TW449482B

TW449482B - Radiolabeled peptides for diagnosis and therapy

Info

Publication number: TW449482B
Application number: TW085105013A
Authority: TW
Inventors: Richard T Dean; Daniel A Pearson; John Lister-James; Edgar R Civitello
Original assignee: Diatide Inc
Priority date: 1995-03-31
Filing date: 1996-04-26
Publication date: 2001-08-11
Also published as: AU710923B2; NO974494L; AR002980A1; HUP9801390A2; HUP9801390A3; IL117725A; JPH11503420A; US6007792A; NZ306677A; BR9607933A; IL117725A0; EP0820313A2; MX9707426A; NO974494D0; ZA962527B; WO1996030055A3; CA2216851A1; CA2216851C; WO1996030055A2; RU2171117C2

Description

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 449482 A7 A7 ___B7五、發明説明（1 ) 發明背景 1. 發明範圍本發明係有關放射性治療之製劑與肽、放射性診斷之製劑與肽，及製造此等放射性標記之放射性診断劑與放射性治療劑之方法。明確言之，本發明係有關受體結合性血管活性腸肽（包括天然血管活性腸肽（VIP)及其片斷、衍生物、類似物’及模擬物）’及此等標記發射-射線之同位素如：i|-99m(Tc-99m)之化合物之具體實施例，及製造及放射性擦記此等肽之方法與套組，及此等肽於哺乳動物體内定位顯影之用途。本發明亦有闕受體結合性血管活性腸肽與其標記細胞毒性放射性同位素如：銖-186 (l86Re)及鍊_ ι88 (188Re)之衍生物，類似物與模擬物，及製造輿放射性標記此等化合物之方法與套组，及此等化合物於哺乳動物體内之治療用途。 2. 先前技藝之説明天然之血管活性腸肽（VIP)爲28個胺基酸肽，首先自豬上小腸分離出（赛德（Said)輿慕特（Mutt), 1970, Science 169: 1217-1218)。此肽屬於包括helodermin、小勝内泌素、生長激素釋放抑制素及胰增血糖素之結構相近之小肽族群。該肽如下式：^L HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN.醯胺 (其中胺基酸之單字母縮窝可見於茲貝（Zubay)之"生化學 M (Biochemistry)，第2版，1988年，紐約麥克米連出版公 -4- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（2丨0X297公釐） 4 4 9 482 A7 B7 五、發明説明（2 ) 司（MacMillan Publishing: New York，p. 33) 0 VIP之生物故應係受與膜結合之受體蛋白質之活化，該蛋白質會與細胞内環狀腺甞單磷酸訊號系統偶合。在組織及器官中，VIP調節許多種不同生物活性。其調節細胞代謝活性及調節外分泌與内分泌^亦誘發平滑肌放鬆並造成血管擴張效果。VIP亦涉及調節許多種不同細胞型態之細胞增殖與存活，此等細胞包括：角蛋白細胞'平滑肌細胞 '交感神經胚細胞、海馬體細胞 '及在活體外之NIH 3T3 細胞。 VIP受體廣泛分佈在胃腸道中，亦出現在多種其他細胞型態中。在例如：腺癌瘤、乳癌、黑色素瘤、神經母細胞瘤及胰癌瘤之腫瘤細胞t會表現大量VIP受體。事實上， VIP (包括VIP受體蛋白質）之高親和性結合位置之表現爲此等腫瘤細胞標誌物，VIP舆此等細胞之專一結合性可發展成在活體内定位及鑑別此等腫瘤細胞標誌物。已知許多種放射性核種適用於放射顯影，包括67Ga、 99ltlTc(下文稱爲 Tc-99m)、inIn ' 123I、125I、i69Yb或 186Re 。在人體内達最適當放射顯影時，必須考慮許多因素。爲了使檢測效率達最大程度，最好使用可發射200至200KeV 範圍内之r -能量之放射性核種。爲了使患者儘量減少吸收放射線劑量，放射性核種之物理性半衰期必須在顯影法所容許之儘可能縮短之範圍内°爲了可以在任一天或該天之任何時間進行檢查，放射性核種之來原宜爲臨床位置經常可取得者。 -5 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） , • , _ 0¾ Ί (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局負工消費合作社印製經濟部中央橾率局員工消費合作社印製 A7__/^Α3ΑΆΆ—____五、發明説明（3 ) 先前技藝已知使用123ι或125ι在νιρ序列之酪胺酸殘基上 (Tyri()或Tyr22)對VIP類似物進行放射性碘化作用之方法e 此等放射性碘化物質亦已用來分析腫瘤細胞上VIP與受體之結合性。包薩（Boissard)等人，1986，Concer Res. 46^: 4406-4413説明VIP之放射性碘化法及與人類結腸腸癌瘤細胞之結合。艾爾巴特利（El Battari)等人 ’ 1988，J. Biol. Chem. 263: 17685-17689説明VIP之放射性碘化法及與人類結腸腺癌瘤細胞之結合.。薩佛（Shaffer)等人，1987, Peptides 是：1101-1106説明 VIP之放射性碘化法及輿人類小細胞及非小細胞癌瘤細胞之結合。史佛包達（Svoboda)等人，1988，Eur. J· Biochem. 176: 707-713説明VIP之放射性碘化法及輿老鼠轉化之腺泡細胞之結合。葛仕巴哈（Gespaeh)等人，1988, Cancer Res. 48: 5079-5083説明VIP之放射性碘化法及輿人類乳癌細胞之結合。慕勒（Muller)等人，1989, J. Biol. Chem. 264: 3647-3650 揭示VIP之放射性碘化法及輿人類神經母細胞瘤細胞之結合0 李（Lee)等人，1990, Peptides 11: 1205-1210揭示 VIP之放射性碘化法及與人類小細胞及非小細胞癌瘤細胞之結合〇派克（Park)等人，1990, Cancer Rds.拉：2773-2780揭示 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 装· 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 4 2 A7 I_____ —_B7 五、發明説明（4 )

VIP之放射性辨化法及與人類胃癌細胞之結合D 畢蘭（Bellan)等人 ’ 1992, Exp Cell Res· 200； 34-40揭示 VIP之放射性辨化法及與人類黑色素瘤細胞之結合。慕迪（Moody)等人，1993, Proc. Natl. Aead. Sci. USA 90: 4345-4349揭示VIP之放射性碘化法及與非小細胞肺癌瘤細胞之結合。維格里尼（Virgolini)等人，I"4, Cancer Res· 54: 690-700説明VIP之放射性碘化法及與初級細胞及腫瘤細胞系之

結合D 先前技藝已知在γΐ〇或γ22上使用nijtvw類似物放射性碘化法。哈珊（Hassan)等人，1994，Nucl. Med. Biol. 2J_: 865-872 揭示VIP之放射性碘化法及由閃爍照相術測定放射性標記物在老鼠活體内之分佈。此等方法之用途在於利用放射性顯影法，特定言之放射性閃爍照相術，在活體内檢測腫瘤細胞。VIP爲適用於此等故射性顯影法之標誌物，因爲許多種不同腫瘤細胞對 VIP (VIP受體蛋白質）均表現高親和性結合位置，然而，放射性碘化肽具有顯著之商業性缺點。123丨昂貴且供應量有限。此外，通常無法在臨床位置上製備合格之放射性碘化放射性藥劑。

Tc-99m爲較佳之放射性核種，因爲其發射i4〇keV之r射線，物理性半衰期爲6小時，且很容易使用鉬_99/鍀-99m發生器於原位製得。先前技藝曾使用之其他放射性核種則不本紙張尺度適用中國國家標準（CMS M4規格（210X297公釐） --:.1-II----裝------訂------^ (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 449482 g 五、發明説明（5 ) 如Tc-99m有利。其原因爲此等放射性核種之物理半衰期較長，以致患者會吸收較多放射劑量（例如：銦-1 11)。或者，此等替代之放射性核種之r射線能顯著低於（例如：碘-125)或高於（例如：碘-131)Tc-99m，因此不遑合閃爍照相顯影法。此外，使用原位發生器不會產生許多種不適用之放射性核種。

