TWI269809B - A plasmid for detection of genetically modified maize - Google Patents

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1269809 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種質體，其包括一啟動子，一玉米内部 對照基因及基因改造玉米品系Btll、Eventl76、GA21、 MON810、NK6〇3、丁25及TC15〇7之殖入基因；除此，亦 包括引子、探針、即時PCR (real-time PCR)反應溶液配 方與即時PCR條件。 【先前技術】 基Q改k作物已成為世界上糧食作物之主要來源。常用 於轉殖作物之基因包括抗蟲、耐除草劑及抗生素基因等。 然而，科學界對於基因改造作物之安全性仍存有疑慮，其 主要原因有_(1)食品加入外來基因所造成的影響仍屬未 知。由於許多用於基因改造之基因來自非人類食用之生物 (例如昆蟲及細菌），人類長期食用此等基因改造食品所造成 之影響實屬未知。（2)培養出超級微生物之風險。由於某些 基因改造食品殖入抗生素基因，造成培養出具抗藥性微生 物之風險。（3)殖入動物基因對素食者引發道德及宗教問 題。（4)對人類引發過敏風險。如殖入易引發過敏之基因， 人類可能對其產生過敏反應，影響健康。基於上述原因， 各國已曰益重視並發展基因改造食品之檢驗方法及標示制 度。 目前’最常見的商業化量產基因改造作物包括基因改造 大旦、玉米、棉花及番祐等。例如，根據農委會進口玉米 資料統計，估算台灣每年約有六百萬噸玉米進口，其中約 〇 \88\88144 DOC -6- 1269809 有30%屬基因改造玉米。因此。發展基因改造玉米之檢驗 方法已成為重要課題。目前商品化之基因改造玉米多殖入 抗蟲及耐除草劑基因。在抗蟲基因改造玉米方面，可區分 為 YieldGard(Cryl A)、StarLink(Cry 9C)、Herculex I(Cry 1F) 及MON863(Cry3Bbl)等四大系列。耐除草劑基因改造玉米 則可區分為耐嘉磷塞（glyphosate)，如GA2 1、NK603，及耐 固殺草（glufosinate ammonium)系歹，噙口 Btll 、Event 176' CBH-351、T25及TC1507。除上述基因改造玉米品系夕卜， 亦已發展出混合型品系（stacked trait hybrid)，例如孟山都 公司之MON810XGA21及杜邦公司之MON810XT25。 基因改造食品檢驗方法主要包括（1)以核酸為基礎之方 法，如PCR ; (2)以蛋白質為基礎之方法，如ELISA ;及（3) 以酵素活性測定為基礎之方法。在上述方法中，最廣為應 用者為PCR，利用不同設計的引子鑑別產物。除定性分析 外，PCR亦可用於定量分析，如PCR-ELISA及Real-time PCR等。目前定量檢測基因改造玉米之文獻或商業化套組 大多利用 TaqMan Real-time PCR(Matsuoka T 等人，J· Food Hyg. Soc. Japan 42:24-32) 〇

Isabel Taverniers等人提供一種檢測及定量基因改造耐 希磷塞基因改造大豆（Roundup ReadySoybean，RRS)之 event_speciHc 聚合酵素鏈鎖反應（polymerase chain reaction， PCR) (Eur Food Res Technol (2001) 213:417-424) 〇 該前案 發展轉形event-Specific引子對。此等引子對放大插入DNA 與大豆DNA間獨特連接區域之片段並藉此作為獨特的鑑

O:\88\88l44 DOC 1269809 Τ25及TC 1 5 07之序列係自行定序所得並利用該等序列構築 本發明之新穎質體。 本發明提供-種質體，其包括-啟動子，一玉米内部對 照基因（an internal control gene)及下列核酸序列：序列辨識 、扁唬· 1，序列辨識編號：2，序列辨識編號：3，序列辨識 、’扁唬· 4，序列辨識編號：5，序列辨識編號：6及序列辨識 編號：7。上述序列辨識編號：丨至7係分別為基因改造玉 米 口口系 Btll、Eventl76、GA21、MON810、NK603、丁25 及TC1507之殖入基因。本發明質體可用於檢測Btu、

Eventl76、GA21、MON810、NK603、T25 及 TC15 07 品系。 根據本發明之較佳具體實施例，本發明之質體為 pBFDAM2負體，其包括一 CaMv 3SS啟動子，一 HMG(h^ mobihty group)基因及下列核酸序列：序列辨識編號：卜 序列辨識編^ : 2,序列辨識編號：3，彳列辨識編號：4, 序列m虎· 5，序列辨識編號：6及序列辨識編號：7。 根據本發明，玉米内部對照基因係玉米中廣泛存在之基 因，用於確認所檢測樣品為玉米。較佳地，該玉米内部對 照基因為玉米澱粉合成酵素IIb (maize starch synthase IIb) 基因，轉化（invertase)基因或高移動群蛋白質（high m〇b出ty group，HMG)基因。孩高移動群蛋白質（HMG)因在凝膠電 泳中遷移速度很快而得名。其廣泛存在於各種生物中，此 虫白田έ離胺、精胺&L、麵胺酸和天冬胺酸等。Hmg蛋 白的特點在於能與DNA結合並使其彎曲，進而促進 chromatin功能及基因調控，HMG直接與nucle〇s〇mes進行 O:\88\88144.DOC -10- 1269809 生產（Monsanto, St. Louis，MO，U.S.A.)，其係殖入耐嘉磷塞 (glyphosate)除草劑基因。NK603之殖入基因包括下列片 段：rice actin I啟動子及插入子，i/m/k而EPSPS基因 之 CTP2 ， Agrobacterium tumefaciens CP4 菌株之 5-enolpyruvylshikim ate-3-phosphate synthase(EPSPS)及

Agrobacterium tumefaciens 之 nos 3 ’-poly A 訊號基因、終止 子。該殖入基因之序列如序列辨識編號：5所示。 丁25基因改造玉米係由德國安萬特（Aventis)公司所生產 (Aventis，AgrEvo，Berlin，Germany)，其係殖入耐固殺草 (glufosinate ammonium)除草劑基因。T25之殖入基因包括 下歹丨J片段 ：CaMV 3 5 S 啟動子 ，Streptomyces viridochromo genes Tu494 菌株之 bar [phosphinothricin N-acetyl transfer as e (PAT)]及 CaMV 3 5S poly (A)訊號基因終 止子。該殖入基因之序列如序列辨識編號：6所示。 TC1507基因改造玉米係由美國My co gen及Pioneer公司 所生產（Mycogen c/o Dow AgroSciences ; Pioneer (c/o DuPont), U.S· A.)，其係殖入Cry IF抗蟲基因。TCI 507之殖 入基因包括下列片段：ubiquitin啟動子及Zea mays之first exon 及 intron 5 Bacillus thuringiensis subsp. aizawai PS811 菌株之Cry IF a2 (delta-endotoxin)。該殖入基因之序列如序 列辨識編號：7所示。 本發明亦關於檢測基因改造玉米轉殖品系、CaMV 35S 啟動子與玉米高移動群蛋白質（high mobility group，HMG) 基因之引子與探針。利用本發明之引子與探針可定性或定 O:\88\88144 DOC -13- 1269809 系T25之定性與定量檢驗。 本發明提供—種雜交至TC15〇7基因序列之引子對，其序 列分別為序列辨識編號：20及序列辨識編號：21。本發明 另提供-種雜交至TC15〇7基因序列之探針，其係由序_ 識編號：22之序列組成。該等引子及探針可供基因改造玉 米品系TC 1507之定性與定量檢驗。 本發明提供一種雜交至CaMV 35S啟動子之引子對，其 序列分別為序列辨識編號：23及序列辨識編號：Μ。本發 明另提供一種雜交至CaMV 35S啟動子之探針’其係由^ 列辨識編號：25之序列組成。該等引子及探針可供 35S啟動子之定性與定量檢驗。 本發明提供一種雜交至玉米高移動群蛋白質㈨叻 mobUity group，HMG)基因序列之引子對，其序列分別為序 列辨識編號：26及序列辨識編號：27。該等引子可供玉米 咼移動群蛋白質（high mobiHty gr〇up，HMG)之定性與定量 檢驗。 本發明提供一種定性及定量檢測基因改造玉米轉殖品系 方法’其係使用本發明之質體及引子及探針。 又，本發明提供一種載體，其包含本發明之質體。本發 明另提供一種宿主細胞，其包含本發明之載體。 根據本發明，針對上述七種殖入基因序列之特異性區域 分別設計適合於定量檢測用之產品特異性引子及探針。將 上述引子所得之DNA序列片段再依據殖入基因DNa序列 資料向兩邊擴展，分別設計引子（tailed primer)，以得到較

