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TW202503267A - 獲取具有高親和力之抗體分子的方法 - Google Patents

獲取具有高親和力之抗體分子的方法 Download PDF

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TW202503267A
TW202503267A TW113109518A TW113109518A TW202503267A TW 202503267 A TW202503267 A TW 202503267A TW 113109518 A TW113109518 A TW 113109518A TW 113109518 A TW113109518 A TW 113109518A TW 202503267 A TW202503267 A TW 202503267A
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TW113109518A
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文怡 李
剛 陳
克里斯朵 維萊斯
喬治 楊柯波洛斯
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美商再生元醫藥公司
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Abstract

本文揭示了用於獲取表現對抗原展現出高結合親和力之抗體分子的抗體產生細胞(antibody-producing cells)的方法，其包含使一群抗體產生細胞，包括表現對細胞表面上抗原的抗體分子的細胞，與抗原的第一標記形式接觸以允許抗原結合至細胞表面上的抗體分子，接著使細胞與(i) 抗原的未標記形式、(ii) 抗原的第二標記形式，或(iii) 抗原的未標記形式及抗原的第二標記形式接觸；以及收集仍結合至抗原的第一標記形式的細胞，從而獲取表現對抗原的高親和力抗體分子的細胞。本方法允許從表現具有不同親和力之抗體分子的抗體產生細胞庫中獲取表現高親和力抗體分子的細胞。

Description

獲取具有高親和力之抗體分子的方法
相關申請案的交互參照
本申請案主張2023年3月15日提申之美國臨時申請案第63/452,206號和2024年2月29日提申之美國臨時申請案第63/559,544號的優先權及權益，兩者之內容係以引用方式併入本文。
高親和力結合為許多治療性抗體分子的期望屬性。高親和力單株抗體的可用性對於標靶免疫療法的開發至關重要。然而，在許多經免疫的動物中，非常高親和力抗體分子稀少，且用於產生抗體分子的標準方法在分離高親和力抗體分子時效率不彰。
通常，單株抗體獲自小鼠融合瘤，最常見為來自經免疫之小鼠的B淋巴球與小鼠骨髓瘤細胞的融合。然而，由於融合瘤培養的通量限制，利用融合瘤技術分離稀少的高親和力抗體的效率差。
產生高親和力抗體分子的另一種方法涉及使用展示技術從噬菌體、酵母或哺乳動物庫中產生先導抗體候選物。雖然可採用從表現抗體分子的B細胞中直接分離出DNA，但DNA庫在細胞表現系統(諸如噬菌體、酵母或細菌系統)中表現，隨後「經淘選(panned)」或經滴定以選出具有高親和力的抗體分子。展示技術可提供高品質的蛋白質庫，隨然其提供有限的多樣性。因此，基於體外突變的親和力成熟經常是產生衍生自此類庫之高親和力抗體分子的下一步驟。
因此，需要一種有效的方法以有效的方式大量獲取具有所需特異性及高結合親和力的抗體分子，而不需要多輪的篩選(諸如「淘選(panning)」)或定點突變。
本文揭露了用於獲取B細胞及其他抗體產生細胞(antibody-producing cells)的方法，該等細胞表現對抗原展現出高結合親和力之抗體分子，以及利用所揭露的方法製成的哺乳動物宿主細胞。本文基於以下觀察：可直接從不同親和力的一群抗體產生細胞中選擇及富集化表現對感興趣抗原具有高親和力之抗體分子的細胞。因此，在單一細胞分離及收集之前，諸如使用螢光活化細胞分選(fluorescence activated cell sorting，FACS)，直接從B細胞及其他抗體產生細胞中選擇抗體分子。此提供了用於從B細胞庫及表現具有不同親和力之抗體分子的其他抗體產生細胞中獲取表現高親和力抗體分子之細胞的簡單方法。
在一態樣中，本文涉及一種用於獲取表現對抗原展現出高結合親和力之抗體分子的抗體產生細胞的方法，所述方法包含： (a) 使一群抗體產生細胞（該群抗體產生細胞表現有針對細胞表面抗原之抗體分子）與抗原的第一標記形式接觸以允許抗原結合至細胞表面上的抗體分子，其中抗原的第一標記形式結合至第一可偵測標記； (b) 洗滌細胞以去除未結合的抗原； (c) 使細胞與 (i) 抗原的未標記形式、 (ii) 抗原的第二標記形式，或 (iii) 抗原的未標記形式和抗原的第二標記形式接觸； (d) 洗滌細胞以去除未結合的抗原；以及 (e) 收集仍結合至抗原的第一標記形式的細胞，從而獲取表現對抗原的高親和力抗體分子的細胞。
在本發明之一些實施例中，抗原的第一標記形式濃度在0.001nM與1mM之間。在本發明之一些實施例中，抗原的第一標記形式濃度在0.05nM與10nM之間。在一些實施例中，抗原的第一標記形式濃度在0.1與7.5nM之間。在一些實施例中，抗原的第一標記形式濃度為約0.2nM。在一些實施例中，抗原的第一標記形式濃度為約5nM。
在一些實施例中，第一可偵測標記為第一螢光標記。
在一些實施例中，抗原為單體形式的蛋白質。在一些實施例中，抗原為多聚體形式的蛋白質，例如二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體等，或其混合物。在一些實施例中，抗原為以單體與多聚體形式存在的蛋白質。
在一些實施例中，抗原的第一標記形式為抗原的單價形式。在此類實施例中，抗原可為單體形式的蛋白質、多聚體形式的蛋白質，或單體與多聚體形式的蛋白質，且抗原的單價形式沒有多聚化。在一些實施例中，抗原的第一標記形式為抗原的多價形式。在此類實施例中，抗原可為單體形式的蛋白質、多聚體形式的蛋白質，或單體與多聚體形式的蛋白質，且抗原的多個單元以多價形式存在。在一些實施例中，抗原的第一標記形式為抗原的單價與多價形式的混合物。在採用抗原的多價形式的實施例中，抗原的多價形式可由抗原結合或連接的多價分子提供。在一些實施例中，多價分子為鏈球菌親生物素蛋白多聚體 (例如四聚體)，其可由與抗原結合的生物素結合。在一些實施例中，多價分子為免疫球蛋白Fc片段的二聚體。在一些實施例中，多價分子為三聚化結構域分子的三聚體，諸如折疊子(foldon)。
在一些實施例中，抗原的未標記形式，其可在追蹤(chase)步驟中被採用，為抗原的單價形式，其中抗原可為單體形式的蛋白質、多聚體形式的蛋白質，或單體與多聚體形式的蛋白質。在一些實施例中，抗原的未標記形式為抗原的多價形式，其中抗原可為單體形式的蛋白質、多聚體形式的蛋白質，或單體與多聚體形式的蛋白質。在一些實施例中，抗原的未標記形式包含抗原的單價形式與多價形式的混合物，其中抗原可為單體形式的蛋白質、多聚體形式的蛋白質，或單體與多聚體形式的蛋白質。在採用抗原的多價形式的實施例中，抗原的多價形式可由抗原結合或連接的多價分子提供。在一些實施例中，多價分子為鏈球菌親生物素蛋白多聚體(例如四聚體)，其可由與抗原結合的生物素結合。在一些實施例中，多價分子為免疫球蛋白Fc片段的二聚體。在一些實施例中，多價分子為三聚化結構域分子的三聚體，諸如折疊子。
在一些實施例中，抗原的第二標記形式，其可在追蹤步驟中被採用，為抗原的單價形式，其中抗原可為單體形式的蛋白質、多聚體形式的蛋白質，或單體與多聚體形式的蛋白質。在一些實施例中，抗原的第二標記形式為多價形式，其中抗原可為單體形式的蛋白質、多聚體形式的蛋白質，或單體與多聚體形式的蛋白質。在一些實施例中，抗原的第二標記形式包含單價形式與多價形式的混合物，其中抗原可為單體形式的蛋白質、多聚體形式的蛋白質，或單體與多聚體形式的蛋白質。在採用抗原的多價形式的實施例中，抗原的多價形式可由抗原結合或連接的多價分子提供。在一些實施例中，多價分子為鏈球菌親生物素蛋白多聚體(例如四聚體)，其可由與抗原結合的生物素結合。在一些實施例中，多價分子為免疫球蛋白Fc片段的二聚體。在一些實施例中，多價分子為三聚化結構域分子的三聚體，諸如折疊子。抗原的第二標記形式以第二可偵測標記進行標記，其不同於第一可偵測標記。在一些實施例中，第二可偵測標記為第二螢光標記，其不同於第一螢光標記(若使用的話)。
在追蹤時使用抗原的未標記形式的實施例中，未標記形式可為抗原的單價形式、抗原的多價形式，或其混合物，其中抗原可為單體形式的蛋白質、多聚體形式的蛋白質，或單體與多聚體形式的蛋白質。在一些實施例中，抗原的未標記形式為抗原的單價形式。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為至少2至150倍且多達例如2500倍。舉例而言，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為至少2至至少120倍，包括2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍，或150倍，多達例如2500倍。在一些實施例中，取決於抗原的第一標記形式的濃度，追蹤步驟中之抗原的未標記形式的濃度可在0.4nM至600nM之間。
在追蹤 (chase)時使用抗原的第二標記形式的實施例中，抗原的第二標記形式可為單價形式、多價形式，或其混合物、單體形式與多聚體形式，其中抗原可為單體形式的蛋白質、多聚體形式的蛋白質，或單體與多聚體形式的蛋白質。在一些實施例中，抗原的第二標記形式為抗原的多價形式。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為至少2至150倍且多達例如2500倍。舉例而言，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為至少2至至少120倍，包括2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍，或150倍，多達例如2500倍。在一些實施例中，取決於抗原的第一標記形式的濃度，抗原的第二標記形式濃度在15與600nM之間。
在一些實施例中，在收集仍結合至抗原的第一標記形式的細胞之前，重複追蹤步驟及追蹤步驟後的洗滌至少一次。
在追蹤時使用抗原的未標記形式和抗原的第二標記形式的實施例中，未標記形式可為單價形式、多價形式，或抗原的單價與多價形式的混合物，且抗原的第二標記形式可為單價形式、多價形式，或抗原的單價與多價形式的混合物。在一些實施例中，追蹤以抗原的未標記、單價形式及多價的抗原的第二標記形式進行。在組合追蹤的一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為至少2倍至150倍且多達例如2500倍，例如至少2至至少150倍，包括2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍，或150倍，且多達例如2500倍；且抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為至少2倍至150倍且多達例如2500倍，例如至少2至至少150倍，包括2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍，或150倍，且多達例如2500倍。
在一些實施例中，第一可偵測標記為螢光標記，且螢光活化細胞分選用於收集與抗原的第一標記形式仍結合的細胞。在一些實施例中，第一可偵測標記為第一螢光標記、第二可偵測標記為不同於第一螢光標記的第二螢光標記，且二維螢光活化細胞分選用於收集與抗原的第一標記形式仍結合的細胞。
在一些實施例中，抗體產生細胞為在細胞表面上產生抗體分子的哺乳動物細胞或酵母(諸如啤酒酵母( S. cerevisiae)或畢赤酵母菌屬( Pichia))。在一些實施例中，抗體產生哺乳動物細胞為在細胞表面上產生抗體分子的初級抗體產生細胞株或永生細胞株。在一些實施例中，初級抗體產生細胞獲自哺乳動物受試者(例如人類、兔、豬、牛、馬及囓齒類)的脾臟、淋巴結、周邊血液及/或骨髓。在一些實施例中，永生細胞株選自於在細胞表面上產生抗體分子的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人類胚胎腎(HEK) 293細胞，以及融合瘤細胞。
