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TW202505022A - 生產組織來源之上皮類器官之方法及其用途 - Google Patents

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TW202505022A
TW202505022A TW113122212A TW113122212A TW202505022A TW 202505022 A TW202505022 A TW 202505022A TW 113122212 A TW113122212 A TW 113122212A TW 113122212 A TW113122212 A TW 113122212A TW 202505022 A TW202505022 A TW 202505022A
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金柏莉 安 霍曼
盈庭 寇
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美商建南德克公司
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Abstract

本揭露提供了製備組織來源之上皮類器官之方法。特定而言，本揭露提供了嵌入在懸浮於培養基中之水凝膠中之組織來源之上皮類器官。本揭露進一步提供了使用此等類器官之方法。

Description

生產組織來源之上皮類器官之方法及其用途
本文所揭示之主題涉及組織來源之上皮類器官以及產生及使用此等類器官之方法。
組織來源之上皮類器官為三維 (3D) 多細胞橢球體，其重現 活體內組織之複雜性及功能，並已成為組織之生理相關 活體外模型。例如，腸類器官，也稱為“類腸 (enteroid)”或“類大腸 (colonoid)”，源自從原生腸組織 (primary intestinal tissue) 分離之成體幹細胞，並且可以輕鬆繁殖及冷凍保存以用於長期儲存。腸類器官可分化成各種腸細胞類型，進行上皮功能，諸如障壁維持、吸收、分泌及消化，並概括從其來源之患者之生物學特徵及臨床反應 (Clevers (2016) Cell 165, 1586–1597；Zachos 等人(2016) J Biol Chem 291, 3759–3766)。因此，許多腸類器官已被廣泛採用，取代傳統之轉化及永生化腸細胞株，從而產生基礎科學發現並促進在包括癌症生物學、傳染病及囊性纖維化的眾多領域中之轉化應用 (Clevers (2016)；Schutgens 及 Clevers (2019) Annu Rev Pathology Mech Dis 15, 1–24)。
組織來源之上皮類器官在諸如藥物開發等領域中的實施之挑戰係現有類器官培養技術難以規模化，需要繁瑣的手動方法或開發先進自動化基礎設施 (Louey 等人(2021) Slas Discov 26, 1138–1147)。在現有技術中，組織來源之上皮幹細胞 (從原生組織中分離或從已建立之類器官培養物中傳代) 係重懸於冷細胞外基質 (ECM) 溶液中，該溶液最常見為 CULTREX® 基底膜萃取物 (BME) 或 MATRIGEL® 水凝膠。將 ECM 沉積到盤表面上，然後溫熱以使 ECM 細胞溶液固化成表面接附之水凝膠圓頂，並以培養基覆蓋。每孔中之培養基每隔幾天更換一次，且類器官在 1-2 週時間內形成 (Mahe 等人Curr Protoc Mouse Biology 3, 217–240；Pleguezuelos‐Manzano 等人(2020) Curr Protoc Immunol 130, e106；Sato 等人(2009) Nature 459, 262–265；Sato 等人(2011) Gastroenterology 141, 1762–1772)。該技術難以規模化，因為它受到水凝膠圓頂形成可用表面積之限制，耗時且費力，並且容易出現使用者錯誤，並且水凝膠之擴散限制導致類器官生長及形態異質性 (Park 等人(2022) Nat Methods 19, 1449–1460；Ringel 等人(2020) Cell Stem Cell 26, 431-440.e8；Shin 等人(2020) iScience 23, 101372)。因此，本技術領域需要產生組織來源之上皮類器官之更有效及高生產量之方法。
本文所揭示之主題涉及組織來源之上皮類器官及產生此等類器官之方法。本揭露進一步提供了使用組織來源之上皮類器官之方法及用於進行本文所揭示之方法之系統。
在某些實施例中，產生組織來源之上皮類器官之方法包括 (a) 使組織來源之上皮幹細胞與水凝膠接觸以產生水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物，(b) 將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物懸浮在培養基中以產生經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物，以及 (c) 將該經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物在該培養基中培養以產生組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，使複數個組織來源之上皮幹細胞與該水凝膠接觸以產生該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。在某些實施例中，該方法進一步包括將該經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物碎片化以產生包含該組織來源之上皮類器官之碎片化結構。
在某些實施例中，該水凝膠係在與培養基接觸時 (upon contact) 固化。在某些實施例中，將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物懸浮在該培養基中包括將含有該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之分配裝置浸沒在該培養基中並將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物分配到該培養基中。在某些實施例中，該培養基之溫度為約 25℃ 至約 50℃。在某些實施例中，該培養基之溫度為約 30℃ 至約 50℃。在某些實施例中，該培養基之溫度為約 30℃ 至約 40℃。在某些實施例中，該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之溫度低於約 20℃。在某些實施例中，該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之溫度為約 2℃ 至約 25℃。在某些實施例中，該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之溫度為約 2℃ 至約 20℃。在某些實施例中，該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之溫度為約 2℃ 至約 10℃。
本揭露進一步提供了一種產生組織來源之上皮類器官之懸浮培養物之方法。在某些實施例中，該方法包括 (a) 將包含水凝膠及組織來源之上皮幹細胞之混合物引入到培養基中以產生經懸浮之混合物；以及 (b) 將該經懸浮之混合物在該培養基中培養以產生呈懸浮狀態之該等組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，引入到該培養基中之該混合物包含該水凝膠及複數個組織來源之上皮幹細胞。在某些實施例中，該方法包括 (a) 將包含水凝膠及複數個組織來源之上皮幹細胞之混合物引入到培養基中以產生經懸浮之混合物，以及 (b) 將該混合物在該培養基中培養以產生呈懸浮狀態之該等組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，該水凝膠係在與培養基接觸時固化。在某些實施例中，將該混合物引入該培養基中包含將含有該混合物之分配裝置浸沒在該培養基中並將該混合物分配到該培養基中。在某些實施例中，該培養基之溫度為約 25℃ 至約 50℃。在某些實施例中，該培養基之溫度為約 30℃ 至約 50℃。在某些實施例中，該培養基之溫度為約 25℃ 至約 40℃。在某些實施例中，該培養基之溫度為約 30℃ 至約 40℃。在某些實施例中，該混合物之溫度低於約 20℃。在某些實施例中，該混合物之溫度為約 2℃ 至約 25℃。在某些實施例中，該混合物之溫度為約 2℃ 至約 20℃。在某些實施例中，該混合物之溫度為約 2℃ 至約 10℃。在某些實施例中，該方法進一步包括將該經懸浮之混合物碎片化以產生包含該組織來源之上皮類器官之碎片化結構。
在某些實施例中，用於產生組織來源之上皮類器官之懸浮培養物之方法包括 (a) 使組織來源之上皮幹細胞與水凝膠接觸以產生水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物；(b) 將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物沉積到基材上；(c) 將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物固化以產生經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物；(d) 將該經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物懸浮在培養基中以產生經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物；以及 (e) 將該經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物在該培養基中培養以產生組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，使複數個組織來源之上皮幹細胞與該水凝膠接觸以產生該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。例如但不限於，該方法包括 (a) 使複數個組織來源之上皮幹細胞與水凝膠接觸以產生水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物，(b) 將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物沉積到基材上，(c) 將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物固化以產生經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物，(d) 將該經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物懸浮在培養基中以產生經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物，以及 (e) 將該經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物在該培養基中培養以產生組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，該方法進一步包括在將該經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物懸浮在該培養基中之前，將該經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物從該基材中取出。
在某些實施例中，將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物作為小滴沉積到該基材上。在某些實施例中，將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物沉積到該基材上以具有絲狀結構。在某些實施例中，該絲狀結構具有線形、蛇形或螺旋形形狀。在某些實施例中，該方法進一步包括將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物在該培養基中碎片化以產生包含該組織來源之上皮類器官之碎片化結構。
在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物、經懸浮之混合物或經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀包含大於約 0.1 mm 之長度、寬度及/或直徑。在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物、經懸浮之混合物或經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀包含約 0.1 mm 至約 1,000 mm ( 例如，約 0.1 mm 至約 20 mm) 之長度、寬度及/或直徑。在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物、經懸浮之混合物或經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物呈小滴形式。在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物、經懸浮之混合物或經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物具有絲狀結構。在某些實施例中，該絲狀結構具有線形、蛇形或螺旋形形狀。
在某些實施例中，該組織來源之上皮幹細胞或該等複數個組織來源之上皮幹細胞含在組織碎片、類器官碎片或其組合內。在某些實施例中，該組織來源之上皮幹細胞或該等複數個組織來源之上皮幹細胞分離自原生上皮組織。在某些實施例中，該組織來源之上皮幹細胞係獲自組織之碎片，該組織選自由以下所組成之群組：淚腺、扁桃腺、唾液腺、胃腸組織、甲狀腺、肺、乳腺、肝、膽管、胃、腎、胰臟、子宮內膜、輸卵管、子宮頸、前列腺、膀胱、卵巢、味蕾、胎盤及其組合。可替代地或另外，該組織來源之上皮幹細胞係獲自類器官之碎片，該類器官係選自由以下所組成之群組：淚腺類器官、扁桃腺類器官、唾液腺類器官、胃腸類器官、甲狀腺類器官、肺類器官、乳腺類器官、肝類器官、膽管類器官、胃類器官、腎類器官、胰臟類器官、子宮內膜類器官、輸卵管類器官、子宮頸類器官、前列腺類器官、膀胱類器官、卵巢類器官、味蕾類器官、滋胚內層類器官及其組合。
在某些實施例中，該等複數個組織來源之上皮幹細胞包含約 1 × 10 4個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠至約 1 × 10 7個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠。
在某些實施例中，該水凝膠係選自由以下所組成之群組：合成水凝膠、天然水凝膠及其組合。在某些實施例中，該天然水凝膠包含基底膜萃取物 (BME) 或細胞外基質 (ECM) 成分。在某些實施例中，該水凝膠具有大於約 1 mg/ml 之蛋白質濃度。在某些實施例中，該水凝膠包含以 w/v % 計大於約 1 w/v % 之 BME 組分、ECM 組分或聚合物。在某些實施例中，該水凝膠具有等於或大於損耗模數 G'' 之儲存模數 G'。
在某些實施例中，該培養基存在於容器中。在某些實施例中，該容器為培養皿、多孔盤、錐形管、貯器、培養袋、生物反應器或燒瓶。
本揭露進一步提供了一種藉由本文所揭示之方法產生之組織來源之上皮類器官。
在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官相比，藉由本揭露之方法產生之組織來源之上皮類器官具有均勻形態。在某些實施例中，該等參考組織來源之上皮類器官為嵌入在接附至基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官具有均勻尺寸。在某些實施例中，與該等參考組織來源之上皮類器官相比，該組織來源之上皮類器官之平均直徑更均勻。
在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體相比，幹細胞及/或增生標記物在藉由本揭露之方法產生之組織來源之上皮類器官之群體中以較高含量表現。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體相比，分化標記物在藉由本揭露之方法產生之組織來源之上皮類器官之群體中以較低含量表現。在某些實施例中，該等參考組織來源之上皮類器官為嵌入在接附至基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，該幹細胞及/或增生標記物選自由以下所組成之群組：MKI67、EpCAM、BMI1、CD49f、ASCL2、CD133、LGR5、SOX9、ALDH1A1、NEUROG3、NKX6.1、SMOC2、PDX1、CD44 及其組合。在某些實施例中，該分化標記物選自由以下所組成之群組：角蛋白 20 (KRT20)、FABP1、MUC2、MUC5B、MUC5AC、MUC6、TFF3、ALPI、SI、CEACAM7、角蛋白 19 (KRT19)、角蛋白 7 (KRT7)、SOX9、MUC1、INS、GCG、AMY、ALB、CYP3A4、HNF4A、細胞角蛋白 8 (K8)、細胞角蛋白 18 (K18)、細胞角蛋白 5 (K5)、細胞角蛋白 14 (K14)、平滑肌肌動蛋白 (SMA) 及其組合。
本揭露進一步提供了一種組成物，其包含組織來源之上皮類器官及培養基，其中該組織來源之上皮類器官嵌入在懸浮於該培養基中之水凝膠內。在某些實施例中，該水凝膠之幾何形狀包含大於約 0.1 mm 之長度、寬度及/或直徑。在某些實施例中，該水凝膠之幾何形狀包含約 0.1 mm 至約 1,000 mm ( 例如，約 0.1 mm 至約 20 mm) 之長度、寬度及/或直徑。在某些實施例中，該水凝膠為小滴。在某些實施例中，該水凝膠具有絲狀結構。在某些實施例中，該絲狀結構具有線形、蛇形或螺旋形形狀。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體相比，幹細胞及/或增生標記物在組織來源之上皮類器官之群體中以較高含量表現。在某些實施例中，該幹細胞及/或增生標記物選自由以下所組成之群組：MKI67、EpCAM、BMI1、CD49f、ASCL2、CD133、LGR5、SOX9、ALDH1A1、NEUROG3、NKX6.1、SMOC2、PDX1、CD44 及其組合。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體相比，分化標記物在上皮類器官群體中以較低含量表現。在某些實施例中，該分化標記物選自由以下所組成之群組：角蛋白 20 (KRT20)、FABP1、MUC2、MUC5B、MUC5AC、MUC6、TFF3、ALPI、SI、CEACAM7、角蛋白 19 (KRT19)、角蛋白 7 (KRT7)、SOX9、MUC1、INS、GCG、AMY、ALB、CYP3A4、HNF4A、細胞角蛋白 8 (K8)、細胞角蛋白 18 (K18)、細胞角蛋白 5 (K5)、細胞角蛋白 14 (K14)、平滑肌肌動蛋白 (SMA) 及其組合。在某些實施例中，該等參考組織來源之上皮類器官為嵌入在接附至基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。
本揭露進一步提供了一種用於篩選藥劑 ( 例如，治療劑) 之方法。在某些實施例中，該方法包括 (a) 使組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體或組織來源之上皮類器官之組成物與藥劑 ( 例如，治療劑) 接觸，以及 (b) 分析該組織來源之上皮類器官或該等組織來源之上皮類器官之群體中指示該藥劑 ( 例如，治療劑) 之有效性、流佈及/或毒性之變化。在某些實施例中，使該藥劑 ( 例如，治療劑) 與該組織來源之上皮類器官或該等組織來源之上皮類器官之群體接觸約 1 分鐘至約 3 年， 例如，約 15 分鐘至約 3 年。在某些實施例中，該藥劑為治療劑。在某些實施例中，該治療劑為基於多肽之治療劑、小分子治療劑、基於細胞之治療劑、基因編輯系統、基於核酸之治療劑或其組合。在某些實施例中，該變化為性質的變化，該性質選自由以下所組成之群組：細胞生存力、細胞代謝、氧化還原電位、細胞增生、細胞形態、類器官形態、類器官尺寸、蛋白質表現含量、核酸表現含量、核酸修飾、轉譯後修飾、細胞傳訊路徑之活化、細胞傳訊路徑之壓制、酵素活性、障壁完整性及其組合。
本揭露進一步提供了一種進行基因體篩選之方法。在某些實施例中，該方法包括 (a) 提供組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體或組織來源之上皮類器官之組成物，(b) 在該組織來源之上皮類器官之一個或多個細胞之基因體中產生突變，以及 (c) 分析該組織來源之上皮類器官或該等組織來源之上皮類器官之群體中與該突變相關之變化。在某些實施例中，該突變係使用基因調節系統產生的。在某些實施例中，該基因調節系統為基因編輯系統。在某些實施例中，該基因編輯系統為 CRISPR 系統。在某些實施例中，該變化為性質的變化，該性質選自由以下所組成之群組：細胞生存力、細胞代謝、氧化還原電位、細胞增生、細胞形態、類器官形態、類器官尺寸、蛋白質表現含量、核酸表現含量、核酸修飾、轉譯後修飾、細胞傳訊路徑之活化、細胞傳訊路徑之壓制、酵素活性、障壁完整性及其組合。
本揭露進一步提供了一種用於產生上皮細胞模型之方法。在某些實施例中，該方法包括 (a) 提供組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體或組織來源之上皮類器官之組成物，(b) 將該組織來源之上皮類器官或該等組織來源之上皮類器官之群體消化成單細胞，以及 (c) 將該單細胞在培養基中培養以產生細胞單層。在某些實施例中，將該單細胞在可滲透細胞培養內件 (cell culture insert) 上培養。在某些實施例中，該培養基為分化培養基。在某些實施例中，該培養基為細胞生長培養基。在某些實施例中，該培養基為幹細胞促進培養基。
本揭露進一步提供了一種使用藉由本文所述之方法產生之細胞單層之篩選方法。在某些實施例中，該篩選方法為用於篩選藥劑 ( 例如，治療劑) 之方法。例如但不限於，該方法可以包括 (a) 使藉由本文所述之方法產生之細胞單層與藥劑 ( 例如，治療劑) 接觸；以及 (b) 分析該細胞單層中指示該藥劑 ( 例如，治療劑) 之有效性、流佈及/或毒性之變化。在某些實施例中，使該藥劑 ( 例如，治療劑) 與該細胞單層接觸約 1 分鐘至約 3 年， 例如，約 15 分鐘至約 3 年。在某些實施例中，該藥劑為治療劑。在某些實施例中，該治療劑為基於多肽之治療劑、小分子治療劑、基於細胞之治療劑、基因編輯系統、基於核酸之治療劑或其組合。在某些實施例中，該篩選方法為基因體篩選。在某些實施例中，該進行基因體篩選之方法可包括 (a) 提供藉由如本文所述之方法產生之細胞單層；(b) 在該細胞單層之一個或多個細胞之基因體中產生突變；以及 (c) 分析該細胞單層中與該突變相關之變化。在某些實施例中，該突變係使用基因調節系統產生的。在某些實施例中，該基因調節系統為基因編輯系統。在某些實施例中，該基因編輯系統為 CRISPR 系統。在某些實施例中，該變化為性質的變化，該性質選自由以下所組成之群組：細胞生存力、細胞代謝、氧化還原電位、細胞增生、細胞形態、類器官形態、類器官尺寸、蛋白質表現含量、核酸表現含量、核酸修飾、轉譯後修飾、細胞傳訊路徑之活化、細胞傳訊路徑之壓制、酵素活性、障壁完整性及其組合。
在某些實施例中，本揭露之方法之一個或多個步驟可使用一個或多個機器人及/或自動化組件來進行。例如但不限於，如本文所述之產生組織來源之上皮類器官之方法、產生組織來源之上皮類器官之懸浮培養物之方法、篩選藥劑之方法、進行基因體篩選之方法、產生上皮細胞模型之方法及/或使用細胞單層之篩選方法之一個或多個步驟可使用一個或多個機器人及/或自動化組件來進行。在某些實施例中，一個或多個機器人及/或自動化組件選自由以下所組成之群組：液體處理機器人、3D 列印機、注射泵及其組合。在某些實施例中，該一個或多個機器人及/或自動化組件包含液體處理機器人。
本揭露進一步提供了用於培養組織來源之上皮類器官之系統。在某些實施例中，該系統包括組織來源之上皮類器官及培養基，其中該組織來源之上皮類器官嵌入在懸浮於該培養基中之水凝膠內。在某些實施例中，該水凝膠之幾何形狀包含大於約 0.1 mm 之長度、寬度及/或直徑。在某些實施例中，該水凝膠之幾何形狀包含約 0.1 mm 至約 1,000 mm ( 例如，約 0.1 mm 至約 20 mm) 之長度、寬度及/或直徑。在某些實施例中，該水凝膠為小滴。在某些實施例中，該水凝膠具有絲狀結構。在某些實施例中，該絲狀結構具有線形、蛇形或螺旋形形狀。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體相比，幹細胞及/或增生標記物在該等組織來源之上皮類器官之群體中以較高含量表現，其中該等參考組織來源之上皮類器官為嵌入在接附至基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，該幹細胞及/或增生標記物選自由以下所組成之群組：MKI67、EpCAM、BMI1、CD49f、ASCL2、CD133、LGR5、SOX9、ALDH1A1、NEUROG3、NKX6.1、SMOC2、PDX1、CD44 及其組合。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體相比，分化標記物在該等組織來源之上皮類器官之群體中以較低含量表現，其中該等參考組織來源之上皮類器官為嵌入在接附至基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，該分化標記物選自由以下所組成之群組：角蛋白 20 (KRT20)、FABP1、MUC2、MUC5B、MUC5AC、MUC6、TFF3、ALPI、SI、CEACAM7、角蛋白 19 (KRT19)、角蛋白 7 (KRT7)、SOX9、MUC1、INS、GCG、AMY、ALB、CYP3A4、HNF4A、細胞角蛋白 8 (K8)、細胞角蛋白 18 (K18)、細胞角蛋白 5 (K5)、細胞角蛋白 14 (K14)、平滑肌肌動蛋白 (SMA) 及其組合。在某些實施例中，該組織來源之上皮類器官係選自由以下所組成之群組：淚腺類器官、扁桃腺類器官、唾液腺類器官、胃腸類器官、甲狀腺類器官、肺類器官、乳腺類器官、肝類器官、膽管類器官、胃類器官、腎類器官、胰臟類器官、子宮內膜類器官、輸卵管類器官、子宮頸類器官、前列腺類器官、膀胱類器官、卵巢類器官、味蕾類器官、滋胚內層類器官及其組合。在某些實施例中，該系統包括用於產生及/或培養該組織來源之上皮類器官之一個或多個機器人及/或自動化組件。在某些實施例中，一個或多個機器人及/或自動化組件選自由以下所組成之群組：液體處理機器人、3D 列印機、注射泵及其組合。在某些實施例中，該一個或多個機器人及/或自動化組件包含液體處理機器人。
本揭露進一步提供了用於進行本文揭示之方法之系統。例如但不限於，本揭露提供了用於進行以下之系統：產生組織來源之上皮類器官之方法、產生組織來源之上皮類器官之懸浮培養物之方法、篩選藥劑之方法、進行基因體篩選之方法、產生上皮細胞模型之方法及/或使用細胞單層之篩選方法。在某些實施例中，該系統包括用於產生及/或培養該組織來源之上皮類器官之一個或多個機器人及/或自動化組件。在某些實施例中，一個或多個機器人及/或自動化組件選自由以下所組成之群組：液體處理機器人、3D 列印機、注射泵及其組合。在某些實施例中，該一個或多個機器人及/或自動化組件包含液體處理機器人。
相關申請之交叉引用
本申請案主張 2023 年 6 月 14 日提交之美國臨時申請案第 63/508,132 號之優先權，該申請案之內容以引用方式全文併入本文中。
本揭露提供了於懸浮培養物中之組織來源之上皮類器官以及產生此等組織來源之上皮類器官之方法。本文所揭示之方法使得能夠產生大規模類器官培養物，而不需要繁瑣手動操作、專用設備或自動化。藉由在經懸浮之水凝膠而非習用表面接附之水凝膠圓頂中生長類器官細胞，可顯著增加水凝膠體積，且因此可顯著增加可在培養容器中生長之類器官細胞之數量。此外，由於目前所揭示之方法不需要將水凝膠沉積在二維 (2D) 表面上，因此該方法與各種培養容器 ( 例如培養瓶及培養袋) 相容，這允許進一步培養規模化，從而實現高生產量。
目前所揭示之方法允許使用各種幾何形狀之經懸浮水凝膠，這可以加快實際培養物製備時間。此外，由於類器官處於懸浮狀態，因此可以在培養過程中在不同時間對它們進行取樣、分割或收集，這對於固定在盤中之習用類器官培養物來說係困難的。如實例 1 所示，類器官在經懸浮之 BME 水凝膠中的生長比在習用表面接附之水凝膠圓頂中更均勻，在習用表面接附之水凝膠圓頂中，有限分子擴散導致營養素梯度 (Park 等人(2022)；Shin 等人(2020))。本文所揭示之經懸浮之水凝膠培養方法產生更適合高生產量研究之組織來源之上皮類器官模型，這將有利於基礎科學及轉化領域二者。
為求清楚，但不作為限制，將本文所揭示之主題之詳細描述分為以下小節： I.        定義； II.      類器官及其組成物； III.     生產類器官之方法； IV.     使用方法； V.      系統；以及 VI.     示例性實施例 I. 定義
除非另有定義，否則本文所用之全部技術及科學術語具有與一般熟習本揭露之主題所屬技術者通常所瞭解之含義相同之含義。下列參考文獻提供技術人員本揭露中所使用的許多術語之一般定義：Singleton 等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (第 2 版，1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker 編，1988)；The Glossary of Genetics，第 5 版，R. Rieger 等人(編)，Springer Verlag (1991)；以及 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。如本文所用，除非另有說明，否則以下術語具有以下賦予其等之含義。
如本文所用，當「一」或「一種」一詞之使用與請求項及/或說明書中之術語「包含」結合使用時，其可意指「一個」，但亦與「一個或多個」、「至少一個」及「一個或大於一個」之含義一致。
術語「約」或「大約」意指特定值處於本技術領域中具有通常知識者所判定之可接受之誤差範圍內，其部分地取決於如何測量或判定該值， 即，取決於測量系統之局限性。例如，按照本技術領域中之實務，「約」可意指 3 倍內或 3 倍以上之標準偏差。可替代地，「約」可意指給定值之至多 20%、較佳至多 10%、更佳至多 5% 並且更佳至多 1% 之範圍。可替代地，特別為關於生物系統或過程，該術語意指數值之一個數量級內， 例如在數值之 5 倍以內，或在數值之 2 倍以內。
本文中之術語「抗體」以最廣義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體 ( 例如，雙特異性抗體) 以及抗體片段，只要其等展示出預期抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體以外之分子，其包含結合完整抗體所結合抗原之完整抗體之一部分。抗體片段之實例包括但不限於 Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab') 2、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體分子 ( 例如，scFv) 及由抗體片段形成之多特異性抗體。
如本文所用，術語「培養基 (culture medium)」或「培養基 (medium)」係指液體，其覆蓋培養容器 (諸如培養瓶及多孔盤) 中之細胞並含有滋養細胞之營養素。在某些實施例中，培養基亦可包括生長因子或分化因子以在細胞中產生所需變化。
如本文所用，術語「包含」、「包括」、「具有 (having、has)」、「可」、「含有」及其變異體意欲為不排除其他行為或結構之開放式連接詞 (open-ended transitional phrase)、術語、或字。本揭露亦涵蓋「包含」本文所呈現之實施例或元件、「由其組成」及「基本上由其組成」之本文所呈現之實施例或元件，無論是否明確陳述。
如本文所用，術語使細胞與化合物 例如治療劑「接觸」係指將細胞曝露於化合物，例如將化合物置於允許其接觸細胞之位置。接觸可使用任何合適方法來完成。例如但不限於，「接觸」可藉由將化合物添加到含有細胞之容器中來完成。接觸也可藉由將化合物添加到包含細胞之培養基中來完成。在某些實施例中，「接觸」係指將細胞 ( 例如組織來源之上皮類器官內或細胞單層中之細胞) 曝露於藥劑或化合物中。在某些實施例中，「接觸」係指將組織來源之上皮類器官或細胞單層曝露於潛在治療劑或所關注的治療劑中。
如本文所用，術語「來源自」或「建立自」或「分化自」當提及本文所揭示之任何細胞時，係指使用任何操作獲自細胞株、組織 (諸如解離組織) 或流體中之 ( 例如，經分離或純化的) 親代細胞之細胞。此等操作之非限制性實例包括單細胞分離、 活體外培養、使用 例如蛋白質、化學物質、輻射、病毒感染及核酸轉染之處理及/或誘變。在某些實施例中，可以藉由對生長因子、細胞介素、細胞介素治療之選定進程、黏附性、缺乏黏附性、分選程序或其組合之反應從混合群體中選擇來源細胞。
術語「檢測 (detection)」或「檢測 (detecting)」包括任何檢測手段，包括直接及間接檢測。
如本文所用，術語「小滴」當提及幾何形狀使用時係指球形或類球形形狀。
如本文所用，術語「嵌入」或「嵌入的」係指至少部分覆蓋或包圍細胞。在某些實施例中，如本文使用，術語「嵌入」或「嵌入的」係指 例如以水凝膠完全覆蓋或包圍組織來源之上皮類器官。
如本文所用，術語「表現 (expression)」或「表現 (express)」係指核苷酸序列之轉錄及/或轉譯。
術語「表現載體」用於表示線性或環狀之核酸分子，其中可以整合適當尺寸之另一核酸序列片段。此等核酸片段可包括提供由核酸序列片段編碼之基因轉錄之額外區段。額外區段可包括但不限於：啟動子、轉錄終止子、增強子、內部核醣體進入位點、非轉譯區、聚腺苷酸化訊號、可選擇標記物、複製起點等，如本技術領域已知的。表現載體通常來源自質粒、黏粒及病毒載體；載體通常為含有來自多種來源之核酸序列之重組分子。
如本文所用，術語「胃腸」係指口腔黏膜、咽 (喉)、食道、胃、小腸、大腸及直腸。
如本文所用，術語「胃腸幹細胞」係指胃腸系統之幹細胞。
如本文所用，術語「受試者」或「個體」係指脊椎動物或無脊椎動物，諸如人類或非人類動物，例如哺乳動物。哺乳動物包括但不限於人類、非人類靈長類動物、農場動物、競賽動物、囓齒動物及寵物。非人類動物個體之非限制性實例包括囓齒動物，諸如小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、兔、狗、貓、綿羊、豬、山羊、牛、馬、猿及猴。在某些實施例中，受試者或個體為人類。
如本文所用，術語「腸的」或「腸」係指直腸、小腸及大腸。
如本文所用，術語「腸幹細胞」係指腸之幹細胞。
如本文所用，術語「 活體外」係指人工環境及在人工環境內發生之過程或反應。 活體外環境例如但不限於細胞培養物。
如本文所用，術語「 活體內」係指自然環境 ( 例如，動物或細胞) 及在自然環境中發生之過程或反應。
如本文所用，術語「線性」當提及幾何形狀使用時係指類似於線之形狀。在某些實施例中，該線可以為直線、曲線或任何形狀之線。
如本文所用，提及細胞 例如胃腸幹細胞之術語「經分離」係指已與其自然環境組分分離之細胞。
如本文所用，「標記物」係指允許直接或間接檢測之藥劑。標記物包括但不限於螢光組成物、顯色標記、電子緻密標記、化學發光標記及放射性標記。標記物之非限制性實例包括綠色螢光蛋白 (「GFP」)、mCherry、dtTomato 或本技術領域中已知之其他螢光蛋白 (例如，Shaner 等人, A Guide to Choosing Fluorescent Proteins, Nature Methods 2(12):905-909 (2005)，藉由引用併入本文)， 32P、 14C、 125I、 3H 及 131I、螢光團 (諸如稀土螯合物或螢光黃及其衍生物)、玫瑰紅 (rhodamine) 及其衍生物，丹磺醯 (dansyl)，繖形酮 (umbelliferone)、螢光素酶 (諸如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素純酶) (美國專利第 4,737,456 號)、螢光素、2,3-二氫呔𠯤二酮，以及產生可檢測訊號之酶， 例如山葵過氧化酶 (horseradish peroxidase, HRP)、鹼性磷酸酶、β 半乳糖苷酶、葡萄糖澱粉酶、溶菌酶、碳水化合物氧化酶 (諸如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶 (G6PD)) 及雜環氧化酶 (諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶)。
術語「核酸」或「多核苷酸」包括任何包含核苷酸聚合物之化合物及/或物質。各核苷酸由鹼基具體而言嘌呤或嘧啶鹼基 (即，胞嘧啶 (C)、鳥嘌呤 (G)、腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶 (T) 或尿嘧啶 (U))、糖 (即，去氧核糖或核糖) 及磷酸基團構成。通常，核酸分子藉由鹼基序列進行描述，其中該等鹼基代表核酸分子之一級結構 (線性結構)。鹼基序列通常由 5' 至 3' 表示。術語核酸包括：去氧核糖核酸 (DNA)，包括例如，互補 DNA (cDNA) 及基因體 DNA；核糖核酸 (RNA)，例如訊息 RNA (mRNA)；DNA 或 RNA 之合成形式；以及包含這些分子中之兩者或更多者之混合聚合物。核酸分子可為線性或環狀的。此外，術語核酸包括有義股及反義股兩者，以及單股及雙股形式。此外，本文所述之核酸可含有天然存在或非天然存在之核苷酸。非天然存在之核苷酸之實例包括帶有衍生糖、磷酸鹽主鏈鍵結或化學修飾殘基之經修飾之核苷酸鹼基。
術語“可操作地連接”，當應用於核酸序列時，例如表現載體中之核酸序列時，表示序列被排列使得它們協同發揮作用以實現其預期目的， 即，啟動子序列允許起始轉錄，該轉錄藉由鏈接編碼序列開展直至終止訊號。
如本文所用，術語「類器官」係指藉由幹細胞 ( 例如成體幹細胞) 之擴增而獲得之三維細胞結構，該幹細胞自組織並可分化成功能細胞類型。 參見Corro 等人(2020) Am. J. Physiol.Cell Physiol.319:C151-C165。
如本文所用，術語「複數」係指數量大於一個。在某些實施例中，術語「複數個組織來源之上皮幹細胞」係指數量大於一個之組織來源之上皮幹細胞。例如但不限於，複數個組織來源之上皮幹細胞包括至少兩個組織來源之上皮幹細胞。在某些非限制性實施例中，複數個組織來源之上皮幹細胞可包括至少約 10 個、至少約 100 個、至少約 200 個、至少約 300 個、至少約 400 個、至少約 500 個、至少約 600 個、至少約 700 個、至少約 800 個、至少約 900 個、至少約 1000 個、至少約 5,000 個、至少約 10,000 個、至少約 100,000 個、至少約 1,000,000 個、至少約 10,000,000 個、至少約 100,000,000 個或至少約 1,000,000,000 個組織來源之上皮幹細胞。
如本文所用，術語「組織來源之上皮類器官之群體」係指至少兩種組織來源之上皮類器官之群組。在某些實施例中，「組織來源之上皮類器官之群體」係指藉由相同方法產生之組織來源之上皮類器官之群組。在某些非限制性實施例中，組織來源之上皮類器官之群體可包括至少約 10 個、至少約 100 個、至少約 200 個、至少約 300 個、至少約 400 個、至少約 500 個、至少約 600 個、至少約 700 個、至少約 800 個、至少約 900 個、至少約 1000 個、至少約 5,000 個、至少約 10,000 個、至少約 100,000 個、至少約 1,000,000 個、至少約 10,000,000 個、至少約 100,000,000 個或至少約 1,000,000,000 個組織來源之上皮類器官。
如本文所用，術語「增生」係指細胞數量之增加。
如本文所使用，術語「啟動子」表示基因內之區域，轉錄因子及/或 RNA 聚合酶可與其結合以控制相關編碼序列之表現。啟動子通常 (但並非經常) 位於轉譯起始密碼子上游之基因 5' 非編碼區。基因之啟動子區可包括充當核酸結合蛋白之序列特異性核酸結合結構域之可辨識結合位點之一個或多個共同序列。然而，此等結合位點也可位於啟動子外部之區域中，例如位於內含子中或編碼序列下游之增強子區域中。
如本文所用，術語「固化」或「凝固的」係指物質之硬化、增稠、聚合及/或剛性增加。
如本文所用，術語“蛇形”當提及幾何形狀使用時係指蛇形形狀。
如本文所用，術語“螺旋”當提及幾何形狀使用時係指圍繞中心點或圍繞軸線螺旋之連續曲線。
如本文所用，術語「子集」係指大量材料中之一小部分。
如本文所用，「組織來源之上皮幹細胞」係指獲自組織之上皮幹細胞。在某些實施例中，組織來源之上皮幹細胞不包括富潛能幹細胞 ( 例如，誘導富潛能幹細胞 (iPSC) 及胚胎幹細胞 (ESC))。
如本文所用，「治療」為用於獲得有益或期望結果包括臨床結果之方法。為本主題之目的，有益或期望臨床結果包括但不限於減輕或改善一種或多種體徵或症狀、減小疾病程度、穩定 ( 即，不惡化) 疾病狀態、預防疾病、延遲或減緩疾病進展、緩解疾病 ( 例如癌症) 及/或改善或減輕疾病狀態。該降低可為併發症、體徵或症狀之嚴重程度或進展至另一等級之可能性的至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98% 或 99% 降低。在某些實施例中，「治療」亦可指抑制癌症之增生或進展至更高等級至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98% 或 99%。 II. 類器官及其組成物