Tc_99m爲過渡金屬，可利用金屬錯合部份有利地螯合。可結合Tc-99m之放射性標記錯合部份可與各種專一結合性化合物共價連接，作爲此等專一結合性化合物之放射性標記方式。此係因最常使用之Tc-99m，過鍀酸根 (Tc04·)化學物質無法直接與大多數專一性結合化合物充份強力結合，因此不適用於放射性藥劑。Tc-99tn與此等放射性標記錯合部份之錯合作用典型地需要使用如：氣化亞錫之還原劑進行過鍀酸根之化學還原反應。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 雖然Tc-9 9 m爲閃爍照相顯影術之較佳放射性核種，但並未廣泛用於標記肽（參見蘭柏特（Lamberts，1991，J. Nucl. Med. 32^: Π89-1191)。此係因先前技藝已知Tc-99m用於標記較大型蛋白質分子（即大小>10,000道爾呑）之方法並不適合標示肽（分子大小小於10,〇〇〇道爾呑）。結果大多數肽之放射性標記物必須由放射性核種螯合部份與肽共會連接 ’因此使螯合物依位置選擇性地進入胜肽中不會干擾胜肽之專一結合性質之位置。以Tc-99m標記胜肽之方法揭示於共同擁有之美國專利案系列No. 5,225,180及同在申請中之美國專利申請案系列N〇. 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 449 48 2 A7 B7 五、發明説明（6 ) 07/653,012, 07/807,062, 07/851,074, 07/871,282, 07/886,752, 07/893,981, 07/902,935, 07/955,466, 07/977,628, 08/019,864, 08/044,825輿 08/073,577, 08 092,355, 08/095,760, 08/210?8225 與 PCT國際申請案 PCT/US92/00757, PCT/US92/10716, PCT/US93/02320; PCT/US93/03687, PCT/US9^/04794? PCT/US93/05372, PCT/US93/06029, PCT/US93/09387,與 PCT/US94/01894 ,該等專利案已併爲本文之參考文獻。然而，此等文獻均未明確説明如何製備標記鍀-99m之血管活性勝肽。製僙之Tc-99m錯合物之方法係相關技藝已知者，並提供下列實例作爲一般參考：拜尼（Byrne)等人，美國專利案Nos. 4,434,15卜 4,575,556與4,571,430説明半胱胺酸硫内酯衍生之雙官能螯合劑。佛立茲柏格（Fritzberg)，美國專利案No. 4,444,690説明一系列以2,3-雙（氫硫基乙醯胺基）丙酸鹽爲主之鍀-螯合劑。諾斯可（Nosco)等人，美國專利案No. 4,925,650説明Tc-99m螯合錯合物。肯得（Kondo)等人，歐洲專利申請案，公告案號483704 A1揭示一種製備含氫硫基-Gly-Gly-Gly部份之Tc-99m錯合物= 歐洲專利申請案No. 8410983 1.2説明雙醢胺基、雙硫醇 Tc-99m配位體及其鹽作爲腎功能追腙劑。戴維森（Davison)等人，1981, Inorg. Chem. 20^: 1629-1632 -9- 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4规格（2i〇x297公釐） II ^—:1:----裳------訂------.Λτ^—:1-1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁〕 449482 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（7 ) 揭示氧鍀鰲合錯合物。佛立茲柏格（Tritzberg)等人，1982, J Nucl. Med. 592-598揭示以N，N，-雙（氩硫基乙醯基）-2,3-二胺基丙酸鹽爲主之Tc-99m螯合劑。拜尼（Byrne)等人，1983, J. Nucl. Med_ 巧：P126説明含高半胱胺酸之Tc-99m螯合劑。布萊森（Bryson)等人，1988, Inorg. Chem. T7} 2154-2161 説明Tc-99之中性錯合物，其對過量配位體不安定。米蘇拉（Misra)等人，1989, Tet. Lett·拉：1885-1888 説明用於放射性標記法之雙胺雙硫醇化合物。螯合劑於放射性標記專一結合性化合物上之用途係相關技藝上已知者，提供下列實例作爲一般參考：甘塞（0这!18〇\^)等人，美國專利案]^〇.4,472,509説明1^-99m螯合物-共軛單株抗體之製法舆純化法。史塔里安語普洛斯（Stavrianopoulos)，美國專利案No. 4,943,523説明含有金屬螯合部份之可檢測分予。佛立茲柏格（Fritzberg)等人，歐洲專利申請案No. 86100360.6説明適用於製備標記鍀之顯影劑之二硫醇、二胺基、或二醯胺基羧酸或胺錯合物6 艾柏特（Albert)等人，英國牟利申請案8927255.3揭示利用生長激素釋放抑制素衍生物（如：標記ϊ I i ln之克奇肽 (Octreotide)，經由與胺基末端結合之螯合基團進行放射性顯影。艾柏特（Albert)等人’歐洲專利申請案N〇. w〇 91/01144 -10- 本紙張.尺度適财酬家鮮（CNS ) Λ4規格（210X297公| ) ---- ^^1 nn n^i ^ϋ· I n^i m m· ,, -. 洚 i (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 49 482 A7 B7 五、發明説明（8 ) 揭示利用與生長因子、漱素、干擾素及細胞素有關之放射性標記胜肽進行放射性顯影法，且包括由專一辨識性肽利用該肽之胺基與放射性核種酱合基®共價連接。費雪曼（Fischman)等人，國際專利申請案公告案號 W093/13317揭示附接螯合部份之向化性肽。奎克布恩（Kwekkeboom)等人，1991，J_ Nucl. Med. 32: 981摘要#305係有關放射性擦記11 lIn之生長激素釋放抑制素° 艾柏特（Albert)等人，1"1，1991年第12屆美國胜肽研討會摘要LM10説明由標記luIn之二乙烯-三胺基五乙酸衍化之生長激素釋放抑制素類似物之用途。寇克斯（Cox)等人，1991年第7屆國際放射性醫藥學研討會，(7th International Symposium on Radiopharmacology, p. 16，揭示標記Tc-99m、131I及⑴In之生長激素釋放抑制素類似物於活體内利用閃爍照相術，爲内分泌腫瘤進行放射性定位上之用途。經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本買) 以Tc-99m標記某些專一結合性化合物，主要指大型蛋白質之方法係先前技藝已知者，提供下列實例作爲一般參考：漢特威奇（Hnatowich)，美國專利案No. 4,668,503説明 T c - 9 9 m蛋白質放射性標記法。托曼（To丨man) ’美國專利案No. 4,732,(584説明目標分子輿金屬硫新質之片段之共軛。尼可洛提（>^〇1〇出）等人’美國專利案_.4,861,869説明 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) Λ4規格（210X29*7公釐） A7 B7 449482 五、發明説明（9 雙官能偶合劑’適用於輿生物性分子如：抗體形成共軛物〇 I- - ϊ —^Γ ^^1 —L. H· n -- t - - - -I m n ^^1 1.^1 > * - - 03 Te (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 佛立兹柏格㈣zberg)等人，美國專利案N0 4 965奶説明以各種以S-受保護之氫硫基乙敢基甘胺酿基甘胺酸爲主之螯合物來標記蛋白質。索哈特（S—)等人，美國專利案N〇 5〇61 ’ 641説明包含至少-個"側接"氫硫基之蛋白質之直接放射性標記法。佛立兹柏格(Fdtzberg)等人，美國專利案N〇 5,〇91514説明以各種以S-受冑護之氫硫基乙醯基甘胺醢基甘胺酸爲主之螯合物來標記蛋白質。古斯塔文森（Gustavscm)，美國專利案N〇 5，112 953説明以Tc-99m螯合劑放射性標記蛋白質n 卡辛那（Kasina)等人’美國專利案n〇 5,175,257説明目標分予與Tc-99m螯合基團之各種組合。狄恩（Dean)等人，美國專利案Ν〇· 5,180,816説明Tc-99m 利用雙官能性螯合劑放射性標記蛋白質之方法。森奇哈根（Sundrehagen)，國際專利申請案公告案號 WO85/03231揭示蛋白質之1^-99〇1標記法。經濟部中央標準局員工消費合作社印製雷错（Reno)輿波提諾（Bottino)，歐洲專利申請案 87300426.1揭示以Tc-99m放射性標記抗體〇布雷莫（Bremer)等人，歐洲專利申請案N〇. 871 18142.6揭示抗禮分子之T c - 9 9 m放射性標記法f 派克（Pak)等人，歐洲專利申請案N〇. WO 88/07832揭示以Tc-99m標記蛋白質之方法。 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 Οχ297公餐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 449482 A7 ____ B7 五、發明説明（10 ) 哥德曼（Goedemans)等人，PCT 申請案 No. WO 89/07456 説明使用環狀硫醇化合物，特定言之2-亞胺基嘍茂烷及衍生物，爲蛋白質進行放射性標記=« 狄恩（Dean)等人，國際專利申請案公告案號w〇 89/12625説明雙官能性偶合劑用於爲蛋白質標記Tc_99ηι ο 索馬克（Schoemaker)等人，國際專利申請案公告案號 W090/06323揭示含有金屬結合區之嵌合蛋白質。童貝克（Thornback)等人，EPC申請案 No. 90402206.8説明使用含硫醇化合物，特定言之2-亞胺基嘧茂烷製備放射性標記蛋白質或胜肽之方法輿用途。古斯塔文森（Gustavson)等人，國際專利申請案公告案號 W〇91/09876揭示以Tc-99m螯合劑放射性標記蛋白質。洛德斯（Rhodes)，1974, Sem. Nucl. Med_ 4:281-293説明以鍀-99m標記人類血清白蛋白。克豪（Khaw)等人，1982, J. Nucl. Med. 23: 1011-1019揭示以Tc-99m標記生物活性大分子之方法。史瓦茲（Schwartz)等人，1991, Bioconjugate Chem.足：333 説明一種使用肼基菸酿胺基，由Tc-99m標記蛋白質之方法〇先前技藝曾提出嘗試標記胜肽之報告。伊格（Ege)等人，美國專利案No. 4J32,940説明以放射性標記肽爲T-淋巴細胞進行顯影定位。摩根（Morgan)等人，美國專利案No. 4,986,979揭示爲發 -13- 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（2!0'犬297公釐~5 ----ILM----.裝------訂------in (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中夬標準局員工消費合作社印掣 4 49 48 2 A7 A7 ________ B7 五、發明説明（11 ) '~~~ ~~ - 炎位置顯影之方法。佛那根（Flanagen)等A ’美國專利案N〇 5 248’764説明放射性標記之螯合部份與衍生自前房鈉尿因子之肽之間之共概物。蘭迪（Ranby)等人，1988, PCT/US88/02276說明一種在動物艘内檢測血纖維蛋白沉積之方法，其包括由放射性標記化合物與血纖維蛋白共償連接。李斯（Lees)等人’ 1989, PCT/US89/01854説明放射性標記胜肽之動脈顯影法。摩根（Morgan)等人，國際專利申請案公告案號 W090/10463揭示消炎位置之顯影方法。佛那根（Flanagan)等人，歐洲專利申請案N〇. 90306428.5 揭示合成胜肽片段利用一组有機螯合分子標記Tc_99m。史都鐸（8!11«16)，？(：丁申請案公告案號评〇 90/15818建議在含RGD之寡肽上標記Tc-99m。洛德威爾（Rodwell)等人，1991，PCT/US91/03116揭示"分子辨識單位”與·’效應物區”之共軛物。寇克斯（Cox)，國際專利申請案NO. PCT/US92/04559揭示含有二個半胱胺酸殘基之放射性標記生長激素釋放抑制素衍生杨。洛德斯（Rhodes)等人，國際專利申請案公告案號 \¥〇93/128丨9説明含有金屬離子結合區之肽。萊里（Lyle)等人，國際專利申請公告案號W093/1577〇揭示Tc-99m螯合物及標記Tc-99m之肚。 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2】0X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 • I - - I - - I - A7 449482 ____87 五、發明説明（12) ~~ 考佛林（Coughlin)等人，國際專利申請案公告案號 W093/21151揭示含有硫脉基之雙官能螯合創，用於放射性標記目標分子。奈特（Knight)等人，1"0，第3?屆核子蟹學學會年度會議（37th Annual Meeting of the Socity of Nuclear Medicine)，摘要#209提出使用Tc-99m標記肽之血栓顯影法。巴畢希（Babich)等人，1 993, J. Nucl. Med. 34: 1964-1974 説明標記Tc-99m之肽，包括肼基菸醯胺衍生物。 VIP受體結合性肽與片段之放射性標記衍生物，其類似物與模擬物亦可用於醫療。此等用途中，以具細胞毒性之放射性同位素-186及銖-188特別逋用。因此仍需要可放射性標記Te-99m之合成性（以便進行例行性製造並方便調節接受性）VIP受體結合性肽，衍生物，類似物輿模擬物，以用爲閃爍照相劑，且可放射性標記銖 -186或姝-188，用爲放射性治療劑。本發明所提供含有可與Tc-99m、Re-186或Re-1 88螯合之螯合基團之小型合成性 VIP受體結合性肽，其衍生物、類似物及模擬物，及其標記Tc-99m、Re-186與Re-188之衍生物特別符合此需要。發明概要本發明提供放射性藥劑，其係標記Tc-99m、、Re-186或 Re-188之受體結合性血管活性腸肽，可用於放射性治療與放射性診斷，特定言之閃爍照相顯影用途。本發明亦提供受體結合性血管活性腸肽試劑，其包含受體結合性血管活性腸肽、其衍生物、類似物與模擬物，其中此等化合物與 -15- 本紙張尺度適用巾酬家標準（CNS )_八鐵格（21GX297公董) ~ - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 經濟部中央榡率局員Η消費合作杜印— 經濟部中央標準局員工消費合作社印笨 4 49 48 2 A7 ____ B7 五、發明説明（13 ) 鰲合部份共價連接，本發明提供此等受體結合性血管活性腸肽、受體結合性血管活性腸肚試劑及放標性標記之受體結合性血管活性腸肽試劑，其係閃爍照相顯影劑Λ放射性 #斷劑及放射性治療劑。本發明之閃爍照相顯影劑包含放射性標記鍀_99ιη之受體結合性血管活性腸肽試劑。本發明之放射性治療劑包括放射性標記銖-186或銖-188之受體結合性血管活性腸肽試劑。亦提供製造此等受體結合性血管活性腸肽、受體結合性血管活性腸肽試劑及其放射性標記具體實施例之方法與用途。本發明提供一種製備放射性藥劑之試劑，其中該試劑爲合成之受體結合性血管活性腸肽（合成性化合物之定義包括：VIP、其與VIP受髏結合之片段、衍生物、類似物及模擬物），會與可螯合鍀或銖放射性標記物之螯合部份共價連接。該螯合部份係於試劑之合成期間加至試劑中。此外，本發明標記鍀或銖之放射性藥劑具有VIP受體結合親和力，未低於放射性標記天然VIP之親和力之十分之一。在一項較佳具體實施例中，本發明提供含有放射性標記 Tc-9 9m之本發明試剤之閃爍照相顯影劑。其他較佳具體實施例中’本發明提供含有放射性標記選自：鍊_186與鍊· 1 88中之細胞毒性放射性同位素之本發明試劑之放射性治療劑。試劑輿Tc-99m、Re-186或Re-188放射性標記物之錯合物係由本發明試劑與放射性標記物於還原劑，例如：亞錫離子之存在下反應形成。Tc·99m、Re-186或Re-188 -16- 本紙張尺度適用巾國國家標準（CNS ) Μ規格（公羞） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 449482 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印裝五、發明説明（14 與本發明試劑之錯合物亦可由已先還原之放射性標記物錯合物進行配位體交換而形成。因此，本發明亦提供含有本發明受體結合性血管活性腸肽試劑之閃爍照相顯影劑，其中螯合部份已與Tc_99m# 定地錯合本發明亦提供放射性治療劑，其係放射性標記鍊·186或銖-188之本發明受體結合性血管活性腸肽試劑。本發明亦提供在醫藥上可接受之載體中包含本發明放射性標記受體結合性血管活性腸肽之醫藥組合物。本發明另一方面提供用於製備放射性治療與放射性珍斷之放射性藥劑之試劑，最妤包括閃爍照相顯影劑β此等試劑分別包含與螯合部份共價連接且爲血管活性腸肽、衍生牧、類似物或模擬物之化合物ρ 本發明第一方面所提供用於製備放射性標記製劑之試劑爲分別包含如上述受體結合性血管活性腸肽，其輿如下式之螯合部份共價連接： c(Pgp)S-(aa)-C(pgp)s 其中（pgp)s爲氫或硫醇保護基團，且（aa)爲不含硫醇基之α 或胺基酸。較佳具體實施例中，胺基酸爲甘胺酸。另一項較佳具體實施例中，該製劑爲閃爍照相顯影劑。另— 項較佳具體實施例中，該製劑爲放射性治療劑。第二項具體實施例中，本發明提供受體結合性血管活性腸肽試劑，可經放射性標記，形成放射性診斷劑與放射性治療劑，其各包含i管活性腸肽輿包含含如下式部份之單 -17 私紙張尺度適财ϋ财標準（CNS)八4規格（2ΐϋχ 297公董） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝_ 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 44948 2 __ 五、發明説明（15) 一硫醇之鰲合基團共價連接：

A-CZ(B)-{C(RaRb)}n-X 其中 A 爲 Η、HOOC、H2NOC、（肽）-HNOC、（肽）-〇〇C、 Re2NCO或 Rd ; B爲 Η ' SH或-NHRC、-N(RC)-(肽）或 Rd ; Z 爲 H或 Rd ; X爲 SH或 _NHRC、_N(RC)·(肽）或 Rd ; Ra、Rb、

Rc_Rd分別爲H或直鏈或分支鏈或環狀之低碳數烷基；n 爲〇、1或2 ; 1^爲<^-04烷基、胺基酸或含有2至約10個胺基酸之肽；且：（1)其中B爲·(肽），X爲SH 且η爲1或2 ; (2)其中X爲-NHRC或-N(RC)(肽），B爲SH且η 爲 1或 2 ; (3)其中 Β爲 Η或 Rd，Α爲 HOOC、H2NOC、（肽）-NHCO或（肽）-〇〇c，X爲SHJLn爲0或1 ; (4)其中A爲Η或Rd 時，則其中B爲SH，X爲-NHRC或-N-Rc-(肽）且其中X爲SH ’ B爲-NHRC或-N(RC)-(肽）且η爲1或2; (5)其中X爲11或1^ ，八爲1100€、H2NOC、（肽）-NHOC 或（肽）.〇〇CJLB 爲 SH ; (6)其中Z爲甲基，X爲甲基，A爲HOOC、H2NOC、（肽）-NHOC或（肽）-〇〇C且B爲SH且η爲0。較佳具體實施例中，該製劑爲閃爍照相顯影劑。另一項較佳具體實施例中，該製劑爲放射性治療劑。此螯合部份之較佳具體實施例之化學式如下：

RlCCK胺基酸）L(胺基酸其中（胺基酸）1與（胺基酸）2分別爲任何不含硫醇基之一級泛 -或々·胺基酸，Z爲含硫醇部份之半肤胺酸、高半脱胺酸 '異半胱胺酸、音撒胺、：Z-氳硫基乙胺或3·氫硫基丙胺，且R 1爲低碳數（C丨-C4)坑基、胺基跋或含有2至1〇個鞍基 -18- 本紙張尺度適用令國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝.

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作杜印裝 ά d 9 4 8 2 α7 ___ ____ Β7 五、發明説明（16 ) 酸之肤。當Z爲半胱胺酸、高半犹胺酸、異半脱胺酸或青微胺時’該部份之羰基係與羥基、NR3R4基® (其中各R3與 R4分別爲Η或低碳數（Ci_C4)烷基）、胺基酸或含2至1〇個胺基睃之肽共價連接；或 y-(胺基酸）2-(胺基酸）2-nhr_2 其中Y爲含硫醇部份之半胱胺酸、高半胱胺酸、異半胱胺酸、青黴胺、2 -氫硫基乙酸根或3 -氫硫基丙酸根，（胺基酸）1與（胺基酸）2分別爲不含硫醉基之一級α或0 -胺基酸，且R2爲Η或低碳數（Crc4)烷基、胺基酸或含有2至1〇個胺基酸之肽。當Y爲半胱胺酸 '高半胱胺酸、異半胱胺酸或青黴胺時，該部份之胺基係與-H、胺基酸或含2至10個胺基酸之肽共價連接。本發明此方面之特別具體實施例中，螯合部份如下式： Ila. ·(胺基酸）〖·（胺基酸， lib. -Α-(：Ζ(Β>_{(：(Ι^Ι12)}η-Χ}-(胺基酸）i-(胺基酸）2， lie.-(一級 α -或点，r -二胺基酸）-(胺基酸）!-A-CZ(B)-，或 lid· -A-CZiBHCWRbVXH胺基酸）匕（一級從，点-或久 r -二胺基酸〉，其中（胺基酸:)1與（胺基酸）2分別爲任何不含硫醇基之天然、經修飾、經取代或經改造之或/?-胺基酸；Α爲Η、HOOC ' H2NOC、（胺基酸或肽）-NHOC、（胺基酸或肽）-OOC或R4 ; B爲Η ' SH或-NHR3、-Ν(ϋ3)-(胺基酸或肽〉或R4 ; Ζ爲Η或R4 ; X爲SH或-NHR3、-N(R3)-(胺基酸或肽）或R4 ; R1、砭2 ' R3與R4分別爲η或直鏈或分 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公f ) ---L--U----裝------訂------J (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 4 9 48 2 五、發明説明（17 ) I-.--Γ - -I ...... . - - ·. I— n^i ^^1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 支鍵或環狀低碳數燒基；η爲0、1或2之整數；（肽）或2至約10個胺基酸之肽；且（1)其中Β爲_NHR3或-N(R3)-(胺基酸或肽）’ X爲SH且η爲1或2 ; (2)其中X爲-NHR3或-N(R3)-( 胺基酸或肽）’ B爲SH且η爲1或2 ; (3>其中B爲Η或R4，A爲 HOOC、H2NOC、（胺基酸或肽）-NHOC、（胺基酸或肽）· OOC，X爲SH且η爲0或1 ; (4)其中A爲Η或R4時，則其中B 爲SH，X爲-NHR3或- N(R3)-(胺基酸或肽），且其中X爲 SH ’ B爲-NHR3或-N(R3)-(胺基酸或肽），且„爲！或2 ; (5) 其中X爲Η或R4，A爲HOOC、H2NOC、（胺基酸或肽）-NHOC ' (胺基酸或肽）-OOC且B爲SH; (6)其中Z爲甲基，X 爲甲基，A爲HOOC、H2NOC ' (胺基酸或肽）-NHOC、（胺基酸或肽>-OOC且B爲SH且η爲0。經濟部中央標準局員工消費合作社印製其也較佳具體實施例包括如下式之螯合部份：-〇1>?-01丫· Cys-, Cys-Gly-Gly-, Gly-Gly-Cys-, -( ε -Lys)-Gly-Cys-, ( d -Orn)-Gly-Cys-, ( γ -Dab)-Gly~Cys-，及 ~(/?-Dap>Gty-Cys-。（此等式中，咸了解 ε-Lys 代表離胺酸殘基，其中ε-胺基（而非典型之心胺基）與相鄰胺基酸之羧基共價連接，形成肽鍵；d*〇rn代表烏胺酸殘基，其β胺基（而非典型之胺基）輿相鄰胺基酸之羧基共價速接，形成肽鍵；r-Dab代表2,4-二胺基丁酸殘基，其 Γ -胺基與相郝胺基酸之羧基共價連接，形成肽鍵；且办_ Dap代表1,3·二胺基丙酸，其胺基與相鄰胺基酸之羧基共價連接，形成肽键）。本發明另一項具體實施例提供可放射性標記放射性同位素之受體結合性血管活性腸肽試劑，用於在哺乳動物體内 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 449482 A7 B7 五、發明説明（18) 位置顯影或用於放射性治療’其各包含與雙胺基-雙硫醇螯合部份共價連接之血管活性腸肽。本發明此具體實施例中，雙胺基雙硫醇螯合部份如下式：

