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TW202448516A - 接合hsc特異性抗體的脂質奈米粒子及其用途 - Google Patents

接合hsc特異性抗體的脂質奈米粒子及其用途 Download PDF

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TW202448516A
TW202448516A TW113104286A TW113104286A TW202448516A TW 202448516 A TW202448516 A TW 202448516A TW 113104286 A TW113104286 A TW 113104286A TW 113104286 A TW113104286 A TW 113104286A TW 202448516 A TW202448516 A TW 202448516A
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TW
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lnp
amino acid
seq
peg
antibody
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TW113104286A
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克里斯托夫 博爾赫斯
奧斯汀 博施
達瑞爾 德拉蒙德
雅各 厚普
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美商健臻公司
美商泰德治療公司
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Abstract

提供了用於將核酸遞送至細胞（例如，HSC）的可電離陽離子脂質和脂質奈米粒子以及製備和使用此類脂質和靶向脂質奈米粒子的方法。

Description

接合HSC特異性抗體的脂質奈米粒子及其用途
[0001]本發明提供了用於將核酸遞送至造血幹細胞中的脂質奈米粒子、其製備和使用方法。
[0002]需要在造血幹細胞（HSC）中進行安全有效的體內靶基因編輯方法。
[0003]本文提供了一種用於將核酸靶向遞送至造血幹細胞（HSC）中的脂質奈米粒子（LNP），所述LNP包含：脂質-抗體接合物，所述脂質-抗體接合物包含式 (I) 的化合物：[脂質] - [任選的連接子] - [抗體]，其中所述抗體結合CD105和/或CD117；可電離陽離子脂質，所述可電離陽離子脂質包含：(i) 式 (II') 的化合物： (II’)， 或其鹽，其中：R 1、R 2和R 3各自獨立地是鍵或C 1-3伸烷基；R 1A、R 2A和R 3A各自獨立地是鍵或C 1-10伸烷基；R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2和R 3A3是各自獨立地是H、C 1-20烷基、C 1-20烯基、-(CH 2) 0-10C(O)OR a1或-(CH 2) 0-10OC(O)R a2；R a1和R a2各自獨立地是C 1-20烷基或C 1-20烯基； R 3B是 ；R 3B1是C 1-6伸烷基；並且R 3B2和R 3B3各自獨立地是H或任選地被一個或多個各自獨立地選自-OH和-O-(C 1-6烷基)的取代基取代的C 1-6烷基；或 (ii) 具有以下結構的化合物： ，或其鹽； 以及佈置於LNP中的一種或多種核酸。 [0004]在一些實施例中，所述式 (II’) 的化合物是式 (II) 的化合物： (II)， 或其鹽，其中：R 1、R 2和R 3各自獨立地是鍵或C 1-3伸烷基；R 1A、R 2A和R 3A各自獨立地是鍵或C 1-10伸烷基；R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2和R 3A3是各自獨立地是H、C 1-20烷基、C 1-20烯基、-(CH 2) 0-10C(O)OR a1或-(CH 2) 0-10OC(O)R a2；R a1和R a2各自獨立地是C 1-20烷基或C 1-20烯基； R 3B是 ；R 3B1是C 1-6伸烷基；並且R 3B2和R 3B3各自獨立地是H或C 1-6烷基。 [0005]在一些實施例中，所述LNP包含兩種含有式 (I) 的化合物的脂質-抗體接合物，其中第一脂質-抗體接合物和第二脂質-抗體接合物相同或不同。 [0006]在一些實施例中，結合CD105和/或CD117的LNP的抗體包含抗體重鏈可變區（VH）和抗體輕鏈可變區（VL）。在一些實施例中，所述抗體結合CD117，其中所述VH包含含有FTFSNYAMS（SEQ ID NO: 1）的胺基酸序列的CDR-H1、含有AISGSGGSTYYADSVKG（SEQ ID NO: 2）的胺基酸序列的CDR-H2以及含有AKGPPTYHTNYYYMDV（SEQ ID NO: 3）的胺基酸序列的CDR-H3，並且所述VL包含含有RASQGISSWLA（SEQ ID NO: 4）的胺基酸序列的CDR-L1、含有AASSLQS（SEQ ID NO: 5）的胺基酸序列的CDR-L2以及含有QQTNSFPYT（SEQ ID NO: 6）的胺基酸序列的CDR-L3。在一些實施例中，所述抗體結合CD117，其中所述VH包含含有FTFSDADMD（SEQ ID NO: 10）的胺基酸序列的CDR-H1、含有RTRNKAGSYTTEYAASVKG（SEQ ID NO: 11）的胺基酸序列的CDR-H2以及含有AREPKYWIDFDL（SEQ ID NO: 12）的胺基酸序列的CDR-H3，並且所述VL包含含有RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 13）的胺基酸序列的CDR-L1、含有AASSLQS（SEQ ID NO: 14）的胺基酸序列的CDR-L2以及含有QQSYIAPYT（SEQ ID NO: 15）的胺基酸序列的CDR-L3。在一些實施例中，所述抗體結合CD105，其中所述VH包含含有DAWMD（SEQ ID NO: 19）的胺基酸序列的CDR-H1、含有EIRSKASNHATYYAESVKG（SEQ ID NO: 20）的胺基酸序列的CDR-H2以及含有WRRFFDS（SEQ ID NO: 21）的胺基酸序列的CDR-H3，並且所述VL包含含有RASSSVSYMH（SEQ ID NO: 22）的胺基酸序列的CDR-L1、含有ATSNLAS（SEQ ID NO: 23）的胺基酸序列的CDR-L2以及含有QQWSSNPLT（SEQ ID NO: 24）的胺基酸序列的CDR-L3。 [0007]在一些實施例中，所述LNP的抗體結合CD117並且包含抗體重鏈可變區（VH）和抗體輕鏈可變區（VL），其中所述VH包含含有FTFSNYAMS（SEQ ID NO: 1）的胺基酸序列的CDR-H1、含有AISGSGGSTYYADSVKG（SEQ ID NO: 2）的胺基酸序列的CDR-H2以及含有AKGPPTYHTNYYYMDV（SEQ ID NO: 3）的胺基酸序列的CDR-H3，並且所述VL包含含有RASQGISSWLA（SEQ ID NO: 4）的胺基酸序列的CDR-L1、含有AASSLQS（SEQ ID NO: 5）的胺基酸序列的CDR-L2以及含有QQTNSFPYT（SEQ ID NO: 6）的胺基酸序列的CDR-L3。 [0008]在一些實施例中，所述LNP的抗體結合CD117並且包含抗體重鏈可變區（VH）和抗體輕鏈可變區（VL），其中所述VH包含含有FTFSDADMD（SEQ ID NO: 10）的胺基酸序列的CDR-H1、含有RTRNKAGSYTTEYAASVKG（SEQ ID NO: 11）的胺基酸序列的CDR-H2以及含有AREPKYWIDFDL（SEQ ID NO: 12）的胺基酸序列的CDR-H3，並且所述VL包含含有RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 13）的胺基酸序列的CDR-L1、含有AASSLQS（SEQ ID NO: 14）的胺基酸序列的CDR-L2以及含有QQSYIAPYT（SEQ ID NO: 15）的胺基酸序列的CDR-L3。 [0009]在一些實施例中，所述LNP的抗體結合CD105並且包含抗體重鏈可變區（VH）和抗體輕鏈可變區（VL），其中VH包含含有DAWMD（SEQ ID NO: 19）的胺基酸序列的CDR-H1、含有EIRSKASNHATYYAESVKG（SEQ ID NO: 20）的胺基酸序列的CDR-H2以及含有WRRFFDS（SEQ ID NO: 21）的胺基酸序列的CDR-H3，並且VL包含含有RASSSVSYMH（SEQ ID NO: 22）的胺基酸序列的CDR-L1、含有ATSNLAS（SEQ ID NO: 23）的胺基酸序列的CDR-L2以及含有QQWSSNPLT（SEQ ID NO: 24）的胺基酸序列的CDR-L3。 [0010]在一些實施例中，所述LNP的抗體包含抗體重鏈可變區（VH）和抗體輕鏈可變區（VL），其中所述抗體結合CD117，並且其中所述VH包含SEQ ID NO: 7的胺基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO: 8的胺基酸序列。在一些實施例中，所述抗體包含抗體重鏈可變區（VH）和抗體輕鏈可變區（VL），其中所述抗體結合CD117，並且其中所述VH包含SEQ ID NO: 16的胺基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO: 17的胺基酸序列。在一些實施例中，所述抗體包含抗體重鏈可變區（VH）和抗體輕鏈可變區（VL），其中所述抗體結合CD105，並且其中所述VH包含SEQ ID NO: 25的胺基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO: 26的胺基酸序列。 [0011]在一些實施例中，所述LNP的抗體結合CD117並且包含抗體重鏈可變區（VH）和抗體輕鏈可變區（VL），其中所述VH包含SEQ ID NO: 7的胺基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO: 8的胺基酸序列。 [0012]在一些實施例中，所述LNP的抗體結合CD117並且包含抗體重鏈可變區（VH）和抗體輕鏈可變區（VL），其中所述VH包含SEQ ID NO: 16的胺基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO: 17的胺基酸序列。 [0013]在一些實施例中，所述LNP的抗體結合CD105並且包含抗體重鏈可變區（VH）和抗體輕鏈可變區（VL），其中所述VH包含SEQ ID NO: 25的胺基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO: 26的胺基酸序列。 [0014]在一些實施例中，結合CD105和/或CD117的LNP的抗體包含Fab、F(ab')2、Fab'-SH、Fv、scFv片段或免疫球蛋白單可變結構域。在一些實施例中，所述抗體包含Fab。在一些實施例中，所述抗體包含Fc結構域。 [0015]在一些實施例中，所述抗體包含含有重鏈結構域和輕鏈結構域的Fab。在一些實施例中，Fab的重鏈和輕鏈結構域包含SEQ ID NO: 9和38所示的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 9和38所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%序列同一性。在一些實施例中，Fab的重鏈和輕鏈結構域包含SEQ ID NO: 18和39所示的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 18和39所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%序列同一性。在一些實施例中，Fab的重鏈和輕鏈結構域包含SEQ ID NO: 27和40所示的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 27和40所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%序列同一性。 [0016]在一些實施例中，所述Fab在C末端缺乏天然鏈間二硫鍵。在一些實施例中，所述Fab被工程化以用非半胱胺酸胺基酸替換天然恒定輕鏈和天然恒定重鏈上的形成天然鏈間二硫鍵的一個或兩個半胱胺酸，從而去除所述Fab中的天然鏈間二硫鍵。在一些實施例中，所述Fab包含含有C233S取代的重鏈片段和含有C214S取代的輕鏈片段，根據Kabat編號。 [0017]在一些實施例中，所述Fab具有非天然鏈間二硫鍵。在一些實施例中，所述Fab具有工程化的包埋的鏈間二硫鍵。 [0018]在一些實施例中，所述Fab在所述重鏈片段中包含F174C取代，並且在所述輕鏈片段中包含S176C取代，根據Kabat編號。在一些實施例中，所述Fab在所述重鏈或輕鏈片段的C末端包含半胱胺酸。在一些實施例中，所述Fab還包含在所述Fab的重鏈片段與所述C末端半胱胺酸之間的一個或多個胺基酸。 [0019]在一些實施例中，所述抗體包含免疫球蛋白單可變（ISV）結構域。在一些實施例中，所述ISV結構域是Nanobody® ISV結構域。在一些實施例中，所述免疫球蛋白單可變結構域在C末端包含半胱胺酸。 [0020]在一些實施例中，所述抗體包含兩個或更多個VHH結構域。 [0021]在一些實施例中，所述免疫球蛋白單可變結構域包含VHH結構域，並且還包含間隔子，其包含在所述VHH結構域與所述C末端半胱胺酸之間的一個或多個胺基酸。在一些實施例中，所述兩個或更多個VHH結構域通過胺基酸間隔子連接。在一些實施例中，所述抗體包含與抗體CH1結構域連接的第一VHH結構域和與抗體輕鏈恒定結構域連接的第二VHH結構域。 [0022]在一些實施例中，所述抗體CH1結構域和所述抗體輕鏈恒定結構域通過一個或多個二硫鍵連接。在一些實施例中，所述CH1結構域包含F174C和C233S取代，並且所述輕鏈恒定結構域包含S176C和C214S取代，根據Kabat編號。 [0023]在一些實施例中，所述抗體包含具有AAA的胺基酸序列或具有SEQ ID NO: 45-60中任一個所示的胺基酸序列的胺基酸間隔子或連接子。 [0024]在一些實施例中，所述抗體包括雙特異性抗體。在一些實施例中，結合CD105和/或CD117的LNP的抗體包括雙特異性抗體。 [0025]在一些實施例中，本文提供了一種LNP，其中所述一種或多種核酸是DNA或RNA。在一些實施例中，所述RNA是mRNA。 [0026]在一些實施例中，所述LNP的一種或多種核酸包括編碼定點核酸酶、化學鹼基編輯器、先導編輯器或表觀基因組編輯器的mRNA。在一些實施例中，所述一種或多種核酸包括編碼定點核酸酶的mRNA。在一些實施例中，所述定點核酸酶是CRISPR相關（Cas）核酸酶、鋅指核酸酶（ZFN）、轉錄啟動因子樣效應核酸酶（TALEN）或megaTAL。在一些實施例中，所述定點核酸酶是包含賦予與靶核苷酸序列的結合的胺基酸序列的Cas核酸酶、ZFN、TALEN或megaTAL。 [0027]在一些實施例中，所述LNP的一種或多種核酸包括編碼CRISPR相關（Cas）核酸酶或化學鹼基編輯器的mRNA；以及含有賦予與靶核苷酸序列的結合的核苷酸序列的指導RNA（gRNA）。 [0028]在一些實施例中，所述LNP的一種或多種核酸包括編碼先導編輯器的mRNA；以及含有賦予與靶核苷酸序列的結合的核苷酸序列的先導編輯指導RNA（pegRNA）。 [0029]在一些實施例中，所述Cas核酸酶是II型或V型Cas酶或其變體。在一些實施例中，所述Cas核酸酶是Cas9酶、Cas12酶、CasX酶、Cas14酶或其變體。 [0030]在一些實施例中，所述LNP的gRNA或pegRNA包含與靶核苷酸序列的至少15個連續核苷酸具有至少80%同一性的序列。在一些實施例中，所述LNP的一種或多種核酸還包括供體範本核酸，所述供體範本核酸包含與靶核苷酸序列的至少15個連續核苷酸具有至少80%同一性的序列。 [0031]在一些實施例中，所述靶核苷酸序列包含至少15個連續核苷酸，並且位於基因的編碼區、與基因相關的內含子區、與基因相關的外顯子區、與基因相關的5'非轉譯區或與基因相關的3'非轉譯區內，其中所述基因選自以下基因： HBB、 HBG1、 HBG2、 HBA1、 HBA2、 HBD、 BCL11A、 BACH2、 KLF1、 LRF、 ADA、 DCLREIC、 IL2RG、 RAG1、 RAG2、 JAK3、 BTK、 WAS、 F8、 F9、 F11、 F10、 PKLR、 RPS19、 CYBA、 CYBB、 NCF1、 NCF1B、 NCF1C、 NCF2、 NCF4、 ELANE、 ABCD1、 ARSA、 FXN、 GBA、 IDS、 IDUA、 TCIRG、 AICDA、 UNG、 CD40、 CD40LG、 FOXP3、 IL4、 IL10、 IL13、 IL7R、 PRF1、 FANCA、 FANCB、 FANCC、 FANCD1/BRACA2、 FANCD2、 MPL、 CCR5、 CXCR4、 F5、 F2、抗凝血酶III基因和蛋白C基因。 [0032]在一些實施例中，所述靶核苷酸序列位於選自以下的基因的調節區內，任選地位於強化子區或抑制子區內： HBB、 HBG1、 HBG2、 HBA1、 HBA2、 HBD、 BCL11A、 BACH2、 KLF1、 LRF、 ADA、 DCLREIC、 IL2RG、 RAG1、 RAG2、 JAK3、 BTK、 WAS、 F8、 F9、 F11、 F10、 PKLR、 RPS19、 CYBA、 CYBB、 NCF1、 NCF1B、 NCF1C、 NCF2、 NCF4、 ELANE、 ABCD1、 ARSA、 FXN、 GBA、 IDS、 IDUA、 TCIRG、 AICDA、 UNG、 CD40、 CD40LG、 FOXP3、 IL4、 IL10、 IL13、 IL7R、 PRF1、 FANCA、 FANCB、 FANCC、 FANCD1/BRACA2、 FANCD2、 MPL、 CCR5、 CXCR4、 F5、 F2、抗凝血酶III基因和蛋白C基因。在一些實施例中，所述靶核苷酸序列位於 BCL11A紅系細胞強化子內。在一些實施例中，所述靶核苷酸序列包含GTGATAAAAGCAACTGTTAG（SEQ ID NO: 62）的多核苷酸序列，或其包含至多10（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10）個核苷酸取代的變體。 [0033]在一些實施例中，所述LNP的可電離陽離子脂質包含式 (II') 的化合物。在一些實施例中，所述LNP的可電離陽離子脂質包含式 (II) 的化合物。在一些實施例中，R 3B2和R 3B3各自獨立地是H或任選地被一個或多個各自獨立地選自-OH和-O-(C 1-6烷基)的取代基取代的C 1-6烷基。在一些實施例中，R 3B2和R 3B3各自獨立地是甲基或乙基，其各自任選地被一個或多個-OH取代。在一些實施例中，R 3B2和R 3B3各自是未取代的甲基。 [0034]在一些實施例中， 是 、 、 、 或 。 [0035]在一些實施例中， 是 。在一些實施例中，R 1、R 2和R 3各自獨立地是鍵或伸甲基。在一些實施例中，R 1和R 2各自是伸甲基並且R 3是鍵。 [0036]在一些實施例中，所述LNP的可電離陽離子脂質是式 (IIa) 的化合物： (IIa)， 其中R 1A、R 2A、R 3A、R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2、R 3A3、R 3B1、R 3B2和R 3B3如針對式 (II')、式 (II) 或其任何變體或實施例所定義的。 [0037]在一些實施例中，所述LNP的可電離陽離子脂質是式 (IIb) 的化合物： (IIb)。 [0038]在一些實施例中，R 1A、R 2A和R 3A各自獨立地是鍵或-(CH 2) 1-10-。在一些實施例中，R 1A和R 2A各自獨立地是鍵、-CH 2-、-(CH 2) 2-、-(CH 2) 3-、-(CH 2) 4-、-(CH 2) 5-、-(CH 2) 6-、-(CH 2) 7-或-(CH 2) 8-。在一些實施例中，R 1A和R 2A各自獨立地是鍵、-(CH 2) 2-、-(CH 2) 4-、-(CH 2) 6-、-(CH 2) 7-或-(CH 2) 8-。在一些實施例中，R 3A是鍵、-CH 2-、-(CH 2) 2-或-(CH 2) 7-。在一些實施例中，R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2和R 2A3各自獨立地是H、C 1-15烷基、-CH=CH-( 1-15烷基)、-CH=CH-CH 2-CH=CH-(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)、-(CH 2) 0-4OC(O)CH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-15烷基)或-(CH 2) 0-4OC(O)CH 2( 1-15烷基)。在一些實施例中，R 1A1和R 2A1各自獨立地是-CH=CH-(C 1-15烷基)、-CH=CH-CH 2-CH=CH-(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)或-(CH 2) 0-4OC(O)CH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)；並且R 1A2、R 1A3、R 2A2和R 2A3各自是H。