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TWI441645B - 作為新穎之局部用止血劑的活化型因子Ｘ（ＦＸａ）刺激劑 - Google Patents

作為新穎之局部用止血劑的活化型因子Ｘ（ＦＸａ）刺激劑 Download PDF

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TWI441645B
TWI441645B TW095128519A TW95128519A TWI441645B TW I441645 B TWI441645 B TW I441645B TW 095128519 A TW095128519 A TW 095128519A TW 95128519 A TW95128519 A TW 95128519A TW I441645 B TWI441645 B TW I441645B
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TW
Taiwan
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factor
tissue factor
activated
coagulation
fxa
Prior art date
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TW095128519A
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English (en)
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TW200744628A (en
Inventor
Javier Pedreno Egea
Luis Caveda Catasus
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Thrombotargets Europe Sl
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Publication date
Application filed by Thrombotargets Europe Sl filed Critical Thrombotargets Europe Sl
Publication of TW200744628A publication Critical patent/TW200744628A/zh
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Description

作為新穎之局部用止血劑的活化型因子X(FXa)刺激劑
本發明關於使用活化型因子X刺激劑以局部治療個體之出血。本發明係基於脂化組織因子(TF)展現新穎調節功能之發現，該功能可刺激可溶性及結合凝血酶原酶(prothrombinase)複合物之活化型因子X的所有溶蛋白活性(胺水解及凝血酶原水解活性)。
 發明背景 1.凝血生理學
止血(Hemostasis)係生物體對出血之反應機制，其中包括二種在受傷後立即啟動且維持長時間活化之過程。第一個過程被稱為原發性止血作用，其特徵在於血管受傷部位發生血管收縮並形成血小板聚集。第二個過程稱為繼發性止血作用，此階段係因不同凝血梯瀑(coagulation cascade)之溶蛋白酵素作用，導致纖維蛋白凝塊形成。
血小板聚集係微血管止血之關鍵，這對黏膜皮膚出血特別重要。相反的，纖維蛋白凝塊形成對大血管止血較為重要，尤其是內出血(胃腸道、腦出血等)。血小板形成聚集的過程可分為下列階段：(i)血小板黏附至受傷暴露的內皮下層(sub－endothelium)表面；(ii)血小板被活化後釋出顆粒內容物；(iii)血小板聚集造成更多血小板在受傷部位收縮(sequestering)及濃縮；及(iv)纖維素原(fibrinogen)及其他凝血蛋白結合至血小板表面，以形成可以讓血栓平板(plates)融合及硬化，進而穩固止血凝塊的凝血酶(thrombin)及纖維蛋白(fibrin)凝塊。另外，眾所週知血小板數係纖維蛋白凝塊形成之關鍵；血小板數低於20,000/微升會伴隨嚴重的出血事件。
凝血過程的第二階段由一些輔助因子及溶蛋白酵素(皆稱為凝血因子)參與，這個階段包含許多步驟，凝血酶水解纖維素原以形成纖維蛋白是最終步驟。另外，凝血酶的產生亦促使血小板聚集，因為有更多血小板被活化及聚集。凝血酶最先係由溶蛋白酵素水解一種稱為凝血酶原(prothrombin)之酶蛋白(apoenzyme)形成。此蛋白水解作用係由結合在活化血小板表面之絲胺酸蛋白酶(活化型因子X)進行，且只有當其輔助因子(活化型凝血因子V)及鈣離子存在時，此絲胺酸蛋白酶才能水解凝血酶原。活化型因子X可由二種不同途徑產生，分別稱為內因性途徑及外因性途徑。
內因性途徑由一連串反應組成，主要和凝血因子VIII(FVIII)、凝血因子IX(FIX)及凝血因子XI(FXI)有關，其中各酶原(proenzyme)被水解以產生各自的活化型蛋白酶(FVIIIa、FIXa及FXIa)。在各步驟中，新形成之溶蛋白酶將相繼催化激活次一酶原以產生活化型。在內因性途徑中，有許多不同的凝血因子被活化；因此，內因性途徑中任何蛋白質之缺乏將以梯瀑(cascade)方式阻斷下一步驟之活化，於是使凝塊無法形成，提高出血風險。不同凝血因子缺乏將造成嚴重的出血症候群，例如因子VIII、因子IX及因子XI缺乏分別造成血友病A、B及C。
在血液凝結外因性途徑中，傷口部位暴露出之血管外膜細胞組織因子，結合循環中之凝血因子VII/活化型凝血因子VII(FVII/FVIIa)，以形成TF：：FVIIa複合物，當鈣離子存在時，此複合物作為因子X活化之基質。外因性途徑是目前公認最重要的凝血途徑，一般認為如果因為血管受傷導致出血，將啟動涉及組織因子及其配體(FVII/FVIIa)交互作用之外因性途徑凝血。
TF：：FVIIa複合物在凝血中的另一項功能係作為基質，以使因子X因為活化型因子VII而發生活化。結果，一開始不足以使纖維蛋白凝塊形成之活化型因子X的基底濃度(<150微微莫耳)因而上升。這種活化型因子X基底濃度的上升，若配合其輔助因子(活化型因子V)及細胞性促凝表面之存在，將能夠產生纖維蛋白凝塊形成所需之凝血酶。目前認為一旦血小板被活化，就開始在凝血過程扮演關鍵角色。它們不但提供富含陰離子磷脂質之促凝表面，而且還暴露出儲存其內之活化型因子V及活化型因子X。所有這些都讓不同的凝血相關物質能正確組合在血小板的細胞膜表面，形成著名的凝血酶原酶(prothrombinase)複合物(包含活化型因子X、活化型因子V、凝血酶原及陰離子促凝性血小板磷脂質表面)。
外因性途徑活化理論可用於解釋，凝血反應是如何透過TF：：FVIIa複合物而開始。說明TF：：FVIIa複合物於凝血過程之生物重要性的一個例子，就是瀰漫性血管內凝血(DIC)症候群。此臨床症候群與血管內釋放組織因子有關，可出現於嚴重臨床疾病之病程中(休克、敗血症、心跳停止、大出血、肝病、大手術、燒傷等)。
很明顯的當活化型因子VII缺乏時，例如先天性缺乏此因子，理論上無法發生凝血，因為無法激活足夠濃度之因子X，將導致危及生命之出血症狀。鼠模式證實此一理論，因子VII缺乏鼠將因嚴重致命之出血而無法存活。然而，人類到目前為止被描述的先天性因子VII缺乏症，並不一定會伴隨出血。曾經有過沒有臨床症狀之因子VII完全缺乏的病例報告，發生在無任何出血併發症之健康人身上。這些在在顯示，人類一定有其他與因子VII無關的啟動凝血機制。
組織因子(TF)係屬於專一性結合因子VII/VIIa之第二類細胞激素受體超家族的完整膜糖蛋白，在外因性凝血途徑中扮演重要角色。組織因子所具備之生理功能為人熟知；一方面它是活化型因子VII之專一性受體，一旦形成TF：：FVIIa複合物便成為使因子X發生活化之基質。事實上，當血管受傷後，原本被隔離在血管外圍之外膜細胞表面的組織因子接觸其配體(血液中之因子VII)並產生交互作用，形成TF：：FVII複合物。此複合物一形成，因子VII便開始自動活化(autoactivation)以產生活化型因子VII(FVIIa)。目前關於TF：：FVII複合物之結構有詳細研究。在和組織因子的交互作用中，因子VII參與的主要結合部位係位於類似表皮生長因子(EGF)第一結構域之結構域及蛋白酶結構域。另一方面，亦有其他較不重要之結合部位參與的報告(富含4－羧基麩胺酸之結構域(Gla結構域)及表皮生長因子之第二結構域)。組織因子之結合部位係位於二個第三型纖維結合蛋白(fibronectin)結構域及二個結構域之間的中間區。
最近的研究已經發現，組織因子之第165及166個離胺酸殘基，可以與活化型及非活化型因子X之Gla結構域產生交互作用。然而和TF：：FVIIa複合物不同的是，我們對組織因子與因子X及活化型因子X之交互作用所知甚少。首先，有資料顯示離胺酸(第165及166個)殘基可作為因子X活化之基質。另一方面，最近的研究描述組織因子可作為活化型因子X之輔助因子以活化因子VII。也就是說，因子VII和組織因子之結合，刺激了活化型因子VII的自動活化及因子X的活化。之後，結合組織因子之活化型因子X將刺激因子VII活化，進而增加因子X之活化，致使凝血酶原水解及纖維蛋白凝塊形成。
發明人發現，組織因子作為活化型因子X之輔助因子的假設角色係更為重要之止血關鍵。雖然組織因子公認的角色係因子VII之膜受體，發明人證實組織因子亦為活化型因子X之有效刺激劑。作為活化型因子X刺激劑之組織因子，可顯著提高活化型因子X的溶蛋白活性。本文中使用的「活化型因子X刺激劑」係指所有形式的活化型因子X，諸如可溶性活化型因子X及結合凝血酶原酶複合物之活化型因子X。
眾所周知，微微莫耳濃度之活化型因子X無法產生任何凝血作用，即使其著名的輔助因子活化型因子V存在時亦然(見表9)。因此在這種情況下，凝血酶原酶複合物不具活性。令人意外的是，當組織因子存在時(受傷或外源性給予)，即使沒有因子VII/VIIa，微微莫耳濃度之活化型因子X(生理性基礎濃度或外源性給予)仍能造成凝血酶原水解，導致纖維蛋白凝塊形成(表7)。
在本專利申請書中，發明人描述TF：：FXa交互作用係新穎之啟動凝血機制，與TF：：FVIIa複合物及外因性凝血途徑無關。
最後，眾所皆知的一些血小板疾病伴隨血小板凝集異常發生及較高之出血風險，其中以葛萊斯曼氏病(Glanzmann’s disease)及伯納德－蘇利爾氏症候群(Bernard－Soulier syndrome)為代表，它們分別被發現具有影響纖維素原受體及Gp1b受體的先天性缺陷。另一方面，在先天性及後天性血小板缺乏症中，血小板數低於20,000/微升將出現嚴重的出血事件。
在本專利申請書中，發明人證實脂化組織因子亦能有效治療先天性、後天性血小板疾病或嚴重血小板低下症(低於9,000/微升)之出血。
2.凝血病理學
先天性缺乏各種凝血因子可能導致出血發生，它們通常與單一蛋白質有關；例如血友病A是一種缺乏因子VIII的遺傳性出血性疾病。後天性凝血疾病發生於無出血病史之個體，可能有多重來源；舉例來說，接受多次輸血之個體體內可能有凝血因子專一性抑制劑。雖然後天性凝血因子缺乏症(亦造成嚴重止血問題)的來源不明，它們也是先天性凝血異常病患在接受多次輸血時會發生最嚴重的問題之一。其他重要的後天性凝血疾病來源係抗凝劑治療，例如肝素(heparin)及殺鼠靈類(warfarin)藥物。顯著比例(5至10%)的抗凝劑治療病患出現出血事件，這些事件大多數不易治療。
如前所述，先天性及後天性血小板疾病亦會造成出血。血小板數降低(低於20,000/微升)可能導致經常嚴重出血之纖維蛋白凝塊形成障礙。
目前可用於輕度/中度或嚴重/致命出血(手術或外傷造成)的治療上可選用之方法非常有限。有一些不同的止血劑可以加速凝血及防止出血，例如(1)源自人類的血液製品(諸如凝血因子濃縮劑)及局部止血劑(諸如纖維膠原蛋白、纖維蛋白膠及凝血酶原複合物濃縮劑)；(2)人類基因重組蛋白；(3)抗纖溶劑(例如胺基己酸(aminocaproic acid)、止血環酸(tranexamic acid))；及(4)無機局部止血劑(諸如矽石及陶土表面)。
下列重要限制曾被報告：(1)靜脈投藥(2)需使用特殊投藥設備(3)治療目標狹窄(4)對特定出血事件無法給予適當或簡便之治療(5)缺乏急性作用(6)纖維蛋白凝塊不穩定(7)副作用非常危險(8)治療費用昂貴
