1304094 玖、發明說明 發明所屬之技術領域 本發明係有關生物技術中蛋白質表現之領域。特別是 關於氨基葡萄糖苷抗性基因（尤指新霉素抗性基因）用於 達成動物細胞之高密度生長的用途，亦分別關於蛋白質生 產方法及高密度細胞培養物。 先前技術 生物技術上以動物細胞培養方式生產治療用蛋白質是 一項非常費力且昂貴的工作。包括下游加工之生產效率主 要係受到最初細胞培養步驟之空間-時間產率支配。自當希 望同時使培養物肉湯中之產物蛋白質達到高產率及高濃度 。結果，在進入工業規模細胞培養之生產穩定期前使最大 細胞密度達到較少量增加，將可希望使總產量增加，此僅 因爲於此方式中加入大量細胞總數。 強硬地視細胞種類及培養方法而定，習知適用於高密 度生長之補料-分批培養系統例如氣升式反應器並無法使生 長中不含血淸之細胞培養物達到或甚至高於ίο7細胞/毫升 的密度。有可能於補充血淸之補料-分批培養系統或於最近 之灌流反應器系統中達到較高密度。但是，該二種選擇皆 留下嚴重的缺點。經補充以胎牛血淸之培養基包含所有天 然生長促進物質，其強烈依賴血淸來源品質且（最重要的 )具有無心地將動物病毒導入生產供醫療用途之治療性蛋 白質之培養物中的永久性危機。因此基於調節性理由，須 避免血淸補充。 1304094 然而，灌流反應器系統較習知補料分批培養系統更爲 複雜，並需要在操作期間加以控制且在操作上更昂貴。此 係由於必須永久灌流新鮮培養基，其需要最新式微過濾系 統以供自該反應器平行釋出培養基。若過濾單元受細胞碎 片或蛋白質阻塞，則易使操作過程發生提早停滯的危險。 比較上，補料分批培養在製程經濟學及耐用性方面具有顯 著優勢。 而且，產生可製造所興趣蛋白質之穩定重組細胞株， 需要導入至少一種通常被固有表現的抗性標記基因。此類 標記基因之表現可能對細胞造成最好不會衝擊其生長行爲 的額外負擔，其或甚至在富含血淸補充之細胞培養基中亦 可能有害地影響生長速率及最大存活細胞密度（蓋格爾等 人’ 1999，氨基葡萄糖苷抗生性磷酸轉移酶亦爲絲胺酸蛋 白質激酶[Aminoglycoside antibiotic phosphotransferases are also serine protein kinases】，Chemistry and Biology 6，11-18 ;麥歐等人，1991，人類巨噬細胞及表現氨基葡萄糖苷 抗生性磷酸轉移酶活性之畸胎癌細胞系中由蛋白質激酶C 所介導的基因活化【Gene activation mediated by protein kinase C in human macrophage and teratocarcinoma cells expressing aminoglycoside phosphotransferase activity] ，J. Cell. Physiology 149，548-559 ;南方氏等人，1982，哺乳細 胞於SV40早期區域啓動子調控下經細菌基因轉形成具抗生 素抗性【Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with a bacterial gene under control of the SV40 early 1304094 region promoter】，J. Mol. Appl. Genet. 1，327-341 )。 發明內容 本發明之目的在於避免先前技藝所產生之缺點，並提 供一種使細胞於不含血淸之培養系統中生長達高細胞密度 的方法。此目的係藉由於動物細胞中表現氨基葡萄糖苷抗 性基因，其後將該等細胞培養於適當培養基及根據申請專 利範圍第1，2，8等獨立項之適宜培養系統中而達成。意 外地，視習用於該項技藝之培養方法及培養基而定，經根 據本發明處理之細胞可於不含血淸之細胞培養基中生長達 到較其未經處理的親本細胞系局出甚多之密度。此外，亦 觀察到穩定期生長有些許延長。以此方法，可於不含血淸 之培養基中達到最大存活細胞密度，其係於本發明之前所 無法理解的。 根據本發明，氨基葡萄糖苷抗性基因產物係用於增進 動物細胞之高密度生長。該項根據本發明之用途包含於細 胞中表現該抗性基因產物，以其氨基葡萄糖苷會被該相對 應抗性基因產物分解之氨基葡萄糖苷抗生素（較佳地以抗 生性新霉素）檢選出表現此類抗性基因產物之細胞，及最 後於生物反應器例如氣升式或攪拌型生物反應器中，於適 宜不含血淸之細胞培養基中將此類細胞活化以達高密度生 長。 根據本發明之抗性基因產物爲任意氨基葡萄糖苷抗性 標記，例如已知對慶大霉素、新霉素、潮霉素（且尤其是 新霉素）之抗性基因，其可用做真核細胞之基因標記。氨 1304094 基葡萄糖苷抗性基因一般用於真核細胞分子生物學中且經 描述於許多標準教科書及實驗手冊中（例如，蕭等人， 1993，氨基葡萄糖苷抗性基因之分子遺傳學及氨基葡萄糖 苦-修飾酵素之家族關係【Molecular genetics of aminoglycoside resistance genes and familial relationships of the aminoglycoside-modifying enzymes ] ，Microbiol. Rev.
