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TW202502807A - 融合il10多肽 - Google Patents

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TW202502807A
TW202502807A TW113120362A TW113120362A TW202502807A TW 202502807 A TW202502807 A TW 202502807A TW 113120362 A TW113120362 A TW 113120362A TW 113120362 A TW113120362 A TW 113120362A TW 202502807 A TW202502807 A TW 202502807A
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polypeptide
hil10
fusion
seq
amino acid
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TW113120362A
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English (en)
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安德魯 莫林
馬哈拉克什米 拉馬達斯
塔賈娜 佩托耶維奇
巴爾加維 賈亞拉曼
桑德羅 維沃納
派崔克 盧帕達斯
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美商新舍凱公司
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    • C07K14/5428—IL-10
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Abstract

本揭示大體上係關於用於調節由介白素-10 (IL10)介導之信號轉導之組合物及方法。詳言之，本揭示提供包含兩個IL10單體之融合IL10多肽。亦提供適用於產生此等融合IL10多肽之組合物及方法，以及用於調節IL10介導之信號傳導及/或用於治療與由IL10介導之信號轉導的擾動相關之病狀的方法。

Description

融合IL10多肽
細胞介素及生長因子配體通常透過細胞表面受體次單元之多聚化進行信號傳導。在一些情況下，細胞介素充當多特異性(例如雙特異性或三特異性)配體，其促進受體次單元之細胞外域之締合且因此使受體次單元之細胞內域接近，從而促進細胞內信號傳導。細胞介素配體之性質及其與受體次單元之細胞外域的相互作用決定了哪些受體次單元締合及受體次單元如何締合以形成配體受體複合物，以及此複合物之細胞內信號傳導特徵。
一些細胞介素受體次單元之細胞內域具有詹納斯激酶(Janus kinase；「JAK」)結合域。JAK結合域通常位於細胞膜之內表面附近的細胞介素受體次單元之細胞內域之box1/box區。細胞內詹納斯激酶與JAK結合域締合且使其磷酸化。已在哺乳動物細胞中鑑別出四種詹納斯激酶：JAK1、JAK2、JAK3及TYK2。Ihle等人, (1995) Nature 377 (6550):591-4, 1995；O'Shea及Plenge (2012) Immunity36(4):542-50。在使含有JAK結合域之細胞介素受體次單元之細胞內域接近時，詹納斯激酶促進JAK結合域之轉磷酸化。JAK之磷酸化誘導JAK中之構形變化，從而提供JAK進一步磷酸化其他細胞內蛋白質之能力。所得磷酸化級聯引起多種細胞內因子之活化，該等因子轉導與由細胞介素配體引起之受體活化相關之細胞內信號。在一些情況下，藉由JAK磷酸化之細胞內蛋白質係信號轉導子及轉錄活化因子(「STAT」)蛋白質家族之成員。迄今為止已經鑑別出哺乳動物STAT家族之七個成員：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b及STAT6。Delgoffe等人, (2011) Curr Opin Immunol. 23(5):632-8；Levy及Darnell (2002) Nat Rev Mol Cell Biol. 3(9):651-62；及Murray, (2007) J Immunol. 178(5):2623-9。經活化之JAK及STAT蛋白質之選擇性相互作用(統稱為JAK/STAT路徑)參與所觀測到的作為對細胞介素結合之回應的多種細胞內反應。藉由細胞介素與其受體之結合起始的此等細胞內反應通常稱為下游信號傳導。
細胞介素人類介白素-10 (hIL10)，亦稱為人類細胞介素合成抑制因子(CSIF)，分類為2型(類)細胞介素，即一組包括以下成員之細胞介素：IL19、IL20、IL22、IL24 (Mda-7)及IL26、干擾素(IFN-α、-β、-γ、-δ、-ε、-κ、-Ω及-τ)以及干擾素樣分子(諸如限制素、IL28A、IL28B及IL29)。hIL10為包含兩個hIL10單體多肽之非共價同二聚體。各hIL10單體多肽為具有兩個分子內雙硫鍵之含有160個胺基酸的多肽。各hIL10單體表現為包含178個胺基酸之原蛋白，其中前18個胺基酸包含信號肽。儘管hIL10主要由巨噬細胞表現，但在經活化之T細胞、B細胞、肥胖細胞、NK細胞、樹突狀細胞、嗜酸性球、嗜中性球及單核球中亦偵測到表現。
人類IL10透過其與hIL10受體(hIL10R)之相互作用對細胞發揮作用。hIL10R為II型細胞介素受體，其包含hIL10Rα及hIL10Rβ次單元，亦分別稱為hIL10R1及hIL10R2。hIL10Rα受體次單元為hIL10受體獨有的「私有」或「專有」次單元。相比之下，hIL10Rβ次單元係與其他細胞介素受體共用，包括IL22、IL26、IL28及干擾素λ L1 (IFNλ1)受體複合物。hIL10R之活化的特徵在於各hIL10單體與hIL10R之一個hIL10Rα及一個hIL10Rβ次單元結合。二聚hIL10細胞介素之各單體與一個hIL10Rα及一個hIL10Rβ次單元締合，從而產生包含兩個hIL10單體、兩個hIL10Rα次單元及兩個hIL10Rβ次單元之六聚配體/受體hIL10R複合物。
hIL10Rα受體次單元為跨膜蛋白，其表現為包含N末端21個胺基酸的信號序列的578個胺基酸的原蛋白。成熟典型hIL10Ra受體次單元之胺基酸序列為以下序列之557個胺基酸的多肽： HGTELPSPPSVWFEAEFFHHILHWTPIPNQSESTCYEVALLRYGIESWNSISNCSQTLSYDLTAVTLDLYHSNGYRARVRAVDGSRHSNWTVTNTRFSVDEVTLTVGSVNLEIHNGFILGKIQLPRPKMAPANDTYESIFSHFREYEIAIRKVPGNFTFTHKKVKHENFSLLTSGEVGEFCVQVKPSVASRSNKGMWSKEECISLTRQYFTVTNVIIFFAFVLLLSGALAYCLALQLYVRRRKKLPSVLLFKKPSPFIFISQRPSPETQDTIHPLDEEAFLKVSPELKNLDLHGSTDSGFGSTKPSLQTEEPQFLLPDPHPQADRTLGNREPPVLGDSCSSGSSNSTDSGICLQEPSLSPSTGPTWEQQVGSNSRGQDDSGIDLVQNSEGRAGDTQGGSALGHHSPPEPEVPGEEDPAAVAFQGYLRQTRCAEEKATKTGCLEEESPLTDGLGPKFGRCLVDEAGLHPPALAKGYLKQDPLEMTLASSGAPTGQWNQPTEEWSLLALSSCSDLGISDWSFAHDLAPLGCVAAPGGLLGSFNSDLVTLPLISSLQSSE (SEQ ID NO: 1) (UniProt參考案號Q13651)。SEQ ID NO: 1之殘基22至235 (成熟hIL10Rβ蛋白質之胺基酸1至214)對應於細胞外域(ECD)，SEQ ID NO: 1之殘基236至256 (成熟hIL10Rβ蛋白質之胺基酸215至235)對應於跨膜域(TM)且SEQ ID NO: 1之殘基257至578 (成熟hIL10Rβ蛋白質之胺基酸236至557)對應於細胞內域(ICD)。
人類IL10Rβ (hIL10Rβ)受體次單元為跨膜蛋白，其表現為包含19個胺基酸的N末端信號的325個胺基酸的原蛋白。成熟典型hIL10Rb受體次單元之胺基酸序列為以下序列之306個胺基酸的多肽： MVPPPENVRMNSVNFKNILQWESPAFAKGNLTFTAQYLSYRIFQDKCMNTTLTECDFSSLSKYGDHTLRVRAEFADEHSDWVNITFCPVDDTIIGPPGMQVEVLADSLHMRFLAPKIENEYETWTMKNVYNSWTYNVQYWKNGTDEKFQITPQYDFEVLRNLEPWTTYCVQVRGFLPDRNKAGEWSEPVCEQTTHDETVPSWMVAVILMASVFMVCLALLGCFALLWCVYKKTKYAFSPRNSLPQHLKEFLGHPHHNTLLFFSFPLSDENDVFDKLSVIAEDSESGKQNPGDSCSLGTPPGQGPQS (SEQ ID NO: 2) (UniProt參考案號Q08334)。胺基酸20至220 (成熟hIL10Rβ蛋白質之胺基酸1至201)對應於細胞外域，胺基酸221至242 (成熟hIL10Rβ蛋白質之胺基酸202至223)對應於22個胺基酸的跨膜域，且胺基酸243至325 (成熟hIL10Rβ蛋白質之胺基酸224至306)對應於細胞內域。
鼠類IL10Rβ (mIL10Rβ)受體次單元表現為包含19個胺基酸的N末端信號序列的349個胺基酸的原蛋白。成熟典型hIL10Rb受體次單元之胺基酸序列為以下序列之330個胺基酸的多肽： MIPPPEKVRMNSVNFKNILQWEVPAFPKTNLTFTAQYESYRSFQDHCKRTASTQCDFSHLSKYGDYTVRVRAELADEHSEWVNVTFCPVEDTIIGPPEMQIESLAESLHLRFSAPQIENEPETWTLKNIYDSWAYRVQYWKNGTNEKFQVVSPYDSEVLRNLEPWTTYCIQVQGFLLDQNRTGEWSEPICERTGNDEITPSWIVAIILIVSVLVVFLFLLGCFVVLWLIYKKTKHTFRSGTSLPQHLKEFLGHPHHSTFLLFSFPPPEEAEVFDKLSIISEESEGSKQSPEDNCASEPPSDPGPRELESKDEAPSPPHDDPKLLTSTSEV (SEQ ID NO: 3)。
mIL10Rβ在UniProtKB資料庫作為條目Q61190引用。胺基酸20至220 (成熟蛋白之胺基酸1至201)對應於細胞外域，胺基酸221至241 (成熟蛋白之胺基酸202至222)對應於21個胺基酸的跨膜域，且胺基酸242至349 (成熟蛋白之胺基酸223至330)對應於細胞內域。
IL10與其受體及受體次單元之相互作用已經研究且描述於科學文獻中。Pletnev等人提供與IL10R2之可溶性受體鏈及IL10/sIL10R1/sIL10R2之三元複合物的結構及參與配體-受體及受體-受體相互作用之殘基相關的資訊。Pletnev等人, (2005) BMC Structural Biology 5:10。儘管hIL10與hIL10Rα受體次單元之間的相互作用為特異性高親和力相互作用，但hIL10與hIL10Rβ之締合為相對低親和力相互作用。報告表明hIL10與hIL10Rα之相互作用誘導hIL10及/或hIL10Rα中之構形變化，促進[hIL10:hIL10Rα]複合物與hIL10Rβ之結合。三元[hIL10:hIL10Rα:hIL10Rβ]複合物之形成提出為起始hIL10信號傳導之速率限制因子。
IL-10與IL10R之相互作用實現JAK1 (與hIL10Rα締合)及Tyk2 (與hIL10Rβ締合)之活化且誘導STAT1、STAT3及(在一些細胞中) STAT5之活化。STAT3經由hIL10Rα細胞質域中之兩個酪胺酸殘基中之任一者直接募集至hIL-10/hIL-10R複合物，該等酪胺酸殘基對hIL-10作出反應而變得磷酸化且為hIL-10信號傳導所必需的。
STAT3之同二聚化引起其自受體釋放及磷酸化STAT同二聚體易位至細胞核中，在細胞核中其與許多基因啟動子(包括由STAT3正向調節之IL10啟動子)中的STAT3結合元素結合。hIL10受體細胞內域具有與其抗發炎活性相關之序列，該等序列並非其他STAT3活化細胞介素受體所共有。Riley等人, (1999) Journal of Biological Chemistry 274(23):15967-16664。
hIL10Rα及IL10Rβ受體次單元之表現隨細胞之細胞類型及活化狀態變化。表現hIL10Rα的細胞之活化狀態可引起表現量之顯著變化性。造血細胞(其固有地表現低水平之hIL10Rα)中之hIL10Rα表現實質上通常因各種刺激上調。與主要表現於造血細胞上之hIL10Rα形成對比，IL10Rβ受體次單元廣佈表現。儘管某些細胞類型以不同水平表現hIL10Rβ，但給定細胞類型中之hIL10Rβ表現量受細胞活化狀態的影響通常小於hIL10Rα。
hIL10與廣泛多種功能相關且透過其與T細胞、B細胞、巨噬細胞及抗原呈遞細胞(APC)之相互作用展現免疫抑制及免疫刺激活性。hIL10之免疫抑制活性已得到充分證實。hIL10與抑制活化單核球及活化巨噬細胞中IL1α、IL1β、IL6、IL8、TNFα、GM-CSF及G-CSF之表現以及抑制NK細胞產生促發炎細胞介素干擾素-γ (INFγ)相關。然而，hIL10亦藉由刺激CD8+ T細胞產生促發炎細胞介素IFN-γ表明免疫刺激作用。hIL10之免疫刺激及免疫抑制特性已證明對hIL10在治療人類疾病之臨床應用係一個挑戰。
Saxton等人描述IL10與IL10Rβ次單元及參與IL10與IL10Rβ之結合的胺基酸殘基之相互作用，且此等殘基之修飾可能提供IL10變異體，其保持IL10對骨髓細胞之免疫抑制功能，但對CD8+ T細胞之促發炎活性減弱。Saxton等人, (2021) Science 371 (6535), eabc8433。
本揭示提供適用於調節由介白素-10 (IL10)介導之信號轉導的組合物。詳言之，本揭示提供融合IL10多肽，其包含兩個IL10單體hIL10A及hIL10B，該等單體可藉由連接子連接或不藉由連接子連接且各自獨立地為選自由以下組成之群：野生型hIL10 (SEQ ID NO: 4)及hIL10突變蛋白。亦提供適用於產生此等融合IL10多肽之組合物及方法，以及用於調節IL10介導之信號傳導及用於治療與由IL10介導之信號轉導擾動相關之病狀的方法。
在一個態樣中，本揭示提供一種融合人類IL10 (hIL10)多肽，其包含下式之多肽： (hIL10A)-L n-(hIL10B)， 其中： (a) hIL10A及hIL10B各自為獨立地選自由以下組成之群的人類IL10 (hIL10)序列：野生型hIL10 (SEQ ID NO: 4)及hIL10突變蛋白，其中該等hIL10突變蛋白各自獨立地包含在對應於SEQ ID NO: 4之殘基T100、H14、N18、N21、M22、R24、D25、D28、R32、E74、H90、N92、S93、E96及R104之位置處的一或多個胺基酸取代，視情況該hIL10A相對於SEQ ID NO: 4具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基之胺基末端缺失，及/或該hIL10B相對於SEQ ID NO: 4具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基之胺基末端缺失； (b) L係長度為1個胺基酸至30個胺基酸的胺基酸連接子；且 (c) n = 0 (不存在)或1 (存在)。
在融合hIL10多肽之一些實施例中， (a) T100位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：T100L、T100D、T100V、T100E、T100A、T100R、T100N、T100Q、T100E、T100I、T100K、T100M及T100S； (b) H14位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：H14C、H14F、H14P、H14W、H14G、H14A、H14D、H14E、H14I、H14K、H14L、H14M、H14N、H14Q、H14R、H14S、H14T、H14Y及H14V； (c) N18位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：N18Y、N18F、N18A、N18D、N18E、N18L、N18V、N18S、N18T、N18I、N18V、N18M、N18R、N18K及N18H； (d) N21位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：N21A、N21R、N21Q、N21H、N21K、N21S、N21V、N21I、N21L、N21M、N21T、N21C、N21D及N21E； (e) M22位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：M22A、M22V、M22I、M22L、M22N、M22D、M22S、M22T、M22W及M22Q； (f) R24位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：R24E、R24D、R24N、R24Q、R24A、R24S及R24T； (g) D25位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：D25A、D25N、D25H、D25I、D25K、D25L、D25P、D25Q及D25V； (h) D28位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：D28A、D28E、D28L、D28V、D28S、D28T、D28I、D28V、D28M、D28H、D28K及D28R； (i) R32位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：R32A、R32D、R32E、R32L、R32V、R32S、R32T、R32I、R32V、R32M、R32N、R32Q、R32G、R32C、R32P、R32F、R32Y及R32H； (j) E74位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：E74A、E74D、E74L、E74V、E74S、E74T、E74I、E74V、E74M、E74H、E74K及E74R； (k) H90位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：H90A、H90D、H90E、H90I、H90K、H90L、H90M、H90N、H90Q、H90R、H90S、H90T、H90Y及H90V； (l) N92位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：N92D、N92Q、N92E、N92H、N92K、N92S、N92V、N92I、N92L、N92M、N92T及N92A； (m) S93位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：S93E、S93A、S93R、S93N、S93D、S93Q、S93E、S93I、S93L、S93K、S93M、S93G及S93V； (n) E96位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：E96C、E96F、E96Y、E96W、E96A、E96N、E96D、E96Q、E96H、E96K及E96S；且 (o) R104位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：R104A、R104W、R104Y、R104F、R104H、R104D、R104E、R104N、R104Q、R104S、R104T、R104I、R104L、R104V及R104M。
在一些實施例中，hIL10A及hIL10B中之至少一者為hIL10突變蛋白。在特定實施例中，hIL10A及hIL10B均為hIL10突變蛋白。在特定實施例中，hIL10A與hIL10B相同。在特定實施例中，hIL10A與hIL10B不同。
在一些實施例中，n = 0 (不存在)。在一些實施例中，n = 1 (存在)且L為具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸之多肽。在一些實施例中，L為GS連接子。在特定實施例中，GS連接子包含GGGSGSGSGSG之序列(SEQ ID NO: 19)。
在一些實施例中，hIL10A及hIL10B各自獨立地選自野生型hIL10 (SEQ ID NO: 4)或IL10突變蛋白，該IL10突變蛋白包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：N21D、N21E、N21K、M22A、M22S、M22T、M22D、M22W、R24E、D25K、E96K、E96Q、T100E、T100C及T100L。在特定實施例中，hIL10A及/或hIL10B包含胺基酸取代T100L。在一些實施例中，hIL10A及/或hIL10B包含胺基酸取代M22A或M22S。在一些實施例中，hIL10A及/或hIL10B包含胺基酸取代E96Q。在一些實施例中，hIL10A及/或hIL10B包含胺基酸取代R24E。在一些實施例中，hIL10A及/或hIL10B包含胺基酸取代D25K。在一些實施例中，hIL10A及/或hIL10B包含胺基酸取代N21K。
在融合hIL10多肽之一些實施例中，hIL10A及/或hIL10B各自為與選自由以下組成之群的多肽具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列一致性的多肽：SEQ ID NO: 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、148、149、150、151、152、153、154、155、156、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204及205，視情況其中hIL10A及hIL10B中之一者或兩者相對於SEQ ID NO: 4之序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基之N末端缺失。在特定實施例中，hIL10A與hIL10B相同。在特定實施例中，hIL10A與hIL10B不同。在特定實施例中，hIL10A與hIL10B各自包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：N21D、N21E、N21K、M22A、M22S、M22T、M22D、M22W、R24E、D25K、E96K、E96Q、T100E、T100C及T100L。
在特定實施例中，hIL10A為選自由以下組成之群的多肽：SEQ ID NO: 191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204及205，且hIL10B為選自由以下組成之群的多肽：SEQ ID NO: 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、148、149、150、151、152、153、154、155及156。
在一些實施例中，hIL10A及hIL10B均為包含胺基酸取代T100L之hIL10突變蛋白。在特定實施例中，hIL10A及hIL10B均為包含胺基酸取代T100L之hIL10突變蛋白，hIL10A為與SEQ ID NO: 204具有100%序列一致性之多肽且hIL10B為與SEQ ID NO: 15具有100%序列一致性之多肽。
在一些實施例中，融合hIL10多肽為包含與選自由以下組成之群的多肽具有至少95%，或者至少96%，或者至少97%，或者至少98%，或者至少99%，或者100%序列一致性之胺基酸序列的多肽：SEQ ID NO: 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、119、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185及186。
在一些實施例中，融合hIL10多肽包含與選自由以下組成之群的多肽具有100%序列一致性之胺基酸序列：SEQ ID NO: 44、123、124、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185及186。
在一些實施例中，融合hIL10多肽包含與選自由以下組成之群的多肽具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列一致性的胺基酸序列：SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 170及SEQ ID NO: 185。在特定實施例中，融合hIL10多肽包含與SEQ ID NO: 44之胺基酸序列具有100%一致性的多肽。在特定實施例中，融合hIL10多肽包含與SEQ ID NO: 185之胺基酸序列具有100%一致性的多肽。
在一些實施例中，融合hIL10多肽經修飾以延長活體內半衰期。在特定實施例中，用於延長活體內半衰期之修飾選自由以下組成之群：聚乙二醇化、醯基化、白蛋白化或與Fc多肽結合。在特定實施例中，用於延長活體內半衰期之修飾為醯基化。在特定實施例中，用於延長活體內半衰期之修飾為與Fc多肽結合。在特定實施例中，Fc多肽為來自hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4或其變異體之Fc域。在特定實施例中，Fc多肽包含由對野生型Fc多肽序列進行修飾以降低效應功能而獲得之序列。在一些實施例中，Fc多肽包含一或多個胺基酸取代或缺失以促進異二聚化。
在一些實施例中，融合hIL10多肽為異二聚Fc分子，其包含下式#1之第一多肽： IL10FP- L1 a-UH1—Fc1   [1] 及下式#2之第二多肽： UH2—Fc2   [2] 其中： hIL10FP為本揭示之融合hIL10多肽(例如式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽)； L1為連接子且a獨立地選自0 (不存在)或1 (存在)； UH1及UH2各自為獨立地選自由以下組成之群的人類免疫球蛋白的上鉸鏈域：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4上鉸鏈域，視情況包含胺基酸取代C220S (EU編號)； Fc1為多肽，其包含選自由以下組成之群的人類免疫球蛋白的下鉸鏈、CH2及CH3域：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，包含一或多個胺基酸取代以促進與Fc2之異二聚化；且 Fc2為多肽，其包含選自由以下組成之群的人類免疫球蛋白的下鉸鏈、CH2及CH3域：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，包含一或多個胺基酸取代以促進與Fc1之異二聚化， 且視情況其中式[1]之多肽及式[2]之多肽藉由至少一個鏈間雙硫鍵連接。
在一些實施例中，用於延長活體內半衰期之修飾為聚乙二醇化。在特定實施例中，PEG為具有約2,000至約80,000道爾頓，或者約2,000至約70,000道爾頓，或者約5,000至約50,000道爾頓，或者約10,000至約50,000道爾頓，或者約20,000至約50,000道爾頓，或者約30,000至約50,000道爾頓之分子量的直鏈或分支鏈聚乙二醇分子。在特定實施例中，PEG為直鏈的。在特定實施例中，PEG為分支鏈的。在一些實施例中，PEG為包含兩個20 kD臂之40 kD分支鏈PEG分子。在特定實施例中，PEG共價連接至多肽之N末端，視情況經由連接子。
在融合hIL10多肽之特定實施例中，PEG為包含兩個下式之20 kD臂之40 kD分支鏈PEG分子： ，共價鍵結至hIL10A之N末端，視情況經由連接子。在特定實施例中，PEG經由醛連接子共價鍵結至hIL10A之N末端。
在一些實施例中，相較於活化人類CD8 T細胞中野生型hIL10之活性分率，融合hIL10多肽在活化人類單核球中展現的野生型hIL10之活性分率更大。在一些實施例中，野生型hIL10之活性為誘導細胞內STAT3信號傳導。在一些實施例中，融合hIL10多肽在活化人類單核球中展現的Emax為野生型hIL10之活性程度之至少30%，視情況至少40%，視情況至少50%，其中活化人類單核球中野生型hIL10之活性選自由以下組成之群：抑制IL1β分泌及抑制TNFα分泌。在一些實施例中，融合hIL10多肽在活化人類CD8 T細胞中展現的Emax小於野生型hIL10之活性程度之30%，視情況小於20%，視情況小於10%，其中活化人類CD8 T細胞中野生型hIL10之活性選自由以下組成之群：IFNγ分泌、顆粒酶A分泌及顆粒酶B分泌。
在另一態樣中，本揭示提供一種核酸序列，其編碼本文所描述之融合hIL10多肽。在一些實施例中，核酸序列為mRNA。在一些實施例中，核酸序列為DNA。
在另一態樣中，本揭示提供一種載體，其包含與表現控制序列可操作地連接的本文所描述之核酸序列。在一些實施例中，該載體係病毒載體。
在另一態樣中，本揭示提供一種細胞，其用本文所描述之載體轉型。在一些實施例中，細胞為哺乳動物細胞。
在另一態樣中，本揭示提供一種醫藥調配物，其包含：作為活性成分之(a)本文所描述之融合hIL10多肽；(b)編碼本文所描述之融合hIL10多肽之核酸序列；(c)包含核酸序列之載體；或(d)用包含核酸序列之載體轉型的細胞，以及一或多種醫藥學上可接受之溶劑、載劑、穩定劑、防腐劑或稀釋劑。
在另一態樣中，本揭示提供一種預防或治療罹患疾病、病症或病狀之哺乳動物個體的方法，該方法包含向該個體投與：(a)本文所描述之融合hIL10多肽；(b)編碼本文所描述之融合hIL10多肽之核酸序列；(c)包含核酸序列之載體；或(d)用包含核酸序列之載體轉型的細胞；或(e)本文所描述之醫藥調配物。
在一些實施例中，該疾病、病症或病狀為自體免疫疾病、病症或病狀。在特定實施例中，自體免疫疾病、病症或病狀為發炎性腸道疾病(IBD)。在特定實施例中，IBD為克羅恩氏病(Crohn's disease)或潰瘍性結腸炎。
在一些實施例中，該疾病、病症或病狀為癌症。在特定實施例中，癌症為由慢性發炎引起之癌症。
在一些實施例中，該疾病、病症或病狀為巨噬細胞活化症候群。
在一些實施例中，該疾病、病症或病狀為干擾素γ誘導之貧血。
在另一態樣中，本揭示提供一種製備式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合人類IL10 (hIL10)多肽的方法，該方法包含以下步驟：用包含核酸序列(編碼本文所描述之融合IL10多肽)之載體轉染宿主細胞；在准許編碼融合hIL10多肽之核酸序列之表現的條件下在培養基中培養該細胞；及自培養基分離融合hIL10多肽，視情況進一步包含純化融合hIL10多肽之步驟。
在一些實施例中，宿主細胞為原核細胞。在一些實施例中，原核細胞為大腸桿菌細胞。
在一些實施例中，hIL10A為選自由以下組成之群的多肽：SEQ ID NO: 191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204及205，且hIL10B為選自由以下組成之群的多肽：SEQ ID NO: 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、148、149、150、151、152、153、154、155及156。在特定實施例中，hIL10A為選自由以下組成之群的多肽：SEQ ID NO: 172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185及186。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2023年6月2日申請的美國臨時專利申請案第63/506,000號之優先權，該美國臨時專利申請案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
為便於理解本揭示，在下文中以及貫穿本說明書定義某些術語及片語。本文所提供之定義為非限制性的且應鑒於熟習此項技術者之知識來閱讀。
在描述本發明方法及組合物之前，應理解，本發明不限於所描述之特定方法或組合物。亦應理解，本文所用之術語僅出於描述實施例之目的且並不意欲為限制性的。
在提供值範圍的情況下，應理解，除非上下文另外明確規定，否則亦特定地揭示所陳述範圍之上限與下限之間的各插入值(精確至十分之一單位)。在所陳述範圍中之任何所陳述值或插入值之間的各更小範圍及彼所陳述範圍中之任何其他所陳述值或插入值涵蓋在本發明內。此等更小範圍之上限及下限可獨立地包括或排除在該範圍內，且任一限值、無限值或兩個限值包括於更小範圍內之各範圍亦涵蓋於本發明內，以特別排除任何限值的所陳述範圍為準。當所陳述範圍包括限值中之一者或兩者時，排除彼等所包括之限值中之任一者或兩者之範圍亦包括於本發明中。
除非另外定義，否則本文所使用之技術及科學術語應理解為本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解的。儘管類似或等效於本文所描述之方法及材料的任何方法及材料可用於本發明之實踐或測試中，但現描述一些潛在及較佳方法及材料。本文所提及之所有公開案、專利、公開專利申請案、GenBank登錄號及UniProt參考編號以引用之方式併入本文中以揭示及描述與引用公開案相關之方法及/或材料。
應注意，除非上下文另外明確規定，否則如本文中及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該」包括複數個提及物。因此，舉例而言，「一細胞」之參考包括複數個該等細胞，且「該肽」之參考包括熟習此項技術者已知之一或多個肽及其等效物(例如多肽)之參考。
本文中所論述之公開案僅提供其在本申請案之申請日之前的揭示內容。本文中之任何內容均不應解釋為承認本發明無權藉助於先前發明而先於該公開案。此外，所提供之公開案的日期可能不同於可能需要獨立確認之實際公開案的日期。
除非另有指示，否則份數為重量份，分子量為重量平均分子量，溫度係以攝氏度(℃)計，且壓力為大氣壓或接近大氣壓。使用標準縮寫，包括以下：bp =鹼基對；kb =千鹼基；pl =皮升；s或sec =秒；min =分鐘；h或hr =小時；AA或aa =胺基酸；kb =千鹼基；nt =核苷酸；pg =皮克；ng =奈克；μg =微克；mg =毫克；g =公克；kg =公斤；dl或dL =分升；μl或μL =微升；ml或mL =毫升；l或L =公升；μM =微莫耳；mM =毫莫耳；M =莫耳；kDa =千道爾頓；i.m. =肌內；i.p. =腹膜內；SC或SQ =皮下；QD =每日；BID =每日兩次；QW =每週一次；QM =每月一次；HPLC =高效液相層析；BW =體重；U =單位；ns =非統計學上顯著；PBS =磷酸鹽緩衝鹽水；PCR =聚合酶鏈反應；HSA =人類血清白蛋白；MSA =小鼠血清白蛋白；DMEM =杜爾貝科氏改良伊格爾氏培養基；EDTA =乙二胺四乙酸。
應瞭解，在整個本揭示中，參考根據單字母或三字母編碼之胺基酸。
分子生物學中之標準方法描述於科學文獻中(參見例如Sambrook及Russell (2001) Molecular Cloning, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；及Ausubel等人(2001) Current Protocols in Molecular Biology, 第1-4卷, John Wiley and Sons, Inc. New York, N.Y.，其描述細菌細胞及DNA突變誘發中的選殖(第1卷)、哺乳動物細胞及酵母菌中之選殖(第2卷)、醣結合物及蛋白質表現(第3卷)及生物資訊(第4卷))。科學文獻描述用於蛋白質純化之方法，包括免疫沉澱、層析、電泳、離心及結晶，以及化學分析、化學修飾、轉譯後修飾、產生融合蛋白及蛋白質之醣基化(參見例如Coligan等人(2000), Current Protocols in Protein Science, 第1-2卷, John Wiley and Sons, Inc., NY)。 胺基酸取代及缺失之命名法
本揭示提供包含相對於野生型或親本多肽之胺基酸取代之變異多肽。以下命名法在本文中用以指取代、缺失或插入。殘基在本文中可藉由野生型分子中發現之天然存在之胺基酸之單字母或三字母胺基酸編碼指定。在本揭示中，參考SEQ ID NO: 4中所提供之hIL10多肽單體之「成熟」形式之殘基編號進行人類IL10多肽單體之胺基酸殘基之編號。參考人類IL10多肽單體，取代在本文中藉由以下指定：單字母胺基酸編碼，後為野生型hIL10 (SEQ ID NO: 4)胺基酸位置，後為經取代之單字母胺基酸編碼。舉例而言，具有修飾「D25K」之人類IL10多肽單體係指在(SEQ ID NO: 4)之位置25處之天冬胺酸(D)殘基被此位置處之離胺酸(K)殘基取代。胺基酸殘基之缺失稱為「des」或符號「Δ」後接胺基酸殘基及其位置。
免疫球蛋白、上鉸鏈及Fc殘基編號：相對於免疫球蛋白之胺基酸殘基之編號採用多種編號慣例，包括Kabat編號、Chothia編號、EU編號及IMGT編號慣例。在本揭示之上下文中，根據EU編號慣例進行免疫球蛋白分子(包括其域，包括上鉸鏈及Fc域(包含下鉸鏈、CH2及CH3域))之胺基酸殘基之編號。本文中使用之EU編號慣例至Kabat編號、Chothia編號或IMGT編號慣例之轉譯易於由熟習此項技術者理解。Dondelinger等人(2018) Understanding the Significance and Implications of Antibody Numbering and Antigen-Binding Surface/Residue Definition, Frontiers in Immunology, 第9卷, 文章編號：2278。 定義
除非另外指示，否則以下術語意欲具有以下闡述之含義。其他術語在整個說明書中在他處定義。
約：術語「約」係指本文所描述之數值之±10%，諸如本文所描述之數值之±0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的值。術語「約」亦適用於本文所描述之所有數值範圍。本文所描述之所有值均應理解為由術語「約」修飾，無論術語「約」是否明確地參考給定值引述。
活化：如本文所使用，術語「活化」在參考受體或受體複合物使用時反映直接及/或藉由參與多組分信號級聯產生的生物作用，由促效劑配體回應於配體之結合而與受體結合引起。術語活化(activate)或經活化(activated)亦可參考細胞狀態回應於將細胞暴露於活化劑而使用。
活性：如本文所用，術語「活性」相對於分子使用以描述分子相對於測試系統(例如分析)的特性或生物或化學特性(例如分子與另一分子之結合程度)、藥劑對細胞之作用(例如細胞之活化)或材料或細胞之物理特性(例如細胞膜電位之修飾)。此等生物功能之實例包括但不限於生物劑之催化活性，刺激細胞內信號傳導、基因表現、細胞增殖之能力，調節免疫活性(諸如發炎反應)之能力。「活性」通常表現為每單位所測試藥劑之生物活性程度，諸如[催化活性]/[mg蛋白質]、[免疫活性]/[mg蛋白質]、活性之國際單位(IU)、[STAT3磷酸化]/[mg蛋白質]、[增殖]/[mg蛋白質]、溶菌斑形成單位(pfu)等。如本文所用，術語增殖活性係指促進細胞增殖及複製之活性，包括諸如在腫瘤疾病、發炎性疾病、纖維化、發育不良、細胞轉型、轉移及血管生成中觀測到之細胞分裂失調。
投與 (Administer)/ 投與 (Administration)：術語「投與(administration)」及「投與(administer)」在本文中可互換地使用以指使個體(包括個體之細胞、組織、器官或生物流體)在活體外、活體內或離體與藥劑(例如hIL10突變蛋白或表現hIL10突變蛋白之工程改造細胞、化學治療劑、抗體或包含前述者中之一或多者的醫藥調配物)接觸的動作。藥劑之投與可透過多種本領域公認方法中之任一者達成，包括但不限於局部投與、血管內注射(包括靜脈內或動脈內輸注)、皮內注射、皮下注射、肌內注射、腹膜內注射、顱內注射、瘤內注射、經皮、經黏膜、離子導入遞送、淋巴內注射、胃內輸注、前列腺內注射、膀胱內輸注(例如膀胱)、吸入(例如呼吸道吸入器，包括乾粉吸入器)、眼內注射、腹內注射、病灶內注射、卵巢內注射、大腦內輸注或注射、腦室內注射(ICVI)及其類似者。術語「投與」包括使藥劑與細胞、組織或器官接觸以及使藥劑與流體接觸，其中流體與細胞、組織或器官接觸。
親和力：如本文所使用，術語「親和力」係指第一分子(例如配體)與第二分子(例如受體)之特異性結合程度且藉由平衡解離常數(K D)、分子與其標靶之間的解離速率常數(K off)與分子與其標靶之間的締合速率常數(K on)的比率量測。
促效劑：如本文所用，術語「促效劑」係指與第二藥劑(「標靶」)特異性結合且與標靶相互作用以引起或促進標靶活化提高的第一藥劑。在一些情況下，促效劑係受體蛋白之活化劑，其調節細胞活性、增強活化、使細胞對第二藥劑之活化敏感或上調一或多個基因、蛋白質、配體、受體、生物路徑之表現，從而可引起包括但不限於細胞活化及/或增殖或細胞週期之細胞活性的調節。在一些實施例中，促效劑為與受體結合且改變受體狀態，從而產生模擬受體之內源性配體之作用之生物反應的藥劑。在一些實施例中，促效劑為同源配體之經修飾形式，其與其同源受體結合且改變同源受體在模擬天然存在之同源配體與其同源受體之相互作用之生物作用的生物反應中之狀態。術語「促效劑」包括部分促效劑、完全促效劑及超促效劑。在此促效劑產生實質上完全生物反應(亦即與天然存在之配體/受體結合相互作用相關之反應)時，促效劑可描述為「完全促效劑」。「部分促進劑」為可產生小於標靶受體之內源性促效劑之最大反應且因此具有小於標靶之原生配體之100%的最大活性的促效劑類型。在一些實施例中，當在相當分析中在類似濃度下進行評估時，超促效劑在標靶受體之內源性促效劑之可評估定量或定性參數方面展現小於100%但大於10%，或者大於20%，或者大於30%，或者大於40%，或者大於50%，或者大於60%，或者大於70%，或者大於80%或或者大於90%之反應。「超促效劑」為可產生大於標靶受體之內源性促效劑之最大反應且因此具有超過標靶之原生配體之100%的最大活性的促效劑類型。在一些實施例中，當在相當分析中在類似濃度下進行評估時，超促效劑在標靶受體之內源性促效劑之可評估定量或定性參數方面展現大於110%，或者大於120%，或者大於130%，或者大於140%，或者大於150%，或者大於160%或或者大於170%之反應。應注意，與部分促進劑、完全促效劑或超促效劑相關之生物作用與標靶受體之內源性促效劑之彼等生物作用不僅可在程度上不同，而且可在種類上不同。
拮抗劑：如本文所用，術語「拮抗劑」或「抑制劑」係指對抗促效劑之作用的分子。拮抗劑防止、降低、抑制或抵消促效劑之活性，且拮抗劑亦可防止、抑制或減輕標靶(例如標靶受體)之固有活性，甚至當不存在經鑑定促效劑時亦如此。抑制劑係降低、阻斷、防止、延遲例如基因、蛋白質、配體、受體、包括免疫檢查點路徑之生物路徑或細胞之活化，使其滅活、脫敏或下調的分子。
生物樣品：如本文所用，術語「生物樣品」或「樣品」係指自個體獲得(或衍生)之樣品。藉助於實例，生物樣品包含選自由以下組成之群的材料：體液、血液、全血、血漿、血清、黏液分泌物、唾液、腦脊髓液(CSF)、支氣管肺泡灌洗液(BALF)、眼液(例如玻璃體液、水狀液)、淋巴液、淋巴結組織、脾臟組織、骨髓、腫瘤組織，包括來源於此等組織中之一或多者的免疫球蛋白富集或細胞類型特異性富集分率。
相當：如本文所用，術語「相當」用於描述可評估定量或定性參數之兩個量測結果的差異度。舉例而言，若可評估定量參數之第一量測結果與可評估參數之第二量測結果的偏差未超出熟習此項技術者認為在各情況下兩個結果之間實際上不會產生統計學上顯著之差異的範圍，則兩個量測結果將視為「相當的」。在一些情況下，若一個量測結果與另一量測結果的偏差小於35%，或者小於30%，或者小於25%，或者小於20%，或者小於15%，或者小於10%，或者小於7%，或者小於5%，或者小於4%，或者小於3%，或者小於2%或小於1%，則量測結果可視為「相當的」。在特定實施例中，若一個量測結果與參考標準的偏差小於15%，或者小於10%或或者小於5%，則其與參考標準相當。
保守胺基酸取代：如本文所用，術語「保守胺基酸取代」係指使給定胺基酸變為具有類似生物化學特性(例如電荷、疏水性及尺寸)之不同胺基酸的胺基酸置換。舉例而言，以下各群中之胺基酸可視為彼此之保守胺基酸：(1)疏水性胺基酸：丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸及甘胺酸；(2)極性胺基酸：麩醯胺酸、天冬胺酸、組胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸及半胱胺酸；(3)鹼性胺基酸：離胺酸及精胺酸；及(4)酸性胺基酸：天冬胺酸及麩胺酸。
對應於：如本文所用，術語「對應性」或「對應於」在多肽或聚核苷酸中之胺基酸或核苷酸之上下文中分別係指在參考序列與第二序列比對以使序列一致性百分比最大化時參考多肽或聚核苷酸序列之等效位置(例如胺基酸或核苷酸)。舉例而言，指定IL10多肽之「對應於胺基酸位置[X]之胺基酸位置」係指其他IL10多肽中基於比對的等效位置，包括結構同源物及變異體或來源於不同物種之IL10 (例如人類IL10及小鼠IL10)。對應位置可基於參考序列、野生型序列或親本序列，例如相對於hIL10突變蛋白，參考序列可為野生型hIL10之胺基酸序列(SEQ ID NO: 4)。
來源於：如本文所用，術語「來源於」在多肽或聚核苷酸變異體或突變蛋白之上下文中意指多肽或聚核苷酸變異體或突變蛋白具有基於參考多肽序列(例如野生型hIL10之胺基酸序列(SEQ ID NO: 4))或聚核苷酸序列(例如編碼野生型hIL10之cDNA)的序列。術語「來源於」不應理解為相對於製備多肽或聚核苷酸變異體或突變蛋白之來源或方法為限制性的。
有效濃度 (EC)：如本文所用，術語「有效濃度」或其縮寫「EC」可互換地用於指呈足以實現測試系統中給定參數之改變的量的藥劑濃度。縮寫「E」係指在測試系統暴露於測試藥劑時在測試系統中觀測到之給定生物作用的量值。在反應之量值表現為測試藥劑之濃度(「C」)之因子時，使用縮寫「EC」。在生物系統之上下文中，術語Emax係指回應於活化測試藥劑之飽和濃度觀測到的給定生物作用的最大量值。在縮寫EC具有下標(例如EC 40、EC 50等)時，下標係指在該濃度處觀測到之生物反應之Emax之百分比。舉例而言，測試藥劑之濃度足以引起測試系統中可量測生物參數之誘導，該濃度為此可量測生物參數回應於此測試藥劑之最大水平之30%，此稱為測試藥劑相對於此生物參數之「EC 30」。類似地，術語「EC 100」用於表示引起可量測參數回應於此藥劑之最大(100%)反應的藥劑有效濃度。類似地，術語EC 50(其常用於藥效學領域)係指足以引起可量測參數之半最大(約50%)改變的藥劑濃度。術語「飽和濃度」係指在溫度及壓力之標準條件下可溶解於標準體積之特定溶劑(例如水)中的測試藥劑之最大可能數量。在藥效學中，藥物之飽和濃度通常用於表示足以使得所有可用受體均被藥物佔據的藥物濃度，且EC 50為產生半最大作用的藥物濃度。
富集：如本文所用，術語「富集」係指對樣品進行非天然操縱，使得所關注物種(例如分子或細胞)呈以下濃度存在：(a)比起始樣品，諸如生物樣品(例如分子天然存在或其在投與之後存在的樣品)中物種之濃度更高的濃度(例如高至少3倍，或者高至少5倍，或者高至少10倍，或者高至少50倍，或者高至少100倍或或者高至少1000倍)；或(b)高於製備分子之環境(例如以重組方式修飾之細菌或哺乳動物細胞)的濃度。
細胞外域：如本文所使用，術語「細胞外域」或其縮寫「ECD」係指在細胞之質膜外部的細胞表面蛋白(例如細胞表面受體)之部分。細胞表面蛋白可為跨膜蛋白、細胞表面或膜相關蛋白。細胞表面蛋白可為具有多個非連續細胞外域之多次跨膜蛋白。
融合蛋白：術語「融合蛋白」係指包含來源於提供不同功能之不同蛋白質或合成序列之胺基酸序列的多肽。融合蛋白之實例包括但不限於包含蛋白質及至少一個額外功能域之多肽，包括但不限於免疫原性域(例如白喉或破傷風毒素)、促進表現(例如信號肽)序列以促進分離及/或純化之多肽域(例如螯合肽)、多肽靶向域(例如單域抗體)、具有獨特額外(例如互補，尤其互補治療)功能之蛋白質、促進活體內作用之持續時間延長之多肽域(例如白蛋白)。融合蛋白之域可進一步藉由多肽連接子連接。融合蛋白之功能域可以任何N末端至C末端次序提供。融合蛋白通常藉由轉譯單一重組DNA序列產生，使得蛋白質及融合蛋白之額外功能域藉由肽鍵共價連接。在一些實施例中，融合蛋白亦包括本揭示之IL10融合蛋白同二聚體。
一致性：如本文參考多肽或DNA序列所用，術語「一致性」係指兩個分子之間的次單元序列一致性。在兩個分子中之次單元位置由相同單體次單元(亦即相同胺基酸殘基或核苷酸)佔據時，則分子在該位置處一致。兩個胺基酸或兩個核苷酸序列之間的類似性與一致位置之數目直接相關。一般而言，對序列進行比對以獲得最高階匹配。在必要時，一致性可使用公開技術及廣泛可用電腦程式，諸如BLAST 2.0演算法計算，其描述於Altschul等人(1990) J. Mol. Biol.215: 403-410及Altschul等人(1977) Nucleic Acids Res.25: 3389-3402中。進行BLAST分析之軟體可透過國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)網站公開獲得。演算法涉及首先藉由鑑別查詢序列中具有長度W之短字來鑑別高評分序列對(HSP)，該等短字當與資料庫序列中相同長度之字比對時匹配或滿足一些正值臨限評分「T」。T稱為鄰域字評分臨限值(Altschul等人，同上)。此等初始鄰域字命中充當用於起始搜尋之種子以尋找含有其之較長HSP。字命中接著沿各序列在兩個方向上延伸，只要累積比對評分增加即可。就核苷酸序列而言，使用參數「M」 (一對匹配殘基之獎勵評分；始終＞ 0)及「N」 (失配殘基之罰分；始終＜ 0)計算累計評分。對於胺基酸序列，使用計分矩陣計算累積評分。當以下情況時，字命中沿各方向之延伸中斷：(a)累積比對評分自其達成之最大值降低數量X；累積評分由於一或多個負分殘基比對之累加而變成零或以下；或(b)到達任一序列之末端。BLAST演算法參數「W」、「T」及「X」確定比對之靈敏度及速度。BLASTN程式(對於核苷酸序列)功能類似，但使用字長(「W」) 28、期望值(「E」) 10、M=1、N=-2及兩股之比較作為預設值。對於胺基酸序列，BLASTP程式使用字長(W) 3、期望值(E) 10及BLOSUM62計分矩陣作為預設值(參見Henikoff與Henikoff (1989) PNAS (USA) 89:10915-10919)。
以足以實現反應之量：如本文所用，片語「以足以引起反應之量」在參考測試藥劑之量使用時足以提供在將測試藥劑施加至測試系統之前(例如基線水平)及之後量測的指標水平之可偵測改變。在一些實施例中，測試系統為細胞、組織或有機體。在一些實施例中，測試系統為活體外測試系統，諸如螢光分析。在一些實施例中，測試系統為活體內系統，其涉及在將測試藥劑施加至細胞、組織或有機體之前及之後量測反映生物功能之細胞、組織或有機體之參數的水平改變。在一些實施例中，指標反映回應於一數量之測試藥劑的投與進行的分析中評估的細胞之生物功能或發育狀態。在一些實施例中，測試系統涉及在將一或多種測試藥劑施加至細胞、組織或有機體之前及之後量測反映生物條件之細胞、組織或有機體之指標水平的改變。術語「以足以實現反應之量」可足以達成治療有效量，但亦可大於或小於治療有效量。
需要治療：如本文所用，術語「需要治療」係指醫師或其他照護者相對於個體作出的個體需要或將可能得益於治療的診斷。基於在醫師或照護者之專門知識範圍內的多種因素作出此診斷。
需要預防：如本文所使用，術語「需要預防」係指醫師或其他照護者相對於個體作出的個體需要或將可能得益於預防性照護的診斷。基於在醫師或照護者之專門知識範圍內的多種因素作出此診斷。
抑制劑：如本文所使用，術語「抑制劑」係指降低、阻斷、防止、延遲例如基因、蛋白質、配體、受體或細胞之活化，使其滅活、脫敏、拮抗或下調的分子。抑制劑亦可定義為降低、阻斷細胞或有機體之固有活性或使其滅活的分子。
細胞內域：如本文所使用，術語「細胞內域」或其縮寫「ICD」係指在細胞之質膜內部的細胞表面蛋白(例如細胞表面受體)之部分。ICD可包括跨膜蛋白或膜相關蛋白之整個細胞質部分，或細胞內蛋白質。細胞表面蛋白可為具有多個非連續細胞內域之多次跨膜蛋白。
分離：如本文所使用，術語「分離」在參考所關注分子使用時，若天然存在，則該分子所處環境不同於其可天然存在之環境。「分離」意欲包括在實質上富集所關注分子及/或其中所關注分子部分或實質上經純化之樣品內的分子。在分子並非天然存在之情況下，「分離」指示該分子已與合成其之環境分離。
配體：如本文所用，術語「配體」係指與受體特異性結合且引起受體的改變以實現受體活性的改變或在表現受體之細胞中引起可量測反應的分子。在一個實施例中，術語「配體」係指可充當受體之促效劑或拮抗劑的分子或其複合物。如本文所用，術語「配體」涵蓋天然及合成配體。「配體」亦涵蓋小分子、細胞介素及抗體之肽模擬物。配體與受體之複合物稱為「配體-受體複合物」。配體可包含聚合蛋白質或融合蛋白之一個域(例如抗體/配體融合蛋白之任一域)。
連接子：如本文所用，術語「連接子」係指用於連接第一及第二異源分子之分子。在一些實施例中，連接子可為化學連接子。在一些實施例中，連接子為「多肽連接子」，用於描述用於連接由多個功能域或次單元構成之多肽之功能性次單元的多肽(例如融合蛋白)。
修飾：如本文所用，術語「修飾」係指結構已相對於未經修飾親本分子改變的分子，諸如多肽。經修飾多肽通常保持未經修飾親本分子之一或多種活性或功能。舉例而言，hIL10突變蛋白單體可作為同二聚體之部分活化表現IL10受體之細胞中之IL10信號傳導，但可相對於未經修飾多肽具有改良特性。術語修飾包括不存在於親本或野生型IL10中之胺基酸取代，且包括IL10多肽之變異體及突變蛋白。
調節：如本文所用，術語「調節(modulate)」、「調節(modulation)」及其類似者係指測試藥劑在包括生物系統或生化路徑之系統中引起陽性或陰性或直接或間接反應之能力。術語調節劑包括促效劑(包括部分促效劑、完全促效劑及超促效劑)及拮抗劑。
突變蛋白：如本文所用，術語「突變蛋白」用以指包含對此多肽之一級結構(亦即，胺基酸序列)之修飾的野生型多肽之變異體。突變蛋白可與突變蛋白衍生自之親本多肽具有至少99%序列一致性，或者至少98%序列一致性，或者至少約97%序列一致性，或者至少96%序列一致性，或者至少95%序列一致性，或者至少約94%一致性，或者至少93%序列一致性，或者至少92%一致性，或者至少91%序列一致性或或者至少90%序列一致性。
核酸：如本文所用，術語「核酸」、「核酸分子」、「聚核苷酸」及其類似者在本文中可互換地使用以指任何長度之核苷酸(包括去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)之聚合形式。聚核苷酸之非限制性實例包括線性及環狀核酸、信使RNA (mRNA)、小核RNA (snRNA)、短干擾RNA (siRNA)、導引RNA (gRNA)、互補DNA (cDNA)、重組聚核苷酸、重組病毒或非病毒載體、重組病毒或非病毒表現載體、雜交探針、PCR引子及其類似者。
一或多個胺基酸取代：如本文所用，術語「一或多個胺基酸取代」係指相對於參考序列之單個胺基酸取代或一個、兩個、三個、四個、五個或更多個胺基酸取代。在一些實施例中，參考序列為野生型hIL10單體(SEQ ID NO: 4)。
可操作地連接：術語「可操作地連接」在本文中用以指第一與第二組分分子(通常為多肽或核酸)之間的關係，該等分子排列於構築體中使得組分分子之功能中之至少一者保持於構築體中，但可操作連接可引起構築體展現對構築體之個別組分之活性的正向或負向調節。舉例而言，聚乙二醇(PEG)分子與野生型蛋白質之可操作連接可產生構築體，其中蛋白質之生物活性相對於野生型分子降低，然而兩者仍然視為可操作地連接。在將術語「可操作地連接」應用於編碼不同功能之多個核酸序列之關係時，多個核酸序列在組合成單個核酸分子時，例如在使用重組技術引入至細胞中時提供能夠實現一或多個核酸序列之轉錄及/或轉譯及細胞中之一或多種蛋白質之表現的核酸。舉例而言，若編碼信號序列之核酸序列引起前體蛋白之表現，則其可視為可操作地連接至編碼多肽的DNA，信號序列從而促進多肽之分泌；若啟動子或強化子影響序列之轉錄，則其視為可操作地連接至編碼序列；或若核糖體結合位點經定位以便促進轉譯，則其視為可操作地連接至編碼序列。一般而言，在核酸分子之上下文中，術語「可操作地連接」意謂連接之核酸序列為連續的，且在分子之分泌前導序列或相關亞域之情況下為連續的且處於讀相。然而，諸如強化子之某些遺傳因子可在遠處發揮作用，且相對於其提供作用之序列無需為連續的，但仍可視為可操作地連接。
親本多肽：如本文所使用，術語「親本多肽」或「親本蛋白質」可互換使用以指定相對於第一「親本」多肽修飾的第二多肽(例如衍生物、突變蛋白或變異體)之來源。在一些情況下，親本多肽為野生型或天然存在形式之蛋白質。在一些情況下，親本多肽可為進一步經修飾的天然存在之蛋白質之經修飾形式。術語親本多肽亦可與「參考多肽」互換使用。
部分促進劑：如本文所用，術語「部分促進劑」係指與給定受體特異性結合且活化給定受體，但相對於完全促效劑僅具有部分活化受體的分子。部分促效劑可顯示促效及拮抗作用。舉例而言，在完全促效劑及部分促進劑兩者均存在時，部分促進劑可藉由與完全促效劑競爭受體結合而充當完全促效劑之競爭性抑制劑，導致相對於受體與完全促效劑在不存在部分促進劑之情況下的接觸，受體活化之淨降低。部分促效劑可用於活化受體，以在個體中不存在內源性配體或水平耗盡的情況下在個體中產生所需次最大反應。在存在過量內源性配體時，部分促效劑可用於減少受體之過度刺激。由部分促進劑產生之最大反應(E max)稱為其固有活性且可以完全促效劑產生100%反應之百分比標度表現。在給定分析系統中在類似濃度下進行評估時，部分促進劑可具有參考完全促效劑多肽配體之大於10%但小於100%，或者大於20%但小於100%，或者大於30%但小於100%，或者大於40%但小於100%，或者大於50%但小於100%，或者大於60%但小於100%，或者大於70%但小於100%，或者大於80%但小於100%，或或者大於90%但小於100%的活性。
百分比一致性：如本文所用，術語「百分比(%)序列一致性」在核酸或多肽之上下文中用以指與參考序列具有至少50%序列一致性的序列。或者，序列一致性百分比可為50%至100%之任何整數。在一些實施例中，序列與參考序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性，如使用標準參數用BLAST確定，如下文所描述。
就序列比較而言，通常一個序列充當參考序列，將測試序列與其進行比較。當使用序列比較演算法時，將測試序列及參考序列輸入至電腦中，必要時指定子序列座標，且指定序列演算法程式參數。可使用預設程式參數，或可指定替代參數。序列比較演算法接著基於程式參數來計算測試序列相對於參考序列的序列一致性百分比。
比較窗包括參考許多連續位置中之任一者之區段，例如至少10個殘基之區段。在一些實施例中，比較窗具有10至600個殘基，例如約10至約30個殘基、約10至約20個殘基、約50至約200個殘基或約100至約150個殘基，其中在最佳地比對兩個序列之後，序列可與連續位置數目相同之參考序列進行比較。
