TW517059B - New process for the production of biologically active protein - Google Patents

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517059 Μ Β7 __ 五、發明説明（） 本發明有關在沒有淸潔劑之折疊緩衝劑中製備生物活 性二聚體TGF_p(轉化生長因子-β)狀蛋白質之折疊方法。 發明背景 r 轉化生長因子_β (TGF-β)狀蛋白質，即TGF-β超族蛋白 質，在很多生物調節路徑上扮演主要角色，例如在胚胎之 成長或組織再生上。此種蛋白質爲很有潛力之生物劑，可 用於一系列不同之醫療目的。TGF_p·族蛋白質中最爲人熟 知之成員爲轉化生長因子-P(TGF-p)族本身。 TGF-β原由人類血小板、胚胎及牛腎中純化到同質性， 確認爲一同原二聚體蛋白質，其分子量約爲25,000道爾頓。 其第一特徵爲能與EGF或TGF-α協同作用來誘導未轉形之 NRK細胞獨立固著生長，最近，TGF-β顯示對各種正常細胞 及贅瘤細胞有很多種調節效果，表示此種蛋白質爲一多功 能之細胞活性調節劑。TGF-β可，視細胞或組織型以及有沒 有其他生長因子之存在而定，刺激絲狀分裂、細胞增殖及 生長，或有效地抑制此等過程，或展示其他作用，像是脂 肪生成、肌肉發育、軟骨生成、骨骼生成及免疫細胞作用 等之控制及向化性之刺激、分化作用之誘導及抑制。TGF-β 之很多作用都與細胞或組織對應力或傷害之反應及造成之 傷害之恢復有關。發炎後，TGF-β在顆粒化組織之形成上也 扮演主要角色，增加基因表現，與細胞外基質形成結合之 基因表現，像是纖維粘連蛋白、膠原及幾種蛋白酶抑制 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再 —-- 育) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -4 - 517059 A7 B7 五、發明説明（） 劑，並刺激膠原-基質收縮（藉纖維原細胞），提示此種蛋 白質在結締組織收縮上可能也扮演一角色。 至今爲止，已有五種不同的TGF-β，但其在功能上及結 構上都有密切的關係，他們分別命名爲TGF-βΙ、TGFj2p TGF_P3、TGF_p4及TGF-P5。前三者也在人類發現。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 所有TGF_P都被合成爲390到412個胺基酸之先質，經蛋 白質水解分裂後產生成熟形式之TGF-β，含有C端112個胺基 酸。成熟之生物活性形式之TGF-β族是對酸及對熱安定，由 兩個各有112個胺基酸之多肽之二硫鍵連結之同原二聚體。 人類（Derynck R. et al_ (I985) Nature 316, 701 - 705)、鼠科動物 (Derynck R et al· (1986) J. Biol· Chem· 261，4377 - 4379)及猿猴 TGF-βΙ (Sharpies, Κ· et al· (1987) DNA 6, 239 - 244)之完全胺基酸序列顯示 有顯著的序列保守，只在單一胺基酸殘基有所區別。由人 類 TGF-βΙ、TGF-P2 (deMartin^ R· et al. (1987) EMBO J. 6, 3673 · 3677; Marquardt，Η· et al· (1987) J· Biol. Chem· 262, 12127 - 12131)及人類丁0?-β3 (Ten Dijke，Ρ· et al. (1988) PNAS 85, 4715 - 4719)之胺基酸序列比 較已證明此三種蛋白質皆在他們成熟形式展現約70-80%之 序列同一性。異原二聚體TGF+1.2已由豬血小板分離出，其 含有一 TGF-βΙ次單元，由一二硫鍵連結到TGF_p2之次單元 (Cheifetz，S. et al· (1987) Cell 48, 409 - 415)。 最近’企圖用基因重組技術生產TGF-β族蛋白質而非自 天然資源中（血小板）分離這些因子，其目的在能獲得足 夠的量以便在各種治療中測試。然而，獲得生物活性重組 基因之TGF-β證明是很困難的。由序列識別號1至6中之序列 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 〇 X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 517059 A7 __ B7___ 五、發明説明（） 可以看出，112個胺基酸長的成熟形式TGF-βΙ、TGF-P2及TGF-β3含有9個半胱胺酸殘基。如TGF-P2之序列所示，9個半胱 胺酸殘基形成4個內鏈及1個間鏈二硫鍵[Schiimegger，Μ.Ρ· and Graetter，M.G. Nature 358: 430 - 434 (1992)]。TGF-β 之異原表現可導 致一產物，其雖有正確的初級結構但卻未折疊成正確的、 複雜之二級或三級結構，因此，缺少生物活性。 考慮到天然TGF-β分子之複雜性，一般認爲在高等生物 細胞中表現TGF-β是最方便的。雖然重組基因之TGF-β族可 在眞核細胞中成功的表現，但要獲得有生物活性且正確折 疊者仍然離滿意程度差很遠。 因此，欲在微生物宿主內生產生物活性TGF-β。然而， 例如在細菌中之細胞內條件無助於正確之折疊、二硫鍵之 形成及二硫鍵安定化之二聚化作用（顯然是對生物活性所 必要的）。因此，將各基因在大腸桿菌中表現後（在λ啓動 子控制下表現）僅能獲得極少量的生物活性TGF-P(歐洲專 利申請案ΕΡ·Α»0268561)。另外報告描述TGF-pcDNA在大腸桿 菌中’在trp啓動子控制下之表現，產生表觀分子量爲13,000 道爾頓之放射性標誌的蛋白質帶（在SDS聚丙烯醯胺膠自體 放射照片中），但未測到活性(Urushizaki，Y.etal.(1987)TumOTRes· 22, 41 - 55) 〇 當重組基因之蛋白質在細菌例如大腸桿菌表現系統中 &高水準生產時，這些生產之蛋白質常以高度不溶性細胞 內沉澱物形式出現，稱之爲內含體或反射體，這些內含體 &位相顯微鏡下，在細胞內爲可見之亮點。此等蛋白質 本氏張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21GX297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 517059 A7 B7 五、發明説明（） (很容易由溶性細菌蛋白質中分離）含有大多爲變性及還 原形式之重組基因蛋白質，而沒有相當的天然相對物之官 能活性，因此不能用爲商品。一般都同意’必須使此重組 基因之反射蛋白質，在宜於維持其在變性之條件下’溶性 化，然後必須折疊，方能使變性未折疊形轉換到適當的官 能活性的三度空間結構，其構形係被相對弱的原子間力， 像氫之鍵結、疏水性相互作用及電荷相互作用安定化。在 含有半胱胺酸之蛋白質情形，此方法也伴隨有二硫鍵之形 成。當用化學方法促進二硫鍵之形成時，應當防止不正確 分子內橋及，在二聚體蛋白質或多聚體蛋白質之情況，分 子間橋之形成或至少要使之減到最低，因爲不希望之，不 正確之折疊之同分異構體之形成可能產生同質物質，因而 使具有希望結構之蛋白質進一步純化複雜化，或可能產生 活性減低之蛋白質。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 蛋白質通常以多重步驟之方法折疊，包括使蛋白質在 強變性條件下溶性化及隨後使無序劑(diaotrop)濃度降低以便 折疊。然而，此種方法在TGF-β之折疊上是失敗的。在歐洲 專利申請案ΕΡ·Α_0433225中描述一成功的生產生物活性二聚 體丁〇^0狀蛋白質之方法，在該方法中使用一溫和淸潔劑， 淸潔劑能使TGF-β蛋白質折疊，同時淸潔劑仍存在於折疊緩 衝劑內。 由先前技術得知（Tam et al. J. Am· Chem. Soc. 113: 6657 - 6662 (1"1)) ’可用二甲亞礪(DMS〇)促進二硫鍵在肽中選擇性地及 有效纟也生成。此方法是有選擇性的，即沒有副反應並且可 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 517059 A7 B7 五、發明説明（） 使用之pH値範圍廣。然而，顯示只有大到30個胺基酸之肽 方有正確二硫鍵橋之形成。在另一刊物(BentleetaLUS Patent 4731440)，用二甲砜或二甲砜與尿素之混合物使內含體中之 生長激素溶性化。然後將溶性化之蛋白質用含蛋白質溶液 之二甲砜與溫和氧化劑接觸而使之復性。 驚異地發現，使用不含淸潔劑之折疊緩衝劑處理溶性 化之單體，TGF-β狀蛋白質可再折疊成活性二聚體，該無淸 潔劑之折疊緩衝劑含一有機溶劑，例如二甲亞砜(DMSO)、 二甲基甲醢胺(DMF)或DMSO與DMF之混合物。 發明之目的 本發明之目的在提供一由變性或非天然形之TGF-β狀蛋 白質生產生物活性二聚體TGF-β狀蛋白質之改進方法。此一 目的由一意外的發現而達成，即當該蛋白質單體用一不含 淸潔劑之折疊緩衝劑處理後可以高產率生產大量希望之二 聚體蛋白質產品，該折疊緩衝劑包含一有機溶劑，例如 DMSO、DMF或DMSO與DMF之混合物。 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 發明之詳細說明 本發明有關一生產二聚體生物活性轉換生長因子(TGF-β) 狀蛋白質之改進方法，該方法包括使該TGF-β狀蛋白質之變 性單體接受沒有淸潔劑之折疊條件。 本發明中之’TGF-β狀蛋白質〃一詞意指一種蛋白質， 其在單體形式具有與下列TGF-β超族成員中至少一個單體胺 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2⑴X297公釐） -8- 517059 經濟部中央檩準局員工消費合作、社印製 A7 B7 五、發明説明（） 基酸序列有至少75%同系性之序列：TGF-βΙ、TGF-P2及TGF-β3, 一種由BSC-1猴子腎細胞之條件培養基分離出之生長抑 制劑（即多方面作用素，HoUey，R·W·etal·(1980)PNAS77,5989-5992; Ristow，H.J· (1986) PNAS 83, 5531 - 5533) ; TGF-P4 爲由雞胚胎 軟骨細胞分離者(Jakowlew，S.B· et al. (1988) Molecular Endocrinology 2, 1186 - 1195) ; TGF-P5 爲由滑爪蟾分離出者(Kondaia^ Ρ· et aL (1990) J· Biol. Chem· 265, 1089 - 1093) ; TGF-β-有關之抑制素及活化素 (生殖線蛋白質，調節垂體分泌濾泡刺激激素）；繆勒氏 抑制物質（MIS，抑制繆勒氏管在哺乳動物雄性胚胎中發 育）；骨骼發育蛋白質（BMP，牽涉軟骨誘發及骨骼形成之 一組多肽，現在已知之成員有BMP-2、BMP-3、BMIM、BMP_ 5 ' BMP-6 > BMP-7 ^ BMP-8 S：BMP-9);果蠅之十五套基因複合 體轉錄產物（dpp，其作用爲控制蠅胚胎中之形態發育）； Vg_l(滑爪蟾之轉錄產物，存在於卵母細胞之植物極）； Vgr-1，爲一與Vg-Ι有關之哺乳動物基因（Mason^ A. et al. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 135, 957 - 964; Cate, R. et al. (1986) Cell 45, 685 · 698; Wozney, J.M. et al. (1988) Science 242, 1528 - 1534; Padgett, R. et al. (1986) Nature 325, 81 - 84; Weeks, D.L. and Melton, D.A. (1987) Cell 51，861 - 868; Lyons，K· et al· (1989) PNAS 86, 4554 - 4558)。 在^TGF-β狀蛋白質〃之意義中也包含雜二聚體，其中 含有各種TGF-β狀蛋白質之次單元，或仍保有一或所有母分 子生物活性之上述蛋白質之片斷或突變體。 本發明中之^TGF-β狀蛋白質〃之一較偏愛意義是代表 TGF-β超族中任一蛋白質。更偏愛之意義是代表TGF_p超族 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) _| ^^^^1 本一 訂 -9- 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 517059 A7 B7 五、發明説明（） 中之下列蛋白質：哺乳動物例如人類或動物，像是人猿、 鼠類、豬、馬、牛之TGF-βΙ、TGF-p2、TGF_03，以及含兩個 各有112胺基酸之不同次單元之雜二聚體TGF-β族，包括雜 交分子之TGF-β片斷及突變體（在其分子中不同之TGF-p族 部份已交換）；一由BSC-1猴腎細胞條件培養基中分離出之 生長抑制劑（即多方面作用素）；由雞胚胎軟骨細胞分離 之TGF-P4 ;由滑爪蟾分離之TGF_p5 ; TGF-β有關之抑制素及 活化素（爲生殖腺蛋白質，調節垂體分泌濾泡刺激激 素）；繆勒氏抑制物質（MIS，能在雌性哺乳動物胚胎中抑 制繆勒管發育）；骨骼形態發育蛋白質（BMP，牽涉軟骨及 骨骼形成誘發之一組多肽，現在已知者有BMP_2、BMP-3、 BMIM、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8 及 BMP-9);果蠅之十五 套基因複合體之轉錄產物（dPP，其作用是控制蠅胚胎中之 形態發育）；Vg-Ι (滑爪蟾轉錄產物，存在於卵母細胞之植 物極）；Vgr-l，爲一與Vg-Ι有關之哺乳動物基因？ TGF-β狀 蛋白質之意義中也包括雑二聚體，其中含不同TGF-β狀蛋白 質之次單元，或保有一或所有母分子生物活性之上述蛋白 質之片斷及突變體。 更偏愛之TGF-β狀蛋白質係由TGF-βΙ、TGF-P2、TGF-P3、 雜二聚體1^!^族、包括雜交分子（並在其中不同TGF-β之 部份被交換）之TGF-β片斷及突變體、BMP、抑制素及活化 素組成之一組中選出者。更偏愛者爲BMP-2、TGF-βΙ、TGF-β2 ' TGiH33、雜二聚體及其包含雜交分子（在其中不同之 TGF_P族被交換）之片斷及突變體，優先者爲雜種TGF-βΙ- 本紙張尺度適用中國國家檩準（CNS ) A4規格（21 Οχ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂 -10- 517059 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 A7 B7 五、發明説明（） 3、雜種 TGF-β2·3 或雜種 TGF-β3·2 或 TGF-pl-2，其在 N_ 到 C-端 之順序，含N端44個人類TGF-βΙ胺基酸及C端之68個TGF-P2 胺基酸之TGF-pl-2。更偏愛之TGF-β狀蛋白質爲那些由具有 序列識別號卜3、5、7、9或11中之胺基酸序列者。最偏愛之 TGF-β狀蛋白質爲TGF#3。 TGF-β之生物活性之定義爲： 一 TGF-β在纖維細胞上之細胞遊移促進活性（Postlethwaite，A.E. et al· (1987) J· Exp. Med· 165, 251，依照 Βιιτίς R« (1973) PNAS 70, 369 修改）， 一 TGF-β對人類A375黑素瘤生長之抑制效果（Brown^ T.L et al. (1987) J. Immunol· 139, 2977)， —CCL-64 細胞 DNA 合成檢定抑制（Graycar，J.L. et al. (1989) Molecular Endocrinology 3: 1977 - 1986)或 一連續之貂肺上皮細胞系Mv_l-Lu (ATCC/CCL64)之生長抑制 (述於下面實例）。 由任何源及任何方法衍生之單體蛋白質都可在 本方法折疊成相當本發明之二聚體生物活性TGF-β狀蛋白 質。例如，單體形TGF-β狀蛋白質可由天然源衍生，或利用 重組基因技術或用習用之合成法生產。在因污染物而不宜 在體外折疊之單體情形，溶性化及變性之單體可用色層分 析法純化，例如用大小排斥色層分析法，例如在西法管柱 (SephacrylS-lOOHR)上。 在被折疊前，單體TGF-β狀蛋白質必須是變性（即未折 疊）、溶性化之形式。能夠有效地將蛋白質變性及溶性化 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