O:\88\88144 D0C -15- 1269809 大片段之產品特異性DNA片段。將各DNA片段互相連接， 再轉殖入適合載體，經大量培養，抽取及純化等步驟可獲 得大量複製之本發明質體。引子及探針技術可自行設計或 參照下列文獻：Va’iti ling om，M.等人，1999，J. Agric. Food Chem. 47: 5261 - 5266.DNA ; Matsuoka，T.，Kawashima 等人， 2000，J. Food Hyg. Soc. Japan 41:137-143 ;及 Matsuoka, Τ· 等人，200 1，J. Food Hyg. Soc. Japan 42:24-32 o DNA 轉殖 技術係技藝人士所熟知者及任何適合的載體及商業化套組 均可用於本發明質體之構築。適合於大量培養本發明質體 的宿主細胞均可用於本發明。該等載體包括，但不限於， 微生物及酵母菌。較佳之宿主細胞為大腸桿菌。 本發明所提供之質體係一種標準化質體，除可定性檢測 七種基因改造玉米轉殖品系：Btll、Event 176、GA21、 MON810、NK603、T25及TC1507外，亦可作為定量參考 物質，以定量篩選及檢測上述基因改造玉米轉殖品系。本 發明自行構築之質體可無限制製備，並可同時作為定性及 定量之參考物質，解決轉殖基因玉米檢測上缺乏標準物質 之問題。此外，亦可避免參考物質受到含構築基因植物之 生長地區，時間，品系及從種子抽出之DNA品質的影響。

定性或定量檢測基因改造玉米可利用DNA或蛋白質方 法。較佳地，本發明之定性檢測基因改造玉米係將本發明 質體經大量培養，抽取，純化，酵素切割成線狀質體DNA 及回收純化後，當作比對之標準物質（reference material )， 採用PCR放大技術檢測基因改造玉米，並再進行即時PCR O:\88\88l44 DOC -16- 1269809 以探針確涊該基因改造玉米定性檢測。本發明之定量檢測 基因改造玉米則係將本發明質體經大量培養，抽取，純化， 酵素切割成線狀質體DNA及回收純化後，進行系列稀釋及 測足DNA濃度。接著取適當濃度（約20至300,000 copies) <線狀質體DNA進行即時PCR，製作定量標準曲線。另針 對轉殖基因玉米樣品須決定轉殖品系之内標比（coefficient value)，該内標比之測定係取轉殖品系基因改造玉米參考物 貝進行定量測試，並以本發明線狀質體DNA所製作之標準 曲線’依據標準曲線及下列公式計算： 内裇比—轉殖品系基因改造玉米產品特異性基因/玉米 内部對照基因 對轉殖基因玉米樣品經定量檢測分析後，依下列公式計 鼻結果： ‘ ua中轉殖品系基因改造玉米含量％ =(產品特異性基因 /玉米内部對照基因）x(l/内標比）xi〇〇 本毛月另&供一種套組，其包括本發明線狀質體dna， 可專一性雜交至 Btu、GA2b MON810、NK603、Eventl76、 及TCI 507基因改造玉米轉殖品系、啟動子 與玉米高移動群蛋白質基因之引子及探針，及即時pcR反 應溶液配方。 根據本發明’所有可專一性雜交至Bm、_、 mon810、NK603、Eventl76、T25 及 Tci5〇7 基因改造玉 米轉殖品系、caMV35s啟動子與玉米高移動群蛋白質基因 之引子及探針均可用於定性或定量檢測Btll、GA21、

O:\88\88144 DOC -17- 1269809 分鐘。棄去上層液，所得沉殿之DN A以去離子水1 0 0微升 溶解。 DNA之抽取與純化亦可採用市售套組Wizard Minipreps DNA Purification Resin (Promega)，DNeasy Plant Mini 套組 或DNeasy Plant Maxi套組（Qiagen)，操作步驟係參考廠商 提供之使用手冊。 實例2本發明質體pBFDAM2之構築與確認 本實例係利用PCR方法將下列七種基因改造玉米品系： Event 176 及 Bt 11 (Syngenta，Basel，Switzerland)，MON8 10、 NK603 及 GA21 (Monsanto，St. Louis，MO，USA)，T25 (Aventis，AgrEvo, Berlin，Germany)及 TC1507(Mycogen (c/o Dow AgroSciences) ; Pioneer (c/o DuPont)，U.S.A.)之七段產 品特異性（product-speciHc)之PCR增幅DNA片段，一段 35S-起動子之PCR增幅DNA片段及HMG(high mobility group)玉米内部對照基因之PCR增幅DNA片段連結。上述 BtU、Eventl76、GA21、MON810、NK603、T25 及 TC1507 所殖入基因之核酸序列分別如序列辨識編號：1，序列辨識 編號：2，序列辨識編號：3，序列辨識編號：4，序列辨識 編號：5，序列辨識編號：6及序列辨識編號：7所示。35S-起動子篩選及HMG之基因DNA序列資料係參考HMG(high mobility group) (accession number: AJ13 13 73)及 35S-promoter (accession number: X53860，AY147202) o O:\88\88144.DOC -19- 1269809 表一 引子/探針 序列5f-3’ 專一性 Amplicon (bp) Eventl76 Crytml Crytm2 Crymp gTg gAC AgC CTg gAC gAg AT TgC TgA AgC CAC TgC ggA AC 5，-(FAM)-AAC AAC AAC gTg CCA CCT CgA CAg g -(TAMRA)-3, CDPK-pro/sense c/7Z4(Z?)/anti-sense 105 MON810 YM556B CR01 PYM92 TgA CAC TAT ATT gCT TCT CTT TAC ATA CgT (序列辨識編號：12) gAT gTT Tgg gTT gTT gTC CAT 5，-(FAM)-CTC gAT gCC TTC TCC CTA gTg TTg ACC A-(TAMRA)-3’（序列辨識編號：13) hsp70/sensQ cryIA(b)/mti-SQnse 139 T25 RT5006 RT3124 GT42 TTA ggC CAg TTA CCC AgA TCT gA (序列辨識編號：17) ATT CCC TTA TCT ggg AAC TAC TCA C (序列辨識編號：18) 5，-(FAM)-CAT gCC CgC TgA AAT CAC Cag TCT CT -(TAMRA)-3’（序列辨識編號：19) pat/sensQ 35S ter./anti-sense 119 Bill Btll 1-5， crylA 1-3， 0205C CCA TTT TTC AgC TAg gAA gTT C TCg TTg ATg TTK ggg TTg TTg TCC 5，-(FAM)-TCC gCg gCT TgT TgT ggT CTT TTg -(TAMRA)-3’（序列辨識編號：8) adhlAS IVS6/sense cryIA(b)/mti-SQnsQ 110 GA21 YCC-6 YCC-2 YCC-35 TTC CAg ggg CTC AAg TCC A (序列辨識編號：9) TCTCCTTgATgggCTgCA(序列辨識編號：10) 5，-(FAM)-TCg CCC gCC gCT CCT CCA gAA g -(TAMRA)-3’（序列辨識編號：11) OTP/sense m-epsps/mti~sense 136 35S 75 161S 100 CCgACAgTggTCCCAAAgAT(序列辨識編號：23) AgT ggA gAT ATC AC A TCA ATC CAC TT (序列辨識編號：24) 5，-(FAM)-CCC ACC CAC gAg gAg CAT Cg -(TAMRA)-3’（序列辨識編號：25) CaMV-35S/sense CaM V-3 5 S/anti-sense 107 HMG hmg-c hmg-d CLC13 TTg gCT ACA TAg ggA gCC TTg T (序列辨識編號：26) hmg/sense gAg TCg gTA AgC TCC ATC TTC Tg (序列辨識編號：27) hmg/anti-sense 55-(FAM)-CAA TCC ACA CAA Acg CAC gCg -(TAMRA)-3, TAH：TAMRA)-3， 123 NK603 0726D-5f 0712B PK06D gTgACAAATgCAgCCTCgTg(序列辨識編號：14) TgC gTT gAC Tgg ATT TCg (序列辨識編號：15) 5，-(FAM)-TgC TAA CTT gCg CCA Tgg TTg ATC ACT T-(TAMRA)-3’（序列辨識編號：16) rice actin intron/sense CTP2/antisense 131 TC1507 1014Ra 1014Rb TC1014R CgA CCT gCA gCC AAg CTT (序列辨識編號：20) TCA TgT TAg TCg CAA CgA AAC C (序列辨識編號：21) 5,-(FAM)-CgA gCT CgA gAT CCC CgA CAT ATg C -(TAMRA)-3’（序列辨識編號：22) crylFa2/sQnsQ ORF25/antisense 71 O:\88\88144.DOC -20- 1269809 先以上述 Btll、Eventl76、GA21、MON810、NK603、 T25及TC1507轉殖品系之基因體DNA (genomic DNA)為模 板（template)，而 HMG及35S-promoter貝J以轉殖品系 MON8 1 0之基因體DNA為模板，分別用下表二所列之引子 對作第一次PCR (如圖1 ): 表二