/NH NIJ-A-CO-X S-(pgp)S S-(pgp)S 其中各R分別爲H、CHs或C.2H5 ;备^8口)5可分別爲硫醇保護基阁或Η ; m、η與p分別爲2或3 ; a爲直鏈或環狀低碳數烷基 '芳基、雜環基、其組合或其經取代衍生物；且X 爲肽；或 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

NH /

(CRj)*, SH

(CRA

經濟部中央標準局負工消費合作社印製其中各R分別爲Η、CH3或C2H5 ; m、η與p分別爲2或3 ; A 爲直鏈或環狀低碳數烷基、芳基、雜環基、其組合或經取代之衍生物；V爲Η或CO-肽；Ri爲η或肽；但其限制條件爲當V爲Η時，R1爲肽，且當Rl爲η時，V爲肽。爲了本發明之目的，具有此等結構之螯合部份稱爲"Β ΑΤ ”部份。較佳具體實施例中’該製劑爲閃爍照相顯影劑。另—項較佳具體實施洌中，該製劑爲放射性治療劑。本發明亦提供放射性藥劑及用於製備此等放射性藥劑之試劑，其包含受體結合性血管活性腸肽，輿選自下列之整 21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )从規格（21〇χ297公楚） 44948 ? Α7 --^ Β7 五、發明説明（19 ) 合部份共價連接； ⑴如下式之基圓：

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} (H)如下式之基困

•11 .I Λ 經濟部中央標率局員工消費合作社印製其中η，m輿p分別爲0或1之整數；各R】分别爲η、低碳數概基、CrC：4羥烷基或（：2_(：4烷氧烷基，且各r分別爲η或 R"，其中R"爲不含硫醇基之經取代或未取代之低碳數烷基或笨基’且R或R’之一爲L，其中L爲連接金屬螯合物輿 3標部份之二價連接頭部份，且其申當一個R，爲[時， -22- 本紙張尺度適用t國國家標準（CNS ) A4規；公着) 4 49 48 2 A7 _______ _ B7五、發明説明（2〇 ) NR、爲胺。較佳具體實施例中，L爲C「Cg直鏈、分支鏈或環狀烷基、羧酸酯、羧醯胺、磺醯胺、醚、硫醚、胺、烯、炔、、1，3·或1，4-連接之可視需要取代之苯環、或胺基酸或 2至約1 〇個胺基酸之肽，或其組合較佳具體實施例中，R"爲Ci-C^直鏈、分支鏈或環狀烷基；-Cq-OCr-、-CqNHCr-或-CqSCr-基困，其中q與r分別爲 1至5之整數’其中q + r之總和不超過6 ; (Ci.C^)娱(基-X’ 其中X爲羥基、經取代之胺、胍、脒、經取代之硫醇基、或羧酸、酯、磷酸根或硫酸根基團；苯基或經下列基團取代之苯基：齒素、經基、經取代之胺、脈、脉、經取代之硫醉、醚、磷酸根或硫酸根；吲哚基；含有1至3個氮、氧或硫原子之Ci_Cg雜環基或其組合。衣發明之較佳螯合部份包括如下式之螯合物： .ΝΗ ίώί.

L-Z n —· » - -- - - - -i * 士^^^1 ^^1 n ... ^^1 -- f - ，言 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本1) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 R3>^nr1r2 ^R7 HS^r8 m. 其中R1與R2分別爲H、低碳數烷基、C2-C4羥烷基或c2-c4 烷氧烷基；R3、R4、R5輿R6分別爲H、不含硫醇基之經取代或未經取代之低碳數烷基或苯基；R7與R8分別爲Η、 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（2ί0X 297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4 4 9 482 A7 B7 五、發明説明（21 ) 低碳數坑基、低碳數羥烷基或低碳數烷氧烷基：L爲二價連接頭基固且Z爲血管活性腸肽。本發明其他較佳金屬螯合物包括如下式之螯合物：

IV. 其中R1與R2分別爲Η、低碳數烷基、C2_C4羥烷基、或c2-C4烷氧烷基；R3、R4、R5與R6分別爲Η、不含硫醇基之經取代或未經取代之低碳數烷基或苯基，且R3、R4、R5 與R6中之一爲Z-L-HN(CH2)n-，其中L爲二價連接頭基團，Z爲目標部份，且η爲1至6之整數；R7與R8分別爲Η、低碳數烷基、低碳數羥烷基或低碳數烷氧烷基；且X爲胺基、經取代之胺基或-nrLy，其中Υ爲胺基酸、胺基酸醯胺、或含2至10個胺基酸之肽。本發明之更佳金屬螯合物包括如下式之螯合物：

本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（21〇><297公楚） nn nn 1 ^^^^1 ^^^^1 flms — -一.-¾ j (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 4 49 4B2 五、發明説明（ 22 其中R1與R2分別爲Η、低碳數烷基、低碳數羥烷基、或低碳數烯烷基；R3與R4分別爲Η、不含硫醇基之經取代或未經取代之低碳數烷基或苯基：η爲1至6之整數；L爲二償連接頭基團；且Ζ爲血管活性腸肽部份。其他更佳螯合部份包括如下式之螯合物：

Z-L-N

V 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝其中L爲二價連接頭基團且Ζ爲血管活性腸肽部份。本發明最佳螯合部份包括如下式之螯合物： (胺基酸）i-(胺基酸）2·半胱胺酸-， (胺基酸”“胺基酸”-異半胱胺酸-， (胺基酸胺基酸）2-高半胱胺酸-， (胺基酸）匕（胺基酸）2-青黴胺-， (胺基酸胺基酸）2-2-氫硫基乙胺-， (胺基酸”-(胺基酸）2-2-氫硫基丙胺-， (胺基酸）1 -(胺基酸）2 - 2 ·氫硫基-2 -甲基丙胺-， (胺基酸）^(胺基酸）2-3-氫硫基丙胺·，其中一級或卢-胺基酸中之（胺基酸）不含硫醇基且其中螯合物與目標部份或連接頭基團利用輿螯合物或其中_個胺基酸上側鏈之羧基末端形成共價鍵而連接。 25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210'乂 297公釐） I_--Μ----'裝------訂------ J;, (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央橾隼局員工消費合作社印装 449482 A7 ______B7 五、發明説明（23 ) 最隹螯合物亦包括如上式之螯合物，其中（胺基酸）1爲沈 Γ或胺基酸，其中α-或万·胺基爲游離胺且或 r -胺基酸利用r -胺基共價連接。其他最佳螯合物包括選自下列者： -半胱胺酸-(胺基酸）-(汉，々-或々，r-二胺基酸）； -異半恍胺酸-(胺基酸-或々，厂-二胺基酸）； -高半胱胺酸·（胺基酸）-(〇Τ，θ-或0，r -二胺基酸）； -青擻胺-(胺基酸或点，r -二胺基酸）； 2 -氫硫基乙酸-(胺基酸）-(α,点-或卢，r •二胺基酸）； 2-或3-氫硫基丙酸-(胺基酸）-(汉，万-或点，r 二胺基酸）； 2-氫硫基-2-甲基丙酸-(胺基酸点-或二胺基酸）；其中一級α -或0 -胺基酸中之（胺基酸）不含硫醇基，且其中螯合物與目標部份或連接頭基團利用與螯合物或其中一個胺基酸基團上之側鏈之胺基末端形成共價鍵而連接。特別佳之金屬螯合物係選自下列：-Gly-Gly-Cys-, Arg-Gly-Cys-， (ε -Lys)-Gly-Cys-，（ i -Om)-Gly-Cys·，（ γ -Dab)-Gly-Cys，輿-Dap)-Giy-Cys-。（此等式中，咸了解ε -Lys代表離胺酸殘基，其ε -胺基（而非典型之π-胺基）輿相鄰胺基酸之羧基共價連接，形成肽鍵；d -Orn代表烏胺酸殘基，其d胺基（而非典型之π -胺基）與相鄰胺基酸之羧基共價連接，形成肽键：F -Dab 代表2,4-二胺基丁酸殘基，其；r-胺基與相鄰胺基酸之羧基共價連接，形成肽键；且万-Dap代表1,3-二胺基丙酸，其胺基與相鄰胺基酸之羧基共價連接，形成肽鍵）。上述（III)類結構之較佳螯合物部份之實例爲螯合物Gly- -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格UlOX29?公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 49 482 A7 B7 五、發明説明（24

Gly-Cys-，其形成如下結構之螯合部份 Ο

[目標部份] VII類結構（螯合配位體形成如下結構之氧锝錯合物〇

[目標部份】如上述V類結構之更佳螯合部份之實例爲LyS_(W -肽） Gly-Cys ‘醯胺，其形成如下結構之螯合部份：經濟部中央標準局員工消費合作社印裂

[目標部份J

H2 IX. IX類結構之螯合配位體形成如下結構之氡鍔錯合物 -27- 本纸張尺度適用中國國家操準（CNS) Α<ί規格（21〇χ297公慶） n - - —Μ.— ί — Lr - - - i ^^1 ^^1 j j ml I In 1 I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 04 49 432 A7 B7 五、發明説明（a

用於製備如本發明所提供放射性藥劑且包含如上述11類結構之螯合部份之試劑實例爲（目標部份ycys-Giy-a -二胺基丙醸胺，可形成如下結構之螯合部份： ---L--U----裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

[目標部份]HN

XI. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

[目標部份]HN IX類結構之放射性診斷劑形成如下結構之氧锝錯合物

s H.N ΧΠ. 本發明較佳具體實施例中，螯合部份與受體結合性血管活性腸肽中組成肽之胺基以外之部位共價連接。如本文所 -28 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2ί0Χ297公釐> 經濟部中央標準局貝工消費合作社印掣 4 49 48 2 A7 —-------------B7 五、發明説明（26 ) 逑，特別有利之作法爲在合成期間，將螯合部份加至肽令或在化學合成期間，使作爲螯合部份之獨特連接部份加至肽中。離胺酸殘基侧鏈中之胺基出現在血管活性腸肽之數個位置上，因此螯合部份沒有位置專一性連接之優點。特定言之，硫醇基較適合作爲螯合物與受體結合性血管活性腸肽之獨特連接位置《本發明亦提供在活體外利用化學合成法製備本發明之肽試劑之方法。較佳具體實施例中，利用固相肽合成法合成受體結合性血管活性腸肽。本發明提供製備放射性標記之血管活性腸受體結合劑，其包含本發明之受體結合性血管活性腸肽與螯合部份共價連接。較佳具體實施例中，以Tc_ 9 9m放射性標記該試劑。另一項較佳具體實施例中’以或丨88Re放射性標記該試劑。本發明亦包括本發明之受體結合性血管活性腸肽試劑與放射性同位素之錯合物製劑，及放射性標記本發明肽試劑之方法。例如：本發明提供之閃爍照相顯影劑包含標記 Tc-99m之錯合物，其係由本發明之血管活性腸肽試劑輿 Tc-99m於還原劑之存在下反應形成。較佳還原劑包括（但不限於）：連二亞硫酸根離子、亞錫離子及亞鐵離子^本發明此等Tc-99m錯合物之形成亦可利用本文所提供預先製成之Tc-99m錯合物之配位體交換作用，由Tc-99m標記本發明之血管活性腸肽試劑。本發明亦提供由本發明之血管活性腸肽試劑製備放射性 -29 - 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) Λ4规格（2】0χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- -11 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 4 49 48 2 at _ B7 五、發明説明（27 ) 標記受體結合性血管活性腸肽之套組。用於放射性標記本發明肽試劑之套組包括含有預定量之本發明肽試劑及可放射標記該試劑之足量還原劑之密封瓶。本發明套组之較佳具體實施例中一方面爲用於以Tc-99m放射性標記本發明肽試劑之套組。亦提供用於製備放射治療劑之套組，其中較佳放射性同位素爲銖-186與鍊-188。本發明提供本發明放射性標記之血管活性腸受雜結合性肽試劑用於診斷上及治療上之方法。本發明一項具體實施例中，本發明提供以標記T c - 9 9 m肽試劑作爲閃爍照相顯影劑，可在活體内得到r -閃爍照相顯影像，用於在喷乳動物體内定位顯影之方法。此等方法包括投與診斷有效量之本發明放射性標記肽並在哺乳動物體内檢測放射性標記物發射之r -射線，而加以定位。本發明亦提供減輕動物（最好指人類）之與VIP有關之疾病之方法’其包括爲動物投與治療有效量之本發明放射性標記VIP受體結合性肽試劑。較佳具體實施例中，試劑係經186Re或188Re進行放射活性標記。本發明亦提供輿金屬結合部份共價連接之VIP受體結合性肽’該金屬結合部份會與磁性、順磁性、超磁性或超順磁性金屬原子 '離子或粒子錯合，並提供使用此等錯合物於活體内朦瘤或其他組織位置進行以磁性爲主之檢測法，爲此等受體結合性血管活性腸肽錯合物定位之方法。因此本發明提供非放射活性法，用於活體内爲腫瘤及其他Vjp 受體表現組織定位。 -30- ^張尺度適^中國國家樣準（CNS ) A4規格（210X297公楚) - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝·