在一些實施例中，R 1A1和R 2A1各自是 、 、 、 、 、 或 。 [0039]在一些實施例中，R 1A1和R 2A1各自是 。 [0040]在一些實施例中，R 3A1、R 3A2和R 3A3各自獨立地是H、C 1-15烷基、-(CH 2) 0-4C(O)OCH(C 1-5烷基)(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4OC(O)CH(C 1-5烷基)(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-10烷基)或-(CH 2) 0-4OC(O)CH 2(C 1-10烷基)。 [0041]在一些實施例中，R 3A1和R 3A2各自獨立地是C 1-15烷基；並且R 3A3是H。 [0042]在一些實施例中，R 3A1和R 3A2各自獨立地是乙基、丙基、 、 、 或 。 [0043]在一些實施例中，R 3A1是丙基並且R 3A2是 。 [0044]在一些實施例中，所述LNP的可電離陽離子脂質是 。 [0045]在一些實施例中，所述LNP的可電離陽離子脂質是 。 [0046]在一些實施例中，所述LNP的可電離陽離子脂質是 。 [0047]所述可電離陽離子脂質包含具有以下結構的化合物 。 [0048]在一些態樣，本文提供了一種LNP，其中所述抗體經由含有聚乙二醇（PEG）的連接子與所述LNP中的脂質共價接合。在一些實施例中，結合CD105和/或CD117的抗體經由含有聚乙二醇（PEG）的連接子與所述LNP中的脂質共價接合。在一些實施例中，經由含有PEG的連接子與所述抗體共價接合的脂質是二硬脂醯甘油（DSG）、二硬脂醯磷脂醯乙醇胺（DSPE）、二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（DMPE）、二硬脂醯-甘油-磷酸甘油（DSPG）、二肉豆蔻醯-甘油（DMG）、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺（DPPE）、二棕櫚醯-甘油（DPG）或神經醯胺。在一些實施例中，所述PEG是PEG 2000或PEG 3400。 [0049]在一些實施例中，所述脂質-抗體接合物以0.001至0.5莫耳百分比的範圍存在於所述LNP中。在一些實施例中，所述脂質-抗體接合物以0.002-0.2莫耳百分比的範圍存在於所述LNP中。 [0050]在一些實施例中，所述可電離陽離子脂質以30-70莫耳百分比的範圍存在於所述LNP中。在一些實施例中，所述可電離陽離子脂質以40-60莫耳百分比的範圍存在於所述LNP中。 [0051]在一些實施例中，所述LNP還包含結構脂質、中性磷脂和游離PEG-脂質中的一種或多種。在一些實施例中，所述結構脂質是固醇。在一些實施例中，所述固醇是膽固醇。在一些實施例中，所述固醇以20-70莫耳百分比的範圍存在於所述LNP中。在一些實施例中，所述固醇以30-50莫耳百分比的範圍存在於所述LNP中。在一些實施例中，所述固醇包含膽固醇並且以約40莫耳百分比的濃度存在於所述LNP中。 [0052]在一些實施例中，所述中性磷脂選自磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DSPE）、1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DSPC）、1,2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）、1,2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DOPC）和鞘磷脂。在一些實施例中，所述中性磷脂以5-15莫耳百分比的範圍存在於所述LNP中。在一些實施例中，所述LNP中中性磷脂的濃度為約10莫耳百分比。在一些實施例中，所述中性磷脂是DSPC，並且所述LNP中DSPC的濃度為約10莫耳百分比。 [0053]在一些實施例中，所述游離PEG-脂質選自PEG修飾的磷脂醯乙醇胺、PEG修飾的磷脂酸、PEG修飾的神經醯胺、PEG修飾的二烷基胺、PEG修飾的二醯基甘油和PEG修飾的二烷基甘油。在一些實施例中，所述游離PEG-脂質包括PEG-二油醯甘油（PEG-DOG）、PEG-二肉豆蔻醯-甘油（PEG-DMG）、PEG-二棕櫚醯甘油（PEG-DPG）、PEG-二亞油醯-甘油-磷脂醯乙醇胺（PEG-DLPE）、PEG-二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DMPE）、PEG-二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺（PEG-DPPE）、PEG-二硬脂醯甘油（PEG-DSG）、N-棕櫚醯-鞘胺醇-1-{琥珀醯[甲氧基(聚乙二醇)]（PEG-神經醯胺）、PEG-二硬脂醯-甘油-磷酸甘油（PEG-DSPG）、PEG-二油醯-甘油磷酸乙醇胺（PEG-DOPE）、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-雙十四烷基乙醯胺、PEG-二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DSPE）或其衍生物。在一些實施例中，所述游離PEG-脂質包括二醯基磷脂醯乙醇胺，其包含二棕櫚醯（C16）鏈或二硬脂醯（C18）鏈，並且任選地所述游離PEG-脂質包括PEG-DPG和PEG-DMG。在一些實施例中，所述游離PEG-脂質以1-4莫耳百分比的範圍存在於所述LNP中。在一些實施例中，所述PEG-脂質是包含分子量為2000道爾頓的PEG的DPG-PEG，並且DPG-PEG脂質以約1.5莫耳百分比的濃度存在於所述LNP中。 [0054]在一些實施例中，所述游離PEG-脂質包含與所述脂質-抗體接合物中的脂質相同或不同的脂質。 [0055]在一些實施例中，所述游離PEG-脂質包含分子量為至少2000道爾頓的PEG。在一些實施例中，所述PEG具有約3000至5000道爾頓的分子量。 [0056]在一些實施例中，所述LNP具有在50-200 nm範圍內的平均直徑。在一些實施例中，所述LNP具有約100 nm的平均直徑。在一些實施例中，所述LNP具有在0.05至1範圍內的多分散性指數。在一些實施例中，所述LNP在pH 5下具有從約+10 mV至約+30 mV的ζ電位。在一些實施例中，所述LNP在pH 7.4下具有從約-30 mV至約5 mV的ζ電位。 [0057]在一些實施例中，所述LNP包含可電離陽離子脂質；含有下式的化合物的脂質-抗體接合物：[脂質] - [任選的連接子] - [抗體]，其中所述抗體結合CD105和/或CD117；固醇或其他結構脂質；中性磷脂；游離聚乙二醇（PEG）脂質以及核酸。 [0058]本文還提供了一種將核酸的遞送靶向至受試者的任選地離體或體內的造血幹細胞（HSC）的方法，所述方法包括向所述受試者投予實施例中任一個所述的LNP，其中所述LNP包含所述核酸。在一些實施例中，所述受試者是人。 [0059]在一些實施例中，所述方法還包括向所述受試者投予HSC動員劑，並且其中向所述受試者靜脈內投予所述LNP。在一些實施例中，在投予所述LNP之前、期間或者之前和期間向所述受試者投予所述HSC動員劑。在一些實施例中，所述HSC動員劑包括普樂沙福（plerixafor）、粒細胞集落刺激因子（G-CSF）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）或其任何組合。在一些實施例中，所述HSC動員劑包括普樂沙福和G-CSF。 [0060]本文還提供了一種對受試者的任選地離體或體內的造血幹細胞（HSC）進行遺傳修飾的方法，所述方法包括向所述受試者投予前述實施例中任一個所述的LNP，其中佈置於所述LNP中的一種或多種核酸包括編碼定點核酸酶、化學鹼基編輯器、先導編輯器或表觀基因組編輯器的mRNA。 [0061]本文還提供了一種治療有需要的受試者的疾病的方法，所述方法包括向所述受試者投予前述實施例中任一個所述的LNP，其中佈置於所述LNP中的一種或多種核酸包括編碼定點核酸酶、化學鹼基編輯器、先導編輯器或表觀基因組編輯器的序列，任選mRNA。 [0062]在一些實施例中，所述方法還包括向所述受試者投予HSC動員劑，並且其中向所述受試者靜脈內投予所述LNP。在一些實施例中，在投予所述LNP之前、期間或者之前和期間向所述受試者投予所述HSC動員劑。在一些實施例中，所述HSC動員劑包括普樂沙福（plerixafor）、粒細胞集落刺激因子（G-CSF）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）或其任何組合。在一些實施例中，所述HSC動員劑包括普樂沙福和G-CSF。 [0063]在一些實施例中，所述疾病是血液病。在一些實施例中，所述疾病是血紅蛋白病、原發性免疫缺陷（PID）、先天性血球減少、血友病、血栓形成傾向、先天性代謝缺陷、神經病或病毒性疾病。在一些實施例中，所述疾病是α-血紅蛋白病或β-血紅蛋白病。在一些實施例中，所述β-血紅蛋白病是β-地中海貧血或鐮狀細胞病。 [0064]在一些實施例中，投予所述LNP導致以下中的一項或多項：(i) HBB轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中；(ii) 所述受試者中β-球蛋白的表現增加；(iii) 所述受試者的α 2β 2成人血紅蛋白（HbA）的量增加；(iv) HBG1轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中；(v) HBG2轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中；(vi) 所述受試者中γ-球蛋白的表現增加；(vii) 所述受試者中α 2γ 2胎兒血紅蛋白（HbF）的量增加；(viii) HBA1基因、 HBA2基因或其組合在所述受試者的至少一個HSC中遭到破壞；(ix) 所述受試者中α-球蛋白的表現降低；以及 (x) 所述受試者中α 4α-球蛋白異四聚體的量減少。 [0065]在一些實施例中，所述疾病是PID。在一些實施例中，所述PID是重症聯合免疫缺陷（SCID）、威斯科特-奧爾德里奇症候群、慢性肉芽腫病、X連鎖多內分泌腺病腸病伴免疫失調（IPEX）、高IgM症候群或X連鎖無丙種球蛋白血症。 [0066]在一些實施例中，所述PID是SCID。在一些實施例中，所述SCID是Artemis-SCID（ART-SCID）、重組啟動基因SCID（RAG-SCID）、X連鎖SCID（X-SCID）、腺苷脫胺酶缺乏型SCID、白介素7受體缺陷型SCID或JAK3 SCID。在一些實施例中，所述SCID是ART-SCID，並且其中投予所述LNP導致 DCLREIC轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，所述受試者中功能性Artemis蛋白的表現增加，或其組合。在一些實施例中，所述SCID是RAG-SCID，並且其中投予所述LNP導致 RAG1轉基因或 RAG2轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，所述受試者中功能性RAG1蛋白或RAG2蛋白的表現增加，或其組合。在一些實施例中，所述SCID是X-SCID，並且其中投予所述LNP導致 IL2RG轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，所述受試者中功能性IL2RG蛋白的表現增加，或其組合。 [0067]在一些實施例中，所述PID是威斯科特-奧爾德里奇症候群。在一些實施例中，所述PID是威斯科特-奧爾德里奇症候群，並且其中投予所述LNP導致 WAS轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，所述受試者中功能性WASP蛋白表現的表現增加，或其組合。 [0068]在一些實施例中，所述PID是慢性肉芽腫病。 [0069]在一些實施例中，所述PID是X連鎖慢性肉芽腫病。 [0070]在一些實施例中，所述PID是慢性肉芽腫病，並且其中投予所述LNP導致以下中的一項或多項：(i) CYBA轉基因、 CYBB轉基因、 NCF1轉基因、 NCF2轉基因或 NCF4轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，(ii) 在所述受試者的至少一個HSC的 CYBB基因中引入點676C＞T點突變；(iii) 所述受試者中功能性CYBA蛋白、CYBB蛋白、NCF1蛋白、NCF2蛋白或NCF4蛋白的表現增加；以及 (v) 所述受試者中功能性NADPH氧化酶複合物的量增加。 [0071]在一些實施例中，所述PID是IPEX。在一些實施例中，所述PID是IPEX，並且其中投予所述LNP導致 FOXP3轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，所述受試者中功能性FOXP3蛋白的表現增加，或其組合。 [0072]在一些實施例中，所述PID是高IgM症候群。在一些實施例中，所述PID是高IgM症候群，並且其中投予所述LNP導致以下中的一項或多項：(i) AICDA轉基因、 UNG轉基因、 CD40轉基因或 CD40LG轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中；(ii) 所述受試者中功能性AICDA蛋白、UNG蛋白、CD40蛋白或CD40LG蛋白的表現增加；(iii) 所述受試者中IgM抗體的量減少；和 (iv) 所述受試者中IgG、IgA、或IgE抗體的量增加。 [0073]在一些實施例中，所述疾病是先天性血球減少。在一些實施例中，所述先天性血球減少是範可尼貧血、施瓦赫曼-戴蒙德症候群、布萊克梵-戴蒙德貧血、先天性角化不良、先天性無巨核細胞血小板減少症或網狀組織發育不全。在一些實施例中，所述先天性血球減少是範可尼貧血，並且其中投予所述LNP導致以下中的一項或多項： FANC基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，所述受試者中一種或多種功能性FANC蛋白的表現增加，或其組合。在一些實施例中，所述先天性血球減少是範可尼貧血，並且其中投予所述LNP導致 FANCA轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，所述受試者中功能性FANCA的表現增加，或其組合。 [0074]在一些實施例中，所述疾病是血友病。在一些實施例中，所述血友病是血友病A、血友病B或血友病C。 [0075]在一些實施例中，所述疾病是血友病，並且其中投予所述LNP導致 (i) F8轉基因、 F9轉基因或 F11或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中；(ii) 所述受試者中功能性因子VIII蛋白、因子IX蛋白或因子XI蛋白的表現增加；以及 (iii) 所述受試者中血液凝固增加。 [0076]在一些實施例中，所述疾病是血栓形成傾向。在一些實施例中，所述血栓形成傾向是無巨核細胞血小板減少症或因子X缺乏症。 [0077]在一些實施例中，所述疾病是血栓形成傾向，並且其中投予所述LNP導致以下中的一項或多項：(i) F5轉基因、 F2轉基因、編碼抗凝血酶III的轉基因、編碼蛋白C的轉基因或編碼蛋白S的轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，(ii) 所述受試者中功能性因子V蛋白、因子II蛋白、抗凝血酶III蛋白、蛋白C或蛋白S的表現增加；以及 (iii) 所述受試者中血液凝固減少。 [0078]在一些實施例中，所述疾病是先天性代謝缺陷。在一些實施例中，所述先天性代謝缺陷是苯丙酮尿症、中鏈醯基輔酶A脫氫酶（MCAD）缺乏症、溶酶體貯積病、糖原貯積障礙、過氧化物酶體障礙、法布裡病、戈謝病、赫勒症候群、亨特症候群、沃爾曼病或丙酮酸激酶缺乏症。在一些實施例中，所述過氧化物酶體障礙是X連鎖腎上腺腦白質營養不良。在一些實施例中，所述溶酶體貯積病是異染性腦白質營養不良、粘多糖貯積症I或粘多糖貯積症II。 [0079]在一些實施例中，所述疾病是神經病。在一些實施例中，所述神經病是弗裡德賴希共濟失調。 [0080]在一些實施例中，所述疾病是病毒性疾病。在一些實施例中，所述病毒性疾病是HIV/AIDS。在一些實施例中，所述病毒性疾病是HIV/AIDS，並且其中投予所述LNP預防被HIV感染、防止HIV/AIDS進展或其組合。 [0081]在一些實施例中，所述治療方法的佈置於LNP中的一種或多種核酸包括編碼定點核酸酶的mRNA。在一些實施例中，所述定點核酸酶是CRISPR相關（Cas）核酸酶、鋅指核酸酶（ZFN）、轉錄啟動因子樣效應核酸酶（TALEN）或megaTAL。在一些實施例中，所述定點核酸酶是包含賦予與靶核苷酸序列的結合的胺基酸序列的Cas核酸酶、ZFN、TALEN或megaTAL。 [0082]在一些實施例中，所述治療方法的佈置於LNP中的一種或多種核酸包括 (i) 編碼CRISPR相關（Cas）核酸酶或化學鹼基編輯器的mRNA；和 (ii) 含有賦予與靶核苷酸序列的結合的核苷酸序列的指導RNA（gRNA）。在一些實施例中，佈置於所述LNP中的一種或多種核酸包括 (i) 編碼先導編輯器的mRNA；和 (ii) 含有賦予與靶核苷酸序列的結合的核苷酸序列的先導編輯指導RNA（pegRNA）。在一些實施例中，所述Cas核酸酶是II型或V型Cas酶或其變體。在一些實施例中，所述Cas核酸酶是Cas9酶、Cas12酶、CasX酶或Cas14酶或其變體。在一些實施例中，所述gRNA或pegRNA包含與靶核苷酸序列的至少15個連續核苷酸具有至少80%同一性的序列。 [0083]在一些實施例中，所述治療方法的佈置於LNP中的一種或多種核酸還包括供體範本核酸，所述供體範本核酸包含與靶核苷酸序列的至少15個連續核苷酸具有至少80%同一性的序列。 [0084]在一些實施例中，所述治療方法的靶核苷酸序列包含至少15個連續核苷酸並且位於基因的編碼區、與基因相關的內含子區、與基因相關的外顯子區、與基因相關的5'非轉譯區或與基因相關的3'非轉譯區內，其中所述基因選自： HBB、 HBG1、 HBG2、 HBA1、 HBA2、 HBD、 BCL11A、 BACH2、 KLF1、 LRF、 ADA、 DCLREIC、 IL2RG、 RAG1、 RAG2、 JAK3、 BTK、 WAS、 F8、 F9、 F11、 F10、 PKLR、 RPS19、 CYBA、 CYBB、 NCF1、 NCF1B、 NCF1C、 NCF2、 NCF4、 ELANE、 ABCD1、 ARSA、 FXN、 GBA、 IDS、 IDUA、 TCIRG、 AICDA、 UNG、 CD40、 CD40LG、 FOXP3、 IL4、 IL10、 IL13、 IL7R、 PRF1、 FANCA、 FANCB、 FANCC、 FANCD1/BRACA2、 FANCD2、 MPL、 CCR5、 CXCR4、 F5、 F2、抗凝血酶III基因和蛋白C基因。 [0085]在一些實施例中，所述靶核苷酸序列位於選自以下的基因的調節區內，任選地位於強化子區或抑制子區內： HBB、 HBG1、 HBG2、 HBA1、 HBA2、 HBD、 BCL11A、 BACH2、 KLF1、 LRF、 ADA、 DCLREIC、 IL2RG、 RAG1、 RAG2、 JAK3、 BTK、 WAS、 F8、 F9、 F11、 F10、 PKLR、 RPS19、 CYBA、 CYBB、 NCF1、 NCF1B、 NCF1C、 NCF2、 NCF4、 ELANE、 ABCD1、 ARSA、 FXN、 GBA、 IDS、 IDUA、 TCIRG、 AICDA、 UNG、 CD40、 CD40LG、 FOXP3、 IL4、 IL10、 IL13、 IL7R、 PRF1、 FANCA、 FANCB、 FANCC、 FANCD1/BRACA2、 FANCD2、 MPL、 CCR5、 CXCR4、 F5、 F2、抗凝血酶III基因和蛋白C基因。 [0086]在一些實施例中，所述靶核苷酸序列位於 BCL11A紅系細胞強化子內。在一些實施例中，所述靶核苷酸序列包含GTGATAAAAGCAACTGTTAG（SEQ ID NO: 62）的多核苷酸序列，或其包含至多10（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10）個核苷酸取代的變體。在一些實施例中，本文提供的方法的受試者是人。
