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TW202511284A - 包含robo結構域的蛋白及其醫藥用途 - Google Patents

包含robo結構域的蛋白及其醫藥用途 Download PDF

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TW202511284A
TW202511284A TW113134934A TW113134934A TW202511284A TW 202511284 A TW202511284 A TW 202511284A TW 113134934 A TW113134934 A TW 113134934A TW 113134934 A TW113134934 A TW 113134934A TW 202511284 A TW202511284 A TW 202511284A
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TW
Taiwan
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robo
robo2
linker
robo1
domain
Prior art date
Application number
TW113134934A
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English (en)
Inventor
曹保華
張曉謙
徐金敬
高文杰
李元元
王瑞雪
Original Assignee
大陸商北京拓界生物醫藥科技有限公司
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Abstract

本揭露涉及包含ROBO結構域的蛋白及其醫藥用途。具體而言，本揭露涉及包含ROBO結構域的蛋白及其治療ROBO-SLIT2信號通路異常上調的疾病的用途。

Description

包含ROBO結構域的蛋白及其醫藥用途
本揭露均要求2023年09月14日提交的專利申請CN202311184604.1的優先權。
本揭露涉及生物醫藥領域，具體涉及包含ROBO結構域的蛋白及其醫藥組成物、製備方法、醫藥用途、預防或治療與ROBO-SLIT2信號通路相關疾病(例如，腎病)的方法。
血管內皮細胞、基底膜和足細胞共同構成腎小球的濾過屏障，足細胞足突融合和胞體脫落是腎小球性蛋白尿發生的主要機制(Kriz W,et al.1998.Kidney Int.54：687-97)。臨床常見腎小球疾病均伴有不同程度的足細胞損傷，及早干預和改善足細胞損傷是腎小球相關慢性腎病的新興治療手段(J.W.Leeuwis et al.Advanced Drug Delivery Reviews 62(2010)1325-1336)。
腎臟足細胞表達環形交叉受體2(Roundabout Receptor 2,ROBO2)，非與配體SLIT結合時，受體會呈現自抑制狀態(Barak et al.,2019,Cell 177,272-285)。ROBO2作為受體與配體SLIT2結合後，藉由下游接頭蛋白Nck與腎病蛋 白(nephrin)形成複合物，負調控腎病蛋白所介導的肌動蛋白集聚。在小鼠模型中，ROBO2缺失可以緩解腎病蛋白缺失小鼠的異常足細胞結構(Xueping Fan et al.Cell Reports 2,52-61,July 26,2012)。此外，ROBO2-SLIT2信號通路藉由下游SLIT/ROBO Rho GTP酶活化蛋白1(SRGAP1)抑制non-muscle肌凝蛋白IIA(NMIIA)的活性，進而影響足細胞在基底膜黏著斑的形成，使足細胞更易脫落。在小鼠模型中，ROBO2缺失可以緩解NMIIA重鏈缺失小鼠腎小球硬化和尿蛋白表型(Xueping Fan et al.JCI Insight.2016；1(19)：e86934)。在腎毒血清誘導的小鼠腎損模型、大鼠被動海曼膜性腎炎模型以及膜性腎病患者中，均觀察到足細胞ROBO2的表達上調(Anna Pisarek-Horowitz et al.The American Journal of Pathology,Vol.190,No.4,April 2020)。因此在足細胞相關慢性腎病中，阻斷ROBO2-SLIT2信號傳導可改善足細胞結構和功能，進而減少蛋白尿。
目前，全球範圍尚未有阻斷ROBO2-SLIT2信號傳導的藥物上市。相較於重組天然ROBO2蛋白，本揭露提供了一類經突變等改造後的重組ROBO蛋白，其作為SLIT配體陷阱，具有更強配體SLIT2中和活性和穩定性、更強的SLIT2中和活性可降低給藥體積和次數、良好的穩定性，從而可以開發為更便利的製劑形式，提高慢性腎病患者的依從性和使用便利性。本揭露的重組ROBO蛋白可用於預防或治療ROBO-SLIT2信號通路相關的疾病，如足細胞相關腎病等。
本揭露提供了包含環形交叉受體(ROBO)結構域的蛋白及其編碼多核苷酸、醫藥組成物，以及用於治療或預防疾病(例如，腎病)的方法和相關製藥用途。
包含ROBO結構域的蛋白
本揭露提供蛋白，其包含ROBO結構域，該ROBO結構域包含環形交叉受體2免疫球蛋白樣結構域1(ROBO2 Ig1)。
一些實施方案中，該ROBO2 Ig1較之野生型ROBO2 Ig1(SEQ ID NO：20)在第17、30、32、66、68位的一個或多個位置存在胺基酸突變，該位置編號是相對SEQ ID NO：1所示胺基酸序列的自然順序編號。
一些具體實施方案中，該ROBO2 Ig1較之野生型ROBO2 Ig1存在選自以下的胺基酸突變：
A)17F、17T、17V或17K，
B)30S、30Y或30H，
C)32R、32T或32Q，
D)66G、66D、66V或66R，和/或
E)68H、68K、68D或68E。
一些具體實施方案中，該ROBO2 Ig1較之野生型ROBO2 Ig1存在選自以下的胺基酸突變：
F)S17F、S17T、S17V或S17K，
G)N30S、N30Y或N30H，
H)K32R、K32T或K32Q，
I)S66G、S66D、S66V或S66R，和/或
J)S68H、S68K、S68D或S68E。
一些具體實施方案中，該ROBO2 Ig1較之野生型ROBO2 Ig1存在選自以下的胺基酸突變：
K)17F/30S/32R/66G/68H，
L)17T/30Y/32T/66D/68K，
M)17V/30Y/32R/66V/68D，或
N)17K/30H/32Q/66R/68E。
一些具體實施方案中，該ROBO2 Ig1較之野生型ROBO2 Ig1存在選自以下的胺基酸突變：
O)S17F/N30S/K32R/S66G/S68H，
P)S17T/N30Y/K32T/S66D/S68K，
Q)S17V/N30Y/K32R/S66V/S68D，或
R)S17K/N30H/K32Q/S66R/S68E。
一些實施方案中，該ROBO2 Ig1包含與SEQ ID NO：20、11-14任一或與之具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%；以下同)同一性的胺基酸序列。
另一些實施方案中，提供ROBO2 Ig1，其較之野生型ROBO2 Ig1在第62、64、70、72、73位的一個或多個位置存在胺基酸突變，該位置編號是相對SEQ ID NO：1所示胺基酸序列的自然順序編號。例如，較之野生型ROBO2 Ig1在第M62、L64、F70、L72、R73位的一個或多個位置存在胺基酸突變。
另一些實施方案中，提供ROBO2 Ig1，其較之野生型ROBO2 Ig1在第19、26、28、30、70位的一個或多個位置存在胺基酸突變，該位置編號是相對SEQ ID NO：1所示胺基酸序列的自然順序編號。例如，較之野生型ROBO2 Ig1在第V19、P26、T28、N30、F70位的一個或多個位置存在胺基酸突變。
一些實施方案中，該蛋白中的ROBO結構域還包含環形交叉受體免疫球蛋白樣結構域2(ROBO Ig2)。
一些具體實施方案中，ROBO Ig2為環形交叉受體1免疫球蛋白樣結構域2(ROBO1 Ig2)或環形交叉受體2免疫球蛋白樣結構域2(ROBO2 Ig2)。
一些具體實施方案中，該ROBO1 Ig2包含如SEQ ID NO：25所示或與之具有至少90%(例如95%)同一性的胺基酸序列，該ROBO2 Ig2包含SEQ ID NO：24或與之具有至少90%(例如95%)同一性的胺基酸序列。
一些實施方案中，該蛋白中的ROBO結構域還包含如下i)-vii)中的一項或多項：
i)ROBO前免疫球蛋白樣1(ROBO前Ig1)，
ii)ROBO免疫球蛋白樣結構域1和免疫球蛋白樣結構域2間的連接子(ROBO Ig1-2連接子)，
iii)ROBO免疫球蛋白樣結構域2和免疫球蛋白樣結構域3間的連接子(ROBO Ig2-3連接子)，
iv)ROBO免疫球蛋白樣結構域3(ROBO Ig3)，
v)ROBO免疫球蛋白樣結構域3和免疫球蛋白樣結構域4間的連接子(ROBO Ig3-4連接子)，
vi)ROBO免疫球蛋白樣結構域4(ROBO Ig4)，
vii)ROBO免疫球蛋白樣結構域4後連接子(ROBO Ig4後連接子)；
一些具體實施方案中，i)-vii)中的ROBO為ROBO1或ROBO2。
一些具體實施方案中，ROBO前Ig1包含如SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列。
一些具體實施方案中，ROBO Ig1-2連接子包含如SEQ ID NO：22或23所示的胺基酸序列。
一些具體實施方案中，ROBO Ig2-3連接子包含如SEQ ID NO：26或27所示的胺基酸序列。
一些具體實施方案中，ROBO Ig3包含如SEQ ID NO：28或29所示的胺基酸序列或與之具有至少90%(例如95%)同一性的胺基酸序列。
一些具體實施方案中，ROBO Ig3-4連接子包含如SEQ ID NO：30或31所示的胺基酸序列。
一些具體實施方案中，ROBO Ig4包含如SEQ ID NO：32或33所示的胺基酸序列或與之具有至少90%(例如95%)同一性的胺基酸序列。
一些具體實施方案中給，ROBO Ig4後連接子包含如SEQ ID NO：34或35所示的胺基酸序列。
一些實施方案中，該蛋白中的ROBO結構域包含式(II)-(IV)所示結構：
[ROBO前Ig1]a2-[ROBO2 Ig1]-[ROBO Ig1-2連接子]b2-[ROBO Ig2]c2-[ROBO Ig2-3連接子]d2-[ROBO Ig3]e2-[ROBO Ig3-4連接子]f2-[ROBO Ig4]g2-[ROBO Ig4後連接子]h2 式(II)
[ROBO前Ig1]a2-[ROBO2 Ig1]-[ROBO Ig1-2連接子]b2-[ROBO1 Ig2]c2-[ROBO Ig2-3連接子]d2-[ROBO Ig3]e2-[ROBO Ig3-4連接子]f2-[ROBO Ig4]g2-[ROBO Ig4後連接子]h2 式(III)
[ROBO前Ig1]a2-[ROBO2 Ig1]-[ROBO Ig1-2連接子]b2-[ROBO2 Ig2]c2-[ROBO Ig2-3連接子]d2-[ROBO Ig3]e2-[ROBO Ig3-4連接子]f2-[ROBO Ig4]g2-[ROBO Ig4後連接子]h2 式(VI)
其中，-為肽鍵，式(II)-(IV)中的a2、b2、c2、d2、e2、f2、g2、h2可以獨自的選自0或1。一些具體實施方案中，a2、b2、c2、d2、e2、f2、g2、h2均為0。一些具體實施方案中，a2為1、b2、c2、d2、e2、f2、g2、h2均為0。一些具體實施方案中，b2、c2為1，a2、d2、e2、f2、g2、h2均為0。一些具體實施方案中，a2、b2、c2為1，d2、e2、f2、g2、h2均為0。一些具體實施方案中，a2、b2、c2、d2、e2、f2、g2、h2均為0。一些具體實施方案中，a2、b2、c2、d2為1，e2、f2、g2、h2均為0。一些具體實施方案中，a2、b2、c2、d2、e2為1，f2、g2、h2均為0。一些具體實施方案中，a2、b2、c2、d2、e2、f2為1，g2、h2為0。一些具體實施方案中，a2、b2、c2、d2、e2、f2、g2為1，h2為0。一些具體實施方案中，b2、c2、d2為1，a2、e2、f2、g2、h2均為0。一些具體實施方案中，b2、c2、d2、e2為1，a2、f2、g2、h2均為0。一些具體實施方案中，b2、c2、d2、e2、f2為1，a2、g2、h2均為0。一些具體實施方案中，b2、c2、d2、e2、f2、g2為1，a2、h2均為0。一些具體實施方案中，b2、c2、d2、e2、f2、g2、h2為1，a2為0。一些具體實施方案中，a2、c2為1，b2、d2、e2、f2、g2、h2均為0。一些具體實施方案中，c2為1，a2、b2、d2、e2、f2、g2、h2均為0。