,1T A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印聚 4 49 482 五、發明説明（28 ) 本發明之受體結合性血管活性腸肽及受體結合性血管活性腸肤試劑亦可包含多價連接部份。本發明之多價連接部份包含至少二個可與受體結合性血管活性腸肽或螯合部份或二者共價鍵結之相同連接頭官能基。較佳連接頭官能基爲一級或二級胺、羥基、羧酸根或硫醇反應性基團。較佳具體實施例中，多價連接基團包括：雙-琥珀醢亞胺基甲基链（BSME)、4-(2,2-二甲基乙醯基）苯甲酸（DMBA)、N-{2-(Ν'，Ν·-雙（2-琥ί白釀亞胺基-乙基）胺乙基）卜N6,N9_雙（2-曱基-2-氩硫基-丙基重氮壬醯胺（BA丁_BS)、參（琥珀醢亞胺基乙基）胺（TSEA)、雙-琥珀醯亞胺基己烷（BSH)、4-(OCH2CO-Gly-Gly-Cys醯胺）-2-甲基丙醢苯（ETAC)、參（乙醯胺乙基）胺、雙·乙醯胺甲基醚、雙乙醯胺乙基醚、汉_ ε·雙-乙醯基離胺酸、離胺酸及ι，8-雙-乙醯胺基_3,6-二哼辛燒，或其衍生物= 由下列某些較佳具體實施例中及申請專利範圍之更詳細説明，將了解本發明明確之較佳具體實施例。本發明之詳細説明本發明提供適用爲製備診斷及治療用之受體結合性血管活性腸肽放射性藥劑之試劑之受體結合性血管活性腸肽及其片段、衍生物、類似物及模擬物。本發明所提供此等受體結合性血管活性腸肽之較佳具體實掩例爲受體結合性血管活性腸肽試劑，其中受體結合性血管活性腸肽、其片段、衍生物、類似物及模擬物係與螯合部份共價連接。此等受體結合性血管活性腸肽試劑可經 -31 _ 本^:尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（2l〇X297公釐> ~ I - --1— —1 - - ' I I ί ----i ^ In- - -- . ϋ I I J— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標率局員工消費合作社印t 449482 A7 A7 _ B7 五、發明説明（29) 敢射性標記，形成放射性診斷劑或放射性治療劑。使用本發明放射性標記製劑之放射性診斷用途之實例之一爲閃爍照相顯影，其中可決定帶有VIP受體之腫瘤位置及程度。本發明之受體結合性血管活性腸肽試劑亦適合經細胞毒性之放射性同位素（如：銖-186或鍊-188)進行放射性標記，用於放射性治療。本文所採用"放射性照相顯影劑"一詞係涵括可利用放射活性檢測法（包括但不限於：；· ·相機或閃爍檢測探針）檢測之放射性標記製劑。另一方面’本發明之放射性治療具體實施例爲適合標記鍊-186及銖-188。此等具體實施例適用於治療動物（最好指人類）之與VIP有關之疾病或其他病症，包括（但不限於）結腸直腸癌及其他出現利用表現在細胞（包括此等腫瘤）之細胞表面上之VIP受體而可與VIP或VIP類似物結合之良性或惡性腫瘤生長特徵之疾病。爲了本發明之目的，"VIP受體結合親和力一詞係指依相關技藝上已知任何方法，特別包括彼等利用解離常數、抑制常數或IC5t)値測定結合親和力之方法測得之結合親和力p ”其親和力爲放射性碘化VIP之親和力之至少十分之一" —詞係指其親和力低於放射性碘化VIP之親和力未超過10 焙，或抑制常數（Ki)或IC5()未超過放射性碘化VIP之1 0倍〇在含有輿本發明所提供硫醇保護基團Kpgp)s}共價連接之硫醇之螯合部份中及輿此等部份共價連接之受體結合性 -32 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0'乂297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 449482 經濟部中央標準局員Η消費合作社印製五、發明説明（3Q) 血管活性暘肽中，硫醇保護基團可相同或相異，且可爲（但不限於）： -ch2-芳基（芳基爲苯基或經烷基或烷氧基取代之苯基） ♦ -CH-(芳基）2(芳基爲苯基或經烷基或烷氧基取代之苯基） * -C-(芳基）3(芳基爲苯基或經坑基或烷氧基取代之苯基） ♦ -CH2-(4-甲氧苯基）；淀基）（私基）2 ; -c(ch3)3 -9-苯基苟基； -CH2NHCOR (R爲未經取代或經取代之烷基或芳基）； -CH2NHCOOR (R爲未經取代或經取代之烷基或芳基）； -CONHR(R爲未經取代或經取代之烷基或芳基）； -CH2-S-CH2苯基較佳保護基團如下式：-CH2-NHCOR，其中R爲1至8個碳原子之低碳數烷基、苯基或經低碳數烷基、羥基、低碳數烷氧基、羧基或低碳數烷氧羧基取代之苯基。最佳保護基團爲乙醸胺甲基。爲了本發明之目的，"受體結合性血管活性腸肽” 一詞係涵括可與相關技藝上可辨識之各種細胞型態中所表現VIP 受體專一性結合之天然VIP、片段、類似物、其衍生物。模擬VIP之受體結合性質而設計之化合物（即”模擬物”）亦 -33- '------訂------,Α-^---1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 449 48 2 a? B7 _ 五、發明説明（31 ) 包括在此定義及本發明中。本發明試劑之特別佳具體實施例包括： Ή；ΦΑνΚΤΤ)ΝΥΤΚΙΚΚ(3ΜΑνΚΚΥΙΝ3ΙΙΝ(：((：Η2(：0,(-Dap)KCK.醯胺).醯胺 HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNC(CH2CO.GG€K.随胺).醯胺 HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNC(CH2Ca( J -Om)GCK.麟).醯胺 HSDAYFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNCCB AT).醯胺 HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNGGC.醯胺 HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNC(CH2C0.GGCE.醯胺).醯胺與 HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN( ε -K)GC.醢胺所有天然胺基酸均採用標準縮寫表示（可參見G.茲貝 (Zubay), Biochemistry(第2版），1988年（紐約麥克米餘出版社（MacMillen Publishing: New York) p.33)。爲了本發明之目的，天然胺基酸之特徵爲親脂性(丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯基丙胺酸、貉胺酸、脯胺酸、色胺酸及纈胺酸，及半胱胺酸之S-烷化衍生物），親水性（天冬醸胺、麩醯胺、蘇胺酸' 絲胺酸）' 酸性（麩胺酸及天冬脖酸）' 鹼性（精胺酸、組胺酸及離胺酸）》ε -K係指利用離胺酸殘基侧鏈上s -胺基之共償連接。J -Orn代表烏胺酸殘基，其中ό' *胺基（而非典型之π -胺基）與相鄰胺基酸之羧基共價連接，形成肽键結。r -Dab代表2,4-二胺基丁酸殘基，其中r-胺基輿相鄰胺基酸之羧基共價連接，形成肽鍵結。/? -Dap代表1,3·二胺基丙酸殘基，其中疗-胺基與相鄰胺基酸之羧基共價連接，形成肽鍵結。（BAT)代表 -34- 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） n^i —^l· n^i m1*·!^ ^^1 ^^1 in In i ,- -. U3 售 t讀先閱讀JtA面之注意事項再填寫本頁〕經濟部中央標準局員工消費合作社印31 4 4 9 48 2 A7 __;__B7 五、發明説明（32 ) Νό，Ν9-雙（2·氫硫基-：2-甲基丙基）-6,9-重氮壬酸；Κ,(ΒΑΤ)及 Lys.(ΒΑΤ)代表胺基酸離胺酸，在（ΒΑΤ)之胺基酸側鏈上ε -胺基上醯化；C(BAT)與Cys(BAT)代表S-(N6，N9·雙（2-氫硫基-2-甲基丙基）-6,9-重氮壬坑-1-基）半胱胺酸；（BAM)爲 (N1，N4-雙（2-氫硫基-2-甲基丙基10-三氮錐癸烷； (BAT-BM)爲Ν-{2-(Ν·，Ν·-雙（2-馬來醢亞胺乙基）胺乙基}-Ν9-(三級丁氧羰基）·Ν6，Ν9-雙（2-甲基-2-三苯基甲硫丙基）-6,9-重氮壬麄胺；（BAT-BS)爲Ν-{2-(Ν，，Ν，-雙（2-琥珀醢亞胺乙基）胺乙基）-Ν6,Ν9-雙（2-氫硫基-2-甲基丙基）-6,9-重氪壬醢胺；（BMME)爲雙-馬來醃亞胺基甲基醚；及（BSME)爲雙琥珀醯亞胺基甲基醚。本文中所使用下列胺基酸及胺基酸類似物以下列縮寫代表：Acm爲氫硫基保護基團乙醯胺甲基；Pen爲青擻胺；Aca爲6-胺基己酸；Hly爲高離胺酸 ;Ape爲L-(S-(3-胺丙基）半胱胺酸；FD爲〇-苯基丙胺酸； WD爲D-色胺酸：YD爲D-酪胺酸；Cpa爲L-(4-氣苯基）丙胺酸；Thp爲4-胺基-四氫硫吡喃-4-羧酸；D-Nal爲D-2-苯基丙胺酸；Dpg爲二丙基甘胺酸；Nle爲正白胺酸；Hey爲高半胱胺酸；Hhc爲高高半胱胺酸；Aib爲胺基異丁酸；Nal 爲2-苔基丙胺酸；D-Na丨爲D-2-茬基丙胺酸；Ain爲2-胺基茹滿-2-羧酸；Achxa爲4-胺基-環己基丙胺基；Amf爲4-胺甲基-苯基丙胺酸；Aec爲S-(2-胺乙基）半胱胺酸；Ape爲S-(3-胺丙基）半胱胺酸：Aes爲0-(2-胺乙基）絲胺酸；Aps爲0-(3-胺丙基）絲胺酸；Abu爲2-胺基丁酸；且Nva爲正纈胺酸 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0 X 297公1 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 4 4 9 4 8 2 a? B7 五、發明説明（33 ) 本發明所提供之受體結舍性血管活性腸肽及其衍生物輿類似物可於活體外化學合成15本發明之肽通常宜在肽合成機上製備。本發明所合成之肽中螯合部份，或螯合劑之獨特附接部份係在活體外之化學合成期間與肽共價連接，該化學轉化法係相關技藝專家們習知者。此等在合成期間與螯合部份或附接該部份之獨特螯合劑共價連接之肽較有利，因爲可決定明確之共價連接位置。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明之螯合部份係在肽合成期間加至目標受體結合性血管活性腸肽、衍生物或類似物中，或在肽合成期間，經由附接已加至血管活性腸肽中之獨特胺基酸而加至目標受體結合性血管活性腸肽、衍生物或類似物中。因此半胱胺酸及高半胱胺酸可在肽合成期間加至肽中特定位置，且螯合部份稍後可與半胱胺酸或高半胱胺酸硫醇基依位置專一性共價連接。本發明提供螯合部份依位置選擇性方式加至肽中實質上任何位置之方法。本發明特定言之係提供含有放射性標記螯合部份與胺基酸侧鏈連接之胺基酸衍生物，其中螯合物或螯合物隨後可依位置專一性連接之獨特胺基酸，可在活體外肽合成作用中加至肽中專一位置。本發明亦提供已含放射性標記之螯合部份加至肽中羧基末端之肽。較佳具體實施例中，放射性標記之螯合部份係加至合成性血管活性腸肽之胺基酸侧鏈中或之上，其中胺基酸爲如下序列肤之天然或替代性胺基酸。 -SDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN.醯胺其他較佳具體實施例中，放射性標記之螯合部份加至合成 -36- 本紙浪尺度適用令國國表標準（CNS ) A4規格（210'〆297公羞） 449482 A7 B7 五、發明説明（34) ~' ' 性血管活性腸肽中胺基酸側鏈之位置，其中胺基酸爲如下序列肽之天然或替代性胺基酸。 -NYTRLRKQMAVKKYLNSILN.醯胺其他較佳具體實施例中，放射性標記之螯合部份係加至合成性血管活性腸肽中天然或替代性胺基酸之侧鏈位置，其 t胺基酸爲如下序列肽之胺基酸： -KQM AVKKYLNSILN.醯胺另一項較佳具體實施例中，放射性標記之螯合部份係加 i合成性血管活性腸肽中羧基末端位置。本發明試劑之特別優點爲其含有放射性標記之螫合部份，或該螯合物隨後可依位置專一性附接之獨特胺基酸，可在合成期間加至肽中。此舉之優點在於因爲可在血管活性腸肤中或在血管活性腸狀片段、類似物或衍生物中之已知位置置入螯合物，因此避免降低肽對VIP受體之親和性。先前技藝中已知將螯合物加至肽令之方法主要係由先爲遠大於肽且對螯合部份之非位置專一性引進之效果較不敏感之蛋白質發展而來之方法發展形成。使用先前技藝方法製造之肽不如在本發明之肽中依位置專一性引進螯合物之作法有利，因爲當使用先前技藝之方法時，依此方法加入之螯合物會因相似性而降低肽結合親和性。