57:138-163 ; W〇82/03087 ;南方氏等人，1982，哺乳細胞 於SV40早期區域啓動子調控下經細菌基因轉形成具抗生素 抗性 【Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with a bacterial gene under control of the SV40 early region promoter】，J· Mol· Appl. Genet. 1，327-341 )。如上 所推論得，氨基葡萄糖苷抗性基因產物以其根據本發明之 氨基葡萄糖苷分解活性的觀點而言，係一種具功能性之基 因產物。因此依上述槪念，亦可將已知氨基葡萄糖苷抗性 基因產物之經遺傳工程改造所得的有義功能性變體用於本 發明。此類變體可例如藉由分別對胺基酸及其編碼DNA序 列進行取代、缺失、插入或截斷而產生。此等方法爲該項 技藝所熟知且通常包含定點突變或經由其隨機突變產生多 樣性，然後再以功能分析之方式篩檢得所希望的變體。用 於產生突變之例行方法可爲例如暴露至烷化劑或UV照射 、進行易錯（error-prone) PCR或相關之基因改組PCR技術 ，且通常係於微生物中完成（米勒，分子遺傳學實驗【 Experiments in Molecular Genetics】，冷泉港實驗室 1972 ; 林等人，1997，DNA致變方法【Approaches to DNA 1304094
Mutagenesis】，分析生物化學254，157-178 ;凱威爾等人 ，1992，藉由PCR致變作用之基因隨機化：於PCR方法【 Randomization of genes by PCR mutagenesis in: PCR Methods 】，冷泉港實驗室出版1992 ;幕爾等人，1997，蛋白質功 能活體外演化之策略【Strategies for the in vitro evolution of protein function】，J. Mol. Biol. 272，336-347 ) o 方便上，係從適用於真核細胞表現且經已知技術轉染 入細胞中之DNA表現構體表現該抗性基因產物；可固有表 現該抗性基因產物或可誘發其表現或壓制，亦即可以其中 任一種方式調控表現。至少於以氨基葡萄糖苷抗生素進行 篩檢期間，及於高密度細胞培養系統中達到最大細胞密度 之對數增長期間，應根據本發明表現該抗性基因。較佳地 ，其係於例如胸苷激酶(TK)或猴病毒（SV40)晚期啓動子調控 下固有表現，最佳地其係於在真核細胞中恆定具活性之強 病毒增強子-啓動子，例如Rous肉瘤病毒（RSV)-長末端重複 序歹[](LTR)-啓動子或巨細胞病毒（CMV)-啓動子調控下表現 。亦可利用由強病毒啓動子之增強子部份與另一啓動子， 例如提供必要如轉錄起始區、TATA區框及CAAT區框之α-肌動蛋白啓動子之核心啓動子部份所構成的嵌合型啓動子 根據本發明之氨基葡萄糖苷爲一般已知的氨基葡萄糖 苷類抗生素（明裘特-里樂克，Μ等人，氨基葡萄糖苷類： 活性與抗性【Aminoglycosides: acitvity and resistance】， 1999 5 Antimicrob. Agents Chemother. 43(4):727-737 )，其包 11 1304094 含至少一個藉由葡萄糖苷鍵與該分子之另半部結合的胺基-吡喃糖或胺基-呋喃糖。彼等之抗生素作用係基於抑制蛋白 質合成。態樣爲卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、妥布拉霉 素、G418(遺傳霉素）、新霉素B (法拉霉素）、紫蘇霉 素、阿米卡星、異帕米星等類。 於本發明之內文中，其他由於抑制細菌蛋白質合成而 具有抗生素活性之化合物例如奇放線菌素、茴香霉素與尤 其普羅霉素，及具有與非還原性胺基-糖部份相關之化學結 構的化合物，亦被認爲係根據本發明之“氨基葡萄糖苷抗 生素”，誠如該項技藝所常爲之。須注意，氨基葡萄糖苷 類化合物對真核細胞培養物亦具有毒性，部份係因爲粒線 體之蛋白質轉譯元件係由原核生物演化而來（粒線體演化 之內共生學說），而亦可能具有其他毒性作用且先前已有 描述。 根據本發明，爲篩檢可表現該抗性基因產物之細胞， 遂於轉染該抗性基因後至少實施以氨基葡萄糖苷抗生素進 行之抗性篩檢，其一般須達48小時至數星期。結果，該氨 基葡萄糖苷抗性基因被穩定轉染至該細胞系中。穩定的轉 染株一般係於其基因組插入至少一個該氨基葡萄糖苷抗性 基因的經表現或可表現拷貝，而產生具功能之基因產物。 最近在遺傳工程方面可想出的策略，例如於細胞中產生人 造、穩定之微型染色體亦包括於目前所提“穩定轉染株” 的槪念中。