Tailed primer 序列5’-3’ Amplicon (bp) Eventl76 E-GA E-M Cgg ggT CCA AgT gCA ACC TgC CCA ggT AAg gAg AgC ATg AAT CCA gCT gAA 190 (G) MON810 M-E M-T TCA gCT ggA TTC ATg CTC TCC TTA CCT CAA CTC AAA ATC CTT Gta Cgg gAT gC 199 (H) T25 T-M T25-3， CAT CCC gTA CAA ggA TTT TgA gTT gC TCA ACA CAT gAg CgAAAC CCT A 184 (I) Btll BT-NK BT-GA CgC AAATCT CCC TgA CTA ATA ACT gAT TAg T CgA ggC CAT CAA CTT CTg ggT TAC TC 210 (E) GA21 GA-BT GA-E gTA ACC CAg AAg TTg ATg gCC TCg T Tgg gCA ggT TgC ACT Tgg ACC CCg 201 (F) 35S 35-hmg 35-TC TCg TgA CgA gTA CCT ACA AAT gCC AAg gTg AAC gCg ggT CTT gCg AA 205 (B) HMG hmg-5， hmg-35 AgC ATC AgT TTC CCT ACC TCg C ggC ATT TgT Agg TAC TCg TCA CgA 276 (A) NK603 NK-TC NK-BT TgC AgC AAT ggA ATC CCT CAg CAT Tg ACT AAT CAg TTA TTA gTC Agg gAg ATT TgC gT 182 (D) TC1507 TC-35 TC-NK TTC gCA AgA CCC gCg TTC ACC TTT C AAT gCT gAg ggA TTC CAT TgC TgC A 279 (C) O:\88\88144.DOC -21- 1269809 第一次PCR反應溶液及條件如下： 反應溶液：

10倍PCR缓衝溶液 5.0微升 25 mM MgCl2 4.0微升 TaqDNA聚合酶（5U/微升） 0.5微升 2.5 mM dNTP 3.0微升 ΙΟμΜ引子F 1.0微升 ΙΟμΜ引子R 1.0微升 模版DNA (總量lOOng) 5.0微升 無菌純水 30.5微升 總體積 50.0微升 PCR反應條件： 步驟 溫度 時間 1.最初變性 94°C 5分鐘 2.變性 94°C 30秒 3.黏接 45°C 30秒 4.延展 72°C 30秒 步騾2至步驟4，共進行5個循環反應 5.變性 94°C 30秒 6.黏接 60°C 30秒 7.延展 72°C 30秒 步驟5至步驟7 ，共進行35個循環反應 8.最終延展 72°C 7分鐘 冷卻 4°C O:\88\88144.DOC -22- 1269809 經上述PCR反應後，可分別得到九個增幅DNA片段(A、B、c、D、 E、F、G、Η、I)，上述步驟如圖一所示。將DNA片段回收後，以其作 為模板，再用表二引子對作第二次PCR (如圖丨）。 弟’人P C R反應〉谷液及條件如下： PCR反應溶液： 10倍PCR緩衝溶液............. 25 mM MgCl2........................ TaqDNA聚合酶（5U/微升;) 2.5 mM dNTP......................... 1〇μΜ引子F........................ 1〇μΜ引子R....................... 純化DNA (10倍稀釋).......... 無菌純水.......................... 總體積................................... PCR條件： ••5.0微升 •·4·0微升 ••0.5微升 ••3.0微升 "1.0微升 ••1.0微升 • 1+1微升 33.5微升 50.0微升 步驟 —溫度 時間 1·最初變性 94°C 5分鐘 3. 黏接 4. 延展

94°C 60°C 72°C 30秒 30秒 30秒 5·最終延展 72°C 7分鐘

O:\88\88144.DOC 23- 1269809 經上述第二次PCR反應後，可分別得到四個片段（J、Κ、 L、Μ，見圖1)。以回收產物作為模板，最後用第二次PCR 中之引子對hmg-5’及T25-3’作第三次PCR，該次PCR之反 應溶液及其條件如下： PCR反應溶液： 10倍PCR緩衝溶液.................................5.0微升 25 mM MgC12............................................4.0 微升

TaqDNA 聚合酶（5U&L).......................0.5 微升 2.5 mM dNTP.............................................3.0 微升 ΙΟμΜ引子F............................................1.0微升 ΙΟμΜ引子R...........................................1.0微升 模版DNA (總量lOOng).................1+1+1+1微升 無菌純水..................................................31.5微升 總體積......................................................50.0微升 PCR條件： _fm_^_ 1. 最初變性 94°C 5分鐘 2. 變性 94°C 30秒 3. 黏接 60°C 30秒 4. 延展 1TC 30秒 _步驟2至步驟4，共進行35個循環反應 _5·最終延展_7TC_7分鐘_ 冷卻 4% O:\88\88144.DOC -24- 1269809 經上述第三次PCR反應後，所得到之片段即為本實驗所 欲構築之DNA片段（質體PBFDAM2)。再將此片段（1926 bp) 轉殖入pGEM®-T Easy載體，其係依promega pGEM-T載 體（？1'〇11^83，％3(^3011，〜1，1；3八）套組之操作步驟進行。將該 段殖入基因進行定序分析，以確認九段PCR增幅產物片段 係呈單一 copy存在於質體中；圖2為本發明質體pBFDAM2 中之基因順序；圖3為本發明質體PBFDAM2中之各基因 順序及其序列；及圖4為構築質體PBFDAM2之DNA序列， 引子及探針位置。確認後之質體經大量複製，以Apal等限 制酶切割成線狀，再回收與純化此片段，經稀釋後備用。 實例3 本發明質體pBFDAM2之測試 構築完成之質體，經大量培養、複製與回收純化後，以 即時 PCR (ABI PRISM 7700 Sequence Detector)測試構築質體 中之七種轉殖品系（Bt 11、Event 176、GA2 1、MON8 1 0、 >^603、丁25及丁(：1507)基因改造玉米產品特異性基因、358-起動子篩選基因及HMG玉米内部對照基因，確認反應無 誤。 實例4 定性檢測 質體PBFDAM2經大量培養，抽取，純化，酵素切割成 線狀質體DNA及回收純化後，當作定性檢驗比對之標準物 質（reference material ) 〇 以表一所列之各組引子對、第一次PCR反應溶液配方及 第一次PCR反應條件，可定性檢驗Eventl76、MON810、 T2 5、Btn、GA21、NK603及TC15 07等基因改造玉米轉殖 O:\88\88144.DOC -25- 1269809 品系、CaMV 35S啟動子與玉米高移動群蛋白質（high mobility group，HMG)基因。引子對 Crytml 及 Crytm2 可 供定性檢測Eventl76基因改造玉米轉殖品系；引子對 YM5 5 6B及CR01可供定性檢測MON810基因改造玉米轉 殖品系；引子對RT5006及RT3124可供定性檢測T25基因 改造玉米轉殖品系；引子對Btll 1-51及ci*yIA 1-3^可供定性 檢測Btll基因改造玉米轉殖品系；引子對YCC-6及YCC-2 可供定性檢測GA21基因改造玉米轉殖品系；引子對 0726D-5'及0712B可供定性檢測NK603基因改造玉米轉殖 品系；引子對l〇14Ra及1014Rb可供定性檢測TC1507基 因改造玉米轉殖品系；引子對75及161S可供定性檢測 CaMV 3 5S啟動子；引子對hmg-c及hmg-d可供定性檢測 玉米HMG基因。 並且，以表一所列之各組引子對及探針、即時PCR反應 溶液配方與即時PCR反應條件進行確認檢驗。引子 Crytml、Crytm2及探針Crymp可供Event 176基因改造玉 米轉殖品系之定性確認檢驗；引子YM5 5 6B、CR01及探針 PYM92可供MON8 1 0基因改造玉米轉殖品系之定性確認檢 驗；引子RT5 006、RT3124及探針GT42可供T25基因改造 玉米轉殖品系之定性確認檢驗；引子Btll 1-5’、crylA卜3’ 及探針0205C可供Btll基因改造玉米轉殖品系之定性確認 檢驗；引子YCC-6、YCC-2及探針YCC-35可供GA21基 因改造玉米轉殖品系之定性確認檢驗；引子0726D-5'、 0712B及探針PK06D可供NK603基因改造玉米轉殖品系之 0\88\88I44.DOC -26- 1269809 定性確認檢驗；引子1014Ra、1014Rb及探針TC1014R可 供TC 1 5 07基因改造玉米轉殖品系之定性確認檢驗；引子 75、161S及探針100可供CaMV 3 5S啟動子之定性確認檢 驗；引子hmg_c、hmg-d及探針CLC13可供玉米HMG基因 之定性確認檢驗。即時PCR反應溶液配方及反應條件如下： 5 μΜ引子F........................................... ······1.25 pL 5μΜ引子R.......................................... ······1.25 \iL 3.3 μΜ探針........................................... ........1·7μί TaqMan Universal PCR Master Mix …·· ······12·5 pL 模版DNA (總量lOOng)....................... ........5.0 pL 無齡屯水................................................ ......3.3 pL 總體積.................................................... ·.····25·0 μί PCR 條件：使用 Real-time PCR—ABI PRISM 7700 Sequence Detector 步驟 溫度 時間 1.熱活化 50°C 2分鐘 2.最初變性 95°C 10分鐘 3.變性 95°C 15秒 4·黏接、延展 60°C 步驟3至步驟4， 1分鐘 循環反應。 5.冷卻 35°C 45秒 實例5定量檢測 質體pBFDAM2經大量培養，抽取，純化，酵素切割成 0 \88\88144 D0C -27· 1269809 線狀質體DNA及回收純化後，進行系列稀釋及測定DNA 濃度。接著取適當濃度（約20至3 00,000 copies)之線狀質體 DNA進行即時PCR，製作定量標準曲線。另針對轉殖基因 玉米樣品須決定轉殖品系之内標比（coefficient value)，該内 標比之測定係取轉殖品系基因改造玉米參考物質進行定量 測試，並以本發明線狀質體DN A所製作之標準曲線，依據 標準曲線及下列公式計算： 内標比=轉殖品系基因改造玉米產品特異性基因/玉米 内部對照基因 對轉殖基因玉米樣品經定量檢測分析後，依下列公式計 算結果： 樣品中轉殖品系基因改造玉米含量％ =(產品特異性基因/ 玉米内部對照基因）χ (1/内標比）χ 100 以表一所列之各組引子對及探針、即時PCR反應溶液配 方與即時PCR反應條件進行定量檢驗。引子Crytml、 Cry tm2及探針Cry mp可供Event 1 76基因改造玉米轉殖品 系之定量檢驗；引子YM5 56B、CR01及探針PYM92可供 MON810基因改造玉米轉殖品系之定量檢驗；引子 R丁5 000、RT3 124及探針GT42可供丁25基因改造玉米轉殖 品系之定量檢驗；引子Btll 1-5’、crylA 1-3’及探針0205C 可供Btl 1基因改造玉米轉殖品系之定量檢驗；引子 YCC-6、YCC-2及探針YCC-35可供GA21基因改造玉米轉 殖品系之定量檢驗；引子0726D-5、0712B及探針PK06D 可供NK603基因改造玉米轉殖品系之定量檢驗；引子 O:\88\88144.DOC -28- 1269809 l〇14Ra、l〇l4Rb及探針TC1014R可供TC15 07基因改造玉 米轉殖品系之定量檢驗；引子75、i61S及探針1〇〇可供 CaMV 35S啟動子之定量檢驗；引子hmg-c、hmg-d及探針 CLC13可供玉米HMG基因之定量檢驗。 實例6精準度測試 除此’進一步實際以國際性基因改造玉米定量精準度測 4檢體測試比較，採用方法為本專利方法及日本專利（日本 第2001 136983號專利公開案）發行之市售檢測套組，測試 檢體共有六件，該檢體分別含有不同濃度之六種轉殖品系 基因改造玉米（Eventl76、Btll、MON810、丁25、NK603 及 GA21)。本實驗室參加該精準度試驗，初次接獲檢體時，僅 被告知檢體中混有不同濃度之六種轉殖品系基因改造玉 米，至於各檢體中混入之詳細品系與濃度並未獲悉，必須 在限定時間内完成測試及繳回結果後，才被告知每件檢體 之實際添加基因改造玉米品系與濃度。從主辦單位獲知，