本發明另一個優點爲所提供之肽爲化學合成性肽0此乃因化學合成法爲配合化學工程技術之有控制之方法，可以提供有品質控制及醫藥上合適之產品。化學合成法優於其他方法’如：可能涉及使用病原菌（病毒、微衆菌，等等;I -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公釐）~~ ------ f請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 裝· 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 449482 A7 ---—_ B7 五、發明説明（35 ) 並需要昴貴成本排除或證實其不存在之生物合成法與萃取法依化學合成法製得之產物生產成本較便宜且更容易取得法規上之許可，因此有能力由醫藥上之具體實施例迅速帶到臨床及市場上。當放射性鍀與本發明之試劑形成錯合物時，由鲟錯合物 (最好爲Tc-99m過锝酸鹽）與試劑於還原劑之存在下反應。較佳運原劑爲連二亞硫酸根，亞錫及亞鐵離予；最佳還原劑爲氡化亞錫。製備此等錯合物之方式可由套組形式方便地提供，套組中包括含有預定量待標記之本發明試劑及可使Te-9 9m標記該試劑之足量還原之密封瓶。或者，可由本發明之試劑與已預先形成之不安定之鍀錯合物及另一種已知爲轉移配位體之化合物反應形成錯合物s已知此方法爲配位體交換作用，且係相關技藝上習知者。這種不安定錯合物可使用如，例如：酒石酸鹽、檸檬酸鹽，葡糖酸鹽或甘露糖醇等轉移配位體形成。適用於本發明之Tc_ 99m過得酸鹽中包括：檢金屬鹽如：鈉鹽，或敍鹽或低碳數烷基銨鹽。經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 本發明較佳具體實施例中，提供製備標記鍀或銖之肽之套組。取適量肽試劑加至含有還原劑如：氣化亟錫之小瓶中，還原劑之含量足以使T c _ 9 9 m、Re-18 6或Re-1 88標記在肽上。亦可包含適量之上述轉移配位體（如，例如：酒石酸鹽、檸檬酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖庚酸鹽或甘露糖醇） °套組中亦可包含習知之醫藥用輔劑如，例如：調節渗透壓之醫藥上可接受之鹽、缓衝劑、防腐劑，等等。套組之 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 'w49482 at ----- ' B7 _ _ 五、發明説明（36) 成份可爲液體、冷凍或乾燥形式。在較佳具體實施例中，套組之成份係呈冷凍乾燥型。根據本發明標記T c - 9 9 m、Re-1 86與Re-188之放射性帛劑之製法爲添加適量Tc-99m、Re-186或Re-】88，或其放射性核種錯合物至小瓶中，並在下文實例2所述之條件下反應。本發明所提供之標記放射活性之閃爍照相顯影劑具有適量放射活性。當形成較佳具體實施例放射活性錯合物時，通常最好在放射活性濃度每毫升約0.01毫居禮（mCi)至1〇〇毫居禮之溶液中形成放射活性錯合物0 經濟部令央樣準局員工消費合作杜印製本發明所提供之顯影劑可用於顯現表現或過度表現之受體’包括如：結腸之器官，以診斷此等器官之病變 ’及腫瘤，特定言之腸胃腫瘤，明確言之可顯影之結腸直腸腫瘤。根據本發明，標記Tc-99m之肽試劑係呈單一單位之立射劑量投藥。本發明所提供之標記Tc-99m之肽試劑可於靜脈注射常用之任何介質如：生理食鹽水溶液介質中’或於i槳介質中，經靜脈内投藥。通常，投藥之單位劑量之放射活性爲約〇〇1 mCi至約100 mCi，以1 mCi至20 mCi較佳.以單位劑量注射之溶液爲約〇〇丨毫升至約1 〇毫井。經靜脈内投藥後，可在幾分鐘内即在活體内顯影。然而’若需要時’在放射性標記之肽注入患者體内數小時或甚至更久後仍可顯影。大多數情況下，在約〇1小時内，即有足量投藥劑量累積在待顯影之區域内，便於拍下閃爍照片。根據本發明可採用供診斷用之任何習知閃爍照相顯 -39- 本紙張尺度適财咖家榡準（CNS ) ( 21GX297公羞） U9 482 . A7 B7 五、發明説明（37) 影方法ΰ 本發明亦提供放射性標記細胞毒性放射性同位素如：鍊 186或銖188之肽，可用於放射性治療上述某些腫瘤。爲了此目的，可經由任何合適之臨床途徑，最好利用靜脈内注射法，投與約10 mCi至約200 mCi之放射活性同位素。本發明亦提供與金屬結合性部份共價連接之VIP •受體結 s性血管活性腸肤，該金展結合性部份會與磁性、順磁性超磁性或超順磁性金屬原予，離子或粒子錯合，並提供使用此等錯合物於活體内之腫瘤或其他組織位置，爲此等梵體結合性金管活性腸肽錯合物進行以磁性爲主之檢測法加以定位。因此，本發明提供非放射活性法，用於活體内爲腫瘤及其他血管活性腸受體表現組織定位。經濟部中央標準局員工消費合作社印繁 ---'“-----坤衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明提供使用本發明診斷劑及放射性診斷劑及治療劑及放射性治療劑之方法。本發明製劑，例如：標記Tc-99m之閃爍照相顯影劑之放射性標記具體實施例中，係投與診斷或治療有故量之本發明診斷劑或放射性診斯劑或治療劑或放射性治療劑。在放射性診斷之具體實施例中，使用習知方法如：r -閃爍照相法，檢測放射性標記物之位置。在非放射活性診斷具體實施例中，使用磁共振顯影法測定本發明標記順磁性金屬之診斷劑之累積位置。爲了本發明之目的，放射治療術之定義爲產生減輕疼痛至疫癒範圍之治療故果。本發明所提供之顯影劑可用於爲腫瘤顯影，特定言之用於顯影初級及轉移之贅生瘤位置，其中該等贅生細胞會表 -40 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（2〖0'X 297公釐） A7 4 49 482 ___________B7 五、發明説明（38 ) ' 現νιρ受體，且特定言之，指一般方法不容易檢測之初級且尤指轉移性結腸直暘腫瘤細胞。彼等相關技藝之專家咸了解，可使用許多種相關技藝上已知之任何活體外方法鑑定、測試及鑑別有效之放射性藥劑 a此等方法特別包括測定本發明放射性藥劑與其同系之 VIP受體結合性之解離常數或抑制常數，並比較此等與放射性標記，例如：標記1251之VIP本身之結合親和性或活動性’及使用本發明之放射性藥劑與放射性標記之νιρ競爭之實驗，或使用未標記之VIP與本發明之放射性藥劑競爭之反貧驗。操作本發明時’依下列方法製備有效之放射性診斷劑及故射性治療劑。包含受體結合性血管活性腸肤及血管活性腸肤片段’其類似物與衍生物之本發明試劑係採用本發明方法合成，其中係在化學合成期間，將螯合部份加至肽中。本發明試劑因此再依本文進一步揭示之方式，與鍊錯合，最好呈ReO錯合物。然後依下列實例4所述，使用放射性碘化VIP，於本文所述之活體外競爭性結合分析法中評估VIP受體結合性。下列實例更詳細説明製造及標記此等化合物之方法。此等f例說明上述方法之某些方面及有利之結果，且以説明方式表示且不受限制。實例1 BAT螯合物之合成法 A. N-B〇C-N'-(5-羧戊基）·Ν，Ν、雙（2-甲基-2-三苯甲硫丙 -41 - 本紙張尺度適用中國囷家標準{ CNS ) Λ4规格（210X297公釐） t請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 449482 : 五、發明説明（39 ) 基〇乙二胺之舍成法 a. 2-甲基-2-(三苯甲硫基）丙醛取三苯甲基硫酵（362.94克，1.31莫耳，100莫耳％)溶於在冰浴中冷卻及氬氣下之無水THF(四氬呋喃；2升）中。以 20分鐘時間，分批添加氫化鈉（60%油中；54.39克，1.35 莫耳，104莫耳％)。然後以20分鐘時間慢慢添加2-溴-2♦甲基丙越r (2〇6.〇6克，I·36莫耳，1〇4莫耳％;參見史帝文斯 (Stevens)與奇里斯（Gillis), 1957，J. Amer. Chem. Soc.巧: 3448-51)。使反應混合物回升至室溫，攪拌12小時。加水 (1升）中止反應，以乙謎（3X1升）萃取。合併酸萃液，以飽和NaCl溶液（500毫升）洗滌’以Na2S04脱水及過濾。減| 排除溶劑，產生濃稠燈色油。此粗油溶於甲笨（2〇〇毫升）中，以熱己烷稀釋至2升。混合物經熔結玻璃漏斗過濾，於 -5°C下冷卻12小時。過濾排除所形成之白色晶體，產生 266.36克（收率59%)標題化合物。測定所得化合物之熔點爲83-85 C °核磁共振鐘定實驗產生下列分子特徵： *H NMR(300MHZ, CDC13)： d 1.24 (s, 6H, 2CH3), 7.2-7.35 (m, 9H), 7.59-7.62 (m, 6H), 8.69 (s? H, -COH) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 i^n· ft ^ϋ— m —A m 1 nn « I ^^^1 ^^^1 ^^^1 ^^^1 ^ J> -. -. ,v# (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) i3C NMR (75 MHZ, CDC13): d: 22.86, 55.66, 67.48, 126.85, 127.75, 129.72, 144.79, 197.31。 b. N，N·-雙（2-甲基-2-三苯甲硫丙基）乙二脬添加6二胺（1.3毫升’0.0194莫耳，1〇〇莫耳％)至溶於氬氣下之甲醇（40毫升）及無水THF(40毫升）之2-甲基-2-(三笨甲硫基）丙越"（13.86克’ 0.0401莫耳，206莫耳％)中，滴加 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 4 49 48 2 A7 ____B7 五、發明説明（4〇 ) (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 乙酸詞至pH 6 :溶液於20Ό下攪拌20分鐘。添加氰基氫硼化鈉（1_22克，0.0194莫耳，100莫耳％)。反應於室溫下攪拌3小時。再添加氰硼化鈉（1.08克），於20aC下攙拌反應17 小時。添加最後一份氰基氩硼化鈉（1.02克），反應於氬氣下回流加熱6小時。加〇·5 M HCK100毫升）中止反應，以6 酸乙酯（2 X 100毫升）萃取。合併有機萃液，依序以2 Μ NaOH(60毫升）、飽和NaCl溶液（60毫升）洗滌，脱水 (Na2S04)及過濾。減壓排除溶劑，產生16.67克粗產物，自甲笨/己烷中結晶，產生10.20克（收率73%)標題化合物之白色晶體。測定所得化合物之熔點爲83-86sC。FABMS分析法產生m/z爲721 (MH+)。核磁共振鑑別實驗產生下列分子特徵： lll NMR(300 MHZ, CDC13): d 1.12 (s, 12H, 4 CH3), 1.64 (s, 4H; N-CH2-C(Me)2-S), 2.52 (s, 4H, N-CHrCHrN), 5.31 (S, 2H, 2-NH), 7.12-7.30 (m, 18H, Ar), 7.62-7.65 (m, 12H, Ar) o c. N-f5-乙酯戊基）-N，N、雙（2-甲基-2-三苯甲硫丙基）乙二胺經濟部中央標準局員工消費合作杜印製添加K2C03(1.92克，13·9毫莫耳，100莫耳％)至含N，N，-雙（2-甲基-2-三笨甲硫丙基）乙二胺（10.03克，13.9毫莫耳）之CH3CN(60毫升）中，然後添加5-溴戊酸乙酯（3_30毫升， 20.8毫莫耳，1 50莫耳％)。反應於氬氣下回流一夜。然後濃縮溶液成糊狀，並分佈在0.25 M K〇H( 100毫升）與乙酸 6酯（100毫升）之間。以乙酸乙酯（1χ 50毫升）萃取水層， -43- 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) Λ4規格（210Χ297公釐> ~ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4 4 9 48 2 A7 B7 五、發明説明（41 ) 合併之乙酸乙酯層以50毫升水及NaC丨溶液（2 X 50毫升）洗滌’以Na2S〇4脱水及滚縮成橙色油。經急驟層析法純化 (300克急驟矽石，1〇〇%CHC13 至 5%MeOH/CHCl3)，產生純標題化合物（7.75克，收率66%)。FABMS分析法產生之 (MH+ )爲849(相較於化合物C55H64N2〇2S2)之分子量計算値爲 849.24)。土 N-B〇C-N’-(5-羧戊基）-N,N··雙（2-甲基-2-三笨甲硫丙基）乙二胺添加1ΜΚΟΗ(25毫升，25.0毫莫耳，274莫耳。/。）至含N-(5-乙酯戍基）-N，N，-雙（2-甲基-2-三苯f硫丙基）乙二胺（7.75 克’ 9.13毫莫耳）之二氧陸園（200毫升）中，然後加水（250 毫升）°攪拌滴加二氧陸園，直到得到均勻溶液爲止。反應緩慢回流加熱一夜。利用旋轉蒸發法排除大部份二氧陸園’並以1 Μ ΚΗ2Ρ04及飽和NaHC03調至pH約7至8。以乙酸乙酯（3 X 75毫升）萃取溶液，合併之有機層以NaCi溶液 (50毫升）洗滌，以Na2S04脱水，濃縮成泡沫物/固體（6.35 克；收率85。/〇)。在上述製得之粗產物中添加（BOC)20(3.35克，15.4毫莫耳，200莫耳》/0)、CH3CN(50毫升）及二氯甲烷（50毫升），然後添加三乙胺（1.〇毫升，7.2毫莫耳，93莫耳％)。反應於室溫及氬氣下攪拌一夜。反應溶液濃縮，並分佈在水（100毫升）與乙酸乙酯（50毫升）之間。水層以乙酸乙酯（〗X 5〇毫升）萃取，合併之乙酸乙酯層以5%檸檬酸及NaCl溶液（各50毫升）洗滴後’脱水（Na.2S〇4) ’並淡縮成檢色油。經急骤層 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210x297公董1 n nn HI* m 一·· • - T妒 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁} 經濟部中央標準局員工消费合作杜印製 449482_Βτ__ 五、發明説明（42) 析法純化（200克急驟矽石，100%CDC13至5〇/〇甲醇/氣仿），產生純標題化合物（2.58克，收率36%) " FABMS分析產生之（MH+)爲921(相較於C58H68N2〇4S2化合物之計算値爲 921.31)。 B. N-Boc-N’-(5-羧戊基}-Ν，Ν·-雙[2-(4-甲氧芊硫基）-2- 甲基丙基j乙二胺之合成法 a. Ν,Ν1-雙-「2-(4-甲氧芊硫基）-2-甲基丙基卜乙二胺取含Ν，Ν·-雙-(2-氫硫基·2·甲基丙基）乙二胺（11.23克， 47.5毫莫耳；參見狄奇歐（Dizio)等人’ 199〗，Bioconjugate Chem 足：353及柯賓（Corbin)等人，1976, J. Org. Chem. 41: 489)之甲醇（500毫升）溶液於冰/水浴中冷卻後，以氨氣飽和45分鐘。添加4-甲氧芊基氣（17.0毫升，125毫莫耳，264 莫耳％) a使反應於氬氣下攪拌一夜回升至室溫。溶液濃縮成糊狀物後，分佈在乙謎（1 50毫升）與0.5 Μ KOH(200毫升）之間。以乙醚（2 X 50毫升）萃取水層。合併之有機層以 NaCl溶液洗務，濃縮成澄清無色油《此油溶於乙謎（2〇〇毫升）中’以含4.0 M HC丨之二氧陸園酸化，直到未再出現沉殿爲止。過濾收集白色沉澱，以乙链洗務。白色固體於pH 〜2下，自熱水中再結晶。過濾收集產物，產生29.94克單 HC丨鹽及二-HC丨鹽之混合物。使HC1鹽分佈在1 Μ KOH(〗0〇毫升）及乙酸乙酯（100毫升）之間。水相以乙酸乙酯（2 X 30 毫升）萃取，合併之有機層以NaCl溶液洗滌，以Na2S04脱水，濃縮產生純產物之游離鹼，爲淺黃色油（丨8.53克，收率82%)。核磁共振鑑別督輪產生下列分子特徵。 -45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） --：-：--.4---.裝------訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁〕 449482 ， Λ7 _；_B7 五 '發明説明（43) •H NMR(300 MHz, CDCL3): d 7.25 (d, 4H, J=9), 6.83 (d, 4H, J=9), 3.78 (s, 6H), 3.67 (s, 4H), 2.63 (s, 4H), 2.56 (s, 4H), 1.34 (s, 12H)。 b. N-(5-乙酯戊基）-N，N’-雙〖2-(4-H爷硫基）_2_甲秦1 基1乙二胺依序添加K2C03(1.21克，8,75毫莫耳，ιοί莫耳％)及5-溴戊酸乙酯（2·80毫升，17_7毫莫耳，204莫耳％)至含Ν，Ν·-雙* [2-(4-甲氧苄硫基）-2-甲基丙基]乙二胺（4.Π克，8.66毫莫耳）之CH3CN(50毫升 >中。反應於回流下攪拌—夜，眞空濃縮成糊狀物。殘質分配在乙酸乙酯（100毫升）及0.5 Μ ΚΟΗ(100毫升）之間。水層以乙酸乙酯（1 X 50毫升）萃取，合併之有機層以NaCl溶液（50毫升）洗滌，以Na2S04脱水，濃縮成黃色油（〜6克）。以正相製備性HPLC純化（以25分鐘由100%CHC13至5%甲醇/氣仿），產生純標題化合物（1.759 克，收率340/。）。FABMS分析法之（MH+)爲605(相較於 C33H52N204S2之計算値爲604.90)。核磁共振鑑定實驗產生下列分子特徵： lH NMR(300 mHzf CDC13): d 7.25 (d, 4H, J=8.5), 6.83 (d, 4H, J-8.5), 4.13 (q, 2H, J=7); 3.793 (s, 3H), 3.789 (s, 3H), n-ln _-* 1^1 ^11- —^1· m 士^^^1 HI ^^1 TJ ' f · 0¾^'t (請先閱讀背面之注意事項再瑱寫本頁) 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 3.74 (s, 2H), 3,67 (s? 2H), 2.6 (m, l〇H), 2.31 (t, 2H, J = 7), 1.6 (m, 2H), 1.5 (m, 2H>, 1.34 (s 12H), i.28 (t, 3H, J=7)。 c. N-(B〇C-N，-(5-幾戊基）-N，N，-雙甲氧节硫基）_2- 甲基丙基]乙二胺添加水（30毫升）及1 mKOH(2.5毫井，2_5毫莫耳，260莫 -46- 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4 49 482 A7 ________B7 五、發明説明（44 ) 耳％)至含N-(5-乙酯戊基）-N，N，-雙-[2-(4-甲氧苄硫基）-2-甲基丙基]乙二胺（586毫克，0.969毫莫耳）之thF(40毫升）中。均句溶液加熱至緩緩回流一夜。溶液冷卻至室溫，於旋轉蒸發法下排除THF。殘質以H2〇稀釋至50毫升，以1 Μ HC1調至pH〜2至3。以乙酸乙酯（3 X 毫升）萃取溶液。合併有機層，以NaCl溶液（50毫升）洗滌，以Na2S04脱水及濃 ‘輪，產生粗酸（422毫克，收率75%)。在得自上述反應之粗產物中添加CH3CN(40毫升）與 (BOC)2〇(240毫克，1.1〇毫莫耳，15〇莫耳％)後，添加三乙胺（0.200毫升，1.43毫莫耳，196莫耳。/〇)。均勻溶液於室溫及氬氣下攪拌一夜，溶液濃縮成糊狀物，分佈在乙酸乙酯 (25毫升）與1 Μ KH2P04(25毫升）之間。有機層以5%檸檬酸 (2X 25毫升）及NaCl溶液（25毫升）洗滌，以Na2S04脱水及濃縮成黃色油。經急驟層析法純化（50毫升急驟矽膠， 100%氣仿至15°/。甲醇/氣仿），產生純標題化合物（344毫克 ’收率70%)。FABMS分析法產生之（MH+)爲677(相較於 (：'36^561^20682之計算値爲676.97”核磁共振鑑定實驗產生下列分子特徵： lE NMR(300 MHz, CDC13)： d 7.20 (d? 4H, J=7)? 6.79 (d, 4H; .1-7), 3.75 (S, 3H), 3.74 (S} 3H), 3.68 (Μ, 4H), 3.35 (M, 4H), 2.65 (Μ, 2H), 2.53 (Μ, 4H), 2.31 (Μ, 2H), 1.59 (U, 2H)S 1.43 (S, 11H), 1.30 (S, 6H), 1.26 (S, 6H) c BAT-BM(N-[2-(N'，N'-雙（2-馬來醯亞胺乙基）胺乙基 ]-Ν6，Ν9-雙（2·甲墓-2-三苯甲硫丙基）-6,9-重氮壬烷醯 -47- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· --¾ 本紙張尺度適财_家縣（CNS ) M規格（210χ 297公楚）經濟部中央標隼局員工消費合作社印聚 “9482 s at _ _1 B7五、發明説明（45 ) — 胺）之合成法 BAT-BM之製法如下。添加BAT酸（N9-(三級丁氧幾基）_ N6，N9-雙（2-甲基-2-三苯甲硫丙基）-6,9-重氮壬酸）（1〇.〇3克，1〇.89毫莫耳）及75毫升無水二氟甲烷（(：112(：〗2)至附裝磁鐵攙拌棒及氬氣球之250毫升圓底燒瓶中。在此溶液中添加二異丙基碳化二亞胺（3.40毫升，21.7毫莫耳，199莫耳 %)，然後添加N-羥基琥珀醯亞胺（3.12克，27.1毫莫耳， 249莫耳。/。）。觀察此溶液在1小時内轉呈混濁，續於室溫下攪拌培養共4小時。添加含參-(2-胺乙基）胺（30毫升，200 毫莫耳，1840莫耳。/。)之30毫升二氣甲烷溶液，續挽拌一夜。反應混合物減壓濃縮，殘質分佈在乙酸乙酯（15〇毫升）及 0.5 Μ碳酸鉀（K2C.〇3，150毫升）之間。分離有機層，以鹽水洗滌及濃縮，產生粗產物N-(2-(N，，N，-雙（2-胺乙基）胺乙基）]-N9-(三級丁氧羰基）_>^,^_雙（2_甲基_2·三苯甲硫丙基） -6,9-重氮壬醯胺之泡沫物/油。此粗產物加至含有300毫升THF且附裝磁鐵攪拌棒之1〇〇〇毫升圓底燒瓶中，添加30毫升飽和碳酸氫鈉（NaHC03)、 100毫升水及N-甲氧羰基馬來醯亞胺（6.13克，39.5毫莫耳 ’ 363莫耳％)。此不均相混合物於室溫下攪拌一夜，利用旋轉蒸發法排除混合物中之THF，水性殘質以乙酸乙酯（2 X 75毫升）萃取2次。合併此等萃取之有機層，以鹽水洗滌 ’以硫酸鈉脱水，經中孔玻璃過濾，濃縮至約12克粗產物 °經液相層析法純化（250克二氧化矽/以氣仿2%甲醇之氣仿溶液梯度溶離），產生5.3克粗產物（N-[2-(N，,N，-雙（2 -48- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝* I11 本纸張尺度適财_家料（CNS ) Α4ί1格（21{}><297公势） 449482 A7 B7 五、發明説明（46) 〜' 馬來醣亞胺乙基）胺乙基）]-N9-(三級丁氧羰基）-N6，N9-雙（2· 甲基-2-三苯甲硫丙基）-6,9-重氮壬醯胺(相當於收率4〇%)及約5克粗產物’可再純化成純產物D純產物之化學分析法證實其與BAT-BM相同，分析數據如下： lR NMR(200 mHz, CDC13): d 0.91 (12H,s), 1.38 (9H,s), 1.2-1.6 (4H,m), 2.06 (2H，s)，2.18 (2H’U=7), 2.31 (4H，m), 2.55(2H,t,J=5), 2.61 (4H,t,J=6), 2.99 (2H,s); 3.0-3.3 (4H,m), 3,46 (4II，t,J=6)，6.49 (-NH，t,J=4)，6.64 (4H，s), 7.1-7.3 (18H，m)，7.6 (12H，tJ=17)。 D. [BAT]-共耗（eN) Lys(aN-Fmoc)[N-e-(N9 ·三級丁氧幾基）-N6,N9-雙[2-甲基-2-(三苯甲硫基）丙基]-6,9-重氣妥醯基）-N-a*Fmoc-離胺酸之合成法於室溫下，在附裝攪拌棒及氬氣球之100毫升單頸圓底燒瓶中添加含N9-(三級丁氧羰基）-N6，N9-雙[2-甲基-2-(三笨肀硫基）丙基-6,9-重氮壬酸（BAT酸；3.29克，3.57毫莫耳） A 50毫升CH2C12溶液。在其中添加二異丙基碳化二亞胺 (DIC ; 580微升，3.70毫莫耳，104莫耳。/〇)，隨後立即添加 N-羥基琥珀醯亞胺（HOSu ; 432毫克，3.75毫莫耳，105莫耳。'b)。反應於室溫下攪拌一夜，此期間出現白色沉澱。過濾混合物，濾液濃縮成固體泡沫物。於100毫升阗底燒瓶中，取該粗泡沫物溶於75毫井2:1二甲氧乙烷與水之混合物中。在此均勻溶液中添加N_a-Fmoc-離胺酸鹽酸鹽（1.52 克，3.75毫莫耳，1〇5莫耳％>，然後添加1<：2003(517毫克， 3.74毫莫耳，105莫耳％)，黃色溶液於室溫下攪掉一夜。 -49- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製經濟部中央樣準局員工消費合作杜印製 A7 ____B7 五、發明説明（47 ) 溶液倒至含100毫升乙酸乙酯與1 〇〇毫升水之250毫升錐形燒瓶中，分離有機層，水層以5〇毫升乙酸乙酯萃取。合併之有機層以鹽水（100毫/卜）洗滌一次，以Na2S〇4脱水，濃縮成黃色固體。此粗產物經低壓液相層析法純化（150克 Si〇2，以曱醇之CHC13溶液溶離）。依此方式製得3.12克標題化合物（收率69%)。純產物之化學分析證實其特性如下： 4 NMR(300MHz, CDC13): d 0.88 (12H, s,寬），1.05-1.45 (19H，m), 18-2.1 (4H,m); 1.8-2.47 (4H,m), 2.75-3.2 (6H,m), 3.9-4.3 (4H，m)，7.2 (22H,m)，7.6 (16H，s, bound)。 FABMS MH+預钴値爲1270.6且實測値爲1272。 E. BAM(N’-(三級丁氧羰基）-N'N4·雙[2-甲基-2-(三苯甲硫基）丙基]-1,4-10-三氮雜癸烷之合成法在附裝攪拌棒、回流冷凝器及氬氣球之250毫升單頸圓底燒瓶中添加含N^N4-雙[2-甲基-2-(三苯甲硫基）丙基]乙二胺（BAT-I: 10_0克；14.01毫莫耳）之50毫升0叫狀30 毫升二氧陸圜，在其中依序添加N-(5-溴戊基）酞醯亞胺 (8,04 克，27.1毫莫耳，194 莫耳％)及K2C03(2.95 克，21.3 毫莫耳’ 152莫耳。/。）。混合物於氬氣下回流加熱2天。反應混合物濃縮，殘質分佈在150毫升水及150毫井乙酸乙酯之間。分離有機層，水層（pH約10)再以50毫升乙酸乙酯萃取。合併之有機層以鹽水（75毫升）洗滌一次，以\&2(：03脱水，濃縮成油。以低壓液相層析法純化（300克Si02，CHC13-、2%甲醇之(：11(：13溶液），產生9.20克9-酞醯亞胺基->11-以- -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（21〇Χ297公嫠） H— ^^1 - In - - — -ί 1 -- - I ---- - - - -(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部.^央標準局員工消費合作社印裂 ίΊ ^9482 Α7 ^ Β7 五、發明説明（48) 雙[2_甲基-2-(三笨甲硫基）丙基】-1，4-重氮士烷之黃色泡沫物（收率70%)。此中間物純產物之化學分析法證實其特性如下： !H NMR(300 MHz, CDC13)： d l.〇l (6H,s), l.〇3 (6H,s); 115-1.4 (2H, t), 1.98 (2H, s), 2.10 (2H, s), 2.28 (2H, m), 2.45 (3H, m), 3.68 (2H, t), 7.15-7.35 (18H, m), 7.62 (12H, t), 7.72(2H，m)，7.85(2H，m” FABMSMH+預估値爲 935.4且實測値爲936。在附裝攪拌棒之500毫升單頸圓底燒瓶中添加含9-S太醯亞胺基雙[2-甲基-2-(三苯甲硫基）丙基]-1，4·重氮壬烷 (8.83克，9.43毫莫耳>之75毫升〇113€1^及20毫升(^2(：12。在其中依序添加K2C03 (1.30克，9.41毫莫耳，1〇〇莫耳％) 及二碳酸二-三級丁酯（2.15克，9_85毫莫耳，104莫耳％)，反應於室溫下攪拌一夜。反應混合物濃縮，分佈在各100 毫升水與乙酸乙酯之間。分離有機層，水層以5〇毫升乙酸乙酯萃取。合併之有機層以鹽水（75毫井）洗滌一次，以 NasSO]脱水及濃縮，產生9.69克粗9-酞醯亞胺基_：^1-(三級丁氧羰基）-N】，N4-雙[2·甲基-2-(三苯甲硫基）丙基卜】，4-重氮妥烷之黃色泡沫物（粗收率99%)。此粗產物未再純化即使用在附裝攪拌棒與回流冷凝器之250毫升單頸圓底燒瓶中 ’添加含9-献醯亞胺基-Ν1·^三級丁氧羰基）·ν〗，ν4-雙[2-甲基-2-(三苯甲硫基）丙基卜1，4_重氮壬烷（5,5〇克，5.319.43毫莫耳）之25毫升THF。在其中添加ι〇〇毫升乙醇及5毫升水。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Λ4規格（ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. ，-* -51 - 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 449482 a? — ^_B7 ___ 五、發明説明（49 ) 添加水，使起始物自溶液中沉澱析出s添加肼水合物（1.2 毫升，24.7毫莫耳，466莫耳％)，反應回流加熱2天。反應混合物濃縮，分佈在备100毫升水及〇.25MK2C〇3之間。分離有機層，以鹽水（75毫升）洗滌一次，以Na2S〇4脱水，濃縮成固體泡沫物。粗產物經低壓液相層析法純化（100克 Si〇2)，CHC丨3->5%甲醇之CHC13溶液，管柱先經200毫升 2%三乙胺之cHCl3溶前處理），產生3·27克純N1 -(三級丁氧羰基）->^，1^4-雙[2-甲基-2-(三苯甲硫基）丙基]-1，4，10-三氮雜妥烷之黃色泡沫物（收率68%”純化產物之化學分析法證實其特性如下： ln NMR(300MHz, CDC13)： d 0.9 (12H, s), 1.2 (6H, s), 1.36 (9H,s), 2.05 (4H, m), 2.24 (2H, t), 2.31 (2H, t), 2.62 (3H, t), 3.0 (2H,s,寬)，3.1 (2H，s,寬)，7.2 (18H，m), 7.6 (12H，t)。FABMS MH+之預估値爲9 〇 5 5，且實測値爲9 〇 6.5。 F· [BAT]·共軛（s) Cys(aN-Fmoc)(N(Fmoc)-S-(N9-三級丁氧羰基）-N6，N9-雙[2-甲基-2-(三苯甲硫基）丙基]-6,9-重氮士烷基）半胱胺酸）之合成法 a- (N9*三鈒丁氧羰基）-N6，N9-雙[2-甲基-2-(三苯甲硫基）丙基丨-6,9-重氮壬-1-醇（BAT-戊醇）之合成法於氣氣下’以5分鐘時間，在含BAT酸（10.4克，10.89毫莫耳）之2S0毫升無水THF溶液之500毫井圓底燒瓶中缓缓添加12.1毫升1M BH3-THF(12.1毫莫耳）。添加時會起泡。此反應產物於室溫下攪拌培養一夜。以過量甲醇（5〇毫升）中止反應，再攪拌培養2小時。蒸發濃縮溶液，殘質分佈在 -52- 本紙張尺度賴中_家縣（ I n Lt n IJ-II ----II 丁 _I —I—A*_ * ————— ^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 “9 48 2 a A 7 -- B7 五、發明説明（50 ) — 200毫升乙酸乙酯，100毫升…檸懞酸及I⑻毫升 ΚΑΡΟ4之間。分離有機層’依序以各1〇〇毫升水、飽和 NaHC〇3及幾水洗務。祕後之有機層以無水Na2S〇4脱水，篆發濃縮成白色泡珠物，產生8 82克粗產物（收率89%) -純化產物义化學分析法證實其特性如下： JH NMR(300MHz; CDC13): d 0.91 (12H5s)? 1.2-1.3 (4H,m), 1.38 (9H,s), 1.4-1.6(4H,m), 2.08 (lH,s), 2.2-2.4 (4H,m), 2.95-3.05 (2H,br), 3.05-3.25 (2H,br), 3.58 (ΖΗ,ΐ,Ι-ό), 7.12-7.28 (18H,m)，7.61 (12H,t，J=7)。 b. 〇-甲磺醯基_(N9-三級丁氧羰基）_n6，N9-雙[2-甲基-2-(三苯甲硫基）丙基]-6,9-重氣壬烷-1-醇（BAT-甲磺酸鹽）之合成法於氬氣下’在含BAT-戊醇（8.8〇克，9·7〇毫莫耳）之1〇0毫升無水THF溶液之500毫井圓底燒瓶中，依序攪拌添加！ 6 毫升三乙胺（11.5毫莫耳）及0.83毫升甲磺醃氣（10.7毫莫耳）。此等添加過程之數分鐘内，溶液轉呈混濁》續於室溫下攪拌一夜。溶液蒸發濃縮，分佈在100毫升乙酸乙酯與100 毫升1Μ KHjPOj之間。分離乙酸乙酯層，以100毫升鹽水洗滌，以無水Na2S04脱水，蒸發，產生9.61克粗產物（收車100%)之淺黃色泡沫物s c. S-(N9-三級丁氧羰基）-N6，N9-雙[2-甲基-2-(三苯甲硫基）丙基]〇重氮妥烷-1-基）半胱胺酸（H· Cvs(BAT)-OH)之合成法在20毫升閃爍測定瓶中混合半耽胺酸（1.3克，10.7毫莫 -53 - 本紙張尺度通财關緖準（CNS ) Λ视格（21GX297公釐） ' —Γ ϋ, ' 裝—-I—. 訂-------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 49 482 at _________B7 五、發明説明（51 ) 耳）'4毫升5_4^1甲醇納（21.6毫莫耳）及5毫升無水甲醇。添加此均勻溶液至含BAT-甲磺酸鹽（9.57克，9.71毫莫耳）之 80毫升無水二甲基甲醯胺（DMF)溶液中，於室溫及氬氣下嫌拌一夜。以旋轉蒸發法減壓排除溶劑，殘質分佈在1 00 毫外乙酸乙酯與100毫升1M ΚΗ2Ρ04之間。分離乙酸乙酯層’依序以各1〇〇毫升炮和NaHC03及鹽水洗滌後，以無水 Na2S〇4脱水及蒸發濃縮，產生白色泡沫物。此產物未再鑑定，立即用於下列合成反應。 d. N-芴曱氧羰基-S-(N9-三級丁氧羰基）-N6,N9·雙[2-甲基-2-(三苯甲硫基）丙基]-6,9-重氮壬烷-卜基）半胱胺酸（Fmoc-Cys(BAT)-OH)之合成法假設依上述製得之粗H-Cys(BAT)-OH含有9.71毫莫耳產物。取全量此粗產物溶於1升錐形瓶中之2〇〇毫升THF及 150毫井水中。在此均勻溶液中依序添加L34克K2C03 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (9_72毫莫耳>及3.28克N-芴甲氧羰氧基琥珀醯亞胺（9J3毫莫耳此反應混合物於室溫下攪拌一夜。利用旋轉蒸發法排除反應混合物中大部份THF，殘質分佈在100毫升乙酸乙酯與100毫升1MKH2P04之間。分離乙酸6酯層，以 50毫升鹽永洗滌，以無水Na2S04脱水及濃縮，產生黃色泡沫物。此粗產物經液相層析法，使用300克矽膠及0-3% f 醇之氣仿溶液線性梯度純化。層析法產生10.1克純Fmoc-Cys(B AT)-OH(來自B AT-甲磺酸鹽之收率爲84%)。純化產物之化學分析法證實其特性如下： ]H NMR(300MHz, CDC13): d 0.85 (12H,s), 1.23 (4H,br), -54- 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐〉 A7 B7 449482 五、發明説明（52 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1-35 (9H,s), 1.5 (2H,m), 2.0-2.15 (2H,m), 2.15-2.35 2.51 (2H,t,J=6), 2.85-3.05 (4H,m), 3.15 (2H,br), 4.1-4.2 (lH,m), 4.2-4.4 (3H,m), 7.05-7.4 (22H,m)? 7.5-7.65 (14H，m), 7.71 (2H，d,J=7) 6 實例2 固相肽合成法依0.25毫莫耳规模，使用應用生物系統公司（Applied Biosystems) 431A型肽合成機並使用9-芴甲氧幾基（Fmoc)保護胺基末端，輿二環己基碳化二亞胺/羥基苯並三唑或 2(1H-苯並三唑-1-基）·〗，1，3,3-四甲基糖醛鑌六氟磷酸鹽/羥基苯並三唑（HBTU/HOBT)偶合，並使用對羥甲基 henoxymethyl-聚苯乙烯（ΗΜΡ)樹脂或Sasrin δ或氣三苯甲基樹脂（供製備羧基末端酸）或Rink醯胺樹脂（供製備羧基末端醯胺），進行固相肽合成法（SPPS)。若適當時，依實例1所述，製備Fmoc-Cys(BAT)及Na-Fmoc-Ne-(BAT)Lys。經濟部中央標準局員工消費合作杜印褽苦逋當時，在SPPS期間，使用適當之2-南代酸作爲最後一個偶合殘基，或以2-鹵代酸/二異丙基碳化二亞胺/N-輕基琥珀醯亞胺/'NMP或2-鹵代酸酐/二異丙基乙胺/NMP處理輿樹脂結合之N-末端游離胺基酸肽，引進2-氣乙醯基、2-溴6醯基及2-溴-3-苯基丙醯基》若適當時’取經HPLC純化之2-卣代酿基化之肤於轉酸鹽或碳酸氫鹽緩衝液或稀氫氧化按(pH 8.0)中，可視需要含 0.5-1.0 mM EDTA、或乙腈或THF中，形成〇卜1 _〇毫克/毫 -55 - "A ^ 尺張紙 I本率 I標一家 i祕 I* 公經濟郎中央標準局員工消費合作社印繁 4 4 9 4 8 2 at __B7___五、發明説明（53 ) 升之溶液，攪拌1-48小時，可視需要以乙酸酸化而環化，冷凍乾燥及HPLC純化。若適當時，由含硫醇肽與含氯乙醯基之硫醇受保護之Tc-99m錯合部份，於pH 10及室溫下反應0.5至4小時，隨後以 6酸酸化，蒸發溶液，產生相應之肽-硫化物加合物。依例行方式脱除保護及純化，產生螯合物-肽共軛物。若適當時，由含單一硫醇之肽（5至50毫克/毫升於已利用 N-甲基嗎啉或N·乙基嗎啉緩衝至pH 7之DMF中，或50 mM 磷酸納緩衝液，pH 7至8，可視需要含0.5 mM EDTA或 DMF或THF或乙腈）與0,5莫耳當量預先溶於乙腈中之 BMME(雙馬來醯亞胺基甲基醚）於室溫下反應約1至18小時，製備BSME加合物。溶液濃縮，以HPLC純化產物。若逋當時，由含單一硫醇之肽（肽濃度爲10至100毫克/毫升於已利用N·甲基嗎啉或N-乙基嗎啉缓衝至pH 7之DMF中，或5至50毫克/毫升肽於可視需要含有0.5 mM EDTA或 DMF或THF或乙腈之50 酸鈉，pH 7-8中）與0.33莫耳當量TMEA(參（2-馬來醯亞胺乙基）胺）（預先溶於乙腈或 DMF中），使用或不使用1莫耳當量三乙醇胺，於室溫下反應約1至18小時，製備TSE A加合物。含加合物之反應混合物濃縮，加合物再使用HPLC純化。若適當時，由（ΒΑΜΗΝ^Ν4-雙（2-氬硫基-2-甲基丙基）-i，4,10-三氮雜癸烷）與肽共軛，其係先以含二異丙基碳化二亞胺/N-經基琥珀醯亞胺或HBTU/HOBt之DMF、NMP或二氣f烷混合物活化肽叛酸鹽，然後於二異丙基乙胺之存 -56- (讀先閱讀背面之注項再填寫本頁) .裝.