、1T ^1. -11 - 517059 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 者稱爲所謂之無序劑（chaotropic agents)，爲本行技術內習知 者，其在水溶液中，在適當之濃度，能經由表面之變更而 改變各蛋白質之立體結構（或經由水合情況、溶劑環境或 溶劑表面交互作用之變更）。此種無序劑或變性劑包括r: 尿素、氫氯化胍、硫氰酸鈉（濃度大約在4_9M)、濃度在 0.01_2%之淸潔劑（如SDS)。含TGF-β狀蛋白質之水溶液之 酸化（酸化到pH2_4,例如用低分子量之脂族有機酸，最好 是有2、3或4個碳原子者，更好的是用醋酸），以及驗性條 件pHIO或以上及高溫也可造成單體之變性及溶性化。 然後使單體接受>折疊條件'，使生物活性二聚體復 原。 >折疊條件"一詞係指一種條件，即在這種條件下可 促使內鏈及間鏈之二硫鍵形成，使變性之單體呈現與生物 活性有關之構形。此方法並不涉及初級結構之任何改變 (即胺基酸序列），但卻有關二聚體產物三度空間構形之 形成，此二聚體產物與生物活性有關。此方法包括二硫鍵 之形成及單體結合成二聚體生物活性結構。 爲此目的，用含一有機溶劑之折疊緩衝劑處理變性之 單體。較偏愛之有機溶劑係由DMSO、DMF、DMS02及此三 者中任兩種或三種之混合物組成之一組中選出者。偏愛之 有機溶劑爲由二甲亞颯(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)及其任 一混合物組成之一組中選出者。 折疊可在中性或鹼性pH値及在一適宜溫度，例如0°C到 大約4〇°C下進行。偏愛之PH値爲大約7到大約10,更偏愛 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) Λ; -12- 517059 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 者，在DMSO情況pH値爲大約9到大約9·5，在DMF情況pH値 爲大約8.5。 可用於折疊之傳統緩衝劑系統爲能在pH 6及10之間提 供足夠緩衝能力之緩衝劑。在本發明中可使用所有對蛋白 質折疊沒有抑制效果之緩衝劑，例如，適當之緩衝劑爲 Tris、bis-Tris或六氫n比畊緩衝劑。此緩衝劑也可另含有鹽， 需要時，也可含鹸性胺基酸。 在折疊緩衝劑中可用之鹽有：Na+、Li+、K+、NH/、 Mg2+、Ca2+ 或 Mn2+ 與 Cl·、F、Br·、r、HC03·、S042、磷酸根離 子、醋酸根離子、氰酸根離子或硫氰酸根離子生成之鹽， 或其他鹼金屬_或鹸土金屬-鹵素或假鹵素化合物（濃度在 3M)。最好是濃度在1_2M之NaCl。 可用在折疊緩衝劑中之鹼性胺基酸爲，例如，精胺 酸，其濃度最好在(X5M。 本發明中用之DMSO之濃度是由大約1〇%到大約50%，更 好是由大約20%到大約50%。最好是大約30%到大約50%，以 大約40%爲最可取。 折疊緩衝劑中之DMSO可用DMF取代。DMF之使用濃度 大約由10%到大約50%，較好是大約20%-50%，最好是由大約 30%到大約50%，以30%-40%最爲可取。 DMSO與DMF混合物可以大約1〇%到大約5〇%之濃度使 用。 DMSO或DMF也可用DMS02取代。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNs ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 訂 ^1. -13 - 517059 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 A7 B7 五、發明説明（） 本發明之一偏愛之具體實例中之緩衝劑另含一還原物 質，此還原物質能激勵在蛋白質或肽中之二硫鍵形成，適 當之還原物質爲，例如，低分子量之氫硫基化合物試劑， 係由還原形式之谷胱甘肽、二硫蘇糖醇、β-魏乙醇、锍甲 醇、半胱胺酸及半胱胺組成之一組中選出者。適當之濃度 爲大約1到lOOmM，較好的是大約1到10mM，更好是大約2.5 mM ° 本發明中使用之偏愛之氫硫基化合物係由還原形式之 谷胱甘肽、半胱胺酸、半胱胺及乙醇組成之一組中選出 者，以谷胱甘肽最適當。 折疊要在合理之溫度下進行，例如，由大約〇°C到大約 40°C，最好是在4°C左右，並在合理的時間內，例如，在大 約2到720小時之時間。因爲折疊所需之時間視溫度而定， 溫度可依照希望之折疊時間而使之最適化，反之亦然。 本發明之二聚體生物活性TGF-β狀蛋白質之生產可在一 步驟中完成，將其中之該蛋白質單體轉移到折疊緩衝劑 中，將反應混合物培養2小時至7天或更長，溫度在〇〇cM4〇 °C之間’最好是4°C，此時折疊作用及二聚合作用繼續在進 行。在折疊反應期間之蛋白質濃度是相當重要的，因爲濃 度太高時，單體會聚結導致不希望的高階寡體形成。如蛋 白質濃度小於2毫克/毫升，二聚體產物最後產率增加，濃 度之範圍以0.01到0.5毫克/毫升爲佳。 折疊後，將生物活性二聚體予以純化以去除未完全折 疊之TGF-β狀蛋白質及雜質，特別是焦精或其他內毒素（如 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 訂 -14 - 517059 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 在細菌宿主生產多肽時可能存在於製劑中)。二聚體之分離 係用色層分析法實施，像是大小排斥膠色層分析、疏水性 交互作用色層分析或離子交換色層分析法，例如單S(MonoS) 管柱及反相高效色層分析法(RP-HPLQ。 ， 本發明進一步有關本發明生產之二聚體生物活性TGF-β 狀蛋白質。這些TGF-β狀蛋白質可用於多種醫療用途。 下面之實例在說明本發明’但不得解釋爲限制本發 明。 實例1: TGF-βΙ、TGF-32及TGF-&3在大腸捍菌中之表理 實例1A: —般方法 細菌株： 一大腸桿菌 K12/LC 137: htpR·、Ιοηκρ、lac·、malam、trpam、 pho·、rspL、tsx::TnlO、supCfe (Goff，S.A. et al. (1984) PNAS 81， 6647 - 6651) 〇 質體： —pPLMu (Buell，G. et al· (1985) Nucleic Acids Res· 13, 1923 _ 1938):此 質體帶有噬菌體λΡΕ啓動子連同噬菌體Mu基因核糖小 體結合位址(Van Leerdam^ E· et al· (1982) Virology 123, 19 - 28)。 一 P〇l857:編碼對熱不安定之λς1857壓制劑並授予對卡那黴素 之抗藥性之質體（Remault^ Ε· et al. (1983) Gene 22 103 _ 113)。 十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺膠電泳(SDS-PAGE): 十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺膠電泳（SDS-PAGE)及蛋白 質染色係使用迷你變相蛋白Π細胞（來自BIORAD)及1毫米 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁) II 本

