TWI398272B - 化學定義的安定劑 - Google Patents

Description

化學定義的安定劑

本發明係關於包含胺基酸及糖的安定劑組成物，其中所有化合物皆為化學定義的；關於包含該安定劑組成物與生物分子及/或微生物的疫苗組成物；關於製備藥學組成物的方法，其包含將該安定劑組成物與生物分子及/或微生物混合；關於該安定劑組成物的使用，及由彼製備的疫苗。

在製造微生物及生物分子作為產品的生物藥學工業中，這些產品的安定性為主要議題。這些產品總是需要經過調製、貯存及運送。不可避免地受到所經歷時間中的溫度變化影響及其他物理或化學影響，製得的物質損失了其原有的有效量或想要的定性特性。結果，便使用為預防該品質及/或有效量的損失之條件和添加劑。

用以安定化的條件多數為在高於或低於0℃的低溫下貯存，及降低水含量；特別有用的是冷凍乾燥。

在將含有生物或藥學活性的分子、微生物、細胞或組織的樣品冷凍乾燥時，首先為冷凍，再則於真空下乾燥。然後經冷凍乾燥的樣品保存在例如4℃下，並常可維持安定多年。參見評論：M.Pikal,1990(BioPharm,vol.3,no.8,p.18－27及no.9,p.26－30)；L.Gatlin,等人，1994(Bioprocess Techn.,vol.18,p.317－367)；J.Carpenter等人，1997(Pharm.Research,vol.14,p.969－975)；F.Bedu－Addo,2004(Pharm.Tech.,2月1日，p.10－18)。

理想上，經冷凍乾燥的產品在一段時間中，冷凍乾燥的成份具有幾乎不變的品質及量，以及冷凍乾燥體或吸引人及漂亮外觀的結塊可抵抗運送的物理影響，且在稀釋劑中的還原會快速溶解。

為了達到對於冷凍乾燥樣品所有的這些要求，並使樣品在冷凍乾燥方法(冷凍、乾燥、加熱、冷卻)本身過程中、延長貯存於冷凍乾燥的狀態、及還原的各種不利條件中「存活」，通常在冷凍乾燥之前，會將待冷凍乾燥的樣品與安定化組成物混合。

安定劑組成物的化合物通常稱為：增積劑、結塊生成劑、凍乾保護劑(lyoprotectant)、張力(tonocity)修飾劑、界面活性劑、低溫保護劑、冷凍保護劑、乾燥劑、冷凍乾燥劑等，其中特定的化合物可具有多種功能。

詞語「相容的溶質」也用以指示將分子及生物安定在低水份環境中的化合物(M.S.da Costa等人，1998,Adv.Bioch.Eng and Techn.,vol.61,p.117－153)。

不論是用以冷凍乾燥或其他安定化用途的安定化組成物皆為蛋白質、碳水化合物、脂質及鹽類混合物的錯合物，該組成物可因待安定化的每一分子或微生物、或特定用途而調整。

雖然很少確實知道安定劑如何作用，常見的發現為大分子量的化合物一般會提供良好的安定化效果。所以，在過去安定劑中所使用的成份為該大的化合物。為了保持低的物質成本，常取材自容易取得的動物來源產品，例如奶粉、胰醣、明膠、血清蛋白、膠原、酪蛋白水解物、硫酸軟骨膠等。

不幸的是，使用該動物來源的化合物容易引致受到其他滅菌或控制產品的外來藥劑污染的風險。因為物種內的人畜疾病的發現及新發現與傳染性蛋白質有關的疾病，此已經成為主要的考量。結果，管理當局要求在(安定化的)生物產品釋出至市場之前，需要對是否含外來藥劑進行嚴密安全測試。

此已經導致放棄使用上述的動物成份，初步地僅於製造生物分子或微生物時所使用的培養基。例如B.Makoschey等人(2002,Cytotechnology vol.39,p.139－145)說明已製成不含血清之用於安定化病毒的冷凍乾燥安定劑；該安定劑包含糖、胺基酸、明膠及取自動物來源的蛋白質水解物的胜肽。

之後，也對在製造之後使用的安定劑進行其組成的修飾；結果，安定劑組成物發展成：不含血清(無動物血清)、不含蛋白質(無動物蛋白質，但可含有其他動物衍生的成份)、或甚至不含動物的化合物(ACF)(不含任何衍生自動物的成份)。

然而，在安定劑組成物中，仍然因其安定化的效果而需要高分子量的大分子。所以，從例如植物或微生物來源取得對ACF安定劑的增積化合物，例如yeastolate(酵母菌萃取物)、大豆消化蛋白質、重組的明膠、(羥基－乙基－)澱粉、褐藻酸酯等。

或是使用天然或合成來源的大型聚合型化合物，例如：聚糖、聚乙烯四氫吡咯酮、ficoel(聚蔗糖)、聚離胺酸、聚乙二醇、(羧－)甲基纖維素、糊精、聚山梨醇酯(例如Tween80)等。例如T.Osterberg等人(1997,Pharm.Res.,vol.14,p.892－898)以Tween80取代血清蛋白，作為因子VIII蛋白的安定化化合物。

然而，仍有一些與這些ACF安定劑化合物有關的問題。例如，一些這類安定用化合物無法抵抗熱滅菌，且因為安定劑組成物的滅菌往往是絕對必要的，唯一達成此目的的其他方法為利用更繁複的過濾滅菌方法。

