TWI443108B - 抗人類表皮生長因子受體抗體及其應用 - Google Patents

Description

抗人類表皮生長因子受體抗體及其應用

本發明關於一種新穎的抗體，特別是關於與人類表皮生長因子受體專一性結合的抗體。

表皮生長因子受體(EGFR)為歸屬於受體型酪胺酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTK) ErbB家族的成員之一。當與EGF配體(ligand)結合時，EGFR會活化下游細胞訊息傳遞的連鎖反應，影響細胞的增殖、移動、細胞凋亡(apoptosis)及存活。EGFR已被認為是發展抗癌標靶治療的有效標的之一。兩種美國食品藥物管理局(FDA)認可的抗EGFR抗體包括嵌合單株抗體(mAb) Cetuximab(Erbitux^TM )及全人源單株抗體Panitumumab(Vectibix^TM )，因具有高親和性已應用於結腸癌及頭頸癌之治療(Wheeler et al. 2010,Nat Rev Clin Oncol. 7,493-507)。相較於胜肽配體或小分子，抗體具有較高的專一性及親和性，因此抗體不僅可用於治療，也可期待作為遞送藥物至目標細胞的載體。

以Cetuximab及Panitumumab為例，IgG已成功使用於臨床，但大體積的IgG(分子量約150 kDa)可能會影響其滲透至腫瘤細胞之能力(Jain et al. 2005,Cancer Res. 65,7840-6)。多種的抗體型態，例如單鏈變異區片段(single chain variable fragments,scFvs)及scFv與Fc區域的融合蛋白(scFv-Fc)，皆已被設計用以改善抗體滲透至腫瘤之效果。無輕鏈抗體(devoid of light chain antibodies)已被報導自然存在於駱駝與駱馬，而此發現也為抗體的基因工程領域提供新的前景(Hamers-Casterman et al. 1993,Nature. 363,446-8.)。單域抗體(single-domain antibodies,sdAbs or dAbs)為僅含人類抗體變異區之最小的抗體結合區域，在重組表現系統中被報導具有高度的可溶性(Jespers et al. 2004,Nat Biotechnol. 22,1161-5.)。目前，利用絲狀噬菌體進行噬菌體展示(phage display)用以篩選人類抗體片段的參考實驗流程已被建立(Lee et al. 2007 Nat Protoc. 2,3001-8.)。為了提高命中率(hit rates)，將抗原表現於細胞膜上用以模擬受體生理型態之噬菌體展示篩選也已經有文獻被報導(Heitner at al. 2001 J Immunol Methods. 248,17-30)。EGFR轉染之32D細胞(32D-EGFR)為介白素-3(IL-3)或是EGF依賴型的細胞株，可作為EGFR訊息傳遞相關路徑之抑制物篩選系統(Lin et al. 2008. Anal Biochem. 377,89-94)。

本案一實施態樣提供一種抗人類表皮生長因子受體(EGFR)抗體，該抗體包括序列識別號3所示之胺基酸序列。

本案另一實施態樣提供一種融合蛋白，包括上述抗體及人類IgG的Fc區域，形成二價抗體。

本案更一實施態樣提供一種融合蛋白，包括上述抗體及人類IgG的重鏈變異區(V_H )取代輕鏈變異區(V_L )的型態，形成四價抗體。

本案另一實施態樣提供一種醫藥組成物，包括上述抗體或融合蛋白，用於治療表皮生長因子受體(EGFR)過度表現所引起的疾病或症狀。

本案更提供一種顯影劑，包括上述抗體以及一標記物，與該抗體連接。

本案另提供一種體外標記細胞的方法，包括提供一帶有上述抗體之標記分子；以及混合該標記分子與欲標記生物樣品，使標記分子與該樣品中具表面抗原EGFR細胞形成一結合分子。

本案更進一步提供一種新穎的抗表皮生長因子受體(EGFR)抗體的篩選方法，包括：(i)以不表現EGFR的細胞排除人類單域抗體庫(human domain antibody library)中與該細胞結合的噬菌體；(ii)提供一具表現EGFR的細胞；(iii)將步驟(i)殘餘的噬菌體以步驟(ii)細胞進行噬菌體展示篩選(phage display selection)；及(iv)將步驟(iii)所得之噬菌體以購自PeproTech的重組之EGFR細胞外區域(recombinant extracellular domain of EGFR,EGFR-ECD)進行噬菌體展示篩選，獲得抗表皮生長因子受體(EGFR)抗體。

本發明之具體實施詳細說明如下，然而以下的實施例僅用於進一步揭露本發明之技術內容，不應藉以限制本案的發明範疇。

單域抗體(single domain antibody,dAb)係由單一變異抗體區域所構成的抗體片段。本案的抗體可為單域抗體形態，具專一性與表皮生長因子受體(EGFR)結合，亦可在與人類IgG的Fc片段融合(fuse)形成融合蛋白時，可藉由內噬進入細胞內。

