TW202500977A

TW202500977A - 光化學標記的方法

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Publication number: TW202500977A
Application number: TW113124153A
Authority: TW
Inventors: 廖仲麒; 陳一德; 張海妍; 鍾佳紋; 張孝任; 謝永達; 鍾穎文; 張至為
Original assignee: 新析生物科技股份有限公司
Priority date: 2023-06-29
Filing date: 2024-06-28
Publication date: 2025-01-01
Also published as: WO2025006872A2

Abstract

提供一種光化學標記的方法，包括遞送光反應性探針至樣本的步驟，以及光反應性探針式(I)：T─L─W，其中T部分為生物素或另一個生物素基部分； L部分包括化學鍵或連接子；以及W部分為光反應性部分，其中光反應性部分可吸收UV光且經活化以與胺基酸交聯；以及在選擇關注區域藉由光輻射選擇性地照光樣本以活化光反應性探針的光反應性部分；以及在選擇關注區域中，形成探針的光反應性部分與樣本不同的複數蛋白質的複數胺基酸之間的非特異性交聯。

Description

使用光反應性探針對生物分子進行光標記的方法

本揭露是有關於一種蛋白質體學發現的方法。特別是有關於一種使用光反應探針來標記、分析和鑑定生物樣本中的生物分子的方法。

空間蛋白質體學可以對生物樣本進行蛋白質圖譜分析，以揭示潛在蛋白質-蛋白質相互作用的地理組織(geographic organization)。細胞生物學家和組織學家都很大程度上受益於空間蛋白質體學的最新發展，例如，能夠進行與疾病相關的微環境蛋白質圖譜、組織學樣本上的異質蛋白質分佈或特定細胞器的蛋白質鑑定。標靶空間蛋白質體學旨在定位已知蛋白質，而無假設空間蛋白質體學(hypothesis-free spatial proteomics)需要空間蛋白質鑑定，而無需事先了解要尋找的蛋白質。與轉錄組學( transcriptomics)不同的是，PCR 能夠放大訊號從而使RNAseq等無假設轉錄組學成為可能，而蛋白質組學尚無與PCR等效的技術。

對於無假設空間蛋白質體學來說，兩種主要技術是可行的：大規模顯微鏡繪圖法和質譜法(mass spectrometry，MS)。蛋白質圖譜計畫(Protein Atlas Project)使用大規模免疫染色繪製了數千種蛋白質物種圖譜，有效地創建了一個無假設的空間蛋白質組資料庫。這種方法的局限性在於其應用於特定的生物問題，如果對刺激或突變引起的蛋白質組變化感興趣，則必須對每個項目實施數月的詳盡染色過程。

免疫沉澱法 (immunoprecipitation，IP)和質譜法一起是一種廣泛使用的生化方法，用於鑑定與誘餌蛋白相關的蛋白質組。近期，鄰近標記法(proximity labeling)提供了接近誘餌蛋白更好的空間精準度。免疫沉澱法和鄰近標記法的結果有時特異性較低，這可能是由於下拉過程中(pulldown process)的非特異性交互作用所致。如果多個關注區域(regions of interest，ROIs)只能透過形態特徵來指定而沒有明顯的誘餌，則鄰近標記法將無法進行。雷射捕獲顯微切割(laser-capture microdissection，LCM)能夠在特定ROIs處進行蛋白質分離，並隨後進行無假設的空間蛋白質組鑑定。然而，切割雷射的光束尺寸太大，無法達到亞細胞(subcellular)的精準度，其非辨識性軸向切割(non-discriminative axial cutting)不可避免地包含非特異性蛋白質，並進一步降低了特異性。最近發展的空間靶向光學微蛋白質組學(spatially targeted optical microproteomics，STOMP)及其衍生方法提供了另一種無假設空間蛋白質組學工具，可在顯微鏡下識別特定ROIs處的蛋白質組。然而，它缺乏基本的放大要求來達到質譜法對靈敏度和特異性的需求，使得雖然驗證已知的高豐富度蛋白質是可行的，但對於主要的發現目標將難以實現，其中需要靈敏度來揭露相對低豐富度的蛋白質，而這些蛋白質對於生物學問題是未知的。

有鑑於上述目的，本揭露提供一種光反應性探針，其使用方便、適用於無假設學說、且螢光成像中雜訊訊號較低。因此，此類光反應性探針是處理高含量蛋白質的更好工具，用於基於使用者定義的顯微影像特徵在關注區域 (ROI)中進行標記、分析、分離和識別，廣泛用於細胞或組織樣本實驗。

在一方面，本揭露提供一種光化學標記的方法，包含：將光反應性探針遞送至樣本，其中以式(I)表示之光反應性探針：T─L─W (I)，其中T部分為生物素，或另一個生物素基部分；L部分為化學鍵或連接子；以及W部分為光反應性部分，其中光反應性部分可吸收UV且經活化以與胺基酸交聯；在選擇關注區域藉由光輻射選擇性地照光樣本以活化光反應性探針的光反應性部分；以及在選擇關注區域中，形成探針的光反應性部分與樣本不同的複數蛋白質的複數胺基酸之間的非特異性交聯。

在一實施方式中，遞送至樣本的光反應性探針具有0.1 mM至10 mM的濃度。

在一實施方式中，關注區域包含複數照光點，且在選擇性地照光的步驟中各照光點的曝光時間為10 μs至5000 μs的範圍。

在一實施方式中，選擇性地照光的步驟包含以具有1 mW 至600 mW的功率強度的光照光。

在一實施方式中，樣本包含固定細胞、固定組織、細胞萃取物、或組織萃取物。

在一實施方式中，在與蛋白質交聯之前，光反應性部分在光輻射活化後轉化為自由基部分。

在一實施方式中，光反應性部分係選自於由二苯酮、疊氮苯、苯基二氮環丙烯、四氟苯基疊氮化物、羥苯基疊氮化物、及三氟甲基苯基二氮丙啶所組成之群組的一種。

在一實施方式中，光反應性部分藉由單光子激發或雙光子激發活化。

在一實施方式中，光反應性部分藉由200 nm至1600 nm的波長範圍的單光子激發活化。

在一實施方式中，光反應性部分藉由680 nm至1600 nm的波長範圍的雙光子激發活化。

在一實施方式中，以式(I-1)或(I-2)表示光反應性探針： (I-1) (I-2)，其中R與R’各自獨立為氫、烷基、或氮保護基，n為1至20的整數。

在一實施方式中，樣本固定於顯微鏡載玻片。

在一實施方式中，非特異性交聯為形成光反應性探針經活化的光反應性部分與蛋白質的胺基酸的α-碳之間的共價鍵。

在另一方面，本揭露提供一種影像引導光標記的方法，包含： (a) 將光反應性探針遞送至樣本，其中光反應性探針包含：可檢測標籤部分為生物素，或另一個生物素基部分；以及光反應性部分可吸收UV光且經活化以與胺基酸交聯，其中可檢測標籤部分藉由連接子或化學鍵與光反應性部分偶合； (b) 以成像光源與相機在第一視野中將樣本成像且獲取在第一視野中的樣本的至少一影像； (c) 處理至少一影像且測定在第一視野中的關注區域； (d) 獲得關注區域的座標訊息； (e) 根據座標訊息，藉由光輻射選擇性地照光關注區域以活化光反應性探針的光反應性部分，且藉以在關注區域中，形成光反應性探針的光反應性部分與樣本不同的複數蛋白質的複數胺基酸之間的非特異性交聯；以及 (f) 第一視野的關注區域被照光之後，移動至樣本的第二視野，並重複步驟(b)至(e)直到樣本的所有視野被完全照光。

在一實施方式中，光反應性部分係選自於由二苯酮、疊氮苯、苯基二氮環丙烯、四氟苯基疊氮化物、羥苯基疊氮化物、及三氟甲基苯基二氮丙啶所組成之群組中的一種。

在一實施方式中，以式(I-1)或(I-2)表示之光反應性探針： (I-1) (I-2)，其中R與R’各自獨立為氫、烷基、或氮保護基，n為1至20的整數。

在另一方面，本揭露提供一種分析探針標記蛋白質的方法，包含：獲取樣本；將光反應性探針遞送至樣本，其中以式(I)表示之光反應性探針：T─L─W (I)，其中T部分為生物素或另一個生物素基部分；L部分為化學鍵或連接子；以及W部分為光反應性部分其可吸收UV且經活化以與胺基酸交聯；藉由光輻射選擇性地照光樣本的關注區域，以活化在關注區域中光反應性探針的光反應性部分，並且在關注區域中形成光反應性部分與樣本不同的複數蛋白質的複數胺基酸之間的非特異性交聯；以及通過光反應性探針的T部分與複數親和性磁珠之間的親和性沉澱，以自樣本分離經探針標記的這些蛋白質。

