Λ 6 It 6 經濟部中央標準局貝工消"合作社印製 五、發明説明（1 ) 發明背最 本發明係鼷於生產萘達黴素的方法，其特激為接種物之 製備，接種物之繁殖，以及在具有從約5.0至約6.5之pH值 的肉湯中的發釀作用。 萘達黴素為多烯類抗徽菌素中的一員。萘達攤素化合物 是具有分子量約66 6的四烯，其實驗式一般相當於 C33H47N〇13’且它含有一糖苷連結的碳水化合物部分，肢 基黴糖（《^(；〇33111丨116>。萘達黴素具有約為出6.5之等電點 。其構造K兩種结構代表性地存在：烯酵结構和酮（基） 结構。 已經知道萘達繳素的產製有數年之久。傳統產製萘達嫌 素的發酵方法已描述於美國氰胺的大不列_專利846,933 號中（1 9 6 0 )。（大不列額暨北愛爾蘭）聯合王國專利 8 46,933號中之公告事項亦合併於此作為參考。 不論萘達縑素之抗生素或抗輿菌的價值，此種產品卻很 少被用於商業上的利用。闞於此種限制的一個主要原因為 其具有非常昂貴的製造價格。 本發明的目的為克服傳统方法的無效率，並在成本-效 益方面提供一種藉著在具有已控制出值之預定培養液中， 使接種物繁殖及發酵的生產萘達黴素之方法。 發明塞沭 本發明係閫於Μ能夠產生萘達黴素之微生物來進行發酵 作用。本發明特別針對製備（网如··生成孢子）及繁殖包 (請先間讀背而之注意事項#碣寫本'r、 本紙張尺度遑用中國B家榣準(CNS)T4規格(210x297公釐) 81. 7. 20,000^(11) 經濟部屮央標準^Α工消费合作社印製 1. W ij « ' 五、發明説明（2 ) 括鏈徽菌種的接種物，此接棰物在發酵期間會產製萘達徽 素。將鏈徽菌種暴露於一糸列預定環境及/或培養液中， 此種預定環境及/或培養液可改菩在其中的萘達徽素產製 之速率。已經發琨鶊著在發酵培養液中加入足夠量的鐮性 出值控制劑，將出值维持在約5.0與6.5之間，可得到蔡 達徽素發酵之進增進速率及改善的產量。 對接棰物繁殖而言，適當的液態培養基包括： <a) 蛋白氮源的量從約2至1G克/升，一般約為8克/升 ;Μ及 (b) 可代謝碳源，有足夠的存在量Μ避免所有的碳消耗殆 盡通常為5至30克/每升培養液，一般約15克/升。 而用於發酵期間Κ誘發產製萘達徽素的適當液態培養基 包括： (¾ 約80至250克/升的可代謝碳源；以及 (b) 含有高量蛋白質及微量成份的蛋白氮源。此蛋白氮源 由非酵母蛋白氮成份及酵母蛋白氮成份代表性地姐成 。依據蛋白質之内容•想要使這兩種蛋白氮成份分別 Μ從5: 1至11: 1的比例範圃存在，一般最佳的結 果約為8 : 1 。 麵Η銳明 _1為本方法的槪要方塊圖，其被用於本發明之接棰物 的繁殖。 _2為在發酵期間内，代表性發生之三個階段的座檷式 Λ 6 Π 6 (請先閱讀背而之注意事項洱项巧木产、 -4 - 本紙張尺度逍用中Η國家樣準（CNS)甲4規格(210X297公龙) 81. 7. ^),000^ (|[) 經濟部屮央標準局CX工消伢合作杜印製 B 6 五、發明説明（3 ) 說明。 圖3為依據實例的試驗4至6，萘嫌素產製之時間對蔡 達徽素產生的座檷画。 H銳.1 依據本發明，將能夠產生萘達黴素的微生物置入並使其 與預定的培養液接觸，來產生接種物’然後在更進一步的 繁殖及產生萘達徽素之發酵作用期間*將接種物置入將供 給微生物之最大限度代謝活動的預定發酵產製培養液中° 在發酵期間内，微生物至少使一部分的預定產製培養液轉 變為萘達徽素。已經發現藉著在發酵培養液中加入足量的 鹼性出值控制0!，來維持在約5.0到約6.5之間的由值’ 可獲得增進速率之萘達徵素的產製及萘達徽素之改菩的產 量。 依據本發明可利用包括產萘達徽素之鍵撤菌種的任何微 生物。