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TWI425951B - 共軛方法 - Google Patents

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TWI425951B
TWI425951B TW096111419A TW96111419A TWI425951B TW I425951 B TWI425951 B TW I425951B TW 096111419 A TW096111419 A TW 096111419A TW 96111419 A TW96111419 A TW 96111419A TW I425951 B TWI425951 B TW I425951B
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pnag
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carrier protein
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TW096111419A
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TW200815028A (en
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Ralph Leon Biemans
Pierre Duvivier
Tomas Maira-Litran
Original Assignee
Glaxosmithkline Biolog Sa
Brigham & Womens Hospital
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Publication of TW200815028A publication Critical patent/TW200815028A/zh
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Description

共軛方法
本發明係關於共軛領域且提供一種使PNAG與載體蛋白共軛之方法。可進一步調配PNAG－載體蛋白共軛物以提供疫苗。本發明亦包括PNAG－載體蛋白共軛物、包含PNAG－載體蛋白共軛物之疫苗及其在治療中之用途。
近年來，社區獲得性及醫院獲得性感染數量隨著血管內裝置使用增加而增加。醫院獲得性(醫院)感染為發病率及死亡率之主要因素，更尤其在美國，醫院獲得性感染每年感染兩百萬以上患者。根據大量研究，約6%之美國患者在其住院期間獲得感染。據估計，1992年美國之經濟負擔超過45億美元(Emori及Gaynes,1993,Clin.Microbiol.Rev.6；428)。最常見感染為尿道感染(UTI佔感染之33%)、接著為肺炎(15.5%)、手術部位感染(14.8%)及原發性血流感染(13%)(Emori及Gaynes,1993,Clin.Microbiol.Rev.6；428)。
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )、凝固酶陰性葡萄球菌(Coagulase－negative Staphylococci，主要為表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis ))、腸球菌(enterococcus spp)、大腸桿菌(Esherichia coli )及綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )為主要醫院病原體。雖然彼等病原體幾乎引起相同數量之感染，但其可產生之病症之嚴重程度與耐抗生素性分離物之頻率平衡了對金黃色葡萄球菌及表皮葡萄球菌之此等級，其中金黃色葡萄球菌及表皮葡萄球菌為最顯著醫院病原體。
金黃色葡萄球菌為具有顯著發病率及死亡率之醫院感染的最常見原因(Romero－Vivas等人1995,Infect.Dis.21；1417)。其為骨髓炎、心內膜炎、膿毒性關節炎、肺炎、膿腫及中毒性休克症候群之某些病例之起因。
表皮葡萄球菌為正常皮膚共生體，其亦為造成植入醫學裝置感染及外科手術部位感染之原因的重要伺機性病原體。經表皮葡萄球菌感染之醫學裝置包括心臟起搏器、腦脊髓液分流器、持續性攜帶式腹膜透析導管、矯形術裝置及人工心臟瓣膜。
用抗生素處理金黃色葡萄球菌及表皮葡萄球菌感染，其中盤尼西林(penicillin)為供選擇藥物，而萬古黴素(vancomycin)用於耐二甲氧苯青黴素分離物。自20世紀八十年代以來，顯示廣泛耐抗生素性之葡萄球菌株之百分比已日漸盛行(Panlilo等人1992,Infect.Control.Hosp.Epidemiol.13；582)，此對有效抗菌治療構成威脅。此外，近來耐萬古黴素之金黃色葡萄球菌株之出現已引起耐二甲氧苯青黴素之表皮葡萄球菌出現且蔓延之恐慌，因為其無法得到有效治療。
已研究在陰性免疫療法中使用抗葡萄球菌抗原之抗體的另一種方法。包括投與多株抗血清之療法處於發展中(WO 00/15238、WO 00/12132)，用抗脂磷壁酸之單株抗體處理亦在發展中(WO 98/57994)。
另一種方法為使用活性疫苗接種以產生抗葡萄球菌之免疫反應。已鑑別包括為疫苗組份之若干候選物。此等包括聚N－乙醯化葡糖胺(PNAG)，其為在葡萄球菌(例如金黃色葡萄球菌及表皮葡萄球菌)中發現之表面多醣。此抗原尤其在呈去乙醯化形式(dPNAG)之情況下已顯示其產生調理素免疫反應(WO 04/43405)。WO 04/43405揭示使用有機氰化劑四氟硼酸1－氰基－4－二甲基胺基吡錠(CDAP)使PNAG與載體蛋白共軛及藉由用戊二醛活化載體蛋白接著還原胺化來使dPNAG與載體蛋白共軛。
所述CDAP共軛不適於與dPNAG共同使用，因為經活化之dPNAG可與dPNAG上之NH2 基團反應使得若使用CDAP化學處理則存在dPNAG交聯之風險。所述用於共軛dPNAG之方法具有缺點，其使用戊二醛處理作為第一步以將醛基引至載體蛋白上。因為戊二醛之不同分枝可導致不同結果，所以戊二醛處理往往使得再生不可靠。戊二醛處理亦可導致載體蛋白交聯。
需要避免使用戊二醛之使去乙醯化PNAG與載體蛋白共軛之其他方法以最大程度使用PNAG作為疫苗組份。
本發明之第一態樣提供一種使N－乙醯化少於40%之PNAG與載體蛋白共軛之方法，該方法包含以下步驟：a)藉由添加包含順丁烯二醯亞胺基之鍵聯劑來活化PNAG以形成活化之PNAG；b)藉由添加包含巰基之鍵聯劑來活化載體蛋白以形成活化之載體蛋白；及c)使活化之PNAG與活化之載體蛋白反應以形成PNAG－載體蛋白共軛物；或a)藉由添加包含巰基之鍵聯劑來活化PNAG以形成活化之PNAG；b)藉由添加包含順丁烯二醯亞胺基之鍵聯劑來活化載體蛋白以形成活化之載體蛋白；及c)使活化之PNAG與活化之載體蛋白反應以形成PNAG－載體蛋白共軛物；或a)藉由添加包含巰基之鍵聯劑來活化PNAG以形成活化之PNAG；b)藉由添加包含巰基之鍵聯劑來活化載體蛋白以形成活化之載體蛋白；及c)使活化之PNAG與活化之載體蛋白反應以形成PNAG－載體蛋白共軛物。
本發明之第二態樣提供一種製造疫苗之方法，該方法包含進行本發明之共軛方法且添加合併PNAG－載體蛋白共軛物與醫藥學上可接受之賦形劑之另一步驟。