在一實施方式中，在分離的步驟之後，方法更包含：使經分離的這些蛋白質進行質譜分析；以及鑑定樣本中經分離的這些蛋白質。

在一實施方式中，在選擇性地照光的步驟之後，方法更包含自樣本移除未經結合的這些光反應性探針。

透過以下參考附圖進行的詳細描述，本發明的實施方式將容易理解，其中相同的附圖標記涉及相同的元件。

本文闡述的範圍可以被解釋為包括它們的端點，並且開放式範圍可以被解釋為僅包括商業實用值。類似地，值列表可以被認為包括中間值，除非上下文指示相反。本文中數值範圍的列舉僅旨在用作單獨提及落入該範圍內的每個單獨值的速記方法。

除非本文另有說明或上下文另有說明，否則本文所述的方法可以以任何適當的順序執行。針對本文的某些實施例提供的範例或示範性語言(例如，「例如(such as)」)的使用僅旨在更好地闡明本發明，並且不對另外要求保護的本發明的範圍構成限制。

本文所使用的術語僅用於描述特定實施例的目的並且不旨在限制本揭露。如本文所用，單數形式「一(a)」、「一(an)」和「該(the)」也旨在包括複數形式，除非上下文清楚地另有說明。也應理解，術語「包含(comprises)」和/或「包含(comprising)」、或「包括(includes)」和/或「包括(including)」或「具有(has)」和/或「具有(having)」當用於本說明書中時，指定所陳述的特徵的存在、區域、整數、步驟、操作、元件和/或組件，但不排除其所述或額外的其一個或多個其它特徵、區域、整數、步驟、操作、元件、組件和/或其群組。

由於質譜法的靈敏度有限且缺乏蛋白質擴增工具，顯微鏡引導的高靈敏度亞細胞蛋白質體學發現極具挑戰性。本文描述的是一種稱為光蛋白質組學的整合技術，該技術結合了顯微成像、即時深度學習影像分割、圖案照光誘導的靶向光親和標記、親和純化和質譜分析，以發現和/或捕獲來自細胞或組織的特定亞細胞結構的蛋白質。該過程可被視為空間蛋白質體學發現。在一些實施例中，透過即時影像分析和一次一個FOV的機電控制，全自動照光數千個FOV中的數百萬個目標點，以實現類似亞細胞ROIs的高容量蛋白質標記。

親和力富集純化標記的蛋白質，在亞細胞層級有效收集(例如，微勺(micro-scooping)) ROI蛋白質。累積的收集的蛋白質足以滿足質譜靈敏度，以高靈敏度和特異性揭示特定蛋白質組。這種強力蛋白質累積克服了目前蛋白質擴增的技術差距，需要數百萬個步驟的速度優化，才能在數小時內完成整個過程。進一步使用光反應性探針來實現超解析度標記精準度。總之，光蛋白質體學可適用於廣泛不同的細胞和組織生物學問題，從而實現無假設的亞細胞蛋白質體學發現，並批量產生可測試的假設。

本文描述的是可用於鑑定、標記、取得和分析目標生物分子以及鄰近生物分子與目標生物分子相互作用的方法和組合物。此方法利用光反應性探針，特別是可以標記不同生物分子，同時在很大程度上保持生物分子中天然存在的分子結構。本文所描述的探針對於使用具有精確照光控制的圖像引導顯微鏡(例如美國專利號11,265,449中描述的系統)來標記細胞的細胞區域中的生物分子子集特別有用，以能夠自動標記感興趣的細胞生物分子。這些探針可用於原位標記生物分子，例如細胞或組織內的蛋白質，然後可以使用酪醯胺訊號放大(Tyramide Signal Amplification，TSA) 等進行鄰近標記。可以藉由質譜和定序等分析技術進一步分析生物分子。這些組合物對於進行組學研究(例如基因組學、蛋白質組學和轉錄組學)以及尋找用於疾病診斷和治療的相關生物標記特別有用。

縮寫與定義：

術語「生物素基部分」(biotin-based moiety)係指生物素和生物素衍生物的變體，例如具有開環或取代的生物素。通常，生物素部分可以用生物素結合實體或蛋白質(例如抗生物素蛋白(avidin)或鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin))容易地檢測到。另一個生物素基部分的實施例包括生物素二胺(diaminobiotin)、生物素碳酸鹽5 (biotin carbonate 5)、生物素碳酸鹽6、以及二亞胺基生物素(iminobiotin)。在一個具體實施例中，另一個生物素基部分是去硫生物素。

術語「連接子」是連接兩個或更多子結構的結構。連接子具有至少一條在子結構之間延伸不間斷的原子鏈。連接子的原子透過化學鍵(通常是共價鍵)連接。

術語「質譜分析」包括線性飛行時間(time-of-flight，TOF)、反射飛行時間(reflectron time-of-flight)、單四極桿(single quadruple)、多四極桿(multiple quadruple)、單磁扇區(single magnetic sector)、多磁扇區(multiple magnetic sectors)、傅立葉變換(Fourier transform)、離子迴旋共振(ion cyclotron resonance，ICR)或離子阱(ion trap)。

術語「鄰近分子」(proximity molecule)或相鄰分子(neighboring molecule)是指靠近另一分子的分子。鄰近分子或相鄰分子可以與該分子結合(例如，共價或非共價)或可靠近分子但不與分子結合。

術語「光敏化」(photoactivated)或「光活化」(light activated)係指藉由輻射能(例如藉由特定波長或波長範圍的光、UV光等)激發原子。在一些實施例中，光活化探針具有自由基基團，可與胺基酸的α碳反應。

術語「烷基」是指直鏈(無支鏈)或支鏈飽和烴基。在一些實施方式中，烷基具有24個或更少的碳原子，例如具有1至24個碳原子(「C _1-24烷基」)。在一些實施方式中，烷基具有1至6個碳原子(「C _1-6烷基」)或2至6個碳原子(「C _2-6烷基」)。C _1-6烷基的實施例包括甲基(C ₁)、乙基(C ₂)、丙基(C ₃)(例如正丙基、異丙基)、丁基(C ₄)(例如正丁基、叔丁基、仲丁基、異丁基)、戊基(C ₅)(例如正戊基、3-戊基、戊基(amyl)、新戊基、3-甲基-2-丁基、叔戊基)和己基(C ₆)(例如正己基)。烷基的另外的實施例包括正庚基、正辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基及類似基團。烷基可以是環狀的(例如環烷基)或無環的。「環烷基」指具有3至24個碳原子，例如3至10個碳原子的一價飽和或芳香環狀烴基，且範例為環丙基、環丁基、環戊基、環戊二烯基、環己基、環庚基、雙環[2.2.1.]庚基及類似基團。烷基可以是未取代或取代。未取代烷基僅由碳和氫原子組成。取代烷基具有與碳原子(代替H原子)鍵結的特殊分子或基團，並且可具有連接一個或多於一個的特殊分子或基團。在一些實施例中，取代烷基的烷基可包括鹵代烷基，其中該烷基被一個或多個鹵素原子(例如，F、Cl、Br或I)取代。在一些實施例中，烷基可以獨立地被一個、兩個、三個取代基取代，或者在烷基具有兩個或更多個碳的情況下，被四個或更多個取代基獨立地取代。

術語「氮保護基」(也稱為胺基保護基)是指存在於氮原子上的取代基。氮可以是化學反應性的，並且分子中的氮保護基團可以被配置為在分子中的其他地方進行修飾的條件下阻斷反應。氮保護基是本領域眾所周知的，並且包括但不限於醯胺基、胺基甲酸酯基(carbamate groups)、磺胺基及類似基團。