一些實施方案中，提供ROBO結構域，其包含SEQ ID NO：20、11-14任一或與之具有至少90%(例如95%)同一性的胺基酸序列。
一些實施方案中，提供蛋白，其包含SEQ ID NO：20、11-14任一或與之具有或與之具有至少90%(例如95%)同一性的胺基酸序列。
本揭露提供蛋白，其包含ROBO結構域，該ROBO結構域包含環形交叉受體2(ROBO2)的胞外區或其部分和環形交叉受體1(ROBO1)的胞外區或其部分。
一些實施方案中，該ROBO結構域包含ROBO2的免疫球蛋白樣結構域和ROBO1的免疫球蛋白樣結構域。
一些實施方案中，該ROBO結構域包含ROBO2的免疫球蛋白樣結構域Ig1、Ig2、Ig3、Ig4、Ig5中的任一或任意組合，和ROBO1的免疫球蛋白樣結構域Ig1、Ig2、Ig3、Ig4、Ig5中的任一或任意組合。
一些實施方案中，該ROBO結構域包含如式(I)所示的結構：
[ROBO前Ig1]a1-[ROBO2 Ig1]-[ROBO Ig1-2連接子]b1-[ROBO1 Ig2]-[ROBO Ig2-3連接子]c1-[ROBO Ig3]d1-[ROBO Ig3-4連接子]e1-[ROBO Ig4]f1-[ROBO Ig4後連接子]g1 式(I)
其中，-為肽鍵，式(I)中的a1、b1、c1、d1、e1、f1、g1可以獨自的選自0或1。一些具體實施方案中，a1、b1、c1、d1、e1、f1、g1均為0。一些具體實施方案中，b1為1，a1、c1、d1、e1、f1、g1均為0。一些具體實施方案中，a1、b1、為1，c1、d1、e1、f1、g1均為0。一些具體實施方案中，a1、b1、c1為1，d1、e1、f1、g1均為0。一些具體實施方案中，a1、b1、c1、d1為1，e1、f1、g1均為0。一些具體實施方案中，a1、b1、c1、d1、e1為1，f1、g1均為0。一些具體實施方案中，a1、b1、c1、d1、e1、f1為1，g1為0。一些具體實施方案中，b1為1，a1、c1、d1、e1、f1、g1均為0。一些具體實施方案中， b1、c1為1，a1、d1、e1、f1、g1均為0。一些具體實施方案中，b1、c1、d1為1，a1、e1、f1、g1均為0。一些具體實施方案中，b1、c1、d1、e1為1，a1、f1、g1均為0。一些具體實施方案中，b1、c1、d1、e1、f1為1，a1、g1均為0。一些具體實施方案中，b1、c1、d1、e1、f1、g1為1，a1為0。一些具體實施方案中，a1為1，b1、c1、d1、e1、f1、g1均為0。
一些實施方案中，該ROBO結構域包含如下1)-15)中任一：
1)ROBO2 Ig1
2)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig2；
3)ROBO2 Ig1和ROBO2 Ig2；
4)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig2和ROBO1 Ig3；
5)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig2和ROBO2 Ig3；
6)ROBO2 Ig1和ROBO2 Ig2和ROBO1 Ig3；
7)ROBO2 Ig1和ROBO2 Ig2和ROBO2 Ig3；
8)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig2和ROBO1 Ig3和ROBO1 Ig4；
9)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig2和ROBO2 Ig3和ROBO1 Ig4；
10)ROBO2 Ig1和ROBO2 Ig2和ROBO1 Ig3和ROBO1 Ig4；
11)ROBO2 Ig1和ROBO2 Ig2和ROBO2 Ig3和ROBO1 Ig4；
12)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig2和ROBO1 Ig3和ROBO2 Ig4；
13)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig2和ROBO2 Ig3和ROBO2 Ig4；
14)ROBO2 Ig1和ROBO2 Ig2和ROBO1 Ig3和ROBO2 Ig4；
15)ROBO2 Ig1和ROBO2 Ig2和ROBO2 Ig3和ROBO2 Ig4。
一些實施方案中，該ROBO結構域還可以包含ROBO1前Ig1序列或ROBO2前Ig1序列、ROBO1 Ig1-2連接子或ROBO2 Ig1-2連接子、ROBO1 Ig2-3連接子或ROBO2 Ig2-3連接子、ROBO1 Ig3-4連接子或ROBO2 Ig3-4連接子、ROBO1 Ig4後連接子或ROBO2 Ig4後連接子的一個或任意組合。
示例性的，該ROBO結構域包含如下16)-84)中任一：
16)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1；
17)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig2；
18)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO2 Ig2；
19)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig2和ROBO1 Ig3；
20)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig2和ROBO2 Ig3；
21)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO2 Ig2和ROBO1 Ig3；
22)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO2 Ig2和ROBO2 Ig3；
23)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig2和ROBO1 Ig3和ROBO1 Ig4；
24)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig2和ROBO2 Ig3和ROBO1 Ig4；
25)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO2 Ig2和ROBO1 Ig3和ROBO1 Ig4；
26)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO2 Ig2和ROBO2 Ig3和ROBO1 Ig4；
27)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig2和ROBO1 Ig3和ROBO2 Ig4；
28)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig2和ROBO2 Ig3和ROBO2 Ig4；
29)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO2 Ig2和ROBO1 Ig3和ROBO2 Ig4；
30)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO2 Ig2和ROBO2 Ig3和ROBO2 Ig4；
31)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)；
32)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2；
33)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2；
34)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2和ROBO1 Ig3；
35)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2和ROBO2 Ig3；
36)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2和ROBO1 Ig3；
37)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2和ROBO2 Ig3；
38)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2和ROBO1 Ig3和ROBO1 Ig4；
39)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2和ROBO2 Ig3和ROBO1 Ig4；
40)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2和ROBO1 Ig3和ROBO1 Ig4；
41)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2和ROBO2 Ig3和ROBO1 Ig4；
42)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2和ROBO1 Ig3和ROBO2 Ig4；
43)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2和ROBO2 Ig3和ROBO2 Ig4；
44)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2和ROBO1 Ig3和ROBO2 Ig4；
45)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2和ROBO2 Ig3和ROBO2 Ig4；
46)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)；
47)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2；
48)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2；
49)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2和ROBO1 Ig3；
50)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2和ROBO2 Ig3；
51)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2和ROBO1 Ig3；
52)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2和ROBO2 Ig3；
53)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2和ROBO1 Ig3和ROBO1 Ig4；
54)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2和ROBO2 Ig3和ROBO1 Ig4；
55)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2和ROBO1 Ig3和ROBO1 Ig4；
56)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2和ROBO2 Ig3和ROBO1 Ig4；
57)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2和ROBO1 Ig3和ROBO2 Ig4；
58)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2和ROBO2 Ig3和ROBO2 Ig4；