本揭露提供了組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官嵌入在不接附於基材 ( 例如培養容器之基材) 之水凝膠中。本揭露進一步提供了包括此等類器官之組成物。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官藉由本文所揭示之方法產生， 例如第 III 節中所揭示之方法。
在某些實施例中，本揭露提供了包括組織來源之上皮類器官及培養基之組成物，其中組織來源之上皮類器官嵌入在水凝膠內。在某些實施例中，水凝膠不接附於基材表面， 例如細胞培養皿及/或多孔盤之表面。在某些實施例中，嵌入在水凝膠內之組織來源之上皮類器官懸浮在培養基中。
在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為淚腺類器官、扁桃腺類器官、唾液腺類器官、胃腸類器官、甲狀腺類器官、肺類器官、乳腺類器官、肝類器官、膽管類器官、胃類器官、腎類器官、胰臟類器官、子宮內膜類器官、輸卵管類器官、子宮頸類器官、前列腺類器官、膀胱類器官、卵巢類器官、味蕾類器官或滋胚內層類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為淚腺類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為扁桃腺類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為唾液腺類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為胃腸類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為甲狀腺類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為肺類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為乳腺類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為肝類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為膽管類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為胃類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為腎類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為胰臟類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為子宮內膜類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為輸卵管類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為子宮頸類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為前列腺類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為膀胱類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為卵巢類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為味蕾類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為滋胚內層類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官選自由以下所組成之群組：肺類器官、胃腸類器官、肝類器官、胰臟類器官、乳腺類器官及其組合。
在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為肺類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為肺泡 II 型 (ATII) 類器官。
在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為胃腸類器官。在某些實施例中，胃腸類器官為腸類器官。例如但不限於，組織來源之上皮類器官為大腸或迴腸類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為大腸類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為迴腸類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為直腸類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為食道類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為口腔顎面類器官。在某些實施例中，胃腸類器官包含杯狀細胞及腸上皮細胞。
在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為乳腺類器官。
在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為胰臟類器官。在某些實施例中，胰臟類器官包含導管細胞， 例如，如實例 6 所揭示的。
在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為肝類器官。在某些實施例中，肝類器官包含肝細胞， 例如，如實例 7 所揭示的。
在某些實施例中，本揭露之組成物可包括一種或多種不同類型之組織來源之上皮類器官。例如但不限於，本揭露之組成物可包括大腸及迴腸類器官。在某些實施例中，本揭露之組成物可包括肝及膽管類器官。
在某些實施例中，本揭露之組成物包括約 1 個或多個嵌入懸浮於培養基中之水凝膠內之組織來源之上皮類器官， 例如約 2 個或更多個、約 5 個或更多個、約 10 個或更多個、約 50 個或更多個、約 100 個或更多個、約 500 個或更多個、約 1,000 個或更多個、約 5,000 個或更多個、約 10,000 個或更多個、約 50,000 個或更多個、約 100,000 個或更多個、約 500,000 個或更多個、約 1,000,000 個或更多個、約 10,000,000 個或更多個、約 100,000,000 個或更多個或約 1,000,000,000 個或更多個嵌入懸浮於培養基中之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，本揭露之組成物包括約 50 個或更多個嵌入懸浮於培養基中之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，本揭露之組成物包括約 100 個或更多個嵌入懸浮於培養基中之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，本揭露之組成物包括約 1,000 個或更多個嵌入懸浮於培養基中之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，本揭露之組成物包括約 5,000 個或更多個嵌入懸浮於培養基中之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，本揭露之組成物包括約 10,000 個或更多個嵌入懸浮於培養基中之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，本揭露之組成物包括約 100,000 個或更多個嵌入懸浮於培養基中之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，本揭露之組成物包括約 500,000 個或更多個嵌入懸浮於培養基中之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，本揭露之組成物包括約 1,000,000 個或更多個嵌入懸浮於培養基中之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，本揭露之組成物包括約 10,000,000 個或更多個嵌入懸浮於培養基中之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，本揭露之組成物包括約 100,000,000 個或更多個嵌入懸浮於培養基中之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。
在某些實施例中，水凝膠為三維 (3D) 支架。在某些實施例中，水凝膠由在大於約 10℃ 之溫度固化之材料構成。例如但不限於，水凝膠由在大於約 15℃、大於約 20℃、大於約 25℃、大於約 30℃、大於約 35℃、大於約 40℃、大於約 45℃ 或大於約 50℃ 之溫度固化之材料構成。在某些實施例中，水凝膠由在大於約 25℃ 之溫度固化之材料構成。在某些實施例中，水凝膠由在大於約 30℃ 之溫度固化之材料構成。在某些實施例中，水凝膠由在大於約 35℃ 之溫度固化之材料構成。在某些實施例中，水凝膠由在大於約 40℃ 之溫度固化之材料構成。在某些實施例中，水凝膠由在大於約 45℃ 之溫度固化之材料構成。在某些實施例中，水凝膠由在大於約 50℃ 之溫度固化之材料構成。在某些實施例中，水凝膠由在約 25℃ 至約 50℃ 之溫度固化之材料構成。在某些實施例中，水凝膠由在約 25℃ 至約 40℃ 之溫度固化之材料構成。在某些實施例中，水凝膠由在約 30℃ 至約 50℃ 之溫度固化之材料構成。在某些實施例中，水凝膠由在約 30℃ 至約 40℃， 例如約 37℃ 之溫度固化之材料構成。
在某些實施例中，水凝膠為合成水凝膠、天然水凝膠或其組合。在某些實施例中，水凝膠為合成水凝膠。在某些實施例中，水凝膠為天然水凝膠。在某些實施例中，水凝膠可為合成水凝膠及天然水凝膠之混合物。在某些實施例中，水凝膠不包括化學交聯之蛋白質及/或聚合物。
在某些實施例中，水凝膠為天然水凝膠。在某些實施例中，天然水凝膠包括一種或多種天然存在組分。例如但不限於，天然水凝膠可包括一種或多種蛋白質， 例如醣蛋白及/或多醣。醣蛋白之非限制性實例包括膠原蛋白 ( 例如，I 型膠原蛋白、II 型膠原蛋白、III 型膠原蛋白、IV 型膠原蛋白、V 型膠原蛋白、VI 型膠原蛋白、VII 型膠原蛋白、VIII 型膠原蛋白、IX 型膠原蛋白、X 型膠原蛋白、 XI 型膠原蛋白及/或 XII 型膠原蛋白)、纖維連接蛋白、巢蛋白、腱生蛋白、玻連蛋白、纖網蛋白、透明質酸及層連結蛋白。在某些實施例中，天然水凝膠可進一步包括一種或多種組分，諸如但不限於多醣、水及/或彈性蛋白。在某些實施例中，本揭露之天然水凝膠包括層連結蛋白、巢蛋白及 IV 型膠原蛋白。在某些實施例中，本揭露之天然水凝膠包括層連結蛋白、巢蛋白、IV 型膠原蛋白及硫酸肝素蛋白聚醣。在某些實施例中，天然水凝膠包括由上皮細胞、內皮細胞、壁內胚層樣細胞及/或結締組織細胞分泌及/或來源之細胞外基質 (ECM)。
在某些實施例中，水凝膠為合成水凝膠。合成水凝膠之非限制性實例包括合成聚合物，諸如普羅結合蛋白 (ProNectin) (Sigma Z378666)、聚乙二醇 (PEG)、聚(甲基丙烯酸羥乙酯)、聚(乙烯亞胺)及聚乙烯醇 (PVA)。中揭示了合成水凝膠及此等合成水凝膠之聚合物之額外非限制性實例揭示於 Unal 及 West (2020) Bioconjugate Chem.31(10):2253-2271；以及 Madduma-Bandarage 及 Madihally (2020) J. of Applied Polymer Science 138(19):e50376 中，各篇之內容以引用方式全文併入本文中。
在某些實施例中，本揭露之水凝膠不包括藻酸鹽。
在某些實施例中，水凝膠可為商業可獲得之 ECM。商業可獲得之 ECM 之非限制性實例包括 ECM 蛋白及來自 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 小鼠肉瘤細胞之基底膜製劑。在某些實施例中，ECM 為 MATRIGEL™ (BD Biosciences)，其包括層連結蛋白、巢蛋白及膠原蛋白 IV。在某些實施例中，ECM 為基底膜萃取物 (BME)，其為基底膜之可溶性形式。BME 之非限制性實例為 CULTREX® 基底膜萃取物 2 型 (R&D Systems)，包括層連結蛋白、巢蛋白、膠原蛋白 IV 及硫酸肝素蛋白聚醣。
在某些實施例中，水凝膠具有大於約 0.7 mg/ml 之蛋白質濃度， 例如醣蛋白濃度。在某些實施例中，水凝膠具有大於約 1 mg/ml 之蛋白質濃度， 例如醣蛋白濃度。在某些實施例中，水凝膠具有大於約 2 mg/ml 之蛋白質濃度， 例如醣蛋白濃度。在某些實施例中，該水凝膠具有大於約 3 mg/ml 之蛋白質濃度。在某些實施例中，該水凝膠具有大於約 4 mg/ml 之蛋白質濃度。在某些實施例中，該水凝膠具有大於約 5 mg/ml 之蛋白質濃度。在某些實施例中，水凝膠具有大於約 6 mg/ml、大於約 7 mg/ml、大於約 8 mg/ml、大於約 9 mg/ml或大於約 10 mg/ml 之蛋白質濃度。在某些實施例中，水凝膠具有約 0.7 mg/ml 至約 10 mg/ml 之蛋白質濃度。在某些實施例中，水凝膠具有約 1 mg/ml 至約 10 mg/ml 之蛋白質濃度。在某些實施例中，水凝膠具有約 5 mg/ml 至約 10 mg/ml 之蛋白質濃度。在某些實施例中，水凝膠具有約 6 mg/ml 至約 10 mg/ml 之蛋白質濃度。在某些實施例中，水凝膠具有不小於 0.7 mg/ml 之蛋白質濃度。在某些實施例中，水凝膠具有不小於 1 mg/ml 之蛋白質濃度。在某些實施例中，水凝膠具有不小於 5 mg/ml 之蛋白質濃度。在某些實施例中，水凝膠具有不小於 6 mg/ml 之蛋白質濃度。
在某些實施例中，水凝膠包含以 w/v % 計大於約 1 w/v % 之 BME 組分、ECM 組分或聚合物。 例如但不限於，水凝膠包含以 w/v % 計大於約 1 w/v %、大於約 1.5 w/v %、大於約 2 w/v %、大於約 2.5 w/v %、大於約 3 w/v %、大於約 3.5 w/v %、大於約 4 w/v %、大於約 4.5 w/v %、大於約 5 w/v %、大於約 5.5 w/v %、大於約 6 w/v %、大於約 6.5 w/v %、大於約 7 w/v %、大於約 7.5 w/v %、大於約 8 w/v %、大於約 8.5 w/v %、大於約 9 w/v %、大於約 9.5 w/v %、大於約 10 w/v %、大於約 10.5 w/v %、大於約 11 w/v %、大於約 11.5 w/v %、大於約 12 w/v %、大於約 12.5 w/v %、大於約 13 w/v %、大於約 13.5 w/v %、大於約 14 w/v %、大於約 14.5 w/v %、大於約 15 w/v %、大於約 15.5 w/v %、大於約 16 w/v %、大於約 16.5 w/v %、大於約 17 w/v %、大於約 17.5 w/v %、大於約 18 w/v %、大於約 18.5 w/v %、大於約 19 w/v %、大於約 19.5 w/v % 或大於約 20 w/v % 之 BME 組分、ECM 組分或聚合物。在某些實施例中，水凝膠包含以 w/v % 計約 1 w/v % 至約 10 w/v % 之 BME 組分、ECM 組分或聚合物。在某些實施例中，水凝膠包含以 w/v % 計約 2 w/v % 至約 10 w/v % 之 BME 組分、ECM 組分或聚合物。在某些實施例中，水凝膠包含以 w/v % 計約 5 w/v % 至約 10 w/v % 之 BME 組分、ECM 組分或聚合物。
在某些實施例中，該水凝膠具有等於或大於損耗模數 G'' 之儲存模數 G'。
在某些實施例中，包含組織來源之上皮類器官並懸浮於培養基中之水凝膠具有幾何形狀。在某些實施例中，水凝膠之幾何形狀具有大於約 0.1 mm 之長度、寬度及/或直徑。在某些實施例中，水凝膠之幾何形狀具有大於約 0.1 mm之長度。在某些實施例中，水凝膠之幾何形狀具有大於約 0.1 mm之寬度。在某些實施例中，水凝膠之幾何形狀具有大於約 0.1 mm 之直徑。例如但不限於，水凝膠之幾何形狀具有大於約 0.5 mm、大於約 1 mm、大於約 1.5 mm、大於約 2 mm、大於約 2.5 mm、大於約 3 mm、大於約 3.5 mm、大於約 4 mm、大於約 4.5 mm、大於約 5 mm、大於約 5.5 mm、大於約 6 mm、大於約 6.5 mm、大於約 7.5 mm、大於約 8 mm、大於約 8.5 mm、大於約 9 mm、大於約 9.5 mm、大於約 10 mm、大於約 10.5 mm、大於約 11 mm、大於約 11.5 mm、大於約 12 mm、大於約 12.5 mm、大於約 13 mm、大於約 13.5 mm、大於約 14 mm、大於約 14.5 mm、大於約 15 mm、大於約 15.5 mm、大於約 16 mm、大於約 16.5 mm、大於約 17.5 mm、大於約 18 mm、大於約 18.5 mm、大於約 19 mm、大於約 19.5 mm、大於約 20 mm、大於約 50 mm、大於約 100 mm、大於約 150 mm、大於約 200 mm、大於約 250 mm、大於約 300 mm、大於約 350 mm、大於約 400 mm、大於約 450 mm、大於約 500 mm、大於約 550 mm、大於約 600 mm、大於約 650 mm、大於約 700 mm、大於約 750 mm、大於約 800 mm、大於約 850 mm、大於約 900 mm、大於約 950 mm 或大於約 1,000 mm 之長度、寬度及/或直徑。
在某些實施例中，水凝膠之幾何形狀具有約 0.1 mm 至約 1000 mm， 例如，約 0.1 mm 至約 500 mm、約 0.1 mm 至約 100 mm、約 0.1 mm 至約 50 mm、約 0.1 mm 至約 20 mm、約 0.1 mm 至約 10 mm、約 1 mm 至約 1000 mm、約 20 mm 至約 1000 mm、約 50 mm 至約 1000 mm、約 100 mm 至約 1000 mm、約 500 mm 至約 1000 mm、約 1 mm 至約 100 mm 或約 1 mm 至約 50 mm 之長度、寬度及/或直徑。在某些實施例中，水凝膠之幾何形狀具有約 0.1 mm 至約 20.0 mm 之長度、寬度及/或直徑。在某些實施例中，水凝膠之幾何形狀具有約 0.1 mm 至約 20.0 mm 之長度。在某些實施例中，水凝膠之幾何形狀具有約 0.1 mm 至約 20.0 mm 之寬度。在某些實施例中，水凝膠之幾何形狀具有約 0.1 mm 至約 20.0 mm 之直徑。例如但不限於，水凝膠之幾何形狀具有約 0.1 mm 至約 19 mm、約 0.1 mm 至約 18 mm、約 0.1 mm 至約 17 mm、約 0.1 mm 至約 16 mm、約 0.1 mm 至約 15 mm、約 0.1 mm 至約 14 mm、約 0.1 mm 至約 13 mm、約 0.1 mm 至約 12 mm、約 0.1 mm 至約 11 mm、約 0.1 mm 至約 10 mm、約 0.1 mm 至約 9 mm、約 0.1 mm 至約 8 mm、約 0.1 mm 至約 7 mm、約 0.1 mm 至約 6 mm、約 0.1 mm 至約 5 mm、約 0.1 mm 至約 4 mm、約 0.1 mm 至約 3 mm、約 0.1 mm 至約 2 mm、約 0.1 mm 至約 1 mm、約 0.5 mm 至約 20 mm、約 1 mm 至約 20 mm、約 2 mm 至約 20 mm、約 3 mm 至約 20 mm、約 4 mm 至約 20 mm、約 5 mm 至約 20 mm、約 6 mm 至約 20 mm、約 7 mm 至約 20 mm、約 8 mm 至約 20 mm、約 9 mm 至約 20 mm、約 10 mm 至約 20 mm、約 11 mm 至約 20 mm、約 12 mm 至約 20 mm、約 13 mm 至約 20 mm、約 14 mm 至約 20 mm、約 15 mm 至約 20 mm、約 16 mm 至約 20 mm、約 17 mm 至約 20 mm、約 18 mm 至約 20 mm、約 19 mm 至約 20 mm、約 1 mm 至約 15 mm、約 1 mm 至約 10 mm、約 1 mm 至約 5 mm 或約 1 mm 至約 4 mm 之長度、寬度及/或直徑。在某些實施例中，水凝膠之幾何形狀具有約 0.1 mm 至約 1 mm 之長度、寬度及/或直徑。在某些實施例中，水凝膠之幾何形狀具有約 0.1 mm 至約 4 mm 之長度、寬度及/或直徑。在某些實施例中，水凝膠之幾何形狀具有約 0.1 mm 至約 5 mm 之長度、寬度及/或直徑。在某些實施例中，水凝膠之幾何形狀具有約 1 mm 至約 20 mm 之長度、寬度及/或直徑。在某些實施例中，水凝膠之幾何形狀具有約 1 mm 至約 10 mm 之長度、寬度及/或直徑。在某些實施例中，水凝膠之幾何形狀具有約 1 mm 至約 5 mm 之長度、寬度及/或直徑。在某些實施例中，水凝膠之幾何形狀具有約 1 mm 至約 4 mm 之長度、寬度及/或直徑。
在某些實施例中，懸浮於培養基中之水凝膠之幾何形狀為小滴， 例如，如圖6 所示。在某些實施例中，水凝膠小滴具有約 0.1 mm 至約 20 mm， 例如，約 0.1 mm 至約 19 mm、約 0.1 mm 至約 18 mm、約 0.1 mm 至約 17 mm、約 0.1 mm 至約 16 mm、約 0.1 mm 至約 15 mm、約 0.1 mm 至約 14 mm、約 0.1 mm 至約 13 mm、約 0.1 mm 至約 12 mm、約 0.1 mm 至約 11 mm、約 0.1 mm 至約 10 mm、約 0.1 mm 至約 9 mm、約 0.1 mm 至約 8 mm、約 0.1 mm 至約 7 mm、約 0.1 mm 至約 6 mm、約 0.1 mm 至約 5 mm、約 0.1 mm 至約 4 mm、約 0.1 mm 至約 3 mm、約 0.1 mm 至約 2 mm、約 0.1 mm 至約 1 mm、約 0.5 mm 至約 20 mm、約 1 mm 至約 20 mm、約 2 mm 至約 20 mm、約 3 mm 至約 20 mm、約 4 mm 至約 20 mm、約 5 mm 至約 20 mm、約 6 mm 至約 20 mm、約 7 mm 至約 20 mm、約 8 mm 至約 20 mm、約 9 mm 至約 20 mm、約 10 mm 至約 20 mm、約 11 mm 至約 20 mm、約 12 mm 至約 20 mm、約 13 mm 至約 20 mm、約 14 mm 至約 20 mm、約 15 mm 至約 20 mm、約 16 mm 至約 20 mm、約 17 mm 至約 20 mm、約 18 mm 至約 20 mm、約 19 mm 至約 20 mm、約 1 mm 至約 15 mm、約 1 mm 至約 10 mm、約 1 mm 至約 5 mm 或約 1 mm 至約 4 mm 之直徑。在某些實施例中，水凝膠小滴具有約 0.1 mm 至約 1 mm 之直徑。在某些實施例中，水凝膠小滴具有約 0.1 mm 至約 4 mm 之直徑。在某些實施例中，水凝膠小滴具有約 1 mm 至約 20 mm 之直徑。在某些實施例中，水凝膠小滴具有約 1 mm 至約 10 mm 之直徑。在某些實施例中，水凝膠小滴具有約 1 mm 至約 4 mm 之直徑。在某些實施例中，各水凝膠小滴包括約 1 個或多個組織來源之上皮類器官， 例如，約 2 個或更多個、約 5 個或更多個、約 10 個或更多個、約 50 個或更多個、約 100 個或更多個、約 500 個或更多個，約 1,000 個或更多個、約 5,000 個或更多個、或約 10,000 個或更多個組織來源之上皮類器官。
在某些實施例中，水凝膠具有絲狀結構， 例如，如圖6 所示。在某些實施例中，該絲狀結構具有線形、蛇形或螺旋形形狀。在某些實施例中，絲狀結構具有線形形狀。在某些實施例中，絲狀結構具有蛇形形狀。在某些實施例中，絲狀結構具有螺旋形形狀。在某些實施例中，絲狀結構具有約 0.1 mm 至約 1000 mm， 例如，約 0.1 mm 至約 500 mm、約 0.1 mm 至約 100 mm、約 0.1 mm 至約 50 mm、約 0.1 mm 至約 20 mm、約 0.1 mm 至約 10 mm、約 1 mm 至約 1000 mm、約 20 mm 至約 1000 mm、約 50 mm 至約 1000 mm、約 100 mm 至約 1000 mm、約 500 mm 至約 1000 mm、約 1 mm 至約 100 mm 或約 1 mm 至約 50 mm 之長度及/或寬度。在某些實施例中，絲狀結構具有約 0.1 mm 至約 20 mm， 例如，約 0.1 mm 至約 19 mm、約 0.1 mm 至約 18 mm、約 0.1 mm 至約 17 mm、約 0.1 mm 至約 16 mm、約 0.1 mm 至約 15 mm、約 0.1 mm 至約 14 mm、約 0.1 mm 至約 13 mm、約 0.1 mm 至約 12 mm、約 0.1 mm 至約 11 mm、約 0.1 mm 至約 10 mm、約 0.1 mm 至約 9 mm、約 0.1 mm 至約 8 mm、約 0.1 mm 至約 7 mm、約 0.1 mm 至約 6 mm、約 0.1 mm 至約 5 mm、約 0.1 mm 至約 4 mm、約 0.1 mm 至約 3 mm、約 0.1 mm 至約 2 mm、約 0.1 mm 至約 1 mm、約 0.5 mm 至約 20 mm、約 1 mm 至約 20 mm、約 2 mm 至約 20 mm、約 3 mm 至約 20 mm、約 4 mm 至約 20 mm、約 5 mm 至約 20 mm、約 6 mm 至約 20 mm、約 7 mm 至約 20 mm、約 8 mm 至約 20 mm、約 9 mm 至約 20 mm、約 10 mm 至約 20 mm、約 11 mm 至約 20 mm、約 12 mm 至約 20 mm、約 13 mm 至約 20 mm、約 14 mm 至約 20 mm、約 15 mm 至約 20 mm、約 16 mm 至約 20 mm、約 17 mm 至約 20 mm、約 18 mm 至約 20 mm、約 19 mm 至約 20 mm、約 1 mm 至約 15 mm、約 1 mm 至約 10 mm、約 1 mm 至約 5 mm 或約 1 mm 至約 4 mm 之長度及/或寬度。在某些實施例中，絲狀結構具有約 0.1 mm 至約 1 mm 之長度。在某些實施例中，絲狀結構具有約 0.1 mm 至約 4 mm 之長度。在某些實施例中，絲狀結構具有約 1 mm 至約 20 mm 之長度。在某些實施例中，絲狀結構具有約 1 mm 至約 10 mm 之長度。在某些實施例中，絲狀結構具有約 1 mm 至約 4 mm 之長度。在某些實施例中，絲狀結構具有約 0.1 mm 至約 1 mm 之寬度。在某些實施例中，絲狀結構具有約 0.1 mm 至約 4 mm 之寬度。在某些實施例中，絲狀結構具有約 1 mm 至約 20 mm 之寬度。在某些實施例中，絲狀結構具有約 1 mm 至約 10 mm 之寬度。在某些實施例中，絲狀結構具有約 1 mm 至約 4 mm 之寬度。
在某些實施例中，絲狀結構具有約 0.1 mm 至約 20 mm， 例如，約 0.1 mm 至約 19 mm、約 0.1 mm 至約 18 mm、約 0.1 mm 至約 17 mm、約 0.1 mm 至約 16 mm、約 0.1 mm 至約 15 mm、約 0.1 mm 至約 14 mm、約 0.1 mm 至約 13 mm、約 0.1 mm 至約 12 mm、約 0.1 mm 至約 11 mm、約 0.1 mm 至約 10 mm、約 0.1 mm 至約 9 mm、約 0.1 mm 至約 8 mm、約 0.1 mm 至約 7 mm、約 0.1 mm 至約 6 mm、約 0.1 mm 至約 5 mm、約 0.1 mm 至約 4 mm、約 0.1 mm 至約 3 mm、約 0.1 mm 至約 2 mm、約 0.1 mm 至約 1 mm、約 0.5 mm 至約 20 mm、約 1 mm 至約 20 mm、約 2 mm 至約 20 mm、約 3 mm 至約 20 mm、約 4 mm 至約 20 mm、約 5 mm 至約 20 mm、約 6 mm 至約 20 mm、約 7 mm 至約 20 mm、約 8 mm 至約 20 mm、約 9 mm 至約 20 mm、約 10 mm 至約 20 mm、約 11 mm 至約 20 mm、約 12 mm 至約 20 mm、約 13 mm 至約 20 mm、約 14 mm 至約 20 mm、約 15 mm 至約 20 mm、約 16 mm 至約 20 mm、約 17 mm 至約 20 mm、約 18 mm 至約 20 mm、約 19 mm 至約 20 mm、約 1 mm 至約 15 mm、約 1 mm 至約 10 mm、約 1 mm 至約 5 mm 或約 1 mm 至約 4 mm 之直徑。在某些實施例中，絲狀結構具有約 0.1 mm 至約 20 mm 之直徑。在某些實施例中，絲狀結構具有約 0.1 mm 至約 10 mm 之直徑。在某些實施例中，絲狀結構具有約 0.1 mm 至約 5 mm 之直徑。在某些實施例中，絲狀結構具有約 1 mm 至約 20 mm 之直徑。在某些實施例中，絲狀結構具有約 1 mm 至約 10 mm 之直徑。在某些實施例中，絲狀結構具有約 1 mm 至約 5 mm 之直徑。
在某些實施例中，各絲狀結構包括約 1 個或多個組織來源之上皮類器官， 例如，約 2 個或更多個、約 5 個或更多個、約 10 個或更多個、約 50 個或更多個、約 100 個或更多個、約 500 個或更多個、約 1,000 個或更多個、約 5,000 個或更多個、或約 10,000 個或更多個組織來源之上皮類器官。
在某些實施例中，組成物包括任何合適的細胞培養基。在某些實施例中，細胞培養基含有對於支持培養細胞之維持而言重要的組分。 在某些實施例中，使用於本揭露之細胞培養基可為營養液，其包括標準細胞培養成分，諸如但不限於胺基酸、維生素、無機鹽、碳能源 ( 例如，葡萄糖) 及緩衝液。在某些實施例中，該培養基為分化培養基。在某些實施例中，培養基為生長培養基。在某些實施例中，該培養基為幹細胞促進培養基。實例中提供了細胞培養基之非限制性實例， 例如類器官生長培養基。
在某些實施例中，組成物中水凝膠體積與培養基體積之比率 (體積比) 為約 1:1 或更大。在某些實施例中，組成物中水凝膠體積與培養基體積之比率 (體積比) 為約 1:1 至約 1:100。在某些實施例中，組成物中水凝膠體積與培養基體積之比率 (體積比) 為約 1:5 至約 1:100、約 1:10 至約 1:100、約 1:15 至約 1:100、約 1:20 至約 1:100、約 1:25 至約 1:100、約 1:30 至約 1:100、約 1:35 至約 1:100、約 1:40 至約 1:100、約 1:45 至約 1:100、約 1:45 至約 1:100、約 1:45 至約 1:100、約 1:45 至約 1:100、約 1:50 至約 1:100、約 1:55 至約 1:100、約 1:60 至約 1:100、約 1:65 至約 1:100、約 1:70 至約 1:100、約 1:75 至約 1:100、約 1:80 至約 1:100、約 1:85 至約 1:100、約 1:90 至約 1:100、約 1:95 至約 1:100, 1:5 至約 1:50、約 1:10 至約 1:50、約 1:15 至約 1:50、約 1:20 至約 1:50、約 1:25 至約 1:50、約 1:30 至約 1:50、約 1:35 至約 1:50、約 1:40 至約 1:50、約 1:45 至約 1:50、約 1:1 至約 1:95、約 1:1 至約 1:90、約 1:1 至約 1:85、約 1:1 至約 1:80、約 1:1 至約 1:75、約 1:1 至約 1:70、約 1:1 至約 1:65、約 1:1 至約 1:60、約 1:1 至約 1:55、約 1:1 至約 1:50、約 1:1 至約 1:45、約 1:1 至約 1:40、約 1:1 至約 1:35、約 1:1 至約 1:30、約 1:1 至約 1:35、約 1:1 至約 1:30、約 1:1 至約 1:25、約 1:1 至約 1:20、約 1:1 至約 1:15、約 1:1 至約 1:10、約 1:1 至約 1:5、約 1:5 至約 1:75、約 1:5 至約 1:60、約 1:5 至約 1:50、約 1:1 至約 1:40、約 1:5 至約 1:30 或約 1:5 至約 1:20。在某些實施例中，組成物中水凝膠體積與培養基體積之比率 (體積比) 為約 1:1 至約 1:50。在某些實施例中，組成物中水凝膠體積與培養基體積之比率 (體積比) 為約 1:2 至約 1:50。在某些實施例中，組成物中水凝膠體積與培養基體積之比率 (體積比) 為約 1:1 至約 1:20。在某些實施例中，組成物中水凝膠體積與培養基體積之比率 (體積比) 為約 1:1 至約 1:15。在某些實施例中，組成物中水凝膠體積與培養基體積之比率 (體積比) 為約 1:1。在某些實施例中，組成物中水凝膠體積與培養基體積之比率 (體積比) 為約 1:2。在某些實施例中，組成物中水凝膠體積與培養基體積之比率 (體積比) 為約 1:5。在某些實施例中，組成物中水凝膠體積與培養基體積之比率 (體積比) 為約 1:10， 例如，如實例 8 所示。在某些實施例中，組成物中水凝膠體積與培養基體積之比率 (體積比) 為約 1:20。在某些實施例中，組成物中水凝膠體積與培養基體積之比率 (體積比) 為約 1:30。在某些實施例中，組成物中水凝膠體積與培養基體積之比率 (體積比) 為約 1:40。在某些實施例中，組成物中水凝膠體積與培養基體積之比率 (體積比) 為約 1:50。在某些實施例中，組成物中水凝膠體積與培養基體積之比率 (體積比) 為約 1:60。在某些實施例中，組成物中水凝膠體積與培養基體積之比率 (體積比) 為約 1:70。在某些實施例中，組成物中水凝膠體積與培養基體積之比率 (體積比) 為約 1:80。在某些實施例中，組成物中水凝膠體積與培養基體積之比率 (體積比) 為約 1:90。在某些實施例中，組成物中水凝膠體積與培養基體積之比率 (體積比) 為約 1:100。
在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官 ( 例如，嵌入接附於基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官) 相比，組織來源之上皮類器官在尺寸上更均勻。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官相比藉由本揭露之方法產生之組織來源之上皮類器官由於如實例 1 中所述之營養素利用率差異而在尺寸上更均勻。例如但不限於，與參考組織來源之上皮類器官 ( 例如，嵌入接附於基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官) 相比，藉由本揭露之方法產生之組織來源之上皮類器官在尺寸上在懸浮培養物小滴 ( 例如，經懸浮之水凝膠小滴) 之寬度上更均勻。在某些實施例中，參考組織來源之上皮類器官在如實例 1 所揭示之水凝膠圓頂中產生。
在某些實施例中，本揭露之組織來源之上皮類器 ( 例如，組織來源之上皮類器官之群體) 以與參考組織來源之上皮類器官 ( 例如，參考組織來源之上皮類器官之群體) 相比不同 ( 例如，較高或較低) 的含量表現標記物。例如但不限於，與參考組織來源之上皮類器官 ( 例如，參考組織來源之上皮類器官之群體) 相比，本揭露之組織來源之上皮類器官 ( 例如，組織來源之上皮類器官之群體) 以較高含量表現標記物。可替代地或另外，在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官 ( 例如，參考組織來源之上皮類器官之群體) 相比，本揭露之組織來源之上皮類器官 ( 例如，組織來源之上皮類器官之群體) 以較低之含量表現標記物。在某些實施例中，標記物為幹細胞及/或增生標記物， 例如，與幹細胞及/或增生相關之基因，如圖5A 所示。 例如但不限於，幹細胞及/或增生標記物為 MKI67、EpCAM、BMI1、CD49f、ASCL2、CD133、LGR5、SOX9、ALDH1A1、NEUROG3、NKX6.1、SMOC2、PDX1 及/或 CD44。在某些實施例中，標記物為分化標記物， 例如與分化相關之基因，如圖5B 所示。例如但不限於，分化標記物為角蛋白 20 (KRT20)、FABP1、MUC2、MUC5B、MUC5AC、MUC6、TFF3、ALPI、SI、CEACAM7、角蛋白 19 (KRT19)、角蛋白 7 (KRT7)、SOX9、MUC1、INS、GCG、AMY、ALB、CYP3A4、HNF4A、細胞角蛋白 8 (K8)、細胞角蛋白 18 (K18)、細胞角蛋白 5 (K5)、細胞角蛋白 14 (K14)、及/或平滑肌肌動蛋白 (SMA)。在某些實施例中，該等參考組織來源之上皮類器官為嵌入在接附至基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。例如但不限於，參考組織來源之上皮類器官為在如實例 1 中所揭示之水凝膠圓頂中產生之組織來源之上皮類器官。
在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為胃腸類器官，且本揭露之胃腸類器官中之差異表現標記物為 MKI67、LGR5、SOX9、CD44、MUC2、MUC5B、TFF3、KRT20、FABP1、ALPI 及/或 CEACAM7。
在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為乳腺類器官，且本揭露之乳腺類器官中之差異表現標記物為 EpCAM、CD49f、細胞角蛋白 8 (K8)、細胞角蛋白 18 (K18)、細胞角蛋白 5 (K5)、細胞角蛋白 14 (K14) 及/或平滑肌肌動蛋白 (SMA)。
在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為胰臟類器官，且本揭露之胰臟類器官中之差異表現標記物為 CD133、LGR5、PDX1、SOX9、ALDH1A1、NEUROG3、NKX6.1、角蛋白 19 (KRT19)、MUC1、INS、GCG 及/或 AMY。
在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為肝類器官，且本揭露之肝類器官中之差異表現標記物為 LGR5、ALB、CYP3A4、HNF4A、KRT19、KRT7 及/或 SOX9。
在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體相比，幹細胞及/或增生標記物由本揭露之組織來源之上皮類器官之群體 ( 例如，本揭露之組成物中之組織來源之上皮類器官之群體) 以較高含量表現。幹細胞及/或增生標記物之非限制性實例包括 MKI67、EpCAM、BMI1、CD49f、ASCL2、CD133、LGR5、SOX9、ALDH1A1、NEUROG3、NKX6.1、SMOC2、PDX1、CD44 及其組合。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物選自由以下所組成之群組：MKI67、ASCL2、LGR5、SOX9、SMOC2、CD44 及其組合。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 MKI67。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 ASCL2。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 LGR5。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 SOX9。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 SMOC2。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 CD44。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 EpCAM。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 CD49f。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 CD133。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 ALDH1A1。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 NEUROG3。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 NKX6.1。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 PDX1。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 BMI1。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體中幹細胞及/或增生標記物之表現含量相比，本揭露之組織來源之上皮類器官之群體中幹細胞及/或增生標記物之表現含量高至少 10%、高至少 20%、高至少 30%、高至少 40%、高至少 50%、高至少 60%、高至少 70%、高至少 80%、高至少 90%、高至少 100%、高至少 110%、高至少 120%、高至少 130%、高至少 140%、高至少 150%、高至少 160%、高至少 170%、高至少 180%、高至少 190%、高至少 200%、高至少 210%、高至少 220%、高至少 230%、高至少 240%、高至少 250%、高至少 260%、高至少 270%、高至少 280%、高至少 290% 或高至少 300%。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體中幹細胞及/或增生標記物之表現含量相比，本揭露之組織來源之上皮類器官之群體中幹細胞及/或增生標記物之表現含量高至少 50%。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體中幹細胞及/或增生標記物之表現含量相比，本揭露之組織來源之上皮類器官之群體中幹細胞及/或增生標記物之表現含量高至少 100%。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體中幹細胞及/或增生標記物之表現含量相比，本揭露之組織來源之上皮類器官之群體中幹細胞及/或增生標記物之表現含量高至少 200%。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體中幹細胞及/或增生標記物之表現含量相比，本揭露之組織來源之上皮類器官之群體中幹細胞及/或增生標記物之表現含量高至少 300%。
