TW528803B - Microbiological process for the preparation of heteroaromatic carboxylic acids using microorganisms of the genus Alcaligenes - Google Patents

Description

528803 A7 ----_____ B7 五、發明説明（L ) 本發明是關於一新穎微生物方法，係製備雜環芳香 族羧酸或其生理上相容之鹽類，通式為

〇

H〇/^N^、COOH

II 其中R^R2可相同或不同，代表一氫或鹵素原子，而χ代表 氮原子或一CH—。 諸如6-羥基晚啶甲酸之雜環芳香族羧酸，是製備藥物 之一重要的中間產物，例如用來製備2_氧嘧啶（Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft 1912,45, pages 2456-2467)或製備除草劑（EP-A 0 447 004)。 含有腈水合酶及醯胺酶或腈酶之微生物可以把腈轉化 成相對應之故類疋眾所習知的。例如，在EP—A 〇 is? 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 中即利用棒狀桿菌、土壤絲菌、桿菌、無芽胞桿菌、球菌 、Brevibacterium屬微生物來製備如菸酸類之有機酸的 微生物方法。此反應必須在光能的存在下進行。Ep—a 〇 444 640提出利用紅球菌屬微生物來製備如於酸類之有機 酸的微生物方法。此反應必須於内醯胺存在下進行。 而且紅球菌屬微生物紅球菌Ji可把2—氰基吡時轉化成 池口井甲酸（Kobayashi et al.，J. of Antibiotics, V〇l. 43 ，No. 10，1990，pages 1316-1320)。然而，這些微生物 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2l〇2i29g公釐_) 528803 A7 B7 五、發明説明（2·) 並無法將2-氰基池淀轉化成13比淀甲酸（Mathew et a 1.， Appl. Environmental Microbiology, Vol. 54, No.4, 1988， pages 1030-1032)。 此外，由EP-A 0 504 818中可知利用2-氰基吡啶之產 驗桿菌屬微生物可把2-氰基吡啶轉化成6-羥基吡啶曱酸。 、 此方法的缺點是形成6-經基咐^定甲酸產率低。 本發明之目的是提供一較具經濟性微生物方法，由產 鹼桿菌屬的微生物來製備雜環芳香族羧酸或其生理上相容 之鹽類。例如吡口井羧酸、吡啶甲酸或吡啶甲酸鉻，其中所 形成之叛酸或其生理上相容鹽類之產率較高。 此目標可利用申請專利範圍第1項之方法達成。 一依據本發明方法是利用在生物轉化作用前經二羧酸、 三叛酸或碳水化合物培養之2—氰基吼淀之產驗桿菌屬微生 物’將雜環芳香族腈類基材轉化成如式工或式辽之雜環芳 香狹竣酸，其中雜環芳香族腈類之通式為 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 〇 ，X、〇 經 濟 部 中 央 標 準 消 費 合 作 社 印 製 R1

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IV ”、中x’R及所述之定義。如此即可轉化成 複酸，其中部份成為其生理上相容之 _ 理上相容«在此是指如鉻、贼城之生 1雜環芳香族 在實際生轉化仙之前，財法所用々 又產鹼屬微生 本紙張尺度適用中國 528803

