TWI248357B - The preparation process of living human dermal and skin substitutes - Google Patents

Description

、1248357 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關生物性真皮、皮膚替代物之製作方法及用途。 【先前技術】 ^皮膚為人體最大的組織結構，並為防禦外界病原入侵的第一道防線，故皮膚一旦遭 受極大損傷時，人體即可能遭受嚴重感染的威脅甚至喪命。利用組織工程以結合皮膚細 胞及天然(或合成)的細胞外基質來製造具生物功能性的生物人工皮膚(artiflcial skin)，不 僅可以解決異體皮膚排斥的問題，克服自體皮膚移植限量的困難，並且可因應需求 同，提供多樣化的生物人工皮膚。 傳統皮膚移植的方式，是將身體某處完整皮膚移植到受傷的皮膚表面，除維持皮膚 的^旎外亦有利於皮膚再生及使傷口癒合的功能。但由於身體的表面皮膚有限，因此對 於k性傷口、燒燙傷面積廣大或在治療上需要重複植皮的病患而言，傳統的自體植皮便 不實用。因此在治療上，人類的屍皮就被廣泛應用作為暫時性的敷料，不過屍皮敷料除 外，亦有供應短缺及保存不易的問題，特別是還有傳染性疾病(例如肝炎或 AIDS)感染的潛在危險。 Λ *為解決前述問題及因應大量皮膚傷口植皮所需，研究人員則致力於人工皮膚的開發 研九。自體上皮細胞膜（cultured epidermal autograft;簡稱CEA)即為其一，它的傣點 票f iff膚於2〜3週内複製1〇3倍，供應大面積燒烫傷患者^皮，以促進i 癒合。但疋自體上皮細胞膜的移植亦面臨一些問題：操作不易、易有水泡生成、皮 口的接受(take)差異大及上皮層與真皮層間的結合力弱容易落。 $=¾層傷日，則需要真皮層填充物以避免傷口過度收縮^成^癒=25 心為解決述問題及目應不同的皮膚傷口的治療，填充真皮層的基質填充物、真皮替代 ϊ 丄皮严物恤n *滅)即陸續被開發*來無細胞ί真g i皮t τ膝®原蛋白凝膠(C0U啊gel)]或天然的基質組織(如人類 便是分別於1995及1996树過美國食品藥物管理 i有生^功1^近林結合麟母細胞及無細胞真妓質所形成 於基礎研究、細^的^= 的齡。另外，生祕人卫歧也可以應用 1248357 於其上以製作皮膚相等物^kin equivalent)，如此製備之皮膚相等物其基本 造相似，應用於大鼠皮膚時，並無排斥反應發生且大鼠接受良好，並"血、其 (vascularization)a^^tffM 〇 ^ Bell 4?6045346 利(4,485,096號)中之真皮替代物為基質，植人穿洞⑦職的的皮膚組 角胎的 接來，，，，，該專利強調已分化完成之表皮與真皮基質 3分化分層的時間外，亦可藉由製備大面積的皮膚相等物作為大面積燒

Bernard氏等人在他們美國專利第5,639,654號中揭露結合^ ^ 母細胞及培養㈣絲魏，賊齡錄aif腿de)於歸上 以製，，如此製備之皮射代物其真皮替代物與表皮。 細胞为化为層7〇全’、與十類皮膚結構類似。另Elsenberg氏在其美國專利第6〇3976〇垆 中則寿型或第^^(typelll；)膠原蛋自或其混合之膠原蛋白為基“ ; 雉母細胞及角質細胞之培養，以製作複合皮膚替代物(eGmpGsitesWns制 : $試者皆可射其皮㈣代物且傷°癒合情況良好，並皮膚#代物$有收 另f國Organogenesis公司所出產已通過FDA認可上 Ap^af^Gra趾in)則是利用牛第-型(type D膠原蛋白與人類纖維母細胞共同層形 hvmgskmequivalent)。