TW496872B

TW496872B - Peptide p277 analogs, and pharmaceutical compositions comprising them for treatment or diagnosis of diabetes

Info

Publication number: TW496872B
Application number: TW085100088A
Authority: TW
Inventors: Irun R Cohen; Dana Elias; Matityahu Fridkin
Original assignee: Yeda Res & Dev
Priority date: 1994-12-21
Filing date: 1996-01-05
Publication date: 2002-08-01
Also published as: NO317350B1; DE69531004D1; CA2208274C; WO1996019236A1; EP0820303A4; AU707835B2; SI0820303T1; IS4510A; CN1175214A; JP3554319B2; HU224160B1; EP0820303A1; JPH10511649A; HUT78092A; DE820303T1; RS49517B; YU78795A; HRP950612A2; BR9510102A; ES2201137T3

Description

496872 A7 · _____B7___ > 五、發明說明（I) 發明領域· 本發明係關於一種由60KDa的人類熱休克蛋白（heat shock protein (hsp60))之抗原決定部位所衍生出的新穎狀類及包括該等肽類之醫藥組成物及用以治療或診斷胰島素依賴型糖尿病（insulin-dependent diabetes mellitus(IDDM))之方法。發明背景第I型糖尿病，或稱IDDM，是一種由攻擊並破壞位於胰腺之胰島中之分泌胰島素的β細胞的T細胞所導致之自身免疫性疾病（Castano及Eisenbarth，1990)。此自身免疫過程的開始與進展至最高點在第I型糖尿病中並不會出現症狀。臨床上只有當β細胞的累積損失超過殘存之β細胞所能提供的胰島素的量時才能被察覺。的確，體內葡萄糖平衡的崩潰及臨床第I型糖尿病的出現被認爲只有當體內80°/。至90%的β細胞被免疫系統去活化(inactivated)後才會發生。因此，可被鑑定爲患有第I型糖尿病之患者係被視爲其β細胞之自身免疫破壞均已在很惡化的階段。再者，初期診斷，藉免疫標記來鑑別β細胞自身免疫性之前臨床糖尿病症只有在免疫反應開始發生後才能鑑別。因此，於治療上之搜尋係爲找到一種安全，專一且有效的方法來去除已經開始進行的自身免疫過程。本案發明人已藉硏究由NOD株發展出之自發糖尿病的老鼠來檢視此一問題，此被認爲是硏究人類IDDM的一 __3 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------訂---------線-^^- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 496872 Ί B7 五、發明說明（>) 種很好的模式（Castano 及 Eisenbarth，1990)。NOD 鼠在出生四週後開始發展出胰島炎、，初期胰島週邊出現輕微的浸潤進而逐漸在胰島內部發展爲嚴重的發炎。高血糖症’ 被證實乃由於胰島素分泌不足，在我們培養的老鼠族群中出現在I4至17週的雌鼠上。到35至40週時，幾乎所有的NOD雌鼠均發展出嚴重的糖尿病且當缺乏胰島素治療時會死亡。雄鼠發病率較低，其原因目前仍不是很淸楚。 NOD老鼠的糖尿病已被證實係由T細胞所引起的自身免疫性疾病（Bendelac 等人，1987 )。 T細胞對各類抗原之反應性及自身抗體已在人類 IDDM的患者身上及NOD老鼠上被偵測出來（Elias ’ 1994 )，且目前並不淸楚單一可能的標的抗原所引起之免疫反應是否爲造成此疾病之主要原因。在病因形成的問題之外就是治療的問題。已證實NOD老鼠上的自身免疫過程之起始可藉著將老鼠，在糖尿病開始前，接受各種的控制例如限制飮食，病毒感染，或非專一性的刺激免疫系統下加以防制 (Bowman等人，1994 )。NOD糖尿病也可藉在前糖尿病鼠中誘導其對抗原榖胺酸脫羧酶（GAD)抗原的免疫容忍性來加以防治（kaufman等人；1993 ; Tisch等人， 1993) ° 本案發明人先則已發現nod老鼠之糖尿病可藉接種使用以對人類hSp60分子之P277胜肽序列具專一性的T細胞之T細胞疫苗加以防治（Elias等人，1991)。此蛋白質 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）請先閲讀背N%之漆意事頊奔瓖寫本貢) 訂---------線」 496872 A7 · _B7_____ . 五、發明說明（q )

I 之前被標示爲hsp65，但目前由於有更仔細的分子量資訊而被重新標示爲hsp60 ;無論是那一種標示，仍是指同樣的蛋白質。該P277胜肽，爲包含於IDDM中之人類hsp6〇之抗原決定部位且相當於人類hsp60序列之位置437至460 ’ 係最早被描述於本案申請人之以色列專利申請案第94241 號及於Elias與Cohen，1994之文章中，且具有如下之序列：

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-

Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (SEQ ID ΝΟ:1) 在胰島素開始之初施予該p277胜肽已顯示能預防糖尿病的發展，可能是由於在NOD糖尿病中所必要的抗-P277免疫性被向下調控所致（Elias等人，1991 ;以色列專利申請案第94241號）。近來硏究已顯示該P277胜肽也可用來逆轉已在很惡化的階段的β細胞之自身免疫性 (Elias 及 Cohen，1994 )。本發明人之實驗室最近報導一種自身免疫糖尿病之形式可藉著在C57BL/KSJ株的老鼠中施予非常低劑量的b-細胞毒素streptozotocin (STZ)而被誘導（Eliase等人， 1994)。持續每天施予標準的低劑量STZ 40毫克/公斤五天通常可在三週內引發臨床糖尿病，而持續每天施予30毫克/公斤五天只在大約三個月之停滯期後才引發臨床糖尿病。此種經誘導糖尿病的模式係藉由在前驅症狀期出現抗 _________5___ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線」 496872 A7 ____ _B7_ ' 五、發明說明（f ) 胰島素的诌身抗體，抗胰島素自身抗體的抗遺傳性抗體，及抗hsP60的自身抗體之所標記。此種老鼠同時也表現出對hsp6〇及P277胜肽的自發性T細胞反應（Elias等人， 1994 )。因此，低於標準低劑量STZ顯然可引發一與在 NOD老鼠中所發展出的自發性糖尿病不同的自身免疫過程 (Elias 等人，1990 )。本發明的一個目的係提供肽p277的變異物，此種變異物可有用於診斷及治療糖尿病。發明摘述在P277胜肽的片段及變異物之硏究中，意外的發現肽類，其中當蘇胺酸殘基被賴胺酸殘基取代及/或其一或兩個半胱胺酸殘基被纈胺酸所取代時，該肽類的活性在治療糖尿病上與P277的活性類似。這些結果相當令人驚異因爲當半胱胺酸殘基被絲胺酸殘基取代時會得到去活性的肽類。因此本發明係關於一種包括序列I的肽： 6 11

Val-Iieu-Gly-Gly-Gly-x1 -Ala-Leu-Leu-Arg-X2 -Ile-Pro- 19 (I)

Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-X3- Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (SEQ ID NO ： 2) _____ 6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公髮) '~ --------------------訂--------線 (請先閱讀背面之泫意事項再填寫本頁) 496872 A7 ______Β7_，五、發明說明) 其中Xi和X2爲Cys或Val殘基且X3爲Thr或Lys殘基，但當X3爲Thr*殘基時，XjD X2不能同時是Cys殘基。在本發明之一特別具體實施例中，該肽由序列I所組成，其中Xi和χ2均是Cys且X3爲Lys，在此爲p277 (Lys19 ) ( SEQ ID NO : 3 )或 Xi 是 Val 和 X2 是 Cys 和 X3 是 Thr 或 Lys，在此分別是 P277 ( Val6) ( SEQ ID NO : 4 )和 p277 ( Val6-Lys19 ) ( SEQ ID NO : 5 )，或 X! 是Cys，X2是Val和X3是Thi*或Lys，在此分別是p277 (Val11) ( SEQ ID NO : 6)和 p277 ( Valn，Lys19) ( SEQ ID NO : 7);或雨者Xi和X2均是Val且X3爲Thr或 Lys，在此分別是 P277 ( Val6-Valn) ( SEQ ID NO : 8 )和 p277 ( Val6，n-Lys19) ( SEQ ID NO : 9)。該 p277 ( Val6-Val11)肽在此也稱p277 ( V)。本發明的另一目的即在提供使用一具有本發明序列I 的肽的方法及套組以用作IDDM之初期診斷。在IDDM的發展期間，動物會表現hsp60分子，或能與其有交互反應的分子，而在動物的血液及尿液中出現。它們也會表現對這些分子具專一性的抗體及T細胞。因此，hsp60的存在 (或能與其有交互反應的分子)或抗體或存在於血液及尿液中具專一性的T細胞，爲一種在β-細胞完全被破壞及個體發展出永遠的糖尿病之前的一種用來偵測IDDM過程的分析法。於患者中IDDM的存在或初期可藉使用具有本發明序列I的肽作爲抗原，來測試患者血液及尿液中抗hsp60抗 _______7___ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂---------線 496872 A7 , ___B7___ · 五、發明說明（L.) 體或能與人類hsP60有免疫反應的T細胞之存在而診斷。的確，任一前述之方法使用ρ277肽，如那些在PCT國際申請案公告號W0 90/10499中所描述的，在此併於此處作爲參考文獻，也可被使用來取代作本發明中具序列I的 ρ277 肽。因此，本發明提供一診斷患者中IDDM的存在或初期症狀的方法，其包括測試該患者是否有抗-hsp60抗體或能與hsP60有免疫反應的T細胞之存在，藉此一個顯示能與 hsp60有免疫反應之抗hsP60抗體或T細胞存在的陽性結果係表示具有胰島素依賴型糖尿病(IDDM)存在或初期的可能性很高。在診斷IDDM的方法中，該患者可能被測試是否有抗-hsp60抗體的存在，其中該測試方法可能包含一放射性免疫測定法或ELISA測試。患者也可能被測試是否有能與hsp60有免疫反應的T 細胞的存在。在此觀點之一具體實施例中，該測試方法包括一 T細胞增殖測試。其包括下列步驟： ⑴由患者血液樣品中製備一含T細胞之單核細胞部分； (ii) 在該單核細胞部分加入一選自如本發明之肽的抗原； (iii) 在該抗原的存在下及適宜的培養條件下培養該細胞部分一段適當的時間； (iv) 在培養時間結束前的一適當的時間下於(m)之經培 _____8_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱) " —~— --------------------1T---------線 (請先M讀背面之注意事項再填寫本頁) 496872 B7 五、發明說明（^]) 養細胞培養物中加入一經標記的核普酸以^E供將5亥經標記的核苷酸帶入增殖的τ細胞之DNA中；及 (v)藉分析被帶入該T細胞中之經標示的核苷酸的含量來決定增殖T細胞的含量。在上述步驟（iv)中，該經標記的核苷酸最好是3士胸苷。增殖的T細胞含量的決定乃藉以標準方法計算T細胞的刺激指數而得。在本發明此觀點之另一具體實施例中，該測試方法包括一 T細胞細胞素反應測試，其中步驟⑴至步驟(Hi)同上述T細胞的增殖測試，且在步驟(W)中細胞素的存在，例如 IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNFoc或 TNF0，由反應的淋巴細胞分泌至培養基中，可以商業上可獲得的套組以標準方法偵測出。在另一觀點中，本發明也提供一用於活體外的方法，其中抗體乃選自一具序列I的肽被皮下注射入患者體內且觀察其可偵測的皮膚反應（DTH)的發生。本發明也係關於一進行此種分析的裝置，以及用來進行此種分析的套組。此種套組之製備乃是用來執行可完成本發明的任一分析方法。每一個此種套組中含執行單一反應或固定數目之反應所須要的所有材料。例如，用來決定抗-hsp60抗體存在與否的套組可能包含一具序列ί的固相固定肽及一能辨識偵測出抗-hsP60抗體非可變性區域的標曰己抗體，例如經標的抗人類F ab。該套組也含如何使用該套組的指示及包含套組之材料的容器。可使用任何傳統 9 ί紙張尺度剌f關家標準（CNS)A4規格（21G X 297公爱)------ Ί (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1T---------線 1▲ 496872 A7 ^ __—_B7___ · 五、發明說明（P ) 的商標或'標示，如放射性同位素，酵素，發光團或螢光團。一典型的放射性同位素是碘-125或硫-35。爲此目的之典型的酵素包含蓐菜過氧化酶，β-半乳糖苷酶及鹼性磷酸酶。 —種藉測試抗-hsp60抗體的存在而診斷IDDM之存在的套組包括： ⑴一具有序列(I)之肽的抗原；及 (ii)一能辨識欲被偵測之抗hsP60抗體上之非可變性區域之經標記抗體。一種藉測試能與hsp60進行免疫反應的T細胞的存在而診斷IDDM之存在的套組包括： ⑴一選自具有序列I之肽的抗原； (ii) 一能培養淋巴細胞(T細胞)之適合的培養基；及 (iii) 一用於T細胞增殖測試之經標記核苷酸，或一細胞素，例如，IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNFoc或 TNFp，分析套組，用來測試細胞素。對活體內測試而言，此套組只含一適當形式之具序列 I的肽作注射用。本發明更進一步係關於一預防或治療IDDM的方法。本發明中以具序列I的肽作成之疫苗能提供一專一的對抗原自身免疫反應的向下調控作用，且有效的創造出一針對 IDDM自身免疫過程之對抗性。周樣針對此抗原在減弱或無毒性的形或經處理以增進其抗原性下，或片段或活性成分以T細胞發展出之疫苗也具有類似的效果。若病人顯示 10 __ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

T /¾.秦 ~ · *1·· -ϋ n n n n n ^ « ϋ ϋ n n ϋ I I I 496872 A7 ____B7_ ‘ 五、發明說明（1 ) 已在IDDM的前臨床症狀出現之前的初期階段，注射此一抗原或T細胞（或部分）可製造出一對抗原自身免疫反應的向下調控作用因此能在自身免疫反應變成非常顯著，且永久傷害形成前將其抑制。此肽也可用做一藥學試劑來抑制自身免疫反應即使其已在很惡化的階段，如本發明之發明人最近以p277肽在NOD老鼠上的治療情形所示（Elias 及 Cohen，1994 )。因此，本發明提供一預防或治療胰島素依賴型糖尿病 (IDDM)的製劑，其包括一選自下列族群所組成的T細胞產物：（a)對人類hsp60之p277序列有專一/丨生的人類 T細胞，其中細胞藉與具有序列I的肽一同培養而活化； (b) (a)中的人類T細胞經輻射照射或以其它方式減弱；（c (a)中的人類T細胞經靜水壓處理，化學性交聯試劑及/或細胞骨架之交聯試劑處理；（d)由（a)，（b)或(c)中之T細胞所脫出的部分，或表面蛋白質；或(e)—含有(a)中專一蛋白質接受器之必要的可變區域，或一鹽類，官能性衍生物，前驅物或活性部分。在本發明之一較佳之具體實施例中，該製劑包括由欲治療之IDDM患者所得的自體人類T細胞，其中T細胞已藉活體外接觸具序列I的肽而加以活化。之後此專一的已活化之T細胞被施予至同一患者體內。本發明同時也提供一種預防或治療IDDM之醫藥組成物，其包括一醫藥上可接受的載劑和，一有效量的具序列 1的肽，其鹽類或官能性衍生物。醫藥上可接受的載劑最 _____11_ ___ 本紙張尺度適用中國國家標準（cns)A4規格（210 X 297公釐） --------------------訂---------^ l^wi (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 496872 A7 _^B7___· 五、發明說明UD) 好是一油·類的載體如已知爲不完全之佛羅恩特氏佐劑 (Freund’s adjuvant)(IFA)的礦物油乳化物。然而，不完全之佛羅恩特氏佐劑，以及完全之佛羅恩特氏佐劑（CFA); — 含有各種量的已死的分枝桿菌Mycobacterium生物體之礦物油之製劑並不被允許在人體上使用因礦物油無法在人體中完全被代謝或分解掉。本案發明人發現某些特定的油脂乳化物，已有多年被用於人類病患靜脈營養注射，可作爲使用本發明肽之肽治療載體。兩種此類乳化物之實例爲目前商用之油脂乳化物稱 ’’Intralipid’f 及 ’’Lipofundin”。’’Intralipid’’ 是瑞典 Kabi