59)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2和ROBO1 Ig3和ROBO2 Ig4；
60)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2和ROBO2 Ig3和ROBO2 Ig4；
61)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2和ROBO1 Ig2-3連接子(或ROBO2 Ig2-3連接子)；
62)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2和ROBO1 Ig2-3連接子(或ROBO2 Ig2-3連接子)；
63)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2和ROBO1 Ig2-3連接子(或ROBO2 Ig2-3連接子)和ROBO1 Ig3；
64)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2和ROBO1 Ig2-3連接子(或ROBO2 Ig2-3連接子)和ROBO2 Ig3；
65)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2和ROBO1 Ig2-3連接子(或ROBO2 Ig2-3連接子)和ROBO1 Ig3；
66)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2和ROBO1 Ig2-3連接子(或ROBO2 Ig2-3連接子)和ROBO2 Ig3；
67)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2和ROBO1 Ig2-3連接子(或ROBO2 Ig2-3連接子)；
68)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2和ROBO1 Ig2-3連接子(或ROBO2 Ig2-3連接子)；
69)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2和ROBO1 Ig2-3連接子(或ROBO2 Ig2-3連接子)和ROBO1 Ig3；
70)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2和ROBO1 Ig2-3連接子(或ROBO2 Ig2-3連接子)和ROBO2 Ig3；
71)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2和ROBO1 Ig2-3連接子(或ROBO2 Ig2-3連接子)和ROBO1 Ig3；
72)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2和ROBO1 Ig2-3連接子(或ROBO2 Ig2-3連接子)和ROBO2 Ig3；
73)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2和ROBO1 Ig2-3連接子(或ROBO2 Ig2-3連接子)和ROBO1 Ig3(或ROBO2 Ig3)和ROBO1 Ig3-4連接子(或ROBO2 Ig3-4連接子)；
74)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2和ROBO1 Ig2-3連接子(或ROBO2 Ig2-3連接子)和ROBO1 Ig3(或ROBO2 Ig3)和ROBO1 Ig3-4連接子(或ROBO2 Ig3-4連接子)；
75)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2和ROBO1 Ig2-3連接子(或ROBO2 Ig2-3連接子)和ROBO2 Ig3和ROBO1 Ig3-4連接子(或ROBO2 Ig3-4連接子)；
76)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2和ROBO1 Ig2-3連接子(或ROBO2 Ig2-3連接子)和ROBO1 Ig3(或ROBO2 Ig3)和ROBO1 Ig3-4連接子(或ROBO2 Ig3-4連接子)；
77)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2和ROBO1 Ig2-3連接子(或ROBO2 Ig2-3連接子)和ROBO1 Ig3(或ROBO2 Ig3)和ROBO1 Ig3-4連接子(或ROBO2 Ig3-4連接子)和ROBO1 Ig4(或ROBO2 Ig4)；
78)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2和ROBO1 Ig2-3連接子(或ROBO2 Ig2-3連接子)和ROBO1 Ig3(或ROBO2 Ig3)和ROBO1 Ig3-4連接子(或ROBO2 Ig3-4連接子)和ROBO1 Ig4(或ROBO2 Ig4)；
79)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2和ROBO1 Ig2-3連接子(或ROBO2 Ig2-3連接子)和ROBO2 Ig3和ROBO1 Ig3-4連接子(或ROBO2 Ig3-4連接子)和ROBO1 Ig4(或ROBO2 Ig4)；
80)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2和ROBO1 Ig2-3連接子(或ROBO2 Ig2-3連接子)和ROBO1 Ig3(或ROBO2 Ig3)和ROBO1 Ig3-4連接子(或ROBO2 Ig3-4連接子)和ROBO1 Ig4(或ROBO2 Ig4)；
81)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2和ROBO1 Ig2-3連接子(或ROBO2 Ig2-3連接子)和ROBO1 Ig3(或ROBO2 Ig3)和ROBO1 Ig3-4連接子(或ROBO2 Ig3-4連接子)和ROBO1 Ig4(或ROBO2 Ig4)和ROBO1 Ig4後連接子(或ROBO2 Ig4後連接子)；
82)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2和ROBO1 Ig2-3連接子(或ROBO2 Ig2-3連接子)和ROBO1 Ig3(或ROBO2 Ig3)和ROBO1 Ig3-4連接子(或ROBO2 Ig3-4連接子)和ROBO1 Ig4(或ROBO2 Ig4)和ROBO1 Ig4後連接子(或ROBO2 Ig4後連接子)；
83)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO1 Ig2和ROBO1 Ig2-3連 接子(或ROBO2 Ig2-3連接子)和ROBO2 Ig3和ROBO1 Ig3-4連接子(或ROBO2 Ig3-4連接子)和ROBO1 Ig4(或ROBO2 Ig4)和ROBO1 Ig4後連接子(或ROBO2 Ig4後連接子)；
84)ROBO2前Ig1序列(或ROBO1前Ig1序列)和ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig1-2連接子(或ROBO2 Ig1-2連接子)和ROBO2 Ig2和ROBO1 Ig2-3連接子(或ROBO2 Ig2-3連接子)和ROBO1 Ig3(或ROBO2 Ig3)和ROBO1 Ig3-4連接子(或ROBO2 Ig3-4連接子)和ROBO1 Ig4(或ROBO2 Ig4)和ROBO1 Ig4後連接子(或ROBO2 Ig4後連接子)。
一些實施方案中，該ROBO結構域從N端到C端包含選自1)-84)所示的結構，例如“2)ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig2”即是該蛋白從N端到C端包含ROBO2 Ig1和ROBO1 Ig2。
一些具體實施方案中，該ROBO2 Ig1是野生型ROBO2 Ig1(例如SEQ ID NO：20所示)或與之具有至少90%(例如至少95%)同一性的胺基酸序列。
一些具體實施方案中，該ROBO2 Ig1是前述本揭露提供的任意存在胺基酸突變的ROBO2 Ig1(例如SEQ ID NO：11-14任一或與之具有至少90%(例如至少95%)同一性的胺基酸序列，或前述A)-R)任一的ROBO2 Ig1)。
一些具體實施方案中，該ROBO2 Ig 2為SEQ ID NO：24所示或與之具有至少90%(例如至少95%)同一性的胺基酸序列。
一些具體實施方案中，該ROBO1 Ig 2為SEQ ID NO：25所示或與之具有至少90%(例如至少95%)同一性的胺基酸序列。
一些具體實施方案中，該ROBO2 Ig 3為SEQ ID NO：28所示或與之具有至少90%(例如至少95%)同一性的胺基酸序列。
一些具體實施方案中，該ROBO1 Ig 3為SEQ ID NO：29所示或與之具有至少90%(例如至少95%)同一性的胺基酸序列。
一些具體實施方案中，該ROBO2 Ig 4為SEQ ID NO：32所示或與之具有至少90%(例如至少95%)同一性的胺基酸序列。
一些具體實施方案中，該ROBO1 Ig 4為SEQ ID NO：33所示或與之具有至少90%(例如至少95%)同一性的胺基酸序列。
一些具體實施方案中，該ROBO2前Ig1序列為SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列。
一些具體實施方案中，該ROBO1前Ig1序列為SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列。
一些具體實施方案中，該ROBO2 Ig1-2連接子為SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列。
一些具體實施方案中，該ROBO1 Ig1-2連接子為SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列。
一些具體實施方案中，該ROBO2 Ig 2-3連接子為SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列。
一些具體實施方案中，該ROBO1 Ig 2-3連接子為SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
一些具體實施方案中，該ROBO2 Ig 3-4連接子為SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列。
一些具體實施方案中，該ROBO1 Ig 3-4連接子為SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列。
一些具體實施方案中，該ROBO2 Ig4後連接子為SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列。
一些具體實施方案中，該ROBO1 Ig4後連接子為SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列。
一些具體實施方案中，提供ROBO前Ig1(ROBO1前Ig1或ROBO2前Ig1)的變體，其與SEQ ID NO：19相比存在一個或多個(例如，2、3、4、5、6個)胺基酸取代、缺失和/或添加，並仍保持ROBO前Ig1的功能。例如，提供ROBO前Ig1的變體，其與SEQ ID NO：19相比存在一個或多個(例如，2、3、4、5、6個)保守胺基酸取代，該變體仍保持ROBO前Ig1的功能。
一些具體實施方案中，提供ROBO2 Ig1-2連接子、ROBO1 Ig1-2連接子、ROBO2 Ig2-3連接子、ROBO1 Ig2-3連接子、ROBO2 Ig3-4連接子、ROBO1 Ig3-4連接子、ROBO2 Ig4後連接子、ROBO1 Ig4後連接子的變體，其與前述本揭露提供的胺基酸序列存在一個或多個(例如，2、3、4個)胺基酸取代、缺失和/或添加(例如，保守胺基酸取代)，並仍能實現連接子的功能。
本揭露提供蛋白，包含(i)前述本揭露任一的ROBO結構域和(ii)半衰期(例如體內半衰期)延長結構域。
一些實施方案中，該(ii)半衰期(例如體內半衰期)延長結構域可以位於(i)ROBO結構域的N端或C端。