源自人類的血液製品(凝血因子及血小板濃縮製劑)這是一種費用昂貴且不易取得之治療，必須經由靜脈投藥。其治療目標非常狹窄，只能用於治療特定因子缺乏。這種製品不適用於局部治療任何種類的出血事件，也無法用於急性治療出血，因為需要長期投藥計畫才能發揮效用。除此之外，這是一種非常危險的治療：20%的血友病患者得到肝炎、5%感染人類免疫不全病毒、高達15%出現抗因子VIII或IX的血漿抗體(後天性血友病)，必須使用特殊且昂貴的替代治療(免疫抑制劑、高劑量的凝血因子、血漿置換術等)。因為這些原因，公共衛生組織(世界衛生組織(WHO)、美國食品藥物管理局(FDA)、歐洲醫藥管理局(EMEA)等)極欲發展優於凝血因子濃縮製劑之新穎止血劑。
局部止血劑這是一種昂貴的治療，不適合某些出血狀況(例如鼻出血)，在牙科治療上使用困難，所形成的纖維蛋白凝塊不穩定，具有和凝血因子濃縮製劑一樣的潛在危險副作用。它們不應被用於不曾接受源自人類血液製品治療之患者，或是因考慮人類病毒傳染之潛在風險而接受基因重組因子VIII或IX治療者。
人類基因重組蛋白這是最昂貴的治療(平均費用6,000歐元)，只在先進國家使用。和凝血因子濃縮製劑相同的是，這種製劑一定要經靜脈給予，只能用於治療特定因子缺乏，因此治療目標非常狹窄，不適合局部治療出血，無法急性治療出血(亦須長期投藥計畫才有效)。雖然不曾有人類病毒傳染之報告，但是有相同比例的後天性血友病(高達15%出現抗因子VIII或IX的抗體)。如同凝血因子濃縮製劑，公共主管機關亦大幅限制其用途。
抗纖溶劑抗纖溶劑最主要的限制在於治療目標狹窄，使用這些藥物需要先能形成纖維蛋白凝塊，因此只能用於健康個體。如果無法形成適當的纖維蛋白凝塊(即先天性凝血異常，如血友病、因子VII缺乏)，其療效將大幅降低。另外它們無法用於急性治療出血，因為也需要長期投藥計畫才有效。
無機局部止血劑這些止血劑最主要的使用限制在於無法適當投藥於大多數的出血事件，例如鼻出血、牙科及手術。另外曾有疼痛放熱反應之報告，因此其用途僅限於危急狀況(如戰爭)下的黏膜皮膚出血。
總結來說，其實目前並沒有適合用於局部治療簡單的鼻出血、刷牙後牙齦出血，或單純因為刮鬍子、抽血靜脈穿刺或走路意外跌倒所導致之日常傷口的藥物。這個問題在具有出血特異質的病患身上更為嚴重，例如血友病或溫韋伯氏病(von Willebrand disease)之先天性凝血異常患者，葛萊斯曼氏病(Glanzmann’s disease)或伯納德－蘇利爾氏症候群(Bernard－Soulier syndrome)之先天性血小板疾病患者，或後天性凝血異常患者。這些病患在日常生活中就會遇到嚴重的問題，即使簡單的拔牙或任何小創傷所導致的出血傷口，都沒有醫藥治療可以改善他們的生活品質。當這些病患受到外傷或嚴重的出血意外，這個問題將益形嚴重，因為他們的生命受到嚴重威脅。在所有這些情況中，唯一可以使用的醫藥工具是給予包含患者所欠缺之因子的人類血漿，或專門用於各種凝血因子缺乏之人類基因重組因子。但是這些療法都必須經由非經腸途徑給予，因此無法在像是日常輕微或中度出血的情況下經常使用。最後，無上述限制之新穎局部止血劑被廣泛認為將能顯著改善目前之療法，既可降低成本又能減少副作用之發生。
3.發明背景
直到目前組織因子才被認為是引起凝血之主要元件。要開始凝血，必須先激活因子X成為活化型因子X，以啟動凝血酶原水解。活化型因子X的來源主要來自活化型因子VII與其受體(組織因子)之交互作用。雖然有報告指出活化型因子X存在於血小板顆粒中，當它開始活化時會被暴露於表面，但是血中的活化型因子X生理濃度(<150微微莫耳)不足以啟動凝血酶形成，即使其輔助因子活化型因子V及血小板促凝表面存在時亦然(圖1)。因此，目前認為只有當活化型因子X之基底濃度顯著上升時才會開始凝血。活化型因子X基底濃度上升之來源一向被歸因於二點，TF：：FVIIa複合物及活化型因子IX的溶蛋白活性(圖2)。
脂化組織因子基因重組蛋白只能促進活體外之健康或血友病血液檢體的凝血狀態，此作用可歸因於組織因子作為活化型因子VII之受體的典型功能。但是在相同的實驗條件下，非脂化之組織因子完全缺乏這種作用，這表示脂化係組織因子發揮功能所需(見結果6.1)。
脂化組織因子作為局部止血劑之用途，不曾以單一治療之方式被描述用於輕微、嚴重或致命之出血(外傷或手術性動脈及靜脈出血)。
歐洲專利EP 266993揭示非脂化組織因子作為非經腸治療出血症候群之止血劑的用途。然而，這個相同的專利揭示出非脂化組織因子(EP 266993所主張者)與本專利申請書之脂化組織因子物件之間有重要的活性差異。
事實上，眾所週知脂化組織因子在活體外條件下具有活性，且非經腸給予將立即引起致命的瀰漫性血管內凝血。相反的，非脂化組織因子在活體外不具活性，但是有專利(EP 266993)主張其可藉由非經腸投藥用於治療凝血異常。
到目前為止，並沒有關於脂化與非脂化組織因子用於單次局部治療出血事件之作用的資料。在本專利申請書中，發明人利用大鼠斷尾模式證實非脂化組織因子無法控制出血。相反的，發明人首次證實，脂化組織因子係可用於局部治療各種出血之止血劑，包括病理性(肝素及殺鼠靈處理之動物)及健康(不改變凝血功能之對照大鼠)的狀況下。整體來說，這表示脂化組織因子與非脂化組織因子係明顯不同之化合物。因此，脂化組織因子作為單一局部治療出血之藥物上的用途並非熟習此項技術者所易於了解。
另一方面，EP 266993係根據現有技術實施，該技術假設絲胺酸蛋白酶因子VII只有在結合其受體(組織因子)時才能被活化。因此，根據EP 266993及現有技術，當因子VII/VIIa不存在時，組織因子一定不具活性。任何熟習此項技術者無法輕易的想到，組織因子(脂化及非脂化)可能可以有效的治療因子VII缺乏病患。但是發明人發現，即使因子活化型VII不存在，組織因子亦可作為活化型因子X之輔助因子。這項發現對於了解非脂化組織因子亦可作為非經腸止血劑以治療因子VII缺乏病患之出血而言非常重要。
根據國際專利申請書WO 94/02172之揭示，藉由全身性給予自然抗凝物抑制劑(抗體)以暫時抑制一或多種自然抗凝物，可防止微血管出血。該抑制劑可視需要與局部給予之凝血酶或脂化組織因子組合投藥。應注意的是，這二種化合物之用途一向屬於選擇性輔助治療，不曾被當成單一治療。另外，WO 94/02172主張這些協同治療之用途僅供治療微血管出血(即燒傷、發炎臟器表面、出血肝臟表面...)，不曾用於因手術或外傷造成動脈及靜脈受傷之嚴重或致命出血。然而WO 94/02172之發明人承認，雖然他們觀察到局部凝血酶與全身性治療組合投藥時有協同作用，但是並未發現局部給予組織因子時有這類協同作用(WO 94/02172，圖3及第22頁，第14至15行)。另外，WO 94/02172中所主張之劑量範圍甚廣，從0.1至10毫克。
和WO 94/02172相反的是，本專利申請書主張單獨使用脂化組織因子，以單一治療輕微/中度至嚴重/致命之動脈或靜脈出血，以實施例為例，這種治療在1.2微克/毫升之活性蛋白質劑量下可有效處理創傷性出血(見表24及25中之嚴重模式)。這種令人驚訝且格外有效之治療過去不曾被描述，因為脂化組織因子作為活化型因子X之溶蛋白活性刺激劑對熟習該項技術者而言並非顯而易見。發明人發現當缺乏活化型因子VII時，組織因子可作為活化型因子X的輔助因子，即使其著名的輔助因子活化型因子V不存在。這項發現非常重要，讓我們了解脂化組織因子可單獨作為止血劑，以治療健康及病理狀況下之嚴重出血。
美國專利第4,721,618號揭示靜脈給予高濃度(0.2至0.5單位/公斤)之磷脂質(PCPS)及活化型因子X協同性混合物，可以不顧血友病哺乳類病患之因子VIII：C缺乏，使凝血梯瀑過程得以繼續進行。此建議之高濃度活化型因子X不需PCPS脂質粒(可提高活性)即具有活性。WO 02/086118同樣揭示包含至少一種特殊磷脂質及至少一種絲胺酸蛋白酶活化型凝血因子之混合物的組成物，其可用於治療凝血疾病以降低使用凝血因子之需求。
另外，WO 02/30479曾主張使用鞣花酸(ellagic acid)及其他促進劑諸如沸石(zeolite)、矽石及無機氧化物以促進凝血。
根據WO 02/086118，凝血因子之定義為絲胺酸蛋白酶活化型凝血因子(第5頁第13至15行)。因此組織因子不被視為凝血因子，因為組織因子並非絲胺酸蛋白酶，而是活化型因子VII之專一性細胞表面受體。
在本專利申請書中，發明人證實磷脂質(不同百分比及莫耳濃度之磷脂醯絲胺酸(phosphatidylserine)及磷脂醯膽鹼(phosphatidylcholine))無法提高由脂化組織因子所媒介之促凝效果(表21)，這表示美國專利第4,721,618號及WO 02/086118所主張之協同作用僅限於絲胺酸蛋白酶活化型凝血因子，不適用諸如組織因子之膜受體。但令人意外的是，當脂化組織因子同時結合負電荷無機表面(NCIS)，即可在活體外及活體內之實驗條件下觀察到顯著的協同作用。本文所述之負電荷無機表面係由脂肪及血液凝集促進劑(鞣花酸)之混合物組成。該脂肪具有靜負電荷，這表示該脂肪混合物可包含中性或兩性離子脂肪，但一定包含能使混合物具有陰離子特性之量的負電荷脂肪。舉例來說(但不限於此例)，負電荷脂肪可以是神經脂質(諸如腦醯胺－1－磷酸鹽、糖化磷脂醯乙醇胺、羥化或非羥化髓硫脂、神經節苷脂)或甘油底質脂肪(諸如磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、磷脂醯肌醇磷酸鹽、磷脂酸、磷脂醯甘油、心脂)。市面上有商品化之負電荷無機表面，諸如DadeActin(Dade Behring)商標，例如DadeActinFS。
總結來說，本專利申請書敘述一種新穎之局部用止血劑，其特徵在於具有下列相對於目前藥品之優點：(1)簡單的局部投藥(2)局部投藥不需使用特殊設備(3)治療目標廣泛(因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII及因子XIII缺乏症)(4)對所有出血事件均可給予適當治療(鼻出血、牙出血、黏膜皮膚出血、創傷性出血及手術出血)(5)具有效之急性作用(6)生理性纖維蛋白凝塊形成(高度凝塊穩定性)(7)無副作用(8)治療費用低
世界衛生組織(WHO)、美國食品藥物管理局(FDA)、歐洲醫藥管理局(EMEA)及其他公共衛生主管機構的主要目標，是要減少使用人類衍生血液製品相關的危險副作用。本發明之設計符合這些未被滿足之需求。
 發明摘要
TF：：FVIIa複合物在凝血之功能廣為人知，其作為一種基質，使因子X活化得以發生。最近的研究已經發現，組織因子第165及166個離胺酸殘基可以與活化型及非活化型因子X之Gla結構域產生交互作用。然而和TF：：FVIIa複合物不同的是，我們對組織因子與因子X及活化型因子X之交互作用所知甚少。目前的研究僅描述組織因子可作為活化型因子X之刺激劑以活化因子VII。也就是說，活化型因子X和組織因子之結合將刺激因子VII的活化，進而促進因子X活化。
發明人發現組織因子具有作為活化型因子X之刺激劑的功能，這是更為重要之止血關鍵(圖3)。眾所週知微微莫耳濃度之活化型因子X無法產生任何凝血及血小板凝集作用。雖然組織因子公認的角色係作為因子VII之膜受體，發明人證實組織因子亦可作為活化型因子X之刺激劑，以促進其主要的溶蛋白活性(水解凝血酶原)，導致纖維蛋白凝塊形成。
令人意外的是，當組織因子存在時(受傷或外源性給予)，即使沒有其配體(因子VII/VIIa)，微微莫耳濃度之活化型因子X仍能造成凝血酶原水解，導致纖維蛋白凝塊形成。整體結果顯示組織因子作為活化型因子X之刺激劑，及活化型因子X與組織因子之專一性結合係啟動凝血機制的第一步。
發明人的資料指出，凝血發生之速度將視組織因子與所有先前敘述之活化型因子X形式之間的交互作用而定。
在無法單獨啟動凝血之活化型因子X生理濃度(<150微微莫耳)下，脂化組織因子之輔助因子的作用，可快速造成凝血酶形成。
這些止血作用其實和因子VII或活化型因子VII的存在與否無關，所以由內源性TF：：FXa複合物(活化型因子X<150微微莫耳)所媒介之促凝效果對於因子VII之缺乏特別有效且重要。然而，在先天性缺乏其他凝血因子之病患(諸如因子VIII(血友病A)、因子IX(血友病B)、因子XI(血友病C)、因子V、因子X、因子XII及因子XIII)，及先天性血小板疾病(諸如伯納德－蘇利爾氏症候群(Bernard－Soulier syndrome)及葛萊斯曼氏病(Glanzmann’s disease))及血小板低下症個體之病例中，也可以發現其強效的止血作用。
因此，本發明係根據脂化組織因子單一治療或與活化型因子X及/或負電荷無機表面之組合物作為活化型因子X之新穎刺激劑，以供局部治療健康個體或具有出血特異質病患之出血上的用途。
發明人得到的結果開啟非脂化組織因子或其功能性片段用於治療因子VII缺乏個體之出血上的用途，該治療可藉由使用非經腸給予非脂化組織因子之適當藥學給藥形式完成。
因此一方面，本發明關於脂化組織因子或其功能性片段於製造供局部治療個體出血的藥物上之用途。