Pharmacia的一註冊商品，用於靜脈營養注射，詳述於美國專利案號 3，169,064。’’Lipofundin，1 是德國 B. Braun Melsungen的一註冊商品。兩者均含大豆油爲油脂（100 或200克在1〇〇〇 ml蒸餾水中：分別是10%或20%)。蛋黃磷脂在Intralipid中被用作乳化劑（12 g/Ι蒸餾水）和蛋黃卵磷脂在Lipofundin中被用作乳化劑（12 蒸餾水）。在Intralipid及Lipofundin中添加甘油而得等張性。本發明更進一步係關於一種預防或治療IDDM的方法，其包括在須要的病患身上施予一含序列I的肽的醫藥組成物或含針對本發明中具序列I的肽而發展出的T細胞之製劑。圖式簡單說明圖1爲一顯示p277和p277 (Val6-Valu)安定性的圖。 _________12____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

tr---------線 J 496872 B7 五、發明說明（ί ί ) 實心的圓圏代表使用Ρ277所得的結果而空心的圓圈代表使用P277(Val6-Valn)所得的結果。大圓圏代表經1週儲存的結果，中等大小的圓圏代表經9週儲存的結果，而最小的圓圏代表經20週儲存的結果。圖2顯示糖尿病選殖株C9之NOD T細胞隨著P277 肽（實心的圓圏）和p277(Val6-Valn)(空心的圓圏）而增殖。圖3顯示NOD脾臟T細胞在p277肽（Lys19)存在下會增殖。五隻雌老鼠的脾臟在每一年齡組中測試其T細胞在P277肽（Lys19)(實心的圓圏），P277肽（空心的圓圈）和控制組肽P278 (實心的方塊）存在下之增殖情形。圖4顯示糖尿病選殖株C9之NOD T細胞隨著p277 肽（Lys19)而增殖。圖5爲一顯示以P277(V)在IFA中前處理以防治由 STZ-誘導的糖尿病與以GADP34治療的控制組的比較圖。發明詳述在本發明中凡是提到f’序列I的肽π，及其鹽類與其官能性衍生物，均指此肽對糖尿病仍具生物活性。本發明中之具序列I的肽之“鹽類”爲生理上可接受的有機及無機鹽。本發明中之具序列1的肽之“官能性衍生物”在此涵蓋由殘基側鏈之官能基或Ν端及C端’以此領域中眾所皆一-__13_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) «--------訂---------線丨- 496872 A7 ____B7___ 五、發明說明（|ι) 知的方法製備而得之衍生物，只要其藥學活性在可接受的範圍均包含於本發明之範疇內，例如，在已知其與p277 類似的活性範圍下它們不會摧毀此肽的活性，不會爲含有此肽的物質帶來毒性也不會相反的影響其抗原的性質。此種“官能性衍生物”並不意欲包含將一種胺基酸轉化成另一種胺基酸之類的變化。由於上述條件的限制，這些衍生物可，例如，包括竣基基團之脂肪族酯類，由與氨或一級或二級胺反應所產生之羧基基團之醯胺類，藉由與醯基反應所得胺基酸殘基之自由胺基之N-醯基衍生物（如烷醯基(alkanoyl)或碳環芳香徑醢(carbocyclic aroyl group))或與酿基部分反應所得之自由羥基之0 -醯基衍生物（例如，絲胺醯基或蘇胺醯基）。本發明中之具序列I的肽可被用作醫藥組成物中之免疫原，特別是用於減輕及治療IDDM的疫苗，以及作爲診斷IDDM的診斷組成物中的抗原，可以此技藝中眾所皆知的方法製備而得，也屬於本發明之一部分。當用在藥學治療及預防疫苗上時，本發明之肽最好是與一具生物活性之載劑一起使用此能促使自身免疫的T細胞由型TH1至TH2之轉換。T細胞中屬CD4輔助型T細胞依其激發時所分泌的細胞素不同被分爲兩類（Mosmann 及 Coffman，1989 ) : TH1 細胞分泌 IL-2 和 IFN-γ，而 TH2細胞分泌IL-4和IL-10。使用之載體最好是脂肪性乳化物含10-20%之植物性和或動物性甘油，1.2-2.4%之植物 -_— _14______ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂-------- ——線丨▲ 496872 A7 ____ B7___ ----- —— 五、發明說明（I)) 性和或動物性磷脂，2.25-4.5%之滲透壓調節物，〇-〇.5%；^ 抗氧化劑，及水至100%。載體最好是Intralipid或 Lipofundin。此載體之使用方式已詳細記述於與本發明之以色列申請案（申請人之參考編號9451A)同一天提出申請之以色列專利申請案（申請人之參考編號9523 )中，申請人均相同，其整個內容倂於此處作爲參考文獻。根據本發明之醫藥組成物可口服或非經腸道方式施用，如皮下，肌內，靜脈，鼻內或直腸內。下列實施例建立以本發明之化合物及組成物用於科擧上可接受的動物模式中其對治療人類IDDM之有效程度。實施例材料與方法 ⑴老鼠。NOD/Lt株血親交配之雌鼠乃由以色列 Weizmann科學硏究所之動物繁殖中心所提供（Animal Breeding Center of the Weizmann Institute of Science， Rehovot，Israel)。這些老鼠在14至17週時會發展出與人類IDDM類似之先天性糖尿病。 (Π)肽。肽以ABIMED合成儀(FRG)依標準的Fmoc化學法合成且以高壓液態層析儀藉逆相層析方式加以純化。序列以胺基酸分析儀加以確認。所合成之肽如下：p277 肽；控制組 p278 肽其序列爲：Asn-Glu-Asp-Gln-Lys-Ile-Gly«Ile-Glu-Ile-Ile-Lys-Arg-Thr-Leu-Lys-Ile ( SEQ ID Ν〇:ι〇)，其正好是人類蛋白質hsp60分子位置458至474 __________15 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 2清先閱讀背面之注意事項再填寫本頁〕 )aJ9 ί I ! n 1_1 ϋ n I n -ϋ n n n I ϋ n n 1· n ϋ 496872 A7 · ___________B7_ , 五、發明說明（#) 之序列；p277片段：P277之胺基段（ρ277· N)，p277之羧基段（p277. C)，及 p277C 與 p278 之結合（p277.C-P278 ) ;P277肽（Lys19);和p277與取代兩個半胱胺酸之各取代胺基酸之順序如下：P277其中有橋聯SH基 (P277 (經橋聯CyS-CyS) ) ; P277其中兩個半胱胺酸殘基被纈胺酸取代（p277(Val6-Valn))或被絲胺酸取代 (p277(Ser6-Seru))。 (iii) 治療與追蹤。老鼠以P277，其它種類的肽，或牛血淸蛋白（BSA，購自 Sigma，St· Louis，MO, USA)之乳化物處理以體積0.1 ml經皮下注射入其背部。抗原以磷酸緩衝液稀釋並以同體積之礦物油乳化（非完全之佛羅恩特氏佐劑（IF A) ; Sigma)或10%之Intralipid 。治療期間 (7，12，15或17週），及40週後存活之老鼠每天早晨 1〇點如所描述之非節食狀況下（Elias等人，1991)測其血糖。當葡萄糖濃度爲11.1 mM/L或更大時被定爲顯著之血糖過高因此値較100隻健康老鼠中所測得之平均値（未顯不）還要高出3個標準誤差。胰臟之胰島之組織檢驗乃藉在切片上染蘇木素和曙紅而成。每一切片分別由兩位未先告知之觀察者觀察並評分。以chi SqUare test來確定各處理間統計上的差異。 (iv) T細胞之增殖測試。由C9選殖株及NOD雌鼠之所得之脾臟細胞懸浮液依前述之方法測試其T細胞之增殖 (Elias等人，1991 )。簡述之，ΙχΙΟ5選殖株C9細胞/ml 或lxl〇5脾細胞/ml以四重複在0.2ml之培養基中有或沒有本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) _ T · ϋ ί ·ϋ ·1· H ϋ n 】fJe n 1« n n 496872 A7 _____Β7_____ 五、發明說明（Lf ) 5pg/ml之各抗原培養72小時。增殖測試乃藉在最後12小時內[3H]-胸苷嵌入NDA之情形來決定。結果以刺激指數表示；有抗原存在下平均的cpm與無抗原下平均的cpm値之比。四重複間之標準誤差均在平均的10%之以下。脾細胞之背景値小於lOOOcpm且選殖株C9細胞之背景値小於 200cpm。每隻老鼠之脾臟均分別測試。每一組之老鼠所得結果以平均値±標準誤差表示。實施例1 以P277或其片段治療NOD老鼠爲測試2個各含12個胺基酸的p277肽片段，單獨或一起，在治療NOD老鼠上是否與P277具有同樣的效用，7 週大之NOD雌鼠經皮下注射50μ§各類在油中的肽。40週後在決定老鼠之狀態。結果顯示於表1。可觀察到控制組hsp60 ρ278肽對疾病的發展沒有效果：在經處理的40隻老鼠中，均有糖尿病且90%到40週時已死亡。相反的，ρ277肽完全抑制死亡的情形且治癒20隻經處理的老鼠中的60%。Ρ277肽片段則沒有那麼有效：ρ277之胺基段（ρ277· Ν)，ρ277之羧基段（ρ277· C)以及ρ277· C與ρ277· Ν之混合物 (ρ277·Ν，Ρ277· C)約爲完整的ρ277效用的一半。ρ277· C肽在合成時接上Ρ278肽使其成爲一較長的肽；然而， p277.C-P278並不比p277.C單獨時更好。因此，所得之結論即欲有全效的藥學作用須完整的p277肽。 __—_\1__ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -·--------訂---------線 1# 496872 A7 __B7 五、發明說明（ίί ) 表1 以ρ277或其片段治療NOD老鼠 40週後之糖尿病狀態治療之肽老鼠數目健康程度高血糖程度死亡 (50// g) % % % p278 40 0 100 90 p277 20 60* 40 0* p277.N 20 20 80 50* p277.C 20 30 70 40* p277.N，p277.C 20 35* 65 40* p277.C-p278 20 25 75 50* *p<0.01與以控制組P278肽治療之組相比實施例2 以經取代後之P277肽治療NOD老鼠下列之肽被用來在NOD老鼠中測試：p277，p277 (經橋聯 Cys-Cys ) ，P277(Val6-Valn)和 p277(Se:r6-