適用於確定序列一致性及序列類似性百分比之演算法為BLAST及BLAST 2.0演算法，其分別描述於Altschul等人(1990) J. Mol. Biol.215: 403-410及Altschul等人(1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402中。進行BLAST分析之軟體可透過國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)網站公開獲得。演算法涉及首先藉由鑑別查詢序列中具有長度W之短字來鑑別高評分序列對(HSP)，該等短字當與資料庫序列中相同長度之字比對時匹配或滿足一些正值臨限評分T。T稱為鄰域字評分臨限值(Altschul等人，同上)。此等初始鄰域字命中充當用於起始搜尋之種子以尋找含有其之較長HSP。字命中接著沿各序列在兩個方向上延伸，只要累積比對評分增加即可。對於核苷酸序列，累積評分係使用參數M (一對匹配殘基之獎勵評分；始終＞ 0)以及N (失配殘基之罰分；始終＜ 0)來計算。對於胺基酸序列，使用計分矩陣計算累積評分。當以下情況時，字命中沿各方向之延伸中斷：累積比對評分自其達成之最大值降低數量X；累積評分由於一或多個負分殘基比對之累加而變成零或以下；或到達任一序列之末端。BLAST演算法參數W、T及X確定比對之靈敏度及速度。BLASTN程式(對於核苷酸序列)使用字長(W) 28、期望值(E) 10、M=1、N=-2及兩股之比較作為預設值。對於胺基酸序列而言，BLASTP程式使用字長(W) 3、期望值(E) 10及BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff及Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:10915 (1989))作為預設值。
BLAST演算法亦進行兩個序列之間的類似性之統計分析(參見例如Karlin與Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA90:5873-5787 (1993))。藉由BLAST演算法得到之一種類似性量測結果為最小總和機率(P(N))，其提供兩個核苷酸或胺基酸序列之間隨機出現匹配之機率的指示。舉例而言，若測試胺基酸序列與參考胺基酸序列之比較中最小總和機率小於約0.01，更佳地小於約10 -5，且最佳地小於約10 -20，則胺基酸序列視為類似於參考序列。
多肽：如本文所用，在本文中可互換地使用之術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」係指任何長度之胺基酸之聚合形式。多肽可包括經遺傳編碼及未經遺傳編碼之胺基酸、經化學或生物化學修飾或衍生之胺基酸，及具有經修飾多肽主鏈之多肽。術語多肽包括融合蛋白。術語多肽亦包括第一多肽之融合蛋白及第二異源多肽載體蛋白(例如人類血清白蛋白(HSA))。
預防：如本文所用，術語「預防(prevent)」、「預防(preventing)」、「預防(prevention)」及其類似者係指在疾病、病症、病狀或其症狀發作之前相對於個體起始的作用過程，以便暫時或永久性地預防、抑制(suppress)、抑制(inhibit)或降低個體罹患疾病、病症、病狀或其類似者的風險(由例如不存在臨床症狀確定)或延遲其發作。預防個體之疾病、病症或病狀的作用過程通常在由於罹患特定疾病、病症或病狀之遺傳、經驗或環境因素而易患疾病、病症或病狀之個體之上下文中施加。
受體：如本文所用，術語「受體」係指具有與配體特異性結合之域之多肽，使得配體之結合引起多肽之至少一種生物特性的改變。在一些實施例中，受體為細胞膜相關蛋白，其包含細胞外域(ECD)及用以將ECD錨定至細胞表面之膜相關域。在細胞表面受體之一些實施例中，受體為包含藉由通常稱為跨膜域(TM)之跨膜域連接的細胞內域(ICD)及細胞外域(ECD)的跨膜多肽。同源配體與受體之結合引起受體的改變，從而引起可量測生物作用。在一些情況下，在受體為包含ECD、TM及ICD之跨膜多肽的情況下，配體與ECD之結合引起回應於配體與ECD之結合由ICD之一或多個域介導之可量測細胞內生物作用。在一些實施例中，受體為在裝配時引起細胞內信號傳導的多組分複合物之組分。舉例而言，配體可與不與任何細胞內信號傳導單獨相關之細胞表面受體結合，但在配體結合後促進異源多聚體(包括異二聚體、異三聚體等)或同源多聚體(包括同二聚體、同源三聚體、同源四聚體等)複合物之形成，從而導致在細胞中引起可量測生物作用，諸如細胞內信號傳導級聯(例如Jak/STAT路徑)之活化。在一些實施例中，受體為包含ECD、TM及ICD域之跨膜單鏈多肽，其中ECD、TM及ICD域來源於相同或不同的天然存在之受體變異體或其合成功能等效物。
重組：如本文所用，術語「重組」用作形容詞以指使用重組DNA技術修飾多肽、核酸或細胞的方法。「重組蛋白」為使用重組DNA技術產生之蛋白質且通常在蛋白質名稱前縮寫為小寫字母「r」以表示產生蛋白質的方法(例如以重組方式產生之人類生長激素通常縮寫為「rhGH」)。類似地，若細胞已藉由使用重組DNA技術併入(例如轉染、轉導、感染)外源性核酸(例如ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA、mRNA、病毒或非病毒載體、質體、黏質體及其類似者)修飾，則細胞稱為「重組細胞」。重組DNA技術之技術及方案為此項技術中眾所周知的，諸如可發現於Sambrook等人(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.)及其他標準分子生物學實驗室手冊中之彼等者。
反應：舉例而言，細胞、組織、器官或有機體之術語「反應」涵蓋可評估生物化學或生理參數(例如濃度、密度、黏著性、增殖、活化、磷酸化、遷移、酵素活性、基因表現量、基因表現速率、能耗速率、分化水平或狀態)之定量或定性改變，其中該改變與活化、刺激或治療，或與外源性藥劑或內部機制，諸如遺傳程式設計的接觸相關。在某些情況下，術語「活化」、「刺激」及其類似者係指如藉由內部機制以及藉由外部或環境因素調節之細胞活化；而術語「抑制」、「下調」及其類似者係指相反作用。「反應」可在活體外評估，諸如透過使用分析系統、流式細胞量測分析、表面電漿子共振、酵素活性、質譜法、胺基酸或蛋白質定序技術。「反應」可在活體內藉由評估客觀生理參數，諸如體溫、體重、腫瘤體積、血壓、X射線或其他成像技術之結果定量地評估或透過報告之幸福感、抑鬱、精神激越或疼痛之主觀感覺的變化來定性地評估。在一些實施例中，回應於測試藥劑投與的T細胞之活化水平可藉由流式細胞量測方法確定，如根據本領域中熟知之方法由一或多個STAT (例如STAT1、STAT3或STAT5)之水平所確定。
顯著降低之結合：如本文所用，術語「展現顯著降低之結合」相對於第一分子(例如配體或抗體)之變異體使用，相對於第一分子之親本形式展現對第二分子(例如受體或抗原)的親和力顯著降低。相對於抗體變異體，若變異體抗體對抗原的親和力在變異體與受體之原生形式結合時小於變異體衍生自之親本抗體之親和力的20%，或者小於約10%，或者小於約8%，或者小於約6%，或者小於約4%，或者小於約2%，或者小於約1%或或者小於約0.5%，則抗體變異體「展現顯著降低之結合」。相對於變異體配體或配體突變蛋白，若與受體結合之變異體配體或突變蛋白的親和力小於變異體配體衍生自之親本配體之親和力的20%，或者小於約10%，或者小於約8%，或者小於約6%，或者小於約4%，或者小於約2%，或者小於約1%或或者小於約0.5%，則變異體配體或突變蛋白「展現顯著降低之結合」。類似地，相對於變異體受體，若與配體結合之變異體受體的親和力小於變異體受體衍生自之親本受體之親和力的20%，或者小於約10%，或者小於約8%，或者小於約6%，或者小於約4%，或者小於約2%，或者小於約1%或或者小於約0.5%，則變異體受體「展現顯著降低之結合」。
特異性結合：如本文所使用，術語「特異性結合」係指第一分子相對於第二分子展現的親和力程度。在結合對(例如配體/受體、抗體/抗原)之上下文中，在結合對之第一分子不與存在於樣品中之其他組分大量結合時，結合對之第一分子稱為與結合對之第二分子特異性結合。在結合對之第一分子對第二分子之親和力比第一分子對存在於樣品中之其他組分之親和力至少大兩倍，或者至少大五倍，或者至少大十倍，或者至少大20倍或或者至少大100倍時，結合對之第一分子稱為與結合對之第二分子特異性結合。特異性結合可使用此項技術中已知之技術評定，包括但不限於競爭ELISA分析、放射性配體結合分析(例如飽和結合、史卡查標繪圖、非線性曲線擬合程式及競爭結合分析)；非放射性配體結合分析(例如螢光偏振(FP)、螢光共振能量轉移(FRET)；液相配體結合分析(例如即時聚合酶鏈反應(RT-qPCR)及免疫沉澱)；及固相配體結合分析(例如多孔盤分析、珠粒上配體結合分析、管柱上配體結合分析及過濾分析))及表面電漿子共振分析(參見例如Drescher等人(2009) Methods Mol Biol 493:323-343，使用可商購儀器，諸如Biacore 8K、Biacore 8K+、Biacore S200、Biacore T200 (Cytiva, 100 Results Way, Marlborough MA 01752))。
個體：術語「接受者」、「個人」、「個體」及「患者」在本文中可互換地使用且係指需要診斷、治療或療法之任何哺乳動物個體，尤其人類。用於治療目的之「哺乳動物」係指被歸類為哺乳動物的任何動物，包括人類、家畜及農畜，以及動物園、運動或寵物動物，諸如犬、馬、貓、牛、綿羊、山羊、豬等。在一些實施例中，哺乳動物係人類。
實質上純的：如本文所用，術語「實質上純的」指示組合物之組分佔組合物之總含量的大於約50%，或者大於約60%，或者大於約70%，或者大於約80%，或者大於約90%，或者大於約95%。「實質上純的」蛋白質佔組合物之總含量的大於約50%，或者大於約60%，或者大於約70%，或者大於約80%，或者大於約90%，或者大於約95%。
患有：如本文所用，術語「患有」係指醫師基於本領域公認可用的用於鑑別個體存在疾病、病症或病狀之客觀或主觀資訊相對於個體作出個體需要或將得益於治療的判斷，包括但不限於X射線、CT掃描、習知實驗室診斷測試(例如血球計數等)、基因體資料、蛋白質表現資料、免疫組織化學。
T 細胞：如本文所使用，術語「T細胞(T-cell)」或「T細胞(T cell)」在其習知意義上用以指在胸腺中分化之淋巴細胞。在一些實施例中，術語T細胞包括但不限於原生CD8 +T細胞、細胞毒性CD8 +T細胞、原生CD4 +T細胞、輔助T細胞，例如T H1、T H2、T H9、T H11、T H22、T FH；調節T細胞，例如T R1、Treg、誘導型Treg；記憶T細胞，例如中樞記憶T細胞、效應記憶T細胞、NKT細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)及此等T細胞之經工程改造變異體，包括但不限於CAR-T細胞、以重組方式修飾之TIL及經TCR工程改造之細胞。
末端 (Terminus)/ 末端 (Terminal)：如本文所用，在多肽之結構之上下文中，「N末端」(或「胺基末端」)及「C末端」(或「羧基末端」)分別係指多肽之胺基及羧基末端，而術語「N末端」及「C末端」分別係指多肽之胺基酸序列中朝向N末端及C末端之相對位置，且可分別包括N末端及C末端處之殘基。「緊鄰N末端」係指連續多肽序列中第一胺基酸殘基相對於第二胺基酸殘基之位置，第一胺基酸更接近多肽之N末端。「緊鄰C末端」係指連續多肽序列中第一胺基酸殘基相對於第二胺基酸殘基之位置，第一胺基酸更接近多肽之C末端。
治療有效量：如本文所用，片語「治療有效量」係指在單獨或作為醫藥組合物或治療方案之部分以單次劑量或作為一系列劑量之部分向個體投與時對疾病、病症或病狀之任何定量或定性症狀、態樣或特徵提供積極作用的藥劑量。治療有效量可藉由量測相關生理作用確定，且其可結合給藥方案且回應於對個體之病狀之診斷性分析進行調節。用於評估確定藥劑之治療有效量的參數係由醫師使用本領域公認的診斷標準確定，包括但不限於諸如年齡、體重、性別、一般健康狀況、ECOG評分、可觀測的生理參數、血液含量、血壓、心電圖、電腦化斷層掃描、X射線及其類似者的標誌。或者或另外，可監測臨床環境中通常評定之其他參數以確定是否已向個體投與治療有效量之藥劑，諸如體溫、心率、血液化學之正常化、血壓之正常化、膽固醇水平之正常化或疾病、病症或病狀之任何症狀、態樣或特徵，生物標記(諸如發炎性細胞介素、IFN-γ、顆粒酶及其類似者)，血清腫瘤標記之減少，存活持續時間之改善、延長，無進展存活期之持續時間之延長、至進展時間之延長、至治療失敗時間之延長、無事件存活期之持續時間之延長、至下次治療時間之延長、客觀反應率之改善、反應持續時間之改善、腫瘤負荷之減少、完全反應、部分反應、病情穩定及其類似者，本領域臨床醫師依賴於該等參數來評定個體回應於藥劑投與的病狀改善。在一個實施例中，治療有效量為在單獨或與另一藥劑組合使用時提供疾病、病症或病狀之任何定量或定性症狀、態樣或特徵之改善且在將藥劑投與至哺乳動物個體的過程中不會引起不可逆嚴重不良事件的藥劑量。
治療：術語「治療(treat)」、「治療(treating)」、「治療(treatment)」及其類似者係指回應於個體患有疾病、病症或病狀或其症狀之診斷相對於個體而起始的作用過程(諸如使個體與單獨包含hIL10變異體多肽單體或與補充藥劑之組合的醫藥組合物接觸)，起始該作用過程以便暫時或永久性地消除、減少、抑制、減輕或改善以下中之至少一者：(a)折磨個體之此疾病、病症或病狀之潛在病因；及/或(b)與此疾病、病症或病狀相關之症狀中之至少一者。在一些實施例中，治療包括相對於患有疾病之個體採取的作用過程，其中該作用過程抑制個體之疾病(例如阻滯疾病、病症或病狀之發展或改善與其相關的一或多種症狀)。在一些實施例中，術語「治療」用以指減緩疾病、病症或病狀自現有狀態至更有害狀態之進展的作用過程。
變異體：術語「變異體」、「蛋白質變異體」或「變異體蛋白」或「變異體多肽」在本文中可互換地使用以指由於至少一個胺基酸修飾、取代或缺失而與親本多肽不同的多肽。親本多肽可為天然存在之多肽或野生型(WT)多肽或可為WT多肽之經修飾型式。術語變異體多肽可指多肽自身、包含多肽之組合物或編碼其之核酸序列。在一些實施例中，變異體多肽相較於親本多肽包含約一個至約十個，或者約一個至約八個，或者約一個至約七個，或者約一個至約五個，或者約一個至約四個，或者約一個至約三個，或者一至兩個胺基酸修飾、取代或缺失，或或者單胺基酸胺基酸修飾、取代或缺失。變異體與變異體衍生自之親本多肽的一致性可為至少約99%，或者至少約98%，或者至少約97%，或者至少約95%，或者至少約90%。術語「變異體」亦包括核酸分子，其編碼相較於親本多肽具有經更改或修飾胺基酸序列之蛋白質或多肽。
野生型：本文之「野生型」或「WT」或「原生」意指在自然界中發現之胺基酸序列或核苷酸序列，包括對偶基因變異。野生型蛋白質、多肽、抗體、免疫球蛋白、IgG等具有未經人工修飾之胺基酸序列或核苷酸序列。
應理解，本文為了清楚及簡潔而分別描述之個別實施例可以不受限制地組合。因此，本揭示包括本文所描述之實施例之一或多個或所有組合，如同每一個組合均被單獨且明確地揭示一般。此亦適用於本文所揭示之實施例之任何及所有子組合，使得本揭示包括本文所描述之實施例之一或多個或所有子組合，如同每一個子組合均被單獨且明確地揭示一般。 人類 IL10
人類IL10 (hIL10)為包含兩個相同次單元之非共價連接之同二聚體蛋白質。各hIL10單體表現為包含18個胺基酸的信號序列(SEQ ID NO: 5)之178個胺基酸的前體蛋白，該信號序列轉譯後經移除以產生160個胺基酸的成熟蛋白。不含信號序列(對應於前體蛋白之胺基酸19至178)的成熟(「野生型」) IL10蛋白質之典型胺基酸序列(UniProt參考案號P22301)具有以下胺基酸序列： SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 4)。 融合人類 IL10 多肽
本揭示提供一種下式之融合人類IL10 (hIL10)多肽： (hIL10A)-L n-(hIL10B)， 其中hIL10A及hIL10B獨立地選自由以下組成之群：野生型hIL10 (SEQ ID NO: 4)及hIL10突變蛋白，其中hIL10A或hIL10B中之至少一者為hIL10突變蛋白；L為連接子且n = 0 (不存在)或1 (存在)。 hIL10 突變蛋白
在一些實施例中，式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽中hIL10A及hIL10B中之至少一者為hIL10突變蛋白。在一些情況下，hIL10突變蛋白可包含在對應於SEQ ID NO: 4之殘基T100、H14、N18、N21、M22、R24、D25、D28、R32、E74、H90、N92、S93、E96及R104之位置處的一或多個胺基酸取代。在一些實施例中，hIL10突變蛋白包含與SEQ ID NO: 4具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性之序列且包含在對應於SEQ ID NO: 4之殘基T100、H14、N18、N21、M22、R24、D25、D28、R32、E74、H90、N92、S93、E96及R104之位置處的一或多個胺基酸取代。在一些情況下，hIL10突變蛋白可包含在對應於SEQ ID NO: 4之殘基T100、H14、N18、N21、M22、R24、D25、D28、R32、E74、H90、N92、S93、E96及R104之位置處的一或多個胺基酸取代。在一些實施例中，hIL10突變蛋白包含與SEQ ID NO: 4具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性之序列且包含在對應於SEQ ID NO: 4之殘基T100、H14、N18、N21、M22、R24、D25、D28、R32、E74、H90、N92、S93、E96及R104之位置處的一或多個胺基酸取代。
在一些實施例中，hIL10突變蛋白包含T100位置處之胺基酸取代，例如T100D、T100V、T100E、T100A、T100R、T100N、T100Q、T100E、T100I、T100L、T100K、T100M或T100S。
在一些實施例中，hIL10突變蛋白包含H14位置處之胺基酸取代，例如H14C、H14F、H14P、H14W、H14G、H14A、H14D、H14E、H14I、H14K、H14L、H14M、H14N、H14Q、H14R、H14S、H14T、H14Y或H14V。
在一些實施例中，hIL10突變蛋白包含N18位置處之胺基酸取代，例如N18Y、N18F、N18A、N18D、N18E、N18L、N18V、N18S、N18T、N18I、N18V、N18M、N18R及N18K或N18H。
在一些實施例中，hIL10突變蛋白包含N21位置處之胺基酸取代，例如N21A、N21R、N21Q、N21H、N21K、N21S、N21V、N21I、N21L、N21M、N21T、N21C、N21D或N21E。
在一些實施例中，hIL10突變蛋白包含M22位置處之胺基酸取代，例如M22A、M22V、M22I、M22L、M22N、M22D、M22S、M22T、M22W或M22Q。
在一些實施例中，hIL10突變蛋白包含R24位置處之胺基酸取代，例如R24E、R24D、R24N、R24Q、R24A、R24S或R24T。
在一些實施例中，hIL10突變蛋白包含D25位置處之胺基酸取代，例如D25A、D25N、D25H、D25I、D25K、D25L、D25P、D25Q或D25V。
在一些實施例中，hIL10突變蛋白包含D28位置處之胺基酸取代，例如D28A、D28E、D28L、D28V、D28S、D28T、D28I、D28V、D28M、D28H、D28K或D28R。
在一些實施例中，hIL10突變蛋白包含R32位置處之胺基酸取代，例如R32A、R32D、R32E、R32L、R32V、R32S、R32T、R32I、R32V、R32M、R32N、R32Q、R32G、R32C、R32P、R32F、R32Y或R32H。
在一些實施例中，hIL10突變蛋白包含E74位置處之胺基酸取代，例如E74A、E74D、E74L、E74V、E74S、E74T、E74I、E74V、E74M、E74H、E74K或E74R。
在一些實施例中，hIL10突變蛋白包含H90位置處之胺基酸取代，例如H90A、H90D、H90E、H90I、H90K、H90L、H90M、H90N、H90Q、H90R、H90S、H90T、H90Y或H90V。
在一些實施例中，hIL10突變蛋白包含N92位置處之胺基酸取代，例如N92D、N92Q、N92E、N92H、N92K、N92S、N92V、N92I、N92L、N92M、N92T或N92A。
在一些實施例中，hIL10突變蛋白包含S93位置處之胺基酸取代，例如S93E、S93A、S93R、S93N、S93D、S93Q、S93E、S93I、S93L、S93K、S93M、S93G或S93V。
在一些實施例中，hIL10突變蛋白包含E96位置處之胺基酸取代，例如E96C、E96F、E96Y、E96W、E96A、E96N、E96D、E96Q、E96H、E96K或E96S。
在一些實施例中，hIL10突變蛋白包含R104位置處之胺基酸取代，例如R104A、R104W、R104Y、R104F、R104H、R104D、R104E、R104N、R104Q、R104S、R104T、R104I、R104L、R104V或R104M。
可用於式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽中的hIL10突變蛋白之實例提供於下表1A中。
表1A
SEQ ID NO 序列 描述
6 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRKLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:6) hIL10 1-160 D25K
7 SCTHFPGNLPNMLRKLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:7) hIL10 11-160 D25K
8 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPKMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:8) hIL10 1-160 N21K
9 SCTHFPGNLPKMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:9) hIL10 11-160 N21K
10 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNALRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:10) hIL10 1-160 M22A
11 SCTHFPGNLPNALRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:11) hIL10 11-160 M22A
12 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNSLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:12) hIL10 1-160 M22S
13 SCTHFPGNLPNSLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:13) hIL10 11-160 M22S
14 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:14) hIL10 1-160 T100L
15 SCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:15) hIL10 11-160 T100L
16 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGQNLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:16) hIL10 1-160 E96Q
17 SCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGQNLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:17) hIL10 11-160 E96Q
18 SENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:18) hIL10 WT N末端缺失8-160
148 SPGQGTQSENSCTHFPGNLP D MLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:148) hIL10 1-160 N21D
149 SPGQGTQSENSCTHFPGNLP E MLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:149) hIL10 1-160 N21E
150 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPD T LRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:150) hIL10 1-160 M22T
151 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPD D LRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:151) hIL10 1-160 M22D
152 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPD W LRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:152) hIL10 1-160 M22W
153 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNML E DLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:153) hIL10 1-160 R24E
154 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLG K NLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:154) hIL10 1-160 E96K
155 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLK E LRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:155) hIL10 1-160 T100E
156 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLK C LRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:156) hIL10 1-160 T100C
可用於式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽中的hIL10突變蛋白之實例提供於下表1B中。
表1B
SEQ ID NO 序列 描述
191 PGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRKLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:191) hIL10 2-160 D25K
192 PGQGTQSENSCTHFPGNLPKMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:192) hIL10 2-160 N21K
193 PGQGTQSENSCTHFPGNLPNALRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:193) hIL10 2-160 M22A
194 PGQGTQSENSCTHFPGNLPNSLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:194) hIL10 2-160 M22S
195 PGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:195) hIL10 2-160 T100L
196 PGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGQNLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:196) hIL10 2-160 E96Q
197 PGQGTQSENSCTHFPGNLP D MLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 197) hIL10 2-160 N21D
198 PGQGTQSENSCTHFPGNLP E MLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 198) hIL10 2-160 N21E
199 PGQGTQSENSCTHFPGNLPD T LRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 199) hIL10 2-160 M22T
200 PGQGTQSENSCTHFPGNLPD D LRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 200) hIL10 2-160 M22D
201 PGQGTQSENSCTHFPGNLPD W LRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 201) hIL10 2-160 M22W
202 PGQGTQSENSCTHFPGNLPNML E DLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 202) hIL10 2-160 R24E
203 PGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLG K NLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 203) hIL10 2-160 E96K
204 PGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLK E LRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 204) hIL10 2-160 T100E
205 PGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLK C LRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 205) hIL10 2-160 T100C
視情況，在一些實施例中，除相對於SEQ ID NO: 4之一或多個胺基酸取代之外，hIL10突變蛋白亦可進一步包含突變蛋白之N末端處1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基之缺失。在某些實施例中，融合hIL10多肽中之hIL10A相對於SEQ ID NO: 4具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基之胺基末端缺失。在其他實施例中，融合hIL10多肽中之hIL10B相對於SEQ ID NO: 4具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基之胺基末端缺失。在某些實施例中，融合hIL10多肽中之hIL10A相對於表1A之胺基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基之胺基末端缺失。在其他實施例中，融合hIL10多肽中之hIL10B相對於表1A之胺基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基之胺基末端缺失。在一些實施例中，hIL10A選自表1B之胺基酸序列且hIL10B選自表1A之胺基酸序列。在一些實施例中，本揭示提供一種式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽，其中hIL10A為選自由以下組成之群的多肽：SEQ ID NO: 191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204及205，且hIL10B為選自由以下組成之群的多肽：SEQ ID NO: 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、148、149、150、151、152、153、154、155及156。 連接子
在一些實施例中，式(hIL10A)-L n-(hIL10B)中之hIL10A及hIL10B將藉助於連接子L彼此連接或融合，亦即式中之n為1。
在一些實施例中，連接子為具有1個胺基酸(例如Thr)至50個胺基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10至20、20至30、30至40、40至50、10至30、20至40或30至50個胺基酸)或超過50個胺基酸之多肽。
連接子之實例可包括但不限於(G) x、(A) x、(S) x、(GA) x、(GS) x、(AS) x、(AG) x、(SG) x、(SA) x，其中x可為整數，例如1至50之間的整數。含有甘胺酸及絲胺酸之連接子之實例可包括但不限於(GmSo) z(SEQ ID NO: 129)、(GSGGS) z(SEQ ID NO: 130)、(GmSoGm) z(SEQ ID NO: 131)、(GmSoGmSoGm) z(SEQ ID NO: 132)、(GSGGSm) z(SEQ ID NO: 133)、(GSGSmG) z(SEQ ID NO: 134)及(GGGSm) z(SEQ ID NO: 135)及其組合，其中m、z及o各自獨立地選自至少1至20 (例如1至18、2至16、3至14、4至12、5至10、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)之整數；以及其他靈活連接子。在一些實施例中，多肽連接子為具有結構(GGGGS m) n(SEQ ID NO: 136)、(GGGS m) n(SEQ ID NO: 137)、(GGGA m) n(SEQ ID NO: 138)及(GGGGA m) n(SEQ ID NO: 139)及其組合之甘胺酸-絲胺酸聚合物，其中m、n及o各自獨立地選自1、2、3或4。例示性甘胺酸-絲胺酸連接子包括但不限於單體：GGGGS (稱為「G4S」；SEQ ID NO: 104)、GGGGA (稱為「G4A」；SEQ ID NO: 112)、GGGS (稱為「G3S」；SEQ ID NO: 103)及GGGA (稱為「G3A」 (SEQ ID NO: 140))；或其同元聚合物(例如「GGGGSGGGGS」，亦稱為(G4S) 2；SEQ ID NO: 111)或異聚物(例如：GGGGSGGGS，亦稱為G4S-G3S；SEQ ID NO: 108)。適用於實踐本揭示之特定連接子序列包括但不限於：GSGG (SEQ ID NO: 101)、GGSG (SEQ ID NO: 102)、GGGS (SEQ ID NO: 103)、GGGGS (SEQ ID NO: 104)、GGGSGG (SEQ ID NO: 105)、GGGGSG (SEQ ID NO: 106)、GGGSGGGS (SEQ ID NO: 107)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 108)、GGGGGSGGGS (SEQ ID NO: 109)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 110)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 111)、GGGGA (SEQ ID NO: 112)、GGGGAGGGGS (SEQ ID NO: 113)、GGGGAGGGGSGGGGA (SEQ ID NO: 114)、GGGAGGGS (SEQ ID NO: 115)、GGGAGGGA (SEQ ID NO: 116)、GGGSGGGA (SEQ ID NO: 117)及GGGGAGGGS (SEQ ID NO: 118)。在此等聚合物之建構中，可能需要避免重複「GSG」序列，其可能提供非天然存在之醣基化位點的引入。
在一些實施例中，式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽之多肽連接子具有選自GGGSGSGSGSG (SEQ ID NO: 19)或NQMFDQKYDDP (SEQ ID NO: 20)之序列。在一些實施例中，式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽中之連接子為Thr。
在一些實施例中，式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽中之連接子可為單個胺基酸。舉例而言，在一些實施例中，單個胺基酸為T、S、A或G (例如T)。 融合 hIL10 多肽
在一些實施例中，式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包括相同的兩個IL10單體，亦即式中之hIL10A及hIL10B均為野生型IL10分子(例如SEQ ID NO: 4)或均為相同hIL10突變蛋白。在一些實施例中，式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包括兩種不同IL10單體，亦即hIL10A及hIL10B中之一者為野生型IL10分子(例如SEQ ID NO: 4)且另一者為hIL10突變蛋白，或這兩者為不同hIL10突變蛋白。
在一些實施例中，hIL10A及hIL10B直接彼此融合，亦即式(hIL10A)-L n-(hIL10B)中之n為0 (無連接子)。hIL10A及hIL10B可經由其末端彼此融合，亦即hIL10B之N末端與hIL10A之C末端融合。在一些實施例中，hIL10A及hIL10B經由連接子彼此融合，亦即n為1。本文描述連接子之實例。
在一些實施例中，具有式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包含hIL10A，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有至少一個胺基酸取代及至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%)一致性的序列；及hIL10B，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有至少一個胺基酸取代及至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%)一致性的序列。在一些實施例中，具有式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包含hIL10A，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸取代或缺失的序列；及hIL10B，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸取代或缺失的序列。
在一些實施例中，具有式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包含hIL10A，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有在對應於SEQ ID NO: 4之殘基T100、H14、N18、N21、M22、R24、D25、D28、R32、E74、H90、N92、S93、E96及R104之一或多個位置處的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸取代及至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%)一致性的序列；及hIL10B，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有在對應於SEQ ID NO: 4之殘基T100、H14、N18、N21、M22、R24、D25、D28、R32、E74、H90、N92、S93、E96及R104之一或多個位置處的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸取代及至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%)一致性的序列。在一些實施例中，具有式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包含hIL10A，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有在對應於SEQ ID NO: 4之殘基T100、H14、N18、N21、M22、D25、R32、S93及E96之一或多個位置處的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸取代及至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%)一致性的序列；及hIL10B，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有在對應於SEQ ID NO: 4之殘基T100、H14、N18、N21、M22、D25、R32、S93及E96之一或多個位置處的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸取代及至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%)一致性的序列。
在一些實施例中，具有式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包含hIL10A，其包含野生型IL10分子之序列(例如SEQ ID NO: 4)；及hIL10B，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸取代及至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%)一致性的序列。
在一些實施例中，具有式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包含hIL10A，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸取代及至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%)一致性的序列；及hIL10B，其包含野生型IL10分子之序列(例如SEQ ID NO: 4)。
在一些實施例中，具有式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包含hIL10A，其包含具有在對應於SEQ ID NO: 4之殘基T100、H14、N18、N21、M22、R24、D25、D28、R32、E74、H90、N92、S93、E96及R104之位置處的胺基酸取代的序列；及hIL10B，其包含具有在對應於SEQ ID NO: 4之殘基T100、H14、N18、N21、M22、R24、D25、D28、R32、E74、H90、N92、S93、E96及R104之位置處的胺基酸取代的序列。在一些實施例中，具有式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包含hIL10A，其包含具有在對應於SEQ ID NO: 4之殘基T100、H14、N18、N21、M22、D25、R32、S93或E96之位置處的胺基酸取代的序列；及hIL10B，其包含具有在對應於SEQ ID NO: 4之殘基T100、H14、N18、N21、M22、D25、R32、S93及E96之位置處的胺基酸取代的序列。
在一些實施例中，具有式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽中hIL10A及hIL10B中之一者或兩者相對於SEQ ID NO: 4之序列可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基之N末端缺失。在某些實施例中，hIL10A相對於SEQ ID NO: 4之序列可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基之N末端缺失。在某些實施例中，hIL10B相對於SEQ ID NO: 4之序列可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基之N末端缺失。
在一些實施例中，具有式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包含hIL10A，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有至少一個(例如一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)胺基酸取代及至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%)一致性的序列；及hIL10B，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有至少一個(例如一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)胺基酸取代及至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%)一致性的序列，其中hIL10A及hIL10B中之一者或兩者相對於SEQ ID NO: 4之序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基之N末端缺失。
在一些實施例中，具有式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包含hIL10A，其包含具有在對應於SEQ ID NO: 4之殘基T100、H14、N18、N21、M22、R24、D25、D28、R32、E74、H90、N92、S93、E96及R104之位置處的胺基酸取代的序列；及hIL10B，其包含具有在對應於SEQ ID NO: 4之殘基T100、H14、N18、N21、M22、R24、D25、D28、R32、E74、H90、N92、S93、E96及R104之位置處的胺基酸取代的序列，其中hIL10A及hIL10B中之一者或兩者相對於SEQ ID NO: 4之序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基之N末端缺失。在一些實施例中，具有式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包含hIL10A，其包含具有在對應於SEQ ID NO: 4之殘基T100、H14、N18、N21、M22、D25、R32、S93或E96之位置處的胺基酸取代的序列；及hIL10B，其包含具有在對應於SEQ ID NO: 4之殘基T100、H14、N18、N21、M22、D25、R32、S93或E96之位置處的胺基酸取代的序列，其中hIL10A及hIL10B中之一者或兩者相對於SEQ ID NO: 4之序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基之N末端缺失。
在一些實施例中，本揭示提供一種式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽，其中hIL10A或hIL10B中之至少一者為選自由以下組成之群的hIL10突變蛋白：SEQ ID NO: 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、148、149、150、151、152、153、154、155、156、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204及205，視情況其中hIL10A及hIL10B中之一者或兩者相對於SEQ ID NO: 4之序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基之N末端缺失。
在一些實施例中，本揭示提供一種式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽，其中hIL10A及hIL10B為獨立地選自由以下組成之群的hIL10突變蛋白：SEQ ID NO: 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、148、149、150、151、152、153、154、155、156、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204及205，視情況其中hIL10A及hIL10B中之一者或兩者相對於SEQ ID NO: 4之序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基之N末端缺失。
在一些實施例中，本揭示提供一種式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽，其中hIL10A及hIL10B兩者為選自由以下組成之群的hIL10突變蛋白：SEQ ID NO: 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、148、149、150、151、152、153、154、155、156、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204及205，視情況其中hIL10A及hIL10B中之一者或兩者相對於SEQ ID NO: 4之序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基之N末端缺失。
在一些實施例中，本揭示提供一種式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽，其中hIL10A包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基之N末端缺失。在一些實施例中，缺失N末端胺基酸(例如相對於野生型序列缺失融合IL10分子之N末端之前三個或六個胺基酸)，所得N末端胺基酸為麩醯胺酸(Q)。已經觀測到N末端麩醯胺酸殘基在生理條件下或接近生理條件下自發地環化以形成焦麩胺酸(pE)。(參見例如Liu等人(2011) J. Biol. Chem. 286(13): 11211-11217)。在一些實施例中，焦麩胺酸之形成使N末端PEG結合複雜化，尤其在醛化學物質用於N末端聚乙二醇化時。因此，在例如藉由自野生型序列缺失N末端3或6個殘基對包含N末端麩醯胺酸之融合IL10分子進行聚乙二醇化時，N末端麩醯胺酸經替代胺基酸取代。在一些實施例中，N末端麩醯胺酸殘基選自由以下組成之群：E及D。
在一些實施例中，本揭示提供一種式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽，其中hIL10A包含3個胺基酸之N末端缺失及選自由Q4E及Q4D組成之群的胺基酸取代。在一些實施例中，本揭示提供一種式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽，其中hIL10A包含6個胺基酸之N末端缺失及選自由Q7E及Q7D組成之群的胺基酸取代。
在特定實施例中，具有式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包含hIL10A，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有胺基酸取代D25K及至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%)一致性的序列；及hIL10B，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有胺基酸取代D25K及至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%)一致性的序列，其中hIL10A及hIL10B中之一者或兩者相對於SEQ ID NO: 4之序列具有N末端缺失SPGQGTQSEN (SEQ ID NO: 21)(例如hIL10B相對於SEQ ID NO: 4之序列具有N末端缺失SPGQGTQSEN (SEQ ID NO: 21))。
在特定實施例中，具有式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包含hIL10A，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有胺基酸取代N21K及至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%)一致性的序列；及hIL10B，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有胺基酸取代N21K及至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%)一致性的序列，其中hIL10A及hIL10B中之一者或兩者相對於SEQ ID NO: 4之序列具有N末端缺失SPGQGTQSEN (SEQ ID NO: 21)(例如hIL10B相對於SEQ ID NO: 4之序列具有N末端缺失SPGQGTQSEN (SEQ ID NO: 21))。
在特定實施例中，具有式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包含hIL10A，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有胺基酸取代M22A及至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%)一致性的序列；及hIL10B，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有胺基酸取代M22A及至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%)一致性的序列，其中hIL10A及hIL10B中之一者或兩者相對於SEQ ID NO: 4之序列具有N末端缺失SPGQGTQSEN (SEQ ID NO: 21)(例如hIL10B相對於SEQ ID NO: 4之序列具有N末端缺失SPGQGTQSEN (SEQ ID NO: 21))。
在特定實施例中，具有式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包含hIL10A，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有胺基酸取代M22S及至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%)一致性的序列；及hIL10B，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有胺基酸取代M22S及至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%)一致性的序列，其中hIL10A及hIL10B中之一者或兩者相對於SEQ ID NO: 4之序列具有N末端缺失SPGQGTQSEN (SEQ ID NO: 21)(例如hIL10B相對於SEQ ID NO: 4之序列具有N末端缺失SPGQGTQSEN (SEQ ID NO: 21))。
在特定實施例中，具有式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包含hIL10A，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有胺基酸取代T100L及至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%)一致性的序列；及hIL10B，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有胺基酸取代T100L及至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%)一致性的序列，其中hIL10A及hIL10B中之一者(例如僅hIL10A或僅hIL10B)或兩者相對於SEQ ID NO: 4之序列具有N末端缺失SPGQGTQSEN (SEQ ID NO: 21)(例如hIL10B相對於SEQ ID NO: 4之序列具有N末端缺失SPGQGTQSEN (SEQ ID NO: 21))。
在特定實施例中，具有式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包含hIL10A，其包含具有胺基酸取代T100L之序列；及hIL10B，其包含具有胺基酸取代T100L之序列，其中hIL10B相對於SEQ ID NO: 4之序列進一步具有N末端缺失SPGQGTQSEN (SEQ ID NO: 21)，n為1，且L為GGGSGSGSGSG (SEQ ID NO: 19)。在某些實施例中，融合hIL10多肽具有SEQ ID NO: 36之序列。
在特定實施例中，具有式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包含hIL10A，其包含具有胺基酸取代T100L之序列；及hIL10B，其包含具有胺基酸取代T100L之序列，其中n為1且L為T。在某些實施例中，融合hIL10多肽具有SEQ ID NO: 37之序列。
在特定實施例中，具有式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包含hIL10A，其包含具有胺基酸取代T100L之序列；及hIL10B，其包含具有胺基酸取代T100L之序列，其中hIL10B相對於SEQ ID NO: 4之序列亦具有N末端缺失SPGQGTQSEN (SEQ ID NO: 21)，n為1，且L為NQMFDQKYDDP (SEQ ID NO: 20)。在某些實施例中，融合hIL10多肽具有SEQ ID NO: 38之序列。
在特定實施例中，具有式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包含hIL10A，其包含具有胺基酸取代T100L之序列；及hIL10B，其包含具有胺基酸取代T100L之序列，其中n為0。在某些實施例中，融合hIL10多肽具有與SEQ ID NO: 44之序列具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致性之序列。