另一方面，本發明關於一種單獨包含脂化組織因子或脂化組織因子與活化型凝血因子X及/或負電荷無機表面之組合物的產品。該產品作為藥物或在製造供治療個體出血之藥物上之用途組成本發明的其他方面。
另一方面，本發明關於一種由脂化組織因子及化合物所組成之複合物，該化合物選自活化型因子X、負電荷無機表面或二者之組合物。該複合物作為藥物或在製造供治療個體出血之藥物上之用途組成本發明的其他方面。
另一方面，本發明關於一種包含脂化組織因子及藥學上可接受之載體的藥學組成物。在特定實施例中，該藥學組成物進一步包含活化型凝血因子X及/或負電荷無機表面。
另一方面，本發明關於一種包含該藥學組成物及載劑之產品。在特定實施例中，該藥學組成物進一步包含活化型凝血因子X及/或負電荷無機表面。
另一方面，本發明關於非脂化組織因子或其功能性片段於製造供治療凝血因子VII缺乏個體之出血的藥物上之用途。在特定實施例中，該藥物被調配為適用於非經腸給予非脂化組織因子之藥學給藥形式。
本發明之詳細說明
本文所描述之現象首次發現，脂化組織因子在其配體(因子VII/VIIa)不存在時，可作為活化型因子X之刺激劑，導致此酵素啟動凝血酶原水解，進而使凝血發生。這項新穎機制在活化型因子X濃度非常低時(低於生理性的150微微莫耳)特別重要。眾所週知有一些血小板疾病會造成血小板凝集異常及出血傾向升高，因此外源性給予脂化組織因子不僅適用於先天性凝血異常，更可以被用於治療先天性及後天性血小板疾病，諸如葛萊斯曼氏病(Glanzmann’s disease)、伯納德－蘇利爾氏症候群(Bernard－Soulier syndrome)及血小板低下症。
因此，凝血發生之速度並非如過去認為的視TF：：FVIIa複合物形成及之後因子X之活化而定，而是取決於組織因子及生理基礎濃度(<150微微莫耳)之活化型因子X的交互作用。此交互作用所導致最重要的生理結果係快速啟動凝血，這僅需血中有生理濃度之活化型因子X，及與刺激劑組織因子之交互作用。此過程因為複合物初期所形成之凝血酶及大量形成之活化型因子X而立刻被擴大，不論是因為TF：：FVIIa複合物或因為凝血酶本身。
因此發明人的發現明確指出，當缺乏活化型因子VII，但是有無法自行引起凝血之生理濃度(<150微微莫耳)的活化型因子X存在時，脂化組織因子因為具有活化型因子X之刺激劑的新穎作用，可以快速啟動凝血酶形成，促使凝血酶原開始水解。另一方面，發明人的發現顯示，當同時給予脂化組織因子及低濃度之活化型因子X(本身無法展現抗出血作用)時，可快速造成纖維蛋白凝塊開始形成。給予TF：：FXa組合物所觀察到之作用，尤其是活化型因子X濃度低於150微微莫耳時，遠優於單獨給予脂化組織因子時所觀察到之作用。活化型因子X及脂化組織因子與負電荷無機表面之組合物更可以促進止血作用。所得到的結果證實，血漿中有無法自行引起初步促凝反應之基礎濃度活化型因子X時(<150微微莫耳)，作為活化型因子X之刺激劑的組織因子可使該反應發生。
因此，脂化組織因子單一治療或與活化型因子X及/或負電荷無機表面之組合物可作為新穎的局部止血劑，以治療健康個體或具有出血特異質病患之出血。
非脂化組織因子或其功能性片段同樣可以被當成新穎的止血劑，以非經腸給予之較佳方式用於治療因子VII缺乏病患之出血。
I.脂化組織因子於局部治療出血上之用途
發明人意外發現脂化組織因子可增加活化型因子X之溶蛋白活性，進而促使凝血酶產生[見本文所包含之實施例結果的第1節]。發明人亦觀察到脂化組織因子可在不論活體外[見本文所包含之實施例結果的第1至5節]或活體內[見本文所包含之實施例結果的第6至7節]，使健康個體及凝血因子缺乏病患(包括因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII及因子XIII缺乏者)之血漿及血液凝結，亦可使抗凝血病患(經抗凝血藥物處理，諸如但不限於肝素、低分子量肝素或香豆素衍生物等)之血漿或血液凝結。發明人進一步觀察到脂化組織因子可使血小板疾病患者凝血[見本文所包含之實施例結果的第5節]。這些結果清楚顯示，脂化組織因子係可用於局部治療個體出血之止血劑。
以現有技術而言，無法顯而易見的想到將組織因子作為健康個體或血友病患者(因子VIII、因子IX或因子XI缺乏症)之局部單一促凝治療。
就下列情況中均不可能想到，包括因子VII缺乏病患，因為無法形成組織因子－因子VII複合物；因子V或因子X缺乏病患，因為無法組合形成凝血酶原酶複合物；肝素處理病患，因為凝血酶及活化型因子X均被抗凝血酶III阻斷；及殺鼠靈處理病患，因為所有維生素K依賴性凝血因子(因子VII、因子IX及因子X)之合成均被阻斷。
因此，一方面，本發明之目的在於脂化組織因子或其功能性脂化片段於製造供局部治療個體出血的藥物上之用途。
組織因子係廣泛存在動物界之完整膜糖蛋白，組織因子蛋白具有結構域構造，也就是有獨立功能區域之蛋白質。人類組織因子載脂蛋白之各結構域具有獨特的結構及功能特徵；(1)含32個胺基酸引導序列之訊號胜肽或區域，在蛋白質從不成熟處理至成熟形式之過程中進行此轉譯後修飾；(2)包含約219個末端胺基酸的N－糖基化細胞外親水性結構域；(3)約23個主要為疏水性胺基酸之片段，這些被認為是跨膜結構域胺基酸；及(4)21個胺基酸之羧基端，這被認為是蛋白質細胞質片段之胺基酸形成部分。這種人類組織因子蛋白質的結構域構造允許生產例如蛋白質或其功能性片段之胞外結構域。人類組織因子蛋白之胺基酸序列已經被發現，可在諸如NCBI之蛋白質資料庫中查到(人類組織因子，取得號碼：P13726)。
本文所使用的「脂化組織因子」一詞，係指任何來源但完全或部分插入脂質粒或細胞膜中之組織因子。「脂化組織因子」之來源包括但不限於：含脂化組織因子之萃取物(其可從一些組織當中分離出來，例如腦、胎盤組織、肺組織、來自不同動物之組織，例如羊、牛、兔、犬、人類等)；純化及(再)脂化之組織因子蛋白成分(從萃取物或基因重組組織因子中純化)，也就是在純化後被加入之該脂質成分，並藉由例如但不限於Morrisey之前所描述之方法加以製備[見本文所包含之實施例]。在該方法中，非脂化組織因子係利用非離子清潔劑(諸如N－辛基－β－D－葡萄哌喃糖苷)被插入磷脂質顆粒內。根據本發明，可被用於脂化組織因子之脂質可能來自任何來源(動物、植物或合成性)。幾乎所有脂質均可被用來製造本發明之脂化組織因子，包括但不限於磷脂質(諸如磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯乙醇胺等)、神經脂質(諸如腦醯胺、神經胺醇－1－磷酸鹽、肌醇磷酸腦醯胺(inositolphosphate ceramide)、甘露糖肌醇磷酸腦醯胺(mannosyl－inositolphosphate ceramide)、甘露糖二肌醇磷酸腦醯胺(mannosyl－diinositolphosphate ceramide)等)、磷脂醯肌醇(諸如L－α－磷脂醯肌醇、L－α－溶血磷脂醯肌醇(L－α－lysophosphatidylinositol)等)或磷脂醯肌醇磷酸鹽(諸如L－α－[磷脂醯肌醇－4－磷酸鹽]、1,2－二辛醇－sn－甘油－3－[磷脂醯肌醇－3,4,5－三磷酸鹽]等)。組織因子之蛋白成分與脂質比(莫耳比、重量比或體積比)可能有廣泛差異，例如從約1：50,000至約1：3,000。
本文所使用之組織因子一詞包含一些野生型組織因子之變異體及突變體，它們至少保留一種野生型組織因子之功能，以至少一種關於凝血之野生型組織因子功能為佳。
在特定實施例中，實現本發明時所使用之脂化組織因子係人類脂化組織因子，由自組織萃取物所取得之組織因子構成；或由組織萃取物中純化之蛋白成分構成且插入脂質成分之組織因子(蛋白質：脂質莫耳比為約1：8700)；或由諸如但不限於美國專利第6,261,803號所描述之方法得到之基因重組組織因子(rTF)構成的組織因子。萃取物的取得及組織因子之純化，可在不同組織(例如腦、胎盤組織及肺組織)及不同動物(例如羊、牛、兔、犬、人類)中進行。
本文中所使用之「脂化組織因子之功能性片段」一語，包括但不限於組織因子之胜肽衍生物，特別是組織因子之蛋白成分，包括野生型組織因子之蛋白成分的突變體及變異體，其保留一或多種組織因子之功能，以關於凝血之功能為佳，例如結合活化型因子X及/或負電荷無機表面之能力，或在傷口癒合期間出現抗出血及血管形成功能之能力。該組織因子之功能性片段可能具有和野生型組織因子之蛋白成分片段完全相同的胺基酸序列，或可能有一或多個胺基酸導入、刪除或改造，前提是至少保留一種野生型組織因子之功能，以至少一種關於凝血之功能為佳。為了簡單起見，本文所使用之「脂化組織因子」一詞包含任何脂化組織因子之功能性片段。
實施本發明時所使用之組織因子蛋白成分，亦可能是融合蛋白質的一部分。就這方面而言，該融合蛋白可能含有由組織因子蛋白或該組織因子蛋白之功能性片段所組成的區域A，並結合由組織因子之其他片段所組成之區域B。該區域B結合該組織因子蛋白或該組織因子蛋白片段之胺基端區域，或該區域B可能結合該組織因子蛋白或該組織因子蛋白片段之羧基端區域。區域A及B均可直接結合，或透過該區域A及B之間的連接多肽結合。融合蛋白可由化學合成，或利用基因表現技術在適當宿主細胞中表現編碼該融合蛋白之核苷酸序列。
本文所使用之「局部治療」一詞係指在有需要的部位直接塗敷治療，例如不連續的皮膚部份(割傷等)或血管組織(血管破裂等)。
根據本發明及本文所涵蓋之實施例，脂化組織因子可作為活化型因子X之刺激劑以提高其溶蛋白活性及因此產生的凝血酶原，所以可以被用來治療或處理出血疾病，特別是與出血特異質有關之出血疾病。
「出血特異質」一詞係指造成止血異常之過程，其結果會導致出血性症候群發生，有時可能發生長期大量出血。出血特異質可能由先天性或後天性凝血異常及/或先天性或後天性血小板疾病引起。
「凝血異常」一詞係指凝血因子異常。這種異常可能因特定凝血因子缺乏或不足(其結果為發生出血症候群)，或因凝血因子異常所致。凝血異常通常是先天性凝血異常或後天性凝血異常。
先天性凝血異常之實例包括但不限於選自因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XII、因子XIII或其組合之凝血因子的缺乏。
後天性凝血異常可能有不同來源。說明性實例包括嚴重肝衰竭中凝血因子合成不足及抗凝血劑治療(諸如肝素、低分子量肝素、殺鼠靈、香豆素衍生物、雙香豆素等)。另一機制係因為過度消耗凝血因子，使凝血因子無法在出血部位形成凝塊。這種機制發生在瀰漫性血管內凝血症候群，或因多重疾病消耗所致之凝血異常，諸如損害微循環內皮、活化血小板及凝血因子形成多重微血栓之嚴重敗血症；胎盤釋放組織因子進入血中；死胎留滯；多重外傷中之碎裂組織；毒蛇咬傷等。在血管炎中，血管壁及內皮受傷會釋出凝血活化劑。凝血因子之消耗將因許多微血栓纖維蛋白被溶解而加劇，這是因為胞漿素之作用及屬於抗血小板劑及抗凝血劑之PDF釋出所致。
「血小板疾病」一詞係指關於血小板之數目及功能上之疾病，其結果係發生出血性症候群。該血小板疾病可能是先天性或後天性。
在特定實施例中，該血小板疾病係先天性血小板疾病。先天性血小板疾病之說明性(非限制性)實例包括葛萊斯曼氏病(Glanzmann’s disease)、伯納德－蘇利爾氏症候群(Bernard－Soulier syndrome)、寶林－詹美森氏症候群(Bolin－Jamieson’s syndrome)、威思考特－奧德里奇氏症候群(Wiskott－Aldrich syndrome)、巴黎－特魯索－亞各布森氏症候群(Paris－Trousseau－Jacobsen syndrome)、X染色體之血小板缺乏症、灰色血小板症候群(Gray platelet syndrome)、沙巴斯丁氏症候群(Sebastian syndrome)及范可尼貧血(Fanconi anemia)。
在另一特定實施例中，該血小板疾病係後天性血小板疾病。後天性血小板疾病之說明性(非限制性)實例包括骨髓增生性疾病(諸如血小板增多症、紅血球增多症或慢性骨髓性白血病等)；骨髓異常增生(myeloid metaplasia)中之功能性血小板疾病，伴隨出血時間延長、玻璃珠黏附缺陷、血小板聚集缺陷、異常釋放及血小板因子III缺陷。功能性血小板缺陷曾被發現於壞血病、先天性心臟疾病及肝硬化中之異常蛋白質血症(dysproteinemias)。
「後天性凝血異常」及「後天性血小板疾病」二詞係指疾病之來源，其可能為醫源性或繼發於其他疾病。
本文所使用之「個體」一詞包含任何動物種類之成員，包括人類；舉例來說(但不限於該例)，該個體可以是哺乳類，諸如靈長類、家畜、囓齒類等，但以任何年齡、種族之男人或女人為佳。在特定實施例中，該個體係無出血疾病病史之人類，諸如無凝血異常或血小板疾病之個人。在另一特定實施例中，該個體係有止血異常之病史的人類，諸如具有出血特異質之個體，例如凝血異常(諸如先天性或後天性凝血異常)或血小板疾病(諸如先天性或後天性血小板疾病)。