術語「交聯」(crosslink)或「交聯」(crosslinking)是指透過共價鍵化學連接兩個或更多分子、形成連接聚合物的三維網絡的過程。具體地，交聯是透過吸收光引發的光化學反應發生的光化學交聯。例如，本文所述的光反應性部分可以吸收UV光並產生反應性物質以在聚合物鏈之間形成共價鍵。

術語「非特異性交聯」(non-specific crosslinking)是指交聯劑以對特定位點或相互作用沒有選擇性的方式在生物分子之間形成共價鍵的過程。這意味著交聯隨機或廣泛地發生在生物分子內的各個可接近位點上。在本揭露中，非特異性交聯是指當光反應性部分吸收光能並在選定的興趣區域被活化時，每個光反應性部分可以與胺基酸形成共價鍵，並且不同的光反應性部分可以與不同的胺基酸交聯，無論是在相同的蛋白質或不同的蛋白質上。

系統

本文描述的是光反應性探針，其可以有利地與顯微鏡系統(例如本文和美國專利No. 11,265,449中描述的系統)一起使用，以能夠自動標記鄰近感興趣生物分子的細胞生物分子。

為了實現無假設的亞細胞蛋白質體學的高靈敏度和高特異性，必須從生物樣本中獲得足夠拷貝數的低豐富度蛋白質的蛋白質樣本。與用於核酸擴增的聚合酶鏈反應(PCR)不同，沒有可用於胜肽和蛋白質的擴增工具。本揭露提供了實現蛋白質擴增的相同目標的自動系統和方法。本發明的基本概念是利用定向光化學(directed photochemistry)在顯微鏡下對生物樣本的關注區域(ROI)處的蛋白質進行標記(例如，生物素化(biotinylate))，一次一個視野(FOV)，全自動處理數萬個FOV。本揭露中的系統執行影像處理以藉由形態特徵(影像引導)識別使用者定義的ROI，這使得使用者能夠發現未知的和新穎的蛋白質。

光誘導標記確保低背景，使得影像引導的蛋白質體學變得可行。然而，由於目前質譜技術的靈敏度限制，通常需要至少飛摩爾(femtomoles，約10 ⁸個分子)的相同物種才能被檢測到。因此，必須進行超高通量影像引導光標記才能解析低豐富度蛋白質。因此，本揭露的系統執行整個過程所需的四個連續步驟，重複數萬次，如第1圖所示。

步驟1：FOV的落射螢光成像。可以對生物樣本(即組織或培養的細胞)進行預處理，例如在玻片上固定和染色。螢光成像允許細胞形態、細胞/亞細胞區室的可視化。例如，如第1圖所示，在FOV 102(圓圈)中，觀察到細胞101 (灰色斑塊)。根據螢光訊號，研究人員能夠假設目標蛋白存在於關注區域103(黑點)。在一些實施方式中，本發明的光反應性探針可以在步驟1之前或步驟1和步驟2之間遞送至生物樣本。

步驟2：透過傳統影像處理或深度學習產生FOV的ROI光罩。光罩104定義了在下一個步驟中將被圖案化照光的所有關注區域103。

步驟3：選擇性地照光ROI以進行光化學標記(活化本文所述的光反應性探針)。

步驟4：將顯微鏡載物台移到下一個FOV，並重複步驟2和步驟3，直到所有FOV都被照光。

這個重複過程是實現蛋白質擴增的核心，並解決了蛋白質擴增的根本問題。現有技術或系統並未經過最佳化，無法在幾個小時內重複執行此過程。如果沒有這樣的速度，人們只能辨識高豐富度的蛋白質，而這些蛋白質大多是已知的沒有新穎性。也就是說，有必要優化此過程中大多數步驟和轉換的速度。

第2圖中顯示一種示例性系統。光學系統包含具有無漂移聚焦裝置的顯微鏡110、用於成像的sCMOS相機(CAM) 120和LED 130、用於雙光子照光的照光光源(ILS) 140 (例如780 nm飛秒雷射)觸發光化學反應、聲光調變器(acousto-optic modulator，AOM) 150作為照光光源快門、以及一對檢流計掃描振鏡160 (例如，振鏡X 162 和振鏡Y 164)引導光照光。顯微鏡110藉由USB介面包括載物台118和完美對焦系統(PFS) 116。雷射的開/關切換由AOM 150調控。然後，雷射光束由振鏡X 162和振鏡Y 164控制，並穿過作為顯微鏡110的部件的掃描透鏡(scan lens，SL) 113和管透鏡(tube lens，TL) 114，以合併在顯微鏡中110通過二向色鏡(dichroic mirrors，DMs，例如DM1 111和DM2 112)，然後透過物鏡115聚焦到樣本平面。雙光子標記可以從成像結果引導，該成像結果可以藉由在顯微鏡110上附接LED 130照光源以進行落射螢光成像來產生。樣本內產生的螢光可由物鏡115收集，且螢光訊號由二向色鏡(例如，DM1 111和DM2 112)引導並經由發射濾鏡117清潔以投影到sCOMS相機120上，能使幀率降至19毫秒。

使用雙光子照光以獲得z方向上更好的化學標記精度。使用電子切換的LED 130和AOM 150是為了利用它們的切換速度，LED 130觸發速度的時間標度(time scale)為＜20 μs且AOM 150上升/下降時間的時間標度為25 ns。為了避免因機械運動而導致速度減慢，使用多波段二向色鏡(例如 DM1 111 和 DM2 112)來實現多色成像和飛秒光照光，而無需移動機械元件(例如轉台(turret)或快門(shutter))。具有1 μs 轉換時間的處理器(processor，PRO) 170(例如現場可編程閘陣列(field programmable gate array)，FPGA)用於控制AOM和振鏡以實現掃描同步，其中每個照光點執行10至5000 µs以進行光化學反應。過程中唯一需要的機械運動是快速振鏡掃描和相對較慢的焦點調整以及向下一個視野的載物台移動。

光反應性探針

關於本發明，光反應性探針可以式(I)表示： T─L─W (I) 其中T部分為生物素或另一個生物素基部分；L部分為化學鍵或連接子；且W部分為光反應性部分，在施加光能時與樣本中的生物分子形成共價鍵。

第3圖顯示用於光選擇性空間標註和標記的系統的示意圖。第1圖之底部顯示了基板206例如於顯微鏡載物台上的樣本，以及設置於基板上之複數個細胞208的單層。在一些實施方式中，可使用自動化顯微鏡系統分析整個基板或基板之一部分的表面以識別所關注區域。例如，可對樣本進行染色或標記以識別所關注區域。第1圖之頂部顯示細胞208a之放大圖，該細胞為複數個細胞208之一。細胞208a具有細胞核216及多種不同類型的胞器212例如細胞膜、粒線體、核糖體及液泡。顯微鏡系統202選擇性地將窄帶光204照光至所關注區域(ROI) 218上以分析所關注區域218。照光可為選擇性的，且細胞及基板之大區域214不被照光。如下文更詳細解釋的，窄帶光204僅在所關注區域218中活化光反應性探針。

第4A圖顯示可以在組合物中使用並用於實踐本文描述的方法的光反應性探針的實施例。式(I-1)和(I-2)的探針包括作為光反應性部分W的二苯酮和作為用於在光反應性部分W和生物素或去硫生物素部分T之間連接的連接子L的聚乙二醇基(polyethylene glycol-based，PEG基)連接子。連接子L不限於PEG基的連接子，並且可以是例如胜肽、胺基酸、寡核苷酸、其他聚合物連接子、或其組合。聚合物連接子的其他實施例包括聚丙二醇、聚乙烯、聚丙烯、聚醯胺和聚酯。連接子可以是至少一個或兩個原子鏈中的線性分子並且可以包括更多。在一些實施方式中，n為1-20的整數，優選為1-6。

在一些實施例中，在式(I-1)和(I-2)中，R和R'各自獨立為氫、烷基或氮保護基。作為另一個實施例，連接子L可以被化學鍵取代，且生物素或去硫生物素部分T可以鍵結至光反應性部分W，而其間沒有連接子L，如第4B圖所示。