此皮膚替代物無感染性病原及引發免疫反應之抗原存在\ / 與人類皮膚相似，並已被廣泛應用於慢性皮膚潰瘍傷口之治療。 由於一般皮膚替代物絕大部分是由萃取之膠原蛋白進行基質製作後， 代物之製備，其結構不似天然之基質骨架(scaffold)。由於天然之基質骨架提供完 層内膠原纖維立體架構，利於細胞的攀附、生長及胞外間質的生成。、為^ 之 膚替代物，仍需尋找更適合且來源豐富並具天然立體結構之基質成再、=匕fig 技術，以發展便利有效之皮膚替代物。 胃表作 【發明内容】 本發明係關於生物性真皮、皮射代物之製作方法，其侧 的緒皮所開發出新穎且具天然立體結構的真皮基質，植人人類纖維 胞。^維=胞可在豬真皮基質表騎著及伸展，並在豬皮基質内職著其膠原纖維 束’形成a有人類纖維母細胞的生物性真皮替代物。另人類皮膚肖質胞丨在物:陡 真皮替代物的乳突狀基質上附著並分化成多層的上皮層結構，胃=成=二 物0 本發明另提供本發明所製得之生物性真皮、皮膚替代物之方法。 【實施方式】 '1248357 本發明之目的為提供製備生物性真皮、皮膚替代物之方法。該方法包括取裁成適當 ^小之無細胞豬真皮基質，種上人類纖維母細胞，待細胞附著伸展後以形成生物性真皮 替代物。將人類皮膚角質細胞種植於前述製得之生物性真皮替代物上，加入使角質細胞 生長及分化之培養液，待角質細胞分層後即可製得生物性皮膚替代物。較佳地，所使用 之角質細胞生長及分化之培養液為自行開發之階段性培養液。 本發明之另一目的係提供生物性真皮、皮膚替代物，其係利用清潔、無污染及無疾 病的豬皮所開發出新穎且具天然立體結構的真皮基質，植入人類纖維母細胞及皮膚角質 細胞。其中該皮膚替代物之纖維母細胞可在豬真皮基質表面附著及伸展，並在豬皮基質 内攀附其膠原纖維束，形成含有人類纖維母細胞的生物性真皮替代物，且皮膚角質細胞 可在$物性真皮替代物的乳突狀基質表面上附著並分化成多層的上皮層結構。根據本發 明所製得之生物性真皮、皮膚替代物其結構完整緻密，在結構及性質上與人類皮膚更為 接近，而增加其在醫療、基礎研究及體外檢測系統應用之便利性及範疇。 依本發明所製得之生物性真皮、皮膚替代物，具有下列優點4丨)所使用豬真皮基質 無特定感染性病源污染，且在去細胞過程中已去除會引起免疫反應之細胞及組'成；（2) 所使用豬真皮基質具天然立體結構，此使得真皮纖維母細胞易於附著、伸展及分化，除 有助於生物性皮膚替代物上皮層之形成外，所得生物性真皮、皮膚替代物更 皮 膚結構及性質。 本發明另一目的為所使用之豬皮基質具天然的真皮層，除具有天然基質成分(膠原 蛋白，胞外間質)外並擁有原始的膠原纖維束三度空間結構。三度空間的立體社構士利 ^深層傷口的填充，避免傷口過度收縮，基質内膠原蛋白可協助細胞的附著、移、生 長及分化’加速傷口的復癒。豬皮基質在去除皮膚細胞後，可以除去免疫及感染的問 ，可以直接應用於臨床治療。台灣豬皮的來源豐沛，加上製程簡便，於是▲夠大量降低 ^質的成本，故本發明係利用自行開發之豬真皮基質作為生物性真皮、皮膚替代物之基 貝0 依士發明所製得之生物性真皮、皮膚替代物可作為皮膚移植或植入材料、 研九、藥物穿透性測試系統或化妝品抗紫外線檢測系統。 土 ^發明提供下列實施例進一步說明本發明，該等實施例之目的係為說明本發明並 作為本發明之限制。 卜 實施例1 :豬真皮基質之製作 新鮮豬皮經過清洗、除去皮下脂肪後再以脫毛劑徹底清除豬毛及毛根。以 =皮劇至0.016英吋厚。剷好的豬皮先以含抗生素盤尼西林(6〇〇〇u/m 浓 (Phosphate-buffered saline，簡稱PBS，ΡΗ7·0)浸泡，再以無菌水清洗數次後 ' 二$ 述去細胞步驟。 人1交丹進仃下 •首先將前述處理後之豬皮，先以0.25%胰蛋白酶(trypsin)溶液及0.04%中性|合 (dispase)溶液於37。(：作用，直到上皮層剝離。再以0.1〇/〇TritonX-100於4°c作用脾畫