因此在特定實施例中，本發明關於脂化組織因子於製造供局部治療無止血異常病史之人類出血的藥物上之用途。在另一實施例中，本發明關於脂化組織因子於製造供局部治療具有出血特異質之人類出血的藥物上之用途。
為了投藥給個體，該脂化組織因子將被調配成為適用於局部給予以供局部治療出血之藥學形式。該藥學形式之說明性(非限制性)實例包括噴霧、溶液、懸浮液、乳劑、凝膠、軟膏、乳膏、敷料、貼片、油膏、漱口液等。為此，含有脂化組織因子之藥學調合物將包括藥學上可接受之載體及製備該選定之藥學投藥形式所需之賦形劑(詳細資訊請見本文關於「藥學組成物」一節)。
個體之脂化組織因子段藥劑量範圍可能非常廣泛，例如介於約0.01微克之活性蛋白質/毫升至100微克之活性蛋白質/毫升。脂化組織因子之投藥劑量將視一些因素而定，其中包括所使用之組織因子蛋白質的特性(例如其活性及生物半衰期)、調合物中組織因子蛋白質的濃度、該個體或病患之臨床狀態、所欲治療之出血性疾病等(詳細資訊請見本文關於「藥學組成物」一節)。
II.組合產品及其應用 II.1脂化組織因子＋活化型因子X
如目前所知，在血液凝結的外因性途徑中，組織因子結合循環中之因子VII/活化型因子VII以形成TF：：FVII複合物，並且在鈣離子存在時作為因子X活化之基質。外因性途徑之活化涉及組織因子與其配體(因子VII/活化型因子VII)之交互作用。此TF：：FVIIa複合物可作為基質，使因子X得以藉由活化型因子VII而開始活化。由於發明人意外發現，脂化組織因子與活化型因子X一起作用時可引發凝血，即使在因子VII缺乏的個體中，因此脂化組織因子係作為活化型因子X之刺激劑，使這個絲胺酸蛋白酶啟動凝血酶原水解以產生凝血酶原，並使凝血之起源得以發生。本文所使用之「活化型因子X」係指一種蛋白質(特別是絲胺酸蛋白酶)，其活化形式負實啟動凝血酶原水解，進而使凝血開始發生。這種蛋白質水解係藉由活化型因子X結合活化型血小板表面進行，且當活化型因子V及鈣離子存在時可水解凝血酶原。
更具體的說，發明人意外發現即使活化型因子X之濃度低至無法自行引起凝血，脂化組織因子與活化型因子X之組合亦可凝結血漿[例如見本文實施例之結果第1(1.5)及2節]。
因此另一方面，本發明關於一種包含(i)脂化組織因子及(ii)活化型因子X之產品。根據之前提到的結果，該產品可以作為藥物，特別是可以被用於治療個體出血，例如局部治療個體出血。該成分(i)及(ii)可以一起或分開提供。在特定實施例中，用於製備本產品之脂化組織因子係人類脂化組織因子。
在特定實施例中，本發明提供一種包含(i)脂化組織因子及(ii)活化型因子X之產品。這二種成分在給予個體之前可以被組合或一起提供於同一組成物中。
在另一特定實施例中，本發明提供一種分別包含(i)脂化組織因子及(ii)活化型因子X之產品。在另一特定實施例中，本發明提供一種分別包含(i)脂化組織因子及(ii)活化型因子X之產品，其作為組合物以供同時或連續投藥給個體。組合給予該成分(i)及(ii)給個體，可以按任何順序同時或間隔一段時間連續進行，也就是先給予脂化組織因子再給予活化型因子X，或反之。或者，該脂化組織因子及活化型因子X可同時給予。
為了投藥給個體，該先前定義之產品將被調配成藥學投藥形式，以適合局部投藥之藥學投藥形式為佳，為此將包含藥學上可接受之載體及適用於製備該想要之藥學投藥形式所需之賦形劑。有關該載體及賦形劑之資訊，以及關於該適用於給予本發明之產品的投藥形式，可參考格林藥學專著(galenic pharmacy treatises)。詳細資訊請見本文關於「藥學組成物」一節。
個體之脂化組織因子及活化型因子X的投藥劑量可能有廣泛差異。舉例來說，脂化組織因子之投藥劑量可能介於約0.01微克之活性蛋白質/毫升至100微克之活性蛋白質/毫升。同樣的，活化型因子X之投藥劑量可能介於例如約17微微莫耳至17奈莫耳(0.001微克之活性蛋白質/毫升至10微克之活性蛋白質/毫升)。一般來說，脂化組織因子及活化型因子X之投藥劑量將視一些因素而定，包括所使用之組織因子蛋白質及活化型因子X的特性(例如其活性及生物半衰期)、調合物中活化型因子X及組織因子蛋白質的濃度、該個體或病患之臨床狀態、所欲治療之出血性疾病等(詳細資訊請見本文關於「藥學組成物」一節)。
該產品中脂化組織因子及活化型因子X的重量比可能有廣泛差異；舉例來說，該TF：FXa之重量比係介於106 ：1至10：1，雖然也可能是其他重量比；在特定實施例中，本發明之產品包含重量比為1比0.001之脂化組織因子及活化型因子X，也就是該混合物中每包含1毫克的組織因子蛋白質，即包含1微克之活化型因子X蛋白質。
本發明的其他方面由先前定義作為藥物之該產品的用途構成，尤其是該產品於製造供治療個體出血的藥物上之用途，特別是局部治療個體出血。
II.2脂化組織因子＋負電荷無機表面
發明人也意外發現到，脂化組織因子與負電荷無機表面(NCIS)之組合可在不論活體外[見本文所包含之實施例的結果第1(1.4)、2(2.2)、3(3.4)、4(4.2)及5(5.2及5.4)節]或活體內[見本文所包含之實施例的結果第6.1節]，凝結健康個體及凝血因子缺乏病患之血漿及血液。
本文所使用之「負電荷無機表面」或「NCIS」一詞係由脂肪及血液凝集促進劑(例如鞣花酸、沸石、矽石、無機氧化物等)之混合物組成。該脂肪具有靜負電荷，這表示該脂肪混合物可包含中性或兩性離子脂肪，但一定包含能使混合物具有陰離子特性之量的負電荷脂肪。舉例來說(但不限於此例)，負電荷脂肪可以是神經脂質(諸如腦醯胺－1－磷酸鹽、糖化磷脂醯乙醇胺、羥化或非羥化髓硫脂、神經節苷脂等)或甘油底質脂肪(諸如磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、磷脂醯肌醇磷酸鹽、磷脂酸、磷脂醯甘油、心脂)。在本專利申請書中，商用產品DadeActin(Dade Behring商標)被用來作為負電荷無機表面之來源。
因此另一方面，本發明關於一種包含(i)脂化組織因子及(ii)負電荷無機表面之產品。根據之前提到的結果，該產品可作為藥物，特別是可以被用於治療個體出血，例如局部治療個體出血。該成分(i)及(ii)可以一起或分開提供。
在特定實施例中，本發明提供一種包含(i)脂化組織因子及(ii)負電荷無機表面之產品。這二種成分在給予個體之前可以被組合或一起提供於同一組成物中。
在另一特定實施例中，本發明提供一種分別包含(i)脂化組織因子及(ii)負電荷無機表面之產品。在另一特定實施例中，本發明提供一種分別包含(i)脂化組織因子及(ii)負電荷無機表面之產品，其作為組合物以供同時或連續投藥給個體。組合給予該成分(i)及(ii)給個體，可以按任何順序同時或間隔一段時間連續進行，也就是先給予脂化組織因子再給予負電荷無機表面，或反之。或者，該脂化組織因子及負電荷無機表面可同時給予。
為了投藥給個體，該先前定義之產品將被調配成藥學投藥形式，以適合局部投藥之藥學投藥形式為佳，為此將包含藥學上可接受之載體及適用於製備該想要之藥學投藥形式所需之賦形劑。有關該載體及賦形劑之資訊，以及關於該適用於給予本發明之產品的投藥形式，可參考格林藥學專著(galenic pharmacy treatises)。詳細資訊請見本文關於「藥學組成物」一節。
個體之脂化組織因子及負電荷無機表面的投藥劑量可能有廣泛差異。舉例來說，脂化組織因子之投藥劑量可能介於約0.01微克之活性蛋白質/毫升至100微克之活性蛋白質/毫升。同樣的，就每微克脂化組織因子活性蛋白質而言，負電荷無機表面之投藥劑量(體積)可能介於例如約0.1至100微升。一般來說，脂化組織因子及負電荷無機表面之投藥劑量將視一些因素而定，包括所使用之組織因子蛋白質及負電荷無機表面的特性(例如其活性及生物半衰期)、調合物中組織因子蛋白質及負電荷無機表面的濃度、該個體或病患之臨床狀態、所欲治療之出血性疾病等(詳細資訊請見本文關於「藥學組成物」一節)。
該產品中脂化組織因子及負電荷無機表面的重量/體積比(w/v)可能有廣泛差異；舉例來說，該脂化TF：NCIS之重量/體積比係介於1：1至1：106 ，雖然也可能是其他重量/體積比；在特定實施例中，本發明之產品每包含1毫克之脂化組織因子活性蛋白質，即包含介於0.1至100微升之負電荷無機表面。
本發明的其他方面由先前定義作為藥物之該產品的用途構成，尤其是該產品於製造供治療個體出血的藥物上之用途，特別是局部治療個體出血。
II.3脂化組織因子＋活化型因子X＋負電荷無機表面
發明人也意外發現到，脂化組織因子、活化型因子X與負電荷無機表面之組合，可在活體外凝結健康個體及凝血因子缺乏病患之血漿及血液[見本文實施例之結果第1(1.6)及2(2.2)節]。
因此另一方面，本發明關於一種包含(i)脂化組織因子、(ii)活化型因子X及(iii)負電荷無機表面之產品。根據之前提到的結果，該產品可作為藥物，特別是可以被用於治療個體出血，例如局部治療個體出血。該成分(i)、(ii)及(iii)可以一起或分開提供。或者，一起提供其中的二個成份，例如(i)＋(ii)、(i)＋(iii)或(ii)＋(iii)，第三個單獨提供。
在特定實施例中，本發明提供一種包含(i)脂化組織因子、(ii)活化型因子X及(iii)負電荷無機表面之產品。這些成分在給予個體之前可以被組合或一起提供於同一組成物中。
在另一特定實施例中，本發明提供一種分別包含(i)脂化組織因子、(ii)活化型因子X及(iii)負電荷無機表面之產品。在另一特定實施例中，本發明提供一種分別包含(i)脂化組織因子、(ii)活化型因子X及(iii)負電荷無機表面之產品，其作為組合物以供同時或連續投藥給個體。組合給予該成分(i)、(ii)及(iii)給個體，可以按任何順序同時或間隔一段時間連續進行，也就是先給予脂化組織因子、再給予活化型因子X、然後給予負電荷無機表面，或先給予脂化組織因子、再給予負電荷無機表面、然後給予活化型因子X，或先給予活化型因子X、再給予脂化組織因子、然後給予負電荷無機表面，或先給予活化型因子X、再給予負電荷無機表面、然後給予脂化組織因子，或先給予負電荷無機表面、再給予活化型因子X、然後給予脂化組織因子，或先給予負電荷無機表面、再給予脂化組織因子、然後給予活化型因子X。或者，任二個成份可以混合在同一組成物中同時給予，第三個成份則在該雙重成分組成物投藥之前或之後給予。在另一實施例中，該脂化組織因子、活化型因子X及負電荷無機表面可同時給予。
為了投藥給個體，該先前定義之產品將被調配成藥學投藥形式，以適合局部投藥之藥學投藥形式為佳，為此將包含藥學上可接受之載體及適用於製備該想要之藥學投藥形式所需之賦形劑。有關該載體及賦形劑之資訊，以及關於該適用於給予本發明之產品的投藥形式，可參考格林藥學專著(galenic pharmacy treatises)。詳細資訊請見本文關於「藥學組成物」一節。
個體之脂化組織因子、活化型因子X及負電荷無機表面的投藥劑量可能有廣泛差異。舉例來說，脂化組織因子之投藥劑量可能介於約0.01微克之活性蛋白質/毫升至100微克之活性蛋白質/毫升。同樣的，活化型因子X之投藥劑量可能介於例如約17微微莫耳至17奈莫耳(0.001微克之蛋白質至10微克之蛋白質/毫升)。另外，負電荷無機表面之投藥劑量(體積)可能介於每微克脂化組織因子活性蛋白質，給予例如約0.1至100微升。一般來說，脂化組織因子、活化型因子X及負電荷無機表面之投藥劑量將視一些因素而定，包括所使用之組織因子蛋白質、活化型因子X及負電荷無機表面的特性(例如其活性及生物半衰期)、調合物中組織因子蛋白質、活化型因子X及負電荷無機表面的濃度、該個體或病患之臨床狀態、所欲治療之出血性疾病等(詳細資訊請見本文關於「藥學組成物」一節)。
該產品中脂化組織因子、活化型因子X及負電荷無機表面之重量比可能有廣泛差異，如之前II.1及II.2中所述；然而在特定實施例中，本發明之產品包含1：0.001：100(重量：重量：體積)之脂化組織因子、活化型因子X及負電荷無機表面。
本發明的其他方面由先前定義作為藥物之該產品的用途構成，尤其是該產品於製造供治療個體出血的藥物上之用途，特別是局部治療個體出血。
III.複合物及其應用 III.1組織因子：：活化型因子X複合物
如前所述(見本文II.1)，發明人發現即使活化型因子X之濃度低至無法自行引起凝血，脂化組織因子與活化型因子X之組合物仍可凝結血漿。雖然不想連接到任何理論，但不論是組合或單獨(按任何順序)給予該脂化組織因子及活化型因子X，均被認為會導致複合物形成，而該複合物能在應該發揮治療效果之處發揮治療效果(止血，特別是局部止血)。