在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體相比，分化標記物由本揭露之組織來源之上皮類器官之群體 ( 例如，本揭露之組成物中之組織來源之上皮類器官之群體) 以較低含量表現。分化標記物之非限制性實例包括角蛋白 20 (KRT20)、FABP1、MUC2、MUC5B、MUC5AC、MUC6、TFF3、ALPI、SI、CEACAM7、角蛋白 19 (KRT19)、角蛋白 7 (KRT7)、SOX9、MUC1、INS、GCG、AMY、ALB、CYP3A4、HNF4A、細胞角蛋白 8 (K8)、細胞角蛋白 18 (K18)、細胞角蛋白 5 (K5)、細胞角蛋白 14 (K14)、平滑肌肌動蛋白 (SMA) 及其組合。在某些實施例中，分化標記物選自由以下所組成之群組：角蛋白 20 (KRT20)、FABP1、MUC2、MUC5B、TFF3、ALPI、SI、CEACAM7 及其組合。在某些實施例中，分化標記物為角蛋白 20 (KRT20)。在某些實施例中，分化標記物為 FABP1。在某些實施例中，分化標記物為 MUC2。在某些實施例中，分化標記物為 MUC5B。在某些實施例中，分化標記物為 TFF3。在某些實施例中，分化標記物為 ALPI。在某些實施例中，分化標記物為 SI。在某些實施例中，分化標記物為 CEACAM7。在某些實施例中，分化標記物為角蛋白 19 (KRT19)。在某些實施例中，分化標記物為角蛋白 7 (KRT7)。在某些實施例中，分化標記物為 SOX9。在某些實施例中，分化標記物為 MUC1。在某些實施例中，分化標記物為 INS。在某些實施例中，分化標記物為 GCG。在某些實施例中，分化標記物為 AMY。在某些實施例中，分化標記物為 ALB。在某些實施例中，分化標記物為 CYP3A4。在某些實施例中，分化標記物為 HNF4A。在某些實施例中，分化標記物為細胞角蛋白 8 (K8)。在某些實施例中，分化標記物為細胞角蛋白 18 (K18)。在某些實施例中，分化標記物為細胞角蛋白 5 (K5)。在某些實施例中，分化標記物為細胞角蛋白 14 (K14)。在某些實施例中，分化標記物為平滑肌肌動蛋白 (SMA)。在某些實施例中，分化標記物為 MUC5AC。在某些實施例中，分化標記物為 MUC6。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體中分化標記物之表現含量相比，本揭露之組織來源之上皮類器官之群體中分化標記物之表現含量低至少 10%、低至少 20%、低至少 30%、低至少 40%、低至少 50%、低至少 60%、低至少 70%、低至少 80%、低至少 90%、低至少 100%、低至少 110%、低至少 120%、低至少 130%、低至少 140%、低至少 150%、低至少 160%、低至少 170%、低至少 180%、低至少 190%、低至少 200%、低至少 210%、低至少 220%、低至少 230%、低至少 240%、低至少 200%、低至少 250%、低至少 260%、低至少 270%、低至少 280%、低至少 290% 或低至少 300%。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體中分化標記物之表現含量相比，本揭露之組織來源之上皮類器官之群體中分化標記物之表現含量低至少 50%。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體中分化標記物之表現含量相比，本揭露之組織來源之上皮類器官之群體中分化標記物之表現含量低至少 100%。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體中分化標記物之表現含量相比，本揭露之組織來源之上皮類器官之群體中分化標記物之表現含量低至少 200%。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體中分化標記物之表現含量相比，本揭露之組織來源之上皮類器官之群體中分化標記物之表現含量低至少 300%。 III. 產生類器官之方法
本揭露提供了產生組織來源之上皮類器官之方法。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生嵌入在懸浮於培養基中之水凝膠中之組織來源之上皮類器官之方法。本揭露進一步提供了用於產生組織來源之上皮類器官之懸浮培養物之方法。在某些實施例中，可使用實例 1 及 4 至 8 以及圖10 及 11 中描述的方法來產生類器官。
在某些實施例中，本揭露提供了用於產生淚腺類器官、扁桃腺類器官、唾液腺類器官、胃腸類器官、甲狀腺類器官、肺類器官、乳腺類器官、肝類器官、膽管類器官、胃類器官、腎類器官、胰臟類器官、子宮內膜類器官、輸卵管類器官、子宮頸類器官、前列腺類器官、膀胱類器官、卵巢類器官、味蕾類器官或滋胚內層類器官之方法。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生淚腺類器官之方法。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生扁桃腺類器官之方法。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生唾液腺類器官之方法。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生胃腸類器官之方法。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生甲狀腺類器官之方法。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生肺類器官之方法。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生乳腺類器官之方法。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生肝類器官之方法。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生膽管類器官之方法。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生胃類器官之方法。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生腎類器官之方法。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生胰臟類器官之方法。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生子宮內膜類器官之方法。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生輸卵管類器官之方法。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生子宮頸類器官之方法。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生前列腺類器官之方法。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生膀胱類器官之方法。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生卵巢類器官之方法。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生滋胚內層類器官之方法。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生滋胚內層類器官之方法。
在某些實施例中，本揭露提供了用於產生組織來源之上皮類器官之方法，該組織來源之上皮類器官選自由以下所組成之群組：肺類器官、胃腸類器官、肝類器官、胰臟類器官、乳腺類器官及其組合。
在某些實施例中，本揭露提供了用於產生胃腸類器官之方法。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生腸類器官之方法。例如但不限於，腸類器官為大腸或迴腸類器官。在某些實施例中，腸類器官為大腸類器官。在某些實施例中，腸類器官為迴腸類器官。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生直腸類器官之方法。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生食道類器官之方法。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生口腔顎面類器官之方法。在某些實施例中，本揭露之方法可產生兩種或更多種不同類型之組織來源之上皮類器官， 例如大腸及迴腸類器官。
在某些實施例中，本揭露提供了用於產生肺類器官之方法。
在某些實施例中，本揭露提供了用於產生肝類器官之方法。
在某些實施例中，本揭露提供了用於產生胰臟類器官之方法。
在某些實施例中，本揭露提供了用於產生乳腺類器官之方法。
在某些實施例中，用於產生組織來源之上皮類器官之方法包括使組織來源之上皮幹細胞與水凝膠接觸以產生水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。在某些實施例中，複數個組織來源之上皮幹細胞可與水凝膠組合以產生水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。
在某些實施例中，複數個組織來源之上皮幹細胞包括至少兩個或更多個組織來源之上皮幹細胞。在某些實施例中，複數個組織來源之上皮幹細胞包括至少約 10 個或更多個組織來源之上皮幹細胞、至少約 100 個或更多個組織來源之上皮幹細胞、至少約 1,000 個或更多個組織來源之上皮幹細胞、至少約 10,000 個或更多個組織來源之上皮幹細胞、至少約 100,000 個或更多個組織來源之上皮幹細胞、至少約 100,000 個或更多個組織來源之上皮幹細胞、至少約 1,000,000 個或更多個組織來源之上皮幹細胞、至少約 10,000,000 個或更多個組織來源之上皮幹細胞、或至少約 100,000,000 個或更多個組織來源之上皮幹細胞、或至少約 1,000,000,000 個或更多個組織來源之上皮幹細胞。在某些實施例中，複數個組織來源之上皮幹細胞包括至少約 10 個或更多個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠、至少約 100 個或更多個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠、至少約 1,000 個或更多個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠、至少約 10,000 個或更多個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠、至少約 100,000 個或更多個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠、至少約 100,000 個或更多個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠、至少約 1,000,000 個或更多個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠、至少約 10,000,000 個或更多個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠、至少約 100,000,000 個或更多個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠、或至少約 1,000,000,000 個或更多個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠。在某些實施例中，複數個組織來源之上皮幹細胞包括至少約 10,000 個或更多個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠。
在某些實施例中，複數個組織來源之上皮幹細胞包括約 1 × 10 4至約 1 × 10 10個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠。例如但不限於，複數個組織來源之上皮幹細胞包括約 1 × 10 4至約 1 × 10 9個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠、約 1 × 104 至約 1 × 10 8個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠、約 1 × 10 4至約 1 × 10 7個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠、約 1 × 10 4至約 1 × 10 6個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠、約 1 × 10 4至約 1 × 10 5個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠、約 1 × 10 5至約 1 × 10 10個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠、約 1 × 10 6至約 1 × 10 10個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠、約 1 × 10 7至約 1 × 10 10個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠、約 1 × 10 8至約 1 × 10 10個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠、約 1 × 10 9至約 1 × 10 10個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠、約 1 × 10 5至約 1 × 10 7個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠、或約 1 × 10 5至約 1 × 10 8個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠。在某些實施例中，複數個組織來源之上皮幹細胞包括約 1 × 10 4個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠至約 1 × 10 7個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠。在某些實施例中，複數個組織來源之上皮幹細胞包括約 1 × 10 4個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠至約 1 × 10 6個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠。
在某些實施例中，該方法可進一步包括將水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物懸浮在培養基中以產生經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。在某些實施例中，將水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物懸浮在該培養基中包括將含有水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之分配裝置浸沒在培養基中並將水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物分配到培養基中。在某些實施例中，可以重複將水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物分配到培養基中，以產生懸浮於培養基中之複數個且經分離之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。在某些實施例中，分配裝置可為允許輸送混合物之任何裝置。在某些實施例中，輸送裝置以準確且受控方式分配混合物。分配裝置之非限制性實例包括移液管、滴管及注射器。在某些實施例中，分配裝置可手動操作或自動操作。例如但不限於，分配裝置可自動操作。在某些實施例中，分配裝置可為自動化液體處理器。在某些實施例中，分配裝置可為液體處理機器人。
在某些實施例中，分配到培養基中之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之體積可為至少約 1 µl。 例如但不限於，分配到培養基中之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之體積可以為至少約 5 µl、至少約 10 µl、至少約 50 µl、至少約 100 µl、至少約 500 µl、至少約 1 ml、至少約 10 ml、至少約 50 ml、至少約 100 ml、至少約 500 ml、至少約 1 L、至少約 1.5 L、至少約 2 L、至少約 5 L 或至少約 10L。在某些實施例中，分配到培養基中之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之體積可為約 1 µl 至約 1 L。在某些實施例中，分配到培養基中之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之體積可為約 1 µl 至約 1 ml。 例如但不限於，分配到培養基中之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之體積可為約 1 µl 至約 900 µl、約 1 µl 至約 800 µl、約 1 µl 至約 700 µl、約 1 µl 至約 600 µl、約 1 µl 至約 500 µl、約 1 µl 至約 400 µl、約 1 µl 至約 300 µl、約 1 µl 至約 200 µl、約 1 µl 至約 100 µl、約 1 µl 至約 10 µl、約 1 µl 至約 900 µl、約 10 µl 至約 1 ml、約 100 µl 至約 1 ml、約 200 µl 至約 1 ml、約 300 µl 至約 1 ml、約 400 µl 至約 1 ml、約 500 µl 至約 1 ml、約 600 µl 至約 1 ml、約 700 µl 至約 1 ml、約 800 µl 至約 1 ml、約 900 µl 至約 1 ml、約 1 µl 至約 50 µl、約 5 µl 至約 20 µl、約 10 µl 至約 100 µl、約 10 µl 至約 500 µl、約 100 µl 至約 200 µl 或約 100 µl 至約 500 µl。在某些實施例中，分配到培養基中之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之體積可為約 1 µl 至約 100 µl。
在某些實施例中，該水凝膠係在與培養基接觸時固化。例如但不限於，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠由在大於約 10℃ 之溫度固化之材料構成。例如但不限於，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠由在大於約 15℃、大於約 20℃、大於約 25℃、大於約 30℃、大於約 35℃、大於約 40℃、大於約 45℃、或大於約 50℃ 之溫度固化之材料構成。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠由在大於約 25℃ 之溫度固化之材料構成。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠由在大於約 30℃ 之溫度固化之材料構成。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠由在大於約 35℃ 之溫度固化之材料構成。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠由在大於約 40℃ 之溫度固化之材料構成。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠由在大於約 45℃ 之溫度固化之材料構成。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠由在約 25℃ 至約 50℃ 之溫度固化之材料構成。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠由在約 30℃ 至約 50℃ 之溫度固化之材料構成。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠由在約 25℃ 至約 40℃， 例如約 37℃ 之溫度固化之材料構成。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠由在約 30℃ 至約 40℃， 例如約 37℃ 之溫度固化之材料構成。
在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物在接觸培養基之前處於約 25℃ 或更低之溫度。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物在接觸培養基之前處於約 20℃ 或更低之溫度。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物在接觸培養基之前處於約 15℃ 或更低之溫度。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物在接觸培養基之前處於約 10℃ 或更低之溫度。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物在接觸培養基之前處於約 5℃ 或更低之溫度。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物在接觸培養基之前處於約 25℃、約 24℃、約 23℃、約 22℃、約 21℃、約 20℃、約 19℃、約 18℃、約 17℃、約 16℃、約 15℃、約 14℃、約 13℃、約 12℃、約 11℃、約 10℃、約 9℃、約 8℃、約 7℃、約 6℃、約 5℃、約 4℃、約 3℃ 或約 2℃ 之溫度。在某些實施例中，在接觸培養基之前，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之溫度為約 2℃ 至約 25℃。在某些實施例中，在接觸培養基之前，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之溫度為約 2℃ 至約 20℃。在某些實施例中，在接觸培養基之前，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之溫度為約 2℃ 至約 15℃。在某些實施例中，在接觸培養基之前，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之溫度為約 2℃ 至約 10℃。
在某些實施例中，水凝膠可包括任何固化之材料。在某些實施例中，水凝膠為合成水凝膠、天然水凝膠或其組合。在某些實施例中，水凝膠為合成水凝膠。在某些實施例中，水凝膠為天然水凝膠。在某些實施例中，水凝膠可為合成水凝膠及天然水凝膠之混合物。在某些實施例中，水凝膠不包括化學交聯之蛋白質及/或聚合物。
在某些實施例中，水凝膠為天然水凝膠。在某些實施例中，天然水凝膠包括一種或多種天然存在組分。例如但不限於，天然水凝膠可包括一種或多種蛋白質， 例如醣蛋白及/或多醣。醣蛋白之非限制性實例包括膠原蛋白 ( 例如，I 型膠原蛋白、II 型膠原蛋白、III 型膠原蛋白、IV 型膠原蛋白、V 型膠原蛋白、VI 型膠原蛋白、VII 型膠原蛋白、VIII 型膠原蛋白、IX 型膠原蛋白、X 型膠原蛋白、 XI 型膠原蛋白及/或 XII 型膠原蛋白)、纖維連接蛋白、巢蛋白、腱生蛋白、玻連蛋白、纖網蛋白、透明質酸及層連結蛋白。在某些實施例中，天然水凝膠可進一步包括一種或多種組分，諸如但不限於多醣、水及/或彈性蛋白。在某些實施例中，本揭露之天然水凝膠包括層連結蛋白、巢蛋白及 IV 型膠原蛋白。在某些實施例中，本揭露之天然水凝膠包括層連結蛋白、巢蛋白、IV 型膠原蛋白及硫酸肝素蛋白聚醣。在某些實施例中，天然水凝膠包括由上皮細胞、內皮細胞、壁內胚層樣細胞及/或結締組織細胞分泌及/或來源之細胞外基質 (ECM)。
在某些實施例中，水凝膠為合成水凝膠。合成水凝膠之非限制性實例包括合成聚合物，諸如普羅結合蛋白 (ProNectin) (Sigma Z378666)、聚乙二醇 (PEG)、聚(甲基丙烯酸羥乙酯)、聚(乙烯亞胺)及聚乙烯醇 (PVA)。中揭示了合成水凝膠及此等合成水凝膠之聚合物之額外非限制性實例揭示於 Unal 及 West (2020) Bioconjugate Chem.31(10):2253-2271；以及 Madduma-Bandarage 及 Madihally (2020) J. of Applied Polymer Science 138(19):e50376 中，各篇之內容以引用方式全文併入本文中。
在某些實施例中，本揭露之水凝膠不包括藻酸鹽。
在某些實施例中，水凝膠可為商業可獲得之 ECM。商業可獲得之 ECM 之非限制性實例包括 ECM 蛋白及來自 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 小鼠肉瘤細胞之基底膜製劑。在某些實施例中，ECM 為 MATRIGEL™ (BD Biosciences)，其包括層連結蛋白、巢蛋白及膠原蛋白 IV。在某些實施例中，ECM 為基底膜萃取物 (BME)，其為基底膜之可溶性形式。BME 之非限制性實例為 CULTREX® 基底膜萃取物 2 型 (R&D Systems)，包括層連結蛋白、巢蛋白、膠原蛋白 IV 及硫酸肝素蛋白聚醣。
在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠具有大於約 0.7 mg/ml 之蛋白質濃度， 例如，醣蛋白濃度。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠具有大於約 1 mg/ml 之蛋白質濃度， 例如，醣蛋白濃度。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠具有大於約 2 mg/ml 之蛋白質濃度， 例如，醣蛋白濃度。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠具有大於約 3 mg/ml 之蛋白質濃度。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠具有大於約 4 mg/ml 之蛋白質濃度。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠具有大於約 5 mg/ml 之蛋白質濃度。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠具有大於約 6 mg/ml、大於約 7 mg/ml、大於約 8 mg/ml、大於約 9 mg/ml 或大於約 10 mg/ml 之蛋白質濃度。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠具有約 0.7 mg/ml 至約 10 mg/ml 之蛋白質濃度。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠具有約 1 mg/ml 至約 10 mg/ml 之蛋白質濃度。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠具有約 5 mg/ml 至約 10 mg/ml 之蛋白質濃度。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠具有約 6 mg/ml 至約 10 mg/ml 之蛋白質濃度。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠具有不小於 0.7 mg/ml 之蛋白質濃度。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠具有不小於 1 mg/ml 之蛋白質濃度。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠具有不小於 5 mg/ml 之蛋白質濃度。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠具有不小於 6 mg/ml 之蛋白質濃度。
在某些實施例中，水凝膠包含以 w/v % 計大於約 1 w/v % 之 BME 組分、ECM 組分或聚合物。例如但不限於，水凝膠包含以 w/v % 計大於約 1 w/v %、大於約 1.5 w/v %、大於約 2 w/v %、大於約 2.5 w/v %、大於約 3 w/v %、大於約 3.5 w/v %、大於約 4 w/v %、大於約 4.5 w/v %、大於約 5 w/v %、大於約 5.5 w/v %、大於約 6 w/v %、大於約 6.5 w/v %、大於約 7 w/v %、大於約 7.5 w/v %、大於約 8 w/v %、大於約 8.5 w/v %、大於約 9 w/v %、大於約 9.5 w/v %、或大於約 10 w/v %、大於約 10.5 w/v %、大於約 11 w/v %、大於約 11.5 w/v %、大於約 12 w/v %、大於約 12.5 w/v %、大於約 13 w/v %、大於約 13.5 w/v %、大於約 14 w/v %、大於約 14.5 w/v %、大於約 15 w/v %、大於約 15.5 w/v %、大於約 16 w/v %、大於約 16.5 w/v %、大於約 17 w/v %、大於約 17.5 w/v %、大於約 18 w/v %、大於約 18.5 w/v %、大於約 19 w/v %、大於約 19.5 w/v % 或大於約 20 w/v % 之 BME 組分、ECM 組分或聚合物。在某些實施例中，水凝膠包含以 w/v % 計約 1 w/v % 至約 10 w/v % 之 BME 組分、ECM 組分或聚合物。在某些實施例中，水凝膠包含以 w/v % 計約 2 w/v % 至約 10 w/v % 之 BME 組分、ECM 組分或聚合物。在某些實施例中，水凝膠包含以 w/v % 計約 5 w/v % 至約 10 w/v % 之 BME 組分、ECM 組分或聚合物。
在某些實施例中，該水凝膠具有等於或大於損耗模數 G'' 之儲存模數 G'。
在某些實施例中，水凝膠體積與培養基體積之比率 (體積比) 為約 1:1 至約 1:50。在某些實施例中，水凝膠體積與培養基體積之比率 (體積比) 為約 1:2 至約 1:50。在某些實施例中，水凝膠體積與培養基體積之比率為約 1:5 至約 1:50、約 1:10 至約 1:50、約 1:15 至約 1:50、約 1:20 至約 1:50、約 1:25 至約 1:50、約 1:30 至約 1:50、約 1:35 至約 1:50、約 1:40 至約 1:50、約 1:45 至約 1:50、約 1:2 至約 1:45、約 1:2 至約 1:40、約 1:2 至約 1:35、約 1:2 至約 1:30、約 1:2 至約 1:35、約 1:2 至約 1:30、約 1:2 至約 1:25、約 1:2 至約 1:20、約 1:2 至約 1:15、約 1:2 至約 1:10 或約 1:2 至約 1:5。在某些實施例中，水凝膠體積與培養基體積之比率為約 1:2 至約 1:20。在某些實施例中，水凝膠體積與培養基體積之比率為約 1:2 至約 1:15。在某些實施例中，水凝膠體積與培養基體積之比率為約 1:2。在某些實施例中，水凝膠體積與培養基體積之比率為約 1:5。在某些實施例中，水凝膠體積與培養基體積之比率為約 1:10， 例如，如實例 8 所示。在某些實施例中，水凝膠體積與培養基體積之比率為約 1:20。在某些實施例中，水凝膠體積與培養基體積之比率為約 1:30。在某些實施例中，水凝膠體積與培養基體積之比率為約 1:40。在某些實施例中，水凝膠體積與培養基體積之比率為約 1:50。
在某些實施例中，將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物分配到具有某個幾何形狀之培養基中。例如但不限於，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀包含大於約 0.1 mm 之長度、寬度及/或直徑。在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀具有大於約 0.1 mm 之長度。在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀具有大於約 0.1 mm 之寬度。在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀具有大於約 0.1 mm 之直徑。例如但不限於，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀具有大於約 0.5 mm、大於約 1 mm、大於約 1.5 mm、大於約 2 mm、大於約 2.5 mm、大於約 3 mm、大於約 3.5 mm、大於約 4 mm、大於約 4.5 mm、大於約 5 mm、大於約 5.5 mm、大於約 6 mm、大於約 6.5 mm、大於約 7.5 mm、大於約 8 mm、大於約 8.5 mm、大於約 9 mm、大於約 9.5 mm、大於約 10 mm、大於約 10.5 mm、大於約 11 mm、大於約 11.5 mm、大於約 12 mm、大於約 12.5 mm、大於約 13 mm、大於約 13.5 mm、大於約 14 mm、大於約 14.5 mm、大於約 15 mm、大於約 15.5 mm、大於約 16 mm、大於約 16.5 mm、大於約 17.5 mm、大於約 18 mm、大於約 18.5 mm、大於約 19 mm、大於約 19.5 mm、大於約 20 mm、大於約 50 mm、大於約 100 mm、大於約 150 mm、大於約 200 mm、大於約 250 mm、大於約 300 mm、大於約 350 mm、大於約 400 mm、大於約 450 mm、大於約 500 mm、大於約 550 mm、大於約 600 mm、大於約 650 mm、大於約 700 mm、大於約 750 mm、大於約 800 mm、大於約 850 mm、大於約 900 mm、大於約 950 mm 或大於約 1,000 mm 之長度、寬度及/或直徑。
在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀包含約 0.1 mm 至約 1000 mm， 例如，約 0.1 mm 至約 500 mm、約 0.1 mm 至約 100 mm、約 0.1 mm 至約 50 mm、約 0.1 mm 至約 20 mm、約 0.1 mm 至約 10 mm、約 1 mm 至約 1000 mm、約 20 mm 至約 1000 mm、約 50 mm 至約 1000 mm、約 100 mm 至約 1000 mm、約 500 mm 至約 1000 mm、約 1 mm 至約 100 mm 或約 1 mm 至約 50 mm 之長度、寬度及/或直徑。在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀包含約 0.1 mm 至約 20 mm， 例如，約 0.1 mm 至約 19 mm、約 0.1 mm 至約 18 mm、約 0.1 mm 至約 17 mm、約 0.1 mm 至約 16 mm、約 0.1 mm 至約 15 mm、約 0.1 mm 至約 14 mm、約 0.1 mm 至約 13 mm、約 0.1 mm 至約 12 mm、約 0.1 mm 至約 11 mm、約 0.1 mm 至約 10 mm、約 0.1 mm 至約 9 mm、約 0.1 mm 至約 8 mm、約 0.1 mm 至約 7 mm、約 0.1 mm 至約 6 mm、約 0.1 mm 至約 5 mm、約 0.1 mm 至約 4 mm、約 0.1 mm 至約 3 mm、約 0.1 mm 至約 2 mm、約 0.1 mm 至約 1 mm、約 0.5 mm 至約 20 mm、約 1 mm 至約 20 mm、約 2 mm 至約 20 mm、約 3 mm 至約 20 mm、約 4 mm 至約 20 mm、約 5 mm 至約 20 mm、約 6 mm 至約 20 mm、約 7 mm 至約 20 mm、約 8 mm 至約 20 mm、約 9 mm 至約 20 mm、約 10 mm 至約 20 mm、約 11 mm 至約 20 mm、約 12 mm 至約 20 mm、約 13 mm 至約 20 mm、約 14 mm 至約 20 mm、約 15 mm 至約 20 mm、約 16 mm 至約 20 mm、約 17 mm 至約 20 mm、約 18 mm 至約 20 mm、約 19 mm 至約 20 mm、約 1 mm 至約 15 mm、約 1 mm 至約 10 mm、約 1 mm 至約 5 mm 或約 1 mm 至約 4 mm 之長度、寬度及/或直徑。在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀包含約 0.1 mm 至約 4 mm 之長度、寬度及/或直徑。在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀具有約 0.1 mm 至約 1 mm 之長度、寬度及/或直徑。在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物具有約 0.1 mm 至約 4 mm 之長度、寬度及/或直徑。在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物具有約 1 mm 至約 20 mm 之長度、寬度及/或直徑。在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀具有約 1 mm 至約 10 mm 之長度、寬度及/或直徑。在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀具有約 1 mm 至約 4 mm 之長度、寬度及/或直徑。
在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀為球形或類球形。在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀為絲狀結構。在某些實施例中，絲狀結構具有線形、蛇形或螺旋形形狀。在某些實施例中，絲狀結構具有線形形狀。在某些實施例中，絲狀結構具有蛇形形狀。在某些實施例中，絲狀結構具有螺旋形形狀。
在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物係以小滴懸浮於培養基中 ( 參見例如圖10)。在某些實施例中，水凝膠小滴大於約 0.1 mm 之直徑。在某些實施例中，水凝膠小滴具有約 0.1 mm 至約 20 mm， 例如，約 0.1 mm 至約 19 mm、約 0.1 mm 至約 18 mm、約 0.1 mm 至約 17 mm、約 0.1 mm 至約 16 mm、約 0.1 mm 至約 15 mm、約 0.1 mm 至約 14 mm、約 0.1 mm 至約 13 mm、約 0.1 mm 至約 12 mm、約 0.1 mm 至約 11 mm、約 0.1 mm 至約 10 mm、約 0.1 mm 至約 9 mm、約 0.1 mm 至約 8 mm、約 0.1 mm 至約 7 mm、約 0.1 mm 至約 6 mm、約 0.1 mm 至約 5 mm、約 0.1 mm 至約 4 mm、約 0.1 mm 至約 3 mm、約 0.1 mm 至約 2 mm、約 0.1 mm 至約 1 mm、約 0.5 mm 至約 20 mm、約 1 mm 至約 20 mm、約 2 mm 至約 20 mm、約 3 mm 至約 20 mm、約 4 mm 至約 20 mm、約 5 mm 至約 20 mm、約 6 mm 至約 20 mm、約 7 mm 至約 20 mm、約 8 mm 至約 20 mm、約 9 mm 至約 20 mm、約 10 mm 至約 20 mm、約 11 mm 至約 20 mm、約 12 mm 至約 20 mm、約 13 mm 至約 20 mm、約 14 mm 至約 20 mm、約 15 mm 至約 20 mm、約 16 mm 至約 20 mm、約 17 mm 至約 20 mm、約 18 mm 至約 20 mm、約 19 mm 至約 20 mm、約 1 mm 至約 15 mm、約 1 mm 至約 10 mm、約 1 mm 至約 5 mm 或約 1 mm 至約 4 mm 之直徑。在某些實施例中，水凝膠小滴具有約 0.1 mm 至約 4 mm 之直徑。在某些實施例中，水凝膠小滴具有約 0.1 mm 至約 1 mm 之直徑。在某些實施例中，水凝膠小滴具有約 0.1 mm 至約 4 mm 之直徑。在某些實施例中，水凝膠小滴具有約 1 mm 至約 20 mm 之直徑。在某些實施例中，水凝膠小滴具有約 1 mm 至約 10 mm 之直徑。在某些實施例中，水凝膠小滴具有約 1 mm 至約 4 mm 之直徑。在某些實施例中，各水凝膠小滴包括約 1 個或多個組織來源之上皮幹細胞， 例如，約 5 個或更多個、約 10 個或更多個、約 50 個或更多個、約 100 個或更多個、約 500 個或更多個、約 1,000 個或更多個、約 5,000 個或更多個、約 10,000 個或更多個、約 100,000 個或更多個、約 200,000 個或更多個、約 300,000 個或更多個、約 400,000 個或更多個、約 500,000 個或更多個、約 600,000 個或更多個、約 700,000 個或更多個、約 800,000 個或更多個、約 900,000 個或更多個、約 1,000,000 個或更多個、約 2,000,000 個或更多個、約 3,000,000 個或更多個、約 4,000,000 個或更多個、約 5,000,000 個或更多個、約 6,000,000 個或更多個、約 7,000,000 個或更多個、約 8,000,000 個或更多個、約 9,000,000 個或更多個、約 10,000,000 個或更多個、約 100,000,000 個或更多個、或約 1,000,000,000 個或更多個組織來源之上皮幹細胞。