本發明之第三態樣提供可藉由本發明之方法獲得之PNAG－載體蛋白共軛物。
本發明之第四態樣提供PNAG－載體蛋白共軛物，其中PNAG少於40% N－乙醯化且PNAG與載體蛋白藉由包含鍵結硫原子之順丁烯二醯亞胺基或鍵結硫原子之硫原子的鍵聯劑接合。
本發明之第五態樣提供N－乙醯化少於40%之活化PNAG，其中PNAG共價鍵結包含順丁烯二醯亞胺基之鍵聯劑。
本發明之第六態樣提供包含可由本發明之方法獲得之PNAG－載體蛋白共軛物之疫苗。
本發明之另一態樣提供用於治療或預防葡萄球菌疾病之本發明之PNAG－載體蛋白共軛物。
本發明之另一態樣提供本發明之PNAG－載體蛋白共軛物之用途，其係用於製備供治療或預防葡萄球菌疾病之疫苗。
本發明之另一態樣提供一種治療或預防葡萄球菌疾病之方法，其包含將本發明之疫苗投與人類或動物患者之步驟。
本發明描述一種用於使N－乙醯化少於40、35、30、20、15、10或5%之PNAG與載體蛋白共軛之方法，該方法包含以下步驟：a)藉由添加包含順丁烯二醯亞胺基之鍵聯劑來活化PNAG以形成活化之PNAG；b)藉由添加包含巰基之鍵聯劑來活化載體蛋白以形成活化載體蛋白；及c)使活化之PNAG與活化之載體蛋白反應以形成PNAG－載體蛋白共軛物。
作為本發明之獨立態樣，本發明描述一種用於使N－乙醯化少於40、35、30、20、15、10或5%之PNAG與載體蛋白共軛之方法，該方法包含以下步驟：a)藉由添加包含順丁烯二醯亞胺基之鍵聯劑來活化載體蛋白以形成活化之載體蛋白；b)藉由添加包含巰基之鍵聯劑來活化PNAG以形成活化之PNAG；及c)使活化之PNAG與活化之載體蛋白反應以形成PNAG－載體蛋白共軛物。
作為本發明之獨立態樣，本發明描述一種用於使N－乙醯化少於40、35、30、20、15、10或5%之PNAG與載體蛋白共軛之方法，該方法包含以下步驟：a)藉由添加包含巰基之鍵聯劑來活化載體蛋白以形成活化之載體蛋白；b)藉由添加包含巰基之鍵聯劑來活化PNAG以形成活化之PNAG；及c)使活化之PNAG與活化之載體蛋白反應以形成PNAG－載體蛋白共軛物。
術語PNAG包含dPNAG及PNAG。PNAG少於40、35、30、25、20、15、10、5、2或1% N－乙醯化使得PNAG主要呈去乙醯形式。PNAG之去乙醯化抗原決定基可引起能介導調理素殺死革蘭氏陽性細菌(Gram positive bacteria)(例如金黃色葡萄球菌及/或表皮葡萄球菌)之抗體。在一實施例中，PNAG未經O－丁二醯化或在少於25、20、15、10、5、2、1或0.1%之殘基上經O－丁二醯化。
PNAG可為不同大小，自超過400 kDa至75與400 kDa之間、至10與75 kDa之間、至由最多30個重複單元構成之寡醣變化。任何大小之PNAG多醣或寡醣可用於本發明之方法中，例如超過40、50、60、80、100或200 kDa或在40－400 kDa、50－350 kDa、40－300 kDa、60－300 kDa、50－250 kDa、60－200 kDa、70－150 kDa或80－120 kDa之間。大小調整可藉由此項技術中已知之任何方法、例如藉由微流化、超音波照射或藉由化學分解(WO 03/53462、EP497524、EP497525)來達成。
在一實施例中，藉由化學處理天然多醣使PNAG去乙醯基化以形成dPNAG。例如，用鹼性溶液處理天然PNAG使得pH值升至10以上。例如，用0.1－5 M、0.2－4 M、0.3－3 M、0.5－2 M、0.75－1.5 M、約1.5 M、約2 M、約5 M或約1 M之NaOH、KOH或NH4 OH處理PNAG。在20－100、25－80、30－60或30－50或35－45℃之溫度下處理歷時至少10或30分鐘或1、2、3、4、5、10、15、20或24小時。dPNAG可如WO 04/43405中所述來製備。
共軛為PNAG與載體蛋白之共價偶合。其可為直接或間接的，併入與活化PNAG及活化載體蛋白之順丁烯二醯亞胺基及巰基反應之另一交聯化合物。
術語鍵聯劑係指在已完成之共軛物中共價連接PNAG與載體蛋白之分子。鍵聯劑可源於用於共軛反應中之兩個分子之共價鍵結。或者，鍵聯劑可來源於用於共軛反應(例如在來自載體蛋白之半胱胺酸殘基之巰基與活化PNAG上之順丁烯二醯亞胺基或巰基反應之情況下)中之單個分子。
在第一實施例之一態樣中，在步驟a)期間包含順丁烯二醯亞胺基之鍵聯劑連接PNAG上之胺基。
在第二實施例之一態樣中，在步驟b)期間包含順丁烯二醯亞胺基之鍵聯劑連接載體蛋白上之胺基。
在一實施例中，鍵聯劑包含衍生自選自由BMPS、EMCS、GMBS、MBS、LC－SMCC、SMCC、SMPB、SMPH、磺基－EMCS、磺基－MBS、磺基－SMCC、磺基－GMBS及磺基－SMPB組成之群之化合物的順丁烯二醯亞胺基。
在一實施例中，包含順丁烯二醯亞胺基之鍵聯劑具有5－10、6－8、10－20、12－17、約7、約10或約15埃之間隔長度。
在一實施例中，在步驟a)期間，PNAG與包含順丁烯二醯亞胺基之鍵聯劑的重量/重量比率為1：20－20：1、1：20－1：1、1：10－1：1、1：5－5：1、1：2－2：1、1：1.5－1.5：1或約1：1或1：10。
約意謂數字應在所提供之數字之10%內。
在一實施例中，藉由添加包含順丁烯二醯亞胺基之鍵聯劑活化PNAG或載體蛋白的步驟在6.0－9.0、6.0－8.5、7.5－8.5、6.5－7.5或約7.0或8.0之pH值下進行。
在一實施例中，在步驟a)或b)期間，包含巰基之鍵聯劑連接載體蛋白上之胺基。在一實施例中，在步驟b)期間，包含巰基之鍵聯劑連接PNAG上之胺基。
在一實施例中，鍵聯劑包含衍生自或可衍生自選自由SPDP、LC－SPDP、SMPT、LC－SMPT、磺基－SPDP、磺基－SMPT、磺基－LC－SMPT、磺基－LC－SPDP及N－乙醯基同型半胱胺酸硫內酯組成之群之化合物的巰基。
在一實施例中，包含巰基之鍵聯劑具有4－25、5－10、6－8、10－20、13－17、5－20、約7或約15埃之間隔長度。
在PNAG藉由添加第一鍵聯劑來活化且載體蛋白藉由添加第二鍵聯劑來活化之實施例中，第一及第二鍵聯劑視情況分別衍生自或可衍生自GMBS及SPDP、GMBS及LC－SPDP、磺基－GMBS及SPDP、磺基－GMBS及LC－SPDP、SPDP及GMBS、SPDP及磺基－GMBS；LC－SPDP及GMBS；或LC－SPDP及磺基－GMBS。
在PNAG藉由添加包含巰基之第一鍵聯劑來活化且載體蛋白藉由添加包含巰基之第二鍵聯劑來活化之實施例中，第一及第二鍵聯劑可相同或不同。例如，第一及第二鍵聯劑可分別衍生自或可衍生自SPDP及SPDP；SPDP及LC－SPDP；SPDP及SMPT；SDPD及LC－SMPT、LC－SPDP及SDPD、LC－SPDP及LC－SPDP；LC－SPDP及SMPT、LC－SDPD及LC－SMPT；SMPT及SPDP；SMPT及LC－SPDP；SMPT及SMPT；SMPT及LC－SMPT；LC－SMPT及SPDP；LC－SMPT及LC－SDPD、LC－SMPT及SMPT或LC－SMPT及LC－SMPT。
在一實施例中，在藉由添加包含巰基之鍵聯劑來活化載體蛋白之步驟期間，包含巰基之鍵聯劑與載體蛋白之重量/重量比率為100：1－1：100、1：1－1：100、100：1－1：1、100：1－10：1、50：1－2：1、50：1－20：1、20：1－3：1、15：1－5：1或約10：1。