在一些實施例中，在步驟(e)中收集的細胞富集了表現高親和力抗體分子的細胞。在一些實施例中，獲取的抗體分子的高親和力具有小於25nM的KD。在一些實施例中，獲取的抗體分子的高親和力在0.1pM至約25nM之範圍內(KD)。在一些實施例中，高親和力為小於10nM (KD)。在一些實施例中，高親和力為小於5nM (KD)。在一些實施例中，高親和力為小於1nM (KD)。在一些實施例中，高親和力為小於0.1nM (KD)。在一些實施例中，高親和力為小於0.01nM (KD)。在一些實施例中，高親和力為小於5pM (KD)。在一些實施例中，高親和力為小於1pM (KD)。在一些實施例中，至少40% (例如40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多)之收集的細胞表現高親和力抗體分子，例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體分子。在一些實施例中，與追蹤之前或沒有追蹤的細胞群的頻率相比，在追蹤後細胞群中表現高親和力抗體分子(例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體分子)的細胞頻率增加至少30% (例如30%、40%、50%、75%、100%、200%或更多)。在一些實施例中，與追蹤之前或沒有追蹤的細胞群的頻率相比，在追蹤後細胞群中表現具有小於1nM的KD的高親和力抗體分子(例如具有0.1pM至1nM的KD的抗體分子)的細胞頻率增加至少30% (例如30%、40%、50%、75%、100%、200%或更多)。在一些實施例中，與追蹤之前或沒有追蹤的細胞群的頻率相比，在追蹤後細胞群中表現具有小於0.1nM的KD的高親和力抗體分子(例如具有0.1pM至0.1nM的KD的抗體分子)的細胞頻率增加至少30% (例如30%、40%、50%、75%、100%、200%或更多)。
在一些實施例中，所述方法進一步包含從收集的與抗原的第一標記形式仍結合的細胞中分離出抗體編碼核酸。
在一些實施例中，所述方法進一步包含以編碼抗體重鏈或其可變結構域的核酸和編碼抗體輕鏈或其可變結構域的核酸進行宿主細胞轉染；以及使轉染的細胞在支持由該轉染的細胞表現抗體的條件下生長。在一些實施例中，宿主細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
在另一態樣中，本文涉及藉由從收集的表現高親和力抗體分子的細胞中分離出抗體編碼核酸並以編碼抗體重鏈或其可變結構域的核酸和編碼抗體輕鏈或其可變結構域的核酸進行宿主細胞轉染而製成的哺乳動物宿主細胞；以及使轉染的宿主細胞在支持由該宿主細胞表現抗體分子的條件下生長。在一些實施例中，宿主細胞為CHO細胞。
本文揭露了用於獲取初級抗體產生細胞的方法，該細胞表現對抗原展現出高結合親和力的抗體。
雖然將根據某些實例來描述所主張的主題，但是其他實例(包括不提供本文闡述之所有益處及特徵的實例)亦落入本文的範疇內。在不脫離本文之範疇的情況下，可進行各種結構、邏輯及過程步驟變更。
本文揭露了數值的範圍。所述範圍設定了下限值及上限值。除非另有說明，否則所述範圍包括下限值、上限值，以及下限值與上限值之間的所有值，包括(但不限於)最小值幅度的所有值(下限值或上限值)。
在下列描述中，將遵循有關術語使用的某些慣例。一般而言，本文中所使用之術語意欲與該等本領域具有通常知識者所已知的術語之含義一致地解釋。在實踐本發明時，使用符合本技術領域之分子生物學、微生物學、細胞生物學、生物化學、及免疫學中之許多常規技術。此等技術更詳細描述於，例如分子選殖：實驗指南(Molecular Cloning: a Laboratory Manual)第4版，J.F. Sambrook與D.W. Russell編制，冷泉港實驗室出版物，2012年；免疫療法重組抗體(Recombinant Antibodies for Immunotherapy)，Melvyn Little編制，劍橋大學出版物，2009年；「寡核苷酸的合成(Oligonucleotide Synthesis)」(M. J. Gait編制，1984年)；「動物細胞培養(Animal Cell Culture)」(R. I. Freshney編制，1987年)；「酵素學方法(Methods in Enzymology)」(學術出版社公司)；「分子生物學的當前協定(Current Protocols in Molecular Biology)」(F. M. Ausubel等人編制，1987年，並定期更新)；「PCR：聚合酶鏈反應(PCR: The Polymerase Chain Reaction)」，(Mullis等人編制，1994年)；「分子選殖實踐指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)」(Perbal Bernard V.，1988年)；「噬菌體展示技術：實驗室手冊(Phage 展示: A Laboratory Manual)」(Barbas等人，2001年)。此等參考文獻及其他包含標準協定之參考文獻的內容為本領域技術人員廣泛知曉並依賴，包括製造商的說明，其在此藉由引用併入作為本發明的一部分。 一般描述
本文的一個態樣涉及一種用於獲取表現對抗原展現出高結合親和力之抗體分子的抗體產生細胞的方法。本方法之一關鍵特徵涉及一初始結合步驟，其允許抗原的第一標記形式結合至抗體產生細胞表面上的抗體分子並形成抗原-抗體複合物，接著為「追蹤」步驟，其中細胞與幾種形式之一的抗原接觸：(i) 抗原的未標記形式(「冷追蹤」)、(ii) 抗原的第二標記形式(「熱追蹤」)，或抗原的未標記形式和抗原的第二標記形式(「組合追蹤」)。在追蹤後與抗原的第一標記形式仍結合的細胞代表表現具有高結合親和力之抗體分子的細胞。
因此，本文揭露之方法允許在表現具有不同親和力之抗體分子的細胞中進行挑選，以富集表現具有高親和力之抗體分子的細胞。
如本文所用，術語「抗體分子」包括全長抗體及其抗原結合片段(例如Fab、Fab’，及F(ab’) 2)。
術語「富集」意指在細胞群中增加所需細胞的頻率或百分比，例如在抗體產生細胞群中增加表現高親和力抗體分子之抗體產生細胞的百分比，該抗體產生細胞群含有表現具有不同親和力(例如高親和力、中等親和力、及低親和力)之抗體分子的細胞。因此，富含表現高親和力抗體分子之細胞的抗體產生細胞群包括因為富集過程而具有更高頻率及/或更高百分比的表現高親和力抗體分子之抗體產生細胞的抗體產生細胞群。在上下文中，富集過程為包括抗原追蹤的一個過程，從而由表現對感興趣抗原具有各種親和力之抗體分子的細胞群中挑選出表現高親和力抗體分子的細胞，並將表現高親和力抗體分子的細胞與表現親和力不高之抗體分子的細胞加以分離。
由所揭露方法獲取的細胞群在表現對感興趣抗原具有高結合親和力之抗體分子的抗體產生細胞中富集。換言之，與追蹤之前或沒有追蹤的細胞群相比，富集的細胞群(在追蹤後收集的細胞)含有更大比例的表現以高結合親和力結合至感興趣抗原的抗體分子的細胞。在一些實施例中，至少40%之收集的細胞表現高親和力抗體分子，例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體分子。在一些實施例中，富集的細胞群可為細胞群內至少50%的細胞表現以高結合親和力結合至感興趣抗原的抗體分子(例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體分子)的細胞群。在一些實施例中，富集的細胞群可為細胞群內至少60%的細胞表現以高結合親和力結合至感興趣抗原的抗體分子(例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體分子)的細胞群。在一些實施例中，富集的細胞群可為細胞群內至少70%的細胞表現以高結合親和力結合至感興趣抗原的抗體分子(例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體分子)的細胞群。在一些實施例中，富集的細胞群可為細胞群內至少80%的細胞表現以高結合親和力結合至感興趣抗原的抗體分子(例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體分子)的細胞群。在一些實施例中，富集的細胞群可為細胞群內至少90%的細胞表現以高結合親和力結合至感興趣抗原的抗體分子(例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體分子)的細胞群。在一些實施例中，富集的細胞群可為細胞群內至少95%的細胞表現以高結合親和力結合至感興趣抗原的抗體分子(例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體分子)的細胞群。在一些實施例中，與追蹤之前或沒有追蹤的細胞群的頻率相比，在追蹤後細胞群中表現高親和力抗體分子(例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體分子)的細胞頻率增加至少30%。在一些實施例中，與追蹤之前或沒有追蹤的細胞群的頻率相比，在追蹤後細胞群中表現高親和力抗體分子(例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體分子)的細胞頻率增加至少40%。在一些實施例中，與追蹤之前或沒有追蹤的細胞群的頻率相比，在追蹤後細胞群中表現高親和力抗體分子(例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體分子)的細胞頻率增加至少50%。在一些實施例中，與追蹤之前或沒有追蹤的細胞群的頻率相比，在追蹤後細胞群中表現高親和力抗體分子(例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體分子)的細胞頻率增加至少75%。在一些實施例中，與追蹤之前或沒有追蹤的細胞群的頻率相比，在追蹤後細胞群中表現高親和力抗體分子(例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體分子)的細胞頻率增加至少100%。在一些實施例中，與追蹤之前或沒有追蹤的細胞群的頻率相比，在追蹤後細胞群中表現高親和力抗體分子(例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體分子)的細胞頻率增加至少200%。在一些實施例中，與追蹤之前或沒有追蹤的細胞群的頻率相比，在追蹤後細胞群中表現具有小於1nM的KD的高親和力抗體分子(例如具有0.1pM至1nM的KD的抗體分子)的細胞頻率增加至少40%。在一些實施例中，與追蹤之前或沒有追蹤的細胞群的頻率相比，在追蹤後細胞群中表現具有小於1nM的KD的高親和力抗體分子(例如具有0.1pM至1nM的KD的抗體分子)的細胞頻率增加至少50%。在一些實施例中，與追蹤之前或沒有追蹤的細胞群的頻率相比，在追蹤後細胞群中表現具有小於1nM的KD的高親和力抗體分子(例如具有0.1pM至1nM的KD的抗體分子)的細胞頻率增加至少75%。在一些實施例中，與追蹤之前或沒有追蹤的細胞群的頻率相比，在追蹤後細胞群中表現具有小於1nM的KD的高親和力抗體分子(例如具有0.1pM至1nM的KD的抗體分子)的細胞頻率增加至少100%。在一些實施例中，與追蹤之前或沒有追蹤的細胞群的頻率相比，在追蹤後細胞群中表現具有小於1nM的KD的高親和力抗體分子(例如具有0.1pM至1nM的KD的抗體分子)的細胞頻率增加至少200%。在一些實施例中，與追蹤之前或沒有追蹤的細胞群的頻率相比，在追蹤後細胞群中表現具有小於0.1nM的KD的高親和力抗體分子(例如具有0.1pM至0.1nM的KD的抗體分子)的細胞頻率增加至少40%。在一些實施例中，與追蹤之前或沒有追蹤的細胞群的頻率相比，在追蹤後細胞群中表現具有小於0.1nM的KD的高親和力抗體分子(例如具有0.1pM至0.1nM的KD的抗體分子)的細胞頻率增加至少50%。在一些實施例中，與追蹤之前或沒有追蹤的細胞群的頻率相比，在追蹤後細胞群中表現具有小於0.1nM的KD的高親和力抗體分子(例如具有0.1pM至0.1nM的KD的抗體)的細胞頻率增加至少75%。在一些實施例中，與追蹤之前或沒有追蹤的細胞群的頻率相比，在追蹤後細胞群中表現具有小於0.1nM的KD的高親和力抗體分子(例如具有0.1pM至0.1nM的KD的抗體分子)的細胞頻率增加至少100%。在一些實施例中，與追蹤之前或沒有追蹤的細胞群的頻率相比，在追蹤後細胞群中表現具有小於0.1nM的KD的高親和力抗體分子(例如例如具有0.1pM至0.1nM的KD的抗體)的細胞頻率增加至少200%。
在一些實施例中，用於獲取表現對抗原展現出高結合親和力之抗體分子的抗體產生細胞的方法包含以下步驟： (a) 使一群抗體產生細胞，其表現對細胞表面上抗原之抗體分子，與抗原的第一標記形式接觸以允許抗原結合至細胞表面上的抗體分子，其中抗原的第一標記形式結合至第一可偵測標記； (b) 洗滌細胞以去除未結合的抗原； (c) 使細胞與(i) 抗原的未標記形式、 (ii) 抗原的第二標記形式，或(iii) 抗原的未標記形式和抗原的第二標記形式接觸； (d) 洗滌細胞以去除未結合的抗原； (e) 收集仍結合至抗原的第一標記形式的細胞，從而獲取富含表現高親和力抗體分子之細胞的細胞群。 具有高結合親和力的抗體分子