在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物具有絲狀結構 ( 參見例如圖11)。在某些實施例中，絲狀結構具有大於約 0.1 mm 之長度及/或寬度。在某些實施例中，絲狀結構具有大於約 0.1 mm 之長度。在某些實施例中，絲狀結構具有大於約 0.1 mm 之寬度。在某些實施例中，絲狀結構具有約 0.1 mm 至約 1000 mm， 例如，約 0.1 mm 至約 500 mm、約 0.1 mm 至約 100 mm、約 0.1 mm 至約 50 mm、約 0.1 mm 至約 20 mm、約 0.1 mm 至約 10 mm、約 1 mm 至約 1000 mm、約 20 mm 至約 1000 mm、約 50 mm 至約 1000 mm、約 100 mm 至約 1000 mm、約 500 mm 至約 1000 mm、約 1 mm 至約 100 mm 或約 1 mm 至約 50 mm 之長度及/或寬度。在某些實施例中，絲狀結構具有約 0.1 mm 至約 20 mm， 例如，約 0.1 mm 至約 19 mm、約 0.1 mm 至約 18 mm、約 0.1 mm 至約 17 mm、約 0.1 mm 至約 16 mm、約 0.1 mm 至約 15 mm、約 0.1 mm 至約 14 mm、約 0.1 mm 至約 13 mm、約 0.1 mm 至約 12 mm、約 0.1 mm 至約 11 mm、約 0.1 mm 至約 10 mm、約 0.1 mm 至約 9 mm、約 0.1 mm 至約 8 mm、約 0.1 mm 至約 7 mm、約 0.1 mm 至約 6 mm、約 0.1 mm 至約 5 mm、約 0.1 mm 至約 4 mm、約 0.1 mm 至約 3 mm、約 0.1 mm 至約 2 mm、約 0.1 mm 至約 1 mm、約 0.5 mm 至約 20 mm、約 1 mm 至約 20 mm、約 2 mm 至約 20 mm、約 3 mm 至約 20 mm、約 4 mm 至約 20 mm、約 5 mm 至約 20 mm、約 6 mm 至約 20 mm、約 7 mm 至約 20 mm、約 8 mm 至約 20 mm、約 9 mm 至約 20 mm、約 10 mm 至約 20 mm、約 11 mm 至約 20 mm、約 12 mm 至約 20 mm、約 13 mm 至約 20 mm、約 14 mm 至約 20 mm、約 15 mm 至約 20 mm、約 16 mm 至約 20 mm、約 17 mm 至約 20 mm、約 18 mm 至約 20 mm、約 19 mm 至約 20 mm、約 1 mm 至約 15 mm、約 1 mm 至約 10 mm、約 1 mm 至約 5 mm 或約 1 mm 至約 4 mm 之長度及/或寬度。在某些實施例中，絲狀結構具有約 0.1 mm 至約 1 mm 之長度。在某些實施例中，絲狀結構具有約 0.1 mm 至約 4 mm 之長度。在某些實施例中，絲狀結構具有約 1 mm 至約 20 mm 之長度。在某些實施例中，絲狀結構具有約 1 mm 至約 10 mm 之長度。在某些實施例中，絲狀結構具有約 1 mm 至約 4 mm 之長度。在某些實施例中，絲狀結構具有約 0.1 mm 至約 1 mm 之寬度。在某些實施例中，絲狀結構具有約 0.1 mm 至約 4 mm 之寬度。在某些實施例中，絲狀結構具有約 1 mm 至約 20 mm 之寬度。在某些實施例中，絲狀結構具有約 1 mm 至約 10 mm 之寬度。在某些實施例中，絲狀結構具有約 1 mm 至約 4 mm 之寬度。
在某些實施例中，絲狀結構具有約 0.1 mm至約 20 mm， 例如，約 0.1 mm 至約 19 mm、約 0.1 mm 至約 18 mm、約 0.1 mm 至約 17 mm、約 0.1 mm 至約 16 mm、約 0.1 mm 至約 15 mm、約 0.1 mm 至約 14 mm、約 0.1 mm 至約 13 mm、約 0.1 mm 至約 12 mm、約 0.1 mm 至約 11 mm、約 0.1 mm 至約 10 mm、約 0.1 mm 至約 9 mm、約 0.1 mm 至約 8 mm、約 0.1 mm 至約 7 mm、約 0.1 mm 至約 6 mm、約 0.1 mm 至約 5 mm、約 0.1 mm 至約 4 mm、約 0.1 mm 至約 3 mm、約 0.1 mm 至約 2 mm、約 0.1 mm 至約 1 mm、約 0.5 mm 至約 20 mm、約 1 mm 至約 20 mm、約 2 mm 至約 20 mm、約 3 mm 至約 20 mm、約 4 mm 至約 20 mm、約 5 mm 至約 20 mm、約 6 mm 至約 20 mm、約 7 mm 至約 20 mm、約 8 mm 至約 20 mm、約 9 mm 至約 20 mm、約 10 mm 至約 20 mm、約 11 mm 至約 20 mm、約 12 mm 至約 20 mm、約 13 mm 至約 20 mm、約 14 mm 至約 20 mm、約 15 mm 至約 20 mm、約 16 mm 至約 20 mm、約 17 mm 至約 20 mm、約 18 mm 至約 20 mm、約 19 mm 至約 20 mm、約 1 mm 至約 15 mm、約 1 mm 至約 10 mm、約 1 mm 至約 5 mm 或約 1 mm 至約 4 mm 之直徑。在某些實施例中，絲狀結構具有約 0.1 mm 至約 20 mm 之直徑。在某些實施例中，絲狀結構具有約 0.1 mm 至約 10 mm 之直徑。在某些實施例中，絲狀結構具有約 0.1 mm 至約 5 mm 之直徑。在某些實施例中，絲狀結構具有約 1 mm 至約 20 mm 之直徑。在某些實施例中，絲狀結構具有約 1 mm 至約 10 mm 之直徑。在某些實施例中，絲狀結構具有約 1 mm 至約 5 mm 之直徑， 例如，如實例 8 所揭示的。
在某些實施例中，各絲狀結構包括約 1 個或更多個組織來源之上皮幹細胞， 例如，約 5 個或更多個、約 10 個或更多個、約 50 個或更多個、約 100 個或更多個、約 500 個或更多個、約 1,000 個或更多個、約 5,000 個或更多個、約 10,000 個或更多個、或約 100,000 個或更多個、約 200,000 個或更多個、約 300,000 個或更多個、約 400,000 個或更多個、約 500,000 個或更多個、約 600,000 個或更多個、約 700,000 個或更多個、約 800,000 個或更多個、約 900,000 個或更多個、或約 1,000,000 個或更多個、約 2,000,000 個或更多個、約 3,000,000 個或更多個、約 4,000,000 個或更多個、約 5,000,000 個或更多個、約 6,000,000 個或更多個、約 7,000,000 個或更多個、約 8,000,000 個或更多個、約 9,000,000 個或更多個、約 10,000,000 個或更多個、約 100,000,000 個或更多個、約 1,000,000,000 個或更多個、或約 10,000,000,000 個或更多個組織來源之上皮幹細胞。
在某些實施例中，該方法可進一步包括將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之組織來源之上皮幹細胞在培養基中培養以產生組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，細胞培養基含有對於支持組織來源之上皮幹細胞及/或類器官之維持而言重要的組分。 在某些實施例中，使用於本揭露之細胞培養基可為營養液，其包括標準細胞培養成分，諸如但不限於胺基酸、維生素、無機鹽、碳能源 ( 例如，葡萄糖) 及緩衝液。在某些實施例中，該培養基為幹細胞促進培養基。在某些實施例中，該培養基為細胞生長培養基。在某些實施例中，該培養基為分化培養基。已知支持特定組織及細胞類型生長之培養基為本技術領域已知的並且可與本文所揭示之主題結合使用。例如但不限於，可在本揭露中使用之培養基之實例在 Calà 等人, Front.Bioeng.Biotechnol.11:1058970 (2023) ( 例如，Calà 等人之表 1) 中揭示，其內容特此以引用方式併入。在實例中， 例如實例 8 中，提供了使用於本揭露之培養基之額外非限制性實例。
在某些實施例中，該培養基存在於容器中。容器之非限制性實例包括培養皿、多孔盤、錐形管、貯器、培養袋、生物反應器或燒瓶。在某些實施例中，錐形管為 50 ml 錐形管。在某些實施例中，多孔盤為 6 孔盤、12 孔盤、24 孔盤、48 孔盤、96 孔盤或 384 孔盤。在某些實施例中，貯器為自訂貯器。在某些實施例中，燒瓶為 25 ml 燒瓶、50 ml 燒瓶、250 ml 燒瓶或 600 ml 燒瓶。在某些實施例中，燒瓶為單一燒瓶或酒店燒瓶。在某些實施例中，容器由使組織來源之上皮幹細胞及/或水凝膠與容器表面之接附最小化之材料構成。可替代地或另外，容器可包括表面塗層，其使組織來源之上皮幹細胞及/或水凝膠與容器表面之接附最小化。
在某些實施例中，該方法可進一步包括將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物碎片化以產生包含該組織來源之上皮類器官之碎片化結構。在某些實施例中，將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物碎片化可包括剪切經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物以產生碎片化結構， 例如藉由使含有經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之培養基上下移液。在某些實施例中，將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物碎片化產生長度及/或寬度較短之結構。例如但不限於，將絲狀結構碎片化產生長度、寬度或二者較短之結構。在某些實施例中，與最初擠出之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物 ( 例如絲狀結構) 相比，將絲狀結構碎片化產生長度、寬度或二者短至少約 10%、至少約 15%、至少約 20%、至少約 25%、至少約 30%、至少約 35%、至少約 40%、至少約 45%、至少約 50%、至少約 55%、至少約 60%、至少約 65%、至少約 70%、至少約 75%、至少約 80%、至少約 85% 或至少約 90% 之結構。
目前所揭示之主題進一步提供了用於產生組織來源之上皮類器官之懸浮培養物之方法。在某些實施例中，該方法可包括將包含水凝膠及組織來源之上皮幹細胞之混合物引入到培養基中以產生經懸浮之混合物。在某些實施例中，引入到該培養基中之該混合物包含如本文所述之水凝膠及複數個組織來源之上皮幹細胞。在某些實施例中，該方法可進一步包括將混合物中之複數個組織來源之上皮幹細胞在培養基中培養以產生如本文所述之呈懸浮狀態之組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，該方法可進一步包括將經懸浮之混合物碎片化以產生包含該組織來源之上皮類器官之碎片化結構。
在某些實施例中，用於產生組織來源之上皮類器官之懸浮培養物之方法可包括使胃腸幹細胞 ( 例如，複數個組織來源之上皮幹細胞) 與水凝膠接觸以產生水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物並將水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物沉積到基材上。在某些實施例中，將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物作為小滴沉積到該基材上。在某些實施例中，將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物沉積到該基材上以具有絲狀結構。在某些實施例中，此方法可進一步包括將水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物固化以產生經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。在某些實施例中，該方法可包括將經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物懸浮在培養基中以產生經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。在某些實施例中，該方法包括將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物在該培養基中培養以產生組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，該方法可以進一步包括在將經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物懸浮在培養基中之前，將經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物從基材中取出。在某些實施例中，該方法可以進一步包括在將經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物懸浮在培養基中之前或之後，將經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物碎片化以產生包含組織來源之上皮類器官之碎片化結構。
在某些實施例中，使用於本揭露之組織來源之上皮幹細胞或複數個組織來源之上皮幹細胞含在組織碎片、類器官碎片或其組合內。例如但不限於，包括組織來源之上皮幹細胞或複數個組織來源之上皮幹細胞之組織碎片及/或類器官碎片可用於產生水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。可替代地或另外，組織來源之上皮幹細胞或複數個組織來源之上皮幹細胞分離自組織 ( 例如，組織碎片)、類器官碎片 ( 例如，組織來源之上皮類器官碎片) 或其組合。在某些實施例中，組織來源之上皮幹細胞不包括富潛能幹細胞 ( 例如，誘導富潛能幹細胞 (iPSC) 及胚胎幹細胞 (ESC))。在某些實施例中，使用於本揭露之組織來源之上皮幹細胞可獲自 活體外細胞培養物。在某些實施例中，組織碎片可獲自冷凍樣本或新鮮樣本， 例如冷凍或新鮮組織樣本及/或冷凍或新鮮組織類器官碎片。在某些實施例中，組織碎片可為原生組織碎片。在某些實施例中， 例如個體之組織 ( 例如組織碎片) 可係正常的 ( 例如非癌性的及/或非患病的)。在某些實施例中， 例如個體之組織 ( 例如組織碎片) 可係異常的 ( 例如癌性的及/或患病的)。在某些實施例中，組織來源之上皮幹細胞可分離自原生組織之碎片。
在某些實施例中，原生組織碎片可為淚腺、扁桃腺、唾液腺、胃腸組織、甲狀腺、肺、乳腺、肝、膽管、胃、腎、胰臟、子宮內膜、輸卵管、子宮頸、前列腺、膀胱、卵巢、味蕾或胎盤之碎片。在某些實施例中，組織來源之上皮幹細胞可分離自選自以下之組織 (或其碎片)：淚腺、扁桃腺、唾液腺、胃腸組織、甲狀腺、肺、乳腺、肝、膽管、胃、腎、胰臟、子宮內膜、輸卵管、子宮頸、前列腺、膀胱、卵巢、味蕾、胎盤及其組合。在某些實施例中，原生組織碎片可為淚腺之碎片。在某些實施例中，原生組織碎片可為扁桃腺之碎片。在某些實施例中，原生組織碎片可為唾液腺之碎片。在某些實施例中，原生組織碎片可為胃腸組織之碎片。在某些實施例中，原發組織碎片可為甲狀腺之碎片。在某些實施例中，原生組織碎片可為肺之碎片。在某些實施例中，原生組織碎片可為乳腺之碎片。在某些實施例中，原生組織碎片可為肝之碎片。在某些實施例中，原生組織碎片可為膽管之碎片。在某些實施例中，主要組織碎片可為胃之碎片。在某些實施例中，原生組織碎片可為腎之碎片。在某些實施例中，原生組織碎片可為胰臟之碎片。在某些實施例中，原生組織碎片可為子宮內膜之碎片。在某些實施例中，原生組織碎片可為輸卵管之碎片。在某些實施例中，原生組織碎片可為子宮頸之碎片。在某些實施例中，原生組織碎片可為前列腺之碎片。在某些實施例中，原生組織碎片可為膀胱之碎片。 在某些實施例中，原生組織碎片可為卵巢之碎片。在某些實施例中，初級組織碎片可為味蕾。在某些實施例中，原生組織碎片可為胎盤之碎片。在某些實施例中，原生組織碎片選自由以下所組成之群組：肺組織碎片、肝組織碎片、胃腸組織碎片、乳腺組織碎片、胰臟組織碎片及其組合。
在某些實施例中，原生組織碎片可為胃腸組織之碎片。在某些實施例中，組織碎片可為 例如個體之口腔黏膜、咽 (喉)、食道、胃、小腸、大腸及/或直腸之碎片。在某些實施例中，組織碎片可為 例如個體之口腔黏膜之碎片。在某些實施例中，組織碎片可為 例如個體之咽之碎片。在某些實施例中，組織碎片可為 例如個體之食道之碎片。在某些實施例中，組織碎片可為 例如個體之胃之碎片。在某些實施例中，組織碎片可為 例如個體之直腸之碎片。在某些實施例中，組織碎片可為 例如個體之小腸之碎片。在某些實施例中，組織碎片可為 例如個體之大腸之碎片。在某些實施例中，組織碎片可為 例如個體之大腸及/或迴腸組織之碎片。例如但不限於，組織來源之上皮幹細胞或複數個組織來源之上皮幹細胞可分離自 例如個體之大腸及/或迴腸組織分離。在某些實施例中，組織來源之上皮幹細胞或複數個組織來源之上皮幹細胞可分離自 ( 例如個體之) 大腸組織， 例如以產生大腸類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮幹細胞或複數個組織來源之上皮幹細胞可分離自 ( 例如個體之) 迴腸組織， 例如以產生迴腸類器官。在某些實施例中， 例如個體之組織可為正常的 ( 即，非癌性的)。例如但不限於， 例如個體之大腸及/或迴腸組織可為正常的 ( 即，非癌性的)。在某些實施例中， 例如個體之組織可為癌性的或患病的。例如但不限於， 例如個體之大腸及/或迴腸組織可為癌性的及/或患病的大腸及/或迴腸組織。在某些實施例中， 例如個體之食道組織可為癌性的及/或患病的食道組織。在某些實施例中， 例如個體之胃組織可為癌性的及/或患病的胃組織。在某些實施例中， 例如個體之直腸組織可為癌性的及/或患病的直腸組織。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官可為個體來源之胃腸腫瘤類器官。
在某些實施例中，原生組織碎片為肺組織碎片。
在某些實施例中，原生組織碎片為肝組織碎片。
在某些實施例中，原生組織碎片為乳腺組織碎片。
在某些實施例中，原生組織碎片為胰臟組織碎片。
在某些實施例中，本揭露之方法產生與參考組織來源之上皮類器官 ( 例如，嵌入接附於基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官) 相比尺寸均勻之組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官相比藉由本揭露之方法產生之組織來源之上皮類器官由於如實例 1 中所述之營養素利用率差異而在尺寸上更均勻。例如但不限於，與參考組織來源之上皮類器官 ( 例如，嵌入接附於基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官) 相比，藉由本揭露之方法產生之組織來源之上皮類器官在尺寸上在懸浮培養物小滴 ( 例如，經懸浮之水凝膠小滴) 之寬度上更均勻。在某些實施例中，參考組織來源之上皮類器官在如實例 1 所揭示之水凝膠圓頂中產生。
在某些實施例中，本揭露之方法產生組織來源之上皮類器官之群體，其以與參考組織來源之上皮類器官 ( 例如，參考組織來源之上皮類器官之群體) 相比不同 ( 例如較高或較低) 的含量表現標記物。例如但不限於，與參考組織來源之上皮類器官 ( 例如，參考組織來源之上皮類器官之群體) 相比，本揭露之組織來源之上皮類器官 ( 例如，組織來源之上皮類器官之群體) 以較高含量表現標記物。可替代地或另外，在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官 ( 例如，參考組織來源之上皮類器官之群體) 相比，本揭露之組織來源之上皮類器官 ( 例如，組織來源之上皮類器官之群體) 以較低之含量表現標記物。在某些實施例中，標記物為幹細胞及/或增生標記物， 例如，與幹細胞及/或增生相關之基因。 例如但不限於，幹細胞及/或增生標記物為 MKI67、EpCAM、BMI1、CD49f、ASCL2、CD133、LGR5、SOX9、ALDH1A1、NEUROG3、NKX6.1、SMOC2、PDX1 及/或 CD44。在某些實施例中，標記物為分化標記物， 例如，與分化相關之基因。例如但不限於，分化標記物為角蛋白 20 (KRT20)、FABP1、MUC2、MUC5B、MUC5AC、MUC6、TFF3、ALPI、SI、CEACAM7、角蛋白 19 (KRT19)、角蛋白 7 (KRT7)、SOX9、MUC1、INS、GCG、AMY、ALB、CYP3A4、HNF4A、細胞角蛋白 8 (K8)、細胞角蛋白 18 (K18)、細胞角蛋白 5 (K5)、細胞角蛋白 14 (K14)、及/或平滑肌肌動蛋白 (SMA)。在某些實施例中，該等參考組織來源之上皮類器官為嵌入在接附至基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。例如但不限於，參考組織來源之上皮類器官為在如實例 1 中所揭示之水凝膠圓頂中產生之組織來源之上皮類器官。
在某些實施例中，本揭露之方法產生以與參考組織來源之上皮類器官之群體相比較高的含量表現幹細胞及/或增生標記物之組織來源之上皮類器官之群體。幹細胞及/或增生標記物之非限制性實例包括 MKI67、EpCAM、BMI1、CD49f、ASCL2、CD133、LGR5、SOX9、ALDH1A1、NEUROG3、NKX6.1、SMOC2、PDX1、及/或 CD44 及其組合。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物選自由以下所組成之群組：MKI67、ASCL2、LGR5、SOX9、SMOC2、CD44 及其組合。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 MKI67。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 ASCL2。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 LGR5。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 SOX9。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 SMOC2。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 CD44。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 EpCAM。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 CD49f。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 CD133。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 ALDH1A1。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 NEUROG3。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 NKX6.1。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 PDX1。在某些實施例中，幹細胞及/或增生標記物為 BMI1。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體中幹細胞及/或增生標記物之表現含量相比，藉由本揭露之方法產生之組織來源之上皮類器官之群體中幹細胞及/或增生標記物之表現含量高至少 10%、高至少 20%、高至少 30%、高至少 40%、高至少 50%、高至少 60%、高至少 70%、高至少 80%、高至少 90%、高至少 100%、高至少 110%、高至少 120%、高至少 130%、高至少 140%、高至少 150%、高至少 160%、高至少 170%、高至少 180%、高至少 190%、高至少 200%、高至少 210%、高至少 220%、高至少 230%、高至少 240%、高至少 250%、高至少 260%、高至少 270%、高至少 280%、高至少 290% 或高至少 300%。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體中幹細胞及/或增生標記物之表現含量相比，藉由本揭露之方法產生之組織來源之上皮類器官之群體中幹細胞及/或增生標記物之表現含量高至少 50%。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體中幹細胞及/或增生標記物之表現含量相比，藉由本揭露之方法產生之組織來源之上皮類器官之群體中幹細胞及/或增生標記物之表現含量高至少 100%。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體中幹細胞及/或增生標記物之表現含量相比，藉由本揭露之方法產生之組織來源之上皮類器官之群體中幹細胞及/或增生標記物之表現含量高至少 200%。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體中幹細胞及/或增生標記物之表現含量相比，藉由本揭露之方法產生之組織來源之上皮類器官之群體中幹細胞及/或增生標記物之表現含量高至少 300%。
在某些實施例中，本揭露之方法產生以與參考組織來源之上皮類器官之群體相比較低之含量表現分化標記物之組織來源之上皮類器官之群體。分化標記物之非限制性實例包括角蛋白 20 (KRT20)、FABP1、MUC2、MUC5B、MUC5AC、MUC6、TFF3、ALPI、SI、CEACAM7、角蛋白 19 (KRT19)、角蛋白 7 (KRT7)、SOX9、MUC1、INS、GCG、AMY、ALB、CYP3A4、HNF4A、細胞角蛋白 8 (K8)、細胞角蛋白 18 (K18)、細胞角蛋白 5 (K5)、細胞角蛋白 14 (K14)、平滑肌肌動蛋白 (SMA) 及其組合。在某些實施例中，分化標記物選自由以下所組成之群組：角蛋白 20 (KRT20)、FABP1、MUC2、MUC5B、TFF3、ALPI、SI、CEACAM7 及其組合。在某些實施例中，分化標記物為角蛋白 20 (KRT20)。在某些實施例中，分化標記物為 FABP1。在某些實施例中，分化標記物為 MUC2。在某些實施例中，分化標記物為 MUC5B。在某些實施例中，分化標記物為 TFF3。在某些實施例中，分化標記物為 ALPI。在某些實施例中，分化標記物為 SI。在某些實施例中，分化標記物為 CEACAM7。在某些實施例中，分化標記物為角蛋白 19 (KRT19)。在某些實施例中，分化標記物為角蛋白 7 (KRT7)。在某些實施例中，分化標記物為 SOX9。在某些實施例中，分化標記物為 SOX9。在某些實施例中，分化標記物為 MUC1。在某些實施例中，分化標記物為 INS。在某些實施例中，分化標記物為 GCG。在某些實施例中，分化標記物為 AMY。在某些實施例中，分化標記物為 ALB。在某些實施例中，分化標記物為 CYP3A4。在某些實施例中，分化標記物為 HNF4A。在某些實施例中，分化標記物為細胞角蛋白 8 (K8)。在某些實施例中，分化標記物為細胞角蛋白 18 (K18)。在某些實施例中，分化標記物為細胞角蛋白 5 (K5)。在某些實施例中，分化標記物為細胞角蛋白 14 (K14)。在某些實施例中，分化標記物為平滑肌肌動蛋白 (SMA)。在某些實施例中，分化標記物為 MUC5AC。在某些實施例中，分化標記物為 MUC6。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體中分化標記物之表現含量相比，藉由本揭露之方法產生之組織來源之上皮類器官之群體中分化標記物之表現含量低至少 10%、低至少 20%、低至少 30%、低至少 40%、低至少 50%、低至少 60%、低至少 70%、低至少 80%、低至少 90%、低至少 100%、低至少 110%、低至少 120%、低至少 130%、低至少 140%、低至少 150%、低至少 160%、低至少 170%、低至少 180%、低至少 190%、低至少 200%、低至少 210%、低至少 220%、低至少 230%、低至少 240%、低至少 200%、低至少 250%、低至少 260%、低至少 270%、低至少 280%、低至少 290% 或低至少 300%。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體中分化標記物之表現含量相比，藉由本揭露之方法產生之組織來源之上皮類器官之群體中分化標記物之表現含量低至少 50%。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體中分化標記物之表現含量相比，藉由本揭露之方法產生之組織來源之上皮類器官之群體中分化標記物之表現含量低至少 100%。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體中分化標記物之表現含量相比，藉由本揭露之方法產生之組織來源之上皮類器官之群體中分化標記物之表現含量低至少 200%。在某些實施例中，與參考組織來源之上皮類器官之群體中分化標記物之表現含量相比，藉由本揭露之方法產生之組織來源之上皮類器官之群體中分化標記物之表現含量低至少 300%。
在某些實施例中，用於產生胃腸類器官之方法包括使組織來源之上皮幹細胞與水凝膠接觸以產生水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。在某些實施例中，複數個組織來源之上皮幹細胞可與水凝膠組合以產生水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。在某些實施例中，該等複數個組織來源之上皮幹細胞包含約 1 × 10 4個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠至約 1 × 10 7個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠。在某些實施例中，該方法可進一步包括將水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物懸浮在培養基中以產生經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。 例如但不限於，分配到培養基中之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之體積可為至少約 10 µL。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物體積與培養基體積之比率為約 1:2 至約 1:15。在某些實施例中，該水凝膠係在與培養基接觸時固化。例如但不限於，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠由在大於約 37℃ 之溫度固化之材料構成。在某些實施例中，水凝膠可為商業可獲得之 ECM。在某些實施例中，ECM 為基底膜萃取物 (BME)，其為基底膜之可溶性形式。BME 之非限制性實例為 CULTREX® 基底膜萃取物 2 型 (R&D Systems)，包括層連結蛋白、巢蛋白、膠原蛋白 IV 及硫酸肝素蛋白聚醣。在某些實施例中，將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物分配到具有某個幾何形狀之培養基中。在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀為球形或類球形。在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀為絲狀結構。在某些實施例中，絲狀結構具有線形、蛇形或螺旋形形狀。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物係以小滴懸浮於培養基中。在某些實施例中，該方法可進一步包括將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之組織來源之上皮幹細胞在培養基 ( 例如，大腸傳代培養基 (Intesticult 類器官生長培養基 (OGM, StemCell Technologies 目錄號 06010) + 10 µM Y27632) 或迴腸培養基 (OGM + 10 µM Y27632 + 2.5 µM CHIR99021)) 中培養以分別產生大腸或迴腸類器官。在某些實施例中，該方法可進一步包括將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物碎片化以產生包含該組織來源之上皮類器官之碎片化結構。在某些實施例中，將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物碎片化可包括剪切經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物以產生碎片化結構， 例如藉由使含有經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之培養基上下移液。在某些實施例中，將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物碎片化產生長度及/或寬度較短之結構。例如但不限於，將絲狀結構碎片化產生長度、寬度或二者較短之結構。在某些實施例中，使用於本揭露之組織來源之上皮幹細胞或複數個組織來源之上皮幹細胞含在類器官碎片內。在某些實施例中，本揭露之方法產生組織來源之上皮類器官之群體，其以與參考組織來源之上皮類器官 ( 例如，參考組織來源之上皮類器官之群體) 相比不同 ( 例如較高或較低) 的含量表現標記物。在某些實施例中，差異表現標記物為 MKI67、LGR5、SOX9、CD44、MUC2、MUC5B、TFF3、KRT20、FABP1、ALPI 及/或 CEACAM7。
在某些實施例中，用於產生肺類器官之方法包括使組織來源之上皮幹細胞與水凝膠接觸以產生水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。在某些實施例中，複數個組織來源之上皮幹細胞可與水凝膠組合以產生水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。在某些實施例中，該等複數個組織來源之上皮幹細胞包含約 1 × 10 4個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠至約 1 × 10 7個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠。在某些實施例中，該方法可進一步包括將水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物懸浮在培養基中以產生經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。 例如但不限於，分配到培養基中之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之體積可為至少約 10 µL。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物體積與培養基體積之比率為約 1:2 至約 1:15。在某些實施例中，該水凝膠係在與培養基接觸時固化。例如但不限於，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠由在大於約 37℃ 之溫度固化之材料構成。在某些實施例中，水凝膠可為商業可獲得之 ECM。ECM 之非限制性實例為 MATRIGEL®。在某些實施例中，將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物分配到具有某個幾何形狀之培養基中。在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀為球形或類球形。在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀為絲狀結構。在某些實施例中，絲狀結構具有線形、蛇形或螺旋形形狀。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物係以小滴懸浮於培養基中。在某些實施例中，該方法可進一步包括將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之組織來源之上皮幹細胞在培養基 ( 例如，含有 10 µM ROCK 抑制劑之 SFFF 培養基) 中培養。在某些實施例中，該方法可進一步包括將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物碎片化以產生包含該組織來源之上皮類器官之碎片化結構。在某些實施例中，將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物碎片化可包括剪切經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物以產生碎片化結構， 例如藉由使含有經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之培養基上下移液。在某些實施例中，將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物碎片化產生長度及/或寬度較短之結構。例如但不限於，將絲狀結構碎片化產生長度、寬度或二者較短之結構。在某些實施例中，使用於本揭露之組織來源之上皮幹細胞或複數個組織來源之上皮幹細胞含在類器官碎片內。在某些實施例中，本揭露之方法產生組織來源之上皮類器官之群體，其以與參考組織來源之上皮類器官 ( 例如，參考組織來源之上皮類器官之群體) 相比不同 ( 例如較高或較低) 的含量表現標記物。
在某些實施例中，用於產生乳腺類器官之方法包括使組織來源之上皮幹細胞與水凝膠接觸以產生水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。在某些實施例中，複數個組織來源之上皮幹細胞可與水凝膠組合以產生水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。在某些實施例中，該等複數個組織來源之上皮幹細胞包含約 1 × 10 4個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠至約 1 × 10 7個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠。在某些實施例中，該方法可進一步包括將水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物懸浮在培養基中以產生經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。 例如但不限於，分配到培養基中之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之體積可為至少約 10 µL。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物體積與培養基體積之比率為約 1:2 至約 1:15。在某些實施例中，該水凝膠係在與培養基接觸時固化。例如但不限於，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠由在大於約 37℃ 之溫度固化之材料構成。在某些實施例中，水凝膠可為商業可獲得之 ECM。在某些實施例中，ECM 為基底膜萃取物 (BME)，其為基底膜之可溶性形式。BME 之非限制性實例為 CULTREX® 低生長因子 BME 2 型 (Trevigen, 3533-010-02)。在某些實施例中，將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物分配到具有某個幾何形狀之培養基中。在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀為球形或類球形。在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀為絲狀結構。在某些實施例中，絲狀結構具有線形、蛇形或螺旋形形狀。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物係以小滴懸浮於培養基中。在某些實施例中，該方法可進一步包括將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之組織來源之上皮幹細胞在培養基 ( 例如，含有 10 µM ROCK 抑制劑之 SFFF 培養基) 中培養。在某些實施例中，該方法可進一步包括將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物碎片化以產生包含該組織來源之上皮類器官之碎片化結構。在某些實施例中，將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物碎片化可包括剪切經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物以產生碎片化結構， 例如藉由使含有經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之培養基上下移液。在某些實施例中，將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物碎片化產生長度及/或寬度較短之結構。例如但不限於，將絲狀結構碎片化產生長度、寬度或二者較短之結構。在某些實施例中，使用於本揭露之組織來源之上皮幹細胞或複數個組織來源之上皮幹細胞含在類器官碎片內。在某些實施例中，本揭露之方法產生組織來源之上皮類器官之群體，其以與參考組織來源之上皮類器官 ( 例如，參考組織來源之上皮類器官之群體) 相比不同 ( 例如較高或較低) 的含量表現標記物。在某些實施例中，差異表現之標記物為 EpCAM、CD49f、細胞角蛋白 8 (K8)、細胞角蛋白 18 (K18)、細胞角蛋白 5 (K5)、細胞角蛋白 14 (K14) 及/或平滑肌肌動蛋白 (SMA)。