具體地說，本案所述之抗體包括如序列識別號3所示之胺基酸序列或者由序列識別號1所示之核苷酸序列所編碼的胺基酸序列。本案之抗體也可包含序列識別號3所示之胺基酸序列的位置117的酪胺酸(Tyr)被置換為天冬胺酸(Asp)的胺基酸序列(如序列識別號4所示)，或者由序列識別號2所示之核苷酸序列所編碼的胺基酸序列。

本案所述之抗體為由一種新穎的篩選方法所獲得。本案所述的篩選方法，簡單地說，包括下列步驟：(i)以不表現EGFR的細胞淘選(panning)人類單域抗體庫(human domain antibody library)中與該細胞結合的噬菌體；(ii)提供一具表現EGFR的細胞；(iii)將步驟(i)殘餘的噬菌體以步驟(ii)細胞進行噬菌體展示篩選；及(iv)將步驟(iii)所得之噬菌體以購自PeproTech的重組之EGFR細胞外區域(recombinant extracellular domain of EGFR,EGFR-ECD)進行噬菌體展示篩選，獲得抗表皮生長因子受體(EGFR)抗體。此述「不表現EGFR的細胞」係指細胞生長過程中不特異表現EGFR的細胞。本案一實施例中，以小鼠IL-3依賴性32D細胞作為不表現EGFR的細胞(Alimandi et al. 1997 EMBO J. 16,5608-17.)。在此實施例中，先以不表現EGFR的32D細胞淘選(panning)人類單域抗體庫，排除與32D細胞結合的噬菌體。接著，如第2B圖所示，EGFR轉染的小鼠32D細胞(32D-EGFR)用於第1及2回的噬菌體展示篩選，重組之EGFR細胞外區域用於第3及4回的噬菌體展示篩選，可得到高噬菌體效價的結果，因而篩選出對EGFR專一的單域抗體(domain antibody,dAbs)。

此述「噬菌體展示篩選」與此技術領域中公知的技術相同。簡單地說，此篩選方法係將所欲的DNA片段插入噬菌體的外殼蛋白結構基因區，使得該DNA片段編碼的多胜肽表現於該噬菌體的表面，以篩選所欲的多胜肽。由於本案之篩選抗體的方法係基於噬菌體展示篩選，因此可避免習知技術使用動物免疫可能產生的多種變因以及道德問題。

根據本發明之篩選方法，在噬菌體展示篩選的最初兩回篩選步驟中使用EGFR-轉染細胞，之後至少兩回篩選步驟使用EGFR-ECD，可得到高噬菌體效價，而且所篩選的抗體仍具有對EGFR專一的結合親和力(如第2B圖)。相較之下，現有技術先以EGFR-ECD為基礎並搭配EGFR-轉染細胞進行噬菌體展示篩選(如第2A圖)，雖同樣可獲得高的噬菌體效價，但是所得的抗體已失去與結合對象的專一性。由此可知，本發明之篩選方法可有效地篩選抗-EGFR抗體，解決習知技術的困難。

本案之篩選方法中，步驟(iv)以EGFR-ECD進行至少兩回的噬菌體展示篩選，此步驟的篩選次數並不特別限制。在後述實施例中可見，經過兩回EGFR-ECD的噬菌體展示篩選後已獲得超過10¹⁰ 的噬菌體效價，因此可以合理預期額外進行數回相同的篩選方法可得到更高的噬菌體效價並增加篩選之準確率。但以噬菌體展示篩選方法的限制來看，較佳可進行2~6回的噬菌體展示篩選。

本案之抗體可進一步地與人類IgG1的片段可結晶區(fragment crystallizable region,Fc)融合，形成融合蛋白dAb-D2-hFc。本案一實施例中，以序列識別號3所示之單域抗體(dAb-D2)的胺基酸序列與序列識別號6所示之人類IgG1的Fc之胺基酸序列融合，形成dAb-D2-hFc融合蛋白。或者以序列識別號1所示之抗體的核苷酸序列(dAb-D2)與序列識別號5所示之人類IgG1的Fc之核苷酸序列構築表現dAb-D2-hFc融合蛋白的構築體。如第1A圖所示，V_H 表示單域抗體(dAb-D2)區域，CH2及CH3表示Fc區域，融合蛋白dAb-D2-hFc為二價抗體，可提高與EGFR的結合效應。而且，本發明人更證實dAb-D2-hFc具有內噬作用的活性，可確認dAb-D2-hFc在活體內的活性。

本案之抗體可進一步與膠原蛋白摺疊結構(collagen scaffold)融合。如第1B圖所示，V_H 表示單域抗體(dAb-D2)區域，下方螺旋結構表示膠原蛋白摺疊結構。抗體與膠原蛋白摺疊結構的融合，可參照先前文獻所揭示之方法進行(Fan et al. 2008. FASEB J. 22,3795-3804.)，無特別限制。由於膠原蛋白摺疊結構的聚合力，本案之抗體與膠原蛋白摺疊結構所形成的融合蛋白可形成三價的融合蛋白。