「結合親和力」，如該術語在本領域中已知，通常意指分子(例如抗體或其片段)的單個結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間的非共價交互作用的總和強度。除非另有說明，否則如本文所用，「結合親和力」意指反映結合對成員(例如抗體及抗原)之間1:1交互作用的內在結合親和力。分子對其結合配偶體的親和力通常可以解離平衡常數(KD或K D)表示。K D(莫耳)值與結合親和力之間呈反向關係，因此K D值(M)越小，親和力越高。因此，「親和力更高」意指通常結合抗原更強及/或更快及/或維持結合時間更長的抗體。通常，由於結合交互作用更強，需要較低濃度(M)的抗原就能達到期望效果。
術語「kd」(sec-1或1/s)意指特定抗體-抗原交互作用的解離速率常數，或抗體、Ig、抗體結合片段、或分子交互作用的解離速率常數。該值亦稱為k off值。
術語「ka」(M-1 x sec-1或1/M)意指特定抗體-抗原交互作用的締合速率常數，或抗體、Ig、抗體結合片段、或分子交互作用的締合速率常數。
術語「KD」或「K D」(M)意指特定抗體-抗原交互作用的平衡解離常數，或抗體、Ig、抗體結合片段、或分子交互作用的平衡解離常數。藉由將ka除以kd獲得平衡解離常數。
多種測量結合親和力的方法為本領域已知，其中任一者皆可用於本發明之目的。使用該方法獲得的結合親和力通常在約0.1pM至約25nM的範圍內，如由表面電漿共振所測定的。在一些實施例中，結合親和力小於約10nM，如由表面電漿共振所測定的。
術語「高親和力」抗體意指該等具有25nM或更低的結合親和力(表示為KD)的抗體，例如具有約0.1pM至約25nM的數值。為此，高親和力抗體分子可具有 measured KD 約25 x 10 -9M (25nM)或更小、約10 x 10 -9M (10nM)或更小、約1 x 10 -9M (1nM)或更小、約1 x 10 -10M (0.1nM)或更小、約0.5 x 10 -10M (0.05nM)或更小、約0.05 x 10 -10M (5pM)或更小、約1pM或更小、或約0.5pM或更小的測量KD，如由表面電漿共振(例如BIACORETM)或溶液親和力ELISA所測定的。本領域該等技術人員將認知到，抗體的KD值可按數字表示為nE -z或n x 10 -z，例如3.2E -12相當於3.2 x 10 -12並指示KD為3.2皮莫耳(pM)。在一些實施例中，高親和力抗體分子具有在約0.1pM至約25nM範圍內的測量KD。在一些實施例中，高親和力抗體分子具有在約0.1pM至約20nM範圍內的測量KD。在一些實施例中，高親和力抗體分子具有在約0.1pM至約15nM範圍內的測量KD。在一些實施例中，高親和力抗體分子具有在約0.1pM至約10nM範圍內的測量KD。在一些實施例中，高親和力抗體分子具有在約0.1pM至約5nM範圍內的測量KD。在一些實施例中，高親和力抗體分子具有在約0.1pM至約1nM範圍內的測量KD。在一些實施例中，高親和力抗體分子具有在約0.1pM至約0.5nM範圍內的測量KD。在一些實施例中，高親和力抗體分子具有在約0.1pM至約0.1nM範圍內的測量KD。在一些實施例中，高親和力抗體分子具有小於約20nM的測量KD。在一些實施例中，高親和力抗體分子具有小於約15nM的測量KD。在一些實施例中，高親和力抗體分子具有小於約10nM的測量KD。在一些實施例中，高親和力抗體分子具有小於約5nM的測量KD。在一些實施例中，高親和力抗體分子具有小於約1nM的測量KD。在一些實施例中，高親和力抗體分子具有小於約0.1nM的測量KD。在一些實施例中，高親和力抗體分子具有小於約0.5nM的測量KD。在一些實施例中，高親和力抗體分子具有小於約0.01nM的測量KD。在一些實施例中，高親和力抗體分子具有小於約0.001nM (或1pM)的測量KD。在一些實施例中，高親和力抗體分子具有小於約0.5pM的測量KD。 抗體產生細胞
術語「抗體產生細胞」及「抗體表現細胞」意指在細胞表面表現抗體分子的細胞，亦即抗體分子結合至或錨定在細胞膜中。抗體分子的細胞表面表現可自然發生，例如由於B細胞活化或由於重組技術及基因工程的結果。因此，該術語涵蓋抗原依賴性B細胞譜系的淋巴細胞(包括記憶B細胞)、重組細胞(諸如經工程改造以在細胞表面表現抗體分子的非淋巴細胞，包括酵母)及哺乳動物細胞(諸如永生化細胞及融合瘤細胞)。在一些實施例中，永生細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人類胚胎腎(HEK)293細胞、及鼠科骨髓瘤細胞(例如NS0及Sp2/0)。
在一些實施例中，抗體產生細胞為初級抗體產生細胞。「初代細胞」意指在其天生環境之外生長的細胞，諸如從哺乳動物分離的組織細胞。在某些實施例中，初級抗體產生細胞源自組織，諸如脾臟、淋巴結、骨髓、或周邊血液。在一些實施例中，抗體產生細胞可源自初級抗體產生細胞。舉例而言，初級抗體產生細胞可融合至骨髓瘤細胞以產生融合瘤，或以其他方式永生，諸如利用病毒(例如EBV)感染，或可利用基於特定B細胞型表現的蛋白質標記的細胞分選技術來區分。
在一些實施例中，抗體產生細胞為經工程改造以在細胞表面表現抗體分子的哺乳動物細胞或酵母。在細胞經工程改造以表現抗體分子的情況下，細胞可經工程改造以表現全長免疫球蛋白分子或抗原結合片段。在一些實施例中，抗體產生細胞為經工程改造以在細胞表面表現抗體分子的酵母細胞(例如啤酒酵母或畢赤酵母菌屬)。在一些實施例中，抗體產生細胞為經工程改造以在細胞表面表現抗體分子的哺乳動物細胞。在一些實施例中，哺乳動物細胞為經工程改造以在細胞表面表現抗體分子的永生細胞，其包括例如CHO細胞、HEK293細胞、及鼠科骨髓瘤細胞(例如NS0及Sp2/0)。
本文所述之一些方法亦適用於各種宿主細胞的細胞表面展示平台，包括酵母或哺乳動物細胞(諸如CHO細胞)，其在細胞表面上表現抗體分子以允許從抗體基因庫或抗體成熟變體庫中進行篩選。
酵母表面展示(YSD)平台已被描述並廣泛用於抗體篩選(Border and Wittrup, Nat Biotechnol. 1997年; 15:553–7；Feldhaus MJ等人，Nat Biotechnol. 2003年;21:163–70；McMahon C等人，Nat Struct Mol Biol. 2018年;25:289–96)。據報導，在酵母表面上展示Fab區可增加抗體多樣性並擴大庫容量(Weaver-Feldhaus JM等人，FEBS Lett. 2004年;564: 24–34；Rosowski S等人，Microb Cell Fact. 2018年;17:3；Sivelle C等人，MAbs. 2018年;10:720–9)。
在哺乳動物細胞(包括CHO細胞)表面上展示全長抗體或Fab片段的哺乳動物細胞表面展示平台已經描述於例如Zhou等人，MAbs. 2010年; 2(5): 508–518；Nguyen等人，Protein Engineering, Design & Selection，2018年，第31卷第3期，第91-101頁)。此外，適用於本文的是哺乳動物細胞，其攜帶單一抗體基因，該基因可與編碼活化誘導脫胺酶(AID)的基因一起轉染，該脫胺酶藉由將去氧胞苷(dC)轉化為去氧尿嘧啶(dU)而啟動體細胞超突變(SHM)，以在細胞培養中的細胞增生期間使細胞中的抗體基因突變。參見例如，Chen C.等人， Biotechnol Bioeng.113, 39–51 (2016年)。 免疫及收集初級抗體產生細胞
包括人類與非人類動物在內的哺乳動物的免疫可由本領域已知之任何方法進行(參見例如E. Harlow及D. Lane – 抗體實驗室手冊，冷泉港(Antibodies A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor)」(1988年)；Malik及Lillehoj，抗體技術：學術出版社(Antibody techniques: Academic Press)，1994年，CA。感興趣抗原作為蛋白質、蛋白質片段、融合蛋白或含有感興趣抗原基因的DNA質體投予，並使用宿主細胞表現工具來表現感興趣抗原，以在體內表現抗原多肽。應當理解，經免疫的哺乳動物可為已經暴露於抗原並表現對感興趣抗原的體液免疫的人類。可直接向哺乳動物投予抗原，無需佐劑，或與佐劑一起投予以協助刺激免疫反應。本領域已知之佐劑包括(但不限於) 完全與不完全弗氏佐劑、MPL+TDM佐劑系統(Sigma)、或RIBI (胞壁醯二肽)(參見O'Hagan, Vaccine Adjuvant，by Human Press，2000年，NJ)。不依賴特定理論，佐劑可藉由將抗原隔離在局部儲庫中而防止多肽的快速分散，並可含有可刺激宿主免疫反應的因子。
一旦達到適當的免疫反應，即從經免疫之動物中收集抗體產生細胞。
可從經免疫動物的不同來源收集抗體產生細胞，包括但不限於 脾臟、淋巴結、骨髓、及周邊血液。在一些實施例中，在免疫後，從經免疫之動物中獲取脾細胞。在一些實施例中，從經免疫之動物中收獲取週邊血單核細胞(PBMC)。
在本方法的一些實施例中，抗體產生細胞群為抗體產生B細胞。  在一些實施例中，抗體產生B細胞可獲自經免疫的動物，並由基於細胞表面B細胞標記的FACS分離出。B細胞標記為本領域已知。舉例而言，可透過使用FACS偵測的適用B細胞標記包括(但不限於) IgG、IgM、IgE、IgA、IgD、CD1、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD30、CD38、CD40、CD78、CD80、CD138、CD319、TLR4、IL-6、PDL-2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、IL-10、及TGFβ。
在一些實施例中，在免疫後，從經免疫的動物中獲取脾細胞。利用裂解去除紅血球後，可分離出IgG+抗原陽性B細胞，並在本方法中用作抗體產生細胞群。
在一些實施例中，從已知對感興趣抗原具有體液免疫的經免疫動物中獲取週邊血單核細胞(PBMC)。隨後，可分離出IgG+、抗原陽性B細胞，並在本方法中用作初級抗體產生細胞。
可將收集的初級抗體產生細胞(諸如抗體產生B細胞)進行處理以富集在細胞表面上表現涉及感興趣抗原之抗體的細胞。在一些實施例中，可選地進行初始純化步驟以富集初級抗體產生細胞。此類純化包括親和層析，亦稱為親和純化。本領域已知有幾種親和純化，諸如硫酸銨沉澱、利用固定化蛋白A、G、A/G、或L的親和純化；以及利用固定化抗原的親和純化。 感興趣抗原
本文揭露的方法可用於與任何感興趣抗原一起使用。感興趣抗原為造成免疫反應的任何物質。在一些實施例中，感興趣抗原為可溶性蛋白。在一些實施例中，感興趣抗原為跨膜蛋白。感興趣抗原可為與抗體結合的任何物質，包括(但不限於)肽、蛋白質或其片段；碳水化合物；有機與無機分子；由動物細胞、細菌細胞、及病毒產生的受體；酶；生物途徑之促效劑及拮抗劑；荷爾蒙；以及細胞激素。示例性抗原包括(但不限於) IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18、IFN-α、IFN-γ、血管收縮素II型、BAFF、CGRP、CXCL13、IP-10、PCSK9、NGF、Nav1.7、VEGF、EPO、EGF、及HRG。在一些實施例中，感興趣抗原為細胞激素。在一些實施例中，感興趣抗原為生長因子。在一些實施例中，感興趣抗原可為腫瘤標記。在一些實施例中，感興趣抗原為病毒蛋白。在一些實施例中，感興趣抗原為來自病原體的表面蛋白。在一些實施例中，感興趣抗原為介白素(IL)。在一些實施例中，感興趣抗原為IL-13。
在一些實施例中，抗原為以單體形式存在的蛋白質。以單體存在之蛋白質的實例包括介白素分子，諸如IL-13。在一些實施例中，抗原為以多聚體形式存在的蛋白質，包括同聚體及異聚體。在一些實施例中，抗原為以單體與多聚體形式存在的蛋白質，在此情況下，蛋白質單體與多聚體之混合物可用於本文所述的方法中。
無論抗原為以單體形式、多聚體形式、或其混合物存在的蛋白質，抗原皆可按單價形式或多價形式用於本文所述的方法中。術語「單價」及「多價」用於意指被呈現的抗原單位數量，並區別抗原本身為單體形式、多聚體形式或其混合物的蛋白質。因此，抗原的單價形式意指抗原的單一單位形式，其中抗原本身可為單體形式、多聚體形式或其混合物的蛋白質。抗原的多價形式意指被呈現的抗原的多個單位，通常是透過與抗原結合或連接的多價分子。多價分子可為二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體及其類似物，或其組合。在一些實施例中，多價分子為鏈球菌親生物素蛋白多聚體(例如四聚體)，其可與生物素複合，隨後生物素連接至抗原，從而提供多價(例如四價)形式的抗原。在一些實施例中，鏈球菌親生物素蛋白多聚體包括四聚體，並可額外包括三聚體及/或二聚體。在一些實施例中，鏈球菌親生物素蛋白多聚體與諸如藻紅素的螢光團結合。在一些實施例中，多價分子為免疫球蛋白Fc片段的二聚體，抗原可與其連接以提供二價形式的抗原。在一些實施例中，多價分子為三聚化分子的三聚體，諸如折疊子，抗原可與其連接以提供三價形式的抗原。 初始結合步驟及抗原標記