在某些實施例中，用於產生胰臟類器官之方法包括使組織來源之上皮幹細胞與水凝膠接觸以產生水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。在某些實施例中，複數個組織來源之上皮幹細胞可與水凝膠組合以產生水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。在某些實施例中，該等複數個組織來源之上皮幹細胞包含約 1 × 10 4個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠至約 1 × 10 7個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠。在某些實施例中，該方法可進一步包括將水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物懸浮在培養基中以產生經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。 例如但不限於，分配到培養基中之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之體積可為至少約 10 µL。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物體積與培養基體積之比率為約 1:2 至約 1:15。在某些實施例中，該水凝膠係在與培養基接觸時固化。例如但不限於，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠由在大於約 37℃ 之溫度固化之材料構成。在某些實施例中，水凝膠可為商業可獲得之 ECM。在某些實施例中，ECM 為基底膜萃取物 (BME)，其為基底膜之可溶性形式。BME 之非限制性實例為低生長因子 BME 2-RGF (基底膜萃取物 2 型 3533-010-02；AMSBIO，CULTREX®)。在某些實施例中，將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物分配到具有某個幾何形狀之培養基中。在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀為球形或類球形。在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀為絲狀結構。在某些實施例中，絲狀結構具有線形、蛇形或螺旋形形狀。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物係以小滴懸浮於培養基中。在某些實施例中，該方法可進一步包括在前 7 天過程中將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之組織來源之上皮幹細胞在優化人類胰臟類器官擴增培養基 ( 例如，包括補充有 1X N2 及 1X B27 (皆來自 GIBCO)、1.25 mM N-乙醯半胱胺酸 (Sigma-Aldrich)、10% RSPO1 條件無血清培養基、10 nM 人類 [Leu 15]-胃泌激素 I (Sigma-Aldrich)、50 ng/mL EGF (Peprotech)、25 ng/mL Noggin (Peprotech)、100 ng/mL FGF10 (Peprotech)、10 mM 菸鹼醯胺 (Sigma-Aldrich)、5 μM A83.01 (Tocris)、10 μM FSK (Tocris) 及 3 μM PGE2 (Tocris) 且補充有 10 μM Rho 激酶抑制劑 (Y27632, Sigma-Aldrich) 之基礎培養基) 中培養。在某些實施例中，該方法可進一步包括將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物碎片化以產生包含該組織來源之上皮類器官之碎片化結構。在某些實施例中，將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物碎片化可包括剪切經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物以產生碎片化結構， 例如藉由使含有經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之培養基上下移液。在某些實施例中，將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物碎片化產生長度及/或寬度較短之結構。例如但不限於，將絲狀結構碎片化產生長度、寬度或二者較短之結構。在某些實施例中，使用於本揭露之組織來源之上皮幹細胞或複數個組織來源之上皮幹細胞含在類器官碎片內。在某些實施例中，本揭露之方法產生組織來源之上皮類器官之群體，其以與參考組織來源之上皮類器官 ( 例如，參考組織來源之上皮類器官之群體) 相比不同 ( 例如較高或較低) 的含量表現標記物。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為胰臟類器官，且差異表現標記物為 CD133、LGR5、PDX1、SOX9、ALDH1A1、NEUROG3、NKX6.1、角蛋白 19 (KRT19)、MUC1、INS、GCG 及/或 AMY。
在某些實施例中，用於產生肝類器官之方法包括使組織來源之上皮幹細胞與水凝膠接觸以產生水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。在某些實施例中，複數個組織來源之上皮幹細胞可與水凝膠組合以產生水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。在某些實施例中，複數個組織來源之上皮幹細胞包括盤 ( 例如，48 孔盤) 中每孔約 3,000 至約 10,000 個組織來源之上皮幹細胞。在某些實施例中，該方法可進一步包括將水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物懸浮在培養基中以產生經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。 例如但不限於，分配到培養基中之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之體積可為至少約 10 µL。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物體積與培養基體積之比率為約 1:2 至約 1:15。在某些實施例中，該水凝膠係在與培養基接觸時固化。例如但不限於，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之水凝膠由在大於約 37℃ 之溫度固化之材料構成。在某些實施例中，水凝膠可為商業可獲得之 ECM。在某些實施例中，ECM 為基底膜萃取物 (BME)，其為基底膜之可溶性形式。ECM 之非限制性實例為 MATRIGEL® (BD Biosciences) 或低生長因子 BME 2 (基底膜萃取物，2 型，Pathclear)。在某些實施例中，將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物分配到具有某個幾何形狀之培養基中。在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀為球形或類球形。在某些實施例中，經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之幾何形狀為絲狀結構。在某些實施例中，絲狀結構具有線形、蛇形或螺旋形形狀。在某些實施例中，水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物係以小滴懸浮於培養基中。在某些實施例中，該方法可進一步包括將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之組織來源之上皮幹細胞在培養基中培養，該培養基 例如包含 AdDMEM/F12 (Invitrogen)，其補充有 1% N2 (GIBCO) 及 1% B27 (GIBCO)、1.25 mM N-乙醯半胱胺酸 (Sigma)、10 nM 胃泌激素 (Sigma) 及生長因子：50 ng/ml EGF (Peprotech)、10% RSPO1 條件培養基 (自製)、100 ng/ml FGF10 (Peprotech)、25 ng/ml HGF (Peprotech)、10 mM 菸鹼醯胺 (Sigma)、5 µM A83.01 (Tocris) 及 10 µM FSK (Tocris)，在分離後的前 3 天過程中，補充有 25 ng/ml Noggin (Peprotech)、30% Wnt 培養基 (如 Barker 等人Cell Stem Cell 6:25-36 (2010) 所述) 及 10 µM (Y27632, Sigma Aldrich) 或 hES 細胞選殖恢復溶液 (Stemgent) 以建立培養物。在某些實施例中，隨後將培養基更換為 例如不含 Noggin、Wnt、Y27632 及 hES 細胞選殖恢復溶液之培養基。在某些實施例中，將肝類器官在補充有 BMP7 (25 ng/ml) 之上述培養基中接種並培養 7 至 10 天。在某些實施例中，隨後將培養基更換為分化培養基， 例如，其包括補充有 1% N2 及 1% B27 並含有 EGF (50 ng/ml)、胃泌激素 (10 nM, Sigma)、HGF (25 ng/ml)、FGF19 (100 ng/ml)、A8301 (500 nM)、DAPT (10 µM)、BMP7 (25 ng/ml) 及地塞米松 (30 µM) 之 AdDMEM/F12 培養基，以產生肝細胞類器官。在某些實施例中，該方法可進一步包括將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物碎片化以產生包含該組織來源之上皮類器官之碎片化結構。在某些實施例中，將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物碎片化可包括剪切經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物以產生碎片化結構， 例如藉由使含有經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之培養基上下移液。在某些實施例中，將經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物碎片化產生長度及/或寬度較短之結構。例如但不限於，將絲狀結構碎片化產生長度、寬度或二者較短之結構。在某些實施例中，使用於本揭露之組織來源之上皮幹細胞或複數個組織來源之上皮幹細胞含在類器官碎片內。在某些實施例中，本揭露之方法產生組織來源之上皮類器官之群體，其以與參考組織來源之上皮類器官 ( 例如，參考組織來源之上皮類器官之群體) 相比不同 ( 例如較高或較低) 的含量表現標記物。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官為肝類器官，且差異表現標記物為 LGR5、ALB、CYP3A4、HNF4A、KRT19、KRT7 及/或 SOX9。
在某些實施例中，所揭示方法之一個或多個步驟可以使用機器人及/或自動化組件來進行。在某些實施例中，本揭露之方法可包括使用機器人及/或自動化組件來產生組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，所揭示方法之一個或多個步驟可使用機器人及/或自動化組件來進行以產生組織來源之上皮類器官。可在所揭示之方法中使用之機器人及/或自動化組件之非限制性實例包括自動化液體處理器 ( 例如，液體處理機器人)、3D 列印機、注射泵、電子移液管 ( 例如，具有或不具有移液機器人) 或其組合。電子移液管 ( 例如，具有移液機器人) 之非限制性實例為來自 Integra Biosciences 之 Assist Plus。在某些實施例中，所揭示方法之一個或多個步驟可以藉由自動化液體處理器 ( 例如，液體處理機器人) 來進行。
在某些實施例中，藉由本揭露之方法產生之組織來源之上皮類器官培養物之傳代藉由機器人及/或自動化組件來進行。在某些實施例中，自動化機器人可以進行本揭露實例 1 之「類器官維持」中描述之方法， 例如，進行以下步驟中之任一者：添加 TrypLE Express、加熱類器官培養物、研磨類器官培養物以解離細胞、添加 PBS、沉澱細胞、將細胞重懸於 BME 中、冷卻培養物、平鋪細胞、以培養基覆蓋類器官或其組合。在某些實施例中，細胞解離可使用機器人及/或自動化組件來進行。在某些實施例中， 例如在類器官維持過程中或在組織來源之上皮類器官產生過程中之培養基更換可使用機器人及/或自動化組件來進行。
在某些實施例中，細胞培養基中 BOBA 及/或 SOBA 之產生藉由機器人及/或自動化組件來進行。在某些實施例中，自動化機器人可進行本揭露實例 1 之「經懸浮之水凝膠 BOBA 培養物」及/或「經懸浮之水凝膠 SOBA 碎片培養物」中描述之方法， 例如，進行以下步驟中之任一者：加熱培養基、將類器官細胞-BME 溶液作為小滴分配到溫熱培養基中以產生 BOBA，將類器官細胞-BME 溶液以 X-Y 平面中線形、蛇形或螺旋形運動方式分配到溫熱培養基中以產生 SOBA、研磨 SOBA 絲培養物以產生 SOBA 碎片、更換媒體或其組合。在某些實施例中，將類器官細胞-BME 溶液分配到溫熱培養基中以產生 BOBA 及/或 SOBA 可使用機器人及/或自動化組件來進行， 例如可藉由液體處理機器人來進行。在某些實施例中，更換培養基可使用機器人及/或自動化組件來進行， 例如可藉由液體處理機器人來進行。在某些實施例中，研磨 SOBA 絲培養物以產生 SOBA 碎片可使用機器人及/或自動化組件來進行， 例如可藉由液體處理機器人來進行。
在某些實施例中， 例如本文所述之高生產量方法可使用機器人及/或自動化組件來進行。例如但不限於，本文所揭示之使用方法中任一者， 例如如第 IV 節所描述的，可部分地使用機器人及/或自動化組件來進行。在某些實施例中，用於篩選藥劑 例如治療劑之方法及用於使用所揭示之組織來源之上皮類器官進行基因體篩選之方法可部分地使用機器人及/或自動化組件來進行。 IV. 使用方法
本揭露提供了使用所揭示之類器官或包括此等類器官之組成物之方法。在某些實施例中，本揭露之組織來源之上皮類器官可用於篩選測定。例如但不限於，本揭露提供了用於篩選藥劑 ( 例如治療劑) 之方法，以及用於使用所揭示之組織來源之上皮類器官進行基因體篩選之方法。在某些實施例中，本揭露之組織來源之上皮類器官可用於產生基於類器官之模型。
在某些實施例中，本揭露之類器官或其組成物可用於鑑定具有治療效果之藥劑。在某些實施例中，本揭露之類器官或其組成物可用於鑑定可有效預防及/或治療疾病之治療劑。在某些實施例中，本揭露之類器官或其組成物可用於鑑定可有效改善疾病症狀之治療劑。
在某些實施例中，本揭露之類器官或其組成物可用於研究疾病之生物學及/或發病機制。例如但不限於，本揭露之類器官或其組成物可與藥劑接觸以研究疾病之生物學及/或發病機制。
在某些實施例中，本揭露之類器官或其組成物可用於鑑定可能有毒之藥劑， 例如治療劑。在某些實施例中，本揭露之類器官或其組成物可用於鑑定藥劑 ( 例如治療劑) 可能有毒的濃度。
在某些實施例中，用於鑑定可有效預防及/或治療疾病之治療劑之方法、用於鑑定可有效改善疾病症狀之治療劑之方法及/或用於鑑定可能有毒之治療劑之方法可包括使組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體與治療劑接觸。在某些實施例中，該方法可包括使包括組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體之組成物與治療劑接觸。在某些實施例中，將組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體嵌入在懸浮於之培養基中之水凝膠中，如本文所述。
在某些實施例中，用於研究疾病之生物學及/或發病機制之方法可包括使組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體與藥劑接觸。在某些實施例中，該方法可包括使包括組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體之組成物與藥劑接觸。在某些實施例中，將組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體嵌入在懸浮於之培養基中之水凝膠中，如本文所述。
在某些實施例中，使藥劑 ( 例如治療劑) 與組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體 (或其組成物) 接觸約 1 分鐘至約 3 年， 例如，約 15 分鐘至約 3 年、約 15 分鐘至約 2.5 年、約 15 分鐘至約 2 年、約 15 分鐘至約 1.5 年、約 15 分鐘至約 1 年、約 15 分鐘至約 183 天、約 15 分鐘至約 150 天、約 15 分鐘至約 100 天、約 15 分鐘至約 50 天、約 1 天至約 3 年、約 10 天至約 3 年、約 20 天至約 3 年、約 50 天至約 3 年、約 100 天至約 3 年、約 150 天至約 3 年、約 183 天至約 3 年、約 1 年至約 3 年、約 1.5 年至約 3 年、約 2 年至約 3 年、或約 2.5 年至約 3 年。在某些實施例中，使藥劑 ( 例如治療劑) 與組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體 (或其組成物) 接觸約 1 分鐘至約 100 天。在某些實施例中，使藥劑 ( 例如治療劑) 與組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體 (或其組成物) 接觸約 15 分鐘至約 100 天。在某些實施例中，使藥劑 ( 例如治療劑) 與組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體 (或其組成物) 接觸約 1 分鐘至約 150 天。在某些實施例中，使藥劑 ( 例如治療劑) 與組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體 (或其組成物) 接觸約 15 分鐘至約 150 天。在某些實施例中，使藥劑 ( 例如治療劑) 與組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體 (或其組成物) 接觸約 1 分鐘至約 1 年。在某些實施例中，使藥劑 ( 例如治療劑) 與組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體 (或其組成物) 接觸約 15 分鐘至約 1 年。在某些實施例中，使藥劑 ( 例如治療劑) 與組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體 (或其組成物) 接觸約 1 分鐘至約 2 年。在某些實施例中，使藥劑 ( 例如治療劑) 與組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體 (或其組成物) 接觸約 15 分鐘至約 2 年。在某些實施例中，使藥劑 ( 例如治療劑) 與組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體 (或其組成物) 接觸約 1 分鐘至約 10 天。在某些實施例中，使藥劑 ( 例如治療劑) 與組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體 (或其組成物) 接觸約 15 分鐘至約 10 天。在某些實施例中，使藥劑 ( 例如治療劑) 與組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體 (或其組成物) 接觸約 1 小時至約 10 天、約 12 小時至約 10 天、約 1 天至約 10 天、約 2 天至約 10 天、約 3 天至約 10 天、約 4 天至約 10 天、約 5 天至約 10 天、約 6 天至約 10 天、約 7 天至約 10 天、約 8 天至約 10 天、約 9 天至約 10 天、約 15 分鐘至約 10 天、約 15 分鐘至約 9 天、約 15 分鐘至約 8 天、約 15 分鐘至約 7 天、約 15 分鐘至約 6 天、約 15 分鐘至約 5 天、約 15 分鐘至約 4 天、約 15 分鐘至約 3 天、約 15 分鐘至約 2 天、約 15 分鐘至約 1 天、約 1 天至約 5 天、約 1 天至約 2 天、約 2 天至約 5 天、或約 2 天至約 10 天。在某些實施例中，使藥劑 ( 例如治療劑) 與組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體 (或其組成物) 接觸約 2 天至約 10 天。
在某些實施例中，該方法可包括使不同組織來源之上皮類器官之群體 (或其組成物) 與增加濃度之藥劑 ( 例如治療劑)接觸，以允許劑量反應研究。
在某些實施例中，藥劑可為任何所關注的藥劑。在某些實施例中，藥劑為已知影響疾病之生物學及/或發病機制之分子。可用於所揭示之方法中之藥劑之非限制性實例包括肽、多肽、小分子、細胞、基因編輯系統或核酸。在某些實施例中，此等藥劑可為影響細胞傳訊、核酸表現、蛋白質表現、細胞生長、細胞分化及/或細胞存活之藥劑。
在某些實施例中，該藥劑為治療劑。在某些實施例中，治療劑可為任何所關注的治療劑。在某些實施例中，治療劑獲自潛在治療劑文庫。可使用所揭示之方法分析及/或鑑定之治療劑之非限制性實例包括基於肽之治療劑、基於多肽之治療劑、小分子治療劑、基於細胞之治療劑、基因編輯系統、基於核酸之治療劑及其組合。
在某些實施例中，治療劑為基於肽之治療劑。在某些實施例中，基於肽之治療劑包括分子量約 5,000 Da 或更小之肽。基於肽之治療劑之非限制性實例包括生長因子、抗感染劑、抗真菌劑、抗細菌劑、受體配體及酪胺酸激酶抑製劑。Wang 等人(2022) Signal Transduction and Targeted Therapy 7:48 ( 例如表 1 及表 2) 中揭示了肽治療劑之其他非限制性實例，其內容以引用方式全文併入本文中。
在某些實施例中，治療劑為基於多肽之治療劑。基於多肽之治療劑之非限制性實例包括基於抗體之治療劑，諸如抗體及抗體藥物結合物、激素及酵素。在某些實施例中，抗體可為促效劑抗體或拮抗劑抗體。在某些實施例中，抗體可為抗體片段。抗體片段之非限制性實例包括但不限於 Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab') 2、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體分子 ( 例如，scFv) 及由抗體片段形成之多特異性抗體。
在某些實施例中，治療劑為小分子治療劑。例如但不限於，小分子治療劑為分子量小於約 1,000 Da 之化合物。在某些實施例中，小分子治療劑包括細胞週期調節劑、激酶調節劑 ( 例如，激酶抑制劑或活化劑)、酵素抑制劑、受體調節劑 ( 例如，受體抑制劑或活化劑)、抗感染劑、抗真菌劑、抗細菌劑、化學治療劑及抗炎劑。
在某些實施例中，治療劑為基於細胞之治療劑。 基於細胞之治療劑之非限制性實例包括細菌細胞及免疫細胞。免疫細胞之非限制性實例包括嗜中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球、肥大細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞、自然殺手細胞 (NK 細胞) 及淋巴球， 例如B 細胞及 T 細胞 ( 例如，細胞毒性 T 細胞、自然殺傷 T 細胞、調節性 T 細胞及輔助性 T 細胞)。在某些實施例中，免疫細胞可為經過基因工程改造以表現嵌合抗原受體 (CAR) ( 例如，CAR T 細胞及 CAR NK 細胞) 或 T 細胞受體 (TCR) ( 例如，異源性 TCR) 之經修飾之免疫細胞。
在某些實施例中，治療劑為基因調節系統及/或基因調節系統之組分。在某些實施例中，基因調節系統及/或基因調節系統之組分為基因編輯系統、CRISPRi、基因表現促進系統、基因抑制促進系統、基於核酸之治療劑、轉錄因子及/或轉錄後修飾之調節劑。
在某些實施例中，治療劑為基因編輯系統。基因編輯系統之非限制性實例包括歸巢核酸內切酶或大範圍核酸酶、鋅指核酸酶 (ZFN)、類轉錄活化因子效應核酸酶 (TALEN) 及 CRISPR 基因編輯系統。在某些實施例中，治療劑為 CRISPR 基因編輯系統， 例如CRISPR/Cas9 基因編輯系統。
在某些實施例中，治療劑為基於核酸之治療劑。基於核酸之治療劑之非限制性實例包括基於 RNA 之治療劑，包括 siRNA、微小 RNA、RNA 適體、核酶、RNA 誘餌及 RNAi。在某些實施例中，基於核酸之治療劑包括基於 DNA 之治療劑，包括反義寡核苷酸 (ASO) 及 DNA 適體。
在某些實施例中，該方法可進一步包括分析組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官 (或組織來源之上皮類器官之細胞) 之群體中之變化。在某些實施例中，該方法可進一步包括分析在藥劑存在下發生的組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官 (或組織來源之上皮類器官之細胞) 之群體中之變化。例如但不限於，該方法可進一步包括分析組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官 (或組織來源之上皮類器官之細胞) 之群體中之變化，該變化指示治療劑之有效性及/或毒性。在某些實施例中，該方法包括分析組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體中之變化，該變化指示治療劑與未以治療劑治療之組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體相比之有效性及/或毒性。
在某些實施例中，本揭露之類器官或其組成物可用於進行基因體篩選。在某些實施例中，基因體篩選可用於鑑定用於產生突變之基因編輯系統。突變之非限制性實例包括缺失、重複、插入及核苷酸取代。在某些實施例中，該方法可包括提供組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體 (或其組成物) 並在組織來源之上皮類器官之一個或多個細胞之基因體中產生突變。在某些實施例中，使用基因調節系統及/或基因調節系統之組分產生突變。在某些實施例中，基因調節系統及/或基因調節系統之組分為基因編輯系統、CRISPRi、RNAi、基因表現促進系統、基因抑制促進系統、基於核酸之治療劑、轉錄因子及/或轉錄後修飾之調節劑。在某些實施例中，基因編輯系統為 CRISPR 系統， 例如，CRISPR/Cas9 基因編輯系統。在某些實施例中，該方法可進一步包括分析組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體中與突變相關之變化。在某些實施例中，該方法包括分析與不具有突變之組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體相比，組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體中與突變相關之變化。
在某些實施例中，本揭露進一步提供了用於使用本揭露之組織來源之上皮類器官產生上皮細胞模型之方法。在某些實施例中，該方法可包括提供組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體 (或其組成物)、將組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體消化成單細胞，以及將單細胞在培養基中培養以產生細胞單層。在某些實施例中，將該單細胞在可滲透細胞培養內件 (cell culture insert) 上培養。在某些實施例中，該培養基為分化培養基。在某些實施例中，該培養基為幹細胞促進培養基。在某些實施例中，該培養基為細胞生長培養基。
在某些實施例中，細胞單層可以用於本文所揭示之方法中任一者， 例如用於本文所揭示之篩選方法。例如但不限於，細胞單層可用於篩選治療劑及用於進行基因體篩選。在某些實施例中，本揭露之單層可用於研究疾病之生物學及/或發病機制。
在某些實施例中，用於使用本揭露之細胞單層篩選治療劑之方法可包括接觸細胞單層並分析細胞單層之變化，該變化指示治療劑之有效性、流佈及/或毒性。在某些實施例中，該方法包括與未以治療劑處理之細胞單層相比，分析細胞單層中之變化，該變化指示治療劑之有效性及/或毒性。
在某些實施例中，用於使用本揭露之細胞單層進行基因體篩選之方法可包括提供藉由本文所述之方法產生之細胞單層，在細胞單層之一個或多個細胞之基因體中產生突變，以及分析細胞單層中與突變相關之變化。在某些實施例中，該方法包括分析與不具有突變之細胞單層相比，細胞單層中與突變相關之變化。
在某些實施例中，組織來源之上皮類器官 (或其細胞)、組織來源之上皮類器官 (或其細胞) 之群體或細胞單層 (或其細胞) 中之變化可為以下中之變化：細胞生存力、細胞增生、類器官尺寸、細胞形態、類器官形態、對水凝膠之侵襲性、運動性、分化狀態、突變狀態、核型、染色體畸變、核酸表現含量、蛋白質表現含量、核酸修飾 ( 例如，甲基化)、轉譯後修飾 ( 例如，磷酸化、泛蛋白化及/或醣基化)、細胞傳訊路徑之活化、細胞傳訊路徑之抑制、酵素活性 ( 例如，酵素裂解)、染色質可及性、組蛋白修飾及其他表觀遺傳變化、類器官之物理特性 (包括胃腸上皮障壁之滲透性、pH、氧張力以及管腔及基底膜中其他代謝物及水凝膠及/或培養基中之分泌因子之濃度)、細胞介素及激素之濃度、藥物靈敏度、藥物吸收及代謝藥物動力學及藥效學、力測量值、類器官、管腔及培養基/水凝膠內生物分子之間相互作用之測量值以及膜電位。
在某些實施例中，組織來源之上皮類器官 (或其細胞)、組織來源之上皮類器官 (或其細胞) 之群體或細胞單層 (或其細胞) 中之變化可為細胞生存力中之變化。
在某些實施例中，組織來源之上皮類器官 (或其細胞)、組織來源之上皮類器官 (或其細胞) 之群體或細胞單層 (或其細胞) 中之變化可為細胞增生中之變化。
在某些實施例中，組織來源之上皮類器官 (或其細胞)、組織來源之上皮類器官 (或其細胞) 之群體或細胞單層 (或其細胞) 中之變化可為類器官尺寸中之變化。
在某些實施例中，組織來源之上皮類器官 (或其細胞)、組織來源之上皮類器官 (或其細胞) 之群體或細胞單層 (或其細胞) 中之變化可為突變狀態中之變化。
在某些實施例中，組織來源之上皮類器官 (或其細胞)、組織來源之上皮類器官 (或其細胞) 之群體或細胞單層 (或其細胞) 中之變化可為 RNA 表現含量及/或蛋白質表現含量中之變化。
在某些實施例中，組織來源之上皮類器官 (或其細胞)、組織來源之上皮類器官 (或其細胞) 之群體或細胞單層 (或其細胞) 中之變化可為幹細胞及/或增生標記物之 RNA 表現含量及/或蛋白質表現含量中之變化。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官、組織來源之上皮類器官之群體或細胞單層中之變化可為幹細胞及/或增生標記物之蛋白質表現含量中之變化。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官、組織來源之上皮類器官之群體或細胞單層中之變化可為幹細胞及/或增生標記物之 RNA 表現含量中之變化。例如但不限於，該變化可為 MKI67 表現中之變化、EpCAM 表現中之變化、CD49f 表現中之變化、ASCL2 表現中之變化、CD133 表現中之變化、LGR5 表現中之變化、SOX9 表現中之變化、ALDH1A1 表現中之變化、NEUROG3 表現中之變化、NKX6.1 表現中之變化、SMOC2 表現中之變化、PDX1 表現中之變化、BMI1 表現中之變化及/或 CD44 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 MKI67 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 ASCL2 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 LGR5 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 SOX9 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 SMOC2 表現中之變化。在某些實施例中，變化可以為 CD44 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 EpCAM 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 CD49f 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 CD133 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 ALDH1A1 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 NEUROG3 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 NKX6.1 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 PDX1 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 BMI1 表現中之變化。
在某些實施例中，組織來源之上皮類器官 (或其細胞)、組織來源之上皮類器官 (或其細胞) 之群體或細胞單層 (或其細胞) 中之變化可為分化標記物之 RNA 表現含量及/或蛋白質表現含量中之變化。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官、組織來源之上皮類器官之群體或細胞單層中之變化可為分化標記物之 RNA 表現含量中之變化。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官、組織來源之上皮類器官之群體或細胞單層中之變化可為分化標記物之蛋白質表現含量中之變化。例如但不限於，該變化可為 角蛋白 20 (KRT20) 表現中之變化、FABP1 表現中之變化、MUC2 表現中之變化、MUC5B 表現中之變化、MUC5AC 表現中之變化、MUC6 表現中之變化、TFF3 表現中之變化、ALPI 表現中之變化、SI 表現中之變化、CEACAM7 表現中之變化、角蛋白 19 (KRT19) 表現中之變化、角蛋白 7 (KRT7) 表現中之變化、SOX9 表現中之變化、MUC1 表現中之變化、INS 表現中之變化、GCG 表現中之變化、AMY 表現中之變化、ALB 表現中之變化、CYP3A4 表現中之變化、HNF4A 表現中之變化、細胞角蛋白 8 (K8) 表現中之變化、細胞角蛋白 18 (K18) 表現中之變化、細胞角蛋白 5 (K5) 表現中之變化、細胞角蛋白 14 (K14) 表現中之變化及/或平滑肌肌動蛋白 (SMA) 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 KRT20 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 FABP1 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 MUC2 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 MUC5B 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 TFF3 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 ALPI 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 SI 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 CEACAM7 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為角蛋白 19 (KRT19) 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為角蛋白 7 (KRT7) 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 SOX9 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 MUC1 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 INS 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 GCG 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 AMY 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 ALB 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 CYP3A4 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 HNF4A 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為細胞角蛋白 8 (K8) 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為細胞角蛋白 18 (K18) 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為細胞角蛋白 5 (K5) 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為細胞角蛋白 14 (K14) 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為平滑肌肌動蛋白 (SMA) 表現中之變化。在某些實施例中，變化可為 MUC5AC 表現中之變化。 在某些實施例中，變化可為 MUC6 表現中之變化。
在某些實施例中，為了確定組織來源之上皮類器官、組織來源之上皮類器官之細胞及/或單層或單層細胞之變化，組織來源之上皮類器官培養物或單層培養物可藉由流式細胞分析技術、RNA 及蛋白質表現、類器官及培養基中之細胞介素及代謝物測量值、細胞生存力及增生測定、監測上皮細胞及免疫細胞運動之顯微術、障壁功能、遷移、增生、RNA、蛋白質及細胞器之亞細胞定位、細胞硬度及其他測定來進行分析。組織來源之上皮類器官、組織來源之上皮類器官之細胞、細胞單層及/或細胞單層之細胞可以染料標記或以編碼螢光蛋白及/或螢光素酶之核酸轉染，以使得能夠使用成像及生物發光測定進行細胞之視覺化及定量。
在某些實施例中，本揭露提供了用於鑑定可有效治療疾病之治療劑之方法。在某些實施例中，該方法可包括 (i) 使 (a) 組織來源之上皮類器官 (或其組成物)，(b) 組織來源之上皮類器官之群體 (或其組成物)，(c) 來源自組織來源之上皮類器官之細胞單層，或 (d) 組織來源之上皮類器官之群體與治療劑接觸，以及 (ii) 分析組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體中之變化，該變化指示治療劑之有效性及/或毒性。在某些實施例中，變化指示治療劑之有效性。在某些實施例中，變化指示治療劑之毒性。例如但不限於，如果與未以治療劑治療之組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之細胞之生存力相比，在治療劑存在下組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之細胞之生存力降低，則指示治療劑係有毒的。