相關申請的交叉引用 [0127]本申請要求2023年2月3日提交的美國臨時申請號63/443,223、2023年5月1日提交的美國臨時申請號63/463,252和2023年5月17日提交的美國臨時申請號63/467,282的優選權權益，將其各自通過引用以其整體併入本文。 對電子序列表的引用 [0128]將電子序列表的內容（183952035042SEQLIST.xml；大小：57,069位元組；創建日期：2024年1月30日）通過引用以其整體併入本文。 [0129]本發明提供了特異性靶向造血幹細胞（HSC）並將包封在LNP中的核酸遞送至HSC中的脂質奈米粒子（LNP）。在一些態樣，用於靶向遞送的LNP包含 (a) 脂質-抗體接合物，所述脂質-抗體接合物包含式 (I) 的化合物：[脂質]-[任選的連接子]-[抗體] (I)；和 (b) 可電離陽離子脂質；以及 (c) 佈置於LNP中的一種或多種核酸。在一些實施例中，所述抗體特異性結合CD105和/或CD117。在一些實施例中，所述一種或多種核酸包括編碼核酸酶的mRNA和相關的指導RNA。本文還提供了包含LNP的組合物、以及製備LNP的方法和使用LNP用於在HSC中進行基因編輯的方法。 [0130]除非另外指示，否則本發明的實踐採用有機化學、藥理學、細胞生物學和生物化學的常規技術。這些技術在以下文獻中闡明，如「Comprehensive Organic Synthesis」（B.M. Trost和I. Fleming, 編輯, 1991-1992）；「Current protocols in molecular biology」（F.M. Ausubel等人, 編輯, 1987, 以及定期更新）；以及「Current protocols in immunology」（J.E. Coligan等人, 編輯, 1991），將其各自通過引用以其整體併入本文。在下面的部分中闡述了本發明的各個態樣；然而，在一個特定部分中所述的本發明的態樣不限於任何特定部分。 I. 定義 [0131]為了便於理解本發明，下面定義了許多術語和短語。 [0132]除非另外定義，否則本文所用的所有技術和科技術語均具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同含義。本文所用的縮寫具有其在化學和生物領域內的常規含義。本文闡述的化學結構和化學式應當根據化學領域已知的化學價的標準規則來解釋。另外，例如，當化學基團是雙自由基時，應理解化學基團可以在一個或兩個方向上與結構的其餘部分中的其相鄰原子鍵合，例如-OC(O)-可與-C(O)O-互換，或者-OC(S)-可與-C(S)O-互換。 [0133]除非上下文不恰當，否則如本文所用的術語「一個/一種（a）」和「一個/一種（an）」意指「一個或多個/一種或多種（one or more）」並且包括複數。在一些實施例中，「一個或多個/一種或多種」是1或2。在一些實施例中，「一個或多個/一種或多種」是1、2或3。在一些實施例中，「一個或多個/一種或多種」是1、2、3或4。在一些實施例中，「一個或多個/一種或多種」是1、2、3、4或5。在一些實施例中，「一個或多個/一種或多種」是1、2、3、4、5或更大。 [0134]如本文所用的術語「烷基」是指飽和直鏈或支鏈烴，如1-12、1-10或1-6個碳原子的直鏈或支鏈基團，在本文中分別稱為C 1-C 12烷基、C 1-C 10烷基或C 1-C 6烷基。在一些實施例中，烷基是任選地經取代的。示例性烷基包括但不限於甲基、乙基、丙基、異丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2,2-二甲基-1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2,2-二甲基-1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、異丁基、三級丁基、戊基、異戊基、新戊基、己基、庚基、辛基等。 [0135]術語「伸烷基」是指烷基的雙自由基。在一些實施例中，伸烷基是任選地經取代的。示例性伸烷基是-CH2CH2-。 [0136]術語「鹵代烷基」是指被至少一個鹵素取代的烷基。例如，-CH 2F、-CHF 2、-CF 3、-CH 2CF 3、-CF 2CF 3等。 [0137]術語「側氧基」是本領域公認的並且是指「=O」取代基。例如，被側氧基基團取代的環戊烷是環戊酮。 [0138]術語「嗎啉基」是指具有以下結構的取代基： ，其是任選地經取代的。 [0139]術語「哌啶基」是指具有以下結構的取代基： ，其是任選地經取代的。 [0140]通常，術語「取代的」無論前面是否有術語「任選地」均意指指定部分的一個或多個氫被合適的取代基替換。除非另外指示，否則「任選取代的」基團可以在所述基團的每個可取代位置處具有合適的取代基，並且當任何給定結構中的超過一個位置可以被超過一個選自指定群組的取代基取代時，在每個位置處的取代基可以相同或不同。在本發明下預想的取代基組合優選地為導致形成穩定或化學上可行的化合物的取代基組合。在一些實施例中，「任選取代的」等同於「未取代的或取代的」。在一些實施例中，「任選取代的」表示指定的原子或基團任選地被一個或多個獨立地選自本文提供的任選取代基的取代基取代。在一些實施例中，任選的取代基可以選自：C 1-6烷基、氰基、鹵素、-O-C 1-6烷基、C 1-6鹵代烷基、C 3-7環烷基、3元至7元雜環基、5元至6元雜芳基和苯基。在一些實施例中，任選的取代基是烷基、氰基、鹵素、鹵代、迭氮化物、芳烷基、烯基、炔基、環烷基、羥基、烷氧基、胺基、硝基、巰基、亞胺基、醯胺基、羧酸、-C(O)烷基、-CO 2烷基、羰基、羧基、烷硫基、磺醯基、磺醯胺基、磺醯胺、酮、醛、酯、雜環基、芳基或雜芳基。在一些實施例中，任選的取代基是-OR s1、-NR s2R s3、-C(O)R s4、-C(O)OR s5、C(O)NR s6R s7、-OC(O)R s8、-OC(O)OR s9、-OC(O)NR s10R 11、-NR s12C(O)R s13或-NR s14C(O)OR s15，其中R s1、R s2、R s3、R s4、R s5、R s6、R s7、R s8、R s9、R s10、R s11、R s12、R s13、R s14和R s15各自獨立地是H、C 1-6烷基、C 3-10環烷基、C 6-14芳基、5元至10元雜芳基或3元至10元雜環基，其各自是任選地經取代的。 [0141]術語「鹵代烷基」是指被至少一個鹵素取代的烷基。例如，-CH 2F、-CHF 2、-CF 3、-CH 2CF 3、-CF 2CF 3等。 [0142]術語「環烷基」是指衍生自環烷烴的3-12、3-10、3-8、4-8或4-6個碳的單價飽和環狀、二環、橋環（例如，金剛烷基）或螺環烴基，在本文中被稱為例如「C 4-8環烷基」。在一些實施例中，環烷基是任選地經取代的。示例性環烷基包括但不限於環己烷、環戊烷、環丁烷和環丙烷。除非另外說明，否則環烷基在一個或多個環位置處任選地被例如烷醯基、烷氧基、烷基、鹵代烷基、烯基、炔基、醯胺基、脒基、胺基、芳基、芳基烷基、迭氮基、胺基甲酸酯、碳酸酯、羧基、氰基、環烷基、酯、醚、甲醯基、鹵素、鹵代烷基、雜芳基、雜環基、羥基、亞胺基、酮、硝基、磷酸酯、膦酸基、次膦酸基、硫酸酯、硫化物、磺醯胺基、磺醯基或硫代羰基取代。在某些實施例中，環烷基沒有被取代，即它是未取代的。 [0143]術語「雜環基」和「雜環基團」是本領域公認的，並且是指飽和、部分不飽和或芳香族的3元至10元環結構，可替代地3元至7元環，其環結構包括一至四個雜原子，如氮、氧和硫。在一些實施例中，雜環基是任選地經取代的。雜環基中的環原子數可以使用C x-C x命名法指定，其中x是指定環原子數的整數。例如，C 3-C 7雜環基是指飽和或部分不飽和的3至7元環結構，其含有一至四個雜原子，如氮、氧和硫。名稱「C 3-C 7」指示雜環含有總共從3至7個環原子，包括佔據環原子位置的任何雜原子。C 3雜環基的一個例子是氮雜環丙烷基。雜環可以是例如單環、二環或其他多環環系統（例如，稠合、螺環、橋接二環的）。雜環可以與一個或多個芳基、部分不飽和或飽和的環稠合。雜環基包括例如生物素基、色烯基、二氫呋喃基、二氫吲哚基、二氫吡喃基、二氫噻吩基、二噻唑基、高哌啶基、咪唑烷基、異喹啉基、異噻唑啶基、異㗁唑啶基、嗎啉基、氧雜環戊烷基、㗁唑啶基、啡𠮿基（phenoxanthenyl）、哌𠯤基、哌啶基、吡喃基、吡唑啶基、吡唑啉基、吡啶基、嘧啶基、吡咯啶基、吡咯啶-2-酮基、吡咯啉基、四氫呋喃基、四氫異喹啉基、四氫吡喃基、四氫喹啉基、噻唑啶基、硫雜環戊烷基、硫代嗎啉基、噻喃基、𠮿基、內酯、內醯胺（如氮雜環丁酮和吡咯啶酮）、磺內醯胺、磺內酯等。除非另外說明，否則雜環在一個或多個位置處任選地被諸如烷醯基、烷氧基、烷基、烯基、炔基、醯胺基、脒基、胺基、芳基、芳基烷基、迭氮基、胺基甲酸酯、碳酸酯、羧基、氰基、環烷基、酯、醚、甲醯基、鹵素、鹵代烷基、雜芳基、雜環基、羥基、亞胺基、酮、硝基、側氧基、磷酸酯、膦酸基、次膦酸基、硫酸酯、硫化物、磺醯胺基、磺醯基和硫代羰基等取代基取代。在某些實施例中，雜環基沒有被取代，即它是未取代的。 [0144]術語「芳基」是本領域公認的並且是指碳環芳香族基團。在一些實施例中，芳基是任選地經取代的。代表性芳基包括苯基、萘基、蒽基等。術語「芳基」包括具有兩個或更多個碳環的多環環系統，其中兩個或更多個碳是兩個相鄰環（所述環是「稠環」）共有的，其中至少一個環是芳香族的，並且例如，其他一個或多個環可以是環烷基、環烯基、環炔基和/或芳基。除非另外說明，否則芳香環可以在一個或多個環位置處被例如鹵素、迭氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、環烷基、羥基、烷氧基、胺基、硝基、巰基、亞胺基、醯胺基、羧酸、-C(O)烷基、CO 2烷基、羰基、羧基、烷硫基、磺醯基、磺醯胺基、磺醯胺、酮、醛、酯、雜環基、芳基或雜芳基部分、-CF 3、-CN等取代。在某些實施例中，芳香環在一個或多個環位置處被鹵素、烷基、羥基或烷氧基取代。在某些其他實施例中，芳香環沒有被取代，即它是未取代的。在某些實施例中，芳基是6元至10元環結構。在一些實施例中，芳基是C 6-C 14芳基。 [0145]術語「雜芳基」是本領域公認的並且是指包括至少一個環雜原子的芳香族基團。在一些實施例中，雜芳基是任選地經取代的。在某些情況下，雜芳基含有1、2、3或4個環雜原子。雜芳基的代表性例子包括吡咯基、呋喃基、苯硫基、咪唑基、㗁唑基、噻唑基、三唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嗒𠯤基和嘧啶基等。除非另外說明，否則雜芳基環可以在一個或多個環位置處被例如鹵素、迭氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、環烷基、羥基、烷氧基、胺基、硝基、巰基、亞胺基、醯胺基、羧酸、C(O)烷基、-CO 2烷基、羰基、羧基、烷硫基、磺醯基、磺醯胺基、磺醯胺、酮、醛、酯、雜環基、芳基或雜芳基部分、-CF 3、-CN等取代。術語「雜芳基」還包括具有兩個或更多個環的多環環系統，其中兩個或更多個碳是兩個相鄰環（所述環是「稠環」）共有的，其中至少一個環是雜芳香族的，例如，其他環狀環可以是環烷基、環烯基、環炔基和/或芳基。在某些實施例中，雜芳基環在一個或多個環位置處被鹵素、烷基、羥基或烷氧基取代。在某些其他實施例中，雜芳基環沒有被取代，即它是未取代的。在某些實施例中，雜芳基是5至10元環結構，可替代地5至6元環結構，其環結構包括1、2、3或4個雜原子，如氮、氧和硫。 [0146]術語「胺」和「胺基」是本領域公認的並且是指未取代和取代的胺兩者，例如由通式-N(R 10)(R 11)表示的部分，其中R 10和R 11各自獨立地代表氫、烷基、環烷基、雜環基、烯基、芳基、芳烷基或(CH 2) m-R 12；或者R 10和R 11與它們所附接的N原子一起構成在環結構中具有從4至8個原子的雜環；R 12代表芳基、環烷基、環烯基、雜環或多環；並且m是零或在1至8範圍內的整數。在某些實施例中，R 10和R 11各自獨立地代表氫、烷基、烯基或-(CH 2) m-R 12。 [0147]術語「烷氧基（alkoxyl）」或「烷氧基（alkoxy）」是本領域公認的並且是指如上所定義的具有與其附接的氧自由基的烷基。在一些實施例中，烷氧基是任選地經取代的。代表性烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、三級丁氧基等。「醚」是通過氧共價連接的兩個烴。因此，烷基的使該烷基成為醚的取代基是或類似於烷氧基，如可以由-O-烷基、-O-烯基、O-炔基、-O-(CH 2) m-R 12中的一個表示，其中m和R 12如上所述。術語「鹵代烷氧基」是指被至少一個鹵素取代的烷氧基。例如，-O-CH 2F、-O-CHF 2、-O-CF 3等。在某些實施例中，鹵代烷氧基是被至少一個氟基團取代的烷氧基。在某些實施例中，鹵代烷氧基是被1-6、1-5、1-4、2-4或3個氟基團取代的烷氧基。 [0148]符號「 」指示附接點。 [0149]本公開文本的化合物可以含有一個或多個手性中心和/或雙鍵，因此作為立體異構體（如幾何異構體、對映異構體或非對映異構體）存在。當在本文中使用時，術語「立體異構體」由所有幾何異構體、對映異構體或非對映異構體組成。這些化合物可以由符號「R」或「S」指定，這取決於立體碳原子周圍的取代基的組態。本發明涵蓋這些化合物的各種立體異構體及其混合物。立體異構體包括對映異構體和非對映異構體。對映異構體或非對映異構體的混合物在命名法中可以由「(±)」指定，但是熟練技術人員應認識到結構可以隱含地表示手性中心。應理解，除非另外指示，否則化學結構（例如，通用化學結構）的圖形描繪涵蓋指定化合物的所有立體異構形式。 [0150]本發明化合物的單獨立體異構體可以由含有不對稱或立體中心的市售起始材料合成製備，或者通過製備外消旋混合物、然後進行本領域普通技術人員熟知的拆分方法來製備。這些拆分方法由以下例示：(1) 將對映異構體混合物附接到手性助劑上，通過重結晶或層析法分離所得的非對映異構體混合物，並從助劑中釋放光學純的產物；(2) 採用光學活性拆分劑形成鹽；或 (3) 在手性層析柱上直接分離光學對映異構體混合物。立體異構混合物也可以通過熟知的方法拆分成其組分立體異構體，所述方法如手性相氣相層析法、手性相高效液相層析法、使化合物結晶為手性鹽複合物或使化合物在手性溶劑中結晶。進一步地，可以使用文獻中所述的超臨界流體層析（SFC）技術分離對映異構體。仍進一步地，立體異構體可以通過熟知的不對稱合成方法由立體異構體純的中間體、試劑和催化劑獲得。 [0151]幾何異構體也可以存在於本發明的化合物中。符號「=」表示可以是如本文所述的單鍵、雙鍵或叁鍵的鍵。本發明涵蓋由碳-碳雙鍵周圍的取代基排列或碳環周圍的取代基排列產生的各種幾何異構體及其混合物。碳-碳雙鍵周圍的取代基被指定處於「 Z」或「 E」組態，其中根據IUPAC標準使用術語「 Z」和「 E」。除非另外說明，否則描述雙鍵的結構涵蓋「 E」和「 Z」異構體兩者。 [0152]碳-碳雙鍵周圍的取代基可替代地可以被稱為「順式」或「反式」，其中「順式」表示取代基在雙鍵的同一側，並且「反式」表示取代基在雙鍵的相對側。碳環周圍的取代基排列被指定為「順式」或「反式」。術語「順式」表示取代基在環平面的同一側，並且術語「反式」表示取代基在環平面的相對側。其中取代基被放置在環平面的同一側和相對側的化合物混合物被指定為「順式/反式」。 [0153]本發明還包括同位素標記的本發明化合物，其與本文所述的化合物相同，不同之處在於一個或多個原子被原子質量或質量數不同於在自然界中通常發現的原子質量或質量數的原子替換。可以摻入本發明的化合物中的同位素的例子包括氫、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，如對應地為 2H、 3H、 13C、 14C、 15N、 18O、 17O、 31P、 32P、 35S、 18F和 36Cl。 [0154]某些同位素標記的公開的化合物（例如，用3H和14C標記的化合物）可用於化合物和/或底物組織分佈測定。氚化的（即，3H）和碳-14（即，14C）同位素因其易於製備和可檢測性而是特別優選的。進一步地，用較重的同位素（如氘，即2H）取代可以提供某些治療優勢，這是由於其具有更高的代謝穩定性（例如，體內半衰期增加或劑量需求減少），因此在一些情況下可能是優選的。同位素標記的本發明化合物通常可以通過類似於例如本文實例中公開的程序的程序，通過用同位素標記的試劑取代非同位素標記的試劑來製備。 [0155]如本文所用，術語「受試者」和「患者」是指待通過本發明的方法治療的生物體。此類生物體優選地是哺乳動物（例如，鼠科動物、猿猴、馬科動物、牛科動物、豬科動物、犬科動物、貓科動物等），並且更優選地是人。 [0156]如本文所用，術語「醫藥組合物」是指活性劑與惰性或活性載劑的組合，使得所述組合物特別適合於體內或離體的診斷或治療用途。 [0157]如本文所用，術語「醫藥上可接受的賦形劑」是指任何標準藥物載劑，如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳劑（例如像油/水或水/油乳劑）和各種類型的潤濕劑。所述組合物還可以包括穩定劑和防腐劑。關於載劑、穩定劑和輔助劑的例子，參見Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 第21版, A. R. Gennaro; Lippincott, Williams & Wilkins, 巴爾的摩, 馬里蘭州, 2006。 [0158]如本領域技術人員已知的，本發明化合物的「鹽」可以衍生自無機酸或有機酸和無機鹼或有機鹼。酸的例子包括但不限於鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富馬酸、馬來酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、對甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其他酸（如草酸）雖然本身不是醫藥上可接受的，但可以用於製備鹽，所述鹽可用作在獲得本發明的化合物及其醫藥上可接受的酸加成鹽時的中間體。 [0159]鹼的例子包括但不限於鹼金屬（例如，鈉）氫氧化物、鹼土金屬（例如，鎂）氫氧化物、氨和式NW 4 +的化合物（其中W是C 1-4烷基）等。 [0160]鹽的例子包括但不限於：乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天門冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、氟庚酸鹽（flucoheptanoate）、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、苯丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一酸鹽等。鹽的其他例子包括與合適的陽離子如Na +、NH 4 +和NW 4 +（其中W是C 1-4烷基）等複合的本發明的化合物的陰離子。 [0161]如本文所用的縮寫包括二異丙基乙胺（DIPEA）；4-二甲基胺基吡啶（DMAP）；四丁基碘化銨（TBAI）；1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺（EDC）；六氟磷酸苯並三唑-1-基-氧基三吡咯啶基鏻（PyBOP）；9-茀基甲氧基羰基（Fmoc）；四丁基二甲基甲矽烷基氯（TBDMSCl）；氟化氫（HF）；苯基（Ph）；雙(三甲基甲矽烷基)胺（HMDS）；二甲基甲醯胺（DMF）；二氯甲烷（DCM）；四氫呋喃（THF）；高效液相層析法（HPLC）；質譜法（MS）；蒸發光散射檢測器（ELSD）；電噴霧（ES）；核磁共振波譜法（NMR）。 [0162]如本文所用，術語「有效量」是指化合物（例如，核酸，例如mRNA）的足以實現有益或期望的結果的量。有效量可以在一次或多次投予、應用或劑量中投予，並不旨在限於特定的配製品或投予途徑。術語有效量可以被認為包括化合物的治療和/或預防有效量。 [0163]如本文所用的短語「治療有效量」意指化合物（例如，核酸，例如mRNA）、材料或包含化合物（例如，核酸，例如mRNA）的組合物的這樣的量，其是以適用於任何醫學治療的合理收益/風險比有效地在哺乳動物（例如，人）或受試者（例如，人類受試者）中的至少一個細胞亞群中產生一些期望的治療效果。 [0164]如本文所用的短語「預防有效量」意指化合物（例如，核酸，例如mRNA）、材料或包含化合物（例如，核酸，例如mRNA）的組合物的這樣的量，其是以適用於任何醫學治療的合理收益/風險比通過降低、最小化或消除患上病症的風險或者降低或最小化病症的嚴重程度而有效地在哺乳動物（例如，人）或受試者（例如，人類受試者）中的至少一個細胞亞群中產生一些期望的預防效果。 [0165]如本文所用，術語「治療（treat）」、「治療（treating）」和「治療（treatment）」包括導致病症、疾病、障礙等的改進或改善其症狀的任何作用，例如減少、減輕、調節、改善或消除。 [0166]短語「醫藥上可接受的」在本文中用於指代在合理的醫學判斷範圍內適用於與人和動物的組織接觸而沒有過度的毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，與合理的收益/風險比相稱的那些化合物、材料、組合物和/或劑型。 [0167]在本申請中，在要素或組分被說成包括在和/或選自所列舉的要素或組分的清單的情況下，應當理解所述要素或組分可以是所列舉的要素或組分中的任何一種，或者所述要素或組分可以選自所列舉的要素或組分中的兩種或更多種。 [0168]進一步地，應當理解，在不背離本發明的精神和範圍的情況下，本文所述的組合物或方法的要素和/或特徵可以以多種方式組合，無論在本文中是明確的還是暗示的。例如，除非從上下文中另外理解，否則在提及特定化合物的情況下，該化合物可以用於本發明組合物的各種實施例和/或本發明的方法中。換言之，在本申請內，實施例已經以使得能夠書寫和繪製清晰且簡明的申請的方式進行了描述和描繪，但是意圖並且應理解的是，實施例可以在不背離本發明教導和一項或多項發明的情況下以各種方式組合或分離。例如，應理解的是，本文描述和描繪的所有特徵均可以適用於本文描述和描繪的一項或多項發明的所有態樣。 [0169]應當理解，除非從上下文和使用中另外理解，否則表述「……中的至少一個/至少一種（at least one of）」包括在所述表述後所列舉的物件中的單獨每一個/每一種以及所列舉物件中的兩個或更多個/兩種或更多種的各種組合。除非從上下文中另外理解，否則與三個或更多個/三種或更多種所列舉物件結合的表述「和/或」應當被理解為具有相同的含義。 [0170]除非另外明確說明或從上下文中另外理解，否則術語「包括（include）」、「包括（includes）」、「包括（including）」、「具有（have）」、「具有（has）」、「具有（having）」、「含有（contain）」、「含有（contains）」或「含有（containing）」（包括其語法對等詞）的使用通常應當被理解為開放式和非限制性的，例如不排除另外的未列舉的要素或步驟。 [0171]除非另外明確說明，否則在數值之前使用術語「約」的情況下，本發明還包括具體的數值本身。如本文所用，除非另外指示或推斷，否則術語「約」是指與標稱值相差± 10%的變化。 [0172]如本文所用，除非另外指示，否則術語「抗體」意指包含至少一個與特定抗原特異性結合或相互作用的互補決定區（CDR）的任何抗原結合分子或分子複合物。應理解，所述術語涵蓋完整抗體（例如，完整單株抗體）或其片段（如抗體的Fc片段，例如單株抗體的Fc片段）或抗體的抗原結合片段（例如，單株抗體的抗原結合片段），包括已經修飾或工程化的完整抗體、其抗原結合片段或Fc片段。抗原結合片段的例子包括Fab、Fab'、(Fab') 2、Fv、單鏈抗體（例如，scFv）、微型抗體和雙抗體。已經修飾或工程化的抗體的例子包括嵌合抗體、人類化抗體和多特異性抗體（例如，雙特異性抗體）。所述術語還涵蓋免疫球蛋白單可變結構域，如奈米抗體（例如，V HH）。 [0173]天然存在的抗體通常包含四聚體。每種這樣的四聚體通常由兩個相同的多肽鏈對構成，每一對具有一條全長「輕」鏈（通常具有約25 kDa的分子量）和一條全長「重」鏈（通常具有約50-70 kDa的分子量）。如本文所用術語「重鏈」和「輕鏈」是指具有足以賦予對靶抗原的特異性的可變結構域序列的任何免疫球蛋白多肽。每條輕鏈和重鏈的胺基末端部分典型地包括約100至110個或更多個胺基酸的可變結構域，所述可變結構域通常負責抗原識別。每條鏈的羧基末端部分通常定義負責效應子功能的恒定結構域。因此，在天然存在的抗體中，全長重鏈免疫球蛋白多肽包含一個可變結構域（V H）和三個恒定結構域（C H1、C H2和C H3），其中V H結構域位於多肽的胺基末端並且C H3結構域位於羧基末端，並且全長輕鏈免疫球蛋白多肽包含一個可變結構域（V L）和一個恒定結構域（C L），其中V L結構域位於多肽的胺基末端並且C L結構域位於羧基末端。 [0174]通常將人輕鏈分類為κ和λ輕鏈，並且通常將人重鏈分類為μ、δ、γ、α或ε，並將抗體的同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有幾個亞類，包括但不限於IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有多個子類，包括但不限於IgM1和IgM2。將IgA類似地細分為多個子類，包括但不限於IgA1和IgA2。在全長輕鏈和重鏈內，可變結構域和恒定結構域通常通過約12個或更多個胺基酸的「J」區接合，並且重鏈還包括約10個或更多個胺基酸的「D」區。參見例如，Fundamental Immunology（Paul, W.,編輯, Raven Press, 第2版, 1989），出於所有目的將所述文獻通過引用以其整體併入。每個輕鏈/重鏈對的可變區通常形成抗原結合位點。天然存在的抗體的可變結構域通常展現出通過三個高變區（也稱為互補決定區或CDR）接合的相對保守的架構區（FR）的相同總體結構。來自每一對的兩條鏈的CDR通常通過架構區對齊，這可以使得能夠結合至特異性表位。從胺基末端到羧基末端，輕鏈和重鏈可變結構域二者通常均包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。 [0175]術語「CDR集」是指一組存在於能夠結合抗原的單一可變區中的三個CDR。這些CDR的確切邊界已根據不同系統以不同方式加以定義。由Kabat所述的系統（Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institutes of Health, 貝塞斯達, 馬里蘭州(1987) 和 (1991)）不僅提供適用於抗體的任何可變區的明確殘基編號系統，還提供定義三個CDR的準確殘基邊界。這些CDR可以被稱為Kabat CDR。Chothia和同事（Chothia和Lesk, 1987, J. Mol.Biol.196: 901-17；Chothia等人, 1989, Nature342: 877-83）發現，雖然在胺基酸序列水準上具有顯著多樣性，但是Kabat CDR內的某些子部分採用幾乎相同的肽骨架構形。這些子部分被命名為L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中「L」和「H」分別指定輕鏈和重鏈區域。這些區域可以被稱為Chothia CDR，它們具有與Kabat CDR重疊的邊界。定義與Kabat CDR重疊的CDR的其他邊界已由Padlan, 1995, FASEB J. 9: 133-39；MacCallum, 1996, J. Mol. Biol. 262(5): 732-45；以及Lefranc, 2003, Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77描述。仍有其他CDR邊界定義可能不嚴格遵循本文系統之一，但仍然會與Kabat CDR重疊，不過鑒於特定殘基或殘基組或甚至整個CDR不顯著影響抗原結合的預測或實驗發現，所述其他CDR邊界可能會被縮短或延長。本文所用的方法可以利用根據這些系統中的任一個系統定義的CDR，但是某些實施例使用Kabat或Chothia定義的CDR。使用胺基酸序列鑒定預測的CDR是本領域中熟知的，如在以下文獻中：Martin, A.C. 「Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains,」 In Antibody Engineering, 第2卷. Kontermann R., Dübel S. 編輯 Springer-Verlag, 柏林, 第33-51頁 (2010)。還可以通過其他常規方法（例如，通過與其他重鏈和輕鏈可變區的已知胺基酸序列進行比較以確定具有序列超變性的區域）來檢查重鏈和/或輕鏈可變結構域的胺基酸序列以鑒定CDR的序列。可以通過目測，或通過採用比對程式（如CLUSTAL程式套件中的一種）來比對已編號的序列，如以下文獻中所述：Thompson, 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4673-80。常規地使用分子模型來正確描繪架構區和CDR區，並且由此校正基於序列的比對。 [0176]如本文所用術語「Fc」是指包含得自抗體消化或通過其他手段產生的非抗原結合片段的序列的分子，所述分子呈單體或多聚體形式，並且所述「Fc」可以含有鉸鏈區。雖然天然Fc的原始免疫球蛋白來源優選地是人起源的，並且可以是任何免疫球蛋白，但是IgG1和IgG2是優選的。Fc分子由可通過共價（即，二硫鍵）和非共價締合連接成二聚體或多聚體形式的單體多肽構成。天然Fc分子的單體亞基之間的分子間二硫鍵的數目範圍從1至4，這取決於類別（例如，IgG、IgA和IgE）或子類（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1和IgGA2）。Fc的一個例子是由IgG的木瓜蛋白酶消化產生的二硫鍵鍵合的二聚體。如本文所用的術語「天然Fc」是單體、二聚體和多聚體形式通用的。 [0177]F(ab)片段典型地包括一條輕鏈以及一條重鏈的V H和C H1結構域，其中F(ab)片段的V H-C H1重鏈部分無法與另一個重鏈多肽形成二硫鍵。如本文所用，F(ab)片段也可以包括含有被胺基酸連接子隔開的兩個可變結構域的一條輕鏈，以及含有被胺基酸連接子隔開的兩個可變結構域和C H1結構域的一條重鏈。 [0178]F(ab')片段典型地包括一條輕鏈和含有更多恒定區的一條重鏈的一部分（在C H1與C H2結構域之間），使得可以在兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab') 2分子。 [0179]如這裡所用，「與X結合的抗體」（即，X是特定抗原）或「抗X抗體」是特異性識別抗原X的抗體。 [0180]如本文所用，「包埋的鏈間二硫鍵」或「鏈間包埋的二硫鍵」是指多肽上的這樣的二硫鍵，其不易被水溶性還原劑接近或有效地「包埋」在多肽的疏水區中，使得它既不能用於還原劑，也不能用於與其他親水PEG接合。包埋的鏈間二硫鍵進一步描述於WO 2017096361A1中，將其通過引用以其整體而併入。 [0181]如本文所用，LNP的靶向遞送的特異性由接受所遞送的核酸的造血幹細胞（HSC）（例如，中靶遞送）的百分比與不意在成為所述遞送的目標但接受所遞送的核酸的不希望的或非靶向的細胞類型（例如，脫靶遞送）的百分比之間的比率來定義。例如，當更多的HSC接受所遞送的核酸時，和/或當更少的其他類型的細胞接受所遞送的核酸時，特異性更高。LNP的靶向遞送的特異性也可以定義為被遞送至HSC的核酸的量（例如，中靶遞送）與被遞送至其他類型的細胞的核酸的量（例如，脫靶遞送）的比率。可以使用任何合適的方法確定遞送的特異性。作為非限制性例子，可以測量核酸在HSC中的表現水準，並且將其與核酸在不意在成為所述遞送的目標的另一細胞類型中的表現水準進行比較。 [0182]如本文所用，人類化抗體是這樣的抗體，其是完全或部分非人起源的，並且其蛋白質序列已經被修飾以替換某些胺基酸，例如出現在來自人的抗體序列中的VH和VL結構域的架構區中的一個或多個相應位置處的胺基酸，以增加其與在人中天然產生的抗體的相似性，以便避免或最小化人的免疫應答。例如，使用基因工程技術，可以將目的非人抗體的可變結構域與人抗體的恒定結構域組合。人類化抗體的恒定結構域在很多時候是人CH和CL結構域。 [0183]如本文所用，術語「間隔物」或「連接子」表示將兩種或更多種多肽或蛋白質融合在一起形成單一分子的肽。使用間隔物來連接兩種或更多種（多）肽是本領域熟知的。表C中示出了另外的示例性肽間隔物。一類常用的肽間隔子稱為「Gly-Ser」或「GS」間隔子。這些是基本上由甘胺酸（G）和絲胺酸（S）殘基組成的間隔物，並且通常包含肽基序的一個或多個重複，所述肽基序如GGGGS（SEQ ID NO: 45）基序（例如，具有式(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n可以是1、2、3、4、5、6、7或更大）。此類GS間隔物的一些常用的例子是9GS間隔物（GGGGSGGGS，SEQ ID NO: 48）、15GS間隔物（n = 3）和35GS間隔物（n = 7）。例如，參考Chen等人 2013（Adv. Drug Deliv. Rev. 65(10): 1357-1369）和Klein等人 2014（Protein Eng. Des. Sel. 27 (10): 325-330）。 [0184]如本文所用，術語「結構脂質」是指固醇，並且還指代含有固醇部分的脂質。 [0185]應當理解，步驟的順序或進行某些動作的順序是無關緊要的，只要本發明保持可操作即可。此外，可以同時進行兩個或更多個步驟或動作。 [0186]在本說明書中的各個地方，取代基以組或以範圍公開。特別地，本說明書旨在包括此類組和範圍的成員的每個單獨的子組合。例如，術語「C 1-6烷基」具體旨在單獨公開C 1、C 2、C 3、C 4、C 5、C 6、C 1-C 6、C 1-C 5、C 1-C 4、C 1-C 3、C 1-C 2、C 2-C 6、C 2-C 5、C 2-C 4、C 2-C 3、C 3-C 6、C 3-C 5、C 3-C 4、C 4-C 6、C 4-C 5和C 5-C 6烷基。通過舉其他例子的方式，在0至40範圍內的整數具體旨在單獨公開0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40，並且在1至20範圍內的整數具體旨在單獨公開1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。 [0187]除非要求保護，否則在本文中使用任何和所有例子或示例性語言（例如，「如」或「包括」）均僅旨在更好地說明本發明，並不對本發明的範圍施加任何限制。在本說明書中的任何語言均不應當被解釋為指示任何未要求保護的要素為實踐本發明所必需。 [0188]在整個說明書中，在組合物和套組被描述為具有、包括或包含特定組分的情況下，或者在過程和方法被描述為具有、包括或包含特定步驟的情況下，設想了另外存在基本上由所列舉的組分組成或由所列舉的組分組成的本發明的組合物和套組，以及存在基本上由所列舉的處理步驟組成或由所列舉的處理步驟組成的根據本發明的過程和方法。 [0189]一般情況下，除非另外說明，否則指定百分比的組合物是按重量計的。進一步地，如果變數沒有伴隨定義，則以所述變數的先前定義為准。 II. 脂質奈米粒子組合物 [0190]本發明提供了脂質奈米粒子（LNP）組合物，所述脂質奈米粒子組合物包含本文所述的可電離陽離子脂質和/或本文所述的脂質-HSC靶向基團接合物（例如脂質-抗體接合物）。在某些實施例中，所述LNP可以包含本文所述的可電離陽離子脂質以及固醇、中性磷脂、PEG-脂質和脂質-免疫細胞靶向基團接合物中的一種或多種。在一些實施例中，所述LNP包含脂質共混物，所述脂質共混物包含可電離陽離子脂質以及固醇、中性磷脂、PEG-脂質和脂質-HSC靶向基團接合物（例如脂質-抗體接合物）中的一種或多種。 (a) 可電離陽離子脂質 [0191]在一些實施例中，本文提供的脂質奈米粒子組合物包含可電離陽離子脂質。當在脂質奈米粒子組合物中使用時，此類可電離陽離子脂質可以促進佈置於其中的有效載荷（例如核酸，如DNA或RNA，如mRNA）遞送至細胞（例如哺乳動物細胞，例如造血幹細胞（HSC））。此類可電離陽離子脂質已經被設計成能夠將核酸（例如，mRNA）細胞內地遞送至靶細胞類型的胞質區室並快速降解成無毒組分。所述可電離陽離子脂質的複雜功能是通過可電離脂質頭基、疏水「醯基尾」基團和連接所述頭基和所述醯基尾基團的連接子的化學與幾何形狀之間的相互作用來促進的。通常，所述可電離胺頭基的pK a被設計成在6-8的範圍內，如在6.2-7.4之間或在6.7-7.2之間，使得它在酸性配製條件（例如，pH 4 - pH 5.5）下保持是強陽離子的，在生理pH（7.4）下保持是中性或弱陰離子的，並且在早期和晚期內體區室（例如，pH 5.5 - pH 7）中保持是陽離子的。所述醯基尾基團在所述脂質奈米粒子與內體膜的融合和通過結構擾動進行的膜失穩中起關鍵作用。所述醯基尾的三維結構（由其長度、不飽和度和位點決定）以及所述頭基和尾基的相對大小被認為在促進膜融合中起作用，因此在脂質奈米粒子內體逃逸（核酸有效載荷的胞質遞送的關鍵要求）中起作用。連接所述頭基和醯基尾基團的連接子被設計成通過生理上普遍存在的酶（例如，酯酶或蛋白酶）或通過酸催化的水解來降解。 [0192]在一些實施例中，本文提供的脂質奈米粒子組合物包含由式 (II') 表示的可電離陽離子脂質： (II')， 或其鹽，其中： R 1、R 2和R 3各自獨立地是鍵或C 1-3伸烷基； R 1A、R 2A和R 3A各自獨立地是鍵或C 1-10伸烷基； R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2和R 3A3各自獨立地是H、C 1-20烷基、C 1-20烯基、-(CH 2) 0-10C(O)OR a1或(CH 2) 0-10OC(O)R a2； R a1和R a2各自獨立地是C 1-20烷基或C 1-20烯基； R 3B是 ； R 3B1是C 1-6伸烷基；並且 R 3B2和R 3B3各自獨立地是H或任選地被一個或多個各自獨立地選自-OH和-O-(C 1-6烷基)的取代基取代的C 1-6烷基。 [0193]本文提供的任何變數或取代基未被取代或被一個或多個取代基取代。在一些實施例中，本文提供的任何變數或取代基是任選地經取代的。在一些實施例中，本文提供的任何變數或取代基任選地被一個或多個獨立地選自以下的取代基取代：-OR s1、-NR s2R s3、-C(O)R s4、-C(O)OR s5、C(O)NR s6R s7、-OC(O)R s8、-OC(O)OR s9、-OC(O)NR s10R 11、-NR s12C(O)R s13和-NR s14C(O)OR s15，其中R s1、R s2、R s3、R s4、R s5、R s6、R s7、R s8、R s9、R s10、R s11、R s12、R s13、R s14和R s15各自獨立地是H、C 1-6烷基、C 3-10環烷基、C 6-14芳基、5元至10元雜芳基或3元至10元雜環基，其各自是任選地經取代的。 [0194]在一些實施例中，R 1、R 2和R 3各自獨立地是鍵或C 1-3伸烷基。在一些實施例中，R 1、R 2和R 3各自獨立地是鍵或伸甲基。在一些實施例中，R 1和R 2各自是伸甲基並且R 3是鍵。在一些實施例中，R 1、R 2和R 3各自是伸甲基。在一些實施例中，R 1、R 2和R 3各自獨立地是未取代的或取代的。 [0195]在一些實施例中，R 1A、R 2A和R 3A各自獨立地是鍵或C 1-10伸烷基。在一些實施例中，R 1A、R 2A和R 3A各自獨立地是鍵或-(CH 2) 1-10-。在一些實施例中，R 1A和R 2A各自獨立地是鍵、-CH 2-、-(CH 2) 2-、-(CH 2) 3-、-(CH 2) 4-、-(CH 2) 5-、-(CH 2) 6-、-(CH 2) 7-或-(CH 2) 8-。在一些實施例中，R 1A和R 2A各自是鍵，各自是-CH 2-，各自是-(CH 2) 2-，各自是-(CH 2) 3-，各自是-(CH 2) 4-，各自是-(CH 2) 5-，各自是-(CH 2) 6-，各自是-(CH 2) 7-，或各自是-(CH 2) 8-。在一些實施例中，R 1A和R 2A各自獨立地是鍵、-(CH 2) 2-、-(CH 2) 4-、-(CH 2) 6-、-(CH 2) 7-或-(CH 2) 8-。在一些實施例中，R 1A和R 2A各自是鍵，各自是-(CH 2) 2-，各自是-(CH 2) 4-，各自是-(CH 2) 6-，各自是-(CH 2) 7-，或各自是-(CH 2) 8-。在一些實施例中，R 3A是鍵、-CH 2-、-(CH 2) 2-或-(CH 2) 7-。在一些實施例中，R 1A、R 2A和R 3A各自獨立地是未取代的或取代的。 [0196]在一些實施例中，R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2和R 3A3各自獨立地是H、C 1-20烷基、C 1-20烯基、-(CH 2) 0-10C(O)OR a1或(CH 2) 0-10OC(O)R a2。在一些實施例中，R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2和R 3A3各自獨立地是H、C 1-15烷基、-CH=CH-(C 1-15烷基)、-CH=CH-CH 2-CH=CH-(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)、-(CH 2) 0-4OC(O)CH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-15烷基)或-(CH 2) 0-4OC(O)CH 2(C 1-15烷基)。在一些實施例中，R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2和R 3A3各自獨立地是未取代的或取代的。 [0197]在一些實施例中，R 1A1和R 2A1各自獨立地是-CH=CH-(C 1-15烷基)、-CH=CH-CH 2-CH=CH-(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)或-(CH 2) 0-4OC(O)CH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)；並且R 1A2、R 1A3、R 2A2和R 2A3各自是H。在一些實施例中，R 1A1和R 2A1各自是 、 、 、 、 、 或 。 [0198]在一些實施例中，R 1A1和R 2A1各自是C 1-15烷基；R 1A2和R 2A2各自是C 1-15烷基；並且R 1A3和R 2A3各自是H。在一些實施例中，R 1A1 和R 2A1各自是 ；並且R 1A2和R 2A2各自是 。 [0199]在一些實施例中，R 1A1和R 2A1各自是-(CH 2) 0-4OC(O)CH 2(C 1-15烷基)；R 2A1和R 2A2各自是-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-15烷基)；並且R 1A3和R 2A3各自是H。在一些實施例中，R 1A1和R 2A1各自是 ；並且R 2A1和R 2A2各自是 。 [0200]在一些實施例中，R 1A1和R 2A1各自是-C(O)OCH 2(C 1-15烷基)；R 1A2和R 2A2各自是-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-15烷基)；並且R 1A3和R 2A3各自是H。在一些實施例中，R 1A1和R 2A1各自是 ；並且R 1A2和R 2A2各自是 。 [0201]在一些實施例中，R 3A1、R 3A2和R 3A3各自獨立地是H、C 1-15烷基、-(CH 2) 0-4C(O)OCH(C 1-5烷基)(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4OC(O)CH(C 1-5烷基)(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-10烷基)或-(CH 2) 0-4OC(O)CH 2(C 1-10烷基)。 [0202]在一些實施例中，R 3A1和R 3A2各自獨立地是C 1-15烷基；並且R 3A3是H。在一些實施例中，R 3A1和R 3A2各自獨立地是乙基、 、 、 或 。 [0203]在一些實施例中，R 3A1是C 1-15烷基；並且R 3A2和R 3A3各自是H。在一些實施例中，R 3A1是 。 [0204]在一些實施例中，R 3A1是-C(O)OCH(C 1-5烷基)(C 1-10烷基)；並且R 3A2和R 3A3各自是H。在一些實施例中，R 3A1是 或 。 [0205]在一些實施例中，R 3A1是-(CH 2) 0-4OC(O)CH 2(C 1-10烷基)；R 3A2是-(CH 2) 0-4(O)OCH 2(C 1-10烷基)；並且R 3A3是H。