為了選取表現對感興趣抗原表現出最高結合親和力之抗體分子的細胞，進行初始結合或接觸步驟。在此步驟中，抗體產生細胞與抗原的第一標記形式接觸，以允許抗原結合至細胞表面上的抗體分子。
在一些實施例中，抗原的第一標記形式濃度在0.001nM與1mM之間。在一些實施例中，抗原的第一標記形式濃度在0.01nM與100nM之間。在一些實施例中，抗原的第一標記形式濃度在0.05nM至10nM之間。在一些實施例中，抗原的第一標記形式濃度在0.05nM至9nM、0.05nM至8nM、0.05nM至7nM、0.05nM至6nM、0.05nM至5nM、0.05nM至4nM、0.05nM至3nM、0.05nM至2nM、或0.05nM至1nM之間。在一些實施例中，抗原的第一標記形式濃度在0.1nM至7.5nM之間。在一些實施例中，抗原的第一標記形式濃度在0.1nM至7nM、0.1nM至6nM、0.1nM至5nM、0.1nM至4nM、0.1nM至3nM、0.1nM至2nM,或0.1nM至1nM之間。在一些實施例中，抗原的第一標記形式濃度在0.2nM至7.5nM之間。在一些實施例中，抗原的第一標記形式濃度在0.2nM至7nM、0.2nM至6nM、0.2nM至5nM、0.2nM至4nM、0.2nM至3nM、0.2nM至2nM、0.2nM至1nM、0.3nM至7nM、0.3nM至6nM、0.3nM至5nM、0.3nM至4nM、0.3nM至3nM、0.3nM至2nM、0.3nM至1nM、0.5nM至7nM、0.5nM至6nM、0.5nM至5nM、0.5nM至4nM、0.5nM至3nM、0.5nM至2nM、0.5nM至1nM之間。在一些實施例中，抗原的第一標記形式濃度在1.0nM至10nM、1.0nM至9nM、1.0nM至8.0nM、1.0nM至7nM、1.0 nM至6nM、1.0nM至5nM、1.0nM至4nM、1.0nM至3nM、1.0nM至2nM、2.0nM至10.0nM,或5.0nM至10.0nM之間。在具體實施例中，抗體產生細胞可與抗原的第一標記形式接觸，其中抗原的第一標記形式濃度為0.2nM。在具體實施例中，抗體產生細胞可與抗原的第一標記形式接觸，其中抗原的第一標記形式濃度為5.0nM。在具體實施例中，抗體產生細胞可與抗原的第一標記形式接觸，其中抗原的第一標記形式濃度為7.5nM。在具體實施例中，抗體產生細胞可與抗原的第一標記形式接觸，其中抗原的第一標記形式濃度為10nM。在具體實施例中，抗體產生細胞可與抗原的第一標記形式接觸，其中抗原的第一標記形式濃度為0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM、1.0nM、1.5nM、2.0nM、2.5nM、3.0nM、3.5nM、4.0nM、4.5nM、5.0nM、5.5nM、6.0nM、6.5nM、7.0nM、8.0nM、8.5nM、9.0nM、9.5nM、或更高。
在一些實施例中，抗體產生細胞與抗原的第一標記形式的接觸發生約5至約60分鐘。在一些實施例中，抗體產生細胞與抗原的第一標記形式的接觸發生約30分鐘。在一些實施例中，抗體產生細胞與抗原的第一標記形式的接觸發生約20分鐘。在一些實施例中，抗體產生細胞與抗原的第一標記形式的接觸發生約40分鐘。在一些實施例中，抗體產生細胞與抗原的第一標記形式的接觸發生約10分鐘。在一些實施例中，抗體產生細胞與抗原的第一標記形式的接觸發生約50分鐘。
在一些實施例中，抗原的第一標記形式為抗原的單價形式。在一些實施例中，抗原的第一標記形式為抗原的多價形式。在一些實施例中，抗原的第一標記形式為抗原的單價與多價形式的混合物。無論是單價形式、多價形式或其混合物，抗原本身可為單體、多聚體、或單體與多聚體之混合物的蛋白質。
在一些實施例中，抗原的第一標記形式為結合至第一可偵測標記的抗原。抗原可以小分子、放射性同位素、酶蛋白及螢光染料標記。在一些實施例中，可偵測標記為小分子。可偵測的小分子標記允許容易地標記蛋白質並可用於本領域已知的許多定期部署的偵測試驗中。
在一些實施例中，可偵測標記為酶報導分子。酶標記比生物素大，但其等很少破壞抗體功能。常用的酶標記為辣根過氧化酶(HRP)、鹼性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶及β-半乳糖苷酶。為了使用酶標記抗體，將樣本與酶特異性受質一起培養，該受質被酶催化以產生有色產物(顯色試驗)或光(化學發光試驗)。每種酶都有一組可採用的受質及偵測方法。舉例而言，HRP可與二胺基聯苯胺反應以生成棕色產物，或與發光胺(lunimol)反應以生成光。相反，AP可與對硝基苯磷酸鹽(pNPP)反應以生成黃色產物(其可被分光光度計偵測到)，或與5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)和硝基藍四唑(NBT)反應以生成紫色沉澱。
在一些實施例中，可偵測標記為螢光標記。螢光標記直接結合至抗體，偵測不需要酶/受質或結合交互作用。因此，偵測到的螢光信號量與樣本中目標蛋白的量成正比。螢光標籤可透過一級胺或硫醇共價附接至抗體。 在初始結合後去除未結合的抗原
在抗體產生細胞與抗原的第一標記形式培養(初始結合步驟)後，可從抗體產生細胞去除任何未結合的抗原。
在一些實施例中，未結合的抗原係藉由洗滌去除。如本領域已知的，洗滌為一種使用洗滌緩衝液去除不需要組分的技術。針對本文，不需要的組分包括未結合的抗原。在非限制性實例中，可藉由將洗滌緩衝液添加至結合的及未結合抗原的混合物中、將混合物離心，並去除包含洗滌緩衝液和未結合抗原的上清液，而使未結合的抗原從結合的抗原上洗滌下來。
洗滌緩衝液為本領域已知。洗滌緩衝液及洗滌步驟用於去除未結合及過量的組分。洗滌緩衝液可針對特定技術進行設計，諸如 ELISA、免疫墨染、或免疫組織化學。一些洗滌緩衝液與許多不同的免疫試驗相容。在一些實施例中，洗滌緩衝液為基於磷酸鹽緩衝鹽液(PBS)的洗滌緩衝液。在一些實施例中，洗滌緩衝液為Tris緩衝鹽液(TBS)洗滌緩衝液。在一些實施例中，洗滌緩衝液包含去污劑。在一些實施例中，去污劑為Tween-20。
細胞以洗滌緩衝液洗滌一段指定的時間以去除未結合抗原。該段指定的時間量將是足以去除未結合抗原的時間量。在一些實施例中，此指定時間可為約10分鐘至約60分鐘以去除未結合的抗原；可使用總計10至60分鐘的多次洗滌，例如3次10分鐘的洗滌或一次30分鐘的洗滌；2-4次5-15分鐘的洗滌等。在一實施例中，可使用的洗滌細胞一段時間包含一(1)次洗滌，總共持續約5分鐘、或約10分鐘、或約15分鐘、或約20分鐘、或約25分鐘、或約30分鐘、或約35分鐘、或約40分鐘、或約45分鐘、或約50分鐘、或約55分鐘、或約60分鐘。在一些實施例中，可使用的洗滌細胞一段時間包含兩(2)次洗滌，每次洗滌約5分鐘、或每次洗滌約10分鐘、或每次洗滌約15分鐘、或每次洗滌約20分鐘、或每次洗滌約25分鐘、或每次洗滌約30分鐘。考慮了額外的洗滌間隔，基本上相當於本文所述之該等。
在洗滌並吸出包含洗滌緩衝液及未結合抗原的上清液後，包含與抗原結合的細胞的小粒可用於後續步驟。在一些實施例中，包含結合抗原的小粒可重新懸浮於緩衝液中並用於後續步驟。在一些實施例中，用於重新懸浮小粒的緩衝液可為相同的洗滌緩衝液。在一些實施例中，用於重新懸浮小粒的緩衝液可為與洗滌緩衝液不同的緩衝液。 追蹤步驟
在抗體產生細胞與抗原的第一標記形式接觸(初始結合/接觸步驟)後，且一旦在未結合的抗原的第一標記形式被去除後，抗體產生細胞會再次接觸或「追蹤」抗原，以選擇性地富集表現對抗原具有高親和力的抗體分子的細胞。可使用幾種形式的抗原中的任一者進行此種追蹤：(i) 抗原的未標記形式 (「冷」追蹤)、(ii) 抗原的第二標記形式(「熱」追蹤)；或(iii) 抗原的未標記形式和抗原的第二標記形式(冷追蹤抗原及熱追蹤抗原的組合，亦稱為「組合追蹤」)。追蹤允許追蹤抗原結合至一開始被抗原的第一標記形式結合的抗體分子，從而追蹤到抗原的第一標記形式脫離抗體分子，除非抗體分子對抗原具有高親和力並在追蹤後與抗原的第一標記形式維持結合。
在一些實施例中，使用抗原的未標記形式進行追蹤(冷追蹤)。在一些實施例中，抗原的未標記形式是抗原的單價形式，亦即，雖然抗原本身可為單體形式、多聚體形式，或單體與多聚體形式之混合物的蛋白質，但抗原的單價形式本身即為抗原，沒有進一步的二次多聚化。在一些實施例中，抗原的未標記形式是抗原的多價形式，其中抗原本身可為單體形式、多聚體形式，或單體與多聚體形式之混合物的蛋白質。在一些實施例中，抗原的未標記形式為抗原的單價形式與多價形式的混合物。在使用抗原的多價形式的實施例中，此類形式可由抗原結合或連接的多價分子提供。在一些實施例中，多價分子為鏈球菌親生物素蛋白多聚體(例如四聚體)，其可與生物素複合，隨後生物素與抗原連接，從而提供多價(例如四價)形式的抗原。在一些實施例中，鏈球菌親生物素蛋白多聚體除了四聚體之外亦可包括三聚體及/或二聚體。在一些實施例中，多價分子為免疫球蛋白Fc片段的二聚體，抗原可與其連接以提供二價形式的抗原。在一些實施例中，多價分子為三聚化分子的三聚體，諸如折疊子，抗原可與其連接以提供三價形式的抗原。
在一些實施例中，使用抗原的第二標記形式進行追蹤(熱追蹤)。在此類實施例中，在初始結合及洗滌步驟之後，與抗原的第一標記形式結合的抗體產生細胞被抗原的第二標記形式追蹤。抗原的第二標記形式具有提供與抗原的第一標記形式上的標記不同的可偵測信號的標記。標記的合適選擇已在本文中描述，只要抗原的第二標記形式上的標記不同於抗原的第一標記形式上的標記即可。此類標記包括小分子、放射性同位素、酶蛋白及螢光染料。在一些實施例中，第一標記為AlexaFluor647，第二標記為藻紅素。
在一些實施例中，抗原的第二標記形式為抗原的單價形式。在一些實施例中，抗原的第二標記形式為抗原的多價形式。在一些實施例中，抗原的第二標記形式包含抗原的單價及多價形式的混合物。在使用抗原的多價形式的實施例中，此類形式可由抗原結合或連接的多價分子提供。在一些實施例中，多價分子為鏈球菌親生物素蛋白多聚體(例如四聚體)，其可以生物素複合，隨後生物素與抗原連接，從而提供多價(四價)形式的抗原。在一些實施例中，鏈球菌親生物素蛋白多聚體除了四聚體之外亦可包含三聚體及/或二聚體。在一些實施例中，鏈球菌親生物素蛋白多聚體與諸如藻紅素的螢光團結合。在一些實施例中，多價分子為免疫球蛋白Fc片段的二聚體，抗原可與其連接以提供二價形式的抗原。在一些實施例中，多價分子為三聚化分子的三聚體，諸如折疊子，抗原可與其連接以提供三價形式的抗原。
抗原的第一標記形式及抗原的第二標記形式可為相同或不同的抗原價數形式，但必須具有發出彼此不同可偵測信號的標記。在一些實施例中，抗原的第一標記形式為抗原的單價形式而抗原的第二標記形式亦為單價形式。在一些實施例中，抗原的第一標記形式為抗原的單價形式，而抗原的第二標記形式為多價形式。
在一些實施例中，追蹤係利用抗原的未標記形式(冷)及抗原的第二標記形式(熱)進行，在本文中亦稱為組合追蹤。在此類實施例中，於初始結合及洗滌步驟之後，抗體產生細胞被抗原的未標記形式及抗原的第二標記形式追蹤。兩種形式的追蹤抗原：抗原的未標記形式(「冷追蹤抗原」)及抗原的第二標記形式 (「熱追蹤抗原」)可同時或依序與細胞接觸(例如先加入冷追蹤抗原，接著加入熱追蹤抗原，反之亦然)。在一些實施例中，抗原的未標記形式為單價形式。在一些實施例中，抗原的未標記形式為多價形式。在一些實施例中，抗原的未標記形式為單價形式與多價形式的混合物。在一些實施例中，抗原的第二標記形式為單價形式。在一些實施例中，抗原的第二標記形式為多價形式。在一些實施例中，抗原的第二標記形式包含單價形式與多價形式的混合物。在組合追蹤中使用抗原的多價形式的實施例中，此類形式可由抗原結合或連接的多價分子提供。在一些實施例中，多價分子為鏈球菌親生物素蛋白多聚體(例如四聚體)，其可與生物素複合，隨後生物素與抗原連接，從而提供多價(例如四價)形式的抗原。在一些實施例中，鏈球菌親生物素蛋白多聚體除了四聚體之外亦可包括三聚體及/或二聚體。在一些實施例中，多價分子為免疫球蛋白Fc片段的二聚體，抗原可與其連接以提供二價形式的抗原。在一些實施例中，多價分子為三聚化分子的三聚體，諸如折疊子，抗原可與其連接以提供三價形式的抗原。