再者，本案所述之抗體也可與人類IgG的重鏈變異區(V_H )取代輕鏈變異區(V_L )的型態(V_H displace V_L form)融合，形成四價的融合蛋白(以下簡稱為「V_H -dAb-D2x4-Ig」)。如第1C圖所示，V_H 表示單域抗體(dAb-D2)區域，CH1、CH2、CH3、CL1表示人類IgG區域。此述四價的融合蛋白可根據美國專利公開案US20060083747記載之方法製備，但不限於此。而且，本發明人更證實藉由抗體價數之增加可增強抗體之結合強度，V_H -dAb-D2x4-Ig四價抗體之結合強度優於dAb-D2-hFc二價抗體。而且V_H -dAb-D2x4-Ig也具有內噬作用的活性，可確認V_H -dAb-D2x4-Ig在活體內的活性。

本發明之抗體更可應用於治療EGFR過度表現所引起的疾病或症狀。透過本案之抗體與EGFR的結合，可減少自然情形下EGF與EGFR的結合，進而減緩或抑制EGFR過度表現所引起的疾病或症狀。已知有多種癌症與EGFR過度表現有關，例如非小細胞肺癌(non-small-cell carcinoma,NSCLC)、鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)、頭頸癌、乳癌、攝護腺癌或卵巢癌等，因此本案所述之抗體也可應用於癌症的治療。

本案所述之醫藥組成物的劑型可為錠劑、膠囊劑、膜衣錠、發泡劑、顆粒、粉末、懸浮液、糖漿等，並可依劑型適當含有醫藥上容許的載劑或添加劑。此述醫藥上容許的載劑或添加劑，例如賦形劑、抗氧化劑、乳化劑、分散劑、制菌劑、矯味劑、著色劑、緩衝劑、溶劑、pH調整劑、界面活性劑等。本案所述之醫藥組成物可單獨投藥或者與其他藥劑組合投藥，投藥路徑包括口服、經皮膚投藥、腹腔注射、靜脈注射等，較佳為口服投藥。投藥劑量可根據患者年齡、體重、健康狀況、疾病種類、疾病的進展、患部等因素，由相關醫療人員依該技術領域中共通知識決定。

本案之抗體也可與一標記物連接(conjugate)或融合(fuse)，作為顯影劑使用。此述的標記物包括顯色物質或放射物質等可形成標記的物質。此述「顯色物質」係指可在體外或體內產生顏色變化的物質，沒有特別限定，可例如螢光染劑(fluorochromes)，如fluorescein isothiocyanate(FITC)、Alexa Fluor系列螢光染劑、對稱型花青染料(Cyanine Dye,C2,Cy3 and Cy5)等；螢光蛋白(fluorescent protein)，如以光敏素為主的近紅外螢光蛋白(phytochrome-based near-infrared fluorescent protein,iRFP)(Miao et al. 2010,J Biomed Opt. 15,036007).；生物性冷光(bioluminescence)，如螢火蟲螢光素酶(firefly luciferase,Fluc)、Gaussia 螢光素酶(Gaussia luciferase,Gluc)(Venisnik et al,2007,Mol Imaging Biol. 9,267-77)；奈米粒子，如量子點(quantum dots)、氧化鐵奈米磁珠(iron oxide magnetic beads)或超順磁氧化鐵奈米磁珠(superparamagnetic iron oxide beads)等(Olafsen er al. 2010,Semin Nucl Med. 40,167-181)(Yang e tal. 2009,Small. 5,235-43)。此述的「放射物質」包括具有放射性質的物質，沒有特別限制，可例如釔90、銦111、碘131或醫療應用上慣常使用之放射物質。根據使用的標記物特性，可適當地應用於體外或體內的顯影方法，例如細胞螢光或冷光顯影、正子斷層掃描(PET)或磁共振成像(MRI)顯影。並且，藉由本案所述之抗體專一性結合於細胞表面的EGFR以及標記物的辨識，可標記(label)表面具有EGFR的細胞，進一步應用於細胞的標定。因此，本案更包括一種體外標記細胞的方法，包括：提供一帶有本案所述抗體之標記分子；以及混合該標記分子與欲標記生物樣品，使標記分子與該樣品中具表面抗原EGFR細胞形成一結合分子。基於本案所述抗體與EGFR的結合專一性，此述標記細胞的方法可具體地標記表面具有EGFR的細胞，並且可容易被辨識。

本發明之具體實施詳細說明如下，然而以下的實施例僅用於進一步揭露本發明之技術內容，不應藉以限制本案的發明範疇。

實施例

材料與方法

材料

人類單域抗體庫(DAb library)(cat no: DAB1000)購買自MRC Geneservice。Dulbecco’s modified Eagle’s培養基(DMEM)、RPMI-1640培養基、盤林西林(penicillin)、鏈黴素(streptomycin)及L-麩胺酸(L-glutamine)購買自Invitrogen。胎牛血清(FBS)購買自Thermo Scientific HyClone。含有IL-3的WEHI-3條件培養基得自培養WEHI-3細胞之已過濾培養基(WEHI-3細胞培養於添加10% FBS及盤林西林(50 U/ml)與鏈黴素(50 mg/ml)的DMEM培養基)。重組之EGFR細胞外區域(EGFR-ECD,cat no: 100-15R)購買自PeproTech。