而且，當對標的人類或動物投以安定化產品時，一些ACF安定劑化合物因為有毒或可能導致過敏反應而無法使用。

然而，在所有這些情況下最重要的問題是，即使是ACF，安定劑組成物仍然有其含有或由未知、異質的且定義不清的成份而構成之常見的缺點。例如，天然植物產品水解物的組成物一點也不清楚。同樣地，所提及的聚合物結構其化學結構僅知道其一般的用語；使用的化合物僅以其具有的平均分子大小或支鏈的平均長度加以定義。所以，這些分子實際上含有分子廣泛變化之一群化學結構。

所以，該化合物仍然有定義不清的特性，且有許多的變化。此需要仔細的選擇，以供製造安定劑組成物的適當批次所用的起始化合物。具有想要的品質之化合物批次，才會有有限度的可利用性。

使用該定義不清的安定化組成物會導致受這些組成物所安定化的產品之組成、品質與產量未知且無法控制的變化。

對於嘗試要製造一致的、安全、高品質產品且僅能以對原料的選擇、進入的貨品認證、產品釋出及最終產品的品質控制之耗錢與耗時的程序加以克服之工業而言，極不希望如此無法控制的產品品質。

本發明之目的係要提供替代與增進的安定劑組成物，而不會有先前技藝的這些缺點。

令人驚訝的是，已發現包含至少一種胺基酸、及至少一種糖且其中所有化合物皆為化學定義的安定劑組成物，可提供生物分子與微生物的品質和量上足夠的安定，而不需要高分子量、大的或定義不清的化合物。此更勝先前技藝而提供許多優點。

本發明的安定化組成物不含血清、不含蛋白質且不含動物化合物，所以不會使已受安定化之控制的產品引進任何外來藥劑。且安定化組成物不需要加入定義不清、異質或未知的化合物，此在產品安定化中產生可預期且可控制最終產物的結果。此二方面減少了控制最終產物的品質及外來藥劑的需求。

安定化組成物僅包含確切已知的化合物，不會有許多變化、或使具有所需的有利特性之批次的可利用性受限。此減少進料控制與對起始物質選擇的需求。而且，如本發明的安定化組成物對標的人類或動物無毒，且可熱滅菌。

此安定化組成物對生物分子與微生物抵抗物理及化學影響提供良好的安定性，特別是其使該樣品抵抗時間與溫度變化所經歷的負面影響，樣品的品質與有效量能受到安定。

當使用於冷凍乾燥時，安定化組成物使生物分子與微生物安定，抵抗冷凍、乾燥、加熱、冷卻的製程條件，以及抵抗在長期貯存於冷凍乾燥狀態下與還原時的任何負面影響。

安定化組成物也提供冷凍乾燥體或吸引人及漂亮外觀的結塊可抵抗運送的物理影響，並在還原時可快速溶解於稀釋劑中。

所以，本發明係關於包含至少一種胺基酸及至少一種糖的安定劑組成物，其特徵在於所有化合物皆為化學定義的。

「安定劑組成物」定義為當與生物分子或微生物混合時具有安定化效果的組成物，亦即安定劑組成物可避免大程度損失含有生物分子及/或微生物之樣品的品質或有效量。

「有效量」例如為生物性或藥學活性之生物分子的量、或活的或傳染性微生物的數目。

「品質的損失」另外可因物理及/或化學影響而產生，如溫度隨時間的變化、機械影響(如運送)及/或物理形式的改變(如冷凍、乾燥)。

安定劑組成物可為水性溶液、水性濃縮液的形式，或以適合用以製備本發明的安定劑組成物的水性溶液或水性濃縮液之乾燥的化合物混合物提供。

待安定化的生物分子及/或微生物在與安定劑組成物混合之前，其本身可為液體、乾燥、冷凍、或冷凍乾燥的形式。

微生物可為活的或死的，例如經過去活化者。

「糖」一般已知為產生甜或微甜味的化合物，且更明確而言為如單或雙醣、糖醇、多元醇、及其衍生物的碳水化合物。

對於本發明，當完全由相同的分子所組成時，此化合物為「化學定義」的。

所以，此化學定義的化合物具有明確已知、不混淆、及一致的化學結構，且其以明確已知的量使用。

所以，本發明的安定劑之化學定義的化合物並非定義不清、異質或未知的化合物，如蛋白質系乾燥物、萃取物、水解物、或胜肽混合物。而且，在本發明安定劑的組成物中不含僅知其中的平均分子量或支鏈平均長度的聚合型化合物。

本發明的安定劑之化學定義的化合物容易取自商業的精密化學品供應商，較佳為使用最高純度者。然而，化學定義的要求並不排除在該化合物中存在微量的雜質。該雜質例如為重金屬、殘渣、溶劑或類似者。較佳的是該雜質以低於化學定義的化合物之1重量%存在，更佳為低於0.1、0.01、0.001或0.0001重量%。

較佳的是當在水性溶液中以離子化形式存在時，化學定義的要求係與本發明安定劑的化合物分子有關。結果，在一較佳具體實例中，該化學定義的化合物可以其固體或非離子化形式存在於不同鹽形式中、或為不同數量的結晶水結合分子的形式(水合形式)。