第4C圖顯示光反應性探針的二苯酮與生物分子的胺基酸AA的α-碳之間在照光下的反應。胺基酸40的一般結構包含α-碳AA、氫、羧基41、胺基42和R基43。二苯酮基團透過施加光能而被活化並轉化為激發態。激發的單重態(singlet state)迅速經歷系間穿越(intersystem crossing)，形成較穩定的三重態。在三重態下，二苯酮可以從附近胺基酸(特別是酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸或半胱胺酸殘基)的C-H鍵(胺基酸AA的α-碳)中奪取氫原子。抽提導致形成二苯酮羰基游離基(ketyl radical)和胺基酸游離基。然後，二苯酮羰基游離基和胺基酸游離基可以重新結合形成共價鍵，將二苯酮與胺基酸殘基交聯。

第4D圖顯示使用光反應性探針和本文描述的系統對樣本進行選擇性光化學標記以標記選定ROI中的生物分子。在選擇性光化學標記之前，含有感興趣的生物分子310(本文將使用蛋白質作為實施例，但可以替代地分析其他生物分子)(例如，細胞或組織樣本)和關注區域(或更多) )的樣本被識別。樣本可以進行預處理，例如固定和染色。例如，可以將樣本固定並用細胞染色劑(例如，蘇木精和伊紅(H&E)；馬森三色染色劑(Masson's trichrome stain))染色，以識別感興趣的生物分子310的免疫螢光標記抗體或透過其他方法來鑑定。

如第4D圖所示，用多個光反應性探針312處理基底309上的樣本，並且圖案光( patterned light，PLT)選擇性地照光使用者定義的關注區域(灰色區域)中的樣本，以便活化光反應性探針312以形成活化的光反應性探針312’(即光敏化(photoactivated)探針或光活化(light activated)探針)。活化的光反應性探針312’(由虛線圓圈所示)能夠透過第4C圖所述的光交聯機制與任何胺基酸殘基形成複合物。活化的光反應性探針312’可以擴散，因此不僅可以標記感興趣的生物分子310附近的鄰近分子311，還可以標記更遠的生物分子331。由活化的光反應性探針312'標記的區域或標記精準度可以覆蓋約250-1000 nm的區域。綜上所述，可根據感興趣的生物分子310原位( in situ)確定關注區域。圖案化光提供光能以活化光反應性探針312，使得經活化的光反應性探針312’可以與整個關注區域內的不同蛋白質的多個胺基酸非特異性交聯。

標記後，用洗滌液洗去未反應的探針312(即未結合的探針)，並且可以透過攜帶報告基團例如辣根過氧化物酶(HRP)或螢光標記的抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白，來檢測經活化的光反應性探針312’標記的生物分子。

第4E圖顯示在以下實施方式中使用的兩種光反應性探針的實際化學結構。一種是含生物素的探針(生物素-二苯酮，BBzP，如B3-BzP)(上排)，另一種是含去硫生物素的探針(去硫生物素-二苯酮，DBBzP，如DB3-BzP)(下排)。

本文所述的光選擇性標註和標記可以在各種類型的樣本中進行，例如從組織、細胞或顆粒獲得的樣本，例如獲自實體(例如，人類個體、小鼠個體、大鼠個體、昆蟲個體、植物、真菌、微生物、病毒)的樣本，或並非來自生物體的組織樣本或細胞樣本，例如細胞培養物樣本或人造組織支架樣本(例如培養的實驗室細胞、體外發育的心臟組織、3D列印組織等)。使用本文所述的探針、材料和方法進行分析的樣本可以是活的(活細胞)或可以是非活的(例如，經固定的)。用於標註和標記的樣本可包括單層樣本、多層樣本、固定至基底(例如顯微鏡載玻片)的樣本、未固定至基底的樣本、細胞懸浮液或萃取物，例如作為體外細胞提取物、重組細胞萃取物或合成萃取物。在一些實施方式中，樣本未經固定(未固定)。在一些實施方式中，樣本是經固定的。例如，細胞或組織樣本可以用例如乙酸、丙酮、甲醛(4%)、福馬林(10%)、甲醇、戊二醛或苦味酸固定。固定劑可以是相對強的固定劑並且可以交聯分子，或者可以是較弱的固定劑且不交聯分子。用於分析的細胞或組織樣本可以在分析之前冷凍，例如使用乾冰或快速冷凍。在分析之前，可以將細胞或組織樣本包埋在固體材料或半固體材料中，例如石蠟或樹脂。在一些實施方式中，用於分析的細胞或組織樣本可以經固定然後包埋，例如福馬林固定石蠟包埋(FFPE)。

處理樣本的光反應性探針的濃度範圍為0.1 mM至10 mM。在一些實施方式中，用於活化光反應性探針或光選擇性標註和標記的光波長範圍約200 nm至約1600 nm。在一些實施方式中，在雙光子光源下，用於進行光選擇性標註和標記的光波長範圍為約680 nm至約1600 nm；或在單光子光源下範圍約300 nm至約650 nm(例如365 nm)。用於探針光活化的波長與用於成像的波長不同。在一些實施方式中，光反應性探針的活化中，於單光子活化利用約300至450 nm、550 nm或於多光子活化利用＞650nm的光輻射(光)。本揭露的一些實施方式中所使用的特定波長在雙光子光源下是780 nm。

方法

本文也公開了光選擇性標註和標記生物分子的方法以及分析方法。此方法可用於單獨或組合地標註和/或標記碳水化合物、脂質、核酸、蛋白質。此方法可包括用具有生物素或另一種生物素基部分和光反應性部分的光反應性探針處理生物樣本，以及使光反應性部分與生物樣本中的生物分子共價結合的步驟。

在一方面，本揭露提供了一種對樣本中的生物分子進行光標記的方法，包括以下步驟：將上述光反應性探針遞送至樣本；用光輻射選擇性地照光樣本的選擇關注區域，以活化選擇關注區域中的光反應性探針的光反應部分，以在選擇關注區域中的光反應性部分和樣本中的生物分子之間形成共價鍵。

如第2圖所示，ROI的照光是透過點掃描實現的。ROI光罩產生後影像處理的輸出是要照光的目標點XY座標陣列(2D陣列)，覆蓋使用者定義的關注區域。每個FOV的照光點數量可能會根據使用者的標準而變化。優選地，每個照光點的曝光時間在100-500 μs範圍內，以確保在合理的工作時間內實現足夠的光化學反應。

光化學反應的效率也與雷射功率強度有關。較高的功率強度可能會縮短工作時間(快速光化學反應)，但也可能損壞樣本。因此，在進行選擇性地照光的步驟時，功率強度的範圍為1 mW至600 mW。優選地，可以在顯微鏡下測量的最佳功率強度在10 mW至300 mW的範圍內。

另一方面，本揭露提供了一種影像引導光標記方法，包括以下步驟：(a)將光反應性探針遞送至樣本；(b)在第一視野中對樣本進行成像並利用成像光源和相機獲取樣本的第一視野中的至少一個影像；(c)處理至少一影像並測定第一視野中的關注區域；(d)取得關注區域的座標資訊；(e)根據座標訊息，選擇性地用光輻射照光關注區域，以活化光反應性探針的光反應部分，從而在關注區域中光反應性探針的光反應部分與樣本的不同蛋白質的多個胺基酸之間形成非特異性交聯；以及(f)在第一視野的關注區域被照光後，移動到樣本的第二視野，並重複步驟(b)至(e)，直到樣本的所有視野已被完全照光。

另一方面，本揭露提供一種探針標記蛋白的分析方法，包括以下步驟：取得樣本；將前述的光反應性探針傳送到樣本上，用光輻射選擇性地照光樣本的關注區域以活化關注區域中的光反應性探針的光反應部分，並且在關注區域中光反應部分與樣本的不同蛋白質的多個胺基酸之間形成非特異性交聯；透過光反應性探針的T部分與多個親和性磁珠之間的親和性沉澱，從樣本中分離多個探針標記的蛋白質。

以下透過實施例對本發明的實際應用進行說明。

實施例 1光活化胺基酸交聯可實現空間光誘導

為了在微觀照光點實現蛋白質的光誘導標記，樣本中添加了具有三種元素的分子：光催化、與蛋白質共價結合的光活化胺基酸接頭以及用於蛋白質下拉的探測標籤。 BBzP(第4E圖)作為以下實施例1-3的光反應性探針。二苯酮在照光點被激發成為1,2-雙自由基，與α-碳的C-H鍵反應，形成對應胺基酸的共價鍵。亦即，整個圖案光區域內的不同蛋白質的多個胺基酸可以被生物素化。

