IGF配位體之結合常數，例外之處為分別以35.1pg/mm2 及38.5pg/mm2 IGF-1及IGF-2塗布感測晶片。接著抗體以下列濃度流過晶片：50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.12nM。
在免疫吸附檢定中測量與人類IGFs、鼠類IGFs及大鼠IGFs及與人類胰島素之結合
在直接免疫吸附檢定(ELISA)中，亦測試以高親和力結合IGF-1之完全人類IgG1抗體與人類IGF-1之結合。藉由在4℃以0.5μg/mL濃度之人類IGF-1(R&D Systems,編號291-G1)塗布96孔Maxisorb板(100微升/孔)過夜進行檢定。單獨塗布緩衝液用作非特異性結合之對照。接著用洗滌緩衝液(1×TBS-T)洗孔一次，且在室溫在軌道震盪器上用200μl阻斷緩衝液阻斷殘餘結合位點1小時，接著進行另一輪洗滌。在塗板上直接製備各測試抗體於阻斷緩衝液中之一系列三倍稀釋液。所用典型濃度為50ng/mL、16.6ng/mL、5.6ng/mL、1.8ng/mL、0.6ng/mL、0.2ng/mL及0.07ng/mL。單獨阻斷緩衝液用作陽性對照。接著板在攪動下在室溫培育2小時。三輪洗滌後，向所有孔中各孔添加100μl於阻斷緩衝液中稀釋之HRPO結合抗人類IgG二次試劑(Jackson ImmunoResearch Inc.)。在室溫攪動下培育2小時後，洗板三次，TMB受質溶液(等量溶液A與B)以100微升/孔吸移至所有孔中。板在室溫攪動下培育10-20分鐘，隨後藉由每孔添加100μl之1M磷酸停止反應。以450nm之波長測量吸光度(參考波長650nm)。
亦如上針對人類IGF-1所述，測試完全人類IGF-1結合IgG1抗體與鼠類IGF-1(R＆D Systems,編號791-MG)、大鼠IGF-1(IBT,編號RU100)、人類IGF-2(GroPep,編號FM001)、鼠類IGF-2(R＆D Systems,編號792-MG)、大鼠IGF-2(IBT,編號AAU100)及人類胰島素(Roche)之結合，例外之處為用於塗布之人類胰島素濃度為3μg/mL。
測定中和效能之活體外細胞檢定
將來源於MCF-7之細胞株(ATCC,HTB-22)及來源於COLO 205結腸癌之細胞株(ATCC #CCL-222)於無血清RPMI培養基中以每孔1000個細胞之細胞密度接種於96孔板中。在12ng/mL、37ng/mL、111ng/mL、333ng/mL、1000ng/mL及3000ng/mL濃度之不結合IGF-1或IGF-2的人類化同型對照抗體或抗體60814、60819及60833存在或不存在下，添加10ng/mL IGF-1或IGF-2。培養細胞5天，接著使用CellTiter-Glo發光細胞存活率檢定(Promega)測定各孔中相對細胞數目。使用XFluor GENios Pro 4記錄發光度(LU=發光單位)。
來源於尤文氏肉瘤之細胞株的生長檢定
來源於尤文氏肉瘤之細胞株TC-71(ATCC #ACC516)及SK-ES-1(ATCC #HTB86)於含有1×NEAA、1×丙酮酸鈉、1×glutamax及10%胎牛血清(FCS)之DMEM培養基中以每孔1000個細胞之密度接種於96孔板中且在37℃及5% CO2 之增濕氛圍下培育隔夜。次日向細胞中添加測試抗體、不結合IGF-1或IGF-2之人類化同型對照抗體(靶向CD44-v6之人類化IgG1抗體)、雷帕黴素或雷帕黴素與測試抗體組合之連續稀釋液。所用典型濃度為30μg/ml、10μg/ml、3.3μg/ml、1.1μg/ml、0.37μg/ml及0.12μg/ml(或就組合研究而言，100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、0.001nM雷帕黴素與測試抗體)且各稀釋於三重複孔中進行。接著將細胞與抗體一起培育120小時，之後使用CellTiter-Glo發光細胞存活率檢定(Promega)測定各孔中相對細胞數目。使用XFluor GENios Pro 4記錄發光度(LU=發光單位)且獲取三重複孔之平均值用於數據分析且使用具有可變希耳斜率(Hill slope)之S形曲線分析程式(Graph Pad Prism)藉由迭代計算來擬合。