六種不同濃度基因改造玉米。經測諸饴 、1.5%、3.0%或 5.〇〇/0

1.5%或5.0%四種濃度僅能達到60%至 吉果針對0%、 100%準確性， O:\88\88144.DOC -29· 1269809 土於〇·1/〇/辰度，偏離高達至0·2%。另外，Eventl70品系是 所有測試品系中所得測試結果偏離較大之唯一品系，三種 添加>辰度0.1%及〇5%及5〇%，經由測試後，二種方法皆 僅能得到約70%至85%準確性。每件添加Eventl76品系之 體僅能侦、測到約7()%至85%添加量，推測可能原因為使 用於配製測試檢體之非基因改造玉米品系與Eventl76基因 改造玉米品系之間具有不同拷貝玉米内部對照基因導致， 本4伤差井必須等待各實驗室及主辨單位間互相確認後， 才能瞭解造成誤差真正原因，惟本Eventl76品系測試所得 結果仍在可接受範圍内。 二、以本申請發明專利之質體、引子、探針及方法與曰本 專利發行之市售檢測套組測試國際性基因改造玉米定 量精準度試驗檢體

檢體 基因改造玉米 (%) 編號 T25 (%) MON810 (%) GA21 (%) Eventl76 (%) Bill (%) NK603 (%) S B W S B W S B W S B W S B W S B W 1 0 0 0 1.50 1.50 1.26 0.50 0.53 0.70 0.10 0.08 0.07 0 0 0 3.00 2.99 UN 2 1.50 1.50 1.74 0.10 0.10 0.07 0 0 0 5.00 3.97 3.83 0.50 0.50 0.70 1.50 1.46 UN 3 0.10 0.10 0.20 5.00 5.07 4.45 1.50 1.52 2.10 0.50 0.35 0.37 1.50 1.53 1.83 0.50 0.50 UN 4 1.50 1.44 1.72 0.10 0.11 0.12 0 0 0 5.00 4.17 4.41 0.50 0.51 0.59 1.50 1.50 UN 5 0.10 0.10 0.17 5.00 4.90 3.78 1.50 1.47 1.81 0.50 0.39 0.35 1.50 1.51 2.04 0.50 0.49 UN 6 0 0 0 1.50 1.49 1.19 0.50 0.49 0.58 0.10 0.08 0.11 0 0 0 3.00 3.05 UN S:檢體之添加濃度 B:以本專利方法測試結果 W:以日本專利發行之市售檢測套組測試結果 UN:該檢測套組無法測試該轉殖品系基因改造玉米 O:\88\88144.DOC -30- 1269809 【圖式簡單說明】 圖1為本發明PBFDAM2質體之構築步驟。 圖2為本發明pBFDAM2質體中之基因順序。 圖3為本發明pBFDAM2質體中之各基因順序及其序列 圖4為構築pBFDAM2質體之DNA序列，引子及探針位置。 O:\88\88144.DOC -31- 1269809 序列表 < 11 ο >行政院衛生署藥物食品檢驗局 <120>檢測基因改造玉米之質體 <160> 27 <170> Patentln version 3.2 <210〉 1 <211> 3134 <212> DNA <213> Btll <40〇> 1 aattcgagct cgtcagaaga ccagagggct attgagactt ttcaacaaag ggtaatatcg 60 ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact tcatcgaaag gacagtagaa 120 aaggaaggtg gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat cgttcaagat 180 gcctctaccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggaacat cgtggaaaaa 240 gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgatatctc cactgacgta 300 agggatgacg cacaatccca ctatccttcg caagaccctt cctctatata aggaagttca 360 tttcatttgg agaggacacg ctgaaatcac cagtctctct ctacaaatct atctctctct 420 attttctcca taataatgtg tgagtagttc ccagataagg gaattagggt tcttataggg 480 tttcgctcac gtgttgagca tataagaaac ccttacgagc tcggtacccg gggatccgga 540 aggtgcaagg attgctcgag cgtcaaggat cattggtgtc gacctgaacc ccagcagatt 600 cgaagaaggt acagtacaca cacatgtata tatgtatgat gtatcccttc gatcgaaggc 660 atgccttggt ataatcactg agtagtcatt ttattacttt gttttgacaa gtcagtagtt 720 catccatttg tcccattttt tcagcttgga agtttggttg cactggcact tggtctaata 780 actgagtagt cattttatta cgttgtttcg acaagtcagt agctcatcca tctgtcccat 840 tttttcagct aggaagtttg gttgcactgg ccttggacta ataactgatt agtcatttta 900 ttacattgtt tcgacaagtc agtagctcat ccatctgtcc catttttcag ctaggaagtt 960 cggttgcact gaatttgtga acccaaaaga ccacaacaag ccgcggatcc tctagagtcg 1020 accatggaca acaacccaaa catcaacgaa tgcattccat acaactgctt gagtaaccca 1080 gaagttgaag tacttggtgg agaacgcatt gaaaccggtt acactcccat cgacatctcc 1140 ttgtccttga cacagtttct gctcagcgag ttcgtgccag gtgctgggtt cgttctcgga 1200 ctagttgaca tcatctgggg tatctttggt ccatctcaat gggatgcatt cctggtgcaa 1260 attgagcagt tgatcaacca gaggatcgaa gagttcgcca ggaaccaggc catctctagg 1320 P:\YAN\SPEC1F1CAT10N\88144_SYC\88144 序列表（中)DOC 1 _ 1 · 1269809 ttggaaggat tgagcaatct ctaccaaatc tatgcagaga gcttcagaga gtgggaagcc 1380 gatcctacta acccagctct ccgcgaggaa atgcgtattc aattcaacga catgaacagc 1440 gccttgacca cagctatccc attgttcgca gtccagaact accaagttcc tctcttgtcc 1500 gtgtacgttc aagcagctaa tcttcacctc agcgtgcttc gagacgttag cgtgtttggg 1560 caaaggtggg gattcgatgc tgcaaccatc aatagccgtt acaacgacct tactaggctg 1620 attggaaact acaccgacca cgctgttcgt tggtacaaca ctggcttgga gcgtgtctgg 1680 ggtcctgatt ctagagattg gattagatac aaccagttca ggagagaatt gaccctcaca 1740 gttttggaca ttgtgtctct cttcccgaac tatgactcca gaacctaccc tatccgtaca 1800 gtgtcccaac ttaccagaga aatctatact aacccagttc ttgagaactt cgacggtagc I860 ttccgtggtt ctgcccaagg tatcgaaggc tccatcagga gcccacactt gatggacatc 1920 ttgaacagca taactatcta caccgatgct cacagaggag agtattactg gtctggacac 1980 cagatcatgg cctctccagt tggattcagc gggcccgagt ttacctttcc tctctatgga 2040 actatgggaa acgccgctcc acaacaacgt atcgttgctc aactaggtca gggtgtctac 2100 agaaccttgt cttccacctt gtacagaaga cccttcaata tcggtatcaa caaccagcaa 2160 ctttccgttc ttgacggaac agagttcgcc tatggaacct cttctaactt gccatccgct 2220 gtttacagaa agagcggaac cgttgattcc ttggacgaaa tcccaccaca gaacaacaat 2280 gtgccaccca ggcaaggatt ctcccacagg ttgagccacg tgtccatgtt ccgttccgga 2340 ttcagcaaca gttccgtgag catcatcaga gctcctatgt tctcatggat tcatcgtagt 2400 gctgagttca acaatatcat tccttcctct caaatcaccc aaatcccatt gaccaagtct 2460 actaaccttg gatctggaac ttctgtcgtg aaaggaccag gcttcacagg aggtgatatt 2520 cttagaagaa cttctcctgg ccagattagc accctcagag ttaacatcac tgcaccactt 2580 tctcaaagat atcgtgtcag gattcgttac gcatctacca caaacttgca attccacacc 2640 tccatcgacg gaaggcctat caatcagggt aacttctccg caaccatgtc aagcggcagc 2700 aacttgcaat ccggcagctt cagaaccgtc ggtttcacta ctcctttcaa cttctctaac 2760 ggatcaagcg ttttcaccct tagcgctcat gtgttcaatt ctggcaatga agtgtacatt 2820 gaccgtattg agtttgtgcc tgccgaagtt accttcgagg ctgagtacta gcagatcagg 2880 atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga 2940 tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca 3000 tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg 3060 cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaacct aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta 3120 tgttactaga tcca 3134 P:\YAN\SPECIF丨CATl〇N\88144_SYC\88144 序列表（中).DOC 1 -2- 1269809 <210〉 2 <211> 2690 <212> DNA <213> Event17 6 <400> 2 cgcatggtcc ttatgcaatt ttgtctgcaa aacacaagcc ttaatacagc cacgcgacaa 60 tcatggaagt ggtcgtttta ggtcctcatc atgaagttca gggaaaacgc atcaaatgta 120 atgcagagaa atggtatttc ttctcttgta aatcagggag aggagtacca tcagtacaga 180 ttcagaatca gaattcagtc ttccaacgac aataatcgca gcatcttgta aaaatttgca 240 gaaacttctg tttgacttgt agccctgacc tttgcaaata tttgaagttg tgcctgctga 300 cacaacttca atctggaagt gctgttgatc agttttgcca gaaacagcaa gcagcctata 360 tatatctgtc acgagacacc ctgccgccct cttctttccc gccattccct ccctaccctt 420 caaaatctag aaaccttttt ttttcctccc gatacgcccc tccatctctc gccgttcatg 480 tccgtggctg gctgccctcc gtgggagcag gcggccgcac tcgttccccg ccgcagccgg 540 atccaacaat ggacaacaac cccaacatca acgagtgcat cccctacaac tgcctgagca 600 accccgaggt ggaggtgctg ggcggcgagc gcatcgagac cggctacacc cccatcgaca 660 tcagcctgag cctgacccag ttcctgctga gcgagttcgt gcccggcgcc ggcttcgtgc 720 tgggcctggt ggacatcatc tggggcatct tcggccccag ccagtgggac gccttcctgg 780 tgcagatcga gcagctgatc aaccagcgca tcgaggagtt cgcccgcaac caggccatca 840 gccgcctgga gggcctgagc aacctgtacc aaatctacgc cgagagcttc cgcgagtggg 900 aggccgaccc caccaacccc gccctgcgcg