U-2OS細胞(HTB-96，ATCC，VA，美國)在補充10% FBS的Dulbecco改良Eagle培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)中於37°C、5% CO ₂濕潤環境中培養。將 2×10 ⁵個細胞接種於玻璃底室(80287，ibidi)中並培養約16小時至80-90%細胞滿度(confluency)。然後，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞，然後用2.4%多聚甲醛溶液(paraformaldehyde，PFA，15710，電子顯微鏡科學)或100%冰冷的甲醇固定。固定細胞以PBS/0.5% Triton X-100培養以透化(permeabilize)細胞膜，並以於PBS/0.1% Triton X-100 (PBS-T)中的3% BSA阻斷(block) 1小時，然後接著以0.002%鏈黴抗生物素蛋白阻斷30分鐘與40 μM生物素阻斷15分鐘。

測試不同的光敏劑、它們的濃度和照光強度以滿足光化學的速度和特異性需求。當使用780 nm飛秒雷射照射U-2OS細胞的整個FOV時，B3-BzP具有最佳標記效率，如Dy488-中性抗生物素蛋白成像所示。後焦平面處具有不同濃度BBzP(100 μM、250 μM)的 150 mW、200 mW雷射功率足以進行標記。如第5圖所示，非特異性標記背景較低，顯示BBzP是優化標記效率和空間特異性的良好選擇。

實施例2透過BBzP對細胞和組織樣本實現亞細胞空間生物素化

為了促進亞細胞蛋白質分離，標記分辨率應為亞微米水平。對U-2OS細胞進行線掃描照光，並使用超解析度結構照光顯微鏡(SR-SIM)藉由B3-BzP和抗生物素染色來測量生物素化標記寬度(第6A圖)。使用40倍放大倍率/0.95 NA物鏡時，標記解析度能夠達到0.39 μm (第6B圖)。為了證明其在細胞樣本中的廣泛用途，我們對五個亞細胞部位的蛋白質進行了光標記，包括細胞核、核仁、核孔複合體、壓力顆粒(stress granules)和高基氏體。使用傳統影像處理根據每個結構的特徵進行影像分割。照射分割區域以誘導標靶生物素化。原位生物素化區域與橫向(xy)和軸向(z)方向上的相應亞細胞結構匹配良好，顯示具有高空間標記特異性(第6C圖)。

此外，在抗CD3塗覆的玻璃表面上的擴散測定(spreading assay)中，應用深度學習來分割F-肌動蛋白環內的區域。擴散測定如下：玻璃室塗有聚-D-賴胺酸，用PBS洗滌，並與10 mg/mL抗CD3(317301，BioLegend)和10 mg/mL抗CD28(302933，BioLegend) 抗體一起培養在PBS中於4°C過夜。用PBS-T洗滌細胞以去除過量的抗體。將Jurkat T細胞(克隆E6-1、TIB-152、ATCC)滴在玻璃室中並在37°C下培養。培養15分鐘後，以4% PFA固定細胞並以指定抗體染色。免疫突觸誘導進行如下：Raji B細胞(CCL-86，ATCC)用作抗原呈現細胞(APC)。為了活化APC形成免疫突觸(immune synapse，IS)，將1×10 ⁶Raji B細胞沉澱，以含有0.1 μg葡萄球菌腸毒素(ET404，Toxin Technology Inc)的100 μL無血清RPMI (SH30027，HyClone)重新懸浮，並在37°C下培養1小時。在培養的最後20分鐘，Raji B細胞以20 μM細胞追蹤劑紅色CMTPX染料(C34552，Invitrogen)染色。然後用PBS洗滌細胞兩次以去除多餘的染料。將6.5×10 ⁵B細胞以500 μL無血清RPMI重新懸浮，並接種在聚D-賴胺酸(P7280，Sigma-Aldrich)包覆的玻璃室(80287，同上)的各個孔中20分鐘。將等量的Jurkat T 細胞(克隆E6-1、TIB-152、ATCC)以250 μL無血清RPMI重新懸浮，然後滴加到B細胞。37°C 培養10分鐘後，T-B細胞接合物(conjugate)用2% PFA溶液固定10分鐘，然後在-20°C下用100%冰冷甲醇固定5分鐘。為了使免疫突觸(IS)可觀察，對CD3 (317301，BioLegend)進行免疫螢光染色，並結合Alexa Fluor™ 647-IgG (A-21235，Invitrogen)作為二抗，進行後續的光標記實驗。

如第6D圖所示，玻璃內焦點水平處的分段照光允許在接觸表面的薄層處進行光標記，從而允許免疫突觸的超分子活化複合物(supramolecular activating complexes，SMAC)處的蛋白質的特異性生物素化。基於深度學習的分割和標靶照光也應用於Jurkat T -Raji B細胞的接合物，在薄免疫突觸處對蛋白質進行精確的生物素化(第6E圖)，說明了多色成像的光標記能力。

進一步檢驗了光標記在組織樣本上的適用性。C57BL/B6小鼠以0.9% NaCl灌注以去除血液，然後更換4% PFA溶液以固定組織樣本。小鼠大腦按照FFPE蠟塊程序製備，包括固定、脫水和石蠟包埋。FFPE切片以10 µm切片，然後脫蠟和再水化。浦金氏細胞(Purkinje cells)以抗鈣結合蛋白-D28K 一抗(C9848，SigmaAldrich)在4°C染色過夜，接著以二抗AlexaFluor-555 (A32727，Invitrogen)染色。

如第6F圖所示，FFPE小鼠腦組織切片的鈣結合蛋白(Calbindin)-D28K染色揭露小腦中高豐富度的浦金氏細胞，具有清晰的軸突和樹突結構以及獨特的神經元細胞體層。採用深度學習的分割和隨後的定向照光達成細胞體內生物素化，證明了FFPE 組織樣本的光標記特異性。

實施例 3光蛋白質體學藉由BBzP實現高靈敏度和特異性的亞細胞空間蛋白質體學

為了檢查超大通量空間生物素化是否可以分離出足夠的蛋白質用於蛋白質組研究，首先測試了核蛋白質的靶向光標記和下拉，作為原理證明。亞細胞結構的光標記進行如下：將細胞與含有0.1-2.0 mM BBzP的光子標記試劑一起培養。使用與顯微系統耦合的雙光子雷射在100-200 mW的雷射功率下進行光標記，並對細胞進行100-1000 μs的影像引導雷射曝光時間。螢光顯微鏡雙光子標記的性能驗證如下：標記的細胞用PBS-T洗滌3次。標記的細胞/訊號以中性抗生物素蛋白-DyLight 488 (22832，Invitrogen)在3% BSA/PBS/0.1% Triton X-100中室溫染色1小時。接著以核標記物(Hoechst 33258、62249、Thermo Fisher Scientific)在室溫下染色細胞30分鐘。使用蔡司(Zeiss) LSM 880共軛焦顯微鏡驗證標記訊號。