較佳的鍵撇菌種，包括預先貯鼸在位於美画， Rockville, Maryland ，之美圔典型培養物收集中心 (ATCC)，並被登記為ATCC 13326號的土黃色孢子鏈徽菌 (Streptomyces gi lvosporeus) ° 由此適當孢子的孢子懸浮液來製備接種物。當把接種物 放到本發明之發酵培養液中時•此適當的鐽徽菌種之接種 物接著被發酵而產生高產量的萘達徽素。將此接種物代表 性地暴露於一糸列的繁殖步鼸，其中每個步驟均使產製萘 達黴素之鐽徽菌细胞的量增加。在鏈徽菌细胞數量足夠了 (請先間讀背而之注意芥項孙埙巧木Γ 本紙張尺度遑用中B國家榣準（CNS)甲4規格（210x297公釐） 81. 7. 20,000^(11) 經濟部中央梂準局A工消仵合作社印製 Η 6_ 五、發明说明（4) 之後，再使_徽菌细胞暴露於一種環境及/或培養液中。 此環境及/或培養液是被設計出在鍵徽菌種發酵時，能促 進萘達黴素的產製。 孢子騄浮 開始做接種物著收集從美園典型培養物收集中心獲 得的產製萘達«素之**徽菌種的孢子°使這些抱子發芽以 產生鍵縑菌種的活播生長培養物。將活躍生長的踺攤菌種 培養物（例如；土黃&孢子**»® ’或任何其他能 達黴素的棰類）灞密地接種於無菌的（例如：經高壓消毒 的）瓊脂斜面上’並加Μ培養直到斜面大體上完全覆滿泡 子。將瓊脂斜面上的孢子刮至少量的液體中，諸如水（例 如：蒸豳水）、營養的培養液等等，>i製成液態孢子懸# 液。使所得到的孢子懸浮液繁殖，來產生用於發酵作用ί 也就是產製萘達徽素）的接種物。為得到最佳的結果’ $ 於開始接種物繁殖的孢子懸浮液，應含有約l〇s至1〇 1(> # 落形成單位（CFU) /奄升之孢子_度，而一般至少約為 108群落形成單位/ «升。 許多可用於促進鐽黴菌種（例如：土黃色孢子鍵«菌） 培養物之孢子生成的瓚脂斜面培養基*將能被用於形成® 子懸浮液。逋當的瓊脂斜面培養基，至少由下列集團中W 一員代表性地構成：酵母麥穿瓊腊、Hickey-Tumer®脂' G Y A瓊脂、P r丨d h a is瓊脂、馬妗薯右旋耱瓊脂、 Bennett、瓊脂等等。 本紙»尺度逍用中《國家«準(CNS)T4規格(210乂297公龙) ㈦7.別，()⑻张（11) Λ 6 Β6 經濟部中央梂準局CSC工消费合作杜印製 五、發明説明（5 ) 在孢子懸浮液中之高瀠度（例如：1〇β群落形成單位/ 奄升）、具有發奇能力的孢子，是本發明之Μ鍵狀況。首 先，若孢子濃度太低，將在整個接棰物繁殖作用中，對萘 達徽素發酵產製的成本-效益而言，花費非常長的時間以 獲得足夠數量的鏈黴菌细胞。其次，在懸浮液中滅少的孢 子量•會延長整個接棰物繁殖的時間*而增加污染的可能 性（例如：被不想要的有櫬物污染）。再者》懸浮液中的 低子濃度可能傾向於促進大而緊密包褒之菌絲體圚球的形 成。這類圓球對於獲得高產量之萘達徵素是不逋合的，因 為與氧之轉移、養份大量轉移至圓球中等問題有關聯。萬 一菌絲體圖球的大小成為不符合需要的，可將圓球Μ物理 性地弄破使之分開，像是使用剪力（例如：攪碎）。 良显_物的繁殖 使上述討論的液態孢子懸浮液（例如：土黃色孢子鐽嫌 菌）發育•並使佃胞持續增加至足夠數量的微生物，可為 了萘達徽素之發酵產製作用，被當作接種物來使用。逋當 的接種物细胞密度包括約為1至5克/升的乾细胞重，並 W約佔萘達徽素產製培養液體積的0.1至Ι0ϋί體積來被使用 〇 用於接種物繁殖的液態養基•決定接種物的细胞密度及 代謝狀態（例如：想要的是適當密度之健康细胞）。要使 接棰物維持想要的細胞密度及代謝狀態，需要含有複合生 長因子（例如：維生素群）、無櫬元素（例如：鉀、納、 (請先閱讀背而之注意卞項再项寫本广、 本紙張尺度遍用中Η國家樣準(CNS)T4規格(210x297公货） 81. 