皮層内細胞及其殘骸移除。去掉細胞的豬真皮基質保存在15%甘油中，再經強产 3^0照射4小時進行滅菌，完成的豬皮基質可冷;東保存㈣。。，藉由組g切^ J 木务、與伊紅染色；簡稱H&E staining)觀察豬真皮基質内膠原纖維結構及細胞殘留产巴^穌 1248357 結果顯示，去除細胞之豬真皮基質内沒有細胞的殘留並且仍保有豬真皮的原始架構(圖 ΙΑ、1B)。另外，如圖1C所示豬真皮基質膠原纖維束呈絲狀或束狀疏鬆纏繞，顯示去 細胞的處理過程並未破壞基質真皮層的纖維結構。 實施例2 :人類皮膚細胞之分離及培養 自醫院取得的人類皮膚組織，利用含珍他黴素(gentamicin)(10ug/ml)的培養液清洗 3-5次，再利用2.4U/ml中性蛋白酶(Dispase)將皮膚上皮層與真皮層分離，兩皮層再分別 以0.25%胰蛋白酶及0.1%膠原蛋白酶(collagenase)作用，分離出單一的人類皮膚上皮層 角質細胞及人類真皮層纖維母細胞。分離出的皮膚細胞分別培養於適合細胞生長及分化 的細胞培養液中，並培養於37°C，5% C02培養箱内，每2-3天更換一次培養液。結果 顯示以中性蛋白酶及胰蛋白酶分離培養的人類皮膚角質細胞，在前三代培養階段，細胞 聚落形成率平均在20%以上，顯示前三代的人類皮膚角質細胞具有良好的增殖能力，如 圖2A所示人類皮膚角質細胞的細胞形態及聚落的形成。另外，以膠原蛋白酶分離皮膚 真皮層的人類推纖維母細胞亦有良好的生長速率及型態，如圖2B所示。 實施例3 :生物性皮膚替代物之製作 1·生物性真皮替代物之製作 無細胞豬皮基質於實驗前先用緩衝液(Dulbecco’s Phosphate-buffered saline，簡稱 DPBS)清洗數遍’裁成適當大小後放入培養盤孔槽中，於每一孔槽中加入含%牛胚胎 血清(fetal bovine serum)之 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (簡稱 DMEM)的人類纖維 母細胞培養液浸泡待用。繼代培養中的人類纖維母細胞經由005%胰蛋白酶作用將細胞 自培養瓶中取下，計算細胞數目後，調整細胞濃度為1X105cell/cm2再植入豬皮基質網狀 真皮面(reticular dermis)。經過培養7天後，以掃瞄式電子顯微鏡(scanning electlOI1 microscope;簡稱SEM)及組織切片染色觀察人類纖維母細胞在基質内附著、增殖及遷移 的情形。結果發現已去細胞的豬真皮基質為架構，有利於人類纖維母細胞的附著、生長 及生物功能的表現。由SEM照片可以看到人類纖維母細胞不僅附著在基質表面，並藉 由偽足攀附在膠原纖維上，如圖3A所示。另外由H&E組織切片染色的結果可知，人 類纖維母細胞會從豬基質表面遷移延伸至基質内部，並攀附在膠原纖維上，細長的人類 $維母細胞會隨著天數的增加逐漸伸展，並開始分化進行基質的再建(rem〇deli 圖 3B所不，箭頭所指者即為人類皮膚纖維母細胞。 2·生物性皮唐替代物之製作