光標記後，刮取(scrape)、收集(harvest)並裂解細胞以提取蛋白質。蛋白質萃取和珠上降解進行如下：用含有10 mM Tris (pH 8.0)、1% Triton X-100、1 倍蛋白酶抑制劑混合物、10 mM抗壞血酸鈉、5 mM Trolox 和1 mM疊氮化鈉的緩衝液刮取收集標記細胞。使用Q125 超音波儀(Qsonica)以1秒開/2 秒關間隔60%功率對收集的細胞進行超音波處理2分鐘，然後藉由SpeedVac系統蒸發刮取緩衝液2小時。將160 μL含有4%十二烷基硫酸鈉(SDS)、1% Triton X-100、10 mM Tris (pH 8.0)和二硫蘇糖醇(DTT)的裂解緩衝液加入收穫的細胞中，並將混合物渦旋(vortex) 1分鐘開/2分鐘關間隔5個週期。為了恢復PFA固定產生的交聯醯胺基團，將裂解的細胞在99°C下進一步加熱45分鐘，然後以1分鐘開/2分鐘關間隔進行另一個渦旋，持續5個循環。將裂解物在20°C、16,000 g下離心20分鐘，並收集上清液。使用Pierce™ 660nm Protein Assay測定蛋白濃度，並對240 μg蛋白進行免疫沉澱。鏈黴抗生物素蛋白磁珠以稀釋緩衝液(0.5% Triton X-100/PBS)洗滌3次，將蛋白裂解液稀釋10倍，使SDS濃度降至0.4%以下，將稀釋後的裂解液加入洗滌珠子並在2-8°C下旋轉培養16小時。之後，用以下洗滌緩衝液洗滌生物素化蛋白結合的珠子，以最大程度地減少非特異性結合：緩衝液A (2%SDS，50mM Tris，pH 8.0)；緩衝液 B (0.5M NaCl、0.1% 去氧膽酸、0.1% SDS、1% Triton X-100、50 mM HEPES)；緩衝液 C (0.5% 去氧膽酸、0.5% Triton X-100、10 mM Tris、250 mM LiCl，pH 8.0)。對於珠上降解，用100 μL 50 mM TEABC 進一步洗滌珠子3次，然後將生物素-蛋白質結合珠子與0.2 μg胰蛋白酶/Lys-C (V5071，Promega)混合，最終體積為20 μL，37°C 100分鐘進行初始降解。之後，收集上清液並進行過夜降解而不添加進一步的酵素。最後，透過添加2 μL 10%甲酸對降解物進行酸化，並透過C18 Ziptip 去鹽。在LC-MS/MS分析之前，去鹽的胜肽會透過Speedvac乾燥並儲存在-20°C下。

LC-MS/MS分析如下進行：藉由資料依賴性擷取質譜法檢測免疫沉澱產物。使用與 Orbitrap Fusion Lumos 質譜儀 (Thermo Fisher Scientific)耦合的UltiMate 3000 RSLCnano系統 (Thermo Fisher Scientific)進行LC-MS/MS分析。將去鹽的胜肽重新懸浮在0.1%甲酸水溶液中，然後上樣到PepMap™ 100 C18 HPLC管柱 (2 µm，100 angstrom，75 µm × 25 cm；Thermo Fisher Scientiﬁc)。對於核照光樣本，胜肽經過160分鐘梯度洗脫；對於核仁、SG照光樣本，胜肽經過120 分鐘梯度洗脫。在Orbitrap 中以120,000 的分辨率、4×10 ⁵的AGC目標值和50 ms的最大進樣時間獲得 m/z375–1500範圍內的完整MS質譜圖。使用數據依賴方法(data-dependent method)在Orbitrap中以最高速度模式於30,000的分辨率記錄片段離子光譜。對於具有2+、3+、4-7電荷態的離子，四極桿分別使用1.2、0.7、0.4 Th的隔離窗口選擇單一同位素前驅離子。均採用5×10 ⁴的AGC目標、54 ms的最大注射時間、30%碰撞能量的高能量碰撞解離(higher-energy collisional dissociation，HCD)片段以及3 s的最大循環時間。動態排除設定為60秒，排除視窗為10 ppm。電荷狀態為未指定、1+或高於8+的前驅離子被排除在片段選擇之外。

鏈黴抗生物素蛋白斑點印跡分析進行如下：裂解光標記的U-2OS細胞和對照U-2OS細胞，並如上所述用鏈黴親和素珠進行免疫沉澱。在PVDF膜上進行斑點印跡分析。PVDF膜以100% MEOH活化，並在PBS-T中浸泡2分鐘，然後將每個樣本8 μL點在膜上。乾燥後，用PBS-T沖洗膜(印跡)，並用5% BSA在室溫下阻斷30分鐘，然後用PBS-T洗滌。然後將膜與含5% BSA的鏈黴抗生物素蛋白-HRP (1:1000)在翹板震盪器上於4°C培養過夜。在使用iBright FL1500影像系統(Invitrogen)以ECL受質(Bio-Rad)顯色之前，先用PBS-T洗滌印跡。用氫氧化鈉在60°C下清除(stripped)印跡5分鐘3次，用2.5% BSA阻斷，並用小鼠抗微管蛋白1:500 (GTX112141，GeneTex)在2.5% BSA中於4°C下於翹板震盪器上過夜再檢測(re-probed)，並以PBS-T洗滌。然後將印跡與抗小鼠HRP (1:500)在2.5% BSA中室溫培養2小時。在使用iBright FL1500以ECL 受質(Bio-Rad)顯色之前，先用PBS-T洗滌印跡。

如第7A圖所示，使用鏈黴親和素珠藉由免疫沉澱富集BBzP的生物素化蛋白質，在珠上進行胰蛋白酶降解，並進行LC-MS/MS測量。斑點印跡分析顯示，當打開光標記時，BBzP生物素化的蛋白質在蛋白質裂解物或鏈黴親和素珠下拉中被富集(第7B圖)，證明樣本的有效光生物素化。計算PL與對照(CTL)中定量的總體蛋白質豐富度的分佈(第7C圖)。藉由計算最終蛋白質清單中真陽性蛋白質的百分比來確定空間標記核蛋白質組的敏感性和特異性。共有1,150個蛋白出現差別富集，其中1,032個被註釋為核蛋白，佔真陽性率的90%。

以高靈敏度鑑定低豐富度蛋白質的能力對於新生物標記的發現是重要的。蛋白質鑑定和無標記定量進行如下：來自同一批雙光子照光的原始數據與Proteome Discoverer (Thermo Fisher Scientific)一起藉由Sequest HT演算法針對UniProtKB/Swiss-Prot人類蛋白質資料庫(版本2020.02，20,365條)進行處理，以用於特徵萃取、肽段辨識和蛋白質推論。資料庫搜尋執行如下：最多有3個缺失裂解的胰蛋白酶胜肽；肽離子的質量容許偏差為10 ppm，片段離子的質量容許偏差為 0.05 Da； Cys殘基上的靜態脲甲基化(static carbamidomethylation) (+57.0215 Da)；Asp和Gln殘基上的動態去醯胺(+0.9840 Da)、Met殘基上的氧化(15.9949 Da)、蛋白質N端的乙醯化(+42.0106 Da)。最小胜肽長度設定為6個殘基。胜肽和蛋白質的錯誤發現率(false discovery rate，FDR)均設定為1%。對於無標記定量，層析峰對齊的時間視窗設定為20分鐘。然後將肽水平數據標準化為總肽強度，並且給定蛋白質的量化值源自屬於該蛋白質的前三個強度獨特肽的標準化強度之總和導出。進行無標記定量(Label-free quantification，LFQ)以從背景訊號中提取富集的蛋白質組。鏈黴親和素珠富集並經質譜法鑑定後，透過比較其峰強度來分析對照組和實驗組的蛋白質 ID。真陽性和假陽性蛋白質的分佈在log ₂(PL/Control)軸上分開，並透過應用log ₂(PL/Control)的閥值給出PL標記的蛋白質ID。

如第7D圖所示，超過10%的核蛋白被鑑定為每個細胞少於10,000個拷貝數的低豐富度蛋白，說明光蛋白質體學鑑定低豐富度蛋白的能力。

藉由採用差別富集的蛋白質作為種子蛋白質來揭示蛋白質複合物，進一步檢查蛋白質複合物發現和進行CORUM複合物分析的能力。功能註釋如下：GO (Gene Ontology，基因本體論)術語關聯從Uniprot取得，且蛋白質複合物資料從CORUM下載。使用Benjamini-Hochberg多重檢定校正的Fisher精確檢定(Fisher’s exact test)來識別過度代表(over-represented)的GO術語和蛋白質複合物。由GO註釋並由CORUM篩選的蛋白質被用作GO和蛋白質複合物富集分析的背景集。使用124個過度代表(富集)的蛋白質對壓力顆粒蛋白質網絡進行STRING分析，以了解功能和物理相互作用的關聯，如可視化網絡圖中所示。

如第7E圖所示，過度代表的蛋白質複合物位於我們的核靶向區域內，例如剪接體、組蛋白複合物和RNA聚合酶複合物，這表明光蛋白質組學不僅提供了真正的陽性蛋白質，而且還提供了空間相關蛋白質複合物。