因此另一方面，本發明關於一種本文稱為TF：：FXa之複合物，其包含脂化組織因子及活化型因子X。雖然為了簡單起見將該複合物以TF：：FXa表示，但是該複合物事實上可以由各別成份的多個單位形成；所有這些可能性均包含在本發明的範圍內。根據之前提到的結果，該複合物可以作為藥物，特別是可以被用於治療個體出血，例如局部治療個體出血。在特定實施例中，用於製備本複合物之脂化組織因子係人類脂化組織因子。
為了投藥給個體，該先前定義之產品將被調配成藥學投藥形式，以適合局部投藥之藥學投藥形式為佳，為此將包含藥學上可接受之載體及適用於製備該想要之藥學投藥形式所需之賦形劑。有關該載體及賦形劑之資訊，以及關於該適用於給予本發明之產品的投藥形式，可參考格林藥學專著(galenic pharmacy treatises)。詳細資訊請見本文關於「藥學組成物」一節。
給予個體之該複合物中所含的脂化組織因子及活化型因子X之劑量可能有廣泛差異。一般來說，該劑量相當於先前II.1提到關於包含脂化組織因子及活化型因子X之產品的劑量。
該TF：：FXa複合物中，脂化組織因子及活化型因子X之重量比可能有廣泛差異；不過通常相當於先前II.1提到關於包含脂化組織因子及活化型因子X之產品的重量比。
本發明的其他方面由先前定義作為藥物之該複合物的用途構成，尤其是該複合物於製造供治療個體出血的藥物上之用途，特別是局部治療個體出血。
III.2組織因子：：負電荷無機表面複合物
如前所述(見本文II.2)，發明人發現脂化組織因子與負電荷無機表面(NCIS)之組合物，可在活體外及活體內凝結健康個體及凝血因子缺乏病患之血漿及血液。雖然不想連接到任何理論，但不論是組合或單獨(按任何順序)給予該脂化組織因子及負電荷無機表面，均被認為會導致複合物形成，而該複合物能在應該發揮治療效果之處發揮治療效果(止血，特別是局部止血)。
因此另一方面，本發明關於一種本文稱為TF：：NCIS之複合物，其包含脂化組織因子及負電荷無機表面。雖然為了簡單起見將該複合物以TF：：NCIS表示，但是該複合物事實上可以由各別成份的多個單位形成；所有這些可能性均包含在本發明的範圍內。根據之前提到的結果，該複合物可以作為藥物，特別是可以被用於治療個體出血，例如局部治療個體出血。在特定實施例中，用於製備本複合物之脂化組織因子係人類脂化組織因子。
為了投藥給個體，該先前定義之產品將被調配成藥學投藥形式，以適合局部投藥之藥學投藥形式為佳，為此將包含藥學上可接受之載體及適用於製備該想要之藥學投藥形式所需之賦形劑。有關該載體及賦形劑之資訊，以及關於該適用於給予本發明之產品的投藥形式，可參考格林藥學專著(galenic pharmacy treatises)。詳細資訊請見本文關於「藥學組成物」一節。
給予個體之該複合物中所含的脂化組織因子及負電荷無機表面之劑量可能有廣泛差異。一般來說，該劑量相當於先前II.2提到關於包含脂化組織因子及負電荷無機表面組合之產品的劑量。
該TF：：NCIS複合物中，脂化組織因子及負電荷無機表面之重量/體積比可能有廣泛差異；不過通常相當於先前II.2提到關於包含脂化組織因子及負電荷無機表面之產品的重量/體積比。
本發明的其他方面由先前定義作為藥物之該複合物的用途構成，尤其是該複合物於製造供治療個體出血的藥物上之用途，特別是局部治療個體出血。
III.3脂化組織因子：：活化型因子X：：負電荷無機表面複合物
如前所述(見本文II.3)，發明人發現脂化組織因子、活化型因子X與負電荷無機表面之組合可凝結血漿。雖然不想連接到任何理論，但不論是組合或單獨(按任何順序)給予該脂化組織因子、活化型因子X與負電荷無機表面，均被認為會導致複合物形成，而該複合物能在應該發揮治療效果之處發揮治療效果(止血，特別是局部止血)。因此另一方面，本發明關於一種本文稱為TF：：FXa：：NCIS之複合物，其包含脂化組織因子、活化型因子X及負電荷無機表面。雖然為了簡單起見將該複合物以TF：：FXa：：NCIS表示，但是該複合物事實上可以由各別成份的多個單位形成，或是由該成分之間所有可能之交互作用形成，例如TF：：NCIS：：FXa、FXa：：NCIS：：TF、FXa：：TF：：NCIS、NCIS：：TF：：FXa或NCIS：：FXa：：TF；所有這些可能性均包含在本發明的範圍內。根據之前提到的結果，該複合物可以作為藥物，特別是可以被用於治療個體出血，例如局部治療個體出血。在特定實施例中，用於製備本複合物之脂化組織因子係人類脂化組織因子。
為了投藥給個體，該先前定義之產品將被調配成藥學投藥形式，以適合局部投藥之藥學投藥形式為佳，為此將包含藥學上可接受之載體及適用於製備該想要之藥學投藥形式所需之賦形劑。有關該載體及賦形劑之資訊，以及關於該適用於給予本發明之產品的投藥形式，可參考格林藥學專著(galenic pharmacy treatises)。詳細資訊請見本文關於「藥學組成物」一節。
給予個體之該複合物中所含的脂化組織因子、活化型因子X及負電荷無機表面之劑量可能有廣泛差異。一般來說，該劑量相當於先前II.3提到關於包含脂化組織因子、活化型因子X及負電荷無機表面組合之產品的劑量。
該TF：：FXa：：NCIS複合物中，脂化組織因子、活化型因子X及負電荷無機表面之比可能有廣泛差異；不過通常相當於先前II.3提到關於包含脂化組織因子、活化型因子X及負電荷無機表面之產品的比。
本發明的其他方面由先前定義作為藥物之該複合物的用途構成，尤其是該複合物於製造供治療個體出血的藥物上之用途，特別是局部治療個體出血。
IV.藥學組成物
如前所述，脂化組織因子可作為止血劑使用，特別是用於局部塗敷之止血劑。因此在另一方面，本發明關於一種藥學組成物(以下稱為本發明之藥學組成物)，其包含脂化組織因子及藥學上可接受之載體。在特定實施例中，該脂化組織因子係人類脂化組織因子。
為了投藥給個體，該先前定義之產品將被調配成藥學投藥形式，以適合局部投藥之藥學投藥形式為佳，為此將包含藥學上可接受之載體及適用於製備該想要之藥學投藥形式所需之賦形劑。有關該載體及賦形劑之資訊，以及關於該適用於給予本發明之產品的投藥形式，可參考格林藥學專著(galenic pharmacy treatises)。一般藥物之不同藥學投藥形式及其製備過程的回顧，可見於”Tratado de Farmacia Galnica”(“Galenic Pharmacy Treatise”),by C.Fauli i Trillo,1s t Edition,1993,Luzn 5,S.A.of Ediciones一書中。
雖然可以使用不同藥學投藥形式之脂化組織因子，但局部給予該化合物在臨床上最具好處，因此該脂化組織因子將被調配成為適用於局部給予之藥學形式。該藥學形式之說明性(非限制性)實例包括噴霧、溶液、懸浮液、乳劑、凝膠、軟膏、乳膏、敷料、貼片、油膏、漱口液等。為此，含有脂化組織因子之藥學調合物將包括藥學上可接受之載體，及製備供局部投藥之脂化組織因子藥學投藥形式所需要的賦形劑。
因此，在特定實施例中，本發明之藥學組成物係一種用於局部給予脂化組織因子之藥學組成物，其包含脂化組織因子及適用於局部給予該脂化組織因子之藥學上可接受之載體。
本發明之藥學組成物含有治療有效量之脂化組織因子。該量之範圍可能非常廣泛，例如介於約0.01微克之活性蛋白質/毫升至100微克之活性蛋白質/毫升。
在另一特定實施例中，本發明之藥學組成物：a)包含一種產品，其含有(i)脂化組織因子及(ii)活化型凝血因子X與藥學上可接受之載體；或b)分別包含(i)脂化組織因子與藥學上可接受之載體，及(ii)活化型凝血因子X與藥學上可接受之載體；或c)包含一種產品，其包含(i)脂化組織因子及(ii)負電荷無機表面與藥學上可接受之載體；或d)分別包含(i)脂化組織因子與藥學上可接受之載體，及(ii)負電荷無機表面與藥學上可接受之載體；或e)包含一種產品，其包含(i)脂化組織因子、(ii)活化型凝血因子X及(iii)負電荷無機表面與藥學上可接受之載體；或f)分別包含(i)脂化組織因子與藥學上可接受之載體、(ii)活化型凝血因子X與藥學上可接受之載體，及(iii)負電荷無機表面與藥學上可接受之載體；或g)包含TF：：FXa複合物及藥學上可接受之載體；或h)包含TF：：NCIS複合物及藥學上可接受之載體；或i)包含TF：：FXa：：NCIS複合物及藥學上可接受之載體。
如前述，本發明定義之藥學組成物包含脂化組織因子作為活性成分，不論其係單獨存在或與活化型凝血因子X及/或負電荷無機表面結合，或與活化型凝血因子X及/或負電荷無機表面形成複合物。在特定實施例中，本發明先前定義之藥學組成物中的脂化組織因子係人類脂化組織因子。
同樣的，在特定實施例中，本發明先前定義之藥學組成物將被調配成供局部給予活性成分(單獨脂化組織因子或與活化型凝血因子X及/或負電荷無機表面結合，或與活化型凝血因子X及/或負電荷無機表面形成複合物)之藥學形式。該藥學形式之說明性(非限制性)實例包括噴霧、溶液、懸浮液、乳劑、凝膠、軟膏、乳膏、敷料、貼片、油膏、漱口液等。為此，含有前述活性成分之藥學調合物將包括藥學上可接受之載體，及製備局部給予該活性成份之藥學投藥形式所需要的賦形劑。
本發明之藥學組成物含有治療有效量之活性成份。給予個體之活性成份的劑量，將視該個體所患疾病之嚴重性、選擇之藥學投藥形式等其他因素而定。因此，本發明中提到之劑量應只作為熟習該技術者參考，此人應根據先前提到的變數調整劑量。然而，本發明之藥學組成物可以一天給予一或多次，以供預防或治療之用。
本發明之藥學組成物可以和其他用於預防及/或治療出血特異質之額外藥物(例如凝血因子、人類血漿等)一起使用，以提供組合療法。該額外藥物可以是原藥學組成物的一部分，或是以單獨組成物之形式存在，在給予本發明之藥學組成物時同時或連續(間隔一段時間)給予。
V.載劑藥學組成物
本發明之藥學組成物可以被放置於載劑上。因此另一方面，本發明關於一種包含本發明之藥學組成物及載劑的產品。本文所使用之「載劑」一詞，係指適當材料之基質，允許本發明之藥學組成物沉積其上，並可將組成物運載及釋放至特定部位，例如本發明之藥學組成物發揮治療作用之處。該載劑可以是固態載劑或非固態載劑，例如液態載劑或氣態載劑。固態載劑之說明而非限制性實例包括敷料、OK繃、貼片、膠布等。液態載劑之說明而非限制性實例包括凝膠、噴液、漱口液等。氣態載劑之說明而非限制性實例包括空氣、推進劑等。在特定實施例中，沉積於該載劑上之本發明的藥學組成物包括：(a)(i)載劑、(ii)包含脂化組織因子和活化型凝血因子X的產品，以及藥學上可接受之載體、(iii)包含脂化組織因子和負電荷無機表面的產品，以及藥學上可接受之載體、(iv)包含脂化組織因子、活化型凝血因子X和負電荷無機表面的產品，以及藥學上可接受之載體；或(b)TF：：FXa複合物以及藥學上可接受之載體，或(c)TF：：NCIS複合物以及藥學上可接受之載體，或(d)TF：：FXa：：NCIS複合物以及藥學上可接受之載體。
在特定實施例中，本發明之藥學組成物中的脂化組織因子係人類脂化組織因子。
沉積於載劑上包含本發明之藥學組成物的該產品，可藉由傳統方法例如混合本發明之藥學組成物及載劑得到。本發明之藥學組成物與載劑之間的交互作用可以是物理性或化學性交互作用，視本發明之藥學組成物成分的性質及所使用之載劑而定。
VI.非脂化組織因子用於治療出血上之用途
由發明人進行之試驗得到的結果，清楚顯示組織因子：－可增加活化型因子X之溶蛋白活性，進而促進凝血酶原產生，－可凝結健康個體及凝血因子缺乏病患之血漿及血液，包括因子VII缺乏血液－可凝結血小板疾病患者之血液，及－可停止不同動物模式中嚴重致命之活體內出血。因此，整體看來這些結果明確顯示，脂化組織因子係一種可用於治療健康個體及凝血因子缺乏症出血之止血劑，包括因子VIII、因子IX、因子XI、因子XIII、因子VII、因子及因子X缺乏病患。
歐洲專利EP 266993揭示非脂化組織因子於治療出血之用途，特別是用於治療因凝血因子缺乏所致之出血，特別是選自因子VIII、因子IX、因子XI或因子XIII之凝血因子。然而，該專利並未揭示亦未建議非脂化組織因子用於治療因子VII缺乏所導致之出血的可能性。
發明人目前之發現係關於組織因子作為活化型因子X溶蛋白活性刺激劑之功能，無論該個體是否係因子VII缺乏，因此允許非脂化組織因子(或其非脂化功能性片段)用於治療因子VII缺乏個體之出血的可能性得以成立。
因此，本發明另一方面關於非脂化組織因子(或其非脂化功能性片段)於製造供治療凝血因子VII缺乏個體之出血的藥物上之用途。
本文所使用之「非脂化組織因子」一詞係指純化的組織因子(不含細胞質脂質膜)。本文所使用之組織因子一詞包含野生型組織因子之變異體及突變體，其至少保留一種野生型組織因子之功能，以至少一種關於凝血之野生型組織因子功能為佳。組織因子可自許多組織(例如腦、胎盤組織及肺組織)及不同動物之組織(例如羊、牛、兔、犬、人類等)中進行分離及純化。組織因子也可以是基因重組組織因子(rTF)，其由諸如但不限於美國專利第6,261,803號所描述之方法得到。在特定實施例中，為實現本發明所使用之非脂化組織因子係人類非脂化組織因子，且由完全去除細胞質脂質膜之人類組織所分離及純化的組織因子之蛋白成分構成。
