TWI403518B

TWI403518B - 一種流感疫苗及其使用方法

Info

Publication number: TWI403518B
Application number: TW097102598A
Authority: TW
Inventors: Alice Yu; Chi Huey Wong; Rachel Tj Cheng; Ming Wei Chen; Yaoxing Huang; David D Ho
Original assignee: Academia Sinica
Priority date: 2007-01-23
Filing date: 2008-01-23
Publication date: 2013-08-01
Also published as: TW200932757A; WO2008091657A1; US20090060949A1; US8030029B2

Description

一種流感疫苗及其使用方法

本揭示內容係關於流感血球凝集素肽、編碼其之核苷酸、以及產製其之方法。本揭示內容亦係關於用於抑制單分化枝系(single－clade)及基因重配(reassortant)流感病毒之流感感染及病毒散布之組合物、病毒、療劑、及使用方法。

近來，東南亞已出現家禽體內之高病原性禽流感(HPAI)病毒株及其對人類之後續傳染，其已造成有關該致命疾病之世界性流行散布之憂慮。1997年，高病原性禽流感H5N1流感病毒在香港自家禽傳染至人類，造成18名感染者及6名患者死亡，並在2003年再度出現，造成2起類似之病例及其中一名患者死亡。家庭聚集中之H5N1流感病毒感染已造成人傳人之額外可能性。隨著人類對於H5N1流感病毒之接觸及感染持續增加，產生禽－人基因重配病毒之可能性亦持續增加，該基因重配病毒可能可在目前缺乏H5N1專一性免疫力之全球人口之中有效傳遞。該在禽－人及豬－人流感A病毒間之基因重配事件已被證實至少與1957年及1968年之流感大流行有關並可能與1918年之大流行有關。對於泛流行性H5病毒株產生之可能性與隨之而來之罹病率和死亡率之憂慮正激勵著對於有效疫苗之探究。

流感病毒係RNA正黏液病毒，且係由三種亞型A、B、及C構成。流感A病毒可感染廣泛不同之鳥類及。甫乳動物，包括人類、馬、豬、雪貂、及雞。流感病毒B及C僅存在於人類體內。經流感病毒A感染之動物通常藉由產生可傳染至人類族群之基因及抗原性不同之病毒而作為流感病毒之貯存庫。傳染可經由人類與該等經感染動物之密切接觸而產生，例如，藉由處理家畜。人類至人類之傳染可經由密切接觸或是經由吸入由咳嗽或打噴嚏所產生之微滴而產生。

流感A病毒顆粒之外表面係由脂質外套膜構成，其含有糖蛋白血球凝集素(HA)及神經胺糖酸酶(NA)。HA糖蛋白係由兩個次單元構成，稱為HA1及HA2。FIA含有一個唾液酸結合位點，其可結合存在於上及下呼吸道之表皮細胞外膜之唾液酸，且其可經由受體中介性之細胞吞噬作用而被吸收進入細胞。一旦進入細胞中，該流感病毒顆粒即釋出其基因組，其會進入細胞核中並起始新流感病毒顆粒之生成。

NA亦會被生成，其可將唾液酸自細胞表面切割，以防止經釋出流感病毒顆粒之再捕捉。該等病毒會培養一段短暫時間，在一般情形下約為五天，但該培養期可廣泛各異。病毒約在該疾病起始之一天前由經感染之細胞分泌，而該所產生之疾病一般持續三至五天。典型之症狀包括發燒、疲倦、不舒服、頭痛、疼痛、咳嗽、及喉嚨痛。部分症狀可在感染之後持續數週。

不同之流感病毒株主要係由HA及NA糖蛋白中之突變而定性，且因此係使用HA及NA身分而辨織病毒亞型(亦即，H5N1係指HA亞型5及NA亞型1)。流感病毒通常可導向HA及NA分子。習知之流感病毒疫苗通常係使用全失活病毒，其呈遞適當之HA及/或NA分子作為抗原，以引發細胞及體液免疫系統。或者，重配形式之HA及NA蛋白及其次單元亦已被用於作為疫苗。然而，流感病毒係一種RNA病毒且因此會遭受經常之突變，造成該病毒抗原組成之經常及永久性變化。在一實例中，抗原組成之小型次要變化通常稱為抗原漂移。在另一實例中，流感A病毒亦可在稱為基因重配之過程中自另一亞型「交換」基因物質，因而造成病毒抗原組成之重大變化。由於對抗病毒顆粒之免疫反應係仰賴抗體與該等HA及NA糖蛋白之結合以及細胞中介性免疫系統組成份對該等HA及NA糖蛋白之辨識，糖蛋白之組成及結構之經常性變化隨時間過去會降低體液及細胞基礎性免疫反應對抗流感病毒之有效性，最終會造成免疫力之缺乏。流感病毒A產生快速抗原漂移之能力通常可引發因為此種缺乏對於新病毒株之既存免疫力之流感流行。

習知失活流感病毒疫苗之冗長研發時間及有限生產力可嚴重阻礙藉由疫苗接種而控制禽流感之泛流行性傳播之能力。因此，技藝中需要一種可快速研發並大規模生產大量流感病毒疫苗之方法。

在一具體實例中，該分離聚核苷酸組合物包含對應SEQ ID NO：2或與其同源之核酸序列。

在另一具體實例中，該分離聚核苷酸組合物尚編碼一細胞因子或生長因子。

在另一具體實例中，該分離聚核苷酸組合物尚包含一細胞因子、生長因子、抗病毒劑、佐劑、賦形劑、或其組合。

在另一具體實例中，該分離聚核苷酸編碼一多肽，其包含對應SEQ ID NO：1所示者或與其同源之胺基酸序列。

在另一具體實例中，該多肽係至少部分經糖基化。

在另一具體實例中，其揭示一種對抗該多肽之抗體。

在另一具體實例中，其揭示一種可專一與該分離聚核苷酸雜交之寡核苷酸。

在另一具體實例中，相較對於包含野生型流感病毒序列之聚核苷酸，該寡核苷酸對於該分離聚核苷酸具有較大之親和力。

在另一具體實例中，該分離聚核苷酸組合物尚包含一載體。

在另一具體實例中，該組合物尚涵括一編碼細胞因子或生長因子之聚核苷酸。

在另一具體實例中，該組合物係針對哺乳動物之表現而經最適化之密碼子。

在另一具體實例中，該組合物包含至少一種對應SEQ ID NO：2、4、及/或6中之至少一者或與其同源之核酸序列。

在另一具體實例中，該包含至少一種對應SEQ ID NO：2、4、及/或6中之至少一者或與其同源之核酸序列之組合物尙編碼一細胞因子或生長因子。

在另一具體實例中，該包含至少一種對應SEQ ID NO：2、4、及/或6中之至少一者或與其同源之核酸序列之組合物尚包含一細胞因子、生長因子、抗病毒劑、佐劑、賦形劑、或其組合。

在另一具體實例中，該包含至少一種對應SEQ ID NO：2、4、及/或6中之至少一者或與其同源之核酸序列之組合物編碼一多肽，其包含對應SEQ ID NOs：1、3、及/或5中之至少一者所示者或與其同源之胺基酸序列。

在另一具體實例中，該包含至少一種對應SEQ ID NO：2、4、及/或6中之至少一者或與其同源之核酸序列之組合物編碼一多肽，其後續至少部分經糖基化。

在另一具體實例中，該包含對應SEQ ID NOs：1、3、及/或5中之至少一者所示者或與其同源之胺基酸序列之多肽可產生對抗至少一種對應SEQ ID NOs：1、3、及/或5中之至少一者所示者或與其同源之多肽之抗體。

在另一具體實例中，一種寡核苷酸可專一與至少一種對應SEQ ID NO：2、4、及/或6中之至少一者或與其同源之核酸序列雜交。

在另一具體實例中，如請求項18之寡核苷酸，其中相較對於包含野生型流感病毒序列之聚核苷酸，該寡核苷酸對於至少一種對應SEQ ID NO：2、4、及/或6中之至少一者或與其同源之核酸序列具有較大之親和力。

在另一具體實例中，該包含至少一種對應SEQ ID NO：2、4、及/或6中之至少一者或與其同源之核酸序列之組合物係一載體。

在另一具體實例中，該包含至少一種對應SEQ ID NO：2、4、及/或6中之至少一者或與其同源之核酸序列之組合物尚包含編碼一細胞因子或生長因子之聚核苷酸。

在另一具體實例中，該包含至少一種對應SEQ ID NO：2、4、及/或6中之至少一者或與其同源之核酸序列之組合物包括針對哺乳動物之表現而經最適化之密碼子。

在另一具體實例中，其揭示一種方法，其包含：向一對象投藥足夠量之至少一種分離聚核苷酸，其選自由對應SEQ ID NO：2、4、及/或6或與其同源之分離聚核苷酸所組成之群之至少一者；其中該對象可對抗後續之病毒感染。

在另一具體實例中，相較對於由未經對應SEQ ID NO：2、4、及/或6或與其同源之分離聚核苷酸投藥之經病毒感染對象所產生之病毒抗原具有專一性之病毒效價量，對於由該對象在病毒感染後所產生之病毒抗原具有專一性之病毒效價量增加至少2%。

在另一具體實例中，相較由未經對應SEQ ID NO：2、4、及/或6或與其同源之分離聚核苷酸投藥之經病毒感染對象所產生之干擾素－γ量，由該對象之CD8陽性細胞在病毒感染後所產生之干擾素－γ量增加至少2%。

在另一具體實例中，相較未經如請求項11之分離聚核苷酸投藥之經病毒感染對象之雞紅血細胞血球吸附量，該對象血清溶液中之感染病毒之雞紅血細胞血球吸附量減少至少2%。

在另一具體實例中，該對象之感染後體溫維持在該對象感染前體溫之95%範圍中。

在另一具體實例中，相較未經如請求項11之分離聚核苷酸投藥之經病毒感染對象之感染後失重，該對象之感染後失重係至少少於2%。

在另一具體實例中，相較未經如請求項11之分離聚核苷酸投藥之經病毒感染對象，該對象之感染後存活率獲得改良。

在另一具體實例中，該後續之病毒感染係流感病毒株H5N1。

在另一具體實例中，該後續之病毒感染係病毒基因重配產物之流感病毒株。

在另一具體實例中，該對象可對抗不同於初始病毒感染之另一分化枝系或次分化枝系之後續流感病毒感染。

在下文之詳細敘述中，其提出諸多特定細節以提供對於本揭示內容之徹底瞭解。然而，熟習技藝者將可明瞭，本揭示內容可在無此等特定細節之情形下實施。在其他情形下，已為熟知之方法、流程、及組成份則未經詳述，以避免模糊本揭示內容。

針對敘述本揭示內容之目的，下列之辭彙係意指如下所述之相關定義：「佐劑」意謂任何藥學或免疫學性試劑，其可修飾其他試劑(如，藥物、疫苗)之作用，同時在以其本身投藥時具有極少(如有任何)之直接作用。就此概念而言，其粗略類似化學催化劑。佐劑之類型包括，但不限於，醫藥佐劑；免疫佐劑；及/或佐劑化療。醫藥佐劑係本身具有極少或無藥學作用之藥物，但在同時給予時可增加其他藥物之功效或強度。免疫佐劑包括可刺激免疫系統並增加對於疫苗之反應之言式劑，其本身不具任何特定之抗原性作用。已知之佐劑包括，但不限於，油類、鋁鹽、及病毒體(virosome)。