細胞株

細胞株皆培養於37℃環境並同時含有5% CO₂ 之二氧化碳培養箱內。人類上皮癌A431細胞株培養於添加10% FBS及盤林西林(50 U/ml)與鏈黴素(50 mg/ml)的DMEM培養基。小鼠32D及32D-EGFR細胞株培養於添加10% FBS、5% WEHI-3條件培養基、L-麩胺酸、盤林西林(50 U/ml)、鏈黴素(50 mg/ml)的RPMI-1640培養基。

方法

噬菌體的營救(rescue)、定量(titration)及製備

噬菌體的定量是將洗提所得的噬菌體感染生長在log-phase時期的Escherichia coli TG1來確定。根據操作指南所示，將洗提所得的噬菌體與KM13輔助噬菌體同時感染E. coli TG1進行噬菌體擴增並用於下一回的篩選。在25℃環境下培養過夜後，以聚乙二醇6000(PEG6000)從細菌上清液中純化及濃縮新擴增的噬菌體，最後回溶噬菌體於1.5毫升的PBS中，用於下一回的篩選或用於以A431細胞為主的ELISA篩選。

[實施例1]　EGFR-ECD與32D-EGFR細胞組合的噬菌體展示篩選

使用含有621個胺基酸(分子量約100 kDa)的重組之EGFR細胞外區域(EGFR-ECD)做為篩選時的標的蛋白。在每一回篩選中，將稀釋於PBS緩衝液中的EGFR-ECD(6 ug/ml)於4℃環境下溫和地攪動而貼附於Nunc-Immuno MaxiSorb管壁上。以PBS緩衝液清洗該管3次，加入約5×10¹² 個多株噬菌體於4毫升StartingBlock blocking buffer中，於室溫下以溫和地攪動反應1.5小時。以含有0.1% Tween 20的PBS緩衝液(PBST清洗緩衝液)清洗該管10次，再以PBS緩衝液清洗2次。以4毫升胰蛋白酶(trypsin)溶液在室溫下、溫和攪動1小時將結合至標的蛋白上之噬菌體洗提(elute)下來。洗提所得的噬菌體如上述方法營救、定量及製備。如第2A圖所示，以上述EGFR-ECD的篩選進行兩回後，以32D-EGFR細胞再進行1回篩選。32D及32D-EGFR細胞生長於15-cm的培養盤，以PBS緩衝液清洗兩次。為了去除人類單域抗體庫中非專一性的噬菌體，將8x10⁶ 個32D細胞與5x10¹² 噬菌體共同置於添加2.5% BSA的2毫升無血清DMEM培養基中於室溫下溫和攪動1小時。之後以1,500 rpm轉速離心移除32D細胞用以收集上清液。將4x10⁶ 個32D-EGFR細胞與先經32D細胞剔除(depleted)之多株噬菌體於室溫下溫和攪動反應1.5小時。之後以預冷之PBS緩衝液清洗32D-EGFR細胞兩次。離心去掉上清液後，使32D-EGFR細胞回溶於1毫升的胰蛋白酶溶液，於室溫下反應30分鐘用以洗提出結合至細胞膜上之噬菌體。洗提所得的噬菌體如上述方法營救、定量及製備。經過EGFR-ECD兩次篩選後，多株噬菌體的效價仍太低(第2A圖)。在32D-EGFR細胞的第3回篩選後，多株噬菌體效價已超過10⁸ ，但是在接下來的以A431細胞為主的ELISA分析中並沒有得到任何陽性結果。上述結果顯示，最初兩回以EGFR-ECD篩選的噬菌體展示篩選不易篩選出具有生物活性(結合親合力)的抗-EGFR抗體。

[實施例2]　以32D-EGFR細胞及EGFR-ECD之組合的噬菌體展示篩選

在每一回篩選中，先將32D及32D-EGFR細胞培養於15-cm培養盤，以PBS緩衝液清洗兩次。為了去除人類單域抗體庫中非專一性的噬菌體，將8x10⁶ 個32D細胞與5x10¹² 噬菌體共同置於添加2.5% BSA的2毫升無血清DMEM培養基中於室溫下溫和攪動1小時。之後以1,500 rpm轉速離心移除32D細胞用以收集上清液。將4x10⁶ 個32D-EGFR細胞與先經32D細胞剔除(depleted)之多株噬菌體於室溫下溫和攪動反應1.5小時。之後以預冷之PBS緩衝液清洗32D-EGFR細胞兩次。離心去掉上清液後，使32D-EGFR細胞回溶於1毫升的胰蛋白酶溶液，於室溫下反應30分鐘用以洗提出結合至細胞膜上之噬菌體。洗提所得的噬菌體如上述方法營救、定量及製備。進行32D-EGFR細胞的兩回篩選後，再進行EGFR-ECD的兩回篩選(如第2B圖)。將稀釋於PBS緩衝液中的EGFR-ECD(6 ug/ml)於4℃環境下溫和地攪動而貼附於Nunc-Immuno MaxiSorb管壁上。以PBS緩衝液清洗該管3次，加入約5×10¹² 個多株噬菌體於4毫升StartingBlock blocking buffer中，於室溫下以溫和地攪動反應1.5小時。以含有0.1% Tween 20的PBS緩衝液(PBST清洗緩衝液)清洗該管10次，再以PBS緩衝液清洗2次。以4毫升胰蛋白酶(trypsin)溶液在室溫下、溫和攪動1小時將結合至標的蛋白上之噬菌體洗提(elute)下來。洗提所得的噬菌體如上述方法營救、定量及製備。。以上述EGFR-ECD的篩選進行兩回後，收集到的噬菌體效價隨著每一回篩選而增加，在第4回收集到的噬菌體效價超過10¹⁰ (如第2B圖)。此結果顯示，最初兩回以32D-EGFR細胞篩選的噬菌體展示篩選可有效地篩選具有結合親合力的抗-EGFR抗體。