、1T -15- 517059 A7 B7 五、發明説明（） 厚18%之聚丙烯醯胺膠進行，如前所述者(Laemmli，U.K. (1970) Nature 227, 680 - 685)。 熱誘導= 將含有40微克安皮西林及卡那黴素之7毫升LB-培養基 (Maniatis, et al. (1982), Molecular Cloning, Coldspring Habor Lab., New York) (LB/amp/kan)在20毫升之培養管中用單一菌叢接種，在30°C下 搖動培養過夜。將此過夜培養之5毫升培養物加入100毫升 錐形瓶中之15毫升LB/amp/kan培養基中。將此錐形瓶移至42 °C之水浴搖動器。在移送之前先取樣2毫升（未誘導），移 送後每隔1小時取樣1毫升（誘導）。用離心機將細胞球狀 化（5分鐘，10,000 rpm Ependorf離心機），傾去上淸液。將 小球粒再懸浮在1〇〇微升樣品緩衝液中以便作SDS_PAGE分 析，並在95°C下加熱10分鐘。將其中5微升裝入作SDS-PAGE 分析。 有能力之細胞之製備= 利用氯化鈣程序製備有能力之大腸桿菌細胞’如 Maniatis, et al. (1982), Molecular Cloning, Cold Spring Habor Laboratory,

NewYork。使帶有質體pcl857 2細胞在30〇C下生長。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 實例 IB :表現載體 pPLMu.hTGF-3l、pPLMu.hTGF-P2 及 pPLMu.hTGF#3 之建造及 TGF-βΙ、TGF42 及 TGF-33 之轰里 將TGF-βΙ、TGF#2及TGF_p3之編碼序列（示於序列表 中）分別選殖於用Ncol水解，用腓腸鹼性磷酸酶（Boehringer) 脫磷酸化，用克倫諾聚合酶（Gibco-BRL)塡入補齊之質體 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -16 - 517059 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（）

V PGem-5ZF(+)內(Promega)。此建構體命名爲 pGKM 125 (TGF-βΙ)、 pGKM 740 (TGF#2)及pGKM 126 (TGF_p3)，用其轉形有能力之大 腸桿菌Y1090。帶有編碼TGF-βΙ、TGF_p2及TGF-P3之正確嵌入 體之純系分別命名爲大腸桿菌Yl〇9〇/pGKM 125 (TGF-βΐ)、大腸 桿菌 Y1090/pGKM 740 (TGF_p2)及大腸桿菌 Y1090/pGKM 126 (TGF_ β3)。 大腸桿菌Y1090/pGKM125、大腸桿菌Y1090/pGKM740及大 腸桿菌Y1090/pGKM 126細胞在LB培養基中生長，用賓包姆 (Bimboin^ H.C.)及都利（Doly，R)在 Nucleic Acids Research 7, 1513 中 所述之方法製備質體DNA。在50微升之限制緩衝劑中，或用 Ncol 及 Sail (pGKM 125)、Ncol 及 EcoRV (pGKM 740)或單獨使用 Ncol (pGKM 126)將5微克之質體DNA切割完全（依照供應商 Boehringer之推薦方法）。加入5微升之3M醋酸鈉、100 mM MgCl2、5mMEDTA及150微升乙醇使DNA沉澱。經在_70°C下 培養15分鐘後，利用離心法（13,000g，15分鐘，使用紹華離 心機，SS34轉動子）將DNA球粒化。去除上淸液，將DNA 球粒再懸浮於含有0.25%溴酚藍及0.25%二甲苯氰基醇之80微 升之 0.089M TRIS 硼酸酯、0.089M 硼酸及 〇·〇〇2Μ EDTA ( TBE 緩 衝劑）中。將20微升樣品在含有0.5微克/毫升溴化乙錠之 TBE緩衝劑中經由1%瓊脂膠電泳四次（電壓爲50伏，直到 溴酚藍標誌達到1〇公分長及0.8公分厚膠之底部爲止）。將 編碼成熟TGF-βΙ、TGFj2及TGF-P3之DNA片斷（可在短波UV 光下看到）用刮臉刀片切割，將其從膠中電析洗出（使用 Schleicher&Schiill生物陷阱儀器，電流爲2〇〇毫安培，I·5小 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 、τ -17- 517059 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 A7 B7 五、發明説明（） 時）。將洗提出來之DNA片斷沉澱（參上），再懸浮在20 微升之TE中。 將5微升之pPLMii質體或用Ncol及Sail、Ncol及EcoRV或 單獨用Ncol水解而直線化，用膠（如上所述）純化。將100 塵克直線化及純化之pPLMii載體DNA及三倍摩爾當量之各純 化片斷DNA在4°C下，在含1單位DNA連結酶(Boehringer)之20 微升連結緩衝劑中（70mMTris/Ha，ρΗ7·5、10mMMgCl2、5 mMDTT、O.lmM三磷酸腺苷）培養15小時。 將10微升之連結混合物加入200微升之4°C冷之有能力 的大腸桿菌LC137細胞中（帶有質體pd857)。30分鐘後，將 細胞放在42°C熱浴中培養熱震1.5分鐘。加入2毫升之LB培 養基，在30°C下搖動培養物60分鐘。取出200微升，將其攤 在含有安皮西林及卡那黴素之LB板上，在30°C下培養22小 時。收集單一菌叢並分析質體DNA。編碼TGF-βΙ、TGF-P2及 TGF_p3 (在pPLMu中）之DNA片斷次選殖分別造成 pPLMiUiTGF-βΙ、pPLMu.hTGF#2 及pPLMu.hTGF-p3 質體。含上建 構體之純系分別稱之爲大腸桿菌LC137/pPLMu.hTGF#l、大腸 桿菌 LC137/pPLMu.hTGF#2 及大腸桿菌 LC137/pPLMu.hTGF-p3。 將大腸桿菌LC137/pPLMu.hTGF-pl、大腸桿菌 LC137/pPLMu.hTGF-p2 及大腸桿菌 LC137/pPLMu.hTGF-p3 細胞予 以熱誘導（參實例1A)，用SDS-PAGE分析表現之蛋白質。 TGF-βΙ、TGF-P2及TGF#3於二小時後熱誘導後都呈現爲以表 觀分子量差不多爲12,000道爾頓遊移之熱誘導蛋白質。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注—事項存本頁) 訂 -18- 經濟部中央標準局員工消費合作、社印製 517059 A7 B7 五、發明説明（） 實例1C:轉形細胞之發酵 使大腸桿菌LC137/pPLMii.hTGF-Pl、大腸桿菌 LC137/pPLMu.hTGF-p2 及大腸桿菌 LC137/pPLMu.hTGF-p3 之過夜 培養物在含750毫升之LB培養基連同40毫克/升之安皮西林 及卡那黴素之2升錐形瓶中在30°C生長。將300毫升之過夜 培養物加入含有抗生素之2升錐形瓶中之750毫升之（如上 述之2升錐形瓶中者）LB培養基中，在60°C水浴中加熱至42 °C，搖動約3.5分鐘。然後將錐形瓶移至42°C之搖震機並培 養3小時。然後將錐形瓶冷卻到12°C (冰水浴中），細胞在 以8,000rpm離心10分鐘後（GSA轉動子）予以收集。 實例2: TGF-βΐ、TGF-&2及TGF-P3在啤酒酵母蘭中之表理 成熟TGF-βΙ、TGF_P2及TGF-β3之編碼序列，在可誘導之 酵母酸磷酸酶(PH05)之控制下，在啤酒酵母菌中表現。 表現載體以兩步驟建造： A. 建造質體 pJDB207/PH05-RIT 12 ; B. 建造質體 pJDB207R/PH05-TGF-pl、pJDB207R/PH05-TGF#2 及 pJDB207R/PH05-TGF-p3， 在A步驟中提供酵母菌載體及PH05轉錄終結子；在B步 驟中提供表現卡帶（其中有分別編碼成熟TGF-βΙ、TGF-P2及 TGF-β3之嵌體），在PH〇5啓動子控制下表現。 竇例2A :質體PJPB207/PH05-RIT 12之建造 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐）

-19- 517059 經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 A7 B7五、發明説明（） 用限制核酸內切酶Sail使質體p31RIT 12 (歐洲專利申請 案EP277.313)直線化。在溴化乙銨存在下，用Hindffl部份水 解產生1 kb之Sall/Hindm片斷，其中含有276 bp之Sall/BamHI ?6尺322序列、534 5?酵母酸磷酸酶1>1105之啓動子、編碼19個 胺基酸之酵母轉化酶訊號序列及PH05轉錄終結子。 將1 kb之Sall/Hindm片斷P31RIT 12選殖在酵母-大腸桿菌梭 載體 pJDB207 中（Beggs，J.D· in: Molecular Genetics in yeast Alfred Benzon Symposium 16, Copenhagen^ 1981，pp· 383 _ 389)，其已被 Sail 及 Hindm切割。所得之含有Ikb嵌體之質體稱之爲pJDB207/PH05-RIT 12 〇 實例 2Β :質體 pJDB207R/PH05-TGF-&3 之建造 將質體pGKMMO (TGF-β3)(參實例1.C)用Ncol切割。在 反應中用克倫諾DNA聚合酶將粘端補齊。加入EcoRI連結子 (5’-CCGGAATTCCGG ; Biolabs)，使混合物連結。所得之圓形質 體名爲pGKMA668(TGF#3)並用EcoRI及Sail切割。由瓊脂膠分 離出一 0.4kb之EcoRI/Sall片斷，將其純化並再懸浮於無菌水 中’濃度爲25微克/毫升。此片斷含有成熟TGF-P3編碼序 列，在框架中有一 ATG編碼GCT，其界定爲成熟TGF-P3之胺 基酸Ala 1。 將PH05啓動子由534 bp BamHI/EcoRI片斷上之質體p31RIT 12 分離出。用 BamHI 及 Xhol 切割此質體 pJDB207/PH05-RIT 12。 分離大的6.8kbBamHI/Xhol片斷。PH05轉錄終結子仍在片斷 上。將 Bamffl/EcoRI PH05 啓動子片斷、編碼 TGF+3 之 EcoRI/Sall (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -20- 517059 經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 A7 B7 五、發明説明（） 片斷及BamHI/Xhol載體片斷連結在一起。一正確而有TGF-P3 基因，在PH05啓動子控制下，在順時針方向選殖在PJDB207 質體中之純系名爲pJDB207R/PH05_TGF-P3 〇 以類似方式，使成熟之TGF-βΐ及TGF#2在啤酒酵母菌中 表現。含有TGF-βΙ及TGF-P3編碼序列之質體分別爲PGKM125 及PGKM126。當此等質體用Ncol水解，加入Ec0Rl連結子連結 後，將所得之圓形質體用EcoRI及Sail切割。將EcoRI/Sall片斷 如上所述選殖在PJDB207內。所得之質體名爲PJDB207R/PH05_ TGF-βΙ 及 pJDB207R/PH05-TGF-p3 〇 實例2C:啤酒酵母菌株GRF18之轉形 啤酒酵母菌株 GRF18 (MATa、his3-ll、his3-15、leu2-3、leu2-112、canR、DSM3665)用下列質體轉形： pJDB207R/PH05-TGF-pl pJDB207R/PH05-TGF-p2 pJDB207R/PH05-TGF-p3 (依照 Hinnen A· et al· (I978) PNAS 75, 1929 中所述之轉形方 案）。將轉形之酵母細胞在缺少白胺酸之最低培養基板上 選出。將單一轉形之酵母菌菌叢分離出名爲： 啤酒酵母菌 GRF18/pJDB207R/PH05-TGF-pl 啤酒酵母菌 GRF18/pJDB207R/PH05-TGF-p2 及 啤酒酵母菌 GRF18/pJDB207R/PH05-TGF-p3 〇 宣例2D:啤酒酵母轉形細胞之發酵及細胞萃取液之製備 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁)