7. 20.()()0^ (II) X 五、發明説明（6 鈣等）Μ 足量蛋白 種將使孢 接種物的 亦必須 Μ達到想 在接種物 殆盡易傾 能等致於 雖然依 ，但要獲 成份是有 Μ水（ 接棰物繁 <a> 蛋白 /升 (b) 可代 通常 及微量元 氮•且這 子懸浮液 蛋白氮源 對液態接 要的接種 繁殖期間 向使接種 發酵期間 據本發明 得高產量 益的。 例如：低 殖的培養 氮源的總 ;Μ及 謝碳源Μ 為5至30 Λ 6 Π 6 素（例如：_、鈷、鐵、銅、鋅等）的 些Μ普通程度存在於蛋白氮源之中。此 繁殖成將產製出想要的高量萘達徽素之 ，可Κ是任何來源的。 種物培養基提供足夠量的可代謝碳源* 物之细胞密度。為了得到最佳的结果* ，此碳源不應完全被用光。碳源的消耗 物的代謝狀態進行不利的轉變，這樣可 減少萘達徽素的產量。 *可有效地使用各棰液態接種物培養基 的萘達嫌素•利用預先決定量之培養基 確物成分水、蒸皤水等等）製備缠用於 基，並包括： 量為從約2至is克/升，一般約為8克 足夠避免所有的碳消耗殆盡的量存在· 克/每升培養液，而一般約為15克/升 下 於 供 提 液 養 培 的 成 姐 殊 特 之 殖 繁 物 種 接 於 用 遘 種 阐 將
Th 先 間 背 而 之 注 意 事 項 填 % 本 經濟部中央標準^只工消费合作杜印製 本紙张尺度遑用中曲國家標準(CNS)甲4規格(2丨0><297公龙） 81. 7. 2(),ί)〇η^ (Π) ί, λ * Λ 6 Π6 五、發明説明（/ ) IS_ Bft__1 Difco ”Bacto"蛋白牌 玉米浸潰液 氛化納 葡萄糖 5克/升 3克/升 1〇克/升 15克/升 姐 成 P. Hor^e 1 蛋白胂 PSR5 氯化納 葡萄糖 噩 8克/升 克/升 15克/升 (諳先閲請背而之注意卞項办项寫本一、 裝· 經濟部中央檁準鈞貞工消费合作社印姐 提供促進鐽徽菌细胞產生 可藉傳铳技術來製備（例如 分離或同時將碳及氮源滅菌 ，必須具有約為7之出值。 養液中，並將接種物培養液 一般約28至35 。 為了得到對萘達徽素之發 之液態接種物，需要數個接 實行後所得的體積均會多於 在鍵徽菌细胞的數量上得到 物的繁殖。在繁殖期間，鶫 速率之營養的接種物培養液， :在約1 2 0至1 4 0 t：的溫度下， )。接種物培養液在滅菌之後 將孢子懸浮液導入此接種物培 加热至約25到仙t：的溫度，而 酵產製而言是想要的大量雅積 種物繁殖的步琢，且每個步嫌 前一涠步驟。例如：以一種能 指數增加的方法，來烴營接種 著在繁殖作用的毎一個步驟中 訂- 線* 本紙ft尺度遑用中國《家«準(CNS)肀4規格(210x297公*) 81. 7. 20,000^(11) riL 2 經濟部屮央櫺準局月工消伢合作社印製 _____ 五、發明説明（8) 有效地增加接種物的體積’對保持培養物在指數生長的横 式中是特別的有益。亦可藉將每個步»的期間滅至最小· 或使步驟數目減至最少來完成。例如：一但已達到接種物 之預定的细胞密度時’便將接種物轉移至較大的環境（例 如：容器）中，Μ進行更進一步的繁殖。藉著有效地控制 接種物的繁殖’僅需頁獻最低限度的時間及花费予接種物 之繁殖，因此在發酵期間成本-效益上之萘達撇素產量會 增加。 一系列接種物繁殖的步驟中•僩別步驟所容許能持續的 時間長度*依賴培養液的姐成、想要的鍵徽素细胞量、溫 度等等。各個繁殖步驟，代表性地可被經營約6到最後至 少約24小時。 接棰物繁殖的方法需要接棰物的通氣。例如，容納有接 棰物的燒瓶或容器，可置於旋轉攪拌器上以200rPm來加以 攪拌。