在一實施例中，藉由添加包含巰基之鍵聯劑來活化載體蛋白之步驟在6.0－9.0、7.0－9.0、7.5－8.5或約8.0之pH值下進行。
在一實施例中，在步驟c)期間，活化PNAG與活化載體蛋白之重量/重量比率為10：1－1：10、9：1－1：5、8：1－1：2、7：1－1：1、5：1－1：1或約2：1。
在一實施例中，步驟c)在6.0－9.0、6.0－8.0、6.5－7.5或約7.0之pH值下進行。
在一實施例中，步驟c)完成後PNAG與載體蛋白之間的鍵聯劑長度為5－40、10－30、12－25、10－15、15－25、20－25、20－30、25－30、30－40、約14、約23、約28或約30埃。
在一實施例中，本發明之方法包含用半胱胺酸阻斷過量順丁烯二醯亞胺基之另一步驟d)。
在一實施例中，載體蛋白係選自由下列各物組成之群：破傷風類毒素、白喉類毒素、CRM197、rEPA、蛋白D、SitC/MntC/唾液結合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、脂肪酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP－1、SSP－2、HBP、玻璃連接蛋白、血纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、IsdA、IsdB、HarA、SitC、α毒素(Hla)、α毒素H35R突變體、MRPII及自溶素或其片段。
目前用於偶合多醣或寡醣免疫原之載體蛋白之實例包括白喉及破傷風類毒素(DT、DT CRM197及TT)、透孔螺血藍蛋白(KLH)、綠膿桿菌外蛋白A(rEPA)及經純化之結核菌素蛋白衍生物(PPD)、自流行性感冒嗜血桿菌(Haemophilus influenzae )之蛋白D、肺炎球菌溶血素或以上之任一者之片段。適用片段包括包含T輔助抗原決定基之片段。詳言之，蛋白D片段較佳含有蛋白之N末端1/3。蛋白D為自流行性感冒嗜血桿菌之IgD結合蛋白(EP 0 594 610 B1)。
用於本發明之方法中之另一載體蛋白為單個葡萄球菌蛋白或其片段或包含至少或確切1、2、3或4個或4個以上葡萄球菌蛋白(例如選自以下所揭示之彼等或其片段)之融合蛋白。
在一實施例中，α毒素用作載體蛋白。因為共軛方法大大減少或移除毒性，所以可使天然形式來與多醣共軛。因為殘餘毒性較低，所以經遺傳去毒之α毒素(諸如His35Leu或His 35 Arg變異體)較佳用作載體。或者藉由用交聯劑甲醛或戊二醛處理來化學上將α毒素去毒。經遺傳去毒之α毒素視情況較佳藉由用交聯劑甲醛或戊二醛處理來化學上去毒以進一步減少毒性。
在一實施例中，本發明之方法包含合併PNAG－載體蛋白共軛物與視情況包含佐劑之醫藥學上可接受之賦形劑的另一步驟。
雖然適合佐劑包括鋁鹽，諸如氫氧化鋁凝膠(礬)或磷酸鋁，但亦可為鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽或鋅鹽，或可為醯化酪胺酸或醯化糖、陽離子或陰離子衍生之多醣或聚磷腈之不溶懸浮液。
在一實施例中，佐劑為TH1或TH2型反應之較佳誘導劑。高含量之Th1型細胞因子傾向於促進細胞介導之對特定抗原之免疫反應的誘發，而高含量之Th2型細胞因子傾向於促進對該抗原之體液免疫反應之誘發。
重要的是記得Th1與Th2型免疫反應之區別並非絕對。事實上，個體忍受描述為主要Th1或主要Th2之免疫反應。然而，根據藉由Mosmann及Coffman(Mosmann,T.R.及Coffman,R.L.(1989)TH1 and TH2 cells：different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties.Annual Review of Immunology,7，第145－173頁)在鼠科動物CD4＋ve T細胞純系中所述，常便於考慮細胞因子總科。傳統上，Th1型反應與藉由T－淋巴細胞產生INF－γ及IL－2細胞因子相關。常與Th1型免疫反應之誘發直接相關的其他細胞因子未由T細胞產生，諸如IL－12。相比之下，Th2型反應與Il－4、IL－5、IL－6、IL－10之分泌相關。促進主要Th1反應之適合佐劑系統包括：單磷醯脂A或其衍生物，尤其3－去－O－醯化單磷醯脂A(3D－MPL)(其製備參見GB 2220211 A)；及單磷醯脂A(較佳3－去－O－醯化單磷醯脂A)與鋁鹽(例如磷酸鋁或氫氧化鋁)或水包油乳液之組合。在該等組合中，抗原及3D－MPL含於相同微粒結構中，使得抗原及免疫刺激信號更有效傳遞。研究表明3D－MPL能進一步增強吸附礬之抗原的免疫原性[Thoelen等人.Vaccine(1998)16：708－14；EP 689454－B1]。
增強系統包括單磷醯脂A與皂素衍生物之組合，尤其如WO 94/00153中所揭示之QS21與3D－MPL之組合，或如WO 96/33739中所揭示用膽固醇中止QS21之較少反應原性組合物。包括QS21、3D－MPL及生育酚於水包油之乳液中之尤其有效佐劑調配物描述於WO 95/17210中。視情況而言，疫苗額外包含皂素，更佳QS21。調配物亦可包含水包油乳液及生育酚(WO 95/17210)。本發明亦提供一種製造疫苗調配物之方法，該方法包含將本發明之PNAG共軛物與醫藥學上可接受之賦形劑(諸如3D－MPL)一起混合。含有寡核苷酸之未甲基化之CpG(WO 96/02555)亦為TH1反應之較佳誘發劑且適用於本發明。佐劑視情況形成脂質體結構或ISCOM結構。
QS21：固醇之重量比通常為約1：100至1：1。在一實施例中，存在過量固醇，QS21：固醇之重量比為至少1：2。對人類投藥而言，QS21及固醇通常以每次給藥約1 μg至約100 μg或約10 μg至約50 μg之範圍存在於疫苗中。
脂質體視情況含有中性脂質，例如磷脂醯膽鹼(視情況在室溫下為非結晶體)，例如蛋黃磷脂醯膽鹼、二油醯磷脂醯膽鹼或雙月桂醯基磷脂醯膽鹼。脂質體亦可含有帶電脂質，其增加脂質體由飽和脂質構成之脂質體－QS21結構的穩定性。在此等狀況下，帶電脂質之量視情況為1－20重量%，視情況為5－10重量%。固醇與磷脂之比率為1－50%(mol/mol)，視情況為20－25%。
在一實施例中，佐劑含有MPL(3－去醯基之單磷醯脂A，亦稱為3D－MPL)。自GB 2 220 211(Ribi)已知3D－MPL為具有4、5或6醯化鏈之3種類型去－O－醯化單磷醯脂A之混合物且其藉由Ribi Immunochem,Montana製造(WO 92/116556)。
在一實施例中，佐劑含有最初在無MPL下製備之脂質體，接著將MPL視情況以100 nm微粒添加至脂質體中。因此，MPL不含在微脂粒膜內(稱為MPL在外)。MPL含在微脂粒膜內(稱為MPL在內)之組合物亦形成本發明之態樣。抗原可含在微脂粒膜內或含在微脂粒膜外。視情況可溶抗原在外且疏水性或脂抗原含在膜內或膜外。
在一實施例中，本發明之方法包含合併PNAG－載體蛋白共軛物與額外抗原之另一步驟。在一實施例中，添加1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個額外抗原。在一實施例中，額外抗原包含細菌多醣或寡醣。
該等抗原之實例包括來自5型及/或8型金黃色葡萄球菌之莢膜多醣或寡醣。