實施例 4去硫生物素-二苯酮(DBBzP)的探針合成

根據第8圖所示的合成方式合成去硫生物素-PEG3-二苯酮(DB3-BzP)的探針。所示的合成方式作為範例，並不用於限制目的。

實施例 5DBBzP 對細胞亞細胞結構的光化學標記

在補充10% FBS的Dulbecco改良Eagle培養基中於37°C、5% CO ₂濕潤環境中培養細胞。將2×10 ⁵個細胞接種於玻璃底室中，且培養約16小時至80-90%細胞滿度。然後，用PBS洗滌細胞並用2.4% 多聚甲醛(PFA)固定。固定細胞以PBS/0.5% Triton X-100 培養以透化細胞膜，然後以PBS/0.1% Triton X-100 中的3% BSA阻斷1小時，然後以0.002% 鏈黴抗生物素蛋白阻斷30分鐘且以40 μM生物素阻斷15分鐘。將細胞與含有0.5-2.0 mM DB3-BzP的標記試劑一起培養。與雙光子雷射耦合的顯微系統用於空間分辨光標記。將細胞置於100-1000微秒、功率為50-400 mW的雷射曝光時間下，以活化二苯酮基團，使其轉化為活性雙自由基，與選擇關注區域的胺基酸中的α-碳形成共價鍵。標記後，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)徹底洗滌細胞3次，以去除殘留的標記試劑。

品質控制如下：藉由於補充3% BSA的0.1% PEST中的500倍稀釋中性抗生物素蛋白-488 (488nm螢光染料接合的中性抗生物素蛋白，N488)在翹板震盪器室溫下染色細胞，來觀察和評估標記(去硫生物素化)效率和標記試劑殘留。使用信噪比(signal-to-noise ratio)作為品質控管程序：其中N488強度是螢光顯微鏡下N488通道的平均強度；ROI，關注區域；空白(blank)，無細胞區域N488通道的平均強度。

如第9圖所示，U-2OS細胞的核仁藉由B3-BzP(左)和DB3-BzP(右)標記並藉由螢光顯微鏡成像，信噪比分別為5.8和17.8。

光化學有兩個主要挑戰：標記效率和空間標記特異性。如果執行每個點一秒的照光，那麼一千萬個點需要一千萬秒的時間，或者大約需要四個月的連續照光，這對於實驗來說是完全不切實際的。因此，應優化光化學標記效率，以達到預期每個照光點100-1000 μs。空間標記特異性也很重要，因為ROI可能只佔據整個生物樣本空間的1/10,000甚至更小的體積。在非照光區域的小機率非特異性結合將導致大量不必要的蛋白質的收集，從而遮蔽了ROI處所需蛋白質的累積拷貝數。總之，我們提供適合在影像引導系統中使用的光反應性探針。光反應性探針具有較高的光標記效率。根據照光點的數量，使用40倍物鏡對2 cm×2 cm樣本孔進行光標記蛋白質的總時間為3至16小時。需要一到十個樣本孔來收集足夠的蛋白質進行質譜分析。此外，當使用BBzP和DBBzP時，非特異性標記背景均較低，顯示兩種光反應性探針具有較好的標記效率和空間特異性。

雖然本文中可以使用術語「第一」、「第二」、「第三」和「第四」來描述各種特徵/元件(包括步驟)，但這些特徵/元件不應受這些術語限制，除非上下文另有說明。這些術語可用於將一個特徵/元素與另一個特徵/元素區分開。因此，在不脫離本發明的教導的情況下，下面討論的第一特徵/元件可以被稱為第二特徵/元件，並且類似地，下面討論的第二特徵/元件可以被稱為第一特徵/元件。

40:胺基酸 41:羧基 42:胺基 43:R基 101:細胞 102:FOV 103:關注區域 104:光罩 110:顯微鏡 111:DM1 112:DM2 113:掃描透鏡 114:管透鏡 115:物鏡/Obj 116:完美對焦系統/PFS 117:發射濾鏡 118:載物台 120:相機/CAM 130:LED 140:照光光源/ILS 150:聲光調變器/AMO 160:檢流計掃描振鏡 162:振鏡X 164:振鏡Y 170:處理器/PRO 202:顯微鏡系統 204:窄帶光 206:基板 208:細胞 208a:細胞 212:胞器 214:大區域 216:細胞核 218:關注區域 309:基底 310:感興趣生物分子 311:鄰近的生物分子 312:光反應性探針 312’:活化的光反應性探針 331:更遠的生物分子 AA:胺基酸 BBzP:生物素-二苯酮 Ctrl:對照組 LF:無標記 LP:標記蛋白 PL:光標記 PLT:圖案光 STB:鏈黴親和素珠

透過參考以下闡述說明性實施例的詳細描述以及附圖，將獲得對本文所描述的方法和裝置之特徵和優點的更好理解，其中：第1圖是根據本揭露的一些實施方式的光蛋白質體學工作流程的示意性概述。(1)視野(field of view，FOV)的落射螢光顯微鏡(epifluorescence microscopy)成像。(2)ROI的即時光罩(mask)產生。(3)對選定的ROI進行光化學標記照光。(4)移動到下一個FOV。(5)自動聚焦下一個落射螢光影像。(6)對整個樣本的每個FOV重複步驟1-5。第2圖顯示根據本揭露的一些實施方式的影像引導雙光子標記顯微鏡系統的光學設定和控制系統。調變飛秒雷射(780nm，140fs脈衝)從檢流計系統(振鏡(galvo) X，振鏡Y)反射並透過物鏡掃描到樣本上。掃描圖案(光罩)可以基於選定的光罩生成器即時生成，以自動對每個視野中感興趣的目標進行光標記。開發一種具有使用者介面的一體化軟體來執行快速的高通量(fast high-content)處理。LED表示發光二極體(light-emitting diode)；CAM表示相機(camera)；ILS表示照光光源(illuminating light source)；AOM表示聲光調變器(acousto-optic modulator)；PFS表示完美對焦系統(perfect focus system)；Obj表示物鏡(objective)；PRO表示處理器(processor)。第3圖顯示根據本揭露的一些實施方式的可用於基板上的細胞的光選擇性空間標註(tagging)和鄰近標記(labeling)的系統的示意圖。第4A圖顯示根據本揭露的一些實施方式的光反應性探針的一例的兩種化學結構。第4B圖顯示根據本揭露的一些實施方式的光反應性探針的另一例。第4C圖顯示根據本揭露的一些實施方式的光反應性探針和胺基酸(amino acid，AA)的α-碳(Cα)之間的照光(illumination，IL)反應的示意圖。第4D圖示意性地顯示根據本揭露的一些實施方式的使用本文所述的光反應性探針的選擇性光化學標記。第4E圖分別顯示根據本揭露的一些實施方式的生物素-PEG3-二苯酮(biotin-PEG3-benzophenone，B3-BzP，上排)和去硫生物素-PEG3-二苯酮(desthiobiotin-PEG3-benzophenone，DB3-BzP，下排)的兩種探針。第5圖顯示根據本揭露的一些實施方式藉由標記功率和B3-BzP濃度顯著提高生物素標記效率。第6A圖顯示根據本揭露的一些實施方式藉由光蛋白質體學將薄「十字」圖案光標記(λex = 780 nm)到多聚甲醛(paraformaldehyd，PFA)固定的U-2OS細胞中，並且生物素標記區域用B3-BzP和抗生物素(中性抗生物素蛋白(neutravidin)-488螢光：綠色)染色。比例尺：10 μm。第6B圖顯示根據本揭露的一些實施方式藉由超解析度結構化照光顯微鏡(super-resolution structured illumination microscopy，SR-SIM)使用40倍放大率/0.95數值孔徑(numerical aperture，NA)物鏡進行的光標記解析度的測量。第6C圖顯示根據本揭露的一些實施方式的光標記亞細胞區室的俯視圖(xy)和側視圖(z)的共軛焦影像，ROIs以Alexa flor 568二抗染色，光標記訊號以抗生物素(中性抗生物素蛋白-488螢光：綠色)染色。NCL表示核仁素(nucleolin)，NPC表示核孔複合體(nuclear pore complex)，GM130表示高基氏體基質蛋白130 (Golgi matrix protein 130)，G3BP1表示GAP SH3結構域結合蛋白1 (GAP SH3 domain-binding protein 1)。比例尺：10 μm。第6D圖顯示根據本揭露的一些實施方式的擴散測定中每個標記突觸(編號：1至4)的俯視圖和側視圖，顯示精確的光標記。光標記區域的側視圖與CD3共定位，CD3是細胞底部免疫突觸的眾所周知的標記。在非光標記細胞中未發現生物素訊號(編號：5)。比例尺：10 μm。第6E圖顯示根據本揭露的一些實施方式的Jurkat T細胞和Raji B細胞的免疫突觸的光標記區域，以綠色(中性抗生物素蛋白-488)顯示，作為精確且薄的標記層。比例尺：10 μm。第6F圖顯示根據本揭露的一些實施方式的福馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed and paraffin-embedded，FFPE)小鼠腦組織切片上的光標記。選擇浦金氏纖維(Purkinje fibers)的細胞體，以生物素(綠色：中性抗生物素蛋白-488)進行光標記。比例尺：10 μm。第7A圖顯示根據本揭露的一些實施方式的用於蛋白質體分析(proteomic profiling)的光蛋白質體學方法的概述。將細胞接種在玻璃室上並透過光蛋白質組學系統進行光標記。然後，在LC-MS/MS測量之前，裂解光標記(photolabeled，PL)細胞，用鏈黴親和素珠(STB)富集(enriched)並用胰蛋白酶降解(digestion)。PL表示光標記，Ctrl表示對照組(control)，LP表示標記蛋白(labeled protein)，STB表示鏈黴親和素珠(streptavidin bead)，LF表示無標記(label-free)。第7B圖顯示根據本揭露的一些實施方式的鏈黴親和素-辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)檢測的斑點印跡測定。在光標記(開)細胞中觀察到生物素訊號，但在對照細胞(關)中觀察不到生物素訊號。SA-珠子是指鏈黴親和素珠。第7C圖顯示根據本揭露的一些實施方式的B3-BzP (深灰色)的三個生物複製的真陽性蛋白質分佈。未註釋為核蛋白的蛋白質顯示為淺灰色。第7D圖顯示根據本揭露的一些實施方式的蛋白質拷貝數的分佈(每個細胞＜10,000個拷貝數：B3-BzP)。第7E圖顯示根據本揭露的一些實施方式藉由B3-BzP對蛋白質複合物進行的CORUM分析。第8圖顯示根據本揭露的一些實施方式的光反應性探針DB3-BzP的一例的示意性合成路線。第9圖顯示根據本揭露的一些實施方式分別使用DB3-BzP(右側)和B3-BzP(左側)探針進行選擇性光化學標記的結果。