「投藥」意謂試管內或體內之投藥，其中體內投藥可涵括口服，或是腸外投藥，包括靜脈內、皮下、局部、穿皮、皮內、穿黏膜、腹膜內、肌內、囊內、眶內、心內、氣管內、皮下、表皮下、動脈內、包膜下、蛛網膜下、椎管內、硬膜外、及胸骨內之注射、輸液、及電穿孔，以及以任何醫藥裝置或是欲插入(暫時或永久)體內之物件之組成份形式而共投藥。

「胺基酸」意謂一組化學實體，其包括至少該20種天然存在之胺基酸；通常在體內經轉譯後修飾之該等胺基酸，包括，例如，羥基脯胺酸、磷酸絲胺酸、及磷酸羥丁胺酸；以及其他非常見之胺基酸，包括，但不限於，2－胺基己二酸、羥基離胺酸、異鎖鏈素、正顯胺酸、正白胺酸、及鳥胺酸。同時，辭彙「胺基酸」包括D－及L－胺基酸兩者。

「安徽(Anhui)」意謂一種H5N1流感病毒家族之聚核苷酸，其編碼一血球凝集素多肽，且具有下列之鹼基對序列：

該多肽編碼下列之胺基酸序列：

「抗原」意謂一種可刺激免疫反應之分子。

「抗原呈遞細胞」意謂一種在其表面展示與MHC複合之外源抗原之細胞。T細胞可使用其T細胞受體(TCR)辨識此種複合物。

「抗病毒劑」意謂一類特定用以治療病毒感染之分子、物質、或藥物中之任何一者。和抗體相似，特定之抗病毒劑係用於特定之病毒。抗病毒藥物係一類之抗微生物劑(其係亦包括抗生素、抗真菌劑、及抗寄生蟲藥物之較大類群)。其對於宿主相對無害，且因此可用於治療感染。

「細胞基礎性免疫力」意謂經由T細胞及相關細胞類型中介之細胞反應。

「分化枝系」意謂一生物分類群，其包含單一共有之祖先，以及該祖先之所有子代。任何此種類群係被視為單源之生物群，且可由譜系分析(如在樹狀圖中)及由分枝圖(參見支序分類學)兩者表示，或單純作為分類參照。

「分化抗原」或「CD」意謂用以辨識及研究存在於白血球上之細胞表面分子之分析法。CD分子可以諸多方式作用，通常作為對細胞具有重要性之受體或配位體(可活化受體之分子)。信號級聯通常會被起始，改變該細胞之行為(參見細胞信號傳導)。部分CD蛋白並不參與細胞信號傳導，但具有其他功能，諸如，細胞黏連。

「密碼子」意謂潛在編碼單一胺基酸之三核苷酸序列。

「一致HA」意謂由HAc聚核苷酸編碼之血球凝集素多肽。

「細胞因子」意謂用於生物體中作為信號傳導向合物之一群蛋白及肽中之任一者。此等化學信號類似激素及神經遞質，且可容許細胞與另一細胞溝通。

「抗原表位」意謂巨分子之一部份，其可由免疫系統辨認，由抗體、B細胞、或T細胞專一辨認。儘管抗原表位通常被認為係衍生自非自體蛋白，但可獲得辨認之衍生自宿主之序列亦被歸類為抗原表位。

「血球吸附」意謂紅血球細胞與其他細胞、顆粒、或表面之黏連。血球吸附及血球吸附之抑制係用於進行部分病毒及其專一性抗體之分析，如，副黏液病毒。

「ELISA」意謂酶連免疫吸附分析；任何使用經酶標記之免疫反應劑以及免疫吸附劑之酶免疫分析。

「ELIspot」意謂酶連免疫吸附斑點，一種用以監測人類及動物體內免疫反應之常用方法。ELISPOT分析係根據一修飾版本之ELISA免疫分析並自其研發而來。ELISPOT分析最初係經研發以計算分泌抗原專一性抗體之B細胞，且後續已經改用於各種任務，特別係在單細胞層級辨識及計算細胞因子生產性細胞。簡言之，在適當之條件下，ELISPOT分析可容許顯影個別經活化或反應之細胞之分泌產物。各個在該分析中顯現之斑點皆代表單一之反應細胞。因此，ELISPOT分析可同時提供質性(免疫蛋白之類型)及量性(反應細胞之數目)兩者之資訊。

「糖基化」意謂在蛋白及脂質上添加酶類。該流程係膜及分泌性蛋白合成之四種主要共轉譯及轉譯後修飾步驟之一。

「較大親和力」意謂配位體與受體間，或是兩個化學實體間之結合時間增加或結合增加之可能性。

「生長因子」意謂可刺激細胞增殖及細胞分化之天然存在性蛋白。生長因子對於調節各種細胞反應而言具有重要性。生長因子一般可作為細胞間之信號傳導分子。其實例係細胞因子及激素，其可連結位於其標靶細胞表面之特定受體。其通常可促進細胞分化及成熟，該等作用隨不同之生長因子而各異。舉例而言，骨形態發生蛋白可刺激骨細胞分化，而纖維母細胞生長因子及血管內皮生長因子則可刺激血管分化(血管生成)。

「HAc」意言胃一H5N1流感病毒家族之一致聚核苷酸，其編碼一血球凝集素多肽，且具有下列之鹼基對序列：

該HAc編碼下列多肽：

「血球凝集素」或「HA」意謂可見於流感病毒(以及諸多其他細菌及病毒)表面之抗原性糖蛋白。其負責該病毒與受感染細胞之結合。該名稱「血球凝集素」來自該蛋白造成紅血細胞(紅血球)在試管內彼此叢聚(「凝集」)之能力。

「同源」意謂具有共享高序列相同性或相似性之基因序列。

「體液免疫」意謂由B細胞中介並涉及循環抗體之免疫反應。

「雜交」意謂與互補RNA或DNA(單股或雙股)分子結合或編織。

「ID5」意謂一H5N1流感病毒家族之聚核苷酸，其編碼一血球凝集素多肽，且具有下列之鹼基對序列：

該聚核苷酸序列編碼一胺基酸，其具有下列之胺基酸序列：

「LD₅₀ 」(致死劑量)意謂一造成試驗族群50%死亡之劑量。

「在對象中維持基礎體重」意謂相較於治療前體重之體重維持。

「維持基礎體溫」意謂相較於治療前體溫之體溫維持。

「寡核苷酸」意謂短核苷酸序列(RNA或DNA)，一般而言具有20個或以下之鹼基。

「pAnhui」意謂涵括於質體載體中之Anhui聚核苷酸。

「pHAc」意謂涵括於質體載體中之HAc一致HA聚核苷酸。

「pID5」意謂涵括於質體載體中之ID5聚核苷酸。

「聚核苷酸」意謂核苷酸單體以共價鍵連結構成鏈狀之有機聚合物分子。DNA(去氧核糖核酸)及RNA(核糖核酸)係具有迥異生物功能之聚核苷酸實例。聚核苷酸亦可自寡核苷酸(一般具有少於30個次單元之較小核苷酸鏈)而以人工製備。

「多肽」意謂衍生自該或該等特定蛋白之胺基酸序列，且進一步係指衍生自與該等相同或其他生物種之特定蛋白同源之蛋白等同區域之同源肽。該辭彙進一步係關於根據該等特定蛋白質或其同源蛋白質之胺基酸序列而設計之可容許之胺基酸變更與肽模擬物。

「抵抗力」意謂一對象避免與流感病毒感染或似流感病毒抗原呈遞相關之體重降低、體溫降低、及死亡率增加之能力。「抵抗力」亦意謂產生對於任何種感染之劇烈及/或體液免疫反應之能力，該等反應係如可由，例如，測量抗體效價或是自CD8陽性免疫系統細胞釋出之干擾素γ 而分析者。

「基因重配病毒」意謂含有來自一種以上病毒種類之核酸及/或蛋白外殼之病毒粒子。

「效價」意謂蛋白質之量測值，該等蛋白可見於脊椎動物之血液或其他體液中，且其可由免疫系統用以辨認及中和外源物件，諸如，細菌及病毒。此等蛋白通常對於特定抗原(例如，流感病毒家族之血球凝集素抗原)具有專一性。

「載體」意謂技藝中已知可傳遞或協助傳遞DNA或RNA片段至真核細胞內部之任何類型傳遞系統(如(不限於)質體、黏粒、噬菌體、病毒、病毒片段等)。

「病毒感染」意謂由至少一個病毒顆粒感染，該顆粒可為完整或部分，該感染可在體內或試管內進行。「病毒感染」亦可定義為使一對象接觸不再為存活之病毒顆粒或顆粒片段，且其涵括使一對象接觸假病毒或其他呈遞病毒專一性抗原之分子建構物。

「病毒體(virosome)」意謂膜上含有流感病毒之膜連性血球凝集素及神經胺糖酸酶之載體，其可用於放大融合活性，並因而協助將該病毒體內之物質攝入抗原呈遞細胞(APC)中並誘發天然抗原處理途徑。

「野生型」意謂天然存在之生物、品系、基因、或特徵之典型形式。

在部分具體實例中，本揭示內容提供一種分離聚核苷酸，其包含與SEQ ID NO.2對應或同源之核酸序列。

在部分具體實例中，本揭示內容提供一種分離聚核苷酸，其包含與SEQ ID NO.4對應或同源之核酸序列。

在部分具體實例中，本揭示內容提供一種分離聚核苷酸，其包含與SEQ ID NO.6對應或同源之核酸序列。

在部分具體實例中，本揭示內容提供一種分離聚核苷酸，其包含與SEQ ID NOS.2、4、或6中至少^一者對應或同源之核酸序列。

在部分具體實例中，本組合物包含與SEQ ID NOS.2、4、或6同源之聚核苷酸中之至少兩者。

在部分具體實例中，本揭示內容提供一種組合物，其包含上述SEQ ID NOS.2、4、或6中至少一者之分離聚核苷酸。

在部分具體實例中，該組合物尚包括載體。

在部分具體實例中，該組合物係載體。

在部分具體實例中，該載體係脂質體、病毒體或細胞。

在部分具體實例中，該載體係質體。

在部分具體實例中，該組合物尚包含編碼生長因子或細胞因子之多醣。

在部分具體實例中，該組合物尚包含生長因子、佐劑、賦形劑、或其組合。

在部分具體實例中，本揭示內容提供一種寡核苷酸，其可專一雜交本揭示內容之聚核苷酸。

在部分具體實例中，該可專一雜交本揭示內容之聚核苷酸之寡核苷酸對於該聚核苷酸具有相較於對包含野生型流感病毒序列之聚核苷酸之較大親和力。

在部分具體實例中，本揭示內容提供一種在對象中治療流感病毒感染、降低其發生率、降低其嚴重性、延緩其發病、或改善與其相關之症狀之方法，該方法包含使對象中之經流感病毒感染前、經其感染、及/或具經其感染風險之細胞接觸足夠量之包含與SEQ ID NOS.2、4、或6中至少一者所述者對應或同源之核酸序列或其任何組合之分離聚核苷酸，以增加對象在受病毒感染時對於流感病毒之抵抗力。