[實施例3]分離單株EGFR專一性抗體

在如實施例2(第2B圖)所述之篩選後，將系列稀釋所得之個別單株噬菌體分別以A431細胞為主的ELISA及以EGFR-ECD為主的ELISA進行分析，測試個別單株噬菌體與抗原的結合能力。進行分析前，將4x10⁴ 個EGFR過量表現的A431細胞接種於Corning CellBIND 96孔盤。經16-24小時培養之後以PBS清洗，以BD CytoFix fixation buffer於室溫下固定A431細胞約15-20分鐘。之後以StartingBlock blocking buffer在37℃條件下封閉(blocking)A431細胞約30分鐘。以PBST清洗緩衝液清洗96孔盤3次，之後每孔加入2倍稀釋的單株擴增噬菌體菌液於50微升的StartingBlock blocking buffer中，於室溫下反應1小時。以PBST清洗緩衝液清洗96孔盤5次。之後以HRP標記的抗M13抗體(經1:5,000稀釋於StartingBlock blocking buffer中)偵測與細胞結合之噬菌體並以TMB為偵測基質。同樣使用EGFR-ECD更進一步確認噬菌體展示篩選的結果。將稀釋於PBS緩衝液中的EGFR-ECD(6 ug/ml)於4℃環境下經反應一個晚上後貼附於Nunc MaxiSorb 96-孔盤。以PBST清洗緩衝液清洗96孔盤3次，之後每孔加入2倍稀釋的單株擴增噬菌體菌液於50微升的StartingBlock blocking buffer中，於室溫下反應1小時。以PBST清洗緩衝液清洗96孔盤5次。之後以HRP標記的抗M13抗體(經1:5,000稀釋於StartingBlock blocking buffer中)偵測與細胞結合之噬菌體並以TMB為偵測基質。

結果顯示，在以A431細胞為主的ELISA中得到56%以上的陽性結果(53/93)，其中29個陽性個別單株被挑選進行更進一步確認。如預期地，以EGFR-ECD為主的ELISA進行更進一步確認皆得到100%的陽性結果(29/29)。將第4回篩選所得的ELISA-陽性個別單株進行定序分析。如第3圖所示，根據序列分析，確認D2選殖株中的獨特序列，包含核苷酸變異株V1及V2。D2選殖株的變異株V1(D2(V1))的胺基酸序列如序列識別號3所示，編碼該胺基酸序列的核苷酸序列如序列識別號1所示。變異株V2(D2(V2))的胺基酸序列如序列識別號4所示，即序列識別號3所示之胺基酸序列的位置117的酪胺酸(Tyr)被置換為天冬胺酸(Asp)的胺基酸序列。D2(V2)胺基酸序列的核苷酸序列如序列識別號2所示。

[實施例4]　重組dAb-D2-hFc的表現及純化

重組的dAb-D2-hFc的二價抗體形態由dAb-D2(序列識別號1)與人類IgG1的Fc(序列識別號5)融合所構築。根據操作指南使用Effectene(QIAGEN)轉染試劑將表現dAb-D2-hFc之表現載體轉染入中國倉鼠卵巢CHO細胞株(RIKEN Bio Resource Center,Japan)。利用細胞培養液中含有400 ug/ml的Hygromycin B(Invitrogen)進行穩定表現細胞株篩選。經由以A431細胞為主的ELISA分析法及HRP標記的抗人類Fc抗體(1:10,000稀釋)作為偵測試劑，篩選出穩定表現dAb-D2-hFc的細胞株。使用奇異公司的Protein A親和性層析管柱從已過濾的細胞培養液中純化dAb-D2-hFc融合蛋白質。以SDS-PAGE分析法確認dAb-D2-hFc的還原態及非還原態。結果如第4圖顯示，dAb-D2-hFc融合蛋白的分子量約為80 kDa。