在人體中引起感染之大部分金黃色葡萄球菌株含有5型或8型多醣。約60%人類菌株為8型的且約30%為5型的。5型及8型莢膜多醣抗原之結構描述於Moreau等人Carbohydrate Res.201；285(1990)及Fournier等人Infect.Immun.45；87(1984)中。兩者在其重複單元中均具有FucNAcp以及可用以引入巰基之ManNAcA。
近來(Jones Carbohydrate Research 340, 1097－1106(2005))NMR光譜分析修改了此等莢膜多醣之結構：5型→4)－β－D－ManNAcA－(1→4)－α－L－FucNAc(3OAc)－(1→3)－β－D－FucNAc－(1→ 8型→3)－β－D－ManNAcA(4OAc)－(1→3)－α－L－FucNAc(1→3)－α－D－FucNAc(1→
使用熟練技術者熟知之方法可自合適金黃色葡萄球菌株萃取多醣，例如US 6294177中所述。舉例而言，ATCC 12902為5型金黃色葡萄球菌株，且ATCC 12605為8型金黃色葡萄球菌株。
多醣可為天然大小或可例如藉由微流化、超音波照射或藉由化學處理來調整大小。寡醣亦可用於本發明之方法中。
視情況使本發明之方法中所用之5型及8型多醣與可為以上所述之彼等載體蛋白的任何載體蛋白共軛(例如使用US 4372945、US 4474757、US 4356170、US 4830852或WO 95/08348之任一者中所揭示之方法)或其可為未經共軛的。
在一實施例中，額外抗原包含自US 6294177及Fattom及Guidry Am.J.Vet.Res.60：530(1999)中所述之金黃色葡萄球菌之336抗原。
在一實施例中，336抗原為天然大小或可例如藉由微流化、超音波照射或藉由化學處理調整大小之多醣。亦可使用來源於336抗原之寡醣。使用任何已知之共軛方法(例如US 4372945、US 4474757、US 4356170、US 4830852或WO 95/08348中所述之彼等方法)使336抗原較佳與載體蛋白共軛或其可為未經共軛的。
表皮葡萄球菌之菌株ATCC－31432、SE－360及SE－10特徵在於三種不同莢膜類型，分別為I、II及III型(Ichiman及Yoshida 1981,J.Appl.Bacteriol.51；229)。萃取自表皮葡萄球菌之每一血清型之莢膜多醣構成I型、II型及III型多醣。多醣可藉由若干方法來萃取，該等方法包括US 4197290中所述或如Ichiman等人1991,J.Appl.Bacteriol.71；176中所述之方法。
在本發明之一實施例中，額外抗原包含自表皮葡萄球菌之I型及/或II型及/或III型多醣或寡醣。多醣可為天然大小或可(例如)藉由微流化、超音波照射或化學分解調整大小。額外抗原亦可包括自表皮葡萄球菌株萃取之寡醣。此等多醣或寡醣未經共軛或較佳使用任何已知之共軛方法(例如US 4372945、US 4474757、US 4356170、US 4830852或WO 95/08348中所述之方法)共軛。
在一實施例中，額外抗原包含葡萄球菌蛋白或其片段。例如自金黃色葡萄球菌或表皮葡萄球菌之蛋白。本發明之某些實施例含有自金黃色葡萄球菌及表皮葡萄球菌之蛋白。舉例而言，額外抗原為分離蛋白，其包含至少85%、較佳至少90%、更佳至少95%、最佳至少97－99%或準確與序列表中任一序列之胺基酸序列相同的胺基酸序列。
當蛋白在本文中特別提及之情況下，可提及天然或重組之全長蛋白或視情況任何信號序列已被移除之成熟蛋白。蛋白可直接自葡萄球菌株分離或藉由重組DNA技術產生。蛋白之免疫原性片段可併入本發明之免疫原性組合物。此等片段為包含連續取自蛋白之胺基酸序列之至少10個胺基酸、至少20個胺基酸、至少30個胺基酸、至少40個胺基酸、至少50個胺基酸或至少100個胺基酸之片段。此外，該等免疫原性片段通常與抵抗葡萄球菌蛋白而產生之抗體或與藉由經葡萄球菌感染之哺乳動物宿主所產生之抗體免疫反應或含有T細胞抗原決定基。免疫原性片段亦包括當以有效劑量投與時(單獨或作為結合載體之半抗原)引起抵抗葡萄球菌感染之保護免疫反應(視情況抵抗金黃色葡萄球菌及/或表皮葡萄球菌感染)之片段。該免疫原性片段可包括(例如)缺乏N末端前導序列及/或跨膜域及/或C末端錨定域之蛋白。在一實施例中，本發明之方法中所用之免疫原性片段實質上包含蛋白之所有胞外域，其與選自序列表序列之序列具有至少85%、至少90%、至少95%或至少97－99%全長片段序列同一性。
在一實施例中，額外抗原可含有葡萄球菌蛋白或葡萄球菌蛋白片段之融合蛋白。該等融合蛋白可重組製得且可包含至少2、3、4、5或6種葡萄球菌蛋白之一部分。或者，融合蛋白可包含至少2、3、4、5或6種葡萄球菌蛋白之多個部分。此等可合併不同葡萄球菌蛋白或其相同蛋白內之片段。或者本發明亦包括葡萄球菌蛋白或其片段之個別融合蛋白作為具有異種序列之融合蛋白，諸如T細胞抗原決定基或純化標籤之供應者，例如β－半乳糖甘酶、麩胱甘肽－S－轉移酶、綠色螢光蛋白(GFP)、抗原決定基標籤(諸如FLAG、myc標籤、聚組胺酸或諸如流感病毒紅血球凝集素之病毒表面蛋白)或細菌蛋白(諸如破傷風類毒素、白喉類毒素、CRM197)。
額外抗原視情況包含葡萄球菌胞外組份結合蛋白或葡萄球菌轉運體蛋白或葡萄球菌毒素或毒性調節劑。額外抗原視情況包含至少或確切1、2、3、4、5或6種葡萄球菌蛋白。胞外組份結合蛋白之實例為昆布胺酸(laminin)受體、SitC/MntC/唾液結合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、脂肪酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP－1、SSP－2、HBP、玻璃連結蛋白、血纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig及MAP。葡萄球菌轉運體蛋白之實例為免疫優勢ABC轉運體、IsdA、IsdB、Mg2＋轉運體、SitC及Ni ABC轉運體。葡萄球菌毒素或毒性調控劑之實例為α毒素(HIa)、α毒素H35R突變體及RNA III活化蛋白(RAP)。
本發明之另一態樣為藉由本發明之方法可獲得或所獲得之PNAG－載體蛋白共軛物。
本發明之PNAG－載體蛋白共軛物包含N－乙醯化少於40%之PNAG，且PNAG與載體蛋白藉由包含鍵結硫原子之順丁烯二醯亞胺基之鍵聯劑接合。
在一實施例中，順丁烯二醯亞胺基位於PNAG與硫原子之間。或者順丁烯二醯亞胺基位於載體蛋白與硫原子之間。
在一實施例中，PNAG－載體蛋白共軛物具有結構： 其中R1及R2獨立選自視情況經取代之芳族鏈或脂肪鏈或一鍵。在一實施例中，R1為C1－C6烷基、C2－C5烷基、C3－C4烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基或C5烷基。在一實施例中，R2為C1－C6烷基、C2－C5烷基、C3－C4烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基或C5烷基。
在一實施例中，本發明之PNAG－載體蛋白共軛物具有結構： 其中R1及R2獨立選自視情況經取代之芳族鏈或脂肪鏈或一鍵。在一實施例中，R1為C1－C6烷基、C2－C5烷基、C3－C4烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基或C5烷基。在一實施例中，R2為C1－C6烷基、C2－C5烷基、C3－C4烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基或C5烷基。