在部分具體實例中，該對象中之細胞係與該聚核苷酸之組合物或載體接觸。

在部分具體實例中，該對象之抵抗力係相對流感病毒之一特定分化枝系而增加。

在部分具體實例中，該對象之抵抗力係相對流感病毒之諸多分化枝系而增加。

在部分具體實例中，該對象之抵抗力係相對基因重配流感病毒而增加。

在部分具體實例中，該分離聚核苷酸之投藥可使該對象產生具有該分離聚核苷酸編碼之多肽。

在部分具體實例中，該具有該分離聚核苷酸編碼之多肽可進行糖基化作用。

在部分具體實例中，該具有該分離聚核苷酸編碼之多肽後續經該對象處理，且至少某些部分之該具有該分離聚核苷酸編碼之多肽呈遞為抗原表位於該對象之抗原呈遞細胞。

在部分具體實例中，該增加之抵抗力可由最初投藥該多肽或多肽組合後增加之抗體效價定量。

在部分具體實例中，該對於病毒感染之增加之抵抗力可由細胞免疫系統之CD－8陽性免疫細胞所生產之干擾素－γ 之增加定量。

在部分具體實例中，該對於病毒感染之增加之抵抗力可由對象降低之死亡率定量。

在部分具體實例中，該對於病毒感染之增加之抵抗力可由對象細胞之降低血球吸附量定量。

在部分具體實例中，該對於病毒感染之增加之抵抗力可由對象之基礎體重維持定量。

在部分具體實例中，本揭示內容之分離聚核苷酸之密碼子使用已針對流感病毒血球凝集素(HA)多肽序列或其衍生物之哺乳動物表現而經最適化。

在部分具體實例中，本揭示內容提供一種包含分離多肽之組合物，該多肽包含與SEQ ID NO.1對應或同源之胺基酸序列。

在部分具體實例中，本揭示內容提供一種包含分離多肽之組合物，該多肽包含與SEQ ID NO.3對應或同源之胺基酸序列。

在部分具體實例中，本揭示內容提供一種包含分離多肽之組合物，該多肽包含與SEQ ID NO.5對應或同源之胺基酸序列。

在部分具體實例中，本揭示內容提供一種組合物，其包含該多肽。

在部分具體實例中，該多肽可進行糖基化作用。

在部分具體實例中，該多肽經糖基化。

在部分具體實例中，該多肽經該對象之抗原呈遞細胞處理，其中該多肽之部分組成份後續經該抗原呈遞細胞呈遞為抗原表位。

在部分具體實例中，本揭示內容提供一種組合物，其包含與SEQ ID NOs.1、3、或5同源之多肽中之至少兩者。

在部分具體實例中，該組合物尚包括載體。

在部分具體實例中，該載體係脂質體、病毒體或細胞。

在部分具體實例中，該組合物尚包含由該等聚核苷酸及脂質、細胞構成之載體及/或包含其之組合物。

在部分具體實例中，該組合物尚包含生長因子、佐劑、或其組合。

在部分具體實例中，該組合物尚包含細胞因子、生長因子、抗病毒劑、佐劑、或其組合。

在部分具體實例中，本揭示內容提供一種抗體，其可專一結合本揭示內容之多肽及/或糖基化多肽。

在部分具體實例中，本揭示內容提供一種在對象中治療流感病毒感染、降低其發生率、降低其嚴重性、延緩其發病、或改善與其相關之症狀之方法，該方法包含使對象中之經流感病毒感染前、經其感染、及/或具經其感染風險之細胞接觸足夠量之包含與SEQ ID NOS：1、3、或5所述者對應或同源之胺基酸序列之分離多肽，以增加對象在受病毒感染時對於流感病毒之抵抗力。

在部分具體實例中，該對象細胞係與該分離多肽接觸。

在部分具體實例中，該對象細胞係與含有該分離多肽之組合物接觸。

在部分具體實例中，該分離多肽係在投藥前經糖基化。

在部分具體實例中，該分離多肽係在投藥後經糖基化。

在部分具體實例中，該對於病毒感染之增加之抵抗力可由最初投藥該多肽或多肽組合後增加之抗體效價定量。

在部分具體實例中，該對於病毒感染之增加之抵抗力可由CD－8陽性細胞基礎性免疫細胞所生產之干擾素－γ之增加定量。

在部分具體實例中，本揭示內容之方法尚包含對該對象重複投藥該分離多肽或該等多肽。

在部分具體實例中，病毒感染涵括以流感病毒感染。

在部分具體實例中，病毒感染涵括以單一分化枝系之流感病毒感染。

在部分具體實例中，病毒感染涵括以基因重配病毒感染。

在部分具體實例中，病毒感染係故意完成，其係經由將該病毒有意引入或投藥至對象中而進行。

在部分具體實例中，病毒感染係因與病毒之傳染性或傳播相關之天然病原學過程之作用而產生。

在部分具體實例中，該流感病毒係H5病毒株。

在部分具體實例中，該流感病毒係H5N1病毒株。

在部分具體實例中，該病毒感染係由多種類型之流感病毒構成。

在部分具體實例中，該病毒感染係由一或多種分化枝系之病毒構成，該等分化枝系係病毒基因重配之產物。

在部分具體實例中，該對象可抵抗另一並非由該經投藥聚核苷酸或多醣定性之分化枝系或次分化枝系之流感病毒之後續病毒感染。

在部分具體實例中，該對象可抵抗多重病毒感染。

在部分具體實例中，該對象可抵抗其他分化枝系之多重病毒感染。

在部分具體實例中，本揭示內容提供一種對抗H5N1病毒之HA－基礎性DNA疫苗，其已針對哺乳動物中之表現而經最適化，其可在小鼠模型中產生對抗致死劑量NIBRG－14(一種H5N1 Vietnam 1194HA之基因重配流感病毒)之黏膜感染之保護，如本文中所例示。在其他具體實例中，本揭示內容提供對抗H5N1分化枝系2.1及2.3之HA－基礎性DNA疫苗，其已針對哺乳動物中之表現而經最適化，其可產生對抗致死劑量RG2(H5N1病毒菌株Indonesia/5/2005之基因重配體)及RG5(H5N1病毒菌株Anhui/01/2005(H5N1)/PR8－IBCDC－RG5之基因重配體)之黏膜感染之保護。

在一具體實例中，本揭示內容提供一種分離多肽，其包含與SEQ ID NOs：1、3、及/或5中任一者所述者對應或同源之胺基酸序列。在一具體實例中，本揭示內容提供一種包含該多肽之組合物，且在部分具體實例中，其尚包含細胞因子、生長因子、抗病毒劑、佐劑、或其組合。

在又其他具體實例中，本揭示內容包含分離或重配多肽，其包含在與任何所述之多肽毗鄰之至少約350個胺基酸中；至少約400個胺基酸中；至少約450個胺基酸中；至少約500個胺基酸中；至少約525個胺基酸中；至少約550個胺基酸中；至少約555個胺基酸中；至少約560個胺基酸中；或至少約565個胺基酸中；共享至少75%，或在部分具體實例中為至少85%、或至少90%、或至少95%相同性之胺基酸序列。在部分具體實例中，該多肽序列(如，如列於本文之序列表中者)包含少於569個、555個等之胺基酸。

在部分具體實例中，本揭示內容之該等多肽選擇性包含融合蛋白、具引導序列之蛋白、前體多肽、具分泌信號或局部化信號之蛋白、或是具抗原表位標記、E－標記、或His抗原表位標記之蛋白。

在部分具體實例中，本揭示內容包含一種多肽，其包含與SEQ ID NOs：1、3、及/或5中所述者具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少95%、至少98%、至少98.5%、至少99%、至少99.2%、至少99.4%、至少99.6%、至少99.8%、或至少99.9%序列相同性之序列。

須明瞭，本揭示內容係關於如本文所述之多肽，或是其片段/其功能性片段，或是其任何操縱，包括，例如，截段、取代、插入、抗原表位、任何修飾(如將可由熟習技藝者所知者)，產生免疫原性HA多肽，其可產生對於不同分化枝系及/或次分化枝系之保護。

本揭示內容之血球凝集素序列可包含內源之胺端信號肽序列，然而，本揭示內容之血球凝集素多肽序列亦包含成熟(胺端信號肽經切割)形式之血球凝集素多肽。任何流感病毒菌株之任何血球凝集素多肽序列之切割位點可使用任何技藝中之方法慣常測量或預測。

在其他態樣中，本揭示內容包含一種組合物，其具有一或多種如本文所述之多肽或其片段。本揭示內容亦包括可對抗至少一種包含至少一種本文所述胺基酸序列或其片段所培養之多株抗血清專一連結之多肽。此等對於上述多肽具有專一性之抗體亦係本揭示內容之特徵。本揭示內容之多肽可選擇性具免疫原性。

本揭示內容亦涵括具有免疫性之組合物，其包含免疫學上有效量之一或多種任何上述多肽，且亦涵括用以刺激個體免疫系統以產生對抗流感病毒之保護性免疫反應之方法，其係藉由對該個體投藥生理學可接受性載體中之免疫學上有效量之任何上述多肽而進行。

此外，本揭示內容包括重配病毒，且在部分具體實例中，其包括重配流感病毒，其包含一或多種上述之多肽或聚核苷酸，同時包括具有免疫原性之組合物，其包含免疫學上有效量之此種重配流感病毒。

在部分具體實例中，本揭示內容之該等多肽、聚核苷酸、及建構物/載體包含之流感病毒序列，其非天然序列。在部分具體實例中，本揭示內容之該等多肽、聚核苷酸、及建構物/載體包含衍生自特定流感病毒菌株之序列，其經最適化以產生免疫反應，其可與多種病毒次分化枝系及/或病毒分化枝系交叉反應。

利用生理上可接受性載體中之免疫學上有效量之此種重配流感病毒，藉由投藥而刺激個體之免疫系統以產生對抗流感病毒之保護性免疫反應之方法，亦係本揭示內容之一部分。

在一具體實例中，本揭示內容提供一種可專一結合本揭示內容多肽之抗體。

在一具體實例中，本揭示內容提供一種分離聚核苷酸，其包含與SEQ ID NOs：2、4、或6中至少一者對應或同源之核酸序列。

在一具體實例中，本揭示內容提供一種寡核苷酸，其可專一雜交本揭示內容之聚核苷酸，其在部分具體實例中對該聚核苷酸具有相較於對包含野生型流感病毒序列之聚核苷酸之較大親和力。