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 物-般是要培養的，其有效的酵素可以和2_氯基吼淀一起 導入。2—氰基㈣可用於培養，使用濃度為請至2㈣ ，最好之濃度為〇. 1至lwt〇/Q。 二叛酸在此是指富馬酸、_酸、馬來酸、戊二酸、 丙一故或其鹽類及其衍生物如黯_。 三瘦酸在此是指檸檬酸、異檸檬酸或其鹽類及其衍生 物如酿類。二叛酸及三叛酸之鹽類及衍生物可以是富馬酸 鹽、蘋果酸鹽、丙二酸鹽、草醋酸鹽、檸檬酸鹽、丙烯三 酸鹽、異檸檬酸鹽、2-氧代戊二酸鹽、玻磁鹽或琥祕 -CoA。使用¥馬酸鹽、丙二酸鹽或伽酸鹽較好。 碳水化合物在此指單糖如葡萄糖，雙糖如蔗糖、海藻 糖或麥芽糖，三糖如棉子糖，糖醇如丙三醇。丙三醇是較 適合的碳水化合物。 二羧酸、三羧酸或碳水化合物較合宜之濃度為〇. i至 20wt%，濃度為0· 5至5wt%較好。 可利用眾所習知之培養媒介wKulla等人所用礦物鹽 媒介（Arch· Microbiol·，135，1-7，1983)，低莫耳數磷 酸鹽緩衝劑或如表1所列者。最好使用表1所列。 經過培養階段後’在眞正加入基材前，可使用傳統分 離方法來收集微生物或基材可直接加至微生物中。 生物轉化作用之基材即如式瓜及IV之雜環芳香族猜類 ，例如2-氰基吡啶是可買到的化合物。 通式I至IV中之X代表氮原子或一CH—，代表—CH、 較好◦ R1及R2基可相同或不相同，代表氫或鹵素如氣、氣 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格1 2102^29¾公曼) ' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •I今 - I ....... Γ- - 言 經濟部中央標準局工消費合作社印製 528803 A7 ______B7^__ 五、發明説明（4·) 、溴或碘。可能之基材如2-氰基吡啶、6-氯氰基吡啶 、5, 6-二氯-2-氰基吡啶、2-氰基吡时、6-氯-2〜氰基吡口井 或6-鼠-2-氧基^1比淀較適合做為基材。 生物轉化作用時基材可一次整批加入或連續地加入， 基材加入媒介之方式以保持媒介中基材濃度不超過2〇wt% 較適合，最好是以不超過l〇wt〇%。 生物轉化作用一般都以固定的細胞進行，而使用Ep_ A 0 504 818中利用2-氰基吡啶之產鹼桿菌屬微生物，此 微生物命名為DSM 6335，也可使用其相同功能之變形及突 變異種。這些微生物在1991年3月1日依據布達佩斯協議記 錄在 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und

Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig o 「相同功能之變形及突變異種」是指具有和原來之微 生物相同性質及功能之微生物。變形和突變異種可以利用 如UV光照射而達成。 生物轉化作用所用之媒介可以和培養微生物時所用之 媒介相同。生物轉化作用也可在有或無上述二羧酸、三羧 酸或碳水化合物存在狀態下進行。 通合之pH値為4至10，而pH値在5至9較適合。生物轉 化作用可在溫度10至5代範園進行，溫度在2〇〜价較 合。 通常轉化時間為6至副小時，接著可利用一般激於方 法如利用酸化，而得到如式！ Μ之適當舰。幾酸切 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 、ΐΤ

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以如銨鹽或鉻鹽的科被分離出。 饭汉所製備《雜環芳香族舰是在版置有堯基取代 如通式Π)則生物轉化作用在好氧的條件下進行較適合 :然而，假設所製備之雜環芳香族舰巾無減如吼淀甲 酸則其生物轉化作用在厭氧的條件下進行較適合。 實例 Θ 實例1 i備6-#f某晚喩 △使用產驗桿菌屬微生物 θ335來製備6—魅吼淀甲 酸之條件如下列。使用一有5升操作空間之7·5升發酵桶， 在礦物鹽媒介（表D中培養產驗桿菌_ 6咖。富馬酸 鈉鹽是唯一的碳及能源，並以2—氰基吡啶為誘導物，在3〇 °C 60〇rpm及ΡΗ=7·0的環境下進行。這段期間之充氣速率 、、、勺為3升/分4里，當ρ〇2 >3〇%時，以ρ〇2來控制添加富馬酸 鈉鹽。使用20%濃度之冨馬酸鈉鹽原料溶液，其中含有〇 $ %之2-氰基吡啶。在生物轉化作用前，細胞先培養直到約 23小時其光學密度在650nm測定値（〇%50)為16。在成長的 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 階段約使用160g的濃度為20%富馬酸鈉鹽溶液（約8〇〇ml) 〇 在2-氰基咐^定及6-#坐基0比淀甲酸之！氧生物轉化作用 是不添加碳及能源。生物轉化作用是在固定的細胞中進行 〇 利用幫浦限量地加入2-氰基吡啶，幫浦送料速率以 HPLC作「線上」監控。中間體吡啶甲酸之濃度限制在小於 巧氏張尺度適财關家標準（CNS ) A4規格（2吧2_隻) ------ 528803 A7 B7 五、發明说明（6·) 2g/l，否則吡哫甲酸轉化成6—羥基吡啶甲酸會被抑制。呼匕 症甲敗之生成速率較吼啶甲酸轉化成6—羥基吡啶甲酸之速 率大2· 5倍（10g/l.h to 4 g/l.h)。 因2-氰基吡啶在室溫為固體，所以必須加熱儲存2—氰 基吡哫足儲槽至50。(：，使之可以液體加料。本方法可以在 31小時内製備75g/l之6-羥基吡啶甲酸。在生物轉化作用 結束時，中間體吡啶甲酸已無法偵測到。 以過濾除去細胞來分離6—羥基吡啶甲酸。將不含細胞 之溶液加熱至60°C，並以濃硫酸酸化至PH=2〜2.5，在此 pH値時，6-羥基吡啶甲酸自溶液中沈澱出。 ，接著携拌並慢慢冷卻至代，過滤後，殘留物以去離 離子^洗務並乾燥⑽此^’执^約有⑽之㈠莖基吨 啶甲酸留在母液中，相對於所使用之2_氰基吼淀 87%。 ’、 ϋ 組成 富馬酸麵鹽 酵母萃取 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 濃度(g/1): 10 1 0.8 0.25 1.0 2. 33 0.2 0. 16