I 訂 -21 - 517059 A7 B7 五、發明説明（）

V 如上所述，酵母轉形細胞內含有用PH05啓動子控制之 表現卡帶之質體，因此，需要消除啓動子之限制以便表現 TGF-βΙ、TGF-P2或TGF_p3。使各轉形細胞以兩連續前培養物 (10毫升及50毫升）在酵母菌高匕之最低培養基中（依 Difco酵母菌氮基處方製備者，沒有胺基酸但含有10克/升 L-天冬胺酸代替(NH^SC^、1克/升L-組胺酸及20克/升葡 萄糖）生長。將第二前培養物細胞在〇.9%NaCl中沖洗，用 所有細胞接種100毫升之低&之最低營養之培養基（依Difco 酵母菌氮基培養基處方製備者，沒有胺基酸，但含有0.03克 /升之ΚΗ2Ρ04、10克/升之L-天冬胺酸、1克/升之L-組胺酸 及20克/升之葡萄糖）。培養物要在30°C及180 rpm下攪 動。 在10毫升培養物中之細胞分別在5時、24時及48時用離 心收集(3000rpm)並在〇e9%NaCl中洗一次。將細胞顆粒再懸浮 於溶解緩衝劑中〔66mM磷酸鉀pH7.4、4 mM之兩性劑 (Calbiochem)]。加入8克玻璃珠（0·5 - 0·75毫米直徑者），將 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 懸浮液劇烈搖動4-5次，各2分鐘（在冷渦旋混拌機上）。 將提取液倒出以去脫玻璃珠。將提取液中之細胞屑用離心 法沉澱（ 3000rpm，5分鐘在4°C下）。將上淸液與顆粒分離 並儲存在-20°C。 實例3 實例3A:由大腸桿菌中回收不溶性單體TGF#3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -22- 517059 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 大腸桿菌LC137/pPLMu.liTGF-P3細胞如在實例1C中方法發 酵。不溶性TGFH33細胞之打碎及回收在4°C下進行。將大約 18克之濕細胞懸浮在60毫升之0.1MTRIS/HC1、lOmMEDTA、1 xnM PMSF (Phenyl Methan Sulphonyl Fluoride)中，pH 8.3 (破碎用緩 衝劑）。使細胞兩次通過法國壓機(FrenchpressUSLM儀器公 司）。使體積連同破碎用緩衝劑成爲200毫升。將懸浮液在 15,000g離心力下離心20分鐘。再將獲得之顆粒懸浮於含有1 MNaCl之100毫升破碎用緩衝劑中，如上所述離心10分鐘。 將顆粒懸浮在含有l%TritonX_100(Pierce)之100毫升破碎用緩 衝劑中，再離心10分鐘。將洗過之顆粒懸浮於50毫升之20 mM Tris/HCl、1 mM EDTA、1 mM PMSF、1% DTT 中，並在特夫 隆織物之硏磨器中均質化。所得之懸浮液含粗不溶性之單 體 TGF-P3。 實例3B:單體TGF_&3之純化及溶性化 將依照實例3A獲得之10毫升TGF-P3懸浮液用10%醋酸 酸化至ρΗ2·5，並在室溫下用埃本道夫(Eppendorf)離心機離心 10分鐘。在Sephaayl S-100管柱上將上淸液作色層分析 (Ph_cia，2.6x78公分），分析用10%之醋酸，流量爲每分鐘 1.4毫升，也可在SephacrylS-lOOHR管柱（Pharmacia公司）作色 層分析，可分別使用1%之醋酸或5mM之HC1。將含有單體 變性之TGF-β3 (在190分鐘及220分鐘洗出者）收集。此一物 質用來折疊以得生物活性二聚體TGF-P3 (實例4)或供進一 步純化及結構分析法（實例3D)。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

訂 -23 - 517059 A7 ________B7_ 五、發明説明（） 實例3c:由啤酒酵母菌回收單體TGF-β3 將上述發酵中獲得之500毫升打碎之細胞顆粒懸浮在20 毫升之4M尿素、0.1MTRIS、1%DTT中，ρΗ8·0。此混合物保 持在室溫30分鐘’每5分鐘漩攪一次。用離心法去除不溶性 物質（30,000 g，4°C，30分鐘），用醋酸將上淸液調到 PH2.5,用5%醋酸在4°C下廣泛透析過夜。再將溶液如上述法 離心，淸澈的上淸液用超濾法在YM10膜上(Amicon)濃縮到4 毫升之最後體積。然後將樣品在SephacrylS_100HR(Pharmada 公司）上在5%之醋酸中（如在實例3中）作色層分析，產生 單體 TGF-P3。 實例3D:單體TGF^3用反相高效液相色層分析(RP-HPLC)進 一步純化 利用Vydac 214 TP 5415高效液相反相管柱（4.6 X 150毫 » The Separation Group, Hesperia, CA USA )將由實例 3B 之 SephaciylS-100管柱中獲得之部份純化。管柱在70%TFA之0.1% 水溶液及30% TFA之0.08%乙腈溶液之混合液中平衡，將產物 用直線梯度洗提30分鐘，用55%TFA之0.1%水溶液及45%TFA 之0.1%乙勝溶液之混合液以每分鐘1毫升之流量終止。檢查 洗出液在216塵米光下之吸收，將各個光峰依照UV吸收予 以手工收集。變性之單體TGF-P3在21.5分鐘洗出。視分離用 之各反相管柱而定，同樣的TGF-β3分別在大約在16分鐘及18 分鐘洗出。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再

訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -24- 517059 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（） 使用同樣管柱及溶劑系統（如上述）將TGF-P3部份作 反相高效液相色層分析(RP-HPLC) °TGF#3用直線梯度在42分 鐘內洗出，起始由l〇〇%TFA之0.1%水溶液及終了用30%TFA 之水溶液及70% TFA之0·08%乙勝溶液之混合液。30.4分鐘後 TFG_p3以單峰洗出。視所用之各管柱而定，分別得到滯留 時間爲29分及29.9分鐘。 亶_例3£:單體TGF-33用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺膠電泳法 (SDS-PAGE)分析 在眞空中將各別取自SephacrylS-100管柱（實例3B)或反 相管柱（實例3D)之部份乾燥並用SDS_PAGE法在15%聚丙烯 醯板膠上（用苦馬西藍R-250染色）分析。獲得表觀分子量 爲大約12,000道爾頓之單一帶，與還原形式之天然豬TGF-P3 沒有什麼區別。 實例3F:單體TGF-B3之N-端胺基酸序列之測定 將由實例3B得之TGF-P3在眞空中蒸發，溶於25微升 0·1Μ醋酸，並使其在氣相蛋白質序列分析儀Model 470A (AppliedBiosystems)作胺基酸序列之測定，以決定端胺基酸 序列。 Ν-端胺基酸序列與序列識別號6中之Ν-端序列相同。 實避Li.:. Tgg#3在含二甲亞楓(DMSO)之緩衝劑之試管中折疊 (請先閲讀背面之注意事項再本頁) —€ 訂 __ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -25- 517059 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（） 由上面獲得之TGF#3，在4°C，在分別含有0.1M Tris、 〇·5Μ精胺酸、IMNaCl、5mM還原之谷胱甘肽及40% (體積/ 體積）DMSO之緩衝劑中折疊。用NaOH將緩衝劑調到 ρΗ9·5。TGF-P3之最後濃度爲〇.1毫克/毫升。七天後用濃醋 酸，在4°C下，將此溶液酸化至ΡΗ3·5,並用超濾法將其濃縮 10次（在Amicon攪動之容器中，使用YMio膜（Amicon公 司））°用〇·1Μ醋酸將此濃縮之溶液稀釋到原來體積，再 予以濃縮。此步驟要重覆兩次。然後作離子交換色層分析 (如下所述）。 實例5 : TGF-P3在含二甲基甲醯胺（PMF)之緩衝劑之試管中 折疊 由上面獲得之TGF_p3，在4°C，在分別含aiM Tris、1Μ NaCl、0·5Μ精胺酸、5mM還原之谷胱甘肽及30% (體積/體 積）DMF之緩衝劑中折疊。將緩衝劑調到pH8.5。TGF-P3之 最後濃度爲〇·1毫克/毫升。七天後，在4°C下，用濃醋酸將 此溶液酸化至ρΗ3·5,在阿米康(Amicon)攪拌器中，用YM10膜 (Amicon)超濾濃縮1〇次。將濃縮之溶液用(um醋酸稀釋到原 來體積’再濃縮。此步驟要重覆兩次。然後用下述之離子 交換色層分析。 實例..§丄.用隆JI子交換色層分析分離二聚體生物活性TGF-β3 將實例4或5中獲得之分別含有大約10到5〇毫克之TGF-β3’以6毫升/分鐘之流量裝入高載西法路斯(Hil〇ad 26/1〇 s_ $5：尺度適用中關£^^(〇刚八4規格（21(^ 297公釐）一 -26- (請先閲讀背面之注意事項再本頁)

訂 -- 517059 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（）

Sepharose)高性能管柱（Pharmacia)。首先用20mM醋酸鈉、30% 異丙醇，ΡΗ4·0 (緩衝劑A)沖洗管柱5分鐘，然後用直線梯 度洗提45分鐘，開始用含〇.2MNaCl之緩衝劑Α，末了用含 0.5M NaCl之緩衝劑A。洗出液在280塵米光下檢測並用手工 分開。用非還原SDS-PAGE法核對分開之部份中之二聚體 TGF#3，並用試管生物分析核對其生物活性。

實例7:二聚體TGF-33之進一步純化及定性 實例7A:用反相高效液相色層分析法純化(RP-HPLQ 收集含有二聚體生物活性TGF-P3之部份，對0.1M醋酸 透析或用同體積之0.1%TFA水溶液稀釋，在Vydac214TP510管 柱（1公分X25公分，TheSeparationsGroup，USA)作反相高效液 相色層分析。此管柱用75%溶劑A〔 TFA之0.1%水溶液〕及 25%溶劑B〔 TFA之0.08%乙腈溶液〕之混合液以每分鐘4.5毫 升流量平衡。在樣品裝入管柱後，在平衡狀態下予以沖洗 直到在235塵米光下檢測到之吸收達到基準線水準然後管 柱用直線梯度提洗30分鐘，起始於平衡狀態，終止用45%溶 劑A及55%溶劑B之混合物。洗出液手工分開，用非還原 SDS-PAGE及試管生物分析法分析。 實例7B :用SDS-PAGE分析 在眞空中將由實例7A純化之TGF-P3部份予以乾燥並在 苦馬西藍R-250染色之15%聚丙烯醯胺板上用SDS-PAGE分 本紙張尺度適用中國國家標準（CNs ) A4規格（21Q>< 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