在部分具體實例中，本揭示內容提供一種載體，其包含本揭示內容之聚核苷酸，並提供含其之脂質體、細胞、及/或組合物。

在部分具體實例中，本揭示內容包含一種分離或重配之核酸，其具有與SEQ ID NOs：2、4、及/或6中任一者所述者(或其互補序列)共享至少75%、或至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或與其對應之序列，一種聚核苷酸序列，其可在高度嚴格條件下與任何上述聚核苷酸序列之實質上全部長度中雜交，以及一種聚核苷酸序列，其包含任何此等聚核苷酸序列之全部或片段，其中該序列較佳編碼血球凝集素多肽或血球凝集素多肽片段，其在與對象中之細胞接觸時可直接(如，聚核苷酸作為抗原)或間接(如，聚核苷酸由該細胞納入，並後續經轉譯及轉錄，產生免疫原活性多肽或抗原表位)產生免疫反應，其可與多種流感病毒分化枝系及次分化枝系交叉反應。

須明瞭，本揭示內容係關於如本文所述之聚核苷酸，或是其片段/其功能性片段，或是其任何操縱，包括，例如，截段、取代、插入、任何修飾(如將可由熟習技藝者所知者)，編碼免疫原性HA多肽，其可產生對於不同分化枝系及/或次分化枝系之保護。

用以將本揭示內容之核酸、載體等引入細胞中之操作流程可包含，例如：直接之DNA攝入技術，病毒、質體、線性DNA、或脂質體中介性轉導或轉染，使用磷酸鈣中介性及DEAE－葡聚糖中介性轉導方法之磁穿孔法(magnetoporation)，電穿孔，直接注射，及受體中介性攝入(就進一步之細節，參見，例如，"Methods in Enzymology[酶學方法]" Vol.1－317,Academic Press、Current Protocols in Molecular Biology[分子生物學之現有操作流程],Ausubel F.M.et al.(eds.)Greene Publishing Associates,(1989)、及Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子選殖：實驗室手冊],第二版,Sambrook et al.Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989)、或其他標準之實驗室手冊)。須明瞭，對於本揭示內容之病毒、核酸、或載體之任何胞內使用之直接方法或間接方法皆由本文預期，且代表其具體實例。

本揭示內容亦包含一種分離或重配之核酸，其編碼一胺基酸序列，該胺基酸序列與任何上述核酸之至少約300個胺基酸中，或是至少約350個胺基酸中；至少約400個胺基酸中；至少約450個胺基酸中；至少約500個胺基酸中；至少約502個胺基酸中；至少約550個胺基酸中；至少約559個胺基酸中；至少約565個胺基酸中；或至少約566個胺基酸中；係實質上相同。同時，在其中該胺基酸之長度係少於，如，566個、565個、559個等時(如，參見，序列表)，則應明瞭，該長度係選擇性少於566個、565個、559個等。本揭示內容亦包括任何上述之核酸，其包含一血球凝集素多肽，或是一或多種血球凝集素多肽之一或多種片段。本揭示內容之其他態樣包括分離或重配之核酸，其編碼一多肽，該多肽之序列與至少一種上述之聚核苷酸具有至少98%相同性、至少98.5%相同性、至少99%相同性、至少99.2%相同性、至少99.4%相同性、至少99.6%相同性、至少99.8%相同性、或至少99.9%相同性。本揭示內容亦包含一種分離或重配之核酸，其編碼一血球凝集素多肽，該血球凝集素多肽係由突變或重配一或多種上述之聚核苷酸序列而產生。本揭示內容之聚核苷酸序列可選擇性包含一或多種，如，引導序列、前體序列、或抗原表位標記序列、或其類似者，且其可選擇性編碼融合蛋白(如，具一或多種其他之核酸序列)。

在本文中，參照蛋白或核酸之辭彙「對應」或「對應性」分別係指與參照序列相同之胺基酸或核酸序列。辭彙「同源性」、「同源」、「同源的」在任何情形下係指其所指稱之核酸或胺基酸序列與所指明之序列具有(在一具體實例中)至少70%對應性。

在另一具體實例中，該核酸或胺基酸序列與所指明之序列具有至少75%對應性。在另一具體實例中，該核酸或胺基酸序列與所指明之序列具有至少80%對應性。在另一具體實例中，該核酸或胺基酸序列與所指明之序列具有至少85%對應性。在另一具體實例中，該核酸或胺基酸序列與所指明之序列具有至少90%對應性。在另一具體實例中，該核酸或胺基酸序列與所指明之序列具有至少95%或以上之對應性。在另一具體實例中，該核酸或胺基酸序列與所指明之序列具有95－100%對應性。

在其他具體實例中，本揭示內容包含一種組合物，其包含二或多種上述之多肽或核酸。在部分具體實例中，該組合物可包含一文庫，該文庫包含至少約2、5、10、50、或以上之核酸。此等組合物可選擇性由切割一或多種上述之核酸而產生(如，機械性切割、化學性切害j、或以限制核酸內切酶/核糖核酸酶/去氧核糖核酸酶等進行酶性切割)。本揭示內容之其他組合物包括，如，藉著在去氧核糖核苷三磷酸及熱安定性核酸聚合酶之存在下恆溫培養一或多種上述之核酸而製備之組合物。

本揭示內容亦涵括細胞，其包含至少一種上述之核酸，或是其經切割或擴增之片段或產物。此等細胞可選擇性表現由此種核酸編碼之多肽。本揭示內容之其他具體實例包括載體(如，質體、黏粒、噬菌體、病毒、病毒片段等)，其包含任何上述之核酸。此等載體可選擇性包含表現載體。經此等載體轉導之細胞亦涵括於本揭示內容中。

在部分具體實例中，本揭示內容涵括病毒(如，流感病毒)，其包含一或多種上述之核酸(如，編碼血球凝集素及選擇性編碼神經胺糖酸酶)，或其一或多種片段。包含此種病毒之免疫原性組合物亦為本揭示內容之一部分。此等病毒可包含基因重配病毒，諸如，6：2基因重配病毒(如，包含取自一或多種供體病毒之6個基因編碼區域以及取自一或多種上述核苷酸序列(或其一或多種片段)之2個基因編碼區域，其可選擇性包含血球凝集素及/或神經胺糖酸酶)。本揭示內容之基因重配病毒(選擇性為活病毒)可包括供體病毒，其係一或多種，如，冷敏感性、冷適應性、或減毒病毒。舉例而言，基因重配病毒可包含，如，A/Ann Arbor/6/60、PR8等。本揭示內容之基因重配病毒或可排除A/Ann Arbor/6/60。本揭示內容之一較佳具體實例係一種基因重配流感病毒，其中該病毒係一6：2基因重配流感病毒，且其包含取自A/Ann Arbor/6/60之6個基因編碼區域以及編碼一多肽之2個基因編碼區域。在一替代具體實例中，本揭示內容之一基因重配流感病毒包括一6：2基因重配流感病毒，其中該病毒包含取自非A/Ann Arbor/6/60之一或多種供體病毒之6個基因編碼區域以及編碼一多肽之2個基因編碼區域。在另一替代具體實例中，本揭示內容之一基因重配流感病毒包括一6：2基因重配流感病毒，其中該病毒包含取自非A/Ann Arbor/6/60之一或多種供體病毒之6個基因編碼區域以及2個基因編碼區域，其中該2個基因編碼區域係取自任何泛流行性流感病毒菌株之HA或NA多肽。經由在容許核酸表現之條件下，於適當培養基中培養具有流感病毒之宿主細胞，再自一或多個宿主細胞或培養基中分離該重配流感病毒而製備重配流感病毒之方法亦係本揭示內容之一部分。

在部分具體實例中，本揭示內容涵括一種次單位疫苗，其包含流感病毒HA衍生性多肽。在部分具體實例中，此等多肽係由電腦模擬衍生之一致序列，如技藝中所知，且可包含針對哺乳動物表現而經最適化之序列。在部分具體實例中，此等疫苗包含衍生自已知分化枝系、基因重配病毒、及經預測突變株之一致序列，如熟習技藝者將可明瞭者。

在其他具體實例中，本揭示內容包含免疫原性組合物，其包含免疫學上有效量之任何上述多肽、聚核苷酸、建構物、及/或本文所述之細胞。其他具體實例包括用以刺激個體之免疫系統以產生對抗流感病毒之保護性免疫反應之方法，其係藉由對該個體投藥免疫學有效量之任何上述多肽、聚核苷酸、建構物、及/或所述之細胞(選擇性於生理學有效之載體中)而進行。

本揭示內容之其他態樣包括製備分離或重配多肽之方法，其係藉由在容許核酸表現之條件下，於適當之培養基中，培養任何上述之宿主細胞，再自一或多個宿主細胞或該等細胞生長之培養基中分離該多肽而進行。

根據另一具體實例，包含本文所述分離核酸序列之核酸載體包括用以調控該分離核酸表現之啟動子。此等啟動子已知為轉錄所需之順式作用序列元件，因其係用以連接在DNA依賴性RNA聚合酶後方，該酶可轉錄存在於其下游之序列。

根據本揭示內容之載體較佳尚包括適當之可選擇性標記。該載體尚可包括複製起點，且其可為穿梭載體，其可在細菌(諸如，例如，大腸桿菌)中繁殖(其中該載體包含適當之可選擇性標記及複製起點，並同時相容於脊椎動物細胞中之繁殖，或是可併入所選生物之基因組中。根據本揭示內容此一態樣之載體可為，例如，質體、桿粒(bacmid)、噬菌粒(phagemid)、黏粒、噬菌體、病毒、或人造染色體。

在本揭示內容之另一態樣中，其提供一種宿主細胞，其含有如本文所述之核酸載體。該細胞可為原核或真核細胞。

本揭示內容之核酸可包含與SEQ ID NO：2具至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或以上(包括95%－100%)同源性或相同性之核酸序列，如藉由在序列排比操作流程(如，例如，在Wisconsin Genetics套裝軟體7.0版(Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)中之GAP、BESTFIT、FASTA、及TFASTA程式)中所用之，例如，Smith－Waterman算法所判定者。

或者或另外，聚核苷酸同源性可藉由與SEQ ID NO：2之雜交而判定，其可由嚴格或中度雜交條件完成。嚴格雜交作用之實例係使用含有10%硫酸葡聚糖、1 M NaC1、1%SDS、及5 x 10⁶ cpm³² p標記性探針之雜交溶液，在65℃下進行，並使用含有0.2 x SSC及0.1% SDS之終清洗溶液，以及65℃下之終清洗：而中度雜交作用之實例則可為使用含有10%硫酸葡聚糖、1 M NaC1、1% SDS、及5 x 10⁶ cpm³² p標記性探針之雜交溶液，在65℃下進行，並使用含有1 x SSC及0.1% SDS之終清洗溶液，以及50℃下之終清洗。

免疫原性組合物亦係本揭示內容之特徵。例如，包含1或多種任何上述多肽及/或核酸以及選擇性之賦形劑(諸如，醫藥可接受性賦形劑)或是一或多種醫藥可接受性投藥組成份之免疫原性組合物。本揭示內容之免疫原性組合物亦可包含一或多種任何上述之病毒(如，結合一或多種醫藥可接受性投藥組成份)。