在本發明的一種狀況下•可賴在容納接種物的容器 中放置絮輪，當強行使無菌的空氣進入容器的底部時*便 攪拌了接棰物。 現在參看圜1 ，此園是可用於產生被發酵後會產製萘達 徽素之接種物的槪要方法。圓1說明在接種物中*藉繁殖 作用而代表性地完成測定體積的增加•此種繁殖作用必須 得到液態接種物的量*要在成本 效益方面足夠產製萘達 徽素。例如，藉著在含有1225升液態接種物培養基的容器 中加入25升的接種物，可使接棰物的體積從25升增至 1 250 升。 (諸先閱請背而之：/F-意卞項再艰荇本P·、 -10 - 本紙張尺度遑用中明國家猱準(CNS) T4規格(210X297公放） HI. 7. 20,0()()ίΜ (II) 經濟部屮央標準局A工消许合作社印製 烈卜:1___ϋΐ 五、發明説明（9) 萘達籯素之產製 係在一有能力容納發酵過程的容器中經營萘達黴素之產 製。已經發現藉著加入足夠量之驗性出值控制劑於發酵培 養液中，使其維持出值在約5.0至約6.5之間，可達到促進 萘達徽素發酵的速率Μ及改菩其產量。對達到最大限度的 萘達鼸素之產量而言，也是重要的一種本發明之狀況，為 液態發酵培養基的姐成。此發酵培養液必須含有通當量的 可代謝碳及蛋白氮。此培養液若含有複合生長因子（例如 :維生素群）、無機元素（例如：鉀、納、鈣等）Μ及微 量元素（例如：硼、鈷、鐵、鋦、鋅等），亦是令人想要 的。 以水（例如：低礦物成分水成、蒸餾水等等）製備適用 於發酵作用的培養液*並包括： <a) 約80至2 5 0克/升的可代謝碳源；Μ及 (b) 至少約15克/升，一般約2Q克/升至80克/升之含有 高量蛋白質及微量成分的蛋白氮源。此蛋白氮源可包 括非酵母蛋白氮成份及酵母蛋白氮成份。依據蛋白質 之内容，這兩種成分通常分別以從約5: 1至11: 1 的比例範圍存在，而最佳的結果，一般是約8 : 1 。 可從廣泛的來源範画提供此棰蛋白氮源》例如，可由非 酵母蛋白氮源所構成的大豆蛋白質產物（例如：Μ大豆蛋 白質來源組成80 - 95% 蛋白質，可獲得想要的萘達徽素 產量）。此類蛋白氮也可由牛肉萃取物及/或蛋白質水解 (請先閲讀背而之注意事項洱艰艿本产、 -11 - 本紙張尺度遑用中國圉家標準（CNS)T4規格（210x297公龙) 81. 7. 20,0()0^ (11) Β6 經濟部屮央橾準局β工消奸合作杜印Μ 五、發明说明（10) 產物（如：蛋白脾類）所姐成。 如上文中所討論*此產製培養液亦必須含有可被鏈徽菌 棰代謝的碳源。此種碳源可藉任何便利形式來提供’諸如 葡萄糖、多釀、玉米及馬羚替澱粉等等。 然而，在本發明的一種狀況下，不需一開始即導入所有 產製萘達嫌素所需的碳源量，作為萘達徽素產製培養液之 起始成份（例如：碳源之起始量不足K進行完全的發酵作 用）。於本發明的此棰狀況下•可在萘達嫌素產製的期間 完成碳源的加入，以致能夠維持磺源的量約為5至3〇克/ 升，而通常為2〇克/升。因此，將固定量之逋用碳源於開 始及/或發酵作用開始之後*加到發酵培養液中。例如； 碳源可以約仙至《〇克/升的量存在於發酵培養液之中。從 那時之後，在發酵作用之主要的期間内，在培養器内Μ至 少相當於在發酵遇程期間，碳源被鐽徽菌種以酵素消耗速 率的速率，加人碳源（例如··為維持碳源瀠度在最低限度 含量或其之上 > 。在朝向發酵ft程之末期，或在主要發酵 期間之後便停止碳源的加入，Μ使得在發酵循環的末期， 很少的或沒有碳源留下（例如：碳源的量實際上相等於在 發酵培養液中完成發酵遇程所需的特定碳源量）。 提供鍵黴菌發酵及產製萘達鼸素之營養的萘萘達徵素產 製培養液，可賴傳統技術來製備（例如：在約120至140t 的溫度下，將碳及氮源分雕或同時加以滅菌）。