較佳的是本發明的安定劑組成物對生物分子及/或微生物所提供安定性至少與先前技藝之包含定義不清的化合物的安定劑有相同的水準。

較佳的是，當使用本發明的安定劑組成物以安定含有活的微生物產品時，其效價損失低於1 Log_{1 0} 。更佳為低於0.5 Log_{1 0} 。

然而，並非總是需要如此：對於某些應用，在安定劑及最終產物中不含有定義不清的化合物是極重要的；因使用本發明的安定劑組成物而在品質及/或量上產生略低的結果在交換勝過先前技藝安定劑的許多優點的情況下是完全可接受的。

例如，在當本發明的安定劑用作為，例如，在甘油中貯存的微生物種子物質的長期貯存時的安定劑之情況。在此情況下，由完全定義的安定劑所得之ACF安定化作用可能更為重要，且高達2 Log_{1 0} 的效價損失是可接受的，無論如何，就種子物質本身而言通常是培養至正確的量，再接種至新的培養基。

而且，熟悉先前技藝者可完美地進一步以常規的實驗最佳化至例本發明的安定劑組成物的組成、或其使用條件。所以，該最佳化組成與條件皆在本發明的範圍內。

為了評估安定的水準(相當於安定化產品的剩餘有效量及品質)，任何適合技術皆可使用。例如，病毒及細菌性化合物的量及毒力(即為品質)可用滴定或有限(limiting)稀釋而量化；可用生化(如酵素)、免疫學(免疫螢光測試)、或物理(如電泳、層析或質譜法)檢測生物分子。所有這些技術皆相當有名且在技藝中皆可得。

在一較佳具體實例中，本發明的安定劑組成物另外包含至少一種多元胺。

「多元胺」係定義為具有二個或多個胺基官能基的化合物。

在更多較佳具體實例中，本發明係關於本發明的安定劑組成物：－其中該糖為選自葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、山梨醇及甘露糖醇中至少一者；－其中多元胺為選自乙二胺、1,5－戊二胺(cadaverine)、1,4－丁二胺(putrescine)、亞精胺及精胺中至少一者；－其中該胺基酸為麩胺酸鹽(麩胺酸)或甘胺酸，或此二種胺基酸均包含在內。

在進一步更佳的具體實例中，本發明的安定劑組成物為緩衝的水性溶液；較佳的是該緩衝溶液於pH 6－8之間緩衝，更佳為約pH 6.9。

此緩衝劑例如為Tris/檸檬酸鹽，較佳在濃度約50 mM/10 mM。

緩衝劑較佳為磷酸系，更佳為磷酸二鈉二水合物。

緩衝劑較佳含量介於0.1至100 g/l，更佳約1 g/l。

在另一更佳的具體實例中，本發明的安定劑組成物的水性溶液為濃縮溶液，包含安定劑組成物的化合物濃度高於這些化合物在以本發明的安定劑組成物與待安定的生物分子或微生物混合而產生的最終藥學組成物中的濃度。

較佳的是安定劑組成物比最終藥學組成物中的濃度或量濃縮2x、3x、4x、5x、10或20x：更佳的是安定劑組成物為濃縮4x。

在一更佳的具體實例中，提供可適合溶解在適當溶劑中的化學品之乾組成物，以製備水性溶液或本發明的安定劑組成物的濃縮液。

對之後的溶解提供乾的化學品混合物具有小體積貯存的優點。如此可節省貯存空間，並有利於運送與銷售。

甚至更佳的是本發明的安定劑組成物中：－糖為蔗糖、山梨醇或甘露糖醇，較佳為山梨醇，更佳為D－山梨醇；－胺基酸為麩胺酸鹽或甘胺酸，更佳為L－麩胺酸鹽，甚至更佳為L－麩胺酸鹽與甘胺酸均包含在內；－使用多元胺的組合物，更佳為精胺及1,4－丁二胺或精胺及乙二胺。

本發明安定劑組成物的進一步更佳的具體實例，4x濃縮液包含：－糖的量介於10至200 g/l，較佳為約75 g/l；－胺基酸的量介於0.1至400 g/l，較佳的是含有L－麩胺酸鹽約20 g/l或含有甘胺酸約160 g/l；－多元胺的量介於0.1至100 g/l，較佳的是含有精胺約10 g/l或含有亞精胺約2.5 g/l。

在進一步的較佳具體實例中，本發明的安定劑組成物包含糖及作為胺基酸的麩胺酸鹽，且另外包含至少一種可相容的溶質。可相容的溶質較佳為選自N－甲基甘胺酸(sarcosine)、甜菜鹼、二－甘胺酸、及膽鹼中至少一者。4x濃縮液中可相容的溶質含量較佳介於0.1至400 g/l，較佳介於50－200 g/l，更佳為約160 g/l。

如上述，使用安定劑組成物的化合物之鹽或水合物的形式並無關係，例如精胺可以用精胺、精胺二水合物、或精胺四鹽酸鹽的形式；同樣地，可使用亞精胺或亞精胺三鹽酸鹽作為亞精胺。

如本發明的安定劑是要與生物分子及/或微生物混合，在有些用途時，安定劑的化合物可為要對標的人類或動物投藥的產物之一部份。所以，本發明的安定劑組成物的化合物較佳為無毒的，至少在待投藥的最終產物中所含的濃度下為無毒的。