在部分具體實例中，用於本揭示內容中之任何該等組合物將包含如本文所述任何形式或具體實例之多肽、聚核苷酸、載體、細胞、或脂質體。在部分具體實例中，用於本揭示內容中之任何該等組合物將係由如本文所述任何形式或具體實例之多肽、聚核苷酸、載體、細胞、或脂質體構成。在部分具體實例中，用於本揭示內容中之任何該等組合物將係實質上由如本文所述任何形式或具體實例之多肽、聚核苷酸、載體、細胞、或脂質體構成。在部分具體實例中，辭彙「包含」係指包括所指明之活性劑，並包括其他活性劑，以及醫藥可接受之載體、賦形劑、緩和劑、安定劑等，如醫藥產業中所知者。在部分具體實例中，辭彙「實質上由…構成」係指一組合物，其唯一之活性成分係所指明之活性成分，然而，亦可包括其他化合物，該等化合物係用以對該調配物進行安定、防腐等，但不直接涉及該所指明活性成分之治療作用。在部分具體實例中，辭彙「實質上由…構成」可係指協助釋出該活性成分之組成份。在部分具體實例中，辭彙「實質上由…構成」可係指諸等組成份，其對於所述之病症仍可為具活性者，然而其就結構、類型、活性、作用模式等卻不同於參照化合物。在部分具體實例中，辭彙「由…構成」係指一組合物，其含有該活性成分以及醫藥上可接受之載體或賦形劑。

經由對一對象投藥有效量之任何上述多肽、聚核苷酸、載體、細胞、組合物、或脂質體而在對象中產生免疫原性反應之方法亦在本揭示內容之中。此外，經由投藥可產生對抗該病毒感染之免疫原性反應之有效量之任何一或多種上述多肽、聚核苷酸、載體、細胞、組合物、或脂質體而在對象中治療病毒(如，流感病毒)感染之預防性或治療性方法亦係本揭示內容之一部分。此等治療之對象可包括哺乳動物(如，人類)。此等方法亦可包含對該對象之體內投藥，以及對該對象一或多個細胞之試管內或體外投藥。此外，此等方法亦可包含投藥病毒及醫藥可接受性賦形劑之組合物，其係以可對病毒感染進行預防性或治療性之治療之量而對該對象投藥。

在本揭示內容之部分具體實例中，該等組合物包含衍生自一或多種泛流行性流感病毒菌株之一致HA序列。在本揭示內容之部分具體實例中，該等組合物包含衍生自一或多種泛流行性流感病毒菌株之一致HA序列以及編碼6：2基因重配體所選骨架菌株之序列。本揭示內容亦包括活減毒疫苗，其包含此等上述組合物，包括編碼本文所述序列之細菌或病毒載體。

在部分具體實例中，就代表經指明菌株衍生物之經指明HA序列而言，就經指明核酸或多肽之辭彙「衍生物」或「變體」係指相對參照序列而言分別經一或多個核苷酸或胺基酸變化之序列。

該衍生物或變體可具有「保守性」變化，其中經取代之核苷酸或胺基酸分別具有類似之結構或化學特性，如，以異白胺酸或是編碼其之核苷酸置換白胺酸。或者，變體可具有「非保守性」變化，如，以色胺酸或是編碼其之核苷酸置換甘胺酸。類似之小變化可亦包括胺基酸/核酸之缺失或插入，或是兩者。判定何者殘基可經取代、插入、或缺失而不會消除生物或免疫活性之指引可使用技藝中所熟知之電腦程式而得見，例如，DNASTAR軟體。

在部分具體實例中，本揭示內容之該等聚核苷酸、多肽、載體、細胞、組合物等包含衍生自流感H5N1病毒之一致HA，或其變體。該等H5N1病毒可包含其任何分化枝系或次分化枝系，包括分化枝系1、2、或3病毒以及其次分化枝系。舉例而言，該等病毒可包括至少任一下述之流感病毒類型：ck/Cambodia/013LC1b/05、Vietnan/1194/04^＊、Vietnam/1203/04^＊、Vietnam/HN30408/05、Thailand/16/04、Vietnam/JPHN30321/05、Hong Kong/213/03、Indonesia/CDC523/06、Indonesia/CDC699/06、Indonesia/CDC326/06、Indonesia/5/05^＊、Indonesia/CDC184/05,Indonesia/7/05、dk/KulonProgoBBVET9/04、ck/Indonesia/CDC25/05、Indonesia/6/05、ck/Brebes/BBVET2/05、Indonesia/CDC594/06#、ck/Dairi/BPPV1/05、ck/Yunnan/374/04,ck/Yunnan/115/04,ck/Yunnan/493/05、ck/Yunnan/447/05,dk/Guangxi/13/04,ck/Guangxi/12/04,whooping swan/Mongolia/244/05^＊ ,bar headed gs/Qinghai/IA/05^＊ ,Turkey/65596/06、 Turkey/15/06,fraq/207NAMRU3/06,ck/Nigeria/641/06,mid/Italy/332/06、turkey/Turkey/1/05^＊ ,E t/2782NAMRU3/06,Djibouti/5691NAMRU3/06、ck/Nigeria42/06、migratory dk/Jiangxi/2136/05、gs/Kazakhstan/464/05、ck/Krasnodar/01/06、Azerbaijan/011162/06、Indonesia/CDC625/06 #、Hong Kong/156/97、swan/Iran/754/06、dk/Laos3295/06、Anhui/1/05^＊、Anhui/2/05、Japanese white－eye/Hong Kong/1038/06、ck/Malaysia935/06、Vietnam/30850/05、Guangxi/1/05、dk/Hunan/15/04、qa/Guangxi/575/05、dk/Vietnam/Ncvdcdc95/05、migratory dk/Jiangxi/1653/05、gs/Guangdong/1/96，或者在部分具體實例中，一致序列係衍生自其組合。在部分具體實例中，本揭示內容係關於以此種一致聚核苷酸或多肽對一對象之疫苗接種，且其在接觸多種分化枝系或次分化枝系時可對該對象提供治療性或預防性之優勢，因該所衍生之一致序列係對不同分化枝系及/或次分化枝系具有交叉保護性者。

在部分具體實例中，該一致胺基酸序列將包含任一述於SEQ ID NOS.1、3、及/或5中之胺基酸序列。在部分具體實例中，該一致序列係由述於SEQ ID NOs：2、4、及/或6中之聚核苷酸編碼。

在部分具體實例中，本揭示內容提供一種在對象中治療流感病毒感染、降低其發生率、降低其嚴重性、延緩其發病、或改善與其相關之症狀之方法，該方法包含使對象中之經流感病毒感染或具經其感染風險之細胞接觸包含與SEQ ID NOs：1、3、及/或5所述者對應或同源之胺基酸序列之分離多肽。

在部分具體實例中，本揭示內容提供一種在對象中治療流感病毒感染、降低其發生率、降低其嚴重性、延緩其發病、或改善與其相關之症狀之方法，該方法包含投藥足夠量之與SEQ ID NOs.2、4、及/或6同源或對應之分離聚核苷酸，以產生對於病毒感染之後續抵抗力。

在部分具體實例中，本揭示內容提供一種在對象中治療流感病毒感染、降低其發生率、降低其嚴重性、延緩其發病、或改善與其相關之症狀之方法，該方法包含使對象中之經流感病毒感染或具經其感染風險之細胞接觸一分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含一核酸序列，其中之密碼子使用已針對流感病毒血球凝集素(HA)或其衍生物之哺乳動物表現而經最適化。

在本文中，辭彙「治療」包括預防性以及病症修補性之治療。在本文中，辭彙「降低」、「抑低」、及「抑制」具有其常可明瞭之減少或降低之意義。在本文中，辭彙「進展」意謂範圍或嚴重性之增加、前進、生長、或惡化。在本文中，辭彙「復發」意謂疾病在緩和後之回復。

在一具體實例中，「治療」係指治療性之處理以及預防性或防止性之措施，其中該目的係預防或減少如本文上述之感染。因此，在一具體實例中，治療可包括對感染產生直接影響或治癒、抑低、抑制、預防、減少其嚴重性、延緩其發病、減少與其相關之症狀，或其組合。因此，在一具體實例中，「治療」尤其係指延緩進展、加快緩和、誘發緩和、增進緩和、加速復原、增加其他療劑之功效或降低對其之抗性、或是其組合。在一具體實例中，「預防」尤其係指延緩症狀之起始、防止疾病之復發、減少復發事件之數目或頻率、增加症狀事件間之潛伏期、或是其組合。在一具體實例中，「抑低」或「抑制」尤其係指降低症狀之嚴重性、降低急性事件之嚴重性、減少症狀之數目、降低疾病相關性症狀之發生、降低症狀之潛伏期、改善症狀、減少次級症狀、減少次級感染、延長病患存活、或是其組合。

在部分具體實例中，本揭示內容之材料及方法可產生對於病毒感染之保護性免疫反應。在部分具體實例中，對抗流感性病毒之「保護性免疫反應」辭彙係指個體(如，人類)所具有之一免疫反應，其該個體於後續接觸及/或感染該種或是其他流感病毒時可保護其對抗疾病。在部分情形下，該流感病毒(如，天然循環性者)仍可造成感染，但其不會造成嚴重之感染。一般而言，該保護性免疫反應可造成可偵測含量之由宿主產生之血清及分泌抗體，該等抗體可在試管內及體內中和相同菌株及/或次群之病毒(且可能亦包括不同之非疫苗菌株及/或次群)。

在部分具體實例中，辭彙「投藥」係指使一對象接觸本揭示內容之化合物。在本文中，投藥可在試管內(亦即，在試管中)或是在體內(亦即，在活生物體(例如，人類)之細胞或組織中)完成。在一具體實例中，本揭示內容涵括對一對象投藥本揭示內容之該等化合物。

在部分具體實例中，辭彙「接觸」意謂將該經指明之試劑引入試管、燒瓶、組織培養、晶片、陣列、試驗盤、微試驗盤、毛細管、或其類似者中之包含免疫細胞之樣本中，再在足以容許攝入該試劑之溫度及時間下進行恆溫培養。

在另一具體實例中，辭彙「接觸」係指將該經指明之試劑引入對象中，並容許該試劑在體內接觸免疫細胞。

在部分具體實例中，本揭示內容之方法尚包含使該細胞重複接觸本揭示內容之聚核苷酸或多肽、細胞、載體、組合物、脂質體等，該重複接觸在部分具體實例中係在該對象經流感病毒感染之前、之期間、或其組合。

在部分具體實例中，該流感病毒係H5N1菌株，其在部分具體實例中係病毒基因重配之產物。

在部分具體實例中，本揭示內容之聚核苷酸或多肽、細胞、載體、組合物、脂質體等係用於治療任何流感病毒感染，例如，與寄存於NCBI之Genbank中登錄號AF036358－AF036360、AF036362、AF036363、AF084261－AF084270、AF084276－AF084278、AF084282AF084287、AF115284－AF115289、及AF115290－AF115295類似之病毒之感染。