在特定實施例中，具有式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包含hIL10A，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有胺基酸取代E96Q及至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%)一致性的序列；及hIL10B，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有胺基酸取代E96Q及至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%)一致性的序列，其中hIL10A及hIL10B中之一者或兩者相對於SEQ ID NO: 4之序列具有N末端缺失SPGQGTQSEN (SEQ ID NO: 21)(例如hIL10B相對於SEQ ID NO: 4之序列具有N末端缺失SPGQGTQSEN (SEQ ID NO: 21))。
在特定實施例中，具有式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包含hIL10A，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有胺基酸取代T100L及至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%)一致性的序列；及hIL10B，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、99%或100%)一致性的序列。
在特定實施例中，具有式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽可包含hIL10A，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、99%或100%)一致性的序列；及hIL10B，其包含相對於SEQ ID NO: 4之序列具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、99%或100%)一致性的序列，其中hIL10A及hIL10B中之一者或兩者相對於SEQ ID NO: 4之序列具有SPGQGTQ (SEQ ID NO: 22)或N末端缺失SPGQGTQSEN (SEQ ID NO: 21)(例如hIL10A相對於SEQ ID NO: 4之序列具有N末端缺失SPGQGTQSEN (SEQ ID NO: 21))。
融合hIL10多肽及編碼其之核酸序列之實例示於下表2中。連接子序列(L)以粗體突出顯示。在一些實施例中，融合hIL10多肽包含表2中之多肽序列中之一者，視情況具有所描繪連接子或具有不同連接子，例如本文中所描述，或缺乏連接子。在一些實施例中，對於下列融合hIL10多肽序列中之各者，His標籤可與具有或不具有連接子之序列之N末端融合，亦即GGSHHHHHHHH (SEQ ID NO: 23)可與下列融合hIL10多肽之N末端融合。表2中所列出之融合hIL10多肽係用具有18個胺基酸的裂解信號序列(SEQ ID NO: 5)之成熟hIL10單體製備。
在一些實施例中，本揭示提供一種式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合IL10多肽，其與選自由以下組成之群的多肽具有至少90%，或者至少91%，或者至少92%，或者至少93%，或者至少94%，或者至少95%，或者至少96%，或者至少97%，或者至少98%，或者至少99%或100%序列一致性：SEQ ID NO: 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、119、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185及186。
本揭示提供一種與表2之多肽序列中之任一者具有至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、99%或100%)一致性之融合IL10多肽。在一些實施例中，本揭示提供一種與表2之多肽序列中之任一者具有至少90%，或者至少91%，或者至少92%，或者至少93%，或者至少94%，或者至少95%，或者至少96%，或者至少97%，或者至少98%，或者至少99%或100%序列一致性的融合IL10多肽，視情況具有所描繪連接子或具有不同連接子，例如本文中所描述，或缺乏連接子。
在一些實施例中，式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合IL10多肽選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50及119。
表2：例示性融合IL10多肽及編碼其之核酸
名稱 蛋白質序列 DNA序列
TP0002 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRKLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGGSGSGSGSGSCTHFPGNLPNMLRKLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:24) agccccggccaaggcacacagagcgagaactcatgtacccattttcccgggaacctgcccaacatgctgcggaagctgagagacgccttcagcagagtgaagactttctttcagatgaaggatcagctggacaaccttttactgaaggagagtctgctagaagacttcaagggatacctgggctgtcaagccttgtcggagatgattcaattctacctggaagaagtgatgccccaagctgagaaccaagaccccgatatcaaggcccatgtgaacagcctgggcgagaatctcaaaaccctgcgcttaaggctcagaagatgccacagatttctgccatgcgaaaacaagagcaaggcagtggaacaagtgaaaaacgccttcaacaagctgcaagagaagggcatctacaaagccatgagcgagttcgacattttcatcaactatattgaggcctacatgacgatgaagattcgaaatggcggagggtcgggctccggctctggcagcggctcctgcacccatttccccggcaacctgcccaatatgctgagaaagctgcgtgacgccttctctagagtaaaaaccttctttcagatgaaggatcagctggacaacttgttactgaaggagagcctgctcgaggacttcaaaggctacctgggctgccaagccctgagcgagatgattcagttttaccttgaagaggtgatgccccaagccgagaaccaagaccccgacatcaaagcccacgtcaactcgctgggcgaaaacctgaagactcttcggttgagacttcgaagatgtcatcggttcttgccctgcgagaataagagcaaggcggtggagcaagtgaagaacgcattcaataagctgcaagagaaaggtatctacaaggctatgagcgaatttgacatctttattaattacatcgaggcctatatgaccatgaaaatcagaaat (SEQ ID NO:51)
TP0003 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRKLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNTSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRKLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:25) agtcccggacaaggcacacagagcgagaacagctgcacgcatttccccggcaacctgcccaacatgctgcgtaaactcagagatgctttcagcagagtgaaaacgttcttccaaatgaaagaccaactcgataacctgttgcttaaggagtcactgctggaagatttcaaaggctatcttggctgtcaagccctgagcgaaatgatacagttctacctggaagaggtgatgcctcaagccgagaaccaagacccggatattaaggcccatgtaaattccctgggcgagaacctgaaaaccctcagactaagactgcgacgatgtcatagattcctaccctgtgaaaacaaatctaaggccgtggagcaagtgaagaatgcttttaacaaactgcaagagaagggcatttacaaggccatgagcgaatttgacatcttcatcaattacatcgaagcctacatgaccatgaaaattagaaacacgtcacccggccaaggcacacagtctgaaaacagctgcacccactttcccggcaaccttcccaacatgttgcgaaagctgagagacgcctttagccgcgtgaaaaccttcttccaaatgaaagatcagctggacaatctgctgctcaaggaaagcctgctcgaggacttcaagggctacctcggctgccaagccctcagcgagatgattcagttttaccttgaagaagtcatgcctcaagccgaaaaccaagaccccgatataaaagcccatgtgaacagcttgggcgagaacttaaagaccctgagattaagattacggcggtgccaccgattcttgccgtgcgagaacaagtcaaaggcggtcgagcaagtgaagaatgcattcaataaattacaagagaagggcatctataaggctatgagtgagttcgatattttcatcaactatatcgaggcttacatgacaatgaaaatcagaaac (SEQ ID NO:52)
TP0004 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRKLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNNQMFDQKYDDPSCTHFPGNLPNMLRKLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:26) tcacccggccaaggcacacagagcgagaactcctgcacccacttccccgggaacttgcccaacatgctgcgcaagctgagagatgccttcagcagagtgaagactttctttcagatgaaggatcagcttgacaaccttctcctgaaggagagtctgctagaagacttcaagggatacctgggctgtcaagccttgtcggagatgattcagttttatctggaagaggtgatgccccaagctgagaatcaagaccccgacatcaaagcccatgtgaacagcctgggcgagaatctcaaaaccctgcgccttcgattgagaagatgccacagatttctgccatgcgaaaacaagagcaaggcagtggaacaagtgaaaaatgccttcaacaagctgcaagagaagggcatctacaaagccatgagcgagttcgacattttcatcaactacatagaggcttacatgaccatgaagatcagaaacaaccaaatgttcgatcagaagtacgacgaccctagctgcactcacttcccgggcaatctgccaaatatgttacgtaaactgcgggacgccttcagccgagttaaaactttctttcagatgaaggatcagctggacaacctgctgttaaaggagagcctgctggaggacttcaagggttatctgggctgccaagccctgagcgagatgatccaattttatctggaagaggtcatgccccaagccgaaaatcaagaccccgatattaaggcccatgtcaattctctcggggagaacctaaagaccttgcgccttcggttaagaagatgtcaccgctttctcccctgtgagaacaagtctaaggccgttgaacaagtgaagaacgccttcaataagctccaagagaaaggcatttataaggccatgtcggagttcgatatattcatcaattacatcgaggcgtatatgacaatgaagattaggaac (SEQ ID NO:53)
TP0005 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPKMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGGSGSGSGSGSCTHFPGNLPKMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:27) agccccggccaaggcacacagagcgagaactcatgtacccattttcccgggaacctgcccaagatgctgcgggacctgagagacgccttcagcagagtgaagactttctttcagatgaaggatcagctggacaaccttttactgaaggagagtctgctagaagacttcaagggatacctgggctgtcaagccttgtcggagatgattcaattctacctggaagaagtgatgccccaagctgagaaccaagaccccgatatcaaggcccatgtgaacagcctgggcgagaatctcaaaaccctgcgcttaaggctcagaagatgccacagatttctgccatgcgaaaacaagagcaaggcagtggaacaagtgaaaaacgccttcaacaagctgcaagagaagggcatctacaaagccatgagcgagttcgacattttcatcaactatattgaggcctacatgacgatgaagattcgaaatggcggagggtcgggctccggctctggcagcggctcctgcacccatttccccggcaacctgcccaaaatgctgagagacctgcgtgacgccttctctagagtaaaaaccttctttcagatgaaggatcagctggacaacttgttactgaaggagagcctgctcgaggacttcaaaggctacctgggctgccaagccctgagcgagatgattcagttttaccttgaagaggtgatgccccaagccgagaaccaagaccccgacatcaaagcccacgtcaactcgctgggcgaaaacctgaagactcttcggttgagacttcgaagatgtcatcggttcttgccctgcgagaataagagcaaggcggtggagcaagtgaagaacgcattcaataagctgcaagagaaaggtatctacaaggctatgagcgaatttgacatctttattaattacatcgaggcctatatgaccatgaaaatcagaaatg (SEQ ID NO:54)
TP0006 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPKMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNTSPGQGTQSENSCTHFPGNLPKMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:28) agtcccggacaaggcacacagagcgagaacagctgcacgcatttccccggcaacctgcccaagatgctgcgtgatctcagagatgctttcagcagagtgaaaacgttcttccaaatgaaagaccaactcgataacctgttgcttaaggagtcactgctggaagatttcaaaggctatcttggctgtcaagccctgagcgaaatgatacagttctacctggaagaggtgatgcctcaagccgagaaccaagacccggatattaaggcccatgtaaattccctgggcgagaacctgaaaaccctcagactaagactgcgacgatgtcatagattcctaccctgtgaaaacaaatctaaggccgtggagcaagtgaagaatgcttttaacaaactgcaagagaagggcatttacaaggccatgagcgaatttgacatcttcatcaattacatcgaagcctacatgaccatgaaaattagaaacacgtcacccggccaaggcacacagtctgaaaacagctgcacccactttcccggcaaccttcccaagatgttgcgagacctgagagacgcctttagccgcgtgaaaaccttcttccaaatgaaagatcagctggacaatctgctgctcaaggaaagcctgctcgaggacttcaagggctacctcggctgccaagccctcagcgagatgattcagttttaccttgaagaagtcatgcctcaagccgaaaaccaagaccccgatataaaagcccatgtgaacagcttgggcgagaacttaaagaccctgagattaagattacggcggtgccaccgattcttgccgtgcgagaacaagtcaaaggcggtcgagcaagtgaagaatgcattcaataaattacaagagaagggcatctataaggctatgagtgagttcgatattttcatcaactatatcgaggcttacatgacaatgaaaatcagaaac (SEQ ID NO:55)
TP0007 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPKMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNNQMFDQKYDDPSCTHFPGNLPKMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:29) tcacccggccaaggcacacagagcgagaactcctgcacccacttccccgggaacttgcccaagatgctgcgcgacctgagagatgccttcagcagagtgaagactttctttcagatgaaggatcagcttgacaaccttctcctgaaggagagtctgctagaagacttcaagggatacctgggctgtcaagccttgtcggagatgattcagttttatctggaagaggtgatgccccaagctgagaatcaagaccccgacatcaaagcccatgtgaacagcctgggcgagaatctcaaaaccctgcgccttcgattgagaagatgccacagatttctgccatgcgaaaacaagagcaaggcagtggaacaagtgaaaaatgccttcaacaagctgcaagagaagggcatctacaaagccatgagcgagttcgacattttcatcaactacatagaggcttacatgaccatgaagatcagaaacaaccaaatgttcgatcagaagtacgacgaccctagctgcactcacttcccgggcaatctgccaaaaatgttacgtgatctgcgggacgccttcagccgagttaaaactttctttcagatgaaggatcagctggacaacctgctgttaaaggagagcctgctggaggacttcaagggttatctgggctgccaagccctgagcgagatgatccaattttatctggaagaggtcatgccccaagccgaaaatcaagaccccgatattaaggcccatgtcaattctctcggggagaacctaaagaccttgcgccttcggttaagaagatgtcaccgctttctcccctgtgagaacaagtctaaggccgttgaacaagtgaagaacgccttcaataagctccaagagaaaggcatttataaggccatgtcggagttcgatatattcatcaattacatcgaggcgtatatgacaatgaagattaggaac (SEQ ID NO:56)
TP0008 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNALRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGGSGSGSGSGSCTHFPGNLPNALRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:30) agccccggccaaggcacacagagcgagaactcctgcacccacttccccgggaacctgcccaacgccctgcgggacctgagagacgccttcagcagagtgaagactttctttcagatgaaggatcagctggacaaccttcttctgaaggagagtctgctagaagacttcaaaggttacctgggctgtcaagccttgtcggagatgattcagttttatctggaagaggtcatgccccaagccgagaaccaagaccccgatatcaaagcccacgtaaatagcctgggagagaatctcaaaaccttacggcttcgactgagaagatgccacagatttctgccatgtgaaaacaaaagcaaagcagtggaacaagtgaaaaacgccttcaacaagctgcaagagaagggcatctataaagccatgagcgagttcgacattttcatcaattacatcgaggcctacatgaccatgaaaatcagaaacgggggcggctccggctctggcagcggcagcggtagttgcacccatttccccggcaacctgcccaatgcgctgagagacctaagagacgcctttagccgagttaagaccttctttcagatgaaggaccaactggacaacttactgctgaaggagagcctcctggaggactttaagggttatctgggttgccaagcccttagcgagatgatccaattctatctggaggaagtgatgccccaagcagagaatcaagaccccgacataaaggcccatgtcaacagcctgggggaaaacctgaaaacgctccgacttagattacggcgctgtcatagatttctgccctgcgaaaacaagtccaaggcggtggagcaagtgaagaatgcctttaacaagttacaagagaaaggcatctacaaagccatgtcggagttcgacatattcattaactacattgaagcatatatgaccatgaagatcagaaac (SEQ ID NO:57)
TP0009 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNALRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNTSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNALRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:31) agtcccggacaaggcacacagagcgagaacagctgcacgcatttccccggcaacctgcccaacgccctgcgtgatctcagagatgctttcagcagagtgaaaacgttcttccaaatgaaagaccaactcgataacctgttgcttaaggagtcactgctggaagatttcaaaggctatcttggctgtcaagccctgagcgaaatgatacagttctacctggaagaggtgatgcctcaagccgagaaccaagacccggatattaaggcccatgtaaattccctgggcgagaacctgaaaaccctcagactaagactgcgacgatgtcatagattcctaccctgtgaaaacaaatctaaggccgtggagcaagtgaagaatgcttttaacaaactgcaagagaagggcatttacaaggccatgagcgaatttgacatcttcatcaattacatcgaagcctacatgaccatgaaaattagaaacacgtcacccggccaaggcacacagtctgaaaacagctgcacccactttcccggcaaccttcccaacgccttgcgagacctgagagacgcctttagccgcgtgaaaaccttcttccaaatgaaagatcagctggacaatctgctgctcaaggaaagcctgctcgaggacttcaagggctacctcggctgccaagccctcagcgagatgattcagttttaccttgaagaagtcatgcctcaagccgaaaaccaagaccccgatataaaagcccatgtgaacagcttgggcgagaacttaaagaccctgagattaagattacggcggtgccaccgattcttgccgtgcgagaacaagtcaaaggcggtcgagcaagtgaagaatgcattcaataaattacaagagaagggcatctataaggctatgagtgagttcgatattttcatcaactatatcgaggcttacatgacaatgaaaatcagaaac (SEQ ID NO:58)
TP0010 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNALRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNNQMFDQKYDDPSCTHFPGNLPNALRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:32) tcacccggccaaggcacacagagcgagaactcctgcacccacttccccgggaacttgcccaacgccctgcgcgacctgagagatgccttcagcagagtgaagactttctttcagatgaaggatcagcttgacaaccttctcctgaaggagagtctgctagaagacttcaagggatacctgggctgtcaagccttgtcggagatgattcagttttatctggaagaggtgatgccccaagctgagaatcaagaccccgacatcaaagcccatgtgaacagcctgggcgagaatctcaaaaccctgcgccttcgattgagaagatgccacagatttctgccatgcgaaaacaagagcaaggcagtggaacaagtgaaaaatgccttcaacaagctgcaagagaagggcatctacaaagccatgagcgagttcgacattttcatcaactacatagaggcttacatgaccatgaagatcagaaacaaccaaatgttcgatcagaagtacgacgaccctagctgcactcacttcccgggcaatctgccaaatgccttacgtgatctgcgggacgccttcagccgagttaaaactttctttcagatgaaggatcagctggacaacctgctgttaaaggagagcctgctggaggacttcaagggttatctgggctgccaagccctgagcgagatgatccaattttatctggaagaggtcatgccccaagccgaaaatcaagaccccgatattaaggcccatgtcaattctctcggggagaacctaaagaccttgcgccttcggttaagaagatgtcaccgctttctcccctgtgagaacaagtctaaggccgttgaacaagtgaagaacgccttcaataagctccaagagaaaggcatttataaggccatgtcggagttcgatatattcatcaattacatcgaggcgtatatgacaatgaagattaggaac (SEQ ID NO:59)
TP0011 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNSLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGGSGSGSGSGSCTHFPGNLPNSLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:33) agccccggccaaggcacacagagcgagaactcctgcacccacttccccgggaacctgcccaacagcctgcgggacctgagagacgccttcagcagagtgaagactttctttcagatgaaggatcagctggacaaccttcttctgaaggagagtctgctagaagacttcaaaggctatctaggctgtcaagccttgtcggagatgattcagttttatctggaagaggttatgccccaagccgagaaccaagaccccgatatcaaagcgcatgtcaatagcctgggcgagaatctcaaaaccttacggcttcgactgagaagatgccacagatttctgccatgcgagaacaagagcaaggctgtggaacaagtgaaaaacgccttcaacaagctgcaagagaagggaatctacaaagcaatgagcgagttcgacattttcatcaattacatcgaggcctacatgaccatgaaaatcagaaacgggggcggctccggctctggcagcggcagcggttcctgcacccatttccccggcaacctgcccaattccctgagagacctaagagacgcctttagccgagttaagaccttctttcagatgaaggatcagcttgacaacttactgctgaaggagagcctcctggaggactttaagggctacctaggttgtcaagcactgagcgagatgatccaattctatctggaagaggtgatgccccaagctgaaaaccaagaccccgacataaaggcccatgtgaactcactgggggagaacctgaaaacgctccgacttagattacggcgctgtcatagatttctgccctgcgaaaacaagagcaaagccgtggagcaagtgaagaatgcctttaacaagttacaagagaaaggcatctacaaagccatgtcggagttcgacatattcattaactacattgaagcatatatgaccatgaagatcagaaac (SEQ ID NO:60)
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SS0052 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:43) agccccggccagggtacacagtcagagaatagttgcacacactttcctggcaatctgcctaatatgctacgcgatctcagggatgccttttctcgcgttaaaacttttttccaaatgaaggaccagcttgataacctgctactcaaagaaagccttttggaggattttaaggggtacctgggttgccaggccctgtcggaaatgattcagttttatttggaggaggtgatgccccaggcagaaaaccaagatcctgacatcaaggcacatgtaaattcccttggagagaacctcaaaacactccgtcttaggctccgacgctgccatcgattcctgccttgcgagaacaagtccaaggcagtggagcaagtcaagaacgcctttaataaattacaagagaagggcatctacaaagcgatgtccgagtttgacatcttcattaactacattgaagcttacatgaccatgaaaataaggaacagcccgggacagggcacccagagtgaaaactcttgtacgcacttccccgggaatctgcccaacatgctgagagatctgcgggacgccttctcaagagtgaagaccttcttccaaatgaaagaccagttggacaatctgctgctgaaggaaagcttattagaggatttcaaaggctatctaggatgtcaggctctgtcagaaatgatccagttctatctggaggaggtgatgccacaggccgagaatcaggacccagacattaaagcgcacgtcaattctctgggagaaaacctcaagactctccggttgcggctgagacggtgtcatagattcttgccatgtgaaaacaagtccaaagctgttgaacaggtgaaaaatgctttcaataagcttcaggaaaaggggatctacaaggccatgagtgagtttgacatatttatcaactacattgaggcatatatgaccatgaagatcaggaac (SEQ ID NO:70)
SS0053 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:44) agtcccggacaaggcacacagagcgagaacagctgcacgcatttccccggcaacctgcccaacatgctgcgtgatctcagagatgctttcagcagagtgaaaacgttcttccaaatgaaagaccaactcgataacctgttgcttaaggagtcactgctggaagatttcaaaggctatcttggctgtcaagccctgagcgaaatgatacagttctacctggaagaggtgatgcctcaagccgagaaccaagacccggatattaaggcccatgtaaattccctgggcgagaacctgaaactgctcagactaagactgcgacgatgtcatagattcctaccctgtgaaaacaaatctaaggccgtggagcaagtgaagaatgcttttaacaaactgcaagagaagggcatttacaaggccatgagcgaatttgacatcttcatcaattacatcgaagcctacatgaccatgaaaattagaaactcacccggccaaggcacacagtctgaaaacagctgcacccactttcccggcaaccttcccaacatgttgcgagacctgagagacgcctttagccgcgtgaaaaccttcttccaaatgaaagatcagctggacaatctgctgctcaaggaaagcctgctcgaggacttcaagggctacctcggctgccaagccctcagcgagatgattcagttttaccttgaagaagtcatgcctcaagccgaaaaccaagaccccgatataaaagcccatgtgaacagcttgggcgagaacttaaagctgctgagattaagattacggcggtgccaccgattcttgccgtgcgagaacaagtcaaaggcggtcgagcaagtgaagaatgcattcaataaattacaagagaagggcatctataaggctatgagtgagttcgatattttcatcaactatatcgaggcttacatgacaatgaaaatcagaaac (SEQ ID NO:71)
DR1063 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGSGSGSGSGSGSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:45) agcccaggacagggaactcagagcgaaaactcttgtacacactttcctggaaatctgcccaacatgctgcgcgacctcagagatgccttcagccgcgtgaaaaccttcttccagatgaaggaccaactcgataacttgctgttaaaggaaagcctgttggaagatttcaagggctacctaggttgtcaggcattgtccgaaatgatacagttttacttggaggaagtcatgccccaagcagagaaccaagaccctgatatcaaagcccacgtgaatagtctcggagagaatttaaaaactctgcggctcagactccgacgatgtcataggtttctgccgtgcgagaacaagtcaaaggcagtggagcaggtaaagaacgcgttcaataagcttcaggaaaaagggatctacaaagctatgtctgagtttgacatctttataaattatatcgaggcttatatgacaatgaaaatcaggaatgggtccggttcgggctccggtagtgggtctggctcctgcacccatttccctggaaacctgccaaatatgctgcgggatctgcgtgacgcctttagcagagtgaagaccttcttccagatgaaagaccagctggacaacttgctactgaaggagtcacttctggaagactttaaagggtacctgggctgccaagccctgtccgagatgattcagttctacttagaagaagtgatgccccaggccgaaaatcaggacccagatattaaagctcatgttaacagtctaggcgagaatcttaaaacactccggctccggcttaggcgctgccacagatttcttccctgtgagaataagtctaaggcggttgagcaagtcaaaaacgctttcaataagctgcaggagaagggcatctataaggcaatgagcgagtttgatattttcattaactatatcgaagcctacatgacgatgaagattaggaac (SEQ ID NO:72)
DR1064 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGSGSGSGSSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:46) agccctggccaaggcacccagagcgaaaacagctgtacccatttcccgggcaatctgcccaatatgctccgcgatctaagagatgcattttcccgggtcaagacattctttcagatgaaggaccaactggataatttgcttctgaaggaatccctcctcgaagatttcaagggttacttggggtgccaggcactgtctgagatgatacagttctacctagaagaggttatgccacaagcggaaaatcaggacccagacattaaggcacacgtgaactctttaggtgagaacttgaagacactccggcttcggctccgtcgatgccatcgcttccttccatgtgagaacaagtccaaggctgttgagcaagtgaagaacgcttttaataaactacaggagaaaggcatctacaaggccatgtcagagtttgatattttcatcaattacatcgaagcctacatgacgatgaaaatcaggaatggaagcggttcgggatctgggagctcatgtactcatttccccggcaacctgcccaatatgctcagggacctcagagacgcctttagccgcgtgaaaaccttctttcagatgaaagaccagcttgacaacttgctgctgaaggaaagtttgttagaggatttcaaaggatacctggggtgtcaggccctgtccgaaatgatccaattttatctggaggaggtaatgcctcaggccgagaatcaggaccccgatattaaagcacacgtgaatagtctgggagaaaacttaaagactctgcgactgagactgaggaggtgccacagattcctgccttgcgaaaataaaagtaaagctgtcgagcaggtgaagaacgccttcaacaagcttcaggagaaggggatttataaagcgatgtctgagtttgacatatttattaactatatcgaagcttatatgacaatgaaaatccggaac (SEQ ID NO:73)
DR1065 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNTSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:47) agccccggccagggtacacagtcagagaatagttgcacacactttcctggcaatctgcctaatatgctacgcgatctcagggatgccttttctcgcgttaaaacttttttccaaatgaaggaccagcttgataacctgctactcaaagaaagccttttggaggattttaaggggtacctgggttgccaggccctgtcggaaatgattcagttttatttggaggaggtgatgccccaggcagaaaaccaagatcctgacatcaaggcacatgtaaattcccttggagagaacctcaaaacactccgtcttaggctccgacgctgccatcgattcctgccttgcgagaacaagtccaaggcagtggagcaagtcaagaacgcctttaataaattacaagagaagggcatctacaaagcgatgtccgagtttgacatcttcattaactacattgaagcttacatgaccatgaaaataaggaacactagcccgggacagggcacccagagtgaaaactcttgtacgcacttccccgggaatctgcccaacatgctgagagatctgcgggacgccttctcaagagtgaagaccttcttccaaatgaaagaccagttggacaatctgctgctgaaggaaagcttattagaggatttcaaaggctatctaggatgtcaggctctgtcagaaatgatccagttctatctggaggaggtgatgccacaggccgagaatcaggacccagacattaaagcgcacgtcaattctctgggagaaaacctcaagactctccggttgcggctgagacggtgtcatagattcttgccatgtgaaaacaagtccaaagctgttgaacaggtgaaaaatgctttcaataagcttcaggaaaaggggatctacaaggccatgagtgagtttgacatatttatcaactacattgaggcatatatgaccatgaagatcaggaac (SEQ ID NO:74)
DR1066 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:48) agccctgggcagggcacacaaagcgaaaactcttgtacccatttcccagggaatctccccaacatgctgcgagatctgagggatgctttcagtagggtgaagacctttttccaaatgaaggaccagctcgacaatctgttattaaaagagtcactgctggaggacttcaaaggctacttgggctgccaggctctgagtgaaatgatccagttctatttggaggaggttatgccccaagcagagaaccaggaccccgatatcaaggcgcacgtcaattccctaggcgagaatctcaagacgcttcggcttcgcctgcgccggtgccacaggtttctgccatgcgagaataagtcaaaggcggttgaacaggtgaagaacgccttcaacaaactccaggagaaaggaatctacaaggctatgtccgaatttgatatattcattaactatatcgaagcctacatgactatgaaaattagaaatggacaaggaacacagagcgagaactcttgtacccattttcctggtaatttacccaacatgctgagagacctgagggatgcattctccagagtgaagactttttttcagatgaaagaccagctcgataatctcctgctcaaagaaagtctactagaggatttcaagggctacctgggatgtcaggccctgagcgaaatgatccagttttatttggaagaggtgatgccgcaggctgagaatcaagaccctgacattaaggcccacgtcaactctctgggtgagaaccttaagacacttcggcttcgactgcggcgctgccatcgtttcttgccatgtgagaacaaatccaaagccgtagaacaggtgaagaatgcatttaacaaattgcaggagaaagggatatataaggcaatgtcggaatttgacatcttcatcaactacattgaagcctacatgaccatgaagattagaaat (SEQ ID NO:75)
DR1067 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNTKPEPMDQYPSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:49) agcccaggacagggaacacagtccgaaaattcatgtacccacttcccggggaatctccccaatatgcttcgagacctgagggatgcgttctctagagttaagaccttcttccagatgaaggatcagttggataatctgctgctgaaggagagcctgctggaggattttaaagggtatttaggttgtcaagccctgtccgaaatgatccaattctaccttgaggaagtgatgcctcaggcagagaatcaagatcccgacatcaaggctcacgtgaactccctaggtgagaacctgaagaccttaaggttgagattgcgccggtgccataggttcctcccttgtgaaaataagagcaaagctgtcgaacaggtgaaaaacgcgtttaacaaactgcaggaaaaaggcatctacaaggcaatgtctgagttcgacatcttcataaactacatcgaggcttatatgactatgaaaattagaaacacaaaacccgagcccatggatcagtatccttcttgcacgcactttccgggcaacctcccaaacatgttacgcgatctgagggacgcatttagtcgcgtaaaaacctttttccagatgaaggaccagcttgacaatctcctgttgaaggagagtctgcttgaagattttaaaggatacctggggtgccaagccctctccgaaatgattcagttctatctggaagaggttatgccacaggccgagaatcaagacccagacattaaggctcatgtgaatagcctcggcgagaaccttaagacactgcgtctccggttgcgaagatgccatcggtttctaccttgtgaaaataaatcaaaggccgtggagcaggtcaagaacgccttcaacaagctacaggagaaaggcatatataaagcaatgtcggagtttgacatctttattaattacatcgaagcctacatgactatgaagattcggaac (SEQ ID NO:76)
DR1068 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNNQMFDQKYDDPSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:50) tctccaggccagggcacgcaatctgaaaatagctgcacacattttcctggcaacctccccaacatgcttagagacttaagggacgcatttagcagggttaagacattcttccagatgaaggatcagttggataatctcctcctgaaagagtccctactagaggactttaagggatacttaggttgtcaagccctgagcgaaatgatccagttctacctggaagaagtgatgccccaggccgagaaccaagatccagatattaaagcgcacgtcaactccctgggagaaaacctcaaaactctgcgcctgaggcttagacgctgtcatcgattcctgccgtgcgagaataaatcgaaggcggtggagcaagtgaaaaacgcttttaacaagttgcaggaaaaaggtatctacaaagctatgagcgagtttgacattttcataaactatatcgaggcttatatgaccatgaagatccggaacaaccaaatgtttgaccagaaatatgacgacccatcctgtacccatttccctgggaatctccctaacatgctcagagacctgcgggatgccttctcccgcgttaaaaccttttttcagatgaaggatcagttggataatctgcttctcaaggagtctcttcttgaagacttcaagggatacctggggtgccaggccctgtcagaaatgattcagttctatctagaggaggtgatgcctcaggctgagaatcaggaccccgatattaaagcccacgtcaacagtctgggggaaaatctgaagacactgcggttaaggttgcggcgatgtcacagattcttgccctgcgaaaataagtcaaaagcagtagagcaggtgaaaaacgcatttaataagctgcaggaaaagggcatttacaaggccatgagtgagttcgatatctttataaattacatcgaggcatatatgactatgaagatccgtaat (SEQ ID NO:77)
SENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNTSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:119) tcagagaatagttgcacacactttcctggcaatctgcctaatatgctacgcgatctcagggatgccttttctcgcgttaaaacttttttccaaatgaaggaccagcttgataacctgctactcaaagaaagccttttggaggattttaaggggtacctgggttgccaggccctgtcggaaatgattcagttttatttggaggaggtgatgccccaggcagaaaaccaagatcctgacatcaaggcacatgtaaattcccttggagagaacctcaaaacactccgtcttaggctccgacgctgccatcgattcctgccttgcgagaacaagtccaaggcagtggagcaagtcaagaacgcctttaataaattacaagagaagggcatctacaaagcgatgtccgagtttgacatcttcattaactacattgaagcttacatgaccatgaaaataaggaacactagcccgggacagggcacccagagtgaaaactcttgtacgcacttccccgggaatctgcccaacatgctgagagatctgcgggacgccttctcaagagtgaagaccttcttccaaatgaaagaccagttggacaatctgctgctgaaggaaagcttattagaggatttcaaaggctatctaggatgtcaggctctgtcagaaatgatccagttctatctggaggaggtgatgccacaggccgagaatcaggacccagacattaaagcgcacgtcaattctctgggagaaaacctcaagactctccggttgcggctgagacggtgtcatagattcttgccatgtgaaaacaagtccaaagctgttgaacaggtgaaaaatgctttcaataagcttcaggaaaaggggatctacaaggccatgagtgagtttgacatatttatcaactacattgaggcatatatgaccatgaagatcaggaac (SEQ ID NO:120)
本揭示提供一種式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合IL10多肽，其與表2之多肽序列中之任一者具有至少90%，或者至少91%，或者至少92%，或者至少93%，或者至少94%，或者至少95%，或者至少96%，或者至少97%，或者至少98%，或者至少99%或100%序列一致性。本揭示提供一種式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合IL10多肽，其與表2A之多肽序列中之任一者具有至少90%，或者至少91%，或者至少92%，或者至少93%，或者至少94%，或者至少95%，或者至少96%，或者至少97%，或者至少98%，或者至少99%或100%序列一致性。在一些實施例中，式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合IL10多肽為與選自由以下組成之群的多肽具有至少90%，或者至少91%，或者至少92%，或者至少93%，或者至少94%，或者至少95%，或者至少96%，或者至少97%，或者至少98%，或者至少99%或100%序列一致性的多肽：SEQ ID NO: 157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170及171。在一些實施例中，式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合IL10多肽為選自由以下組成之群的多肽：SEQ ID NO: 157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170及171。在一些實施例中，式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合IL10多肽為SEQ ID NO: 159。在一些實施例中，式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合IL10多肽為SEQ ID NO: 160。在一些實施例中，式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合IL10多肽為SEQ ID NO: 165。在一些實施例中，式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合IL10多肽為SEQ ID NO: 170。
表2A
SEQ ID# 描述 hIL10突變蛋白融合二聚體序列
157 hIL10 N21D 融合同二聚體 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPDMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPDMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:157)
158 hIL10 N21E 融合同二聚體 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPEMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPEMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:158)
159 hIL10 N21K 融合同二聚體 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPKMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPKMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:159)
160 hIL10 M22A 融合同二聚體 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPDALRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPDALRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:160)
161 hIL10 M22S 融合同二聚體 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPDSLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPDSLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:161)
162 hIL10 M22T 融合同二聚體 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPDTLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPDTLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:162)
163 hIL10 M22D 融合同二聚體 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPDDLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPDDLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:163)
164 hIL10 M22W 融合同二聚體 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPDWLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPDWLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:164)