-27- 517059 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 析。未還原的樣品展示有一表觀分子量爲25,000道爾頓之單 一帶，然而還原的樣品則在12,500道爾頓有一帶。 實例7C :分子質量之測定 r 由實例7A獲得之純化TGF-P3用電子噴射離子化質譜儀 (ESI-MS)分析。測得之總質量與理論上之期望値很接近。 實例7D :胺基酸分析 胺基酸分析係依 Knecht K 及 Chang，J.-X·在 Analytical 0^11^办58:2375 -2379(1986)中所述者進行。結果與理論相 符。 實例7E: N-端胺基酸序列之測定 將由實例7A獲得之10-20毫克之TGF#3在眞空中予以蒸 發，溶於25微升之10mM醋酸中，用氣相序列分析儀Model 477A (Applied Biosystems)測定胺基酸序列。測得之前10個胺基 酸之胺基酸序列與理論上所期望者相符。 實例7F:用Asp^N蛋白酶使蛋白水解斷裂 將92毫克（6.7塵摩爾）之TGF-P3予以還原，4·乙烯基 吡啶基乙基化，在眞空離心機中乾燥並再溶於200毫升之 5mMHCl中。在其中加入200微升之0.2MTris醋酸酯緩衝劑， ρΗ7·8 (其中含有 10mM 兩性 3-12 淸潔劑(Calbiochem Corporation^ La JollaCA))並與蛋白質溶液混合。用2微克（溶於5〇微升 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再^^本頁) 訂 -28- 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 517059 A7 B7 五、發明説明（） 水）之內蛋白酶Asp-N (得自假單胞菌fragi突變體’序列 級，Boehringer Mannheim Biochemica，德國）在 37°C 進行斷裂反 應。13小時後加入50微升之10%(體積/體積）TFA，混合 物以直線梯度（5到45% (體積/體積）乙腈在0.1% TFA/水 之溶液，在40分鐘內，0.1毫升/分鐘之流量，使用RP_HPLC Vydac 21 TP 415 管柱（4.6 毫米 X 150 毫米，The Separations Group))分離。分離出之肽用電子噴射離子化質譜儀(ESI-MS)分析。測得之分子質量與計算之値（期得之Asp»N片 斷）相符合。 確認的片斷涵蓋整個胺基酸序列（殘基1及2除外）。 這些胺基酸被整個蛋白質之N-端序列之測定及V8片斷之分 析確認。 實例7G:用V8蛋白酶使蛋白水解斷裂 與使用Asp_N蛋白酶之實例11相似，4_乙烯基吡啶乙基 化之TGF-P3用蛋白酶V8水解，其片斷用RP-HPLC色層分析法 分離並用ESI_MS分析。測得之分子質量與理論値相符，進 一步還證明與TGF_03相等。確認之片斷涵蓋112個胺基酸之 整個序列。 實例8 :折疊之TGF43試管活性試驗：貂肺上皮細胞(Mv-1-Lu) 酸性磷酸酶分析 TGF-β或雜交TGF-β在細胞生物分析鑑定中，在試管中 加以篩檢（此分析法係測量化合物在抑制連續之貂肺上皮 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注秦事項再本頁) 、11 -29- 517059 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 Α7 Β7 五、發明説明（） 細胞系Mv-l-Lu (ATCC/CCL64)生長之能力）。此Mv-l_Lu細胞 系已被證實爲作物分析鑑定之敏銳通訊報告員’展 示一 Sigma (Σ)形之濃度反應（報告之EC50差不多爲10-50皮 (1012)克 / 毫升）（Tucker et al·，Science 1984; 226: 705 - 707; Absher et al·，J. Immunol. Methods 1991; 138: 301 - 303; Danielpour et al., J. Cell Physiol 1989; 138: 79 _ 86)。Mv_l-Lu (其增殖被 TGF-β 強烈抑制） 目前被認爲是作此細胞素生物分析鑑定發展最適用之細胞 系（Kelley et al·，Exp· Lung Res. 1992; 18: 877 - 887; Meager，J. Immunol. Methods 1991; 141: 1 _ 14)。此分析係使用由美國菌體收集中心 獲得之通道46細胞在96孔之微滴定板上實施。此細胞以低 密度（每孔5000細胞）種植在生長培養基中（最少必須營 養之培養基，含5%(體積/體積）胎牛血淸者），培養基 中含有一系列TGF-β標準稀釋液或樣品。將分析品，在3rt 下，在濕的5%C02之培養器中培養72小時。細胞增殖之抑 制用敏感之酶細胞染色方法測定（該方法測得者爲每一孔 中生產之酶磷酸酶比色法估計之量），染色之強度與每一 孔中之細胞數目相當。每孔之吸收光密度係在4〇5塵米光下 測定’將分析之數據繪成圖並用個人電腦軟體程式分析。 在此分析中，一單位(U)之活性爲Mv_l_Lu細胞增殖50%最大 抑制所需之TGF-β之量。 實施便H疊之TGF-&3活體活性試驗 實例9Δ:毛齡大之老鼠部份厚度之傷口癒合 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 訂 -30- 517059 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 五、發明説明（） 老鼠傷口癒合過程已被認定會隨年齡之增加而受到損 害（Grove，G.L. (1982) Arch. Dermatol. Res· 272: 381)，因此，此一現 象代表老人病醫藥方面之主要問題。因此，折疊之活性二 聚體TGF#3在活體之部份厚度之傷口（由二級灼傷形成 者）癒合之活體生物效果遂加以硏究（在部份缺陷或損害 之傷口恢復情況，即在年齡大的老鼠情況），使用下列之 實驗程序（與 Schutz; G.S. et al· (W87) Science 235:350 中描述者相 似）： 在麻醉之C57/BL6老鼠背側胸造成一中皮(Middeimal)熱傷 害（老鼠年齡爲450天或更老者），老鼠背事先已經刮毛並 用商用膏型脫毛劑脫毛。用一在8〇°C水浴中平衡之黃銅模 板（1x1公分，8克）在老鼠背上烙10秒鐘。用外科手術將 燙傷水泡去除，每天在傷處予以治療達5天之久。用25微升 消毒之含有不同量（ 500塵克、100塵克或10塵克）之折疊 活性二聚體TGF#3之載體緩衝劑溶液局部塗敷治療（由〇.8% (重量/體積）之羥丙基纖維素在l〇mM之組胺酸之溶液及 MOrnM之Naa，ΡΗ7·4組成），或只使用緩衝劑溶液治療， 或不予治療。所有局部塗敷之治療物料皆經消毒，沒有內 毒素，沒有焦精，所有試驗用老鼠皆養在各別之籠內σ每 一實驗組有5隻老鼠。 用TGF-β3局部塗敷治療5天後，再將老鼠麻醉，如有水 泡用外科手術切除。將傷口攝影。將已再生之上皮傷口面 積在投影透明片上投影。每一已癒合之原來傷口面積之百 分數用測面積儀測量。測量結果與未經治療之年輕老鼠 本紙張尺度適用中國國家標準（CNs ) Α4規格（210Χ ；297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

、1Τ -31 - 517059 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 A7 B7 五、發明説明（） ( 56-84天大之C57/BL6老鼠）上皮再生過程比較（同樣之中 皮灼傷）。 面積測量分析結果證實，每天局部塗敷活性二聚體 TGF_p3(在適當之載體緩衝液中者），經治療5天後之年齡 大之老鼠與僅用緩衝劑局部施藥或未治療者比較，顯然有 刺激及加速部份厚度傷口上皮再生作用。年輕的老鼠顯然 在沒有局部施予TGF-P3藥物治療也有使傷口上皮再生之能 力。組織學分析揭示上皮再形成之過程連同在第6天用TGF_ β3治療之傷口再生表皮角化之增加程度。 實例9Β:在成年老鼠身上全厚度傷口之癒合 折疊之活性二聚體TGF-β3在第二個活體傷口恢復模$ 中之生物效果也加以硏究（此第二模式即成年老鼠外科$ 術形成之全厚度傷口癒合），使用下列與Mustoe，Τ.Α. et μ (1987)在Science 237: 1333中所述之相似實驗方法。 在雄性3〇〇 _ 35〇克之魏斯他(Wistar)老鼠（用戊巴比通 (pentobarbitone)麻醉者）背中線兩側L5公分遠處用手術刀各 切一全厚度5公分長之直線切口，老鼠事先已刮毛並用商用 膏型脫毛劑脫毛。在實驗中，左邊切口邊緣予以局部塗數 100毫升之經消毒之含各種量（2微克、1微克、〇·1微克或 〇·〇1微克）之折疊活性二聚體TGF_P3載體緩衝劑治療（稜衝 劑由〇·8% (重量/體積）之羥丙基纖維素及10 mM之粗胺 酸、14〇 mM Naa，pH7·4組成）。右邊切口之邊緣用相當等 量之安慰劑（牛血淸蛋白）之該載體緩衝劑治療，在對照 (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -32- 517059 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 組動物中之左切口邊緣單獨用載體緩衝劑治療，而右切口 則不予治療。所有局部塗敷之藥物皆經消毒，沒有內毒素 及焦精。每一切口邊用5«OEthilon縫線均距縫5針。所有實驗 用動物養在各別籠子中。傷口要治療一段時間，包括21天 之後治療。殺死動物後由每隻動物中取下全部背部皮膚’ 並用手術刀將皮膚下面之皮下脂肪切除。然後用兩個平行 手術刀片（相距8毫米）將皮膚切成條片（在縫線中間）以 便作拉力測量。從每一切口之一端取樣作組織學分析。用 萬能拉力試驗機Model 144501 (Zwick^Ulm^德國）測量每一切 割下的皮膚條片之最大容許負荷。將3〇毫米X8毫米之皮膚 條片用水力夾紺固定，然後以每分1〇毫米之速度將皮膚條 片拉伸到破裂點，所用之最大力記錄在表上。每一傷口取 三份試樣，試驗動物4個一組。顯示有感染或過量破裂出血 證據之傷口折斷強度未予測量（小於所有傷口之3%)。 拉力強度測量結果證明，局部使用溶於適當載體緩衝 劑中之折疊活性二聚體TGF-p3較對照組之老鼠能增加斷裂 強度達2倍之多並加速癒合成年老鼠之全厚度切割傷口（視 劑量而有不同）經21天治療後。組織學分析揭示，單核細 胞、纖維細胞及膠原生產在用TGF-P3處理的傷口（經21天 治療）之流入顯著增加（與對照組比較）。處理後14天， 在用TGF_p3處理過之傷口有明顯之短暫的上皮角化現象。 實例1〇:溶性化之單體雜種TGF-β蛋白質之製篮 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