在部分具體實例中，該對象係經保護而對抗由不同於該在該對象中造成感染者之另一分化枝系或次分化枝系之流感病毒之後續感染。

該等組合物可以任何有效、便利之方式投藥，其包括，舉例而言，例如由靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、鼻內、或穿皮途徑。在療法中或作為預防劑時，該活性劑可以可注射組合物之形式對個體進行投藥，舉例而言，以無菌水分散液之形式，較佳為等滲性者。在部分具體實例中，該等組合物可藉由注射而投藥，以達成對抗相關病毒病原之全身性作用。在部分具體實例中，該等多肽、聚核苷酸、載體、細胞、脂質體可經預防性或治療性之投藥，以免疫學有效量並在適當之載體或賦形劑中，以刺激對於一或多種流感病毒菌株序列具有專一性之免疫反應。在部分具體實例中，該載體或賦形劑係醫藥可接受性載體或賦形，諸如，無菌水、鹽水溶液、緩衝鹽水溶液、葡萄糖水溶液、甘油水溶液、乙醇、或其組合。此等溶液確保無菌性、pH、等滲性、及安定性之製備係根據技藝中已建立之操作流程進行。一般而言，載體或賦形劑係經選擇以使過敏性及其他不欲之作用降至最低，並適合特定之投藥途徑，如，皮下、肌內、鼻內等。

在部分具體實例中，本揭示內容之聚核苷酸或多肽、細胞、載體、組合物、脂質體等可藉由抗原呈遞細胞(諸如，例如，樹狀細胞)之體外或體內靶向而刺激免疫反應。舉例而言，使增植樹狀細胞接觸足夠量之本揭示內容之聚核苷酸或多肽、細胞、載體、組合物、脂質體等一段足夠時間，以容許該等樹狀細胞捕捉該等流感病毒抗原。接著藉由標準之靜脈內移植方法，將該等細胞轉移至待進行疫苗接種之對象中。

在部分具體實例中，較佳係以單劑之本揭示內容聚核苷酸或多肽、細胞、載體、組合物、脂質體等刺激保護性免疫反應，且可藉由相同或不同途徑投藥額外之劑量，以達成所欲之預防性作用。例如，在新生兒或嬰兒體內，可能需要多重投藥以激發足夠量之免疫力。投藥可間隔而持續整個兒童期，如維持足量之保護力對抗天然型流感病毒所需。同樣，特別容易受到重複或嚴重流感病毒感染之成人，諸如，舉例而言，健康照護工作者、日間托育工作者、幼兒之家庭成員、老年人、及心肺功能不良之個體可能需要多重免疫以建立及/或維持保護性免疫反應。可監測經誘發免疫力之量，例如，藉由測量中和性分泌或血清抗體之量，並如所需調整劑量或重複疫苗接種，以激發及維持所欲量之保護。

在部分具體實例中，本揭示內容之聚核苷酸或多肽、細胞、載體、組合物、脂質體等包含一或多種用以增進對於該等流感病毒抗原之免疫反應之佐劑，或與其一同投藥。適當之佐劑包括：弗氏(Freund)完全佐劑、弗氏不完全佐劑、皂苷、礦物膠(諸如，氫氧化鋁)、界面活性物質(諸如，脫脂酸卵磷脂)、普盧蘭尼克(pluronic)多元醇、聚陰離子、肽、油或烴乳液、卡介苗(BCG)、短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum )、及合成佐劑QS－21。

在部分具體實例中，本揭示內容之聚核苷酸或多肽、細胞、載體、組合物、脂質體等包含一或多種免疫刺激分子，或與其一同投藥。免疫刺激分子包括具有免疫刺激、免疫增強、及促炎活性之各種細胞因子、淋巴因子、及趨化因子，諸如，間白素(如，IL－I、IL－2、IL－3、IL－4、IL－12、IL－13)；生長因子(如，粒細胞－巨噬細胞(GM)集落刺激因子(CSF))；及其他免疫刺激分子，諸如，巨噬細胞炎性因子、Flt3配位體、B7.1、B7.2等。該等免疫刺激分子可與本揭示內容之聚核苷酸或多肽、細胞、載體、組合物、脂質體等同時投藥或是可分別投藥。

在部分具體實例中，本揭示內容之聚核苷酸或多肽、細胞、載體、組合物、脂質體等係用於治療性及/或預防性之治療疾病或病症，一般而言係流感，藉由試管內、體外、或體內靶向免疫細胞而進行。

在部分具體實例中，本揭示內容之聚核苷酸或多肽、細胞、載體、組合物、脂質體等係作為疫苗。在部分具體實例中，辭彙「疫苗」係指可在對象中發免疫反應(細胞及/或體液免疫反應)之組合物。疫苗可降低感染之風險，但不一定可預防感染。在特定之非限制性具體實例中，疫苗可增加至少30%、50%、或100%基線量之細胞及/或體液免疫力。

在部分具體實例中，該疫苗可包括活病毒，其中該病毒已經減弱，或減毒，以致於其無法造成疾病；經滅殺病毒；一或多種額外之病毒蛋白；嵌合病毒及其他病毒元件。在部分具體實例中，本揭示內容針對個體之疫苗接種提供本揭示內容之聚核苷酸或多肽、細胞、載體、組合物、脂質體等，其可誘發對抗不同菌株及/或次群之流感病毒之交叉保護。在部分具體實例中，本揭示內容之疫苗可選擇性與可誘發對抗其他感染劑之保護性免疫反應之疫苗組合。

在部分具體實例中，疫苗接種係藉由技藝中已知之任何途徑進行，其包括但不限於黏膜疫苗接種，諸如，穿鼻或氣溶膠投藥。就哺乳動物(且特別為人類)之投藥而言，咸預期醫師將可判定實際之劑量及治療持續期，其將係最適合一個體者，且可隨特定個體之年齡、體重、及反應而變化。

實例材料及方法

一致序列設計 自約500種H5N1病毒菌株之HA基因推導出一致HA核苷酸序列(HAc)，並進行譜系分析(圖1)。針對該一致HA核苷酸序列而使密碼子使用最適化。合成該經最適化之核酸，並與適當之載體建構以進行表現，該等載體之一係pVAX(Invitrogen,Carlsbad,CA)。使用該一致序列作為樣板，建構編碼各WHO疫苗中之個別HA基因之質體。因此，所有編碼HAs之核苷酸序列，包括該一致HA(pHAc)及不同流感病毒菌株之HAs，皆經密碼子最適化並相似用於此等實驗中。

分化枝系專一性序列設計之建構 針對RG2之H5(H5N1分化枝系2，次分化枝系1)建構HA序列，接著可針對哺乳動物表現而使該核苷酸序列(ID5)最適化。在以致死劑量之RG2感染時，100%之pID5免疫化小鼠受到保護，而僅有40%之HAc免疫化小鼠存活(圖15A)。

亦針對RG5之H5(Anhui病毒株H5N1(Anhui/01/2005(H5N1)/PR8－IBCDC－RG5)Indonesia/5/2005)之基因重配體)菌株(H5N1分化枝系2，次分化枝系3)(Anhui)建構HA序列。自表現A/Duck/Fujian/1734(似－FJ)之HA之既有DNA質體作為樣板起始，該兩菌株在下列之三個胺基酸殘基處不同：V281M；I231T，M293K。使用定位誘變產生所欲之DNA質體。兩次注射後，所有經30微克pHAc或pAnhui免疫之小鼠分別發展出顯著之抗－H5抗體對抗一致HA或RG5之HA。在以最大可用劑量之RG5感染時，20%之控制組小鼠死亡，而100%之經pHAc或pAnhui免疫小鼠則受到保護。以pAnhui之免疫保護該等小鼠不受顯著之體溫及體重喪失，該等情形在控制組小鼠中則相當顯著(圖15B)。

密碼子最適化HA質體在培養細胞中之定性 在試管內監測密碼子最適化DNA疫苗之表現量。以個別質體轉染人類上皮腎臟293細胞(HEK293細胞)。48小時後，收集該等細胞進行SDS－PAGE分析，並藉由抗－HA抗體之免疫印跡偵測HA表現量(包括由HAc編碼之一致HA)(圖8A)。

亦以血球吸附分析檢驗由HAc編碼之一致HA所促進之血球凝集。以編碼各種HAs之個別DNA疫苗轉染HEK293細胞48小時，接著與雞紅血球細胞進行恆溫共置。接著裂解經吸收之紅血球細胞，並以540 nm之光學密度測量血紅素之量，以評估血球吸附能力(圖8B)。

免疫原性測定 以3週間期之30微克DNA之一次或兩次注射免疫BALB/c小鼠。使用可溶性HA作為塗覆抗原，由ELISA分析之血清抗體效價監測經由HAc聚核苷酸之轉譯表現之HA多肽之體液免疫原性。藉著在HEK293細胞中表現與人類Fc區域融合之一HA胞外域取得可溶性HA，並將如此產生之培養基用於塗覆ELISA試驗盤。使用取自經免疫小鼠之脾細胞測定細胞毒性。以標準之方法學製備單細胞懸浮液，並藉由標準之方法學進行ELISPOT分析。與經或未經肽脈衝之細胞共培養脾細胞，在經抗－小鼠γ 干擾素(IFN－γ)塗覆之膜滴定盤上，於37℃下恆溫培養24小時。如前述處理此等試驗盤(McGettigan,J.P.,et al.2003.J.Virol.77：237－244)，並使用自動判讀機計數印跡(圖9A－9C)。此外，評估由HAc免疫所促進之細胞基礎性免疫反應(圖10A－B)。

圖10(A)以ELIspot分析定量出由該DNA疫苗誘發之細胞中介性免疫力。該等脾細胞係取自經一致HAc聚核苷酸免疫之對象，並在試管內經HA－專一性CD8－反應性肽(HA 9mer)或非相關肽(HIV 9mer)刺激。圖10說明由CD－8陽性T細胞所釋出之IFN－γ反應HA肽(HA 9mer)之試管內刺激而增加，因此指出由該HAc核苷酸疫苗誘發之細胞中介性免疫力。

圖10(B)進一步說明在HAc免疫後之細胞免疫力反應。在圖10(B)中，在HAc核苷酸疫苗免疫後以HA－表現性病毒對小鼠脾細胞所進行之病毒感染造成強健之細胞中介性免疫反應，其由CD－8陽性T細胞所釋出之IFN－γ增加所示，並由 ELIspot分析。

病毒感染研究 以致死劑量之活NIBRG－14(一種Vietnam基因重配體)、RG2(代表分化枝系2.1 H5N1)、及RG5(代表分化枝系2.3H5N1)感染經疫苗接種之小鼠，並監測存活率。亦評估小鼠之體重及發熱。(圖11、12、15)。

中和分析 使用進一步包含H5N1 HAs之HIV骨架產生HA－假型病毒，使用包括VN 1104、VN 1203、HK2003、Qing Hai、Indonesia、及Tamsui。評估由取自經該建構物免疫兩次之小鼠之抗血清所產生之病毒中和作用(圖13、14)。

實例1

一致產列之建構 公開資料庫中共有超過700種之H5N1病毒血球凝集素(HA)基因。H5N1疫苗發展中所存在之障礙之一係缺乏不同病毒菌株間之交叉保護力。H5N1病毒已被分類為WHO所建議之不同分化枝系。至今，H5N1疫苗可保護對抗相同分化枝系之病毒感染，但不可對抗另一分化枝系之病毒。舉例而言，Vietnam疫苗株可誘發對抗其本身之完整保護，但無法誘發對抗Indonesia H5N1病毒株之保護性免疫力。因此，為涵蓋其基因多樣性並因而誘發遍及不同H5N1病毒株之交叉保護力，咸欲推論出一致序列以進行保護實驗，同時發展出可予同時投藥之數種額外之經分離核苷酸序列，以進一步擴展對抗病毒感染之保護範圍。