當然，根據已知之轉染方法例如脂質轉染法、 DEAE-葡聚糖、Ca-磷酸鹽或電穿透（皆爲根據本發明之可 12 1304094 用轉染方法），係首先將剛經轉染之細胞培養於未補充氨 基葡萄糖苷之培養基中，然後再於進行篩檢時添加此類補 料。此未篩檢之間隔期係爲有效表現該抗性標記基因產物 所需’且視細胞種類而定期範圍大約從12小時至1-2天。 較佳地，抗性篩檢係於轉染後進行至少2週，更佳地係於 轉染後進行至少5週，最佳地係於轉染後進行至少8週。 亦可能於生物反應器中進行發酵期間，在由已添加至該培 養基之氨基葡萄糖苷抗生素所產生之壓力下延長生長期以 進一步培養細胞。亦可於轉染株之最初篩檢後，在進一步 培養期間藉由重複添加單一劑量氨基葡萄糖苷，然後將該 培養基再以未補充氨基葡萄糖苷之培養基沖淨，而間隔地 施予短暫篩檢壓力。較佳地，於生物反應器培養期間，該 根據本發明之可表現或經表現抗性基因係穩定地整合入基 因組中，且該培養係於無篩檢壓力存在下進行。亦即，例 如於根據本發明另一較佳具體態樣之補料-分批生物反應器 中進行之細胞培養，係於無補充至該細胞培養基（發酵開 始或發酵期間）之氨基葡萄糖苷存在下完成。 較佳地，氨基葡萄糖苷之使用濃度爲至少0.1毫克/毫 升，較佳地濃度爲至少1毫克/毫升，最佳地濃度爲至少4 毫克/毫升。通常，係於經用以表現相對應抗性基因產物之 表現構體轉染後，將此量根據本發明之氨基葡萄糖苷如該 項技藝所熟知且如標準實驗操作手冊所述加至細胞培養基 中。於另一尤其較佳具體態樣中’係於轉染後連續細胞培 養期間，使用氨基葡萄糖苷濃度爲1至4毫克/毫升達至少 13 1304094 2週，更佳地達至少5週，最佳地達至少8週。 較佳地，根據本發明之抗性基因產物爲如W082/03087 中所述之新霉素-磷酸轉移酶（該抗性基因通常命名爲Neo’ )。此類磷酸轉移酶之各種天然同工型爲已知，且亦包含 於本發明範圍中。可使用以G418 (遺傳霉素，定義於化學 摘要註冊編號49863-47-0 )或新霉素進行之篩檢，以挑選出 表現該新霉素基因產物的細胞。於一項更佳之具體態樣中 ，係使用G418篩檢具抗性之細胞。 根據本發明之動物細胞或細胞系可爲任何用於生產重 組蛋白質之習知細胞系，例如Sf9昆蟲細胞、CH0細胞、 Hela糸田胞、C0S-7糸田胞、VERO-96糸田胞、HepG2糸田胞、BHK 細胞、纖維母細胞、融合瘤、EBV無限增殖化淋巴母細胞 、或“骨髓瘤”細胞例如NS0細胞系。骨髓瘤細胞例如 NS0細胞實際上爲B-淋巴細胞，而其於該項技藝中慣常被 歸於“骨髓瘤”（巴尼斯等人，Cytotechnology 32:109-123 ，2000)。 較佳地，根據本發明之動物細胞或細胞系爲不依賴貼 壁的細胞。此類細胞毋需仰賴基質接觸而得以適當生長， 且可自由懸浮於培養基中。於更佳之具體態樣中，該生產 細胞系爲淋巴細胞系例如融合瘤、EBV無限增殖化淋巴母 細胞或骨髓瘤細胞，最佳地該細胞系爲骨髓瘤細胞且尤其 是骨髓瘤NS0細胞例如細胞系ECACC No. 851 10503及其衍 生物，可免費索取自歐洲細胞培養物保藏所（ECACC)，應用 微生物學與硏究中心，薩里布利，威斯海爾SP4 0JG，英國 14 1304094 。NS0已發現可提升相當高的產量，尤其在用於製造重組 抗體方面。最標準之NS0細胞系爲膽固醇依賴性，使膽固 醇成爲培養基之必須組成份。 於另一較佳具體態樣中，根據本發明攜帶氨基葡萄糖 苷抗性基因之細胞系爲亦能夠進一步表現重組谷胺醯胺合 成酶（GS)之細胞系，其更佳地爲NS0骨髓瘤重組型GS細胞 系。NS0細胞若與谷胺醯胺合成酶（GS)表現系統使用時則特 別有利（貝賓頓等人，1992，自使用谷胺醯胺合成酶基因 做爲可擴增可偵測標記之骨髓瘤細胞高度表現重組型抗體 [High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selctable marker】，Bio/Technology 10:169-175 ; 寇特等人，1990，於使用谷胺醯胺合成酶基因擴增作用之 中國倉鼠卵巢（CH0)細胞中高度表現金屬蛋白酶之組織抑制 劑 [High level expression of tissue inhibitor of metalloproteinases in Chinese Hamster Ovary (CHO) cells using Glutamine synthetase gene amplification ] ，Bio/Technology 8:662-667 )。較佳地，該產物蛋白質基因序列及GS基因序 列係攜帶於供產生該經轉染NS0細胞系之單一 GS質體載 體上，且該等基因係從不同或相同使用（例如）內部核糖 體進入位置之啓動子表現。GS系統爲現今僅兩種供製造治 療性蛋白質之特別重要系統其中之一。