、1T -33 - 517059 A7 B7 五、發明説明（） 將5毫升之質體pPLMu用Ncol及Sail水解使其直線化並用 上述之膠純化方法以獲得DNA片斷。將100塵克之直線化及 純化之pPLMu載體DNA及3倍等摩爾量之編碼雜種TGFH3l-3、 TGF-P2-3及TGF-P3-2 (示於序列表中）之各純化之DNA片 斷，在4 °C，培養15小時（在含有1單位DNA連結酶 (Boehringer))之由 70mM TRIS-HC1，ρΗ7·5、10mM MgCl2、5mM DTT、0.1mM磷酸腺苷組成之20微升連結緩衝劑中培養）。 將10毫升之連結混合物加入帶有質體pcl857之200毫 升，4°C，之有能力之大腸桿菌LC137細胞中。30分鐘後在42 °C水浴中培養1.5分鐘，使細胞熱震。加入2毫升之LB培養 基，將培養物在30°C下搖動60分鐘。取200毫升攤在含有安 皮西林及卡那黴素之LB板上並在30°C下培養22小時。收集 單一菌落並將質體DNA加以分析。將編碼TGF#l_3、TGF_p2-3 及TGF43-2之DNA片斷次選殖於pPLMu中分別造成質體 pPLMu.TGF-pl(44/45)p3 、pPLMu.TGF#2(44/45)p3 及 pPLMu.TGF-β3(44/45)β2。含有上述建構體之純系分別稱之爲大腸桿菌 LC 137/pPLMu.TGF-pl(44/45)p3、大腸桿菌 LC137/pPLMu.TGF_ β2(44/45)β3 及大腸桿菌 LC137/pPLMu.TGF-p3(44/45)p2 〇 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 大腸桿菌 LC137/pPLMu.TGF_Pl(44/45)p3、大腸桿菌 LC137/pPLMu.TGF-P2(44/45)p3 及大腸桿菌 LC137/pPLMu.TGF-β3(44/45)β2加以熱誘導（參實例3A)並用SDS-PAGE分析表現 之蛋白質。在熱誘導後2小時，TGF-βΙΘ、TGF_p2_3及TGF-P3-2 都呈現爲熱誘導之，以表觀分子量差不多12,〇〇〇道爾頓遊移 之蛋白質。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -34- 517059 A7 B7 五、發明説明（） 使大腸桿菌 LC137/pPLMn.TGF-pl (44/45) β3、大腸桿菌 LC137/pPLMu.TGF_p2 (44/45) β3 及大腸桿菌 LC137/pPLMu.TGF#3 (44/45)β2之過夜培養物在2升錐形瓶中（含有750毫升之LB 培養基、40毫克/升之安皮西林及卡那黴素）在30°C生 長。將300毫升之過夜培養物加入750毫升含有抗生素之LB 培養基中（在2升錐形瓶中）並在65°C熱浴中搖動加熱到42 °C 3.5分鐘。然後將錐形瓶移至42°C之搖動器並培養3小 時。將錐形瓶在冰浴中冷卻至12°C，於離心後（在8,000 rpm，用GSA轉動子，Sorvall公司提供）10分鐘後收集細胞。 下述之生產單體溶性化之TGF+1_3雜體之程序也可用在 使TGF_P2-3及TGF_p3-2之溶性化作用上。 大腸桿菌LC137/pPLMii.TGF-pl (44/45) β3細胞如上述方法發 酵及內含體如下製備。細胞之搗碎及內含體之回收在4°C下 進行。將大約18克之濕細胞懸浮在60毫升之0.1MTRIS/HC1、 lOmMEDTA、ImMPMSF (苯基甲烷磺醯氟）中，ΡΗ8·3 (破壞 用緩衝劑）。使細胞兩次通過法國壓機（SLM儀器公司提 供，依照製造商之指導），並使體積連同破壞用緩衝劑成 爲200毫升。在15,000g下離心此懸浮液20分鐘。將所得之顆 粒懸浮於100毫升之含IMNaCl之破壞用緩衝劑中，如上離心 10分鐘。將顆粒懸浮在含l%TritonX-100 ( Pierce公司）之100 毫升破壞用緩衝劑中，再如上離心10分鐘。 然後將洗過之0.3克顆粒懸浮於1〇毫升之20mM Tris/HCl、 ImMEDTA、ImMPMSF、0.1%DTT，pH8.0 之溶液中，並在室溫 下用磁攪動機攪動1小時。然後用濃醋酸將其酸化到PH2.5, —-»»__________________ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 O X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項 —-- 再一^本貢) 經濟部中央榡準局員工消費合作'社印製 -35- 517059 A7 B7 五、發明説明（） 並在特夫隆織物均化器中均化，在CentriconH«401型離心機內 (Kontron儀器公司），用A.8.24固定角度之轉子離心60分鐘 (15°C，12,000rpm)。將含有溶性化之單體TGF-β雜體之上淸 液中之醋酸用lOmMHCl (在有YM05濾網之Amicon8010型攪祎 器中）交換，利用lOmMHCl重覆濃縮及稀釋此溶液之方法 交換。 實例11 :不同TGF-β族、TGF-^雜體族及BMP-2之折疊實驗系

2L 本發明之多樣性及廣泛應用性以下面兩系統之實驗結 果說明之。表中列有試管中蛋白質折疊實驗用之特定條件 及各別蛋白質。其他實驗條件如實例4。 在試管中蛋白質折疊開始後3-7天測得生物活性。 在不含淸潔劑之有機溶劑中之活體外折疊：生物分析鑑定 結果 (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 訂 經濟部中央橾隼局員工消費合作、社印製 編號 RSH DMSO DMF pH TGF-β 活件 1.) 2.5mM GSH 10% 9.5 β3 + 2.) 2.5mM GSH 20% 9.5 β3 + 3.) 2.5mM GSH 30% 8.0 β3 + 4·) 2.5mM GSH 30% 9.5 β3 +-h 5.) 2.5mM GSH 40% 9.5 β3 -Η- 6.) 2.5mM GSH 50% 9.5 β3 4-f 7.) 2.5mM GSH 40% 6.5 β3 + 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -36- 517059 A7 B7 五、發明説明（） 8.) 2.5mM GSH 40% 7.5 β3 + 9·) 2.5mM GSH 40% 8.5 β3 + 10·) 2.5mM GSH 40% 10.5 β3 ++ 11·) O.OmM GSH 40% 9.5 β3 + 12·) 2.5mM GSH 40% 9.5 β2 + 13.) 2.5mMGSH 40% 9.5 β1-3 + 14.) 2.5mM GSH 40% 9.5 β3-2 + 15.) 2.5mMGSH 40% 9.5 β2_3 + 16.) 2.5mM GSH 10% 9.5 β3 + 17.) 2.5mMGSH 20% 9.5 β3 -Η- 18.) 2.5mM GSH 30% 9.5 β3 44- 19.) 2.5mM GSH 40% 9.5 β3 + 20·) 2.5mM半臟酸 40% 9.5 β3 + 21·) 2.5mM半胱胺 40% 9.5 β3 + (請先閱讀背面之注I事項再本頁) 、τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 RSH： 如表中指定之氫硫基試劑 GSH： 還原之谷胱甘肽 DMSO: 二甲亞磡 DMF： 二甲基甲醯胺 β3 : TGF-p3 β2 : TGF-p2 β1-3 :TGF-pl-3 雜體 p3-2:TGFj3-2 雜體 β2-3 : TGF-p2-3 雜體 活性：+:在實例8描述之活體外生物分析鑑定中之中活性 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) -37- 517059 Α7 Β7 五、發明説明（） 在實例8描述之活體外生物分析鑑定中之高活性 微生物寄存 下列微生物寄存在德國菌體收集中心(DSM)，Mascherod^r Weg lb，D-3300 Braunschweig (德國）： (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 丨 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 微生物 寄存曰期 型錄號 大腸桿菌 LC 137/pPLMu.hTGF-pl 1989.11.28 DSM 5656 大腸桿菌 LC 137/pPLMiLhTGF#2 1989.11.28 DSM 5657 大腸桿菌 LC 137/pPLMu.hTGF-p3 1989.11.28 DSM 5658 啤酒酵母菌GRF 18 1986.3.4 DSM 3665 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公釐） -38- 517059 A7 B7 五、發明説明（） 序列表 (1) 一般資訊： (i)申請人： (A) 名稱：汽巴一嘉基股份公司 (B) 街名：克里貝克街141號 (C) 城市：巴塞爾 (E) 國家：瑞士 (F) 郵遞區號（ZIP): 4002 (G) 電話：+416169 11 11 (H) 電傳：+4161696 79 76 (I) 電報·· 962 991 ⑼發明名稱：生物活性蛋白質之新生產方法 (iii) 序列數：12 (iv) 電腦可讀形式： (A) 媒體類型：軟碟 (B) 電腦：IBMPC相容電腦

(C) 操作系統：PC-DOS/MS-DOS 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (D) 軟體：PatentlnRelease #1.0,版本 #1·3〇(ΕΡΟ) ⑵序列識別號1資訊： (i)序列特徵： (A) 長度：339個鹼基對 (B) 型式：核酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -39- 517059 A7 B7 五、發明説明（） (C) 股數：雙股

(D) 結構：直線型 ⑻分子型：cDNA至mRNA (iii)假設：無 f (νϋ)直接來源： (Β)純系：大腸桿菌 LC137/pPLMu.hTGF-pl(DSM5656) (ix)特徵：

(A) 名稱/關鍵字：CDS (B) 位置：1..336 (D)其它資訊：/產物=”人類TGF_pl” (xi)序列描述：序列識別號1 : GCC CTG GAC ACC AAC TAT TGC TTC AGC TCC ACG GAG AAG AAC TGC TGC 48

Ala Leu Asp Thr Asn Tyx Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys 1 5 10 15 GTG CGG CAG CTG TAC ATT GAC TTC CGC AAG GAC CTC GGC TGG AAG TGG 96

Val Arg Gin Leu Tyr lie Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30 ATC CAC GAG CCC AAG GGC TAC CAT GCC AAC TTC TGC CTC GGG CCC TGC 144

He His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys 35 40 45 CCC TAC ATT TGG AGC CTG GAC ACG CAG TAC AGC AAG GTC CTG GCC CTG 192 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

Pro Tyr lie Trp Ser Leu Asp Thr Gin Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu 50 55 60 TAC AAC CAG CAT AAC CCG GGC GCC TCG GCG GCG CCG TGC TGC GTG CCG 240

Tyr Asn Gin His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 CAG GCG CTG GAG CCG CTG CCC ATC GTG TAC TAC GTG GGC CGC AAG CCC 288

Gin Ala Leu Glu Pro Leu Pro lie Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro 85 90 95 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -40- 517059 A7 B7 五、發明説明（ AAG GTG GAG CAG CTG TCC AAC ATG ATC GTG CGC TCC TGC AAG TGC AGC 336

Lys Val Glu Gin Leu Ser Asn Met lie Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 TGA (2)序列識別號2資訊： (i)序列特徵： (A) 長度：112個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)結構：直線型 ⑻分子型：蛋白質 (xi)序列描述：序列識別號2 : 339 (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys 15 10 15 Val Arg Gin Leu Tyr lie Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 lie His Glu Pro Lys Gly Ί 35 25 30

His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys 40 45 訂 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製

Pro Tyr lie Trp Ser Leu Asp Thr Gin Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu 50 55 60 Tyr Asn Gin His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 Gin Ala Leu Glu Pro Leu Pro lie Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro 85 90 95 Lys Val Glu Gin Leu Ser Asn Met lie Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 ⑵序列識別號3資訊： (i)序列特徵： (A)長度：339個鹸基對 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -41 - 517059 A7 _B7_ 五、發明説明（） (B) 型式：核酸 (C) 股數：雙股 (D) 結構：直線型 ⑼分子型：cDNA至mRNA (νϋ)直接來源： (Β)純系：大腸桿菌 LC137/pPLMu.hTGF#2(DSM5657) (ix)特徵：

(A) 名稱/關鍵字：CDS (B) 位置：1..336 (D)其它資訊：/產物=”人類TGF_p2” (xi)序列描述：序列識別號3:

GCT TTG GAT GCG GCC TAT TGC TTT AGA AAT GTG CAG GAT AAT TGC TGC

Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gin Asp Asn Cys Cys 115 120 125 48 請 先 閲 讀 背 之 注

I 玎

CTA CGT CCA CTT TAC ATT GAT

AAG AGG GAT CTA 96

Leu Arg Pro Leu Tyr lie Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp 130 135 140 ATA CAC GAA CCC AAA G lie His Glu Pro Lys Gly 145 150 TAC AAT GCC AAC TTC TGT GCT GGA GCA TGC :Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys 155 160 144 •f 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 CCG Pro