西方墨點法分析磷酸化AKT及PTEN含量
SK-ES-1細胞於含有10%胎牛血清之培養基中接種於6孔板中且在隔夜培育後，用100nM不結合IGF-1或IGF-2之同型對照抗體(靶向CD44-v6之人類化IgG1抗體)、100nM雷帕黴素或100nM 60819與100nM雷帕黴素組合對其進行處理。24小時後，細胞溶解且在以Bradford檢定測定蛋白質濃度後冷凍細胞溶胞物。藉由將30μg蛋白質溶解物施加至SDS PAGE凝膠(BioRad)上且將凝膠置於Citerian凝膠吸墨夾層上吸墨來進行西方墨點分析。將西方墨點與兔抗β肌動蛋白(對照)抗體、兔抗PTEN抗體(Cell Signaling #9559)或兔抗磷酸化pAKT抗體(Cell Signaling #4060)(於1%乳粉中1:5000(抗β肌動蛋白)、1:1000(抗PTEN)或1:2000(抗磷酸化AKT)稀釋)一起培育隔夜。在TBS中洗滌後，施加抗兔IgG HRPO結合二次抗體(Amersham)1小時且在TBS中再洗滌後，藉由ECL偵測抗體反應且捕捉於Hyperfilm(Amersham)上。
抗IGF抗體與EGFR抑制劑活體外組合於來源於NSCLC之細胞株中
將來源於NSCLC之細胞株A-549(ATCC #CCL-185)於含有2mM L-麩胺醯胺及10%胎牛血清之RPMI 1640培養基中以每孔1000個細胞之密度接種於96孔板中且在37℃及5%CO2 之增濕氛圍下培育隔夜。次日向細胞中添加測試IGF抗體、埃羅替尼/得舒緩(Tarceva)或測試IGF抗體與埃羅替尼組合之連續稀釋液。所用測試IGF抗體之典型濃度為30000ng/mL、10000ng/mL、3333ng/mL、1111ng/mL、370ng/mL、123ng/mL、41ng/mL、14ng/mL，且所用埃羅替尼之典型濃度為20000nM、6667nM、2222nM、741nM、247nM、82nM、27nM、9nM，且各稀釋於三重複孔中進行。接著將細胞與抗體一起培育120小時，之後使用CellTiter-Glo發光細胞存活率檢定(Promega)測定各孔中相對細胞數目。使用XFluor GENios Pro 4記錄發光度(LU=發光單位)且獲取三重複孔之平均值用於數據分析且使用具有可變希耳斜率之S形曲線分析程式(Graph Pad Prism)藉由迭代計算來擬合。
測定對鼠類血清中總IGF-1含量及大鼠血清中總IGF-1含量之影響
向6-8週齡雌性無胸腺NMRI裸小鼠(n=5)中靜脈內單次投與(快速注射)25mg/kg、12.5mg/kg、6.25mg/kg及3.13mg/kg之抗體60819。向6-8週齡雄性或雌性Wistar Han大鼠(n=4隻雄性，4隻雌性)中單次10分鐘靜脈內投與30mg/kg、100mg/kg、200mg/kg之抗體60819。抗體治療前及在投與後24小時獲取血液樣品，收集血清且使用OCTEIA大鼠/小鼠總IGF-1免疫細胞檢定測定鼠類或大鼠總IGF-1含量。根據製造商說明書進行檢定，在450nm下測量吸光度且使用SoftMax Pro軟體進行評估。使用標準曲線測定血清中總IGF-1濃度(ng/mL)。使用GraphPad Prism軟體進行統計分析。
實例1 選 擇可結合IGF-1之高親和力抗體
為鑑別對人類IGF-1之親和力改良的Fab片段，使經鑑別可以低奈莫耳濃度親和力結合IGF-1的多個「親本」Fab純系進行「活體外親和力成熟」，其中各純系之L-CDR3及H-CDR2序列分別由新L-CDR3及H-CDR2序列之文庫取代親本序列來多樣化。所得「成熟文庫」進行針對人類IGF-1之溶液淘選且選擇具有最佳親和力之純系轉型為IgG1抗體並進一步測試。具有最佳人類IGF-1親和力之三種抗體為分別具有180pM、190pM及130pM之親和力(KD )的60814、60819及60833(表1中所示)，如藉由基於電化學發光之平衡滴定方法所測定。