[實施例5]　重組V_H -dAb-D2x4-Ig的表現及純化

重組的V_H -dAb-D2x4-Ig的四價抗體由人類IgG的重鏈變異區(V_H )取代輕鏈變異區(V_L )的型態(V_H displace V_L form)融合所構築，其中重鏈變異區(V_H )部分皆是dAb-D2(序列識別號1)。根據操作指南使用Effectene(QIAGEN)轉染試劑將表現V_H -dAb-D2x4-Ig之表現載體轉染入中國倉鼠卵巢CHO細胞株(RIKEN Bio Resource Center,Japan)。利用細胞培養液中含有400 ug/ml的Hygromycin B(Invitrogen)進行穩定表現細胞株篩選。經由以A431細胞為主的ELISA分析法及HRP標記的抗人類Fc抗體(1:10,000稀釋)作為偵測試劑，篩選出穩定表現V_H -dAb-D2x4-Ig的細胞株。使用奇異公司的Protein A親和性層析管柱從已過濾的細胞培養液中純化V_H -dAb-D2x4-Ig融合蛋白質。以SDS-PAGE分析法確認V_H -dAb-D2x4-Ig的非還原態。結果如第5圖顯示，V_H -dAb-D2x4-Ig融合蛋白的分子量約為160 kDa。

[實施例6]　確認抗體結合的親和性

進行分析前，將4x10⁴ 個EGFR過量表現的A431細胞接種於Corning CellBIND 96孔盤。經16-24小時培養後先以PBS清洗，再以BD CytoFix fixation buffer於室溫下固定A431細胞約15-20分鐘。之後以StartingBlock blocking buffer在37℃條件下封閉(blocking)A431細胞約30分鐘。以PBST清洗緩衝液清洗96孔盤3次，將系列稀釋的特定濃度dAb-D2-hFc與V_H -dAb-D2x4-Ig融合蛋白質稀釋於於50微升的StartingBlock blocking buffer中並加入特定孔內，將96孔盤置於冰上反應1.5小時。以PBST清洗緩衝液清洗孔3次。將50微升的HRP標記的抗人類Fc抗體(以1:10,000稀釋於StartingBlock blocking buffer中)加入每孔中並置於冰上反應1小時。之後以PBST清洗緩衝液清洗孔3次並加入TMB偵測基質進行訊號偵測。以盤式免疫酵素分析儀讀取在450nm的吸光值。以SigmaPlot軟體分析dAb-D2-hFc融合蛋白質的解離常數(K_D )值為約52 nM(如第6圖)；V_H -dAb-D2x4-Ig融合蛋白質的解離常數(K_D )值為約6 nM(如第7圖)。

[實施例7]　抗體內噬作用分析

將生長於15-cm培養盤上的A431細胞以TrypLE^TM Select(Invitrogen)移除，以預冷的PBS緩衝液清洗兩次。使指定濃度的dAb-D2-hFc與V_H -dAb-D2x4-Ig融合蛋白質置於內含1x10⁶ 個A431細胞的無血清培養基中，分別在37℃或冰上個別反應30分鐘。以PBS緩衝液清洗後，在37℃條件下以TrypLE^TM Select處理10分鐘用以移除連接於膜上的蛋白質。以CelLytic^TM M(Sigma)細胞裂解液裂解經上述處理過之A431細胞，各組取相同蛋白質量的細胞裂解液進行西方點漬分析。以HRP標記的抗人類Fc抗體(以1:10,000稀釋於StartingBlock blocking buffer中)偵測內噬的dAb-D2-hFc與V_H -dAb-D2x4-Ig融合蛋白質。β-肌動蛋白(β-actin)(以1:5,000稀釋於StartingBlock blocking buffer中)為內部控制組。結果如第8與9圖所示，內噬作用反應為溫度依賴性，可觀察到在37℃條件下內噬的dAb-D2-hFc與V_H -dAb-D2x4-Ig融合蛋白質量高於在冰上(4℃)進行者。此結果確認dAb-D2-hFc與V_H -dAb-D2x4-Ig融合蛋白質具有內噬作用特性。

[實施例8]癌細胞株的生長抑制

A431　細胞的生長抑制作用是以PrestoBlue^TM (Invitrogen)細胞存活試劑組進行評估。簡單地說，在進行分析前，將2x10³ 個A431細胞接種於Corning 96-孔細胞培養盤內並經16-24小時的培養。以指定濃度的dAb-D2-hFc與V_H -dAb-D2x4-Ig融合蛋白質稀釋於含有0.5% FBS的培養液中用以處理上述細胞5天。在第5天結束時，於每孔培養液中加入20微升的PrestoBlue試劑並於37℃條件下共同反應2小時。使用盤式免疫酵素分析儀測量螢光的讀值(544 nm激發及590 nm散射)，用以評估細胞生長。結果如第10與11圖，顯示dAb-D2-hFc與V_H -dAb-D2x4-Ig融合蛋白質具有劑量依賴性(dose-dependent)抑制A431細胞生長之能力。

本案所引用的參考資料如下所示，此述之參考資料在此全文併入本文內容。

Alimandi M,LM Wang,D Bottaro et al. Epidermal growth factor and betacellulin mediate signal transduction through co-expressed ErbB2 and ErbB3 receptors. EMBO J,Sep 1997;16(18): 5608-17.

Cai W,K Chen,L He et al. Quantitative PET of EGFR expression in xenograft-bearing mice using 64Cu-labeled cetuximab,a chimeric anti-EGFR monoclonal antibody. Eur J Nucl Med Mol Imaging,Jun 2007;34(6): 850-8.