Ser11) 〇 NOD雌鼠經皮下注射lCK^g各類在0.2 cc礦物油乳化劑(IFA)中的肽。老鼠在I2週時開始治療其糖尿病狀態則在30週後決定。如表2所顯示，p277(Val6-Valn)和p277在治療糖尿病上一樣有效，未經處理的老鼠中80%有糖尿病，而經 _ _ 18 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐1 " "" " (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·--------訂--------- 丨 496872 A7 ___B7___ 五、發明說明（ι7]) P277(Val6^Valn)和p277處理的老鼠中各有22%和23°/。有糖尿病。另一方面，無論是ρ277 (經橋聯Cys-Cys )或 P277(Ser6-Sern)均不具任何藥效。另兩個P277肽之變異物，其中位置6和11之半胱胺酸分別被丙胺酸或安基丁酸所取代，在活體外測試於C9選殖株及NOD雌鼠之脾 T細胞中測試也同樣不具任何藥效。因此兩種肽無法被抗_ p277專一之T細胞辨識（結果未顯示），沒有進一步測試其活體內之治療功效。表2 以經取代後之P277肽治療NOD老鼠肽治療糖尿病發生率 (%) —— 治療之個數 ^τττ 11 IT j \ \\ 80 100 p277 22* 200 p277(經橋聯 Cys-Cys) 701 10 p277(Val6-Valn) 23* 52 p277(Ser6-Sern) 85^ 20 *ρ<0.01與只以佐劑治療者之老鼠相比其糖尿病發生率。 11在與只以佐劑治療者之老鼠相比其糖尿病發生率無顯著差異。實施例3 ρ277(να1β-να1")之安定度 19 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} ---------訂---------線· 496872 A7 ___ Β7___ 五、發明說明（[1) 之所以會將半胱胺酸取代是因爲ρ277肽有由於安定性的問題，p277(Val6-Valn)之安定度在合成後選定數個時間點加以測試。P277肽係不穩定且即使在很嚴格控制的條件„下也很容易被破壞（真空攝氏-20度經冷凍乾燥粉末）。爲了比較p277肽與其類似物P277(Val0-Valn)之安定度，兩種肽在同一時間合成並以乾燥的粉末儲存於攝氏-20 度。在合成後1，9和20週，取些許稱重，溶解並測試。其安定性的指標即其能刺激C9選殖株T細胞的能力。圖 1顯示此實驗的結果。可見到的，當p277肽在9週後喪失其大部分的效用且在合成20週後完全無效時，P277(Val6-Val11)在經20週的儲存其效果完全未變。一般深信P277的不穩定乃由於半胱胺酸殘基所造成，因此任何本發明之類似物只要其仍保持P277之生物活性均能如上例p277(Val6-Valn)所顯示的改善之安定度。實施例4 1ρ277肽或p277(Val6-Valn)治療NOD雌鼠能逆轉膜島炎 12週之NOD雌鼠，經皮下注射，以每隻老鼠lOOpg 的未經修飾之p277肽或p277(Val6-Val")在0.1 cc礦物油乳化劑中（非完全之佛羅恩特氏佐劑）加以治療。控制組老鼠則注射以磷酸緩衝液及礦物油。6個月後，犧牲每組中的五隻老鼠，取出胰臟在bouin中固定切片則以蘇木素：曙紅染色。胰島炎係以盲測試加以評分。由於控制組 ___ 20 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 496872 A7 B7 --- ζ ： -- 五、發明說明（L ) 老鼠均發展出嚴重的糖尿病\它們在5個月大時即加以犧牲。在那時，控制組老鼠的血糖量位於29-48 mmol/L的範圍。結果顯示於表3。表3 以p277肽或p277(Val6-Valn)治療NOD雌鼠逆轉胰島炎肽治療胰島數目_組織檢視（22週)_ (12週）乾淨％胰島週圍胰胰島內部％臟炎％ Μ 83 10 23 67 p277 49 25 69 6 p277(Val6-Valn) 62 52 31 17 在12週治療之時，未經治療的老鼠約60%顯出胰島內部有胰島炎，約20%顯出胰島週圍有胰島炎，而約20% 胰島顯出不具胰島炎。胰島內部發炎被認爲是一種嚴重的胰島炎警訊導因於缺乏β-細胞功能。如表3所示，與只以油處理之控制組老鼠相較下兩實驗組老鼠的胰島發病率有很大的差異。只以油處理之控制組老鼠其未受影響的胰島比例下跌較大，在22週後只有10%的胰島爲正常，在此時大半的老鼠均已發展出嚴重的糖尿病。在22週後約67%顯出胰島內部有胰島炎，剩餘的23%胰島顯出週圍有胰島炎的現象。相反的，以Ρ277肽或p277(Val0-Valn)治療的老鼠其正常胰島的數目有上升的現象（在25%至52%之間） 21 _____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 496872 B7 五、發明說明（>/D) 且胰島內部有胰島炎的數目則有下降的趨勢（在6%至17% 之間）。胰島週圍有胰島炎的數目增加至約31%至69%之間。因此，以P277肽或p277(Val6-Valn)的治療方能有改善病理組織且在治療三個月後能逆轉老鼠胰島炎的病情。以p277(V)治療NOD雌鼠夕茸它結果以每組10隻12至15週之NOD雌鼠經以p277(V)在油中或只有油處理做了 15個額外的實驗。在全部150隻老鼠中只以油處理的老鼠，90%會發展出糖尿病且85%的老鼠在32週時會死亡。相反的，以p277(V)處理的老鼠，只有50% (ρ<0·01)會發展出糖尿病且僅20%(ρ<0·01)的老鼠因嚴重的糖尿病而死亡。因此，在晚期以p277(V)處理能有效的抑制致死性糖尿病的發展。實施例5 以P277(Val6-Valu)在油脂乳化劑中來治療第I型糖尿病之狀療法在胰臟內製造胰島素之β細胞的自身免疫破壞乃由T 淋巴細胞主導。胰臟胰島週圍在5至8週時會有發炎浸潤的現象且β細胞的損壞導致胰島素的缺乏及嚴重的糖尿病 I4至2〇週時會出現，在35至40週時則幾乎100%的 NOD雌鼠均受其影響。 NOD雌鼠經皮下注射1〇〇叫P277(Val6-Valn)在0.1毫升磷酸緩衝液或一 10%的脂質乳化劑中由10%大豆油， ___ _ 22____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐) " " (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線一 496872 A7 __B7______ 五、發明說明（/1) 1.2%卵磷脂和2.25%甘油.所組成（Intralipid，Kabi Pharmacia AB，Sweden)。 - 追蹤其在6個月後糖尿病的發生率及體內製造抗-p277(Val6-Valn)抗體的情形。糖尿病的診斷彳票準爲持續性的高血糖，亦即以貝克曼葡萄糖分析儀Π至少兩次測定相隔數週血中葡萄糖的量超過11.1 mmol/L。成功的肽療法的診斷標準爲血中葡萄糖的量保持正常（少於11.1 mmol/L)，減緩胰臟胰島之胰島內部發炎（胰島炎）和誘導治療肽抗體做爲TH2-型免疫反應之指標。結果顯示於表 4 〇表4 在第6個月之糖尿病的發生率治療糖尿病的發生率（％) 死亡率(％) p277(Val6-Valn)/PBS 90 80 p277(Val6-Val1 l)/Intralipid 45* 20* 迦 j \ \\ 100 90 :P<〇.01與未經處理之NOD老鼠相比如於表4中所見，以施予於Intralipid中之本發明胜肽治療係有效降低糖尿病之發生及死亡。另一方面，以施予於PBS者治療爲無效。實施例6 应ZLM和係免疫性的交互反應由前糖尿病NOD老鼠所分離出之的T細胞選殖株C9 -----23_ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 496872 A7 _____B7___ 五、發明說明（>\ ) 的細胞與P277肽（實心圓圈）’ p277(Val6-Valn)(空心圓圈），p277(Ser6-Seru)(實心方塊）和 p277 (經橋聯 cys-Cys)(空心菱形）一起培養。結果顯示於圖2。發現選殖株C9只對p277和p277(Val6-Valu)處理後有正增殖反應的現象。此證明P277和p277(Val6-Valu)之間有交互作用而 p277(Ser6-Sern)和 p277 (經橋聯 Cys-Cys)，其不具有效治療作用，因此彼此之間沒有交互作用。實施例7 新診斷出的IDDM患者顯示其T細胞對P277肽和 p277(Val6-Valn)有增殖反應對新診斷出的IDDM患者（2至4週）作增殖分析測試。在ficol-hypaque上由已經肝燐脂處理之全血中分離週圍血液淋巴細胞，且在活體外作增殖的篩選，以hsP60肽 p277，P277(Val6-Valn)和控制組肽p278刺激引起增殖，測定3H-胸苷的嵌入。T細胞增殖反應以刺激指數表示 (SI):有肽刺激下T細胞嵌入3H-胸苷的値與背景値 (無添加抗原）間之比例。表5 新診斷出的IDDM患者顯示其T細胞對p277肽和 p277(Val6-Valn)有增殖反應患者 T細胞增殖反應（SI) ___p277 p277(Val6-Valu) P278 _ 24 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公爱1 ' --------------------訂-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 496872 A7 ___B7__ 五、發明說明) IDDM#68 3.5 3.2 〇·8 IDDM#69_2J_~ 5.0 _〇J_ 如表5所示，新診斷出的IDDM患者對p277(Val6-Val11)以及p277肽有反應。因此，p277(Val6-Valn)在免疫性上與P277相當。由於p277之治療效果乃由免疫辨示而來，又基於p277和p277(Val6-Valn)之間有免疫交互作用的事實，表示在糖尿病治療上它可被用來代替p277。實施例8 在IDDM患者與健康的個體上其T細朐對hsp60和狀的反藍以實施例7之方法篩選21個IDDM患者與14個健康的個體其血液中抗-hsP60及p277(V)。表6和表7顯示每一個體對控制組抗原（control Ag )即破傷風類毒素和流行性感冒病毒-德州株，完全重組hsp60與P277(V)之增殖T 細胞反應(刺激指數；SI)。SI爲3或更大時被認爲是正反應。表6 IDDM患者之增殖T細朐反^ 患者年紀診斷後之 T細胞反應（刺激指數）對： (歲）時間控治組 hsp60 p277(V) _(週/月）抗原 _ 1. LM 32 3.5 個月 + + , 25 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) -- --------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 496872 A7 _ B7 五、發明說明（/{) 2. G 25 24個月 + + - 3. Η 23 6個月、 + + - 4. DV 20 3週 + + - 5週 + + + 5. SD 15 6週 + + + 6. Ρ 15 4週 + - - 7. G 60* 5週 + + + 7週 + + + 8. F 45* 6週 + + + 9. IS 53 2週 + + - 10. T 20 4週 + + + 11. ΚΚ 21 4週 + + - 12. RI 40 6週 + - - 13. MS 5 1週 + - - 14. KB 5 2個月 + + + 15. BI 11.3 3週 + - - 16. YY 60 2個月 + + - 17. KA 12 4週 - - - 18. ZA 12 4週 + + + 19. A 17.5 11.5 年 + + + 20. N 17.5 7.5年 + + 4* 21. A 19.7 5.7年 + + + --------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) *患者對抗-GAD抗體有正反應者，爲第I糖尿病而非第II 型糖尿病，即使其開始爲高齡。 _26 ___ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐7" 一 496872 ___B7 五、發明說明（/) 轰Ί