MgCls · 6H2〇 Na2S04 (NHU)2S〇4

NH4CI

NaCl

CaCU · 2H2〇 本紙張尺度適财關家縣（CNS) M規格（2逆幻 528803 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1.8X10-2 3X10-2 2X10-3 3X10-3 0.3 0.75 1 0.4 0.96 A7 五、發明説明（7·)

MnS04 H3BO3 NiCl2 NaMo04 FeS04 · 7H2〇 Na2EDTA · 2H2〇 2-Cyanopyridine KH2P04 Na2HP〇4 實例2 製備吡啶甲酸 生物物吳之培養方式如實例1所示。在嚴密地厭氧條 件下製成吡啶甲酸。在一有橡膠隔膜之5〇〇ml玻璃瓶中加 入450ml之OD65〇=20之生物物質進行生物轉化作用。在％ C下進行培養，生物轉化作用前，混合物以純氮氣進行厭 氧處理。為此，氮氣（50mbar表壓）經一針閥通入攪拌中的 混合物30分鐘，以便趕掉氧氣。為了確保防止生物轉化作 用過程中或添加2〜氰基吡啶過程中氧氣進入，在生物轉化 作用過私中保持通氮氣（約1⑽匕虹表壓）。氰基p比淀分a 次加入，每次加料量l〇g/l，每次加料間隔1小時。然而， 也可以連續方法加料，使用HPLC來檢查在次一部份加入 别’原來之2-氰基吼淀是否已完全轉化成池淀甲酸。在生 物轉化作用過程中，並未檢測到有吡啶醯胺形成，用此方 法可在26小時製備150g/l之吡啶甲酸。在此過程中並未形 本紙張尺度適用中國國家椁( ---一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 528803 Α7 Β7 五、發明説明（8·) 成6-羥基吡啶曱酸。 將不含細胞之吡啶甲酸溶液以氯化鈣/硫酸沈澱而分 離。為此，將實例2中不含細胞之p比淀甲酸溶液稀釋3倍， 並且在不含細胞發酵溶液中加熱至90°C後，於揽拌中加入 0. 5當量之氯化#5對每當量之^2比淀甲酸◦此齊Λ比淀甲酸錯 合體立即沈澱◦攪拌此錯合體並冷卻至4°C，利用玻璃漏 斗（孔度=3)過濾，並用去離子水洗滌。濾餅懸浮在去離 子水中，利用濃硫酸將之酸化至pH=2. 5。在此階段吡啶甲 酸會自錯合體中溶解出來，同時形成不溶之硫酸鈣。因游 離的池淀甲酸極易溶於水，可用過濾、法將硫酸#5去除。池 啶甲酸經乾燥後分析，粗產率為70%經滴定純度為86%，水 含量經Karl—Fischer方法測定為0.7%。 實例3 製備吡啶甲酸鉻（m)鹽 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 氯化鉻結晶水之水溶液（ 23. 95克，63ml水中含0.09 111〇16鉻）於3.5小時内滴入一盛有？11=7.1，73°0比啶甲酸 銨鹽溶液（271.4g，0.325mole，16.8%)於500ml燒瓶中。 此紫紅色溶液攪拌1小時後慢慢冷卻至3°C。等所形成之紅 色固體沈澱後，上層藍色層可傾析出，使固體的部份懸浮 在100ml水中30分鐘後再次傾析。再經過50ml水懸浮30分 鐘後，固體部份以吸濾法過濾，並在50°C眞空下乾燥，得 到33.64g暗紅色結晶體（產率90%)。 實例4 利用各種碳源培養產鹼桿菌微生物DSM 6335 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21化缝」 528803 A7 B7 五、發明説明（9·) 300ml錐形燒瓶中含有i〇〇mi的a+N媒介（表1中不含冨 馬酸鈉鹽）被用於培養產鹼桿菌微生物（DSM 6335)，此外 在媒介中加入2gl-1的2-氰基吡啶及l〇gl —1之下列碳源： 富馬酸鈉鹽 丙三醇 丙二酸納鹽 琥ίό酸鋼鹽 在一搖動器中30°C狀態下培養，經過16小時成長後， 將細胞吐出並懸浮在含10§1-2 2-氰基吡啶之新的A+N媒介 (不含竣源）中。此細胞懸浮液之光學密度以650nm( 0D65〇)測定為1〇。細胞懸浮體（總體積ίο-20ml)再於30 °C培養。光譜法來偵測6-羥基吡啶甲酸之生成，即測定不 含細胞溶液在308nm之吸收。生成6-羥基吡啶甲酸之平均 產率測定如下 石炭 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 產率(單位gl —1 h—1 2.4 2.0 4.2 0. 14 ---^-------衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 富馬酸鈉鹽 丙三醇 丙二酸鈉鹽 琥珀酸鈉鹽 實例5 製備6-¾基吡时叛酸 以實例4方法使用富馬酸當碳源培養產鹼桿菌屬微生 物（DSM 6335)。洗滌後之細胞再懸浮於含10gl —1 2-氰基 吡口K0D65〇=10)A+N媒介中’並在30°C培養。以光譜法偵