因此進行一致HA對WHO H5N1疫苗病毒株HA之譜系分析(圖1)。病毒株08 Indonesia/5/2005(NIBRG-2)、010 turkey/Turkey/1/2005(NIBRG-23)、011 ws/Mongolia/244/2005、012 bhg/Qinghai/1A/2005及014Anhui/1/2005係WHO H5N1疫苗病毒株，病毒株一致(HAc)、009 ck/Indonesia/5/2004(ID)、013 bhg/Qinghai/62/205(QH)、018 dk/China/E319-2/03(Tamsui病毒株)及015 dk/Fujian/1734/05(似-FJ)係經建構以進行本文之定性及感染實驗之疫苗。病毒株001 VN/1203/2004、002 VN/1194/2004(NIBRG-14)及003 HK/213/03(HK))係同時為WHO H5N1疫苗菌株及用以進行本文之疫苗設計之病毒株。星號指明在本文之保護實驗中所測試之活H5N1病毒。

自約500種H5N1病毒株之HA基因推導出一致HA蛋白序列(SEQ ID NO：1)(圖2)。該一致HA係位於譜系分析之分化枝系1及分化枝系2間，且其係由SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列及SEQ ID NO：2所示之核酸序列定性(圖2、3)。

每一生物種皆具有一偏好之密碼子使用，其係大部分基因用以編碼蛋白者，且此種密碼子偏倚係與不同生物種中之基因表現效率有關。舉例而言，流感病毒基因富含AT百分比，而哺乳動物密碼子則係GC-富集性者。因此使用標準之方法學，對編碼一致HAs之HA基礎性DNA疫苗之密碼子使用進行最適化，以使其在哺乳動物中之表現最大化(圖3)。使用pVAX骨架載體，並在其中引入HAc基因盒，該所得之建構物即稱為「pHAc」。使用該pHAc樣板，建構一系列編碼WHO菌株個別HA基因之質體。因此，所有之該等HAs，包括一致HA以及不同流感病毒菌株之HA，皆經密碼子最適化，且類似用於本文所述之實驗中。圖4-5說明分離多肽HA(SEQ ID NO：3)，以及編碼SEQ ID NO：5之分離多肽之經最適化分離聚核苷酸(SEQ ID NO：4)(ID5)，其係用以產生對抗H5N1分化枝系2，次分化枝系1病毒之免疫原性，且後續作為如上所述之質體建構物(pID5)。圖6-7說明分離多肽HA(SEQ ID NO：5)，以及編碼SEQ ID NO：3之分離多肽之經最適化分離聚核苷酸(SEQ ID NO：6)(pAnhui)，其係用以產生對抗H5N1分化枝系2，次分化枝系3病毒之免疫原性，且後續作為如上所述之質體建構物(pAnhui)。

實例2 一致序列之定性

在HEK293細胞中監測密碼子最適化DNA疫苗之表現量(圖8A)，以及DNA疫苗中介性HA受體正調節協助血球凝集作用之能力(圖8B)。表現該一致HA之HEK293細胞具有與H5N1病毒之HAs相當之血球吸附能力。

實例3 一致序列之體液及細胞免疫原性

HAc聚核苷酸疫苗具高度免疫原性，如以經HAc免疫(在此實例中，經由pHAc)之BALB/c小鼠之血清抗體效價生產所測定。其在一次注射後之終點抗體效價介於1：400與1：1,600間，而在兩次注射後之效價則大於1：10,000(圖9A, B)。終點抗體效價在第二免疫接種之後亦有增加情形(圖9C)。

CD8細胞之ELISPOTs指出，HAc疫苗接種亦反應後續之HA肽引發而間接誘發大量之IFN－γ(圖10A,B)。

實例4

HAc可保護對抗H5N1之致命感染 為評估DNA疫苗之功效，在第二次DNA疫苗注射14天後，以致死劑量之活NIBRG－14(一種Vietnam基因重配(H5N1分化枝系1)病毒)感染經疫苗接種之小鼠，並監測存活率。如圖11所示，HAc多醣疫苗(在此實例中，經由pHAc)之一次注射可誘發70%之保護對抗後續之100LD₅₀ 病毒感染，而兩次注射則可產生100%之保護。該等小鼠在病毒感染後亦為無熱，而體重喪失之程度則指出與之小鼠疾病狀態之存活率觀察結果相關(圖12A－C)。

實例5

HAc可保護對抗基因重配體V5N1之致命感染 為評估對抗HAc編碼性一致HA所培養之抗血清之交叉中和活性，產生包含各種H5N1 HAs之HIV骨架HA假型病毒，並評估對抗HAc編碼性一致HA多肽所培養之抗血清之交叉中和活性。使用取自六種H5N1菌株之HA，包括VN 1104、VN1203、HK2003、Qing Hai、Indonesia、及Tamsui。顯著可見者，所有此等6種假型病毒對於MDCK細胞之感染力皆由取自給予兩劑該一致HAc聚核苷酸序列免疫之小鼠之抗血清中和。造成假病毒感染力50%抑制之半最大有效濃度自1：175之稀釋商數至1：16,857之稀釋商數不等，但VSV－G假型病毒之感染力並未受到抑制，顯示該抗血清之專一性(圖13B)。因此，HAc DNA疫苗接種可產生保護對抗多種H5N1分化枝系，其可藉由僅以HA－編碼性聚核苷酸之免疫而提供交叉保護之優點，相較於至今使用具有有限保護免疫力範圍之全病毒疫苗。如圖14中可見，HAc聚核苷酸之投藥(在此實例中係經由pHAc)亦可產生免疫力，如在對抗HAc編碼性HA多肽所培養之抗血清存在下對於雞紅血細胞血球吸附之抑制所示。

實例6

HAc、ID5及Anhui聚核苷酸序列之組合可產生較廣之保護範圍對抗H5N1基因重配病毒感染 為評估某些其他之分離聚核苷酸序列是否可提供保護對抗來自某些基因重配H5N1病毒分化枝系及次分化枝系之病毒挑戰，以2劑之pHAc、pID5、pAnhui、及pVAX(控制組)免疫BALB/c小鼠。在後續之感染之後：經pID5疫苗接種之小鼠顯示增加之保護力對抗RG2(分化枝系2，次分化枝系1)基因重配病毒感染，而經pAnhui免疫之小鼠顯示增加之保護力對抗RG5(分化枝系2，次分化枝系3)基因重配病毒感染。

儘管本揭示內容之某些特徵已在本文中說明及敘述：諸多修飾、取代、變更、及等同物現將可為一般熟習技藝者所見。因此，咸須明瞭，附呈之申請專利範圍係欲涵括所有此等落於本揭示內容真正精神範圍內之修飾及變更。

圖I說明一致HA序列對WHO H5N1疫苗病毒株HA之譜系分析。根據WHO之定義，循環性之H5N1病毒可分為兩分化枝系。就此申請案之目的，該一致HA核苷酸序列指名為HAc，而涵括該一致HAc核苷酸序列之質體建構物指明為pHAc。該一致HA核苷酸序列(藍字)(指明為「一致(HAc)」)在譜系上位於H5N1流感病毒家族分化枝系1及分化枝系2中之WHO建議疫苗病毒株(紅字)(08 Indonesia/5/2005(NIBRG－2)；010 turkey/Turkey/1/2005(NIBRG－23)；011 ws/Mongolia/244/2005；012 bhg/Qinghai/1A/2005；014 Anhui/1/2005)之間。星號標記可用於病毒感染實驗之流感A病毒。

圖2說明由該HAc一致聚核苷酸(SEQ ID NO：2)編碼之一致血球凝集素(HA)(SEQ ID NO：1)蛋白(胺基酸)序列。

圖3說明編碼圖2之一致HA(SEQ ID NO：1)之HAc核苷酸(鹼基)序列(SEQ ID NO：2)。

圖4說明由SEQ ID NO：4(圖5)並指明為「ID5」之最適化聚核苷酸序列(pID5)編碼，與H5NI流感病毒分化枝系之H5N1病毒家族次分化枝系2.1(RG2之H5；H5N1病毒菌株Indonesia/5/2005之基因重配體)相關之HA之蛋白(胺基酸)序列(SEQ ID NO：3)。

圖5說明編碼列於SEQ ID NO：3之與分化枝系2.1相關之HA之最適化核苷酸(鹼基)序列(SEQ ID NO：4)(ID5)。

圖6說明由SEQ ID NO：6(圖7)並指明為「Anhui」之最適化聚核苷酸序列(pAnhui)編碼，與H5N1流感病毒分化枝系之H5N1病毒家族次分化枝系2.3(RG5之H5；Anhui/01/2005(H5N1)/PR8－IBCDC－RG5)相關之HA之蛋白(胺基酸)序列(SEQ ID NO：5)。

圖7說明編碼列於SEQ ID NO：5之與分化枝系2.3相關之HA之最適化核苷酸(鹼基)序列(SEQ ID NO：6)(「Anhui」)。

圖8說明HAc DNA疫苗之定性。以編碼不同H5N1病毒株HA基因之個別質體轉染HEK293細胞。接著以抗－HA多株抗體之免疫印跡分析細胞裂解物。

圖8(A)係該免疫印跡之照片，其說明由SEQ ID NOs1及2編碼之HA一致序列之相對表現，如由免疫印跡所分析。該等病毒株示於各行之頂端。HAc：一致HA，VN 1203：VN 1203/2004，VN1194：VN1194/2004，TS：dk/China/E319－2/03，QH：bhg/QingHai/62/2005，HK：11K/213/03，ID：ck/Indonesia/5/2004，FJ：dk/Fujian/1734/05，pVAX：空質體控制組。作為一免疫印跡之照片，圖8(A)無法以墨水圖式說明，及/或以照片可更清楚顯示。

圖8(B)描繪經HAc轉染以及所得之HA多肽表現性HEK293細胞之相對雞紅血細胞血球吸附情形。以編碼不同H5N1病毒株HA基因之個別質體(包括pHAc)轉染HEK293細胞，接著使該等細胞與雞紅血細胞恆溫培養30分鐘。以血紅素之量分析經吸附雞紅血細胞之量，該血紅素之量可以540 nm處之光學吸收值偵測。示於各長條圖底部者代表病毒株，與上述者相同。

圖9說明一致HAc聚核苷酸疫苗之免疫原性。在圖9(A)中，小鼠係以含有30微克pHAc之一次注射免疫，並在三週後收集血清。終點血清抗體效價係使用對抗一致HA－hFc融合蛋白之ELISA測定。

圖9(B)描繪在以間隔三週之兩次HAc聚核苷酸疫苗注射後所分析之終點抗體效價。小鼠係以三週間期之30微克pHAc兩次注射免疫。在第二次注射兩週後收集血清。終點血清抗體效價係使用對抗一致HA－hFc融合蛋白之ELISA測定。