亦在免疫吸附檢定中測試抗體針對人類、鼠類及大鼠IGF-1及IGF-2以及人類胰島素之結合。此測試證明60814、60819及60833顯示與鼠類及大鼠IGF-1及人類、鼠類及大鼠IGF-2之交叉反應性結合，但對人類胰島素(在50ng/mL之最大測試濃度下)無反應(圖1A-1G)。
實例2 對IGF-1及IGF-2誘發之細胞增殖的影響
測定抗體60814、60819及60833對IGF-1及IGF-2誘發之MCF-7(來源於乳癌)及COLO 205(來源於結腸癌)細胞株增殖之影響。抗體60814及60819之影響之實例顯示於圖2A-D中。所有三種抗體皆對IGF-1(圖2A及2C)及IGF-2(圖2B及2D)誘發之MCF-7(圖2A及2B)及COLO 205(圖2C及2D)細胞增殖顯示劑量依賴性抑制。將IGF-1或IGF-2誘發之各細胞株增殖抑制50%所需之各抗體濃度顯示於表2中。
實例3 對來源於尤文氏肉瘤之細胞株的影響
抗體60819及60833對生長於含有10% FCS之培養基中之來源於尤文氏肉瘤之細胞株TC-71增殖的影響顯示於圖3中。相對於不結合IGF-1或IGF-2之人類化IgG1同型對照抗體，60819及60833對TC-71細胞增殖顯示劑量依賴性抑制。
實例4 對鼠類及大鼠總IGF-1含量之影響
用靶向之IGF抗體中和活性IGF-1預期可引起經由GH路徑之內分泌反饋，導致血清總IGF-1含量升高。抗體60814、60819及60833與小鼠及大鼠IGF-1可交叉反應，從而容許對此等物種之血清中總IGF-1含量之任何藥效學影響進行測量。如圖4及5中所示，向小鼠(圖4)及大鼠(圖5)中投與抗體60819使得投與後24小時鼠類及大鼠血清中總IGF-1含量隨劑量升高而升高。此代表此等抗體活性之適用藥效學標記，其可在臨床開發期間於人體中測試。
實例5 靶向抗體之IGF配位體與雷帕黴素組合對來源於尤文氏肉瘤之細胞株增殖及胞內信號傳導的影響
抗體60819及mTOR抑制劑雷帕黴素(單獨或組合)對來源於尤文氏肉瘤之細胞株SK-ES-1增殖的影響顯示於圖6中。抗體60819與雷帕黴素單獨使用時存在對增殖之劑量依賴性抑制，此兩種單藥在100nM下均實現約60%增殖抑制。抗體60819與雷帕黴素之等劑量組合可展示對細胞增殖之累加抑制效應，當以100nM劑量組合時，具有約95%抑制作用。
IGF誘發之細胞增殖係經一連串胞內蛋白質磷酸化事件所介導。一種在IGF刺激下磷酸化增強之蛋白質為AKT。圖7展示使用100nM劑量處理後24小時、抗體60819及雷帕黴素(單獨或組合)對SK-ES-1細胞中AKT磷酸化之影響。與顯示AKT磷酸化之未處理細胞之增殖相比，100nM抗體60819可抑制AKT磷酸化。相反，100nM雷帕黴素處理引起磷酸化AKT含量高於對照，此被認為因mTOR抑制後之補償反饋機制所致。然而，當100nM雷帕黴素與100nM抗體60819組合時，AKT之磷酸化被抑制。此表明導致雷帕黴素處理後AKT磷酸化之補償反饋係因IGF配位體升高所致且此等配位體可由抗體60819抑制。圖7亦展示抗體60819與雷帕黴素(單獨或組合)不會影響PTEN之總含量。
實例6 靶向IGF配位體之抗體與EGFR抑制劑組合對來源於 NSCLC之細胞株增殖的影響
抗體60819及EGFR抑制劑埃羅替尼/得舒緩(單獨或組合)對來源於NSCLC之細胞株A-549增殖的影響顯示於圖8中。在此模型中，單獨抗體60819對細胞增殖僅存在微小影響，而得舒緩在最大測試劑量(20μM)下顯示約60%細胞增殖抑制之劑量依賴性影響。然而，當抗體60819與得舒緩組合時，對細胞增殖的抑制更強烈且更有效，表明存在協同效應。
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US 4,342,566
US 3,773,919
US 6,696,245
US 6,991,790
US 7,060,268