在健康的血液捐贈者上其增殖TiSLilKM 捐贈者 T 控制組抗原細胞反應（刺激指數）對 hsp60 p277(V) 1 + - - 2 + - - 3 + nd + 4 + - - 5 + + + 6 + - - 7 + 痛 - 9 + - * 10 + - - 11 + + - 12 + - - 13 + + ' 14 + ~ nd :未作表8爲一總結表顯示86%和52%之患者對hsP60和 p277(V)有反應，控制組則爲21%和Η% (Ρ<〇·〇5) °因此，IDDM組之Τ細胞對hsp60和P277(V)有顯著的正反應。由此可結論在IDDM患者中對hsp6〇和p277(V)有反應的個體數較正常個體爲高。 _______27____________ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 496872 A7 _____B7_ 五、發明說明（yt ) ' 表8 在IDDM患考逛雠康個體中其τ細胞呈現正反應的發生率反應者 T細胞對下列之反應的發生率（％) hsp 60 p277(v) IDDM 18/21(86) 11/21(52)* 健康者 3/14(21) 2/14(14) * ρ<0·05藉由χ2分析，與健康血液捐贈者中抗p277(V)的發生率比較。實施例9 NOD T-細胞銷Lp277(Lys19)之增殖反應 p277(Lys19)與P277之差異僅爲一個胺基酸。爲確疋 p277(Lys19)在NOD IDDM中是一個自體抗原，我們比較τ 細胞肽ρ277和肽P277(Lys19)之增殖反應。圖3顯示N〇D 雌鼠脾臟之T細胞對p277(Lys19)和P277之增殖反應相同。控制組肽P278則無反應。以選殖株C9作實驗也同樣證實上述之結果’ 一個有致糖尿的NOD T-細胞選殖株被發現對人類肽p277有反應 (Elias 等人，1991)。C9 細胞對肽 p277(Lys19)和肽 P277 之增殖反應相同（圖4)。實施例1〇以p277(Lys19)來治療NOD雌鼠本案發明人先前報導在3個月大的NOD雌鼠身上惡 _____28_____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------tr---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 496872 A7 _______B7___ 五、發明說明〇/]) 化之胰島炎可以單一注射人類p277加以抑制，經治療之老鼠發展出臨床上非常惡化的糖尿病及嚴重的高血糖之比例較低。爲測試是否肽P277(Lys19)，即老鼠本身之肽 p277，也一樣有效，我們以100μ§之人類P277或 p277(Lys19)在IFA中來治療NOD雌鼠。濃度2mg/ml之肽p277或p277(Lys19)在磷酸鹽緩衝液 (PBS)中與同體積之非完全的佛羅恩特氏佐劑IFA乳化。10 隻3個月大的NOD雌鼠爲一組經皮下注射0.1ml ( 100pg 肽）之含任一肽之乳劑。控制組老鼠則只注射磷酸鹽緩衝液和佛羅恩特氏佐劑。每隔4週將老鼠放血一次並以貝克曼葡萄糖分析儀Π分析血中葡萄糖濃度。6個月時評其高血糖及由於糖尿病死亡的比例。如果老鼠血中葡萄糖濃度高於llmmol/L即被認爲具有糖尿病。結果顯示於表9。在6個月大時，90%之控制組老鼠均有非常惡化的高血糖且60%會死於糖尿病。相反的，以 p277或p277(Lys19)治療可防止糖尿病（比例分別是40%和 50%發生率）及死亡（比例分別是和20%發生率）的情形。因此，老鼠本身之肽p277(Lys19)在治療嚴重的胰島炎上似乎與外來之P277 —樣有效。表9 以p277或p277(Lys19)來治療糖尿病在3個月時之治療_在6個月時之糖尿病 __一 ______高血糖(％)_死亡率（°/。）___ p277(Lys19) 50 20 _ _29___ . 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線----- 496872 A7 ___B7__ 五、發明說明) ρ277 40* 10* __PBS_90^ __60_ *P<0.05 .這些結果顯示以人類hsP60分子及其P277肽來測試 NOD T細胞之增殖反應與老鼠hsP60與其P277(Lys19)序列之自體免疫反應相當。這些結果也在有致糖尿的C9 T細胞選殖株及於前糖尿的老鼠之脾臟所發展出之自發反應中被證實。再者，肽p277(Lys19)與P277在治療NOD老鼠的糖尿病上一樣有效。年齡及性別相吻合之其它株老鼠的脾臟 T-細胞對P277並不會表現出自發的T細胞之增殖反應（結果未顯示）。發現藉致糖尿的T細胞對老鼠hsP60序列的自體免疫性的這項事實進一步支持一般認爲IDDM乃造因於自體免疫過程。實施例11 以p277(V)治療由STZ誘導之糖尿病