本發明之另一態樣為PNAG－載體蛋白共軛物，其中PNAG少於40% N－乙醯化，且PNAG與載體蛋白藉由包含鍵結硫原子之硫原子之鍵聯劑接合。
在一實施例中，PNAG－載體蛋白共軛物具有結構： 其中R1及R2獨立選自視情況經取代之芳族鏈或脂肪鏈或一鍵。在一實施例中，R1為C1－C6烷基、C2－C5烷基、C3－C4烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基或C5烷基。在一實施例中，R2為C1－C6烷基、C2－C5烷基、C3－C4烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基或C5烷基。
在一實施例中，PNAG－載體蛋白共軛物具有結構：
本發明之另一態樣為N－乙醯化少於40%之活化PNAG，其中PNAG共價鍵結包含順丁烯二醯亞胺基之鍵聯劑。在一實施例中，順丁烯二醯亞胺基鍵聯劑包含衍生自或可衍生自選自由BMPS、EMCS、GMBS、MBS、LC－SMCC、SMCC、SMPB、SMPH、磺基－EMCS、磺基－MBS、磺基－SMCC、磺基－GMBS及磺基－SMPB組成之群之化合物。
在一實施例中，活化PNAG具有結構： 其中R1係選自視情況經取代之芳族鏈或脂肪鏈或一鍵。在一實施例中，R1為C1－C6烷基、C2－C5烷基、C3－C4烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基或C5烷基。在一實施例中，鍵聯劑長5－40、10－30、12－25、10－15、15－25、20－25、20－30、25－30、30－40、約14、約23、約28或約30埃。
藉由本發明之方法製成之PNAG－載體蛋白共軛物及疫苗製劑可藉助於經由全身途徑或黏膜途徑投與該疫苗用以保護或治療易受感染之哺乳動物。此等投藥可包括經由肌肉內、腹膜內、皮內或皮下途徑注射；或經由黏膜投與口腔/食道、呼吸道、泌尿生殖道。雖然本發明之疫苗可以單一劑量投與，但其組份亦可在相同時間或不同時間共投藥。對共投藥而言，可選Th1佐劑可存在於任何或所有不同投藥中，然而若其與疫苗之細菌蛋白組份組合存在則較佳。除單一投藥途徑外，可使用兩種不同投藥途徑。例如，多醣可經肌肉內(或皮內)投與且細菌蛋白可鼻內(或皮內)投與。此外，對預致敏劑量而言本發明之疫苗可肌肉內投與，且對加強劑量而言可鼻內投與。
選擇各疫苗中共軛抗原之量為誘發無典型疫苗中顯著、不利副作用之免疫保護反應之量。該量視使用何種特定免疫原及其如何呈現而變。一般而言，預期各劑量包含0.1－100 μg多醣，較佳0.1－50 μg多醣共軛物，較佳0.1－10 μg，更佳1－10 μg，其中1至5 μg為更佳範圍。
疫苗中蛋白抗原含量通常在1－100 μg、較佳5－50 μg之範圍內，最通常在5－25 μg之範圍內。在最初疫苗接種後，受檢者可接收一或若干次充分間隔之加強免疫。
疫苗製備一般描述於Vaccine Design("The subunit and adjuvant approach"(Powell M.F.& Newman M.J.編)(1995)Plenum Press New York)中。用脂質體封裝係描述於Fullerton之美國專利第4,235,877號。
本發明之疫苗可儲存於溶液中或經凍乾。溶液較佳在糖(諸如蔗糖、海藻糖或乳糖)存在下凍乾。疫苗經凍乾且在使用前臨時再生仍更佳。凍乾可導致更穩定組合物(疫苗)且在3D－MPL存在下及以鋁為主之佐劑缺乏下可能導致更高抗體力價。
在各情況下本發明者期望本文之術語"包含"視情況可用術語"由...組成"代替。
本專利說明書內所引用之所有文獻或專利申請案均以引用的方式併入本文中。
為更好地理解本發明而提出以下實例。此等實例僅為達成說明之目的，且不應解釋為以任何方式限制本發明之範疇。
實例 實例1 PNAG－TT共軛物之製備
dPNAG如WO 04/43405中所述來製備。在Superose 6管柱上進一步純化dPNAG。
dPNAG活化 將dPNAG(12 mg)溶於300 μl 5 M HCl＋300 μl 5 M NaOH＋1700 μl 1×PBS(pH值7.0)中，且將pH值調節至7.0。經由0.22 μm過濾器過濾樣品且將pH值再次調節至7.0。將12 mg GMBS添加於200 μl DMSO中，且在室溫下在黑暗中緩慢攪拌樣品2小時。用0.5 M NaOH將pH值保持在7.0。使用經1×PBS、10 mM EDTA(pH值7.0)緩衝液平衡之脫鹽管柱(PD10管柱)移除過量GMBS，且使用Centricon 10 KDa MWCO濃縮裝置濃縮樣品。
TT活化 將破傷風類毒素(TT)(6.5 mg；195 μl儲備溶液)添加至1105 μl含有10 mM EDTA之1×PBS(pH值8.0)中。將130 μLSPDP(DMSO中6.2 mg/ml)添加至蛋白溶液中，且在室溫下在黑暗中緩慢攪拌樣品1小時。使用0.5 M NaOH將pH值保持在8.0。使用經1×PBS、10 mM EDTA(pH值8.0)緩衝液平衡之脫鹽管柱(PD10管柱)移除過量SPDP，且使用Centricon 10 KDa MWCO濃縮樣品至1.3 ml。將0.65 mlDTT(1×PBS、10 mM EDTA(pH值8.0)緩衝液中23 mg/ml)添加至1.3 ml經SPDP活化之TT中。將樣品在室溫下黑暗中培育30分鐘。使用0.5 M NaOH將pH值保持在8.0。使用經1×PBS、10 mM EDTA(pH值7.0)緩衝液平衡之脫鹽管柱(PD10管柱)移除過量DTT，且使用Centricon 10 KDa MWCO濃縮裝置濃縮樣品至0.6 ml。
將經GMBS活化之Dpnag(0.6 ml)＋SH－SPDP－TT(0.6 ml)混合且在室溫下黑暗中緩慢攪拌2小時。在100 μl1×PBS、10 mM EDTA(pH值7.0)中用3 mg半胱胺酸阻斷過量順丁烯二醯亞胺，歷時30分鐘。在以1×PBS、10 mM EDTA(pH值7.0)作為電泳緩衝液之1 ml/min之Superose 6管柱上層析樣品。使用Bradford檢定測試溶離份之蛋白。將含有共軛物之溶離份彙集且使用Spectra/gel吸附劑濃縮至25 ml。測試最終共軛物之多醣及蛋白組成。
dPNAG－TT組合物 dPNAG：153.37 μg/ml(46.3%)TT：178.06 μg/ml(53.7%)
實例2
dPNAG之活化及偶合dPNAG－TT共軛物 使用下文所述之方法產生以下共軛物：dPNAG－TT010：dPNAG－S－GMBS＋經DTT處理之TT－LC－SPDP dPNAG－TT011：dPNAG－S－GMBS＋經DTT處理之TT－LC－SPDP dPNAG－TT012：dPNAG－S－GMBS＋經DTT處理之TT－SPDPdPNAG－TT014：dPNAG－SPDP＋經DTT處理之TT－SPDP dPNAG－TT017：經DTT處理之dPNAG－SPDP＋TT－LC－SPDP dPNAG－TT019：dPNAG－S－GMBS＋經DTT處理之TT－SPDP dPNAG－TT020：dPNAG－S－GMBS＋經DTT處理之TT－SPDP
dPNAG 將1 g PNAG以20 mg/ml之濃度溶於5 N HCl中，且培育1小時。接著用5 N NaOH中和。在5 μm膜上淨化溶液且在Sephacryl S400HR上純化。彙集對應於"介質分子大小"(參見Infection and Immunity,70：4433－4440(2002))之相關溶離份且在去N－乙醯化處理前濃縮。