aggagatgcg catccagttc aacgacatga 960 acagcgccct gaccaccgcc atccccctgt tcgccgtgca gaactaccag gtgcccctgc 1020 tgagcgtgta cgtgcaggcc gccaacctgc acctgagcgt gctgcgcgac gtcagcgtgt 1080 tcggccagcg ctggggcttc gacgccgcca ccatcaacag ccgctacaac gacctgaccc 1140 gcctgatcgg caactacacc gaccacgccg tgcgctggta caacaccggc ctggagcgcg 1200 tgtggggtcc cgacagccgc gactggatca ggtacaacca gttccgccgc gagctgaccc 1260 tgaccgtgct ggacatcgtg agcctgttcc ccaactacga cagccgcacc taccccatcc 1320 gcaccgtgag ccagctgacc cgcgagattt acaccaaccc cgtgctggag aacttcgacg 1380 gcagcttccg cggcagcgcc cagggcatcg agggcagcat ccgcagcccc cacctgatgg 1440 acatcctgaa cagcatcacc atctacaccg acgcccaccg cggcgagtac tactggagcg 1500 gccaccagat catggccagc cccgtcggct tcagcggccc cgagttcacc ttccccctgt 1560 acggcaccat gggcaacgct gcacctcagc agcgcatcgt ggcacagctg ggccagggag 1620 P:\YAN\SPECIFICAT10N\88144_SYC\88144 序列表（中）.DOC 1 1269809 tgtaccgcac cctgagcagc accctgtacc gtcgaccttt caacatcggc atcaacaacc 1680 agcagctgag cgtgctggac ggcaccgagt tcgcctacgg caccagcagc aacctgccca 1740 gcgccgtgta ccgcaagagc ggcaccgtgg acagcctgga cgagatcccc cctcagaaca 1800 acaacgtgcc acctcgacag ggcttcagcc accgtctgag ccacgtgagc atgttccgca I860 gtggcttcag caacagcagc gtgagcatca tccgtgcacc tatgttcagc tggattcacc 1920 gcagtgccga gttcaacaac atcatcccca gcagccaaat cacccagatc cccctgacca 1980 agagcaccaa cctgggcagc ggcaccagcg tggtgaaggg ccccggcttc accggcggcg 2040 acatcctgcg ccgcaccagc cccggccaga tcagcaccct gcgcgtgaac atcaccgccc 2100 ccctgagcca gcgctaccgc gtccgcatcc gctacgccag caccaccaac ctgcagttcc 2160 acaccagcat cgacggccgc cccatcaacc agggcaactt cagcgccacc atgagcagcg 2220 gcagcaacct gcagagcggc agcttccgca ccgtgggctt caccaccccc ttcaacttca 2280 gcaacggcag cagcgtgttc accctgagcg cccacgtgtt caacagcggc aacgaggtgt 2340 acatcgaccg catcgagttc gtgcccgccg aggtgacctt cgaggccgag tacgacctgg 2400 agagggctca gaaggccgtg aacgagctgt tcaccagcag caaccagatc ggcctgaaga 2460 ccgacgtgac cgactaccac atcgatcagg tgtaggagct ctagatctgt tctgcacaaa 2520 gtggagtagt cagtcatcga tcaggaacca gacaccagac ttttattcat acagtgaagt 2580 gaagtgaagt gcagtgcagt gagttgctgg tttttgtaca acttagtatg tatttgtatt 2640 tgtaaaatac ttctatcaat aaaatttcta attcctaaaa ccaaaatcca 2690 <21〇> 3 <211〉 2318 <212> DNA <213> GA21 <4〇〇> 3 ggtgggcgag aggcggcttc ggtgcgcgcc cagatcggtg cgcgggaggg gcgggatctc 60 gcggctgggg ctctcgccgg cgtggatccg gcccggatct cgcggggaat ggggctctcg 120 gatgtagatc tgcgatccgc cgttgttggg ggagatgatg gggggtttaa aatttccgcc 180 atgctaaaca agatcaggaa gaggggaaaa gggcactatg gtttatattt ttatatattt 240 ctgctgcttc gtcaggctta gatgtgctag atctttcttt cttctttttg tgggtagaat 300 ttgaatccct cagcattgtt catcggtagt ttttcttttc atgatttgtg acaaatgcag 360 cctcgtgcgg agcttttttg taggtagacg ataagctggg ctgcaggaat tccgaaagac 420 aaagattatc gccatggctt cgatctcctc ctcagtcgcg accgttagcc ggaccgcccc 480 tgctcaggcc aacatggtgg ctccgttcac cggccttaag tccaacgccg ccttccccac 540 P:\YAN\SPEC1FICAT10N\88144_SYC\88144 序列表（中).DOC 1 - 4 1269809 caccaagaag gcaggtgtgg gtctatggcg gctcaagtcc cagcaacggc caaggagatc cctactcgcc tgtccactac tgccaaaaga ggaagtgcag tactgctgct acccattggc tggcactgac caagctgtct ggctcttggg aatgacattg cagattctac tgatgcctca tgtggaaggt gatgatggga ggagccattt tgtcgccatg cgtggcttcc caagctggga gctgaacgtg tgccgcctgt ccccgactac gacgaatttc tgccggtctt taacatgtaa gctaacgact ccggcctacg cccaccgtga accgccagcc ggaaggatcc tccggcaccg gccctgtccg atgctcgggg gctgtagttg ctcttcttgg ggtggaaatg gacttggttg tgcccacctg ggctccatca gatgtggaga agattgatgg attaagggag agcgcaagct tgtggcacca gcgaaggtta gggaggaaac actcttgctg tggagagtaa gcatctgttg acggcgatcg gccgaggtcc ttcgatgtgc cccgatcgtt gcgatgatta tgcatgacgt tctccaccct gcaacaagaa tgatggcctc tccccgtcgc ggtgcatggc tcaagctgcc aggggacaac ccttgaggac ttggctgtgg ggaatgctgg caacttacgt tcggattgaa ttcgtgtcaa gcagtcagta ttgaaatcat agcgttttgg gtcaaaaata atttcttggc ccagtttgca catggaccga acctcaaggc tggttgccct aggagaccga aggaagggcc acacgtacga ccgtcaccat tgagcacttt caaacatttg tcatataatt tatttatgag tcccagcaac gttcgagacg gtcggccacc ccgccgctcc cggcgccgag ggggtccaag agtggttgat tcttggtctc tggaaagttc aatcgcaatg gcttgatgga gcagcttggt tggaatcgga cttgagtgcc tgataaatta tgtgaaagca caagtcccct tggtgctgca gggtgatgtg gactagcgta gattgatgtc ctttgccgat gaggatggtt ggactactgc cgaccacagg ccgggaccct cgtcaagaat gcaataaagt tctgttgaat atgggttt ggtggaagag ctgtcgtacc gccgtcgctc tccagaagcc gagatcgtgc tcgctttcca aacctgctga tctgtcgaag ccagttgagg cggtccttga gtaccaagaa gcagatgttg gggctacctg ttgctgatgg atctccattc gagcattctg aaaaatgcct attactggag aagtttgctg actgttactg aacatgaaca ggcccgacag gcgatccgga atcatcacgc atggcgatgg gggtgcaccc taagctctag ttcttaagat tacgttaagc ttcaatgtat tgccgccgct cgttccaggg tcggcaacgt tgcagcccat accggatcct acagtgagga cggacaaagc atgctaaaga cagcagctgt tgagggagag attgtttcct gtggcaaggt ctgctccttt cgtacgtcga atagctggga atgttgaagg ggactgtgac aggtactgga gcccaccgcg agatgcctga ccatcagaga cggagctaac cgccggagaa ctttctccct ggaagacctt aagaagcttc tgaatcctgt atgtaataat 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 17 40 1800 I860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2318 P:\YAN\SPEC1FICAT10N\88144_SYC\88144 序列表(中).DOC 1 1269809 <210〉 4 <211> 1402 <212> DNA <213> MON810 <220> <221> misc—feature <222> (70βΥ..(706) <223> n is a, c, g, or t <400> 4 ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag 60 tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac 120 cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca 180 atcccactat ccttcgcaag acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag 240 gacacgctga caagctgact ctagcagatc taccgtcttc ggtacgcgct cactccgccc 300 tctgcctttg ttactgccac gtttctctga atgctctctt gtgtggtgat tgctgagagt 360 ggtttagctg gatctagaat tacactctga aatcgtgttc tgcctgtgct gattacttgc 420 cgtcctttgt agcagcaaaa tatagggaca tggtagtacg aaacgaagat agaacctaca 480 cagcaatacg agaaatgtgt aatttggtgc ttagcggtat ttatttaagc acatgttggt 540 gttatagggc acttggattc agaagtttgc tgttaattta ggcacaggct tcatactaca 600 tgggtcaata gtatagggat tcatattata ggcgatacta taataatttg ttcgtctgca 660 aagcttatta attgccaaat tagatatcct atcctgcttt tgttgngtgc tgttaaattg 720 ttaacgcctg aaggaataaa tataaatgac gaaattttga tggttatctc tgctccttta 780 ttgtgaccat aagtcaagat cagatgcact tgttttaaat attgttgtct gaagaaataa 840 gtactgacag tattttgatg cattgatctg cttgtttgtt gtaacaaaat ttaaaaataa 900 agagtttcct ttttgttgct ctccttacct cctgatggta tctagtatct accaactgac 960 actatattgc ttctcttaca tacgtatctt gctcgatgcc ttctccctag tgttgaccag 1020 tgttactcac atagtctttg ctcatttcat tgtaatgcag ataccaagcg gccatggaca 1080 acaacccaaa catcaacgag tgcatcccgt acaactgcct cagcaaccct