TWI275795B - Novel assay method - Google Patents

Description

1275795 A7 _B7 _ 五、發明說明（/ ) [發明之詳細說明] [發明所屬之技術領域] 本發明係關於一種測定方法，其在對活體試料以利用 酵素反應之測定反應系來測定受檢物質時，可回避因含於 試料中之溶血成份所產生之測定誤差。 [習知技術] 臨床檢查之領域中時常使用獲知輔酶(NAD、NADP、 NADH、NADPH、Thio-NAD、Thio-NAD、Thio-NADH、

Thio-NADP、Thio-NADPH)之吸光度變化作爲其變化量， 以定量出目的成份之方法。檢體一般使用血淸，但爲取得 血淸時，或是因物理衝擊或是因人爲之不當操作，會使血 球破裂，有時會造成溶血。又，由溶血性病患採血時，有 時會因該疾病而認定出現溶血現象。再者，最近爲使檢查 時間縮短，有時會以全血作爲檢體來測試，有時該種檢體 也會產生溶血。 血球若破裂產生溶血狀態，則紅血球中之成份肌酸激 酶(腺苷酸肌酶(以下以「MK」略稱)）、葡萄糖6磷酸脫氫 酶(以下以「G6PDH」略稱）等之酵素會混入血淸當中。因 該等酵素會對某些臨床檢查項目之測定値造成影響，故以 往需對各別酵素擬定對策。比如，爲回避在測定葡萄糖時 因溶血所造成之測定誤差，有關於使用由氟化鈉、氯化鎂 、磷酸二氫鈉及抗凝固劑之混合物所構成之臨床檢查用糖 解防止劑之報告（日本專利特開平5-126834公報），又對於 MK活性，有關於AP5A之報告。 ____ 3 _____^— 本纸張尺度適闬中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1275795 B7 五、發明說明（Z ) 但，在利用酵素反應之臨床檢查測定上，試料中所含 紅血球中之成分所造成之測定誤差，亦即溶血干擾之問題 還不能說已被充份解決。 [發明欲解決之課題] 本發明之課題係爲提供一種在對活體試料以可生成6-磷酸葡糖酸之反應系來測定受檢物質時，可得到正確、測定 値之測定方法。 [用以解決課題之手段] 本發明者等爲解決上述課題專心檢討之結果，注意到 以輔酶測定蔔萄糖之反應系其最終產物爲6磷酸葡糖酸(以 下以「6PG」略稱），並發現血球中之6PG脫氫酶(以下以 「6PGDH」略稱)係以NADP作爲輔酶反應，對葡萄糖測定 系之結果6PG値會產生正誤差。 是以，乃硏究出一種在以輔酶測定葡萄糖之反應系中 ，藉將6PGDH屏除於反應系之外，可得到正確之葡萄糖 測定値之方法。先前，溶血時6PGDH活性之影響未曾被 報告，而由本發明者等初次發現。到目前爲止MK活性或 血球中之葡萄糖、磷酸不被認爲會影響溶血。 亦即，本發明係由 1·一種受檢物質測定方法，其特徵爲對活體試料以可 生成6PG之反應系測定受檢物質時，將6PGDH屏除於反 應系之外。 2·如前項1中之受檢物質測定方法，其特徵爲將 6PGDH屏除於反應系之外之方法係在反應系中使用不會與 __________- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) ^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) · 線. A7 1275795 ___B7____ 五、發明說明（？） 6PGDH反應之輔酶。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 3. 如前項2中之受檢物質測定方法，其特徵爲以NAD 或Thio-NAD作爲不會與6PGDH反應之輔酶。 4. 如前項1中之受檢物質測定方法，其特徵爲，將 6PGDH屏除於反應系之外之方法係使用6PGDH活性抑制 劑。 5. 如前項1中之受檢物質測定方法，其特徵爲，將 6PGDH屏除於反應系之外之方法係使用抗6PGDH抗體。 6. 如前項1〜5項中任一項之受檢物質測定方法，其特 徵爲進一步將乳酸脫氫酶屏除於反應系之外。 7. 如前項6中之受檢物質測定方法，其特徵爲，將乳 酸脫氫酶屏除於反應系之外之方法係使反應系含有草酸或 草氨酸，或該等之鹽類。 --線. 8·如前項1〜7項任一項之受檢物質測定方法，其特徵 爲受檢物質係使用生成葡萄糖反應系所能測定;^物j胃。 9·如前項1〜8項任一項之受檢物質測定方法，其特徵 爲受檢物質係擇自己糖、中性脂肪、無機磷、肌酸激酶或 其同功酶、或澱粉酶或其同功酶中之1或1種以上之物質 〇 10.—種溶血干擾之回避方法，其特徵爲將因溶血所產 生之6PGDH屏除於反應系之外。 11·一種試藥，係將前項1〜9項任一項之方法中必須之 試藥予以套組化或以單品來構成。 所構成。 5 - 拿、紙張尺度適闬中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^ ---------- 1275795 A7 ___ B7_____ 五、發明說明（t ) [發明實施之形態] 本發明中，對活體試料使用生成6PG之反應系來測定 受檢物質時，比如有對上述試料中利用酵素反應，以輔酶 測定己糖或磷酸化己糖之反應系。在此己糖爲六碳糖，代 表者爲葡萄糖。使用該種測定系測定之臨床檢查項目有比 如葡萄糖（GLU)、中性脂肪（TG)、無機磷(IP)、肌酸激酶 (CPK)等。 比如，如式1及式2所示，對葡萄糖或中性脂肪進行 測定時，使用生成葡萄糖之反應系其最終產物爲6PG。 以輔酶測定己糖或磷酸化己糖之反應系中，當試料有 溶血產生時，測定値會產生正誤差，此種現象稱爲溶血干 擾。 此被認爲係因溶血使血球中之6PGDH以測定系中之 NADP作爲輔酶與6PG反應，產生干擾作用，其結果無法 得到正確之6PG測量値。本發明發現藉由讓溶血所產生之 6PGDH產生干擾作用，及在上述測定系中將6PGDH屏除 於測定反應系之外，可回避因溶血產生之干擾作用。 將6PGDH屏除於反應系之外之方法比如有在反應系 中使用不會與6PGDH反應之輔酶、使用6PGDH活性抑制 劑、添加6PGDH抗體或將6PGDH免疫除去等。再者，本 發明者等探討6PGDH以NADP爲輔酶反應時不會將NAD 視爲輔酶，因此發現可藉NAD構成反應系來將6PGDH屏 除於測定反應系之外，而進行可回避溶血影響之新穎測定 方法。 ______Jl___' 本紙張尺度適闬中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1275795 A7 五、發明說明（y ) 再者，NAD或NADH會受試料中之脫氫酶，特別是 乳酸脫氫酶(以下以「LDH」稱之。與NAD依存)影響，但 若使含有草酸、草氨酸或該等之鹽類則可完全回避LDH之 影響，故可與該測定方法組合。 又，以本發明之以輔酶測定己糖或磷酸化己糖之反應 系除輔酶之外，使用擇自HK、G0PDH、己糖、G0P之酵 素或糖之1種或1種以上之組合。以該等酵素法測定葡萄 糖之測定法爲廣泛周知。 [式 1] ; 葡萄糖