針對任何形式的追蹤，所用的追蹤抗原濃度與抗原的第一標記形式濃度相比是過量的，無論用於追蹤的抗原形式為何(亦即未標記形式、第二標記形式，或未標記形式和第二標記形式)。在使用抗原的未標記形式的實施例中(在冷追蹤或組合追蹤中)，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為至少2倍，亦即2倍至多達例如2500倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為2倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為3倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為4倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為5倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為6倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為7倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為8倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為9倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為10倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為15倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為20倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為25倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為30倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為35倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為40倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為45倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為50倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為60倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為70倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為80倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為90倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為100倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為110倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為120倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為130倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為140倍。在一些實施例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為150倍。在一些實施例中，取決於抗原的第一標記形式的濃度，抗原的未標記形式的濃度可在0.4nM至1mM，或10至600nM之間。在一些實施例中，取決於抗原的第一標記形式的濃度，抗原的未標記形式的濃度可在10nM至600nM、10nM至500nM、10nM至400nM、10nM至300nM、10nM至200nM、10nM至150nM、10nM至100nM、10nM至75nM、10nM至65nM、10nM至50nM、10nM至40nM、10nM至30nM、10nM至25nM,或10nM至20nM之間。在使用抗原的第二標記形式的實施例中(在熱追蹤或組合追蹤中)，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為至少2倍，亦即2倍至多達例如2500倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為2倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為3倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為4倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為5倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為6倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為7倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為8倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為9倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為10倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為15倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為20倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為25倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為30倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為35倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為40倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為45倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為50倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為60倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為70倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為80倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為90倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為100倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為110倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為120倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為130倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為140倍。在一些實施例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式之莫耳比率為150倍。在一些實施例中，取決於抗原的第一標記形式的濃度，抗原的第二標記形式的濃度可在0.4nM至1mM，或10nM至600nM之間。在一些實施例中，取決於抗原的第一標記形式的濃度，抗原的第二標記形式的濃度可在10nM至600nM、10nM至500nM、10nM至400nM、10nM至300nM、10nM至200nM、10nM至150nM、10nM至100nM、10nM至75nM、10nM至65nM、10nM至50nM、10nM至40nM、10nM至30nM、10nM至25nM，或10nM至20nM之間。
在進行組合追蹤的一些實施例中，冷追蹤抗原及熱追蹤抗原可呈相同濃度或呈不同濃度。
在組合追蹤的一些實施例中，細胞依序與冷追蹤抗原及熱追蹤抗原接觸；且在一些此類實施例中，可在兩種追蹤抗原的培養之間納入洗滌步驟。在此類實施例中，細胞以洗滌緩衝液洗滌一段足夠的指定時間以去除未結合的抗原。在一些實施例中，可使用的洗滌細胞一段時間包含一(1)次洗滌，總共持續約10分鐘、或約15分鐘、或約20分鐘、或約25分鐘、或約30分鐘、或約35分鐘、或約40分鐘、或約45分鐘、或約50分鐘、或約55分鐘、或約60分鐘。在一些實施例中，可使用的洗滌細胞一段時間包含兩(2)次洗滌，每次洗滌約5分鐘、或每次洗滌約10分鐘、或每次洗滌約15分鐘、或每次洗滌約20分鐘、或每次洗滌約25分鐘、或每次洗滌約30分鐘。考慮了額外的洗滌間隔，基本上相當於本文所述之該等。
追蹤進行一段足以允許追蹤抗原結合至抗體的時間。在一些實施例中，追蹤係以抗原的未標記形式進行約5至約60分鐘的時間。在一些實施例中，追蹤係以抗原的未標記形式進行約50分鐘。在一些實施例中，追蹤係以抗原的未標記形式進行約45分鐘。在一些實施例中，追蹤係以抗原的未標記形式進行約40分鐘。在一些實施例中，追蹤係進行約30分鐘的時間。在一些實施例中，追蹤係以抗原的未標記形式進行約20分鐘。在一些實施例中，追蹤係以抗原的未標記形式進行約10分鐘。
在一些實施例中，追蹤係以抗原的第二標記形式進行約5至約60分鐘的時間。在一些實施例中，追蹤係以抗原的第二標記形式進行約50分鐘。在一些實施例中，追蹤係以抗原的第二標記形式進行約45分鐘。在一些實施例中，追蹤係以抗原的第二標記形式進行約40分鐘。在一些實施例中，追蹤係以抗原的第二標記形式進行約30分鐘的時間。在一些實施例中，追蹤係以抗原的第二標記形式進行約20分鐘。在一些實施例中，追蹤係以抗原的第二標記形式進行約10分鐘。
在組合追蹤的一些實施例中，追蹤係以抗原的未標記形式進行約5至約60分鐘(例如5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、或60分鐘)的時間，接著與抗原的第二標記形式接觸約5至約60分鐘(例如5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、或60分鐘)的時間。在組合追蹤的一些實施例中，追蹤係以抗原的第二標記形式進行約5至約60分鐘(例如5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、或60分鐘)的時間，接著與抗原的未標記形式接觸約5至約60分鐘(例如5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、或60分鐘)的時間。與抗原的未標記形式及與抗原的第二標記形式接觸的時間長度可能相同或不同。作為一非限制性實例，抗原的未標記形式可接觸結合至抗原的第一標記形式的初級抗體產生細胞約30分鐘，而抗原的第二標記形式隨後可接觸細胞約45分鐘，反之亦然。在組合追蹤的一些實施例中，追蹤係以抗原的未標記形式及抗原的第二標記形式同時進行約5至約60分鐘，例如5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、或60分鐘的時間。
在一些實施例中，進行超過一次的追蹤。在一些實施例中，進行超過一次的冷追蹤。在一些實施例中，進行超過一次的熱追蹤。在一些實施例中，進行一次的冷追蹤，接著進行超過一次的熱追蹤。在一些實施例中，進行超過一次的冷追蹤，接著進行一次的熱追蹤。在一些實施例中，進行超過一次的冷追蹤，接著進行超過一次的熱追蹤。在一些實施例中，進行超過一次的組合追蹤。在一些實施例中，每個追蹤步驟之後納入洗滌 步驟。在一些實施例中，每個追蹤步驟之後納入超過一次的洗滌步驟，例如2次洗滌或3次洗滌。 在追蹤後去除未結合的抗原
在追蹤步驟(例如其中以抗原的未標記形式、抗原的第二標記形式、或抗原的未標記形式和抗原的第二標記形式追蹤與抗原的第一標記形式結合的抗體產生細胞)之後，再次去除未結合的抗原。
在一些實施例中，透過洗滌來去除未結合的抗原。
在一些實施例中，在收集與抗原的第一標記形式仍結合的細胞之前重複超過一次的追蹤及洗滌，從而獲取富含表現高親和力抗體之細胞的細胞群。 螢光活化細胞分選 (FACS)