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（2iq^H>U 528803 A7 五、發明説明（1〇·) 測6-羥基吡吋羧酸的生成，即測定不含細胞溶液在32〇nm <吸收，也可測量2—氰基吡吋（基材）在270nm吸收度之 降低。在7小時後所使用2_氰基吡口井已轉化成6_羥基吡口井 羧酸。 實例6 製備6-氯吡啶甲酸及吡口井羧酸— 以貪例4方法使用冨馬酸當碳源培養產鹼桿菌屬微生 物（DSM 6335)，洗滌後之細胞在玻璃容器（㈤65〇：=ι〇)中懸 浮於A+N媒介，此容器可以橡膠塞子封住。經由針孔充入 氮氣以除去溶解之氧氣，然後加入2—氰基吡坤或6_氯一2_ 氰基咐^定基材至細胞懸浮體中，直到最後濃度為， 並在30 C培養。在3小時後，起始之基材已轉化成相對應 之酸（可由矽膠60螢光指示器，流動相：氯仿3〇/乙醇55 /氨水（25%) 10/水5之薄層分析法來偵測出）。 ----^-------衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21化29^旁聲」

Claims (1)

1. 補务1 公告本靠 六 申請專利範圍第851〇7〇71號專利案申請專利範團修正本 1· 一種製備雜環芳香族羧酸或其生理上相容之鹽類之微 生物方法，通式為

   -X、 R1/^N"^、COOH HO 、C〇〇H Π R1，！^可相同或不同，代表一氳或鹵素原予，而χ代表 氮原子或-CH-，其中，利用生物轉化作用前經二羧 酸、單糖或糖醇培養之2-氰基ϋ比啶之命名為DSM6335 之屬於物種Alcaligenes faecalis之產鹼桿菌，將雜環芳 香族腈類基材轉化成相對應雜環芳香族幾酸，其中雜環 芳香族艄*類之通式為

   R1八N八CN m IIIIIII — — — — — - I 1 I 1 I I I 一5J I « < I I I I I I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 t 合 作 社 印 製 SN IV 、CN R1、R2及X如所述之定義，如此即可轉化成雜環芳香 族羧酸，而後者一部份轉化成其生理上相容之鹽類。 2·根據申請專利範圍第1項所述之方法，其中，生物轉化 作用是在pH為4至10，溫度為10至50°C的條件丁進 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -16 528803 D8六、申請專利範圍 行。 3· 一種製備α比啶甲酸或其生理上相容鹽類之方法，其中， 利用在生物轉化作用前，經二羧酸在厭氧狀態下培養之 叩名為DSM 6335之屬於物種Alcaligenes faecalis之產 驗桿菌，將2-氰基α比啶基材轉化成此啶曱酸，而後者 一邵份轉化成其生理上相容之鹽類。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -> n ϋ n n 1 n 一5J ΜΗ t a··· κ.β < MM I I 經濟部智慧財產局員Η消費合作社印製 本紙張尺度適用中國_標’準（CNS)A4規袼（21㈡97公釐) -17-