在一些實施例中，R 3A1是 或 ；並且R 3A2是 。 [0206]在一些實施例中，R 3A1是-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-10烷基)；R 3A2是-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-10烷基)；並且R 3A3是H。在一些實施例中，R 3A1是 ；並且R 3A2是 。 [0207]在一些實施例中，R 3A1、R 3A2和R 3A3各自是H。 [0208]R a1和R a2各自獨立地是C 1-20烷基或C 1-20烯基。在一些實施例中，R a1和R a2各自獨立地是-(CH 2) 0-15CH 3或-CH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)。在一些實施例中，R a1和R a2各自獨立地是 、 、 、 、 、 、 、 或 ，其各自是任選地經取代的。在一些實施例中，R a1和R a2各自獨立地是未取代的或取代的。 [0209]在一些實施例中，R 3B是 。在一些實施例中，R 3B是H。在一些實施例中，R 3B是未取代的或取代的。 [0210]在一些實施例中，R 3B1是C 1-6伸烷基。在一些實施例中，R 3B1是亞乙基或亞丙基。在一些實施例中，R 3B1是未取代的或取代的。在一些實施例中，R 3B1是任選地經取代的。 [0211]在一些實施例中，R 3B2和R 3B3各自獨立地是任選地經取代的。在一些實施例中，R 3B2和R 3B3各自獨立地是H或任選地被一個或多個各自獨立地選自-OH和-O-(C 1-6烷基)的取代基取代的C 1-6烷基。在一些實施例中，R 3B2和R 3B3各自獨立地是H或任選地被一個或多個各自獨立地選自以下的取代基取代的C 1-6烷基：-OR s1、-NR s2R s3、-C(O)R s4、-C(O)OR s5、C(O)NR s6R s7、-OC(O)R s8、-OC(O)OR s9、-OC(O)NR s10R 11、-NR s12C(O)R s13和-NR s14C(O)OR s15，其中R s1、R s2、R s3、R s4、R s5、R s6、R s7、R s8、R s9、R s10、R s11、R s12、R s13、R s14和R s15各自獨立地是H、C 1-6烷基、C 3-10環烷基、C 6-14芳基、5元至10元雜芳基或3元至10元雜環基，其各自是任選地經取代的。在一些實施例中，R 3B2和R 3B3各自獨立地是H、甲基、乙基、丙基、丁基或戊基，其各自任選地被一個或多個各自獨立地選自-OH和-O-(C 1-6烷基)的取代基取代。在一些實施例中，R 3B2和R 3B3各自獨立地是甲基或乙基，其各自任選地被一個或多個-OH取代。在一些實施例中，R 3B2和R 3B3各自是甲基或各自是乙基，其各自任選地被一個或多個-OH取代。在一些實施例中，R 3B2和R 3B3各自是未取代的甲基。 [0212]在一些實施例中， 是 、 、 、 或 ，其各自是任選地經取代的。 [0213]在一些實施例中，本文提供的脂質奈米粒子組合物包含由式 (IIa) 表示的可電離陽離子脂質： (IIa)， 或其鹽，其中R 1A、R 2A、R 3A、R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2、R 3A3、R 3B1、R 3B2和R 3B3如針對式 (II’)、式 (II) 或其任何變體或實施例所定義的。 [0214]在一些實施例中，本文提供的脂質奈米粒子組合物包含由式 (IIb) 表示的可電離陽離子脂質： (IIb)， 或其鹽，其中R 1A、R 2A、R 3A、R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2和R 3A3如針對式 (II’)、式 (II) 或其任何變體或實施例所定義的。 [0215]在一些實施例中，本文提供的脂質奈米粒子組合物包含下式的可電離陽離子脂質： 或其鹽。 [0216]在一些實施例中，本文提供的脂質奈米粒子組合物包含下式的可電離陽離子脂質： 或其鹽。 [0217]在一些實施例中，本文提供的脂質奈米粒子組合物包含下式的可電離陽離子脂質： 或其鹽。 [0218]在一些實施例中，本文提供的脂質奈米粒子組合物包含由式IIIa或式IIIb表示的可電離陽離子脂質： (式IIIa) (式IIIb)， 或其鹽，其中： R 1’和R 2’獨立地是C 1-3烷基，或者R 1’和R 2’與氮原子一起形成任選取代的哌啶基或嗎啉基； Y選自-O-、-OC(O)-、-OC(S)-和-CH 2-； X 1、X 2、X 3和X 4是氫，或者X 1和X 2或X 3和X 4獨立地一起形成側氧基； n是0或3； o和p獨立地是選自2-6的整數。 [0219]在一些實施例中，本文提供的脂質奈米粒子組合物包含由式IIIa表示的可電離陽離子脂質。在一些實施例中，本文提供的脂質奈米粒子組合物包含由式IIIb表示的可電離陽離子脂質。 [0220]在一些實施例中，所述IIIa的化合物不是選自以下的化合物： ， ， ， ， ，以及 ，或其鹽。 [0221]在某些實施例中，o和p可以是2。在某些實施例中，o和p可以是3。在其他實施例中，o和p可以是4。在一些實施例中，o和p可以是5。在其他實施例中，o和p可以是6。 [0222]在某些實施例中，X 1和X 2可以一起形成側氧基，並且X 3和X 4一起形成側氧基。在其他實施例中，X 1、X 2、X 3和X 4可以是氫。 [0223]在某些實施例中，Y可以選自-O-、-OC(O)-、OC(S)-和-CH 2-。例如，在某些實施例中，Y可以是-O-。在某些實施例中，Y可以是-OC(O)-。在某些實施例中，Y可以是-CH 2-。在某些實施例中，Y可以是-OC(S)-。 [0224]在某些實施例中，R 1’和R 2’可以獨立地是C 1-3烷基。在其他實施例中，R 1’和R 2’可以是-CH 3。在某些實施例中，R 1’和R 2’是-CH 2CH 3。在某些實施例中，R 1’和R 2’是C 3烷基。 [0225]在某些實施例中，n可以是0。在其他實施例中，n可以是3。 [0226]本文還部分地提供了由式IV表示的化合物： (式IV)， 或其鹽，其中： R 1’和R 2’獨立地是C 1-3烷基，或者R 1’和R 2’與氮原子一起形成任選取代的哌啶基或嗎啉基； Y選自-O-、-OC(O)-、-OC(S)-和-CH 2-； X 1、X 2、X 3和X 4是氫，或者X 1和X 2或X 3和X 4一起形成側氧基； n是0-4； o是1並且r是選自3-8的整數，或者o是2並且r是選自1-8的整數， p是1並且s是選自3-8的整數，或者p是2並且s是選自1-8的整數， 其中， 當o和p兩者均是1時，r和s獨立地是4、5、7或8，並且 當o和p兩者均是2時，r和s獨立地是1、2、4或5。 [0227]在某些實施例中，X 1和X 2可以一起形成側氧基，並且X 3和X 4可以一起形成側氧基。在其他實施例中，X 1、X 2、X 3和X 4可以是氫。 [0228]在某些實施例中，Y可以選自-O-、-OC(O)-和-CH 2-。例如，在某些實施例中，Y可以是-O-。在某些實施例中，Y可以是-OC(O)-。在某些實施例中，Y可以是-CH 2-。在某些實施例中，Y可以是-OC(S)-。 [0229]在某些實施例中，R 1’和R 2’可以獨立地是C 1-3烷基。在其他實施例中，R 1’和R 2’可以是-CH 3。在某些實施例中，R 1’和R 2’可以是-CH 2CH 3。在一些實施例中，R 1’和R 2’可以是C 3烷基。在某些實施例中，R 1’和R 2’與氮原子一起形成任選取代的哌啶基。 [0230]在某些實施例中，n可以是0。在其他實施例中，n可以是3。 [0231]在一些實施例中，本文提供的脂質奈米粒子組合物包含選自以下的可電離陽離子脂質： ， ， ， ， ， ，以及 ， 或其鹽。 [0232]在一些實施例中，本文提供的脂質奈米粒子組合物包含下式的可電離陽離子脂質： ， 或其鹽。 [0233]在一些實施例中，本文提供的脂質奈米粒子組合物包含下式的可電離陽離子脂質： ， 或其鹽。 [0234]在一些實施例中，本文提供的脂質奈米粒子組合物包含下式的可電離陽離子脂質： ， 或其鹽。 [0235]在一些實施例中，本文提供的脂質奈米粒子組合物包含下式的可電離陽離子脂質： ， 或其鹽。 [0236]在一些實施例中，本文提供的脂質奈米粒子組合物包含下式的可電離陽離子脂質： ， 或其鹽。 [0237]在一些實施例中，本文提供的脂質奈米粒子組合物包含下式的可電離陽離子脂質： ， 或其鹽。 [0238]在一些實施例中，本文提供的脂質奈米粒子組合物包含下式的可電離陽離子脂質： ， 或其鹽。 [0239]在一些實施例中，本文提供的脂質奈米粒子組合物包含式V的可電離陽離子脂質： (式V)， 或其鹽，其中： R 1’和R 2’獨立地是C 1-3烷基，或者R 1’和R 2’與氮原子一起形成任選取代的哌啶基或嗎啉基； Y選自-O-、-OC(O)-、-OC(S)-和-CH 2-； X 1、X 2、X 3和X 4是氫，或者X 1和X 2或X 3和X 4一起形成側氧基；並且 n是選自0-4的整數。 [0240]在某些實施例中，X 1和X 2可以一起形成側氧基，並且X 3和X 4可以一起形成側氧基。在其他實施例中，X 1、X 2、X 3和X 4可以是氫。 [0241]在某些實施例中，Y可以選自-O-、-OC(O)-和-CH 2-。例如，在某些實施例中，Y可以是-O-。在某些實施例中，Y可以是-OC(O)-。在某些實施例中，Y可以是-CH 2-。在某些實施例中，Y可以是-OC(S)-。 [0242]在某些實施例中，R 1’和R 2’可以獨立地是C 1-3烷基。在其他實施例中，R 1’和R 2’可以是-CH 3。在某些實施例中，R 1’和R 2’可以是-CH 2CH 3。在一些實施例中，R 1’和R 2’可以是C 3烷基。在某些實施例中，R 1’和R 2’與氮原子一起形成任選取代的哌啶基。 [0243]在某些實施例中，n可以是0。在其他實施例中，n可以是3。 [0244]在一些實施例中，本文提供的脂質奈米粒子組合物包含下式的可電離陽離子脂質： ， 或其鹽。 方案 S1 - 用於製備式 (IIIa) 的脂質的合成方案 [0245]可以例如根據方案S1製備式IIIa的化合物。將羥基官能團保護的丙二醇轉化為相應的二甲基胺基官能醚（Y = 側氧基）或酯（Y = O-C(O)）。醚鍵的形成是由烷基鹵化物與醇在三級丁基碘化銨/NaOH存在下在THF中在80ºC進行反應引起的。酯鍵的形成利用在碳二亞胺活化（DCM、EDC、DIEPA、DMAP）下用醇處理酸官能團二甲胺。二醇脫保護產生鄰二醇中間體，隨後分別通過用TBAI/NaOH和溴醯處理或通過碳二亞胺介導的羧酸活化以形成酯鍵，將其轉化為相應的醚連接或酯連接的二醯基脂質。 方案 S2 - 用於製備式 (IV) 的脂質組合物的合成方案 [0246]可以例如根據方案S2製備式IV的化合物。所述合成程序如上針對方案S1所概述；然而，在方案S2中，雙不飽和醯基或單不飽和醯基可以用於獲得式IV的脂質。 [0247]在一些實施例中，用於本公開文本的LNP中的可電離陽離子脂質選自 表 A中的脂質或其組合。在一些實施例中，所述可電離陽離子脂質是： ，或 。 [0248]在一些實施例中，用於本公開文本的LNP中的可電離陽離子脂質是式 (KC3) 的化合物： (KC3)， 或其鹽。本文提及「KC3」或「脂質KC3」是指式 (KC3) 的化合物或其鹽。本文提及的「KC3 LNP」是指包含式 (KC3) 的化合物或其鹽的脂質奈米粒子。 表 A ：示例性可電離陽離子脂質。
（脂質1）
（脂質2）
（脂質3）
（脂質4）
（脂質5）
（脂質6）
（脂質7）
（脂質8）
（脂質9）
（脂質10）
（脂質11）
（脂質12）
（脂質13）
（脂質14）
（脂質15）
（脂質16）
（脂質17）
（脂質18）
（脂質19）
（脂質20）
（脂質21）
（脂質22）
（脂質23）
（脂質24）
（脂質25）
（脂質31）
（脂質32）
（脂質33）
（脂質34）
（脂質35）
（脂質36）
（脂質37）
（脂質38）
(KC3)
[0249]在一些實施例中，所述可電離陽離子脂質不是Dlin-MC3-DMA。 [0250]在某些實施例中，本文所述的可電離陽離子脂質可以以30-70莫耳百分比、30-60莫耳百分比、30-50莫耳百分比、40-70莫耳百分比、40-60莫耳百分比、40-50莫耳百分比、50-70莫耳百分比、50-60莫耳百分比的範圍，或者約30莫耳百分比、約35莫耳百分比、約40莫耳百分比、約45莫耳百分比、約50莫耳百分比、約55莫耳百分比、約60莫耳百分比、約65莫耳百分比或約70莫耳百分比存在於所述LNP或所述脂質共混物中。 (b) 固醇 [0251]在某些實施例中，所述LNP或脂質共混物可以包含固醇組分，所述固醇組分可以包含例如膽固醇、岩藻甾醇、β-麥固醇、麥角固醇、菜油甾醇、豆固醇、豆甾烷醇或菜籽固醇。在某些實施例中，所述固醇是膽固醇。 [0252]所述固醇（例如，膽固醇）可以以20-70莫耳百分比、20-60莫耳百分比、20-50莫耳百分比、30-70莫耳百分比、30-60莫耳百分比、30-50莫耳百分比、40-70莫耳百分比、40-60莫耳百分比、40-50莫耳百分比、50-70莫耳百分比、50-60莫耳百分比的範圍，或者約20莫耳百分比、約25莫耳百分比、約30莫耳百分比、約35莫耳百分比、約40莫耳百分比、約45莫耳百分比、約50莫耳百分比、約55莫耳百分比、約60莫耳百分比或約65莫耳百分比存在於所述LNP或所述脂質共混物中。 (c) 中性磷脂 [0253]在一些實施例中，所述LNP或所述脂質共混物可以包含一種或多種本文所述的中性磷脂。在某些實施例中，所述一種或多種中性磷脂可以包括例如磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DSPE）、1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DSPC）、氫化大豆磷脂醯膽鹼（HSPC）、1,2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）或1,2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DOPC）、鞘磷脂（SM）。 [0254]中性磷脂包括例如二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（DSPE）、二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（DMPE）、二硬脂醯-甘油-磷酸膽鹼（DSPC）、氫化大豆磷脂醯膽鹼（HSPC）、二油醯-甘油-磷酸乙醇胺（DOPE）、二亞油醯-甘油-磷酸膽鹼（DLPC）、二肉豆蔻醯-甘油-磷酸膽鹼（DMPC）、二油醯-甘油-磷酸膽鹼（DOPC）、二棕櫚醯-甘油-磷酸膽鹼（DPPC）、二十一烷醯-甘油-磷酸膽鹼（DUPC）、棕櫚醯-油醯-甘油-磷酸膽鹼（POPC）、二十八烯基-甘油-磷酸膽鹼、油醯-膽固醇基半琥珀醯-甘油-磷酸膽鹼、十六基-甘油-磷酸膽鹼、二亞麻醯-甘油-磷酸膽鹼、二花生四烯醯-甘油-3-磷酸膽鹼、二二十二碳六烯醯-甘油-磷酸膽鹼或鞘磷脂。 [0255]所述中性磷脂可以以1-10莫耳百分比、1-15莫耳百分比、1-12莫耳百分比、1-10莫耳百分比、3-15莫耳百分比、3-12莫耳百分比、3-10莫耳百分比、4-15莫耳百分比、4-12莫耳百分比、4-10莫耳百分比、4-8莫耳百分比、5-15莫耳百分比、5-12莫耳百分比、5-10莫耳百分比、6-15莫耳百分比、6-12莫耳百分比、6-10莫耳百分比的範圍，或者約1莫耳百分比、約2莫耳百分比、約3莫耳百分比、約4莫耳百分比、約5莫耳百分比、約6莫耳百分比、約7莫耳百分比、約8莫耳百分比、約9莫耳百分比、約10莫耳百分比、約11莫耳百分比、約12莫耳百分比、約13莫耳百分比、約14莫耳百分比或約15莫耳百分比存在於所述LNP或所述脂質共混物中。 (d) PEG- 脂質 [0256]所述LNP或所述脂質共混物可以包括一種或多種聚乙二醇（PEG）或PEG修飾的脂質。此類種類可以可替代地稱為聚乙二醇化脂質。PEG脂質是用聚乙二醇修飾的脂質。如上面所指出的，當脂質-HSC靶向基團接合物（例如抗體接合物）被包括在所述LNP或脂質共混物中時，游離PEG-脂質可以被包括在所述LNP或所述脂質共混物中，以減少或消除經由靶向基團進行的非特異性結合。 [0257]所述一種或多種PEG脂質可以包括例如PEG修飾的磷脂醯乙醇胺、PEG修飾的磷脂酸、PEG修飾的神經醯胺、PEG修飾的二烷基胺、PEG修飾的二醯基甘油和PEG修飾的二烷基甘油。例如，PEG脂質可以是PEG-二油醯甘油（PEG-DOG）、PEG-二肉豆蔻醯-甘油（PEG-DMG）、PEG-二棕櫚醯-甘油（PEG-DPG）、PEG-二亞油醯-甘油-磷脂醯乙醇胺（PEG-DLPE）、PEG-二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DMPE）、PEG-二棕櫚醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DPPE）、PEG-二硬脂醯甘油（PEG-DSG）、PEG-二醯基甘油（PEG-DAG，例如PEG-DMG、PEG-DPG和PEG-DSG）、PEG-神經醯胺、PEG-二硬脂醯-甘油-磷酸甘油（PEG-DSPG）、PEG-二油醯-甘油-磷酸乙醇胺（PEG-DOPE）、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-雙十四烷基乙醯胺或PEG-二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DSPE）脂質。 [0258]在某些實施例中，所述LNP或所述脂質共混物可以含有一種或多種游離PEG-脂質，其可以包括例如PEG-二硬脂醯甘油（PEG-DSG）、PEG-二醯基甘油（PEG-DAG，例如PEG-DMG、PEG-DPG和PEG-DSG）、PEG-二肉豆蔻醯-甘油（PEG-DMG）、PEG-二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DSPE）和PEG-二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DMPE）。在一些實施例中，所述游離PEG-脂質包括二醯基磷脂醯膽鹼，其包含二棕櫚醯（C16）鏈或二硬脂醯（C18）鏈。 [0259]所述PEG-脂質可以以1-10莫耳百分比、1-8莫耳百分比、1-7莫耳百分比、1-6莫耳百分比、1-5莫耳百分比、1-4莫耳百分比、1-3莫耳百分比、2-8莫耳百分比、2-7莫耳百分比、2-6莫耳百分比、2-5莫耳百分比、2-4莫耳百分比、2-3莫耳百分比的範圍，或者約1莫耳百分比、約2莫耳百分比、約3莫耳百分比、約4莫耳百分比或約5莫耳百分比存在於所述LNP或所述脂質共混物中。在一些實施例中，所述PEG-脂質是游離PEG-脂質。 [0260]在一些實施例中，所述PEG-脂質可以以0.01-10莫耳百分比、0.01-5莫耳百分比、0.01-4莫耳百分比、0.01-3莫耳百分比、0.01-2莫耳百分比、0.01-1莫耳百分比、0.1-10莫耳百分比、0.1-5莫耳百分比、0.1-4莫耳百分比、0.1-3莫耳百分比、0.1-2莫耳百分比、0.1-1莫耳百分比、0.5-10莫耳百分比、0.5-5莫耳百分比、0.5-4莫耳百分比、0.5-3莫耳百分比、0.5-2莫耳百分比、0.5-1莫耳百分比、1-2莫耳百分比、3-4莫耳百分比、4-5莫耳百分比、5-6莫耳百分比或1.25-1.75莫耳百分比的範圍存在於所述LNP或所述脂質共混物中。在一些實施例中，所述PET-脂質可以占所述脂質共混物約0.5莫耳百分比、約1莫耳百分比、約1.5莫耳百分比、約2莫耳百分比、約2.5莫耳百分比、約3莫耳百分比、約3.5莫耳百分比、約4莫耳百分比、約4.5莫耳百分比、約5莫耳百分比或約5.5莫耳百分比。在一些實施例中，所述PEG-脂質是游離PEG-脂質。 [0261]在一些實施例中，PEG-脂質的脂錨鉤長度是C14（如在PEG-DMG中）。在一些實施例中，PEG-脂質的脂錨鉤長度是C16（如在DPG中）。在一些實施例中，PEG-脂質的脂錨鉤長度是C18（如在PEG-DSG中）。在一些實施例中，PEG-脂質的骨架或頭基是二醯基甘油或磷酸乙醇胺。在一些實施例中，所述PEG-脂質是游離PEG-脂質。 [0262]本公開文本的LNP可以包含一種或多種未與HSC靶向基團（例如，結合CD105和/或CD117的抗體）接合的游離PEG-脂質，以及與HSC靶向基團（例如，結合CD105和/或CD117的抗體）接合的PEG-脂質。在一些實施例中，所述游離PEG-脂質包含與脂質-HSC靶向基團接合物（例如脂質-抗體接合物）中的脂質相同或不同的脂質。 (e) HSC 靶向基團 [0263]如本文所討論的，可以將所述LNP靶向至特定細胞類型，例如造血幹細胞（HSC）。這可以通過使用本文所述的一種或多種脂質來實現。此外，靶向可以通過在LNP粒子的溶劑可及表面上包括HSC靶向基團來增強。例如，HSC靶向基團可以包括特異性結合對（例如，抗體-抗原對、配體-受體對等）的成員。在一些實施例中，所述HSC靶向基團是抗體。在某些實施例中，所述抗體結合HSC表面抗原，如CD105（也稱為內皮聯蛋白）和/或CD117（也稱為c-kit、酪胺酸-蛋白激酶KIT或肥大/幹細胞生長因子受體（SCFR））。可以例如通過使用本文所述的脂質-HSC靶向基團接合物（例如脂質-抗體接合物）來實現靶向。 [0264]任選地，所述HSC靶向基團是沒有Fc組分的抗體片段（例如，結合CD105和/或CD117的抗體片段）。scFv、Fab或VHH片段也可以直接與活化的PEG-脂質接合，以製成可插入的接合物。在一些實施例中，所述HSC靶向基團是包含scFv、Fab或VHH片段的抗體片段-脂質接合物。