在某些實施例中，本揭露提供了進行基因體篩選之方法。在某些實施例中，該方法可包括 (i) 提供 (a) 組織來源之上皮類器官 (或其組成物)，(b) 組織來源之上皮類器官之群體 (或其組成物)，或 (c) 來源自組織來源之上皮類器官之細胞單層，(ii) 在組織來源之上皮類器官或細胞單層之一個或多個細胞之基因體中產生突變，以及 (iii) 分析組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體中與突變相關之變化。例如但不限於，如果與參考細胞或組織來源之上皮類器官相比，在具有基因體突變之組織來源之上皮類器官或包括一個或多個細胞之細胞單層中觀察到變化，則這指示該變化為基因體突變之結果。 V. 系統
本揭露進一步提供了使用於本揭露之系統。在某些實施例中，本揭露進一步提供了用於進行目前所揭示之方法之系統。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生組織來源之上皮類器官之系統， 例如淚腺類器官、扁桃腺類器官、唾液腺類器官、胃腸類器官、甲狀腺類器官、肺類器官、乳腺類器官、肝類器官、膽管類器官、胃類器官、腎類器官、胰臟類器官、子宮內膜類器官、輸卵管類器官、子宮頸類器官、前列腺類器官、膀胱類器官、卵巢類器官、味蕾類器官或滋胚內層類器官。在某些實施例中，本揭露提供了用於鑑定可有效治療疾病之治療劑之系統。在某些實施例中，本揭露提供了用於進行基因體篩選之系統。在某些實施例中，本揭露提供了用於產生上皮細胞模型之系統。
在某些實施例中，本揭露之系統可包括能夠進行目前所揭示之方法之機器人及/或自動化組件。在某些實施例中，本揭露之系統包括能夠產生組織來源之上皮類器官之機器人及/或自動化組件。在某些實施例中，本揭露之系統包括一個或多個機器人及/或自動化組件，其用於進行所揭示之用於產生組織來源之上皮類器官之方法之一個或多個步驟。機器人及/或自動化組件之非限制性實例包括自動化液體處理器 ( 例如，液體處理機器人)、3D 列印機、注射泵或其組合。在某些實施例中，本揭露之系統包括一個或多個自動化液體處理器。
在某些實施例中，機器人及/或自動化組件用於進行目前所揭示之方法及/或產生組織來源之上皮類器官以使用於高生產量研究。在某些實施例中，本揭露之系統可包括用於進行高生產量方法之一個或多個機器人及/或自動化組件， 例如，如本文所述。例如但不限於，本揭露之系統可包括一個或多個機器人及/或自動化組件，其可用於進行本文所揭示之使用方法中之任一者。在某些實施例中，本揭露之系統可包括一個或多個機器人及/或自動化組件，其用於篩選藥劑 ( 例如，治療劑)，並用於使用所揭示之組織來源之上皮類器官進行基因體篩選。
在某些實施例中，機器人及/或自動化組件能夠使組織來源之上皮類器官培養物傳代。在某些實施例中，自動化機器人可以進行本揭露實例 1 之「類器官維持」中描述之方法， 例如，進行以下步驟中之任一者：添加 TrypLE Express、加熱類器官培養物、研磨類器官培養物以解離細胞、添加 PBS、沉澱細胞、將細胞重懸於 BME 中、冷卻培養物、平鋪細胞、以培養基覆蓋類器官或其組合。在某些實施例中，本揭露之系統可包括一個或多個用於解離細胞之機器人及/或自動化組件。在某些實施例中，本揭露之系統可包括一個或多個機器人及/或自動化組件，其用於 例如在類器官維持過程中或在產生組織來源之上皮類器官過程中進行培養基更換。
在某些實施例中，機器人及/或自動化組件能夠產生 BOBA 及/或 SOBA。在某些實施例中，自動化機器人可進行本揭露實例 1 之「經懸浮之水凝膠 BOBA 培養物」及/或「經懸浮之水凝膠 SOBA 碎片培養物」中描述之方法， 例如，進行以下步驟中之任一者：加熱培養基、將類器官細胞-BME 溶液作為小滴分配到溫熱培養基中以產生 BOBA，將類器官細胞-BME 溶液以 X-Y 平面中線形、蛇形或螺旋形運動方式分配到溫熱培養基中以產生 SOBA、研磨 SOBA 絲培養物以產生 SOBA 碎片、更換媒體或其組合。在某些實施例中，本揭露之系統可包括一個或多個機器人及/或自動化組件，其用於將類器官細胞-BME 溶液分配到溫熱培養基中以產生 BOBA 及/或 SOBA。在某些實施例中，本揭露之系統可包括一個或多個液體處理機器人，其用於將類器官細胞-BME 溶液分配到溫熱培養基中以產生 BOBA 及/或 SOBA。在某些實施例中，本揭露之系統可包括用於進行媒介物更換之一個或多個機器人及/或自動化組件。
在某些實施例中，本揭露之系統可包括組織來源之上皮類器官、組織來源之上皮類器官之群體及/或包括組織來源之上皮類器官之組成物， 例如淚腺類器官、扁桃腺類器官、唾液腺類器官、胃腸類器官、甲狀腺類器官、肺類器官、乳腺類器官、肝類器官、膽管類器官、胃類器官、腎類器官、胰臟類器官、子宮內膜類器官、輸卵管類器官、子宮頸類器官、前列腺類器官、膀胱類器官、卵巢類器官、味蕾類器官或滋胚內層類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官選自由以下所組成之群組：肺類器官、胃腸類器官、肝類器官、胰臟類器官、乳腺類器官及其組合。在某些實施例中，系統包括由一個或多個組織來源之上皮幹細胞產生之組織來源之上皮類器官。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官以水凝膠形式提供。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官可嵌入在水凝膠中並懸浮在培養基中。組織來源之上皮類器官 (或其組成物) 或產生此等組織來源之上皮類器官之方法之非限制性實例分別在第 II 節及第 III 節中揭示。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官可提供在容器中， 例如培養容器。在某些實施例中，組織來源之上皮類器官可提供在培養容器中， 例如燒瓶及/或多孔盤。
在某些實施例中，本揭露之系統可進一步包括用於使用組織來源之上皮類器官來確定待測試之治療劑是否有效治療疾病之說明。在某些實施例中，本揭露之系統可進一步包括用於使用組織來源之上皮類器官來確定基因體突變之影響之說明。在某些實施例中，本揭露之系統可進一步包括用於產生上皮細胞模型之說明。
在某些非限制性實施例中，本揭露之系統可進一步包括一種或多種藥劑及其他組分 ( 例如，染料、抗體、引體、探針等) 以確定變化， 例如蛋白質或核酸表現、組織來源之上皮類器官、組織來源之上皮類器官之細胞、細胞單層或細胞單層之細胞中之變化。此等變化之非限制性實例在第 III 節中揭示。在某些實施例中，本揭露之系統可包括一個或多個機器人及/或自動化組件，其用於分析組織來源之上皮類器官、組織來源之上皮類器官之細胞、細胞單層或細胞單層之細胞中之變化。 VI. 示例性實施例A. 目前所揭示之主題提供了一種產生組織來源之上皮類器官之方法，該方法包含： a)   使組織來源之上皮幹細胞與水凝膠接觸以產生水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物； b)   將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物懸浮在培養基中以產生經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物；以及 c)   將該經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物在該培養基中培養以產生組織來源之上皮類器官。 A1.如 A 之方法，其中使複數個組織來源之上皮幹細胞與該水凝膠接觸以產生該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。 A2.如 A1 之方法，其中該等複數個組織來源之上皮幹細胞包含約 1 × 10 4個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠至約 1 × 10 7個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠。 A3.如 A1 或 A2 之方法，其中該等複數個組織來源之上皮幹細胞包含在組織碎片、類器官碎片或其組合內。 A4.如 A 至 A2 之方法，其中該組織來源之上皮幹細胞或該等複數個組織來源之上皮幹細胞分離自原生上皮組織。 A5.如 A 至 A4 中任一項之方法，其中該水凝膠係在與該培養基接觸時固化。 A6.如 A 至 A5 中任一項之方法，其中將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物懸浮在該培養基中包含將含有該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之分配裝置浸沒在該培養基中並將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物分配到該培養基中。 A7.如 A 至 A6 中任一項之方法，其中該培養基之溫度為約 25℃ 至約 50℃。 A7-1.如 A 至 A7 中任一項之方法，其中該培養基之溫度為約 30℃ 至約 50℃。 A8.如 A 至 A7-1 中任一項之方法，其中該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之溫度為約 2℃ 至約 25℃。 A8-1.如 A 至 A8 中任一項之方法，其中該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之溫度為約 2℃ 至約 20℃。 A9.如 A 至 A8-1 中任一項之方法，其中該水凝膠係選自由以下所組成之群組：合成水凝膠、天然水凝膠及其組合。 A10.如 A9 之方法，其中該天然水凝膠包含基底膜萃取物 (BME) 或細胞外基質 (ECM) 成分。 A11.如 A 至 A10 中任一項之方法，其中該水凝膠具有等於或大於損耗模數 G'' 之儲存模數 G'。 A12.如 A 至 A11 中任一項之方法，其中該經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物具有包含大於約 0.1 mm 之長度、寬度及/或直徑之幾何形狀。 A13.如 A12 之方法，其中該經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物具有包含約 0.1 mm 至約 1,000 mm 之長度、寬度及/或直徑之幾何形狀。 A14.如 A 至 A13 中任一項之方法，其中該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物係以小滴懸浮在該培養基中。 A15.如 A 至 A13 中任一項之方法，其中該經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物具有絲狀結構。 A16.如 A15 之方法，其中該絲狀結構具有線形、蛇形或螺旋形形狀。 A17.如 A 至 A16 中任一項之方法，其進一步包含將該經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物碎片化以產生包含該組織來源之上皮類器官之碎片化結構。 B. 一種產生組織來源之上皮類器官之懸浮培養物之方法，該方法包含： a)   將包含水凝膠及組織來源之上皮幹細胞之混合物引入到培養基中以產生經懸浮之混合物；以及 b)   將該經懸浮之混合物在該培養基中培養以產生呈懸浮狀態之該等組織來源之上皮類器官。 B1.如 B 之方法，其中引入到該培養基中之該混合物包含該水凝膠及複數個組織來源之上皮幹細胞。 B2.如 B1 之方法，其中該等複數個組織來源之上皮幹細胞包含約 1 × 10 4個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠至約 1 × 10 7個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠。 B3.如 B1 或 B2 之方法，其中該等複數個組織來源之上皮幹細胞包含在組織碎片、類器官碎片或其組合內。 B4.如 B 至 B2 中任一項之方法，其中該組織來源之上皮幹細胞或該等複數個組織來源之上皮幹細胞分離自原生上皮組織。 B5.如 B 至 B4 中任一項之方法，其中該水凝膠係在與該培養基接觸時固化。 B6.如 B 至 B5 中任一項之方法，其中將混合物引入該培養基中包含將含有該混合物之分配裝置浸沒在該培養基中並將該混合物分配到該培養基中。 B7.如 B 至 B6 中任一項之方法，其中該培養基之溫度為約 25℃ 至約 50℃。 B7-1.如 B 至 B7 中任一項之方法，其中該培養基之溫度為約 30℃ 至約 50℃。 B8.如 B 至 B7-1 中任一項之方法，其中該混合物之溫度為約 2℃ 至約 25℃。 B8-1.如 B 至 B8 中任一項之方法，其中該混合物之溫度為約 2℃ 至約 20℃。 B9.如 B 至 B8-1 中任一項之方法，其中該水凝膠係選自由以下所組成之群組：合成水凝膠、天然水凝膠及其組合。 B10.如 B9 之方法，其中該天然水凝膠包含基底膜萃取物 (BME) 或細胞外基質 (ECM) 成分。 B11.如 B 至 B10 中任一項之方法，其中該水凝膠具有等於或大於損耗模數 G'' 之儲存模數 G'。 B12.如 B 至 B11 中任一項之方法，其中該經懸浮之混合物具有包含大於約 0.1 mm 之長度、寬度及/或直徑之幾何形狀。 B13.如 B12 之方法，其中該經懸浮之混合物具有包含約 0.1 mm 至約 1,000 mm 之長度、寬度及/或直徑之幾何形狀。 B14.如 B 至 B13 中任一項之方法，其中該混合物係以小滴引入到該培養基中。 B15.如 B 至 B3 中任一項之方法，其中該混合物係以絲狀結構形式引入到該培養基中。 B16.如 B15 之方法，其中該絲狀結構具有線形、蛇形或螺旋形形狀。 B17.如 B 至 B16 中任一項之方法，其進一步包含將該經懸浮之混合物碎片化以產生包含該組織來源之上皮類器官之碎片化結構。 B18.如 A 至 B17 中任一項之方法，其中該培養基存在於容器中，該容器選自由以下所組成之群組：培養皿、多孔盤、錐形管、貯器、培養袋、生物反應器或燒瓶。 C. 一種產生組織來源之上皮類器官之懸浮培養物之方法，該方法包含： a)   使組織來源之上皮幹細胞與水凝膠接觸以產生水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物； b)   將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物沉積到基材上； c)   將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物固化以產生經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物； d)   將該經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物懸浮在培養基中以產生經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物；以及 e)   將該經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物在該培養基中培養以產生組織來源之上皮類器官。 C1.如 C 之方法，其中使複數個組織來源之上皮幹細胞與該水凝膠接觸以產生該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。 C2.如 C1 之方法，其中該等複數個組織來源之上皮幹細胞包含約 1 × 10 4個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠至約 1 × 10 7個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠。 C3.如 C1 或 C2 之方法，其中該等複數個組織來源之上皮幹細胞包含在組織碎片、類器官碎片或其組合內。 C4.如 C 至 C2 中任一項之方法，其中該組織來源之上皮幹細胞或該等複數個組織來源之上皮幹細胞分離自原生上皮組織。 C5.如 C 至 C3 中任一項之方法，其進一步包含在將該經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物懸浮在該培養基中之前，將該經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物從該基材中取出。 C6.如 C 至 C4 中任一項之方法，其中該水凝膠係選自由以下所組成之群組：合成水凝膠、天然水凝膠及其組合。 C7.如 C6 之方法，其中該天然水凝膠包含基底膜萃取物 (BME) 或細胞外基質 (ECM) 成分。 C8.如 C 至 C7 中任一項之方法，其中該水凝膠具有等於或大於損耗模數 G'' 之儲存模數 G'。 C9.如 C 至 C8 中任一項之方法，其中該經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物具有包含大於約 0.1 mm 之長度、寬度及/或直徑之幾何形狀。 C10.如 C9 之方法，其中該經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物具有包含約 0.1 mm 至約 1,000 mm 之長度、寬度及/或直徑之幾何形狀。 C11.如 C 至 C10 中任一項之方法，其中將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物作為小滴沉積到該基材上。 C12.如 C 至 C10 中任一項之方法，其中將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物沉積到該基材上以具有絲狀結構。 C13.如 C12 之方法，其中該絲狀結構具有線形、蛇形或螺旋形形狀。 C14.如 C 至 C13 中任一項之方法，其進一步包含將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物在該培養基中碎片化以產生包含該組織來源之上皮類器官之碎片化結構。 C15.如 C 至 C14 中任一項之方法，其中與參考組織來源之上皮類器官相比，該組織來源之上皮類器官具有均勻形態，其中該等參考組織來源之上皮類器官為嵌入在接附至基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。 C16.如 C15 之方法，其中該組織來源之上皮類器官具有均勻尺寸。 C17.如 C16 之方法，其中與該等參考組織來源之上皮類器官相比，該組織來源之上皮類器官之平均直徑更均勻。 C18.如 A 至 C17 中任一項之方法，其中與參考組織來源之上皮類器官之群體相比，幹細胞及/或增生標記物在該等組織來源之上皮類器官之群體中以較高含量表現，其中該等參考組織來源之上皮類器官為嵌入在接附至基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。 C19.如 C18 之方法，其中該幹細胞及/或增生標記物選自由以下所組成之群組：MKI67、EpCAM、BMI1、CD49f、ASCL2、CD133、LGR5、SOX9、ALDH1A1、NEUROG3、NKX6.1、SMOC2、PDX1、CD44 及其組合。 C20.如 A 至 C18 中任一項之方法，其中與參考組織來源之上皮類器官之群體相比，分化標記物在該等組織來源之上皮類器官之群體中以較低含量表現，其中該等參考組織來源之上皮類器官為嵌入在接附至基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。 C21.如 C20 之方法，其中該分化標記物選自由以下所組成之群組：角蛋白 20 (KRT20)、FABP1、MUC2、MUC5B、MUC5AC、MUC6、TFF3、ALPI、SI、CEACAM7、角蛋白 19 (KRT19)、角蛋白 7 (KRT7)、SOX9、MUC1、INS、GCG、AMY、ALB、CYP3A4、HNF4A、細胞角蛋白 8 (K8)、細胞角蛋白 18 (K18)、細胞角蛋白 5 (K5)、細胞角蛋白 14 (K14)、平滑肌肌動蛋白 (SMA) 及其組合。 D. 一種組織來源之上皮類器官，其藉由如 A 至 C21 中任一項之方法產生。 D1.如 D 之組織來源之上皮類器官，其中該組織來源之上皮類器官係選自由以下所組成之群組：淚腺類器官、扁桃腺類器官、唾液腺類器官、胃腸類器官、甲狀腺類器官、肺類器官、乳腺類器官、肝類器官、膽管類器官、胃類器官、腎類器官、胰臟類器官、子宮內膜類器官、輸卵管類器官、子宮頸類器官、前列腺類器官、膀胱類器官、卵巢類器官、味蕾類器官、滋胚內層類器官及其組合。 E. 一種組成物，其包含組織來源之上皮類器官及培養基，其中該組織來源之上皮類器官嵌入在懸浮於該培養基中之水凝膠內。 E1.如 E 之組成物，其中該水凝膠具有包含大於約 0.1 mm 之長度、寬度及/或直徑之幾何形狀。 E2.如 E1 之組成物，其中該水凝膠具有包含約 0.1 mm 至約 1,000 mm 之長度、寬度及/或直徑之幾何形狀。 E3.如 E 至 E2 中任一項之組成物，其中該水凝膠為小滴。 E4.如 E 至 E2 中任一項之組成物，其中該水凝膠具有絲狀結構。 E5.如 E4 之組成物，其中該絲狀結構具有線形、蛇形或螺旋形形狀。 E6.如 E 至 E5 中任一項之組成物，其中與參考組織來源之上皮類器官之群體相比，幹細胞及/或增生標記物在該等組織來源之上皮類器官之群體中以較高含量表現，其中該等參考組織來源之上皮類器官為嵌入在接附至基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。 E7.如 E6 之組成物，其中該幹細胞及/或增生標記物選自由以下所組成之群組：MKI67、EpCAM、BMI1、CD49f、ASCL2、CD133、LGR5、SOX9、ALDH1A1、NEUROG3、NKX6.1、SMOC2、PDX1、CD44 及其組合。 E8.如 E 至 E5 中任一項之組成物，其中與參考組織來源之上皮類器官之群體相比，分化標記物在該等組織來源之上皮類器官之群體中以較低含量表現，其中該等參考組織來源之上皮類器官為嵌入在接附至基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。 E9.如 E8 之組成物，其中該分化標記物選自由以下所組成之群組：角蛋白 20 (KRT20)、FABP1、MUC2、MUC5B、MUC5AC、MUC6、TFF3、ALPI、SI、CEACAM7、角蛋白 19 (KRT19)、角蛋白 7 (KRT7)、SOX9、MUC1、INS、GCG、AMY、ALB、CYP3A4、HNF4A、細胞角蛋白 8 (K8)、細胞角蛋白 18 (K18)、細胞角蛋白 5 (K5)、細胞角蛋白 14 (K14)、平滑肌肌動蛋白 (SMA) 及其組合。 F. 一種篩選藥劑之方法，該方法包含： a)   使如 D 或 D1 之組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體或如 E 至 E9 中任一項之組成物與藥劑接觸；以及 b)   分析該組織來源之上皮類器官或該等組織來源之上皮類器官之群體中指示該藥劑之有效性及/或毒性之變化。 F1.如 F 之方法，其中使該藥劑與該組織來源之上皮類器官或該等組織來源之上皮類器官之群體接觸約 1 分鐘至約 3 年。 F1-1.如 F1 之方法，其中使該藥劑與該組織來源之上皮類器官或該等組織來源之上皮類器官之群體接觸約 15 分鐘至約 3 年。 F2.如 F、F1 或 F1-1 之方法，其中該藥劑為治療劑。 F3.如 F2 之方法，其中該治療劑為基於多肽之治療劑、小分子治療劑、細胞治療劑、基因編輯系統、基於核酸之治療劑或其組合。 G. 一種進行基因體篩選之方法，該方法包含： a)   提供如 D 或 D1 之組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體或如 E 至 E9 中任一項之組成物； b)   在該組織來源之上皮類器官之一個或多個細胞之基因體中產生突變；以及 c)   分析該組織來源之上皮類器官或該組織來源之上皮類器官之群體的與該突變相關之變化。 G1.如 G 之方法，其中該突變係使用基因調節系統產生的。 G2.如 G1 之方法，其中該基因調節系統為基因編輯系統。 G3.如 G2 之方法，其中該基因編輯系統為 CRISPR 系統。 G4.如 F 至 G2 中任一項之方法，其中該變化為性質的變化，該性質選自由以下所組成之群組：細胞生存力、細胞代謝、氧化還原電位、細胞增生、細胞形態、類器官形態、類器官尺寸、蛋白質表現含量、核酸表現含量、核酸修飾、轉譯後修飾、細胞傳訊路徑之活化、細胞傳訊路徑之壓制、酵素活性、障壁完整性及其組合。 H. 一種用於產生上皮細胞模型之方法，該方法包含： a)   提供如 D 之組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體； b)   將該組織來源之上皮類器官或該組織來源之上皮類器官之群體消化成單細胞；以及 c)   將該等單細胞在培養基中培養以產生細胞單層。 H1.如 H 之方法，其中將該單細胞在可滲透細胞培養內件上培養。 H2.如 H 或 H1 之方法，其中該培養基為分化培養基。 H3.如 H 或 H1 之方法，其中該培養基為細胞生長或幹細胞促進培養基。 I. 一種篩選藥劑之方法，該方法包含： a)   使藉由如 H 至 H3 中任一項之方法產生之細胞單層與藥劑接觸；以及 b)   分析該細胞單層的指示該藥劑之有效性、流佈及/或毒性之變化。 I1.如 I 之方法，其中使該藥劑與該細胞單層接觸約 1 分鐘至約 3 年。 I1-1.如 I1 之方法，其中使該藥劑與該細胞單層接觸約 15 分鐘至約 3 年。 I2.如 I、I1 或 I1-1 之方法，其中該藥劑為治療劑。 I3.如 I2 之方法，其中該治療劑為基於多肽之治療劑、小分子治療劑、細胞治療劑、基因編輯系統、基於核酸之治療劑或其組合。 J. 一種進行基因體篩選之方法，該方法包含： a)   提供藉由如 H 至 H3 中任一項之方法產生之細胞單層； b)   在該細胞單層之一個或多個細胞之基因體中產生突變；以及 c)   分析該細胞單層的與該突變相關之變化。 J1.如 J 之方法，其中該突變係使用基因調節系統產生的。 J2.如 J1 之方法，其中該基因調節系統為基因編輯系統。 J3.如 J2 之方法，其中該基因編輯系統為 CRISPR 系統。 J4.如 J 至 J3 中任一項之方法，其中該變化為性質的變化，該性質選自由以下所組成之群組：細胞生存力、細胞代謝、氧化還原電位、細胞增生、細胞形態、類器官形態、類器官尺寸、蛋白質表現含量、核酸表現含量、核酸修飾、轉譯後修飾、細胞傳訊路徑之活化、細胞傳訊路徑之壓制、酵素活性、障壁完整性及其組合。 J1.如 A 至 C21 及 F 至 J4 中任一項之方法或如 E 至 E9 中任一項之組成物，其中該組織碎片為來自組織之碎片，該組織係選自由以下所組成之群組：淚腺、扁桃腺、唾液腺、胃腸組織、甲狀腺、肺、乳腺、肝、膽管、胃、腎、胰臟、子宮內膜、輸卵管、子宮頸、前列腺、膀胱、味蕾、卵巢、胎盤及其組合。 J5.如 A 至 C21 及 F 至 J4 中任一項之方法或如 E 至 E9 中任一項之組成物，其中該組織來源之上皮幹細胞係獲自類器官之碎片，該類器官係選自由以下所組成之群組：淚腺類器官、扁桃腺類器官、唾液腺類器官、胃腸類器官、甲狀腺類器官、肺類器官、乳腺類器官、肝類器官、膽管類器官、胃類器官、腎類器官、胰臟類器官、子宮內膜類器官、輸卵管類器官、子宮頸類器官、前列腺類器官、膀胱類器官、卵巢類器官、味蕾類器官、滋胚內層類器官及其組合。 K. 一種用於培養組織來源之上皮類器官之系統，該系統包含組織來源之上皮類器官及培養基，其中該組織來源之上皮類器官嵌入在懸浮於該培養基中之水凝膠內。 K1.如 K 之系統，其中該組織來源之上皮類器官為腸類器官。 K2.如 K 或 K1 之系統，其中該水凝膠具有包含大於約 0.1 mm 之長度、寬度及/或直徑之幾何形狀。 K3.如 K 至 K2 中任一項之系統，其中該水凝膠具有包含約 0.1 mm 至約 1,000 mm 之長度、寬度及/或直徑之幾何形狀。 K4.如 K 至 K3 中任一項之系統，其中該水凝膠為小滴。 K5.如 K 至 K3 中任一項之系統，其中該水凝膠具有絲狀結構。 K6.如 K5 之系統，其中該絲狀結構具有線形、蛇形或螺旋形形狀。 K7.如 K 至 K6 中任一項之系統，其中與參考組織來源之上皮類器官之群體相比，幹細胞及/或增生標記物在該等組織來源之上皮類器官之群體中以較高含量表現，其中該等參考組織來源之上皮類器官為嵌入在接附至基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。 K8.如 K7 之系統，其中該幹細胞及/或增生標記物選自由以下所組成之群組：MKI67、EpCAM、BMI1、CD49f、ASCL2、CD133、LGR5、SOX9、ALDH1A1、NEUROG3、NKX6.1、SMOC2、PDX1、CD44 及其組合。 K9.如 K 至 K6 中任一項之系統，其中與參考組織來源之上皮類器官之群體相比，分化標記物在該等組織來源之上皮類器官之群體中以較低含量表現，其中該等參考組織來源之上皮類器官為嵌入在接附至基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。 K10.如 K9 之系統，其中該分化標記物選自由以下所組成之群組：角蛋白 20 (KRT20)、FABP1、MUC2、MUC5B、MUC5AC、MUC6、TFF3、ALPI、SI、CEACAM7、角蛋白 19 (KRT19)、角蛋白 7 (KRT7)、SOX9、MUC1、INS、GCG、AMY、ALB、CYP3A4、HNF4A、細胞角蛋白 8 (K8)、細胞角蛋白 18 (K18)、細胞角蛋白 5 (K5)、細胞角蛋白 14 (K14)、平滑肌肌動蛋白 (SMA) 及其組合。 K11.如 K 至 K10 中任一項之系統，其中該組織來源之上皮類器官係選自由以下所組成之群組：淚腺類器官、扁桃腺類器官、唾液腺類器官、胃腸類器官、甲狀腺類器官、肺類器官、乳腺類器官、肝類器官、膽管類器官、胃類器官、腎類器官、胰臟類器官、子宮內膜類器官、輸卵管類器官、子宮頸類器官、前列腺類器官、膀胱類器官、卵巢類器官、味蕾類器官、滋胚內層類器官及其組合。 K12.如 K 至 K11 中任一項之系統，其進一步包含機器人及/或自動化組件。 K13.如 K12 之系統，其中該機器人及/或自動化組件包含液體處理機器人、3D 列印機、注射泵或其組合。 L. 如 A 至 C21 及 F 至 J5 中任一項之方法，其中該方法之一個或多個步驟藉由機器人及/或自動化組件進行。 L1.如 L 之方法，其中該機器人及/或自動化組件包含液體處理機器人、3D 列印機、注射泵或其組合。 L2.如 L 或 L1 之方法，其中該機器人及/或自動化組件為液體處理機器人。 M. 一種產生如 D 至 D1 之組織來源之上皮類器官或如 E 至 E9 之組成物之方法，其中該方法之一個或多個步驟藉由機器人及/或自動化組件進行。 M1.如 M 之方法，其中該機器人及/或自動化組件包含液體處理機器人、3D 列印機、注射泵或其組合。 N. 如 B 至 B18 中任一項之方法，其中將包含水凝膠及組織來源之上皮幹細胞之混合物引入到培養基中以產生經懸浮之混合物藉由機器人及/或自動化組件進行。 N1.如 B 至 B18 中任一項之方法，其中將經懸浮之混合物在該培養基中培養以產生呈懸浮狀態之該等組織來源之上皮類器官藉由機器人及/或自動化組件進行。 N2.如 N 或 N1 之方法，其中該機器人及/或自動化組件包含液體處理機器人、3D 列印機、注射泵或其組合。 N3.如 N2 之方法，其中該機器人及/或自動化組件包含一個或多個液體處理機器人。 實例
藉由參考以下實例將更好地理解本文所揭示之主題，這些實例是作為本文所揭示之主題的例示而不是作為限制而提供的。
實例 1 ：腸類器官之形成
該實例提供了一種在各種幾何形狀之經懸浮之基底膜萃取物 (BME) 水凝膠中培養腸類器官之方法。該方法簡化了協議，增加了可擴展性，實現了動力學採樣並改善了培養物均勻性，而無需專用設備或額外專業知識。此方法與多種培養物形式相容，並且藉由此方法產生之類器官可用於下游應用，諸如實施中等生產量藥物篩選及產生用於障壁評估之 Transwell 單層，如實例 2 及 3 所示。經懸浮之 BME 水凝膠培養方法使腸類器官之使用範圍比以前可能的使用範圍更廣泛且生產量比以前可能的生產量更高。
方法
人類腸類器官來源。 類器官來源如前所述 (Pleguezuelos-Manzano 等人(2020))，其中進行了一些修改。來自已故供體之未鑑定之人類大腸及迴腸組織樣本藉由西部供體網路獲得。組織以 Advanced DMEM/F12 培養基 (ThermoFisher) 洗滌，切成 5cm x 5cm 區段，然後將上皮從黏膜下層刮到培養基中並用刀片切碎。將溶液以 450 x g 沉澱 5 分鐘，然後在不含 Mg 2+或 Ca 2+之 PBS 中於 2.5 µM EDTA 中於 37°C 培育 9 分鐘 (迴腸) 或 12 分鐘 (大腸)，每 3 至 4 分鐘渦旋一次，直至釋放隱窩。將隱窩以 450 x g 沉澱 5 分鐘，在 PBS 中洗滌，藉由無菌紗布過濾，然後藉由 100 µm 細胞過濾器過濾以去除碎片，並以 450 x g 沉澱 5 分鐘。將隱窩重懸於冰上之 CULTREX® 低生長因子基底膜基質 II 型 (BME, R&D Systems 目錄號 3533-010-02) 中，置於 24 孔盤中之 50 µL 圓頂中，在 37℃ 固化 15 至 30 分鐘，然後以 500 µL 大腸傳代培養基 (Intesticult 類器官生長培養基 (OGM, StemCell Technologies 目錄號 06010) + 10 µM Y27632) 或迴腸培養基 (OGM + 10 µM Y27632 + 2.5 µM CHIR99021) 覆蓋。於培養物中前 2 至 3 天後，每 2 至 3 天一次更換培養基，或當培養基變黃時更換一次培養基，對於大腸培養物更換為普通 OGM，對於迴腸培養物更換為迴腸培養基。
類器官維持。 每 1 至 2 週藉由以 TrypLE Express (ThermoFisher) 在 37°C 消化 10 分鐘來使類器官培養物傳代，然後以 P1000 移液管研磨。如有必要，重複培育最多 2 次以獲得單細胞懸浮液。TrypLE Express 藉由以 PBS 稀釋來滅話，並將細胞以 450 x g 沉澱 3 分鐘。將細胞以 6 x 10 5個細胞/mL 重懸於冰上之 BME 中，在 24 孔盤中在 50 µL 圓頂中平鋪，並在 37°C 固化 15 至 30 分鐘。前 2 至 3 天以大腸傳代培養基或迴腸培養基覆蓋圓頂，並且每 2 至 3 天一次以普通 OGM 更換大腸之培養基或以迴腸培養基更換迴腸之培養基。對於大腸類器官分化，以 Advanced DMEM/F12 培養基洗滌培養物，然後以 Intesticult 類器官分化培養基 (ODM, StemCell Technologies 目錄號 100-0214) + 5 µM DAPT 覆蓋 5 天，每 2 至 3 天一次更換培養基。
經懸浮之水凝膠 BOBA 培養物。 如上所述，在冰上製備 BME 中之單類器官細胞。將預熱之大腸傳代培養基或迴腸培養基添加至 6 孔盤 (5 mL/孔)、100 cm 培養皿 (15-30 mL/皿) 或 50 mL 錐形管 (30 mL/管) 中，並保持在 37°C 之溫熱珠浴上。超低接附 (ULA) 或標準組織培養盤產生類似結果。圖10 提供了顯示 BOBA 之產生之示例性示意圖。為了產生經懸浮之 BME 小滴或 BOBA，使用帶有寬孔或切割移液管尖端 (開口約 2 mm) 之電子連續移液管 (Integra VIAFLO 300) 以慢速至中速將類器官細胞-BME 溶液以 10 µL 體積直接分配到溫熱培養基中，以避免形成絲或細帶而不是小滴。在分配過程中，尖端立即浸入液體表面下方，然後在每次分配後提起，以確保小滴分離。對於較大形式之培養物，藉由血清移液管或傾析將 BOBA 轉移至燒瓶中。每 2 至 3 天一次以普通 OGM 更換大腸之培養基或以迴腸培養基更換迴腸之培養基。在 6 孔盤培養中，將無菌 70 µm 細胞過濾器放入孔中，傾斜盤並透過過濾器輕輕吸出 4 mL 培養基。在燒瓶培養物中，將燒瓶傾斜一定角度，將 BOBA 放置在角落，然後以血清移液管更換大約 2/3 體積之已用培養基。
經懸浮之水凝膠 SOBA 及 SOBA 碎片培養物。 如上所述，在冰上製備 BME 中之單類器官細胞。將經預熱之大腸傳代培養基添加至 6 孔盤 (5 mL/孔)、100 cm 培養皿 (15-30 mL/皿) 中，並保持在溫熱珠浴上。圖11 提供了顯示產生 SOBA 絲之示例性示意圖。為了產生經懸浮之 SOBA 絲，將細胞-BME 溶液輕輕吸入帶有 15 號鈍尖端針之注射器中，然後直接擠出到溫熱培養基中，同時以 X-Y 平面中線形、蛇形或螺旋形運動方式移動浸沒針。X-Y 平面中之擠出速度及運動可影響絲長度及/或寬度。為了產生 SOBA 碎片，使用 10 mL 血清移液管或寬孔 P1000 移液管尖端輕輕研磨 SOBA 絲培養物兩次。添加額外培養基以使最終 BME 與培養基之比率達到 1:10。如上對 BOBA 培養物所述進行培養基更換。
明視野顯微術及影像分析。 使用具有 2.5X、4X 或 10X 物鏡之 THUNDER DMi8 倒置光學顯微鏡 (Leica) 及 DFC9000 GTC 相機 (Leica) 藉由明視野顯微術對培養物進行成像。使用 Imaris 影像分析軟體及 Imaris Batch 軟體套件 (Oxford Instruments) 分析影像。對於自動化類器官直徑測量值，Imaris Surfaces 檢測模組與倒置明視野影像一起使用。使用背景扣除步驟 (滾球，直徑 19.5 µm) 排除背景及失焦類器官。然後根據四個標準對檢測到之表面進行過濾：軟體指定之品質指標 (＞3000 A.U.)、短軸長度 (＞35 µm - 排除碎片)、長方形圓度 (＞0.2 - 排除陰影) 及長軸長度 (35 µm 與 600 µm 之間，排除重疊類器官之假檢測)。在剩餘表面 (每個分析影像至少 40 個) 中，直徑被報告為最小物件定向包圍框之最長邊。然後在所有分析之影像上批量進行該過程。計算每個影像之平均值，並繪製 n = 3 次重複之三個總實驗之平均值。
使用 FIJI (ImageJ) 進行空間類器官均勻性類器官直徑分析。在各影像中心設置含量矩形 (1.5 mm x 9 mm) ROI，並在 X 軸中分成 1 mm 部分。對於各部分，手動測量跨越各類器官最寬點之直徑。
免疫螢光樣本製備及共焦顯微術。 24 孔圓頂培養物以於 PBS 中之 2% 多聚甲醛 (PFA) 固定。使用抹刀將圓頂從盤上分離，並使用切割 P1000 移液管尖端轉移到微量離心管中。對於 BOBA 培養物，使用切割 P1000 移液管尖端將 500 µL 培養物轉移至微量離心管中，除去培養基並添加於 PBS 中之 2% PFA。將樣本在固定劑中室溫培育 15 至 30 分鐘，然後在 PBS 中洗滌 3 次。將樣本在微量離心管中以在封閉/透化緩衝液 (3% BSA、0.1% Triton X-100、0.02% 疊氮化鈉，於 PBS 中) 中稀釋之初級抗體在室溫染色至少 4 小時，然後在 PBS 中洗滌 3 次。所使用之初級抗體如下：ɑ-Ki67 (Invitrogen 目錄號 MA5-14520)、ɑ-MUC2 (Millipore 目錄號 MABF1989)、ɑ-FABP1 (Novus 目錄號 NBP-87695) 及 ɑ-CHGA (Novus 目錄號 NB120-15160)。然後將樣本與於室溫在封閉/透化緩衝液中稀釋之二級抗體 (驢 ɑ-兔 Alexa Fluor 488 (ThermoFisher 目錄號 A-21206) 或山羊 ɑ-小鼠 Alexa Fluor 594 (ThermoFisher 目錄號 A-11032))、DAPI 及 AlexaFluor 660 蠅虎蕈鹼一起在室溫培育至少 2 小時。使用 40X 物鏡在 Stellaris 8 共焦顯微鏡 (Leica) 上收集影像，並使用 Imaris 影像分析軟體 (Oxford Instruments) 進行 3D 重建。
轉錄組分析。 對於 RNA 分離，使用 RNeasy Micro Plus 套組 (Qiagen)。將 RLT+ 裂解緩衝液添加至 BME 圓頂或沉澱 BOBA 中並儲存在 -80℃。使用 QiaCube Connect (Qiagen) 進行 RNA 分離，並使用 Nanodrop 8000 (ThermoFisher) 定量 RNA。批量 mRNA-seq (NovaSeq PE150) 及分析藉由 Novogene 進行。使用 HISAT2 (Mortazavi 等人 2008) 比對讀段，使用 DESeq2 (Anders 等人2014) 進行差異基因表現分析，並使用負二項分佈模型及 Benjamini-Hochberg FDR 校正計算統計顯著性。
96 孔盤懸浮之 BME 類器官變異性。 培養 9 天後，收集 225 cm 2燒瓶中之大腸類器官 SOBA 碎片，並使用血清移液管輕輕研磨兩次，以均質化樣本，而不會破壞完整類器官。將類器官混合物轉移至試劑貯器中，且然後使用帶有寬孔移液管尖端之 P200 多通道移液管以 100 µL/孔平鋪於 96 孔盤中。如上所述製備圓頂培養物，並使用連續移液管將其平鋪於 96 孔盤各孔中心之 5 µL 圓頂中。在進行生存力測量之前，使培養物生長 7 天。所有生存力測量均使用 Cell Titer Glo 3D Assay 套組 (Promega) 進行，並在 Ensight 酶標儀 (Perkin Elmer) 上測量發光。
統計學分析。 除非另有說明，否則所有統計學分析均使用 Prism 9 軟體 (Graphpad) 進行。統計學檢驗、n 及 p 值在圖例中標示。
結果：
用於人類腸類器官培養之經懸浮之 BME 水凝膠方法。 習用腸類器官培養方法需要將冷 ECM 中之類器官細胞溶液沉積到塑膠表面，在培養箱中固化形成以水凝膠圓頂，然後以生長培養基覆蓋 (圖1A-1B) (Mahe 等人(2013)；Pleguezuelos‐Manzano 等人(2020)；Sato 等人(2009)；Sato 等人(2011))。為了解決規模化該技術之局限性，開發了一種方法，其中冷細胞 ECM 溶液立即固化為懸浮於溫熱培養基中之漂浮水凝膠。 已經顯示了一種使用經懸浮之 BME 小滴之方法，BME 為 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 細胞來源之 ECM，相當於 MATRIGEL®，並且該方法稱為 BOBA (BME 嵌入類器官珠組裝體) 培養。