流式細胞術為一種流行的分析細胞生物學技術，其利用光對異源性流體混合物中的細胞進行計數及剖析。流式細胞術為一種特別強大的方法，係因其允許研究人員快速、準確且簡單地從含有活細胞的異源性流體混合物中收集與許多參數相關的數據。螢光活化細胞分選(FACS)為流式細胞術的衍生技術，其增加了非凡的功能性。研究人員可使用FACS將異源性細胞混合物實體上分選為不同的群體。
二維(2D) FACS為基於兩種不同螢光標記的細胞分選。二維FACS比基於一個參數的FACS提供更具選擇性的結果。二維FACS可用於本揭露之使用熱追蹤的實施例中。在第一可偵測標記為第一螢光標記且第二可偵測標記為不同於第一螢光標記的第二螢光標記的一些實施例中，二維FACS用於收集與抗原的第一標記形式仍結合的細胞。在具體實施例中，第一可偵測標記為A647且第二可偵測標記為藻紅素。 收取富含表現高親和力抗體分子之細胞的細胞群
在追蹤後收集與抗原的第一標記形式仍結合的抗體產生細胞。此抗體產生細胞的收集允許收取富含表現高親和力抗體分子之細胞的細胞群。
所獲取的富含表現高親和力抗體分子之細胞的細胞群可被分選或分離成單一細胞。在一些實施例中，螢光活化細胞分選(FACS)用於分選及選取單一抗體產生細胞。藉由流式細胞術分離單一細胞的方案為眾所周知的(Huang, J. et al, 2013，上文)。 可藉由本領域已知之替代方法來分選並收集單一抗體產生細胞，包括但不限於手動單一細胞挑選、有限稀釋、吸附抗原的B細胞淘選、微流體、雷射捕獲顯微切割、及凝膠珠粒乳液(GEM)，其等皆為本領域熟知的。參見例如Rolink等人，J Exp Med (1996年)183:187-194；Lightwood, D.等人，J. Immunol. Methods (2006年) 316(1-2):133-43；Gross等人，Int. J. Mol. Sci. (2015年) 16: 16897-16919；以及 Zheng等人，Nature Communications (2017年) 8: 14049。凝膠珠粒乳液(GEM)亦可商購(例如來自10x Genomics的10X Chromium System，Pleasanton，CA)。
一但獲取，單一抗體產生細胞可藉由常見細胞培養技術而繁殖，以用於後續的DNA製備。或者，抗體基因可直接從單一抗體產生細胞中擴增，隨後選殖至DNA載體中。 從表現高親和力抗體分子之抗體產生細胞所獲得的核酸來產生抗體。
編碼抗體或其片段的核酸可從使用本文所述方法獲取的抗體產生細胞分離而來。
在一些實施例中，編碼免疫球蛋白可變重鏈及可變輕鏈(亦即VH及VL，且VL可為Vκ或Vλ鏈)的基因或核酸可使用RT-PCR方案從抗體產生細胞分離而來的核酸進行回收。
在一些實施例中，核酸編碼抗體的片段(諸如可變結構域、恆定結構域或其組合)。在某些實施例中，從抗體產生細胞分離的核酸編碼抗體的可變結構域。在一些實施例中，核酸編碼抗體重鏈或其片段(例如抗體重鏈的可變結構域)。在其他實施例中，核酸編碼抗體輕鏈或其片段(例如抗體輕鏈的可變結構域)。
一旦回收，抗體編碼基因或核酸可被選殖至IgG重鏈及輕鏈表現載體中，並經由轉染宿主細胞而表現。舉例而言，可將抗體編碼基因或核酸插入可複製載體中，以進一步在細胞中選殖(DNA擴增)或表現(穩定或瞬時)。許多載體(特別是表現載體)係可用或可被工程改造以包含調控抗體編碼基因或核酸表現所需的適當調節元件。
本文上下文中的表現載體可為任何合適的載體，包括如本文所述之染色體、非染色體、及合成核酸載體(包含一組合適表現控制元件的核酸序列)。此類載體之實例包括SV40的衍生物、細菌質體、噬菌體DNA、桿狀病毒、酵母質體、衍生自質體與噬菌體DNA之組合的載體，以及病毒核酸(RNA或DNA)載體。在一些實施例中，核酸分子被納入裸DNA或RNA載體中，包括例如線性表現元件(如例如Sykes and Johnston，Nat Biotech (1997年) 12:355-59中所述)、壓縮的核酸載體(如例如US 6,077,835中所述)、或質體載體(諸如pBR322或pUC 19/18)。此類核酸載體及其用途為本領域熟知。參見例如US 5,589,466及US 5,973,972。在某些實施例中，表現載體可為適合在酵母系統中表現的載體。可採用適合在酵母系統中表現的任何載體。合適的載體包括，例如包含組成型或誘導型啟動子(諸如酵母α因子、醇氧化酶及PGH)的載體。參見F. Ausubel等人，編制Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987年)；以及Grant等人，Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987年)。
在某些實施例中，載體包含編碼抗體重鏈的核酸分子(或基因)及編碼抗體輕鏈的核酸分子(或基因)核酸，其中抗體由本文之方法所獲取的抗體產生細胞產生。
合適的表現抗體分子的宿主細胞包括(但不限於)原核或真核(通常為哺乳動物)源的細胞。在一些實施例中，宿主細胞為細菌或酵母細胞。在一些實施例中，宿主細胞為哺乳動物細胞。在其他實施例中，宿主細胞可為例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)，諸如CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO細胞；COS (例如COS-7)；幹細胞；視網膜細胞；Vero細胞；CV1細胞；腎細胞，諸如例如HEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、aHaK、BHK21細胞；HeLa細胞；HepG2細胞；WI38；MRC 5；Colo25；HB 8065；HL-60；Jurkat或Daudi細胞；A431(表皮)細胞；CV-1、U937、3T3或L細胞；C127細胞、SP2/0、NS-0或MMT細胞、腫瘤細胞，以及源自任何上述細胞的細胞株。在特定實施例中，宿主細胞為CHO細胞。在特定實施例中，宿主細胞為CHO K1細胞。
應當理解，隨後可將全長抗體核酸序列或基因選殖至適當載體或多個載體中。 或者，可將分離的抗體的Fab區選殖至與任何同種型之恆定區一致的一或多個載體中。因此，任何恆定區可用於建構分離的抗體，包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD、及IgE重鏈恆定區，或嵌合重鏈恆定區。取決於抗體的預期用途，此類恆定區可獲自任何人類或動物物種。同時，可將抗體可變區或Fab區選殖至適當載體中，用於表現其他形式的蛋白質，例如ScFv、雙抗體等。
在一些實施例中，在表現全長抗體的條件下培養包含一或多種抗體編碼核酸的宿主細胞，隨後可產生並分離抗體以供進一步使用。在某些實施例中，宿主細胞包含編碼抗體可變結構域的核酸，並在表現可變結構域的條件下細胞培養。在其他實施例中，宿主細胞包含編碼抗體可變重鏈(VH)結構域的核酸，並在表現VH結構域的條件下培養細胞。在另一實施例中，宿主細胞包含編碼抗體可變輕鏈(VL)結構域的核酸，並在表現VL結構域的條件下培養細胞。在具體實施例中，宿主細胞包含編碼抗體VH結構域的核酸及編碼抗體VL結構域的核酸，並在表現VH結構域及VL結構域的條件下培養細胞。 實例 實例 1. 珠粒的製備
作為概念驗證，使用聚苯乙烯微珠來替代B細胞。所用的聚苯乙烯微珠與B細胞的大小相同。與多株抗hFc捕獲抗體(Spherotech，Lake Forest，IL)結合的聚苯乙烯微珠塗覆了具有不同親和力的四種針對人類IL13蛋白的單株抗體：抗IL13-1、抗IL13-2、抗IL13-3、及抗IL13-4。此等四種抗體與hIL13之間結合的解離t 1/2如下：抗IL13​​-1為1.3分鐘、抗IL13​​-2為10分鐘、抗IL13​​-3為102分鐘，且抗IL13-4為1155分鐘，如表1所示。 表 1
抗 hIL13 Abs Ka (1/Ms) Kd (1/s) KD (M) t ½ ( 分鐘 )
抗 IL13-1 1.42E+06 8.89E-03 6.26E-09 1.3
抗 IL13-2 1.25E+06 1.19E-03 9.53E-10 10
抗 IL13-3 6.27E+05 1.13E-04 1.81E-10 102
抗 IL13-4 2.03E+06 1.00E-05* 4.93E-12 1155
將聚苯乙烯珠粒與四種抗人類IL13抗體(抗IL13-1、抗IL13-2、抗IL13-3、及抗IL13-4)在4℃下培養過夜。隔天，利用PBS洗滌珠粒來去除未結合的抗體。隨後，將結合的珠粒與5nM或0.2nM的A647結合的hIL13一起培養30分鐘。較佳為為使用5nM的染色輪廓；然而，亦測試了0.2nM至5nM範圍內的濃度並取得成功。使用染色緩衝液，透過兩次洗滌，去除未結合的A647結合的hIL13，而mAb塗覆的珠粒可用於追蹤實驗：無追蹤、單價冷追蹤、螢光團標記多價追蹤、及具有單體冷抗原與螢光團標記多價抗原的組合追蹤。 實例 2 ：在 FACS 實驗中根據抗原結合解離速率的聚苯乙烯珠粒分離的概念驗證
為了證實在基於FACS的實驗中根據抗原結合解離速率的B細胞分離能力，使用螢光團標記抗原，接著使用各種追蹤步驟：1) 無追蹤，2) 單價冷追蹤，3) 螢光團標記(「熱」)多價追逐，以及4) 單價冷抗原與熱多價抗原的組合追蹤。圖2顯示所用的三種示例性追蹤方法的整體觀點示意圖。 無追蹤
在沒有追蹤的樣本中，不需要進一步的步驟，但利用離心來沉澱細胞、重新懸浮於PBS中，並利用流式細胞術進行分析。結果如圖3所示，利用流式細胞術偵測沒有追蹤的IL13抗體塗覆珠粒的A647染色的代表性單變量直方圖疊加。 單價冷追蹤
針對單價冷追蹤實驗，將hIL13 mAb塗覆珠粒與20nM或500nM未標記的hIL13一起培養45分鐘，接著以PBS洗滌兩次。未標記的 hIL13進行45分鐘的第二次培養。在第二次培養之後，利用離心來沉澱珠粒、重新懸浮於PBS中，並利用流式細胞術進行分析。
結果如圖4及圖5所示，利用流式細胞術偵測IL13塗覆珠粒的A647染色的代表性單變量直方圖疊加。圖4顯示單價冷追蹤實驗的結果，其中在利用流式細胞術偵測A647之前，將四組不同的珠粒塗覆具有不同解離常數的IL13抗體，並暴露於5nM A647 結合的人類IL13、洗滌，且進一步以4x (20nM)的未標記人類IL13培養兩次，各持續45分鐘，其間洗滌兩次。圖5顯示單價追蹤實驗的結果，其中將四組不同的IL13抗體塗覆珠粒暴露於5nM A647結合的人類IL13、洗滌，並進一步以100x (500nM)未標記的人類IL13培養兩次，各持續45分鐘，其間洗滌兩次。兩種IL13 mAb塗覆珠粒具有較長的解離t 1/2(抗IL13-3及抗IL13-4)，其等在有及沒有追蹤的情況下出現相同的染色程度；而以其他兩種具有較短t 1/2mAb (抗IL13-1及抗IL13-2)的塗覆珠粒，相較於沒有冷追蹤的樣本，在冷追蹤條件下顯示較長t 1/2mAb塗覆珠粒染色更弱且分離效果更好。 螢光團標記多價追蹤
針對螢光團標記的多價追蹤實驗，將hIL13 mAb塗覆珠粒與預結合5nM藻紅素(PE)-鏈球菌親生物素蛋白(SA)的20nM生物素-hIL13一起培養45分鐘，接著以PBS洗滌兩次，之後與預結合5nM PE-SA的20nM生物素-hIL13進行第二次培養，並另外持續45分鐘。在第二次培養之後，利用離心來沉澱珠粒、重新懸浮於PBS中，並利用流式細胞術進行分析。
螢光團標記的多價追蹤實驗結果顯示在A647直方圖疊加結果(圖6)以及A647與PE 2色點圖疊加結果(圖8及圖10)。由於A647標記的hIL13以5nM施加(如圖6所示)，當僅觀察A647染色程度時，進行螢光團標記多價追蹤的所有mAb塗覆珠粒顯示出與其相應的進行上述單體冷追蹤的mAb塗覆珠粒具有相同的差異A647染色程度；然而，當觀察PE染色程度時，以具有最長t 1/2的mAb (t 1/2= 1155分鐘，抗IL13-4)塗覆的珠粒顯示出最少的PE染色，其與抗IL13-3 (t 1/2= 102分鐘)塗覆珠粒的PE染色的差距更大，其明顯不同於抗IL13-1及抗IL13-2塗覆的珠粒，該兩種mAb具有較短的t 1/2，分別為1.3分鐘及10分鐘，如圖8及圖10所示。在此追蹤中加入第二種顏色有助於進一步將塗覆兩種較長t 1/2的珠粒彼此分開。 單價冷追蹤與螢光團標記多價追蹤的組合
針對單價冷追蹤與螢光團標記多價追蹤組合實驗，將hIL13 mAb塗覆珠粒與上述兩種追蹤試劑的組合(亦即500nM未標記的hIL13與預結合5nM PE-鏈球菌親生物素蛋白的20nM生物素-hIL13)一起培養，並持續45分鐘，接著以PBS洗滌兩次，之後與500nM未標記的hIL13和預結合5nM PE-鏈球菌親生物素蛋白的20nM生物素-hIL13進行第二次培養，並另外持續45分鐘。