在一些實施例中，所述接合物的抗體片段直接與活化的PEG-脂質接合。 [0265]在一些實施例中，PEG-(脂質)等同於(脂質)-PEG。 [0266]在某些實施例中，HSC靶向基團可以是表面結合抗體或其表面結合抗原結合片段，其可以允許調節細胞靶向特異性。這特別有用，因為可以針對所需的靶向位點的目的表位產生高度特異性的抗體。在一個實施例中，可以將多種不同的抗體摻入並呈遞在LNP的表面，其中每種抗體與相同抗原上的不同表位或不同抗原上的不同表位結合。此類方法可以增加與特定靶細胞的靶向相互作用的親合力和特異性。 [0267]在一些實施例中，可以例如通過使用本文所述的脂質-HSC靶向基團接合物（例如脂質-抗體接合物）來實現靶向。示例性脂質-HSC靶向基團接合物（例如脂質-抗體接合物）可以包括式 (VI) 的化合物， [脂質] - [任選的連接子] - [HSC靶向基團，例如結合HSC表面抗原的抗體，例如結合CD105和/或CD117的抗體] (式VI)。 [0268]在某些實施例中，可以例如通過使用本文所述的脂質-HSC靶向基團接合物（例如脂質-抗體接合物）來實現靶向。示例性脂質-HSC靶向基團接合物（例如脂質-抗體接合物）可以包括式 (I) 的化合物， [脂質] - [任選的連接子] - [抗體]，(I)，其中所述抗體結合CD105和/或CD117 (式I)。 [0269]在一些實施例中，所述HSC靶向基團包括多肽，並且所述接合物（例如脂質-抗體接合物）的脂質與所述多肽的N末端、C末端或中間部分的任何位置接合。在一些實施例中，所述HSC靶向基團包括多肽，並且所述接合物的脂質與所述多肽的N末端接合。在一些實施例中，所述脂質與所述多肽的N末端接合。在一些實施例中，所述脂質與所述多肽的N末端與C末端之間的位置接合。在一些實施例中，所述HSC靶向基團包括抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段在所述抗體或其抗原結合片段的N末端、C末端或N末端與C末端之間的任何位置與所述脂質接合。在一些實施例中，所述HSC靶向基團包含與所述脂質接合的抗體或其抗原結合片段，其中所述脂質-抗體接合物的抗體或其抗原結合片段與CD105和/或CD117結合。 [0270]示例性抗CD105抗體包括例如TRC105（美國專利號US 20180311359A1）、muRH105（PCT申請號WO 2012149412A3）、43A3（Biolegend）、166707（Novus Biologicals）、MEM-229（Abcam）、MJ7/18（Ge A.Z等人, Cloning and expression of a cDNA encoding mouse endoglin, an endothelial cell TGF-β ligand」 Gene 1994;138(1-2):201-206）、OTI8A1（OriGene）、EPR19911-220（Sigma Aldrich）、3A9（Abcam）、MAB1320（R&D Systems）、GTX100508（GeneTex）、SN6（https://doi.org/10.1002/ijc.11551）、MEM-226（Thermo Fisher）、10862-1-AP（Proteintech）、JE60-59（Thermo Fisher）、103（Invitrogen）、ARC0446（Invitrogen）、PA5-111623（Invitrogen）、PA5-29555（Invitrogen）、PA5-80582（Invitrogen）、PA5-27205（Invitrogen）、PA5-117933（Invitrogen）、PA5-29554（Invitrogen）、2D5E8（Proteintech）、OTI3H5（OriGene）、OTI9E5（OriGene）、4C11（Thermo Fisher）、1E5（Abnova）、OTI6G8（OriGene）、QA19A14（Biolegend）、43A4E1（Miltenyi Biotec）、REA794（Miltenyi Biotec）、D50G1（Cell Signlaing）、AF1097（Novus Biologicals）、001（Novus Biologicals）、EPR10145-12（Abcam）、EPR10145-10（Abcam）、EPR19911（Abcam）、ENG/3269（Abcam）、P3D1（Santa Cruz）、P4A4（Santa Cruz）、2Q1707（Santa Cruz）、RM0030-6J9（Santa Cruz）、A-8（Santa Cruz）、8E11（Santa Cruz）及其抗原結合片段。在某些實施例中，所述抗CD105抗體包含選自以下的抗體的重鏈可變結構域（V H）和輕鏈可變結構域（V L）：EPR19911-220、GTX100508、PA5-111623、PA5-29555、PA5-80582、PA5-27205、PA5-117933、PA5-29554、AF1097、EPR10145-12、EPR10145-10、EPR19911和10862-1-AP。在某些實施例中，所述抗CD105抗體包含選自以下的抗體的V H和V L序列的重鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3以及輕鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3：EPR19911-220、GTX100508、AF1097、PA5-111623、PA5-29555、PA5-80582、PA5-27205、PA5-117933、PA5-29554、EPR10145-12、EPR10145-10、EPR19911和10862-1-AP，所述CDR由Kabat（參見Kabat等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH出版號91-3242, 貝塞斯達）、Chothia（參見例如，Choth, (1987), J. MOL. BIOL. 196: 901-917）、MacCallum（參見MacCallum R M等人, (1996) J. MOL. BIOL. 262: ia C & Lesk A M732-745）、或本領域已知的任何其他CDR確定方法確定。在一些實施例中，所述抗CD105抗體包含本文所述的任一種抗CD105抗體或本領域已知的其他抗CD105抗體的重鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3以及輕鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3。 [0271]示例性抗CD117抗體包括例如Ab58（PCT公開號WO 2019084067A1）、Ab67（PCT公開號WO 2019084067A1）、Ab55（PCT公開號WO 2019084067A1）、CK6（美國專利號US 8552157B2）、hSR-1（美國專利號US 7915391B2）、6LUN1、104D2（Biolegend）、A3C6E2（歐洲專利號EP0787743）、OTI3F9（OriGene）、BA7.3C.9（ATCC）、B-K15（OriGene）、2B8（美國專利申請號US 20160324982A1）、ACK2（Invitrogen）、K45（Blechmen J.等人, J Biol Chem 1993 Feb 25;268(6):4399-406）、YB5.B8（Ashman L.K.等人, 「Epitope mapping and functional studies with three monoclonal antibodies to the c-kit receptor tyrosine kinase, YB5.B8, 17F11, and SR-1」 J Cell Physiol 1994;158(3):545-554）、1C5（Thermo Fisher）、34-8800（Invitrogen）、PA5-14694（Invitrogen）、PA5-16458（Invitrogen）、PA5-16770（Invitrogen）、18696-1-AP（Proteintech）、HC34LC14（Thermo Fisher）、ST04-99（Invitrogen）、MA5-44656（Invitrogen）、YR145（Abcam）、EPR25707-134（Abcam）、YR145（Abcam）、D13A2（Cell Signaling）、Ab81（Cell Signaling）、2C11（Sigmaaldrich）、S18022G（Biolegend）、QA18A19（Biolegend）、W18195C（Biolegend）、A3C6E2（Biolegend）、AF1356（R&D Systems）、AF332（R&D Systems）、MAB332（R&D Systems）、AF3267（R&D Systems）、E-3（Santa-Cruz）、E-1（Santa-Cruz）、H-10（Santa-Cruz）、3C11（Santa-Cruz）、3H1825（Santa-Cruz）、C-14（Santa-Cruz）、47233（Novus Biologicals）、NBP2-45508（Novus Biologicals）、NBP2-52975（Novus Biologicals）、AF3267（Novus Biologicals）、NBP2-34487（Novus Biologicals）、NBP1-85593（Novus Biologicals）及其抗原結合片段。在某些實施例中，所述抗CD117抗體包含選自以下的抗體的重鏈可變結構域（V H）和輕鏈可變結構域（V L）：PA5-14694、PA5-16458、PA5-16770、18696-1-AP、HC34LC14、ST04-99、MA5-44656、EPR25707-134、AF1356、AF332、MAB332、AF3267、NBP2-45508、NBP2-52975、AF3267、NBP2-34487、34-8800和NBP1-85593。在某些實施例中，所述抗C117抗體包含選自以下的抗體的V H和V L序列的重鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3以及輕鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3：PA5-14694、PA5-16458、PA5-16770、18696-1-AP、HC34LC14、ST04-99、MA5-44656、EPR25707-134、AF1356、AF332、MAB332、AF3267、NBP2-45508、NBP2-52975、AF3267、NBP2-34487、34-8800和NBP1-85593，所述CDR由Kabat（參見Kabat等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH出版號91-3242, 貝塞斯達）、Chothia（參見例如，Choth, (1987), J. MOL. BIOL. 196: 901-917）、MacCallum（參見MacCallum R M等人, (1996) J. MOL. BIOL. 262: ia C & Lesk A M732-745）、或本領域已知的任何其他CDR確定方法確定。在一些實施例中，所述抗CD117抗體包含本文所述的任一種抗CD117抗體或本領域已知的其他抗CD117抗體的重鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3以及輕鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3。 [0272]在一些實施例中，所述HSC靶向基團（例如，結合CD105和/或CD117的抗體）包含抗體Fc片段。人類中最常見的免疫球蛋白同種型是IgG，其由兩個相同的重鏈多肽和兩個相同的輕鏈多肽組成。二硫鍵將兩個重鏈多肽彼此連接。另外，二硫鍵還將每個輕鏈多肽與重鏈多肽連接。重鏈多肽含有四個不同的結構域，包括可變重（VH）、恒定重1（CH1）、恒定重2（CH2）和恒定重3（CH3）結構域。每個輕鏈含有可變輕鏈（VL）和可變重鏈（VH）結構域。重鏈和輕鏈的可變結構域為抗體提供抗原結合活性，並負責免疫球蛋白的多樣性和特異性。重要的是，重鏈恒定結構域（主要是CH2和CH3）參與抗體的非抗原結合功能，並構成Fc區。Fc區能夠結合補體，這可以觸發吞噬作用或補體依賴性細胞毒性（CDC）。另外，Fc區還可以與Fc受體結合，這可以觸發吞噬作用或抗體依賴性細胞毒性（ADCC）。此外，已知Fc區可改善抗體在循環期間的維持。 [0273]在一些實施例中，所述HSC靶向基團（例如，結合CD105和/或CD117的抗體）包含選自以下的抗體或其抗原結合片段：Fab、F(ab')2、Fab'-SH、Fv和scFv片段。在一些實施例中，所述抗體是人或人類化抗體。在一些實施例中，所述HSC靶向基團包含Fab或免疫球蛋白單可變結構域，如奈米抗體。 [0274]在一些實施例中，HSC靶向基團包含不含有天然鏈間二硫鍵的Fab。例如，在一些實施例中，所述Fab包含含有C233S取代的重鏈片段和/或含有C214S取代的輕鏈片段，根據Kabat編號。在一些實施例中，所述HSC靶向基團包含含有一個或多個非天然鏈間二硫鍵的Fab。在一些實施例中，所述鏈間二硫鍵位於分別在所述輕鏈片段和所述重鏈片段上的兩個非天然半胱胺酸殘基之間。例如，在一些實施例中，所述Fab包含含有F174C取代的重鏈片段和/或含有S176C取代的輕鏈片段，根據Kabat編號。在一些實施例中，所述Fab包含含有F174C和C233S取代的重鏈片段和/或含有S176C和C214S取代的輕鏈片段，根據Kabat編號。在一些實施例中，所述HSC靶向基團包含C末端半胱胺酸殘基。在一些實施例中，所述HSC靶向基團包含在所述重鏈或輕鏈片段的C末端含有半胱胺酸的Fab。在一些實施例中，所述Fab還包含在所述Fab的重鏈與所述C末端半胱胺酸之間的一個或多個胺基酸。例如，在一些實施例中，所述Fab包含在所述Fab的C末端與所述C末端半胱胺酸之間的衍生自抗體鉸鏈區（例如，部分鉸鏈序列）的兩個或更多個胺基酸。在一些實施例中，所述Fab包含與抗體CH1結構域連接的重鏈可變結構域和與抗體輕鏈恒定結構域連接的輕鏈可變結構域，其中所述CH1結構域和所述輕鏈恒定結構域通過一個或多個鏈間二硫鍵連接，並且其中所述HSC靶向基團還包含通過胺基酸連接子與所述輕鏈恒定結構域的C末端連接的單鏈可變片段（scFv）。在一些實施例中，所述Fab抗體是DS Fab、NoDS Fab、bDS Fab、bDS Fab-ScFv，如 圖 12所展示。 [0275]在一些實施例中，所述接合物（例如脂質-抗體接合物）包含Fab，其中所述Fab包含重鏈和輕鏈片段。在一些實施例中，所述重鏈片段包含與抗體CH1結構域連接的重鏈可變結構域。在一些實施例中，所述重鏈可變結構域是IgG1 VH。在一些實施例中，所述抗體CH1結構域是IgG CH1結構域。在一些實施例中，所述輕鏈片段包含與抗體輕鏈恒定結構域連接的輕鏈可變結構域。在一些實施例中，所述輕鏈可變結構域是κVL結構域。在一些實施例中，所述抗體輕鏈恒定結構域是κCL結構域。在一些實施例中，所述CH1結構域和所述輕鏈恒定結構域通過一個或多個鏈間二硫鍵連接。 [0276]在一些實施例中，所述HSC靶向基團（例如，結合CD105和/或CD117的抗體）包含免疫球蛋白單可變結構域，如奈米抗體（例如，V HH）。在一些實施例中，所述奈米抗體在C末端包含半胱胺酸。 [0277]示例性HSC靶向基團（例如，結合CD105和/或CD117的抗體）可以包含如針對 表 B中列出的抗體所述的一個或多個胺基酸序列。在一些實施例中，所述HSC靶向基團包含如針對表B中列出的Ab1所述的胺基酸序列。在一些實施例中，所述HSC靶向基團包含如針對表B中列出的Ab2所述的胺基酸序列。在一些實施例中，所述HSC靶向基團包含如針對表B中列出的Ab3所述的胺基酸序列。 表 B. 示例性 HSC 靶向抗體。
抗體 靶標 序列名稱 SEQ ID NO 胺基酸序列
Ab1 CD117 CDR-H1 1 FTFSNYAMS
CDR-H2 2 AISGSGGSTYYADSVKG
CDR-H3 3 AKGPPTYHTNYYYMDV
CDR-L1 4 RASQGISSWLA
CDR-L2 5 AASSLQS
CDR-L3 6 QQTNSFPYT
VH 7 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG FTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVS AISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AKGPPTYHTNYYYMDVWGKGTTVTVSS
VL 8 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIY AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQTNSFPYTFGGGTKVEIK
重鏈 9 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG FTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVS AISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AKGPPTYHTNYYYMDVWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTCPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTCGGHHHHHH
輕鏈 38 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIY AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQTNSFPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLCSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES
Ab2 CD117 CDR-H1 10 FTFSDADMD
CDR-H2 11 RTRNKAGSYTTEYAASVKG
CDR-H3 12 AREPKYWIDFDL
CDR-L1 13 RASQSISSYLN
CDR-L2 14 AASSLQS
CDR-L3 15 QQSYIAPYT
VH 16 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG FTFSDADMDWVRQAPGKGLEWVGR TRNKAGSYTTEYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYC AREPKYWIDFDLWGRGTLVTVSS
VL 17 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIY AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYIAPYTFGGGTKVEIK
重鏈 18 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG FTFSDADMDWVRQAPGKGLEWVGR TRNKAGSYTTEYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYC AREPKYWIDFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTCPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTCGGHHHHHH
輕鏈 39 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIY AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYIAPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLCSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES
Ab3 CD105 CDR-H1 19 DAWMD
CDR-H2 20 EIRSKASNHATYYAESVKG
CDR-H3 21 WRRFFDS
CDR-L1 22 RASSSVSYMH
CDR-L2 23 ATSNLAS
CDR-L3 24 QQWSSNPLT
VH 25 EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFS DAWMDWVRQSPEKGLEWVA EIRSKASNHATYYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYYCTR WRRFFDSWGQGTTLTVSS
VL 26 QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTC RASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIY ATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYC QQWSSNPLTFGAGTKLELK