165 hIL10 R24E 融合同二聚體 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLEDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLEDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:165)
166 hIL10 D25K 融合同二聚體 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRKLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRKLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:166)
167 hIL10 E96K 融合同二聚體 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGKNLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGKNLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:167)
168 hIL10 E96Q 融合同二聚體 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGQNLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGQNLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:168)
169 hIL10 T100E 融合同二聚體 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKELRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKELRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:169)
170 hIL10 T100L 融合同二聚體 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:170)
171 hIL10 T100C 融合同二聚體 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKCLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKCLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:171)
如本文中所論述，其中分子為融合hIL10多肽的N末端藉由直接表現(亦即，不作為融合蛋白)以重組方式產生於細菌細胞中，可缺失天然存在之N末端絲胺酸以提供N末端甲硫胺醯基殘基之高效裂解。本揭示提供一種式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合IL10多肽，其與表2B之多肽序列中之任一者具有至少90%，或者至少91%，或者至少92%，或者至少93%，或者至少94%，或者至少95%，或者至少96%，或者至少97%，或者至少98%，或者至少99%或100%序列一致性。在一些實施例中，本揭示提供一種式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合IL10多肽，其與表2B之多肽序列中之任一者具有至少90%，或者至少91%，或者至少92%，或者至少93%，或者至少94%，或者至少95%，或者至少96%，或者至少97%，或者至少98%，或者至少99%或100%序列一致性。在一些實施例中，式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合IL10多肽為與選自由以下組成之群的多肽具有至少90%，或者至少91%，或者至少92%，或者至少93%，或者至少94%，或者至少95%，或者至少96%，或者至少97%，或者至少98%，或者至少99%或100%序列一致性的多肽：SEQ ID NO: 172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185及186。在一些實施例中，式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合IL10多肽為SEQ ID NO: 174。在一些實施例中，式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合IL10多肽為SEQ ID NO: 175。在一些實施例中，式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合IL10多肽為SEQ ID NO: 180。在一些實施例中，式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合IL10多肽為SEQ ID NO: 185。在一些實施例中，式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合IL10多肽選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185及186。
表2B
SEQ ID# 描述 des-SER1- hIL10突變蛋白融合二聚體序列
172 des-SER1 hIL10 N21D/hIL10 N21D 融合異二聚體 PGQGTQSENSCTHFPGNLPDMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPDMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:172)
173 des-SER1 hIL10 N21E/hIL10 N21E 融合異二聚體 PGQGTQSENSCTHFPGNLPEMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPEMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:173)
174 des-SER1 hIL10 N21K/hIL10 N21K 融合異二聚體 PGQGTQSENSCTHFPGNLPKMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPKMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:174)
175 des-SER1 hIL10 M22A/hIL10 M22A 融合異二聚體 PGQGTQSENSCTHFPGNLPDALRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPDALRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:175)
176 des-SER1 hIL10 M22S/hIL10 M22S 融合異二聚體 PGQGTQSENSCTHFPGNLPDSLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPDSLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:176)
177 des-SER1 hIL10 M22T/hIL10 M22T 融合異二聚體 PGQGTQSENSCTHFPGNLPDTLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPDTLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:177)
178 des-SER1 hIL10 M22D/hIL10 M22D 融合異二聚體 PGQGTQSENSCTHFPGNLPDDLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPDDLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:178)
179 des-SER1 hIL10 M22W/hIL10 M22W 融合異二聚體 PGQGTQSENSCTHFPGNLPDWLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPDWLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:179)
180 des-SER1 hIL10 R24E/hIL10 R24E 融合異二聚體 PGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLEDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLEDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:180)
181 des-SER1 hIL10 D25K/hIL10 D25K 融合異二聚體 PGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRKLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRKLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:181)
182 des-SER1 hIL10 E96K/hIL10 E96K 融合異二聚體 PGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGKNLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGKNLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:182)
183 des-SER1 hIL10 E96Q/hIL10 E96Q 融合異二聚體 PGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGQNLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGQNLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:183)
184 des-SER1 hIL10 T100E/hIL10 T100E 融合異二聚體 PGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKELRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKELRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:184)
185 des-SER1 hIL10 T100L/hIL10 T100L 融合異二聚體 PGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:185)
186 des-SER1 hIL10 T100C/hIL10 T100C 融合異二聚體 PGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKCLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKCLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:186)
融合小鼠IL10多肽之實例示於下表中，其中連接子呈粗體。在一些實施例中，對於下列融合mIL10多肽序列中之各者，His標籤可與具有或不具有連接子之序列之N末端融合，亦即GGSHHHHHHHH (SEQ ID NO: 23)可與下列融合mIL10多肽之N末端融合。
表3. 例示性小鼠融合IL10多肽及編碼其之核酸
名稱 蛋白質序列 DNA序列
TP0035 QYSREDNNCTHFPVGQSHMLLELRTAFSQVKTFFQTKDQLDNILLTDSLMQDFKGYLGCQALSEMIQFYLVEVMPQAEKHGPEIKEHLNSLGEKLKTLRMRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKSDFNKLQDQGVYKAMNEFDIFINCIEAYMMIKMKSSRGQYSREDNQYSREDNNCTHFPVGQSHMLLELRTAFSQVKTFFQTKDQLDNILLTDSLMQDFKGYLGCQALSEMIQFYLVEVMPQAEKHGPEIKEHLNSLGEKLKTLRMRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKSDFNKLQDQGVYKAMNEFDIFINCIEAYMMIKMKS (SEQ ID NO:78) cagtacagcagagaagataataactgcacccacttccccgtagggcagagccatatgctgctggagctgagaacagcctttagccaagtcaagaccttcttccaaacgaaggatcagcttgacaatatactgctgaccgatagcctgatgcaagacttcaaaggttacctcggctgtcaagccctctccgagatgatccaattttacctggtggaggtgatgccgcaagccgaaaaacatggccccgagatcaaagaacatctgaacagtcttggtgaaaagctgaagaccctgcgaatgcggctgcgcagatgtcacagatttctaccgtgcgagaataagagcaaggccgtggagcaagtgaagagcgacttcaataagctgcaagaccaaggcgtttataaggcgatgaacgagttcgatatatttatcaactgcatagaagcctatatgatgatcaagatgaagagcagcagagggcagtactcgagagaggataatcagtacagccgagaagacaacaactgtacccacttccccgtgggtcaaagccacatgctgctagagctcagaacggccttcagccaagtgaagactttctttcaaaccaaggaccaactggacaacatcctgttaaccgactcactaatgcaagactttaaggggtacctgggttgccaagccctgagcgagatgattcagttctacctcgtggaggtcatgcctcaagccgaaaagcacggccccgagattaaagagcacttaaacagtctaggggagaaactgaagaccttgagaatgagattaagacggtgtcatagatttctcccctgtgagaacaaaagcaaagcggtggagcaagtgaagagcgattttaacaagctccaagatcaaggcgtatataaagcgatgaatgagttcgatatcttcattaactgcatcgaagcctatatgatgattaaaatgaaaagcgg (SEQ ID NO:88)
TP0040 QYSREDNNCTHFPVGQSHMLLELRTAFSQVKTFFQTKDQLDNILLTDSLMQDFKGYLGCQALSEMIQFYLVEVMPQAEKHGPEIKEHLNSLGEKLKLLRMRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKSDFNKLQDQGVYKAMNEFDIFINCIEAYMMIKMKSSRGQYSREDNQYSREDNNCTHFPVGQSHMLLELRTAFSQVKTFFQTKDQLDNILLTDSLMQDFKGYLGCQALSEMIQFYLVEVMPQAEKHGPEIKEHLNS LGEKLKLLRMRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKSDFNKLQDQGVYKAMNEFDIFINCIEAYMMIKMKS (SEQ ID NO:79) cagtacagcagagaagataataactgcacccacttccccgtagggcagagccatatgctgctggagctgagaacagcctttagccaagtcaagaccttcttccaaacgaaggatcagcttgacaatatactgctgaccgatagcctgatgcaagacttcaaaggttacctcggctgtcaagccctctccgagatgatccaattttacctggtggaggtgatgccgcaagccgaaaaacatggccccgagatcaaagaacatctgaacagtcttggtgaaaagctgaagctgctgcgaatgcggctgcgcagatgtcacagatttctaccgtgcgagaataagagcaaggccgtggagcaagtgaagagcgacttcaataagctgcaagaccaaggcgtttataaggcgatgaacgagttcgatatatttatcaactgcatagaagcctatatgatgatcaagatgaagagcagcagagggcagtactcgagagaggataatcagtacagccgagaagacaacaactgtacccacttccccgtgggtcaaagccacatgctgctagagctcagaacggccttcagccaagtgaagactttctttcaaaccaaggaccaactggacaacatcctgttaaccgactcactaatgcaagactttaaggggtacctgggttgccaagccctgagcgagatgattcagttctacctcgtggaggtcatgcctcaagccgaaaagcacggccccgagattaaagagcacttaaacagtctaggggagaaactgaagctgttgagaatgagattaagacggtgtcatagatttctcccctgtgagaacaaaagcaaagcggtggagcaagtgaagagcgattttaacaagctccaagatcaaggcgtatataaagcgatgaatgagttcgatatcttcattaactgcatcgaagcctatatgatgattaaaatgaaaagcgg (SEQ ID NO:89)
TP0054 QYSREDNNCTHFPVGQSHMLLELRTAFSQVKTFFQTKDQLDNILLTDSLMQDFKGYLGCQALSEMIQFYLVEVMPQAEKHGPEIKEHLNSLGEKLKLLRMRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKSDFNKLQDQGVYKAMNEFDIFINCIEAYMMIKMKSSRGQYSREDNQYSREDNNCTHFPVGQSHMLLELRTAFSQVKTFFQTKDQLDNILLTDSLMQDFKGYLGCQALSEMIQFYLVEVMPQAEKHGPEIKEHLNSLGEKLKTLRMRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKSDFNKLQDQGVYKAMNEFDIFINCIEAYMMIKMKS (SEQ ID NO:80) cagtacagcagagaagataataactgcacccacttccccgtagggcagtcacacatgctgctggagctgcggactgcctttagccaagtcaagaccttcttccaaacgaaggatcagcttgacaatatactgctgactgacagccttatgcaagacttcaaaggttacctcggctgtcaagccctctccgagatgatccaattttacctggtggaggtgatgccgcaagccgagaaacacggaccggagatcaaagaacatctgaacagtcttggtgaaaagctgaagctgctgagaatgcgcctgagaagatgccatagattcctgccctgcgagaacaagtccaaagcggttgaacaagtgaagagcgacttcaataagctgcaagaccaaggcgtgtataaggctatgaacgagttcgacatctttataaattgtatcgaggcgtacatgatgataaaaatgaaaagcagcagagggcagtactcgagagaggataatcaatacagcagagaagacaacaactgcactcactttcccgtgggtcagtcacatatgctcctggaactgagaaccgccttctcgcaagtgaagactttcttccaaaccaaggatcagctggacaacatcttgctcactgacagcctgatgcaagacttcaaaggctaccttggctgccaagccctgagcgaaatgattcagttctacctagttgaagtgatgcctcaagccgaaaagcacggccccgaaataaaggaacacctgaacagcttaggcgagaagctgaagacattgagaatgagattaagaagatgccacagattcttaccctgtgaaaataaaagcaaggcggtggagcaagtgaagagcgattttaacaagctccaagaccaaggcgtatataaagcgatgaacgagttcgacatcttcattaactgcatcgaagcatacatgatgattaagatgaagagcgg (SEQ ID NO:90)
DR2467 QYSREDNSCTHFPVGQSHMLLELRTAFSQVKTFFQTKDQLDNILLTDSLMQDFKGYLGCQALSEMIQFYLVEVMPQAEKHGPEIKEHLNSLGEKLKTLRMRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKSDFNKLQDQGVYKAMNEFDIFINCIEAYMMIKMKSSRGQYSREDNQYSREDNSCTHFPVGQSHMLLELRTAFSQVKTFFQTKDQLDNILLTDSLMQDFKGYLGCQALSEMIQFYLVEVMPQAEKHGPEIKEHLNSLGEKLKTLRMRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKSDFNKLQDQGVYKAMNEFDIFINCIEAYMMIKMKS (SEQ ID NO:81) caatactcaagagaagataacagttgcacacatttccccgtagggcaaagtcacatgctgttggaattgcgcactgcattttctcaggtaaaaacctttttccaaaccaaagaccagcttgataacattcttctgaccgactcacttatgcaggacttcaaaggctaccttggctgccaagccctttctgaaatgatacaattctacttggtcgaggtcatgcctcaggcagaaaagcatggtccagaaatcaaagaacatttgaactccctgggagagaagcttaaaactcttaggatgcgccttcggagatgccatcgctttcttccatgcgagaataaaagcaaggccgtcgaacaagtaaagtccgactttaataagctgcaagaccaaggtgtctataaagcaatgaacgaatttgacatctttatcaattgtattgaggcctatatgatgatcaaaatgaaaagttcccgcgggcaatactcacgggaggacaatcaatattcccgagaagataattcttgtacccacttccccgtcggtcaaagccacatgcttcttgagctcagaactgcattctcccaagtcaagacttttttccaaacaaaagatcaacttgacaacatcctcttgactgactccttgatgcaagacttcaaaggttacctcggctgtcaagctctcagtgagatgattcaattctatttggtagaggttatgcctcaagccgagaagcatgggccagaaatcaaagagcaccttaactccctgggtgaaaaactcaagacccttcggatgaggcttcgcagatgtcaccggttcctcccatgcgagaataagtccaaggctgttgagcaagtgaaatcagacttcaacaaattgcaagaccaaggagtttacaaagcaatgaatgagttcgatatctttattaactgtatcgaagcatacatgatgattaaaatgaagagc (SEQ ID NO:91)
WC163 GNCTHFPVGQSHMLLELRTAFSQVKTFFQTKDQLDNILLTDSLMQDFKGYLGCQALSEMIQFYLVEVMPQAEKHGPEIKEHLNSLGEKLKTLRMRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKSDFNKLQDQGVYKAMNEFDIFINCIEAYMMIKMKSSRGQYSREDNQYSREDNSCTHFPVGQSHMLLELRTAFSQVKTFFQTKDQLDNILLTDSLMQDFKGYLGCQALSEMIQFYLVEVMPQAEKHGPEIKEHLNSLGEKLKTLRMRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKSDFNKLQDQGVYKAMNEFDIFINCIEAYMMIKMKS (SEQ ID NO:82) ggcaactgtactcatttcccagtggggcaaagccatatgttgttggaattgcgcactgctttctctcaggtcaaaacattttttcagacaaaagaccaattggacaacattttattgacagatagtctgatgcaggattttaaggggtacttgggttgtcaagctctttctgaaatgatccagttttatctggttgaagttatgccacaggcggaaaagcacggaccggagatcaaggaacatttaaattcactgggcgaaaaacttaagactctgcgcatgcgcctgcgccgctgtcaccgttttctgccatgtgaaaataagtccaaggccgtagaacaggtgaaatctgacttcaacaaactgcaggaccagggggtgtacaaagcaatgaatgagtttgatatttttatcaattgtattgaagcctatatgatgatcaagatgaaatcatctcgcggtcaatacagccgcgaagacaaccagtattcacgtgaggacaattcgtgcacccacttcccggtgggccaatcgcatatgctgctggagttacgcacagccttctcgcaggtgaagactttttttcagactaaggatcagctggataatatcctgttgaccgattcattaatgcaagatttcaagggttacctgggttgccaggcgttatccgagatgattcaattctacttagtagaagtgatgccccaggctgaaaaacacggtcctgagattaaagagcacttgaacagtttgggagaaaagctgaagactcttcgtatgcgtctgcgccgctgccatcgctttttgccctgtgagaataaatccaaggccgtcgagcaggttaagtctgatttcaacaaattacaggatcaaggggtttacaaagcgatgaatgagtttgacatctttattaattgtatcgaggcttatatgatgattaagatgaagagtgg (SEQ ID NO:92)
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DR2678 EYSREDNNCTHFPVGQSHMLLELRTAFSQVKTFFQTKDQLDNILLTDSLMQDFKGYLGCQALSEMIQFYLVEVMPQAEKHGPEIKEHLNSLGEKLKLLRMRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKSDFNKLQDQGVYKAMNEFDIFINCIEAYMMIKMKSSRGQYSREDNNCTHFPVGQSHMLLELRTAFSQVKTFFQTKDQLDNILLTDSLMQDFKGYLGCQALSEMIQFYLVEVMPQAEKHGPEIKEHLNSLGEKLKLLRMRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKSDFNKLQDQGVYKAMNEFDIFINCIEAYMMIKMKS (SEQ ID NO:87) gagtattctcgggaggacaataattgcacccacttccctgtcggccagagccacatgcttctggagcttagaactgccttttcccaggttaagacattctttcaaaccaaggatcagctggacaacatcttgctgactgactctctgatgcaggacttcaaaggctatcttggttgccaggccctgtccgagatgatccagttctatctggtcgaagtgatgccacaggcagaaaagcatggccctgagatcaaggagcacctcaattccctgggcgaaaagctgaagctcctgcggatgcgtctgcgcagatgccatagattcctgccgtgtgagaacaagtctaaagccgtggagcaggtcaagagcgatttcaacaagctccaggaccagggggtttacaaggccatgaacgagttcgatatcttcattaactgcatcgaagcctacatgatgattaagatgaagtctagtagaggacagtacagcagagaggacaataactgcacacacttcccggtgggccagagtcacatgctgttggagctgcgcacggccttttcccaggtgaaaacttttttccagacgaaggaccagctcgataatatcctcttgaccgacagcctcatgcaggactttaaaggctacctgggctgtcaggctctctccgagatgatccagttctacctcgtcgaggtgatgccccaggcggagaagcacggtcctgagatcaaggagcacctgaactccctgggcgagaagctgaaactcttgcgtatgcgcctgcggcgttgtcacagatttctcccttgtgaaaacaagagcaaggctgttgaacaggtgaaatccgacttcaacaaacttcaagaccagggcgtctacaaggccatgaacgaatttgacatcttcataaattgcattgaagcctatatgatgattaagatgaagtcag (SEQ ID NO:97)
此外，視併入hIL10A或hIL10B次單元中之特定突變而定，本揭示之hIL10突變蛋白及含有hIL10突變蛋白之融合hIL10多肽可展現差異表現或熱穩定性。相較於在其他胺基酸位置處具有取代型突變或在相同位置處具有不同胺基酸取代之hIL10突變蛋白，hIL10突變蛋白及含有hIL10突變蛋白之融合hIL10多肽(其中hIL10突變蛋白包括T100L、N21K、M22A或R24E突變)可展現提高之表現或熱穩定性。 偏差活性
發炎反應為哺乳動物對感染性及/或損傷性刺激作出反應而起始的一系列生物事件，旨在減輕全身性感染的可能性。通常，哺乳動物發炎反應由骨髓細胞介導，尤其藉由外來刺激活化之巨噬細胞，例如細菌細胞壁之組分，諸如革蘭氏陰性細菌之脂多醣(「LPS」)。活化骨髓細胞藉由分泌起始及/或介導與發炎反應相關之多個生物程序的各種促發炎信號傳導分子來充當感染及/或損傷之前兆，該等信號傳導分子包括但不限於介白素-6 (IL6)、介白素-1 (IL1，尤其IL1β)及腫瘤壞死因子α (TNFα)。
儘管發炎反應對於保護哺乳動物個體免於感染至關重要，但免疫細胞(尤其骨髓細胞)之過度及/或慢性活化與組織損傷、器官功能障礙及自體免疫疾病相關。廣泛多種人類疾病與過度及/或慢性發炎相關，包括但不限於發炎性腸道疾病(IBD)、類風濕性關節炎(RA)、阿茲海默氏病(alzheimer's disease)、哮喘、1型及2型糖尿病，及癌症。個體產生某些分子，例如IL10，其作用(除其他活性之外)為抑制發炎反應，以防止與過度發炎相關之不利影響。小鼠及人類兩者中IL10之基因缺失與重度發炎性腸道疾病(IBD)相關。 IL10之表現及分泌與抑制免疫細胞中之發炎反應相關，包括但不限於抑制促發炎細胞介素之表現及/或分泌及藉由活化骨髓細胞之抗原呈遞。儘管在抑制發炎反應方面發揮主要作用，但IL10亦與促發炎活性相關，尤其在活化CD8+ T細胞中。觀測到活化CD8+ T細胞與IL10之接觸引起促發炎細胞介素干擾素-γ (IFNγ)之分泌增強以及溶胞因子(諸如顆粒酶A及顆粒酶B)之釋放。此等競爭性的促發炎及抗發炎作用對IL10在治療哺乳動物個體之發炎性疾病方面的治療用途提出了挑戰。
在一些實施例中，本揭示之融合hIL10多肽相對於野生型IL10展現細胞類型偏差活性。如本文所使用，當在融合IL10多肽之上下文中使用時，術語「偏差」用於指示相對於融合IL10多肽衍生自之野生型IL10物種，相較於第二細胞類型中野生型IL10之活性程度，融合IL10多肽在第一細胞類型中展現的野生型IL10之活性程度分率更大。在一個實施例中，第一細胞類型為骨髓來源之細胞，包括骨髓細胞。在一些實施例中，骨髓細胞選自骨髓球、顆粒球(例如嗜中性球、嗜酸性球或嗜鹼性球)、肥胖細胞或單核球。在一些實施例中，單核球為巨噬細胞或樹突狀細胞。在一些實施例中，巨噬細胞為庫弗(Kupffer)細胞。在一個實施例中，第一細胞類型為活化骨髓細胞。在一個實施例中，第一細胞類型為LPS活化之人類骨髓細胞。在一些實施例中，第二細胞類型為T細胞。
在一些實施例中，本揭示之融合IL10多肽以細胞類型依賴性方式抑制促發炎反應及/或STAT3介導之信號傳導，使得抑制發炎性巨噬細胞活化，而不會實質上促進藉由T細胞產生發炎性細胞介素，諸如干擾素-γ。在一些實施例中，本揭示之融合hIL10多肽保持野生型hIL10之免疫抑制功能，諸如抑制發炎性細胞介素之產生，同時減少野生型hIL10之免疫刺激功能，諸如藉由CD8 +T細胞產生IFNγ。舉例而言，在一些實施例中，本揭示之融合hIL10多肽保持與野生型hIL10相當的活性以抑制骨髓細胞活化(例如藉由提高骨髓細胞中STAT3介導之信號傳導來評估)，但在PBMC、T細胞、B細胞及NK細胞中實質上具有減少之活化(例如藉由減少IFNγ之產生來評估)。
在一些實施例中，本揭示之融合IL10多肽係hIL10部分促效劑。 相對 STAT3 誘導
如先前所述，IL10與IL10受體之相互作用引起細胞內信號傳導，其特徵在於磷酸化STAT3 (phosphor-STAT3)之細胞內產生增強。因此，可使用表現IL10受體(包含IL10Ra及IL10Rb)之細胞評估的IL10活性之一個量度為phospho-STAT3之細胞內產生。
在一個實施例中，融合hIL10多肽為偏差hIL10部分促進劑，第一細胞類型為活化人類骨髓細胞且第二細胞類型為活化人類T細胞，其中IL10活性程度藉由phospho-STAT3之細胞內產生量測。在一個實施例中，融合hIL10多肽為偏差hIL10部分促進劑，其相較於活化人類CD8+ T細胞對活化人類單核球保持更大分率之hIL10活性，其中IL10活性程度藉由phospho-STAT3之細胞內產生量測。在一些實施例中，本文所描述之融合hIL10多肽在第一細胞類型對比第二細胞類型中之STAT3信號傳導之相對活化不同於野生型人類或鼠類IL10在第一細胞類型對比第二細胞類型中之STAT3信號傳導之相對活化。在一些實施例中，回應於骨髓細胞與有效量之融合hIL10多肽接觸而在人類骨髓細胞中誘導之細胞內phospho-STAT3之水平比回應於人類淋巴細胞與相同量的融合hIL10多肽接觸而在人類淋巴細胞中誘導之細胞內phospho-STAT3之水平高至少10倍，或者至少100倍，或者至少1000倍。在一個實施例中，回應於骨髓細胞與融合hIL10多肽接觸而在骨髓細胞中誘導之STAT3信號傳導水平相對於回應於淋巴細胞與融合hIL10多肽接觸而在淋巴細胞中誘導之STAT3信號傳導水平的比率不同於(大於或小於)回應於骨髓細胞與野生型hIL10接觸而在骨髓細胞中誘導之STAT3信號傳導水平相對於回應於淋巴細胞與野生型hIL10接觸而在淋巴細胞中誘導之STAT3信號傳導水平的比率。在一些實施例中，融合hIL10多肽在人類骨髓細胞相對於人類淋巴細胞中之活性比率(如由細胞內phospho-STAT3之水平所確定)大於野生型人類IL10在人類骨髓細胞相對於人類淋巴細胞中之活性比率。在一些實施例中，骨髓細胞為嗜中性球、嗜酸性球、肥胖細胞、嗜鹼性球或單核球。在一些實施例中，單核球為巨噬細胞或樹突狀細胞。在一些實施例中，巨噬細胞為庫弗細胞。在一些實施例中，淋巴細胞為CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、B細胞或NK細胞。
在一些實施例中，本揭示之融合hIL10多肽之pSTAT3 E max大於骨髓細胞中野生型hIL10之pSTAT3 E max之20%、大於30%、大於40%、大於50%、大於60%或大於70% (參見例如圖2A)。在一些實施例中，相較於野生型hIL10，本揭示之融合hIL10多肽在淋巴細胞，諸如T細胞、B細胞或NK細胞中展現STAT3介導之信號傳導減少。在一些實施例中，本揭示之融合hIL10多肽在淋巴細胞中之pSTAT3 E max小於淋巴細胞中野生型hIL10之pSTAT3 E max的70%、小於60%、小於50%、小於40%或小於30%。在一些實施例中，其融合hIL10多肽使得淋巴細胞中之pSTAT3 E max小於淋巴細胞中野生型或親本IL10多肽之pSTAT3 E max之70% (例如小於70%、小於60%、小於50%、小於40%或小於30%)但大於20%。在一些實施例中，淋巴細胞選自CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、B細胞或NK細胞。 相對促發炎及抗發炎活性
在一些實施例中，融合IL10多肽：(a)展現顯著水平之野生型IL10之至少一種抗發炎特性及(b)展現顯著降低水平之野生型IL10之至少一種促發炎特性。在一些實施例中，「顯著水平之至少一種抗發炎特性」意謂融合IL10多肽相對於此抗發炎特性之Emax大於野生型IL10展現之此抗發炎特性之Emax水平之10%，或者大於20%，或者大於30%，或者大於40%，或者大於50%，或者大於60%，或者大於70%，或者大於80%，或者大於90%，如測試系統中所確定。可在測試系統中量測之抗發炎特性之實例包括但不限於：(a)抑制活化人類骨髓細胞表現及/或分泌ILβ；(b)抑制活化人類骨髓細胞表現及/或分泌IL6；及(c)抑制活化人類骨髓細胞表現及/或分泌TNFα。在一些實施例中，根據在此項技術中熟知之程序，活化人類骨髓細胞係藉由自離心抗凝人類血液樣品之膚色血球層分離人類單核球來獲得，及藉由使分離單核球與脂多醣[LPS]接觸來活化分離單核球。活化單核球表現及/或分泌之ILβ、IL6及TNFα之水平可根據在此項技術中熟知之程序藉由免疫分析或流式細胞量測方法確定。用於評估對LPS活化之人類單核球表現及/或分泌ILβ、IL6及TNFα之抑制的方案提供於本文中之實例中。
在一些實施例中，「顯著降低水平之至少一種促發炎特性」意謂融合IL10多肽相對於此促發炎特性之Emax小於野生型IL10之促發炎特性之Emax之90%，或者小於80%，或者小於70%，或者小於60%，或者小於50%，或者小於40%，或者小於30%，或者小於20%，或者小於10%，如測試系統中所確定。促發炎特性之實例包括但不限於：(a)抑制活化人類CD8+ T細胞表現及/或分泌IFNγ；(b)抑制活化人類CD8+ T細胞表現及/或分泌顆粒酶A；及(c)抑制活化人類CD8+ T細胞表現及/或分泌顆粒酶A。在一些實施例中，根據在此項技術中熟知之程序，活化人類T細胞係藉由分離CD8+ T細胞人類全血來獲得，及藉由使分離CD8+細胞與抗CD3及抗CD28抗體接觸來活化。分離CD8+ T細胞表現及/或分泌之IFNγ、顆粒酶A及顆粒酶B之水平可根據在此項技術中熟知之程序藉由免疫分析或流式細胞量測方法確定。用於評估CD3/CD28活化CD8+ T細胞表現及/或分泌之IFNγ、顆粒酶A及顆粒酶B之表現及/或分泌的方案提供於實例中。
在一些實施例中，融合hIL10展現顯著水平之野生型hIL10之至少一種抗發炎特性且展現顯著降低水平之野生型hIL10之至少一種促發炎特性，其中：(a)野生型hIL10之至少一種抗發炎特性之顯著水平為至少一種抗發炎特性之Emax，大於野生型hIL10展現之此抗發炎特性之Emax之30%，其中至少一種抗發炎特性選自由以下組成之群：(i)抑制LPS活化人類單核球中hILb之表現及/或分泌；(ii)抑制LPS活化人類單核球中hIL6之表現及/或分泌；或(iii)抑制LPS活化人類單核球中hTNFα之表現及/或分泌；及(b)野生型hIL10之至少一種促發炎特性之顯著降低水平為至少一種抗發炎特性之Emax，小於野生型hIL10展現之此抗發炎特性之Emax之30%，其中至少一種促發炎特性選自由以下組成之群：(i)抑制活化人類CD8+ T細胞表現及/或分泌IFNγ；(ii)抑制活化人類CD8+ T細胞表現及/或分泌顆粒酶A；及(iii)抑制活化人類CD8+ T細胞表現及/或分泌顆粒酶B。
在一些實施例中，包含式(1)或式(2)之多肽的本揭示之融合hIL10多肽為偏差hIL10部分促進劑，其展現顯著水平之野生型hIL10之至少一種抗發炎特性且展現顯著降低水平之野生型IL10之至少一種促發炎特性，其中：野生型hIL10之至少一種抗發炎特性之顯著水平為至少一種抗發炎特性之Emax，大於野生型hIL10展現之此抗發炎特性之Emax的30%，其中至少一種抗發炎特性選自由以下組成之群：(i)抑制LPS活化人類單核球中hILb之表現及/或分泌；(ii)抑制LPS活化人類單核球中hIL6之表現及/或分泌；或(iii)抑制LPS活化人類單核球中hTNFα之表現及/或分泌；及(b)野生型hIL10之至少一種促發炎特性之顯著降低水平為至少一種抗發炎特性之Emax，小於野生型hIL10展現之此抗發炎特性之Emax的30%，其中至少一種促發炎特性選自由以下組成之群：(i)抑制活化人類CD8+ T細胞表現及/或分泌IFNγ；(i)抑制活化人類CD8+ T細胞表現及/或分泌顆粒酶A；及(iii)抑制活化人類CD8+ T細胞表現及/或分泌顆粒酶A。
在一些實施例中，融合hIL10多肽為部分促進劑，其中：(a)融合IL10多肽之Emax大於抗發炎活性分析中野生型hIL10之Emax之30%，該分析選自由以下組成之群：(i)抑制LPS活化人類單核球中hILβ之表現及/或分泌；(ii)抑制LPS活化人類單核球中hIL6之表現及/或分泌；或(iii)抑制LPS活化人類單核球中hTNFα之表現及/或分泌；及(b)融合IL10多肽之Emax小於促發炎活性分析中野生型hIL10之Emax之10%，該分析選自由以下組成之群：(i)抑制活化人類CD8+ T細胞表現及/或分泌IFNγ；(i)抑制活化人類CD8+ T細胞表現及/或分泌顆粒酶A；及(iii)抑制活化人類CD8+ T細胞表現及/或分泌顆粒酶A。
在一些實施例中，融合hIL10多肽為部分促進劑，其中：(a)融合IL10多肽之Emax大於抗發炎活性分析中野生型hIL10之Emax之50%，該分析選自由以下組成之群：(i)抑制LPS活化人類單核球中hILβ之表現及/或分泌；(ii)抑制LPS活化人類單核球中hIL6之表現及/或分泌；或(iii)抑制LPS活化人類單核球中hTNFα之表現及/或分泌；及(b)融合IL10多肽之Emax小於促發炎活性分析中野生型hIL10之Emax之20%，該分析選自由以下組成之群：(i)抑制活化人類CD8+ T細胞表現及/或分泌IFNγ；(i)抑制活化人類CD8+ T細胞表現及/或分泌顆粒酶A；及(iii)抑制活化人類CD8+ T細胞表現及/或分泌顆粒酶A。
在一些實施例中，融合hIL10多肽為部分促進劑，其中：(a)融合IL10多肽之Emax大於抗發炎活性分析中野生型hIL10之Emax之50%，該分析選自由以下組成之群：(i)抑制LPS活化人類單核球中hILβ之表現及/或分泌；(ii)抑制LPS活化人類單核球中hIL6之表現及/或分泌；或(iii)抑制LPS活化人類單核球中hTNFα之表現及/或分泌；及(b)融合IL10多肽之Emax小於促發炎活性分析中野生型hIL10之Emax之10%，該分析選自由以下組成之群：(i)抑制活化人類CD8+ T細胞表現及/或分泌IFNγ；(i)抑制活化人類CD8+ T細胞表現及/或分泌顆粒酶A；及(iii)抑制活化人類CD8+ T細胞表現及/或分泌顆粒酶A。 提供額外功能之修飾
在一些實施例中，hIL10突變蛋白可包含嵌合多肽之功能域。本揭示之人類IL10突變蛋白融合蛋白可易於藉由構築包含核酸序列之重組載體藉由此項技術中已知之技術藉由重組DNA方法產生，該核酸序列包含編碼hIL10突變蛋白之核酸序列，其在hIL10突變蛋白之N末端或C末端與編碼融合夥伴之核酸序列同框，該序列視情況進一步包含在編碼連接子或間隔子多肽之框內之核酸序列。
在其他實施例中，hIL10突變蛋白可經修飾以包括充當抗原標籤之額外多肽序列，諸如旗標序列。旗標序列係藉由經生物素標記之高特異性抗旗標抗體識別，如本文所描述(參見例如Blanar等人(1992) Science 256:1014及LeClair等人(1992) PNAS-USA 89:8145)。在一些實施例中，結合分子進一步包含C末端C-Myc抗原決定基標籤。
在一些實施例中，hIL10突變蛋白與分子(「靶向域」)結合以促進與表現細胞表面分子(其與此靶向域特異性結合)之特定細胞類型或組織之選擇性結合，視情況在hIL10突變蛋白序列與融合蛋白之靶向域之序列之間併入1至40 (或者2至20，或者5至20，或者10至20)個胺基酸之連接分子。
在其他實施例中，可產生包括hIL10突變蛋白及抗體或其抗原結合部分之嵌合多肽。舉例而言，其可用於將嵌合蛋白定位至細胞或標靶分子之特定子集。嵌合蛋白之抗體或抗原結合組分可充當靶向部分。在一些實施例中，靶向域為抗體。如本文所用，術語「抗體」意謂展現與抗原決定基結合之所需生物活性的任何形式之抗體(亦稱為免疫球蛋白(Ig))，如本文所描述。術語「抗體」特定地涵蓋但不限於多株抗體、單株抗體(包括包含兩條輕鏈及兩條重鏈之全長單株抗體)、多特異性抗體(例如與兩個或更多個抗原或單一抗原上之抗原決定基結合之雙特異性抗體)、完全人類抗體(huAb)、人源化抗體(hzAb)、嵌合抗體、單鏈可變片段抗體(scFv)、單域抗體(sdAb)、可變重鏈(VH)域抗體、雙價抗體(dAb)，及僅重鏈抗體(VHH)之抗原結合片段，包含可變區之胺基酸序列，如本文所描述。如本文所用，術語「抗體」統指：(a)醣基化及非醣基化免疫球蛋白(包括但不限於哺乳動物免疫球蛋白類別IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)，其特異性結合於標靶分子，諸如抗原；及(b)免疫球蛋白衍生物，包括但不限於IgG(1-4)deltaC H2、F(ab')2、Fab、scFv、V H、V L、四價抗體、三價抗體、雙價抗體、dsFv、F(ab') 3、scFv-Fc及(scFv) 2，它們與其衍生自之免疫球蛋白競爭以與標靶分子結合。術語抗體不限於來源於任何特定哺乳動物物種之免疫球蛋白且包括鼠類、人類、馬科、駱駝科及人類抗體。術語抗體包括「重鏈抗體」及單域抗體(sdAb)，諸如「VHH」，通常獲自駱駝科(包括駱駝、美洲駝及羊駝，如藉由例如Hamers-Casterman等人, 1993. Nature. 363:446-448所描述)之免疫，如下文在「VHH」之定義中更詳細地描述。術語「抗體」涵蓋可與天然來源或用抗原免疫後的動物分離之抗體，以及經工程改造之抗體，包括單株抗體，雙特異性抗體，三特異性嵌合抗體，人源化抗體，人類抗體，CDR移植、面飾化或經去免疫(例如以移除B及/或T細胞抗原決定基)抗體。在一些實施例中，靶向域與促發炎細胞，諸如活化免疫細胞之細胞表面標記特異性結合。在一些實施例中，靶向域為與細胞表面標記選擇性地結合之抗體，該細胞表面標記包括但不限於IL1R1受體、IL-1受體輔助蛋白、IL6受體次單元(IL6R)、HLA-DR、HLA-DR α鏈、HLA-DR β鏈、TNFR1、TNFR2、CD4、CD8、F4/80、CCR2、CD169、CX3CR1、CD206、CD163及Lyve1。產生細胞介素-抗體嵌合多肽之方法描述於例如美國專利第6,617,135號中。 與載體分子締合以延長作用持續時間
本文所描述之融合hIL10多肽可經修飾以延長活體內壽命及/或延長個體內之作用持續時間。在一些實施例中，融合hIL10多肽與一或多個載體分子結合以提供所需藥理學特性，諸如延長半衰期。在一些實施例中，融合hIL10多肽共價連接至IgG、白蛋白、水溶性聚合物或其他分子之Fc域以延長其半衰期，例如醣基化、醯基化及其類似者，如此項技術中已知。在一些實施例中，經修飾以在哺乳動物個體中提供延長作用持續時間之融合hIL10多肽在哺乳動物中具有大於4小時，或者大於5小時，或者大於6小時，或者大於7小時，或者大於8小時，或者大於9小時，或者大於10小時，或者大於12小時，或者大於18小時，或者大於24小時，或者大於2天，或者大於3天，或者大於4天，或者大於5天，或者大於6天，或者大於7天，或者大於10天，或者大於14天，或者大於21天或或者大於30天之半衰期。
修飾融合hIL10多肽以在哺乳動物個體中提供延長作用持續時間包括(但不限於)： ž  融合hIL10多肽與一或多個蛋白質載體分子之結合， ž  融合hIL10多肽與蛋白質載體分子，視情況呈融合蛋白與額外多肽序列(例如融合hIL10多肽-Fc融合物)形式的結合，及 ž  與聚合物(例如水溶性聚合物以提供聚乙二醇化IL10多肽)的結合。
應注意，可相對於給定融合hIL10多肽採用在哺乳動物個體中提供延長作用持續時間的多於一種類型的修飾。舉例而言，本揭示之融合hIL10多肽可包含提供延長作用持續時間之兩個胺基酸取代以及與載體分子，諸如聚乙二醇(PEG)分子之結合。
可共價連接至融合hIL10多肽以延長活體內作用持續時間的蛋白質載體分子之實例包括但不限於白蛋白、抗體及抗體片段，諸如IgG分子之Fc域。 Fc 融合物
在一些實施例中，融合IL10多肽可與Fc多肽結合。在一些實施例中，融合IL10多肽與Fc二聚體之一個Fc多肽結合。在一些實施例中，融合IL10多肽與Fc二聚體之兩個Fc多肽結合。Fc結合之融合IL10多肽之四個例示性組態之示意性表示提供於附圖之圖18A及圖18B中。如圖18A及圖18B中所繪示，融合IL10多肽可共價連接至Fc二聚體之一個Fc多肽之N末端，該Fc多肽經修飾以採用對Fc多肽之杵-進入-臼(KiH)修飾來促進異二聚化，其中融合IL10多肽可連接至含有「臼」胺基酸取代(圖18A)或「杵」胺基酸取代(圖18B)之Fc多肽。另外，如圖18B中所繪示，兩種不同融合IL10多肽可各自連接至Fc二聚體之Fc多肽，其中Fc域經修飾以促進異二聚化。或者，如圖18D中所繪示，相同融合IL10多肽中之兩者可各自連接至Fc二聚體之Fc多肽，其未經修飾以促進異二聚化。
Fc多肽可為來自hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4或其變異體之Fc域。在一些實施例中，Fc多肽包含自野生型Fc多肽序列修飾以降低效應子功能的序列。在一些實施例中，Fc二聚體之Fc多肽可經修飾以促進異二聚化。
適用於製備Fc融合物之「Fc區」可為天然存在之多肽或合成多肽，其與藉由用番木瓜蛋白酶消化IgG產生之IgG C末端域同源。本文所描述之結合分子可與整個Fc區結合，或與較小部分結合，該部分保持延長其作為一部分之嵌合多肽之循環半衰期的能力。另外，全長或片段化Fc區可為野生型分子之變異體。
如所指示，融合hIL10多肽與Fc次單元之連接可在融合hIL10多肽與Fc次單元之間併有連接分子。在一些實施例中，融合hIL10多肽表現為融合蛋白，其中Fc域併有IgG抗體之鉸鏈區之胺基酸序列。根據前述內容經工程改造之Fc域可來源於IgG1、IgG2、IgG3及IgG4哺乳動物IgG物種。在一些實施例中，Fc域可來源於人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4 IgG物種。在一些實施例中，鉸鏈區為IgG1之鉸鏈區。在一個特定實施例中，融合hIL10多肽使用人類IgG1鉸鏈域連接至Fc域。
在一些實施例中，連接子為化學連接子。化學連接子之實例包括芳基乙炔、含有2至10個單體單元之乙二醇寡聚物、二胺、二酸、胺基酸或其組合。在一些實施例中，連接子為肽連接子。肽連接子可包括1至50個胺基酸(例如2至50個胺基酸、5至50個胺基酸、10至50個胺基酸、15至50個胺基酸、20至50個胺基酸、25至50個胺基酸、30至50個胺基酸、35至50個胺基酸、40至50個胺基酸、45至50個胺基酸、2至45個胺基酸、2至40個胺基酸、2至35個胺基酸、2至30個胺基酸、2至25個胺基酸、2至20個胺基酸、2至15個胺基酸、2至10個胺基酸、2至5個胺基酸)。甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物係相對非結構化的，且因此可充當各組分之間的中性繫鏈。甘胺酸聚合物之實例包括(G)n、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物、甘胺酸-絲胺酸聚合物(例如(GmSo)n (SEQ ID NO: 129)、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 130)、(GmSoGm)n (SEQ ID NO: 131)、(GmSoGmSoGm)n (SEQ ID NO: 132)、(GSGGSm)n (SEQ ID NO: 133)、(GSGSmG)n (SEQ ID NO: 134)及(GGGSm)n (SEQ ID NO: 135)及其組合，其中m、n及o各自獨立地選自至少1至20，例如1至18、2至16、3至14、4至12、5至10、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10之整數)，及其他靈活連接子。
在一些實施例中，與融合hIL10多肽結合之Fc多肽之胺基酸序列可經修飾以降低效應子功能。在一些實施例中，Fc多肽可經修飾以實質上降低與Fc受體(FcyR及FcR)之結合，從而降低或消除抗體引導細胞毒性(ADCC)效應子功能。修飾Fc多肽以降低效應子功能為此項技術中熟知的。參見例如Wang等人(2018) IgG Fc engineering to modulate antibody effector functions, Protein Cell 9(1):63-73。舉例而言，已知位置235 (EU編號)處之離胺酸殘基自白胺酸(L)至麩胺酸(E)之突變藉由降低FcgR及C1q結合而降低效應子功能。Alegre等人(1992) J. Immunology 148:3461-3468。另外，IgG1鉸鏈區中位置234及235 (EU編號)處之兩個白胺酸(L)殘基經丙胺酸(A)取代(亦即L234A及L235A)引起補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)降低。Hezereh等人(2001) J. Virol 75(24):12161-68。此外，位置329 (EU編號)處之脯胺酸突變成丙胺酸(P329A)或甘胺酸(P329G)會減輕效應子功能且可與L234A及L235A取代組合。在一些實施例中，Fc多肽可包含稱為「LALAPA」取代之胺基酸取代L234A/L235A/P329A (EU編號)或稱為「LALAPG」取代之胺基酸取代L234A/L235A/P329G (EU編號)。在一些實施例中，Fc多肽可包含胺基酸取代E233P/L234V/L235A/∆G237 (在科學文獻中稱為PVAdelG突變)。
在一些實施例中，Fc多肽來源於hIgG4。已顯示位置297 (EU編號)處之醣基化促進IgG4中之效應子功能。Edelman等人(1969) PNAS (USA) 63:78-85。在N297處進行修飾以消除hIgG4之Fc域中之醣基化位點及效應子功能之實例包括選自N297Q及N297G (EU編號)之胺基酸取代。
在一些實施例中，Fc多肽之胺基酸序列可進一步經修飾以併有延長分子之作用持續時間且防止清除之胺基酸取代。在一些實施例中，對Fc多肽之此等修飾包括稱為「LS」修飾之胺基酸取代M428L及N434S (EU編號)。LS修飾可視情況與胺基酸取代組合以降低效應子功能且提供Fc域之間的雙硫鍵。
在一些實施例中，與融合hIL10多肽結合之Fc多肽之胺基酸序列可進一步經修飾以消除N連接或O連接之醣基化位點。已知Fc多肽，尤其IgG1子類別之去醣基化變異體不能很好地介導效應子功能。Jefferies等人, 1998, Immol. Rev., 第163卷, 50-76。已顯示位置297 (EU編號)處之醣基化促進效應子功能。Edelman等人(1969) PNAS (USA) 63:78-85。在一些實施例中，Fc多肽包含一個或多個修飾以消除N連接或O連接之醣基化位點。在N297處進行修飾以消除Fc多肽中之醣基化位點之實例包括胺基酸取代N297Q及N297G。在一些實施例中，Fc多肽為包含選自由N297Q及N297G組成之群的胺基酸取代的hIgG4 Fc。
在一些實施例中，融合hIL10 Fc多肽可進一步經修飾以延長其活體內作用持續時間。在一些實施例中，PEG部分之結合可經由半胱胺酸殘基之硫氫基(-SH)基團實現。在一些實施例中，融合hIL10多肽之聚乙二醇化在Fc多肽之上鉸鏈區之位置220處提供天然存在之半胱胺酸殘基(C220，EU編號)。
在一些實施例中，融合hIL10多肽可與Fc二聚體之單一Fc多肽結合，其中Fc二聚體之第一及第二Fc多肽經修飾以促進異二聚化(圖18A及圖18B)。在一些實施例中，融合hIL10多肽可與Fc二聚體之Fc多肽中之兩者結合，其中Fc二聚體之第一及第二Fc多肽經修飾以促進異二聚化，其中融合hIL10多肽中之各者相同或不同(圖18C)。建立用於促進Fc域之異二聚化之多種技術。參見例如Kim等人之2021年8月3日發佈之美國專利第11,087,249號。在一些實施例中，對第一及第二Fc多肽之啟動子異二聚化的修飾係HF-TA突變及HA-TF突變，如Moore等人(2011) mAbs3(6):546-557中所描述。HF-TA方法採用一個Fc單體上之S364H/T394F取代及互補Fc多肽上之Y349T/F405A取代。(HA-TF)方法採用一個Fc多肽上之S364H/F405A取代及互補Fc多肽上之Y349T/T394F取代。或者，第一及第二Fc多肽經修飾以藉由ZW1異二聚化方法促進異二聚化，該方法採用一個Fc多肽上之T350V/L351Y/F405A/Y407V取代及互補Fc多肽上之T350V/T366L/K392L/T394W取代。Von Kreudenstein等人(2013) mAbs, 5(5):646-654。或者，第一及第二Fc多肽經修飾以藉由EW-RVT異二聚化方法促進異二聚化，該方法採用一個Fc多肽上之K360E/K409W取代及互補Fc多肽上之Q347R/D399V/F405T取代。Choi等人(2015) Molecular Immunology65(2):377-83。