此產製培 養液在滅菌後，必須具有約為7的pH值。 將接種物導入直到其在產製培養液中的瀠度達到以體積 -12 - 本紙張尺度遑用中Β困家樣準(CNS) 4規格(210x297公龙） 81. 7. 20,(K)(iifc (II) (請先閲讀背而之注意事項#塥巧本F-、 Λ 6 Η 6 2ΐ£^1__ 五、發明説明αι ) 計約佔0.1至1〇χ，一般約為2% (例如：可使接種物的量 足Μ接種大部分的發酵物）。發酵物中其餘的體樓，則由 上文中描述的發酵培養液所姐成。任何將接種物導入發酵 物中的產製培養液之技術，且其能Μ活性代謝狀態來傅遞 此接種物。 將此發酵或產製培養液帶到約25C至4QT：的溫度，而一 般約28至35 υ。此發酵過程所容許持續的時間長度，係依 據發酵培養液之姐成、溫度、在接種物中鍵徽菌细胞的數 鼉、所想要的萘達撇素量等等。代表性地纆營此發酵《程 ，約70到至少約1 6 8個小時之久。 在發酵期間中*供應氧予萘達徽素產製培養液。這樣有 益於在主要的發酵期間内•維持具有約20 %至80 %之飽和 空氣的產製培養液中的溶氧量。可藉適當的調整通氣及/ 或攪拌速率，來促進達到逋合之溶氧量的能力。例如，必 須藉強行使空氣（如：無菌之空氣）通過發酵培養液，來 將發酵或產製培養液通氣，通常Μ每體積發酵培養液對約 0.3到至少約1.0艏積空氣之速率來通遴發酵培養液。在本 發明的一種狀況下，當通氣時攪拌發酵培養液是令人想要 的。更進一步也可使通氣速率足Μ引起發酵培養液的攪拌 (請先閲請背而之注意卞項Λ-塡寫本Γ-、 經濟部中央標準工消仲合作杜印5i 間發一的 時在第素 出括。» 示包殖達 顯段增萘 別階或中 分個長湯 ,一 生肉 段第的酵 階。種發 個性菌 三 Μ»製 的相鏈產 法的及的 方間 Μ素 本之，黴 就率源達 ，速碳萘 2 製入有 圖產加随 看素中伴 參徽液亦 在達養段 現萘培階 與酵個 本紙張尺度遑用中國國家標準(CNS)規格（210x297公龙） 81. 7. 2(1，⑽丨张（II) Λ 6η 6 經濟部屮央櫺準局Μ工消伢合作杜印製 五、發明説明（12 ) 濃度增加，如同鍵徽菌種之细胞繁殖上的蝤加。在第一階 段之期間，萘達撇素濃度上的增加，一般是與時間成指數 地增加。最後，萘達徽素之濃度將與時間成固定地增加， 表示已到逹萘達嫌素產製的第二陏段（也躭是主要的階段 。第三階段的特微為萘達黴素瀟度的高原期（例如，此種 現象可歸因於鍵黴菌種的代謝作用減慢）。可分析在發酵 器中萘達徽素之濃度與時間的闞係，以確定發酵作用目前 的階段。為了產製最大限度的萘達撇素之總量，想要利用 培養液及/或環境，來誘導使能迅速達到並維持發酵作用 的第二階段。 在本發明的一種狀況下，當想要控制起泡沫時，Μ按體 憒計從約佔發酵或萘達黴素產製培養液之〇.〇1 χ至IX的量 ，將去沫劑（例如：矽去沫劑）加到發酵培養液中，亦可 Μ是令人想要的。 萘達撇素產製培養液在加入接種物後，具有約為7的出 值。如上述所討論，在相對上較短的第一階段期間内*主 要的活動為使培養物迅速繁殖。其後萘達黴素之產製變成 佔優勢的活動，而出值會降低。在發酵期間，控制或維持 出值是本發明的闞鐽狀況，因為若不控制出值，在萘達黴 素產製的期間中，出值將會至約出4.0。 萘達黴素產製的主要或第二階段所代表的時期，係開始 於出值首先降至約出6.5以下•到接近萘達徽素產製之未 期。將近發酵作用之末期時，可容許出值降至約出5.0 K 下。根據本發明，此主要階段並不包括造段出值在約出 -14 - 本紙張尺度遑用中國國家標準(CNS) Τ4規格（210x297公放） (請先閲讀背而之注意卞項洱填"本一, 4 五、發明説明（13 ) 5.0 Μ下的低出值時 包括發酵培養液之 入出值控制劑來加以 劑包括氫氧化物及驗 萘達徽素之產製及回 至少由納、鉀及鈣的 與鉀之檸檬酸鹽等的 根據本發明，一開 (也就是在培養物繁 達黴素產製作用已經 約6 . 