重鏈 27 EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFS DAWMDWVRQSPEKGLEWVA EIRSKASNHATYYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYYCTR WRRFFDSWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTCPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTCGGHHHHHH
輕鏈 40 QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTC RASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIY ATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYC QQWSSNPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLCSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES
mutAb1 N/A （ Ab1 的非結合性陰性對照） CDR-H1 28 FAAANYAMS
CDR-H2 29 AISGAAASTYYADSVKG
CDR-H3 30 AKGPPTYAAAYYYMDV
CDR-L1 31 RASQAAASWLA
CDR-L2 32 AAASLQS
CDR-L3 33 QQTAAAPYT
VH 34 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG FAAANYAMSWVRQAPGKGLEWVS AISGAAASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AKGPPTYAAAYYYMDVWGKGTTVTVSS
VL 35 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQAAASWLAWYQQKPGKAPKLLIY AAASLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQTAAAPYTFGGGTKVEIK
重鏈 36 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG FAAANYAMSWVRQAPGKGLEWVS AISGAAASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AKGPPTYAAAYYYMDVWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTCPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSDKTHTCGGHHHHHH
輕鏈 37 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC RASQAAASWLAWYQQKPGKAPKLLIY AAASLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQTAAAPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLCSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES
NA NA 重鏈恒定結構域（ IgG1 CH1 ） 41 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTCPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
NA NA C 末端序列 42 EPKSSDKTHTCGGHHHHHH
NA NA 輕鏈恒定結構域（ κCL ） 43 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLCSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES
[0278]在一些實施例中，所述HSC靶向基團（例如，結合CD105和/或CD117的抗體）包含胺基酸間隔子和/或連接子。在一些實施例中，所述間隔子在抗體或其抗原結合片段的兩個結構域之間。在一些實施例中，所述間隔子在V HH結構域與C末端半胱胺酸之間。在一些實施例中，所述間隔子在抗體或其抗原結合片段與脂質之間。在一些實施例中，所述間隔子在抗原結合單可變結構域與脂質之間。在一些實施例中，所述間隔子在V HH與脂質之間。在一些實施例中，所述HSC靶向基團包含 表 C中任一序列所示的胺基酸間隔子和/或連接子。在一些實施例中，所述HSC靶向基團（例如抗體）包含具有AAA的胺基酸序列或SEQ ID NO: 45-60中任一個所示的胺基酸序列的胺基酸間隔子和/或連接子。 表C：間隔子/連接子序列
名稱 SEQ ID NO 胺基酸序列
3A間隔子 N/A AAA
5GS間隔子 45 GGGGS
7GS間隔子 46 SGGSGGS
8GS間隔子 47 GGGGSGGS
9GS間隔子 48 GGGGSGGGS
10GS間隔子 49 GGGGSGGGGS
15GS間隔子 50 GGGGSGGGGSGGGGS
18GS間隔子 51 GGGGSGGGGSGGGGSGGS
20GS間隔子 52 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
25GS間隔子 53 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
30GS間隔子 54 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
35GS間隔子 55 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
40GS間隔子 56 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
G1鉸鏈 57 EPKSCDKTHTCPPCP
9GS-G1鉸鏈 58 GGGGSGGGSEPKSCDKTHTCPPCP
美洲駝上部長鉸鏈區 59 EPKTPKPQPAAA
G3鉸鏈 60 ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP
[0279]胺基酸間隔子的例子包括但不限於SEQ ID NO: 45-60所示的那些和胺基酸序列AAA。本發明的間隔子可以具有至少3、5、10、15、20、25或30個胺基酸的長度。本發明的間隔子可以包含3與50、5與45、7與40、10與35、12與30或15與25個之間的胺基酸。在一些實施例中，所述間隔子的長度為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個胺基酸。本文所述的融合蛋白單體的間隔子可以是柔性間隔子或剛性間隔子。本文所述的HSC靶向基團（例如，結合CD105和/或CD117的抗體）的間隔子可以是短間隔子或長間隔子。在一些實施例中，所述胺基酸間隔子包含如表C中列出的含有1、2、3、4或5個胺基酸取代、插入或缺失的胺基酸序列。在一些實施例中，所述胺基酸間隔子包含如表C中列出的胺基酸序列。本文所述的間隔子可以用於將兩個或更多個胺基酸結構域連接在一起。 [0280]在一些實施例中，所述HSC靶向基團（例如，結合CD105和/或CD117的抗體）包含一個或多個互補決定區（CDR）序列。常規抗體的CDR序列是免疫球蛋白抗體中重鏈和輕鏈的高度可變區，其決定抗原特異性並代表這些抗體分子與其特異性抗原結合的位置。在一些情形下，抗原結合單可變結構域（即V HH）僅包含位於所述結構的N末端部分的一組CDR。本文描述了HSC靶向基團，其包含具有一個或多個CDR序列的多肽，所述一個或多個CDR序列具有4與30、6與28、8與26、10與24、12與22、14與20或16與18個之間的殘基的胺基酸長度。在一些實施例中，所述CDR序列的長度為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸。在一些實施例中，所述CDR序列的長度在4與20個胺基酸之間。在一些實施例中，所述CDR序列的長度在5與15個胺基酸之間。在一些實施例中，所述CDR序列包含表B中列出的含有1、2、3、4或5個胺基酸取代、插入或缺失的胺基酸序列。在一些實施例中，所述CDR序列包含表B中列出的胺基酸序列。 [0281]在一些實施例中，本文提供的HSC靶向基團（例如，結合CD105和/或CD117的抗體）包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的重鏈可變結構域以及含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的輕鏈可變結構域。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列（其各自具有表B中列出的胺基酸序列），其中一個或多個CDR序列包含1、2、3、4或5個胺基酸取代、插入或缺失。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包含具有SEQ ID NO: 1所示胺基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO: 2所示胺基酸序列的CDR-H2、具有SEQ ID NO: 3所示胺基酸序列的CDR-H3、具有SEQ ID NO: 4所示胺基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO: 5所示胺基酸序列的CDR-L2、以及具有SEQ ID NO: 6所示胺基酸序列的CDR-L3，其中一個或多個CDR序列包含1、2、3、4或5個胺基酸取代、插入或缺失。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包含具有SEQ ID NO: 1所示胺基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO: 2所示胺基酸序列的CDR-H2、具有SEQ ID NO: 3所示胺基酸序列的CDR-H3、具有SEQ ID NO: 4所示胺基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO: 5所示胺基酸序列的CDR-L2、以及具有SEQ ID NO: 6所示胺基酸序列的CDR-L3。 [0282]在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包含具有SEQ ID NO: 10所示胺基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO: 11所示胺基酸序列的CDR-H2、具有SEQ ID NO: 12所示胺基酸序列的CDR-H3、具有SEQ ID NO: 13所示胺基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO: 14所示胺基酸序列的CDR-L2、以及具有SEQ ID NO: 15所示胺基酸序列的CDR-L3，其中一個或多個CDR序列包含1、2、3、4或5個胺基酸取代、插入或缺失。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包含具有SEQ ID NO: 10所示胺基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO: 11所示胺基酸序列的CDR-H2、具有SEQ ID NO: 12所示胺基酸序列的CDR-H3、具有SEQ ID NO: 13所示胺基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO: 14所示胺基酸序列的CDR-L2、以及具有SEQ ID NO: 15所示胺基酸序列的CDR-L3。 [0283]在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包含具有SEQ ID NO: 19所示胺基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO: 20所示胺基酸序列的CDR-H2、具有SEQ ID NO: 21所示胺基酸序列的CDR-H3、具有SEQ ID NO: 22所示胺基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO: 23所示胺基酸序列的CDR-L2、以及具有SEQ ID NO: 24所示胺基酸序列的CDR-L3，其中一個或多個CDR序列包含1、2、3、4或5個胺基酸取代、插入或缺失。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包含具有SEQ ID NO: 19所示胺基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO: 20所示胺基酸序列的CDR-H2、具有SEQ ID NO: 21所示胺基酸序列的CDR-H3、具有SEQ ID NO: 22所示胺基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO: 23所示胺基酸序列的CDR-L2、以及具有SEQ ID NO: 24所示胺基酸序列的CDR-L3。 [0284]在一些實施例中，本文提供的HSC靶向基團（例如，結合CD105和/或CD117的抗體）包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的重鏈可變結構域（VH）以及含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的輕鏈可變結構域（VL）。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH結構域以及含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL結構域，其中所述VH和VL結構域與針對表B中的Ab1所述的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同一性。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH結構域以及含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL結構域，其中所述VH結構域與SEQ ID NO: 7所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同一性，其中所述VL結構域與SEQ ID NO: 8所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同一性。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH結構域以及含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL結構域，其中所述VH結構域包含SEQ ID NO: 7中任一個所示的胺基酸序列，其中所述VL結構域包含SEQ ID NO: 8中任一個所示的胺基酸序列。 [0285]在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH結構域以及含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL結構域，其中所述VH和VL結構域與針對表B中的Ab2所述的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同一性。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH結構域以及含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL結構域，其中所述VH結構域與SEQ ID NO: 16所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同一性，其中所述VL結構域與SEQ ID NO: 17所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同一性。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH結構域以及含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL結構域，其中所述VH結構域包含SEQ ID NO: 16中任一個所示的胺基酸序列，其中所述VL結構域包含SEQ ID NO: 17中任一個所示的胺基酸序列。 [0286]在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH結構域以及含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL結構域，其中所述VH和VL結構域與針對表B中的Ab3所述的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同一性。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH結構域以及含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL結構域，其中所述VH結構域與SEQ ID NO: 25所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同一性，其中所述VL結構域與SEQ ID NO: 26所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同一性。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH結構域以及含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL結構域，其中所述VH結構域包含SEQ ID NO: 25中任一個所示的胺基酸序列，其中所述VL結構域包含SEQ ID NO: 26中任一個所示的胺基酸序列。 [0287]在一些實施例中，本文提供的HSC靶向基團（例如，結合CD105和/或CD117的抗體）包括Fab，其中所述Fab包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的重鏈可變結構域（VH）以及含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的輕鏈可變結構域（VL）。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包括Fab，其中所述Fab的VH和VL結構域與表B中列出的Ab1的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同一性。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包括Fab，其中所述Fab的VH和VL結構域與SEQ ID NO: 7和8所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.5%的序列同一性。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包括Fab，其中所述Fab的VH和VL結構域包含SEQ ID NO: 7和8所示的胺基酸序列。 [0288]在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包括Fab，其中所述Fab的VH和VL結構域與表B中列出的Ab2的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同一性。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包括Fab，其中所述Fab的VH和VL結構域與SEQ ID NO: 16和17所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.5%的序列同一性。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包括Fab，其中所述Fab的VH和VL結構域包含SEQ ID NO: 16和17所示的胺基酸序列。 [0289]在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包括Fab，其中所述Fab的VH和VL結構域與表B中列出的Ab3的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同一性。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包括Fab，其中所述Fab的VH和VL結構域與SEQ ID NO: 25和26所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.5%的序列同一性。