在一個實施例中，第一及第二Fc多肽經修飾以藉由採用「杵-進入-臼」(縮寫KiH)修飾來促進異二聚化，如本文中所例示。KiH修飾包含在第一Fc多肽中進行一或多個胺基酸取代，以在第一Fc多肽上產生大型「杵」域，及在第二Fc多肽上進行一或多個胺基酸取代，以產生互補凹穴或「臼」來接受第一Fc單體之「杵」。已經建立用於產生互補杵及臼Fc單體的多種胺基酸取代。參見例如Ridgway等人(1996) Protein Engineering9(7):617-921；Atwell等人(1997) J. Mol. Biol.270:26-35；Carter等人, 1998年9月15日發佈之美國專利第5,807,706號；Carter等人, 2010年4月13日發佈之美國專利第7,695,936號；Zhao等人, 「A new approach to produce IgG4-like bispecific antibodies」, Scientific Reports11:18630(2021)；Cao等人, 「Characterization and Monitoring of a Novel Light-heavy-light Chain Mispair in a Therapeutic Bispecific Antibody」；及Liu等人, 「Fc Engineering for Developing Therapeutic Bispecific Antibodies and Novel Scaffolds」, Frontiers in Immunology8: 38, 2017。在一些實施例中，Fc二聚體包含兩個Fc多肽，其中第一Fc多肽之CH3域(其中位置366 (EU編號)處之蘇胺酸經大型殘基修飾(例如T366W))產生「杵」及取代，且第二Fc多肽包含第二Fc多肽之CH3域之互補殘基中的一或多個取代以產生凹穴或「臼」來接受大型殘基，例如藉由諸如T366S、L368A及/或Y407V之胺基酸取代。在一個實施例中，式1之Fc1單體為包含胺基酸取代T366W之「杵」修飾之Fc單體，且式2之Fc2單體為包含胺基酸取代T366S/L368A/Y407V之集合的「臼」修飾之Fc。在一個實施例中，Fc二聚體之第一Fc多肽為包含胺基酸取代T366S/L368A/Y407V之集合的「臼」修飾之Fc單體，且Fc二聚體之第二Fc多肽為包含胺基酸取代T366W之「杵」修飾之Fc單體。
在一些實施例中，本揭示之融合hIL10多肽Fc結合物提供為融合hIL10 Fc多肽之互補異二聚體對，其中第一及第二融合hIL10多肽Fc多肽藉由至少一個雙硫鍵連接。在一些實施例中，在第一與第二融合hIL10多肽Fc多肽之間併入雙硫鍵可藉由在第一及第二Fc多肽內之特定點處之半胱胺酸取代達成。在一個實施例中，第一融合hIL10 Fc多肽之Fc多肽來源於包含胺基酸取代S354C (EU編號)之hIgG1之Fc域，且第二融合hIL10 Fc多肽域來源於包含胺基酸取代Y349C (EU編號)之hIgG1之Fc域，以在第一Fc多肽之S354C與第二Fc多肽之Y349C之間提供雙硫鍵。或者，第一Fc多肽來源於包含胺基酸取代Y349C (EU編號)之hIgG1之Fc域且第二Fc多肽來源於包含胺基酸取代S354C (EU編號)之hIgG1之Fc域，以在第一Fc多肽之S354C與第二Fc多肽之Y349C之間提供雙硫鍵。
在一些實施例中，本揭示提供一種異二聚體融合IL10多肽Fc，該異二聚體融合IL10多肽Fc包含下式#1之第一多肽： IL10FP-L1 a-UH1—Fc1   [1] 及下式#2之第二多肽： UH2—Fc2   [2] 其中： ž       hIL10FP為本揭示之融合hIL10多肽(例如式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽)； ž       L1為連接子且a獨立地選自0 (不存在)或1 (存在)； ž       UH1及UH2各自為獨立地選自由以下組成之群的人類免疫球蛋白的上鉸鏈域：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4上鉸鏈域，視情況包含胺基酸取代C220S (EU編號)； ž       Fc1為多肽，其包含選自由以下組成之群的人類免疫球蛋白的下鉸鏈、CH2及CH3域：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，包含一或多個胺基酸取代以促進與Fc2之異二聚化；且 ž       Fc2為多肽，其包含選自由以下組成之群的人類免疫球蛋白的該等下鉸鏈、CH2及CH3域：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，包含一或多個胺基酸取代以促進與Fc1之異二聚化， 且視情況其中式[1]之多肽及式[2]之多肽藉由至少一個鏈間雙硫鍵連接。
本揭示之異二聚體融合IL10多肽Fc為異二聚體，其包含各自併有人類免疫球蛋白分子之上鉸鏈區的式[1]及式[2]之多肽。術語「上鉸鏈」或「UH」係指對應於人類免疫球蛋白分子之胺基酸殘基216至220 (EU編號)的胺基酸序列。在一些實施例中，上鉸鏈區為選自人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3及人類IgG4上鉸鏈域的人類免疫球蛋白之天然存在之上鉸鏈區。在一些實施例中，上鉸鏈區為人類IgG1免疫球蛋白之上鉸鏈區。在一些實施例中，上鉸鏈區為包含五聚體胺基酸序列：EPKSC (SEQ ID NO: 121)的人類IgG1免疫球蛋白之上鉸鏈區。
在一些實施例中，上鉸鏈區在位置220 (EU編號)處含有不成對半胱胺酸殘基，其通常在完整免疫球蛋白分子中與輕鏈上之半胱胺酸結合。在僅使用包含鉸鏈域之Fc域時，鉸鏈域中之不成對半胱胺酸產生形成不當雙硫鍵之可能性。因此，在一些實施例中，位置220處之半胱胺酸(C220，根據EU編號來編號)經不促進二硫鍵結合之胺基酸取代。在一些實施例中，Fc域包含具有胺基酸序列EPKSS (SEQ ID NO: 122)之C220S突變。 Fc1 及 Fc2
本揭示之異二聚體融合IL10多肽Fc係異二聚體，其包含各自併有經修飾以促進異二聚化的人類免疫球蛋白分子之Fc區(Fc1及Fc2)的式[1]及式[2]之多肽。
如本文所使用，術語「Fc」及「Fc單體」及「Fc多肽」在本文中可互換地使用以指定Fc二聚體之單體多肽次單元。Fc包含以下胺基酸序列(自胺基至羧基末端)：包含人類免疫球蛋白分子之下鉸鏈域以及CH2及CH3域。在一些實施例中，Fc單體為包含人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3及人類IgG4鉸鏈域之人類免疫球蛋白分子域之下鉸鏈域以及CH2及CH3域的多肽。hIgG1之CH2域對應於胺基酸殘基231至340 (EU編號)且提供為SEQ ID NO: 128。hIgG1之CH3域對應於胺基酸殘基341至447 (EU編號)且提供為SEQ ID NO: 128。
式[1]及式[2]之多肽各自併有人類免疫球蛋白之下鉸鏈區。如本文所用，術語「下鉸鏈」或「LH」係指對應於人類免疫球蛋白分子之胺基酸殘基221至229 (EU編號)的胺基酸序列。在一些實施例中，下鉸鏈區為選自IgG1、IgG2、IgG3及IgG4下鉸鏈域之LH區的人類免疫球蛋白之天然存在之下鉸鏈區。在一些實施例中，下鉸鏈區為人類IgG1免疫球蛋白之下鉸鏈區。在一些實施例中，下鉸鏈區為包含十聚體胺基酸序列：DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 127)的人類IgG1免疫球蛋白之下鉸鏈區。
在一些實施例中，Fc1及Fc2衍生自對應於人類IgG1免疫球蛋白之胺基酸221至447 (EU編號)之多肽，如下所示：
如以上序列中所指示，IgG1 Fc域之野生型形式之C末端殘基為離胺酸，根據EU編號稱為K447。K447在重組生產期間藉由生產細胞不一致地移除。因此，重組Fc單體之群體可為異質的，因為以重組方式產生之Fc單體之某一分率將含有K447而其他分率將不含。藉由生產細胞進行之此不一致蛋白質水解處理可因此產生hIL10 Fc之異質群體。通常，尤其在人類藥劑之上下文中，應避免活性醫藥成分之此異質性。因此，除對Fc單體序列之修飾促進異二聚化之外，本揭示亦提供Fc單體，其進一步包含C末端K447之缺失或G446及K447之缺失及編碼Fc單體之核酸序列，包含：(a)位置447處之離胺酸殘基之缺失(K447，EU編號，縮寫為ΔK447或des-K447)，或(b)位置456處之甘胺酸之缺失(G446，EU編號，縮寫為des-G446)及K447之缺失(G446及K447之此雙重缺失在本文中稱為des-G446/des-K447或ΔG446/ΔK447)。
如上式[1]及[2]中所提供，二聚體Fc之Fc1及Fc2單體含有促進Fc1與Fc2之間的異二聚化的胺基酸取代。
在一些實施例中，本揭示之融合hIL10多肽Fc結合物經由胱胺酸對之以下基團之側鏈之間的一或多個雙硫鍵，視情況兩個或更多個雙硫鍵，視情況三個或更多個雙硫鍵，視情況四個或更多個雙硫鍵共價連接：(a) hP35之C96與hP40M之C199；(b)第一Fc單體之C226與第二Fc單體之C226；(c)第一Fc單體之C229與第二Fc單體之C229；及(d)包含S354C胺基酸取代之第一Fc域之S354C與包含Y349C胺基酸取代之第二Fc域之Y349C。 白蛋白載體分子
在一些實施例中，融合hIL10多肽與白蛋白分子(例如人類血清白蛋白)結合，其為此項技術中已知的以促進延長活體內暴露。在一些實施例中，融合hIL10多肽經由化學連接與白蛋白結合或表現為與白蛋白分子之融合蛋白(在本文中稱為「融合hIL10多肽白蛋白融合物」)。如在融合hIL10多肽-白蛋白融合物之上下文中所用之術語「白蛋白」包括白蛋白，諸如人類血清白蛋白(HSA)、食蟹猴血清白蛋白及牛血清白蛋白(BSA)。在一些實施例中，HSA包含相對於野生型HSA序列之C34S或K573P胺基酸取代。根據本揭示，白蛋白可在羧基末端、胺基末端、羧基及胺基末端處及內部與融合hIL10多肽結合(參見例如US 5,876,969及US 7,056,701)。在本揭示涵蓋之HAS-融合hIL10多肽中，可使用各種形式之白蛋白，諸如白蛋白分泌前序列及其變異體、其片段及變異體，及HSA變異體。此等形式通常具有一或多種所需白蛋白活性。在額外實施例中，本揭示涉及融合蛋白，其包含直接地或間接地融合至白蛋白、白蛋白片段及白蛋白變異體等之融合hIL10多肽，其中融合蛋白相較於未融合藥物分子具有較高血漿穩定性及/或融合蛋白保持未融合藥物分子之治療活性。作為融合hIL10多肽與白蛋白分子之間的化學連接的替代方案，融合hIL10多肽-白蛋白複合物可提供為包含白蛋白多肽序列及在宿主細胞中以重組方式表現為單一多肽鏈之融合hIL10多肽的融合蛋白，視情況包含白蛋白與融合hIL10多肽之間的連接分子。對於一般熟習此項技術者而言，此等融合蛋白可易於透過重組技術製備。編碼此等融合蛋白之核酸序列可自多種商業來源中之任一者訂購。將編碼融合蛋白之核酸序列併入可操作地連接至一或多個表現控制元件之表現載體中，將該載體引入至適合宿主細胞中且融合蛋白藉由此項技術中熟知之技術與宿主細胞培養物分離。 聚合物載體
在一些實施例中，延長融合hIL10多肽之活體內作用持續時間可藉由與一或多個聚合物載體分子，諸如XTEN聚合物或水溶性聚合物結合來達成。 XTEN 結合物
融合hIL10多肽可進一步包含XTEN聚合物。與融合hIL10多肽結合(以化學方式或以融合蛋白形式)的XTEN聚合物提供類似於聚乙二醇化之延長持續時間且可在大腸桿菌中產生為重組融合蛋白。適用於與融合hIL10多肽結合使用之XTEN聚合物提供於Podust等人(2016) 「Extension of in vivohalf-life of biologically active molecules by XTEN protein polymers」, J Controlled Release 240:52-66及Haeckel等人(2016) 「XTEN as Biological Alternative to PEGylation Allows Complete Expression of a Protease-Activatable Killin-Based Cytostatic」 PLOS ONE|DOI:10.1371/journal.pone.0157193 (2016年6月13日)中。XTEN聚合物融合蛋白可在XTEN多肽與hIL2突變蛋白之間併有蛋白酶敏感性裂解位點，諸如MMP-2裂解位點。 水溶性聚合物
在一些實施例中，融合hIL10多肽可與一或多種水溶性聚合物結合。適用於實踐本揭示之水溶性聚合物之實例包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、多醣(聚乙烯吡咯啶酮、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚烯烴醇)、多醣、聚α-羥基酸、聚乙烯醇(PVA)、聚磷腈、聚㗁唑啉(POZ)、聚(N-丙烯醯𠰌啉)或其組合。 聚乙二醇化
在一些實施例中，融合hIL10多肽可與一或多個聚乙二醇分子結合或「聚乙二醇化」。儘管PEG與結合分子之連接方法或位點可變化，但在某些實施例中，聚乙二醇化不改變或僅最低限度地改變結合分子之活性。
一般而言，適合於與多肽序列結合之PEG在室溫下可溶於水，且具有以下通式： R(O-CH 2-CH 2) nO-R， 其中R為氫或諸如烷基或烷醇基團之保護基，且其中n為1至1000之整數。在R為保護基時，其通常具有1至8個碳。PEG可為直鏈或分支鏈的。本揭示涵蓋分支鏈PEG衍生物、「星形PEG」及多臂PEG。
在一些實施例中，可採用融合hIL10多肽之選擇性聚乙二醇化，例如藉由併入具有側鏈之非天然胺基酸以促進選擇性PEG結合。可選擇特異性聚乙二醇化位點使得結合分子之聚乙二醇化不影響其與標靶受體結合。
在某些實施例中，半衰期之延長大於生物活性之任何降低。適合於與多肽序列結合之PEG在室溫下通常可溶於水且具有通式R(O-CH 2-CH 2) nO-R，其中R為氫或諸如烷基或烷醇基團之保護基，且其中n為1至1000之整數。在R為保護基時，其通常具有1至8個碳。與多肽序列結合之PEG可為直鏈或分支鏈的。本揭示涵蓋分支鏈PEG衍生物、「星形PEG」及多臂PEG。
在本揭示中使用之PEG之分子量不限於任何特定範圍。結合分子之PEG組分可具有大於約5 kDa、大於約10 kDa、大於約15 kDa、大於約20 kDa、大於約30 kDa、大於約40 kDa或大於約50 kDa之分子量。在一些實施例中，分子量為約5 kDa至約10 kDa、約5 kDa至約15 kDa、約5 kDa至約20 kDa、約10 kDa至約15 kDa、約10 kDa至約20 kDa、約10 kDa至約25 kDa或約10 kDa至約30 kDa。直鏈或分支鏈PEG分子具有約2,000至約80,000道爾頓，或者約2,000至約70,000道爾頓，或者約5,000至約50,000道爾頓，或者約10,000至約50,000道爾頓，或者約20,000至約50,000道爾頓，或者約30,000至約50,000道爾頓，或者約20,000至約40,000道爾頓或或者約30,000至約40,000道爾頓之分子量。在本揭示之一個實施例中，PEG為包含兩個20 kD臂之40 kD分支鏈PEG。
在一些實施例中，本揭示提供一種下式之融合人類IL10 (hIL10)多肽： PEG-L2 m-[(hIL10A)-L n-(hIL10B)]， 其中： PEG為具有約10 kD至約80 kD之分子量的直鏈或分支鏈聚乙二醇分子； L2為多肽或化學連接子且m = 0 (不存在)或1 (存在)； hIL10A為人類IL10突變蛋白，其包含根據SEQ ID NO: 4編號的選自由以下組成之群的位置處之胺基酸取代：T100、H14、N18、N21、M22、R24、D25、D28、R32、E74、H90、N92、S93、E96及R104 (例如選自由以下組成之群：T100、H14、N18、N21、M22、D25、R32、S93及E96)，視情況包含選自由以下組成之群的一或多個胺基酸之N末端缺失：Ser1、Ser1-Pro2、Ser1-Pro2-Gly3、Ser1-Pro2-Gly3-Gln4 (SEQ ID NO: 141)、Ser1-Pro2-Gly3-Gln4-Gly5 (SEQ ID NO: 142)、Ser1-Pro2-Gly3-Gln4-Gly5-Thr6 (SEQ ID NO: 143)、Ser1-Pro2-Gly3-Gln4-Gly5-Thr6-Gln7 (SEQ ID NO: 22)、Ser1-Pro2-Gly3-Gln4-Gly5-Thr6-Gln7-Ser8 (SEQ ID NO: 144)、Ser1-Pro2-Gly3-Gln4-Gly5-Thr6-Gln7-Ser8-Glu9 (SEQ ID NO: 145)及Ser1-Pro2-Gly3-Gln4-Gly5-Thr6-Gln7-Ser8-Glu9-Asn10 (SEQ ID NO: 21)，視情況包含額外N末端甲硫胺酸殘基； hIL10B為人類IL10突變蛋白，其包含根據SEQ ID NO: 4編號的選自由以下組成之群的位置處之胺基酸取代：T100、H14、N18、N21、M22、R24、D25、D28、R32、E74、H90、N92、S93、E96及R104 (例如選自由以下組成之群：T100、H14、N18、N21、M22、D25、R32、S93及E96)，視情況包含選自由以下組成之群的一或多個胺基酸之N末端缺失：Ser1、Ser1-Pro2、Ser1-Pro2-Gly3、Ser1-Pro2-Gly3-Gln4 (SEQ ID NO: 141)、Ser1-Pro2-Gly3-Gln4-Gly5 (SEQ ID NO: 142)、Ser1-Pro2-Gly3-Gln4-Gly5-Thr6 (SEQ ID NO: 143)、Ser1-Pro2-Gly3-Gln4-Gly5-Thr6-Gln7 (SEQ ID NO: 22)、Ser1-Pro2-Gly3-Gln4-Gly5-Thr6-Gln7-Ser8 (SEQ ID NO: 144)、Ser1-Pro2-Gly3-Gln4-Gly5-Thr6-Gln7-Ser8-Glu9 (SEQ ID NO: 145)及Ser1-Pro2-Gly3-Gln4-Gly5-Thr6-Gln7-Ser8-Glu9-Asn10 (SEQ ID NO: 21)；且 L為1至30個胺基酸之多肽連接子，且n = 0 (不存在)或1 (存在)。
在一個實施例中，本揭示提供一種具有以下結構之聚乙二醇化融合hIL10多肽： PEG-[hIL10A-L n-hIL10B]， 其中： a) PEG為包含兩個20 kD臂之40 kD分支鏈PEG分子，共價鍵結至hIL10A之N末端，視情況經由醛連接子； b) hIL10A為hIL10突變蛋白，其包含在對應於SEQ ID NO: 4之殘基T100、H14、N18、N21、M22、R24、D25、D28、R32、E74、H90、N92、S93、E96及R104 (例如對應於殘基T100、H14、N18、N21、M22、D25、R32、S93及E96)之位置處的一或多個胺基酸取代且視情況包含對應於SEQ ID NO: 4之殘基1、1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9或1至10之N末端缺失；視情況包含額外N末端甲硫胺酸殘基； c) hIL10B為hIL10突變蛋白，其包含在對應於SEQ ID NO: 4之殘基T100、H14、N18、N21、M22、R24、D25、D28、R32、E74、H90、N92、S93、E96及R104 (例如對應於殘基T100、H14、N18、N21、M22、D25、R32、S93及E96)之位置處的一或多個胺基酸取代且視情況包含對應於SEQ ID NO: 4之殘基1、1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9或1至10之N末端缺失； d) L為多肽連接子且n = 0 (不存在)或1 (存在)。
在一個實施例中，本揭示提供一種具有以下結構之聚乙二醇化融合hIL10多肽： PEG-[hIL10A-L n-hIL10B]， 其中： a) PEG為包含兩個20 kD臂之40 kD分支鏈PEG分子，共價鍵結至hIL10A之N末端，視情況經由醛連接子； b) hIL10A為hIL10突變蛋白，其選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、148、149、150、151、152、153、154、155、156、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204及205，且視情況包含對應於SEQ ID NO: 4之殘基1、1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9或1至10之N末端缺失；視情況包含額外N末端甲硫胺酸殘基； c) hIL10B為hIL10突變蛋白，其選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、148、149、150、151、152、153、154、155、156、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204及205，且視情況包含對應於SEQ ID NO: 4之殘基1、1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9或1至10之N末端缺失； d) L為多肽連接子且n = 0 (不存在)或1 (存在)。
在一個實施例中，本揭示提供一種具有以下結構之聚乙二醇化融合hIL10多肽： PEG-[hIL10A-L n-hIL10B]， 其中： (a) PEG為包含兩個20 kD臂之40 kD分支鏈PEG分子，共價鍵結至hIL10A之N末端，視情況經由醛連接子； (b) hIL10A為hIL10突變蛋白，其選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、148、149、150、151、152、153、154、155、156、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204及205；視情況包含額外N末端甲硫胺酸殘基； (c) hIL10B為hIL10突變蛋白，其選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、148、149、150、151、152、153、154、155、156、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204及205； (d) L為多肽連接子且n = 0 (不存在)或1 (存在)。
在一個實施例中，本揭示提供一種具有以下結構之聚乙二醇化融合hIL10多肽： PEG-[hIL10A-L n-hIL10B]， 其中： (a) PEG為包含兩個20 kD臂之40 kD分支鏈PEG分子，共價鍵結至hIL10A之N末端，視情況經由醛連接子；且 (b) 式[hIL10A-L n-hIL10B]之多肽為選自由以下組成之群的多肽：SEQ ID NO: 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、119、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185及186。
在一個實施例中，本揭示提供一種具有以下結構之聚乙二醇化融合hIL10多肽： PEG-[hIL10A-L n-hIL10B]， 其中： (a) PEG為包含兩個20 kD臂之40 kD分支鏈PEG分子，共價鍵結至hIL10A之N末端，視情況經由醛連接子；且 (b) 式[hIL10A-L n-hIL10B]之多肽為選自由以下組成之群的多肽：SEQ ID NO: 36、37、38、42及44。
在一個實施例中，本揭示提供一種具有以下結構之聚乙二醇化融合hIL10多肽： PEG-[hIL10A-L n-hIL10B]， 其中： (a) PEG為下式之包含兩個20 kD臂之40 kD分支鏈PEG分子： ，共價鍵結至hIL10A之N末端，視情況經由連接子；且 (b) 式[hIL10A-L n-hIL10B]之多肽為選自由以下組成之群的多肽：SEQ ID NO: 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、119、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185及186。
在一個實施例中，本揭示提供一種具有以下結構之聚乙二醇化融合hIL10多肽： PEG-[hIL10A-L n-hIL10B]， 其中： PEG為下式之包含兩個20 kD臂之40 kD分支鏈PEG分子： ，共價鍵結至hIL10A之N末端，視情況經由連接子； hIL10A為選自表1B之多肽； hIL10B為選自表1A之多肽；且 L為多肽連接子且n = 0 (不存在)或1 (存在)。
在一個實施例中，本揭示提供一種具有以下結構之聚乙二醇化融合hIL10多肽： PEG-[hIL10A-L n-hIL10B]， 其中： (a)    PEG為下式之包含兩個20 kD臂之40 kD分支鏈PEG分子： ，共價鍵結至hIL10A之N末端，視情況經由連接子；且 (b)    式[hIL10A-L n-hIL10B]之多肽為以下序列之多肽： SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 44)。
在一個實施例中，本揭示提供一種具有以下結構之聚乙二醇化融合hIL10多肽： PEG-[hIL10A-L n-hIL10B]， 其中： (a) PEG為下式之包含兩個20 kD臂之40 kD分支鏈PEG分子： ，共價鍵結至hIL10A之N末端，視情況經由連接子；且 (b) 式[hIL10A-L n-hIL10B]之多肽為以下序列之多肽： MSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 123)。
在一個實施例中，本揭示提供一種具有以下結構之聚乙二醇化融合hIL10多肽： PEG-[hIL10A-L n-hIL10B]， 其中： (a) PEG為下式之包含兩個20 kD臂之40 kD分支鏈PEG分子： ，共價鍵結至hIL10A之N末端，視情況經由連接子；且 (b) 式[hIL10A-L n-hIL10B]之多肽為以下序列之多肽： PGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 124)。
在一個實施例中，本揭示提供一種具有以下結構之聚乙二醇化融合hIL10多肽： PEG-[hIL10A-L n-hIL10B]， 其中： (a) PEG為下式之包含兩個20 kD臂之40 kD分支鏈PEG分子： ，共價鍵結至hIL10A之N末端，視情況經由連接子；且 (b)    式[hIL10A-L n-hIL10B]之多肽為以下序列之多肽： PGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 185)。
在一個實施例中，本揭示提供一種具有以下結構之聚乙二醇化融合hIL10多肽： PEG-[hIL10A-L n-hIL10B]， 其中： (a)    PEG為下式之包含兩個20 kD臂之40 kD分支鏈PEG分子： ，共價鍵結至hIL10A之N末端，視情況經由連接子；且 (b)    式[hIL10A-L n-hIL10B]之多肽為以下序列之多肽： SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 170)。
在一些實施例中，本揭示提供一種「單聚乙二醇化」融合hIL10多肽。
在一個實施例中，本揭示提供一種具有以下結構之聚乙二醇化融合hIL10多肽： PEG-hIL10A-Ln-hIL10B， 其中： (a) PEG為視情況經由多肽或化學連接子連接至hIL10A之N末端的40 kD分支鏈PEG分子； (b) hIL10A及hIL10B係hIL10突變蛋白，其中hIL10A及hIL10B獨立地選自hIL10突變蛋白，其包含在對應於SEQ ID NO: 4之殘基T100、H14、N18、N21、M22、R24、D25、D28、R32、E74、H90、N92、S93、E96及R104 (例如對應於殘基T100、H14、N18、N21、M22、D25、R32、S93及E96)之位置處的一或多個胺基酸取代；且 (c) L為多肽連接子且n = 0 (不存在)或1 (存在)。
在一個實施例中，本揭示提供一種具有以下結構之聚乙二醇化融合hIL10多肽： PEG-hIL10A-Ln-hIL10B， 其中： (a) PEG為視情況經由多肽或化學連接子連接至hIL10A之N末端的40 kD分支鏈PEG分子； (b)  hIL10A及hIL10B係hIL10突變蛋白，其中hIL10A及hIL10B獨立地選自hIL10突變蛋白，其包含在對應於SEQ ID NO: 4之殘基T100、H14、N18、N21、M22、R24、D25、D28、R32、E74、H90、N92、S93、E96及R104 (例如對應於殘基T100、H14、N18、N21、M22、D25、R32、S93及E96)之位置處的一或多個胺基酸取代，其中一或多個胺基酸取代選自由以下組成之群：N21D、N21E、N21K、M22A、M22S、M22T、M22D、M22W、R24E、D25K、E96K、E96Q、T100E、T100L及T100C；且 (c) L為多肽連接子且n = 0 (不存在)或1 (存在)。
在一個實施例中，本揭示提供一種具有以下結構之聚乙二醇化融合hIL10多肽： PEG-hIL10 T100L-hIL10 T100L。
在一個實施例中，本揭示提供一種具有以下結構之聚乙二醇化融合hIL10多肽： PEG-[hIL10A—hIL10B]， 其中： (a) PEG為視情況經由多肽或化學連接子連接至hIL10A之N末端的40 kD分支鏈PEG分子； (b) 「—」為肽鍵；且 (c) [hIL10A—hIL10B]為選自由以下組成之群的多肽：[hIL10 N21D—hIL10 N21D]、[ΔSer1 hIL10 N21D—hIL10 N21D]、[hIL10 N21E—hIL10 N21E]、[ΔSer1 hIL10 N21E—hIL10 N21E]、{hIL10 N21K—hIL10 N21K]、[ΔSer1hIL10 N21K—hIL10 N21K]、[hIL10 M22A—hIL10 M22A]、[ΔSer1 hIL10 M22A—hIL10 M22A]、[hIL10 M22S—hIL10 M22S]、[ΔSer1 hIL10 M22S—hIL10 M22S]、[hIL10 M22T—hIL10 M22T]、[ΔSer1 hIL10 M22T—hIL10 M22T]、[hIL10 M22D—hIL10 M22D]、[ΔSer1 hIL10 M22D—hIL10 M22D]、[hIL10 M22W—hIL10 M22W]、[ΔSer1 hIL10 M22W—hIL10 M22W]、[hIL10 R24E—hIL10 R24E]、[ΔSer1 hIL10 R24E—hIL10 R24E]、[hIL10 D25K—hIL10 D25K]、[ΔSer1 hIL10 D25K—hIL10 D25K]、[hIL10 E96K—hIL10 E96K]、[ΔSer1 hIL10 E96K—hIL10 E96K]、[hIL10 E96Q—hIL10 E96Q]、[ΔSer1 hIL10 E96Q—hIL10 E96Q]、[hIL10 T100E—hIL10 T100E]、[ΔSer1 hIL10 T100E—hIL10 T100E]、[hIL10 T100L—hIL10 T100L]、[ΔSer1 hIL10 T100L—hIL10 T100L]、[hIL10 T100C—hIL10 T100C]及[ΔSer1 hIL10 T100C—hIL10 T100C]。
在一些情況下，本揭示之融合hIL10多肽具有N末端麩醯胺酸(「1Q」)殘基。已經觀測到N末端麩醯胺酸殘基在生理條件下或接近生理條件下自發地環化以形成焦麩胺酸(pE)。(參見例如Liu等人(2011) J. Biol. Chem. 286(13): 11211-11217)。在一些實施例中，焦麩胺酸之形成防止N末端PEG結合，尤其在醛化學物質用於N末端聚乙二醇化時。因此，在對本揭示之IL-10促效劑化合物進行聚乙二醇化時，尤其在將採用醛化學物質時，具有位置1處之胺基酸(例如1Q)之IL-10促效劑化合物在位置1處經替代胺基酸取代或在位置1處缺失(例如des-1Q)。在一些實施例中，本揭示之IL-10促效劑化合物包含選自群組Q1E及Q1D之胺基酸取代。
本揭示亦涵蓋結合物之組合物，其中PEG具有不同n值，且因此各種不同PEG以特定比率存在。舉例而言，一些組合物包含結合物之混合物，其中n = 1、2、3及4。在一些組合物中，結合物(其中n=1)之百分比為18-25%，結合物(其中n=2)之百分比為50-66%，結合物(其中n=3)之百分比為12-16%，且結合物(其中n=4)之百分比高達5%。此等組合物可藉由此項技術中已知之反應條件及純化方法產生。層析可用於解析結合物分率，且隨後鑑別含有例如連接有所需數目之PEG的結合物、經純化不含未經修飾之蛋白質序列及不含連接有其他數目之PEG的結合物的分率。
適合於與多肽序列結合之PEG在室溫下通常可溶於水，且具有通式R(O-CH 2-CH 2) nO-R，其中R為氫或諸如烷基或烷醇基團之保護基，且其中n為1至1000之整數。在R為保護基時，其通常具有1至8個碳。
兩種廣泛使用之第一代活化單甲氧基PEG (mPEG)係琥珀醯亞胺碳酸酯PEG (SC-PEG；參見例如Zalipsky等人(1992) Biotehnol. Appl. Biochem15:100-114)及苯并三唑碳酸酯PEG (BTC-PEG；參見例如Dolence等人, 美國專利第5,650,234號)，其優先與離胺酸殘基反應以形成胺基甲酸酯鍵，但已知亦與組胺酸及酪胺酸殘基反應。使用PEG-醛連接子透過還原胺化靶向多肽之N末端上之單一位點。
聚乙二醇化最常發生在多肽之N末端處之α-胺基、離胺酸殘基之側鏈上之ε胺基及組胺酸殘基之側鏈上之咪唑基團處。因為大多數重組多肽具有單一α胺基及多個ε胺基及咪唑基團，因此可視連接子化學物質而定產生許多位置異構體。此項技術中已知之通用聚乙二醇化策略可應用於本文中。
PEG可經由末端反應性基團(「間隔子」)與本揭示之結合分子結合，該末端反應性基團介導多肽序列中之一或多者之游離胺基或羧基與聚乙二醇之間的鍵。具有可與游離胺基結合之間隔子之PEG包括N-羥基丁二醯亞胺聚乙二醇，其可藉由用N-羥基丁二醯亞胺活化聚乙二醇之丁二酸酯製備。
在一些實施例中，藉由併入具有獨特側鏈之非天然胺基酸來促進結合分子之聚乙二醇化，以促進位點特異性聚乙二醇化。將非天然胺基酸併入至多肽中以提供功能性部分來達成此等多肽之位點特異性聚乙二醇化為此項技術中已知的。參見例如Ptacin等人之PCT國際申請案第PCT/US2018/045257號，該國際申請案在2018年8月3日申請且在2019年2月7日以國際公開案第WO 2019/028419Al號公開。
與多肽序列結合之PEG可為直鏈或分支鏈的。本揭示涵蓋分支鏈PEG衍生物、「星形PEG」及多臂PEG。適用於實踐本揭示之特定實施例PEG包括10 kDa直鏈PEG-醛(例如Sunbright® ME-100AL，NOF America Corporation，One North Broadway，White Plains，NY 10601 USA)；10 kDa直鏈PEG-NHS酯(例如Sunbright® ME-100CS，Sunbright® ME-100AS，Sunbright® ME-100GS，Sunbright® ME-100HS，NOF)；20 kDa直鏈PEG-醛(例如Sunbright® ME-200AL，NOF)；20 kDa直鏈PEG-NHS酯(例如Sunbright® ME-200CS，Sunbright® ME-200AS，Sunbright® ME-200GS，Sunbright® ME-200HS，NOF)；20 kDa 2臂分支鏈PEG-醛，該20 kDa PEG-醛包含兩個10 kDa直鏈PEG分子(例如Sunbright® GL2-200AL3，NOF)；20 kDa 2臂分支鏈PEG-NHS酯，該20 kDa PEG-NHS酯包含兩個10 kDa直鏈PEG分子(例如Sunbright® GL2-200TS，Sunbright® GL200GS2，NOF)；40 kDa 2臂分支鏈PEG-醛，該40 kDa PEG-醛包含兩個20 kDa直鏈PEG分子(例如Sunbright® GL2-400AL3)；40 kDa 2臂分支鏈PEG-NHS酯，該40 kDa PEG-NHS酯包含兩個20 kDa直鏈PEG分子(例如Sunbright® GL2-400AL3，Sunbright® GL2-400GS2，NOF)；30 kDa直鏈PEG-醛(例如Sunbright® ME-300AL)；及直鏈30 kDa PEG-NHS酯。
在一些實施例中，連接子可用於連接融合hIL10多肽與PEG分子。適合連接子包括通常具有足夠長度以准許經修飾多肽序列與連接組分及分子之間的一定移動的「靈活連接子」。連接子分子之長度通常為約6至50個原子。舉例而言，連接子分子亦可為芳基乙炔、含有2至10個單體單元之乙二醇寡聚物、二胺、二酸、胺基酸或其組合。適合連接子可易於選擇且可具有任何適合長度，諸如1個胺基酸(例如Gly)、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10至20、20至30、30至50或超過50個胺基酸。靈活連接子之實例描述於章節IV中。此外，此等連接子序列之多聚體(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10至20、20至30或30至50)可連接在一起以提供可用於結合兩個分子之靈活連接子。除多肽連接子之外，連接子亦可為化學連接子，例如PEG-醛連接子。在一些實施例中，結合分子在N末端處藉由與N末端乙醯基轉移酶及例如乙醯CoA之酶促反應而乙醯化。或者，或除N末端乙醯化之外，結合分子可在一或多個離胺酸殘基處例如藉由與離胺酸乙醯基轉移酶之酶促反應而乙醯化。參見例如Choudhary等人(2009) Science 325 (5942):834-840。
在一些實施例中，本揭示提供一種聚乙二醇化之融合hIL10多肽，其中PEG與融合hIL10多肽結合且PEG為直鏈或分支鏈PEG分子，具有約2,000至約80,000道爾頓，或者約2,000至約70,000道爾頓，或者約5,000至約50,000道爾頓，或者約10,000至約50,000道爾頓，或者約20,000至約50,000道爾頓，或者約30,000至約50,000道爾頓，或者約20,000至約40,000道爾頓或或者約30,000至約40,000道爾頓之分子量。在本揭示之一個實施例中，PEG為包含兩個20 kD臂之40 kD分支鏈PEG。 脂肪酸載體
在一些實施例中，融合hIL10多肽在哺乳動物個體中具有延長之作用持續時間且適用於實踐本揭示係藉由將融合hIL10多肽共價連接至脂肪酸分子來實現，如Resh (2016) Progress in Lipid Research 63:120-131中所描述。可結合之脂肪酸之實例包括肉豆蔻酸、棕櫚酸及棕櫚油酸。肉豆蔻醯化通常與N末端甘胺酸相關，但離胺酸亦可經肉豆蔻醯基化。棕櫚醯化通常藉由游離半胱胺酸-SH基團之酶促修飾實現，諸如DHHC蛋白質催化S-棕櫚醯化。絲胺酸及蘇胺酸殘基之棕櫚醯化通常使用PORCN酶以酶促方式實現。在一些實施例中，融合hIL10多肽在N末端處藉由與N末端乙醯基轉移酶及例如乙醯CoA之酶促反應而乙醯化。或者，或除N末端乙醯化之外，融合hIL10多肽在一或多個離胺酸殘基處例如藉由與離胺酸乙醯基轉移酶之酶促反應而乙醯化。參見例如Choudhary等人(2009) Science 325 (5942):834L2 ortho840。 核酸序列
在一些實施例中，融合hIL10多肽藉由重組方法使用編碼融合hIL10多肽之核酸序列產生。編碼所需融合hIL10多肽之核酸序列可藉由化學方式使用寡核苷酸合成器合成。
核酸分子不限於編碼多肽之序列；亦可包括位於編碼序列上游或下游之非編碼序列中之一些或全部。一般熟習分子生物學技術者熟悉用於分離核酸分子之常規程序。其可例如藉由用限制性核酸內切酶處理基因體DNA或藉由進行聚合酶鏈反應(PCR)產生。在核酸分子為核糖核酸(RNA)之情況下，分子可例如藉由活體外轉錄產生。
編碼融合hIL10多肽之核酸分子可含有天然存在之序列或不同於天然存在之序列的序列，但由於基因密碼之簡併性，編碼相同多肽。此等核酸分子可由RNA或DNA (例如基因體DNA、cDNA或合成DNA，諸如藉由基於胺基亞磷酸酯之合成產生)或此等類型核酸內核苷酸之組合或修飾組成。另外，核酸分子可為雙股或單股(亦即有義股或反義股)。
核酸序列可獲自提供定製核酸序列之各種商業來源。本揭示之融合hIL10多肽之胺基酸序列變異體係藉由基於此項技術中熟知之基因密碼將適當核苷酸變化引入至編碼序列中來製備。此等變異體表示如所提及的殘基之插入、取代及/或指定缺失。進行插入、取代及/或指定缺失之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有如本文所定義之所需生物活性。
用於在經適合轉型之宿主中構築DNA序列及表現彼等序列之方法包括但不限於使用PCR輔助突變誘發技術。由胺基酸殘基之缺失或添加組成之突變亦可用標準重組技術進行。在缺失或添加之情況下，核酸分子視情況用適當的限制性核酸內切酶消化。所得片段可直接表現或進一步藉由例如將其接合至第二片段來操縱。若核酸分子之兩端含有彼此重疊之互補核苷酸，則可促進接合，但平端片段亦可接合。PCR產生之核酸亦可用以產生各種突變體序列。
本揭示之融合hIL10多肽不僅可以重組方式直接產生，而且可作為與異源多肽之融合多肽產生，例如在成熟融合hIL10多肽之N末端或C末端處具有特異性裂解位點之信號序列或其他多肽。在一些實施例中，核酸分子進一步包含編碼信號肽之核酸序列。一般而言，信號序列可為載體之組分，或其可為插入至載體中之編碼序列的一部分。所選擇的異源信號序列較佳為經宿主細胞識別及處理(亦即，藉由信號肽酶裂解)之信號序列。包括信號序列視是否需要自製備其之重組細胞分泌分子而定。若所選細胞為原核的，則DNA序列不編碼信號序列通常為較佳的。在重組宿主細胞為諸如釀酒酵母之酵母細胞時，α匹配因子分泌信號序列可用以實現分子細胞外分泌至培養基中，如Singh, 2007年4月3日發佈之美國專利第7,198,919 B1號中所描述。在一些實施例中，信號肽包含內源性或野生型信號肽。在一些實施例中，信號肽包含人類IL10多肽之胺基酸序列：MHSSALLCCLVLLTGVRA (SEQ ID NO: 98)。在一些實施例中，信號肽包含鼠類IL10多肽之胺基酸序列：MPGSALLCCLLLLTGMRI (SEQ ID NO: 99)。
在待表現之融合hIL10多肽將表現為嵌合體(例如包含融合hIL10多肽及異源多肽序列之融合蛋白)的情況下，嵌合蛋白可由包含編碼融合hIL10多肽之全部或一部分的第一序列及編碼異源多肽之全部或一部分的第二序列之雜交核酸分子編碼。舉例而言，分子可與六/八組胺酸標籤(SEQ ID NO: 146)融合以促進細菌表現之蛋白質之純化，或與血球凝集素標籤融合以促進真核細胞中表現之蛋白質之純化。第一及第二，不應理解為限制融合蛋白之元素之定向，且異源多肽可在分子之N末端及/或C末端處連接。舉例而言，N末端可連接至靶向域且C末端連接至六組胺酸標籤(SEQ ID NO: 147)純化柄。
待表現之多肽(或融合物/嵌合體)之完整胺基酸序列可用於構築反向轉譯基因。可合成含有編碼融合hIL10多肽之核苷酸序列之DNA寡聚物。舉例而言，可合成編碼所需多肽之各部分的若干小寡核苷酸且隨後接合。個別寡核苷酸通常含有5'或3'突出端用於互補性組裝。 密碼子最佳化
在一些實施例中，編碼胺基酸分子之核酸序列可經「密碼子最佳化」以促進特定宿主細胞類型中之表現。用於在包括哺乳動物、酵母及細菌宿主細胞之廣泛多種表現系統中進行密碼子最佳化之技術為熟知的，且存在在線工具以提供用於在多種宿主細胞類型中表現之密碼子最佳化序列。參見例如Hawash等人(2017) 9:46-53及Mauro及Chappell之 Recombinant Protein Expression in Mammalian Cells: Methods and Protocols, 由David Hacker編輯(Human Press New York)。另外，存在多種基於網路之在線套裝軟體，其可免費用於輔助製備密碼子最佳化核酸序列。 重組產生
在一些實施例中，本揭示之融合hIL10多肽由重組DNA技術產生。在多肽之重組產生之典型實踐中，將編碼所需多肽之核酸序列併入適合於將在其中實現表現之宿主細胞的表現載體中，該核酸序列可操作地連接至由載體編碼且在標靶宿主細胞中具有功能性之一或多個表現控制序列。若將分泌前導序列(信號肽)併入多肽中，則重組蛋白可透過破壞宿主細胞或自細胞培養基回收。
在某些實施例中，融合hIL10多肽可含有相對於不含此取代之野生型hIL10之表現提供增強重組表現的胺基酸取代。在一些實施例中，在轉染或重組細胞中具有增加表現的融合hIL10多肽中之hIL10突變蛋白包含對應於SEQ ID NO: 4之殘基H14之位置處之胺基酸取代。在一些實施例中，對應於SEQ ID NO: 4之H14之位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：H14A、H14D、H14E、H14I、H14K、H14L、H14M、H14N、H14Q、H14R、H14S、H14T、H14Y及H14V。在一些實施例中，對應於SEQ ID NO: 4之H14之位置處之胺基酸取代選自H14D、H14C、H14G、H14P、H14F及H14W。在一些實施例中，對應於SEQ ID NO: 4之H14之位置處之胺基酸取代引起產率之顯著提高，但保持STAT3信號傳導。 表現載體
在組裝(藉由合成、定點突變誘發或另一方法)後，編碼胺基酸分子之核酸序列可插入至表現載體中。用於各種宿主細胞中之多種表現載體係可用的且通常基於用於表現之宿主細胞來選擇。表現載體通常包括但不限於以下中之一或多者：複製起點、一或多個標記基因、強化子元件、啟動子及轉錄終止序列。載體包括病毒載體、質體載體、整合載體及其類似者。質體係非病毒載體之實例。
在一些實施例中，載體可包含可操作地連接至表現控制元件(例如啟動子)之序列。為了促進重組多肽之高效表現，編碼待表現之多肽序列之核酸序列可操作地連接至在所選表現宿主中具有功能性之轉錄及轉譯調節控制序列。 可選標記
表現載體通常含有選擇基因，亦稱為可選標記。此基因編碼在選擇性培養基中生長之經轉型之宿主細胞存活或生長所需的蛋白質。不用含有選擇基因之載體轉型之宿主細胞將無法在該培養基中存活。典型的選擇基因編碼如下蛋白質：(a)賦予針對抗生素或其他毒素(例如安比西林(ampicillin)、新黴素(neomycin)、胺甲喋呤或四環素)之抗藥性，(b)補體營養缺陷性不足，或(c)供應無法自複雜培養基中獲得的關鍵營養物。 調節控制序列
表現載體可含有由宿主有機體識別且可操作地連接至編碼胺基酸分子之核酸序列的調節序列。術語「調節控制序列」、「調節序列」或「表現控制序列」在本文中可互換地使用以指啟動子、強化子及其他表現控制元件(例如多腺苷酸化信號)。參見例如Goeddel (1990)之Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press，San Diego CA USA)。調節序列包括引導核苷酸序列在許多類型之宿主細胞中之構成表現的彼等序列及引導核苷酸序列僅在某些宿主細胞中之表現的彼等序列(例如組織特異性的調節序列)。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計可視諸如待轉型宿主細胞之選擇、所需蛋白質之表現量及其類似者的因素而定。在選擇表現控制序列時，應考慮熟習此項技術者所理解之多種因素。此等因素包括例如序列相對強度、其可控性及其與編碼胺基酸分子之實際DNA序列之相容性，尤其關於可能的二級結構。
在一些實施例中，調節序列為啟動子，其係基於例如尋求表現之細胞類型選擇。啟動子係位於結構基因之起始密碼子上游(5')之未轉譯序列(通常在約100至1000 bp內)，其控制與其可操作地連接之特定核酸序列之轉錄及轉譯。此等啟動子通常分為兩類：誘導型啟動子及組成性啟動子。誘導型啟動子係回應於培養條件之一些變化(例如存在或不存在營養物或溫度變化)引發在其控制下自DNA之轉錄水平提高的啟動子。已熟知由多種潛在宿主細胞所識別之許多啟動子。
T7啟動子可用於細菌中，多角體蛋白啟動子可用於昆蟲細胞中，且細胞巨大病毒或金屬硫蛋白啟動子可用於哺乳動物細胞中。此外，在較高真核細胞之情況下，組織特異性及細胞類型特異性啟動子為廣泛可用的。此等啟動子根據其引導核酸分子在體內給定組織或細胞類型中之表現的能力如此命名。熟習此項技術者十分瞭解可用於引導核酸表現之許多啟動子及其他調節元件。
舉例而言，哺乳動物宿主細胞中自載體之轉錄可受控於：獲自病毒之基因體的啟動子，諸如多瘤病毒、鳥痘病毒、腺病毒(諸如人類腺病毒血清型5)、牛乳頭狀瘤病毒、禽類肉瘤病毒、細胞巨大病毒、反轉錄病毒(諸如鼠類幹細胞病毒)、B型肝炎病毒且最佳地猿猴病毒40 (SV40)；異源哺乳動物啟動子，例如肌動蛋白啟動子、磷酸甘油酯激酶(PGK)或免疫球蛋白啟動子；熱休克啟動子，其限制條件為此等啟動子與宿主細胞系統相容。SV40病毒之早期及晚期啟動子宜以亦含有SV40病毒複製起點之SV40限制性片段形式獲得。
較高真核細胞之轉錄通常藉由將強化子序列插入至載體中而增加。強化子為DNA之順式作用元件，通常為約10至300 bp，其作用於啟動子上以增加其轉錄。強化子係相對定向及位置無關的，見於轉錄單元之5'及3'端、內含子內以及編碼序列自身內。現已知來自哺乳動物基因(血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)之許多強化子序列。然而，通常，將使用來自真核細胞病毒的強化子。實例包括對複製起點之後的部分起作用之SV40強化子、細胞巨大病毒早期啟動子強化子、對複製起點之後的部分起作用之多瘤病毒強化子以及腺病毒強化子。強化子可剪接至表現載體中在編碼序列5'或3'端之位置處，但較佳位於啟動子5'端之位點處。真核宿主細胞中所用之表現載體通常亦將含有終止轉錄及穩定mRNA所需之序列。此等序列通常可獲自真核或病毒DNA或cDNA的5'及偶爾3'未轉譯區。含有上文所列出之組分中之一或多者的適合載體之構築採用標準技術。
除了促進插入的核酸分子之轉錄之序列之外，載體可含有複製起點及編碼可選標記之其他基因。舉例而言，新黴素耐性(neoR)基因賦予表現該基因之細胞G418耐性，且因此准許經轉染細胞之表現型選擇。標記或報導子基因的額外實例包括β-內醯胺酶、氯胺苯醇乙醯基轉移酶(CAT)、腺苷去胺酶(ADA)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、濕黴素-B-磷酸轉移酶(HPH)、胸苷激酶(TK)、lacZ (編碼β-半乳糖苷酶)及黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(XGPRT)。熟習此項技術者可容易地確定給定調節元件或可選標記是否適用於特定實驗情境。
表現載體之適當組裝可依據核苷酸定序、限制酶圖譜及/或生物活性多肽在適合宿主中之表現來證實。 宿主細胞
本揭示進一步提供原核或真核細胞，其含有及表現編碼融合hIL10多肽之一或多個核酸分子。本揭示之細胞為經轉染的細胞，亦即已藉助於重組DNA技術引入有核酸分子，例如編碼融合hIL10多肽之核酸分子的細胞。
在一些實施例中，以重組方式修飾細胞包含載體，該載體包含編碼胺基酸分子之核酸序列。在一些實施例中，以重組方式修飾細胞為原核細胞，諸如細菌細胞。在一些實施例中，以重組方式修飾細胞為真核細胞，諸如哺乳動物細胞。
宿主細胞通常根據其與所選表現載體之相容性、由本發明之DNA序列編碼的產物之毒性、其分泌特徵、其正確地摺疊多肽之能力、其醱酵或培養要求，及純化由DNA序列編碼之產物的難易程度進行選擇。本文中適合於選殖或表現載體中之DNA的宿主細胞為原核細胞、酵母細胞或高級真核細胞。
在一些實施例中，重組融合hIL10多肽或突變蛋白亦可製備於真核細胞，諸如酵母或人類細胞中。適合真核宿主細胞包括昆蟲細胞(可供用於在經培養昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中表現蛋白質之桿狀病毒載體之實例包括pAc系列(Smith等人(1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165)及pVL系列(Lucklow及Summers (1989) Virology 170:31-39))；酵母細胞(用於在酵母S.cerenvisiae中表現的載體之實例包括pYepSecl (Baldari等人(1987) EMBO J. 6:229-234)、pMFa (Kurjan及Herskowitz (1982) Cell 30:933-943)、pJRY88 (Schultz等人(1987) Gene 54:113-123)、pYES2 (Invitrogen Corporation，San Diego，Calif.)及pPicZ (Invitrogen Corporation，San Diego，Calif.))；或哺乳動物細胞(哺乳動物表現載體包括pCDM8 (Seed (1987) Nature 329:840)及pMT2PC (Kaufman等人(1987) EMBO J. 6:187:195))。
適用之哺乳動物宿主細胞株之實例係小鼠L細胞(L-M [TK-]，ATCC#CRL-2648)、藉由SV40轉型之猴腎CV1株(COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚腎細胞株(次選殖用於在懸浮培養物中生長之HEK293或HEK293細胞)；嬰兒倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR (CHO)；小鼠塞特利氏細胞(TM4)；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；人類子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝癌株(Hep G2)。在哺乳動物細胞中，表現載體之控制功能通常藉由病毒調節元件提供。舉例而言，常用啟動子來源於多瘤病毒、腺病毒2、細胞巨大病毒及猿猴病毒40。
融合hIL10多肽可產生於原核宿主，諸如大腸桿菌中，或產生於真核宿主，諸如昆蟲細胞(例如Sf21細胞)或哺乳動物細胞(例如COS細胞、NIH 3T3細胞或希拉細胞)中。此等細胞可購自多種來源，包括美國菌種保存中心(American Type Culture Collection) (Manassas, Va.)。在選擇表現系統時，重要的僅有組分彼此相容。業內人士或一般技術能夠進行此確定。此外，若在選擇表現系統時需要指南，則熟習此項技術者可參考Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1993)及Pouwels等人(Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985 Suppl. 1987)。
在野生型hIL10內源性表現於哺乳動物細胞中時，其表現為包含信號肽之前體蛋白，該信號肽在哺乳動物細胞中高效地裂解，從而使得成熟野生型hIL10多肽之N末端胺基酸為絲胺酸殘基(Ser1)。在哺乳動物細胞中之重組表現之替代方案中，融合hIL10多肽亦可以重組方式表現於細菌細胞中。融合hIL10多肽之直接表現(亦即不作為N末端融合蛋白)引起向融合hIL10多肽添加N末端甲硫胺酸殘基(亦即以Met-Ser-Pro-……開始之N末端序列)。若野生型IL10序列之原生N末端序列之Ser1特徵保持在融合(hIL10A-hIL10B) hIL10多肽之hIL10A之N末端處，則此將相對於融合hIL10多肽之N末端甲硫胺酸在+2位置處產生脯胺酸(P)殘基。在脯胺酸相對於多肽之N末端甲硫胺酸存在於+2位置處時，細菌宿主細胞之內源性細菌甲硫胺醯基胺基肽酶(MAP)通常不會高效地裂解N末端甲硫胺酸。(參見例如圖4B之Frottin等人(2019) The Proteomics of N-terminal Methionine Cleavage, Molecular & Cellular Proteomics 5(12):2336-2349)。因此，包含原生N末端序列之融合hIL10多肽之細菌直接表現可產生融合hIL10多肽物種之混合物，一個分率具有N末端甲硫胺酸殘基且另一物種缺乏N末端甲硫胺酸。融合hIL10多肽物種之此混合物可難以藉由典型製造程序解析，在嘗試將分子結合至融合hIL10多肽之N末端，諸如靶向分子或載體分子，諸如PEG分子時，此可導致處理增加、產物損失及其他困難。然而，藉由自融合hIL10多肽缺失Ser1 (des-Ser1)，+2位置中相對於N末端甲硫胺酸之殘基為甘胺酸殘基(G3)，這實現N末端甲硫胺酸之高效裂解且促進融合hIL10多肽之細菌產生並提供更均勻的融合hIL10多肽產物。在一些實施例中，本揭示提供融合hIL10多肽，其包含融合hIL10多肽之N末端hIL10 (hIL10A)之位置1處的絲胺酸(des-Ser1，根據hIL10編號)的缺失。或者，已顯示hIL10分子之N末端之1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸之缺失使得hIL10分子實質上保持hIL10之活性。在一些實施例中，融合hIL10多肽之hIL10A包含融合hIL10多肽之hIL10A之N末端之1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸的缺失。
在一些實施例中，視用於產生突變蛋白之宿主有機體而定，所獲得之融合hIL10多肽或突變蛋白經醣基化或未經醣基化。若選擇細菌作為宿主，則所產生分子未經醣基化。另一方面，真核細胞通常將引起分子之醣基化。
在一些實施例中，融合hIL10多肽之胺基酸可能含有醣基化模體，尤其序列Asn-X-Ser (N-X-S)或Asn-X-Thr (N-X-T)之N連接醣基化模體，其中X為除脯胺酸之外的任何胺基酸。在此等情況下，需要藉由修飾N連接醣基化模體之序列以防止醣基化來消除此等N連接醣基化模體。在一些實施例中，藉由併入N連接醣基化模體之Asn (N)殘基之保守胺基酸取代來破壞N連接醣基化模體。舉例而言，人類IL10之野生型序列之殘基N116/K117/S118界定潛在NXS N連接醣基化模體。儘管未觀測到哺乳動物中產生之hIL10經醣基化，但在一些實施例中，融合hIL10多肽之hIL10A及/或IL10B可包含位置N116、K117及/或S118中之一或多者處之保守胺基酸取代以排除此推定N連接醣基化模體處之醣基化。
對於原核及真核細胞之其他額外表現系統，參見Sambrook等人(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N. Y.)之章節16及17。參見Goeddel (1990)之Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, Calif.)。 轉染
表現構築體可引入至宿主細胞中，藉此產生本文所揭示之融合hIL10多肽或突變蛋白。將包含編碼胺基酸分子之核酸序列之表現載體經由習知轉型或轉染技術引入至原核或真核宿主細胞中。用於轉型或轉染宿主細胞之適合的方法可見於Sambrook等人(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.)及其他標準分子生物學實驗室手冊。為了促進標靶細胞之轉染，標靶細胞可在促進非病毒載體之吸收的條件下直接暴露於非病毒載體。促進哺乳動物細胞吸收外來核酸之條件之實例為此項技術中熟知的且包括但不限於化學方式(諸如Lipofectamine®，Thermo-Fisher Scientific)、高鹽及磁場(電穿孔)。 細胞培養