Streptozotocin(STZ)是一種針對β-細胞的毒素如果注射量爲200 mg/Kg則可藉著在24至48小時內摧毀β-細胞而引起毒性糖尿病。在具有糖尿病基因的老鼠上給予低於有效劑量之毒素會引發糖尿病的發生。此種發炎過程約須 20至30天，視所給之STZ劑量而定。通常對以STZ引起之糖尿病使用之劑量爲每公斤體重200mg，以在連續天數中5個劑量每一劑爲40mg/Kg (Like及Rossini，1976)此 ___ _30__ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 496872 A7 -_____B7___ 五、發明說明) 種模式稱低劑量STZ。我們發現如果降低總劑量至150 mg/Kg (3 0mg/Kg x5 )，則糖尿病的發展在80至100天內。此種慢慢發展之STZ引起的糖尿病可能與人類之自體免疫情形較相似且與NOD老鼠自發性糖尿病中臨床階段前的時間相同（Castano及Eisenbarth，1990)。再者，急性毒性作用也因劑量的降低而減緩。 60 KDa的人類熱休克.蛋白（hsp60)在N〇D(Elias等人，1990)和STZ引起的糖尿病（Elias等人，1994)中均扮演了一個角色。我們先前顯示抗體及T細胞對hsP60之增殖反應均發生在嚴重的糖尿病之前。由尙未發展出糖尿病的NOD老鼠所選殖出針對hsP60的T細胞選殖株可選用來轉移胰島炎及高血糖至年輕的NOD老鼠（Elias等人， 1991 )或τ r ί 5 NOD老鼠身上。該NOD致糖尿的T 細胞選殖株能辨識hsp60序列437至460之一段24個胺基酸長的肽，我們稱之爲p277。STZ引起的糖尿病同時也扮隨有在臨床症狀前的抗-p277之T細胞反應。前述實施例已顯示p277(Val6-Valn)可保護NOD老鼠。本實驗測試p277(V)在治療由低劑量STZ模式中之治療功效。雄鼠，每組10隻，以STZ 30mg/Kg之劑量處理，每天一次共5天。一週後，老鼠以lOOpg之p277(V)在油中，一肽如Kaufman等人在I"3年所述乃穀胺酸脫羧酶 (GADp34)中的一段，被認爲與NOD老鼠的糖尿病有關，或是只以油處理。在第85天時重複此處理。第100天 _ 31 ^^張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱1 " ------------------- —訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 496872 A7 ___B7______ 五、發明說明（}° ) 時，將老鼠放血並測其血液是否爲高血糖（血糖濃度大於 15 nmol/L)。結果總結於圖5。可看到以GADp34處理或未經處理的其平均血糖屬高血糖範圍。相反的，以P277(V) 處理的其平均血糖屬正常範圍。因此，可有效的治療在雄性C57BL/ksj老鼠中以STZ引起的糖尿病也可治療在具糖尿病基因的NOD雌鼠上自發性糖尿病。P277(V)療法並不限於只一種糖尿病或只因一種基因型或性別引起之糖尿病。所有在此引用的文獻，包括期刊文章或摘要，公告或相對應美國或外國之專利申請案，由美國或外國所核發之專利，在此均整個倂於此處作爲參考文獻’包括所有的數據，表格，圖形，和內容均詳列於參考文獻內。此外，所有在引證之參考文獻中引用之參考文獻的內容也一倂作爲參考文獻。關於習知方法步驟，傳統方法步驟’習知方法或傳統方法，不以任何方式認爲本發明之任何觀點，描述或具體實施例係被相關技藝所揭示，教導或建議° 前述之具體實施例敘述詳盡將本發明之性質完全表現出來，以致他人藉應用此領域中眾所皆知之技術（包括所列舉之文獻），可很快的修改及/或改良以適用於各種應用此種具體化的應用，而不需額外的實驗’且未偏離本發明之範疇。因此，此種改良和修改，基於本發明所提供之教導，應視爲屬於所揭露之具體實施例的範疇內。在此所使用之語言文字或名詞乃爲了描述之目的應不受其限制，因 _______32______ _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------J 《--------訂---------線— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 496872 A7 _____B7_ 五、發明說明（V ) 此本文中所使用之語言文字或名詞應視爲教導之便，以結合此領域中之知識與技術。、參考文獻