人類皮膚角質細胞利用0·05%胰蛋白酶將細胞自培養皿中取下，所得细胎於 後，調整細胞濃度為3X1Q6ceU/em2，再種植於本發明之生物性真皮替S 面，此時所用細胞培養液為促進皮膚角質細胞生長的第一 ρ白叙不3血π之角質細胞培養液，其主要為以MCDB_153培養液為主培養液。 1248357 化合物所配製成之水i液，較;i者t氣 荖、fi7八染色觀察t類皮膚脱細胞在生物性活真皮替代物上附 ΐ菩ΐ人類皮膚角f細胞在豬基質基底層不規則的凹&面上 2貝者生長，並沿著表面’形成一多層化的上皮層（圖 β( ^ · ”、、貝曰（Stl=Um comeum)、顆粒層(stratum granulosum)及棘狀細胞 f (Saturn spmosum)形成，而且表皮底層有排列規則組織化並呈矮小柱狀的基底 g (basal cell layer)，形成與人類皮膚組織結構(圖4C)十分相近的皮膚替代物。- 由於皮膚角質細胞生長分化，須有技術性的培養條件及方式，才能 备 f上f層二此實驗結果顯示，採用目前培養條件有利於角質細胞生長及分化，並可以ί 成全皮功能的生物性皮膚替代物。故依本發明方法所製得生物性真 膚 枓、皮膚基礎研九、樂物牙透性測試系統或化妝品抗紫外線檢測系統之用。 實施例4 :生物性活皮替代物動物測試 2 8週大之裸鼠(BALB/c-nu)以ketamine麻醉之後，以銳剪進行全皮層開創約15对 =λ·ί· ’植入物^真皮替代物及生物性活皮替代物，以縫線固定，覆蓋 上^ucidm，以3 M Tegaderm將整個傷口包住，最後再以3M Coban™繃帶纏繞。2l 天後解開傷口，進行組織切片觀察，如圖5所示，未植入基質之傷口沒有角質声覆芸， fit佳’植人活真皮及活皮替代物之傷口癒合程度、角質層皮膚層數均較只^入^基 【圖式簡單說明】 圖1A為正常豬皮膚之組織切片H&E染色圖(2〇〇χ): 圖1B為無細胞豬真皮基質之組織切片圖(2〇οχ) 圖1C為豬皮基質電子顯微鏡圖(250X)。 圖2A為人類皮膚纖維母細胞照片（2〇〇χ): 圖2B人類皮膚角質細胞(200X)。 圖3A為本發明之生物性真皮替代物電子顯微鏡圖(ιοοοχ); 圖3B為本發明之生物性真皮替代物組織切片h&e染色圖(200X)。 圖4A為本發明之生物性皮膚替代物電子顯微鏡圖(LQoox) 圖4B為本發明之生物性皮膚替代物組織切片H&E染色圖(2⑻X) 1248357

切片職染色聊Χ)。其中a為角質層;b為上皮層;C 圖圖圖圖 未植入無細胞豬基質之組織切片H&E染色圖(200X) β為植入無細胞豬基質之組織切片H&E染色圖(200X) 植入生物性真皮替代物之組織切片Η&Ε染色圖(200Χ) 為植入生物性皮膚替代物之組織切片Η&Ε染色圖(200Χ) 【主要元件符號說明】 、申請專利範圍： •申請專利範圍 1. 種生物性真皮替代物之製作方法，包括下列步驟： (1) 無細胞豬皮基質放入培養盤孔槽中，於每一孔槽中加入添加血清之DMEM的人 類皮膚纖維母細胞培養液浸泡待用； (2) 將人類皮膚纖維母細胞植入於(1)之無細胞豬皮基質網狀真皮面，待纖維母細胞 在基質内及表面附著及伸展即得。 2. 如申請專利範圍第i項所述之方法，其中之人類皮膚纖維母細胞可為初代培養細胞、 細胞株或基因操控之細胞而得。 3. —種生物性皮膚替代物之製作方法，包括下列步驟： (1) 生物性真皮替代物之製作 (i)無細胞豬皮基質放入培養盤孔槽中，於每一孔槽中加入添加血清之DMem的 人類皮膚纖維母細胞培養液浸泡待用； (η)將人類皮膚纖維母細胞植入於①之無細胞豬皮基質網狀真皮面，待纖維母細 胞在基質内及表面附著及伸展即得； 、 (2) 生物性皮膚替代物之製作 細胞分裂生長 ⑼繼以糊第-階段肖f細胞培養液加人添加血清之纖維母細胞 第二階段角質細胞培養液，提供角質細胞多層分化； "彳于 ⑽再利用第二階段㈣細胞培養液再添加娜子及▲清馳成之第三階段 ①利用步驟⑴所得之真錢代物為基質，將人類皮膚角質細胞種植於真皮替代 物ίϋΐίί層面表面，並以第—階段不含血清之角f細胞培養液提供角質 之 角 質細胞培養液，提供角質細胞分化形成角質層即得