相較於二氫葉酸還 原酶（DHFR)系統，GS系統（且尤指用於與NS0組合之GS 系統）於硏發期間提供極大時間優勢，因爲常可自原始轉 15 1304094 染株族群中產生具高產量之細胞系，而免除需要重複多次 漸增篩選劑濃度以達基因擴增之篩檢循環（布朗等人， · 1992，供使用谷胺醯胺合成酶(GS)系統製造重組抗體之製程 - 硏發[Process development for the production of recombinant antibodies using the glutamine synthetase (GS) system】， Cytotechnology 9:231-236 )。NSO骨髓瘤細胞在表現型上缺 乏谷胺醯胺合成酶。因此衍生自小鼠腫瘤細胞系之NS0細 胞系（賈佛瑞，G.與米爾斯坦，C.Methods in Enzymol. 73， 3-75，1981)常在工業規模上被選爲利用GS系統之細胞系 · 。此類細胞系之實例爲6Al-Neo細胞系，其於2002年8月 30依據布達佩斯條約以寄存編號爲02083031寄存於歐洲細 胞培養物保藏所(ECACC)，應用微生物學與硏究中心，波特 丹，薩里布利/威斯海爾SP4 0JG，英國。該已寄存之細胞 系缺乏重組型bcl-2，且經進一步描述於實驗段落中。此細 胞系與任何經工程改造以生產除cB72以外之抗體的親本子 代亦爲本發明之較佳具體態樣。此類工程可包含細胞融合 及緘默化或剔除特定基因，以及藉由致變方法產生重組體 ® 及產生變異株之較傳統技術（如前文詳述）或使所給細胞 培養基保留或改善親本細胞系生長特性之傳統培養基適應 技術。 於另一較佳具體態樣中，根據本發明用以高密度細胞 培養之細胞系缺乏經重組表現的bcl-2蛋白質、bcl-xl蛋白 質或其他具功能性（據瞭解爲防止細胞凋亡）之抑制細胞 凋亡-bcl-2家族的天然或經遺傳工程改造的變體（皮托斯等 16 1304094 人，2001，抗細胞凋亡蛋白質bcl-2之溶液結構【Solution structure of the antiapoptotic protein bcl-2】，Proc. Natl. Acad. Science U.S.A·，98，3012-3017 )，或 bcl-2 之種系類 似物例如依斯坦巴爾病毒之BHFR-1，或如皮托斯等人（前 述）所回顧描述之bcl-2功能類似物。此類較佳具體態樣可 權宜地與另一前述較佳具體態樣組合，亦即如所瞭解在發 酵期間無篩選壓力實則有氨基葡萄糖苷抗生素存在。意外 地，已發現氨基葡萄糖苷抗性標記與bcl-2之共表現對根據 本發明氨基葡萄糖苷抗性增進性細胞密度之功效而言是一 項難題。無意限定於理論，本發明之生長促進作用似乎並 非由於抗-細胞凋亡或以bcl-2爲主之影響所致，因爲在比 較性實驗中確實觀察到，例如bcl-2與Neo之共表現應較欲 達成高密度生長之難題更佔優勢。 適用於哺乳動物細胞系之適宜培養基與培養方法爲該 項技藝所熟知，例如描述於美國專利5633162號。用於實 驗室培養瓶或低密度細胞培養且適於特定細胞種類所需之 標準細胞培養基實例如：羅斯威爾派克紀念協會（RPMI) 1640 培養基（摩爾，G.，The Journal of the American Medical Association，199，ρ·519 f. 1967 )、L-15 培養基（ 賴柏維兹，A.等人，Amer. J· of Hygiene，78，1ρ·173 ff， 1963 )、杜貝可改進之伊格氏培養基（DMEM)、伊格氏極限 必須培養基（MEM)、漢姆氏F12培養基（漢姆，R.等人， Proc. Natl. Acad. Sc.53，p288 ff.1965 )、或缺乏白蛋白、轉 鐵蛋白及卵磷脂之艾斯可夫改進的伊格氏培養基（艾斯可 17 1304094 夫等人，J. Exp. med.，1，ρ·923 ff.，1978 )。已知此等培 養基可補充以胎牛血淸（FBS，亦稱爲FCS)，該後者提供 許多激素與生長因子來源。 於轉染及以氨基葡萄糖苷進行篩檢期間，可使用任何 適於使所培養之動物細胞持續生長的培養基。爲使動物細 胞於根據本發明之補料分批生物反應器中達高密度生長， 則必須使用高密度生長培養基。 根據本發明，若一種培養基可使動物細胞於習知補料 分批生物反應器系統中生長高達或超過存活細胞密度爲1〇6 細胞/毫升，則該培養基即被定義爲高密度生長培養基。於 本發明內文中，此類培養基再與前述氨基葡萄糖苷篩檢組 合時甚至可提升較高細胞密度。通常，此類根據本發明之 培養基將包含1-10克/升葡萄糖或其他能量來源，於補料_ 分批培養期間將葡萄糖濃度控制於此濃度。較佳地，該培 養基將包含至少2克/升葡萄糖，基本上於補料-分批發酵期 間被控制於此濃度。該培養基爲等張性，亦即範圍介於 270-320 m〇sm/公斤，較佳地爲280-300 mOsm/公斤。特定細 胞種類（例如淋巴細胞）對某種培養基之個別較佳性爲該 項技藝所熟知，且複雜地與各營養物之濃度範圍、比例及 個別劑量有關。