TAT TTA

AGT TCA GAC ACT CAG CAC AGC AGG GTC CTG AGC TTA

Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gin His Ser Arg Val Leu Ser Leu 165 170 175 TAT AAT ACC ATA AAT CCA GAA GCA TCT GCT TCT CCT TGC TGC GTG TCC Tyr Asn Thr lie Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser 180 185 190 CAA GAT TTA GAA CCT CTA ACC ATT CTC TAC TAC ATT GGC AAA ACA CCC Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr lie Leu Tyr Tyr lie Gly Lys Thr- Pro 195 200 205 192 240 288 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -42- 517059 A7 B7 五、發明説明（） AAG ATT GAA CAG CTT TCT AAT ATG ATT GTA AAG TCT TGC AAA TGC AGC 336 Lys lie Glu Gin Leu Ser Asn Met lie Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 210 215 220 TAA 339 經濟部中央標準局員工消費合作、社印製 (2)序列識別號4資訊： ω序列特徵： (Α)長度：112個胺基酸 (B)型式：胺基酸 (D)結構：直線型 ⑻分子型：蛋白質 (xi)序列描述：序列識別號4: Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gin Asp Asn Cys Cys 15 10 15 Leu Arg Pro Leu Tyr lie Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30 lie His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys 35 40 45 Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gin His Ser Arg Val Leu Ser Leu 50 55 60 Tyr Asn Thr lie Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser 65 70 75 80 Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr lie Leu Tyr Tyr lie Gly Lys Thr Pro 85 90 95 Lys lie Glu Gin Leu Ser Asn Met lie Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 (2)序列識別號5資訊： (i)序列特徵： (A)長度：339個鹼基對 (請先閱讀背面之注意事項再？ϋ：本頁) 太 訂

* ·ϋΓ 1.11 HUB 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -43 - 517059 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 A7 B7 五、發明説明（） (B) 型式：核酸 (C) 股數：雙股 (D) 結構：直線型 ⑻分子型：cDNA至mRNA f (viii) 直接來源： (B)純系：大·腸桿菌LCl37/pPLMu.hTGF_P3(DSM5658) (ix) 特徵：

(A) 名稱/關鍵字：CDS (B) 位置：1..336 (D)其它資訊：/產物=”人類TGF_p3” (xi)序列描述：序列識別號5: GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG GAG GAG AAC TGC TGT 48

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys 115 120 125 GTG CGC CCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG GGC TGG AAG TGG 96

Val Arg Pro Leu Tyr lie Asp Phe Arg Gin Asp Leu Gly Trp Lys Trp 130 135 140 GTC CAT GAA CCT AAG GGC TAC TAT GCC AAC TTC TGC TCA GGC CCT TGC 144

Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys 145 150 155 160 CCA TAC CTC CGC AGT GCA GAC ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG GGA CTG 192

Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu 165 170 175 TAC AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCA TCT GCC TCG CCT TGC TGC GTG CCC 240

Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro 180 185 190 CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TAC TAT GTT GGG AGG ACC CCC 288

Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr lie Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro 195 200 205 AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG GTG AAG TCT TGT AAA TGT AGC 336

Lys Val Glu Gin Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 21〇 215 220 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-44- 517059 A7 B7 五、發明説明（） TGA 339 (2)序列識別號6資訊： (i)序列特徵： (A) 長度：112個胺基酸 f (B) 型式：胺基酸 (D)結構：直線型 ⑼分子型：蛋白質 (xi)序列描述：序列識別號6:

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys 15 10 15

Val Arg Pro Leu Tyr lie Asp Phe Arg Gin Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30

Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys 35 40 45

Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu 50 55 60

Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80

Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr lie Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro 85 90 95 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製

Lys Val Glu Gin Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 (2)序列識別號7資訊： (i)序列特徵： (A) 長度：336個鹼基對 (B) 型式：核酸 (C) 股數：雙股 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -45- 517059 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製

A7 B7 五、發明説明（） (D)結構：直線型 〜 ⑻分子型：其它核酸 (A) 描述：/desc=”TGF-p及TGFj3DNA之基因重組雜種DNA” (vii)直接來源： r (B) 純系：大腸桿菌 LC137/pPLMu.hTGF-p(44/45)p3 (ix)特徵： (A) 名稱/關鍵字：成熟-肽 (B) 位置：1..132 (D)其它資訊：/產物=”A^TGF-p之N-端44個胺基酸” (ix)特徵： (A) 名稱/關鍵字：成熟·肽 (B) 位置：133..336 (D)其它資訊：/產物=”人類TGF-P3之C-端68個胺基酸” (ix)特徵：

(A) 名稱/關鍵字：CDS (B) 位置：1..336 (D)其它資訊：/產物名爲TGF-pl-3之雜種TGF-β” (xi)序列描述：序列識別號7: GCC CTG GAC ACC AAC TAT TGC TTC AGC TCC ACG GAG AAG AAC TGC TGC 48

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys 15 10 15 GTG CGG CAG CTG TAC ATT GAC TTC CGC AAG GAC CTC GGC TGG AAG TGG 96

Val Arg Gin Leu Tyr lie Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30 ATC CAC GAG CCC AAG GGC TAC CAT GCC AAC TTC TGC TCA GGC CCT TGC 144 lie His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys 35 40 45 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -46- 517059 A7 B7 五、發明説明（ CCA TAC CTC CGC AGT GCA GAC ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG GGA CTG Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu 50 55 60 TAC AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCA TCT GCC TCG CCT TGC Cys TGC GTG CCC Thr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala ser Ala Ser Pro Cys Val Pro 65 70 75 80 CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TAC TAT GTT GGG AGG ACC CCC Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr lie Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro 85 90 95 AAA GTG GAG CAG Gin CTC TCC AAC ATG GTG GTG AAG TCT Ser TGT AAA TGT Cys AGC Lys Val Glu Leu Ser Asn Met Val Val Lys Cys Lys Ser 100 105 110 192 240 288 336 (2)序列識別號8資訊： (i)序列特徵： (A) 長度：112個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)結構：直線型 ⑻分子型：蛋白質 (xi)序列描述：序列識別號8: Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys 15 10 15 Val Arg Gin Leu Tyr lie Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 lie His Pro Tyr 50 Tyr Asn 65 Gin Asp Lys Val 20 Glu Pro Lys Gly 35 25 30

His Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys 40 45

Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu 55 60 Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro 70 75 80 Leu Glu Pro Leu Thr 工le Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro 85 90 95 Glu Gin Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公釐） -47- 517059 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） (2)序列識別號9資訊： (i)序列特徵： (A) 長度：336個鹼基對 (B) 型式：核酸 ^ (C) 股數：雙股 (D) 結構：直線型 ⑻分子型：其它核酸 (A) 描述：/desc=”編Ml種TGF«p2_3之基因重組雜種DNA” (vii)直接來源： (B) 純系：大腸桿菌LC137/pPLMu.hTGF_P2(44/45)P3 ㈣特徵： (A) 名稱/關鍵字：成熟·肽 (B) 位置：1J32 (D)其它資訊：/產物=”人類TGF-P2之N-端44個胺基酸” (ix)特徵： (A) 名稱/關鍵字：成熟-肽 (B) 位置·· 133..336 (D)其它資訊：/產物="人類TGF-P3之C-端68個胺基酸” (ix)特徵：

(A) 名稱/關鍵字：CDS (B) 位置：1..336 (D)其它資訊：/產物=”雜種TGF，p2-3” (xi)序列描述：序列識別號9: GCT TTG GAT GCG GCC TAT TGC TTT AGA AAT GTG CAG GAT AAT TGC TGC 48

Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gin Asp Asn Cys Cys 1 5 10 15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) a4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 太

、1T -48- 7059 A7B7 五、發明説明（） CTT TAC ATT GAT TTC AAG AGG GAT CTA GGG TGG AAA TGG Leu Tyr lie Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30 CCC AAA GGG TAC AAT GCC AAC TTC TGC TCA GGC CCT TGC Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys 40 45 CGC AGT GCA GAC ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG GGA CTG Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu 55 60 CTA CGT CCA Leu Arg Pro ΑΤΑ CAC GAA lie His Glu 35 CCA TAC CTC Pro Tyr 50 Leu TAC AAC ACT Tyr Asn Thr 65 CAG GAC CTG Gin Asp Leu AAA GTG GAG Lys Val Glu 96 144 192 GAA GCA Glu Ala 70 TOT GCC TCG CCT TGC TGC GTG CCC Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro 75 80 240 85 lie Leu Tyr 90 GTT GGG AGG ACC CCC Val Gly Arg Thr Pro 95

TGT AGC 288 336

100 105 110 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 (2)序列識別號10資訊： (i)序列特徵： (A) 長度：112個胺基酸 (B) 型式：胺基酸 (D)結構：直線型 ⑻分子型：蛋白質 (xi)序列描述：序列識別號10:

Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gin Asp Asn Cys Cys 15 10 15

Leu Arg Pro Leu Tyr lie Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30 lie His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys 35 40 45

Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu 50 55 60

Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -49- 517059 Α7 Β7 五、發明説明（）

Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr lie Leu Tyx Tyr Val Gly Arg Thr Pro 85 90 95

Lys Val Glu Gin Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 (2)序列識別號11資訊： (i)序列特徵： (A) 長度：336個鹼基對 (B) 型式：核酸 (C) 股數：雙股 (D) 結構：直線型 ⑻分子型：其它核酸 (A) 描述：/desc=”編碼雜種TGF-P3-2之基因重組雜種DNA1 (vii)直接來源： (B) 純系：大腸桿菌 LC137/pPLMu.hTGF-p3(44/45)p2 (ix)特徵： (A) 名稱/關鍵字：成熟^肽 (B) 位置：1..132 (D)其它資訊：/產物=”人類TGF_p3之N•端44個胺基酸，， (ix)特徵： 經濟部中央標準局員工消費合作、社印製 (A) 名稱/關鍵字：成熟_肽 (B) 位置：133..336 ①)其它資訊：/產物=TGFf2之C-端68個胺基酸’， (ix)特徵：

(A) 名稱/關鍵字：CDS (B) 位置：1 336 本紙張尺度適用中關家榡準（CNS ) M規格（non97公釐） -50- 517059 A7 B7 五、發明説明（） (D)其它資訊：/產物=”雜種TGF-p3-2” (xi)序列描述：序列識別號11: 經濟部中央檩準局員工消費合作衽印製 GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys 1 5 GTG CGC CCC CTC TAC ATT lie GAC Val Arg Pro Leu Tyr Asp 20 GTC CAT GAA CCT AAG GGC TAC Val His Glu Pro Lys Gly Tyr 35 CCG TAT TTA TGG AGT TCA GAC Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp 50 55 TAT AAT ACC ATA AAT CCA GAA Glu Tyr Asn Thr lie Asn Pro 65 70 CAA GAT TTA GAA CCT CTA ACC Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr 85 AAG ATT GAA CAG CTT TCT AAT Lys lie Glu Gin Leu Ser Asn 100 PTC CGC AAC TTG GAG GAG AAC TGC TGT ?he Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys 10 15 rTC CGA CAG GAT CTG GGC TGG AAG TGG ?he Arg Gin Asp Leu Gly Trp Lys Trp 25 30 CAT GCC AAC TTC TGT GCT GGA GCA TGC ryr Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys 40 45