將溶液在1 M NaOH下調節且在37℃下放置24小時。中和後，使產物經受透析及濃縮。
dPNAG活化 將S－GMBS(N－(γ－順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基)磺基丁二醯亞胺，Pierce)添加至0.2 M NaCl中之dPNAG(S－GMBS/PS(w/w)比率：1：1)中且在室溫下於pH值7.0(使用1 M NaOH調節pH值)下培育2 h。藉由在使用PBS、10 mM EDTA、50 mM NaCl(pH值7.2)作為溶離緩衝液而流動速率固定在60 ml/h之Toyopearl HW－40F純化來移除過量GMBS及副產物。根據光學密度(UV＝206 nm)選擇溶離池且接著在Vivaspin管3000 MWCO或Amicon Ultra 10,000 MWCO上濃縮。
偶合 混合經GMBS活化之dPNAG及經DTT還原之TT－SPDP且在室溫下攪拌。根據所用條件，在20－120 min後藉由添加半胱胺酸(在pH值8.0之磷酸鈉緩衝液中4 mg/ml)來中止反應，歷時30分鐘。在5 μm過濾器上淨化共軛物且注射於Sephacryl S300HR樹脂(XK16/100)上以供純化。在流動速率固定於30 ml/h之200 mM NaCl中實現溶離。藉由己醣胺及藉由蛋白劑量來分析溶離份。將相關溶離份彙集且在0.22 μm Sterivex上過濾。測試最終共軛物之多醣(己醣胺劑量)及蛋白組合物(Lowry劑量)。
dPNAG－SPDP： 將溶於DMSO(二甲亞碸，Merck)中之5倍莫耳過量之SPDP(N－丁二醯亞胺基－3－(2－吡啶基二硫基)丙酸酯，MW：312.4，Pierce)添加至100 mg以5 mg/ml於100 mM磷酸鈉(pH值7.2)中之dPNAG中。在Sephacryl S100HR(XK16/40)上純化前，在Amicon Ultra 10,000 MWCO(以3000 rpm離心28 min)上將反應混合物濃縮至±6 ml。在流動速率固定在60 ml/h之pH值7.4之磷酸鹽緩衝液中實現溶離。彙集相關溶離份(在206 nm下讀出)且在Amicon Ultra 10,000 MWCO(以3000 rpm離心30分鐘)上濃縮至1.1 ml。
TT－SPDP： 將溶於DMSO(二甲亞碸，Merck)中之15倍莫耳過量之SPDP(Pierce)添加至1 g於100 mM磷酸鈉(pH值7.2)中之TT(50 mg/ml)中，且在室溫下培育80 min。接著將產物注射至Sephacryl S100HR(XK16/40)上且在流動速率固定在60 ml/h之100 mM乙酸鈉(pH值5.6)、100 mM NaCl、1 mM EDTA中溶離。根據光學密度(UV＝280 nm)選擇溶離池且接著在Amicon Ultra 10,000 MWCO(以3000 rpm離心75 min)濃縮至19.6 ml。
TT－LC－SPDP產生為TT－SPDP但使用LC－SPDP(丁二醯亞胺基6－[3－(2－吡啶基二硫基)－丙醯胺基]己酸酯，Pierce)及60 min培育時間。
TT－SH或TT－LC－SH 將DTT添加至TT－SPDP或TT－LC－SPDP中，DTT/TT比率(mg/mg)為0.7/1。室溫下2 h後，釋放吡啶－2－硫酮接著為其在343 nm下之特徵吸收。藉由凝膠過濾(PD－10,Amersham)自過量DTT純化經硫醇化之蛋白。在Amicon Ultra 10,000 MWCO上濃縮後，藉由Lowry劑量評估蛋白含量。
dPNAG－SPDP＋TT－SH或TT－LC－SH(dPNAG－TT014及016) 在室溫下在連續攪拌下且在最初TT/PS比率(w/w)為2/1下實施偶合。
將dPNAG與TT－SH混合以獲得20 mg/ml之最終PS濃度及40 mg/ml之最終蛋白濃度。30 min後，藉由添加2－碘代乙醯胺(Merck)來中止未經反應之巰基。
將dPNAG與TT－LC－SH混合以獲得10 mg/ml之最終PS濃度及20 mg/ml之最終蛋白濃度。75 min後，藉由添加2－碘代乙醯胺(Merck)來中止未經反應之巰基。
接著使用5 μm Minisart過濾器淨化共軛物且將共軛物注射於Sephacryl S300HR(XK16/100)上。在流動速率固定於30 ml/h之200 mM NaCl中實現溶離。
藉由己醣胺及藉由蛋白劑量來分析溶離份。將相關溶離份彙集且在0.22 μm Sterivex上過濾。
所得共軛物具有2.18(TT－SH)及2.24(TT－LC－SH)之最終TT/PS比率(w/w)。
dPNAG硫醇化 將11.6 mg DTT(1,4－二硫蘇糖醇，Boerhinger Mannheim，MW：154.24)添加至16.5 mg dPNAG－SPDP中。在室溫下2 h後，釋放吡啶－2－硫酮接著為其在343 nm下之特徵吸收。藉由凝膠過濾(Toyopearl HW40F)自過量DTT純化經硫醇化之PS且接著在Amicon Ultra 10,000 MWCO上濃縮至860 μl。
dPNAG－SH＋TT－SPDP(dPNAG－TT017) 在室溫下在連續攪拌下且在最初TT/PS比率(w/w)為1.7/1下實施偶合。
將dPNAG與TT－SPDP混合以獲得7.73 mg/ml之最終PS濃度及13.3 mg/ml之最終蛋白濃度。90 min後，藉由添加2－碘代乙醯胺(Merck)來中止未經反應之巰基。
接著使用5 μm Minisart過濾器淨化共軛物且將共軛物注射於Sephacryl S300HR(XK16/100)上。在流動速率固定於30 ml/h之200 mM NaCl中實現溶離。
藉由己醣胺及藉由蛋白劑量來分析溶離份。將相關溶離份彙集且在0.22 μm Sterivex上過濾。
所得共軛物具有2.74之最終TT/PS比率(w/w)。
實例3
金黃色葡萄球菌dPNAG－TT共軛物之免疫原性 以0.3 μg之醣劑量為30隻小鼠之組皮下預防注射無佐劑或與3D－MPL佐劑合併之金黃色葡萄球菌dPNAG－TT共軛物。在第0、14及28天，小鼠接收三種預防注射。在第41天，自小鼠收集血清，且藉由ELISA測試各血清樣品以分析抗PNAG之免疫反應。10隻小鼠之群用於對照組中且為此等小鼠預防注射生理食鹽水。
抗PNAG之ELISA： 將與稀釋於磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)中之甲基化HSA(2.5 μg/ml)混合之經純化PNAG(2.5 μg/ml)在高結合微量滴定盤(Nunc Maxisorp)上於4℃下塗佈隔夜。
室溫下，在攪動下將培養盤用1%之PBS－BSA阻斷30 min。將小鼠抗血清預先稀釋1/100，接著進一步在微定量盤中進行兩倍稀釋且在37℃下培育1小時。洗滌後，使用Jackson ImmunoLaboratories Inc之在PBS－BSA 0.2%－tween 0.05%中稀釋1：5000倍之過氧化酶共軛之affiniPure山羊抗小鼠IgG(H＋L)(ref：115－035－003)來偵測結合鼠科動物抗體。在室溫下在攪動下培育偵測抗體歷時30 min。在室溫下在黑暗中使用每10 ml pH值4.5 0.1M檸檬酸鹽緩衝液4 mg OPD(Sigma)＋5 μl H2 O2 歷時15分鐘形成顏色。用50 μl HCl中止反應，且相對於650 nm在490 nm下讀出光學密度。