本發明安定劑組成物的化合物較佳為不會誘發非所欲的過敏反應者。

較佳的是本發明安定劑組成物為無菌的。本發明安定劑的滅菌可由熱、過濾、照光或此技藝中所知的任何適當技術而達成。較佳的是安定劑組成物是以熱滅菌的。

藉由非限制的實例，表1列出適用於本發明安定劑組成物的化學定義之化合物。

如先前技藝所知，在此所述本發明的安定劑組成物化合物的衍生物為可取得，或也可合成。該衍生物也適用於作為本發明的安定劑組成物化合物。所以，該衍生物在本發明的範圍之內。

以本發明的安定劑組成物進行大量的實驗。這些係設計成納入所有本發明的安定劑組成物可提供有效安定性的條件：－冷卻，將(總體)產物以液體形式貯存於例如4℃－冷凍，將(總體)產物以低溫冷凍貯存於例如－20℃，或－45℃－冷凍乾燥，使用：乾燥、加熱、冷卻－將經冷凍乾燥的產物冷凍，以低溫冷凍貯存於例如－20℃，或－45℃－將經冷凍乾燥的產物冷卻，貯存於例如4℃－將經冷凍乾燥的產物加熱，至溫度高於室溫，及－在稀釋劑中將經冷凍乾燥的產物還原。

當這些實驗以包含微生物的安定化組成物進行時，以滴定或有限稀釋為基礎的知名量化技術，測定還原產物中活的感染性微生物的剩餘數目。當以生物分子進行時，使用如滴定、酵素免疫測定法(Elisa)或生物分析之特定分析法加以測定質與量。

這些實驗及其結果摘錄於實例中，並顯示本發明的安定劑組成物對微生物及生物分子提供有效的安定，不僅用於冷凍乾燥及接近冷凍乾燥的各種用途，也用於在冷卻或在冷凍階段、在冷凍乾燥之前或取代冷凍乾燥的總體抗原的安定。

在另一具體實例中，本發明的安定劑組成物其特徵在於不含高分子量或大尺寸的化合物。

就本發明而言，「高分子量」及「大」的化合物其定義為任何具有分子量或分子離子的尺寸超過203 Da的化合物。例如，精胺不會是該大的化合物，因當排除任何結晶水或如水合物或氯化物(氫)的鹽形式時，其分子離子的分子量僅為202 Da。

如上所述，令人驚奇的是發現不需如先前技藝中要達到有效安定化所常用的大型化合物，事實上不需要有比精胺大的化合物。

也已經提及其優點，高分子量、大的化合物常為定義不清且異質性，或至佳也僅為知道其平均分子尺寸或支鏈平均長度的化合物。結果，將該定義不清的化合物使用於安定劑的組成物中時，會導致受安定產物出現不可預期的特徵。

在另一較佳的具體實例中，本發明係關於包含本發明的安定劑組成物的疫苗組成物，以及至少一種生物分子或至少一種微生物、或其組合。

在先前技藝中常為已知的疫苗組成物係代表包含在藥學可接受的載體中可產生免疫性的化合物之組成物，其可產生免疫性的化合物，可誘發標的物免疫系統的被動或主動的活化。誘發的免疫反應意為干擾特定感染的形成或進行、或改善疾病的症狀。

藥學可接受的載體可為例如滅菌的水或滅菌的生理食鹽水。載體更複雜的形式可為例如緩衝劑。

就本發明的「生物分子」係理解為可在自然界中發現的分子，特別是此係指蛋白質、碳水化合物、脂質或核酸。此分子的來源可為生物或合成的、衍生自活體外或試管外。

詞語「蛋白質」意為使用具二個或多個胺基酸的分子鏈，所以胜肽、寡聚胜肽及聚胜肽皆包含在蛋白質的定義中。

本發明的疫苗組成物可為任何形式，例如：冷凍乾燥、液體、或冷凍的；或視所要的貯存、運送或對標的物的使用方法而定，可調製或處理成液體、凝膠、軟膏、粉、錠、膠囊、或冷凍乾燥體。

本發明的疫苗組成物可包含單個產生免疫性的微生物及生物分子或其組合。

在一較佳具體實例中，本發明係關於疫苗組成物：－其中該微生物為病毒或細菌，或病毒與細菌二者皆包含於其中；更佳的是病毒為至少一種選自疱疹病毒、副黏液病毒、正黏液病毒、腺病毒、桿狀病毒、雙股核糖核酸病毒、冠狀病毒、肺炎病毒及痘病毒之病毒物種；甚至更佳為病毒係選自牛疱疹病毒、牛副流行性感冒病毒3、假性狂犬病毒、人類呼吸道細胞融合性病毒、及人類或動物的流行性感冒病毒；更佳的是細菌係選自鏈球菌屬、葡萄球菌屬、大腸桿菌屬、黴漿菌屬、愛德華屬(Edwardsiella)、弧形菌屬、及沙氏桿菌屬的細菌物種；－其中該生物分子為選自蛋白質、碳水化合物、脂質及核酸中至少一者；更佳的是該蛋白質為選自抗體、抗體片段、細胞激素、荷爾蒙及酵素中至少一者。