本文所使用之「非脂化組織因子之功能性片段」一詞，包括但不限於組織因子之胜肽衍生物，特別是組織因子之蛋白成分，包括野生型組織因子之蛋白成分的突變體及變異體，其保留一或多種組織因子之功能，以關於凝血之功能為佳，例如結合活化型因子X及/或負電荷無機表面之能力，或在傷口癒合期間出現抗出血及血管形成功能之能力。該組織因子之功能性片段可能具有和野生型組織因子之蛋白成分片段完全相同的胺基酸序列，或可能有一或多個胺基酸導入、刪除或改造，前提是至少保留一種野生型組織因子之功能，以至少一種關於凝血之功能為佳。為了簡單起見，本文所使用之「非脂化組織因子」一詞包含任何非脂化組織因子之功能性片段。
非脂化組織因子可利用傳統方法得到。舉例來說，有機溶劑萃取法可自脂質成分中分離出組織因子之蛋白成分。該有機溶劑之說明性實例包括吡啶(pyridine)、乙醇、庚烷－丁醇(heptane－butanol)混合物等。組織因子之蛋白成分可利用傳統化學方法純化。該化學方法之實例包括以清潔劑處理(例如去氧膽酸(deoxycholate)、Triton X－100等)、以含十二烷基硫酸鈉之聚丙烯醯胺膠體進行膠體過濾及製備型電泳、利用組合Sepharose管柱之刀豆素A(concavalin A)、利用含抗組織因子蛋白成分(蛋白質)抗體之親和性管柱等。
為了投藥給因子VII缺乏個體，非脂化組織因子將被調配成適合以任何適當途徑投藥之藥學形式。雖然可以使用幾乎任何藥學形式，但仍以非經腸給予該非脂化組織因子之藥學形式的用途為佳。
因此，在特定實施例中，本發明關於非脂化組織因子(或其非脂化片段)於製造供非經腸給予該非脂化組織因子(或其非脂化片段)的藥物上之用途。
在這種情況下，該包含非脂化組織因子及藥學上可接受之賦形劑或載體的藥學組成物，將被調配成含適當劑量形式之例如無菌溶液、懸浮液或冷凍乾燥產品的非經腸投藥形式；在這種情況下，該藥學組成物將包含適當賦形劑，諸如緩衝劑、表面張力素等。在任何情況下，賦形劑將根據預定之藥學投藥形式來加以選擇。有關該載體及賦形劑之資訊，以及關於該適用於給予本發明之產品的投藥形式，可參考格林藥學專著(galenic pharmacy treatises)。一般藥物之不同藥學投藥形式及其製備過程的回顧，可見於”Tratado de Farmacia Galnica”(“Galenic Pharmacy Treatise”),by C.Fauli i Trillo,1s t Edition,1993,Luzn 5,S.A.of Ediciones一書中。
因子VII缺乏個體之非脂化組織因子投藥劑量範圍可能非常廣泛，例如介於約0.01微克之活性蛋白質/毫升至100微克之活性蛋白質/毫升。非脂化組織因子之投藥劑量將視一些因素而定，包括所使用之組織因子蛋白質的特性(例如其活性及生物半衰期)、調合物中組織因子蛋白質的濃度、該病患之臨床狀態、所欲治療之出血性疾病等。
為了評估脂化組織因子作為活化型因子X之刺激劑的能力，進行一系列的活體外及活體內試驗，包括：1.證實脂化組織因子(單獨或合併)作為活化型因子X之直接刺激劑，可於因子VII缺乏之條件下(因沒有、缺乏或免疫阻斷)，導致纖維蛋白凝塊形成及血液凝結之活體外試驗。
1.1脂化組織因子增加活化型因子X之溶蛋白活性，進而在因子VII缺乏時促使凝血酶產生(溶液及洗滌血小板懸浮液之呈色試驗)。
1.2脂化組織因子可以凝結因子VII缺乏病患之血漿及血液(血漿及無抗凝全血之凝血試驗)。
1.3脂化組織因子可以凝結加入抗因子VII之單株抗體的健康個體血漿(凝血試驗)。
1.4脂化組織因子及負電荷無機表面之組合物協同促進因子VII缺乏血漿之凝血(凝血試驗)。
1.5脂化組織因子及活化型因子X之組合物在抗因子VII之單株抗體存在時協同促進凝血(因子X缺乏血漿之凝血試驗)。
1.6脂化組織因子、活化型因子X及負電荷無機表面之組合物在抗因子VII之抗體存在時協同促進凝血(因子X缺乏血漿之凝血試驗)。
2.證實脂化組織因子與低濃度活化型因子X(無法引起任何促凝效果)之組合物，可導致因子X缺乏血漿凝結之活體外試驗。
2.1當活化型因子X之濃度過低時，脂化組織因子可作為此絲胺酸蛋白酶之刺激劑。
2.2脂化組織因子與活化型因子X及負電荷無機表面之組合物在活化型因子X之刺激下有協同作用。
3.證實脂化組織因子(單獨或合併)導致其他非因子VII之凝血因子缺乏病患凝血之活體外試驗。
3.1脂化組織因子使來自凝血因子V、因子VIII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII及因子XIII缺乏病患之血漿及血液凝結(凝血因子缺乏血漿及缺乏因子VIII及因子IX之非凝結全血之凝血試驗)。
3.2脂化組織因子凝結先經肝素化處理之全血及血漿。
3.3脂化組織因子凝結經殺鼠靈處理之動物的血漿。
3.4脂化組織因子與負電荷無機表面之組合物協同促進凝血因子V、因子VIII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII及因子XIII缺乏病患之血漿(凝血因子缺乏血漿之凝血試驗)及血友病病患之全血凝結。
4.證實脂化組織因子(單獨或合併)導致健康個體凝血之活體外試驗。
4.1脂化組織因子凝結來自健康個體之血漿及血液。
4.2脂化組織因子與負電荷無機表面之組合物協同促進來自健康個體之血漿及血液凝結。當脂化組織因子結合磷脂質時不具協同作用。
5.證實脂化組織因子(單獨或合併)於先天性及後天性(血小板減少性)血小板疾病病患血漿之凝血效果的活體外試驗。
5.1脂化組織因子凝結來自先天性血小板疾病病患之血漿。
5.2脂化組織因子與負電荷無機表面之組合物促進來自先天性血小板疾病病患之全血凝結。
5.3脂化組織因子凝結血小板缺乏檢體。
6.證實組織因子係可用於對照大鼠以供局部止血治療之藥劑的活體內試驗(直接單獨塗敷或與負電荷無機表面一起用於先前截斷之血管)。
6.1脂化組織因子(單獨或與負電荷無機表面一起)可作為大鼠近側斷尾嚴重出血動物模式之局部止血劑。
6.2脂化組織因子可作為以肝素或殺鼠靈預先處理之嚴重出血動物模式的局部止血劑。
6.3脂化組織因子可作為大鼠近側斷尾致死性出血動物模式之局部止血劑。
I.材料及方法
材料所使用之脂化組織因子來源係人類基因重組組織因子(rTF)、ThromborelS及NeoplastinPlus。特別是使用下列商品化製劑：人類基因重組組織因子(非脂化)(American Diagnostica,USA)，其依Morrissey所述之方法再脂化；含鈣離子之冷凍乾燥人類胎盤凝血酶原激酶(ThromborelS,Dade Behring Inc)；含鈣離子之冷凍乾燥兔腦(NeoplastinPlus,Diagnostica Stago－Roche)。
組織因子蛋白質之促凝活性係由標準曲線決定，以人類基因重組脂化組織因子(American Diagnostica,USA)為參照物質，在文字中以活性蛋白質之微克數/毫升表示，在表格中以微克/毫升表示。在此例中為了簡單起見，rTF或TF係指脂化組織因子除非另外說明。使用Haematologic Technologies之商業化合物，以作為活化型因子X、因子II及活化型因子V之來源。使用商品化之DadeActinFS試劑(Dade Behring)，作為負電荷無機表面。商品化之凝血因子缺乏血漿(因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII及因子XIII)係購自Dade Behring Marburg GmbH。
方法在脂質微粒中利用辛基葡萄糖苷透析再脂化組織因子之方法(Morrisey法)利用非離子清潔劑N－辛基－β－D－葡萄吡喃糖苷(octylglucoside)，將非脂化組織因子融入脂質微粒中。組織因子及脂質均被溶於辛基葡萄糖苷中以形成微胞(micelles)。辛基葡萄糖苷可利用透析輕易的自溶液中分離出來，因為其臨界微胞濃度很高(CMC＝20至50毫莫耳)。當辛基葡萄糖苷被清除，脂質會形成單層微脂粒。組織因子藉由其跨膜結構域浸潤在這些微脂粒中。一般來說，50至80%的組織因子分子由微脂粒向外排列。
緩衝液及儲備溶液來自Calbiochem之辛基葡萄糖苷(n－辛基－β－D－葡萄吡喃糖苷)。
脂質：
緩衝液
製備辛基葡萄糖苷之脂質溶液(OG)1.利用希望的脂質莫耳半徑，於玻璃管中為各檢體製備2.6毫莫耳之總脂質。
2.在氬或氮氣流下乾燥脂質混合物。
3.當玻璃管呈現乾燥後，再真空乾燥60分鐘。
4.添加400微升新鮮OG/HBS溶液(於室溫下)至含有乾燥脂質之玻璃管中。
再脂化添加希望量之組織因子至含400微升OG/脂質及足夠HBSA之玻璃管中，使最終體積成為1毫升。在室溫下進行此步驟。
取得洗滌血小板懸浮液洗滌血小板懸浮液係根據Radomski M.等人所描述之方法(Radomski M,Moncada S.；1983 Thromb Res.此為以前列環素(prostacyclin)洗滌人類血小板之改良方法15；30(4)：383－9)，自健康志願者之血液萃取液(3.15%檸檬酸鈉)中製備。血液萃取後應立刻在室溫下處理檢體。利用凝集試驗，在試驗前和試驗當中評估血小板的活化及功能狀態。藉由已知協同劑(膠原)之活化，可估計其自我活化及功能。
活體外試驗呈色試驗在溶液及活化血小板懸浮液中設計不同的呈色試驗，以顯示基因重組組織因子對活化型因子X之溶蛋白活性的影響。
進行呈色試驗決定活化型因子X的胺分解活性，以S－2765(Chromogenix)作為活化型因子X之呈色基質，凝血酶形成能力則以S－2238(Chromogenix)作為凝血酶之呈色基質進行分析。
呈色試驗係於懸浮液(緩衝液)中進行，使用洗滌血小板懸浮液。將適當體積之各種受試因子分布在ELISA板上，若使用洗滌血小板懸浮液，適當體積係使培養液中濃度達250,000血小板/微升。最後添加特殊呈色基質，以利用405奈米處之分光光度讀數，定量欲檢測檢體之溶蛋白活性。在測定胺分解活性之試驗中，只需分布活化型因子X及不同的基因重組組織因子濃縮液，然而在測定凝血酶形成活性的試驗中，必須進一步添加因子II(凝血酶原)及活化型因子V(後者只用於懸浮液試驗中，因為洗滌血小板試驗中已包含這些內源性活化型因子V)。
血漿凝血試驗血漿中自發性促凝血活性(未經刺激)係利用特定步驟之凝血試驗，在凝血計(Fibrintimer BFT－II clot－timer Dade－Behring,Germany)中測量。簡單地說，在已預熱之光析管中加入50微升之缺血小板血漿及50微升之蒸餾水。在37℃下靜置培養此混合物60秒後，立刻加入50微升25毫莫耳氯化鈣，並在凝血計中測定凝血時間之秒數(藉由觀察凝塊形成)。每個檢體均測試二次。缺血小板血漿係利用離心法取得，血小板數由Coulter決定。
全血凝血試驗非抗凝全血之促凝活性係利用凝血法檢測。將欲研究之不同試劑加入1毫升的非抗凝全血，以計時器測量從一開始抽血到出現穩固血塊之凝血時間。以不同試劑縮短或延長血液凝結之時間，來評估它們的效果。
活體內試驗大鼠近側斷尾嚴重出血模式23隻體重350至450公克的Sprage－Dawley公鼠，被隨機分配至3個治療組：接受生理食鹽水局部治療之對照組(14隻大鼠)，而另外二組分別接受1.2微克/毫升基因重組組織因子之局部治療(含5隻大鼠)，及1.2微克/毫升基因重組組織因子＋負電荷無機表面(體積：體積＝1：2)之局部治療(4隻大鼠)。利用塑膠微量吸量管，將所有化合物局部分佈至鼠尾近側截面，以發揮止血作用。確認不再出血，即表示形成穩固凝塊。
經抗凝藥物處理之大鼠近側斷尾嚴重出血模式27隻體重350至450公克的Sprage－Dawley公鼠，被隨機分配至5個治療組：對照組接受生理食鹽水局部治療(14隻大鼠)。二組在截尾前15分鐘接受200單位/公斤肝素靜脈注射(3隻以組織因子治療，5隻以食鹽水治療)，另外二組在截尾前三天每天口服0.1毫克/公斤殺鼠靈(3隻以組織因子治療，2隻以食鹽水治療)。各治療組中僅一組接受1.2微克/毫升基因重組組織因子之局部治療，因此這是各種抗凝處理的對照治療組。利用塑膠微量吸量管，將脂化組織因子局部分佈至鼠尾近側截面以發揮止血作用。確認不再出血，即表示形成穩固凝塊。
大鼠頸動脈穿刺之致死出血模式4隻體重350至450公克之Sprage－Dawley公鼠被隨機分配至2治療組，各組包含2隻大鼠。對照組以生理食鹽水治療，另一組接受脂化組織因子局部治療(最終劑量為2微克之活性蛋白質)。依標準程序進行大鼠頸動脈穿刺，以建立致死出血模式。在穿刺部位直接覆蓋分別含3毫升脂化組織因子及3毫升生理食鹽水之敷料，同時施加壓力及接觸個別治療物2分鐘。
II.結果