一些實施方案中，該(ii)半衰期(例如體內半衰期)延長結構域包括但不限於人血清白蛋白(HSA)、HSA結合結構域(例如抗HSA抗體，又例如抗HSA單域抗體)、免疫球蛋白結構域。
一些實施方案中，該免疫球蛋白結構域為免疫球蛋白Fc區。一些具體實施方案中，該免疫球蛋白Fc區源自人IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM的Fc區。一些具體實施方案中，該Fc區可以包含突變，示例性突變包括：IgG1上的L234A、L235A、G237A任一或任意組合，；例如L234A/L235A、L234A/L235A/G237A；IgG4上的F234A、L235A、S228P任一或任意組合，例如F234A/L235A、S228P/F234A/L235A。一些具體實施方案中，該Fc區包含C220S。一些具體實施方案中，該IgG Fc區含有SEQ ID NO：37-39或與之具有至少80%、至少90%同一性的胺基酸序列。
一些實施方案中，(i)ROBO結構域和(ii)半衰期(例如體內半衰期)延長結構域可以直接連接，或藉由連接子連接。該連接子可以是長1-20個或更多個胺基酸、無二級以上結構的非功能性胺基酸序列。例如，該連接子是柔性連接子；例如G4S(SEQ ID NO：54)、GS、GAP、(G4S)2(SEQ ID NO：55)、(G4S)3(SEQ ID NO：56)、(G4S)4(SEQ ID NO：57)、(G4S)5(SEQ ID NO：58)、ASGS(SEQ ID NO：59)等；例如，連接子為(GxS)y連接子，其中，x選自1-5的整數(例如為2)，y選自1-6的整數；例如，連接子為GGSGGS(SEQ ID NO：36)、(G4S)2；一些實施方案中，連接子不存在，即，y為0。
一些實施方案中，提供蛋白，其包含SEQ ID NO：15-18、40-53任一所示或與之具有至少80%、至少90%(例如至少95%)同一性的胺基酸序列。
前述本揭露提供的包含ROBO結構域的蛋白具有選自以下的至少一項的特性：
(a)以
Figure 113134934-A0202-12-0022-77
1×10-7M，例如
Figure 113134934-A0202-12-0022-78
1×10-8M、
Figure 113134934-A0202-12-0022-79
1×10-9M、
Figure 113134934-A0202-12-0022-80
1×10-10M、
Figure 113134934-A0202-12-0022-81
1×10-11M、
Figure 113134934-A0202-12-0022-82
1×10-12M的KD值結合人SLIT2，該KD值較佳為
Figure 113134934-A0202-12-0022-83
1×10-11M。該KD值的檢測方法是本領域常規的，例如為本揭露實施例4中所提供的。
(b)當該包含ROBO結構域的蛋白中包含免疫球蛋白Fc區(例如，含有234A/L235A/237A的IgG1 Fc區)時，具有延長的體內(或血漿)半衰期。體內半衰期與未包含免疫球蛋白Fc區時提高了至少1.5倍，較佳至少2倍，例如至少5倍，例如至少10倍或大於20倍；例如，與未包含免疫球蛋白Fc區時相比，增加的體內半衰期可以大於1、2、6、12小時，或大於24、48或72小時。
(c)以
Figure 113134934-A0202-12-0022-84
500nM、400nM、300nM、200nM、100nM、50nM的IC50阻斷細胞表面表達的ROBO2結合SLIT2，該IC50較佳
Figure 113134934-A0202-12-0022-86
100nM、更佳
Figure 113134934-A0202-12-0022-87
50nM。該阻斷細胞表面表達的ROBO2結合SLIT2的實驗方法和IC50值的檢測方法是本領域常規的，例如為本揭露實施例5中所提供的。
(d)以
Figure 113134934-A0202-12-0022-88
200nM、100nM、50nM、20nM、10nM、5nM、3nM的EC50恢復神經元遷移，解除ROBO2-SLIT2依賴的排斥性導向作用，該EC50較佳
Figure 113134934-A0202-12-0022-89
10nM、更佳
Figure 113134934-A0202-12-0022-90
5nM、2nM。該神經元軸突遷移的實驗方法和EC50值的檢測方法是本領域常規的，例如為本揭露實施例6中所提供的。
(e)能夠抑制或減少受試者的蛋白尿，該受試者例如為大鼠，更例如為大鼠被動型海曼腎炎模型。該大鼠被動型海曼腎炎模型的構建方法、給藥方案和蛋白尿的檢測方法是本領域常規的，例如本揭露實施例7中所提供的。
本揭露提供包含ROBO結構域的蛋白的變體，該變體與SEQ ID NO：7-18任一相比，具有一個或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個)胺基酸突變；該胺基酸突變可以是保守胺基酸取代和/或不影響功能的缺失、添加。
以及，本揭露的蛋白涵蓋其藥學上可接受的鹽。
多核苷酸和載體
本揭露提供多核苷酸，其編碼本揭露的包含ROBO結構域的蛋白。
一些實施方案中，該多核苷酸可為RNA、DNA或cDNA。根據本揭露的一些實施方案，本揭露的多核苷酸是分離的多核苷酸。
本揭露的多核苷酸也可呈載體形式，可存在於載體中和/或可為載體的一部分，該載體例如質粒、黏端質粒、YAC或病毒載體。載體可尤其為表達載體，即可提供包含ROBO結構域的蛋白體外和/或體內(即在適合宿主細胞、宿主有機體和/或表達系統中)表達的載體。該表達載體通常包含至少一種本揭露的多核苷酸，其可操作地連接至一個或多個適合的表達調控元件(例如啟動子、增強子、終止子等)。針對在特定宿主中的表達對該元件及其序列進行選擇為所屬技術領域中具有通常知識者的常識。對本揭露的包含ROBO結構域的蛋白的表達有用或必需的調控元件及其他元件例如為啟動子、增強子、終止子、整合因子、選擇標記物、前導序列、報告基因。
本揭露的多核苷酸可基於本揭露的多肽的胺基酸序列的信息藉由已知的方式(例如藉由自動DNA合成和/或重組DNA技術)製備或獲得，和/或可從適合的天然來源加以分離。
宿主細胞
一些實施方案中，提供宿主細胞，其表達或能夠表達一種或多種本揭露的包含ROBO結構域的蛋白、和/或含有本揭露的多核苷酸或載體的重組宿主細胞。
一些實施方案中，宿主細胞為細菌細胞、真菌細胞或哺乳動物細胞。
細菌細胞例如包括革蘭氏陰性細菌菌株(例如大腸桿菌(Escherichia coli)菌株、變形桿菌屬(Proteus)菌株及假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株)及革蘭氏陽性細菌菌株(例如芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株、鏈黴菌屬(Streptomyces)菌株、葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌株及乳球菌屬(Lactococcus)菌株)的細胞。
真菌細胞例如包括木黴屬(Trichoderma)、脈孢菌屬(Neurospora)及麴菌屬(Aspergillus)的物種的細胞；或者包括酵母屬(Saccharomyces)(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、畢赤酵母屬(Pichia)(例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pasioris)及嗜甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica))及漢森酵母屬(Hansenula)的物種的細胞。
示例性地，哺乳動物細胞例如HEK293細胞、CHO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞等。
本揭露也可使用兩栖類細胞、昆蟲細胞、植物細胞及本領域中用於表達異源蛋白的任何其他細胞。
本揭露的細胞不能發育成完整的植株或動物個體。
生產或製備方法
本揭露提供製備本揭露的包含ROBO結構域的蛋白的方法，其包括：
- 在允許表達本揭露的包含ROBO結構域的蛋白的條件下培養本揭露的宿主細胞；及
- 從培養物回收由該宿主細胞表達的；及
- 視需要地，包括進一步純化和/或修飾本揭露的包含ROBO結構域的蛋白。
本揭露的包含ROBO結構域的蛋白可在如上所述細胞中以細胞內方式(例如在細胞質中、在周質中或在包涵體中)產生，接著從宿主細胞分離且視需要進一步純化；或其可以細胞外方式(例如在培養宿主細胞的培養基中)產生，接著自培養基分離且視需要進一步純化。
用於重組產生多肽或蛋白的方法及試劑，例如特定適合表達載體、轉化或轉染方法、選擇標記物、誘導蛋白表達的方法、培養條件等在本領域中是已知的。類似地，適用於製造本揭露的結合分子或抗體等目的蛋白的分離及純化技術為所屬技術領域中具有通常知識者所公知。生產和純化抗體的方法在現有技術中熟知和能找到，如冷泉港的抗體實驗技術指南(5-8章和15章)。本揭露工程化的抗體也可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染細胞。哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端。藉由表達與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的株。陽性的株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化、收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩，離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
然而，本揭露的包含ROBO結構域的蛋白也可以藉由本領域已知的其它產生蛋白質的方法獲得，例如化學合成，包括固相或液相合成。
組成物
一些實施方案中，該組成物為醫藥組成物，其含有預防或治療有效量的如上所述的本揭露的包含ROBO結構域的蛋白，和/或編碼該包含ROBO結構域的蛋白的多核苷酸，以及一種或多種藥學上可接受的載劑或賦形劑。
一些具體實施方案中，該醫藥組成物單位劑量中可含有0.01至99重量%的包含ROBO結構域的蛋白。另一些具體實施方案中，醫藥組成物單位劑量中含包含ROBO結構域的蛋白的量為0.1-2000mg。一些具體實施方案中為1-1000mg。
試劑盒和檢測
本揭露提供試劑盒或產品，其包含前述本揭露任意的包含ROBO結構域的蛋白和/或編碼本揭露包含ROBO結構域的蛋白的核酸分子。
本揭露提供檢測SLIT2的組成物，該組成物包含本揭露的包含ROBO結構域的蛋白。本揭露還提供用於體內或體外檢測SLIT2的方法、系統或裝置，其包括使用本揭露的包含ROBO結構域的蛋白。
一些實施方案中，體外檢測方法、系統或裝置可能例如包括：(1)使樣品與本揭露的包含ROBO結構域的蛋白接觸；(2)檢測在本揭露的包含ROBO結構域的蛋白和樣品之間形成的複合物；和/或(3)使參比樣品(例如，對照樣品)與包含ROBO結構域的蛋白接觸；和(4)藉由與參比樣品比較，確定包含ROBO結構域的蛋白和樣品之間複合物形成的程度。如與對照樣品或受試者中相比，樣品中複合物形成的變化(例如，統計學上的顯著變化)表示樣品中存在SLIT2。
另一些實施方案中，體內檢測方法、系統或裝置可以包括：(1)向受試者施用本揭露的包含ROBO結構域的蛋白；和(2)檢測在本揭露的包含ROBO結構域的蛋白和受試者之間複合物的形成。檢測可以包括確定形成複合物的位置或時間。結合包含ROBO結構域的蛋白的抗體可以直接或間接地用可檢測物質標記以促進所結合的或未結合的抗體的檢測。合適的可檢測物質包括多種酶、輔基、螢光物質、發光物質和放射性物質。可以藉由測量與包含ROBO結構域的蛋白結合或不結合的抗體或使其可視化，檢測在本揭露的包含ROBO結構域的蛋白和血清白蛋白之間的複合物形成。可以使用常規檢測測定法，例如，酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)或組織免疫組織化學。一些實施方案中，藉由競爭免疫測定法分析樣品中血清白蛋白的存在，該競爭免疫測定法使用以可檢測物質標記的標準物和未標記的本揭露的包含ROBO結構域的蛋白。檢測或測定的活體樣品可以是組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿液、糞便、組織液或培養液。