、1T .1. 本紙張尺度適用中國國家橾隼（CNS ) Λ4规格（2〗0 X 2?7公釐）經濟部中夬標準局員工消費合作杜印11 ^ 49 48 2 a? —____B7_____ 五、發明説明（54 ) 在下偶合。偶合後，依上述脱除共軛物之保護。若適當時，（BAT) (N6，N9-雙（2-氫硫基-2-甲基丙基）-6,9-重氮壬酸）在肽合成期間，以受保護之胺基酸衍生物形式 ’如：（Na(Fmoc)-Ne(N-Boc)-S，S，-三苯甲基-BAT)離胺酸（依共同擁有且同在申請中之美國專利案系列No. 08/__ (已併爲本文之參考文獻）之實例2所述，由Na(Fmoc)-離胺酸與 Ne(N-Boc)-S,S.-雙-三苯甲基-BAT製備），或（N(Fmoc)-S，S、雙-三苯甲基·ΒΑΤ)半胱胺酸（依上述實例IF製備）加至狀中’自合成樹腊上裂解完成之肽後，再脱除保護。若適當時，由含單一硫醇之肽（肽濃度爲2至50毫克/毫升於利用N-甲基嗎嗛或N-乙基嗎啉緩衝至pH 7之DMF t，或於可視需要含0.5 mM EDTA或DMF或THF或乙腈之50 mM 磷酸鈉（pH 7-8)中）0‘5莫耳當量ΒΑΤ-ΒΜ (Ν-{2-(Ν，，Ν·-雙（2-馬來醯亞胺6基）胺乙基）}-Ν9-(三級丁氧羰基）-Ν6，Ν9-雙 (2-甲基-2-三苯甲硫丙基）·6,9-重氮壬醯胺）(預先溶於乙腈或THF中）於室溫下反應約1_18小時，製備baT-BS(N-{2-(Ν·:Ν·_雙（2-琥iE白醯亞胺乙基）胺乙基）}_Νό,Ν9·雙（2_甲基_2. 氫硫基丙基）-6,9-重氮壬醯胺）加合物。溶液蒸發至乾，以 10毫升TFA及0_2毫升三乙矽烷處理卜]、時，脱除（BAT-BS)- 肽共軛物之保護。溶液濃縮，加合產物經醚沉澱，以 IIP LC純化。若適當時，肚前體由側鏈受保護之N-末端游離胺與C-末端游離酸使用二苯基.轉醯疊氮化物反應而環化（胺基-與羧基末端之間）。 -57 - 本紙浪纽剌巾關家料（CNS ) Λ4規格（ ---!丄-----装------訂-----:%I..--Ί1 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ^9 482 1 A7 __B7___五、發明説明（55 ) 使用含丨％ TFA之二氣甲坑溶液裂解與Sasrin樹腊結合之肽，產生受保護之肽。若適當時，受保護之肽前體由侧鏈受保護之胺基末端游離胺及羧基末端游離酸使用二苯基磷醯晏氮化物反應，使胺基-與羧基-末端之間環化。照例裂解與HMP或Rink醯胺樹脂結合之產物並使用含三氟乙酸（TFA)、或TFA與二氣甲烷，可視需要含水、硫苯甲醚、乙二硫醇、或三乙矽烷或三異丙矽烷，（比例爲 100:5:5:2.5:2)之溶液，於室溫下反應0.5-3小時，脱除受保護之環化肽之保護。若適當時，產物於三苯酚甲醇/TFA中再次S-三苯甲基化，並使用（Boc)2 Ο將N-Boc基團再次加至肚中。以製備性高壓液相層析法（HPLC)，使用Waters Delta Pak C18管柱及使用含0.1%三氟乙酸（TFA)之水與乙腈之梯度溶液溶離。蒸發溶出之溶離份中之乙腈後，冷凍乾燥°以快速原子撞擊質譜（FABMS)或電子噴灑質譜（ESMS)證實各產物之特性e 下表丨出示本文所提供合成之受體結合性血管活性腸肽、衍生物及類似物，及由F A B M S銀別此等合成法之產物 (請先閱讀背Ι&之注意事項再填寫本頁) -裝' 訂 " 58 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0><297公麓） 4 49 482 A7 B7五、發明説明（56 ) 經濟部中央標準局舅工消費合作社印製 8ε 3Ρ1 ί 导 3D00.8sCJ3IS3AMXAVWiwnrmu2aldAvasH 震 31 si ^00(E2).8*H0u3ISNTASXAVWC0WTalANaxdAvasH sfn3P1 <315J300 8„Hu)uisNTA*iAvwax>rmLANaJUIAyasH (33?s8*s>uNTISNTA5WAVW0x>rmAzaLdlAvasH δε ^ρίιυτανβυι'ΠΚΝΤΑ^ΧΛνΜσ^πΉΙΑΝαυΛνανίΗ i ^tnuKDOOisNTAXHAVWiwMTULANalilAvasH 2νοε lauo^w,ow§wi.^§<sa^is2PE><QS tslslsars_