相較於上述標準培養基，一些適用於例如 融合瘤之高密度生長培養基態樣係經描述於GB2251 249 A 中；此類高密度生長培養基一般可補充以諸如所有氨基酸 、能量來源如葡萄糖（濃度範圍如上述）、無機鹽類、維 生素、微量元素（定義爲通常以其最終濃度落於微莫耳體 18 1304094 積濃度範圍內存在之無機化合物）、緩衝劑、四種核苷類 或其相對應之核苷酸、抗氧化劑如谷胱甘肽（還原型）、 維生素c及其他組成如重要的膜脂質例如膽固醇或磷脂醯 膽鹼或脂質前驅物例如膽鹼或肌醇等營養物。高密度培養 基將富含大多數或所有此等化合物，且彼等（除需以其調 節實質等張性培養基之滲透莫耳濃度的無機鹽類以外）之 含量將較前述標準培養基更高（增養化），例如GB2251 249與RPMI 1640間之比較。較佳地，根據本發明之高密度 培養基係以所有氨基酸（除色胺酸外）量高於75毫克/升而 均衡地增養化。較佳地，結合對一般胺基酸之需求，谷胺 醯胺及/或天冬醯胺共同量高於1克/升，更佳爲2克/升高 密度培養基。無異議地，後述之較佳具體態樣較不適用於 經谷胺醯胺合成酶（GS)載體轉染之重組細胞系個案中。於 此類細胞系中，過量例如自外加及內在來源產生之谷胺醯 胺將導致氨產生（其應避免）0GS轉染細胞系之培養條件 敘述於下列實施例中。 權宜地，根據本發明之高密度細胞培養基缺乏胎牛血 淸（FCS或FBS)，稱之爲“不含血淸”。根據本發明不 僅希望以不含血淸之培養基使存活細胞密度高達或高於107 細胞/毫升，亦意外地發現補充胎牛血淸在至少某些於本發 明內文中所測試之細胞系難以達成高密度生長，此與習於 該項技藝人士所接受之一般槪念相左。生長於無血淸培養 基中之細胞需要胰島素與轉鐵蛋白以達最適生長。轉鐵蛋 白可至少部份以非肽類鐵載體如WO 94/02592中所述之環 19 1304094 庚三烯酚酮取代。大多數細胞系需要一或多種合成型生長 因子（包含重組型多肽類），其包括例如上皮生長因子 (EGF)、纖維母細胞生長因子（FGF)、類胰島素生長因子I及 II (IGFI、IGFII)等。可能需要其他類因子其可包括：前列 腺素、轉載蛋白予結合蛋白（例如血漿銅藍蛋白、高及低 密度脂蛋白、牛血淸白蛋白（BSA))、激素（包括類固醇激 素）及脂肪酸。最好以逐步方式進行多肽因子試驗，以測 試出該等於其存在下可刺激生長之新穎多肽因子。在動物 細胞培養領域中已知有數種可行方法，其中一例即列述於 下文中。最初步驟係獲得可使細胞從血淸-補充培養基繼代 後存活且/或緩慢生長達3-6天之條件。於大多數細胞種類 中，此條件至少部份爲接種密度之函數。一旦發現最適激 素/生長因子/多肽補充物後，即減少存活所需之接種密度。 於更佳具體態樣中，該細胞培養基不含生長因子，亦 即其中不含胎牛血淸或未添加可分別觸發訊號傳導及細胞 週期進行之實質上純的蛋白質生長因子。此類培養基尙可 包含其他蛋白質例如胰島素或轉鐵蛋白（可用於自培養基 徵集鐵）、或供遞送諸如膽固醇筹脂質所需之BSA。更佳 地，根據本發明係將此類培養基與淋巴細胞結合使用，最 佳地係與骨髓瘤細胞系（尤其是NS0細胞系）組合。 根據本發明之生物反應器爲分批生物反應器，例如慣 常用於高密度動物細胞培養之氣升式生物反應器或攪袢式 生物反應器。方便上，爲達高密度細胞培養此類生物反應 器將以補料-分批形式操作。此定義亦包括連續型補料操作 1304094 。較佳地，根據本發明之補料-分批生物反應器具有容羹_ 轉質係數Κβ (如於貝里，L等人，生化工程原理【 Biochemical Engineering Fundamentals 】，麥克勞·希爾， N.Y. 1986中所定義）爲至少6 h_1，更佳地爲至少10 h·1。 最佳地，一種具有該根據本發明較佳氧轉質特性之補料 批生物反應器爲氣升式生物反應器。氣升式生物反應器胃 習於該項技藝人士所熟知，且爲已知反應器設計之必要# 數（其回顧參見，例如吉斯提，M·等人，1987，氣升式反 應器【Airlift reactors】，Chem. Eng. Commun. 60，195-242 ;寇克，A.等人，1987，氣升-循環式反應器之轉質測量及 模型製作【Measurement and modeling of mass transport in airlift-loop reactors in relation to the reactor design】，Chem. Ing. Tech.，59，964-965 )。雖已自明但仍需在此強調，根 據本發明之補料-分批培養並不包含灌流培養系統。 於本發明內文中，高密度細胞培養係定義爲具有存活 細胞密度爲至少或高於1〇6細胞/毫升，較佳地爲至少或高 於1〇7細胞/毫升，更佳地高於1.23XU)7細胞/毫升，最佳地 高於1.3 X107細胞/毫升之動物細胞族群，且該族群已於細 胞培養基中於恆定或漸增培養體積中連續地自單一細胞或 接種較低存活細胞密度下生長而得。 