針對單價冷追蹤與螢光團標記多價追蹤的組合實驗，其結果再次顯示在A647直方圖疊加結果(圖7)以及A647與PE 2色點圖疊加結果(圖8及圖10)。由於A647標記的hIL13以0.2nM施加，具有最長t 1/2(t 1/2s = 1155分鐘)的mAb塗覆珠粒在A647與PE點圖疊加結果中明顯突出，且不同於其餘的mAb塗覆珠粒。抗IL13-3 (t 1/2= 102分鐘)、抗IL13- 2 (t 1/2= 10分鐘)、及抗IL13-1 (t 1/2= 1.3分鐘)塗覆珠粒不僅不同於以最長t 1/2mAb (抗IL13-4)塗覆的珠粒，在點圖中彼此亦更接近。在此追蹤中加入第二種顏色有助於進一步將塗覆兩種較長t 1/2的珠粒彼此分開。
因此，表現具有快或慢的解離常數的表面錨定抗體的B細胞可藉由使用本文的各種追蹤條件標記B細胞並併入分選策略以富集高親和力抗體而分離。 實例 3 ：在 FACS 實驗中根據抗原結合解離速率的 B 細胞分離
在標準B細胞分選技術工作流程中，來自經免疫之小鼠的脾細胞以螢光標記抗原染色、洗滌，隨後使用流式細胞術進行單一細胞分選。分選閘控主要根據篩選IgG與抗原雙重陽性群體，因此可分離出表現具有一系列親和力之抗體的抗原特異性B細胞。此過程先前已經過改進，藉由使用單體分選試劑並藉由特異性地分選具有最高抗原特異性+/IgG+比率的細胞(「對角分選(diagonal sorting)」)而識別出更高親和力的抗體。
在此實例中，藉由加入被設計用於從表現高親和力抗原特異性抗體的B細胞中去除表現較低親和力抗體的B細胞的追蹤步驟而進一步改進B細胞的分選過程。在此種改進的工作流程中，追蹤步驟係於有或沒有額外未標記(「冷」) 抗原的多聚化及差異性標記抗原存在下進行。將AlexaFluor647 (A647)標記的人類IL13與小鼠脾細胞一起培養30分鐘，接著洗滌2次以去除未結合的分選試劑，並僅呈現結合至標記人類IL13的B細胞。標記的B細胞進一步使用以下兩種方法之一來進行追蹤步驟：多價追蹤或組合(冷單價追蹤與熱多價)追蹤。多價追蹤由比率4:1的生物素-hIL13與鏈球菌親生物素蛋白-PE的預集叢組成，導致四聚體、三聚體、二聚體與一些單體的混合物。組合追蹤由「冷」(未標記)單價hIL3與多價追蹤抗原的組合組成。此等追蹤方法藉由減少需要選殖、表現及篩選的抗體總數而大大地提高具有超高親和力mAb之分離過程的效率。
針對可溶性細胞激素標靶(IL13)分離出超高親和力抗體。藉由美國專利第8,502,018號所述方法來產生基因改造小鼠，其在內源性小鼠免疫球蛋白基因座處具有未重排的人類免疫球蛋白可變區基因片段。基因改造小鼠以mFc二聚體蛋白形式的人類IL13及與抗體標靶抗原呈現細胞的融合物進行免疫。實施本文揭露的追蹤策略，在B細胞分離過程中識別出總共58種t 1/2長於100分鐘的抗體。在使用此方法分離的所有抗體中，有超過50%具有奈莫耳或更好的親和力。其中，47種抗體具有超高親和力，亦即親和力低於1x10 -10(M)。這與使用沒有任何「追蹤」步驟的傳統分選策略所識別出的具有亞奈莫耳親和力的20%抗體形成鮮明對比，僅產生7種超高親和力抗體。在47種超高親和力抗體中，有39種在生物試驗中亦為IL13的有效抑制劑。因此，針對需要高親和力抗體來達到治療功效的該些應用，所揭露的B細胞分選策略提供了相對於現有方法的顯著改進。
在從如所述的IL13免疫小鼠中分選出B細胞之後，將重鏈及輕鏈的可變結構域選殖至完整人類IgG1的表現構築體中，並在CHO細胞中進行瞬時表現。利用Luminex或SPARCL試驗來分析含抗體上清液的標靶特異性結合。透過所有的分選策略，將所有的IL13結合物移至Biacore及生物試驗篩選，且結果如表2所示。表2所示之數字意指在特定分選策略中使用的小鼠數量，其中每隻小鼠可用於多個分選策略。因此，分選出的小鼠總數為13隻。 表 2
分選策略 分選出的小鼠 收集的 B 細胞 選殖的抗體 IL13 結合物 (%)
無追蹤 12 1496 637 519 (81%)
多聚體追蹤 6 675 199 157 (79%)
冷 + 多聚體追蹤 13 1907 775 700 (90%)
總數 13 4078 1611 1376 (85%)
利用Biacore分析代表性小鼠的抗體，且結果如圖13A-C所示。在無追蹤條件下(圖13A)，分離出的抗體大多為具有短t 1/2的低親和力抗體。然而，使用兩種追蹤策略中任一者(圖13B及圖13C)所分離出的抗體在100分鐘的t 1/2內顯示出明顯富含次奈莫耳（sub-nanomolar）親和力的抗體。除了具有提高的親和力特性之外，此等抗體在IL13抑制試驗中亦為有效的抑制劑。這可在圖13B至C中觀察到，如數據點的顏色所示，其中黃色為100%抑制。
利用Biacore分析所有實驗小鼠的抗體，如表3所示。在所有小鼠中一致性地觀察到如圖13A-C的單獨小鼠實例中看到的趨勢。圖14B、14D及14F為放大視圖並聚焦在較高親和力的抗體。參見圖14A至F，表3顯示，觀察到較長t 1/2抗體的富集量大於3倍，且整體K D的富集量大於2倍。此外，如圖14E及14F所示，來自冷單價+多價追蹤策略的高親和力抗體亦具有成為強的IL13生物試驗阻斷劑的傾向(在生物試驗中使用100-200pM hIL13)。
整體而言，針對具有較長t 1/2的抗體，冷+多聚體追蹤策略的富集量大於3倍(2.3%至7.4%)。儘管在此等實例中使用IL13，但本文提出的追蹤策略亦可用於其他需要超高親和力抗體的目標。 表 3
無追蹤 (519種Ab) 多聚體追蹤(157種Ab) 冷+ 多聚體追蹤(700種Ab)
t 1/2＞ 100分鐘：12 (2.3%) t 1/2＞ 100分鐘：6 (3.8%) t 1/2＞ 100分鐘：52 (7.4%)
總Ab (%) 總抑制劑(%) 總Ab (%) 總抑制劑(%) 總Ab (%) 總抑制劑(%)
1x10 -11＞ K D＞ 1x10 -12M 0 (0.0%) 0 (0.0%) 1 (0.6%) 1 (0.6%) 1 (0.1%) 1 (0.1%)
1x10 -10＞ K D＞ 1x10 -11M 7 (1.3%) 7 (1.3%) 7 (4.5%) 6 (3.8%) 38 (5.4%) 31 (4.4%)
1x10 -9＞ K D＞ 1x10 -10M 96 (18.5%) 43 (8.3%) 44 (28.0%) 29 (18.5%) 349 (49.9%) 218 (31.1%)
2.5x10 -8＞ K D＞ 1x10 -9M 89 (17.1%) 1 (0.20%) 36 (22.9%) 0 (0.0%) 60 (15.0%) 0 (0.0%)
總和 192 (36.9%) 51 (9.8%) 88 (56.1%) 36 (22.9%) 448 (64.0 %) 250 5.7%)
實例 4. 概念驗證：在 FACS 實驗中根據抗體與多聚體抗原之間的解離速率的抗體 - 塗覆珠粒分離。
目的：為了證實根據抗體與多聚體抗原(伊波拉GP三聚體蛋白)之間的解離速率而分離抗體表現細胞的能力，在基於FACS的實驗中使用螢光團標記多價追蹤。
在此種概念驗證實驗中，使用聚苯乙烯微珠來替代抗體表現細胞。如實例1所述，珠粒分別塗覆了針對薩伊伊波拉GP蛋白的具有不同親和力的兩種單株抗體(抗伊波拉GP-1及抗伊波拉GP-2)。此等兩種抗體之間的結合解離t 1/2如下：抗伊波拉GP-1為1155分鐘且抗伊波拉GP-2為3分鐘，如表4所示。 表 4
抗伊波拉 Ab KD (M) t ½ ( 分鐘 )
抗伊波拉 GP-1 2.28E-10 1155
抗伊波拉 GP-1 5.23E-08 3
隨後，將抗體塗覆珠粒與5nM或0.2nM的A647結合的伊波拉GP三聚體蛋白一起培養30分鐘。使用染色緩衝液，透過兩次洗滌，去除未結合的 A647結合的伊波拉GP三聚體蛋白，而抗體塗覆的珠粒可進一步用於無追蹤條件或螢光團標記多價追蹤條件。隨後，利用流式細胞術分析樣本。結果如圖15的A647與PE 2色點圖疊加所示。
在沒有追蹤的樣本中，不需要進一步的步驟。利用離心來沉澱樣本，並重新懸浮於PBS中，之後利用流式細胞術進行分析。如圖15A所示，針對以5nM A647結合的伊波拉GP三聚體蛋白培養的珠粒，抗伊波拉GP-1塗覆珠粒(綠色陰影)的A647 MFI為6,335，且抗伊波拉GP-2塗覆珠粒(紫色陰影)的A647 MFI為3,781。儘管其等的染色不同，但疊加結果顯示兩種群體明顯重疊，因此在A647染色(Y軸)中難以區分。圖15C顯示與0.2nM伊波拉GP三聚體蛋白一起培養的珠粒具有類似結果。抗伊波拉GP-1塗覆珠粒(綠色陰影)的A647 MFI為1,466，且抗伊波拉GP-2塗覆珠粒(紫色陰影)的A647 MFI為908。兩種珠粒群體明顯重疊，且在疊加結果中密不可分。
在應用螢光團標記多價追蹤方法的珠粒中，在去除未結合的A647結合的伊波拉GP三聚體蛋白之後，將抗體塗覆珠粒與預結合5nM藻紅素(PE)-鏈球菌親生物素蛋白(SA)的20nM生物素標記伊波拉GP三聚體蛋白一起培養45分鐘，接著以PBS洗滌兩次，之後與預結合5nM PE-SA的20nM生物素標記伊波拉GP三聚體蛋白進行第二次培養，並另外持續45分鐘。在第二次培養之後，利用離心來沉澱珠粒、重新懸浮於PBS中，並利用流式細胞術進行分析。
螢光團標記的多價追蹤實驗結果如圖15B及15D的A647與PE 2色點圖疊加所示。由於A647標記的伊波拉GP三聚體蛋白以5nM施加(圖15B)，當僅觀察A647染色程度時，進行螢光團標記多價追蹤的抗伊波拉GP-1及抗伊波拉GP-2塗覆珠粒皆顯示出與其相應的具有無追蹤的抗體塗覆珠粒(如圖15A所示)具有類似的差異A647染色程度；然而，當亦考慮到點圖中的PE染色程度時，兩種抗體塗覆群體彼此遠離。綠色陰影的珠粒(t 1/2= 1155分鐘，以抗伊波拉GP-1塗覆)顯示出PE染色程度較少且A647染色程度較多，其不同於紫色陰影的珠粒(t 1/2= 3分鐘，以抗伊波拉GP-2塗覆)，其PE染色程度較多且A647染色程度較少。在此追蹤中加入第二種顏色有助於將具有不同t 1/2的珠粒彼此分開。在三聚體抗原結合的情況下，根據解離速率，使用螢光團標記多價追蹤方法可將塗覆兩種不同抗體的珠粒彼此分離。
無
所述專利或申請文件包含至少一張彩色圖。本專利或專利申請案的副本將連同彩色圖在請求並支付必要費用後由專責機關提供。
圖 1為顯示本文中所用方法的綜觀代表圖。在進行追蹤步驟之前，將塗覆不同親和力之抗體的珠粒或細胞暴露並結合至濃度為例如5nM或0.2nM的A647結合抗原(亦即分選劑或抗原的第一標記形式)。圖示說明所追蹤的三個示例性選項：A. 利用未標記的單價抗原進行冷(未標記)單價追蹤，其濃度相對於標記的分選抗原為至少2倍且多達2500倍；B. 利用鏈球菌親生物素蛋白(SA)-藻紅素(phycoerythrin)(PE)對預結合生物素的標記抗原進行螢光團標記的(或「熱」)多價追蹤(其中抗原濃度相對於標記的分選抗原為至少4倍且多達2500倍，且生物素標記抗原與SA-PE的比率為4:1)；或C. 未標記的單價抗原(其濃度相對於標記的分選抗原為至少2倍且多達2500倍)與使用具有SA-PE之預結合生物素的標記抗原的熱多價試劑(其中抗原濃度相對於標記的分選抗原為至少2倍且多達2500倍，且生物素標記抗原與SA-PE的比率為4:1)的組合。
圖 2為顯示本文中所用方法的綜觀代表圖，其中以人類IL-13作為抗原。在進行追蹤步驟之前，將塗覆有不同親和力之IL-13抗體的珠粒暴露及結合至濃度為例如5nM或0.2nM的A647結合的人類IL13 (亦即分選試劑)。圖示說明所追蹤的三個示例性選項：A. 利用未標記的人類IL13進行冷(未標記)單價追蹤，其濃度相對於標記的分選抗原為至少4倍且多達2500倍；B. 利用鏈球菌親生物素蛋白(SA)-藻紅素(PE)對預結合生物素的標記人類IL13進行螢光團標記的(熱)多價追蹤(其中人類IL13濃度相對於標記的分選抗原為至少4倍且多達2500倍，且生物素標記的人類IL13與SA-PE的比率為4:1)；或C. 未標記的單價追蹤試劑人類IL13 (濃度相對於標記的分選抗原為至少4倍且多達2500倍)與使用具有SA-PE之預結合生物素的標記的人類IL13的熱多價追蹤試劑(其中人類IL13濃度相對於標記的分選抗原為至少4倍且多達2500倍，且生物素標記的人類IL13與SA-PE的比率為4:1)的組合。
圖 3為利用流式細胞術（flow cytometry）偵測的沒有追蹤的IL13抗體塗覆珠粒的A647染色的代表性單變量直方圖疊加結果。將四組不同的珠粒塗覆具有不同解離常數(如插入框中所示)的IL13抗體，並暴露於5nM A647結合的人類IL13，接著洗滌兩次。利用0.2nM A647結合的人類IL13進行類似的實驗，產生類似的結果(未顯示)。
圖 4為利用流式細胞術偵測的具有冷單體追蹤的IL13抗體塗覆珠粒的A647染色的代表性單變量直方圖疊加結果。在利用流式細胞術偵測A647之前，將四組不同的珠粒塗覆具有不同解離常數(如插入框中所示)的IL13抗體，並暴露於5nM A647結合的人類IL13、洗滌，且進一步以4x (20nM)的未標記人類IL13培養兩次，各持續45分鐘，其間洗滌兩次。以相同條件的四組不同珠粒塗覆的IL13抗體進行類似的實驗，並暴露於0.2nM A647結合的人類IL13、洗滌，且進一步以20nM (亦即10x)的未標記人類IL13培養兩次，產生類似的結果(未顯示)。