iM lid §ld §Id -59- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210Χ2<Π公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝- 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 449482 , A7 ____B7__五、發明説明（w) 實例3 ---' I - _ 以Tc-99m進行放和ϋ記之一般方法取0.1毫克依實例2製備之肽溶於〇.1毫升或0.2毫升水或 0.9%生理食鹽水中。由葡聚糖瓶（E.I. DuPont杜邦公司（Ε.Ι DuPont, de Nemours, Inc·, Wilmington，DE))與〇·25毫升丁c-99m過锊酸鈉（含至高200 mCi)重新组合，於室溫下靜置15 分鐘，製成Tc-99m gluceptate。然後取25微升Tc-99m gluceptate加至狀中，於室溫或100°C下反應15或55分鐘，然後經0.2微米濾紙過濾。由逆相HPLC使用下列條件測定標記Tc-99m之肽純度： Waters Delta Pak C-18，5微米，在 3.9毫米 X 1 50毫米分析級管柱上承載各經放射性標記之肽，以流速等於1毫升/分鐘（Delta-Pak)之溶劑溶離肽。使用20至50%溶劑B/溶劑A之悌度溶液（溶劑A爲含0.1%CF3COOH之水，且溶劑B爲含 0_1% CF3COOH之 90/10 CH3CN/H20)進行梯度溶離20 分鐘後，以100% B/A溶離3分鐘。採用與積分記錄器連線之放射性檢測器檢測放射活性成份。在此等條件下，Tc-99mgluceptate與Tc-99m過得酸納在1至4分鐘之間溶出，而標記Tc-99m之肽則在較久之後溶出°使用連線之光度計，於220nm檢測肽D 由本發明各肽試劑與約1莫耳當量四丁基銨氧四溴銖酸鹽（+ 5)(依葛登（Cotton)等人所述製備（1996, Inorg. Chem. L 9-16))共同溶於二甲基甲醯胺或乙腈/水中，攪拌0.5-5天，製成非放射活性铼錯合物，依上述分離標記Tc-99m之肽之 -60- (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 装· --訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐） 4 4 9 48 2 A7 B7 五、發明説明（58 逆相HPLC法，分離銖錯化物，以FABMS或ESMS鑑別。依檢測肽之方法，使用連線之光度計，於220nm下檢測非放射活性肽。使用例如：R e -18 6或R e -18 8之放射活性鍊錯合物係由適當過鍊酸鹽依標記Tc-99m之相同方式製備，或添加還原劑至肽與過銖酸鹽之溶液中製備，或可視需要使用配位體轉移劑如：檸檬酸鹽，並於室溫至l〇〇°C之溫度間培養反應5 至60分鐘製備。肽、標記Tc-99m之肽及ReO-錯合肽之HPLC純化結果示於表II。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 訂 Λ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 61 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） Λ d9 482五、發明説明（59 ) t-odl οοτι 6εί 日 66ύ1.^錐 11碘 5Ϊ SI δ #φφ-ο*Η (鋇令)S:—抄ri-υΉΗ οοπ ΙΤΪ 9ΊΙ 經濟部中央標率局員工消費合作社印製着，οοεκΛΛ} 鸽谖 DCKXiKnA}

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*1T Λ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐）經濟部中央標_局員工消費合作社印製 4 49 482 A7 A7 r______B7 五、發明説明（60) 實例4 生物分析法在競爭結合分析法中，使用標記1251之VIP分析本發明之肽或其ReO-錯合物具體實施例之生物活性。

此等分析法係於VIP結合性之標準分析法中，使用自天竺鼠肺部分離之膜進行；於周邊自液單細胞與血小板上；及於許多種人類腫瘤細胞系上進行P 操作此等方法時’使用埃形成法（i〇d〇gen meth〇d)(述於珊納（Schanen)等人（1991，Lancet 色：395-396)爲 VIP 進行放射性碘化作用。簡言之，取含5〇微克VIP之10微升〇.5M碍酸鹽緩衝液（pH 7.5)、適量放射性同位素及6微克碘源 (iodogen)，於室溫下溫和攪拌培養約3〇分鐘。利用HPLC 層析法，自未被？丨進之放射性碘中純化放射性碘化之VIP ，溶於補充〇. 10/〇人類血清白蛋白及〇 1% Tween-80清潔劑之磷酸鹽緩衝之生理食鹽水（PBS)中。在使用已分離出之天竺鼠肺膜之分析法中，肺部係來自雄性天竺鼠，且基本上依卡斯捷爾（Carstairs)與巴恩斯 (Barnes)所述（1986, J. Pharmacol. Exp· Ther. 239: 249-255 ，已併爲本文之參考文獻）分離膜。取0.2毫克膜標本與 0.01 nM標記1251之VIP，於各種不同濃度之本發明肽或其 ReO錯合物之存在或不存在下培養。比較在未標記之Vlp 化合物之存在或不存在下之結合程度，決定各化合物抑制 50%標記12之VIP之結合性時之濃度(稱爲1C50)。各試驗化合物使用此等方法得到之結果示於表III。此等 •63- 本紙張尺度適用t國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ~~~' '~~ (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. -訂 A7 經濟部中央標傘局員工消費合作杜印f d 49 4B2 B7 五、發明説明（61 ) 結果表示本發明之肽及肽ReO錯合物爲VIP對表現VIP受體之肺膜之結合性之強力抑制劑。 -64- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 449482 A7 B7 五、發明説明（62 ) S3 (i)2

- - 98 -9 Γ9 09 S '9 - 卜 •C 0t --ι.ς II _ I I - nn ti 1^— Λ 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 $ (o°6COJWr^_ 遂请 ZTISNTANXAVW0x>nHlANauAvasHilA 雄镡 Οοίϋύ-&Λ) 建磨 3§·8£ϋ> 鸪馋-&-雄？βόοο'λι 建镛 tLVHXJUI-囊镡 XJOis) 8¾})建瘠-<0-S 檐-ΝΟΟΟΧΚΛΟ)缕谊ϋί&Λ) <ΠΛ s£ sold 9l£ -£ sold S2d 00£ §ld -65- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格ί 210X 297公釐） (請先85讀背面之注意事項再填寫本頁) Ί---‘裝------訂 449482 A7 _____________ B7 五、發明説明（63 ) 採用正常人類周邊血小板及單核細胞進行類似實驗。此等實驗中，根據維格里尼（Virgolini)等人之方法單離血小板（1990，Brit. J. Cancer 12: 849-861〉。利用菲克 (Fico丨1)密度梯度離心法（r=l.〇77)，自全血血塊黃層中分離出周邊單核細胞（PMNCs)。分析前，以50 mM Tris-HCl緩衝液，1>117.5洗滌細胞，然後再懸浮於補充5|111^\^(：12、 1 iiiM CaCl 2、及〇. 1 M NaCl之相同緩衝液中。每次分析法使用約5 X 107個細胞^ 此等使用血小板及PMNCs之分析結果示於表IV，證實本發明肽之ReO錯合物爲對此等周邊血球上之血管活性腸受體結合性之強力拮抗劑。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) '裝.