結果(表1中所示)展示為彙集血清之中點力價。針對個別血清分析，在30個樣品(10個為對照組)之中點力價上計算GMT。
<110> 1.比利時商葛蘭素史密斯克藍生物品公司2.美國布萊翰婦女醫院<120> 共軛方法<130> VB61918 <140> 096111419 <141> 2007－03－30 <150> 60/787,587；0606416.6；0606417.4；60/787,249 <151> 2006－03－30；2006－03－30；2006－03－30；2006－03－30 <160> 164 <170> FastSEQ for windows Version 4.0 <210> 1 <211> 533 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 1 <210> 2 <211> 535 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 2 <210> 3 <211> 434 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 3 <210> 4 <211> 434 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 4<210> 5 <211> 255 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 5<210> 6 <211> 267 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 6 <210> 7 <211> 257 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 7<210> 8 <211> 309 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 8 <210> 9 <211> 309 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 9<210> 10 <211> 233 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 10 <210> 11 <211> 235 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 11<210> 12 <211> 3890 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 12 <210> 13 <211> 6713 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 13 <210> 14 <211> 701 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 14 <210> 15 <211> 9439 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 15 <210> 16 <211> 1115 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 16 <210> 17 <211> 1469 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 17 <210> 18 <211> 167 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 18 <210> 19 <211> 167 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 19<210> 20 <211> 1141 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 20 <210> 21 <211> 1056 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 21 <210> 22 <211> 486 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 22 <210> 23 <211> 472 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 23 <210> 24 <211> 165 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 24<210> 25 <211> 319 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 25 <210> 26 <211> 428 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 26 <210> 27 <211> 350 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 27<210> 28 <211> 645 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 28 <210> 29 <211> 953 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 29 <210> 30 <211> 935 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 30 <210> 31 <211> 1038 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 31 <210> 32 <211> 877 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 32 <210> 33 <211> 658 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 33 <210> 67 <211> 961 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 67 <210> 68 <211> 578 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 68 <210> 69 <211> 895 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 69 <210> 70 <211> 747 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 70 <210> 71 <211> 482 