5的範圍中之後 後能在約5 . 0至6 . 5的 。藉具有含出值控制 正常地維持出值。 可同時及/或連鑛 雜物，混合物等。例 期。 發酵肉 控制。 性蘧類 收有不 氫氧化 其中一 始可容 殖期間 在進行 ，開始 出值之 劑之水 湯的pH 用於本 ，且其 利的影 物，Μ 個所構 許發酵 )。在 中。於 並持績 速率， 瑢液的 Λ 6 Π 6 值，可藉著在肉湯中加 發明方法中的出值控制 將能控制出值又不會對 響。遴當的出值控制劑 及單一、 成。 循環之cH 這段時間 出值已降 Μ足夠維 將驗性出 自動出值 雙 和三納 值降至約出6 中，有效的蔡 至從出5 . 0到 持發酵肉湯稍 值控制劑加入 控制滴定，可 的使用各棰出值控制劑之姐合物，混 如，將檸樣酸鼸和氫氧化物一起導入 (請先閲讀背而之注意事項#場寫本頁) 經濟部+央標準灼C3:工消费合作杜印製 入多被 值之達黴 加許能 出明萘達 物明才 的發了萘 化發時 成本善許 氧本同 構，改容 氫在劑 基述並可 將’制 鹽前 ’ ’ 時而控 機如率制 同然值 無。速控 可。ΡΗ由值的的 :丨性 用CH製值 如值蠊 使的產CH 例CH與 括1素之 <的要 包16»明 的5 鹽 況91達發 要ί6酸 狀5萘本 想01様 鍵在進 ， 是 5 檸 闞約促如 Μ約的 項持可例 可持性 一維 ，。 中維酸 之來制量 湯於- 明，控產 肉易下。發劑的的 酵較況入本制值素 發，狀加 控出黴 本紙張尺度边用中因S家標準（CNS)例規ΙΜ210Χ297公货) 81. 7. 20.000^(11) 經濟部屮央標準而只工消讣合作杜印51 1 A 6___ij_6_ 五、發明説明（14) 素發酵產製作用，於產生相同產量之萘達徽素方面，所用 的時間遠少於沒有對出值加Μ控制的。此產製時間可代表 性地被減少20-60!«，通常減少約35 %。 當將本發明適當地實施時（例如：有效地搡作鏈嫌菌接 種物•選擇培養基等等）*最終的發酵肉湯通常至少將含 有約5克/升的萘達嫌素。在某些實例中，萘達徽素之產 製量可達從約7克/升到至少約12克/升的範画。 可將萘達黴素從產製培養液中分離出來。在某些案例中 ，可從發酵肉湯中萃取出萘達鼸素，並使之形成结晶。在 聯合王國專利846 , 933號中可見到魷獲得萘達黴素結晶而 言，能被接受之技術的實例。 本發明以下列實例證明，此實例企圖Μ圖解來說明|但 並不限於此類意圖之間等範園。除了其他特別指定的，係 使用可經商業上獲得之製劑等級的材料來經營下列實例。 竄_________&L 在下列試驗中，下列姐成的瓊脂斜面利用蒸餾水來製備 3克/升酵母萃取物（Difco "Bacto”酵母萃取物） 3克/升麥穿萃取物（Difco麥穿萃取物） 5克/升蛋白胂（Difco "Bacto”蛋白脾） 10克/升葡萄糖 15克/升瓊脂 在約12110 下將此瓊脂滅菌約15分鐘。 (請先閲讀背而之注意事項#填寫本頁) 本紙張尺度逍用中困國家標準（CNS)T4規格（210x297公龙) 81. 7. 20,000¾ (I!)