gaggtcgagg 1140 tgctcggcgg tgagcgcatc gagaccggtt acacccccat cgacatctcc ctctccctca 1200 cgcagttcct gctcagcgag ttcgtgccag gcgctggctt cgtcctgggc ctcgtggaca 1260 tcatctgggg catctttggc ccctcccagt gggacgcctt cctggtgcaa atcgagcagc 1320 tcatcaacca gaggatcgag gagttcgcca ggaaccaggc catcagccgc ctggagggcc 1380 tcagcaacct gtaccaaatc ta 1402 P\YAN\SPECIFICATION\88144_SYC\88144 序列表（中).DOC 1 -6 - 1269809 <210> 5 <211〉 2145 <212> DNA <213> NK603 <400> 5 ccctctcctc tttctttctc cgtttttttt tccgtctcgg tctcgatctt tggccttggt 60 agtttgggtg ggcgagaggc ggcttcgtgc gcgcccagat cggtgcgcgg gaggggcggg 120 atctcgcggc tggggctctc gccggcgtgg atccggcccg gatctcgcgg ggaatggggc 180 tctcggatgt agatctgcga tccgccgttg ttgggggaga tgatgggggg tttaaaattt 240 ccgccgtgct aaacaagatc aggaagaggg gaaaagggca ctatggttta tatttttata 300 tatttctgct gcttcgtcag gcttagatgt gctagatctt tctttcttct ttttgtgggt 3 60 agaatttgaa tccctcagca ttgttcatcg gtagtttttc ttttcatgat ttgtgacaaa 420 tgcagcctcg tgcggagctt ttttgtaggt agaagtgatc aaccatggcg caagttagca 480 gaatctgcaa tggtgtgcag aacccatctc ttatctccaa tctctcgaaa tccagtcaac 540 gcaaatctcc cttatcggtt tctctgaaga cgcagcagca tccacgagct tatccgattt 600 cgtcgtcgtg gggattgaag aagagtggga tgacgttaat tggctctgag cttcgtcctc 660 ttaaggtcat gtcttctgtt tccacggcgt gcatgcttca cggtgcaagc agccggcccg 720 caaccgcccg caaatcctct ggcctttccg gaaccgtccg cattcccggc gacaagtcga 780 tctcccaccg gtccttcatg ttcggcggtc tcgcgagcgg tgaaacgcgc atcaccggcc 840 tcctggaagg cgaggacgtc atcaatacgg gcaaggccat gcaggcgatg ggcgcccgca 900 tccgtaagga aggcgacacc tggatcatcg atggcgtcgg caatggcggc ctcctggcgc 960 ctgaggcgcc gctcgatttc ggcaatgccg ccacgggctg ccgcctgatg atgggcctcg 1020 tcggggtcta cgatttcgac agcaccttca tcggcgacgc ctcgctcacg aagcggccga 1080 tgggccgcgt gatgaacccg ctgcgcgaat ggggcgtgca ggtgaaatcg gaagacggtg 1140 accgtcttcc cgttaccttg cgcggcccga agacgccgac gccgatcacc taccgcgtgc 1200 cgatggcctc cgcacaggtg aagtccgccg tgctgctcgc cggcctcaac acgcccggca 1260 tcacgacggt catcgagccg atcatgacgc gcgatcatac ggaaaagatg ctgcagggct 1320 ttggcgccaa ccttaccgtc gagacggatg cggacggcgt gcgcaccatc cgcctggaag 1380 gccgcggcaa gctcaccggc caagtcatcg acgtgccggg cgacccgacc tcgacggcct 1440 tcccgctggt tgcggccctg cttgttccgg gctccgacgt caccatcctc aacgtgctga 1500 tgaaccccac cccgaccggc ctcatcctga cgctgcagga aatgggcgcc gacatcgaag 1560 ttatcaaccc gcgccttgcc ggcggcgaag acgtggcgga cctgcgcgtt cgctcctcca 1620 cgctgaaggg cgtcacggtg ccggaagacc gcgcgccttc gatgatcgac gaatatccga 1680 P:\YAN\SPEC1F1CAT10N\88 丨 44_SYC\88144 序列表（中).DOC 1 1269809 tcctcgctgt cgccgccgcc ttcgcggaag gggggaccgt gatgaacggt ctggaagaac 1740 tccgcgtcaa ggaaagcgac cgcctctcgg ccgtcgccaa tggcctcaag ctcaatggcg 1800 tggattgcga tgagggcgag acgtcgctcg tcgtgcgtgg ccgccctgac ggcaaggggc I860 tcggcaacgc ctcgggcgcc gccgtcgcca cccatctcga tcaccgcatc gccatgagct 1920 tcctcgtcat gggcctcgtg tcggaaaacc ctgtcacggt ggacgatgcc acgatgatcg 1980 ccacgagctt cccggagttc atggacctga tggccgggct gggcgcgaag atcgaactct 2040 ccgatacgaa ggctgcctga tgagctcgaa ttcccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa 2100 gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatca 2145 <210> 6 <211> 834 <212> DNA <213> T25 <400> 6 attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag 60 acccttcctc tatataagga agttcttttc atttggagag gacagggtac ccggggatcc 120 tctagagtcg acatgtctcc ggagaggaga ccagttgaga ttaggccagc tacagcagct 180 gatatggccg cggtttgtga tatcgttaac cattacattg agacgtctac agtgaacttt 240 aggacagagc cacaaacacc acaagagtgg attgatgatc tagagaggtt gcaagataga 300 tacccttggt tggttgctga ggttgagggt gttgtggctg gtattgctta cgctgggccc 360 tggaaggcta ggaacgctta cgattggaca gttgagagta ctgtttacgt gtcacatagg 420 catcaaaggt tgggcctagg atccacattg tacacacatt tgcttaagtc tatggaggcg 480 caaggtttta agtctgtggt tgctgttata ggccttccaa acgatccatc tgttaggttg 540 catgaggctt tgggatacac agcccggggt acattgcgcg cagctggata caagcatggt 600 ggatggcatg atgttggttt ttggcaaagg gattttgagt tgccagctcc tccaaggcca 660 gttaggccag ttacccagat ctgagtcgac ctgcaggcat gcccgctgaa atcaccagtc 720 tctctctaca aatctatctc tctctataat aatgtgtgag tagttcccag ataagggaat 78〇 tagggttctt atagggtttc gctcatgtgt tgagcatata agaaaccctt agta 834 <21〇> 7 <211> 2986 <212> DNA <213> TC1507 <4〇〇> Ί cgttctgatt gctaacttgc cagtgtttct ctttggggaa tcctgggatg gctctagccg 60 P:\YAN\SPECIF1CAT10N\88144_SYC\88144 序列表（中).DOC 1 1269809 ttccgcagac gggatagatt tcatgatttt ttttgtttcg ttgcataggg tttggtttgc 120 ccttttcctt tatttcaata tatgccgtgc acttgtttgt cgggtcatct tttcatgctt 180 ttttttgtct tggttgtgat gatgtggtct ggttgggcgg tcgttctaga tcggagtaga 240 attctgtttc aaactacctg gtggatttat taattttgga tctgtatgtg tgtgccatac 300 atattcatag ttacgaattg aagatgatgg atggaaatat cgatctagga taggtatacg 360 tgttgatgcg ggttttactg atgcatatac agagatgctt tttgttcgct tggttgtgat 420 gatgtggtgt ggttgggcgg tcgttcattc gttctagatc ggagtagaat actgtttcaa 480 actacctggt gtatttatta attttggaac tgtatgtgtg tgtcatacat cttcatagtt 540 acgagtttaa gatggatgga aatatcgatc taggataggt atacatgttg atgtgggttt 600 tactgatgca tatacatgat ggcatatgca gcatctattc atatgctcta accttgagta 660 cctatctatt ataataaaca agtatgtttt ataattattt tgatcttgat atacttggat 720 gatggcatat acagcagcta tatgtggatt tttttagccc tgccttcata cgctatttat 780 ttgcttggta ctgtttcttt tgtcgatgct caccctgttg tttggtgtta cttctgcagg 840 tcgactctag aggatccaac aatggagaac aacatacaga atcagtgcgt cccctacaac 900 tgcctcaaca atcctgaagt agagattctc aacgaagaga ggtcgactgg cagattgcca 960 ttagacatct ccctgtccct tacacgtttc ctgttgtctg agtttgttcc aggtgtggga 1020 gttgcgtttg gcctcttcga cctcatctgg ggcttcatct ctccatctga ttggagcctc 1080 tttcttctcc agattgaaca gctgattgaa caaaggattg agaccttgga aaggaatcgg 1140 gccatcacta cccttcgtgg cttagcagac agctatgaga tctacattga agcactaaga 1200 gagtgggaag ccaatcctaa caatgcccaa ctgagagaag atgtgcgtat acgctttgct 1260 aacacagatg atgctttgat cacagccatc aacaacttca cccttaccag cttcgagatc 1320 cctcttctct cggtctatgt tcaagctgct agcctgcact tgtcactact gcgcgacgct 1380 gtgtcgtttg ggcaaggttg gggactggac atagctactg tcaacaatca ctacaacaga 1440 ctcatcaatc tgattcatcg atacacgaaa cattgtttgg atacctacaa tcagggattg 1500 gagaacctga gaggtactaa cactcgccaa tgggccaggt tcaatcagtt caggagagac 1560 cttacactta ctgtgttaga catagttgct ctctttccga actacgatgt tcatacctat 1620 ccgattcaaa cgtcatccca acttacaagg gagatctaca ccagttcagt cattgaagac 1680 tctccagttt ctgcgaacat acccaatggt ttcaacaggg ctgagtttgg agtcagacca 1740 ccccatctca tggacttcat gaactctttg tttgtgactg cagagactgt tagatcccaa 1800 actgtgtggg gaggacactt agttagctca cgcaacacgg ctggcaatcg tatcaacttt 1860 cctagttacg gggtcttcaa tcccgggggc gccatctgga ttgcagatga agatccacgt 1920