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 71 <210> 72 <211> 706 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 72 <210> 73 <211> 241 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 73<210> 74 <211> 995 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 74 <210> 75 <211> 2186 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 75 <210> 76 <211> 773 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 76 <210> 87 <211> 774 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 87 <210> 88 <211> 128 <212> PRT <213> 葡萄球菌<400> 88

Claims (11)

  1. 一種用於使N-乙醯化少於40%之聚N-乙醯化葡糖胺(PNAG)與載體蛋白共軛之方法，其包含以下步驟：a)藉由添加包含順丁烯二醯亞胺基(maleimide)之鍵聯劑來活化該PNAG以形成活化之PNAG，其中該PNAG與該包含順丁烯二醯亞胺基之鍵聯劑之重量/重量比率為1：2-2：1；b)藉由添加包含巰基(Sulphydryl)之鍵聯劑來活化該載體蛋白以形成活化之載體蛋白，其中該載體蛋白與該包含巰基之鍵聯劑之重量/重量比率為50：1-2：1，且其中該包含巰基之鍵聯劑具10-25埃(Angstroms)之間隔長度；及c)使該活化之PNAG與該活化之載體蛋白反應以形成PNAG-載體蛋白共軛物，其中活化之PNAG與該活化之載體蛋白之重量/重量比率為4：1-1：4。
  2. 一種用於使N-乙醯化少於40%之PNAG與載體蛋白共軛之方法，其包含以下步驟：a)藉由添加包含巰基之鍵聯劑來活化該PNAG以形成活化之PNAG，其中該PNAG與該包含巰基之鍵聯劑之重量/重量比率為50：1-2：1，且其中該包含巰基之鍵聯劑具10-25埃之間隔長度；b)藉由添加包含順丁烯二醯亞胺基之鍵聯劑來活化該載體蛋白以形成活化之載體蛋白，其中該載體蛋白與該包含順丁烯二醯亞胺基之鍵聯劑之重量/重量比率為1：2-2：1；及 c)使該活化之PNAG與該活化之載體蛋白反應以形成PNAG-載體蛋白共軛物，其中活化之PNAG與該活化之載體蛋白之重量/重量比率為4：1-1：4。
  3. 一種用於使N-乙醯化少於40%之PNAG與載體蛋白共軛之方法，其包含以下步驟：a)藉由添加包含巰基之鍵聯劑來活化該PNAG以形成活化之PNAG，其中該PNAG與該包含巰基之鍵聯劑之重量/重量比率為50：1-2：1，且其中該包含巰基之鍵聯劑具10-25埃之間隔長度；b)藉由添加包含巰基之鍵聯劑來活化該載體蛋白以形成活化之載體蛋白，其中該載體蛋白與該包含巰基之鍵聯劑之重量/重量比率為50：1-2：1，且其中該包含巰基之鍵聯劑具10-25埃之間隔長度；及c)使該活化之PNAG與該活化之載體蛋白反應以形成PNAG-載體蛋白共軛物，其中活化之PNAG與該活化之載體蛋白之重量/重量比率為4：1-1：4。
  4. 如請求項1或2之方法，其中在步驟a)或步驟b)中該包含順丁烯二醯亞胺基之鍵聯劑連接至PNAG上之胺基。
  5. 如請求項1或2之方法，其中該包含順丁烯二醯亞胺基之鍵聯劑係選自由β-馬來醯亞胺丙基琥珀醯亞胺酯(BMPS)、ε-馬來醯亞胺己醯基氧基琥珀醯亞胺酯(EMCS)、N-(γ-馬來醯亞胺丁醯基氧基)琥珀醯亞胺酯(GMBS)、m-馬來醯亞胺苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)、長鏈4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸琥珀 醯亞胺酯(LC-SMCC)、4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯(SMCC)、6-(4-疊氮-2-硝基苯基胺基)已酸琥珀醯亞胺酯(SMPB)、6-β-馬來醯亞胺-丙醯胺基)已酸琥珀醯亞胺酯(SMPH)、磺基-EMCS、磺基-MBS、磺基-SMCC、磺基-GMBS及磺基-SMPB組成之群。
  6. 如請求項1之方法，其中在步驟b)中該包含巰基之鍵聯劑連接至該載體蛋白上之胺基。
  7. 如請求項1之方法，其中該包含巰基之鍵聯劑係選自由長鏈3-(2-吡啶基二硫)丙酸琥珀醯亞胺酯(LC-SPDP)、琥珀醯亞胺基氧基羰基-(2-吡啶基二硫)甲苯(SMPT)、長鏈琥珀醯亞胺基氧基羰基-(2-吡啶基二硫)甲苯(LC-SMPT)、磺基-SMPT、磺基-LC-SMPT及磺基-LC-SPDP組成之群。
  8. 如請求項1或2之方法，其中該載體蛋白係選自由以下組成之群：破傷風類毒素、白喉類毒素、白喉類毒素CRM197、重組外蛋白(exprotein)A(rEPA)、蛋白D、SitC/錳運輸蛋白C(MntC)/唾液結合蛋白、胞外基質結合蛋白A(EbhA)、胞外基質結合蛋白B(EbhB)、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、胞外血織維蛋白元(fibrinogen)結合蛋白(EFB)/血織維蛋白元結合蛋白(FIB)、葡萄球菌免疫球蛋白結合蛋白(SBI)、凝集(clumping)因子A(ClfA)、富含Ser-Asp血織維蛋白元/骨涎蛋白(sialoprotein)結合蛋白C(SdrC)、富含Ser-Asp血織維蛋白元/骨涎蛋白結合蛋白G(SdrG)、富含Ser-Asp血織維蛋白元/骨涎蛋白結合蛋白 H(SdrH)、脂肪酶甘油酯水解酶(GehD)、分泌抗原A(SasA)、血織維蛋白元結合蛋白A(FnbA)、血織維蛋白元結合蛋白B(FnbB)、膠原蛋白結合蛋白(Cna)、凝集因子B(ClfB)、纖維蛋白原(fibrogen)結合蛋白A(FbpA)、中性磷酸酶(Npase)、免疫優勢(immunodominant)葡萄球菌抗原A(IsaA/PisA)、金黃色葡萄球菌表面蛋白A(SsaA)、EPB、葡萄球菌表面蛋白1(SSP-1)、葡萄球菌表面蛋白2(SSP-2)、肝素結合蛋白(HBP)、玻璃連接蛋白、血纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig、微管活化蛋白(MAP)、鐵調節表面決定子A(IsdA)、鐵調節表面決定子B(IsdB)、鐵調節表面決定子H(HarA)、鐵運輸SitABC之C次單元(SitC)、α毒素(Hla)、α毒素H35R突變體、MRPII及自溶素或其片段。
  9. 一種用於製造疫苗之方法，其包含進行如請求項1-8中任一項之方法及合併該PNAG-載體蛋白共軛物與醫藥學上可接受之賦形劑及視情況額外抗原之另一步驟。
  10. 一種PNAG-載體蛋白共軛物，其可藉由如請求項1-9中任一項之方法獲得。
  11. 一種疫苗，其包含如請求項10之PNAG-載體蛋白共軛物及醫藥學上可接受之賦形劑。
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