·正α‘丨 lT Λ t; iU) 五、發明説明（ώ) 補充私βMM 以蒸豳水製備下列组成的接種物培養液•並Μ氫氧化鉀. 將出值調至約7 . 0 。 20克/升葡萄糖 10克/升氛化納 6克/升玉米浸漬液（PPM (品牌）> 玉米浸漬液） 6克/升蛋白脾（Difco ”Bacto”蛋白胂） 在約121¾ 下將此接種物培養液滅菌約15分鐘。 由美國典型培養物收集中心獲得圼冷凍乾烽孢子懸浮液 型式的土黃色孢子鐽黴菌、美國典型培養物收集中心登記 號碼13326 ·並作為培養源來使用。將此培養物盛装在瓊 脂斜面上並置於約25 下•直到培養物生成孢子。 在瓊脂斜面上瀠密地進行孢子生成不超過1Q天，並在10 到20天之後使用。將孢子由瓊脂斜面上刮下至接種物培養 液中，使孢子懸浮液濃度達到約l〇a群落形成單位/奄升 。在500奄升折流燒瓶中，約100毫升的接種物坫養液中 加入約g毫升孢子懸浮液。將折流燒瓶内的接種物在約2S t下培養約48小時，並於旋轉攪拌器上以約200 「pm將其 播拌。於約48小時之後，在1 0 0 0奄升的折流埔艇中•於約 200奄ft接種物培養液内加入4奄升此培養物，Μ K殖接 (請先閱4背而之注*事碩祌碭寫本了) 裝· 訂 線· 經液部屮央榣準兄A工消tv·合作社印51 時由 成 小用 始 個利 起 24。 的 約拌 列 的攪 下 外以。有 另加液具 餐其養 . 培將培液 再 Β 製養 下ΓΡ產培 to 的製 2920升產 在約 8 衆 物以養徽 種上培達 接器來萊 此拌物的 將攪種例 後轉接 « 然旋的本 。在生於 物並產用： 棰，此 分 本紙张尺度边用中Η Η ¥：«^Μ(；Ν5)ΤΊ規15(210x297公放） 81. 7. 20.00〇ik (li) Λ: Λ 6 Β 6 五、發明説明（迅） 19.5克/升大豆蛋白質分離物（60肘，”？「<^31«”$970) 4.5 克 / 升酵母萃取物（Stauffer, Type ΚΑΤΊ 0.2毫升/升去沫劑（Mazu, DF 289> 在U升的發酵液中，Μ蒸餾水來製備此產製培養液，並 Κ氫氧化鉀將出值調到約7 . 6 。然後使發酵液在約1 2 1 t 下滅菌約15分鐘。將葡萄糖Μ蒸餾水作成50 %的溶液並分 開滅菌。 在接種之前，加熱產製培養液至約29 t並加入葡萄糖， 以達到約為40克/升之葡萄糖的起始濃度。對發酵物設定 約0.3體積/體積一分鐘的通氣速率（每體積培養液於每 分鑰所通空氣的體積>，K及約300 rpm的播拌速率。 將上述討論，含有土黃色孢子鐽黴菌（ATC C登記號碼 13326 )的接種物加入於發酵容器中，直到發酵容器具有 Μ體積計約佔2 %的接棰物内容物。在發酵的約4Q小時後 將葡萄糖加入接種物中，Μ維持發酵容器中約20克/升葡 萄糖的葡萄糖濃度。這件工作可藉Μ約1克/升一小時之 速率將葡萄糖供給予發酵容器來完成。可加需要增加發酵 容器的攫拌速率，Μ維持約為飽和空氣50%的溶氧量。 ΚΜΛ1-此試驗顆示高產量之發酵方法的典型實施，但 沒有本發明的出值控制。如上所述來進行，Μ約8升產製 培養液之起始體積為開始（出值約為7)，並使發酵循環 時間持讀約117個小時之久，使用葡萄糖加入總量約為 110克/升，可在約8.7升的發酵肉場中，獲得約7.3克 /升萘達黴素的產量（缌共S4克萘達嫌素）。 (請先閲讀背而之注意事項再場寫本頁) 裝- 線· 經濟部屮央標準局β工消费合作杜印製 本紙51尺度逍用中國國家標準（CNS)T4規格（2]0Χ297公龙） 81. 7. 20.0005fc (II) Λ 6 Π 6 2