Fan Chia-Yu,Chuan-Chuan Huang,Wei-Chun Chiu et al. Production of multivalent protein binders using a self-trimerizing collagen-like peptide scaffold. FASEB J,Nov 2008;22: 3795-3804.

Filonov GS,KD Piatkevich,LM Ting et al. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotechnol,Aug 2011;29(8): 757-61.

Hamers-Casterman C,T Atarhouch,S Muyldermanset al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature,Jun 1993;363(6428): 446-8.

Heitner T,A Moor,JL Garrisonet al. Selection of cell binding and internalizing epidermal growth factor receptor antibodies from a phage display library. J Immunol Methods,Feb 2001;248(1-2): 17-30.

Jain Maneesh,Subhash C. Chauhan,Ajay P. Singhet al. Penetratin Improves Tumor Retention of Single-Chain Antibodies: A Novel Step toward Optimization of Radioimmunotherapy of Solid Tumors Cancer Res.,Sep 2005;65: 7840-7846.

Jespers L,O Schon,K Famm,and G Winter. Aggregation-resistant domain antibodies selected on phage by heat denaturation Nat Biotechnol,Sep 2004;22(9): 1161-5.

Lee CM,N Iorno,F Sierro et al. Selection of human antibody fragments by phage display. Nat Protoc,Jan 2007;2(11): 3001-8.

Lin WH,JS Song,TY Changet al. A cell-based high-throughput screen for epidermal growth factor receptor pathway inhibitors. Anal Biochem,Jun 2008;377(1): 89-94.

Miao Z,G Ren,H Liu et al. Cy5.5-labeled Affibody molecule for near-infrared fluorescent optical imaging of epidermal growth factor receptor positive tumors. J Biomed Opt,May 2010;15(3): 036007.

Olafsen Tove and Anna M. Wu. Novel Antibody Vectors for Imaging. Semin Nucl Med. 2010 May;40(3): 167-181.

Venisnik KM,T Olafsen,SS Gambhir et al. Fusion of Gaussia luciferase to an engineered anti-carcinoembryonic antigen(CEA) antibody for in vivo optical imaging. Mol Imaging Biol,Sep 2007;9(5): 267-77.

Wheeler DL,EF Dunn,and PM Harari. Understanding resistance to EGFR inhibitors-impact on future treatment strategies. Nat Rev Clin Oncol,Sep 2010;7(9): 493-507.

Yang Lily,Hui Mao,Y. Andrew Wang et al. Single chain epidermal growth factor receptor antibody conjugated nanoparticles for in vivo tumor targeting and imaging. Small. 2009 Feb;5(2):235-43.

雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟悉此項技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

第1A圖顯示融合蛋白dAb-D2-hFc的結構示意圖，V_H 區域表示抗體；

第1B圖顯示抗體與膠原蛋白摺疊結構的融合蛋白的結構示意圖，V_H 區域表示該抗體；

第1C圖顯示抗體與人類IgG的重鏈變異區(V_H )取代輕鏈變異區(V_L )的型態的融合蛋白的結構示意圖，V_H 區域表示該抗體；

第2A圖顯示以噬菌體展示篩選法篩選抗-EGFR抗體之一習知例的流程圖；

第2B圖以噬菌體展示篩選法篩選抗-EGFR抗體之本案一實施例的流程圖；

第3圖顯示表現抗-EGFR抗體的D2選殖株的變異區V1及V2的核苷酸序列排比；

第4圖顯示融合蛋白dAb-D2-hFc的還原態及非還原態；

第5圖顯示融合蛋白V_H -dAb-D2x4-Ig的非還原態；

第6圖顯示融合蛋白dAb-D2-hFc與A431細胞的結合親和力；

第7圖顯示融合蛋白V_H -dAb-D2x4-Ig與A431細胞的結合親和力；

第8圖顯示融合蛋白dAb-D2-hFc對A431細胞的內噬作用活性；

第9圖顯示融合蛋白V_H -dAb-D2x4-Ig對A431細胞的內噬作用活性；

第10圖顯示融合蛋白dAb-D2-hFc對A431細胞的生長抑制活性；

第11圖顯示融合蛋白V_H -dAb-D2x4-Ig對A431細胞的生長抑制活性。

<110>　財團法人工業技術研究院

<120>　抗人類表皮生長因子受體之抗體及其應用

<130>　0965-A23833TW

<160>　6

<170>　PatentIn version 3.5

<210>　1

<211>　384

<212>　DNA

<213>　Homo sapiens

<400>　1

<210>　2

<211>　384

<212>　DNA

<213>　Homo sapiens

<400>　2

<210>　3

<211>　128

<212>　PRT

<213>　Homo sapiens

<400>　3

<210>　4

<211>　128

<212>　PRT

<213>　Homo sapiens

<400>　4

<210>　5

<211>　696

<212>　DNA

<213>　Homo sapiens

<400>　5

<210>　6

<211>　232

<212>　PRT

<213>　Homo sapiens

<400>　6

Claims (28)