圖1A-1G顯示命名為60814、60819及60833之IgG1抗體針對人類IGF-1(圖1A)、鼠類IGF-1(圖1B)、大鼠IGF-1(圖1C)、人類IGF-2(圖1D)、鼠類IGF-2(圖1E)、大鼠IGF-2(圖1F)及人類胰島素(圖1G)之ELISA結合滴定；
圖2A-2D顯示抗體60814及60819對IGF-1(圖2A及2C)及IGF-2(圖2B及2D)刺激之MCF-7(圖2A及2B)及COLO 205(圖2C及2D)細胞增殖之影響；
圖3顯示在10%生長培養基中，抗體60819及60833對來源於尤文氏肉瘤之細胞株TC-71增殖的影響；
圖4顯示投與25mg/kg、12.5mg/kg、6.25mg/kg、3.13mg/kg單次劑量後24小時，抗體60819對鼠類血清中總IGF-1含量的影響；0mg/kg代表抗體處理前的血清中總IGF-1含量；
圖5顯示藉由10分鐘靜脈內輸注投與30mg/kg、100mg/kg、200mg/kg單次劑量後24小時，抗體60819對大鼠血漿中總IGF-1含量的影響；0mg/kg代表抗體處理前的血清中總IGF-1含量；
圖6說明在含有10% FCS之生長培養基中，抗體60819及雷帕黴素(單獨或組合)對來源於尤文氏肉瘤之細胞株SK-ES-1之增殖的影響；
圖7顯示抗體60819及雷帕黴素(單獨或組合)對AKT磷酸化及PTEN含量的影響；
圖8說明在含有10% FCS之生長培養基中抗體60819及埃羅替尼/得舒緩(單獨或組合)對來源於NSCLC之細胞株A-549之增殖的影響；及
圖9顯示抗體60814(A)、60819(B)及60833(C)之鏈可變區之胺基酸及DNA序列；CDR呈粗體字。
(無元件符號說明)

Claims (29)

  1. 一種分離之人類抗體分子，其a)結合人類IGF-1及IGF-2，以i)防止IGF-1及IGF-2結合IGF-1受體，及ii)抑制IGF-1受體介導之信號傳導，b)結合鼠類及大鼠IGF-1及IGF-2，c)不結合人類胰島素；其中該抗體分子係重鏈CDRs包含SEQ ID NO：21(CDR1)、SEQ ID NO：22(CDR2)及SEQ ID NO：23(CDR3)之胺基酸序列且輕鏈CDRs包含SEQ ID NO：24(CDR1)、SEQ ID NO：25(CDR2)及SEQ ID NO：26(CDR3)之胺基酸序列的抗體分子。
  2. 如請求項1之抗體分子，其具有包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的可變重鏈。
  3. 如請求項1之抗體分子，其具有包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列的可變輕鏈。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體分子，其包含選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA及IgE恆定區組成之群的重鏈恆定區。
  5. 如請求項4之抗體分子，其中該抗體重鏈恆定區為IgG1。
  6. 如請求項5之抗體分子，其中該IgG1重鏈恆定區包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列。
  7. 如請求項1至3中任一項之抗體分子，其中該輕鏈恆定區 為Igλ。
  8. 如請求項7之抗體分子，其中該輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列。
  9. 如請求項2或3之抗體分子，其具有a)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的重鏈，及b)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的輕鏈。
  10. 如請求項1之人類抗體分子，其為Fab片段。
  11. 如請求項1之人類抗體分子，其為F(ab')2 片段。
  12. 如請求項1之人類抗體分子，其為單鏈Fv片段。