五、發明説明（17) 經濟部中央標準^Jcs:工消费合作杜印5i 試驗tf2-實除進行如同試驗#1中的，但在18個小時之後 ，當出值已降至約為6.0時，加入約20 % JCOHM使出值維 持在約6.0 ，並在整個約92小時的循瓖中加人約155克/ 升葡萄糖*在約10.1升中可得到約7.4克/升的萘達嫌素 產量（缌共75克萘達黴素）。因此對試驗》Γ1作比較，本發 明的這項試驗提供了相同產量之萘達徽素*而用了較少的 產製時間。 藉著下述大體上相同的程序，但使用NaOH代替kOH ，亦 可達到類似迅速且高產量的萘達黴素之產製。 試„驗^ 一試驗》2的連績產製作用，並在整個約282個小 時的總發酵循環時間中，加入約250克/升葡萄糖，在約 10.4升的發酵肉湯中得到約為12.4克/升的萘達黴素產量 (總共129克萘達黴素）。因此延長萘達黴素之產製來提 供高產量的萘達徽素是可能的。 試驗林4 -如試驗#2來進行，但當出值降至約出6.0時， 藉自動滴定加入約20 %的氫氧化鉀，以維持出值約在6.1 到5 . 9 。在約為68個小時的發酵時間之後，於約9 . 2升 發酵肉湯中產生了 6.6克/升萘達撇素（總共克萘達徽 素）。 試驗林5 -如試驗tf2來進行，但在約24小時，此時發酵肉 湯約5.1之pH值，將7克/升的三納檸檬酸鹽加至發酵容 器中。出值維持在從約5.0到6.5出值範圍内。持讀進行發 酵約69個小時之久。在約8.7升中萘達黴素的產製約為 6.6克/升（總共57克萘達微素）。 - 19 - 本紙張尺度边用中國Η家樣準（CNS)肀4規格（210X297公放) 81. 7. 20.000ife (II) (請先閲讀背而之注意事項#堝寫本頁) 裝· 訂- 線. 經濟部中央標準局A工消费合作杜印製 五、發明説明（18) 藉著下述大體上相同的程序•但使用等奠耳悬的三鉀檸 樣酸鹽，可達到類似的迅速且高產量之萘達徽素產製。 試驗06-實際上係依據試驗U5進行，除了在發酵開始之 約24小時，加入三納檸檬酸鹽來調整出值至約5.0之後* K檸檬酸（加人物含有約5克/升的檸樣酸離子）來代替 三納檸檬酸鹽出值控制劑，然後於45個小時之後，加入棒 檬酸來使出值維持在低於5.0 。在約117個小時的發酵作 用之後，僅產生約25.6克的萘達徽素。 mi-實際上係依據試驗》Π進行，但不加任何出值控 制劑，在約S6小時的發酵作用之後，在8.3升肉湯中僅有 約4 . 3克/升的萘達賺素產虽（總共3E5克萘達徽素）。比 較試驗#4和試驗U7，說明了控制出值將可促進蔡達嫌素的 產製速率（也就是說，於防個小時的發酵過程中，試驗 #4產製了 si克萘達徽素，然而試驗U7僅產製36克的萘達徽 素）。 下表以萘達徽素產製之相對速率的角度，概述試驗1至 7的結果。檢視下表證實了本發明之出值控制法，在經發 酵過程時，可改菩所獲得的萘達黴素產量。 (請先閱1?背而之注意事項#堝寫本頁) 裝· 訂· 線_ 本紙張尺度边用中國Η家標準（CNS)T4規格（210X297公*) 81. 7. 20,000¾ (II) 五、發明説明（w) Λ 6 Β 6 產製時間 m pH 悄 抨 制 1 (小時 ) (總量/瀰度） 1 沒 有 117 6 4克/ 7 . 3克/升 2 Κ0Η 92 75克/7 . 4克/升 3 Κ0Η 282 129克/ 12 . 4克/升 4 Κ0Η 66 61克/6.6克/升 5 二 納 檸 檬 酸鹽 69 57克/6.6克/升 6 納 檸 樣 酸翹 / 檸 樣 酸 117 25.6克/ 3.2克/升 7 沒 有 66 36克/4 . 3克/升 (請先閱讀背而之注意事項#場寫本頁) 經濟部屮央標準而员工消"合作杜印製 現在參看圖3 ，這是說明在整個約115小時的發酵過程 中，萘達黴素產製（克/升在發酵肉湯中）的座標圖圖解 *此發酵過程係依據試驗4、5 、6及7來完成。圖3之 回顧，係圖解說明了本發明之出值控制法促進了萘達鼸素 產製之速率、 雖然很少的本發明具體實腌例在Ji文中被詳细描述，但 諸熟此藝者將承認本發明包含了許多姐合及變化。 21 本紙張尺度逍用中a國家標準(CMS) T4規格（210X297公龙） 81. 7. 20.000張（II)