P\YAN\SPECIFICATION\88144 SYC\88I44 序列表（中).DOC I 1269809 cctttctatc ggaccttgtc agatcctgtc ttcgtccgag gaggctttgg caatcctcac 1980 tatgtactcg gtcttagggg agtggccttt caacaaactg gtacgaatca cacccgcaca 2040 ttcaggaact ccgggaccat tgactctcta gatgagatac cacctcaaga caacagcggc 2100 gcaccttgga atgactactc ccatgtgctg aatcatgtta cctttgtgcg ctggccaggt 2160 gagatctcag gttccgactc atggagagca ccaatgttct cttggacgca tcgtagcgct 2220 acccccacaa acaccattga tccagagaga atcactcaga ttcccttggt gaaggcacac 2280 acacttcagt caggaactac agttgtaaga gggccggggt tcacgggagg agacattctt 2340 cgacgcacta gtggaggacc attcgcgtac accattgtca acatcaatgg gcaacttccc 2400 caaaggtatc gtgccaggat acgctatgcc tctactacca atctaagaat ctacgttacg 2460 gttgcaggtg aacggatctt tgctggtcag ttcaacaaga caatggatac cggtgatcca 2520 cttacattcc aatctttctc ctacgccact atcaacaccg cgttcacctt tccaatgagc 2580 cagagcagtt tcacagtagg tgctgatacc ttcagttcag gcaacgaagt gtacattgac 2640 aggtttgagt tgattccagt tactgccaca ctcgagtaag gatccgtcga cctgcagcca 2700 agctttcgcg agctcgagat ccccgacata tgccccggtt tcgttgcgac taacatgagt 2760 tcttggacaa atttgattgg acctgatgag atgatccaac ccgaggatat agcaaagctc 2820 gttcgtgcag caatggaacg gccaaaccgt gcttttgtcc ccaagaatga ggtgctatgc 2880 atgaaggaat ctacccgttg atgtccaaca gtctcagggt taatgtctat gtatcttaaa 2940 taatgttgtc ggtattttgt aatctcatat agattttcac tgtgcg 2986 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> 0205C <4〇〇> 8 tccgcggctt gttgtggtct tttg 24 <21〇> 9 <211〉19 <212> DNA <213> YCC-6 <400> 9 ttccaggggc tcaagtcca 19 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> YCC-2 P:\YAN\SPECIFICATI0N\88I44_SYC\88M4 序列表（中)D〇C 1 -10- 181269809 <4〇〇> 10 tctccttgat gggctgca <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> YCC-35 <4〇〇> 11 tcgcccgccg ctcctccaga ag 22