1.證實脂化組織因子(單獨或合併)作為活化型因子X之直接刺激劑，可於因子VII缺乏之條件下(因沒有、缺乏或免疫阻斷)，導致纖維蛋白凝塊形成及血液凝結之活體外試驗1.1脂化組織因子增加活化型因子X之溶蛋白活性，進而在因子VII缺乏時促使凝血酶產生為了評估脂化組織因子在因子VII缺乏時作為活化型因子X刺激劑的能力，進行一些活體外試驗：(i)溶液中活化型因子X胺分解活性之呈色試驗；及(ii)洗滌血小板懸浮液中凝血酶形成活性之呈色試驗。
活化型因子X胺分解活性之呈色試驗使用活化型因子X專一性基質S－2765之活化型因子X於溶液中的胺分解活性直接試驗，顯示脂化組織因子可以非常顯著地提高活化型因子X之溶蛋白活性。當高濃度(1微克/毫升)之基因重組組織因子存在時，發現低濃度及高濃度之活化型因子X的活性均增加(p<0.001)。當脂化組織因子之濃度較低時(0.1微克/毫升)，亦可發現類似的顯著刺激效果(p<0.001)。表1顯示5次獨立試驗得到的結果。
洗滌血小板懸浮液中凝血酶形成活性之呈色試驗使用血小板懸浮液作為促凝表面之來源可測得高出許多之促凝效果，利用專一性基質S－2238測量凝血酶形成(表2)。當外源性活化型因子X不存在時，脂化組織因子對凝血酶形成產生顯著的刺激作用(p<0.001)。類似的刺激效果可見於低濃度或高濃度之外源性活化型因子X存在時(p<0.001)。
1.2脂化組織因子可以凝結因子VII缺乏病患之血漿及血液(血漿及無抗凝全血之凝血試驗)一系列活體外凝血試驗顯示脂化組織因子於因子VII缺乏病患之血漿及無抗凝全血中具有凝血作用，因此脂化組織因子可作為止血治療藥物。
在商品化因子VII缺乏血漿及來自因子VII缺乏病患之無抗凝全血中的凝血試驗藉由使用商品化因子VII缺乏血漿及來自2位因子VII缺乏病患之無抗凝全血的凝血試驗，研究脂化組織因子對凝血之作用(表3)。脂化組織因子可依濃度依賴模式顯著促進因子VII缺乏血漿之凝血。同樣的，來自因子VII缺乏病患之無抗凝全血亦可於低、中及高濃度之脂化組織因子存在時凝結，這表示即使缺乏因子VII，亦可藉由脂化組織因子產生正常的凝血作用。表3顯示5次於因子VII缺乏血漿進行之獨立試驗的結果。
脂化組織因子對健康志願者之血液的作用，在0.01微克/毫升之後的濃度有顯著作用，然而在因子VII缺乏病患中需要更高濃度(表4)。雖然在0.1微克/毫升之後的濃度才測得顯著之促凝效果(p<0.001)，但0.01微克/毫升之脂化組織因子已能使凝血時間正常化，在基準狀態下之正常檢體與含該濃度之脂化組織因子的因子VII缺乏檢體所測得的凝血時間並無差異。最後，雖然1微克/毫升之脂化組織因子無法在因子VII缺乏血漿中引起同樣強烈的促凝作用，但也造成非常顯著的效果，這表示脂化組織因子可以使這些病患的止血功能回復正常。
1.3脂化組織因子可以凝結加入抗因子VII之單株抗體的健康個體血漿(凝血試驗)活體外凝血試驗顯示，脂化組織因子於加入抗因子VII單株抗體(此抗體可阻斷正常血漿中的凝血作用)之健康個體血漿中具有凝血作用。
以抗因子VII抗體阻斷清除因子VII之正常血漿中的凝血試驗藉由使用添加抗因子VII單株抗體之健康志願者血漿的凝血試驗，研究脂化組織因子對血漿凝血之作用(表5)。脂化組織因子甚至可在抗因子VII單株抗體存在時導致凝血(該抗體可完全抑制凝血)。在這些試驗條件下(類似因子VII缺乏檢體)，脂化組織因子可以使血漿凝結。
1.4脂化組織因子及負電荷無機表面之組合物協同促進因子VII缺乏血漿之凝血(凝血試驗)一系列活體外凝血試驗顯示，脂化組織因子與負電荷無機表面[NCIS]之組合物於因子VII缺乏血漿中具有凝血作用。此促凝效果超越單獨使用脂化組織因子作為促凝劑所得到之作用。這些結果顯示脂化組織因子所媒介之作用與因子VII無關，甚至可以在其專一性配體不存在時引起血漿凝結。表6顯示5次獨立試驗的結果。
1.5脂化組織因子及活化型因子X之組合物在抗因子VII之單株抗體存在時協同促進凝血(因子X缺乏血漿之凝血試驗)在以抗因子VII抗體免疫阻斷之活化型因子X缺乏血漿中，探討脂化組織因子與低濃度活化型因子X(170微微莫耳及1700微微莫耳)之組合物在無因子VII下的促凝作用(表7)。
1.6脂化組織因子、活化型因子X及負電荷無機表面之組合物在抗因子VII之單株抗體存在時協同促進凝血(因子X缺乏血漿之凝血試驗)亦探討脂化組織因子、低濃度活化型因子X(170微微莫耳及1700微微莫耳)及負電荷無機表面之組合物於活化型因子X缺乏血漿中的促凝作用(表8)。
2.證實脂化組織因子與低濃度活化型因子X(無法引起任何促凝效果)之組合物，可導致因子X缺乏血漿凝結之活體外試驗2.1當活化型因子X之濃度過低時，脂化組織因子可作為此絲胺酸蛋白酶之刺激劑在凝血因子X缺乏血漿中進行活體外凝血試驗，以顯示脂化組織因子對活化型因子X之偕同作用(添加低濃度活化型因子X(170微微莫耳及1700微微莫耳)至因子X缺乏血漿，因此這些血漿無法經任何凝血途徑產生活化型因子X)。脂化組織因子與低濃度活化型因子X之組合物的促凝效果見表9。
2.2脂化組織因子與活化型因子X及負電荷無機表面之組合物在活化型因子X之刺激下有協同作用亦探討脂化組織因子、低濃度活化型因子X(170微微莫耳及1700微微莫耳)及負電荷無機表面之組合物於因子X缺乏血漿中的促凝作用(表10)。
3.證實脂化組織因子(單獨或合併)導致其他非因子VII之凝血因子缺乏病患凝血之活體外試驗3.1脂化組織因子使來自凝血因子V、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII及因子XIII缺乏病患之血漿及血液凝結利用以免疫結合技術清除凝血因子之商品化血漿，以及來自3位被診斷為血友病A(因子VIII缺乏)及2位被診斷為血友病B(因子IX缺乏)病患之血漿，探討脂化組織因子(單獨使用)對於凝血因子缺乏血漿之促凝作用。表11顯示這些結果。在濃度為1微克/毫升時，脂化組織因子能夠有效的凝結所有因子V、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII及因子XIII缺乏血漿。另外，當缺乏知名的活化型因子X輔助因子活化型因子V時，脂化組織因子亦能產生血漿凝結，不過只有當其濃度為高或中等時。在其他凝血因子缺乏的情況下，所有測試濃度之脂化組織因子均有效，在非常低的濃度仍能得到極佳結果。即使缺乏因子X(1%)，脂化組織因子仍可凝血，但僅在高濃度時。所有這些結果經過來自血友病A及血友病B患者檢體的確認。
利用凝血試驗評估脂化組織因子(單獨使用)對於來自血友病A及B患者之人類非抗凝全血之促凝作用。藉由預估凝塊硬化之時間(分鐘)以決定凝塊形成。脂化組織因子對於健康志願者之血液從0.001微克/毫升濃度開始有顯著效果，然而在血友病患者則需較高劑量，從0.01微克/毫升開始可測得顯著的促凝效果(p<0.001)。當濃度為o.1微克/毫升，脂化組織因子可使凝血時間完全恢復正常，於正常個體與血友病患者所測得之凝血時間並無差異。表12顯示從4個健康個體(檢體編號1－4)、3個血友病A患者及2個血友病B患者之檢體得到的結果。
3.2脂化組織因子凝結先經肝素化處理之全血及血漿脂化組織因子可以凝結預先培養於高濃度肝素之血漿(表13)及非抗凝全血(表14)，顯示其對活化型因子X之作用不受抗凝藥物媒介之抑制作用影響，即使肝素類的抑制劑存在。
3.3脂化組織因子凝結經殺鼠靈處理之動物的血漿脂化組織因子能凝結經殺鼠靈處理之大鼠的血漿，處理步驟如方法中描述。表15之結果顯示即使所有維生素K依賴性凝血因子的合成均被阻斷，脂化組織因子仍能凝結血液，證實其對活化型因子X之作用不受此抗凝藥物媒介之抑制作用的影響。
3.4脂化組織因子與負電荷無機表面之組合物協同促進凝血因子V、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII及因子XIII缺乏病患之血漿(凝血因子缺乏血漿之凝血試驗)及血友病病患之全血凝結進行一系列的活體外凝血試驗，以顯示脂化組織因子與負電荷無機表面之組合物於凝血因子缺乏病患(因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII及因子XIII)血漿中的凝血作用。該促凝作用超越單獨使用脂化組織因子作為促凝劑時得到之作用。即使在低濃度(1微克/毫升)之脂化組織因子無法凝結的因子V缺乏血漿(FV－D血漿)，這二種藥劑之組合物產生顯著的促凝作用。同樣的，當使用因子VII缺乏血漿(FVII－D血漿)亦可得到類似的協同作用。這些結果顯示脂化組織因子媒介的作用與因子VII無關，即使缺乏因子V時仍可導致血漿凝結。同樣的，該組合物(脂化組織因子＋負電荷無機表面)也能在血友病(A及B)患者的血漿檢體中展現有效的促凝作用。表16顯示5次獨立試驗得到的結果。
也利用血友病A(3位)及B(2位)病患之血液進行凝血試驗，以探討脂化組織因子與負電荷無機表面組合物在非抗凝全血中的促凝作用。藉由和單獨使用脂化組織因子之試驗(表12)比較，該組合物(基因重組組織因子＋負電荷無機表面)之促凝效果顯著(p<0.001)較高(表17)。
4.證實脂化組織因子(單獨或合併)導致健康個體凝血之活體外試驗4.1脂化組織因子凝結來自健康個體之血漿及血液進行一系列的活體外凝血試驗，以顯示脂化組織因子於無凝血障礙病史之健康志願者的血漿及非抗凝全血中之凝血作用。表18顯示5次於健康血漿之獨立試驗的結果，表19為非抗凝全血。
4.2脂化組織因子與負電荷無機表面之組合物協同促進來自健康個體之血漿及血液凝結。當脂化組織因子結合磷脂質時不具協同作用進行一系列的活體外凝血試驗，以顯示基因重組組織因子與負電荷無機表面之組合物於健康志願者的血漿中之凝血作用。表20顯示在5次獨立試驗得到的結果。藉由和單獨使用基因重組組織因子之試驗比較，該組合物(基因重組組織因子＋負電荷無機表面)在各個使用的濃度下有顯著(p<0.001)較高之促凝效果。
5.證實脂化組織因子(單獨或合併)於先天性及後天性(血小板減少性)血小板疾病病患血液之凝血效果的活體外試驗5.1脂化組織因子凝結來自先天性血小板疾病病患之全血利用2位葛萊斯曼氏病(Glanzmann’s disease)及伯納德－蘇利爾氏症候群(Bernard Soulier syndrome)患者之血液進行凝血試驗，研究脂化組織因子對於促進血小板疾病患者血液凝結的效果。基因重組組織因子依濃度依賴模式非常顯著地促進葛萊斯曼氏病(Glanzmann’s disease)及伯納德－蘇利爾氏症候群(Bernard Soulier syndrome)患者之凝血(表22)；因此基因重組組織因子可用於該類病患作為止血治療之藥物。
5.2脂化組織因子與負電荷無機表面之組合物促進來自先天性血小板疾病病患之全血凝結進行一系列的活體外凝血試驗，以顯示基因重組組織因子與負電荷無機表面之組合物於先天性血小板疾病病患之全血中的凝血作用。表23顯示在2位葛萊斯曼氏病(Glanzmann’s disease)及伯納德－蘇利爾氏症候群(Bernard－Soulier syndrome)患者中得到的結果。藉由和單獨使用基因重組組織因子之試驗比較，該組合物(基因重組組織因子＋負電荷無機表面)在每位病患均有顯著(p<0.001)較高之促凝效果。
5.3脂化組織因子凝結血小板缺乏檢體進行一系列的活體外凝血試驗，以顯示脂化組織因子於不同血小板數之血漿中的凝血作用。表24顯示從正常血小板數至血小板低下狀態得到的結果。
6.證實組織因子係可用於對照大鼠以供局部止血治療之藥劑的活體內試驗(直接塗敷於先前截斷之血管)6.1脂化組織因子可作為大鼠近側斷尾嚴重出血動物模式之局部止血劑活體內試驗顯示，單獨或與負電荷無機表面一起給予之脂化組織因子可作為局部止血治療之藥物。藉由大鼠近側斷尾嚴重出血動物模式，評估脂化組織因子作為單獨或與負電荷無機表面一起給予之局部止血劑的用途。結果顯示於表25。如該表所示，在該嚴重出血模式中，對照大鼠(PSS對照組，以生理食鹽水治療)之出血於18.1±5.98分鐘後自動凝結；然而，局部給予基因重組脂化組織因子(單獨)顯著縮短凝血時間(11.1±5.54分鐘，p<0.001)。當基因重組脂化組織因子與負電荷無機表面一起給予時，其促凝效果甚至更強(5.0±1.1分鐘；p<0.001)。
在相同的實驗條件下評估非脂化組織因子(n＝3)。結果發現沒有任何影響，出血凝結時間類似對照組。這些結果顯示，非脂化組織因子無法用於局部治療出血事件。
6.2脂化組織因子可作為以肝素或殺鼠靈預先處理之嚴重出血動物模式的局部止血劑活體內試驗顯示，單獨給予之脂化組織因子可用於抗凝狀況下作為局部止血治療藥物(表25)。藉由預先處理之大鼠近側斷尾嚴重出血動物模式，包括於截尾前15分鐘以200單位/公斤肝素靜脈注射，或在截尾前三天每天經口給予0.1毫克/公斤之殺鼠靈，評估脂化組織因子作為單獨給予之局部止血劑的用途。結果顯示於表26。如該表所示，在該嚴重出血模式中，以生理食鹽水治療之食鹽水對照組於18.1±5.98分鐘後自動凝血。肝素對照組無法自動凝血(>90分鐘)，殺鼠靈對照組於41.6±8.5分鐘後自動凝血。表26顯示局部給予脂化組織因子(單獨)在所有治療組均顯著縮短凝血時間。