一些實施方案中，出於檢測目的，本揭露的包含ROBO結構域的蛋白可以用螢光團或發色團標記。
治療、預防疾病的方法和製藥用途
本揭露提供治療和/或預防疾病的方法，其包括向有需要的受試者施用治療和/或預防有效量的本揭露的包含ROBO結構域的蛋白。
本揭露還提供了包含ROBO結構域的蛋白用於治療和/或預防疾病的方法中，方法包括向有需要的受試者施用治療和/或預防有效量的本揭露的包含ROBO結構域的蛋白。
本揭露還提供了包含ROBO結構域的蛋白在製備用於治療和/或預防疾病的藥物中的用途。
一些實施方案中，該疾病為ROBO-SLIT2信號通路異常上調導致的疾病。
一些實施方案中，該疾病為腎病，包括足細胞相關腎病。
一些實施方案中，該疾病為腎小球疾病、局部區段性腎小球硬化(FSGS)。
圖1示出了ROBO2-Fc2.2和本揭露的嵌合配體陷阱以劑量依賴性的方式抑制配體SLIT2-D2與細胞表面人ROBO2受體的結合。
圖2示出了ROBO2-Fc2.2和本揭露的嵌合配體陷阱能夠中和配體SLIT2-N，以劑量依賴性的方式恢復神經元細胞的遷移。
圖3示出了ROBO2-Fc2.2和本揭露的嵌合配體陷阱採用預防性給藥方案在大鼠被動型海曼腎炎模型中抑制蛋白尿的效果。
定義
為了更容易理解本揭露，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本揭露中的它處另有明確定義，否則本揭露使用的所有其它技術和科學術語都具有本揭露所屬領域具有通常知識者通常理解的含義。
本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
環形交叉受體(Roundabout Receptor，ROBO)為Slit指導配體(SLIT)蛋白配體的受體。脊椎動物中的四個ROBO受體已得到表徵：ROBO1/Dutt1；ROBO2；ROBO3/Rig-1及ROBO4/Magic Roundabout。其中，人ROBO2的序列參見Uniprot Q9HCK4，人ROBO1的序列Uniprot Q9Y6N7。ROBO1、ROBO2都有細胞外結構域(ECD)結構，該ECD含有五個免疫球蛋白樣(Ig樣)結構域(Ig1、Ig2、Ig3、Ig4及Ig5)，之後為三個3型纖連蛋白(FN3)重複序列。示例性的，環形交叉受體免疫球蛋白樣結構域簡稱為ROBO Ig，環形交叉受體1免疫球蛋白樣結構域2簡稱為ROBO1 Ig2，環形交叉受體2免疫球蛋白樣結構域1簡稱為ROBO2 Ig1，ROBO前免疫球蛋白樣1簡稱為ROBO前Ig1；而僅為表述簡潔的考量，示例性的，ROBO Ig2和ROBO Ig3間的連接子可簡稱為ROBO Ig2-3連接子，ROBO Ig1-2連接子包括ROBO1 Ig1-2連接子、ROBO2 Ig1-2連接子；示例性的，ROBO2 Ig1-2連接子如SEQ ID NO：22所示，ROBO1 Ig1-2連接子如SEQ ID NO：23所示。
“重組蛋白”指藉由重組DNA技術產生的多肽，一般而言，編碼多肽的DNA插入至適合的表達載體中，繼而引入至宿主細胞中以產生重組蛋白。本揭露中，“蛋白”或“蛋白質”指包含胺基酸且由所屬技術領域中具有通常知識者公認為蛋白質的任何組成物。術語“蛋白”、“蛋白質”、“肽”及“多肽”在本文中互換地使用。作為一個示例，本揭露的包含ROBO結構域的蛋白是重組蛋白。本揭露的重組ROBO蛋白結合SLIT配體，由此阻礙SLIT與細胞ROBO受體結合，因此稱作SLIT中和配體陷阱(SLIT neutralizing ligand trap)。
通常，本揭露的包含ROBO結構域的蛋白將以如於Biacore或KinExA或Fortibio測定中測量的較佳10-7至10-10莫耳/升(M)、更佳10-8至10-10莫耳/升、甚至更佳10-9至10-10或更低的平衡解離常數(KD)結合SLIT2。任何大於10-4M的KD值一般都視為指示非特異性結合。受體與配體的特異性結合可以以已知的任何適合方式來測定，包括例如本揭露所述的表面電漿共振術(SPR)測定、Scatchard測定和/或競爭性結合測定(例如放射免疫測定(RIA)、酶免疫測定(ELISA)及夾心式競爭性測定。
本揭露中的恆定區胺基酸位置編號是根據Eu索引而定。
“連接子”為使兩個分離實體(例如ROBO結構域與免疫球蛋白Fc區)彼此結合的分子或分子群，且連接子可在兩個實體之間提供間隔以使得其能夠達成其例如特異性結合其同源配體(例如SLIT配體)的構象。連接子例如為多肽連接子，且可使用本領域中熟知的標準重組DNA技術將其表達為重組蛋白的組分。
術語“抑制”或“阻斷”可互換使用，並涵蓋部分和完全抑制/阻斷這兩者。
本揭露中“同源性”、“同一性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源；如果兩個序列中的100個位置有95個匹配或同源，那麼兩個序列為95%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。
“保守胺基酸取代”是指將蛋白或多肽的某個或多個胺基酸殘基進行保守胺基酸替換，替換前的胺基酸殘基與替換後的胺基酸殘基的化學結構類似，且替換對蛋白或多肽的功能、活性或其他生物性質影響較小或基本上無影響。該保守胺基酸替換在本領域中是公知的，例如保守胺基酸替換較佳是以下組(i)-(v)內的一個胺基酸被同一組內的另一胺基酸殘基所取代：
(i)較小脂族非極性或弱極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；
(ii)極性帶負電殘基及其(不帶電)醯胺：Asp、Asn、Glu及Gln；
(iii)極性帶正電殘基：His、Arg及Lys；(iv)較大脂族非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及
(v)芳族殘基：Phe、Tyr及Trp。
特別佳地保守胺基酸取代如下：Ala被Gly或Ser取代；Arg被Lys取代；Asn被Gln或His取代；Asp被Glu取代；Cys被Ser取代；Gln被Asn取代；Glu被Asp取代；Gly被Ala或Pro取代；His被Asn或Gln取代；Ile被Leu或Val取代；Leu被Ile或Val取代；Lys被Arg、Gln或Glu取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Phe被Met、Leu或Tyr取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Trp或Phe取代；Val被Ile或Leu取代。
“核酸”、“核酸分子”或“多核苷酸”在本揭露可互換使用，指的是單鏈或雙鏈的任何DNA分子或RNA分子以及在單鏈的情況下，它的互補序列的分子，較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增強子有效地連接至該編碼序列。
術語“載體”是指能夠運輸與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中，載體是“質粒”，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本揭露中的載體能夠在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，從而隨宿主基因組一起複製(例如，非附加型哺乳動物載體)。
本揭露使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括後代。因此，“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮傳代數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。
“宿主細胞”包括各個細胞或細胞培養物，其可為或已是用於摻入核酸插入片段的載體的受體。宿主細胞包括單個宿主細胞的子代，並且由於天然、偶然或有意的突變，子代可不一定與原始親本細胞完全相同(在形態學或基因組DNA互補體中)。宿主細胞包括用本揭露的核酸在體內轉染和/或轉化的細胞。“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括其後代。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本揭露所述融合蛋白、包含ROBO結構域的蛋白、多核苷酸與其他組分的混合物，該其他組分例如生理學/藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
“給予”、“施用”和“處理”當應用於動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”、“施用”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”、“施用”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組成物或藉由另一種細胞體外和離體處理細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予受試者內用或外用治療劑(如本揭露的融合蛋白)，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床有測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本揭露的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢 驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。“和/或”應視為特定揭示兩種指定特徵或組分中的每一者具有或不具有另一者。因此，諸如本揭露中“A和/或B”的詞組中所用的術語“和/或”包括“A及B”、“A或B”、“A”(單獨)及“B”(單獨)。除非上下文另外清楚要求，否則在整個說明書和申請專利範圍中，應將詞語“包含”、“具有”、“包括”等理解為具有包含意義，而不是排他性或窮舉性意義；也即，“包括但不僅限於”的意義。
本揭露的“受試者”、“患者”意指哺乳動物，尤其靈長類動物，尤其是人。
本公开中，“至少95%(序列)同一性”涵蓋至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%(序列)同一性、以及前述任意兩個數值之間的範圍，包括整數和小數；“至少90%(序列)同一性”涵蓋至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%(序列)同一性、以及前述任意兩個數值之間的範圍，包括整數和小數；“至少80%(序列)同一性”涵蓋至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%(序列)同一性、以及前述任意兩個數值之間的範圍，包括整數和小數。
實施例
以下結合實施例用於進一步描述本揭露，但這些實施例並非限制本揭露的範圍。
本揭露實施例或測試例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。參見Sambrook等，分子選殖，實驗室手冊，冷泉港實驗室；當代分子生物學方法，Ausubel等著，Greene出版協會，Wiley Interscience，NY。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例1. 配體陷阱及檢測用蛋白的製備
以人ROBO2(Uniprot Entry：Q9HCK4)胞外區作為ROBO2的模板，設計ROBO2配體陷阱及檢測用蛋白的胺基酸序列(以下ROBO2配體陷阱未特殊說明的均指人ROBO2)。
>ROBO2-Fc2.2(Pfizer & Boston medical center,WO2018222850A1)
Figure 113134934-A0202-12-0035-5
Figure 113134934-A0202-12-0035-4
(SEQ ID NO：1)
斜體雙下劃線為ROBO2前Ig1；下劃線部分為ROBO2 Ig1；雙下劃線為ROBO2 Ig1和ROBO2 Ig2之間的連接子，曲線為ROBO2 Ig2；虛線為 ROBO2 Ig2-Ig3連接子；斜體部分為GS連接子；其餘為抗體恆定區，去除Fc介導效應的帶有C220S/L234A/L235A/G237A的hIgG1-Fc。