<21〇> 12 <211> 30 <212> DNA <213> YM556B <4〇〇> 12 tgacactata ttgcttctct ttacatacgt 30 <21〇> 13 <211〉 28 <212> DNA <213> PYM92 <4〇〇> 13 ctcgatgcct tctccctagt gttgacca 28 <21〇> 14 <211> 20 <212> DNA <213> 0726D-5, <4〇〇> 14 gtgacaaatg cagcctcgtg 20 > > > > 0 12 3 i—I 1—I -—I τ—I 2 2 2 2 < < < <

15 18 DNA 0712B <400〉 15 tgcgttgact ggatttcg 18

<21〇> 16 <211〉 28 <212〉 DNA <213> PK06D <4〇〇> 16 tgctaacttg cgccatggtt gatcactt

<210> 17 <211> 23 <212> DNA P:\YAN\SPEC1F1CATI0N\88144_SYC\88144 序列表（中).DOC 1 -11 - 28 1269809 <213> RT5006 <400> 17 ttaggccagt tacccagatc tga <210> <211> <212> <213> 18 25 DNA RT3124 <400> 18 attcccttat ctgggaacta ctcac <21〇> <211> <212> <213> 19 26 DNA GT42 <400> 19 catgcccgct gaaatcacca gtctct <210〉 <211> <212> <213> 20 18 DNA l〇14Ra <400> 20 cgacctgcag ccaagctt <21〇> <211> <212> <213> 21 22 DNA l〇14Rb <4〇〇> 21 tcatgttagt cgcaacgaaa cc <21〇> <211〉 <212> <213> 22 25 DNA TC1014R <4〇〇> 22 cgagctcgag atccccgaca tatgc <210> <211> <212> <213> 23 20 DNA 7 5 <400> 23 ccgacagtgg tcccaaagat <210〉 24 P:\YAN\SPECIFICAT10N\88144_SYC\88144 序列表（中).DOC 1 1269809 <211> 26 <212> DNA <213> 161S <400> 24 agtggagata tcacatcaat <210> 25 <211〉 20 <212> DNA <213> 100 <4〇〇> 25 cccacccacg aggagcatcg ccactt <210> 26 <211> 22 <212〉 DNA <213〉 hmg-c <4〇〇> 26 ttggctacat agggagcctt gt <210〉 27 <211〉 23 <212> DNA <213> hmg-d <400〉 27 gagtcggtaa gctccatctt ctg P:\YAN\SPEC1F1CATI0N\88144_SYC\88144 序列表（中).DOC 1

Claims (1)

1269809 拾、申請專利範圍： 公告本 圍 種負體’其包括一啟動子，一玉米内部對照基因及下 列核酸序列：序列辨識編號：1，序列辨識編號：2，序 歹J辨識編號：3，序列辨識編號：4 ,序列辨識編號：5， 序列辨識編號：6及序列辨識編號：7。 2_ 根據申清專利範圍第1項之質體，其中該啟動子為CaMV 3 5 S啟動子。 3. 4. 5. 根據申。目專利範圍第丨項之質體，其中該玉米内部對照 基因為玉米澱粉合成酵素lib (maize starch synthase lib) 基因，轉化酵素（invertase)基因或高移動群蛋白質（high mobility group，HMG)基因。 根據申請專利範圍帛i項之質體，其中該玉米内部對照 基因為南移動群蛋白質（HMG)基因。 根據申請專利範圍帛丨項之質體，其中該啟動子為 CaMV35S啟動子及該玉米内部對照基因為hmg。 6. 一種載體，其包括申請專利範圍第丨或2項之質體 8. 一種宿主細胞，其 根據申請專利範圍 k玉米品系Btll、 T25 及 TC1507 〇 包括申請專利範圍第6項之載體。 第1項之質體，其可用於檢測基因改 Eventl76、GA21、MON810、NK603、 其由序列辨識編號 9· 一種雜交至Btll基因序列之探針 之序列組成。 10. 一種雜交至GA2 1基因序列之引子對 辨識編號：9及序列辨識編號·· 1 〇。 其序列分別為序列 O:\88\88144-950704.DOC 1269809 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 一種雜交至GA21基因序列之探 十，其係由序列接^ 號：11之序列組成。 辨喊編 其係由序列辨識 其係由序列辨識 其序列分別為序 一種雜交至MON810基因序列之弓|子 編號：12之序列組成。 一種雜交至MON810基因序列之探针 編號：13之序列組成。 一種雜交至NK603基因序列之引子對 列辨識編號：14及序列辨識編號：丄$。 一種雜交至NK603基因序列之探針， 號：16之序列組成。 …、係由序列辨識編 -種雜交i T25基因序列之引子對，其序列分 辨識編號：17及序列辨識編號：18。 幻 一種雜交至T25基因序列之探針， 1Q、“““ 木卞其係由序列辨識編號: 1 9 <序列組成。 一種雜交至TC1 507基因序列之引 』< 5丨子對，其序列分別為岸 列辨識編號：20及序列辨識編號：2i。 一種雜交至TC 1507基因序列之禊 斤歹叫針，其係由序列辨識編 號：22之序列組成。 一種雜交至CaMV 3 5S啟動子之引早料 、 5丨子對，其序列分別為序 列辨識編號·· 23及序列辨識編號：24。 一種雜交至CaMV 35 S啟動子之您私甘化ι 勒于又彳木針，其係由序列辨識編 號：2 5之序列組成。 -種雜交至玉米高移動群蛋白質（high mGb叫㈣叩， HMG)基因序列之引子對，其序列分別為序_識編號： O:\88\88144-950704.DOC -2- 1269809 26及序列辨識編號：27。 23 24. 25. 26. 一種檢測基因改造玉米品系之方法，其係使用如申請專 利範圍第i項之質體及一或多種如申請專利範圍第9項 至第22項所列之引子及探針。 -種檢測基因改造玉米品系之套組，其包括根據申請專 利範圍第！項之質體，一或多種專一性雜交至bui、 GA21、MON810、NK603、Eventl76、丁25 及 Tcl5〇7 基 因改U玉米轉殖w系之引子及探針，如巾請專利範圍第 2〇項之引子’如申請專利範圍第21項之探針，如申請專 利範圍第22項之引子，及即時pcR反應溶液配方。… 根據申請專利範圍第Μ項之套組，其中專一性雜交至 BtU、GA21、MON81〇、NK6〇3、丁25 及 tci5〇7 基因改 k玉米轉殖品系足探針分別如申請專利範圍第9、1工、 13、15、17及19項所列。 根據申請專利範圍第24項之套組，其中專一性雜交至 GA21、MON810、NK603、T25 及 TC1507 基因改造玉米 轉殖品系之引子分別如中請專利範圍帛1G、12、14、 及1 8項所列。 O:\88\88144-950704.DOC