圖 5為利用流式細胞術偵測的具有冷單價追蹤的IL13抗體塗覆珠粒的A647染色的代表性單變量直方圖疊加結果。將四組不同IL13抗體塗覆的珠粒暴露於5nM A647結合的人類IL13、洗滌，並進一步以100x (500nM)的未標記人類IL13培養兩次，各持續45分鐘，其間洗滌兩次。進行類似的實驗，將相同條件的四組不同IL13抗體塗覆的珠粒暴露於0.2nM A647結合的人類IL13、洗滌，並進一步以100x (20nM)的未標記人類IL13培養兩次，產生類似的結果(未顯示)。
圖 6為利用流式細胞術偵測的具有螢光團標記多價追蹤的IL13抗體塗覆珠粒的A647染色的代表性單變量直方圖疊加結果。將四組不同的珠粒塗覆具有不同解離常數的IL13抗體，並暴露於5nM A647結合的人類IL13、洗滌，且進一步以5nM SA-PE預集叢的4x (20nM)生物素化人類IL13培養兩次，各持續45分鐘，其間洗滌兩次。進行類似的實驗，將四組不同IL13抗體塗覆的珠粒暴露於0.2nM A647結合的人類IL13、洗滌，並進一步以5nM SA-PE預集叢的100x (20nM)生物素化人類IL13培養兩次，產生類似的結果(未顯示)。
圖 7為利用組合追蹤(冷單價抗原與熱多價抗原)的IL13抗體塗覆珠粒的A647染色的代表性單變量直方圖疊加結果。將四組不同的珠粒塗覆具有不同解離常數的IL13抗體，並暴露於5nM A647結合的人類IL13、洗滌，並進一步以5nM SA-PE預集叢的500nM人類IL13及20nM生物素化人類IL13培養兩次，各持續45分鐘，其間洗滌兩次。
圖 8為利用流式細胞術偵測的具有螢光團標記多價追蹤的IL13抗體塗覆珠粒的A647與PE點圖(亦即追蹤圖)的代表性結果。將具有不同解離常數的IL13抗體塗覆的四組不同珠粒暴露於5nM A647結合的人類IL13、洗滌，隨後進一步以5nM SA-PE預集叢的4x (20nM)生物素化人類IL13培養兩次，各持續45分鐘，其間洗滌兩次。進行類似的實驗，將四組不同的IL13抗體塗覆珠粒暴露於0.2nM A647結合的人類IL13、洗滌，並進一步以5nM SA-PE預集叢的100x (20nM)生物素化人類IL13培養兩次，產生類似的結果(未顯示)。
圖 9為利用流式細胞術偵測的具有組合追蹤(冷單價與熱多價)的IL13抗體塗覆珠粒的A647與PE點圖(亦即追蹤圖)的代表性結果。將具有不同解離常數的IL13抗體塗覆的四組不同珠粒暴露於5nM A647結合的人類IL13、洗滌，並進一步以5nM SA-PE預集叢的100x (500nM)人類IL13及4x (20nM)生物素化人類IL13培養兩次，各持續45分鐘，其間洗滌兩次。
圖 10為利用流式細胞術偵測的具有螢光團標記多價追蹤的IL13抗體塗覆珠粒的A647與PE點圖(亦即追蹤圖)代表性結果。將具有不同解離常數的IL13抗體塗覆的四組不同珠粒暴露於0.2nM A647結合的人類IL13、洗滌，隨後進一步以SA-PE預集叢的100x (20nM)生物素化人類IL13培養，各持續45分鐘，其間洗滌兩次。
圖 11為利用流式細胞術偵測的具有組合追蹤(冷單價與熱多價)的IL13抗體塗覆珠粒的A647與PE點圖(亦即追蹤圖)的代表性結果。將具有不同解離常數的IL13抗體塗覆的四組不同珠粒暴露於0.2nM A647結合的人類IL13、洗滌，並進一步以5nM SA-PE預集叢的500nM人類IL13及20nM生物素化人類IL13培養，各持續45分鐘，其間洗滌兩次。
圖 12A 至 C顯示根據上述策略的小鼠脾細胞分選結果。A. 無追蹤。B. 熱多價追蹤。C. 組合追蹤(冷單價與熱多價)。首先根據存活力及IgG表現對所有細胞進行閘控。在流式細胞術圖譜上以黃色突顯出A647與PE點圖上的最終分選閘(上圖)。根據Biacore數據，對閘控的細胞群進行索引分選及分析，如圖的下方部分所示。無追蹤分選策略(A)產生最短t 1/2值的抗體，而追蹤策略則富含具有更長t 1/2值的抗體(B及C)。
圖 13A 至 C顯示來自代表性小鼠(#6018066)的抗體結果，其中抗體利用Biacore進行分析。A. 無追蹤。B. 熱多價追蹤。C. 組合追蹤(冷單價及熱多價)。未追蹤而分離出的抗體大多為具有短t 1/2的低親和力抗體(A)。然而，使用2種追蹤策略中任一者所分離出的抗體在100分鐘的t 1/2內顯示出明顯富含亞奈莫耳親和力的抗體(B及C)。除了具有提高的親和力特性之外，來自追蹤條件的抗體在IL13抑制試驗中亦為有效的抑制劑(如數據點的顏色所示，其中黃色為100%抑制)。
圖 14A 至 F顯示利用Biacore分析的所有小鼠的抗體結果。在所有小鼠中亦一致性地觀察到如圖13的單獨小鼠實例中看到的趨勢。圖14B、14D及14F為插入框的放大視圖並聚焦在較高親和力的抗體。A及B：無追蹤；C及D：熱多價追蹤；E及F：冷單價加上熱多價追蹤。總體而言，觀察到較長t 1/2抗體的富集量大於3倍，整體K D的富集量大於2倍。此外，來自冷單價 + 熱多價追蹤策略的高親和力抗體(E及F)亦具有成為強的IL13生物試驗阻斷劑的傾向(在生物試驗中使用100至200pM hIL13)。
圖 15A 至 D顯示分別塗覆兩種針對薩伊伊波拉(Zaire Ebola) GP蛋白的具有不同親和力的單株抗體的聚苯乙烯微珠的點圖重疊結果：抗伊波拉GP-1及抗伊波拉GP-2。進一步以無追蹤條件(A及C)或螢光團標記的多價追蹤條件(B及D)處理抗體塗覆珠粒。綠色陰影珠粒(t 1/2= 1155分鐘，以抗伊波拉GP-1塗覆)顯示PE染色較少且A647染色較多，其不同於紫色陰影珠粒(t 1/2= 3分鐘，以抗伊波拉GP-1塗覆)，其PE染色較多且的A647染色較少。可使用基於解離速率的螢光團標記多價追蹤方法將塗覆兩種不同抗體的珠粒彼此分開。
無

Claims (43)

  1. 一種用於獲取表現對抗原展現出高結合親和力之抗體分子的抗體產生細胞的方法，該方法包含： (a) 使一群抗體產生細胞與抗原的第一標記形式接觸，以允許該抗原結合至該細胞表面上的抗體分子，該等抗體產生細胞係涵蓋表現有針對細胞表面抗原之抗體分子的細胞，其中該抗原的第一標記形式係與第一可偵測標記接合； (b) 洗滌該等細胞以去除未結合的抗原； (c) 使該等細胞與以下接觸： (i) 該抗原的未標記形式、 (ii) 該抗原的第二標記形式，或 (iii) 該抗原的該未標記形式和該抗原的該第二標記形式； (d) 洗滌該等細胞以去除未結合的抗原；以及 (e) 收集仍結合至該抗原的該第一標記形式的細胞，從而獲取表現對該抗原的高親和力抗體分子的細胞。
  2. 如請求項1之方法，其中該抗原的該第一標記形式濃度在0.001nM與1mM之間。
  3. 如請求項1之方法，其中該抗原的該第一標記形式濃度在0.1與7.5nM之間。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該第一可偵測標記為第一螢光標記。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該抗原為單體形式的蛋白質。
  6. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該抗原為多聚體形式的蛋白質。
  7. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該抗原為以單體與多聚體形式存在的蛋白質。
  8. 如請求項5至7中任一項之方法，其中該抗原的該第一標記形式為抗原的單價形式。
  9. 如請求項5至8中任一項之方法，其中該抗原的該未標記形式為抗原的單價形式。
  10. 如請求項5至8中任一項之方法，其中該抗原的該未標記形式為抗原的多價形式。
  11. 如請求項10之方法，其中該抗原的該多價形式由抗原所結合之或所連接之多價分子提供。
  12. 如請求項11之方法，其中該多價分子選自於鏈球菌親生物素蛋白多聚體(諸如四聚體)、免疫球蛋白Fc片段的二聚體，或三聚化分子的三聚體(諸如折疊子)。
  13. 如請求項5至12中任一項之方法，其中該抗原的第二標記形式為抗原的單價形式。
  14. 如請求項7至12中任一項之方法，其中該抗原的第二標記形式為抗原的多價形式。
  15. 如請求項14之方法，其中該抗原的多價形式由抗原結合的多價分子提供。
  16. 如請求項15之方法，其中該多價分子為鏈球菌親生物素蛋白多聚體(例如四聚體)、免疫球蛋白Fc片段的二聚體，或三聚化分子的三聚體(諸如折疊子（foldon）)。
  17. 如請求項14至16中任一項之方法，其中該抗原的該多價形式以第二可偵測標記進行標記。
  18. 如請求項17之方法，其中該第二可偵測標記為第二螢光標記。
  19. 如請求項8之方法，其中在步驟(c)中該等細胞與該抗原的該未標記形式接觸。
  20. 如請求項19之方法，其中該抗原的該未標記形式為抗原的單價形式。
  21. 如請求項19或20之方法，其中在該未標記形式中的該抗原與相對於步驟(a)中使用的該抗原的該第一標記形式之莫耳比率為至少2至4倍。
  22. 如請求項8之方法，其中在步驟(c)中該等細胞與該抗原的該第二標記形式接觸。
  23. 如請求項22之方法，其中該抗原的該第二標記形式為抗原的多價形式。
  24. 如請求項22或23之方法，其中在該第二標記形式中的該抗原與相對於步驟(a)中使用的該抗原的第一標記形式之莫耳比率為至少2至4倍。
  25. 如請求項19至24之方法，其中在步驟(e)中收集細胞之前係重複步驟(c)中的接觸及步驟(d)中的洗滌至少一次。
  26. 如請求項8之方法，其中在步驟(c)中該等細胞與該抗原的未標記形式和該抗原的第二標記形式接觸。
  27. 如請求項26之方法，其中該未標記形式為該抗原的單價形式，且該抗原的該第二標記形式為該抗原的多價形式。
  28. 如請求項26之方法，其中該抗原為單體蛋白，該未標記形式為該抗原的單價形式，且該抗原的該第二標記形式為該抗原的多價形式。
  29. 如請求項26之方法，其中該抗原為多聚體蛋白，該未標記形式為該抗原的單價形式，且該抗原的該第二標記形式為該抗原的多價形式。
  30. 如請求項26之方法，其中該抗原為以單體與多聚體形式存在的蛋白質，該未標記形式為該抗原的單價形式，且該抗原的該第二標記形式為抗原的多價形式。
  31. 如請求項26至30之方法，其中使該等細胞同時接觸該抗原的該未標記形式及該抗原的該第二標記形式。
  32. 如請求項26至31中任一項之方法，其中該抗原的該未標記形式與相對於步驟(a)中使用的該抗原的該第一標記形式之莫耳比率為至少2至4倍。
  33. 如前述請求項中任一項之方法，其中該第一可偵測標記為螢光標記，且其中螢光活化細胞分選（fluorescence-activated cell sorting）係被用來收集與該抗原的該第一標記形式仍結合的細胞。
  34. 如請求項19至32中任一項之方法，其中該第一可偵測標記為第一螢光標記，且該第二可偵測標記為不同於該第一螢光標記的第二螢光標記，其中二維螢光活化細胞分選（two-dimensional fluorescence-activated cell sorting）係被用來收集與該抗原的該第一標記形式仍結合的細胞。
  35. 如前述請求項中任一項之方法，其中該等抗體產生細胞為初級抗體產生細胞、酵母，或在細胞表面上產生抗體分子的永生哺乳動物細胞。
  36. 如請求項35之方法，其中初級抗體產生細胞係獲取自脾臟、淋巴結、周邊血液及/或骨髓。
  37. 如請求項35之方法，其中產生抗體分子的永生哺乳動物細胞係選自於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞及融合瘤細胞。
  38. 如前述請求項中任一項之方法，其中該高親和力在約0.1pM至約25nM (KD)之範圍內。
  39. 如請求項38之方法，其中該高親和力小於約10nM (KD)。
  40. 如前述請求項中任一項之方法，其進一步包含：從步驟(e)中所收集之該等細胞中分離出抗體編碼核酸。
  41. 如請求項40之方法，其進一步包含以編碼抗體重鏈或其可變結構域的核酸和編碼抗體輕鏈或其可變結構域的核酸來轉染宿主細胞；以及使經轉染的宿主細胞在支持由該宿主細胞表現抗體的條件下生長。
  42. 如請求項41之方法，其中該宿主細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
  43. 一種利用如請求項41或42之方法製成的哺乳動物宿主細胞。
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