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Tisch R，Yang XD，Singer SM，Liblav RS，Fuggar L， McDevitt HO. (1993) Immune response to glutamic acid decarboxylase correlates with insulitis in non-obese diabetic mice. Nature, 366:72-75. ______34_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -B n n n n ϋ I n 一OJfl n n· n an n n ϋ 1 n n ϋ n n n i-i n n 496872 A7 ___B7_ 五、發明說明) ' 序列表 (1)一般資訊： ⑴申請人： (A) 名稱： YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO. LTD. (B) 街道：郵政信箱95 (C) 城市：Rehovot (E) 國家：以色列 (F) 郵遞區號(ZIP) : 76100 (A) 姓名：Irun R· Cohen (B) 街道：11 Hankin Street (C) 城市：Rehovot (E) 國家：以色列 (F) 郵遞區號(ZIP) : 76354 (A) 姓名：Dana Elias (B) 街道·· 57 Derech Yavne (C) 城市：Rehovot (E) 國家：以色列 (F) 郵遞區號(ZIP) : 76344 (A) 姓名：Matityahu Fridkin (B) 街道：23 Miller Street 35 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —訂---------線」 496872 A7 _B7_ 五、發明說明q+) (C)城市：Rehovot (E) 國家：以色列 (F) 郵遞區號（ZIP) : 76284 (ii) 發明名稱：肽P277類似物以及包括該類似物用以治療或診斷糖尿病之醫藥組成物 (iii) 序列數目：1〇 (iv) 電腦可讀形式： (A) 媒體型式：磁碟片 (B) 電腦：IBM PC相容

(C) 操作系統：PC-DOS/MS-DOS (D) 軟體：Patent In Release #1.0，Version #1·30 (EPO) (v) 申請前資料： (A) 申請號碼：IL 1 12094 (B) 申請日期·· 12月21日1994年 (vi) 申請前資料： (A) 申請號碼·· IL 114460 (B) 申請日期：7月5日1995年 (2)序列編號：1之資料 ⑴序列特性： (A) 長度：24個胺基酸 (B) 形式：胺基酸 (C) 股：單股 (D) 拓樸學：線性本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------------—訂 i ftd m an ϋν an 1— I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 496872 A7 B7 五、發明說明 (Π)分子型式：胜肽 (xi)序列描述：序列編號

Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys lie Pro Ala Leu Asp IS 10 15

Ser Leu Thr Pro Ala· Asn Glu Asp 20 (2)序列編號：2之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：24·個胺基酸 (B) 形式：胺基酸 (C) 股：單股 (D) 拓樸學：線性 (ii)分子型式：胜肽 (ix)特點： (A) 名稱/關鍵子·胜狀 (B) 位置：6，11，19 (D)其它資料：/備註=”於位置6/11之Xaa =Cys或Val ;於位置19之Xaa = Thr或Lys ;其中當於位置19之Xaa爲Thr時，於位置6/11之Xaa不能同時爲 Cys” (xi)序列描述：序列編號· 2 · Val Leu Gly Gly Gly Xaa Ala Leu Leu Arg Xaa lie Pro Ala Leu Asp 1 S 10 15 Ser Leu Xaa Pro Ala Asn Glu Asp 20 * (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂i -線丨#-1丨本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 496872 A7 _____B7 五、發明說明 (2)序列編號：3之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：24個胺基酸 (B) 形式：胺基酸 (C) 股：單股 (D) 拓樸學：線性 (ii)分子型式：胜肽 (xi)序列描述：序列編號：3 :

Val Leu Gly Giy Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys lie Pro Ala Leu Asp 15 10 15

Ser Leu Lys Pro Ala Asn Glu Asp ^ 20 (2)序列編號：4之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：24個胺基酸 (B) 形式：胺基酸 (C) 股：單股 (D) 拓樸學：線性 (ii)分子型式：胜肽 (ix)特點： (A) 名稱/關鍵字：胜肽 (B) 位置：19 (D)其它資料：/備註=”於位置19之Xaa爲 _38_ ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) --------------------訂---------線-^^~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 496872 A7 B7 五、發明說明0 /]

Thr 或 Lys” (xi)序列描述：序列編號：4 :

Val Leu Gly Gly Gly* Val Ala Leu Leu Arg Cys lie Pro Ala Leu Asd 15 l〇 15 ' 〇 r ο 01 2 a a X u e L r e s

Ala Asn Glu Asp (2)序列編號：5之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：24個胺基酸 (B) 形式：胺基酸 (C) 股：單股 (D) 拓樸學：線性 (ii)分子型式：胜肽 (xi)序列描述：序列編號· 5 · Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Cvs lie Pro Ala Leu Asp 1 5 10 15 Se-ζ. Leu Lys Pro Ala Asn Glu Asp 20 (2)序列編號：6之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：24個胺基酸 (B) 形式：胺基酸 (C) 股：單股 (D) 拓樸學：線性 39 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂.丨 -線—ti 496872 A7 ___B7__ 五、發明說明qk) (ii)分子型式：胜肽 (ix)特點： (A) 名稱/關鍵字：胜肽 (B) 位置：19 (D)其它資料：/備註=”於位置19之Xaa爲 Thr 或 Lys” (xi)序列描述：序列編號：6 :

Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Val Xle Pro Ala Leu Aso 1 5 10 15

Ser Leu Xaa Pro Ala Asn Glu Asp 20 (2)序列編號：7之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：24個胺基酸 (B) 形式：胺基酸 (C) 股：單股 (D) 拓樸學：線性 (ii)分子型式：胜肽 (xi)序列描述：序列編號：7 :

Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Val lie Pro Ala Leu Asp 1 5 10 15

Ser Leu Lys Pro Ala Asn Glu Asp 20 (2)序列編號：8之資料： 40 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210^297公釐） --------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

V 496872 A7 % ______B7___ 五、發明說明（飞） ⑴序列特性： (A) 長度：24個胺基酸 (B) 形式：胺基酸 (C) 股：單股 (D) 拓樸學：線性 (ii)分子型式：胜肽 (ix)特點： (A) 名稱/關鍵子·胜狀 (B) 位置：19 (D)其它資料：/備註=”於位置19之Xaa爲 Thr 或 Lys” (xi)序列描述：序列編號：8 :

Val Leu Glv Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Val lie Pro Ala Leu Aso 1 ^ 5 10 15

Ser^Leu Xaa Pro Ala Asn Glu Asp 20 * (2)序列編號：9之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：24個胺基酸 (B) 形式：胺基酸 (C) 股：單股 (D) 拓樸學：線性 (ii)分子型式：胜肽 (xi)序列描述：序列編號：9 : (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------tr---------^ 1A_W— 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 496872 A7 ·, ______B7_________ 五、發明說明（p)

Val L'eu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Val lie Pro Ala Leu Aso 1 5 10 15

Ser Leu Lys Pro Ala Asn Glu Aso 20 : (2)序列編號：10之資料： ⑴序列特性： (A) 長度：17個胺基酸 (B) 形式：胺基酸 (C) 股：單股 (D) 拓樸學：線性 (ii)分子型式：胜肽 (xi)序列描述：序列編號：10·