ATP

Mg-ADP / 葡荀糖-6-磷酸

HK C： -NAD(P)+ -NAD(P)H 6,酸葡糖酸各內酯+H2〇 磷酸葡糖酸 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

各紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1275795 A7 B7 五、發明說明（心 [式2]

TG

LPL

C 甘油+脂肪酸3分子 丙酮酸

GK 甘油-3- 磷酸

ADP-HK

AMP

ATP Mg2+ PK ADP

Mg 2+ 磷酸丙烯酮酸 葡萄糖 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Mg 2+ 葡萄糖-6-磷酸

G6PDH

C

▽ AMP

β -NAD(P)+ β -NAD(P)H 6-磷酸葡糖酸-δ-內酯+H20 6-磷酸葡糖酸 [實施例] 以下以實施例說明本發明，但本發明並不侷限於該等 實施例。 [實施例1] 本紙張尺度適罔中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1275795 B7 五、發明說明（1 ) 以採血管採血後，將血液以300〇rpm離心得到人類紅 血球。將該紅血球以-20°C凍結，再於室溫溶解。血球會因 此破裂以得到溶血成份。將其以生理食鹽水稀釋爲血紅素 爲500mg/dl。依以下所示調製試藥。 調製出於〇·1Μ三乙醇胺緩衝液（pH7.5)中溶解有 NADP2.0mM、6PG1.0mM之試藥溶液(試藥A)及於0.1M三 乙醇胺緩衝液(ρΗ7·5)中溶解有NAD2.0mM、6PG1.0mM之 試藥溶液(試藥B)。 將試藥A及試藥B於37°C下加溫5分鐘後，添加已 溶血之試料15μ1： w於波長340〜750nm下每隔1分鐘測定 吸光度。測定該溶血液之結果，如圖1所示，使用NAD時 吸光度沒有上昇。另一方面，如圖2所示，以NADP爲輔 酶反應時，NADPH於340nm之吸光度有上昇。其結果顯 示藉使用NAD可回避溶血干擾。 [實施例2] 依以下所示，調製試藥，以供應葡萄糖(GLU)之測定 〇 (第1試藥） 甲基氨基甲烷(Tris) lOOmM HK 3.5U/ml G6PDH 5.0U/ml β-NAD 3mM 乙酸鎂 lOmM ρΗ6·0