60 K：T TCT CCT TGC TGC GTG TCC ila Ser Pro Cys Cys Val Ser 75 80 [>AC TAC ATT GGC AAA ACA CCC ?yr Tyr lie Gly Lys Thr Pro 90 95 ；TA AAG TCT TGC AAA TGC AGC 105 110 (2)序列識別號12資訊： (i)序列特徵： (A) 長度：112個胺基酸 (B) 型式··胺基酸 (D)結構：直線型 ⑻分子型：蛋白質 (xi)序列描述：序列識別號12:

Ala Leu Asp Thr Asn 1 5

Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Gys 10 15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 48 96 144 192 240 288 336 (請先閱讀背面之注惫事項再本頁)

、?T -51 - 517059 A7 B7 五、發明説明（）

Val Arg Pro Leu Tyr lie Asp Phe 20 Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr 35 40 Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Thr 50 55 Tyr Asn Thr He Asn Pro Glu Ala 65 70 Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr lie 85 Lys lie Glu Gin Leu Ser Asn Met 100

Arg Gin Asp Leu Gly Trp f«ys Trp 25 30

Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys 45

Gin His Ser Arg Val Leu Ser Leu 60

Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser 75 80

Leu Tyr Tyr lie Gly Lys Thr Pro 90 95 lie Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 105 110 經濟部中央檩準局員工消費合作衽印製 本紙G度適用中國國) A4規格（210><297公^7 -52-

Claims (1)

1. 517059 A8 B8 C8 D8 第84107189號專利申請案 中文申請專利範圍修正本年月）

   ι· 一種生產二聚體生物活性轉化生長因子冷（TGF_冷）狀 蛋白質之方法，該方法包括用不含清潔劑之折疊緩衝劑 處理變性之單體形式之該TGF•沒狀蛋白質，該緩衝劑 含有濃度為約1 〇至約5 〇 〇/〇 (V / v)之選自二甲亞砜 (DMSO)、二甲基甲醯胺（dmF)及其混合物所組成之 群之有機落劑，其中該緩衝劑另含有還原物質且該緩衝 劑p Η為約7至約1 〇之間。 2 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中使用之有機溶劑濃 度為大約2 0 %到大約5 〇 %。 3·如申請專利範圍第丨項之方法，其中使用之有機溶劑濃 度為大約3 0 %到大約5 〇 %。 4 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中使用之有機溶劑濃 度為大約3 0 %到大約4 〇 %。 5 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中使用之有機溶劑濃 度為大約4 0 %。 6 .如申請專利範圍第1項之方法，其中該轉化生長因子-0 (TGF-/9)狀蛋白質係選自TGF-/31 、TGF-沒2、 TGF-石3、雜二聚體TGF_石族、包含雜交分子（其中 各TGF -泠族部份被交換）之tgf -冷片斷及突變體、骨 路發育蛋白質（BMP )、抑.制素及活化素所組成之群。 7 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該轉化生長因子-沒 (TGF - /3 )狀蛋白質係選自丁gf -冷2、TGF - /3 3、雜種 TGF/3 1-2、雜種 TGF-/3 1-3、雜種 TGF-02_3、雜 種TGF_yS3-2及骨骼發育蛋白質（BMP-2)組成之群。 本紙張尺度適用中國國家標準((：]^3) A4規格(21〇χ297公釐) A B c D 517059 申請專利範圍 8 ·如申請專利範圍第7項之方法，其中該T G F -冷狀蛋白質 為 TGF-/33。 9 ·如申請專利範圍第丨項之方法，其中該緩衝劑溫度為約〇 °C 到約 4 0 °C。 10.如申請專利範圍第1項之方法，其中該還原物質為還原 之氣硫基化合物。 U·如申請專利範圍第1 〇項之方法，其中該還原之氫硫基化 合物係選自還形式之谷胱甘肽、還原形式之/3 -龜乙 醇、還原形式之巯甲醇、還原形式之半胱胺酸、還原形 式之半胱胺及還原形式之二硫蘇糖醇所組成之群。 12·如申請專利範圍第1 〇項之方法，其中使用之還原之氫硬 基化合物濃度為大約1到1 0 0 m Μ。 13·如申凊專利範圍第1 〇項之方法，其中使用之還原之氫硫 基化合物濃度為大約1到1 0 m Μ。 14·如申請專利範圍第1 〇項之方法，其中使用之還原之氫硫 基化合物濃度為大約2.5 m Μ。 O:\56\56541.DOCNtsp — 2 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公爱)

   第841〇7189號專利申請案 中文補充說明書（90年10月） 實驗方法 單體TGF-/32及單體TGF-/S3在4°C於含有以下條件之緩衝液中進行 折疊：0·1Μ之Tris、含有或不含有氫硫基試劑（RSH)、CHAPS或 CHAPSO、或可溶混水的溶劑（WMS，如表中所示）及1M[之NaO。缓 衝液之酸鹼值調整至表中的值。TGF-石之最終濃度為〇.1毫克/毫升。經 過4°C不同的時間間隔之後，以濃縮的醋酸使溶液酸化至pH 3.5，並在具 有YM10濾膜之Amicon攪拌器中進行超過濾，使溶液濃縮十倍。以o.im 之醋酸將濃縮的溶液稀釋至原本的體積並再次進行濃縮。重複進行這個程 序二次。將此溶液進行離子交換色層分析。藉由活體外生物分析測試分裝 液之生物活性，並同時在Mono S HR5/5管柱（Pharmacia)進行離子交換 色層分析以進行二聚體TGF-/3之色層分析鑑定。管柱係經2〇mM醋酸鈉 鹽、30%異丙基醇、pH 4.0 (緩衝液A)以1毫升/分鐘進行平衡，並以一 開始為緩衝液A且最後為〇·5Μ NaC1之緩衝液A的線性梯度方式沖提2〇 分鐘。 實驗I 以不含CHAPS或CHAPSO及氫硫基試劑，但含有各種可溶混水的溶 劑（WMS)之折豐緩衝液進行上述折叠實驗。結果顯示於表i。 WMS_ 10%異丙基醇 15%異丙基醇 _ TGF-/3_ /33 . B3 . P.\CJG\®\56541 -901009ROA2.DOC\2\tsp 517059 0.1 Μ甘油 β2 0·5Μ甘油 占2 10%甘油+10%異丙基醇 β2 10%乙二醇 β3 15%乙二醇 β3 10%乙腈 β2 20%乙腈 β2 30%乙腈 βΐ 40%乙腈 β2 0.3 聚乙二醇 4000 (PEG 4000) β2 10%六甲基磷酸三醯胺（ΗΜΡΤ) β3 20%六甲基磷酸三醯胺 /33 -無樣本在生物分析中表現活性，或在MonGS管柱之陽離子交換色層分析中顯現正確折叠之一㈣ TGF-沒蛋白質之存在。 10%二甲楓（DMS02)_ β3 實驗II 以含有DMSO或DMF、CHAPS或CHAPSO、以及含有或不含有氫硫 化物試劑之折疊緩衝液處理TGF-石。結果顯示於表2。 表2 No. CHAPS/CHAPSO RSH DMSO DMF DMS02 PH TGF-/3 活性 l〇 30 mM CHAPS 2.5 mM GSH 10% 8.0 石3 + 2·) 30 mM CHAPS 2.5 mM GSH 10% 9.0 /33 ++ 3·) 30 mM CHAPS 2.5 mM GSH 20% 8.0 4.) 30 mM CHAPS 2.5 mM GSH 30% 8.0 /33 ++ 5·) 30 mM CHAPS 2,5 mM GSH 10% 9.5 /33 ++ 6.) 30 mM CHAPS 2.5 mM GSH 20% 9.5 幻 ++ 7.) 30 mM CHAPS 2.5 mM GSH 30% 9.5 沒3 ++ 8.) 30 mM CHAPS 2.5 mM GSH 40% 9.5 /33 ++ 9.) 30 mM CHAPS 2.5 mM GSH 50% 9.5 + 10.) 30 mM CHAPS 10 mM GSH 10% 8.0 /33 + 11.) 30 mM CHAPS 1.0 mM GSH 20% 9.5 /33 ++ P:\CJG\®\56541 -901009ROA2.DOC\2\tsp 517059 12.) 30 mM CHAPS 5.0 mM GSH 20% 9.5 /33 ++ 13.) 30 mM CHAPS 10 mM GSH 20% 9.5 /?3 ++ 14.) 30 mM CHAPS 20 mM GSH 20% 9.5 沒3 + 15.) 30 mM CHAPS 50 mM GSH 20% 9.5 /33 + 16.) 30 mM CHAPS 2.5 mM 半胱胺酸 20% 9.5 /33 ++ 17.) 30 mM CHAPS 2.5 mM 半胱胺 20% 9.5 /33 ++ 18.) 30 mM CHAPS 2.5 mM 冷-ME 20% 9.5 /33 + 19.) 30 mM CHAPS 2.5 mM GSH 10% 6.5 /33 + 20.) 30 mM CHAPS 2.5 mM GSH 10% 7.5 + 21.) 30 mM CHAPS 2.5 mM GSH 10% 8.5 /33 ++ 22.) 30 mM CHAPS 2.5 mM GSH 10% 9.5 23.) 30 mM CHAPS 2.5 mM GSH 20% 9.5 /33 ++ 24.) 30 mM CHAPS 2.5 mM GSH 30% 9.5 Ή- 25.) 30 mM CHAPS 2.5 mM GSH 40% 9.5 iS3 + 26.) 30 mM CHAPS 2.5 mM GSH 10% 10.5 /33 + 27.) 30 mM CHAPS 0.0 mM GSH 10% 8.5 ++ 28.) 30 mM CHAPS 2.5 mM GSH 10% 8.5 /32 ++ 29.) 30 mM CHAPSO 2.5 mM GSH 20% 9.5 ++ 30.) 30 mM CHAPSO 2.5 mM GSH 20% 9.5 β2 ++ 31.) 30 mM CHAPSO 0.0 mM GSH 10% 9.5 沒3 + 32.) 30 mM CHAPSO 2.5 mM GSH 10% 9.5 月3 + RSH :如表中所示之氫硫基試劑 GSH :還原的谷胱甘肽 /3-ME :冷-疏乙醇 DMF :二甲基甲醯胺 DMSO :二甲亞楓 DMS02 :二甲楓 活性：+:上述活體外生物分析鑑定之中活性 ++ :上述活體外生物分析鑑定之高活性 卩:\(：】0\函\56541 -901009ROA2.DOC\2\tsp -3- 517059 實驗III 使用含有（八）30_之<：1^8、（8)30%之〇]\^0及（(：）3〇111^[ 之CHAPS加上30%之DMSO，且含有以下成分之折疊緩衝液處理TGF-冷3。以上述方式進行實驗，但折疊溫度為25°c。結果顯示於表3。 表3 實驗 緩衝液添加物 活性 (單位/微克） 活性 (單位/微克） 活性 (單位/微克） (A) 30mM CHAPS 0 (50h) 270 (144h) 180 (310h) (B) 30次 DMSO 1400 (65h) 4900 (165h) 3500 (235h) (C) 30mM CHAPS 30% DMSO 4600 (65h) 7800 (165h) 9300 (235h) 緩衝液: :lOOmM 之 Tris、 1M之Naa、0.5精胺酸 、2.5mM之GSH (還原的谷胱甘肽）、PH8.0，並含 有表中所列之添加物。 活性：依美國專利第5,650,494所述進行測試（括弧中韻示活性測試之時間點）。 溫度：25Ϊ 蛋白質：人類TGF-；S3 (單體，還原及變性的） P：\CJG\®\56541-901009R〇A2.DOC\2\tsp -4-