Asn Glu Asp Gin Lys lie Gly He Glu He lie Lys Arg Thr Leu Lys 1 5 10 1:3 lie 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----------------- I I---訂---------^ —Awl (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Claims

496872 _

ji- /λ 口六、申請專利範圍 1、一種具有序列I之肽， (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 6 11 Val - Leu-Gly-Gly-Gly-X1 - Ala - Leu-Leu - Arg - X2 -Ile-Pro- 19 Ala - Leu-Asp-Ser-Leu-X3 - Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (SEQ ID NO ： 2 ) 其中\和X2分別是半胱胺酸(Cys)或纈胺酸(Val)殘基，且 X3爲蘇胺酸(Thr)或離胺酸(Lys)殘基，但當X3爲蘇胺酸 (Thr)，其鹽類及其官能性衍生物時，和X2不能同時是半胱胺酸(Cys)殘基。 2、如申請專利範圍第1項之肽，其標示爲 p277(Val6)，其中 X!是 Val，X2 是 Cys，且 X3 爲 Thr*。 3、如申請專利範圍第1項之肽，其標示爲 p277(Valn)，其中义1是 Cys，X2 是 Val 且 X3 爲 Thr。 4、如申請專利範圍第1項之肽，其標示爲 p277(Val6-Val")，其中乂，和 X2 二者是 Val 且 X3 爲 Thr。 5、如申請專利範圍第1項之肽，其標示爲 p277(Lys19)，其中 Χβ[] X2 二者是 Cys 且 X3 爲 Lys。 6、如申請專利範圍第1項之肽，其標示爲 p277(Val6-Lys19)，其中 X丨是 Val，X2 是 Cys 且 X3 爲 Lys 〇 7、如申請專利範圍第1項之肽，其標示爲 pZTTCValH-Lysi9)，其中 X丨是 Cys，X2 是 Val 且 X3 爲本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐） 496872 098895 ABCD 六、申請專利範圍 Lys 〇 8、如申請專利範圍第1項之肽，其標示爲 p277(Val6，u-Lys19)，其中 Χι 和 X2 二者是 Val 且 χ3 爲 Lys 〇 9、如申請專利範圍第1至8項中任一項之肽，其係用於診治胰島素依賴型糖尿病（insulin-dependent diabetes mellitus)(以下簡稱 IDDM)。 10、一種於活體外檢測於患者中之胰島素依賴型糖尿病(IDDM)存在或初期之方法，其包括以如申請專利範圍第 1至8項中任一項之肽作爲抗原來測試患者血液或尿液中能與人類hsp60有免疫反應之抗體或T細胞之存在。 11、如申請專利範圍第10項之方法，其包括測試患者血液或尿液中能與hsp60有免疫反應之抗hsp60抗體或 T細胞之存在，藉此一個顯示能與hsp60有免疫反應之抗 hsp60抗體或T細胞存在的陽性結果係表示具有胰島素依賴型糖尿病(IDDM)存在或初期的可能性很高。 12、如申請專利範圍第10或11項之方法，其中患者血液或尿液被測試是否有抗hsP60抗體之存在。 13、如申請專利範圍第Π項之方法，其中該測試法包括一種放射免疫測定法。 Η、如申請專利範圍第13項之方法，其中該測試法包括一種酶標記免疫吸附測定法(ELISA)測試。 15、一種藉著如申請專利範圍第10至14項中任〜項之方法測試抗hsP60抗體存在而診斷胰島素依賴型糖尿病 2 本紙張尺度適用中國Ϊ家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐） .......................---------------訂---------------- (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 496872 A8 B8 * . C8 D8 六、申請專利範圍 (IDDM)之存在的套組，其包括： ⑴一具有如申請專利範圍第1項之序列(I)之肽的抗原；及 (Π) —能辨識欲被偵測之抗hsp60抗體上之非可變性區域之經標記抗體。 16、如申請專利範圍第I5項之套組，其中該抗原係爲如申請專利範圍第2至8項中任一項之肽。 17、如申請專利範圍第15或16項之套組，其中該抗原係被固定於一固相上。 18、如申請專利範圍第15或16項之套組，其進一步包含使用此套組來診斷胰島素依賴型糖尿病（IDDM)之指示。 19、如申請專利範圍第15或16項之套組，其中之標記係選自由放射性同位素，酵素，發色團及螢光團所組成之族群中。 2〇、如申請專利範圍第10或11項之方法，其中患者血液或尿液被測試是否有能與hsp60行免疫反應之T細胞的存在。 21、如申請專利範圍第20項之方法，其中該測試方法包括由下列步驟組成之T細胞的增殖測試： ⑴由患者血液樣品中製備一含T細胞之單核細胞部分； (ii) 在該單核細胞部分加入一選自如申請專利範圍第1項中之肽的抗原； (iii) 在該抗原的存在下及適宜的培養條件下培養該細胞部分一段適當的時間； ____3 張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公笼厂 ~ .......................0^---------------訂……..........^9. (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 496872 頜 * . C8 D8 ---- " '""""' ~ ~· 六、申請專利範圍 ------------------------------ {請先閲讀背面之注意事項再項寫本頁} (iv) 在培養時間結束前的一適當的時間下於(iU)之經培養細胞培養物中加入一經標記的核苦酸以提供能將該經標記的核苷酸帶入增殖的T細胞之DNA中；及 (v) 藉分析被帶入該T細胞中之經標示的核笼酸的含量來決定增殖T細胞的含量。 22、如申請專利範圍第20項之方法’其中該測試方法包括一由下列步驟組成之T細胞細胞素反應測試： ⑴由患者血液樣品中製備一包含T細胞之單核細胞部分； (ii) 在該單核細胞部分加入一選自如申請專利範圍第1項中之肽的抗原； (iii) 在該抗原的存在下及適宜的培養條件下培養該細胞部分一段適當的時間；及 (iv) 測量培養基中由反應的琳巴細胞中所分泌之細胞素的存在。 Φ, 23、如申請專利範圍第22項之方法，其中該細胞素爲 IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNF-α或 TNF-β。 24、一種藉著如申請專利範圍第10、11及21項中任一項之方法測試能與hsp60行免疫反應之T細胞的存在診斷胰島素依賴型糖尿病(IDDM)存在之套組，其包括： ⑴一具有如申請專利範圍第1項之肽的抗原； (ii) 一經標記之核苷酸；及 (iii) 一能培養淋巴細胞之適合的培養基。 25、一種藉著如申請專利範圍第10、11、22及23項中任一項之方法測試能與hsP60行免疫反應之T細胞的存 _____ 4_ ^^尺玉適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐） ~ 496872 B8 ' C8 D8 六、申請專利範圍在診斷胰島素依賴型糖尿病(IDDM)存在之套組，其包括： ⑴〜具有如申請專利範圍第1項之肽的抗原； (…一能培養淋巴細胞之適合的培養基；及 (iii)一能測量培養基中由反應的淋巴細胞中所分泌之細胞素存在的分析套組。 26、如申請專利範圍第22至25項中任一項之套組’ 其進一步包含使用該套組來診斷胰島素依賴型糖尿病 (IDDM)之指示。 27、一種用於治療胰島素依賴型糖尿病（IDDM)之醫藥組成物，其包括如申請專利範圍第1項之序列I之肽及一醫藥上可接受之載劑。 28、如申請專利範圍第27項之醫藥組成物，其係用來預防或治療胰島素依賴型糖尿病(IDDM)。 29、如申請專利範圍第27或28項之醫藥組成物，其中該肽係爲如申請專利範圍第2至,8項中任一項之肽。 3〇·如申請專利範圍第1至8項中任一項之肽，其係用於製備可治療胰島素依賴型糖尿病(IDDM)之醫藥組成物。 ____〜_5 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公f) .......................MW.............訂................ (請先閲讀背面之注意事項存璜寫本頁)