抗體片段例如為Fab片段及單鏈抗體。與本發明的安定劑組成物一起使用的荷爾蒙例如為胰島素、促性腺素的荷爾蒙，如激濾泡素、人類絨毛促性腺素及紅血球生成素。

本發明的疫苗與安定劑組成物可與多種的病毒(任何基因或形態的類型，對任何動物物種或對人類有感染力的病毒)一起使用。特別是任何對動物病毒的安定上所代表的結果可直接外插，以預測感染其他宿主物種(動物或人類)的相對應病毒與在其病毒科之內其他病毒物種之安定的結果。

具有病毒包膜的病毒對化學及物理的影響特別敏感。結果，此種病毒可被本發明的安定劑組成物有效地安定，此更進一步證實其效果。

用於本發明的安定劑的細菌實例可為任何類型，例如具有染色的格蘭氏(Gram)陽性或格蘭氏陰性之特徵者。

將這些細菌安定後所獲得的結果可外插至在提及的菌屬內的其他細菌物種。

用於製造生物分子及微生物以用於本發明安定劑的製造系統可為任何試管內及活體內的系統。例如可在細胞培養基中、受精的雞蛋上、或宿主動物中製造病毒；可使用類似的技術製造細菌，且另外可在培養液中；且可從動物或微生物分離以製造生物分子，特別是可有利地使用重組合表現系統。

然而，要達到經安定的最終產物的最佳安全性與可預測性，要將未知的、異質且定義不清的成份從製造階段與安定劑組成物中去除。

所以，本發明疫苗組成物的較佳具體實例中，生物分子或微生物、或二者係以不含動物成份的形態製得。

ACF製造系統例如為在ACF基質中細胞上的病毒培養；為ACF培養液中的細菌培養；及使用ACF基質的重組合表現培養基，例如使用昆蟲細胞的桿狀病毒(baculovirus)表現系統。在其他較佳具體實例中，本發明的疫苗組成物另外包含佐藥。

佐藥常用以推動對疫苗成份的免疫反應，在非特定方式下，以刺激標的人類或動物的免疫系統。先前技藝中已知許多不同的佐藥，例如：礦物或生物性油類、皂素、胜肽、氧化鋁及衍生物等。

在其他較佳具體實例中，本發明的疫苗組成物為冷凍乾燥的。

冷凍乾燥形式之本發明的安定劑組成物是最有利的，冷凍乾燥之本發明疫苗組成物可在例如＋4℃下安定數月至數年。

冷凍乾燥的程序在先前技藝中為已知，可由市面上購買得到不同規模的冷凍乾燥設備。本發明之含有安定劑的疫苗組成物填充於如玻璃樣品瓶中至一定的體積，例如介於0.5至50 ml，較佳為1、2或5 ml。隨後，將這些樣品瓶冷凍，並送至冷凍乾燥程序。

概述示範的冷凍乾燥程序，其包含下列步驟：－低溫冷凍維持10－60分鐘，以將液體固定成特定結構；－第一乾燥步驟，於－20至20℃的高真空下維持1－12小時，以將結晶水昇華；－第二次乾燥，於0至40℃的中等真空下維持1/2－6小時，以將未冷凍的水脫附；－將冷凍乾燥體包裝(以橡膠塞密閉玻璃樣品瓶)，以維持乾燥狀態，例如在真空下或氮氣中；且－保存於＋4℃。

熟悉此項技藝者對該程序很能夠做出例行的變化與最佳化，以達到特定種類樣品的最佳結果。

冷凍乾燥方法可由乾燥程序中監測設備內的溫度及水含量而最佳化。而且，例行地使用示差掃描熱析法，以評估產物在冷凍乾燥前後的特徵。

在最終產物中的剩餘水含量(rwc)為決定冷凍乾燥產品安定性的重要參數。較佳的是，本發明的冷凍乾燥樣品與疫苗的rwc低於5%。為決定rwc，可有利地使用先前技藝中已知的卡費雪(Karl Fischer)滴定。

在其他較佳具體實例中，本發明的冷凍乾燥疫苗製備成如歐洲專利EP 799.613中所述的冷凍球(lyosphere)的形式。

由本發明的疫苗組成物製得的冷凍乾燥體可為任何形式。本發明的安定化組成物對疫苗組成物提供有利的特徵，以達到冷凍乾燥體的漂亮或吸引人的外觀。較佳的是，在玻璃樣品瓶中的冷凍乾燥塊為閃亮、均質的外觀，對其輕拍時較佳為附著在樣品瓶的牆壁，且在正常的運送條件下，不容易破碎成粉狀。

結果，所欲的冷凍乾燥疫苗體的外觀不僅與主觀或美質的特徵有關，也包含真正有利的技術效果；特別是安定化效果，包含抵抗運送的嚴苛條件及重新溶解的速度。

特別考量的是避免先前技藝中已知的「崩散」外觀，因具有此不定型及團狀外觀的冷凍乾燥體重新溶解緩慢且不完全，對所保存的生物分子及/或微生物無法提供適當的安定化。

在其他較佳具體實例中，在藥學可接受的載體中還原本發明冷凍乾燥的疫苗組成物，即可獲得馬上可使用的疫苗溶液。

因本發明之冷凍乾燥的疫苗組成物溶解快速，較佳的是在疫苗溶液於使用於標的對象之前才進行還原。如此可確保疫苗溶液新鮮且為所要的劑量與品質。

本發明的疫苗組成物可依據先前技藝中已知的方法，投服於人類或動物標的。例如，以如經由注射進入的所有途徑或經由皮膚之非經腸的應用：例如肌內、靜脈內、腹膜內、皮膚內、黏膜下、或皮下。可行的替代使用途徑為以液滴、噴霧、凝膠或油膏對眼睛的黏膜上皮、鼻子、嘴巴、肛門、或陰道、或身體任何部位的外皮表皮上的局部使用；以霧劑的噴霧、或粉末。或是，以經由消化道途徑之使用，與食物、飼料或飲水混合，例如以粉末、液體、或顆粒，或以液體、凝膠、顆粒或膠囊直接投入口中，或以栓劑進入肛門。也可有利地使用浸泡接種。