Claims (1)

1248357 切片職染色聊Χ)。其中a為角質層;b為上皮層;C 圖圖圖圖 未植入無細胞豬基質之組織切片H&E染色圖(200X) β為植入無細胞豬基質之組織切片H&E染色圖(200X) 植入生物性真皮替代物之組織切片Η&Ε染色圖(200Χ) 為植入生物性皮膚替代物之組織切片Η&Ε染色圖(200Χ) 【主要元件符號說明】 、申請專利範圍： •申請專利範圍 1. 種生物性真皮替代物之製作方法，包括下列步驟： (1) 無細胞豬皮基質放入培養盤孔槽中，於每一孔槽中加入添加血清之DMEM的人 類皮膚纖維母細胞培養液浸泡待用； (2) 將人類皮膚纖維母細胞植入於(1)之無細胞豬皮基質網狀真皮面，待纖維母細胞 在基質内及表面附著及伸展即得。 2. 如申請專利範圍第i項所述之方法，其中之人類皮膚纖維母細胞可為初代培養細胞、 細胞株或基因操控之細胞而得。 3. —種生物性皮膚替代物之製作方法，包括下列步驟： (1) 生物性真皮替代物之製作 (i)無細胞豬皮基質放入培養盤孔槽中，於每一孔槽中加入添加血清之DMem的 人類皮膚纖維母細胞培養液浸泡待用； (η)將人類皮膚纖維母細胞植入於①之無細胞豬皮基質網狀真皮面，待纖維母細 胞在基質内及表面附著及伸展即得； 、 (2) 生物性皮膚替代物之製作 細胞分裂生長 ⑼繼以糊第-階段肖f細胞培養液加人添加血清之纖維母細胞 第二階段角質細胞培養液，提供角質細胞多層分化； "彳于 ⑽再利用第二階段㈣細胞培養液再添加娜子及▲清馳成之第三階段 ①利用步驟⑴所得之真錢代物為基質，將人類皮膚角質細胞種植於真皮替代 物ίϋΐίί層面表面，並以第—階段不含血清之角f細胞培養液提供角質 之 角 質細胞培養液，提供角質細胞分化形成角質層即得 1248357 4·如申請專利範圍第3項所述之方法，其中之人類皮膚纖維母細胞可為初代培養細胞、 細胞株或基因操控之細胞而得。 5·如申請專利範圍第3項所述之方法，其中之人類皮膚角質細胞可為初代培養細胞、細 胞株或基因操控之細胞而得。 6·如申請專利範圍第3項所述之方法，其中第二階段角質細胞培養液是由第一階段角質 細胞培養液加入添加金清之纖維母細胞培養液，以1:1至5:1的比例調配而成。 7.如申請專利範圍第3項之方法，其中第二階段角質細胞培養液所添加之血清可為牛胚 胎血清(fetal bovine serum)、成牛血清(b〇vine serum)或小牛企清(caif serum) 〇 8·如申請專利範圍第3項之方法，其中第二階段角質細胞培養液所添加之血清最終含量 介於2-15%之間。 '' 9·如申請專利範圍第3項所述之方法，其中第三階段角質細胞培養液所添加觸 源可為4弓的化合物所配製成的各種水溶液提供。 ι〇·如申請專利範圍第3項所述之方法，其中第三階段角質細胞培養液 11·如申請專利範圍第3項所述之方法，其中第三階段角質細胞培養 牛胚胎血清(fetal bovine semm)、成牛血清(b〇vineserum)或小牛血清㈣可為 I2·如申請專利範圍第3項所述之方法，其中第三階段角質細胞培 終含量介於5-20%之間。 之所添加之血清的*