>ROBO2 Ig1-hIgG1-FcS
Figure 113134934-A0202-12-0036-6
Figure 113134934-A0202-12-0036-7
(SEQ ID NO：2)
斜體雙下劃線為ROBO2前Ig1序列；下劃線部分為ROBO2 Ig1；斜體部分為GS連接子；其餘為抗體恆定區，去除Fc介導效應的帶有C220S/L234A/L235A/G237A的hIgG1-Fc。
以人ROBO1(Uniprot Entry：Q9Y6N7)胞外區作為ROBO1的模板設計ROBO1配體陷阱及檢測用蛋白的胺基酸序列(以下ROBO1配體陷阱未特殊說明的均指人ROBO1)。
>ROBO1 Ig1-hIgG1-FcS
Figure 113134934-A0202-12-0036-8
Figure 113134934-A0202-12-0037-9
Figure 113134934-A0202-12-0037-10
(SEQ ID NO：3)
斜體雙下劃線為ROBO1前Ig1序列；下劃線部分為ROBO1 Ig1；斜體部分為GS連接子；其餘為抗體恆定區，為含有C220S/L234A/L235A/G237A的hIgG1-Fc。
以人SLIT2(Uniprot Entry：O94813)胞外區作為SLIT2的模板設計SLIT2及檢測用蛋白的胺基酸序列(以下SLIT2未特殊說明的均指人SLIT2)。
>人SLIT2-D2-avi-his
Figure 113134934-A0202-12-0037-11
Figure 113134934-A0202-12-0037-12
(SEQ ID NO：4)
下劃線部分為人SLIT2胞外區部分，人Slit2的第二LRR結構域(SLIT2 D2)；斜體部分為GS連接子；曲線部分為avi-tag；虛線部分為his-tag。
>人SLIT2-D2-his
Figure 113134934-A0202-12-0037-13
(SEQ ID NO：5)
>大鼠SLIT2-D2-his
Figure 113134934-A0202-12-0038-14
(SEQ ID NO：6)
以上SEQ ID NO：5-6中，虛線部分為his-tag，其餘部分分別為人SLIT2-D2和大鼠SLIT2-D2。
實施例2. 飽和突變噬菌體文庫設計、構建和篩選
根據SLIT2-D2與ROBO1 Ig1複合體的晶體結構(PDB ID：2V9T)，結合ROBO2 Ig1與ROBO1 Ig1的序列比對，選擇ROBO2 Ig1和SLIT2-D2作用界面的部分關鍵胺基酸殘基，設計3個隨機突變噬菌體文庫(表1)。
表1. ROBO2-Ig1飽和突變噬菌體文庫
Figure 113134934-A0202-12-0038-15
在野生型ROBO2 Ig1結構域的基礎上完成上述3個飽和突變文庫構建，隨機挑選株進行測序，驗證文庫的質量。隨後進行噬菌體文庫與對應SLIT2-D2的篩選。
藉由噬菌體庫的篩選來獲得與人SLIT2-D2-avi-his(SEQ ID NO：4)蛋白具有高親和力的ROBO2 Ig1結構域，用20μg的人SLIT2-D2-avi-his生物素蛋白結合100uL DynabeadsTM M-280 Streptavidin，37℃放置一小時後用2%脫 脂奶室溫封閉1小時，加入ROBO2 Ig1結構域飽和突變噬菌體展示文庫，在室溫下作用1小時。用PBST(0.05% Tween-20)溶液洗9遍，去除不結合的噬菌體。用1mg/mL的胰蛋白酶將與人SLIT2-D2特異性結合的噬菌體沖提，並感染處於對數期生長的大腸桿菌TG1，產生並純化噬菌體用於下一輪篩選。重複5次以上步驟進行篩選，從篩選富集的陽性株中挑取96個單株菌落包裝成噬菌體單鏈抗體，用於噬菌體ELISA測試。ELISA板上分別包被2μg/mL的SLIT2-D2蛋白，加入封閉液稀釋的噬菌體上清，用抗M13 HRP(義翹神州，Cat.# 11973-MM05T-H)檢測。將ELISA結合實驗中的OD450值/背景值>5的株進行測序，選殖序列至真核表達載體，表達純化蛋白，藉由細胞阻斷實驗進一步篩選。共篩選得到4個親和力及功能提高的突變體(表2)。
表2. 配體陷阱體外細胞阻斷結合IC50測定
Figure 113134934-A0202-12-0039-16
>0044-0504
Figure 113134934-A0202-12-0039-17
Figure 113134934-A0202-12-0040-18
Figure 113134934-A0202-12-0040-19
(SEQ ID NO：7)
>0044-0505
Figure 113134934-A0202-12-0040-20
Figure 113134934-A0202-12-0040-21
(SEQ ID NO：8)
>0044-0506
Figure 113134934-A0202-12-0040-22
Figure 113134934-A0202-12-0041-23
Figure 113134934-A0202-12-0041-24
(SEQ ID NO：9)
>0044-0507
Figure 113134934-A0202-12-0041-25
Figure 113134934-A0202-12-0041-26
(SEQ ID NO：10)
以上SEQ ID NO：7-10中，斜體為ROBO2-Ig1，其中的單下劃線為胺基酸突變位點，雙下劃線為ROBO2 Ig1-2連接子，虛線為ROBO2 Ig2，曲線為ROBO2 Ig2-3連接子，雙曲線為GS連接子，其餘為抗體恆定區，為C220S/L234A/L235A/G237A的hIgG1-Fc；斜體雙下劃線為ROBO2前Ig1序列。
篩選獲得的ROBO2 Ig1突變體序列如下：
>ROBO2 Ig1(0044-0504 Ig1)17F/30S/32R/66G/68H
PRIVEHPFDVIVSKGEPTTLSCRAEGRPTPTIEWYKDGERVETDKDDPRSHRMLLPGGHLFFLRIVHGRRSKPDEGSYVCVARNYLGEAVSRNASLE(SEQ ID NO：11)
>ROBO2 Ig1(0044-0505 Ig1)17T/30Y/32T/66D/68K
PRIVEHPTDVIVSKGEPTTLYCTAEGRPTPTIEWYKDGERVETDKDDPRSHRMLLPDGKLFFLRIVHGRRSKPDEGSYVCVARNYLGEAVSRNASLE(SEQ ID NO：12)
>ROBO2 Ig1(0044-0506 Ig1)17V/30Y/32R/66V/68D
PRIVEHPVDVIVSKGEPTTLYCRAEGRPTPTIEWYKDGERVETDKDDPRSHRMLLPVGDLFFLRIVHGRRSKPDEGSYVCVARNYLGEAVSRNASLE(SEQ ID NO：13)
>ROBO2 Ig1(0044-0507 Ig1)17K/30H/32Q/66R/68E
PRIVEHPKDVIVSKGEPTTLHCQAEGRPTPTIEWYKDGERVETDKDDPRSHRMLLPRGELFFLRIVHGRRSKPDEGSYVCVARNYLGEAVSRNASLE(SEQ ID NO：14)。
實施例3. 嵌合配體陷阱構建與篩選
在穩定性實驗中發現ROBO2 Ig2存在易發生斷裂的位點，替換成ROBO1 Ig2序列可以規避這一斷裂位點，以突變體0044-0504、0044-0505、0044-0506、0044-0507為基礎，構建ROBO2 Ig1/ROBO1 Ig2嵌合體，並替換或優化ROBO1 Ig1-2連接子、ROBO1 Ig2-3連接子、GS連接子及hIgG1 Fc鉸鏈區序列，進一步篩選獲得穩定性較好的目標蛋白。
>0044-0518
Figure 113134934-A0202-12-0042-27
Figure 113134934-A0202-12-0043-28
(SEQ ID NO：15)
>0044-0519
Figure 113134934-A0202-12-0043-29
(SEQ ID NO：16)
>0044-0520
Figure 113134934-A0202-12-0043-30
Figure 113134934-A0202-12-0044-31
(SEQ ID NO：17)
>0044-0521
Figure 113134934-A0202-12-0044-32
(SEQ ID NO：18)
以上SEQ ID NO：15-18中，斜體為ROBO2-Ig1(SEQ ID NO：11-14)，雙下劃直線為ROBO1 Ig1-2連接子，虛線為ROBO1-Ig2，雙下劃曲線為ROBO1 Ig2-3連接子，其餘為帶有L234A/L235A/G237A並在鉸鏈區去除EPKSC的hIgG1-Fc；斜體雙下劃線為ROBO2前Ig1序列。
實施例4. 嵌合配體陷阱與配體的親和力測定
本實施例藉由Biacore T200(GE Healthcare)儀器測定示例嵌合配體陷阱0044-0520及陽性對照ROBO2-Fc2.2，與人或大鼠SLIT2 D2的親和力。
實驗方法：使用芯片Series S sensor chip Protein A(GE Healthacare，Cat.# 29127556)將待檢測配體陷阱蛋白捕獲至芯片表面，然後於芯片表面流過不同濃度的蛋白人/大鼠SLIT2 D2-his(SEQ ID NO：5-6)。實時檢測反應信號，獲得結合解離曲線，藉由擬合獲得結合力常數。實驗使用溶液為HBS-EP溶液(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005% P20，pH 7.4)。每個實驗循環結束時，用pH1.5 Glycine(GE Healthcare，Cat.# BR-1003-54)溶液將芯片洗淨再生。親和力結果如表3所示。結果顯示，本揭露的示例突變體0044-0520對人SLIT2 D2-his和大鼠SLIT2 D2-his的親和力都優於陽性對照ROBO2-Fc2.2。
表3. 配體陷阱與人/大鼠SLIT2 D2的親和力測定
Figure 113134934-A0202-12-0045-33
實施例5. 嵌合配體陷阱體外細胞阻斷ROBO2受體與SLIT2結合的實驗
本實施例檢測嵌合配體陷阱蛋白是否藉由與細胞表面表達的ROBO2受體競爭性結合配體SLIT2，進而發揮配體陷阱的作用。
實驗方法：懸浮HEK293E細胞，經LipofectamineTM 2000(Invitrogen,Cat.# 11668027)轉染人ROBO2受體質粒(義翹SinoBiological，Cat.# HG10310-CF)。轉染後60小時，離心收集細胞，PBS緩衝液清洗一遍，活細胞計數重新懸浮細胞濃度至500,000細胞/50uL PBS，與5nM人SLIT2-D2(SEQ ID NO：5)、不同濃度配體陷阱蛋白、10ug/mL肝素鈉在PBS中，4℃孵育1小時，PBS清洗兩遍，洗去未結合蛋白。添加anti-His-APC螢光標記二抗(biolegend,Cat.# 362605)，繼續4℃孵育1小時，添加工作濃度7AAD(abcam,Cat.# ab142391)，室溫孵育10分鐘，PBS清洗兩遍，洗去過量抗體。流式細胞儀(BD Accuri C6 Plus)上機檢測，FlowJo軟件分析結果，選取7AAD陰性活細胞，分析APC陽性細胞群體比例。經GraphPad Prism9軟件分析配體陷阱蛋白濃度和APC陽性細胞/活細胞百分比進行三參數擬合得到IC50。示例測定結果參見表4。
表4. 配體陷阱體外細胞阻斷結合IC50測定
Figure 113134934-A0202-12-0046-34
使用GraphPad Prism 9藉由非線性擬合、三參數非對數抑制劑對反應模型作圖，示例結果如圖1所示，0044-0520以劑量依賴性的方式抑制配體SLIT2-D2與細胞人ROBO2受體的結合，並且0044-0520阻斷效果顯著優於陽性對照ROBO2-Fc2.2。
實施例6. 神經元細胞遷移實驗
本實施例檢測嵌合配體陷阱對SLIT2-N的中和能力，解除ROBO2-SLIT2對大鼠幼崽前腦亞室管膜層神經元遷移的排斥性導向作用。大鼠前腦亞室管膜層神經元在大鼠出生兩週內會沿著頭端遷移渠遷移到達嗅球，發育成嗅球中間神經元，SLIT2對上述神經細胞遷移有排斥性的導向作用，且為ROBO2依賴性的。