於另一較佳具體態樣中’該補料-分批培養爲一種其中 除藉由分別補料以控制葡萄糖濃度外，亦至少將谷胺醯胺 (視需要地與一或數種其他氨基酸，較佳係甘胺酸）補料 至細胞培養物中（如GB2251 249所述）以維持彼等在培養 1304094 基中所存之濃度的培養系統。更佳地，係將谷胺醯胺視需 要地一或數種其他氨基酸之補料與將一或多種能量來源如 葡萄糖添補入該細胞培養物結合，如歐洲專利EP-229 809-A中所述。通常於開始培養後25-60小時進行補料；例如， 通常係於細胞已達爲約106細胞/毫升之密度時開始進行補 料。谷胺醯胺及/或天冬醯胺補料（以天冬醯胺替代谷胺醯 胺，參見倉野，N.等人，1990，J. Biotechnology 15，113-128)通常係介於0·5至3克（較佳係1至2克）每1培養 體積之範圍內；其他可存在補料中之氨基酸較佳爲10至 300毫克總補料每升培養物，尤其甘胺酸、賴胺酸、精胺酸 、纈胺酸、異白胺酸及白胺酸通常較其他胺基以爲至少150 至200毫克之較高量進行補料。補料可以噴九-添加或以連 續泵送補料之形式添加，較佳地係將補料以幾近連續地泵 送至該生物反應器中。當然在生物反應器中進行補料分批 培養期間，須藉由添加鹼或緩衝劑將pH値控制於所指定最 適細胞系生長之近似生理pH値下。當使用葡萄糖作爲能量 來源時，總葡萄糖補料通常爲1至10 (較佳係3至6)克 每升培養物。除包含氨基酸外，該補料較佳地尙包含範圍 爲5至20克每升培養物之低量膽固醇。 較佳地，根據本發明之動物細胞或細胞系爲一種（例 如）於誘導時製造第二產物蛋白質，或能夠表現第二產物 蛋白質之生產細胞系。根據本發明，該第二產物蛋白質係 爲能以高產量製造並獲得之蛋白質。其可爲任何有興趣之 蛋白質，例如治療性蛋白質如介白質或酵素，例如酵素抑 22 1304094 制劑或抗體或其片段（如fab片段）。其可爲重組蛋白質（ 攜帶於質體或另一類包括經遺傳工程改造之病毒的載體上 )或其可經由任何技術穩定地整合入該細胞之基因組中。 其亦可爲天然表現構體例如由血漿或融合瘤細胞所分泌之 抗體。該產物蛋白質可包括令多肽自宿主生產者細胞分泌 出之訊號序列。其可經固有表現或可經誘導表現。 較佳地，該產物蛋白質爲重組型蛋白質，最佳地爲一 種自組成啓動子表現之重組蛋白質。根據本發明“重組型 ”意指於細胞系中從原先已藉由任意遺傳工程技術導入該 細胞系之該相對應基因的至少一個外源拷貝所表現得之蛋 白質，而不考慮該蛋白質是否以其至少一個天然存在之拷 貝生成於該生產細胞系中。此等重組基因之額外拷貝可例 如整合入基因組內或可攜帶於游離型元件上。可使用穩定 或暫時性表現。根據本發明可使用任意表現載體技術，包 括經遺傳工程改造之病毒。更佳地，該重組型蛋白質爲經 穩定地整合至染色體之蛋白質。 於本發明另一較佳具體態樣中，該產物蛋白質爲分泌 蛋白。更佳地，該產物蛋白質爲抗體或經工程改造之抗體 或其片段，最佳地其爲免疫球蛋白G (IgG)抗體。 蛋白質表現之個別方法及進一步基於使用氨基葡萄糖 苷抗性基因與前述對應之高密度細胞培養亦爲本發明之標 的。前文中對於可能及較佳具體態樣之敘述同樣應用於此 等標的。 實施方式 1304094 實施例 細胞系及質體之產牛 NS〇6A1 (100)3細胞系（6A1簡稱；隆沙生化公開有限 責任公司，史羅夫/UK)係自經穩定整合之重組谷胺醯胺合 成酶（GS)表現構體分泌人-鼠嵌合型IgG抗體（CB72.3)。攜帶 新霉素抗性之重組細胞系係藉由將該6A1細胞系以雙順反 子表現bcl-2及Net/或僅自單一質體構體表現NeV之質體 載體轉染而得。爲產生pEF-Nec/，係將得自pMClneopa ( 史塔金）之MCI Neo聚A卡匣插入具有塡充片段之pEF B〇S (水島等人，1990，pEF BOS，一種有力的哺乳動物表 現載體[A powerful mammalian expression vector] ，Nucleic Acids Research 18，5322 )，而製得 pEF MCI neo poly A ( 維斯瓦得等人，Mol. Cell Biol. 1995 Feb;15(2):643-41 )。圖 4列示該質體之圖譜。爲產生pEFbd-2-NeV，係將人類bcl-2 cDNA (長抗細胞凋亡轉錄版本，克萊瑞等人，Cell 47:19-28(1986))之 EcoRI/Taq I 片段次選殖入經 EcoRI/Clal 開環之 PIC194 ( Gene 32:482，1984)中，再切出呈 Sail ( 鈍端）/EcoRV片段進一步選殖至pEF_MClneopA之多重選 殖部位（MCS)的鈍端Xbal位置中。因此bcl-2係自延伸因子 (EF) Ι-a啓動子表現（質體圖譜，圖3)。該Neo^表現卡匣 (MClneopA)爲pEF-載體之整合部份，雖然在最終所使用之 Neo載體構體中EFl-a啓動子下的MCS係於Xhol位置開環 ，鈍端化且爲達適當調控而插入一段得自非-編碼序列之 300 bp隨機塡充片段（質體圖譜，圖4)。