首先在經懸浮之 BOBA 培養方法中評估腸類器官生長，並與習用表面接附 BME 圓頂方法 (此處稱為圓頂培養) 進行比較。對於圓頂培養，將來自消化類器官之單細胞懸浮在冷 BME 中，並作為 50 µL 圓頂平鋪在 24 孔盤中，在 37°C 培養箱中固化 15 至 30 分鐘，然後以生長培養基 (Intesticult 類器官生長培養基) 覆蓋。每 2 至 3 天一次對各孔單獨進行培養基更換。對於 BOBA 培養，使用帶有寬孔尖端之電子連續移液管將單細胞 BME 溶液作為 10 µL 小滴直接沉積到預熱培養基中，其中水凝膠立即固化成經懸浮之 BOBA。BOBA 可以在培養皿、盤或錐形管中產生，並且經由血清移液管或傾析輕鬆轉移到更大容器，如細胞培養瓶中 (圖1A-1B)。藉由允許 BOBA 沉降，然後以新鮮培養基替換頂部 75% 體積之已用培養基來對整個燒瓶進行培養基更換。
將人類腸類器官細胞-BME 溶液平鋪於平行圓頂或 BOBA 培養物中，並在生長培養基中生長 9 天。類器官生長及尺寸在兩種方法中相似，如藉由明視野顯微術所觀察到的 (圖1C) 並以類器官直徑測量進行定量 (圖1D)。類器官細胞增生也係可比較的，如藉由定量表現增生標記物 Ki-67 之細胞豐度所確定的 (圖1E-1F)。BOBA 方法似乎使得能夠在每 cm 2表面積上實現更多類器官細胞生長，儘管僅在小腸 (迴腸) 類器官中觀察到統計學顯著性 (圖1G-1H)。對於大腸類器官，圓頂培養產生平均 2.9 x 10 5個活細胞/孔或 24 孔盤中 1.5 x 10 5個細胞/cm 2，而 BOBA 培養產生平均 2.2 x 10 7個活細胞/孔或 75 cm 2燒瓶中 2.9 x 10 5個細胞/cm 2(圖 1G)。對於迴腸類器官，圓頂培養產生平均 4.8 x 10 5個活細胞/孔或 24 孔盤中 2.6 x 10 5個細胞/cm 2，而 BOBA 培養產生平均 2.9 x 10 7個活細胞/孔或 75 cm 2燒瓶中 3.9 x 10 5個細胞/cm 2(圖1H)。每 µL BME 水凝膠之活細胞數量相似，指示兩種方法在固定接種密度下之生長量係可比較的 (圖1G)。
BOBA 培養中之類器官分化。 腸類器官模型之主要優點係能夠藉由改變培養基組成 (例如藉由取出幹細胞促進因子) 分化成各種腸上皮細胞類型 (Clevers (2016)；Schutgens 及 Clevers (2019)；Zachos 等人(2016))。比較了圓頂及 BOBA 培養中之類器官分化。使類器官在生長培養基中生長 7 天，然後洗滌並轉移到分化培養基 (含有 5 µM DAPT 之 Intesticut 類器官分化培養基) 中，持續 5 天。明視野顯微術顯示，在兩種培養形式中，生長培養基中之增生類器官表現出具有大管腔之隱窩形態 (圖2A) 且分化類器官表現出具有細長柱狀細胞及小管腔之緻密球狀形態 (圖2A)。
對圓頂及 BOBA 培養中之增生及分化類器官進行批量 RNA-seq 分析。在兩種培養方法中，相對於增生類器官，分化類器官下調幹細胞及增生標記物 ( MKI67、 LGR5、 SOX9及 CD44) 之表現，且上調杯狀細胞 ( MUC2、 MUC5B、 TFF3) 及腸上皮細胞 ( KRT20、 FABP1、 ALPI及 CEACAM7) 之分化標記物之表現 (圖2B)。也藉由免疫螢光 (IF) 共焦顯微術在兩種培養形式中觀察到分化細胞類型 (圖2C)。
BOBA 培養條件之表徵及優化。 接下來，評估了在 BOBA 方法中不同培養參數將如何影響類器官生長。將培養物接種在 6 孔盤 (圖3A-3B) 或 25 cm 2燒瓶 (圖3C) 中，該接種係以各種 BME 體積及 6 x 10 5個細胞/mL BME 之固定細胞接種密度進行。所有 BOBA 均以 10 µL 小滴形式在 5 mL 生長培養基中產生，並藉由定量培養 9 天後之類器官直徑及活細胞數量來評估類器官生長 (圖3B-3C)。在 6 孔盤中，隨著每孔總 BME 體積從 0.5 mL 增加到 2 mL，類器官直徑降低，且活細胞與 BME 體積之比率降低 (儘管不具有統計學顯著性)。儘管在較高 BME 體積條件下接種細胞數量較高，但在所有條件下，活細胞總數及每 cm 2表面積之活細胞比率係可比較的，指示每個接種細胞之增生較少。總之，這些資料表明，當 BME 體積超過 6 孔盤中固定量培養基之閾值時，類器官生長就會受到損害 (圖3B)。
有趣的是，對於 25 cm 2燒瓶中之 BOBA 培養物，類器官在所有測試條件下都生長得一樣好 (圖3C)。隨著每個燒瓶之總 BME 體積從 0.5 mL 增加到 2 mL，類器官直徑以及活細胞與 BME 體積之比率相似。在培養物中 BME 體積似乎增加時，活細胞總數及每 cm 2表面積之活細胞比率增加 (儘管由於實驗間差異，不具有統計學顯著性)，這表明對於 6 孔盤及 25 cm 2燒瓶，BME 體積與培養基之閾值係不同的。BME 與培養基之比率及容器類型都應針對特定應用進行優化。
BOBA 培養中之類器官均勻性。 已知習用圓頂方法會導致類器官異質性 (Pleguezuelos-Manzano 等人(2020)；Ringel 等人(2020))。天然 ECM 水凝膠限制氣體及分子擴散，導致營養物梯度及異質的類器官生長 (Colom 等人(2014) J Biomed Mater Res A 102, 2776–2784；Park 等人(2022)；Shin 等人(2020))。據觀察，類器官在 BOBA 培養中比在圓頂培養中生長得更均勻 (圖4)。藉由明視野顯微術在每種形式的最深點-圓頂之底部 Z 平面或 BOBA 之中心 Z 平面-對大腸類器官培養物進行成像，並定量各水凝膠中心跨越矩形 ROI 的平均類器官直徑 (圖4C)。與先前報告一致 (Park 等人(2022)；Shin 等人(2020))，圓頂培養類器官在水凝膠邊緣的生長較大，且在核心的生長較小 (圖4B-4E)。然而，BOBA 中之類器官跨越水凝膠之生長尺寸係可比較的 (圖4B-E)。
也觀察到，圓頂培養物核心中之類器官通常具有緻密球狀管腔較少之形態，這通常指示分化 (圖4B)。批量 RNA-seq 分析指示，相對於其 BOBA 培養對應物，圓頂培養類器官之幹細胞及增生標記物表現較低，且腸上皮細胞標記物表現較高，這支持圓頂培養物中可能存在分化類器官亞群之假設 (圖5)。
經懸浮之 BME 水凝膠之替代幾何形狀。 雖然 BOBA 方法比習用圓頂方法具有顯著規模化優勢，但在沒有自動化液體處理器之情況下經懸浮之 BOBA 水凝膠小滴之大規模培養擴增仍然為一項勞動密集型工作。為了減少經懸浮之 BME 水凝膠培養所需之時間及勞動力，設計了替代的水凝膠幾何形狀，具體而言為水凝膠絲。擠出絲已在生物列印領域用於在空間上控制細胞生長或構建 3D 水凝膠結構之逐層組裝體，但通常依賴接附於表面 (Kolesky 等人(2014) Adv.Mater.26, 2966–2966；Kolesky 等人(2016) Proc National Acad Sci 113, 3179–3184)。為了產生含有類器官細胞之水凝膠絲，稱為 SOBA (注射器擠出之類器官 BME 組裝體)，將冷細胞-BME 溶液加載到帶有15 號 (1.37 mm 內徑) 鈍尖端針之注射器中，然後直接注入溫熱培養基，同時跨越 X-Y 平面移動尖端 ( 例如，以線形、蛇形或螺旋形圖案)。藉由以寬孔 P1000 尖端或 10 mL 血清移液管輕輕研磨 SOBA 培養物，也產生了更密切接近 BOBA 幾何形狀之絲碎片，稱為 SOBA 碎片。
在 BOBA、SOBA 或 SOBA 碎片培養物中生長 9 天之類器官顯示出相似生長，如藉由明視野顯微術 (圖6A)、類器官直徑測量 (圖6B 至 6C) 及活細胞計數 (圖6D)。相對於 BOBA 小滴，SOBA 及 SOBA 碎片形式產生可比較的類器官生長，同時實現更快且更省力之培養物製備。與 SOBA 培養物相比，SOBA 碎片更均勻地分散在培養基中，從而使單一培養物更容易分割、采樣或等分。
討論：
該實例描述了用於人類腸上皮類器官之經懸浮之 BME 水凝膠培養方法之開發，該方法克服了若干與習用表面接附之圓頂水凝膠培養方法相關之挑戰。與圓頂方法相比，BOBA、SOBA 及 SOBA 絲方法簡化並加快了協議，使得能夠與可擴展之培養容器相容，允許動態學培養採樣並改善類器官培養均勻性。
已經針對腸類器官及類腫瘤規模化提出了若干懸浮培養協議，但在這些方法中，類器官係在含有不會形成完整水凝膠之低濃度溶解 MATRIGEL® (類似於 BME) 之液體培養基中培養的 (Hirokawa 等人(2021) Commun Biology 4, 1067；Price 等人(2022) Sci Rep-Uk 12, 5571)。這與目前所揭示之方法形成對比，該方法依賴於形成完全固化的不溶性水凝膠。此外，先前研究顯示，雖然類器官及類腫瘤可在 5% 可溶性 MATRIGEL® 溶液中生長，但濃度高於 5% 會導致生長減少。此外，在 5% MATRIGEL® 中生長之腸類器官表現出反向上皮極性 (Hirokawa 等人(2021))，這與先前關於低 ECM 條件下類器官極性反轉之報告一致 (Co 等人(2019) Cell Reports 26, 2509-2520.e4)。
與習用圓頂方法相比，BOBA 方法提供了若干優點。首先，它簡化了協議。由於水凝膠直接在培養基中固化，因此無需單獨固化培育步驟，從而節省時間及勞力。其次，它減少了容器表面積量及平鋪圓頂所需之技術精度。藉由減輕對可用表面積之依賴，BOBA 方法利用了培養容器之所有 3 個維度，從而增加了水凝膠體積及每個培養物之類器官細胞。BOBA 方法有助於大幅規模化培養，因為它使得能夠與燒瓶相容，燒瓶可得尺寸較大，更易於操作，並且使得能夠快速更換培養基。例如，在 BOBA 培養中，可在單一 225 cm 2燒瓶中培養 10 mL BME，並且可簡單藉由以血清移液管更換上清液來更換培養基。然而，使用圓頂方法，等同培養物需要九個 24 孔盤 (50 µL 圓頂之 200 孔)，並且需要為各孔單獨更換培養基。這也使塑膠消耗量減少超過 70% (225 cm 2燒瓶含有 152.7 g 塑膠，且代替九個 24 孔盤中之 562.5 g 塑膠，資料未顯示)。可使用可容納數升培養物體積之多層燒瓶或「細胞工廠」來實現進一步規模化。表 1 提供了針對若干容器類型，所揭示之經懸浮之 BME 水凝膠培養設置之一般指南。據報導，培養物容器類型會影響如氣體傳輸的參數 (Allen 等人(2001) Am J Physiol-Lung C 281, L1021–L1027)，以及諸如培養基配方、水凝膠組成及類器官株特異性生長速率的因素都可影響類器官生長。 表 1
表面接附之 BME 圓頂 經懸浮之 BME 水凝膠 (BOBA、SOBA、SOBA 碎片)
容器 24 孔盤 6 孔盤 75 cm 2燒瓶 75 cm 2燒瓶
每孔之培養基 (mL) 0.5-1 3-5 n/a n/a
每盤/燒瓶之培養基 (mL) 12-24 18-30 15-30 80-100
每孔之 BME (mL) 30-50 300-700 n/a n/a
每盤/燒瓶之 BME (mL) 720-1200 1800-4200 1500-6000 8000-15000
接種密度 (細胞/mL) 3 x 10 5– 6.0 x 10 5 3 x 10 5– 6.0 x 10 5 3 x 10 5– 6.0 x 10 5 3 x 10 5– 6.0 x 10 5
針對經懸浮之 BME 水凝膠培養物之接種條件。
BOBA 方法也克服了圓頂培養物中產生的因水凝膠擴散限製而產生之培養物異質性 (Park 等人(2022)；Shin 等人(2020))。一些協議建議平鋪較小之 10-15 µL 水凝膠圓頂 (Pleguezuelos-Manzano 等人(2020)；Stewart 等人(2020) Methods Mol Biology 2121, 185–198)，由此減少分子轉運之擴散路徑。然而，即使在每孔平鋪多個圓頂時，平鋪較小圓頂也會減少每孔之水凝膠總體積。克服水凝膠擴散限制之另一方法係在水凝膠固化步驟過程中翻轉盤，使重力引起細胞沉降在圓頂頂部表面附近，其中圓頂核心中幾乎沒有或沒有細胞 (Pleguezuelos-Manzano 等人(2020))。這導致昂貴水凝膠體積之次優使用，並且最終每 µL 水凝膠可接種之類器官細胞較少。已經開發出複雜生物工程方法來增加水凝膠表面積以改善分子轉運 (Park 等人(2022))，但這些難以規模化，並且仍然依賴將水凝膠錨定到 2D 表面。BOBA 方法產生更均質的培養物，而不會犧牲每孔之水凝膠量或每 µL 水凝膠之細胞數量。不限於特定理論，所觀察到之類器官培養均勻性改善可藉由 BOBA 水凝膠來解釋，該 BOBA 水凝膠具有 (1) 較小直徑，且因此較短擴散路徑，及 (2) 所有外表面都曝露於培養基中，使得分子甚至能夠均勻擴散到水凝膠中。
水凝膠圓頂中類器官形態異質性之另一有記錄之挑戰係位於盤底部附近之類器官可接附於盤表面、展開及變平，並失去其 3D 結構 (Pleguezuelos-Manzano 等人(2020)；Price 等人(2022))。由於經懸浮之水凝膠小滴不會與盤表面直接接觸，因此不會發生類器官展開及變平。
除了 BOBA 水凝膠小滴外，類器官還可以生長為 SOBA 絲及 SOBA 絲碎片。類器官在所有 3 種配置中的生長相似，證明了懸浮 BME 培養方法之穩健性。SOBA 方法有利於並加快培養物製備，因為可將大體積細胞-BME 溶液加載到單一注射器中以產生 SOBA 水凝膠絲。一分鐘內可產生約 10 mL SOBA，而等同圓頂培養則需要超過 15 分鐘進行平鋪，並額外需要 15 至 30 分鐘進行固化。儘管 SOBA 之長度比 BOBA 長得多，但沒有觀察到類器官生長之異質性 (如在圓頂培養物中觀察到的)，這可能係因為 SOBA 直徑較小 (通常小於 2 mm) 並且使得能夠從培養基有效轉運營養物。SOBA 碎片在尺寸及幾何形狀上更密切接近 BOBA，但產生速度要快得多。與 BOBA 一樣，SOBA 碎片均勻地分散在整個培養物中，這對於動態採樣或劃分培養物以進行多次應用或讀取可能係有用的。
整體而言，經懸浮之水凝膠培養方法使得能夠進行大規模類器官規模化，改善類器官培養均勻性，並節省勞力、時間及資源。這些培養改善使腸類器官更適合於實施如化合物或基因體篩選的高生產量應用。該方法可能擴展到培養患病腸類器官及類腫瘤、來自其他物種之腸類器官以及來自不同組織類型之類器官。因此，BOBA、SOBA 及 SOBA 絲有潛力推動及擴大類器官技術之採用。
實例 2 ：類器官在篩選方法中之用途
該實例揭示了藉由實例 1 之方法產生之腸類器官在細胞毒性測定中之用途。
方法：
96 孔盤懸浮之 BME 類器官細胞毒性測定。 將來自均質化大腸類器官 SOBA 碎片之兩個 96 孔盤以每孔 90 µl 接種到225 cm 2燒瓶中。將化合物原液在 Intesticult OGM 中稀釋至 10 倍最終濃度，並向各孔中添加 10 µL。對從 100 µM 開始 5 倍稀釋之 8 劑量稀釋系列在技術上一式四份評估。3 天處理後，使用 Cell Titer Glo 3D 測定套組 (Promega) 進行生存力測量，並在 Ensight 酶標儀 (Perkin Elmer) 上測量發光。使用 Prism (GraphPad) 產生 4PL 擬合曲線。
結果：
將懸浮之 BME 水凝膠類器官在藥物毒性篩選測定中之應用。 以 BOBA、SOBA 或 SOBA 碎片形式產生之腸類器官可直接用於下游測定，無需額外類器官消化或傳代步驟。作為概念驗證，在藥物毒性篩檢中證明了這些類器官之實施。SOBA 碎片培養之類器官在 225 cm 2燒瓶中生長 (圖7A-7B)，藉由以血清移液管研磨均質化，然後轉移至 96 孔盤 (圖7A-7C)。藉由基於 Cell Titer Glo 3D ATP 之生存力測定測量之孔間變異性與平鋪在 96 孔盤中之 SOBA 絲生長類器官及圓頂培養物係可比較的 (圖7D)。
對於藥物毒性篩選，將 96 孔盤中之 SOBA 絲生長類器官以已知引起腸毒性之化合物 (雙醋瑞因、索拉非尼、SN-38 或多西紫杉醇) 或 DMSO 媒介物對照處理 3 天。生存力被確定為 ATP 之量度並產生劑量反應曲線 (圖7E)。這係經懸浮之 BME 水凝膠培養物如何直接用於下游應用之一個實例。
經懸浮之 BME 水凝膠生長培養物之實用性在此處在兩個應用中得到了證明。首先，SOBA 絲培養物可以經均質化以產生低孔間類器官變異性之 96 孔盤培養物。作為概念驗證，進行了藥物毒性篩檢；此方法可用於其他中高生產量篩選。
實例 3 ：類器官來源模型之產生
該實例揭示了藉由實例 1 之方法產生之腸類器官在提供替代類器官來源模型中之用途。
方法：
Transwell 單層。 將 225 cm 2燒瓶中之大腸類器官 SOBA 碎片收集到 50 mL 錐形管中，並以 800 x g 沉澱 3 分鐘。移除上清液，並藉由在 TrypLE Express 中於 37°C 水浴中培育 10 分鐘，將類器官消化成單細胞，然後用 P1000 移液管研磨。根據需要重複培育及研磨最多 2 次。將細胞沉澱並以 PBS 洗滌，然後重懸於單層生長培養基 (Intesticult OGM + 10 µM Y-27632) 或單層分化培養基 (Intesticult ODM + 10 µM Y-27632) 中。對於 96 孔 PET Transwell 盤 (孔徑 0.4 µm，Corning 目錄號 3450) 之各孔，將 100 µL 培養基中之 2.0 x 10 5個細胞接種到頂部室中，並將 200 µL 培養基添加到基部室中。兩個室中之培養基每 2 至 3 天一次更換。使用 10X 物鏡以及 THUNDER 顯微鏡 (Leica) 與 DFC9000 GTC 相機 (Leica) 進行明視野成像。藉由以伏特/歐姆計 (EVOM3, WPI) 測量電阻，然後將電阻乘以 Transwell 表面積 (0.143 cm 2) 來確定跨上皮電阻 (TEER)。
結果：
經懸浮 BME 之水凝膠培養物有利於替代類器官來源模型。 除了直接以其經懸浮之 BME 水凝膠形式使用類器官外，這些類器官還可以有利於產生其他類器官來源模型，尤其係該等需要大細胞輸入之模型，如單層及微生理系統 (MPS) 裝置。經懸浮之 BME 水凝膠類器官用於產生大腸上皮 Transwell 單層，並在兩種條件下評估上皮障壁功能。將於 225 cm 2燒瓶中培養之 SOBA 絲類器官消化成單細胞，在匯合時接種在 96 孔 Transwell 小室上，並在單層生長或單層分化培養基中培養 7 天 (圖8A)。這兩種條件產生具有不同形態之 Transwell 上皮培養物：在生長培養基中，所得上皮形成從單層表面突出之 3D 結構，而在分化培養基中，這些結構不存在，並且可見具有成熟緊密連接之分化上皮細胞之典型「鵝卵石」細胞形態 (圖8B)。與此形態一致，到第 3 天時，與生長培養基相比，分化培養基中之 Transwell 單層之藉由跨上皮電阻 (TEER) 測量定量之上皮障壁功能較高 (圖8C)。該實驗為使用 BOBA、SOBA 或 SOBA 絲方法生長之類器官如何能夠產生替代腸類器官來源之 活體外模型之實例。
SOBA 絲類器官可用於產生類器官來源之 Transwell 單層，其提供同時進入頂端及基底外側之優勢，但難以規模化，因為它們需要大量細胞來接種。藉由實現大量類器官擴增，經懸浮之 BME 水凝膠培養方法可有利於具有更高組織傳真度及實驗優勢之複雜腸類器官來源模型之開發及實施。
實例 4 ：肺類器官之產生
該實例揭示了使用本文所述之 BME 懸浮方法產生肺類器官。
方法：
人類肺 ATII 細胞分離及類器官來源。 來自已故供體之未鑑定之人類肺組織藉由西部供體網路獲得。先前描述了肺解離為單細胞及類器官建立 (Konishi 等人，2022)。簡而言之，以 HBSS 緩衝液洗滌組織並以消化緩衝液 (I 型膠原酶：450 單位/mL；分散酶：5 單位/mL；DNase I：10 單位/mL) 膨脹。去除胸膜及小氣道後，用單刃刀片切碎剩餘組織，轉移到含有溫熱消化緩衝液之標準管中，且在每 15 分鐘一次攪拌及劇烈混合下於 37℃ 培育總共 1 小時。使溶液通過 100 µm 細胞過濾器，並在 4℃ 以 450 g 沉澱 10 分鐘。將細胞沉澱重懸於 5 mL ACK 緩衝液中以裂解紅血球，並在室溫培育 3 至 5 分鐘。藉由添加 DMEM/F12+10%FBS 來終止反應。隨後將細胞懸浮液透過 40 µm 細胞過濾器過濾，並在 4℃ 以 450g 沉澱 5 分鐘。然後以 CD45 磁性微珠 (Miltenyi Biotech，目錄號 130-045-801) 標記細胞，並將該細胞加載到 MACS® 柱上，將該柱放置在 MACS 分離器之磁場中 (根據製造協議)。磁性標記之 CD45+ 細胞保留在柱內並丟棄，並收集通過柱之未標記細胞。將這些細胞在 Gentle MACS 緩衝液中洗滌，在 4℃ 以 450g 沉澱 5 分鐘，並與含有 50 nM Lysotracker 綠 (Invitrogen，目錄號 L7526) 之 DMEM+10%FBS 一起在 37℃ 培育 30 分鐘。將以下抗體添加到冰上之細胞中，持續 30 分鐘：預結合之 HTII280+Alexa 647 (Terrance Biotech；Invitrogen 目錄號 A20186)； EpcamPE-Cy7 (BioLegend，目錄號 324222)； CD45-Alexa700 (BioLegend，目錄號 304024)，CD31-Alexa594 (BioLegend，目錄號 303126)。亦添加了活/死染色探針 Sytox 藍 (Invitrogen)。然後將細胞沉澱、洗滌、重懸於 PBS+2%FBS 中，並藉由針對 Sytox 藍-、CD45-、CD31-、EpCAM+、HTII-280+、lysotracker 綠+ 進行分選來分離 ATII 細胞。將 ATII 細胞重懸於 MATRIGEL® (低生長因子，不含酚紅；Corning，目錄號 356231) 中，平鋪於 6 孔盤之 50 µl 圓頂中 (60 x 10 4個細胞/mL，或 3000 個細胞/50 µl MATRIGEL®)，在 37°C 固化 30 分鐘，並且然後以含有 10 µM ROCK 抑制劑 Y27632 (Selleckchem，目錄號 S1049) 之 3 ml 無血清無飼養層 (SFFF) 培養基 (Konishi 等人，2022) 覆蓋 3 天。培養前 2 至 3 天後，每 2 至 3 天一次更換不含 ROCK 抑制劑之 SFFF 培養基。
類器官維持。 類器官培養物每 10 至 14 天一次傳代。為了傳代，首先將培養物與 Accutase (Cell Stem Cell Technologies，目錄號 07922) 一起培育 15 分鐘以軟化 MATRIGEL®。然後將圓頂及類器官收集在 15 ml 管中，並在 37°C 攪拌下培育 15 分鐘。在 4°C 以 450g 離心 5 分鐘後，以 TrypLE Express (Gibco，目錄號 12604-021) 在 37°C 處理細胞 10 分鐘。TrypLE Express 藉由以 PBS 稀釋來滅活，並在 4°C 以 450 x g 沉澱細胞 5 分鐘。將細胞以 60 x 10 4個細胞/mL 重懸於冰上之 MATRIGEL® 中，平鋪於 6 孔盤之 50 µL 圓頂中，並在 37°C 固化 30 分鐘。前 3 天以含有 10 µM ROCK 抑制劑之 SFFF 培養基覆蓋圓頂，並且然後添加不含 ROCK 抑制劑之 SFFF 培養基，且每 2 至 3 天一次更換。
經懸浮之水凝膠 BOBA 培養物。 如上所述，在冰上製備 MATRIGEL® 中之單類器官細胞。將含有 10 µM ROCK 抑制劑之預熱 SFFF 培養基添加至 6 孔盤 (4 mL/孔) 中，並保持在 37°C 溫浴上。為了產生經懸浮之 BME 小滴或 BOBA，使用帶有寬孔或切割移液管尖端 (開口約 2 mm) 之電子連續移液管 (參考) 將類器官細胞-MATRIGEL® 溶液以10 µL 體積直接分配到溫熱培養基中。在分配過程中，尖端立即浸入液體表面下方，然後在每次分配後提起，以確保小滴分離。3 天後，添加 SFFF 培養基並每 2 至 3 天一次更換。對於培養基交換，將無菌 70 µm 細胞過濾器放入孔中，傾斜盤並透過過濾器輕輕吸出 3 mL 培養基。
結果：
如圖9 所示，使用分離自嵌入懸浮於培養基中之水凝膠中的肺組織之肺泡 II 型 (ATII) 幹細胞成功產生肺類器官。
實例 5 ：乳腺類器官之產生
該實例提供了使用本文所述之 BME 懸浮方法產生乳腺類器官之方法。
方法：
人類乳腺類器官來源。 乳腺類器官如 Sachs 等人Cell 172(1-2):373-389.e10 (2018) 之前所述來源，其內容全文併入本文中。將乳腺組織切成 1-3 mm 3塊，切碎並以 10 mL AdDF+++ (含有 1x Glutamax、10 mM HEPES 及抗生素之 Advanced DMEM/F12) 洗滌。隨後將組織在迴旋振盪器上在含有 1 至 2 mg/ml 膠原蛋白酶 (Sigma，C9407) 之 10 mL 類器官培養基中於 37°C 消化 1 至 2 小時。使用塑膠及火焰玻璃 Pasteur 移液管依序剪切消化組織懸浮液，並且在各剪切步驟後，將懸浮液在過濾器 ( 例如，100 μm 過濾器) 上過濾。以約 10ml AdDF+++ 對過濾後保留之組織塊進行後續剪切步驟。將 2% FCS 添加到過濾懸浮液中，且然後以 400 rcf 離心 。將沉澱重懸於 10 ml AdDF+++ 中，並再次以 400 rcf 離心 。如果可見紅色沉澱，則將紅血球在 2 mL 紅血球裂解緩衝液 (Roche，11814389001) 中在室溫裂解 5 分鐘，然後添加 10 ml AdDF+++ 並以 400 rcf 離心 。將沉澱重懸於 10 mg/ml 冷 BME ( 例如，CULTREX® 低生長因子 BME 2 型 (Trevigen，3533-010-02)) 中，並使 40 µL BME-細胞懸浮液滴在預熱 24 孔懸浮液培養盤 (Greiner，M9312) 上於 37°C 固化 20 分鐘。凝膠化完成時，向各孔添加 400 µL 類器官培養基，並將盤轉移至 2% 或環境 O 2之濕潤 37°C/5% CO 2培養箱中。培養基每 4 天一次更換。類器官培養基含有 R-Spondin 1 條件培養基 (10%) 或 R-Spondin 3 (250 ng/ml) 與神經調節蛋白 1 (5 nM)、FGF7 (5 ng/ml)、FGF10 (20 ng/ ml)、EGF (5 ng/ml)、Noggin (100 ng/ml)、A83-01 (500 nM)、Y-27632 (5 µM)、SB202190 (500 nM)、B27 補充劑 (1x)、N-乙醯半胱胺酸 (1.25 mM)、菸鹼醯胺 (5 mM)、GlutaMax 100x (1x)、HEPES (10 nM)、青黴素/鏈黴素 (100 U/ml/100 µg)、Primocin (50 µg/ml) 及 Advanced DMEM/F12 (1x)。
類器官維持。 類器官每 1 至 4 週一次傳代。將囊性類器官重懸於 2 mL 冷 AdDF+++ 中，並透過火焰玻璃 Pasteur 移液管進行機械剪切。緻密類器官藉由重懸於 2 mL TrypLE Express (Invitrogen，12605036) 中來解離，在室溫培育 1 至 5 分鐘，並藉由火焰玻璃 Pasteur 移液管進行機械剪切。添加 10 mL AdDF+++ 並以 300 rcf 或 400 rcf 離心後，將類器官碎片重懸於冷 BME 中，並以上述比率 ( 例如，1:1 至 1:6) 重新接種，從而形成新類器官。
經懸浮之水凝膠 BOBA 培養物。 如上所述，在冰上製備 BME 中之單類器官細胞或類器官碎片。將預熱類器官培養基添加到 6 孔盤 (5 mL/孔)、100 cm 培養皿 (15 至 30 mL/皿) 或 50 mL 錐形管 (30 mL/管) 中，並保持在 37°C 溫熱珠浴上。為了產生經懸浮之 BME 小滴或 BOBA，使用帶有寬孔或切割移液管尖端 (開口約 2 mm) 之電子連續移液管 (Integra VIAFLO 300) 將類器官細胞-BME 溶液以 10 µL 體積直接分配到溫熱培養基中。在分配過程中，尖端立即浸入液體表面下方，然後在各分配後提起，以確保小滴分離。對於較大形式培養物，藉由血清移液管或傾析將 BOBA 轉移至燒瓶中。培養基每 2 至 4 天一次更換。在 6 孔盤培養物中，將無菌 70 µm 細胞過濾器放入孔中，傾斜盤並透過過濾器輕輕吸出 4 mL 培養基。在燒瓶培養物中，將燒瓶傾斜一定角度，將 BOBA 放置在角落，然後以血清移液管更換大約 2/3 體積之已用培養基。
經懸浮之水凝膠 SOBA 及 SOBA 碎片培養物。 如上所述，在冰上製備 BME 中之單類器官細胞或類器官碎片。將預熱類器官培養基添加至 6 孔盤 (5 mL/孔)、100 cm 培養皿 (15-30 mL/皿) 中，並保持在溫熱珠浴上。為了產生經懸浮之 SOBA 絲，將細胞-BME 溶液輕輕吸入帶有 15 號鈍尖端針之注射器中，然後直接擠出到溫熱培養基中，同時以 X-Y 平面中線形、蛇形或螺旋形運動方式移動浸沒針。為了產生 SOBA 碎片，使用 10 mL 血清移液管或寬孔 P1000 移液管尖端輕輕研磨 SOBA 絲培養物兩次。添加額外培養基以使最終 BME 與培養基之比率達到 1:10。如上對 BOBA 培養物所述進行培養基更換。
免疫螢光樣本製備及共焦顯微術。 24 孔圓頂培養物以於 PBS 中之 2% 多聚甲醛 (PFA) 固定。使用抹刀將圓頂從盤上分離，並使用切割 P1000 移液管尖端轉移到微量離心管中。對於 BOBA 培養物，使用切割 P1000 移液管尖端將 500 µL 培養物轉移至微量離心管中，除去培養基並添加於 PBS 中之 2% PFA。將樣本在固定劑中室溫培育 15 至 30 分鐘，然後在 PBS 中洗滌 3 次。將樣本在微量離心管中以在封閉/透化緩衝液 (3% BSA、0.1% Triton X-100、0.02% 疊氮化鈉，於 PBS 中) 中稀釋之初級抗體在室溫染色至少 4 小時，然後在 PBS 中洗滌 3 次。然後將樣本與於室溫在封閉/透化緩衝液中稀釋之二級抗體、DAPI 以及 AlexaFluor 660 蠅虎蕈鹼在室溫培育至少 2 小時。使用 40X 物鏡在 Stellaris 8 共焦顯微鏡 (Leica) 上收集影像，並使用 Imaris 影像分析軟體 (Oxford Instruments) 進行 3D 重建。
轉錄組分析。 對於 RNA 分離，使用 RNeasy Micro Plus 套組 (Qiagen)。將 RLT+ 裂解緩衝液添加至 BME 圓頂或沉澱 BOBA 中並儲存在 -80℃。使用 QiaCube Connect (Qiagen) 進行 RNA 分離，並使用 Nanodrop 8000 (ThermoFisher) 定量 RNA。批量 mRNA-seq (NovaSeq PE150) 及分析藉由 Novogene 進行。使用 HISAT2 (Mortazavi 等人 2008) 比對讀段，使用 DESeq2 (Anders 等人2014) 進行差異基因表現分析，並使用負二項分佈模型及 Benjamini-Hochberg FDR 校正計算統計顯著性。分析幹細胞及增生標記物 (EpCAM 及 CD49f +) 以及分化標記物 (細胞角蛋白 8 (K8)、細胞角蛋白 18 (K18)、細胞角質白 5 (k5)、細胞角蛋白 14 (K14)、平滑肌肌動蛋白 (SMA))。
實例 6 ：胰臟類器官之產生
該實例提供了使用本文所述之 BME 懸浮方法產生胰臟類器官之方法。
方法：
人類 胰臟類器官來源及維持。 胰臟類器官如 Georgakopoulos 等人BMC Developmental Biology 20:4 (2020) 之前所述產生，其內容全文併入本文中。將約 5 mg 胰臟組織手動切碎並以 gentleMACS 解離器 (Miltenyi Biotec) 解離總共 2 分鐘。將切碎組織在洗滌培養基中洗滌兩次，並在 40 mL 消化溶液中消化，並在 37℃ 放置 1 至 2 小時。洗滌溶液包括杜爾貝科改良伊格爾培養基 (DMEM)、高葡萄糖、GlutaMAX、丙酮酸鹽 (Life Technologies)，其補充有 1% 胎牛血清 (FBS) (Life Technologies) 及 1% 青黴素/鏈黴素 (10,000 U/mL) (Life Technologies) Technologies)，且消化溶液包括膠原蛋白酶 I 型 (Sigma-Aldrich) 及分散酶 II (Life Technologies)，在含有 0.1 mg/mL DNase I (Sigma-Aldrich) 之 DMEM 中之濃度為 0.125 mg/mL。分離導管以移液管手工挑選，或以 100 μm 孔尼龍細胞過濾器 (Falcon) 過濾整個消化混合物。導管碎片在基礎培養基 (Advanced DMEM/F12 (Life Technologies)，其補充有 1% 青黴素/鏈黴素、1% Glutamax 100x (Life Technologies) 及 HEPES (Life Technologies) 10 mM) 中洗滌，並以 200 g 旋轉 5 分鐘。將細胞沉澱與低生長因子 BME 2-RGF (基底膜萃取物 2 型 3533-010-02；AMSBIO，CULTREX®) 混合，接種於 24 孔盤中，並以優化人類胰臟類器官擴增培養基覆蓋。優化人類胰臟類器官擴增培養基包括基礎培養基，其補充有 1X N2 及 1X B27 (皆來自 GIBCO)、1.25 mM N-乙醯半胱胺酸 (Sigma-Aldrich)、10% RSPO1 條件無血清培養基、10 nM 人類 [Leu 15]-胃泌激素 I (Sigma-Aldrich)、50 ng/mL EGF (Peprotech)、25 ng/mL Noggin (Peprotech)、100 ng/mL FGF10 (Peprotech)、10 mM 菸鹼醯胺 (Sigma-Aldrich)、5 μM A83.01 (Tocris)、10 μM FSK (Tocris) 及 3 μM PGE2 (Tocris)。在前 7 天過程中，給優化人類胰臟類器官擴增培養基補充 10 μM Rho 激酶抑制劑 (Y27632，Sigma-Aldrich)。14 天後，如 Broutier 等人Nat Protoc.11:1724–43 (2016) 之前所述進行傳代，其內容全文併入本文中。
經懸浮之水凝膠 BOBA 培養物。 如上所述，在冰上製備 BME 中之單類器官細胞或類器官碎片。將預熱培養基添加到 6 孔盤 (5 mL/孔)、100 cm 培養皿 (15 至 30 mL/皿) 或 50 mL 錐形管 (30 mL/管) 中，並保持在 37°C 溫熱珠浴上。為了產生經懸浮之 BME 小滴或 BOBA，使用帶有寬孔或切割移液管尖端 (開口約 2 mm) 之電子連續移液管 (Integra VIAFLO 300) 將類器官細胞-BME 溶液以 10 µL 體積直接分配到溫熱培養基中。在分配過程中，尖端立即浸入液體表面下方，然後在各分配後提起，以確保小滴分離。對於較大形式培養物，藉由血清移液管或傾析將 BOBA 轉移至燒瓶中。培養基每 2 至 4 天一次更換。在 6 孔盤培養物中，將無菌 70 µm 細胞過濾器放入孔中，傾斜盤並透過過濾器輕輕吸出 4 mL 培養基。在燒瓶培養物中，將燒瓶傾斜一定角度，將 BOBA 放置在角落，然後以血清移液管更換大約 2/3 體積之已用培養基。
經懸浮之水凝膠 SOBA 及 SOBA 碎片培養物。 如上所述，在冰上製備 BME 中之單類器官細胞或類器官碎片。將預熱培養基添加至 6 孔盤 (5 mL/孔)、100 cm 培養皿 (15-30 mL/皿) 中，並保持在溫熱珠浴上。為了產生經懸浮之 SOBA 絲，將細胞-BME 溶液輕輕吸入帶有 15 號鈍尖端針之注射器中，然後直接擠出到溫熱培養基中，同時以 X-Y 平面中線形、蛇形或螺旋形運動方式移動浸沒針。為了產生 SOBA 碎片，使用 10 mL 血清移液管或寬孔 P1000 移液管尖端輕輕研磨 SOBA 絲培養物兩次。添加額外培養基以使最終 BME 與培養基之比率達到 1:10。如上對 BOBA 培養物所述進行培養基更換。
免疫螢光樣本製備及共焦顯微術。 24 孔圓頂培養物以於 PBS 中之 2% 多聚甲醛 (PFA) 固定。使用抹刀將圓頂從盤上分離，並使用切割 P1000 移液管尖端轉移到微量離心管中。對於 BOBA 培養物，使用切割 P1000 移液管尖端將 500 µL 培養物轉移至微量離心管中，除去培養基並添加於 PBS 中之 2% PFA。將樣本在固定劑中室溫培育 15 至 30 分鐘，然後在 PBS 中洗滌 3 次。將樣本在微量離心管中以在封閉/透化緩衝液 (3% BSA、0.1% Triton X-100、0.02% 疊氮化鈉，於 PBS 中) 中稀釋之初級抗體在室溫染色至少 4 小時，然後在 PBS 中洗滌 3 次。然後將樣本與於室溫在封閉/透化緩衝液中稀釋之二級抗體、DAPI 以及 AlexaFluor 660 蠅虎蕈鹼在室溫培育至少 2 小時。使用 40X 物鏡在 Stellaris 8 共焦顯微鏡 (Leica) 上收集影像，並使用 Imaris 影像分析軟體 (Oxford Instruments) 進行 3D 重建。
轉錄組分析。 對於 RNA 分離，使用 RNeasy Micro Plus 套組 (Qiagen)。將 RLT+ 裂解緩衝液添加至 BME 圓頂或沉澱 BOBA 中並儲存在 -80℃。使用 QiaCube Connect (Qiagen) 進行 RNA 分離，並使用 Nanodrop 8000 (ThermoFisher) 定量 RNA。批量 mRNA-seq (NovaSeq PE150) 及分析藉由 Novogene 進行。使用 HISAT2 (Mortazavi 等人 2008) 比對讀段，使用 DESeq2 (Anders 等人2014) 進行差異基因表現分析，並使用負二項分佈模型及 Benjamini-Hochberg FDR 校正計算統計顯著性。分析幹細胞及增生標記物 ( CD133、 LGR5、 PDX1、 SOX9、 ALDH1A1、 NEUROG3及 NKX6.1) 以及分化標記物 ( 角蛋白 19 (KRT19)、 MUC1、 INS、 GCG及 AMY)。
實例 7 ：肝類器官之產生
該實例提供了使用本文所述之 BME 懸浮方法產生肝類器官之方法。
方法：
人類肝類器官來源及維持。 肝類器官如 Huch 等人Cell 160(1-2):299-312 (2015) 之前所述產生，其內容全文併入本文中。 尺寸範圍為 0.5 至 1 cm 3之肝活體組織切片獲自肝移植過程中之供體及外植體肝。藉由切碎肝活體組織切片，以含 1% FCS 之 DMEM (GIBCO) 沖洗 2 次，並與消化溶液 (於 EBSS (Hyclone, Thermoscientific) 中之 2.5 mg/ml 膠原蛋白酶 D (Roche) 及 0.1 mg/ml DNase I (Sigma)) 一起在 37°C 培育 20 至 40 分鐘來從肝活體組織切片中分離肝細胞。藉由添加含有 1% FCS 之冷 DMEM 來停止消化。將消化懸浮液透過 70 µm 尼龍細胞過濾器過濾，並以 300 至 400 × g 旋轉 5 分鐘。將所得沉澱重懸於含有 1% FCS 之 DMEM 中並保持冷卻。如果材料保留在過濾器上，則在 37°C 在 Accutase (GIBCO) 中進一步消化此等材料 10 分鐘，然後停止並如上所述收集細胞。隨後將不同級分混合並以冷 Advanced DMEM/F12 洗滌，並以 300 至 400 × g 旋轉 5 分鐘。將細胞沉澱與水凝膠 ( 例如，MATRIGEL® (BD Biosciences) 或低生長因子 BME 2 (基底膜萃取物，2 型，Pathclear)) 混合，並將約 3,000 至 10,000 個細胞接種到盤 ( 例如，48 孔盤) 中之每個孔中。然後在 MATRIGEL® 或 BME 固化後添加培養基。培養基基於 AdDMEM/F12 (Invitrogen)，其補充有 1% N2 (GIBCO) 及 1% B27 (GIBCO)、1.25 mM N-乙醯半胱氨酸 (Sigma)、10 nM 胃泌激素 (Sigma) 及生長因子：50 ng/ml EGF (Peprotech)、10% RSPO1 條件培養基 (自製)、100 ng/ml FGF10 (Peprotech)、25 ng/ml HGF (Peprotech)、10 mM 菸鹼醯胺 (Sigma)、5 µM A83.01 (Tocris) 及 10 µM FSK (Tocris)。在分離後前 3 天過程中，給培養基補充 25 ng/ml Noggin (Peprotech)、30% Wnt 培養基 (如 Barker 等人Cell Stem Cell 6:25-36 (2010) 所述) 及 10 µM (Y27632, Sigma Aldrich) 或 hES 細胞選殖恢復溶液 (Stemgent) 以建立培養物。隨後將培養基更換為不含 Noggin、Wnt、Y27632 及 hES 細胞選殖恢復溶液之培養基。10 至 14 天後，將類器官從 MATRIGEL® 或 BME 中取出，機械解離成小碎片並轉移到新鮮基質中。以分流比 ( 例如，1:4 至 1:8) 每 7 至 10 天一次進行傳代，持續至少 6 個月。為了製備冷凍原液，將類器官培養物解離並與恢復細胞培養冷凍培養基 (GIBCO) 混合，並依照標準程序冷凍。使用標準解凍程序解凍培養物並如上所述進行培養。在解凍後前 3 天內，給培養基補充 Y-27632 (10 μM)。
對於肝細胞分化，，將肝類器官在補充有 BMP7 (25 ng/ml) 之上述肝培養基中接種並培養 7 至 10 天。將培養物分開並接種在此補充有 BMP7 之培養基中至少約 2 至 4 天。隨後，將培養基更換為分化培養基，其包括補充有 1% N2 及 1% B27 並含有 EGF (50 ng/ml)、胃泌激素 (10 nM, Sigma)、HGF (25 ng/ml)、FGF19 (100 ng/ml)、A8301 (500 nM)、DAPT (10 µM)、BMP7 (25 ng/ml) 及地塞米松 (30 µM) 之 AdDMEM/F12 培養基。在 11 至 13 天之時段內，每 2 至 3 天一次更換分化培養基。