較佳的使用途徑為肌內或皮下注射、或鼻內噴霧。

不用說最佳的使用途徑當然與待預防與改善的特定感染或症狀的特殊性、使用的疫苗調製品特徵、以及標的物種的特定特徵有關。

本發明疫苗組成物對人體或動物的使用計畫可為單次或多次劑量，可同時或連續給予，以與藥劑或調製物相容的方式，及以免疫學有效的量，例如以每一年的劑量。

在另一具體實例中，本發明係關於製備藥學組成物之方法，包含將本發明的安定劑組成物與包含至少一種生物分子或至少一種微生物、或其組合之組成物混合。

由本發明之方法製備的藥學組成物可為任何形式：液體或乾燥、冷凍、冷凍乾燥等。

可使用先前技藝中可得的任何適當技術進行混合。

較佳的是本發明的方法包含將1份4×濃度之本發明的安定劑組成物作為滅菌的水性緩衝溶液與3份包含至少一種生物分子及/或至少一種微生物的組成物混合，以製造本發明的藥學組成物。

待與本發明的安定劑組成物混合的該組成物包含至少一種生物分子或至少一種微生物、或其組合，較佳為液體形式。此組成物可由病毒或細菌培養基、或表現系統培養基獲得。此組成物可例如在下游處理(例如離心)，例如，培養基的澄清液、或(重新懸浮的)離心團塊(包含受病毒感染的細胞或細菌)後而獲致；或者可由未處理的整個培養獲致。

較佳的是，本發明之安定劑組成物與包含生物分子及/或微生物的組成物的混合可在製造及下游處理已完成後旋即進行，以達到最佳的安定結果。

較佳的是，所獲得之經安定的藥學組成物在冷卻或冷凍下貯存，等待進一步的處理以及控制生產產品的品質結果。

本發明之方法的較佳具體實例：－微生物為病毒或細菌，或病毒與細菌二者均包含在內。

－病毒為至少一種選自疱疹病毒、副黏液病毒、正黏液病毒、腺病毒、桿狀病毒、雙股核糖核酸病毒、冠狀病毒、肺炎病毒及痘病毒之病毒物種。

－生物分子為選自蛋白質、碳水化合物、脂質及核酸中至少一者。

－蛋白質為選自抗體、抗體片段、細胞激素、荷爾蒙及酵素中至少一者。

－生物分子或微生物，或二者，係以不含動物成份的形態製得。

－所得的藥學組成物進行冷凍乾燥。

在一更佳的具體實例中，本發明係關於以本發明的方法而獲得的藥學組成物，其中該組成物為疫苗。

在進一步更佳的具體實例中，本發明係關於製備疫苗溶液的方法，其將本發明的藥學組成物於藥學可接受之載體中還原。

在另一具體實例中，本發明係關於本發明的安定劑組成物之用於安定組成物中至少一種生物分子或至少一種微生物、或其組合的品質及/或量的用途。

本發明的用途之較佳具體實例：－微生物為病毒或細菌，或病毒與細菌二者均包含在內。

－病毒為至少一種選自疱疹病毒、副黏液病毒、正黏液病毒、腺病毒、桿狀病毒、雙股核糖核酸病毒、冠狀病毒、肺炎病毒及痘病毒之病毒物種。生物分子為選自蛋白質、碳水化合物、脂質及核酸中至少一者。

－蛋白質為選自抗體、抗體片段、細胞激素、荷爾蒙及酵素中至少一者。

－生物分子或微生物，或二者，係以不含動物成份的形態製得。

在一較佳具體實例中，本發明係關於本發明、本發明的疫苗溶液、或以本發明方法所獲得的疫苗溶液，於使標的人類或動物免疫上的用途。

參考以下的非限制性實例，進一步說明本發明。

如上所述，進行的冷凍乾燥實驗包含所有的有效安定劑必須能夠安定化的條件：冷卻、冷凍、乾燥、加熱。

於微生物的安定化中進行的冷凍乾燥實驗之一般概述如下：－由培養基所獲得之含有微生物的組成物，若需要則處理並貯存於4℃或低於零℃。

－將所要的化合物秤取所要的量，以製備本發明的安定劑組成物，將這些加至所要體積的滅菌蒸餾水中，並混合直到溶解。然後將安定劑組成物於121℃下加熱滅菌20分鐘。

－實驗開始時將樣品解凍，並與為樣品體積三分之一的4×濃縮安定劑的體積混合。使用本發明的安定劑或參考的安定劑組成物。實驗中也包含不具有任何安定劑的樣品。

－將安定化的樣品以一定的填充體積置入標準的10 ml玻璃樣品瓶中：BHV及PI3病毒為2 ml，PRV、黏液病毒、BRSV、EIV及BCV為1 ml。細菌樣品為每瓶填充2.5 ml。