表 IV Μ IUnM):血小板 IC^(nM): PMNCs 血管活性腸肽 4.0 5.5 Ρ887 6 6.0 Ρ915 4.5 7.5 Ρ916 3.0 6.5 Ρ917 0.8 2.7 其中血管活性腠肽爲：HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製採用上述結合性競爭分析法分析下列腫瘤細胞系： KU812細胞（人類慢性骨髄性白血病細胞系）；COLO320細胞（人類結腸腺癌瘤細胞系）；HT29細胞（人類結腸直腸腺癌瘤細胞系）；PANC1細胞（人類胰癌瘤細胞系）；HMC1細臉（人類肥胖細胞）。各細跑系基本上係如上述分析人類周 -66- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210 X 297公釐） 449482 A7 __B7__ 五、發明説明（64 ) 邊血球之方法分析。細胞生長於補充10%胎牛血清 '麩醯胺及抗生素之RPMI培養基或杜貝克氏改良培養基 (Dulbecco’s Modified Media>(HMCl 細胞）中，採用標準細胞培養技術培養(參見英國牛津，IRL出版社，佛雷斯尼編輯之”動物細胞培養：實際操作法"，1992年（Animal Cell Culture: A Pratical Approach, Freshney, ed, IRL Press: Oxford, UKJ992)) c 此等分析法之結果示於表V，證實本發明肽之Re〇錯合物爲血管活性腸肽與此等人類腫瘤細胞之結合性之強力抑制劑。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 一---.餐------ir----- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -67- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS >八4規格（2丨〇><297公釐） 4 49 48 2 A7 B7 五、發明説.明（65 ) L L 2 ?00 LS3 stst寸一 01 < 5 TuNvd ττ 2 s 99 ·. fsl9W ) 831 s,l 938 s 3 s 0.9 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝· 訂 M.o sd.z a.N t« 經濟部中央標率局員工消費合作杜印製 s' £I6d 目本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 4 4 9 482 / 3 482 ' A7 ________B7 五、發明説明（δ6 ) 此等結果證實本發明所提供之金管活性腸肽與其㈣錯合物可於標準活體外分析法中，與許多種正常及人類應瘤細胞型態上之血管活性暘受體專一性結合。此等結果顯示，本發明之血管活性腸肽具有閃爍照相顯影劑之用途，可用於爲人體内腫瘤位置顯影。採用此等分析法來選擇本發明所提供之有效放射性治療劑，其中活體外血管活性腸受體表現細胞及膜係用來檢測及定量血管活性腸受體與本發明Re-錯合試劑之結合量，其中該試劑含有血管活性腸肽，係在肽合成期間，與加至試劑中之螯合部份共價連接。然後可依本文所述之競爭性結合分析法，使用經放射性碘化之血管活性腸肽分析Re-錯合試劑。咸了解，上述説明係強調本發明某些專一性具體實施例，且其所有修飾法或同等替代法均涵括在本發明示於申請專範圍中之精神及範圍内。 (請先間讀背面之注意事項再填寫本頁) 、-=" 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -69- 本紙張尺㈣财誠家鱗（CNS ) ( 21QX297/>ft>

Claims

4 9 4 8 2 第851〇5〇13號專利申請案 Ββ Ρ申請專利範圍修正本（90年5月)S 、申請專利範圍 1 ·—種用於製備放射性藥劑之試劑，其包括共價連接至鍀或銖螯合基團之化學合成之受體結合性血管活性腸跃（VIP) ’其中該螯合基困在肽合成期間加入至肽的特定位置’及其中鍀或銖標記之放射性藥劑具有v I P 受體結合親和力’此對該受體之親和力不低於經放射性碘化之天然VI P親和力之約十分之一。 2 根據申請專利範圍第1項之試劑，其中該肽具有選自包括下列之胺基酸序列： SDAVFTDNYTRLRK-QMAVKKYLNSILN.醯胺； -NYTRLRKQMAVKKYLNSILN.醯胺，·及 -K Q M A V K K： Y L N S I L N .醯胺；及其中該螯合基團加至試劑中至上述序列之胺基酸侧鍵或該肚之獲基端 3 ·根據申請專利範圍第1或2項任一項之試劑，其中該螯合基團具有選自包括下列之式： I. C(pgp)S-(aa)-(pgp)s 經濟部中央標率局貝工消費合作社印裝修正 | 本年月R 補充 90. 5. 3G Α8 Β8 ml n^i f a^v— I i fl^— n^— n I. I^h. (請先閲讀背面之注意事項存填寫本肓) 其中（pgp)sS Η或硫醇保護基團，且（aa)為一級ci-或冷-胺基酸； II. 一螯合基團，其包括具有下式之單硫醇： A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X 其中 A為Η、HOOC ' H2NOC、（胺基酸或肽）_ ' 0:W3\45412.D0C - 1 · 本紙張尺度適用中困國家橾準（CNS M4規格（210X297公釐） 449482 A8 B8 C8 D8 經濟部中央揉準局月工消費合作社印装六、申請專利範圍 NHOC、（胺基酸或肽）-00C或R4 ; B為 Η、SH、-NHR3 ' -N(R3)-(胺基酸或肽），或R4 ; X為 Η、SH ' -NHR3、-N(R3)-(胺基酸或肽），或R4 : Z為Η或R4 ; R1 ' R2、R3與R4分別為Η或低碳數直鍵或分支鏈或.環狀烷基； η為 0、1 或2 ; * - (肽）為2至約1 0個胺基酸之肽；且：其中Β為-NHR3或-N(R3)-(胺基酸或肽），X為SH且η 為1或2 ; 其中X為-NHR3或-N(R3)-(胺基酸或肽），Β為SH且η 為1或2 ; 其中Β為Η或R4，Α為HOOC ' H2NOC、（胺基酸或肽）-NHOC、（胺基酸或肽）-00C，X為SH，且η為0 或1 ; 其中Α為Η或R4時，則其中Β為SH * X為-NHR3或-N(R3)-(胺基酸或肽）且其中X為SH，Β為-NHR3或-N ( R 3)-(胺基酸或肽）且η為1或2 ; 其中X為Η或R4，Α為HOOC、H2NOC、（胺基酸或肽）-NHOC、（胺基酸或肽）-〇〇C且B為SH ; 其中Z為甲基，X為甲基，A為HOOC、H2NOC、（胺- O:\43\4J4I2.DOC - 2 I —^ϋ n ^ Μ <請先閲讀背面之注意Ϋ項再填寫本頁) 本紙張尺度逍用中國國家揉準（CNS ) Α4規格（2丨0Χ297公釐） 449482 A8 BS C8 D8 六、申請專利範圍基酸或肽）-NHOC、（胺基酸或肽）-O0C，B為SH且η 為0 ; 且其中硫醇基團呈還原形式且（胺基酸）為不含硫醇基之任何一致α -或胺基酸； III. (CR2)fl ΜΗ (CRz)m S-(pgp)s N-A-CO-peptide (CR：)P S-(pgp)S D\ 其中各R分別為H'CH3或C2H5; 各（P g P ) s可分別為硫醇保護基團或η ; m、η與p分別為2或3 ; A=直鏈或環狀低碳數烷基、芳基、雜環基其组合或其經取代之衍生物； IV. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央搮準局貝工消費合作社印装 (CRA NH (ΐ:Κ·2)η 3Η \T-A-CH(V)NHR' (iR：)p SH 〆 O:\43\434J2.DOC 3- 本紙張尺度適用中國囷家標準（CNS ) A4現格（210X297公釐） 4 9 482 8 88 8 ABCD 六、申請專利範圍其中各R分別為H'CH3或C2H5 ; m、η與p分別為2或3 ; A =直鏈或環狀低碳數烷基、芳基、雜環基、其組合或經取代之衍生物； V = H或·C0-肽； R' = H或肽；且其中當V=H時，R1為肽，且當R' = H時，V = -CO-肽；及具有下式之單胺、二醯胺、單硫醇基： R R

------------装-- (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) ,1Τ 經濟部中央標率局員工消費合作社印製其中： η、m與p分別為0或1，各R'分別為Η、低碳數烷基、羥烷基（C2-C4)或烷氧烷基（C2-C4); 各R分別為Η或R ”，其中R "為不含硫醇基之經取代或未經取代之低碳數烷基或苯基； R或R·之一為L，其中當R·為L時，-NR·為胺；且 OM3\4im.DOC - 4 - 本紙張尺度適用中圃國家揉準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） /149 4-B2 as CS _________£8 六、申請專利範團 L為連接放射性標記物結合部份與肽之二價連接基團；及具有下式之單胺、二醯胺、單硫醇基：

其中： η、m與p分別為〇或1，各R1分別為Η、低碳數烷基、羥烷基（c2-C4)或烷氧烷基（C2-C4); 各R分別為Η或R ”，其中R "為不含硫醇基之經取 .代或未經取代之低碳數烷基或苯基； R或R'之一為L ’其中當R1為L時，-NR1為胺；且經濟部中央揉準局負工消费合作社印装 I I .......... I I 1 I I f i I 1^1 -- ! - 」j-aJ (請先w讀背面之注意事項再填寫本頁} L為連接放射性標記物結合部份與肽之二價連接基團。 4 .根據申請專利範圍第3項之試劑，其中該螯合基團為選自包括下列之含單硫醇基團： -(胺基酸）匕（胺基酸）2-{A-CZ(B){ ¢:(111 R2)}n-X ； O:\43\4M11.DOC - 5 - 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4说格（210X297公釐） 449402 ABCD 經濟部中央標準局貝工消費合作社印策六、申請專利範圍 -A-CZtBhiC^WR2)}!!·^}、胺基酸）！-(胺基酸）2 ; -(一級-或万，r -二胺基酸）-(胺基酸广-八-C Z ( B ) - { C (R 1 R2 ) } η - X ； -A-CZtBhiC^WHn-X}^ 胺基酸）’-(一級 α， /3-或石，7^-二胺基酸）； (胺基酸^-(胺基酸）2 -半胱胺酸-; (胺基酸广-(胺基酸）2 -異半胱胺酸-; (胺基酸^-(胺基酸）2 -高半胱胺酸-; (胺基酸V-C胺基酸）2 -青黴胺-; (胺基酸广-(胺基酸）2-2 -氫硫基乙胺-; (胺基酸）】-(胺基酸）2-2 -氫硫基丙胺-; (胺基酸）^(胺基酸）2-2 -氫硫基-2-甲基丙胺-; (胺基酸广-(胺基酸）2-3 -氫硫基丙胺-; -半胱胺酸-(胺基酸）-(α，石-或厶，r -二胺基酸）； -異半胱胺酸-(胺基酸）-(α，/5 -或沒，r-二胺基酸）； -高半胱胺酸-(胺基酸）-(α，θ -或石，r -二胺基酸）； -青黴胺-(胺基酸或；5,r-二胺基酸）； 2·氫硫基乙酸-(胺基酸）-0,/5 -或-二胺基酸）； 2 -或3 -氮破基丙酸·-(胺基)-((2,/5 -或γ - —胺基酸）； O:\43\4M 12.D0C - 6 _ ---------^------.1τ------^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家梯率（CNS ) Α4規格（210Χ；297公釐） Α8 Β8 C8 D8 449482 六、申請專利範圍 2”_氫领基·2_甲基丙酸-(胺基酸）-(a，jS -或/9，γ -二胺基酸）； Gly-Gly-Cys-Ala-Gly-Cys--(ε -Lys)-Gly-Cys--(<5 - Orn)-Gly-Cys--(7 - Dab)-Gly-Cys- -(^-DappGly-Cys-;及 -Cys(BAT)； ' 其中（胺基酸）為不含硫醇之一級a -或yS -胺基酸。根據申請專利範園第3項之試劑，其中該螯合基囷為選自包括下列之單胺、二醯胺、單硫醇基： I 1^1 I I - ·1 I -I I -I - I - I i -I ' i I —^n (請先»讀背面之注意事項再填寫本頁) R4 Rs-^° 〇 .NH L-Z. R3 Re 經濟部_央標率局貞工消费合作社印装其中： R1與R2分別為H、低碳數烷基、羥烷基（C2-C4)或烷氧烷基（C2-C4); R 3、R 4、R 5與R6分別為Η、不含硫醇基之經取代或未經取代之低碳數烷基或苯基； R7與R8分別為Η、低碳數烷基、低碳數羥烷基或低' O:\43VtMl2XlOC 本紙张尺度逍用中®國家揉準（CNS ) A4规格（210X297公釐） i9 48 2 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍碳數烷氧烷基； L為二價連接部价；且 Z為肤，

(請先聞读背面之注意事項再填寫本頁) 装· 經濟部中央揉率局貞工消费合作社印装其中： R1與R2分別為Η、低碳數烷基、羥烷基（C2-C4) 或烷氧烷基（C2-C4); R3、R4、R 5與R6分別為Η、不含硫醇基之經取代或未經取代之低碳數烷基或苯基；JLR3、R4、R5與 R6中之一為Z-L-(CR2)n-，其中η為1至6之整數’且各R分別為Η、低碳數烷基或經取代之低碳數烷基； R7與R8分別為Η、低碳數烷基、低碳數羥烷基或低碳數烷氧烷基： L為二價連接部份； Ζ為肽；且 X為- NH2、-NR1!^2、或-NR】-Y，其中Υ為胺基酸、胺基酸醯胺、或2至約20個胺基酸之肽；〇如\43412.DOC - 8 - 本紙張尺度速用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X29?公釐） ir 4 49432 Α8 Β8 C8 D8 六、申請專利範圍 O^NH z-u

HS^-f ,- R1 〇〇其中： R1與R2分別為H、低碳數烷基、羥烷基（C2-C4) 或烷氧烷基（C2-C4); R3與R4分別為Η、不含硫醇基之經取代或未經取代之低碳數烷基或苯基；其中η為1至6之整數； L為二價連接部份；且 Ζ為肽； 2-L.

(請先閲讀背面之注意事項再4寫本頁) 装' '1Τ 經濟部中央揉準局負工消費合作社印装其中： L為連接基團；且 Ζ為肤。 6.根據申請專利範圍第1項之試劑成之群：其係選自下式所組 O:\43V43Un.DOC 9 本纸張尺度逋用中國固家揉準（CNS ) Α4规格（210Χ297公釐） 4 49 48 2 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍 HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNhK)GC,醯胺； HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNGGC.醯胺； AGCHSDAVtTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN.醯胺； HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNC(BAT).醯胺； HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNCiCHeo^-DapiKCK.醯胺）‘醯胺； HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNC(CH:CO‘GGCK：.醯胺J .醯胺； HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNC(CH2CO，(S-Om)GCK.S& 胺）.醯胺；及 ^ΌΑνΠΌΝΥΤΙΙϋΙΚ(5ΜΑνΚΚΥυ<ί5ΠϋΝ(：(αΗϊ<：0.(Κ^Ε·3ΐηί£ΐε)·醯胺）·醯胺。 7 .—種閃爍照相顯影劑，其包括經鍀-9 9 m放射性標記之根據申請專利範圍第1至6項任一項之試劑。 8. 一種在哺乳動物體内某-位置顯影之方法，其包括投與診斷有效量之根據申請專利範圍第7項之顯影劑’並於哺乳動物體内檢測定位於該位置之鍀-9 9 m。 9 . 一種放射性治療劑，其包含經選自銖-1 8 6與銖-1 8 8 之細胞毒性放射性同位素、進行放射性標記之根據申請專利範圍第1至6項任一項之試劑。 10. —種用於製備放射性醫藥製劑之套組，其中該套組包括含有預定量根據申請專利範園第1至6項任一項之試劑及可以使得- 99m、鍊-186或鍊-188標記在試劑上之足量還原劑之密封瓶。 1^1 · I t^i —t^— I- - I - -I ^1.^1 i ^aJ (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) 經濟部中央標率局貝工消費合作社印«. O:\43\4MI2.DOC - 10 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS > Α4ϋ格（210X297公嫠) 4 9 4 8 2 第851〇5〇13號專利申請案 Ββ Ρ申請專利範圍修正本（90年5月)S 、申請專利範圍 1 ·—種用於製備放射性藥劑之試劑，其包括共價連接至鍀或銖螯合基團之化學合成之受體結合性血管活性腸跃（VIP) ’其中該螯合基困在肽合成期間加入至肽的特定位置’及其中鍀或銖標記之放射性藥劑具有v I P 受體結合親和力’此對該受體之親和力不低於經放射性碘化之天然VI P親和力之約十分之一。 2 根據申請專利範圍第1項之試劑，其中該肽具有選自包括下列之胺基酸序列： SDAVFTDNYTRLRK-QMAVKKYLNSILN.醯胺； -NYTRLRKQMAVKKYLNSILN.醯胺，·及 -K Q M A V K K： Y L N S I L N .醯胺；及其中該螯合基團加至試劑中至上述序列之胺基酸侧鍵或該肚之獲基端 3 ·根據申請專利範圍第1或2項任一項之試劑，其中該螯合基團具有選自包括下列之式： I. C(pgp)S-(aa)-(pgp)s 經濟部中央標率局貝工消費合作社印裝修正 | 本年月R 補充 90. 5. 3G Α8 Β8 ml n^i f a^v— I i fl^— n^— n I. I^h. (請先閲讀背面之注意事項存填寫本肓) 其中（pgp)sS Η或硫醇保護基團，且（aa)為一級ci-或冷-胺基酸； II. 一螯合基團，其包括具有下式之單硫醇： A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X 其中 A為Η、HOOC ' H2NOC、（胺基酸或肽）_ ' 0:W3\45412.D0C - 1 · 本紙張尺度適用中困國家橾準（CNS M4規格（210X297公釐）