根據製造商之操 24 1304094 作程序進行由脂質轉染試劑（吉布可，派斯利，蘇格蘭） 介導之轉染作用。質體轉染株係以1毫克/毫升G418存於 補充以5%胎牛血淸及其他如泰等人.（泰，B.等人，於骨髓 瘤NS0培養物中由Bcl-2所介導之細胞凋亡抑制作用【3义 2 mediated suppression of apoptosis in myeloma NSO cultures 】，J. Biotechnology，79(2000)，147-159 )所述之補料的 GMEM培養基（吉布可）中進行篩檢。然後將穩定之轉染 株適應於不含血淸的高密度生長培養基EX-CELL 302。 高密度補料分批細胞培養 對於高密度細胞培養，係將NSO 6A1親本細胞系、6A1 Neo-細胞系及6A1 bcl-2/Neo對照組細胞系適應於補充以1 毫升/50毫升GSEM ( GS表現培養基補料，產品編號G9785 ，西格瑪，普爾，UK)之無血淸培養基EX-CELL 302 ( JRH 生物科學股份有限公司，KS/U.S.A.)。在進行繼代同時， 將25 μΜ MSX及0.7克/升G418補充至該培養基中，但於 接種及生物反應器培養基則省略。針對各細胞系於生物反 應器細胞培養期間之存活細胞密度係列示於圖1中。各細 胞系之補料分批培養設定如下： 骨髓瘤細胞系生長於含無血淸EX-CELL 302培養基之 10升氣升式發酵槽中。起始細胞族群密度爲大約105細胞/ 毫升取自新鮮之中-指數生長其培養物。待連續生長至密度 達約1〇6細胞/毫升後，進行補料之噴九添加並開始泵送補 料（表1)。補料連續進行歷時100小時。pH値控制於約 pH 7。大約每25小時藉由計數經錐蟲藍排除法決定之細胞 25 1304094 存活度測定培養物密度。爲計算總體及存活細胞濃度，遂 將經適度稀釋之樣本以錐蟲藍（西格瑪，普爾，υκ)稀釋 ，隨後使用改進之Fuchs-Rosental血球計數器以顯微鏡進行 檢視。使用CASY計數器（基於細胞大小）測量總體及存 活細胞濃度以進行覆核。 表1 組成 添加量 [毫克/升培養®— 添加模式 補料A L-谷胺醯胺 250-350 當培養物達106細胞/ 毫升時，以200 mM溶 液進行噴九-補料 補料B L-胱胺酸 10-40 當培養物達1〇6細胞/ L-酪胺酸 40-70 毫升時，以200 mM溶 L-色胺酸 10-20 液進行噴九-補料 補料C L_賴胺酸HC1 100-140 以溶於PBS之濃縮液 L-組胺酸 30-40 進行泵送·補料。當培 L-精胺酸HC1 6 0-90 養物達106細胞/毫升 L-甘胺酸 10-30 時開始補料 L-纈胺酸 60-80 L-甲硫胺酸 20-30 L-蘇胺酸 40-60 L-絲胺酸 20-40 L-異白胺酸 80-100 L-白胺酸 70-90 L_苯丙胺酸 40-60 L-谷胺醯胺 1000-1250 D-葡萄糖 4000-5000 氯化膽鹼 5-15 膽固醇（ + BSA) 5-20 L-肉鹼 5-20 26 1304094 而bcl-2/Neo重組細胞系僅生長至最大存活細胞密度爲 約1〇7細胞/毫升，相對於泰等人所述於血淸-補充之補料分 批培養中所獲得最大細胞密度爲< 106細胞/毫升，該Neo 重組細胞系可生長至最大密度爲1.4X107細胞/毫升（圖1 )。所計算得之細胞存活度係依上述之錐蟲藍排除法進行 測定。 重組抗體之空間時間產率支持該重組型Neo細胞系（ 圖2)。此列示於以生物反應器中之產物力價對培養細胞時 間（CCT ;單位：109細胞小時/升）所繪製之圖中。CCT 係經由細胞生長曲線之積分計算得，基本上如雷納德等人 (1988，生物技術簡報10:91-96)所述。如圖2所示，bcl-2/Neo重組細胞系之平均單一細胞產量爲0.260微微克蛋白 質/細胞•小時，而Neo細胞系計量爲0.210微微克蛋白質/ 細胞。單一細胞產量（qp)之些微差距顯然在總產量層面上高 過於存活細胞密度上的差異。 1.某因拷貝數之測定 藉由定量PCR分析方法對所寄存之6Al-Neo細胞系測 定該新霉素抗性基因之基因拷貝數，其使用6A1親本做爲 比較性標準物。測定得基因拷貝數爲3.0拷貝（±0.4)。已給 予經穩定轉染基因之多聯體整合，亦即該重組新霉素抗性 標記之單一整合作用發生於該6A1細胞系中而未進一步擴 增。此與約爲25 μΜ MSX之低MSX濃度有關；爲可使GS 標記基因發生擴增必須施予高出10-20倍高濃度之篩檢劑。 該分析係由特定合約實驗室（拉克技術股份有限公司，胡 27 1304094 斯頓，德州）完成。除了測試來自轉座子Τη5之新霉素抗 性基因外，亦建立以同樣方法測定小鼠甘油醛_3_磷酸脫氫 酶[GAPDH]基因之陰性對照組。使用經選殖之質體標準物 校正該等分析平板。拷貝數計算成每細胞中標靶物（ΝΕΟ)之 數量（MUSGAPDH)，假設標準雙套哺乳動物細胞之DNA質 量爲約6.6微微克，且GAPDH係以兩拷貝存在每細胞。