細胞可在經修飾適於誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列之基因的習知營養物培養基中培養。哺乳動物宿主細胞可在多種培養基中培養。可商購培養基，諸如Ham's F10 (Sigma)、最低必需培養基((MEM)，Sigma)、RPMI 1640 (Sigma)及杜爾貝科氏改良伊格爾氏培養基((DMEM)，Sigma)適合於培養宿主細胞。此等培養基中之任一者可視需要補充激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷(諸如腺苷及胸苷)、抗生素、痕量元素及葡萄糖或等效能量來源。亦可以熟習此項技術者將已知之合適濃度包括任何其他必要的增補劑。培養條件(諸如溫度、pH及其類似條件)為先前用於經選擇用於表現之宿主細胞之培養條件，且對於一般熟習此項技術者而言將顯而易見。 重組蛋白之回收
若採用分泌前導序列，則以重組方式產生之分子可作為分泌之多肽自培養基回收。或者，分子亦可自宿主細胞溶解產物回收。可在自細胞溶解產物之回收階段期間採用蛋白酶抑制劑，諸如苯甲基磺醯基氟化物(PMSF)以在純化期間抑制蛋白分解降解，且可包括抗生素以防止外來污染物之生長。
各種純化步驟為此項技術中已知的且使用例如親和層析。親和層析利用通常存在於生物大分子中之高度特異性結合位點，根據分子結合特定配體之能力來分離分子。共價鍵以將配體公開呈遞給蛋白質樣品之方式將配體連接至不可溶多孔載體培養基，從而使用一個分子物種之天然特異性結合自混合物分離及純化第二物種。抗體常用於親和層析中。亦可使用尺寸選擇步驟，例如凝膠過濾層析(亦稱為尺寸排阻層析或分子篩層析)用於根據其尺寸分離蛋白質。在凝膠過濾中，使蛋白質溶液通過裝填有半滲透多孔樹脂之管柱。半滲透樹脂具有決定可與管柱分離之蛋白質之尺寸的孔徑範圍。
由轉型宿主表現之重組分子可根據任何適合方法純化。重組分子可使用陽離子交換、凝膠過濾及/或逆相液相層析，從大腸桿菌產生之包涵體中分離，或從產生指定突變蛋白之哺乳動物或酵母培養物之條件培養基中分離。重組分子之實質上純化形式可使用常規生物化學程序自表現系統純化，且可例如用作治療劑，如本文所描述。
在一些實施例中，若分子使用上文所論述之純化標籤表現的情況下，此純化處理法可用於從細胞溶解產物或細胞培養基中分離該分子。在純化標籤為螯合肽的情況下，用於使用固定化金屬親和層析分離此等分子之方法為此項技術中熟知的。參見例如Smith等人之美國專利4,569,794。在一些實施例中，螯合肽為包含4、5、6、7、8、9或10個組胺酸殘基之聚組胺酸多肽序列。此等聚組胺酸螯合肽在科學文獻中亦稱為「His標籤」。在一些實施例中，融合hIL10多肽經修飾以在N末端處包含螯合肽，視情況其中螯合肽經由GS連接子共價連接至融合hIL10多肽。在一些實施例中，融合hIL10多肽經修飾以在C末端處包含螯合肽，視情況其中螯合肽經由連接子共價連接至融合hIL10多肽。
所回收分子之生物活性可藉由此項技術中已知之任何適合方法分析活化，且可在採用分泌前導序列用於表現時，評估為實質上純化形式或呈細胞溶解產物或細胞培養基之部分。 醫藥調配物
在一些實施例中，融合hIL10多肽(及/或編碼融合hIL10多肽之核酸或併有核酸序列且經修飾以表現融合hIL10多肽之重組細胞)可併入組合物，包括醫藥組合物中。此等組合物通常包括多肽或核酸分子及醫藥學上可接受之載劑。醫藥組合物經調配以與其預期投與途徑相容且與待向需要治療或預防之個體投與融合hIL10多肽之治療用途相容。 載劑：
載劑包括無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似者)及其適合混合物之溶劑或分散介質。可例如藉由使用諸如卵磷脂之塗層，藉由在分散液之情況下維持所需粒徑及藉由使用界面活性劑，例如十二烷基硫酸鈉來維持適當流動性。對於靜脈內投與，適合的載劑包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL TM(BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。 緩衝液 ：
術語緩衝液包括諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽之緩衝劑及諸如氯化鈉或右旋糖的用於調節張力之劑。可用酸或鹼，諸如單及/或二-鹼性磷酸鈉、鹽酸或氫氧化鈉調節pH (例如至約7.2至7.8，例如7.5之pH)。 分散液：
一般而言，分散液係藉由將活性化合物併入無菌媒劑中來製備，該無菌媒劑含有鹼性分散介質及來自上文所列舉之成分的其他所需成分。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，其利用先前無菌過濾溶液產生活性成分加上任何額外所需成分的粉末。 防腐劑：
用於向個體非經腸投與之醫藥調配物應為無菌的且應為流體，以促進易注射能力。其應在製造及儲存條件下穩定且經保存免於污染。微生物作用之預防可藉由各種抗細菌及抗真菌劑達成，例如諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯之藥劑；諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉之抗氧化劑；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸、對羥苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞及其類似者。無菌溶液可藉由如下方法製備：將所需量之活性化合物與上文所列舉之成分中之一者或組合一起併入適當溶劑中，視需要隨後進行過濾滅菌。 張力劑：
在許多情況下，組合物中較佳包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化鈉。 投與途徑：
在一些實施例中，本揭示之治療方法涉及向需要治療之個體投與包含融合hIL10多肽(及/或編碼融合hIL10多肽之核酸或表現融合hIL10多肽之以重組方式修飾宿主細胞)的醫藥調配物。可藉由多種投與途徑，包括非經腸投與、經口、局部或吸入途徑向需要治療或預防之個體投與包含本揭示之融合hIL10多肽之醫藥調配物。 非經腸投與：
在一些實施例中，本揭示之方法涉及向需要治療之個體非經腸投與包含融合hIL10多肽(及/或編碼融合hIL10多肽之核酸或表現融合hIL10多肽之以重組方式修飾宿主細胞)的醫藥調配物。非經腸投與途徑之實例包括例如靜脈內、皮內、皮下、經皮(局部)、經黏膜及直腸投與。非經腸調配物包含用於非經腸施加之溶液或懸浮液，可包括媒劑、載劑及緩衝液。用於非經腸投與之醫藥調配物包括無菌水溶液(當可溶於水時)或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。非經腸製劑可封裝於由玻璃或塑膠製成之安瓿、拋棄式注射器或多劑量小瓶中。在一個實施例中，調配物提供於預填充注射器中用於 經口投與：
在一些實施例中，本揭示之方法涉及向需要治療之個體經口投與包含融合hIL10多肽(及/或編碼融合hIL10多肽之核酸或表現融合hIL10多肽之以重組方式修飾宿主細胞)的醫藥調配物。經口組合物(若使用)通常包括惰性稀釋劑或可食用載劑。出於經口治療性投與之目的，活性化合物可併有賦形劑且以呈錠劑、口含錠或膠囊(例如，明膠膠囊)之形式使用。亦可使用流體載劑製備經口組合物以用作漱口水。可包括醫藥學上相容之結合劑及/或佐劑物質作為組合物之一部分。錠劑、丸劑、膠囊、口含錠及其類似者可含有以下成分或具有類似性質之化合物中之任一者：結合劑，諸如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，諸如澱粉或乳糖；崩解劑，諸如褐藻酸、Primogel TM或玉米澱粉；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂或Sterotes TM；滑動劑，諸如膠態二氧化矽；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；或調味劑，諸如胡椒薄荷、水楊酸甲酯或橙味調味劑。 吸入調配物：
在一些實施例中，本揭示之方法涉及向需要治療之個體吸入投與包含融合hIL10多肽(及/或編碼融合hIL10多肽之核酸或表現融合hIL10多肽之以重組方式修飾宿主細胞)的醫藥調配物。在藉由吸入投與之情況下，本發明融合hIL10多肽或編碼其之核酸以氣溶膠噴霧形式自含有適合推進劑，例如諸如二氧化碳之氣體之加壓容器或分配器，或噴霧器遞送。此等方法包括美國專利第6,468,798號中所描述之彼等方法。 經 黏膜及經皮調配物：
在一些實施例中，本揭示之方法涉及向需要治療之個體經黏膜或經皮投與包含融合hIL10多肽(及/或編碼融合hIL10多肽之核酸或表現融合hIL10多肽之以重組方式修飾宿主細胞)的醫藥調配物。對於經黏膜或經皮投與，在調配物中使用適於滲透阻障之滲透劑。此等滲透劑一般為此項技術中已知的，且對於經黏膜投與，包括例如清潔劑、膽汁鹽及梭鏈孢酸衍生物。經黏膜投與可透過使用鼻噴霧劑或栓劑(例如具有習知栓劑基質，諸如可可豆油及其他甘油酯)或用於直腸遞送之保留灌腸劑實現。對於經皮投與，如此項技術中一般已知，將活性化合物調配成軟膏、油膏、凝膠或乳膏，且可併有滲透增強劑，諸如乙醇或羊毛脂。 延長釋放及貯存調配物：
在本揭示之方法之一些實施例中，向需要調配物治療之個體投與融合hIL10多肽以延長釋放融合hIL10多肽。可藉由在組合物中包括延遲吸收之藥劑，例如單硬脂酸鋁及明膠來實現可注射組合物之延長釋放調配物之實例。在一個實施例中，將本發明融合hIL10多肽或核酸與載劑一起製備，以保護融合hIL10多肽不被身體快速消除，諸如受控釋放調配物，包括植入物及微膠囊化遞送系統。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。可使用標準技術製備此等調配物。材料在商業上亦可獲自Alza Corporation及Nova Pharmaceuticals, Inc.。脂質體懸浮液(包括靶向具有針對病毒抗原之單株抗體的經感染細胞的脂質體)亦可用作醫藥學上可接受之載劑。此等物質可根據熟習此項技術者已知之方法製備，例如美國專利第4,522,811號中所描述。 編碼融合 hIL10 多肽之核酸之投與 ：
在本揭示之方法之一些實施例中，藉由編碼融合hIL10多肽之核酸的投與達成向需要治療之個體遞送融合hIL10多肽。用於向個體投與編碼融合hIL10多肽之核酸之方法藉由使用此項技術中已知之方法進行轉染或感染來達成，該等方法包括但不限於描述於McCaffrey等人(Nature (2002) 418:6893)、Xia等人(Nature Biotechnol. (2002) 20:1006-1010)或Putnam (Am. J. Health Syst. Pharm. (1996) 53:151-160勘誤於Am. J. Health Syst. Pharm. (1996) 53:325)中之方法。在一些實施例中，藉由包含編碼融合hIL10多肽之核酸序列之重組表現載體的醫藥學上可接受之調配物的投與來向個體投與融合hIL10多肽，該核酸序列可操作地連接至哺乳動物個體中可操作之一或多個表現控制序列。在一些實施例中，可選擇在有限細胞類型範圍(或單一細胞類型)中可操作之表現控制序列以促進融合hIL10多肽在特定標靶細胞類型中之選擇性表現。在一個實施例中，重組表現載體為病毒載體。在一些實施例中，重組載體為重組病毒載體。在一些實施例中，重組病毒載體為重組腺相關病毒(rAAV)或重組腺病毒(rAd)，尤其衍生自人類腺病毒血清型3及/或5之複製缺陷型腺病毒。在一些實施例中，複製缺陷型腺病毒對E1區具有一或多個修飾，其干擾病毒在人類細胞中起始細胞週期及/或凋亡路徑之能力。複製缺陷型腺病毒載體可視情況包含E3域中之缺失。在一些實施例中，腺病毒為複製勝任型腺病毒。在一些實施例中，腺病毒為經工程改造以在標靶細胞類型中選擇性地複製之複製勝任型重組病毒。
在一些實施例中，尤其對於向個體投與融合hIL10多肽，尤其對於治療個體之腸道疾病或細菌感染，可藉由編碼融合hIL10多肽之以重組方式修飾之細菌噬菌體載體的投與來向個體遞送編碼融合hIL10多肽之核酸。如本文所用，術語「原核病毒」、「細菌噬菌體」及「噬菌體」可在本文中互換使用以描述感染細菌及在細菌內複製之多種細菌病毒中之任一者。細菌噬菌體選擇性地感染原核細胞，從而將融合hIL10多肽之表現限於個體中之原核細胞，同時避免在哺乳動物細胞中表現。能夠選擇廣泛範圍細菌細胞之廣泛多種細菌噬菌體已在科學文獻中廣泛地鑑別且表徵。在一些實施例中，噬菌體經修飾以移除相鄰模體(PAM)。自噬菌體基因體消除Cas9序列降低標靶原核細胞之Cas9核酸內切酶中和編碼融合hIL10多肽之入侵噬菌體的能力。 表現融合 hIL10 多肽之以重組方式修飾細胞的投與
在本揭示之方法之一些實施例中，藉由經修飾以表現融合hIL10多肽之重組宿主細胞的投與來達成向需要治療之個體遞送融合hIL10多肽，可在本文所描述之治療性及預防性應用中投與。在一些實施例中，重組宿主細胞係哺乳動物細胞，例如人類細胞。在一些實施例中，重組宿主細胞係原核細胞，例如與腸菌族，諸如大腸桿菌或乳桿菌屬相關之細菌細胞。
在一些實施例中，編碼融合hIL10多肽之核酸序列(或包含其之載體)可在以重組方式修飾宿主細胞中染色體外維持以供投與。在其他實施例中，編碼融合hIL10多肽之核酸序列可使用至少一種核酸內切酶併入待投與之宿主細胞之基因體中，以促進將核酸序列插入至細胞之基因體序列中。如本文所用，術語「核酸內切酶」用以指能夠催化DNA或RNA分子，較佳地DNA分子內核酸之間的鍵裂解的野生型或變異酶。核酸內切酶在此等核酸內切酶具有長度大於約12鹼基對(bp)，更佳地14至55 bp之聚核苷酸識別位點時稱為「稀切」核酸內切酶。稀切核酸內切酶可用於在基因座處滅活基因或藉由同源重組(HR)整合轉殖基因，亦即藉由在基因座處誘導DNA雙股斷裂(DSB)及在此基因座處藉由基因修復機制插入外源DNA。稀切核酸內切酶之實例包括歸位核酸內切酶(Grizot等人(2009) Nucleic Acids Research 37(16):5405-5419)、由經工程改造之鋅指域之融合產生嵌合鋅指核酸酶(ZFN) (Porteus M及Carroll D., Gene targeting using zinc finger nucleases (2005) Nature Biotechnology 23(3):967-973)、TALEN核酸酶、來自CRISPR系統之Cas9核酸內切酶或經修飾之限制性核酸內切酶以擴展序列特異性(Eisenschmidt等人, 2005; 33(22): 7039-7047)。
在一些實施例中，尤其對於向腸道投與融合hIL10多肽，融合hIL10多肽可藉由以重組方式修飾之原核細胞(例如乳桿菌屬)向個體遞送。用於向腸道遞送重組蛋白之經工程改造之原核細胞的用途為此項技術中已知的。參見例如Lin等人(2017) Microb Cell Fact 16:148。在一些實施例中，表現融合hIL10多肽之經工程改造之細菌細胞可通常以水性懸浮液形式經口投與，或經直腸(例如灌腸劑)投與。 使用方法
本揭示進一步提供藉由投與治療有效量之以下各者治療患有疾病、病症或病狀之個體之方法：(a)融合hIL10多肽；(b)含有融合hIL10多肽作為活性成分之醫藥學上可接受之調配物；(c)重組非病毒或真核病毒或細菌噬菌體載體，其包含可操作地連接至一或多個表現控制序列的編碼融合hIL10多肽之核酸序列；(d)重組原核或哺乳動物細胞，其經基因體修飾以包含可操作地連接至一或多個表現控制序列的編碼融合hIL10多肽之核酸序列；或(e)重組原核或哺乳動物細胞，其包含可操作地連接至一或多個表現控制序列的編碼融合hIL10多肽之核酸。 發炎性及自體免疫病症
適合於用本揭示之融合hIL10多肽(包括包含融合hIL10多肽及/或編碼其之核酸分子的醫藥學上可接受之調配物，包括編碼此融合hIL10多肽之重組病毒)治療的病症包括發炎性或自體免疫疾病，包括但不限於器官排斥反應、移植物抗宿主疾病、自體免疫甲狀腺疾病、多發性硬化症、過敏、哮喘、神經退化疾病包括阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、全身性紅斑性狼瘡症(SLE)、自體發炎性疾病、發炎性腸道疾病(IBD)、克羅恩氏病(Crohn's disease)、糖尿病包括1型或2型糖尿病、發炎、自體免疫疾病、異位性疾病、副腫瘤自體免疫疾病、軟骨發炎、關節炎、類風濕性關節炎、幼年性關節炎、幼年性類風濕性關節炎、幼年性類風濕性關節炎、多關節幼年性類風濕性關節炎、全身性發作的幼年性類風濕性關節炎、幼年性僵直性脊椎炎、幼年性腸病性關節炎、幼年性反應性關節炎、幼年性萊特爾氏症候群、SEA症候群(血清陰性末端病、關節病症候群)、幼年性皮肌炎、幼年性牛皮癬性關節炎、幼年性硬皮病、幼年性全身性紅斑性狼瘡症、幼年性脈管炎、少關節類風濕性關節炎、多關節類風濕性關節炎、全身性發作的類風濕性關節炎、僵直性脊椎炎、腸病性關節炎、反應性關節炎、萊特爾氏症候群、SEA症候群(血清陰性末端病、關節病症候群)。 潰瘍性結腸炎
在一些實施例中，本揭示提供一種治療患有潰瘍性結腸炎之哺乳動物個體之方法，該方法包含以下步驟：向個體投與本揭示之融合hIL10多肽(或包含融合hIL10多肽之醫藥調配物，該投與提供潰瘍性結腸炎之一或多種症狀之改善。在一個實施例中，本揭示提供一種治療患有潰瘍性結腸炎之哺乳動物個體之方法，該方法包含以下步驟：向個體投與融合hIL10多肽，其與選自由以下組成之群的多肽具有至少90%，或者至少91%，或者至少92%，或者至少93%，或者至少94%，或者至少95%，或者至少96%，或者至少97%，或者至少98%，或者至少99%或100%序列一致性：SEQ ID NO: 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、119、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185及186，其中該投與提供潰瘍性結腸炎之一或多種症狀之改善。 IFNγ 誘導之貧血：
在一些實施例中，本揭示提供一種治療及/或預防個體之IFNγ誘導之貧血的方法，該方法包含以下步驟：向個體投與治療有效量之本揭示之融合IL10二聚體，其中該投與引起個體中IFNγ誘導之貧血之一或多種症狀的改善及/或血清IFNγ水平之降低。IFNγ誘導之貧血為患有慢性發炎性疾病之患者之常見併發症。慢性發炎可由多種病狀，諸如感染性疾病、AIDS、惡性病及/或自體免疫疾病，諸如發炎性腸道疾病、類風濕性關節炎引起。活化T細胞分泌IFNγ及介白素2 (IL-2)。已觀測到IFNγ提高TNFα之細胞毒性作用。在IFNγ誘導之貧血之鼠類模型中評估本揭示之組合物(實例32)。如圖44中所繪示，野生型mIL10替代分子之投與使IFNγ誘導之貧血加劇，而本揭示之融合二聚體的投與未使IFNγ誘導之貧血加劇。在一個實施例中，本揭示提供一種治療及/或預防個體之IFNγ誘導之貧血的方法，該方法包含以下步驟：向個體投與融合hIL10多肽，其與選自由以下組成之群的多肽具有至少90%，或者至少91%，或者至少92%，或者至少93%，或者至少94%，或者至少95%，或者至少96%，或者至少97%，或者至少98%，或者至少99%或100%序列一致性：SEQ ID NO: 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、119、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185及186，其中該投與提供IFNγ誘導之貧血之一或多種症狀的改善。 巨噬細胞活化症候群
在一些實施例中，本揭示提供一種治療及/或預防個體之巨噬細胞活化症候群(MAS)之方法，該方法包含以下步驟：向個體投與治療有效量之本揭示之融合IL10二聚體。巨噬細胞活化症候群(MAS)為全身性發炎性病症之潛在危及生命的併發症，包括但不限於全身性幼年特發性關節炎(sJIA)、川崎病(Kawasaki disease)、全身性紅斑性狼瘡症(SLE)及感染，尤其埃-巴二氏病毒(EBV)感染、惡性疾病及原發性免疫缺乏症。CD163升高與MAS相關。如圖29所示，用野生型IL-10治療在第15天PEC誘導CD163表現，而包含hIL10突變蛋白之融合IL-10二聚體未誘導CD163。在一些實施例中，本揭示提供一種治療及/或預防個體之巨噬細胞活化症候群(MAS)之方法，該方法包含以下步驟：向個體投與治療有效量之本揭示之融合IL10二聚體，其中該投與引起巨噬細胞活化症候群之一或多種症狀之改善。在一個實施例中，本揭示提供一種治療及/或預防個體之巨噬細胞活化症候群之方法，該方法包含以下步驟：向個體投與融合hIL10多肽，其與選自由以下組成之群的多肽具有至少90%，或者至少91%，或者至少92%，或者至少93%，或者至少94%，或者至少95%，或者至少96%，或者至少97%，或者至少98%，或者至少99%或100%序列一致性：SEQ ID NO: 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、119、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185及186，其中該投與提供巨噬細胞活化症候群之一或多種症狀之改善。
適合於用本揭示之融合hIL10多肽(包括包含融合hIL10多肽及/或編碼其之核酸分子的醫藥學上可接受之調配物，其包括編碼此融合hIL10多肽之重組病毒)治療的增生性及/或分化病症之其他實例包括但不限於皮膚病症。皮膚病症可涉及真皮、表皮或皮下層中一細胞或一組細胞或層之活性異常，或真皮-表皮接合處之異常。舉例而言，皮膚病症可涉及角質細胞(例如過度增殖基底及緊鄰上基部角質細胞)、黑色素細胞、蘭格漢氏細胞、麥克爾細胞、免疫細胞及表皮層，例如基層(生髮層)、棘層、顆粒層、透明層或角質層中之一或多者中發現之其他細胞的活性異常。在其他實施例中，病症可涉及在真皮層，例如乳頭狀層或網狀層中發現的真皮細胞，例如真皮內皮、纖維母細胞、免疫細胞(例如肥胖細胞或巨噬細胞)之活性異常。
發炎性或自體免疫皮膚病症之實例包括乾癬、牛皮癬性關節炎、皮炎(濕疹)，例如剝脫性皮炎或異位性皮炎、毛髮紅糠疹、玫瑰糠疹、類牛皮癬、苔蘚樣糠疹、扁平苔蘚、光澤苔蘚、魚鱗病樣皮膚病、角化病、皮膚病、斑禿、壞疽性膿皮病、白斑症、類天疱瘡(例如眼瘢痕性類天疱瘡或大皰性類天疱瘡)、蕁麻疹、汗孔角化病、涉及關節囊內壁上皮相關細胞過度增生及發炎的類風濕性關節炎；皮炎，諸如脂溢性皮炎及日光性皮炎；角化症，諸如脂溢性角化症、老年性角化症、光化性角化症、光誘導角化症及毛囊角化症；尋常痤瘡；瘢痕瘤及預防瘢痕瘤形成；痣；小肉瘤，包括疣、濕疣或尖形濕疣，以及人類乳頭瘤病毒(HPV)感染，例如性病疣；白斑病；扁平苔蘚；及角膜炎。皮膚病症可為皮炎，例如異位性皮炎或過敏性皮膚炎，或乾癬。
本揭示之組合物(包括包含融合hIL10多肽及/或編碼其之核酸分子的醫藥學上可接受之調配物，其包括編碼此融合hIL10多肽之重組病毒)亦可向患有(或可能患有)乾癬或牛皮癬性病症之患者投與。術語「乾癬」旨在具有其醫學含義，亦即主要折磨皮膚並產生凸起、增厚、脫屑、非瘢痕性病變之疾病。病變通常為邊界清晰之紅斑丘疹，覆蓋有重疊的閃亮鱗屑。鱗屑通常呈銀色或略帶乳白色。經常會發生指甲受累，導致指甲凹陷、分離、增厚及變色。乾癬有時與關節炎相關，且可能致殘。角質細胞之過度增生為牛皮癬性表皮增生之關鍵特徵，伴隨表皮發炎及角質細胞分化之減少。已調用多個機制來解釋表徵乾癬之角質細胞過度增生。細胞免疫紊亂亦與乾癬之發病機制有關。牛皮癬性病症之實例包括慢性靜止性乾癬、斑塊型乾癬、中度至重度斑塊型乾癬、尋常型乾癬、發疹性乾癬、牛皮癬性紅皮病、全身性膿皰型乾癬、環狀膿皰型乾癬或侷限性膿皰型乾癬。
在一些實施例中，本揭示提供一種治療癌症之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之本揭示之融合IL10多肽，其中該投與引起癌症之一或多種症狀之改善。如先前所論述，慢性發炎與廣泛多種癌症之發展相關。參見例如Coussens及Werb (2002) Nature 420: 860-867。因此，本揭示之經反轉組合物可用於治療及/或預防由慢性發炎引起之癌症。在一個實施例中，與慢性發炎相關之癌症選自由以下組成之群：結腸癌、結腸直腸癌、胰臟癌及肝癌。在一個實施例中，本揭示提供一種藉由向個體投與預防有效量之組合物來預防人類個體之與慢性發炎相關之癌症發生的方法，該組合物包含編碼本揭示之融合IL10多肽之載體或表現該多肽之重組細胞。 給藥
本揭示之融合hIL10多肽相較於野生型IL10展現加寬治療窗口。「治療窗口」係指融合hIL10多肽之給藥範圍，該給藥範圍提供的融合hIL10多肽在個體中之濃度足以在單核球中提供顯著水平之IL10活性(例如STAT3信號傳導)，但該濃度小於促使個體中之濃度足以在T細胞中誘導顯著水平之IL10活性信號傳導的劑量。因此，在一些實施例中，以一水平(其促使個體中之濃度足以在單核球中提供顯著水平STAT3信號傳導但小於促使個體中之濃度足以在T細胞中誘導顯著水平之STAT3信號傳導的劑量)向個體給藥融合hIL10多肽。在一些實施例中，本揭示提供一種治療患有發炎或自體免疫疾病、病症或病狀之個體之方法，其特徵在於投與治療有效量之融合hIL10多肽(或含有融合hIL10多肽作為活性成分之醫藥學上可接受之調配物)，其中該治療有效量為促使個體中之濃度足以在單核球中提供顯著水平STAT3信號傳導但小於促使個體中之濃度足以在T細胞中誘導顯著水平之STAT3信號傳導之劑量的量。
在一個實施例中，本揭示提供一種治療患有發炎或自體免疫疾病、病症或病狀之個體之方法，藉由以使單核球上之IL10活性之Emax相對於T細胞上之此IL10活性之Emax的比率最大化的單體劑量水平投與治療有效量之融合hIL10多肽(或含有融合hIL10多肽作為活性成分之醫藥學上可接受之調配物)。在一些實施例中，本揭示提供一種藉由投與治療有效量之融合hIL10多肽(或含有融合hIL10多肽作為活性成分之醫藥學上可接受之調配物)治療患有疾病、病症或病狀之個體之方法，其中該治療有效量為提供如下濃度之劑量：(a)大於活化人類單核球上之STAT3 EC 20，或者大於活化人類單核球上之STAT3 EC 30，或者大於活化人類單核球上之STAT3 EC 40，或者大於活化人類單核球上之STAT3 EC 50，或者大於活化人類單核球上之STAT3 EC 60、活化人類單核球上之STAT3 EC 70，或者大於活化人類單核球上之STAT3 EC 80，或者大於活化人類單核球上之STAT3 EC 90，或者大於活化人類單核球上之Emax (EC 100)；及(b)小於活化人類T細胞上之STAT3 EC 40，或者小於活化人類T細胞上之STAT3 EC 30，或者小於活化人類T細胞上之STAT3 EC 20，或者小於活化人類T細胞上之STAT3 EC 10，或者小於活化人類T細胞上之STAT3 EC 5。在一些實施例中，本揭示提供一種藉由投與治療有效量之融合hIL10多肽(或含有融合hIL10多肽之醫藥學上可接受之調配物)治療患有疾病、病症或病狀之個體之方法，其中該治療有效量為提供如下濃度之劑量：大於活化人類單核球上之STAT3 EC 20但小於活化人類T細胞上之STAT3 EC 30；或者大於活化人類單核球上之STAT3 EC 50但小於活化人類T細胞上之STAT3 EC 20；或者大於活化人類單核球上之STAT3 EC 70但小於活化人類T細胞上之STAT3 EC 20；或者大於活化人類單核球上之STAT3 EC 80但小於活化人類T細胞上之STAT3 EC 20；或者大於活化人類單核球上之STAT3 Emax但小於活化人類T細胞上之STAT3 EC 30；或或者大於活化人類單核球上之STAT3 EC 50但小於活化人類T細胞上之STAT3 EC 10。 用於調節 IL10 介導之信號傳導之方法
在另一態樣中，本揭示提供用於調節個體之IL10介導之信號傳導的方法。在一些實施例中，該方法包含向個體投與有效量之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含本文所描述之融合hIL10多肽、編碼本文所描述之融合hIL10多肽之核酸分子、包含編碼本文所描述之融合hIL10多肽之核酸分子的以重組方式修飾細胞。在一些實施例中，醫藥組合物包含醫藥學上可接受之載劑。
在一些實施例中，用於調節個體之IL10介導之信號傳導的方法包含確定獲自個體之一或多個細胞中之STAT3介導之信號傳導。在一些實施例中，STAT3介導之信號傳導係藉由選自由以下組成之群的分析來確定：基因表現分析、磷酸流信號傳導分析及酶聯結免疫吸附分析(ELISA)。在一些實施例中，個體中STAT3介導之信號傳導相較於參考水平降低了約20%至約100%。在一些實施例中，所投與組合物導致個體中誘導選自IFN-γ、顆粒酶B、顆粒酶A、穿孔蛋白、TNF-α、GM-CSF及MIP1α之促發炎基因之表現的能力降低。 套組
亦提供包含本揭示之融合hIL10多肽之套組。在一些實施例中，套組包含用於調節個體之IL10介導之信號傳導或治療有需要之個體之健康狀況的一或多個組分，其中該等組分選自本文所描述之融合hIL10多肽、編碼本文所描述之融合hIL10多肽之核酸分子、包含編碼本文所描述之融合hIL10多肽之核酸分子的以重組方式修飾細胞，或包含一或多個組分之醫藥組合物。在一些實施例中，套組之醫藥組合物包含醫藥學上可接受之載劑。 實例
提供以下實例以說明而非限制所主張之本發明。 實例 1 ：方法 蛋白質表現及純化
將蛋白質編碼DNA序列以與野生型hIL10信號肽(AA序列：MHSSALLCCLVLLTGVRA (SEQ ID NO: 98)；DNA序列：ATGCACAGCAGCGCCCTGCTGTGCTGCCTGGTGCTGCTGACCGGCGTGAGAGCC (SEQ ID NO: 125))或用於小鼠分子之小鼠IgG重鏈信號肽(AA序列：MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 100)；DNA序列：ATGGGATGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCTACCGCCACCGGTGTGCACAGC (SEQ ID NO: 126))之C末端His標籤融合物形式插入pEXSyn 2.0中的EcoRI與NotI限制位點之間。
蛋白質藉由暫態轉染表現於expi293細胞中。使用Ni親和層析自所收集之細胞培養上清液純化含有C末端His標籤之多肽。培養上清液補充有5 mM咪唑且在含有Ni-Excel (Cytiva)樹脂之重力管柱上純化，在含有5 mM咪唑之PBS中平衡。分別在補充有5 mM及250 mM咪唑之PBS中進行洗滌及溶離。在儲存及測試之前，將蛋白質透析至PBS中。使用SDS-PAGE、LCMS及分析型SEC評估蛋白質純度及品質。 蛋白質聚乙二醇化
將純化蛋白質在10k Amicon (Millipore)中在100 mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.3)、100 mM NaCl中濃縮至2至3 mg/ml。經由醛化學方法在N末端處對蛋白質進行聚乙二醇化，其中使用20 kDa直鏈PEG (Sunbright® ME-200AL，NOF)對野生型IL10進行聚乙二醇化且使用40 kDa分支鏈PEG (Sunbright® GL2-400AL3)對融合分子進行聚乙二醇化。聚乙二醇化反應在室溫下以端對端旋轉方式進行24至48小時，其中添加相對於蛋白質5倍莫耳過量之PEG及10 mM氰基硼氫化鈉(NaCNBH 3，Sigma)。藉由分析型SEC評估聚乙二醇化進程。將聚乙二醇化反應混合物稀釋10倍且經陽離子交換管柱(SP HP，Cytiva)純化，其中使用20 mM磷酸鈉(pH 6.3)、0.7M NaCl進行溶離步驟，以將蛋白質與游離PEG及NaCNBH 3分離。溶離蛋白質含有未聚乙二醇化、單聚乙二醇化及多聚乙二醇化蛋白質物種之混合物，且用在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中平衡之Superose 6 increase管柱(Cytiva)藉由尺寸排阻層析來進一步純化。將含有聚乙二醇化蛋白質之溶離峰匯集起來且濃縮至0.5至2 mg/ml且在使用之前進行無菌過濾。 表面電漿共振
在配備有抗人類捕捉(AHC)-CM5晶片(Cytiva)之Biacore® T200儀器上在10 mM Hepes、150 mM NaCl、0.05% (v/v)聚山梨醇酯20 (PS20)及3 mM EDTA (HBS-EP+緩衝液)中進行所有實驗。
在AHC表面上捕捉人類或小鼠IL10RαFc (人類：R&D systems #9044-RI；小鼠：Sino biologicals #51298-M02H)。因為IL10分析物可為二價的，所以將配體捕捉密度設定成12-25 RU以將Rmax限於＜ 8.5 RU (在單獨實驗中確定)，以量測非親合條件下之結合動力學。在高效能模式(90秒締合，360秒解離)中以0.74、2.22、6.66、20、60、180 nM注射IL10分析物，隨後用3M MgCl 2(40秒，30 μL/min)進行表面再生。用Biacore T200評估軟體處理減去緩衝液之感測器圖譜且以1:1 Langmuir結合模型進行整體擬合以萃取動力學及親和力常數(k on、k off、K D)。R max範圍為4至8.5 RU，表明表面密度支持在不存在親合力之情況下的真實結合動力學量測。所有分子對IL10Rα之親和力與原生WT分子相當，表明T100L突變或融合並不影響與IL10Rα結合。
未報告與人類或小鼠IL10Rβ結合，因為預期IL10對IL10Rβ之親和力較弱(μM至mM)且在此等條件下不可偵測。 熱穩定性量測
將蛋白質在PBS中以約1 mg/mL調配且經0.1 μm過濾以移除聚集體。各蛋白質負載於4個毛細管中且在Prometheus Panta儀器上，以1℃/分鐘在25至95℃之溫度斜變內量測動態光散射(DLS)及濁度。由於IL10分子中缺乏色胺酸，導致信號較差，因此未對經由差示掃描螢光測定法展開資料進行分析。資料指示經工程改造之分子顯示與IL10 WT相同的熱穩定性，其中聚集在約52℃時開始(DLS)。 pH 穩定性 量測
將約1 mg/mL之蛋白質經24小時透析至10 mM HEPES、150 mM NaCl (pH 7.4)或10 mM乙酸鈉(pH 3.0、4.0、5.0或6.3)及150 mM NaCl中。在透析之後，在Superdex 200 Increase 10/300 GL管柱上藉由分析型SEC測試蛋白質。圖17中之資料指示原生IL10分子在pH ＜ 5.0下解離成單體，而融合蛋白質保持穩定。
表4. 人類融合IL10多肽Biacore結合資料
配體 分析物 k ON(1/Ms) k OFF(1/s) 親和力 (nM) Rmax (RU) 負載 (RU) 計算Rmax (RU) 活性
hIL10RαFc (R&D 9044-RI) hIL10 WT 2.42E+06 1.51E-04 0.06 7.6 22.5 12.5 61%
hIL10 T100L 1.22E+06 3.16E-04 0.26 7.5 23.4 13.0 58%
h_SS0052_AA (hIL10 WT融合) 2.32E+06 2.61E-04 0.11 8.5 23.7 13.2 64%
h_SS0053_AA (hIL10 T100L融合) 3.10E+06 2.27E-04 0.07 8.5 23.6 13.1 65%
表5. 小鼠融合IL10多肽Biacore結合資料
配體 分析物 k ON(1/Ms) k OFF(1/s) 親和力 (nM) Rmax (RU) 負載 (RU) 計算Rmax (RU) 活性
mIL10RαFc (Sino 51298-M02H) mIL10 WT 1.44E+07 1.16E-02 0.81 5.4 12.8 7.1 76%
mIL10 T100L 4.78E+06 9.20E-03 1.92 5.5 13.1 7.3 75%
WC163_AA (mIL10WT融合) 4.70E+06 4.04E-03 0.86 5.3 13.3 7.4 72%
SS0051_AA (mIL10 T100L融合) 7.85E+06 5.75E-03 0.73 6 13.3 7.4 81%
實例 2 ： pSTAT3 流式細胞量測分析
使用人類Miltenyi MACSprep™ PBMC分離套組，自白血球減少系統(LRS)室中收集之健康非吸菸供體血液純化PBMC。將純化PBMC (500,000個細胞/孔)在0.1 pM至100 nM範圍內之濃度下在37℃下用IL10蛋白質刺激20分鐘。將細胞在37℃下用BD Phosflow™ Fix緩衝液I (BD Biosciences，目錄號557870)固定15分鐘。接著洗滌細胞且在-20℃下用經冷凍BD Phosflow™透化緩衝液III (目錄號558050)透化隔夜。洗滌細胞以移除透化緩衝液且在室溫下用人類TruStain FcX (Biolegend，目錄號422301)及小鼠血清阻斷5分鐘。接著將細胞在室溫下用抗體混合液(下表6中所列出)處理1小時。抗體染色後，將細胞洗滌，固定且在Cytek® Aurora Spectral流式細胞儀上操作。使用FlowJo軟體(www.flowjo.com)分析資料。各種細胞譜系係使用其譜系標記圈選且用FlowJo計算pSTAT3表現之幾何平均螢光強度。相較於單核球及CD8 T細胞中之原生WT IL10，融合WT分子之pSTAT3 Emax略高。pSTAT流式細胞量測分析之資料顯示於圖1至圖5及圖8中。
表6
螢光染料 抗體 磷酸化位點 殖株 目錄號 供應商
BV480 CD4 L200 566148 BD Biosciences
BV605 CD8a RPA-T8 301040 Biolegend
BV786 CD56 5.1H11 362550 Biolegend
AF488 pSTAT3 Tyr705 D3A7 4323S CST
PE-Cy5 CD3 UCHT1 555334 BD Biosciences
PerCP-Cy 5.5 CD14 M5E2 301824 Biolegend
APC CD20 1412 340516 Biolegend
實例 3 ：單核球 IL10 活性分析
藉由Ficoll®梯度純化將人類PBMC與獲自非吸菸人類供體之LRS室分離。遵循製造商之方案，使用人類CD14微珠粒(Miltenyi Biotech，目錄號130-050-201)藉由正向選擇自PBMC純化人類單核球。在存在不同濃度之IL10蛋白質(0.05 pM至200 nM)的情況下將單核球在37℃下用1 ng/ml之LPS (Millipore Sigma，目錄號L2630)處理48小時。處理後，將細胞以400 g離心5分鐘且收集上清液。基本上根據製造商之方案，使用MSD套組(Meso Scale Discovery，目錄號K151A9H-4)評定上清液之促發炎細胞介素。資料使用Prism軟體(www.prismsoftware.com)作圖。將未經刺激及單獨LPS處理條件下之細胞介素水平在y軸上標記為未經刺激及LPS。單核球IL10活性分析之資料顯示於圖6A及圖6B以及圖9A及圖9B中。如所提供資料所繪示，具有T100L突變之融合分子抑制LPS誘導之單核球分泌IL-1β及TNF-α。 實例 4 ： CD8 T 細胞 母細胞 IL10 活性分析
藉由Ficoll梯度純化將人類PBMC與獲自非吸菸人類供體之LRS室分離。基本上根據製造商之方案，使用CD8+ T細胞分離套組(Miltenyi Biotech-130-096-495)藉由負向選擇自PBMC純化人類CD8 T細胞。在存在100 pM人類IL2的情況下使用人類T細胞活化/擴展套組(Miltenyi Biotech，目錄號130-091-441)將分離CD8 T細胞在37℃下活化72小時。洗滌活化CD8 T細胞且以磁性方式移除珠粒，隨後將細胞在37℃下用不同濃度之IL10蛋白質(0.05 pM至200 nM)處理72小時。處理後，將細胞以400 g離心5分鐘且收集上清液。基本上根據製造商之方案，使用MSD套組(Meso Scale Discovery，目錄號K151AEL-4)評定上清液之細胞介素IFNγ、顆粒酶A及顆粒酶B。資料使用Prism軟體作圖。CD8 T細胞母細胞IL10活性分析之資料顯示於圖7A至圖7C及圖10A至圖10C中。如圖式中所繪示，具有T100L突變之融合分子在藉由CD8 T細胞母細胞誘導IFNγ、顆粒酶A及顆粒酶B方面較弱，且在濃度高達100 nM時並未達成等效於融合WT之Emax水平。 實例 5 ：小鼠 pSTAT3 流式細胞量測分析
自原生C57BL/6小鼠移除脾臟。藉由將脾臟用注射器之柱塞端在完全RPMI培養基(Gibco RPMI 1640 + 10% FBS + 1%青黴素-鏈黴素)中壓碎及通過70 µM濾網粗濾來分離脾細胞。將細胞以400 g離心5分鐘且丟棄上清液。將細胞集結粒再懸浮於10 ml銨-氯-鉀(ACK)溶解緩衝液(ThermoFisher)中且使其在37℃下靜置2分鐘。洗滌細胞且將其再懸浮於完全RPMI中。將純化脾細胞(500,000個細胞/孔)在0.1 pM至100 nM範圍內之濃度下在37℃下用IL10蛋白質刺激20分鐘。將細胞在37℃下用BD Phosflow™ Fix緩衝液I (BD Biosciences，目錄號557870)固定15分鐘。接著洗滌細胞且在-20℃下用經冷凍BD Phosflow™透化緩衝液III (BD Biosciences，目錄號558050)透化隔夜。洗滌細胞以移除透化緩衝液且在室溫下用小鼠Trustain Fcx (Biolegend，目錄號101320)阻斷5分鐘。接著將細胞在室溫下用抗體混合液(列於下表7中)處理1小時。在抗體染色之後，將細胞洗滌，固定且在Cytek® Aurora Spectral流式細胞儀上操作。使用FlowJo軟體分析資料。各種細胞譜系係使用其譜系標記圈選且用FlowJo計算pSTAT3表現之幾何平均螢光強度。小鼠pSTAT3流式細胞量測分析之資料顯示於圖11A及圖11B中。
表7
螢光染料 抗體 磷酸化位點 殖株 目錄號 供應商
BV480 CD4 RM4-5 565634 BD Biosciences
BV711 CD8a 53-6.7 563046 BD Biosciences
BV750 CD11b M1/70 746910 BD Biosciences
BV786 CD3 17A2 564010 BD Biosciences
AF488 pSTAT3 Tyr705 D3A7 4323S CST
實例 6 ：小鼠脾細胞 LPS 分析
自原生C57BL/6小鼠移除脾臟。藉由將脾臟用注射器之柱塞端在完全RPMI培養基(Gibco RPMI 1640培養基+ 10% FBS + 1%青黴素-鏈黴素)中壓碎及通過70 µM濾網粗濾來分離脾細胞。將細胞以400 g離心5分鐘且丟棄上清液。將細胞集結粒再懸浮於10 ml ACK溶解緩衝液中且使其在37℃下靜置2分鐘。洗滌細胞且將其再懸浮於完全RPMI中。在存在不同濃度之IL10蛋白質(0.1 pM至100 nM)的情況下將純化脾細胞(500,000個細胞/孔)在37℃下用1 ng/ml之LPS (Millipore Sigma，目錄號L2630)處理48小時。處理後，將細胞以400 g離心5分鐘且收集上清液。基本上根據製造商之方案，使用MSD套組(Meso Scale Discovery，目錄號K152A0H-2)評定上清液之促發炎細胞介素。如圖12A及圖12B中所示之資料使用Prism軟體作圖。 實例 7 ： 小鼠 CD8 T 細胞 母細胞分析
自原生C57BL/6小鼠移除脾臟。藉由將脾臟用注射器之柱塞端在完全RPMI培養基(Gibco RPMI 1640 + 10% FBS + 1%青黴素-鏈黴素)中壓碎及通過70 µM濾網粗濾來分離脾細胞。將細胞以400 g離心5分鐘且丟棄上清液。將細胞集結粒再懸浮於10 ml ACK溶解緩衝液中且使其在37℃下靜置2分鐘。洗滌細胞且將其再懸浮於完全RPMI中。遵循製造商之方案，使用套組(Miltenyi Biotech，目錄號130-104-075)藉由負向選擇自PBMC純化小鼠CD8 T細胞。在存在100 pM小鼠IL2的情況下使用小鼠T細胞活化及擴展套組(Miltenyi Biotech-130-093-627)將分離CD8 T細胞在37℃下活化72小時。洗滌母細胞化CD8 T細胞，以磁性方式移除珠粒，隨後在存在100 pM小鼠IL2的情況下將細胞在37℃下用不同濃度之IL10蛋白質(0.1 pM至100 nM)處理72小時。處理後，將細胞以400 g離心5分鐘且收集上清液。基本上根據製造商之方案，使用MSD套組(Meso Scale Discovery，目錄號K1523XR-2)評定上清液之細胞介素(顆粒酶B)。資料使用Prism軟體作圖。小鼠CD8 T細胞母細胞分析之資料顯示於圖13中。具有T100L突變之融合分子在藉由CD8 T細胞母細胞誘導IFNγ、顆粒酶A及顆粒酶B方面較弱，且在濃度高達100 nM時並未達成等效於融合WT之Emax水平。 實例 8 ： 小鼠 CD8 T 細胞 母細胞存活分析
自原生C57BL/6小鼠移除脾臟。藉由將脾臟用注射器之柱塞端在完全RPMI培養基(RPMI + 10% FBS + 1%青黴素-鏈黴素)中壓碎及通過70 µM濾網粗濾來分離脾細胞。將細胞以400 g離心5分鐘且丟棄上清液。將細胞集結粒再懸浮於10 ml ACK溶解緩衝液中且使其在37℃下靜置2分鐘。洗滌細胞且將其再懸浮於完全RPMI中。基本上根據製造商之方案，使用套組(Miltenyi Biotech，目錄號130-104-075)藉由負向選擇自PBMC純化小鼠CD8 T細胞。向用2.5 µg/ml之抗小鼠CD3𝛆抗體(Biolegend 100302)預塗的96孔盤之各孔添加200,000個CD8 T細胞。接著在存在5 µg/ml之抗小鼠CD28抗體(Biolegend 102102)的情況下將細胞在37℃下用0.1 pM至100 nM濃度範圍內之IL10蛋白質處理72小時。接著將細胞以400 g離心5分鐘且丟棄上清液。基本上根據製造商之方案，使用具有膜聯蛋白V用於流式細胞分析技術之死細胞凋亡套組(Invitrogen，目錄號V13241)對細胞進行膜聯蛋白V及碘化丙錠染色。使用FlowJo軟體分析資料。染色後，將細胞在Cytek Aurora Spectral流式細胞儀上操作。使用FlowJo軟體分析資料。如圖14中所示之資料使用Prism軟體作圖。小鼠融合T100L突變在誘導CD8 T細胞母細胞存活方面較弱且在濃度高達100 nM時並未達成等效於融合WT之Emax水平。 實例 9 ：單核球細胞表面 CD64 染色
藉由Ficoll梯度純化將人類PBMC與獲自非吸菸人類供體之LRS室分離。遵循製造商之方案，使用人類CD14微珠粒(Miltenyi Biotech，目錄號130-050-201)藉由正向選擇自PBMC純化人類單核球。將單核球在37℃下用不同濃度之融合IL10多肽(0.1 pM至100 nM)處理48小時。處理後，將細胞以400 g短暫離心5分鐘。接著洗滌細胞且在4℃下用人類Trustain Fcx (Biolegend，目錄號422301)及小鼠血清阻斷15分鐘。接著將細胞在4℃下用CD64抗體(Biolegend，目錄號305006)處理30分鐘。抗體染色後，將細胞洗滌，固定且在Cytek Aurora Spectral流式細胞儀上操作。使用FlowJo軟體分析資料。資料使用Prism軟體作圖。相較於原生二聚體IL10分子(圖15)，具有T100L突變(TP0015)之融合多肽在單核球上展現細胞表面CD64之較低誘導。 實例 10 ： PK 研究
基本上根據實例9之教示產生的融合IL-10多肽以所指示劑量皮下注射至10週齡C57Bl/6J雌性小鼠(RRID:IMSR_JAX:000664)中。經由頜下放血收集血液且使用血清微管(Sarstedt，41.1378.005)製備血清。使用MSD套組(Meso Scale Discovery，K15069M)來量測血清IL-10濃度。在GraphPad Prism 9.3.1軟體中使用四參數(4PL)模型內插濃度。PK研究之資料顯示於圖16中。相較於原生WT IL-10，融合T100L在單次劑量注射分子後72小時具有較佳暴露作用。 實例 11 ： 物種交叉反應性之評估 ， 小鼠脾細胞 LPS 分析
為了評估小鼠中人類IL10分子之物種交叉反應性，自原生C57BL/6小鼠移除脾臟。藉由將脾臟用注射器之柱塞端在完全RPMI培養基(RPMI + 10% FBS + 1%青黴素-鏈黴素)中磨碎及通過70 µM濾網粗濾來分離脾細胞。將細胞以400 g短暫離心5分鐘且丟棄上清液。將細胞集結粒再懸浮於10 ml ACK溶解緩衝液中且使其在37℃下靜置2分鐘。洗滌細胞且將其再懸浮於完全RPMI中。在存在不同濃度之IL10蛋白質(0.05 pM至200 nM)的情況下，將純化脾細胞(500,000個細胞/孔)在37℃下用1 ng/ml之LPS (Millipore Sigma：L2630)處理48小時。處理後，將細胞以400 g短暫離心5分鐘且收集上清液。遵循製造商之方案，使用MSD套組(Meso Scale Discovery)評定上清液之促發炎細胞介素。資料使用Prism軟體作圖。資料呈現於附圖之圖19A及圖19B中。由對LPS誘導之IL-6及TNF-α分泌之抑制所評定，人類STK-030 (h_SS0165_AA_PEG；SEQ ID NO: 123)顯示對小鼠之良好跨物種反應性。 實例 12 ： 評估小鼠 CD8 T 細胞 母細胞之顆粒酶 B 分泌
自原生C57BL/6小鼠移除脾臟。藉由將脾臟用注射器之柱塞端在完全RPMI培養基(RPMI + 10% FBS + 1%青黴素-鏈黴素)中磨碎及通過70 µM濾網粗濾來分離脾細胞。將細胞以400 g短暫離心5分鐘且丟棄上清液。將細胞集結粒再懸浮於10 ml ACK溶解緩衝液中且使其在37℃下靜置2分鐘。洗滌細胞且將其再懸浮於完全RPMI中。遵循製造商之方案，使用套組(Miltenyi Biotech- 130-104-075)藉由負向選擇自PBMC純化小鼠CD8 T細胞。在存在100 pM小鼠IL2的情況下使用小鼠T細胞活化及擴展套組(Miltenyi Biotech- 130-093-627)將經分離之CD8 T細胞在37℃下母細胞化72小時。洗滌母細胞化CD8 T細胞且將細胞在存在100 pM小鼠IL2的情況下，在37℃下用不同濃度之IL10蛋白質(0.05 pM至200 nM)處理72小時。處理後，將細胞以400 g短暫離心5分鐘且收集上清液。遵循製造商之方案，使用MSD套組(Meso Scale Discovery：K1523XR-2)評定上清液之細胞介素(顆粒酶B)。資料使用Prism軟體作圖。資料呈現於附圖之圖20中。資料表示為WT IL-10 (h_DR2339_AA)之最大分泌百分比。人類STK-030 (h_SS0165_AA_PEG；SEQ ID NO: 123)在誘導顆粒酶B分泌方面較弱，其所實現之最大顆粒酶B分泌僅為WT IL-10之32%。hSTK-030顯示小鼠分析中功能之骨髓偏差，與人類細胞分析中所觀測到的類似。 實例 13 ： 物種交叉反應性 (CYNO) 之評估
在存在不同濃度之IL10蛋白質(0.05 pM至200 nM)的情況下將來自食蟹猴之100 μl的Li-肝素血液在37℃下用1 ng/ml之LPS (Millipore Sigma：L2630)處理48小時。處理後，將樣品以400 g短暫離心5分鐘且收集上清液。遵循製造商之方案，使用MSD套組(Meso Scale Discovery)評定上清液之促發炎細胞介素。資料使用Prism軟體作圖。資料提供於附圖之圖21中。由對LPS誘導之IL-6分泌之抑制所評定，人類STK-030 (h_SS0165_AA_PEG；SEQ ID NO: 123)顯示對食蟹猴之良好跨物種反應性。 實例 14 ： 潰瘍性結腸炎之 DSS 模型中之活體內評估
評估本揭示之IL10變異體在潰瘍性結腸炎之鼠類DSS模型中之治療功效。鼠類DSS誘導之結腸炎模型廣泛使用且與人類潰瘍性結腸炎具有許多類似性。Chassaing, B.等人(2014) Current Protocols in Immunology 104:15.25.1-15.25.14。
成熟(缺乏內源性18個胺基酸的信號肽)野生型鼠類IL10分子之典型序列(UniProt參考P18893)為具有以下胺基酸序列之160個胺基酸的多肽： SRGQYSREDNNCTHFPVGQSHMLLELRTAFSQVKTFFQTKDQLDNILLTDSLMQDFKGYLGCQALSEMIQFYLVEVMPQAEKHGPEIKEHLNSLGEKLKTLRMRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKSDFNKLQDQGVYKAMNEFDIFINCIEAYMMIKMK (SEQ ID NO: 187) 在參考本文所描述之鼠類IL10變異體分子中之胺基酸取代或缺失時，參考典型野生型成熟mIL10多肽(SEQ ID NO: 187)。
為了在小鼠DSS模型中進行活體內實驗，使用人類IL10變異體之鼠類代替物。下表8描述在DSS研究中使用聚乙二醇化鼠類IL10 (mIL10)測試物品。m_DR756_AA用作野生型分子之鼠類替代物且展現與野生型mIL10實質上等效的活性。m_DR2677_AA為融合mIL10二聚體，除3個N末端胺基酸之缺失(ΔS1/ΔR2/ΔG3)及Q4E胺基酸取代之外實質上亦包含mIL10野生型序列以避免焦麩胺酸形成且促進N末端聚乙二醇化，m_DR2678_AA為融合mIL10二聚體，包含具有T100L突變之IL10變異體，同樣包含3個N末端胺基酸之缺失(ΔS1/ΔR2/ΔG3)及Q4E胺基酸取代以避免焦麩胺酸形成且促進N末端聚乙二醇化。
表8. DSS研究鼠類測試物品
名稱 多肽 聚乙二醇化
m_DR756_AA_PEG m_DR756_AA N末端20 kDa直鏈PEG
m_DR2677_AA_PEG m_DR2677_AA N末端40 kDa PEG分支鏈(2×20) PEG
m_DR2677_AA_PEG m_DR2678_AA N末端40 kDa PEG分支鏈(2×20) PEG
m_DR756_AA_PEG、m_DR2677_AA_PEG、m_DR267_AA_PEG測試物品之親本多肽之胺基酸序列提供於下表9中：
表9. 聚乙二醇化測試物品之親本多肽
SEQ ID# 名稱 描述 hIL10突變蛋白單體序列
188 m_DR756_AA：(WT IL-10) 丙胺酸；8×His螯合肽；Gly-Ser連接子；ΔS1/ΔR2/ΔG3 mIL10 AHHHHHHHHGSQYSREDNNCTHFPVGQSHMLLELRTAFSQVKTFFQTKDQLDNILLTDSLMQDFKGYLGCQALSEMIQFYLVEVMPQAEKHGPEIKEHLNSLGEKLKTLRMRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKSDFNKLQDQGVYKAMNEFDIFINCIEAYMMIKMKS (SEQ ID NO:188)
189 m_DR2677_AA：(融合WT IL-10) [ΔS1/ΔR2/ΔG3/Q4E mIL10]-[wt mIL10 1-160]-GGS連接子-His8 EYSREDNNCTHFPVGQSHMLLELRTAFSQVKTFFQTKDQLDNILLTDSLMQDFKGYLGCQALSEMIQFYLVEVMPQAEKHGPEIKEHLNSLGEKLKTLRMRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKSDFNKLQDQGVYKAMNEFDIFINCIEAYMMIKMKSSRGQYSREDNNCTHFPVGQSHMLLELRTAFSQVKTFFQTKDQLDNILLTDSLMQDFKGYLGCQALSEMIQFYLVEVMPQAEKHGPEIKEHLNSLGEKLKTLRMRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKSDFNKLQDQGVYKAMNEFDIFINCIEAYMMIKMKSGGSHHHHHHHH (SEQ ID NO:189)
190 m_DR2678_AA：(融合T100L) [ΔS1/ΔR2/ΔG3/Q4E/T100L mIL10]-[T100L mIL10 1-160]-GGS連接子；8×His螯合肽 EYSREDNNCTHFPVGQSHMLLELRTAFSQVKTFFQTKDQLDNILLTDSLMQDFKGYLGCQALSEMIQFYLVEVMPQAEKHGPEIKEHLNSLGEKLK L LRMRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKSDFNKLQDQGVYKAMNEFDIFINCIEAYMMIKMKSSRGQYSREDNNCTHFPVGQSHMLLELRTAFSQVKTFFQTKDQLDNILLTDSLMQDFKGYLGCQALSEMIQFYLVEVMPQAEKHGPEIKEHLNSLGEKLK L LRMRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKSDFNKLQDQGVYKAMNEFDIFINCIEAYMMIKMKSGGSHHHHHHHH (SEQ ID NO:190)
簡言之，DSS研究如下進行。在研究第0至6天，以飲用水向雌性C57BL/6小鼠(Jackson Laboratories)隨意投與2.5% DSS。向小鼠提供普通水充當陰性疾病對照組。根據下表10，用PBS、m_DR2677_AA-PEG (每隔一天皮下投與3或10微克)或m_DR2678_AA-PEG (每隔一天皮下投與3或10微克)對小鼠進行治療。
表10. DSS研究治療組
組 DSS 治療 劑量[ug] 時程
A 水 PBS - -
B 2.5% PBS - D0、D2、D4、D6、D8
C 2.5% m_DR756_AA_PEG 3 D0、D2、D4、D6、D8
D 2.5% m_DR756_AA_PEG 10 D0、D2、D4、D6、D8
E 2.5% m_DR2677_AA_PEG 3* D0、D2、D4、D6、D8
F 2.5% m_DR2677_AA_PEG 10** D0、D2、D4、D6、D8
G 2.5% m_DR2678_AA_PEG 3 D0、D2、D4、D6、D8
H 2.5% m_DR2678_AA_PEG 10 D0、D2、D4、D6、D8
*在第0天，治療組E中之小鼠接受劑量2.5 μg之m_DR2677_AA_PEG。 **在第0天，治療組F中之小鼠接受劑量8.5 μg之m_DR2677_AA_PEG且小鼠2、3及4不接受第5次劑量。
在整個研究期間評估小鼠之體重。在DSS起始之前三天(研究第-3天)及在DSS投與及測試物品治療之後對小鼠進行稱量。與各治療組之體重相關的資料提供於附圖之圖22及圖23中。顯示平均體重及平均體重% +/- SEM。體重百分比經計算為= (研究第X天之體重-研究第-3天之基線體重)/(研究第-3天之基線體重)。在研究第15天評估小鼠之終末體重且第15天之平均體重% +/- SEM顯示於附圖之圖24中。藉由單向ANOVA用Holm-Šídák's多重比較測試來確定顯著性。****p＜0.0001。如圖22、圖23及圖24中之資料所示，融合IL10多肽防止DSS相關之體重減輕。
在研究第15天，末梢血經由心臟穿刺收集且收集至血清收集管中。藉由將凝結血液以10,000 RPM離心5分鐘來分離生前及末梢血清。在離心之後收集血清且暫時將其置放於冰上，隨後冷凍以供稍後分析。
在第15天藉由CO 2窒息使小鼠生命終結。收集結腸，清除糞便，且量測長度。回應於各種治療與結腸長度相關之資料提供於圖25中且反映平均結腸長度+/- SEM。如圖25中呈現之資料所示，m_DR756_AA_PEG、m_DR2677_AA_PEG及m_DR2678_AA_PEG顯示針對DSS相關結果及病理學之保護證據。
在研究第4天(D4)評估血容比水平。基本上根據製造商說明書，將在研究第4天經由頜下血液收集而收集之血液樣品置放於血清收集管中且使用Hemata Stat II血容比微量離心機(EKF Diagnostics, Inc.)進行定量。與血容比水平相關之資料提供於附圖之圖26中且說明平均血容比+/- SEM。RBC =紅血球。如所繪示，可在用m_DR756_AA_PEG後第4天觀測到HCT之推定降低。