實驗方法：從SD大鼠幼崽(北京維通利華實驗動物技術有限公司，性別不限，新生3-4天)分離前腦亞室管膜層神經元組織塊，切割成0.5mm* 0.5mm*0.5mm大小。基質膠和含10%血清的DMEM全培養基按照4：1的體積比進行混合(基質膠BD,Cat.# 354234；DMEM培養基thermo，Cat.# 11995073；胎牛血清Gibco，Cat.# 10099-141c)，吸取約50μL上述混合物至35mm玻底共聚焦培養皿的玻璃底中央(碧雲天，Cat.# FCFC020)，將組織塊包埋其中，37℃放置半小時待基質膠凝固。在含工作濃度5nM人SLIT2-N(PeproTech,Cat.# 150-11-50)的DMEM全培養基中添加不同濃度的配體陷阱蛋白，吸取2mL至共聚焦培養皿中，覆蓋凝固後的基質膠。37℃細胞培養箱孵育24小時，用奧林巴斯倒置顯微鏡明場拍攝各神經元組織塊。ImageJ分別圈定組織塊周長C1、神經元遷移最遠端周長C2，分別計算各周長對應的半徑R1=C1/(π*2)、R2=C2/(π*2)，計算各組織塊神經元的遷移距離L=R2-R1，各實驗組要求不低於5個組織塊納入統計分析。
配體陷阱能夠以劑量依賴性方式恢復神經元細胞的遷移，經GraphPad Prism9軟件分析配體陷阱蛋白濃度和神經元遷移距離進行三參數擬合得到EC50。示例測定結果參見表5。
表5. 配體陷阱恢復神經元細胞遷移EC50測定
Figure 113134934-A0202-12-0047-35
使用GraphPad Prism 9藉由非線性擬合、三參數非對數激動劑對反應模型作圖，雙因素方差分析(
Figure 113134934-A0202-12-0047-76
ídák檢驗，*<0.05)，示例結果如圖2所示，配體陷阱以劑量依賴性的方式恢復神經元細胞的遷移，並且0044-0520配體的SLIT2-N中和活性顯著優於陽性對照ROBO2-Fc2.2。
實施例7. 嵌合配體陷阱大鼠腎炎模型體內藥效驗證
本實施例檢測嵌合配體陷阱在大鼠被動型海曼腎炎模型抑制蛋白尿的效果。
實驗方法：Lewis大鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司，雄性，8週齡)適應性飼養1週。大鼠根據體重隨機分組編號，尾靜脈注射綿羊抗大鼠Fx1A(Probetex，Cat.# PTX-002S)血清，以誘導大鼠對注射血清產生免疫反應、補體活化引起足細胞足突消弭進而出現蛋白尿的腎損表型。採用預防性給藥方案，在注射抗大鼠血清前一天皮下起始給予配體陷阱蛋白，給藥劑量25mg/kg，每兩天給藥一次，共持續給藥6次。並藉由代謝籠採集血清造模前後的大鼠尿液樣品，分別檢測尿白蛋白和尿肌酸酐(Invitrogen,Cat.# EIACUN)，計算得到尿白蛋白/肌酸酐比(UACR，mg/mg)，經GraphPad Prism9統計分析各處理組UACR統計差異。
表6. 配體陷阱處理組蛋白尿減少率
Figure 113134934-A0202-12-0048-36
示例結果如表6、圖3所示，大鼠自造模第2-3天開始出現蛋白尿、第11天前後達到峰值。在造模第11天，相較於PBS對照組，陽性對照ROBO2-Fc2.2處理組蛋白尿減少率為30.4%，0044-0520處理組的蛋白尿減少率 提升至45.8%。並且兩個處理組的蛋白尿水平具有顯著差異，單因素方差分析(Tukey檢驗，*<0.05)。
本揭露的序列還包括：
>ROBO1/2前Ig1序列
SRLRQEDFP(SEQ ID NO：19)
>ROBO2 Ig1
PRIVEHPSDVIVSKGEPTTLNCKAEGRPTPTIEWYKDGERVETDKDDPRSHRMLLPSGSLFFLRIVHGRRSKPDEGSYVCVARNYLGEAVSRNASLE(SEQ ID NO：20)
>ROBO1 Ig1
PRIVEHPSDLIVSKGEPATLNCKAEGRPTPTIEWYKGGERVETDKDDPRSHRMLLPSGSLFFLRIVHGRKSRPDEGVYVCVARNYLGEAVSHNASLE(SEQ ID NO：21)
>ROBO2 Ig1-2連接子
VALLR(SEQ ID NO：22)
>ROBO1 Ig1-2連接子
VAILR(SEQ ID NO：23)
>ROBO2 Ig2
DDFRQNPTDVVVAAGEPAILECQPPRGHPEPTIYWKKDKVRIDDKEERISIRGGKLMISNTRKSDAGMYTCVGTNMVGERDSDPAELT(SEQ ID NO：24)
>ROBO1 Ig2
DDFRQNPSDVMVAVGEPAVMECQPPRGHPEPTISWKKDGSPLDDKDERITIRGGKLMITYTRKSDAGKYVCVGTNMVGERESEVAELT(SEQ ID NO：25)
>ROBO2 Ig2-3連接子
VFER(SEQ ID NO：26)
>ROBO1 Ig2-3連接子
VLER(SEQ ID NO：27)
>ROBO2 Ig3
PTFLRRPINQVVLEEEAVEFRCQVQGDPQPTVRWKKDDADLPRGRYDIKDDYTLRIKKTMSTDEGTYMCLAENRVGKMEASATLT(SEQ ID NO：28)
>ROBO1 Ig3
PSFVKRPSNLAVTVDDSAEFKCEARGDPVPTVRWRKDDGELPKSRYEIRDDHTLKIRKVTAGDMGSYTCVAENMVGKAEASATLT(SEQ ID NO：29)
>ROBO2 Ig3-4連接子
VRAP(SEQ ID NO：30)
>ROBO1 Ig3-4連接子
VQEP(SEQ ID NO：31)
>ROBO2 Ig4
PQFVVRPRDQIVAQGRTVTFPCETKGNPQPAVFWQKEGSQNLLFPNQPQQPNSRCSVSPTGDLTITNIQRSDAGYYICQALTVAGSILAKAQLEVT(SEQ ID NO：32)
>ROBO1 Ig4
PHFVVKPRDQVVALGRTVTFQCEATGNPQPAIFWRREGSQNLLFSYQPPQSSSRFSVSQTGDLTITNVQRSDVGYYICQTLNVAGSIITKAYLEVT(SEQ ID NO：33)
>ROBO2 Ig4後連接子
DVLTDRPP(SEQ ID NO：34)
>ROBO1 Ig4後連接子
DVIADRPP(SEQ ID NO：35)
>GS連接子
GGSGGS(SEQ ID NO：36)
>IgG1 Fc(C220S)
Figure 113134934-A0202-12-0051-37
Figure 113134934-A0202-12-0051-38
(SEQ ID NO：37)
>IgG1 Fc(C220S/L234A/L235A/G237A)
Figure 113134934-A0202-12-0051-39
Figure 113134934-A0202-12-0051-40
(SEQ ID NO：38)
>IgG1 Fc(L234A/L235A/G237A；缺失EPKSC)
Figure 113134934-A0202-12-0051-41
Figure 113134934-A0202-12-0051-42
(SEQ ID NO：39)。
此外，本揭露還構建、製備了如下嵌合配體陷阱：
>0044-0545
Figure 113134934-A0202-12-0052-43
(SEQ ID NO：40)
以上序列中，斜體雙下劃線為ROBO2前Ig1，斜體為ROBO2-Ig1(SEQ ID NO：13)，雙下劃直線為ROBO1 Ig1-2連接子，虛線為ROBO1-Ig2，雙下劃曲線為ROBO1 Ig2-3連接子，單下劃線為ROBO1 Ig3及ROBO1 Ig3-4連接子，其餘為hIgG1-Fc。
>0044-0546
Figure 113134934-A0202-12-0052-44
Figure 113134934-A0202-12-0053-45
Figure 113134934-A0202-12-0053-46
(SEQ ID NO：41)
以上序列中，斜體雙下劃線為ROBO2前Ig1，斜體為ROBO2-Ig1(SEQ ID NO：13)，雙下劃直線為ROBO1 Ig1-2連接子，虛線為ROBO1-Ig2，雙下劃曲線為ROBO1 Ig2-3連接子，單下劃線為ROBO1 Ig3-連接子及ROBO1 Ig3-4連接子，單曲線為ROBO1 Ig4及ROBO1 Ig4後連接子，其餘為hIgG1-Fc。
>0044-0547
Figure 113134934-A0202-12-0053-47
Figure 113134934-A0202-12-0053-48
(SEQ ID NO：42)
以上序列中，斜體雙下劃線為ROBO2前Ig1，斜體為ROBO2-Ig1(SEQ ID NO：13)，雙下劃直線為ROBO1 Ig1-2連接子，虛線為ROBO1-Ig2，雙下劃曲線為ROBO1 Ig2-3連接子，單下劃線為ROBO1 Ig3-連接子及ROBO1 Ig3-4連接子，單曲線為ROBO2 Ig4及ROBO2 Ig4後連接子，其餘為hIgG1-Fc。
>0044-0548
Figure 113134934-A0202-12-0054-49
Figure 113134934-A0202-12-0054-50
(SEQ ID NO：43)
以上序列中，斜體雙下劃線為ROBO2前Ig1，斜體為ROBO2-Ig1(SEQ ID NO：13)，雙下劃直線為ROBO1 Ig1-2連接子，虛線為ROBO1-Ig2，雙下劃曲線為ROBO1 Ig2-3連接子，單下劃線為ROBO2 Ig3及ROBO2 Ig3-4連接子，其餘為hIgG1-Fc。
>0044-0549
Figure 113134934-A0202-12-0054-51
Figure 113134934-A0202-12-0055-52
Figure 113134934-A0202-12-0055-53
(SEQ ID NO：44)
以上序列中，斜體雙下劃線為ROBO2前Ig1，斜體為ROBO2-Ig1(SEQ ID NO：13)，雙下劃直線為ROBO1 Ig1-2連接子，虛線為ROBO1-Ig2，雙下劃曲線為ROBO1 Ig2-3連接子，單下劃線為ROBO2 Ig3及ROBO2 Ig3-4連接子，單曲線為ROBO2 Ig4及ROBO2 Ig4後連接子，其餘為hIgG1-Fc。
>0044-0550
Figure 113134934-A0202-12-0055-54
Figure 113134934-A0202-12-0056-55
Figure 113134934-A0202-12-0056-56
(SEQ ID NO：45)
以上序列中，斜體雙下劃線為ROBO2前Ig1，斜體為ROBO2-Ig1(SEQ ID NO：13)，雙下劃直線為ROBO1 Ig1-2連接子，虛線為ROBO1-Ig2，雙下劃曲線為ROBO1 Ig2-3連接子，單下劃線為ROBO2 Ig3及ROBO2 Ig3-4連接子，單曲線為ROBO1 Ig4及ROBO1 Ig4後連接子，其餘為hIgG1-Fc。
>0044-0518-1
Figure 113134934-A0202-12-0056-57
Figure 113134934-A0202-12-0056-58
(SEQ ID NO：46)
>0044-0519-1
Figure 113134934-A0202-12-0056-59
Figure 113134934-A0202-12-0056-60
(SEQ ID NO：47)
>0044-0520-1
Figure 113134934-A0202-12-0056-61
Figure 113134934-A0202-12-0056-62
(SEQ ID NO：48)
>0044-0521-1
Figure 113134934-A0202-12-0057-63
Figure 113134934-A0202-12-0057-64
(SEQ ID NO：49)
以上SEQ ID NO：46-49中，斜體雙下劃線為ROBO2前Ig1序列，斜體為ROBO2-Ig1(SEQ ID NO：11-14)，雙下劃直線為ROBO1 Ig1-2連接子，虛線為ROBO1-Ig2，雙下劃曲線為ROBO1 Ig2-3連接子。
>0044-0518-2
Figure 113134934-A0202-12-0057-65
Figure 113134934-A0202-12-0057-66
(SEQ ID NO：50)
>0044-0519-2
Figure 113134934-A0202-12-0057-67
Figure 113134934-A0202-12-0057-68
(SEQ ID NO：51)
>0044-0520-2