－使用標準的二階段程序將樣品冷凍乾燥至剩餘水含量低於5%，然後在真空下以橡膠塞密封。

－之後，樣品貯存於4℃或更高溫度維持一段時間；欄中「直接4℃」結果為樣品於冷凍乾燥後在4℃下貯存少於1個月的滴定結果；欄中「3天28℃」結果為樣品冷凍乾燥後可能在4℃下貯存，於28℃下貯存3天，然後隨即在這3天後定量的滴定結果；欄中「1年4℃」結果為樣品於冷凍乾燥後在4℃下貯存至少1年的滴定結果。

使用在28℃下貯存3天作為加速安定度的分析；大多數這些結果可指示作為在室溫或冷卻的條件下貯存一段長時間的的結果。

為了測定在這些處理條件之後微生物剩餘的量與品質，將病毒進行感染性滴定，微生物樣品則進行培養皿計數。

BRSV滴定分析：

BRSV病毒的安定化樣品於含有FCS 10%(v/v)的0.2ml標準的細胞培養基中稀釋，稀釋成10^{－ 1} 及10^{－ 7} 之間。將此稀釋物接種於微滴定盤的井中之BEL細胞上：0.2 ml/井，1.5×10⁵ BEL細胞/ml。每個病毒稀釋使用10個井。培育微滴定盤8天(3－5% CO₂ ，37℃)。在室溫下於10－15分鐘中，使用丙酮/PBS 70/30% v/v加以固定。經固定的單層先與對BRSV為無性繁殖的抗體培育，其次與抗體FITC－共軛物＋伊凡氏藍(Evans blue)培育(為計數的染色)。已發展陽性螢光細胞的盤子記錄為陽性。依據Reed及Muench計算病毒的效價，並以TCID_{5 0} 表示病毒的效價。

在所有實驗中，每批次的病毒滴定皆包括同系列的標準病毒樣品及陰性控制。每天所有病毒滴定皆重複進行，表達平均的效價。

黏液病毒滴定分析：

以每毫升4×10⁵ 細胞、每井100 μl、於具有5%牛胎兒血清(FCS)及適當抗體的標準細胞培養基中，將RK13細胞植種於96個井盤中。此盤於37℃、5% CO₂ 的環境下隔夜培養。

次日，含有黏液病毒、經安定化的樣品稀釋成10^{－ 1} 至10^{－ 8} 。20 μl之每一病毒稀釋液接種在RK13細胞盤的井上重複三組。在37℃/5% CO₂ 下培養1小時後，100 μl含FCS的新鮮培養基加入井中，將這些盤另外培養2－3天，直到病毒班點清晰可見，且可讀CPE。

然後將盤清空，以萘黑的稀釋液染色，於室溫下培養1小時。再度將盤清空，以自來水清洗、乾燥，並使用光學顯微鏡讀取。

以Spearman－Karber演算法計算原始樣品中活的感染性黏液病毒的數目，並以TCID_{5 0} 表示。

BHV、PI3及PRV病毒滴定分析：

除了使用BHV及PI3病毒於JCK細胞、及使用PRV於Vero細胞以外，BHV、PI3及PRV病毒之經安定化的樣品以與黏液病毒類似的方式加以滴定。也使用光學顯微鏡計數斑點，以測定CPE。

BCV滴定分析：

以1×10⁵ 細胞/ml、200 μl/井、於具有10% FCS及適當抗體的DMEM培養基中，將MDBK細胞的細胞懸浮液置於96個井盤中。此盤於37℃、5% CO₂ 的環境下培養3天。在3天後，產生融合的單層。去除培養基，加入200 μl不含FCS的新鮮培養基，將盤培養2小時。由經安定化的樣品，以10倍稀釋的步驟製備BCV的稀釋液。再次清空微滴定盤，將10^{－ 3} 及10^{－ 8} 之間的稀釋液接種在MDBK細胞單層上。此盤培養5－6天。使用多株兔抗BCV血清及經山羊－抗－兔－FITC標記的共軛抗體，以免疫螢光計數觀察病毒的斑點。在以伊凡氏藍計數染色後，使用UV光顯微鏡計數斑點。以Reed及Muench演算法計算經安定化的樣品中活病毒的TCID_{5 0} 效價。

馬流行性感冒病毒

在雞蛋上滴定EIV；經安定的EIV樣品稀釋液接種在受精過、活的10天齡雞蛋的尿囊腔內，於40－42℃下培養3－5天。將蛋打開，使用雞蛋紅血球的血球凝集(heamagglutination)分析，測試尿囊腔液的樣品。以產生HA反應的最高稀釋液計算在原來樣品中活的感染性EIV數量。

在一些實驗中判斷冷凍乾燥結塊的品質。此包含樣品瓶的目視檢查及搖晃。

給予下列主觀的指示：＋精緻的外觀，良好的堅固結構0適當的外觀及結構－低於想要的外觀及結構

細菌

將震盪瓶中的原料物質於適當的標準生長基質中生長，獲得細菌培養物。其次，以重複計算血液－瓊漿盤上一系列的有限稀釋樣品，計算隔夜培養後出現的菌落數目，定量這些培養。對於有些實驗，在冷凍乾燥後回復的菌落數目以冷凍乾燥前原來培養中的菌落數目的%表示。