1. 一種抗表皮生長因子受體(EGFR)單域抗體，其係由序列識別號3所示之胺基酸序列所構成。
2. 如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中，序列識別號3所示之胺基酸序列的位置117的酪胺酸(Tyr)被置換為天冬胺酸(Asp)的胺基酸序列。
3. 如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中該抗體係由序列識別號1所示之核苷酸序列所編碼的胺基酸序列所構成。
4. 如申請專利範圍第2項所述之抗體，其中該抗體係由序列識別號2所示之核苷酸序列所編碼的胺基酸序列所構成。
5. 一種融合蛋白，包括申請專利範圍第1-4項任一項所述之抗體及人類IgG的Fc區域，其中該融合蛋白專一性地與表皮生長因子受體(EGFR)結合。
6. 如申請專利範圍第5項所述之融合蛋白，其中該融合蛋白為二價體。
7. 一種融合蛋白，包括申請專利範圍第1-4項任一項所述之抗體及膠原蛋白摺疊結構，其中該融合蛋白專一性地與表皮生長因子受體(EGFR)結合。
8. 如申請專利範圍第7項所述之融合蛋白，其中該融合蛋白為三價抗體。
9. 一種融合蛋白，包括申請專利範圍第1-4項任一項所述之抗體及人類IgG的重鏈變異區(V_H )取代輕鏈變異區 (V_L )的型態，其中該融合蛋白專一性地與表皮生長因子受體(EGFR)結合。
10. 如申請專利範圍第9項所述之融合蛋白，其中該融合蛋白為四價抗體。
11. 一種醫藥組成物，包括申請專利範圍第1-4項任一項所述之抗體或申請專利範圍第5-10項所述之融合蛋白，用於治療表皮生長因子受體(EGFR)過度表現所引起的疾病。
12. 如申請專利範圍第11項所述之醫藥組成物，其中該表皮生長因子受體(EGFR)過度表現所引起的疾病或症狀包括非小細胞肺癌、鱗狀細胞癌、頭頸癌、乳癌、攝護腺癌或卵巢癌。
13. 如申請專利範圍第11項所述之醫藥組成物，其中該醫藥組成物更包含醫藥上容許的載劑或添加劑。
14. 一種顯影劑，包括如申請專利範圍第1-4項任一項所述之抗體；以及一標記物，與該抗體連接。
15. 如申請專利範圍第14項所述之顯影劑，其中該標記物包括一顯色物質或放射物質。
16. 如申請專利範圍第15項所述之顯影劑，其中該顯色物質包括螢光染劑(fluorochromes)、螢光蛋白(fluorescent protein)、生物性冷光(bioluminescence)、量子點(quantum dots)、或氧化鐵奈米磁珠或超順磁化鐵奈米磁珠。
17. 如申請專利範圍第16項所述之顯影劑，其中該螢光染劑包括fluorescein isothiocyanate(FITC)、Alexa Fluor 系列螢光染劑或對稱型花青染料(Cyanine Dye,C2,Cy3 and Cy5)。
18. 如申請專利範圍第16項所述之顯影劑，其中該螢光蛋白包括近紅外螢光蛋白(phytochrome-based near-infrared fluorescent protein,iRFP)。
19. 如申請專利範圍第16項所述之顯影劑，其中該生物性冷光包括螢火蟲螢光素酶(firefly luciferase,Fluc)或Gaussia 螢光素酶(Gaussia luciferase,Gluc)。
20. 如申請專利範圍第15項所述之顯影劑，其中該放射物質包括釔90、銦111或碘131。
21. 如申請專利範圍第14項所述之顯影劑，其中該顯影劑用於細胞螢光或冷光顯影、正子斷層掃描(PET)或磁共振成像(MRI)顯影。
22. 一種體外標記細胞的方法，包括：提供一帶有申請專利範圍第1-4項任一項所述抗體之標記分子；以及混合該標記分子與欲標記生物樣品，使標記分子與該樣品中具表面抗原EGFR細胞形成一結合分子。
23. 如申請專利範圍第22項所述之體外標記細胞的方法，其中該標記分子包含一顯色物質或放射物質。
24. 如申請專利範圍第23項所述之體外標記細胞的方法，其中該顯色物質包括螢光染劑(fluorochromes)、螢光蛋白(fluorescent protein)、生物性冷光(bioluminescence)、量子點(quantum dots)、或氧化鐵奈米磁珠或超順磁化鐵奈米 磁珠。
25. 如申請專利範圍第24項所述之體外標記細胞的方法，其中該螢光染劑包括fluorescein isothiocyanate(FITC)、Alexa Fluor系列螢光染劑或對稱型花青染料(Cyanine Dye,C2,Cy3 and Cy5)。
26. 如申請專利範圍第24項所述之體外標記細胞的方法，其中該螢光蛋白包括近紅外螢光蛋白(phytochrome-based near-infrared fluorescent protein,iRFP)。
27. 如申請專利範圍第24項所述之體外標記細胞的方法，其中該生物性冷光包括螢火蟲螢光素酶(firefly luciferase,Fluc)、Gaussia 螢光素酶(Gaussia luciferase,Gluc)。
28. 如申請專利範圍第23項所述之體外標記細胞的方法，其中該放射物質包括釔90、銦111或碘131。