Figure 113134934-A0202-12-0057-69
Figure 113134934-A0202-12-0057-70
(SEQ ID NO：52)
>0044-0521-2
Figure 113134934-A0202-12-0058-71
Figure 113134934-A0202-12-0058-72
(SEQ ID NO：53)
以上SEQ ID NO：50-53中，斜體為ROBO2-Ig1(SEQ ID NO：11-14)，雙下劃直線為ROBO1 Ig1-2連接子，虛線為ROBO1-Ig2，雙下劃曲線為ROBO1 Ig2-3連接子。
TW202511284A_113134934_SEQL.xml

Claims (22)

  1. 一種蛋白，其包含環形交叉受體(ROBO)結構域，其中該ROBO結構域包含：
    環形交叉受體2免疫球蛋白樣結構域1(ROBO2 Ig1)、和
    環形交叉受體1免疫球蛋白樣結構域2(ROBO1 Ig2)。
  2. 如請求項1所述的蛋白，其中該ROBO結構域還包含如下i)-vii)中的一項或多項：
    i)ROBO前免疫球蛋白樣1(ROBO前Ig1)，
    ii)ROBO免疫球蛋白樣結構域1和免疫球蛋白樣結構域2間的連接子(ROBO Ig1-2連接子)，
    iii)ROBO免疫球蛋白樣結構域2和免疫球蛋白樣結構域3間的連接子(ROBO Ig2-3連接子)，
    iv)ROBO免疫球蛋白樣結構域3(ROBO Ig3)，
    v)ROBO免疫球蛋白樣結構域3和免疫球蛋白樣結構域4間的連接子(ROBO Ig3-4連接子)，
    vi)ROBO免疫球蛋白樣結構域4(ROBO Ig4)，
    vii)ROBO免疫球蛋白樣結構域4後連接子(ROBO Ig4後連接子)；
    較佳地，i)-vii)中的ROBO為ROBO1或ROBO2。
  3. 如請求項1或2所述的蛋白，其中該ROBO2 Ig1較之野生型ROBO2 Ig1在第17、30、32、66、68位的一個或多個位置存在胺基酸突變，該位置編號是相對SEQ ID NO：1所示胺基酸序列的自然順序編號；
    較佳地，該ROBO2 Ig1較之野生型ROBO2 Ig1存在選自A)-E)的胺基酸突變：
    A)17F、17T、17V或17K，
    B)30S、30Y或30H，
    C)32R、32T或32Q，
    D)66G、66D、66V或66R，和/或
    E)68H、68K、68D或68E；
    更佳地，該ROBO2 Ig1較之野生型ROBO2 Ig1存在選自K)-N)的胺基酸突變：
    K)17F/30S/32R/66G/68H，
    L)17T/30Y/32T/66D/68K，
    M)17V/30Y/32R/66V/68D，或
    N)17K/30H/32Q/66R/68E。
  4. 如請求項2或3所述的蛋白，其中ROBO結構域從胺基端到羧基端包含如式(I)所示結構、或是式(I)結構所示：
    [ROBO前Ig1]a-[ROBO2 Ig1]-[ROBO Ig1-2連接子]b-[ROBO1 Ig2]-[ROBO Ig2-3連接子]c-[ROBO Ig3]d-[ROBO Ig3-Ig4連接子]e-[ROBO Ig4]f-[ROBO Ig4後連接子]g 式(I)
    其中，-為肽鍵，a、b、c、d、e、f、g可以獨自的選自0或1。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的蛋白，其中，ROBO2 Ig1包含SEQ ID NOs：20、11-14任一或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列。
  6. 如請求項2至5中任一項所述的蛋白，其中，
    ROBO1 Ig2包含如SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列；
    ROBO前Ig1包含如SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列；
    ROBO Ig1-2連接子包含如SEQ ID NO：22或23所示的胺基酸序列；
    ROBO Ig2-3連接子包含如SEQ ID NO：26或27所示的胺基酸序列；
    ROBO Ig3包含如SEQ ID NO：28或29所示的胺基酸序列；
    ROBO Ig3-4連接子包含如SEQ ID NO：30或31所示的胺基酸序列；
    ROBO Ig4包含如SEQ ID NO：32或33所示的胺基酸序列；和/或，
    ROBO Ig4後連接子包含如SEQ ID NO：34或35所示的胺基酸序列。
  7. 如請求項1至6中任一項所述的蛋白，其還包含免疫球蛋白Fc區，
    較佳地，該Fc區為人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區；
    更佳地，該Fc為包含220S、234A、235A、237A的一個或多個突變的人IgG1 Fc區；
    最佳地，該Fc區包含SEQ ID NOs：37-39任一或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列。
  8. 如請求項7所述的蛋白，其中該ROBO結構域與該Fc區直接或藉由連接子連接；
    較佳地，該連接子為(GxS)y所示，其中，x選自1-5的整數，y選自1-6的整數；
    更佳地，該連接子為(G2S)2所示。
  9. 如請求項1至8中任一項所述的蛋白，其包含SEQ ID NOs：15-18、40-53任一或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列。
  10. 一種蛋白，其包含環形交叉受體(ROBO)結構域，該ROBO結構域包含環形交叉受體2免疫球蛋白樣結構域1(ROBO2 Ig1)，該ROBO2 Ig1較之野生型ROBO2 Ig1在第17、30、32、66、68位的一個或多個位置存在胺基酸突變，該位置編號是相對SEQ ID NO：1所示胺基酸序列的自然順序編號；
    較佳地，該ROBO2 Ig1較之野生型ROBO2 Ig1存在選自A)-E)的胺基酸突變：
    A)17F、17T、17V或17K，
    B)30S、30Y或30H，
    C)32R、32T或32Q，
    D)66G、66D、66V或66R，和/或
    E)68H、68K、68D或68E；
    更佳地，該ROBO2 Ig1較之野生型ROBO2 Ig1存在選自K)-N)的胺基酸突變：
    K)17F/30S/32R/66G/68H，
    L)17T/30Y/32T/66D/68K，
    M)17V/30Y/32R/66V/68D，或
    N)17K/30H/32Q/66R/68E；
    最佳地，該ROBO2 Ig1包含SEQ ID NOs：11-14任一或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列。
  11. 如請求項10所述的蛋白，其中該ROBO結構域還包含環形交叉受體免疫球蛋白樣結構域2(ROBO Ig2)，較佳為環形交叉受體1免疫球蛋白樣結構域2(ROBO1 Ig2)或環形交叉受體2免疫球蛋白樣結構域2(ROBO2 Ig2)；
    更佳地，該ROBO1 Ig2包含如SEQ ID NO：25所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，該ROBO2 Ig2包含SEQ ID NO：24或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列。
  12. 如請求項10或11所述的蛋白，其中該ROBO結構域還包含如下i)-vii)中的一項或多項：
    i)ROBO前免疫球蛋白樣1(ROBO前Ig1)，
    ii)ROBO免疫球蛋白樣結構域1和免疫球蛋白樣結構域2間的連接子(ROBO Ig1-2連接子)，
    iii)ROBO免疫球蛋白樣結構域2和免疫球蛋白樣結構域3間的連接子(ROBO Ig2-3連接子)，
    iv)ROBO免疫球蛋白樣結構域3(ROBO Ig3)，
    v)ROBO免疫球蛋白樣結構域3和免疫球蛋白樣結構域4間的連接子(ROBO Ig3-4連接子)，
    vi)ROBO免疫球蛋白樣結構域4(ROBO Ig4)，
    vii)ROBO免疫球蛋白樣結構域4後連接子(ROBO Ig4後連接子)；
    較佳地，i)-vii)中的ROBO為ROBO1或ROBO2；更佳地，
    ROBO前Ig1包含如SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列，
    ROBO Ig1-2連接子包含如SEQ ID NO：22或23所示的胺基酸序列，
    ROBO Ig2-3連接子包含如SEQ ID NO：26或27所示的胺基酸序列，
    ROBO Ig3包含如SEQ ID NO：28或29所示的胺基酸序列，
    ROBO Ig3-4連接子包含如SEQ ID NO：30或31所示的胺基酸序列，
    ROBO Ig4包含如SEQ ID NO：32或33所示的胺基酸序列，和/或，
    ROBO Ig4後連接子包含如SEQ ID NO：34或35所示的胺基酸序列。
  13. 如請求項10至12中任一項所述的蛋白，其中該ROBO結構域包含如式(II)所示的結構：
    [ROBO前Ig1]a-[ROBO2 Ig1]-[ROBO Ig1-2連接子]b-[ROBO Ig2]c-[ROBO Ig2-3連接子]d-[ROBO Ig3]e-[ROBOIg3-Ig4連接子]f-[ROBO Ig4]g-[ROBO Ig4後連接子]h 式(II)
    其中，-為肽鍵，a、b、c、d、e、f、g、h可以獨自的選自0或1。
  14. 如請求項10至13中任一項所述的蛋白，其還包含免疫球蛋白Fc區，
    較佳地，該Fc區為人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區；
    更佳地，當該免疫球蛋白Fc區為人IgG1的Fc區時，包含220S、234A、235A、237A的一個或多個突變；
    最佳地，該免疫球蛋白Fc區包含SEQ ID NO：37-39任一或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列。
  15. 如請求項14所述的蛋白，其中該ROBO結構域與該Fc區直接或藉由連接子連接；
    較佳地，該連接子為(GxS)y所示，其中，x選自1-5的整數，y選自1-6的整數；
    更佳地，該連接子為(G2S)2所示。
  16. 如請求項10至15中任一項所述的蛋白，其包含SEQ ID NOs：7-18任一或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列。
  17. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至16中任一項所述的蛋白。
  18. 一種載體，其包含或表達如請求項17所述的多核苷酸。
  19. 一種宿主細胞，其包含或表達請求項18所述的載體。
  20. 一種生產或製備如請求項1至16中任一項所述蛋白的方法，包括：
    培養如請求項19的宿主細胞；
    回收該蛋白，以及
    視需要地，分離和/或純化該蛋白。
  21. 一種醫藥組成物，其包含：
    如請求項1至16中任一項所述的蛋白、如請求項17所述的多核苷酸或如請求項18所述的載體；
    較佳地，該醫藥組成物進一步包含一種或多種藥學上可接受的載劑或賦形劑。
  22. 一種如請求項1至16中任一項所述的蛋白、如請求項17所述的多核苷酸或如請求項18所述的載體用於製備治療、預防疾病的藥物中的用途；
    較佳地，該疾病為ROBO-SLIT2信號通路異常上調的疾病；
    較佳地，該疾病為腎病；
    更佳地，該腎病為腎小球疾病、局部區段性腎小球硬化(FSGS)。
TW113134934A 2023-09-14 2024-09-13 包含robo結構域的蛋白及其醫藥用途 TW202511284A (zh)

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