在研究期間的各個時間點收集血清且量測血清細胞介素(IFNγ、IL10、IL-1B、IL6、TNF-a、IL-4、IL-5、IP10、IL17A/F、MIP1a)水平。基本上根據製造商說明書，使用Meso Scale Discovery多重套組(Meso Scale Discovery)評定血清細胞介素。與各個治療組之此等細胞介素水平相關之資料提供於附圖之圖27及圖28中且反映平均分析物濃度(pg/mL) +/- SEM。如圖27中所繪示，用m_DR2677_AA_PEG及m_DR2678_AA_PEG治療與血清IL-4及IL-5 (T H2細胞介素)升高相關，m_DR756_AA_PEG及融合IL10突變蛋白顯示全身性IFNγ及TNFα降低且血清IL-4 (T H2細胞介素)潛在地升高。如圖28中所繪示，用m_DR756_AA_PEG及m_DR2677_AA_PEG治療顯示血清IP-10及MIP1a升高，用m_DR2678_AA_PEG未發現。
在D15處死之後收集腹膜滲出細胞，且藉由流式細胞分析技術偵測CD45+ CD11b+ F4/80+巨噬細胞上之CD163或CD64表現。資料提供於圖29及圖30中。相對於治療組中之各者，在縱軸上說明平均CD163或CD64陽性巨噬細胞百分比+/- SEM。m_DR756_AA_PEG、m_DR2677_AA_PEG誘導之CD163表現比用_DR2678_AA_PEG觀測到的更高。用m_DR2678_AA_PEG未發現巨噬細胞上之MCD163上調。
在評估結腸長度之後，接著將分離結腸在室溫下置放於福爾馬林中24小時，隨後使用標準化程序在組織處理器上進行處理且嵌入至FFPE區塊中。FFPE區塊以5 μm厚度分割且置放於帶電玻璃載玻片上。
對所收集組織進行多重免疫螢光分析，以分析以下標記是否存在：RORγ、CD11b與CD3e。用於免疫組織化學分析之初級抗體係：抗小鼠：工作濃度1:750之RORγ (Abcam，目錄ab207802)；工作濃度1:3000之抗CD11b (Abcam，目錄ab216445)；及工作濃度1:200之抗CD3e (Thermo/Invitrogen，目錄MA1-90582)。將所有抗體在室溫下培育60分鐘。
在Leica Bond Rx (Leica Biosystems)自動化染色系統上用抗體對載玻片進行染色。自動化染色系統經程式化以進行以下步驟：(a)在存在BOND-PRIME抗原決定基修復溶液2 (ER2) (Leica Biosystems)的情況下在97℃下進行熱誘導之抗原決定基修復(HIER)及脫蠟20分鐘；(b)進行過氧化酶淬滅；(c)與初級抗體一起培育60分鐘；(d)與二級抗體聚合物一起培育30分鐘；及(e)在室溫下偵測螢光團10分鐘。用於使信號可視化之螢光團包括Opal 520、Opal 620及Opal 690螢光團(Akoya Biosciences，Marlborough MA)。
為進行標記，按順序進行染色，藉由在兩個程序之間包括第二抗原修復步驟以使用BOND-PRIME抗原決定基修復溶液1 (ER1) (Leica Biosystems)去除來自先前標記之任何未結合試劑。包括適當的交叉反應性對照以供品質檢查。
在完成螢光染色後，用Akoya spectral DAPI (Akoya Biosciences)對組織進行對比染色且使用ProLong™ Gold Antifade Mountant (ThermoFisher Scientifid/Invitrogen，目錄號：P36930)水性封固劑蓋載玻片。使用Akoya Vectra多光譜成像系統(Akoya Biosciences)及Akoya Vectra InForm分析軟體套(Akoya Biosciences)進行全載玻片掃描及信號定量。對特定染色信號進行數位定量，且藉由使用Akoya Phenoptr Reports套裝軟體(Akoya Biosciences)自所有影像整理及彙總資料。
評估組織之結腸上皮損傷。用Visiopharm軟體(Visiopharm A/S，DK 2970-Hørsholm，Denmark)評估全載玻片掃描之蘇木素及伊紅(H&E)染色的小鼠結腸切片的完整上皮層。各個治療組之資料提供於附圖之圖31中且反映平均結腸上皮損傷百分比。如所繪示，測試物品m_DR756_AA、m_DR2677_AA_PEG及m_DR2678_AA_PEG保護免受DSS相關上皮損傷。
用inForm影像分析軟體(Akoya Biosciences)評估全載玻片掃描之多重免疫螢光染色的小鼠結腸切片中CD11b及CD4+ RorG T細胞之存在。各個治療組之資料提供於附圖之圖 32中且反映平均細胞數/mm 2。 實例 15 ： 骨髓細胞中隨時間推移之 pSTAT3 誘導
藉由流式細胞分析技術評估分離骨髓細胞中pSTAT3之誘導。藉由基於譜系標記之免疫細胞子集鑑別出免疫細胞群體。將全血收集至K2-EDTA管中且將100 µl血液/小鼠在37℃下用2 ml預溫熱之1× Lyse/Fix Phosphoflow溶液(BD #558049)處理10分鐘。細胞藉由以500 g離心5分鐘集結，隨後用FACS緩衝液(PBS + 2% FBS)洗滌。細胞藉由添加1 mL之經冷凍透化緩衝液III (BD #558050)透化且在-20℃下培育隔夜。將細胞用FACS緩衝液洗滌以移除透化緩衝液且在室溫下用小鼠FcX (Biolegend #101320)及大鼠血清阻斷5分鐘。接著將細胞在室溫下用下表11中所列出之抗體混合液處理1小時。
表11. 抗體混合液組分
螢光染料 抗體 植株 目錄號 供應商
BV421 CD25 PC61 102034 Biolegend
BV480 CD4 RM4-5 565634 BD Biosciences
BV711 CD8a 53-6.7 563046 BD Biosciences
BV750 CD11b M1/70 101267 Biolegend
BV786 CD3 UCHT1 565491 BD Biosciences
AF488 pSTAT3 D3A7 4323S Cell Signaling Technology
PE pSTAT1 REA159 130-129-183 Miltenyi Biotec
PerCP-Cy 5.5 B220 RA3-6B2 552771 BD Biosciences
AF647 pSTAT5 47 562076 BD Biosciences
APC/Fire750 NK1.1 PK136 108752 Biolegend
抗體染色後，將細胞洗滌，固定且在Cytek Aurora Spectral流式細胞儀上操作。使用Cell engine軟體分析資料。各種細胞譜系係使用其譜系標記圈選且用Cell engine計算pSTAT3表現之中值螢光強度。CD4 T細胞鑑別為活CD3+ CD4+細胞；CD8 T細胞鑑別為活CD3+ CD8+細胞；B細胞鑑別為活CD19+細胞。顯示個別及平均pSTAT3陽性細胞百分比+/- SEM。資料提供於附圖之圖33中。如圖33中所繪示，m_DR2678_AA_PEG在投與之後48及72小時展現PBMC中之pSTAT誘導證據。 實例 16 ： 藥物動力學參數之活體內評估 ：
在C57BL/6小鼠之活體內研究中評估m_DR756_AA_PEG及m_DR2678_AA_PEG測試物品之藥物動力學參數。簡言之，在研究第0天(D0)，雌性C57BL/6小鼠接受10微克m_DR756_AA_PEG之單次皮下投與，或10或30微克m_DR2678_AA_PEG之單次皮下投與。在各個時間點經由頜下血液收集將生前血液樣品收集至血清收集管中。末梢血經由心臟穿刺收集且收集至血清收集管中。藉由將凝結血液以10,000 RPM離心5分鐘來分離生前及末梢血清。在離心之後收集血清且暫時將其置放於冰上，隨後冷凍以供稍後分析。基本上根據製造商說明書，使用小鼠IL-10 MSD U-plex套組(Meso Scale Discovery)對血清中之測試物品進行定量。將各個別測試物品用作偵測標準。隨時間推移收集血清且隨時間推移對測試物品之血清濃度進行定量且資料提供於附圖之圖34中，反映平均測試物品濃度(ng/mL) +/- SEM。如圖34中所繪示，m_DR756_AA_PEG、m_DR2677_AA_PEG及m_DR2678_AA_PEG顯示高持續暴露。 實例 17 ： 評估 LPS 休克模型中之 IL-10 變異體
LPS休克模型用作評估治療劑在敗血症治療中之潛在效用的方法。Garrido等人(2004) 「 Experimental models of sepsis and septic shock: an overview」. Acta Cirúrgica Brasileira 19.2；Poli-de-Figueiredo等人(2008) Experimental models of sepsis and their clinical relevance. Shock, 30(7):53-59。以下LPS休克模型用於評估測試物品在敗血症治療中之功效。用腹膜內投與之單次100 μg劑量之LPS刺激雌性BALB/c小鼠。緊接在LPS攻擊之後，用0.5 μg m_DR756_AA或10 μg m_DR2677_AA對小鼠進行治療。在LPS投與之後1.5及6小時的時間點分別經由頜下血液收集及終末心臟穿刺將血液樣品收集至血清收集管中。藉由將凝結血液以10,000 RPM離心5分鐘來分離血清。在離心之後收集血清且暫時將其置放於冰上，隨後冷凍以供稍後分析。遵循製造商之建議，使用Meso Scale Discovery多重套組評定血清細胞介素(IL10、TNFα、IL6及KC/GRO)。與1.5小時血清細胞介素水平相關之資料提供於附圖之圖35中。與6小時血清細胞介素水平相關之資料提供於附圖之圖36中。顯示平均分析物濃度(pg/mL) +/- SEM。 實例 18 ： 評估單次劑量藥效學及藥物動力學參數
為了確定測試物品之藥物動力學特性，用單次劑量之m_DR756_AA_PEG (在第0天(D0)皮下投與10 μg)或m_DR2678_AA_PEG (在D0皮下投與0.3、3或30 μg)對雌性C57BL/6小鼠進行治療。在各個時間點經由頜下血液收集將生前血液樣品收集至血清收集管中。末梢血經由心臟穿刺收集且收集至血清收集管中。藉由將凝結血液以10,000 RPM離心5分鐘來分離生前及末梢血清。在離心之後收集血清且暫時將其置放於冰上，隨後冷凍以供稍後分析。使用基於MSD之偵測(Meso Scale Discovery)對血清中之測試物品進行定量。將各個別測試物品用作偵測標準。在各個時間點收集血清且隨時間推移對測試物品之血清濃度進行定量。資料提供於附圖之圖37中。顯示平均測試物品濃度(ng/mL) +/- SEM。如圖37中所繪示，m_DR2678_AA_PEG相較於m_DR756_AA_PEG顯示改良之全身性暴露。 實例 19 ： 評估隨時間推移之骨髓細胞 pSTAT3 誘導
如下評估測試物品之作用以評估其隨時間推移誘導骨髓細胞中之pSTAT3的能力。將來自以上實例18中描述之實驗的生前或末梢全血收集至EDTA管中以用於pSTAT或表面免疫表型分型流式細胞分析技術。將收集至EDTA管中的100至200 μL之全血轉移至96孔深孔盤。向2 ml總體積中添加BD Phosflow Lyse/Fix緩衝液(目錄號558049)且在37℃下培育10分鐘。將細胞以600 g離心7分鐘，移除上清液，且用1 ml PBS/2% FBS/孔洗滌兩次。渦動細胞集結粒以使其再懸浮且添加1 ml預冷凍BD透化緩衝液III (目錄號558050)且將細胞儲存在-80℃下。在結束生前樣品收集之後，將細胞解凍且洗滌三次以移除透化緩衝液。將細胞在冰上用1:25 TruStain FcX (Biolegend #101320)與1:50大鼠血清阻斷10分鐘，接著與抗體混合液一起在4℃下培育30分鐘(參見下表12)。將細胞洗滌兩次且再懸浮於PBS/2% FBS中且在Cytek Aurora Spectral細胞計數器上操作。使用Cell Engine分析資料。細胞使用譜系標記圈選且計算pSTAT1及pSTAT3之中值螢光強度。
表12 pSTAT染色圖
螢光染料 抗體 植株 來源 目錄號
PE pSTAT-1 (Y701) REA159 Miltenyi Biotec 130-129-183
AF488 pSTAT-3 (Y705) C3A7 Cell Signaling Tech 4323S
BV786 CD3 17A2 BD Biosciences 564010
APC CD4 RM4-5 Biolegend 100516
BV711 CD8 53-6.7 BD Biosciences 563046
PacBlue B220 RA3-6B2 BD Biosciences 558108
BV750 cd11b M1/70 Biolegend 101267
Trustain FcX Biolegend 101320
為了評估隨時間推移之骨髓細胞pSTAT3誘導，隨時間推移收集周邊血液且藉由流式細胞分析技術偵測pSTAT3。來自CD11b Int(CD3 -B220 -CD11b Intermediate)之資料顯示如下。資料提供於附圖之圖38中。亦顯示個別及平均中值螢光強度+/- SEM。 實例 20 ：免疫表型分型方法
相對於實例27至31中進行之評估，採用以下免疫表型分型方法。在96孔深孔盤中對經分離細胞進行染色。首先，遵循製造商之方案，用Zombie NIR Fixable Viability套組(Biolegend #423105)對細胞進行染色。將細胞洗滌兩次，再懸浮於50 μl殘餘體積中，且向細胞中添加抗小鼠CD32 (1:50)及大鼠血清(1:50)之阻斷混合液以阻斷非特異性結合且在4℃下培育10分鐘。向細胞中添加30種抗體之主混合物(參見下表)且在4℃下培育30分鐘。將細胞洗滌兩次，接著固定，且使用FoxP3/轉錄染色緩衝液集(ThermoFisher #00-5523-00)進行透化。將細胞在4℃下用抗小鼠CD32 +大鼠血清阻斷10分鐘。向細胞添加FoxP3及顆粒酶B抗體且在4℃下培育30分鐘。將細胞洗滌兩次，再懸浮於PBS/2% FBS中且在Cytek Aurora Spectral細胞計數器上操作。使用Cell Engine進行分析。基於已知定義標記之陽性染色及其他標記之表現缺乏來鑑別出細胞子集。對於陽性與陰性之間的區別並非雙峰的標記，使用螢光減一(FMO)對照。在Cell Engine內計算對中值螢光強度及陽性細胞百分比之後續分析。
表13 免疫表型分型染色圖
螢光團 抗體 植株 來源 目錄號
BUV395 F480 T45-2342 BD Biosciences 565614
BUV496 MHC II (I-A/I-E) M5/114.15.2 BD Biosciences 750281
BUV563 Ly6G 1A8 BD Biosciences 612921
BUV615 CD163 TNKUPJ Invitrogen 366-1631-82
BUV661 CD80 18-1OA1 BD Biosciences 741515
BUV737 Ly6C HK1.4.rMAb BD Biosciences 755201
BUV 805 CD35 8C12 BD Biosciences 741960
BV421 CD38 90 Biolegend 102732
SB436 CD25 PC61.5 invitrogen 62-0251-82
PB CD11b M1/70 Biolegend 101224
BV480 CD62L MEL-14 BD Biosciences 746726
BV570 NK1.1 PK136 Biolegend 108733
BV605 CD19 6D5 Biolegend 115540
V610 CD4 RM4-5 Cytek R7-20269
BV650 CD83 Michel-19 Biolegend 121515
BV711 NKp46 29A1.4 Invitrogwn 407-3351-82
BV750 CD3 17A2 Biolegend 100249
BB515 ICOS C398.44 BD Biosciences 585880
FITC CD16 S17014E Biolegend 158008
AF532 CD45 30-F11 Invitrogen 58-0451-82
PerCPCY5.5 CD8a 53-6.7 Biolegend 100734
PerCP-Vio 700 FoxP3 FJK-16s Invitrogen 46-5773-82
APC TCRb H57-597 Biolegend 109212
AF647 CD14 Sa14-2 Biolegend 123328
AF700 CD44 IM7 Biolegend 103026
Zombie NIR dead n/a Biolegend 423105
APCFire 750 CD64 X54-5/7.1 Biolegend 139334
PE CD150 Q38-480 BD Biosciences 562651
PE/Dazzle594 CD86 GL-1 Biolegend 105042
PE/Fire640 CD127 S18006K Biolegend 158214
PECy5 PD-1 29F.1A12 Biolegend 135256
PE/Fire 700 CD11c QA18A72 Biolegend 161108
PECy7 顆粒酶B NGZB Invitrogen 25-8898-92
pur CD32 S17012B Biolegend 156402
實例 21 ： 評估腹膜滲出細胞清除劑 CD163 及 CD64 受體隨時間推移之表現
對於腹膜滲出細胞收集，對安樂死的小鼠進行腹膜灌洗且收集滲出液(腹膜滲出細胞，PEC)。將腹膜灌洗流體離心(1500 rpm，5分鐘)，移除上清液，且將細胞集結粒再懸浮於1 ml PBS中且保持在冰上。將血液收集至含有EDTA之管中，轉移至5 ml管，且將紅血球使用ACK溶解緩衝液(ThernoFisher，#A1059201)溶解，接著離心(1500 rpm，5分鐘)。移除上清液且將細胞集結粒再懸浮於1 ml PBS中。隨時間推移收集腹膜滲出細胞且藉由流式細胞分析技術偵測CD163或CD64。來自活CD45 +免疫子集之資料在附圖之圖39中。亦顯示個別及平均中值螢光強度+/- SEM。APC =抗原呈遞細胞。未回應於m_DR2678_AA_PEG觀測到巨噬細胞上之CD163上調。 實例 22 ： 評估腹膜滲出細胞清除劑 CD16 隨時間推移之表現
基本上根據實例20進行腹膜滲出細胞之分離。隨時間推移收集腹膜滲出細胞且藉由流式細胞分析技術偵測CD16。來自活CD45 +免疫子集之資料在附圖之圖40中。亦顯示個別及平均中值螢光強度+/- SEM。APC =抗原呈遞細胞。 實例 23 ： 評估腹膜滲出細胞 CD38 隨時間推移之表現
基本上根據實例20進行腹膜滲出細胞之分離。隨時間推移收集腹膜滲出細胞且藉由流式細胞分析技術偵測CD38。來自活CD45 +免疫子集之資料在附圖之圖41中。亦顯示個別及平均中值螢光強度+/- SEM。APC =抗原呈遞細胞。 實例 24. 評估周邊血液 CD16 及 CD38 隨時間推移之表現
基本上根據以上實例23，隨時間推移收集周邊血液且藉由流式細胞分析技術偵測CD16或CD38。來自活CD45 +CD3 -CD19 +B細胞之資料提供於附圖之圖42中。亦顯示個別及平均中值螢光強度+/- SEM。 實例 25. 評估周邊血液清除劑 CD150 受體隨時間推移之表現
基本上根據以上實例20，隨時間推移收集周邊血液且流式細胞分析技術偵測CD150。來自活CD45 +CD3 -CD19 +B細胞之資料提供於附圖之圖43中。亦顯示個別及平均中值螢光強度+/- SEM。 實例 26 ： IFNγ 誘導之貧血研究
為了評估測試物品相對於IFNγ誘導之貧血之作用，進行以下研究。自第0天(D0)開始，每日向雌性C57BL/6小鼠皮下投與PBS或3 μg之小鼠IFNγ (Shenandoah，目錄號200-16AF)來進行治療。亦每三至四天用PBS、m_DR756_AA_PEG (在D0皮下投與10、20、40或80 μg)或m_DR2678_AA_PEG (在D0皮下投與10、20、40或80 μg)對小鼠進行共治療。在第8天(第三次測試物品劑量後24小時)評定小鼠之血容比水平，遵循製造商之建議使用Hemata Stat II對研究進行定量。此研究之結果提供於附圖之圖44中。顯示平均血容比+/- SEM (RBC =紅血球)。如圖44中呈現之資料所繪示，野生型IL10替代分子(m_DR756_AA_PEG)加劇了IFNγ誘導之貧血，而包含T100L胺基酸取代之融合二聚體(m_DR2678_AA_PEG)不會。 實例 27. 單核球 IL10 活性分析：
藉由Ficoll®梯度純化將人類PBMC與獲自非吸菸人類供體(#451)之白血球採集物分離。基本上根據製造商提供之說明書，使用人類CD14微珠粒(Miltenyi Biotech，目錄號130-050-201)藉由正向選擇自PBMC純化人類單核球。在存在下表14中所列出之測試物品的情況下使單核球在0.02 pM至1000 nM範圍內之濃度下在37℃下與1 ng/ml之LPS (Millipore Sigma，目錄號L2630)接觸48小時。h_DR2339_AA多肽在Expi293細胞中使用藉由宿主細胞移除且層析純化之MHSSALLCCLVLLTGVRA (SEQ ID NO: 98)信號肽藉由暫態轉染表現。測試物品h_SS0165_AA產生於大腸桿菌中。測試物品h_DR2339_AA_PEG及h_SS0165_AA_PEG用包含兩個20 kD臂之40 kD分支鏈PEG進行N末端聚乙二醇化。基本上根據實例1之教示進行聚乙二醇化。
表14. 實例27測試物品
SEQ ID NO 名稱 描述 AA序列
4 h_DR2339_AA及h_DR2339_AA_PEG 野生型hIL10；哺乳動物表現 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 4)
123 h_SS0165_AA_PEG T100L/T100L hIL10融合二聚體；大腸桿菌表現 MSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 123)
處理後，將細胞以400 g離心5分鐘且收集上清液。基本上根據製造商提供之說明書，使用MSD套組(MesoScale Discovery；目錄號K151A9H-4)評定上清液之促發炎細胞介素IL1b (圖45)、IL6 (圖46)及TNFa (圖47)之分泌。資料使用Prism軟體作圖且提供為圖45至圖47。圖45至圖47中圖式下方之表格提供與分析中測試物品之EC50 (ECF)相關之資料。如圖45至圖47中所示，具有T100L突變之聚乙二醇化融合hIL10分子(h_SS0165_AA_PEG)完全抑制LPS誘導之單核球分泌IL-1β、IL-6及TNF-α，其中EC50 (ECF)相較於聚乙二醇化野生型IL-10 (h_DR2339_AA_PEG)高大致3至4倍。 實例 28. 大腸桿菌及哺乳動物產生之蛋白質具有等效效能
藉由Ficoll®梯度純化將人類PBMC與獲自非吸菸人類供體(#3323)之白血球採集物分離。基本上根據製造商提供之說明書，使用人類CD14微珠粒(Miltenyi Biotech，目錄號130-050-201)藉由正向選擇自PBMC純化人類單核球。在存在下表15中所列出之蛋白質的情況下使單核球在0.1 pM至100 nM範圍內之濃度下在37℃下與1 ng/ml之LPS (Millipore Sigma，目錄號L2630)接觸48小時。h_TP0015_AA在Expi293細胞中使用藉由哺乳動物宿主細胞移除之MHSSALLCCLVLLTGVRA (SEQ ID NO: 98)信號肽藉由暫態轉染表現為前驅物，以產生表15中描述之序列。h_SS0165_AA表現於大腸桿菌菌株B12中。使用金屬親和層析純化蛋白質。
表15. 實例28測試物品
SEQ ID NO 名稱 描述 AA序列
206 h_TP0015_AA T100L/T/T100L hIL10；GGS-His8標籤；哺乳動物表現 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNTSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGSHHHHHHHH (SEQ ID NO: 206)
207 h_SS0165_AA T100L/T/T100L hIL10；GGS-His8標籤；大腸桿菌表現 MSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGSHHHHHHHH(SEQ ID NO: 207)
處理後，將細胞以400 g離心5分鐘且收集上清液。基本上根據製造商提供之說明書，使用MSD套組(Meso Scale Discovery，目錄號K151A9H-4)評定上清液之促發炎細胞介素。資料使用Prism軟體作圖且提供於附圖之圖48及圖49中。如圖48及圖49中所繪示，獲自大腸桿菌中之表現的包含T100L突變之融合hIL10分子與包含T100L突變之融合hIL10分子與哺乳動物產生之具有T100L突變之融合分子展現等效效能。 實例 29. 引入至融合分子上之各種單點突變之活性
藉由Ficoll®梯度純化將人類PBMC與獲自非吸菸人類供體之白血球採集物分離。基本上根據製造商提供之說明書，使用人類CD14微珠粒(Miltenyi Biotech，目錄號130-050-201)藉由正向選擇自PBMC純化人類單核球。在存在下表16中所提供之測試物品的情況下使單核球在0.02 pM至1000 nM範圍內之濃度下在37℃下與1 ng/ml之LPS (Millipore Sigma，目錄號L2630)接觸48小時。測試物品蛋白質在Expi293細胞中使用藉由哺乳動物宿主細胞移除且使用金屬親和層析純化之MHSSALLCCLVLLTGVRA (SEQ ID NO: 98)信號肽藉由暫態轉染表現為前驅物，以產生表16中描述之序列。
表16. 實例29測試物品
SEQ ID 名稱 描述 AA序列
208 h_DR2339 hIL10-WT C末端GGS-His8標籤；哺乳動物表現 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGSHHHHHHHH (SEQ ID NO: 208)
209 h_SS0053 T100L/T100L hIL10融合；C末端GGS-His8標籤；哺乳動物表現 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGSHHHHHHHH (SEQ ID NO: 209)
210 h_SS0258 N21K/N21K hIL10融合；C末端GGS-His8標籤；哺乳動物表現 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPKMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPKMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGSHHHHHHHH (SEQ ID NO: 210)
211 h_SS0259 R24E/R24E hIL10融合；C末端GGS-His8標籤；哺乳動物表現 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLEDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLEDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGSHHHHHHHH (SEQ ID NO: 211)
212 h_SS0260 hIL10 M22A/M22A融合；C末端GGS-HIS8標籤；哺乳動物表現 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNALRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNALRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGSHHHHHHHH (SEQ ID NO: 212)
處理後，將細胞以400 g離心5分鐘且收集上清液。基本上根據製造商提供之說明書，使用MSD套組(Meso Scale Discovery，目錄號K151A9H-4)評定上清液之促發炎細胞介素。資料使用Prism軟體作圖且提供於附圖之圖50及圖51中。引入至hIL10融合多肽上之各種單點突變在不同程度上影響骨髓分析效能。 實例 30. CB0009 之單核球 IL10 活性分析 (E96K)
藉由Ficoll®梯度純化將人類PBMC與獲自非吸菸人類供體(供體#072)之白血球採集物分離。基本上根據製造商提供之說明書，使用人類CD14微珠粒(Miltenyi Biotech，目錄號130-050-201)藉由正向選擇自PBMC純化人類單核球。在存在下表17所描述之h_DR2339_AA或h_CB0009_AA的情況下使單核球在0.02 pM至1000 nM範圍內之濃度下在37℃下與1 ng/ml之LPS (Millipore Sigma，目錄號L2630)接觸48小時。h_DR2339_AA (SEQ ID NO: 208)之描述提供於實例29中。測試物品h_CB0009_AA在Expi293細胞中使用藉由哺乳動物宿主細胞移除且使用金屬親和層析純化之MHSSALLCCLVLLTGVRA (SEQ ID NO: 98)信號肽藉由暫態轉染表現為前驅物，以產生表17中描述之序列。
表17. h_CB0009_AA
SEQ ID NO 名稱 描述 AA序列
213 h_CB009_AA E96K/E96K hIL10；GGS-His8 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGKNLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGKNLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGSHHHHHHHH (SEQ ID NO:213)
處理後，將細胞以400 g離心5分鐘且收集上清液。基本上根據製造商提供之說明書，使用MSD套組(Meso Scale Discovery，目錄號K151A9H-4)評定上清液之促發炎細胞介素IL1b (圖52)、IL6 (圖53)及TNFa (圖54)。資料使用Prism軟體作圖且提供於附圖之圖52、圖53及圖54中。如所呈現資料中所繪示，在融合hIL10型式(h_CB0009_AA)中引入單點突變E96K降低了分子抑制LPS誘導之單核球分泌促發炎細胞介素之活性。 實例 31. CB0010 之單核球 IL10 活性分析 (E96Q)
藉由Ficoll®梯度純化將人類PBMC與獲自非吸菸人類供體(供體#072)之白血球採集物分離。基本上根據製造商提供之說明書，使用人類CD14微珠粒(Miltenyi Biotech，目錄號130-050-201)藉由正向選擇自PBMC純化人類單核球。在存在下表18所描述之h_DR2339_AA或h_CB0010_AA的情況下使單核球在0.02 pM至1000 nM範圍內之濃度下在37℃下與1 ng/ml之LPS (Millipore Sigma，目錄號L2630)接觸48小時。h_DR2339_AA (SEQ ID NO: 208)之描述提供於實例29中。測試物品h_CB0010_AA在Expi293細胞中使用藉由哺乳動物宿主細胞移除且使用金屬親和層析純化之MHSSALLCCLVLLTGVRA (SEQ ID NO: 98)信號肽藉由暫態轉染表現為前驅物，以產生表18中描述之序列。
表18. h_CB0010_AA
SEQ ID NO 名稱 描述 AA序列
214 h_CB0010_AA E96Q/E96Q hIL10；GGS-His8 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGQNLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGQNLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGSHHHHHHHH (SEQ ID NO:214)
處理後，將細胞以400 g離心5分鐘且收集上清液。基本上根據製造商提供之說明書，使用MSD套組(Meso Scale Discovery，目錄號K151A9H-4)評定上清液之促發炎細胞介素IL1b (圖55)、IL6 (圖56)及TNFa (圖57)。資料使用Prism軟體作圖且提供於附圖之圖55、圖56及圖57中。如所呈現資料中所繪示，引入至融合型式(h_CB0010_AA)中之單點突變E96Q強效抑制LPS誘導之單核球分泌促發炎細胞介素，其中相較於fused_WT IL-10 (h_DR2339_AA)效能低大致2至3倍。 實例 32. CB0014 之單核球 IL10 活性分析 (R24E)
藉由Ficoll®梯度純化將人類PBMC與獲自非吸菸人類供體(供體#072)之白血球採集物分離。基本上根據製造商提供之說明書，使用人類CD14微珠粒(Miltenyi Biotech，目錄號130-050-201)藉由正向選擇自PBMC純化人類單核球。在存在下表19所描述之h_DR2339_AA或h_CB0014_AA的情況下使單核球在0.02 pM至1000 nM範圍內之濃度下在37℃下與1 ng/ml之LPS (Millipore Sigma，目錄號L2630)接觸48小時。h_DR2339_AA (SEQ ID NO: 208)之描述提供於實例29中。測試物品h_CB0014_AA在Expi293細胞中使用藉由哺乳動物宿主細胞移除且使用金屬親和層析純化之MHSSALLCCLVLLTGVRA (SEQ ID NO: 98)信號肽藉由暫態轉染表現為前驅物，以產生表19中描述之序列。
表19. h_CB0014_AA
SEQ ID NO 名稱 描述 AA序列
215 h_CB0014_AA R24E/R24E hIL10；GGS-His8 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLEDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLEDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGSHHHHHHHH (SEQ ID NO:215)
處理後，將細胞以400 g離心5分鐘且收集上清液。基本上根據製造商提供之說明書，使用MSD套組(Meso Scale Discovery，目錄號K151A9H-4)評定上清液之促發炎細胞介素IL1b (圖58)、IL6 (圖59)及TNFa (圖60)。資料使用Prism軟體作圖且提供於附圖之圖58、圖59及圖60中。如所呈現資料中所繪示，引入至融合型式(h_CB0014_AA)中之單點突變R24E抑制LPS誘導之單核球分泌促發炎細胞介素，但相較於fused_WT IL-10 (h_DR2339_AA)效能低大致300倍。 實例 33. CB0007 之單核球 IL10 活性分析 (E96K)
藉由Ficoll®梯度純化將人類PBMC與獲自非吸菸人類供體(供體#072)之白血球採集物分離。基本上根據製造商提供之說明書，使用人類CD14微珠粒(Miltenyi Biotech，目錄號130-050-201)藉由正向選擇自PBMC純化人類單核球。在存在下表20所描述之h_DR2339_AA或h_CB0007_AA的情況下使單核球在0.02 pM至1000 nM範圍內之濃度下在37℃下與1 ng/ml之LPS (Millipore Sigma，目錄號L2630)接觸48小時。h_DR2339_AA (SEQ ID NO: 208)之描述提供於實例29中。測試物品h_CB0007_AA在Expi293細胞中使用藉由哺乳動物宿主細胞移除且使用金屬親和層析純化之MHSSALLCCLVLLTGVRA (SEQ ID NO: 98)信號肽藉由暫態轉染表現為前驅物，以產生表20中描述之序列。
表20. h_CB0007_AA
SEQ ID NO 名稱 描述 AA序列
216 h_CB0007_AA M22A/M22A hIL10；GGS-His8 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPDALRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPDALRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGSHHHHHHHH (SEQ ID NO:216)
處理後，將細胞以400 g離心5分鐘且收集上清液。基本上根據製造商提供之說明書，使用MSD套組(Meso Scale Discovery，目錄號K151A9H-4)評定上清液之促發炎細胞介素IL1b (圖61)、IL6 (圖62)及TNFa (圖63)。資料使用Prism軟體作圖且提供於附圖之圖61、圖62及圖63中。如圖61、圖62及圖63中呈現之資料所繪示，引入至融合型式(h_CB0007_AA)中之單點突變M22A抑制LPS誘導之單核球分泌促發炎細胞介素，其中相較於融合hWT IL-10 (h_DR2339_AA)效能低大致10倍。 實例 34. CB0005 之單核球 IL10 活性分析 (M22S)
藉由Ficoll®梯度純化將人類PBMC與獲自非吸菸人類供體(供體#072)之白血球採集物分離。基本上根據製造商提供之說明書，使用人類CD14微珠粒(Miltenyi Biotech，目錄號130-050-201)藉由正向選擇自PBMC純化人類單核球。在存在下表21所描述之h_DR2339_AA或h_CB0005_AA的情況下使單核球在0.02 pM至1000 nM範圍內之濃度下在37℃下與1 ng/ml之LPS (Millipore Sigma，目錄號L2630)接觸48小時。h_DR2339_AA (SEQ ID NO: 208)之描述提供於實例29中。測試物品h_CB0005_AA在Expi293細胞中使用藉由哺乳動物宿主細胞移除且使用金屬親和層析純化之MHSSALLCCLVLLTGVRA (SEQ ID NO: 98)信號肽藉由暫態轉染表現為前驅物，以產生表21中描述之序列。
表21. h_CB0005_AA
SEQ ID NO 名稱 描述 AA序列
217 h_CB0005_AA M22S/M22S hIL10；GGS-His8 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPDSLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPDSLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGSHHHHHHHH (SEQ ID NO:217)
處理後，將細胞以400 g離心5分鐘且收集上清液。基本上根據製造商提供之說明書，使用MSD套組(Meso Scale Discovery，目錄號K151A9H-4)評定上清液之促發炎細胞介素IL1b (圖64)、IL6 (圖65)及TNFa (圖66)。資料使用Prism軟體作圖且提供於附圖之圖64、圖65及圖66中。如由呈現所繪示，引入至融合型式(h_CB0005_AA)中之單點突變M22S不完全抑制LPS誘導之單核球分泌促發炎細胞介素且具有高於1 nM濃度之阻斷作用。 實例 35. CB0006 之 單核球 IL10 活性分析 (M22T)
藉由Ficoll®梯度純化將人類PBMC與獲自非吸菸人類供體(供體#072)之白血球採集物分離。基本上根據製造商提供之說明書，使用人類CD14微珠粒(Miltenyi Biotech，目錄號130-050-201)藉由正向選擇自PBMC純化人類單核球。在存在下表22所描述之h_DR2339_AA或h_CB0006_AA的情況下使單核球在0.02 pM至1000 nM範圍內之濃度下在37℃下與1 ng/ml之LPS (Millipore Sigma，目錄號L2630)接觸48小時。h_DR2339_AA (SEQ ID NO: 208)之描述提供於實例29中。測試物品h_CB0006_AA在Expi293細胞中使用藉由哺乳動物宿主細胞移除且使用金屬親和層析純化之MHSSALLCCLVLLTGVRA (SEQ ID NO: 98)信號肽藉由暫態轉染表現為前驅物，以產生表22中描述之序列。
表22. h_CB0006AA
SEQ ID NO 名稱 描述 AA序列
218 h_CB0006_AA M22T/M22T hIL10；GGS-His8 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPDTLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPDTLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGSHHHHHHHH (SEQ ID NO:218)
處理後，將細胞以400 g離心5分鐘且收集上清液。基本上根據製造商提供之說明書，使用MSD套組(Meso Scale Discovery，目錄號K151A9H-4)評定上清液之促發炎細胞介素IL1b (圖67)、IL6 (圖68)及TNFa (圖69)。資料使用Prism軟體作圖且提供於附圖之圖67、圖68及圖69中。如由呈現所繪示，引入至融合型式(h_CB0006_AA)中之單點突變M22T不完全抑制LPS誘導之單核球分泌促發炎細胞介素且具有高於1 nM濃度之阻斷作用。 實例 36. CB0011 之單核球 IL10 活性分析 (T100E)
藉由Ficoll®梯度純化將人類PBMC與獲自非吸菸人類供體(供體#072)之白血球採集物分離。基本上根據製造商提供之說明書，使用人類CD14微珠粒(Miltenyi Biotech，目錄號130-050-201)藉由正向選擇自PBMC純化人類單核球。在存在下表23所描述之h_DR2339_AA或h_CB0011_AA的情況下使單核球在0.02 pM至1000 nM範圍內之濃度下在37℃下與1 ng/ml之LPS (Millipore Sigma，目錄號L2630)接觸48小時。h_DR2339_AA (SEQ ID NO: 208)之描述提供於實例29中。測試物品h_CB0011_AA在Expi293細胞中使用藉由哺乳動物宿主細胞移除且使用金屬親和層析純化之MHSSALLCCLVLLTGVRA (SEQ ID NO: 98)信號肽藉由暫態轉染表現為前驅物，以產生表23中描述之序列。
表23. h_CB0011_AA
SEQ ID NO 名稱 描述 AA序列
219 h_CB0011_AA T100E/T100E hIL10；GGS-His8 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKELRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKELRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGSHHHHHHHH (SEQ ID NO:219)
處理後，將細胞以400 g離心5分鐘且收集上清液。基本上根據製造商提供之說明書，使用MSD套組(Meso Scale Discovery，目錄號K151A9H-4)評定上清液之促發炎細胞介素IL1b (圖73)、IL6 (圖74)及TNFa (圖75)。資料使用Prism軟體作圖且提供於附圖之圖73、圖74及圖75中。如圖73、圖74及圖75中呈現之資料所繪示，引入至融合型式(h_CB0011_AA)中之單點突變T100E抑制LPS誘導之單核球分泌促發炎細胞介素，其中相較於fused_WT IL-10 (h_DR2339_AA)效能降低小於3倍。 實例 37. CB0013 之單核球 IL10 活性分析 (T100L)
藉由Ficoll®梯度純化將人類PBMC與獲自非吸菸人類供體(供體#072)之白血球採集物分離。基本上根據製造商提供之說明書，使用人類CD14微珠粒(Miltenyi Biotech，目錄號130-050-201)藉由正向選擇自PBMC純化人類單核球。在存在下表24所描述之h_DR2339_AA或h_CB0013_AA的情況下使單核球在0.02 pM至1000 nM範圍內之濃度下在37℃下與1 ng/ml之LPS (Millipore Sigma，目錄號L2630)接觸48小時。h_DR2339_AA (SEQ ID NO: 208)之描述提供於實例29中。測試物品h_CB0013_AA在Expi293細胞中使用藉由哺乳動物宿主細胞移除且使用金屬親和層析純化之MHSSALLCCLVLLTGVRA (SEQ ID NO: 98)信號肽藉由暫態轉染表現為前驅物，以產生表24中描述之序列。
表24. h_CB0013_AA
SEQ ID NO 名稱 描述 AA序列
220 h_CB0013_AA T100L/T100L hIL10；GGS-His8 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKLLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGSHHHHHHHH (SEQ ID NO:220)
處理後，將細胞以400 g離心5分鐘且收集上清液。基本上根據製造商提供之說明書，使用MSD套組(Meso Scale Discovery，目錄號K151A9H-4)評定上清液之促發炎細胞介素IL1b (圖70)、IL6 (圖71)及TNFa (圖72)。資料使用Prism軟體作圖且提供於附圖之圖73、圖74及圖75中。如圖73、圖74及圖75中提供呈現之資料所繪示，引入至融合型式(h_CB0013_AA)中之單點突變T100L抑制LPS誘導之單核球分泌促發炎細胞介素，其中相較於fused_WT IL-10 (h_DR2339_AA)效能低3至7倍。 實例 38. CB0002 之單核球 IL10 活性分析 (N21D)
藉由Ficoll®梯度純化將人類PBMC與獲自非吸菸人類供體(供體#072)之白血球採集物分離。基本上根據製造商提供之說明書，使用人類CD14微珠粒(Miltenyi Biotech，目錄號130-050-201)藉由正向選擇自PBMC純化人類單核球。在存在下表25所描述之h_DR2339_AA或h_CB0002_AA的情況下使單核球在0.02 pM至1000 nM範圍內之濃度下在37℃下與1 ng/ml之LPS (Millipore Sigma，目錄號L2630)接觸48小時。h_DR2339_AA (SEQ ID NO: 208)之描述提供於實例29中。測試物品h_CB0002_AA在Expi293細胞中使用藉由哺乳動物宿主細胞移除且使用金屬親和層析純化之MHSSALLCCLVLLTGVRA (SEQ ID NO: 98)信號肽藉由暫態轉染表現為前驅物，以產生表25中描述之序列。
表25. h_CB0002_AA
SEQ ID NO 名稱 描述 AA序列
221 h_CB0002_AA N21D/N21D hIL10；GGS-His8 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPDMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPDMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGSHHHHHHHH (SEQ ID NO:221)
處理後，將細胞以400 g離心5分鐘且收集上清液。基本上根據製造商提供之說明書，使用MSD套組(Meso Scale Discovery，目錄號K151A9H-4)評定上清液之促發炎細胞介素IL1b (圖76)、IL6 (圖77)及TNFa (圖78)。資料使用Prism軟體作圖且提供於附圖之圖76、圖77及圖78中。如圖76、圖77及圖78中提供呈現之資料所繪示，引入至融合型式(h_CB0002_AA)中之單點突變N21D抑制LPS誘導之單核球分泌促發炎細胞介素，其中相較於fused_WT IL-10 (h_DR2339_AA)效能下降小於2倍。 實例 38. CB0003 之 單核球 IL10 活性分析 (N21E) ：
藉由Ficoll®梯度純化將人類PBMC與獲自非吸菸人類供體(供體#072)之白血球採集物分離。基本上根據製造商提供之說明書，使用人類CD14微珠粒(Miltenyi Biotech，目錄號130-050-201)藉由正向選擇自PBMC純化人類單核球。在存在下表26所描述之h_DR2339_AA或h_CB0003_AA的情況下使單核球在0.02 pM至1000 nM範圍內之濃度下在37℃下與1 ng/ml之LPS (Millipore Sigma，目錄號L2630)接觸48小時。h_DR2339_AA (SEQ ID NO: 208)之描述提供於實例29中。測試物品h_CB0003_AA在Expi293細胞中使用藉由哺乳動物宿主細胞移除且使用金屬親和層析純化之MHSSALLCCLVLLTGVRA (SEQ ID NO: 98)信號肽藉由暫態轉染表現為前驅物，以產生表26中描述之序列。
表26. h_CB0003_AA
SEQ ID NO 名稱 描述 AA序列
222 h_CB0003_AA N21E/N21E hIL10；GGS-His8 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPEMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPEMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGSHHHHHHHH (SEQ ID NO:222)
處理後，將細胞以400 g離心5分鐘且收集上清液。基本上根據製造商提供之說明書，使用MSD套組(Meso Scale Discovery，目錄號K151A9H-4)評定上清液之促發炎細胞介素IL1b (圖79)、IL6 (圖80)及TNFa (圖81)。資料使用Prism軟體作圖且提供於附圖之圖79、圖80及圖81中。如圖79、圖80及圖81中提供呈現之資料所繪示，引入至融合型式(h_CB0003_AA)中之單點突變N21E抑制LPS誘導之單核球分泌促發炎細胞介素，其中相較於融合h_WT IL-10 (h_DR2339_AA)效能下降小於2倍。 實例 40. CB0001 之單核球 IL10 活性分析 (N21K)
藉由Ficoll®梯度純化將人類PBMC與獲自非吸菸人類供體(供體#072)之白血球採集物分離。基本上根據製造商提供之說明書，使用人類CD14微珠粒(Miltenyi Biotech，目錄號130-050-201)藉由正向選擇自PBMC純化人類單核球。在存在下表27所描述之h_DR2339_AA或h_CB0001_AA的情況下使單核球在0.02 pM至1000 nM範圍內之濃度下在37℃下與1 ng/ml之LPS (Millipore Sigma，目錄號L2630)接觸48小時。h_DR2339_AA (SEQ ID NO: 208)之描述提供於實例29中。測試物品h_CB0001_AA在Expi293細胞中使用藉由哺乳動物宿主細胞移除且使用金屬親和層析純化之MHSSALLCCLVLLTGVRA (SEQ ID NO: 98)信號肽藉由暫態轉染表現為前驅物，以產生表27中描述之序列。
表27. h_CB0001_AA
SEQ ID NO 名稱 描述 AA序列
223 h_CB0001_AA N21K/N21K hIL10；GGS-His8 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPKMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPKMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGSHHHHHHHH (SEQ ID NO:223)
處理後，將細胞以400 g離心5分鐘且收集上清液。基本上根據製造商提供之說明書，使用MSD套組(Meso Scale Discovery，目錄號K151A9H-4)評定上清液之促發炎細胞介素IL1b (圖82)、IL6 (圖83)及TNFa (圖84)。資料使用Prism軟體作圖且提供於附圖之圖82、圖83及圖84中。如圖82、圖83及圖84中提供呈現之資料所繪示，引入至融合型式(h_CB0001_AA)中之單點突變N21K抑制LPS誘導之單核球分泌促發炎細胞介素，其中相較於fused_WT IL-10 (h_DR2339_AA)效能低大致10倍。 實例 41. AG020 之單核球 IL10 活性分析 (D25K)
藉由Ficoll®梯度純化將人類PBMC與獲自非吸菸人類供體(供體#072)之白血球採集物分離。基本上根據製造商提供之說明書，使用人類CD14微珠粒(Miltenyi Biotech，目錄號130-050-201)藉由正向選擇自PBMC純化人類單核球。在存在下表28所描述之h_DR2339_AA或h_AG020_AA的情況下使單核球在0.02 pM至1000 nM範圍內之濃度下在37℃下與1 ng/ml之LPS (Millipore Sigma，目錄號L2630)接觸48小時。h_DR2339_AA (SEQ ID NO: 208)之描述提供於實例29中。測試物品h_AG020_AA在Expi293細胞中使用藉由哺乳動物宿主細胞移除且使用金屬親和層析純化之MHSSALLCCLVLLTGVRA (SEQ ID NO: 98)信號肽藉由暫態轉染表現為前驅物，以產生表28中描述之序列。
表28. h_AG020_AA
SEQ ID NO 名稱 描述 AA序列
224 h_AG020_AA D25K/D25K hIL10；GGS-His8 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRKLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRKLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGSHHHHHHHH (SEQ ID NO:224)
處理後，將細胞以400 g離心5分鐘且收集上清液。基本上根據製造商提供之說明書，使用MSD套組(Meso Scale Discovery，目錄號K151A9H-4)評定上清液之促發炎細胞介素IL1b (圖85)、IL6 (圖86)及TNFa (圖87)。資料使用Prism軟體作圖且提供於附圖之圖85、圖86及圖87中。如圖85、圖86及圖87中提供呈現之資料所繪示，引入至融合型式(h_AG020_AA)中之單點突變D25K抑制LPS誘導之單核球分泌促發炎細胞介素，其中相較於fused_WT IL-10 (h_DR2339_AA)效能低大致25倍。 實例 42. CB0004 之 單核球 IL10 活性分析 (M22D)
藉由Ficoll®梯度純化將人類PBMC與獲自非吸菸人類供體(供體#072)之白血球採集物分離。基本上根據製造商提供之說明書，使用人類CD14微珠粒(Miltenyi Biotech，目錄號130-050-201)藉由正向選擇自PBMC純化人類單核球。在存在下表29所描述之h_DR2339_AA或h_CB0004_AA的情況下使單核球在0.02 pM至1000 nM範圍內之濃度下在37℃下與1 ng/ml之LPS (Millipore Sigma，目錄號L2630)接觸48小時。h_DR2339_AA (SEQ ID NO: 208)之描述提供於實例29中。測試物品h_CB0004_AA在Expi293細胞中使用藉由哺乳動物宿主細胞移除且使用金屬親和層析純化之MHSSALLCCLVLLTGVRA (SEQ ID NO: 98)信號肽藉由暫態轉染表現為前驅物，以產生表29中描述之序列。
表29. h_CB0004_AA
SEQ ID NO 名稱 描述 AA序列
225 h_CB0004_AA M22D/M22D hIL10；GGS-His8 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPDDLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPDDLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGSHHHHHHHH (SEQ ID NO:225)
處理後，將細胞以400 g離心5分鐘且收集上清液。基本上根據製造商提供之說明書，使用MSD套組(Meso Scale Discovery，目錄號K151A9H-4)評定上清液之促發炎細胞介素IL1b (圖88)、IL6 (圖89)及TNFa (圖90)。資料使用Prism軟體作圖且提供於附圖之圖88、圖89及圖90中。如圖88、圖89及圖90中提供呈現之資料所繪示，引入至融合型式(h_CB0004_AA)中之單點突變M22D不抑制LPS誘導之單核球分泌促發炎細胞介素。 實例 43. CB0008 之單核球 IL10 活性分析 (M22W)
藉由Ficoll®梯度純化將人類PBMC與獲自非吸菸人類供體(供體#072)之白血球採集物分離。基本上根據製造商提供之說明書，使用人類CD14微珠粒(Miltenyi Biotech，目錄號130-050-201)藉由正向選擇自PBMC純化人類單核球。在存在下表30所描述之h_DR2339_AA或h_CB0008_AA的情況下使單核球在0.02 pM至1000 nM範圍內之濃度下在37℃下與1 ng/ml之LPS (Millipore Sigma，目錄號L2630)接觸48小時。h_DR2339_AA (SEQ ID NO: 208)之描述提供於實例29中。測試物品h_CB0008_AA在Expi293細胞中使用藉由哺乳動物宿主細胞移除且使用金屬親和層析純化之MHSSALLCCLVLLTGVRA (SEQ ID NO: 98)信號肽藉由暫態轉染表現為前驅物，以產生表30中描述之序列。
表30. h_CB0008_AA
SEQ ID NO 名稱 描述 AA序列
226 h_CB0008_AA M22W/M22W hIL10；GGS-His8 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPDWLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPDWLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGSHHHHHHHH (SEQ ID NO:226)
處理後，將細胞以400 g離心5分鐘且收集上清液。基本上根據製造商提供之說明書，使用MSD套組(Meso Scale Discovery，目錄號K151A9H-4)評定上清液之促發炎細胞介素IL1b (圖91)、IL6 (圖92)及TNFa (圖93)。資料使用Prism軟體作圖且提供於附圖之圖91、圖92及圖93中。如圖91、圖92及圖93中提供呈現之資料所繪示，引入至融合型式(h_CB0008_AA)中之單點突變M22W抑制LPS誘導之單核球分泌促發炎細胞介素，其中相較於fused_WT IL-10 (h_DR2339_AA)效能下降小於2倍。 實例 44. CB0012 之單核球 IL10 活性分析 (T100C)
藉由Ficoll®梯度純化將人類PBMC與獲自非吸菸人類供體(供體#072)之白血球採集物分離。基本上根據製造商提供之說明書，使用人類CD14微珠粒(Miltenyi Biotech，目錄號130-050-201)藉由正向選擇自PBMC純化人類單核球。在存在下表31所描述之h_DR2339_AA或h_CB0012_AA的情況下使單核球在0.02 pM至1000 nM範圍內之濃度下在37℃下與1 ng/ml之LPS (Millipore Sigma，目錄號L2630)接觸48小時。h_DR2339_AA (SEQ ID NO: 208)之描述提供於實例29中。測試物品h_CB0012_AA在Expi293細胞中使用藉由哺乳動物宿主細胞移除且使用金屬親和層析純化之MHSSALLCCLVLLTGVRA (SEQ ID NO: 98)信號肽藉由暫態轉染表現為前驅物，以產生表31中描述之序列。