經懸浮之水凝膠 BOBA 培養物。 如上所述，在冰上製備 BME 中之單類器官細胞或類器官碎片。將預熱培養基添加到 6 孔盤 (5 mL/孔)、100 cm 培養皿 (15 至 30 mL/皿) 或 50 mL 錐形管 (30 mL/管) 中，並保持在 37°C 溫熱珠浴上。為了產生經懸浮之 BME 小滴或 BOBA，使用帶有寬孔或切割移液管尖端 (開口約 2 mm) 之電子連續移液管 (Integra VIAFLO 300) 將類器官細胞-BME 溶液以 10 µL 體積直接分配到溫熱培養基中。在分配過程中，尖端立即浸入液體表面下方，然後在各分配後提起，以確保小滴分離。對於較大形式培養物，藉由血清移液管或傾析將 BOBA 轉移至燒瓶中。每 2 至 3 天一次以培養基更換培養基。在 6 孔盤培養物中，將無菌 70 µm 細胞過濾器放入孔中，傾斜盤並透過過濾器輕輕吸出 4 mL 培養基。在燒瓶培養物中，將燒瓶傾斜一定角度，將 BOBA 放置在角落，然後以血清移液管更換大約 2/3 體積之已用培養基。
經懸浮之水凝膠 SOBA 及 SOBA 碎片培養物。 如上所述，在冰上製備 BME 中之單類器官細胞或類器官碎片。將預熱培養基添加至 6 孔盤 (5 mL/孔)、100 cm 培養皿 (15-30 mL/皿) 中，並保持在溫熱珠浴上。為了產生經懸浮之 SOBA 絲，將細胞-BME 溶液輕輕吸入帶有 15 號鈍尖端針之注射器中，然後直接擠出到溫熱培養基中，同時以 X-Y 平面中線形、蛇形或螺旋形運動方式移動浸沒針。為了產生 SOBA 碎片，使用 10 mL 血清移液管或寬孔 P1000 移液管尖端輕輕研磨 SOBA 絲培養物兩次。添加額外培養基以使最終 BME 與培養基之比率達到 1:10。如上對 BOBA 培養物所述進行培養基更換。
免疫螢光樣本製備及共焦顯微術。 24 孔圓頂培養物以於 PBS 中之 2% 多聚甲醛 (PFA) 固定。使用抹刀將圓頂從盤上分離，並使用切割 P1000 移液管尖端轉移到微量離心管中。對於 BOBA 培養物，使用切割 P1000 移液管尖端將 500 µL 培養物轉移至微量離心管中，除去培養基並添加於 PBS 中之 2% PFA。將樣本在固定劑中室溫培育 15 至 30 分鐘，然後在 PBS 中洗滌 3 次。將樣本在微量離心管中以在封閉/透化緩衝液 (3% BSA、0.1% Triton X-100、0.02% 疊氮化鈉，於 PBS 中) 中稀釋之初級抗體在室溫染色至少 4 小時，然後在 PBS 中洗滌 3 次。然後將樣本與於室溫在封閉/透化緩衝液中稀釋之二級抗體、DAPI 以及 AlexaFluor 660 蠅虎蕈鹼在室溫培育至少 2 小時。使用 40X 物鏡在 Stellaris 8 共焦顯微鏡 (Leica) 上收集影像，並使用 Imaris 影像分析軟體 (Oxford Instruments) 進行 3D 重建。
轉錄組分析。 對於 RNA 分離，使用 RNeasy Micro Plus 套組 (Qiagen)。將 RLT+ 裂解緩衝液添加至 BME 圓頂或沉澱 BOBA 中並儲存在 -80℃。使用 QiaCube Connect (Qiagen) 進行 RNA 分離，並使用 Nanodrop 8000 (ThermoFisher) 定量 RNA。批量 mRNA-seq (NovaSeq PE150) 及分析藉由 Novogene 進行。使用 HISAT2 (Mortazavi 等人 2008) 比對讀段，使用 DESeq2 (Anders 等人2014) 進行差異基因表現分析，並使用負二項分佈模型及 Benjamini-Hochberg FDR 校正計算統計顯著性。分析幹細胞及增生標記物 ( LGR5) 以及分化標記物 (針對肝細胞之 ALB、 CYP3A4及 HNF4A，以及針對導管細胞之 KRT19、 KRT7及 SOX9)。
實例 8 ：注射器擠出之類器官 BME 組裝體 (SOBA) 培養方法
該實例提供了使用 SOBA 絲及 SOBA 絲碎片產生腸類器官並維持此等腸類器官之方法。SOBA 方法有利於並加快培養物製備，因為可將大體積細胞-BME 溶液加載到單一注射器中以產生 SOBA 水凝膠絲。整體而言，SOBA 方法使得能夠進行大規模類器官規模化，改善類器官培養均勻性，並節省勞力、時間及資源。
材料：
該方法使用了以下材料：10 cm 或 15 cm 培養皿、5 mL 注射器、15 號鈍尖端針 (藉由浸入 70% EtOH 中滅菌)、燒瓶 (T25-T225 或 6 孔盤/培養皿皆相容)、50 mL 錐形管、離心機、含 5% CO 2之培養箱、TC 倒置光學顯微鏡及 37℃ 水浴。
藥劑：
CULTREX® 低生長因子基底膜萃取物 2 型 (BME，R&D Systems 3533-010-2；必須保存在冰上) 或 MATRIGEL®；TrypLE Express；PBS (不含 Ca 2+/Mg 2+)；類器官生長培養基：人類腸類器官生長培養基 (OGM，Stem Cell Tech 06010) 及 Primocin®(1:1000, InvivoGen ant-pm-1)；以及類器官傳代培養基：類器官生長培養基及 10 µM Y-27632 (10 µM；1:1000 的於 PBS 中之 10 mM 原液)。
低滯留移液管尖端可用於所有步驟，以防止類器官損失。如果沒有低滯留尖端且不可接受類器官損失，則可在使用前給管及/或尖端包被 1% BSA/PBS。
方法：
細胞製備 。如本文所述產生胃腸類器官，並在類器官生長培養基中培養 7 至 14 天，該培養基包括人 Intesticult 類器官生長培養基 (OGM，Stem Cell Tech 06010) 及 Primocin® (1:1000，InvivoGen ant-pm-1)。對活細胞進行計數 (通常觀察到約 50% 至 70% 生存力)，並且視情況地，藉由重懸於 10mL DMEM 或 PBS 中並以 500 x g 離心 3 分鐘來洗滌細胞。這改善了生存力百分比，但有一些總體細胞損失。為了產生細胞-BME 溶液，將類器官細胞沉澱以 6 x 10 5個細胞/mL BME 之密度重懸於冰上之 BME 中 (這相當於 24 孔盤每孔 3 x 10 4個細胞，接種密度可能需要針對各行進行調整)。以 P1000 移液管將細胞沉澱輕輕重懸於 1 mL BME 中，而不引入氣泡。然後以 1 mL 增量添加額外 BME，每次均輕輕研磨。
經懸浮之水凝膠 SOBA 及 SOBA 碎片培養物。 將預熱類器官傳代培養基 (在 37℃ 水或珠浴中預熱) 添加到培養皿 (10 cm 培養皿中 30 mL 培養基或 15 cm 培養皿中 60 mL 培養基) 中並保持在溫熱珠浴上以維持溫度，該培養基包括類器官生長培養基及 10 µM Y-27632 (10 µM；1:1000 的於 PBS 中之 10 mM 原液)。如果迅速進行，則 SOBA 產生可在室溫在實驗台上進行，而不需要溫熱珠浴。
為了產生經懸浮之 SOBA 絲，將冷細胞-BME 溶液加載到帶有 15 號 (或更寬) 鈍尖端針或大體積移液管尖端之注射器中。將細胞-BME 溶液直接擠出到溫熱培養基中，同時在 X-Y 平面中以線形、蛇形或螺旋形運動移動浸沒針或尖端以產生 SOBA 絲。類器官在直徑 1-5 mm 絲中成功生長，其中藉由較慢分配速度及較慢 X-Y 運動產生更寬絲。更寬且更長絲可改善培養基更換過程中之 SOBA 重力沉降。如果培養基不夠溫熱或 BME 溶液太冷，則 SOBA 絲可能無法很好地形成。如果培養基不夠溫熱，則可能無法將 BME 溫熱到足以在分配過程中足夠快地聚合。如果 BME-細胞溶液太冷，則溫熱培養基可能無法立即將 BME 溫熱到足夠溫度以進行正確固化。在產生 SOBA 之前，可將 BME-細胞溶液在手中短暫溫熱，或可從冰中取出至室溫，持續 30 秒到一分鐘 (取決於 BME 體積)。
為了將 SOBA 絲及培養基轉移到燒瓶或其他培養容器中，使用寬開口血清移液管緩慢吸出並分配 SOBA 絲，以防止 SOBA 絲碎片化。然後將類器官傳代培養基添加到培養容器中，以使最終 BME 與培養基之比率達到 1:10。
培養基變化 。為了使 SOBA 絲藉由重力沉降，(a) 將培養容器 ( 例如，燒瓶) 垂直支撐並對角傾斜 5 分鐘 (例如，燒瓶可支撐在管架或冰桶中) ，或 (b) 將培養物輕輕傾析入 50 mL 錐形管中，其中藉由血清移液管轉移 SOBA 絲之次數應受到限制，以盡量減少碎片化。如果 SOBA 碎片非常小，則它們可保持漂浮在培養基中，在這種情況下，將培養物轉移到錐形管中以有利於 SOBA 沉降。將錐形管以 500 x g 離心 3 分鐘，關閉制動以促進沉降，並以 PBS 稀釋培養物並再次離心。在某些情況下，可以 PBS 稀釋培養物並再次離心。使用血清移液管，每 2 至 3 天用新鮮類器官傳代培養基更換約 50% 至 75% 培養基。如果將培養物轉移到錐形管中，則將培養物輕輕傾析回原始培養容器中。
使 SOBA 培養物傳代。 類器官通常在接種單類器官細胞後 7 至 14 天即可傳代。作物初始步驟，藉由重力沉降 SOBA 碎片。如上所討論的，為了使 SOBA 絲藉由重力沉降，(a) 將培養容器 ( 例如，燒瓶) 垂直支撐並對角傾斜 5 分鐘，或 (b) 將培養物輕輕傾析入 50 mL 錐形管中。藉由血清移液管除去盡可能多的培養基。如果 SOBA 碎片仍漂浮在培養基中，則將培養物稀釋，轉移至錐形管並以 PBS 稀釋。將錐形管以 500 x g 離心 3 分鐘，關閉制動以促進沉降。
將預熱 TrypLE Express 以至少 10 mL TrypLE Express 與 SOBA 培養物中 1 mL BME 之比率添加到錐形管中，並以血清移液管研磨溶液以打碎 SOBA 絲。然後將溶液在 37°C 水浴中培育 30 分鐘至 1 小時，視情況地在培育期間藉由血清移液管劇烈研磨。培育後，以血清移液管劇烈研磨溶液，並目視觀察類器官解離 ( 例如，使用倒置顯微鏡)。然後藉由向錐形管中添加 PBS 來滅活 TrypLE Express。
採用這種技術，活細胞可根據需要進行計數、稀釋或等分。在某些實施例中，細胞可根據需要傳代、冷凍或用於實驗。 * * * * * * * *
儘管已詳細描述目前揭露之主題及其優點，但應理解，在不脫離本揭露的精神和範圍的情況下，可在本文中進行各種改變、替換和變更。此外，本案的範圍不意圖限於說明書中所述的製程、機器、製造和物質組成、手段、方法和步驟的特定實施例。本技術領域中具有通常知識者將容易地從本文所揭示之主題的發明中輕易理解，可根據本文所揭示的主題，利用目前存在或今後將開發的進行與在本文描述的對應實施例基本上相同的功能或實現基本上相同的結果的製程、機器、製造、物質組成、手段、方法或步驟。因此，所附的申請專利範圍旨在將該等製程、機器、製造、物質組成、手段、方法或步驟包括在該申請專利範圍的範圍內。
本案通篇引用了各種專利、專利申請案、出版物、產品說明、方案和序列登錄號，出於所有目的，其內容藉由引用整體而併入本文。
圖 1A-1H 顯示經懸浮之 BME 水凝膠中腸類器官之規模化。習用圓頂培養物 (上) 及經懸浮之 BOBA (嵌入 BME 之類器官珠組裝體) 培養物 (下) 中人類大腸類器官之 (A) 示意圖、(B) 照片及 (C) 明視野顯微術。顯微照片之比例尺為 500 µm。(D) 明視野影像中圓頂及 BOBA 培養物之類器官直徑。(E) 共焦影像中 Ki67 陽性細胞之百分比。所呈現之資料為平均值 ± SD，學生 t 檢驗，n = 3，各 10 個視野。(F) 圓頂或 BOBA 培養物中大腸類器官之 3D 重建共焦影像。Ki67 為綠色，細胞核為藍色，肌動蛋白為白色，且比例尺為 20 µm。(G, H) (G) 大腸及 (H) 迴腸類器官之總活細胞、每 cm 2表面積之細胞或每 µL BME 之細胞。所有所呈現之資料為平均值 ± SD，學生 t 檢驗，*p ≤ 0.05，****p ≤ 0.0001，n = 3 次實驗。 圖 2A-2C 顯示 BOBA 培養物中之類器官分化。(A) 圓頂 (上) 及 BOBA (下) 培養物中大腸類器官之明視野影像顯示增生及分化類器官之相當形態。比例尺為 100 µm。(B) 批量 RNA-seq 顯示，從生長培養基過渡到分化培養基後，圓頂及 BOBA 培養之大腸類器官類似地下調幹細胞及前驅細胞標記物並上調分化標記物。(C) 針對分化上皮細胞類型之標記物 (針對杯狀細胞之 MUC2、針對腸上皮細胞之 FABP1 及針對腸內分泌細胞之 CHGA) 在以圓頂 (上) 及 BOBA (下) 二者形式培養之類器官中表現。細胞核為藍色，肌動蛋白為白色，且比例尺為 10 µm。 圖 3A-3C 顯示 BME 體積及培養容器可影響經懸浮之 BME 水凝膠培養物中之類器官生長。(A) 24 孔盤中表面接附之圓頂 (0.5 mL 培養基中之 50 µL BME) 中大腸類器官之明視野影像，或 6 孔盤孔中之 BOBA 培養物 (5 mL 培養基中之 0.5、1 或 2 mL BME) 中之大腸類器官之明視野影像。比例尺為 200 µm。(B，C) (B) 6 孔盤或 (C) 25 cm 2燒瓶中類器官直徑、總活細胞、每 cm 2表面積之活細胞及每 µL BME 之活細胞之定量。所呈現之資料為平均值 ± SD，單因素 ANOVA 多重比較檢驗，n = 3 次實驗；*p ≤ 0.05，**p ≤ 0.01，***p ≤ 0.001，****p ≤ 0.0001。 圖 4A-4E 顯示 BOBA 培養物中類器官尺寸均勻性。(A) 描述用於均勻性分析之成像策略之示意圖。(B，C) 50 µl BME 圓頂或 10 µl 經懸浮之 BOBA 水凝膠中最深平面處之大腸類器官之明視野影像。比例尺為 (B) 200 µm 及 (C) 1 mm。(D) 依跨 X 軸之位置，圓頂或 BOBA 水凝膠之水平 ROI 中之類器官直徑之定量。所呈現之資料為平均值 ± SD，並且在 3 次實驗之代表性實驗中 n=3 次重複。(E) 圓頂及 BOBA 培養物邊緣或核心處平均類器官直徑之定量。所有所呈現之資料為平均值 ± SD，雙因素 ANOVA，並且在 3 次實驗之代表性實驗中 n=3 次重複。 圖 5A-5B 顯示圓頂及 BOBA 培養物中類器官之基因表現。(A，B) 批量 RNA-seq 分析顯示，在生長培養基中培養 7 天後，在圓頂培養物或經懸浮之 BOBA 培養物中之大腸類器官之間 (A) 幹細胞及增生標記物與 (B) 腸上皮細胞標記物之基因表現差異。所呈現之資料為藉由 DESeq2 確定之標準化計數之平均值 ± SD，n = 3 次重複，且藉由負二項分佈模型進行統計分析，其中 BH 調整 p 值，*padj ≤ 0.05，** padj ≤ 0.01。 圖 6A-6D 顯示替代的經懸浮之 BME 水凝膠培養物形式具有相當的類器官生長。BOBA、SOBA (注射器擠出之類器官 BME 組裝體) 或 SOBA 碎片形式之 6 孔盤培養物中大腸類器官之 (A) 照片及 (B) 明視野影像。替代形式使得能夠加快培養物製備以用於規模化。比例尺為 1 mm。(C) 類器官直徑之定量及 (D) 每孔之活細胞。所呈現之資料為平均值 ± SD，單因素 ANOVA 多重比較檢驗，n = 3 次實驗。 圖 7A-7E 顯示經懸浮之 BME 水凝膠類器官培養物在中等生產量篩選中之應用。(A) 實驗示意圖。將 225 cm 2燒瓶中之 SOBA 碎片類器官培養物研磨以達到均勻類器官懸浮液，然後接種到 96 孔盤中。(B) 在 225 cm 2燒瓶中培養之 SOBA 碎片培養物之明視野影像。比例尺為 1 mm。(C) 跨 96 孔盤隨機選擇之孔之明視野影像顯示相當的孔間類器官密度。比例尺為 1 mm。(D) Cell Titer Glo 3D (CTG) 生存力讀數顯示 96 孔盤中圓頂與經懸浮之 BME 培養物之間相似的孔間變異性。所呈現之資料為平均值 ± SD。學生 t 檢驗。(E) 以雙醋瑞因、索拉非尼、SN-38 或多西紫杉醇處理 3 天之經懸浮之 BME 類器官之代表性劑量反應生存力曲線 (CTG 測定)。所呈現之資料為平均值 ± SD，n = 4。 圖 8A-8C 顯示使用經懸浮之 BME 水凝膠類器官來產生 Transwell 單層。(A) 實驗示意圖。將 225 cm 2燒瓶中之 SOBA 碎片類器官培養物消化成單細胞懸浮液，然後在匯合時接種到 96 孔 BME 包被之 Transwell 小室中。(B) 接種後 3 天之 SOBA 碎片類器官來源之 Transwell 單層之明視野影像。Transwell 係以單層生長培養基或單層分化培養基建立。比例尺為 100 µm。(C) 在單層生長培養基 (實心圓圈) 或單層分化培養基 (空心圓圈) 中培養之 Transwell 單層之跨上皮電阻 (TEER)。所呈現之資料為平均值 ± SD，n = 6 孔。 圖 9提供嵌入懸浮於 BOBA 培養物之培養基中之水凝膠中之肺 AT2 類器官之影像。 圖 10提供描繪用於產生水凝膠小滴之示例性條件之示意圖，該水凝膠小滴在本文中被稱為基底膜類器官珠組裝體 (BOBA)。懸浮於冷液體水凝膠中之類器官或經解離之類器官細胞作為小滴分配到室溫或更溫暖之培養基中，這使得水凝膠在分配到培養基中時能夠立即固化。 圖 11提供描繪用於產生水凝膠絲之示例性條件之示意圖，水凝膠絲在本文中被稱為注射器擠出之類器官基底膜組裝體 (SOBA)。懸浮於冷液體水凝膠中之類器官或經解離之類器官細胞作為絲擠出 (藉由注射器、移液管或任何其他分配裝置) 到室溫或更溫暖之培養基中，這使得水凝膠在分配到培養基中時能夠立即固化。

Claims (117)

  1. 一種產生組織來源之上皮類器官之方法，其包含： (a)   使組織來源之上皮幹細胞與水凝膠接觸以產生水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物； (b)   將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物懸浮在培養基中以產生經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物；以及 (c)   將該經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物在該培養基中培養以產生組織來源之上皮類器官。
  2. 如請求項 1 之方法，其中使複數個組織來源之上皮幹細胞與該水凝膠接觸以產生該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。
  3. 如請求項 2 之方法，其中該複數個組織來源之上皮幹細胞包含約 1 × 10 4個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠至約 1 × 10 7個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠。
  4. 如請求項 2 或 3 之方法，其中該複數個組織來源之上皮幹細胞包含在組織碎片 (fragment)、類器官碎片或其組合內。
  5. 如請求項 1 至 3 中任一項之方法，其中該組織來源之上皮幹細胞或該複數個組織來源之上皮幹細胞係分離自原生上皮組織 (primary epithelial tissue)。
  6. 如請求項 1 至 5 中任一項之方法，其中該水凝膠係在與該培養基接觸時固化。
  7. 如請求項 1 至 6 中任一項之方法，其中將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物懸浮在該培養基中包含將含有該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之分配裝置浸沒在該培養基中並將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物分配到該培養基中。
  8. 如請求項 1 至 7 中任一項之方法，其中該培養基之溫度係約 25℃ 至約 50℃。
  9. 如請求項 1 至 8 中任一項之方法，其中該培養基之溫度係約 30℃ 至約 50℃。
  10. 如請求項 1 至 9 中任一項之方法，其中該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之溫度係約 2℃ 至約 25℃。
  11. 如請求項 1 至 10 中任一項之方法，其中該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物之溫度係約 2℃ 至約 20℃。
  12. 如請求項 1 至 11 中任一項之方法，其中該水凝膠係選自由以下所組成之群組：合成水凝膠、天然水凝膠及其組合。
  13. 如請求項 12 之方法，其中該天然水凝膠包含基底膜萃取物 (BME) 或細胞外基質 (ECM) 成分。
  14. 如請求項 1 至 13 中任一項之方法，其中該水凝膠具有等於或大於損耗模數 G'' 之儲存模數 G'。
  15. 如請求項 1 至 14 中任一項之方法，其中該經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物具有包含大於約 0.1 mm 之長度、寬度及/或直徑之幾何形狀。
  16. 如請求項 15 之方法，其中該經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物具有包含約 0.1 mm 至約 1,000 mm 之長度、寬度及/或直徑之幾何形狀。
  17. 如請求項 1 至 16 中任一項之方法，其中該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物係以小滴 (droplet) 懸浮在該培養基中。
  18. 如請求項 1 至 16 中任一項之方法，其中該經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物具有絲狀結構。
  19. 如請求項 18 之方法，其中該絲狀結構具有線形、蛇形或螺旋形形狀。
  20. 如請求項 1 至 19 中任一項之方法，其進一步包含將該經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物碎片化以產生包含該等組織來源之上皮類器官之碎片化結構。
  21. 一種產生組織來源之上皮類器官之懸浮培養物之方法，其包含： (a)   將包含水凝膠及組織來源之上皮幹細胞之混合物引入到培養基中以產生經懸浮之混合物；以及 (b)   將該經懸浮之混合物在該培養基中培養以產生呈懸浮狀態之該等組織來源之上皮類器官。
  22. 如請求項 21 之方法，其中引入到該培養基中之該混合物包含該水凝膠及複數個組織來源之上皮幹細胞。
  23. 如請求項 22 之方法，其中該複數個組織來源之上皮幹細胞包含約 1 × 10 4個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠至約 1 × 10 7個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠。
  24. 如請求項 22 或 23 之方法，其中該複數個組織來源之上皮幹細胞包含在組織碎片、類器官碎片或其組合內。
  25. 如請求項 21 至 23 中任一項之方法，其中該組織來源之上皮幹細胞或該複數個組織來源之上皮幹細胞係分離自原生上皮組織。
  26. 如請求項 21 至 25 中任一項之方法，其中該水凝膠係在與該培養基接觸時固化。
  27. 如請求項 21 至 26 中任一項之方法，其中將該混合物引入該培養基中包含將含有該混合物之分配裝置浸沒在該培養基中並將該混合物分配到該培養基中。
  28. 如請求項 21 至 27 中任一項之方法，其中該培養基之溫度係約 25℃ 至約 50℃。
  29. 如請求項 21 至 28 中任一項之方法，其中該培養基之溫度係約 30℃ 至約 50℃。
  30. 如請求項 21 至 29 中任一項之方法，其中該混合物之溫度係約 2℃ 至約 25℃。
  31. 如請求項 21 至 30 中任一項之方法，其中該混合物之溫度係約 2℃ 至約 20℃。
  32. 如請求項 21 至 31 中任一項之方法，其中該水凝膠係選自由以下所組成之群組：合成水凝膠、天然水凝膠及其組合。
  33. 如請求項 32 之方法，其中該天然水凝膠包含基底膜萃取物 (BME) 或細胞外基質 (ECM) 成分。
  34. 如請求項 21 至 33 中任一項之方法，其中該水凝膠具有等於或大於損耗模數 G'' 之儲存模數 G'。
  35. 如請求項 21 至 34 中任一項之方法，其中該經懸浮之混合物具有包含大於約 0.1 mm 之長度、寬度及/或直徑之幾何形狀。
  36. 如請求項 35 之方法，其中該經懸浮之混合物具有包含約 0.1 mm 至約 1,000 mm 之長度、寬度及/或直徑之幾何形狀。
  37. 如請求項 21 至 36 中任一項之方法，其中該混合物係以小滴引入到該培養基中。
  38. 如請求項 21 至 36 中任一項之方法，其中該混合物係以絲狀結構引入到該培養基中。
  39. 如請求項 38 之方法，其中該等絲狀結構具有線形、蛇形或螺旋形形狀。
  40. 如請求項 21 至 39 中任一項之方法，其進一步包含將該經懸浮之混合物碎片化以產生包含該等組織來源之上皮類器官之碎片化結構。
  41. 如請求項 1 至 40 中任一項之方法，其中該培養基係存在於選自由以下所組成之群組的容器中：培養皿、多孔盤、錐形管、貯器、培養袋、生物反應器或燒瓶。
  42. 一種產生組織來源之上皮類器官之懸浮培養物之方法，其包含： (a)   使組織來源之上皮幹細胞與水凝膠接觸以產生水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物； (b)   將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物沉積到基材上； (c)   將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物固化以產生經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物； (d)   將該經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物懸浮在培養基中以產生經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物；以及 (e)   將該經懸浮之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物在該培養基中培養以產生組織來源之上皮類器官。
  43. 如請求項 42 之方法，其中使複數個組織來源之上皮幹細胞與該水凝膠接觸以產生該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物。
  44. 如請求項 43 之方法，其中該複數個組織來源之上皮幹細胞包含約 1 × 10 4個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠至約 1 × 10 7個組織來源之上皮幹細胞/ml 水凝膠。
  45. 如請求項 43 或 44 之方法，其中該複數個組織來源之上皮幹細胞包含在組織碎片、類器官碎片或其組合內。
  46. 如請求項 42 至 44 中任一項之方法，其中該組織來源之上皮幹細胞或該複數個組織來源之上皮幹細胞係分離自原生上皮組織。
  47. 如請求項 32 至 46 中任一項之方法，其進一步包含在將該經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物懸浮在該培養基中之前，將該經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物從該基材中取出。
  48. 如請求項 42 至 47 中任一項之方法，其中該水凝膠係選自由以下所組成之群組：合成水凝膠、天然水凝膠及其組合。
  49. 如請求項 48 之方法，其中該天然水凝膠包含基底膜萃取物 (BME) 或細胞外基質 (ECM) 成分。
  50. 如請求項 42 至 49 中任一項之方法，其中該水凝膠具有等於或大於損耗模數 G'' 之儲存模數 G'。
  51. 如請求項 42 至 50 中任一項之方法，其中該經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物具有包含大於約 0.1 mm 之長度、寬度及/或直徑之幾何形狀。
  52. 如請求項 51 之方法，其中該經固化之水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物具有包含約 0.1 mm 至約 1,000 mm 之長度、寬度及/或直徑之幾何形狀。
  53. 如請求項 42 至 52 中任一項之方法，其中將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物呈小滴沉積到該基材上。
  54. 如請求項 42 至 52 中任一項之方法，其中將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物沉積到該基材上以具有絲狀結構。
  55. 如請求項 54 之方法，其中該絲狀結構具有線形、蛇形或螺旋形形狀。
  56. 如請求項 42 至 55 中任一項之方法，其進一步包含將該水凝膠-組織來源之上皮幹細胞混合物在該培養基中碎片化以產生包含該等組織來源之上皮類器官之碎片化結構。
  57. 如請求項 1 至 56 中任一項之方法，其中與參考組織來源之上皮類器官相比，該等組織來源之上皮類器官具有均一形態，其中該等參考組織來源之上皮類器官為嵌入在接附至基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。
  58. 如請求項 57 之方法，其中該等組織來源之上皮類器官具有均一尺寸。
  59. 如請求項 58 之方法，其中該等組織來源之上皮類器官之平均直徑比該等參考組織來源之上皮類器官更均一。
  60. 如請求項 1 至 59 中任一項之方法，其中與參考組織來源之上皮類器官之群體相比，幹細胞及/或增生標記物在該等組織來源之上皮類器官之群體中以較高含量表現，其中該等參考組織來源之上皮類器官為嵌入在接附至基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。
  61. 如請求項 60 之方法，其中該幹細胞及/或增生標記物係選自由以下所組成之群組：MKI67、EpCAM、CD49f、ASCL2、CD133、LGR5、SOX9、ALDH1A1、NEUROG3、NKX6.1、SMOC2、PDX1、CD44 及其組合。
  62. 如請求項 1 至 61 中任一項之方法，其中與參考組織來源之上皮類器官之群體相比，分化標記物在該等組織來源之上皮類器官之群體中以較低含量表現，其中該等參考組織來源之上皮類器官為嵌入在接附至基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。
  63. 如請求項 62 之方法，其中該分化標記物係選自由以下所組成之群組：角蛋白 20 (KRT20)、FABP1、MUC2、MUC5B、TFF3、ALPI、SI、CEACAM7、角蛋白 19 (KRT19)、角蛋白 7 (KRT7)、SOX9、MUC1、INS、GCG、AMY、ALB、CYP3A4、HNF4A、細胞角蛋白 8 (K8)、細胞角蛋白 18 (K18)、細胞角蛋白 5 (K5)、細胞角蛋白 14 (K14)、平滑肌肌動蛋白 (SMA) 及其組合。
  64. 一種組織來源之上皮類器官，其藉由如請求項 1 至 63 中任一項之方法產生。
  65. 一種組成物，其包含組織來源之上皮類器官及培養基，其中該組織來源之上皮類器官係嵌入在懸浮於該培養基中之水凝膠內。
  66. 如請求項 65 之組成物，其中該水凝膠具有包含大於約 0.1 mm 之長度、寬度及/或直徑之幾何形狀。
  67. 如請求項 66 之組成物，其中該水凝膠具有包含約 0.1 mm 至約 1,000 mm 之長度、寬度及/或直徑之幾何形狀。
  68. 如請求項 65 至 67 中任一項之組成物，其中該水凝膠為小滴。
  69. 如請求項 65 至 67 中任一項之組成物，其中該水凝膠具有絲狀結構。
  70. 如請求項 69 之組成物，其中該絲狀結構具有線形、蛇形或螺旋形形狀。
  71. 如請求項 65 至 70 中任一項之組成物，其中與參考組織來源之上皮類器官之群體相比，幹細胞及/或增生標記物在該等組織來源之上皮類器官之群體中以較高含量表現，其中該等參考組織來源之上皮類器官為嵌入在接附至基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。
  72. 如請求項 71 之組成物，其中該幹細胞及/或增生標記物係選自由以下所組成之群組：MKI67、EpCAM、CD49f、ASCL2、CD133、LGR5、SOX9、ALDH1A1、NEUROG3、NKX6.1、SMOC2、PDX1、CD44 及其組合。
  73. 如請求項 65 至 72 中任一項之組成物，其中與參考組織來源之上皮類器官之群體相比，分化標記物在該等組織來源之上皮類器官之群體中以較低含量表現，其中該等參考組織來源之上皮類器官為嵌入在接附至基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。
  74. 如請求項 73 之組成物，其中該分化標記物係選自由以下所組成之群組：角蛋白 20 (KRT20)、FABP1、MUC2、MUC5B、TFF3、ALPI、SI、CEACAM7、角蛋白 19 (KRT19)、角蛋白 7 (KRT7)、SOX9、MUC1、INS、GCG、AMY、ALB、CYP3A4、HNF4A、細胞角蛋白 8 (K8)、細胞角蛋白 18 (K18)、細胞角蛋白 5 (K5)、細胞角蛋白 14 (K14)、平滑肌肌動蛋白 (SMA) 及其組合。
  75. 一種篩選藥劑之方法，其包含： (a)   使如請求項 64 之組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體或如請求項 65 至 74 中任一項之組成物與藥劑接觸；以及 (b)   分析該組織來源之上皮類器官或該組織來源之上皮類器官之群體的指示該藥劑之有效性、配置 (disposition) 及/或毒性之變化。
  76. 如請求項 75 之方法，其中該藥劑係與該組織來源之上皮類器官或該組織來源之上皮類器官之群體接觸約 15 分鐘至約 3 年。
  77. 如請求項 75 或 76 之方法，其中該藥劑為治療劑。
  78. 如請求項 77 之方法，其中該治療劑為基於多肽之治療劑、小分子治療劑、細胞治療劑、基因編輯系統、基於核酸之治療劑或其組合。
  79. 一種進行基因體篩選之方法，其包含： (a)   提供如請求項 64 之組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體或如請求項 65 至 74 中任一項之組成物； (b)   在該組織來源之上皮類器官之一個或多個細胞之基因體中產生突變；以及 (c)   分析該組織來源之上皮類器官或該組織來源之上皮類器官之群體的與該突變相關之變化。
  80. 如請求項 79 之方法，其中該突變係使用基因調節系統產生的。
  81. 如請求項 80 之方法，其中該基因調節系統為基因編輯系統。
  82. 如請求項 81 之方法，其中該基因編輯系統為 CRISPR 系統。
  83. 如請求項 75 至 82 中任一項之方法，其中該變化為性質的變化，該性質係選自由以下所組成之群組：細胞生存力、細胞增生、細胞形態、類器官形態、類器官尺寸、蛋白質表現含量、核酸表現含量、核酸修飾、轉譯後修飾、細胞傳訊路徑之活化、細胞傳訊路徑之壓制 (repression)、酵素活性、障壁完整性及其組合。
  84. 一種產生上皮細胞模型之方法，其包含： (a)   提供如請求項 64 之組織來源之上皮類器官或組織來源之上皮類器官之群體； (b)   將該組織來源之上皮類器官或該組織來源之上皮類器官之群體消化成單細胞；以及 (c)   將該等單細胞在培養基中培養以產生細胞單層。
  85. 如請求項 84 之方法，其中將該等單細胞在可滲透細胞培養內件 (permeable cell culture insert) 上培養。
  86. 如請求項 84 或 85 之方法，其中該培養基為分化培養基。
  87. 如請求項 84 或 85 之方法，其中該培養基為細胞生長或幹細胞促進培養基。
  88. 一種篩選藥劑之方法，其包含： (a)   使藉由如請求項 84 至 87 中任一項之方法產生之該細胞單層與藥劑接觸；以及 (b)   分析該細胞單層的指示該藥劑之有效性、配置及/或毒性之變化。
  89. 如請求項 88 之方法，其中該藥劑係與該細胞單層接觸約 15 分鐘至約 3 年。
  90. 如請求項 88 或 89 之方法，其中該藥劑為治療劑。
  91. 如請求項 90 之方法，其中該治療劑為基於多肽之治療劑、小分子治療劑、細胞治療劑、基因編輯系統、基於核酸之治療劑或其組合。
  92. 一種進行基因體篩選之方法，其包含： (a)   提供藉由如請求項 84 至 87 中任一項之方法產生之該細胞單層； (b)   在該細胞單層之一個或多個細胞之基因體中產生突變；以及 (c)   分析該細胞單層的與該突變相關之變化。
  93. 如請求項 92 之方法，其中該突變係使用基因調節系統產生的。
  94. 如請求項 93 之方法，其中該基因調節系統為基因編輯系統。
  95. 如請求項 94 之方法，其中該基因編輯系統為 CRISPR 系統。
  96. 如請求項 84 至 95 中任一項之方法，其中該變化為性質的變化，該性質係選自由以下所組成之群組：細胞生存力、細胞增生、細胞形態、類器官形態、類器官尺寸、蛋白質表現含量、核酸表現含量、核酸修飾、轉譯後修飾、細胞傳訊路徑之活化、細胞傳訊路徑之壓制、酵素活性、障壁完整性及其組合。
  97. 如請求項 1 至 63 及 75 至 96 中任一項之方法或如請求項 65 至 74 中任一項之組成物，其中該組織碎片為來自組織之碎片，該組織係選自由以下所組成之群組：淚腺、扁桃腺、唾液腺、胃腸組織、甲狀腺、肺、乳腺、肝、膽管、胃、腎、胰臟、子宮內膜、輸卵管、子宮頸、前列腺、膀胱、味蕾、卵巢、胎盤及其組合。
  98. 如請求項 1 至 63 及 75 至 96 中任一項之方法或如請求項 65 至 74 中任一項之組成物，其中該組織來源之上皮幹細胞係獲自類器官之碎片，該類器官係選自由以下所組成之群組：淚腺類器官、扁桃腺類器官、唾液腺類器官、胃腸類器官、甲狀腺類器官、肺類器官、乳腺類器官、肝類器官、膽管類器官、胃類器官、腎類器官、胰臟類器官、子宮內膜類器官、輸卵管類器官、子宮頸類器官、前列腺類器官、膀胱類器官、卵巢類器官、味蕾類器官、滋胚內層類器官及其組合。
  99. 一種培養組織來源之上皮類器官之系統，其包含組織來源之上皮類器官及培養基，其中該組織來源之上皮類器官係嵌入在懸浮於該培養基中之水凝膠內。
  100. 如請求項 99 之系統，其中該組織來源之上皮類器官為腸類器官。
  101. 如請求項 99 或 100 之系統，其中該水凝膠具有包含大於約 0.1 mm 之長度、寬度及/或直徑之幾何形狀。
  102. 如請求項 99 至 101 中任一項之系統，其中該水凝膠具有包含約 0.1 mm 至約 1,000 mm 之長度、寬度及/或直徑之幾何形狀。
  103. 如請求項 99 至 102 中任一項之系統，其中該水凝膠為小滴。
  104. 如請求項 99 至 102 中任一項之系統，其中該水凝膠具有絲狀結構。
  105. 如請求項 104 之系統，其中該絲狀結構具有線形、蛇形或螺旋形形狀。
  106. 如請求項 99 至 105 中任一項之系統，其中與參考組織來源之上皮類器官之群體相比，幹細胞及/或增生標記物在該等組織來源之上皮類器官之群體中以較高含量表現，其中該等參考組織來源之上皮類器官為嵌入在接附至基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。
  107. 如請求項 106 之系統，其中該幹細胞及/或增生標記物係選自由以下所組成之群組：MKI67、EpCAM、CD49f、ASCL2、CD133、LGR5、SOX9、ALDH1A1、NEUROG3、NKX6.1、SMOC2、PDX1、CD44 及其組合。
  108. 如請求項 99 至 107 中任一項之系統，其中與參考組織來源之上皮類器官之群體相比，分化標記物在該等組織來源之上皮類器官之群體中以較低含量表現，其中該等參考組織來源之上皮類器官為嵌入在接附至基材之水凝膠內之組織來源之上皮類器官。
  109. 如請求項 108 之系統，其中該分化標記物係選自由以下所組成之群組：角蛋白 20 (KRT20)、FABP1、MUC2、MUC5B、TFF3、ALPI、SI、CEACAM7、角蛋白 19 (KRT19)、角蛋白 7 (KRT7)、SOX9、MUC1、INS、GCG、AMY、ALB、CYP3A4、HNF4A、細胞角蛋白 8 (K8)、細胞角蛋白 18 (K18)、細胞角蛋白 5 (K5)、細胞角蛋白 14 (K14)、平滑肌肌動蛋白 (SMA) 及其組合。
  110. 如請求項 99 至 109 中任一項之系統，其中該組織來源之上皮類器官係選自由以下所組成之群組：淚腺類器官、扁桃腺類器官、唾液腺類器官、胃腸類器官、甲狀腺類器官、肺類器官、乳腺類器官、肝類器官、膽管類器官、胃類器官、腎類器官、胰臟類器官、子宮內膜類器官、輸卵管類器官、子宮頸類器官、前列腺類器官、膀胱類器官、卵巢類器官、味蕾類器官、滋胚內層類器官及其組合。
  111. 如請求項 99 至 110 中任一項之系統，其包含用於產生及/或培養該組織來源之上皮類器官之一個或多個機器人及/或自動化組件。
  112. 如請求項 111 之系統，其中該一個或多個機器人及/或自動化組件包含液體處理機器人。
  113. 一種用於進行如請求項 1 至 63 及 75 至 98 中任一項之方法之系統，其包含一個或多個機器人及/或自動化組件。
  114. 如請求項 113 之系統，其中該一個或多個機器人及/或自動化組件包含液體處理機器人。
  115. 如請求項 1 至 63 及 75 至 98 中任一項之方法，其中該方法之步驟中之一者或多者係藉由一個或多個機器人及/或自動化組件來進行。
  116. 如請求項 115 之方法，其中該一個或多個機器人及/或自動化組件包含液體處理機器人。
  117. 如請求項 64 之組織來源之上皮類器官，其中該組織來源之上皮類器官係選自由以下所組成之群組：淚腺類器官、扁桃腺類器官、唾液腺類器官、胃腸類器官、甲狀腺類器官、肺類器官、乳腺類器官、肝類器官、膽管類器官、胃類器官、腎類器官、胰臟類器官、子宮內膜類器官、輸卵管類器官、子宮頸類器官、前列腺類器官、膀胱類器官、卵巢類器官、味蕾類器官、滋胚內層類器官及其組合。
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