然後，對應的培養與1：4與4×濃縮之本發明的安定劑組成物混合，並進行標準的二階段冷凍乾燥程序。

對含有大腸桿菌的實驗，使用K12菌株，並使用不同的培養基：標準LB基質、具安比西林(ampicillin)的LB、及血液瓊漿基質。本發明的安定劑組成物之效果與含有蛋白的標準安定劑相當。

樣品在冷凍乾燥之前或直接在冷凍乾燥之後、或於28或30℃下培養3天後測試，同樣作為加速的安定性分析。

NB：在這些實驗中，安定劑組成物包含精胺或亞精胺。

為了參考的目的，比較性實例包含先前技藝習用的安定劑(Makoschey等人，上述)，此指示為「習用的安定劑」。

n.a.＝無法獲得

n.a.＝無法獲得

以先前技藝習用的安定劑進行比較性實例(Makoschey等人，上述)，此指示為「習用的安定劑」。

n.a.＝無法獲得 n.a.＝無法獲得 n.a.＝無法獲得

n.a.＝無法獲得

pH的變化指示於表中

Claims (22)

1. 一種呈冷凍乾燥形式之經安定化的疫苗組成物，其包含：一種安定劑組成物，其包含至少一種胺基酸、至少一種糖、及至少一種多元胺，其特徵在於該安定劑組成物中之所有化合物皆為化學定義的，及其中該至少一種胺基酸為甘胺酸(glycine)和麩醯胺酸(glutamine)二者；該糖是山梨醇；及該多元胺選自精胺(spermine)和亞精胺(spermidine)，及其中該安定劑組成物不包含分子量或分子離子的尺寸超過203Da的分子，及至少一種生物分子或至少一種微生物、或其組合，其中該微生物為病毒，及其中該安定劑組成物於4x(4倍)濃縮液中之組份包含：- 10至200 g/l的糖，- 0.1至400 g/l的胺基酸，及- 0.1至100 g/l的多元胺。
2. 如申請專利範圍第1項之疫苗組成物，其中該組成物為經緩衝的水性溶液。
3. 如申請專利範圍第2項之疫苗組成物，其中該緩衝劑為磷酸鹽系。
4. 如申請專利範圍第1項之疫苗組成物，其中該病毒為至少一種選自疱疹病毒、副黏液病毒、正黏液病毒、腺病毒、桿狀病毒、雙股核糖核酸病毒、冠狀病毒、肺炎病 毒及痘病毒之病毒物種。
5. 如申請專利範圍第1項之疫苗組成物，其中該生物分子為選自蛋白質、碳水化合物、脂質及核酸中至少一者。
6. 如申請專利範圍第5項之疫苗組成物，其中該蛋白質為選自抗體、抗體片段、細胞激素、荷爾蒙及酵素中至少一者。
7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之疫苗組成物，其中該生物分子或微生物，或二者，係以不含動物成份的形態製得。
8. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之疫苗組成物，其另外包含佐藥。
9. 一種疫苗溶液，其係藉由將經冷凍乾燥後之如申請專利範圍第1項之疫苗組成物於藥學可接受之載體中還原而得。
10. 一種製備藥學組成物之方法，其包含將如申請專利範圍第1項中所定義之安定劑組成物與包含至少一種生物分子或至少一種微生物、或其組合之組成物混合，其中該微生物為病毒。
11. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該病毒為至少一種選自疱疹病毒、副黏液病毒、正黏液病毒、腺病毒、桿狀病毒、雙股核糖核酸病毒、冠狀病毒、肺炎病毒及痘病毒之病毒物種。
12. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該生物分子 為選自蛋白質、碳水化合物、脂質及核酸中至少一者。
13. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該蛋白質為選自抗體、抗體片段、細胞激素、荷爾蒙及酵素中至少一者。
14. 如申請專利範圍第10至13項中任一項之方法，其中該生物分子或微生物，或二者，係以不含動物成份的形態製得。
15. 如申請專利範圍第10至13項中任一項之方法，其中將所得的藥學組成物進行冷凍乾燥。
16. 一種藥學組成物，其係由申請專利範圍第10至15項中任一項之方法所獲得，其中該組成物為疫苗組成物。
17. 一種製備疫苗溶液的方法，其係藉由將如申請專利範圍第16項之藥學組成物於藥學可接受之載體中還原而獲致。
18. 一種如申請專利範圍第1項中所定義之安定劑組成物的用途，其係用於安定組成物中之至少一種生物分子或至少一種微生物、或其組合的品質及/或量，其中該微生物為病毒。
19. 如申請專利範圍第18項之用途，其中該病毒為至少一種選自疱疹病毒、副黏液病毒、正黏液病毒、腺病毒、桿狀病毒、雙股核糖核酸病毒、冠狀病毒、肺炎病毒及痘病毒之病毒物種。
20. 如申請專利範圍第18項之用途，其中該生物分子為選自蛋白質、碳水化合物、脂質及核酸中至少一者。
21. 如申請專利範圍第20項之用途，其中該蛋白質為選自抗體、抗體片段、細胞激素、荷爾蒙及酵素中至少一者。
22. 如申請專利範圍第18至21項中任一項之用途，其中該生物分子或微生物，或二者，係以不含動物成份的形態製得。