表31. h_CB0012_AA
SEQ ID NO 名稱 描述 AA序列
227 h_CB0012_AA T100C/T100C hIL10；GGS-His8 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKCLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKCLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGSHHHHHHHH (SEQ ID NO:227)
處理後，將細胞以400 g離心5分鐘且收集上清液。基本上根據製造商提供之說明書，使用MSD套組(Meso Scale Discovery，目錄號K151A9H-4)評定上清液之促發炎細胞介素IL1b (圖94)、IL6 (圖95)及TNFa (圖96)。資料使用Prism軟體作圖且提供於附圖之圖94、圖95及圖96中。如圖94、圖95及圖96中提供呈現之資料所繪示，引入至融合型式(h_CB0012_AA)中之單點突變T100C不完全抑制LPS誘導之單核球分泌促發炎細胞介素且具有高於1 nM濃度之阻斷作用。 實例 45. 單核球 IL10 活性分析
藉由Ficoll梯度純化將人類PBMC與獲自四個非吸菸人類供體(供體#072、供體#890、供體#836及供體#838)之白血球採集物分離。遵循製造商之方案，使用人類CD14微珠粒(Miltenyi Biotech- 130-050-201)藉由正向選擇自PBMC純化人類單核球。在存在不同濃度之IL10蛋白質(0.1 pM至100 nM)的情況下將單核球在37℃下用1 ng/ml之LPS (Millipore Sigma：L2630)處理48小時。處理後，將細胞以400 g短暫離心5分鐘且收集上清液。遵循製造商之方案，使用MSD套組(Meso Scale Discovery：K151A9H-4)評定上清液之促發炎細胞介素。資料使用Prism軟體作圖。上文標繪各種分子在抑制LPS誘導之來自4個供體之促發炎細胞介素之分泌方面的IC50值。 實例 46. CD8 T 細胞 母細胞 IL10 活性分析
藉由Ficoll梯度純化將人類PBMC與獲自4個非吸菸人類供體(供體#072、供體#890、供體#836及供體#838)之LRS室分離。遵循製造商之方案，使用套組(Miltenyi Biotech- 130-096-495)藉由負向選擇自PBMC純化人類CD8 T細胞。在存在100 pM人類IL-2的情況下使用人類T細胞活化及擴展套組(Miltenyi Biotech- 130-091-441)將分離CD8 T細胞在37℃下母細胞化72小時。洗滌母細胞化CD8 T細胞且在37℃下用不同濃度之IL10蛋白質(0.1 pM至100 nM)處理72小時。處理後，將細胞以400 g短暫離心5分鐘且收集上清液。遵循製造商之方案，使用MSD套組(Meso Scale Discovery：K151AEL-4)評定上清液之細胞介素(IFNγ、顆粒酶A及顆粒酶B)。資料使用Prism軟體作圖。各種細胞介素之分泌表示為正規化為由fused_WT IL-10 (h_DR2339_AA)誘導之最大分泌百分比的值(其中fused_WT IL-10 (h_DR2339_AA)之最大分泌設定為100%)。即使在對照樣品中亦未觀測到供體072之IFNγ分泌，且因此標繪n=3個供體之IFNγ資料。
如所呈現資料所示，本揭示之融合hIL10多肽在功能上具有骨髓偏差，顯示對LPS誘導之單核球分泌促發炎細胞介素之抑制(在一些情形下完全抑制)，同時相較於融合野生型hIL10分子，誘導自活化CD8 T細胞母細胞釋放細胞介素之效能較低。 例示性實施例
本揭示亦包括以下實施例： 實施例1. 一種融合人類IL10 (hIL10)多肽，其包含下式之多肽： (hIL10A)-L n-(hIL10B)， 其中： (a) hIL10A及hIL10B各自為獨立地選自由以下組成之群的人類IL10 (hIL10)序列：野生型hIL10 (SEQ ID NO: 4)及hIL10突變蛋白，其中該等hIL10突變蛋白各自獨立地包含在對應於SEQ ID NO: 4之殘基T100、H14、N18、N21、M22、D25、R32、S93及E96之位置處的一或多個胺基酸取代，視情況該hIL10A相對於SEQ ID NO: 4具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基之胺基末端缺失，及/或該hIL10B相對於SEQ ID NO: 4具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基之胺基末端缺失； (b) L係長度為1個胺基酸與30個胺基酸之間的胺基酸連接子；且 (c) n = 0 (不存在)或1 (存在)。 實施例2. 如實施例1之融合hIL10多肽，其中： (a) T100位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：T100L、T100D、T100V、T100E、T100A、T100R、T100N、T100Q、T100E、T100I、T100K、T100M及T100S； (b) H14位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：H14C、H14F、H14P、H14W、H14G、H14A、H14D、H14E、H14I、H14K、H14L、H14M、H14N、H14Q、H14R、H14S、H14T、H14Y及H14V； (c) N18位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：N18Y、N18F、N18A、N18D、N18E、N18L、N18V、N18S、N18T、N18I、N18V、N18M、N18R、N18K及N18H； (d) N21位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：N21A、N21R、N21Q、N21H、N21K、N21S、N21V、N21I、N21L、N21M、N21T、N21C、N21D及N21E； (e) M22位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：M22A、M22V、M22I、M22L、M22N、M22D、M22S、M22T、M22W及M22Q； (f) R24位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：R24E、R24D、R24N、R24Q、R24A、R24S及R24T； (g) D25位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：D25A、D25N、D25H、D25I、D25K、D25L、D25P、D25Q及D25V； (h) D28位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：D28A、D28E、D28L、D28V、D28S、D28T、D28I、D28V、D28M、D28H、D28K及D28R； (i) R32位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：R32A、R32D、R32E、R32L、R32V、R32S、R32T、R32I、R32V、R32M、R32N、R32Q、R32G、R32C、R32P、R32F、R32Y及R32H； (j) E74位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：E74A、E74D、E74L、E74V、E74S、E74T、E74I、E74V、E74M、E74H、E74K及E74R； (k) H90位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：H90A、H90D、H90E、H90I、H90K、H90L、H90M、H90N、H90Q、H90R、H90S、H90T、H90Y及H90V； (l) N92位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：N92D、N92Q、N92E、N92H、N92K、N92S、N92V、N92I、N92L、N92M、N92T及N92A； (m) S93位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：S93E、S93A、S93R、S93N、S93D、S93Q、S93E、S93I、S93L、S93K、S93M、S93G及S93V； (n) E96位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：E96C、E96F、E96Y、E96W、E96A、E96N、E96D、E96Q、E96H、E96K及E96S；且 (o) R104位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：R104A、R104W、R104Y、R104F、R104H、R104D、R104E、R104N、R104Q、R104S、R104T、R104I、R104L、R104V及R104M。 實施例3. 如實施例1或2之融合hIL10多肽，其中該hIL10A及該hIL10B中之至少一者為hIL10突變蛋白。 實施例4. 如實施例1至3中任一項之融合hIL10多肽，其中該hIL10A及/或該hIL10B包含胺基酸取代T100L。 實施例5. 如實施例1至4中任一項之融合hIL10多肽，其中該hIL10A及/或該hIL10B包含胺基酸取代M22A或M22S。 實施例6. 如實施例1至5中任一項之融合hIL10多肽，其中該hIL10A及/或該hIL10B包含胺基酸取代D25K。 實施例7. 如實施例1至6中任一項之融合hIL10多肽，其中該hIL10突變蛋白包含與SEQ ID NO: 4之序列具有至少95%一致性的序列。 實施例8. 如實施例1至7中任一項之融合hIL10多肽，其中該hIL10A與該hIL10B相同。 實施例9. 如實施例1至7中任一項之融合hIL10多肽，其中該hIL10A與該hIL10B不同。 實施例10.    如實施例1至9中任一項之融合hIL10多肽，其中n = 1。 實施例11.    如實施例10之融合hIL10多肽，其中L為GS連接子。 實施例12.    如實施例11之融合hIL10多肽，其中該GS連接子包含GGGSGSGSGSG之序列(SEQ ID NO: 19)。 實施例13.    如實施例1至9中任一項之融合hIL10多肽，其中n = 0。 實施例14.    如實施例1至13中任一項之融合hIL10多肽，其中該hIL10A及該hIL10B各自獨立地選自野生型hIL10 (SEQ ID NO: 4)或包含選自由M22A、M22S、D25K及T100L組成之群的胺基酸取代的IL10突變蛋白。 實施例15.    如實施例14之融合hIL10多肽，其中該hIL10A與該hIL10B相同。 實施例16.    如實施例15之融合hIL10多肽，其中該hIL10A及該hIL10B均為包含該胺基酸取代T100L之hIL10突變蛋白。 實施例17.    如實施例16之融合hIL10多肽，其中n為0。 實施例18.    如實施例17之融合hIL10多肽，其中該融合hIL10多肽包含與SEQ ID NO: 44之序列具有至少90%一致性之序列。 實施例19.    如實施例18之融合hIL10多肽，其中該融合hIL10多肽包含SEQ ID NO: 44之該序列。 實施例20.    如實施例1至19中任一項之融合hIL10多肽，其中該融合hIL10多肽經聚乙二醇化。 實施例21.    如實施例1至20中任一項之融合hIL10多肽，其中該融合hIL10多肽經醯基化。 實施例22.    如實施例1至21中任一項之融合hIL10多肽，其中該融合hIL10多肽共價連接至Fc多肽。 實施例23.    如實施例22之融合hIL10多肽，其中該Fc多肽為來自hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4或其變異體之Fc域。 實施例24.    如實施例22或23之融合hIL10多肽，其中該Fc多肽包含由對野生型Fc多肽序列進行修飾以降低效應功能而獲得之序列。 實施例25.    如實施例1至24中任一項之融合hIL10多肽，其中相較於活化人類CD8 T細胞中野生型hIL10之活性分率，該融合hIL10多肽在活化人類單核球中展現的野生型hIL10之活性分率更大。 實施例26.    如實施例25之融合hIL10多肽，其中野生型hIL10之該活性為誘導細胞內STAT3信號傳導。 實施例27.    如實施例1至24中任一項之融合hIL10多肽，其中該融合hIL10多肽在活化人類單核球中展現的Emax為野生型hIL10之活性程度之至少30%，視情況至少40%，視情況至少50%，其中活化人類單核球中野生型hIL10之該活性選自由以下組成之群：抑制IL1β分泌及抑制TNFα分泌。 實施例28.    如實施例1至24中任一項之融合hIL10多肽，其中該融合hIL10多肽在活化人類CD8 T細胞中展現的Emax小於野生型hIL10之活性程度之30%，視情況小於20%，視情況小於10%，其中活化人類CD8 T細胞中野生型hIL10之該活性選自由以下組成之群：IFNγ分泌、顆粒酶A分泌及顆粒酶B分泌。 實施例29.    一種核酸序列，其編碼如實施例1至28中任一項之融合hIL10多肽。 實施例30.    如實施例29之核酸序列，其中該核酸序列為mRNA。 實施例31.    如實施例29之核酸序列，其中該核酸序列為DNA。 實施例32.    一種載體，其包含與表現控制序列可操作地連接的如實施例29至31中任一項之核酸序列。 實施例33.    如實施例32之載體，其中該載體係病毒載體。 實施例34.    一種細胞，其用如實施例33之載體轉型。 實施例35.    如實施例34之細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞。 實施例36.    一種醫藥調配物，其包含：作為活性成分之(a)如實施例1至28中任一項之融合hIL10多肽；(b)如實施例29之核酸序列；(c)如實施例32之載體；或(d)如實施例34之細胞，以及一或多種醫藥學上可接受之溶劑、載劑、穩定劑、防腐劑或稀釋劑。 實施例37.    一種預防或治療罹患疾病、病症或病狀之哺乳動物個體的方法，該方法包含向該個體投與：(a)如實施例1至28中任一項之融合hIL10多肽；(b)如實施例29之核酸序列；(c)如實施例32之載體；或(d)如實施例34之細胞；或(e)如實施例36之醫藥調配物。 實施例38.    如實施例37之方法，其中該疾病、病症或病狀為自體免疫疾病、病症或病狀。 實施例39.    如實施例38之方法，其中該自體免疫疾病、病症或病狀為發炎性腸道疾病(IBD)。 實施例40.    如實施例39之方法，其中該發炎性腸道疾病為克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎。 實施例41.    如實施例38之方法，其中該疾病、病症或病狀為與慢性發炎相關之癌症。
圖1A顯示評估所指示融合hIL10多肽在活化單核球中回應於融合hIL10多肽之不同濃度(x軸)的STAT3產生水平(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖1B顯示評估所指示融合hIL10多肽在活化CD8 T細胞中回應於融合hIL10多肽之不同濃度(x軸)的STAT3產生水平(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖2A顯示評估所指示融合hIL10多肽在活化單核球中回應於融合hIL10多肽之不同濃度(x軸)的STAT3產生水平(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖2B顯示評估所指示融合hIL10多肽在活化CD8 T細胞中回應於融合hIL10多肽之不同濃度(x軸)的STAT3產生水平(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖3A顯示評估所指示融合hIL10多肽在活化單核球中回應於融合hIL10多肽之不同濃度(x軸)的STAT3產生水平(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖3B顯示評估所指示融合hIL10多肽在活化CD8 T細胞中回應於融合hIL10多肽之不同濃度(x軸)的STAT3產生水平(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖4A顯示評估所指示融合hIL10多肽在活化單核球中回應於融合hIL10多肽之不同濃度(x軸)的STAT3產生水平(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖4B顯示評估所指示融合hIL10多肽在活化CD8 T細胞中回應於融合hIL10多肽之不同濃度(x軸)的STAT3產生水平(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖5A顯示評估所指示融合hIL10多肽在活化單核球中回應於融合hIL10多肽之不同濃度(x軸)的STAT3產生水平(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖5B顯示評估所指示融合hIL10多肽在活化CD8 T細胞中回應於融合hIL10多肽之不同濃度(x軸)的STAT3產生水平(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖6A顯示評估活化單核球中回應於所指示融合hIL10多肽之不同濃度(x軸)的IL1β分泌(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖6B顯示評估活化單核球中回應於所指示融合hIL10多肽之不同濃度(x軸)的TNFα分泌(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖7A顯示評估活化CD8+ T細胞中回應於所指示融合hIL10多肽之不同濃度(x軸)的IFNγ產生(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖7B顯示評估活化CD8+ T細胞中回應於所指示融合hIL10多肽之不同濃度(x軸)的顆粒酶A產生(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖7C顯示評估活化CD8+ T細胞中回應於所指示融合hIL10多肽之不同濃度(x軸)的顆粒酶B產生(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。如圖7A至圖7C中所繪示，包含T100L突變之融合hIL10多肽展現CD8 T細胞母細胞中IFNγ、顆粒酶A及顆粒酶B之誘導相較於融合hIL10多肽減少，且在評估高達100 nM濃度時展現Emax相對於融合WT hIL10多肽減小。
圖8A顯示評估所指示融合hIL10多肽在活化單核球中回應於融合hIL10多肽之不同濃度(x軸)的STAT3產生水平(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖8B顯示評估所指示融合hIL10多肽在活化CD8 T細胞中回應於融合hIL10多肽之不同濃度(x軸)的STAT3產生水平(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖9A顯示評估LPS活化單核球中回應於所指示融合hIL10多肽之不同濃度(x軸)的IL1β分泌(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖9B顯示評估LPS活化單核球中回應於所指示融合hIL10多肽之不同濃度(x軸)的TNFα分泌(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖10A顯示評估活化CD8+ T細胞中回應於所指示融合hIL10多肽之不同濃度(x軸)的IFNγ產生(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖10B顯示評估活化CD8+ T細胞中回應於所指示融合hIL10多肽之不同濃度(x軸)的顆粒酶A產生(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖10C顯示評估活化CD8+ T細胞中回應於所指示融合hIL10多肽之不同濃度(x軸)的顆粒酶B產生(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖11A顯示評估所指示融合mIL10多肽在活化小鼠骨髓細胞中回應於融合mIL10多肽之不同濃度(x軸)的STAT3產生水平(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖11B顯示評估所指示融合mIL10多肽在活化小鼠CD8 T細胞中回應於融合mIL10多肽之不同濃度(x軸)的STAT3產生水平(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖12A顯示評估LPS活化小鼠脾細胞中回應於所指示融合mIL10多肽之不同濃度(x軸)的IFNγ產生(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖12B顯示評估LPS活化小鼠脾細胞中回應於所指示融合hIL10多肽之不同濃度(x軸)的IL6產生(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖13顯示評估所指示融合mIL10多肽在活化小鼠CD8 T細胞中回應於融合mIL10多肽之不同濃度(x軸)的顆粒酶B分泌水平(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。
圖14顯示評估回應於所指示融合mIL10多肽之不同濃度(x軸)的活化小鼠CD8 T細胞存活百分比(y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。如所繪示，具有T100L突變之小鼠融合多肽在誘導CD8 T細胞母細胞存活方面較弱且在高達100 nM濃度時未達到等效於融合mIL10 WT多肽的Emax水平。
圖15顯示評估小鼠單核球中回應於所指示融合mIL10多肽之不同濃度(x軸)的誘導細胞表面CD64 (y軸)的分析結果，如實例中更充分地描述。所提供資料指示，相較於原生mIL10分子，具有T100L突變(TP0015)之融合多肽展現對單核球上CD64之細胞表面表現的誘導降低。
圖16提供評估回應於包含T100L突變之所指示聚乙二醇化鼠類融合mIL10多肽之不同指示劑量的單次投與，小鼠血清濃度(y軸)隨時間推移(x軸)的作用的藥物動力學研究結果，如實例中更充分地描述。所提供資料指示在多肽之單次投與後，相較於非聚乙二醇化融合mIL10多肽，融合mIL10多肽之聚乙二醇化型式展現更長活體內半衰期。
圖17提供監測原生IL10 (hIL10 WT)或融合IL10 WT (h_SS0052_AA)之pH依賴性穩定性的分析型SEC結果。所提供資料指示原生IL10分子在pH ＜ 5.0下解離為單體，而融合hIL10分子在類似條件下保持穩定。
圖18A至圖18D提供與Fc多肽結合之融合IL10多肽的各種組態的示意性表示。圖18A至圖18C指示杵-進入-臼(KiH) Fc組態，其中融合IL10多肽與KiH二聚體Fc之「臼」次單元結合(18A)，其中融合IL10多肽與KiH二聚體Fc之「杵」次單元結合(18B)，其中第一(白色)融合IL10多肽與KiH二聚體Fc之「臼」Fc次單元結合且第二(黑色)融合IL10多肽與「杵」Fc次單元結合(18C)，其中第一與第二融合IL10多肽不同。圖18D繪示Fc未經修飾以促進異二聚化且Fc二聚體之Fc次單元中之各者與融合IL10多肽結合的組態。
圖19A及圖19B提供評估小鼠脾細胞中人類分子之物種交叉反應性的結果，展示回應於測試物品之不同濃度(橫軸)的IL6 (A，縱軸)及TNFα (B，縱軸)水平，如本文實例11中更充分地描述。
圖20提供回應於測試物品之不同濃度(橫軸)的顆粒酶B分泌(縱軸)作為野生型IL10活性百分比的評估結果，如本文實例12中更充分地描述。
圖21提供回應於測試物品之不同濃度(橫軸)的藉由抑制食蟹獼猴全血中LPS誘導之IL-6分泌(縱軸)之能力評定的測試物品活性的評估結果，如本文實例13中更充分地描述。
圖22提供在潰瘍性結腸炎之DSS模型中用不同劑量之各種測試物品治療的小鼠之體重(縱軸)隨時間推移(橫軸)的評估結果，如本文實例14中更充分地描述。
圖23提供在潰瘍性結腸炎之DSS模型中用不同劑量之各種測試物品治療的小鼠之初始體重百分比(縱軸)隨時間推移(橫軸)的評估結果，如本文實例14中更充分地描述。
圖24提供在潰瘍性結腸炎之DSS模型結束時，回應於不同劑量之各種測試物品(橫軸)的體重(縱軸)的評估結果，如本文實例14中更充分地描述。
圖25提供在潰瘍性結腸炎之DSS模型結束時，回應於不同劑量之各種測試物品(橫軸)的結腸長度(縱軸)的評估結果，如本文實例14中更充分地描述。
圖26提供在潰瘍性結腸炎之DSS模型之第4天，回應於不同劑量之各種測試物品(橫軸)的小鼠血容比結果(縱軸)，如本文實例14中更充分地描述。
圖27提供回應於各種測試物品治療的投與的IFNγ、IL10、IL-1B、IL6、TNF-a及IL-4血清細胞介素水平(縱軸)隨時間推移(研究天數，橫軸)的評估結果，如本文實例14中更充分地描述。
圖28提供回應於各種測試物品治療的投與的IL-5、IP10、IL17A/F及MIP1a血清細胞介素水平(縱軸)隨時間推移(研究天數，橫軸)的評估結果，如本文實例14中更充分地描述。
圖29提供腹膜巨噬細胞的CD163表現(縱軸)相對於各種測試物品的投與(橫軸)的評估結果，如實例14中更充分地描述。
圖30提供腹膜巨噬細胞之CD64表現(縱軸)相對於各種測試物品的投與(橫軸)的評估結果，如實例14中更充分地描述。
圖31提供小鼠結腸中回應於各種測試物品的投與(橫軸)的上皮損傷百分比(縱軸)的評估結果，如實例14中更充分地描述。
圖32提供小鼠結腸黏膜中回應於各種測試物品的投與(橫軸)的CD11B+及TH17細胞(縱軸)的評估結果，如實例14中更充分地描述。
圖33提供周邊血液免疫細胞中回應於各種測試物品的投與(橫軸)的pSTAT3誘導水平的評估結果，如實例15中更充分地描述。
圖34提供評估各種測試物品隨時間推移的血清濃度的藥物動力學研究結果，如實例16中更充分地描述。
圖35提供在LPS休克模型中在LPS投與後1.5小時回應於各種測試物品的投與(橫軸)的IL6、KC/GRO、IL10及TNFα血清細胞介素水平(縱軸)的評估結果，如實例17中更充分地描述。
圖36提供在LPS休克模型中在LPS投與六(6)小時後回應於各種測試物品的投與(橫軸)的IL6、KC/GRO、IL10、TNFα、IFNγ、IL1b及IL5血清細胞介素水平(縱軸)的評估結果，如實例17中更充分地描述。
圖37提供評估各種測試物品隨時間推移的血清濃度的藥物動力學研究結果，如實例18中更充分地描述。
圖38提供周邊血液骨髓細胞中測試物品誘導pSTAT3的能力(縱軸)隨時間推移(橫軸)的評估結果，如實例19中更充分地描述。
圖39提供回應於各種測試物品的投與(橫軸)的腹膜滲出液免疫細胞清除劑CD163及CD64受體表現(縱軸)隨時間推移的評估結果，如實例21中更充分地描述。
圖40提供回應於各種測試物品的投與(橫軸)的腹膜滲出液免疫細胞清除劑CD16表現(縱軸)隨時間推移的評估結果，如實例22中更充分地描述。
圖41提供回應於各種測試物品的投與(橫軸)的腹膜滲出液免疫細胞清除劑CD38表現(縱軸)隨時間推移的評估結果，如實例23中更充分地描述。
圖42提供回應於各種測試物品的投與(橫軸)的周邊血液免疫細胞上之CD38及CD16水平(縱軸)隨時間推移的評估結果，如實例24中更充分地描述。
圖43提供回應於各種測試物品的投與的周邊血液B細胞上之CD150水平隨時間推移的評估結果，如實例25中更充分地描述。
圖44提供在IFNγ誘導之貧血模型中在研究第8天回應於各種測試物品的投與的小鼠血容比結果(縱軸)，如實例26中更充分地描述。
圖45提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL1βb分泌(縱軸)相關的資料，如實例27中更充分地描述。
圖46提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL6分泌(縱軸)相關的資料，如實例27中更充分地描述。
圖47提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的TNFα分泌(縱軸)相關的資料，如實例27中更充分地描述。
圖48提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品投與之濃度提高(橫軸)的IL1βb分泌(縱軸)相關的資料，如實例28中更充分地描述。
圖49提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品投與之濃度提高(橫軸)的TNFα分泌(縱軸)相關的資料，如實例28中更充分地描述。
圖50提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品投與之濃度提高(橫軸)的IL1βb分泌(縱軸)相關的資料，如實例29中更充分地描述。
圖51提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品投與之濃度提高(橫軸)的TNFα分泌(縱軸)相關的資料，如實例29中更充分地描述。
圖52提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL1βb分泌(縱軸)相關的資料，如實例30中更充分地描述。
圖53提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL6分泌(縱軸)相關的資料，如實例30中更充分地描述。
圖54提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的TNFα分泌(縱軸)相關的資料，如實例30中更充分地描述。
圖55提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL1βb分泌(縱軸)相關的資料，如實例31中更充分地描述。
圖56提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL6分泌(縱軸)相關的資料，如實例31中更充分地描述。
圖57提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的TNFα分泌(縱軸)相關的資料，如實例31中更充分地描述。
圖58提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL1βb分泌(縱軸)相關的資料，如實例32中更充分地描述。
圖59提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL6分泌(縱軸)相關的資料，如實例32中更充分地描述。
圖60提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的TNFα分泌(縱軸)相關的資料，如實例32中更充分地描述。
圖61提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL1βb分泌(縱軸)相關的資料，如實例33中更充分地描述。
圖62提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL6分泌(縱軸)相關的資料，如實例33中更充分地描述。
圖63提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的TNFα分泌(縱軸)相關的資料，如實例33中更充分地描述。
圖64提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL1βb分泌(縱軸)相關的資料，如實例34中更充分地描述。
圖65提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL6分泌(縱軸)相關的資料，如實例34中更充分地描述。
圖66提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的TNFα分泌(縱軸)相關的資料，如實例34中更充分地描述。
圖67提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL1βb分泌(縱軸)相關的資料，如實例35中更充分地描述。
圖68提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL6分泌(縱軸)相關的資料，如實例35中更充分地描述。
圖69提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的TNFα分泌(縱軸)相關的資料，如實例35中更充分地描述。
圖70提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL1βb分泌(縱軸)相關的資料，如實例36中更充分地描述。
圖71提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL6分泌(縱軸)相關的資料，如實例36中更充分地描述。
圖72提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的TNFα分泌(縱軸)相關的資料，如實例36中更充分地描述。
圖73提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL1βb分泌(縱軸)相關的資料，如實例37中更充分地描述。
圖74提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL6分泌(縱軸)相關的資料，如實例37中更充分地描述。
圖75提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的TNFα分泌(縱軸)相關的資料，如實例37中更充分地描述。
圖76提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL1βb分泌(縱軸)相關的資料，如實例38中更充分地描述。
圖77提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL6分泌(縱軸)相關的資料，如實例38中更充分地描述。
圖78提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的TNFα分泌(縱軸)相關的資料，如實例38中更充分地描述。
圖79提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL1βb分泌(縱軸)相關的資料，如實例39中更充分地描述。
圖80提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL6分泌(縱軸)相關的資料，如實例39中更充分地描述。
圖81提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的TNFα分泌(縱軸)相關的資料，如實例39中更充分地描述。
圖82提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL1βb分泌(縱軸)相關的資料，如實例40中更充分地描述。
圖83提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL6分泌(縱軸)相關的資料，如實例40中更充分地描述。
圖84提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的TNFα分泌(縱軸)相關的資料，如實例40中更充分地描述。
圖85提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL1βb分泌(縱軸)相關的資料，如實例41中更充分地描述。
圖86提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL6分泌(縱軸)相關的資料，如實例41中更充分地描述。
圖87提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的TNFα分泌(縱軸)相關的資料，如實例41中更充分地描述。
圖88提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL1βb分泌(縱軸)相關的資料，如實例42中更充分地描述。
圖89提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL6分泌(縱軸)相關的資料，如實例42中更充分地描述。
圖90提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的TNFα分泌(縱軸)相關的資料，如實例42中更充分地描述。
圖91提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL1βb分泌(縱軸)相關的資料，如實例43中更充分地描述。
圖92提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL6分泌(縱軸)相關的資料，如實例43中更充分地描述。
圖93提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的TNFα分泌(縱軸)相關的資料，如實例43中更充分地描述。
圖94提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL1βb分泌(縱軸)相關的資料，如實例44中更充分地描述。
圖95提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的IL6分泌(縱軸)相關的資料，如實例44中更充分地描述。
圖96提供與用LPS刺激之人類單核球中回應於各種測試物品之濃度提高(橫軸)的TNFα分泌(縱軸)相關的資料，如實例44中更充分地描述。
圖97提供與用LPS刺激之人類單核球中抑制IL1βb之各種測試分子之IC50值(縱軸)相關的資料，如實例45中更充分地描述。
圖98提供與用LPS刺激之人類單核球中抑制IL6之各種測試分子之IC50值(縱軸)相關的資料，如實例45中更充分地描述。
圖99提供與用LPS刺激之人類單核球中抑制TNFα之各種測試分子之IC50值(縱軸)相關的資料，如實例45中更充分地描述。
圖100提供與各種測試物品之顆粒酶A分泌相關的資料，其正規化為由fused_WT IL-10 (h_DR2339_AA)誘導之最大分泌百分比，如實例46中更充分地描述。
圖101提供與各種測試物品之顆粒酶B分泌相關的資料，其正規化為由fused_WT IL-10 (h_DR2339_AA)誘導之最大分泌百分比，如實例46中更充分地描述。
圖102提供與各種測試物品之IFNγ分泌相關的資料，其正規化為由fused_WT IL-10 (h_DR2339_AA)誘導之最大分泌百分比，如實例46中更充分地描述。

Claims (70)

  1. 一種融合人類IL10 (hIL10)多肽，其包含下式之多肽： (hIL10A)-L n-(hIL10B)， 其中： (a) hIL10A及hIL10B各自為獨立地選自由以下組成之群的人類IL10 (hIL10)序列：野生型hIL10 (SEQ ID NO: 4)及hIL10突變蛋白，其中該等hIL10突變蛋白各自獨立地包含在對應於SEQ ID NO: 4之殘基T100、H14、N18、N21、M22、R24、D25、D28、R32、E74、H90、N92、S93、E96及R104之位置處的一或多個胺基酸取代，視情況該hIL10A相對於SEQ ID NO: 4具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基之胺基末端缺失，及/或該hIL10B相對於SEQ ID NO: 4具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基之胺基末端缺失； (b) L係長度為1個胺基酸至30個胺基酸的胺基酸連接子；且 (c) n = 0 (不存在)或1 (存在)。
  2. 如請求項1之融合hIL10多肽，其中： (a) T100位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：T100L、T100D、T100V、T100E、T100A、T100R、T100N、T100Q、T100E、T100I、T100K、T100M及T100S； (b) H14位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：H14C、H14F、H14P、H14W、H14G、H14A、H14D、H14E、H14I、H14K、H14L、H14M、H14N、H14Q、H14R、H14S、H14T、H14Y及H14V； (c) N18位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：N18Y、N18F、N18A、N18D、N18E、N18L、N18V、N18S、N18T、N18I、N18V、N18M、N18R、N18K及N18H； (d) N21位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：N21A、N21R、N21Q、N21H、N21K、N21S、N21V、N21I、N21L、N21M、N21T、N21C、N21D及N21E； (e) M22位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：M22A、M22V、M22I、M22L、M22N、M22D、M22S、M22T、M22W及M22Q； (f) R24位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：R24E、R24D、R24N、R24Q、R24A、R24S及R24T； (g) D25位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：D25A、D25N、D25H、D25I、D25K、D25L、D25P、D25Q及D25V； (h) D28位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：D28A、D28E、D28L、D28V、D28S、D28T、D28I、D28V、D28M、D28H、D28K及D28R； (i) R32位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：R32A、R32D、R32E、R32L、R32V、R32S、R32T、R32I、R32V、R32M、R32N、R32Q、R32G、R32C、R32P、R32F、R32Y及R32H； (j) E74位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：E74A、E74D、E74L、E74V、E74S、E74T、E74I、E74V、E74M、E74H、E74K及E74R； (k) H90位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：H90A、H90D、H90E、H90I、H90K、H90L、H90M、H90N、H90Q、H90R、H90S、H90T、H90Y及H90V； (l) N92位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：N92D、N92Q、N92E、N92H、N92K、N92S、N92V、N92I、N92L、N92M、N92T及N92A； (m) S93位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：S93E、S93A、S93R、S93N、S93D、S93Q、S93E、S93I、S93L、S93K、S93M、S93G及S93V； (n) E96位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：E96C、E96F、E96Y、E96W、E96A、E96N、E96D、E96Q、E96H、E96K及E96S；且 (o) R104位置處之胺基酸取代選自由以下組成之群：R104A、R104W、R104Y、R104F、R104H、R104D、R104E、R104N、R104Q、R104S、R104T、R104I、R104L、R104V及R104M。
  3. 如請求項1或2之融合hIL10多肽，其中該hIL10A及該hIL10B中之至少一者為hIL10突變蛋白。
  4. 如請求項1至3中任一項之融合hIL10多肽，其中hIL10A及該hIL10B均為hIL10突變蛋白。
  5. 如請求項1至4中任一項之融合hIL10多肽，其中hIL10A與該hIL10B相同。
  6. 如請求項1至4中任一項之融合hIL10多肽，其中hIL10A與該hIL10B不同。
  7. 如請求項1至6中任一項之融合hIL10多肽，其中n = 0 (不存在)。
  8. 如請求項1至6中任一項之融合hIL10多肽，其中n = 1 (存在)且L為具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸之多肽。
  9. 如請求項8之融合hIL10多肽，其中L為GS連接子。
  10. 如請求項9之融合hIL10多肽，其中該GS連接子包含GGGSGSGSGSG之序列(SEQ ID NO: 19)。
  11. 如請求項1至10中任一項之融合hIL10多肽，其中該hIL10A及該hIL10B各自獨立地選自野生型hIL10 (SEQ ID NO: 4)或IL10突變蛋白，該IL10突變蛋白包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：N21D、N21E、N21K、M22A、M22S、M22T、M22D、M22W、R24E、D25K、E96K、E96Q、T100E、T100C及T100L。
  12. 如請求項1至11中任一項之融合hIL10多肽，其中該hIL10A及/或該hIL10B包含胺基酸取代T100L。
  13. 如請求項1至11中任一項之融合hIL10多肽，其中該hIL10A及/或該hIL10B包含胺基酸取代M22A或M22S。
  14. 如請求項1至11中任一項之融合hIL10多肽，其中該hIL10A及/或該hIL10B包含胺基酸取代E96Q。
  15. 如請求項1至11中任一項之融合hIL10多肽，其中該hIL10A及/或該hIL10B包含胺基酸取代R24E。
  16. 如請求項1至11中任一項之融合hIL10多肽，其中該hIL10A及/或該hIL10B包含胺基酸取代D25K。
  17. 如請求項1至11中任一項之融合hIL10多肽，其中該hIL10A及/或該hIL10B包含胺基酸取代N21K。
  18. 如請求項1至11中任一項之融合hIL10多肽，其中hIL10A及/或hIL10B各自為與選自由以下組成之群的多肽具有至少90%序列一致性之多肽：SEQ ID NO: 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、148、149、150、151、152、153、154、155、156、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204及205，視情況其中hIL10A及hIL10B中之一者或兩者相對於SEQ ID NO: 4之序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基之N末端缺失。
  19. 如請求項18之融合hIL10多肽，其中該hIL10A與該hIL10B相同。
  20. 如請求項18之融合hIL10多肽，其中該hIL10A與該hIL10B不同。
  21. 如請求項19或20之融合hIL10多肽，其中該hIL10A及該hIL10B各自包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：N21D、N21E、N21K、M22A、M22S、M22T、M22D、M22W、R24E、D25K、E96K、E96Q、T100E、T100C及T100L。
  22. 如請求項19或20之融合hIL10多肽，其中hIL10A為選自由以下組成之群的多肽：SEQ ID NO: 191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204及205，且hIL10B為選自由以下組成之群的多肽：SEQ ID NO: 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、148、149、150、151、152、153、154、155及156。
  23. 如請求項21之融合hIL10多肽，其中該hIL10A及該hIL10B均為包含胺基酸取代T100L之hIL10突變蛋白。
  24. 如請求項23之融合hIL10多肽，其中該hIL10A及該hIL10B均為包含胺基酸取代T100L之hIL10突變蛋白，hIL10A為與SEQ ID NO: 204具有100%序列一致性的多肽且hIL10B為與SEQ ID NO: 15具有100%序列一致性的多肽。
  25. 如請求項21之融合hIL10多肽，其中該融合hIL10多肽為包含與選自由以下組成之群的多肽具有至少95%，或者至少96%，或者至少97%，或者至少98%，或者至少99%，或者100%序列一致性之胺基酸序列的多肽：SEQ ID NO: 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、119、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185及186。
  26. 如請求項21之融合hIL10多肽，其中該融合hIL10多肽包含與選自由以下組成之群的多肽具有100%序列一致性的胺基酸序列：SEQ ID NO: 44、123、124、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185及186。
  27. 如請求項23之融合hIL10多肽，其中該融合hIL10多肽包含與選自由以下組成之群的多肽具有至少90%序列一致性之胺基酸序列：SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 170及SEQ ID NO: 185。
  28. 如請求項27之融合hIL10多肽，其中該融合hIL10多肽包含與SEQ ID NO: 44之胺基酸序列具有100%一致性之多肽。
  29. 如請求項27之融合hIL10多肽，其中該融合hIL10多肽包含與SEQ ID NO: 185之胺基酸序列具有100%一致性之多肽。
  30. 如請求項1至29中任一項之融合hIL10多肽，其中該融合hIL10多肽經修飾以延長活體內半衰期。
  31. 如請求項30之融合hIL10多肽，其中用於延長活體內半衰期之修飾選自由以下組成之群：聚乙二醇化、醯基化、白蛋白化或與Fc多肽結合。
  32. 如請求項31之融合hIL10多肽，其中該用於延長活體內半衰期之修飾為醯基化。
  33. 如請求項31之融合hIL10多肽，其中該用於延長活體內半衰期之修飾為與Fc多肽結合。
  34. 如請求項33之融合hIL10多肽，其中該Fc多肽為來自hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4或其變異體之Fc域。
  35. 如請求項33或34之融合hIL10多肽，其中該Fc多肽包含由野生型Fc多肽序列進行修飾以降低效應功能的序列。
  36. 如請求項33至35中任一項之融合hIL10多肽，其中該Fc多肽包含一或多個胺基酸取代或缺失以促進異二聚化。
  37. 如請求項33之融合hIL10多肽，其中該融合hIL10多肽為異二聚Fc分子，該異二聚Fc分子包含下式#1之第一多肽： IL10FP- L1 a-UH1—Fc1   [1] 及下式#2之第二多肽： UH2—Fc2   [2] 其中： hIL10FP為本揭示之融合hIL10多肽(例如式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合hIL10多肽)； L1為連接子且a獨立地選自0 (不存在)或1 (存在)； UH1及UH2各自為獨立地選自由以下組成之群的人類免疫球蛋白的上鉸鏈域：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4上鉸鏈域，視情況包含胺基酸取代C220S (EU編號)； Fc1為多肽，其包含選自由以下組成之群的人類免疫球蛋白的下鉸鏈、CH2及CH3域：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，包含一或多個胺基酸取代以促進與Fc2之異二聚化；且 Fc2為多肽，其包含選自由以下組成之群的人類免疫球蛋白的下鉸鏈、CH2及CH3域：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，包含一或多個胺基酸取代以促進與Fc1之異二聚化， 且視情況其中式[1]之多肽及式[2]之多肽藉由至少一個鏈間雙硫鍵連接。
  38. 如請求項31之融合hIL10多肽，其中該用於延長活體內半衰期之修飾為聚乙二醇化。
  39. 如請求項38之融合hIL10多肽，其中PEG為具有約2,000至約80,000道爾頓，或者約2,000至約70,000道爾頓，或者約5,000至約50,000道爾頓，或者約10,000至約50,000道爾頓，或者約20,000至約50,000道爾頓，或者約30,000至約50,000道爾頓之分子量的直鏈或分支鏈聚乙二醇分子。
  40. 如請求項39之融合hIL10多肽，其中該PEG為直鏈。
  41. 如請求項39之融合hIL10多肽，其中該PEG為分支鏈。
  42. 如請求項39之融合hIL10多肽，其中該PEG為包含兩個20 kD臂之40 kD分支鏈PEG分子。
  43. 如請求項39之融合hIL10多肽，其中該PEG，視情況經由連接子，共價連接至該多肽之N末端。
  44. 如請求項39之融合hIL10多肽，其中該PEG為包含兩個下式之20 kD臂之40 kD分支鏈PEG分子： ，其視情況經由連接子共價鍵結至hIL10A之N末端。
  45. 如請求項44之融合hIL10多肽，其中該PEG經由醛連接子共價鍵結至hIL10A之N末端。
  46. 如請求項1至45中任一項之融合hIL10多肽，其中相較於活化人類CD8 T細胞中野生型hIL10之活性分率，該融合hIL10多肽在活化人類單核球中展現更高的野生型hIL10之活性分率。
  47. 如請求項46之融合hIL10多肽，其中該野生型hIL10之活性為誘導細胞內STAT3信號傳導。
  48. 如請求項1至45中任一項之融合hIL10多肽，其中該融合hIL10多肽在活化人類單核球中展現的Emax為野生型hIL10之活性程度之至少30%，視情況至少40%，視情況至少50%，其中活化人類單核球中該野生型hIL10之活性係選自由以下組成之群：抑制IL1β分泌及抑制TNFα分泌。
  49. 如請求項1至45中任一項之融合hIL10多肽，其中該融合hIL10多肽在活化人類CD8 T細胞中展現的Emax小於野生型hIL10之活性程度之30%，視情況小於20%，視情況小於10%，其中活化人類CD8 T細胞中該野生型hIL10之活性選自由以下組成之群：IFNγ分泌、顆粒酶A分泌及顆粒酶B分泌。
  50. 一種核酸序列，其編碼如請求項1至45中任一項之融合hIL10多肽。
  51. 如請求項50之核酸序列，其中該核酸序列為mRNA。
  52. 如請求項50之核酸序列，其中該核酸序列為DNA。
  53. 一種載體，其包含與表現控制序列可操作地連接的如請求項50至52中任一項之核酸序列。
  54. 如請求項53之載體，其中該載體係病毒載體。
  55. 一種細胞，其經如請求項53或54之載體轉型。
  56. 如請求項55之細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞。
  57. 一種醫藥調配物，其包含：作為活性成分之(a)如請求項1至45中任一項之融合hIL10多肽；(b)如請求項50至52中任一項之核酸序列；(c)如請求項53或54之載體；或(d)如請求項55或56之細胞，以及一或多種醫藥學上可接受之溶劑、載劑、穩定劑、防腐劑或稀釋劑。
  58. 一種預防或治療罹患疾病、病症或病狀之哺乳動物個體的方法，該方法包含向該個體投與：(a)如請求項1至45中任一項之融合hIL10多肽；(b)如請求項50至52中任一項之核酸序列；(c)如請求項53或54之載體；或(d)如請求項55或56之細胞；或(e)如請求項57之醫藥調配物。
  59. 如請求項58之方法，其中該疾病、病症或病狀為自體免疫疾病、病症或病狀。
  60. 如請求項59之方法，其中該自體免疫疾病、病症或病狀為發炎性腸道疾病(IBD)。
  61. 如請求項60之方法，其中該IBD為克羅恩氏病(Crohn's disease)或潰瘍性結腸炎。
  62. 如請求項58之方法，其中該疾病、病症或病狀為癌症。
  63. 如請求項62之方法，其中該癌症為由慢性發炎引起之癌症。
  64. 如請求項58之方法，其中該疾病、病症或病狀為巨噬細胞活化症候群。
  65. 如請求項58之方法，其中該疾病、病症或病狀為干擾素γ誘導之貧血。
  66. 一種製備式(hIL10A)-L n-(hIL10B)之融合人類IL10 (hIL10)多肽的方法，該方法包含以下步驟：用如請求項53或54之載體轉染宿主細胞；在培養基中，在准許編碼該融合hIL10多肽之核酸序列之表現的條件下培養該細胞；及自該培養基分離該融合hIL10多肽，視情況進一步包含純化該融合hIL10多肽之步驟。
  67. 如請求項66之方法，其中該宿主細胞為原核細胞。
  68. 如請求項67之方法，其中該原核細胞為大腸桿菌( E. coli)細胞。
  69. 如請求項66至68中任一項之方法，其中該hIL10A為選自由以下組成之群的多肽：SEQ ID NO: 191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204及205，且該hIL10B為選自由以下組成之群的多肽：SEQ ID NO: 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、148、149、150、151、152、153、154、155及156。
  70. 如請求項69之方法，其中該hIL10A為選自由以下組成之群的多肽：SEQ ID NO: 172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185及186。
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