如 該項技藝之例行公事，藉由測量於260及280 nm下之吸光 密度以分光光度計定量從細胞萃取出之基因組DNA。爲分 析新霉素抗性基因拷貝數，遂使用八組由隆薩生物公司所 提供之pMCl neopA質體的稀釋物製作QPCR標準曲線。該 系列稀釋代表範圍從5 X106拷貝至49拷貝之質體DNA。將 各標準物稀釋於GS-NS0對照組基因組DNA (相當於1000 個細胞）中以模擬經粹取細胞系DNA之基質效應。陰性對 照組反應不包含模板或其僅含有對照組質體（5000至50 〇〇〇拷貝）或相當1000 GS-NS0細胞（親本細胞系，約6.6 毫微克）之DNA同等物。 藉由測定閥値週期（Ct)以95%置信區間決定.拷貝數。該 Ct爲藉由探針裂解所產生之報告物螢光乘以設定於基準線 以上之固定閥値的分數。各Ct數値之增加代表標的物呈2 X增加，假設PCR效率達100%。製備各測試物件DNA之 六組獨立稀釋並重複進行分析。各QPCR反應含有約6.6毫 微克之測試樣本DNA。該等QPCR係根據TaqManTM Universal PCR Master Mix操作程序（應用生物系統，佛斯 特市，CA)進行組裝。將反應進行熱循環並藉由ABI Prism 1304094 7700序列測定系統1.6.3版（應用生物系統）收集數據。 2.比較實施例：6A1親太細胞系於無Neo-抗性基因存在但有 次致死量G418存在下之培曼 爲排除任何因暴露至G418而非由於經表現之新霉素抗 性基因所造成對生長的影響，遂使親本細胞系6A1適應於 含有G418之細胞培養基中。可在未使細胞停止生長之條件 下，將G418之含量逐漸增加至濃度爲360毫克/毫升G418 (西格瑪，普爾，UK ;注意G418之批次品質會視其來源 而有所改變）。生長培養基爲補充以6mM谷胺醯胺而不含 胎牛血淸之最適化NS0細胞專用培養基。相較於bd-2轉染 株或未經轉染之親本細胞系6A1，對於6Al-Neo細胞系而 言，此無血淸培養基可重複性地達到根據本發明之高細胞 密度（>2X107細胞/毫升）。因此，該培養基適用於偵測 在無新霉素標記基因存在下G418適應之可能影響。 相較於生長於PMl + 6mM谷胺醯胺之未經適應之親本 細胞系，生長於G418(-)培養基之已適應細胞對細胞凋亡及 壞死性細胞死亡稍較具抗性（數據未示），但其與親本細 胞系相較時具有較低生長速率及較低最大細胞密度（圖5A :NSO 6A1細胞系之分批培養物中的存活細胞密度/未經適 應之6A1 :實心圓形，經適應於360毫克/毫升G418之6A1 於有G418存在下（空心圓形）及無G418存在下（實心三角形) )。藉由將存活細胞數從總體細胞數扣除，而測定得死亡 或壞死細胞之數量並以其對總體細胞數之百分比列示圖5B 中。該項實驗結論爲，於無新霉素抗性標記存在下暴露至 29 1304094 G418可僅視爲對細胞凋亡抗性之潛在作用而不能視爲增進 高密度生長行爲的功效。有趣地，經適應細胞系之生物反 應器培養物於有360毫克/升G418存在下，甚至使該經適 應細胞系於無血淸PM1培養基中的生長速率及最大細胞密 度減至最小。 3.於6A1、6Al-Neo及6Al-bcl-2之分批培養物中的\値 各細胞系已詳述於實施例1及2中；如實施例2所述 進行細胞培養，惟係以於搖晃燒瓶中進行單次分批培養取 代前述於氣升式發酵槽中進行的補料-分批培養。藉由於 Elisa測試中分析等量取樣自培養物之cB72.3分泌量而測定 單一細胞產量。對各等量計數存活細胞數並懸浮於新鮮培 養基中置入96槽平盤達一段預定時間。於約80小時採樣 培養物樣本並收取細胞（於約240小時）。結果列示於圖 6B中。基於經由錐蟲藍排除法校正所得存活細胞密度繪製 的生長曲線列示於圖6A中（空心圓形：6Al-Neo，實心三 角形：6Al-bcl-2，實心圓形：6Α1·(100)3)。該 6Al-Neo 細 胞系恆定地顯示具有較該6Al-bcl-2細胞系高的單一細胞產 量qp。該親本6A1細胞系具有曾經較高之qp値，而此係由 於被其低甚多的生長位勢負平衡所致。 圖式簡單說明 本發明之可能具體態樣列示於圖示中。其中 圖1 : Neo-轉形NS0細胞系於101補料分批氣升式反應 器系統中生長期間之存活細胞密度，與親本及bcl-2轉形細 胞系的比較。 30 1304094 圖2 : Neo-轉形NS0細胞系於101補料分批氣升式反應 器系統中生長期間所表現呈累加細胞時間之分泌抗體的產 量，與bcl-2轉形細胞系的比較。 圖3 :質體圖譜pEF-bcl-2 圖4 :質體圖譜pEF-Neo 圖5 :以NS0細胞系適應非致死劑量G418之比較性生 長實驗。 圖6 : Neo-轉形NS0細胞系之搖瓶分批培養及產量，與 親本及bcl-2轉形細胞系的比較。
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