圖9(C)說明自以控制組質體(pVAX)或pHAc質體免疫所得之抗體效價之差異。在第1天及第21天經由電穿孔而以30微克pHAc或pVAX(控制組)質體對Balb/c小鼠進行疫苗接種。如圖9(C)所指出，經pHAc免疫小鼠之抗體效價顯著高於經pVAX免疫小鼠之抗體效價。

圖10定量由DNA疫苗誘發之細胞中介性免疫力。圖10(A)說明由CD－8陽性T細胞所釋出之IFN－γ反應以一致pHAc聚核苷酸序列對個體進行免疫接種並後續經由病毒感染引入HA而產生之增加情形。脾細胞係取自經一致HAc聚核苷酸序列免疫之對象，並在試管內經HA－專一性CD8－反應性肽(HA 9mer)或非相關肽(HIV 9mer)刺激。

圖10(A)說明由CD－8陽性T細胞所釋出之IFN－γ反應HA肽(HA 9mer)之試管內刺激而增加，因此指出由該HAc核苷酸疫苗誘發之細胞中介性免疫力。

圖10(B)進一步說明在HAc聚核苷酸免疫後之細胞免疫力反應。在圖10(B)中，在HAc核苷酸疫苗(在此實例中，pHAc)免疫後以HA－表現性病毒對小鼠脾細胞所進行之病毒感染造成強健之細胞中介性免疫反應，其由CD－8陽性T細胞所釋出之IFN－γ曾加所示，並由ELIspot分析。

圖11描繪對抗致死劑量NIBRG－14(一種H5N1分化枝系1禽流感病毒之代表)感染之HAc DNA疫苗誘發性保護力。在圖11(A)中，小鼠係經一致HAc疫苗(在此實例中，pHAc)或控制組質體表現載體(pVax)之一次注射免疫，再使用NIBRG－14既經建立LD₅₀ 之50或100倍進行病毒感染。括弧中之數字指明用於各組中之小鼠數目。在圖11(B)中，小鼠係經HAc DNA疫苗或控制組質體表現載體(pVax)之兩次注射免疫，再如圖11(A)進行病毒感染。如圖11(A)及(B)所示，在病毒感染前以pHAc聚核苷酸疫苗免疫可造成增加之存活率。

圖12描繪經致死劑量NIBRG－14(一種H5N1分化枝系1禽流感病毒之代表)感染之小鼠之體溫(A)及體重(B)變化。小鼠係經HAc DNA疫苗(在此實例中，pHAc)或控制組質體表現載體(pVax)之兩次注射免疫，接著以NIBRG－14病毒既經建立LD₅₀ 之20及100倍進行感染。

圖12(A)說明，相較於經控制組質體載體免疫者，經HAc聚核苷酸(在此實例中，pHAc)免疫之小鼠隨時間可維持較高、較穩定之基礎體溫。

圖12(B)說明，相較於經控制組質體載體免疫者，經HAc 聚核苷酸(在此實例中，pHAc)免疫之小鼠隨時間可維持較高之平均體重(且喪失較少百分比之體重)。

圖12(C)進一步說明HAc DNA疫苗產生對於基因重配H5N1流感病毒(包括NIBRG14(一種H5N1分化枝系1禽流感病毒之代表)及NIBRG23(一種H5N1分一匕枝系2禽流感病毒之代表))之病毒挑戰之改良抗性之能力。如圖12(C)所示，相較於經NIBRG14及NIBRG23流感病毒挑戰之經pVAX疫苗接種對象，亦相較於以編碼HA之同源分離聚核苷酸(pVN 1194)所進行之疫苗接種，以HAc聚核苷酸(在此實例中，pHAc)進行之疫苗接種可造成更高之存活率、較高之體重、及較高之體溫。

圖13A說明假型H5N1病毒對於MDCK細胞之感染力由取自經HAc DNA疫苗(在此實例中，pHAc)之第二次免疫2週後之小鼠之免疫血清產生之中和作用。該所產生之HA－假型病毒包含HIV骨架及不同H5N1病毒株之HA，如前所述。如所示，以pHAc聚核苷酸疫苗之免疫可造成廣泛基礎之免疫力，對抗來自各種H5蛋白－表現性假型病毒之病毒感染。

圖13B說明HA－假型病毒之感染力由取自接受HAc聚核苷酸疫苗兩次注射之小鼠之抗血清產生之中和作用。在感染MDCK細胞前，以所指明之血清稀釋度，使HA－HIV假病毒與抗血清進行預恆溫共置。自以各種經預恆溫共置之HA－HIV假病毒所造成之後續感染收集數據。

圖14描繪在對抗由HAc編碼之HA多肽所培養之抗血清存在下HA對於雞紅血細胞血球吸附之相對抑制。在有(空白長條)或無(黑色長條)對抗由HAc聚核苷酸編碼之HA多肽所培養之抗血清存在下，使HA表現性細胞與紅血細胞進行恆溫共置。接著使用血紅素量之光學密度測量值定量連結之紅血細胞。使用在無抗血清恆溫共置下所偵測之值作為100%，以計算對抗由HAc聚核苷酸編碼之一致HA多肽所培養之抗血清所產生之抑制作用。同樣，可見涵括不同HA－表現性病毒分化枝系之對於血球吸附作用之廣泛基礎性抑制。

圖15描繪藉由使用特定之不同分化枝系DNA疫苗所產生之對病毒感染之改良抗性。在圖15(A)中，其以HAc核苷酸(在此實例中係經由pHAc)及以編碼圖5序列之圖5HA核苷酸序列(ID5)(在此實例中係經由pID5)之兩次注射免疫Balb/c小鼠，接著再以代表分化枝系2.1 H5N1之基因重配RG2病毒進行病毒感染。如與控制組pVAX及pHAc兩者相較者，pID5之疫苗接種可在實驗族群中產生較高之存活率以及體重及體溫之維持。在圖15(B)中，其以HAc(在此實例中係經由pHAc)及以圖7之HA核苷酸序列(Anhui)(在此實例中係經由pAnhui)之兩次注射免疫Balb/c小鼠，接著再以代表分化枝系2.3 H5N1之基因重配RG5病毒進行病毒感染。如與控制組pVAX及pHAc兩者相較者，pAnhui之疫苗接種可在實驗族群中產生較高之體重及體溫維持。

<110> 中央研究院 <120> 流感疫苗及其使用方法 <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 568 <212> PRT <213> 流感病毒(influenza virus) <400> 1 <210> 2 <211> 1704 <212> DNA <213> 流感病毒(influenza virus) <400> 2 <210> 3 <211> 567 <212> PRT <213> 流感病毒(influenza virus) <400> 3 <210> 4 <211> 1701 <212> DNA <213> 流感病毒(influenza virus) <400> 4 <210> 5 <211> 567 <212> PRT <213> 流感病毒(influenza virus) <400> 5 <210> 6 <211> 1701 <212> DNA <213> 流感病毒(influenza virus) <400> 6

在圖11(B)中，小鼠係經HAc DNA疫苗或控制組質體表現載體(pVax)之兩次注射免疫，再進行病毒感染。如圖11(B)所示，在病毒感染前以pHAc聚核苷酸疫苗免疫可造成增加之存活率。

Claims

一種分離聚核苷酸組合物，其包含具有如SEQ ID NO：2之核酸序列。
如請求項1之分離聚核苷酸組合物，其中該分離聚核苷酸尚編碼一細胞因子或生長因子。
如請求項1之分離聚核苷酸組合物，其尚包含一細胞因子、生長因子、抗病毒劑、佐劑、賦形劑、或其組合。
如請求項1之分離聚核苷酸組合物，其中該分離聚核苷酸編碼一多肽，其包含具有如SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
一種多肽，其包含具有如SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
一種如請求項5之多肽，其中該多肽至少部分經糖基化。
如請求項1之分離聚核苷酸組合物，其尚包含一載體。
如請求項7之組合物，其尚涵括一編碼細胞因子或生長因子之聚核苷酸。
如請求項1之組合物，其中該組合物之密碼子係針對哺乳動物之表現而經最適化。
一種分離聚核苷酸組合物，其包含至少一具有如SEQ ID NO：2、4、及/或6中之至少一者之核酸序列。
如請求項10之分離聚核苷酸組合物，其中該分離聚核苷酸尚編碼一細胞因子或生長因子。
如請求項10之分離聚核苷酸組合物，其尚包含一細胞因子、生長因子、抗病毒劑、佐劑、賦形劑、或其組合。
如請求項10之分離聚核苷酸組合物，其中該分離聚核苷酸編碼一多肽，其包含具有如SEQ ID NOs：1、3、及/或5中之至少一者之胺基酸序列。
一種多肽，其包含具有如SEQ ID NOs：1、3、及/或5中之至少一者之胺基酸序列。
一種如請求項14之多肽，其中該多肽至少部分經糖基化。
如請求項10之分離聚核苷酸組合物，其尚包含一載體。
如請求項16之組合物，其尚涵括一編碼細胞因子或生長因子之聚核苷酸。
如請求項10之組合物，其中該組合物之密碼子係針對哺乳動物之表現而經最適化。
一種免疫組合物，其包含至少一分離聚核苷酸，其中該分離聚核苷酸係選自由具有如SEQ ID NO：2、4、及/或6之核酸序列之分離聚核苷酸所組成之群之至少一者。
如請求項19之組合物，其含有足夠量之由具有如 SEQ ID NO：2、4、及/或6之核酸序列之分離聚核苷酸所組成之群之至少一者，以對抗一對象後續之病毒感染。
如請求項20之組合物，其投予至該對象後，相較未經足夠量之由具有如SEQ ID NOs：2、4、及/或6之分離聚核苷酸所構成之群之至少一者投予者，該對象在病毒感染後所產生之對病毒抗原具有專一性之抗體效價量增加至少2%。
如請求項20之組合物，其投予至該對象後，相較未經足夠量之由具有如SEQ ID NOs：2、4、及/或6之分離聚核苷酸所構成之群之至少一者投予者，由該對象之CD8陽性細胞在病毒感染後所產生之干擾素-γ量增加至少2%。
如請求項20之組合物，其投予至該對象後，相較未經足夠量之由具有如SEQ ID NOs：2、4、及/或6之分離聚核苷酸所構成之群之至少一者投予者，該對象血清溶液中之感染病毒之雞紅血細胞血球吸附量減少至少2%。
如請求項20之組合物，其投予至該對象後，該對象之感染後體溫維持在該對象感染前體溫之95%範圍中。
如請求項20之組合物，其投予至該對象後，相較未經足夠量之由具有如SEQ ID NOs：2、4、及/或6之分離聚核苷酸所構成之群之至少一者投予者，該對象之感染後失重係較少至少2%。
如請求項20之組合物，其投予至該對象後，相較未經足夠量之由具有如SEQ ID NOs：2、4、及/或6之分離聚核苷酸所構成之群之至少一者投予者，該對象之感染後存活率獲得改良。
如請求項20之組合物，其中該後續之病毒感染係流感病毒株H5N1。
如請求項20之組合物，其中該後續之病毒感染係病毒基因重配產物之流感病毒株。
如請求項20之組合物，其中該對象可對抗不同於初始病毒感染之另一分化枝系或次分化枝系之流感病毒之後續病毒感染。