6.3脂化組織因子可作為頸動脈穿刺致死性出血動物模式之局部止血劑活體內試驗顯示，單獨給予之基因重組組織因子係可直接塗佈於血管上之局部止血治療藥物。藉由頸動脈穿刺之致死性出血動物模式，評估單獨給予基因重組脂化組織因子之用途。得到的結果顯示於表27，具有非常顯著的意義。如該表所示，所有對照組(以生理食鹽水治療之PSS對照組)的動物出血致死，但是脂化組織因子組沒有動物死亡，所有傷口均可成功癒合及凝血。就達成穩固凝血及穿刺傷口癒合所需的時間而言，該治療係為有效。
總結：實施例1的結果清楚顯示：1)當配體(因子VII)不存在時，脂化組織因子能直接與活化型因子X交互反應，顯著增加其溶蛋白活性(胺分解及凝血酶形成活性)，此結果首次顯示脂化組織因子之新穎功能，也就是作為活化型因子X之新穎輔助因子(與知名的活化型因子V無關)。
2)脂化組織因子可以凝結因子VII缺乏血漿。因此，脂化組織因子係這些病患良好的替代治療(目前唯一的治療是昂貴的人類基因重組活化型因子VII)。
3)脂化組織因子與負電荷無機表面及活化型因子X(無法造成凝血之低濃度)產生協同作用。
實施例2的結果清楚顯示：1)脂化組織因子促使生理濃度之活化型因子X(無法產生任何促凝效果)造成凝血酶原水解及後續的凝血酶形成。
2)脂化組織因子具有新穎功能，也就是作為所有形式之活化型因子X(可溶性或與凝血酶原酶複合物結合)的所有溶蛋白作用之輔助因子。
3)即使因子X缺乏血漿(含微量之因子X)亦可被脂化組織因子凝結，因此脂化組織因子可作為這類病患良好的替代治療。
4)脂化組織因子與負電荷無機表面協同刺激活化型因子X之活性。
實施例3的結果清楚顯示：1)脂化組織因子能使血友病患者(因子VIII、因子IX及因子XI)凝血，因此脂化組織因子可作為這類病患良好的替代治療。
2)脂化組織因子即使在缺乏因子V時亦可造成凝血，這些結果清楚顯示脂化組織因子對活化型因子X具有強烈刺激效果，因為當其輔助因子不存在時(因子V缺乏血漿)，脂化組織因子可作為造成相同刺激效果的輔助因子。
3)即使在因子X缺乏血漿中(含微量因子X)，脂化組織因子亦可導致凝血。因此脂化組織因子可作為這類病患的替代治療。
4)脂化組織因子可以在肝素及殺鼠靈處理血漿中造成凝血，這表示脂化組織因子干擾抗凝血酶III之作用，甚至可能透過其對活化型因子X基礎濃度之刺激作用，而可以在殺鼠靈處理血漿中造成凝血。
5)最後，脂化組織因子與負電荷無機表面在所有因子缺乏血漿中具有協同促凝作用。
實施例4的結果清楚顯示：1)脂化組織因子能造成健康個體之凝血。因此，脂化組織因子係治療健康個體出血事件之良好替代治療。
2)脂化組織因子與負電荷無機表面協同促進健康個體之凝血作用，但只含磷脂質則否。
實施例5的結果清楚顯示：1)脂化組織因子可以造成血小板疾病病患凝血，諸如先天性或後天性(也就是血小板低下症)。因此，脂化組織因子係血小板數及/或功能變化病患之出血事件的良好替代治療。
實施例6的結果清楚顯示：1)局部給予之脂化組織因子可在嚴重出血(近側全尾截斷)之動物模式中停止出血。
2)局部給予之脂化組織因子可在嚴重出血(近側全尾截斷)複合抗凝處理(肝素或殺鼠靈)之動物模式中停止出血。
3)局部給予之脂化組織因子可在致死出血(頸動脈穿刺)之動物模式中停止出血。
圖1說明活化型因子X基底濃度與纖維纖維蛋白凝塊形成。
圖2說明典型的內因性及外因性凝血途徑。
圖3根據本發明說明脂化組織因子作為活化型因子X之刺激劑的新穎調節作用。

Claims (47)

  1. 一種作為活化型凝血因子X(FXa)刺激劑之脂化(lipidated)組織因子(TF)於製造供局部治療個體出血的藥物上之用途。
  2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該個體係健康個體或具有出血特異質之個體，該出血特異質包含凝血異常(coagulopathy)及/或血小板疾病。
  3. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該凝血異常係先天性凝血異常或後天性凝血異常。
  4. 如申請專利範圍第3項之用途，其中該先天性凝血異常係因選自凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、因子XI、凝血因子XII、凝血因子XIII或其組合之凝血因子缺乏所致之凝血異常。
  5. 如申請專利範圍第4項之用途，其中該先天性凝血異常係因選自凝血因子V之凝血因子缺乏所致之凝血異常。
  6. 如申請專利範圍第4項之用途，其中該先天性凝血異常係因選自凝血因子VII之凝血因子缺乏所致之凝血異常。
  7. 如申請專利範圍第4項之用途，其中該先天性凝血異常係因選自凝血因子X之凝血因子缺乏所致之凝血異常。
  8. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該個體之後 天性凝血異常係因抗凝血劑之抗凝血治療所致。
  9. 如申請專利範圍第8項之用途，其中該抗凝血劑係肝素、低分子量肝素、殺鼠靈(warfarin)、香豆素(coumarin)衍生物或雙香豆素(dicoumarins)。
  10. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該個體具有先天性或後天性血小板疾病。
  11. 如申請專利範圍第10項之用途，其中該先天性血小板疾病選自葛萊斯曼氏病(Glanzmann’s disease)、伯納德-蘇利爾氏症候群(Bernard-Soulier syndrome)、寶林-詹美森氏症候群(Bolin-Jamieson’s syndrome)、威思考特-奧德里奇氏症候群(Wiskott-Aldrich syndrome)、巴黎-特魯索-亞各布森氏症候群(Paris-Trousseau-Jacobsen syndrome)、X染色體之血小板缺乏症、灰色血小板症候群(Gray platelet syndrome)、沙巴斯丁氏症候群(Sebastian syndrome)或范可尼貧血(Fanconi anemia)。
  12. 如申請專利範圍第10項之用途，其中該後天性血小板疾病選自骨髓增生性疾病(諸如血小板增多症、紅血球增多症或慢性骨髓性白血病)；骨髓異常增生(myeloid metaplasia)；壞血病、先天性心臟疾病及肝硬化中之異常蛋白質血症(disproteinemia)。
  13. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該脂化組織因子係人類脂化組織因子。
  14. 一種產品，其包含(i)作為活化型凝血因子X(FXa)刺激劑之脂化組織因子及(ii)活化型凝血因子X(FXa)。
  15. 一種產品，其分別包含(i)作為活化型凝血因子X(FXa)刺激劑之脂化組織因子及(ii)活化型凝血因子X(FXa)。
  16. 一種產品，其分別包含作為組合物用於同時或連續投藥給個體之(i)作為活化型凝血因子X(FXa)刺激劑之脂化組織因子及(ii)活化型凝血因子X(FXa)。
  17. 一種產品，其包含(i)作為活化型凝血因子X(FXa)刺激劑之脂化組織因子及(ii)負電荷無機表面(NCIS)。
  18. 一種產品，其分別包含(i)作為活化型凝血因子X(FXa)刺激劑之脂化組織因子及(ii)負電荷無機表面(NCIS)。
  19. 一種產品，其分別包含作為組合物用於同時或連續投藥給個體之(i)作為活化型凝血因子X(FXa)刺激劑之脂化組織因子及(ii)負電荷無機表面(NCIS)。
  20. 一種產品，其包含(i)作為活化型凝血因子X(FXa)刺激劑之脂化組織因子、(ii)活化型凝血因子X(FXa)及(iii)負電荷無機表面(NCIS)。
  21. 一種產品，其分別包含(i)作為活化型凝血因子X(FXa)刺激劑之脂化組織因子、(ii)活化型凝血因子X(FXa)及(iii)負電荷無機表面(NCIS)。
  22. 一種產品，其分別包含作為組合物用於同時或連續投藥給個體之(i)作為活化型凝血因子X(FXa)刺激劑之脂化組織因子、(ii)活化型凝血因子X(FXa)及(iii)負電荷無機表面(NCIS)。
  23. 如申請專利範圍第14至22項中任一項之產品，其中該脂化組織因子係人類脂化組織因子。
  24. 如申請專利範圍第14至22項中任一項之產品，其係作為藥物。
  25. 如申請專利範圍第23項之產品，其係作為藥物。
  26. 一種申請專利範圍第14至23項中任一項之產品於製造供治療個體出血的藥物上之用途。
  27. 一種申請專利範圍第14至23項中任一項之產品於製造供局部治療個體出血的藥物上之用途。
  28. 一種複合物(TF：：FXa)，其包含作為活化型凝血因子X(FXa)刺激劑之脂化組織因子及活化型凝血因子X(FXa)。
  29. 如申請專利範圍第28項之複合物，其係作為藥物。
  30. 一種申請專利範圍第28項之複合物於製造供治療個體出血的藥物上之用途。
  31. 一種申請專利範圍第28項之複合物於製造供局部治療個體出血的藥物上之用途。
  32. 一種複合物(TF：：NCIS)，其包含作為活化型凝血因子X(FXa)刺激劑之脂化組織因子及負電荷無機表面。
  33. 如申請專利範圍第32項之複合物，其係作為藥物。
  34. 一種申請專利範圍第32項之複合物於製造供治療個體出血的藥物上之用途。
  35. 一種申請專利範圍第32項之複合物於製造供局部治療個體出血的藥物上之用途。
  36. 一種複合物(TF：：FXa：：NCIS)，其包含作為活化型凝血因子X(FXa)刺激劑之脂化組織因子、活化型凝血因子X及負電荷無機表面。
  37. 如申請專利範圍第36項之複合物，其係作為藥物。
  38. 一種申請專利範圍第36項之複合物於製造供治療個體出血的藥物上之用途。
  39. 一種申請專利範圍第36項之複合物於製造供局部治療個體出血的藥物上之用途。
  40. 一種藥學組成物，其包含作為活化型凝血因子X(FXa)刺激劑之脂化組織因子及藥學上可接受之載體。
  41. 一種用於局部給予脂化組織因子之藥學組成物，其包含作為活化型凝血因子X(FXa)刺激劑之脂化組織因子及適用於局部給予該脂化組織因子之藥學上可接受之載體。
  42. 一種藥學組成物，其：a)包含申請專利範圍第14項之產品及藥學上可接受之載體；或b)分別包含(i)作為活化型凝血因子X(FXa)刺激劑之脂化組織因子與藥學上可接受之載體，及(ii)活化型凝血因子X與藥學上可接受之載體；或c)包含申請專利範圍第17項之產品及藥學上可接受 之載體；或d)分別包含(i)作為活化型凝血因子X(FXa)刺激劑之脂化組織因子與藥學上可接受之載體，及(ii)負電荷無機表面與藥學上可接受之載體；或e)包含申請專利範圍第20項之產品及藥學上可接受之載體；或f)分別包含(i)作為活化型凝血因子X(FXa)刺激劑之脂化組織因子與藥學上可接受之載體、(ii)活化型凝血因子X與藥學上可接受之載體，及(iii)負電荷無機表面與藥學上可接受之載體；或g)包含申請專利範圍第28項之TF：：FXa複合物及藥學上可接受之載體；或h)包含申請專利範圍第32項之TF：：NCIS複合物及藥學上可接受之載體；或i)包含申請專利範圍第36項之TF：：FXa：：NCIS複合物及藥學上可接受之載體。
  43. 如申請專利範圍第42項之藥學組成物，其係以藥學投藥形式用於局部投藥。
  44. 一種產品，其包含申請專利範圍第40至43項中任一項之藥學組成物及載劑。
  45. 一種包含藥學組成物之產品，該藥學組成物包含：(i)載劑、(ii)申請專利範圍第14項之產品及藥學上可接受之載體、(iii)申請專利範圍第17項之產品及藥學上 可接受之載體或(iv)申請專利範圍第20項之產品以及藥學上可接受之載體；或申請專利範圍第28項之TF：：FXa複合物及藥學上可接受之載體，或申請專利範圍第32項之TF：：NCIS複合物及藥學上可接受之載體，或申請專利範圍第36項之TF：：FXa：：NCIS複合物及藥學上可接受之載體。
  46. 一種非脂化組織因子或其功能性片段於製造供治療凝血因子VII缺乏個體之出血的藥物上之用途。
  47. 如申請專利範圍第46項之用途，其係用於製造供非經腸給予非脂化組織因子或其功能性片段的藥物。
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