101:細胞

102:FOV

103:關注區域

104:光罩

Claims

一種光化學標記的方法，包含：將一光反應性探針遞送至一樣本，其中以式(I)表示之該光反應性探針： T─L─W (I)，其中該T部分為生物素，或另一個生物素基部分；該L部分為一化學鍵或一連接子；以及該W部分為一光反應性部分，其中該光反應性部分可吸收UV且經活化以與一胺基酸交聯；在一選擇關注區域藉由光輻射選擇性地照光該樣本以活化該光反應性探針的該光反應性部分；以及在該選擇關注區域中，形成該探針的該光反應性部分與該樣本不同的複數蛋白質的複數胺基酸之間的一非特異性交聯。
如請求項1所述之方法，其中遞送至該樣本的該光反應性探針具有0.1 mM至10 mM的一濃度。
如請求項1所述之方法，其中該關注區域包含複數照光點，且在該選擇性地照光的步驟中各該照光點的該曝光時間為10 μs至5000 μs的一範圍。
如請求項1所述之方法，其中該選擇性地照光的步驟包含以具有1 mW 至600 mW的一功率強度的光照光。
如請求項1所述之方法，其中該樣本包含固定細胞、固定組織、細胞萃取物、或組織萃取物。
如請求項1所述之方法，其中在與該蛋白質交聯之前，該光反應性部分在該光輻射活化後轉化為一自由基部分。
如請求項1所述之方法，其中該光反應性部分係選自於由二苯酮、疊氮苯、苯基二氮環丙烯、四氟苯基疊氮化物、羥苯基疊氮化物、及三氟甲基苯基二氮丙啶所組成之群組的一種。
如請求項1所述之方法，其中該光反應性部分藉由單光子激發或雙光子激發活化。
如請求項1所述之方法，其中該光反應性部分藉由200 nm至1600 nm的一波長範圍的單光子激發活化。
如請求項1所述之方法，其中該光反應性部分藉由680 nm至1600 nm的一波長範圍的雙光子激發活化。
如請求項1所述之方法，其中以式(I-1)或(I-2)表示該光反應性探針： (I-1) (I-2)，其中R與R’各自獨立為氫、烷基、或氮保護基，n為1至20的一整數。
如請求項1所述之方法，其中該樣本固定於一顯微鏡載玻片。
如請求項1所述之方法，其中該非特異性交聯為形成該光反應性探針經活化的該光反應性部分與該蛋白質的一胺基酸的一α-碳之間的一共價鍵。
一種影像引導光標記的方法，包含： (a) 將一光反應性探針遞送至一樣本，其中該光反應性探針包含：一可檢測標籤部分為生物素，或另一個生物素基部分；以及一光反應性部分可吸收UV光且經活化以與一胺基酸交聯，其中該可檢測標籤部分藉由一連接子或一化學鍵與該光反應性部分偶合； (b) 以一成像光源與一相機在一第一視野中將該樣本成像且獲取在該第一視野中的該樣本的至少一影像； (c) 處理該至少一影像且測定在該第一視野中的一關注區域； (d) 獲得該關注區域的一座標訊息； (e) 根據該座標訊息，藉由光輻射選擇性地照光該關注區域以活化該光反應性探針的該光反應性部分，且藉以在該關注區域中，形成該光反應性探針的該光反應性部分與該樣本不同的複數蛋白質的複數胺基酸之間的一非特異性交聯；以及 (f) 該第一視野的該關注區域被照光之後，移動至該樣本的一第二視野，並重複該步驟(b)至(e)直到該樣本的所有視野被完全照光。
如請求項12所述之方法，其中該光反應性部分係選自於由二苯酮、疊氮苯、苯基二氮環丙烯、四氟苯基疊氮化物、羥苯基疊氮化物、及三氟甲基苯基二氮丙啶所組成之群組中的一種。
如請求項14所述之方法，其中以式(I-1)或(I-2)表示之該光反應性探針： (I-1) (I-2)，其中R與R’各自獨立為氫、烷基、或氮保護基，n為1至20的一整數。
一種分析探針標記蛋白質的方法，包含：獲取一樣本；將一光反應性探針遞送至該樣本，其中以式(I)表示之該光反應性探針： T─L─W (I)，其中該T部分為生物素或另一個生物素基部分；該L部分為一化學鍵或一連接子；以及該W部分為一光反應性部分其可吸收UV且經活化以與一胺基酸交聯；藉由光輻射選擇性地照光該樣本的一關注區域，以活化在該關注區域中該光反應性探針的該光反應性部分，並且在該關注區域中形成該光反應性部分與該樣本不同的複數蛋白質的複數胺基酸之間的一非特異性交聯；以及通過在該光反應性探針的該T部分與複數親和性磁珠之間的一親和性沉澱，以自該樣本分離經探針標記的該些蛋白質。
如請求項17所述之方法，其中在該分離的步驟之後，該方法更包含：使經分離的該些蛋白質進行質譜分析；以及鑑定該樣本中經分離的該些蛋白質。
如請求項17所述之方法，其中該在選擇性地照光的步驟之後，該方法更包含自該樣本移除未經結合的該些光反應性探針。
如請求項17所述之方法，其中該光反應性部分係選自於由二苯酮、疊氮苯、苯基二氮環丙烯、四氟苯基疊氮化物、羥苯基疊氮化物、及三氟甲基苯基二氮丙啶所組成之群組中的一種。
如請求項17所述之方法，其中以式(I-1)或(I-2)表示之該光反應性探針： (I-1) (I-2)，其中R與R’各自獨立為氫、烷基、或氮保護基，n為1至20的一整數。