----—_____Q 纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

200mM 6mM 1275795 a7 __ B7 五、發明說明（发） (第2試藥） 三羥甲基氨基甲烷 ATP ρΗ9·0 又，亦以上述試藥組成調製以β-NADP取代β-ΝΑΟ之 試藥。 (操作方法） 於試料5pL中添加第1試藥21(^L、第2試藥70pL， 並於主波長340nm >之條件下以日7170型自動分析裝置 進行終點測定，並依事先作好之檢量線算出葡萄糖之濃度 〇 調製試料使溶血液中血紅素濃度爲〇、100、200、300 、400、500mg/dl，並使人類血淸成份濃度爲一定。如圖3 所示，以NADP作爲輔酶之試藥A其葡萄糖測定値與血紅 素濃度會有依存性上昇，但使用NAD時則觀察不到測定値 上昇，且沒有產生因溶血所造成之正誤差。血紅素濃度爲 Omg/dl時葡萄糖爲8〇mg/dl。 [實施例3] 依以下所示調製試藥，以供測定中性脂肪(TG)。 _ ___— 10-_ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -la!*". i線· A7 1275795 _ B7 五、發明說明（？） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

(1)第1試藥之組成 氮-二（羥乙基)甘氨酸 50mM 氯化鉀 100mM 氯化鎂 10mM 諾尼翁A-10R 0.5% 特立通-100 0.2% 疊氮化鈉 0.1% PEP 4.0mM ATP 3.0mM G6PDH f 4.5U/ml PK 3.0U/ml GK 3.0U/ml pH 8.5 (2)第2試藥之組成 MES 50mM 草酸 lOOmM 葡萄糖 80mM 特立通X-100 0.25% β-NAD 7.0mM 疊氮化鈉 0.1% ADP-HK lO.OU/ml 脂肪酶 1500U/ml pH 6.5 _ η 本紙張尺度適闬中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐〉 A7 1275795 __ _B7 ____ 五、發明說明（γ )

又，亦以上述試藥組成調製出以β-NADP取代β-NAD 之試藥。 測定操作與測定葡萄糖時相同，以測定中性脂肪。 調製試料使溶血液中血紅素濃度爲0、100、200、300 、400、500mg/dl，且人類血淸成份濃度爲一定。如圖4所 示，以NADP作爲輔酶之試藥B其中性脂肪測定値與血紅 素濃度會有依存性上昇，但使用NAD時則觀察不到測定値 上昇，且沒有產生因溶血所造成之正誤差。血紅素濃度爲 Omg/dl時中性脂肪之濃度爲95mg/dl。 [發明之效果] ， 如以上之說明，在活體試料使用可生成6磷酸葡糖酸 之反應系來測定受檢物質時，藉將6磷酸蔔糖酸脫氫酶屏 除於反應系之外’可以防止溶血干擾，並得到受檢物質之 正確測定値。 [圖式之簡單說明] 圖1表示於NAD反應系中溶血液之吸光度變動(實施 例1)。 圖2表示於NADP反應系中溶血液之吸光度變動(實 施例1)。 圖3表示葡萄糖測定値之變動(實施例2)。 圖4表示中性脂肪測定値之變動(實施例3)。 ___________12 拿、紙張尺度適甩中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Claims (1)

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A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍

L一種受檢物質測定方法，其特徵爲，對活體試料使 用可生成6磷酸葡糖酸之反應系來測定受檢物質時，將6 4 磷酸葡糖酸脫氫酶屏除於反應系之外； 示 將6磷酸葡糖酸脫氫酶屏除於反應系之外之方法，係| 於反應系中使用不會與6磷酸葡糖酸脫氫酶反應之NAD或| Thio-NAD，且將乳酸脫氫酶屏除於反應系之外。 I 2·如申請專利範圍第1項之受檢物質測定方法，其中 ’將乳酸脫氫酶屏除於反應系之外之方法，係使反應系含f 有草酸或草氨酸，或該等之鹽類。 | 3·如申請專利範圍第1或2項之受檢物質測定方法，g 其中’受檢物質係使用生成葡萄糖之反應系所能測定之物 質。 4·如申請專利範圍第1或2項之受檢物質測定方法， 其中，受檢物質係擇自己糖、中性脂肪、無機磷、肌酸激 酶或其同功酶、澱粉酶或其同功酶中之1種或1種以上之 物質。 5. —種避免溶血干擾之方法，其特徵爲，係將因溶血 產生之6磷酸化葡萄糖醛酸脫氫酶屏除於反應系之外； 將6磷酸葡糖酸脫氫酶屏除於反應系之外之方法，係 於反應系中使用不會與6磷酸葡糖酸脫氫酶反應之NAD或 Thio-NAD。 6. —種試藥套組，係含有選自草酸、草氨酸以及該等 鹽類中至少一種、葡萄糖6磷酸脫氫酶、ATP、甘油激酶 、葡萄糖、NAD或Thio-NAD、ADP己糖激酶、以及脂肪 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐) 請 閲 讀 背 事

訂

1275795 錯 C8 D8 六、申請專利範圍 酶，用來測定受檢物質。 7·如申請專利範圍第6項之試藥套組，其中，該受檢 物質爲中性脂肪。 請 先 閲 讀 背 之 注 意 事 項

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