  13. 一種編碼如請求項1至12中任一項之抗體分子之可變重鏈或可變輕鏈的DNA分子。
  14. 如請求項13之DNA分子，其具有SEQ ID NO：27之核苷酸序列編碼如請求項2中所定義之抗體之可變重鏈。
  15. 如請求項13之DNA分子，其具有SEQ ID NO：29之核苷酸序列編碼如請求項3中所定義之抗體之可變輕鏈。
  16. 一種表現載體，其含有一種DNA分子，該DNA分子包含SEQ ID NO：27及/或SEQ ID NO：29之序列。
  17. 如請求項16之表現載體，其另外包含一種分別編碼恆定重鏈或恆定輕鏈的DNA分子，該DNA分子連接至分別編碼可變重鏈或可變輕鏈之DNA分子。
  18. 一種宿主細胞，其攜帶一或多個如請求項16或17之表現載體。
  19. 如請求項18之宿主細胞，其為哺乳動物細胞。
  20. 一種產生如請求項1至12中任一項之抗體的方法，其包 含用一或多個如請求項16或17之載體轉染哺乳動物宿主細胞，培育該宿主細胞，及回收並純化該抗體。
  21. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至12中任一項之抗體分子及醫藥學上可接受之載劑。
  22. 如請求項21之醫藥組合物，其進一步包含一或多種選自以下之其他治療劑：a)DNA損傷劑，b)抑制癌細胞中信號轉導路徑或有絲分裂檢查點之治療活性化合物，c)糖尿病藥。
  23. 如請求項22之醫藥組合物，其中該一或多種化合物b)係選自EGFR、VEGF、HER2-neu、AuroraB、Plk1、PI3激酶或mTor之抑制劑之群。
  24. 如請求項21至23中任一項之醫藥組合物，其係用於治療選自以下之癌性疾病：造血系統之癌症，包括白血病、淋巴瘤及骨髓瘤；胃腸道之癌症，包括食道癌、胃癌、結腸直腸癌、胰臟癌、肝癌及膽囊癌及膽管癌；腎臟癌、前列腺癌及膀胱癌；婦科癌，包括乳癌、卵巢癌、子宮頸癌及子宮內膜癌；皮膚癌及頭頸癌，包括惡性黑色素瘤；兒科癌症，諸如威爾姆氏腫瘤(Wilms' tumour)、神經母細胞瘤及尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)；腦癌，諸如神經膠母細胞瘤；肉瘤，諸如骨肉瘤、軟組織肉瘤、橫紋肌肉瘤、血管肉瘤；肺癌、間皮瘤及甲狀腺癌。
  25. 一種如請求項21至23中任一項之醫藥組合物的用途，其係用於製造供治療罹患癌症之患者的藥物，該癌症選自：造血系統之癌症，包括白血病、淋巴瘤及骨髓瘤；胃腸道之癌症，包括食道癌、胃癌、結腸直腸癌、胰臟癌、肝癌及膽囊癌及膽管癌；腎臟癌、前列腺癌及膀胱癌；婦科癌，包括乳癌、卵巢癌、子宮頸癌及子宮內膜癌；皮膚癌及頭頸癌，包括惡性黑色素瘤；兒科癌症，諸如威爾姆氏腫瘤、神經母細胞瘤及尤文氏肉瘤；腦癌，諸如神經膠母細胞瘤；肉瘤，諸如骨肉瘤、軟組織肉瘤、橫紋肌肉瘤、血管肉瘤；肺癌、間皮瘤及甲狀腺癌。
  26. 一種活體外抑制哺乳動物細胞中IGF-1及IGF-2結合IGF-1受體之方法，其包含向該細胞投與如請求項1至12中任一項之抗體分子，藉此抑制由IGF-1受體介導之信號傳導及由IGF-1及IGF-2介導之增殖及抗細胞凋亡。
  27. 一種活體外抑制哺乳動物細胞中IGF-2結合胰島素受體IR-A之方法，其包含向該細胞投與如請求項1至12中任一項之抗體分子，藉此抑制由胰島素受體IR-A介導之信號傳導及藉此抑制由IGF-2介導之增殖及抗細胞凋亡。
  28. 如請求項26或27之方法，其中該投與係在活體外進行。
  29. 一種監測結合IGF-1及IGF-2之抗體分子治療癌症患者之有效性的方法，其中該抗體分子為如請求項1至12中任一項之抗體，其中該方法包含：(a)測量該患者生物樣本中之總IGF-1含量， (b)向該患者中投與該抗IGF抗體分子，(c)測量該患者生物樣本中之總IGF-1含量，其中該總IGF-1含量比步驟(a)中測得之總IGF-1含量增大之量指示該患者對該抗IGF抗體分子治療發生反應之程度。
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