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包括Fab，其中所述Fab的VH和VL結構域包含SEQ ID NO: 25和26所示的胺基酸序列。 [0290]在一些實施例中，本文提供的HSC靶向基團（例如，結合CD105和/或CD117的抗體）包括Fab，其中所述Fab包含重鏈結構域和輕鏈結構域。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包括Fab，其中所述Fab的重鏈和輕鏈結構域與表B中列出的Ab1的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同一性。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包括Fab，其中所述Fab的重鏈和輕鏈結構域與SEQ ID NO: 9和38所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.5%的序列同一性。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包括Fab，其中所述Fab的重鏈和輕鏈結構域包含SEQ ID NO: 9和38所示的胺基酸序列。 [0291]在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包括Fab，其中所述Fab的重鏈和輕鏈結構域與表B中列出的Ab2的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同一性。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包括Fab，其中所述Fab的重鏈和輕鏈結構域與SEQ ID NO: 18和39所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.5%的序列同一性。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包括Fab，其中所述Fab的重鏈和輕鏈結構域包含SEQ ID NO: 18和39所示的胺基酸序列。 [0292]在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包括Fab，其中所述Fab的重鏈和輕鏈結構域與表B中列出的Ab3的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同一性。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包括Fab，其中所述Fab的重鏈和輕鏈結構域與SEQ ID NO: 27和40所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.5%的序列同一性。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包括Fab，其中所述Fab的重鏈和輕鏈結構域包含SEQ ID NO: 27和40所示的胺基酸序列。 [0293]在一些實施例中，所述HSC靶向基團（例如，結合CD105和/或CD117的抗體）包含兩個或更多個抗原結合結構域（例如，兩個V HH結構域）。在一些實施例中，所述兩個或更多個抗原結合結構域通過胺基酸連接子連接。在一些實施例中，所述兩個或更多個V HH結構域通過胺基酸連接子連接。在一些實施例中，所述胺基酸連接子包含一個或多個甘胺酸和/或絲胺酸殘基（例如，序列GGGGS的一個或多個重複）。在一些實施例中，所述HSC靶向基團包含與抗體CH1結構域連接的第一V HH結構域和與抗體輕鏈恒定結構域連接的第二V HH結構域，並且其中所述抗體CH1結構域和所述抗體輕鏈恒定結構域通過一個或多個二硫鍵（例如，鏈間二硫鍵）連接。在一些實施例中，所述HSC靶向基團（例如，結合CD105和/或CD117的抗體）包含與抗體CH1結構域連接的V HH結構域，並且其中所述抗體CH1結構域通過一個或多個二硫鍵與抗體輕鏈恒定結構域連接。在一些實施例中，所述CH1結構域包含F174C和C233S取代，並且所述輕鏈恒定結構域包含S176C和C214S取代，根據Kabat編號。在一些實施例中，所述抗體是ScFv、V HH、2xV HH、V HH-CH1/空Vk或V HH1-CH1/V HH-2-Nb bDS，如 圖 12所展示。 [0294]在一些實施例中，所述HSC靶向基團（例如，結合CD105和/或CD117的抗體）包括以高結合親和力結合HSC表面抗原的多肽。在一些實施例中，將HSC靶向基團對HSC表面抗原的結合親和力測量為平衡解離常數（K D）。在一些實施例中，所述HSC靶向基團以小於500、400、300、200、100或1 nM的結合親和力結合HSC表面抗原。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包括Fab，其中所述Fab的VH和VL結構域與SEQ ID NO: 7和8所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.5%的序列同一性。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包括Fab，其中所述Fab的VH和VL結構域包含SEQ ID NO: 7和8所示的胺基酸序列。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包括Fab，其中所述Fab的VH和VL結構域與SEQ ID NO: 16和17所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.5%的序列同一性。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包括Fab，其中所述Fab的VH和VL結構域包含SEQ ID NO: 16和17所示的胺基酸序列。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包括Fab，其中所述Fab的VH和VL結構域與SEQ ID NO: 25和26所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.5%的序列同一性。在一些實施例中，結合HSC表面抗原的HSC靶向基團包括Fab，其中所述Fab的VH和VL結構域包含SEQ ID NO: 25和26所示的胺基酸序列。 [0295]在一些實施例中，本文提供的HSC靶向基團（例如，結合CD105和/或CD117的抗體）靶向人HSC表面抗原，包括例如本申請中描述的任何HSC表面抗原。在一些實施例中，所述HSC靶向基團靶向人CD105和/或人CD117。在一些實施例中，所述HSC靶向基團靶向多於一種人HSC表面抗原。 [0296]在一些實施例中，包含HSC靶向基團的接合物（例如，脂質-抗體接合物）能夠結合非人HSC表面抗原。在一些實施例中，包含HSC靶向基團的接合物（例如，脂質-抗體接合物）能夠結合人HSC表面抗原。在一些實施例中，包含HSC靶向基團的接合物（例如，脂質-抗體接合物）能夠結合本文所述的人HSC表面抗原，例如人CD105和/或人CD117。 [0297]在一些實施例中，所述HSC靶向基團（例如，結合CD105和/或CD117的抗體）包括如本文所公開的多肽序列。在一些實施例中，所述靶向部分包含如本文所公開的多肽序列（例如抗體多肽序列，例如Fab多肽序列）的所有六個CDR。在一些實施例中，所述HSC靶向部分包含如本文所公開的免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）的CDR1、CDR2和CDR3。在另外的實施例中，所述HSC靶向基團（例如，結合CD105和/或CD117的抗體）結合靶分子（例如CD105和/或CD117）上與如本文所公開的多肽序列結合的相同表位。在另外的實施例中，所述HSC靶向基團（例如，結合CD105和/或CD117的抗體）與如本文所公開的多肽序列競爭結合靶分子上的相同表位。 [0298]在某些實施例中，所述HSC靶向基團（例如，結合CD105和/或CD117的抗體）可以經由含有聚乙二醇（PEG）的連接子與脂質共價接合。 [0299]在其他實施例中，用於產生接合物（例如，脂質-抗體接合物）的脂質可以選自二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（DSPE）： ， 二棕櫚醯-磷脂醯乙醇胺（DPPE）： ， 二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（DMPE）： ， 二硬脂醯-甘油-磷酸甘油（DSPG）： ， 二肉豆蔻醯-甘油（DMG）： ， 二硬脂醯甘油（DSG）： ，以及 N-棕櫚醯-鞘胺醇（C16-神經醯胺） 。 [0300]所述HSC靶向基團（例如，結合CD105和/或CD117的抗體）可以直接或經由連接子（例如，含有聚乙二醇（PEG）的連接子）與脂質共價接合。在某些實施例中，所述PEG是PEG 1000、PEG 2000、PEG 3400、PEG 3000、PEG 3450、PEG 4000或PEG 5000。在某些實施例中，所述PEG是PEG 2000。 [0301]在一些實施例中，所述脂質-HSC靶向基團接合物（例如脂質-抗體接合物）以0.001-0.5莫耳百分比、0.001-0.3莫耳百分比、0.002-0.2莫耳百分比、0.01-0.1莫耳百分比、0.1-0.3莫耳百分比或0.1-0.2莫耳百分比的範圍存在於所述LNP中。 [0302]在某些實施例中，所述脂質-HSC靶向基團接合物（例如脂質-抗體接合物）包含DSPE、PEG組分和靶向抗體。在某些實施例中，HSC靶向基團接合物是結合本文所述的HSC表面抗原的抗體，例如結合CD105和/或CD117的抗體。 [0303]示例性脂質-HSC靶向基團接合物（例如脂質-抗體接合物）包含DSPE和PEG 2000，例如，如Nellis等人 (2005) BIOTECHNOL. PROG. 21, 205-220所述。示例性接合物包含式 (VII) 的結構，其中scFv代表與目的靶標結合的工程化抗體結合位點。在某些實施例中，所述工程化抗體結合位點與本文所述的任何靶標結合。在某些實施例中，所述工程化抗體結合位點可以是例如工程化抗CD105抗體或工程化抗CD117抗體。 [0304]式 (VII) 的化合物的例子如下所示： (式VII)。 設想了式 (VII) 中的scFv可以被完整抗體或其抗原片段（例如，Fab）替換。 [0305]式 (VIII) 的化合物的另一個例子如下所示： (VIII)， 其產生描述於Nellis等人(2005) 同上，或美國專利號7,022,336中。設想了式 (VIII) 中的Fab可以被完整抗體或其抗原片段（例如，(Fab') 2片段）或工程化抗體結合位點（例如，scFv）替換。 [0306]其他脂質-抗體接合物描述於例如美國專利號7,022,336中，其中所述靶向基團（例如抗體或其抗原結合片段）可以被目的靶向基團（例如，結合本文所述的任何HSC表面抗原的靶向基團）替換。 [0307]在某些實施例中，式 (I) 或式 (VI) 的示例性接合物的脂質組分可以是本文所述的任何脂質。在一些實施例中，式 (I) 或式 (VI) 的接合物的脂質組分基於本文所述的可電離陽離子脂質或其鹽，例如，式 (II')、式 (II)、式 (IIa)、式 (Iib)、式 (IIIa)、式 (IIIb)、式 (IV) 或式 (V) 的可電離陽離子脂質。例如，示例性可電離陽離子脂質可以選自表A或其鹽。 [0308]在某些實施例中，基於本公開文本的脂質的接合物（例如脂質-抗體接合物）可以包括： ，其中scFv代表結合本文所述的靶標（例如HSC表面抗原，例如CD105和/或CD117）的工程化抗體結合位點。 [0309]在某些實施例中，所述LNP還可以包含游離PEG-脂質，以便減少經由HSC靶向基團（例如，結合CD105和/或CD117的抗體）的非特異性結合的量。所述游離PEG-脂質可以與所述接合物中包括的PEG-脂質相同或不同。在某些實施例中，所述游離PEG-脂質選自PEG-二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DSPE）或PEG-二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DMPE）、N-(甲基聚氧乙烯氧基羰基)-1,2-二棕櫚醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DPPE-PEG）、1,2-二肉豆蔻醯-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯（PEG-DMG）、1,2-二棕櫚醯-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯（PEG-DPG）、1,2-二油醯-rac-甘油,甲氧基聚乙二醇（DOG-PEG）、1,2-二硬脂醯-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯（PEG-DSG）、N-棕櫚醯-鞘胺醇-1-{琥珀醯[甲氧基(聚乙二醇)]（PEG-神經醯胺）、DSPE-PEG-半胱胺酸或其衍生物，全部具有在2000-5000之間，為2000、3400或5000的平均PEG長度。最終組合物可以含有兩種或更多種這些聚乙二醇化脂質的混合物。在某些實施例中，所述LNP組合物包含具有肉豆蔻醯基和硬脂酸醯基鏈的PEG-脂質的混合物。在某些實施例中，所述LNP組合物包含具有棕櫚醯基和硬脂醯基鏈的PEG-脂質的混合物。 [0310]在某些實施例中，所述PEG-脂質的衍生物在PEG末端具有甲氧基、羥基或羧酸端基。 [0311]可以將所述脂質-HSC靶向基團接合物（例如脂質-抗體接合物）摻入如下所述的LNP中，例如摻入含有例如可電離陽離子脂質、固醇、中性磷脂和PEG-脂質的LNP中。設想了在某些實施例中，含有所述脂質-HSC靶向基團的LNP可以含有本文所述的可電離陽離子脂質，或者描述於例如以下文獻中的陽離子脂質：美國專利號10,221,127、10,653,780或美國公開申請號US 2018/0085474、US 2016/0317676，國際公開號WO 2009/086558，或Miao等人 (2019) NATURE BIOTECH 37:1174-1185或Jayaraman等人 (2012) ANGEW CHEM INT. 51: 8529-8533。 [0312]在一些實施例中，所述陽離子脂質可以選自表A中所列出的可電離陽離子脂質或其鹽。本文提供的R 1、R 2、R 3、R 1A、R 2A、R 3A、R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3，R 3A1、R 3A2、R 3A3、R a1、R a2、R 3B、R 3B1、R 3B2、R 3B3、R s1、R s2、R s3、R s4、R s5、R s6、R s7、R s8、R s9、R s10、R s11、R s12、R s13、R s14或R s15的任何變體或實施例可以與R 1、R 2、R 3、R 1A、R 2A、R 3A、R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2、R 3A3、R a1、R a2、R 3B、R 3B1、R 3B2、R 3B3、R s1、R s2、R s3、R s4、R s5、R s6、R s7、R s8、R s9、R s10、R s11、R s12、R s13、R s14或R s15的每一個其他變體或實施例組合，如同每個組合已經被單獨且具體描述一樣。 [0313]可以使用在下文的以下部分中所述的方法和其他組分配製所述LNP。 [0314]在某些實施例中，所述LNP或脂質共混物還可以包括如本文所述的脂質-HSC靶向基團接合物（例如脂質-抗體接合物）。 [0315]所述脂質-HSC靶向基團接合物（例如脂質-抗體接合物）可以以0.001-0.5莫耳百分比、0.001-0.1莫耳百分比、0.01-0.5莫耳百分比、0.05-0.5莫耳百分比、0.1-0.5莫耳百分比、0.1-0.3莫耳百分比、0.1-0.2莫耳百分比、0.2-0.3莫耳百分比的範圍，約0.01莫耳百分比、約0.05莫耳百分比、約0.1莫耳百分比、約0.15莫耳百分比、約0.2莫耳百分比、約0.25莫耳百分比、約0.3莫耳百分比、約0.35莫耳百分比、約0.4莫耳百分比、約0.45莫耳百分比或約0.5莫耳百分比存在於所述LNP或所述脂質共混物中。 (f) 有效載荷 [0316]所述LNP組合物可以包含用於遞送至細胞（例如，造血幹細胞（HSC））或組織（例如，受試者的細胞（例如，HSC）或組織）的藥劑，例如核酸分子。 [0317]本發明的LNP組合物可以包括核酸，例如DNA或RNA，如mRNA、tRNA、微小RNA、siRNA、指導RNA（gRNA）、先導編輯指導RNA（pegRNA）、circRNA（環狀RNA）、核酶、誘餌RNA、dicer底物siRNA或供體範本DNA或RNA。本發明的LNP組合物可以包括單鏈DNA（ssDNA）、雙鏈DNA（dsDNA）、單鏈RNA（ssRNA）和/或雙鏈RNA（dsRNA）。設想了核酸可以含有天然存在的組分，如天然存在的鹼基、糖或連接基團（例如，磷酸二酯連接基團）；或者可以含有非天然存在的組分或修飾（例如，硫酯連接基團）。例如，所述核酸可以被合成為含有本領域技術人員已知的鹼基、糖、連接子修飾。此外，所述核酸可以是線性或環狀的，或者具有任何所需的組態。所述LNP組合物可以包括多種核酸分子（例如，多種RNA分子），它們可以相同或不同。 [0318]在某些實施例中，所述有效載荷是mRNA。在某些實施例中，特定LNP組合物可以含有許多mRNA分子，它們可以相同或不同。在某些實施例中，包括一種或多種不同mRNA的一種或多種LNP組合物可以與細胞組合和/或同時接觸。設想了mRNA可以包括莖環、鏈終止核苷、polyA序列、多腺苷酸化信號和/或5'帽結構中的一種或多種。所述mRNA可以編碼如本文所述的定點核酸酶、化學鹼基編輯器、先導編輯器或表觀基因組編輯器。 [0319]在一些實施例中，所述有效載荷的一種或多種核酸包括編碼定點核酸酶、化學鹼基編輯器、先導編輯器或表觀基因組編輯器的mRNA。在一些實施例中，所述一種或多種核酸包括編碼定點核酸酶的mRNA。在一些實施例中，所述定點核酸酶是CRISPR相關（Cas）核酸酶、鋅指核酸酶（ZFN）、轉錄啟動因子樣效應核酸酶（TALEN）或megaTAL。在一些實施例中，所述定點核酸酶是包含賦予與靶核苷酸序列的結合的胺基酸序列的ZFN、TALEN或megaTAL。 [0320]在一些實施例中，所述有效載荷的一種或多種核酸包括編碼CRISPR相關（Cas）核酸酶或化學鹼基編輯器的mRNA；以及含有賦予與靶核苷酸序列的結合的核苷酸序列的指導RNA（gRNA）。 [0321]在一些實施例中，所述有效載荷的一種或多種核酸包括編碼先導編輯器的mRNA；以及含有賦予與靶核苷酸序列的結合的核苷酸序列的先導編輯指導RNA（pegRNA）。 [0322]在一些實施例中，所述有效載荷包括gRNA或pegRNA。在一些實施例中，所述有效載荷的gRNA或pegRNA包含與靶核苷酸序列的至少15個連續核苷酸具有至少80%同一性的序列。在一些實施例中，所述有效載荷的gRNA或pegRNA包含與靶核苷酸序列的至少15個連續核苷酸具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。在一些實施例中，所述有效載荷的gRNA或pegRNA包含與靶核苷酸序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個連續核苷酸具有至少80%同一性的序列。 [0323]在一些實施例中，所述有效載荷包括gRNA或pegRNA。在一些實施例中，所述有效載荷的gRNA或pegRNA包含與靶核苷酸序列的至少15個連續核苷酸具有至少80%同一性的序列。在一些實施例中，所述有效載荷的一種或多種核酸還包括供體範本核酸，所述供體範本核酸包含與靶核苷酸序列的至少15個連續核苷酸具有至少80%同一性的序列。在一些實施例中，所述有效載荷的供體範本核酸包含與靶核苷酸序列的至少15個連續核苷酸具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。在一些實施例中，所述有效載荷的供體範本核酸包含與靶核苷酸序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個連續核苷酸具有至少80%同一性的序列。 [0324]在一些實施例中，所述靶核苷酸序列包含至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個連續核苷酸，並且位於基因的編碼區、與基因相關的內含子區、與基因相關的外顯子區、與基因相關的5'非轉譯區或與基因相關的3'非轉譯區內，其中所述基因選自以下基因： HBB、 HBG1、 HBG2、 HBA1、 HBA2、 HBD、 BCL11A、 BACH2、 KLF1、 LRF、 ADA、 DCLREIC、 IL2RG、 RAG1、 RAG2、 JAK3、 BTK、 WAS、 F8、 F9、 F11、 F10、 PKLR、 RPS19、 CYBA、 CYBB、 NCF1、 NCF1B、 NCF1C、 NCF2、 NCF4、 ELANE、 ABCD1、 ARSA、 FXN、 GBA、 IDS、 IDUA、 TCIRG、 AICDA、 UNG、 CD40、 CD40LG、 FOXP3、 IL4、 IL10、 IL13、 IL7R、 PRF1、 FANCA、 FANCB、 FANCC、 FANCD1/BRACA2、 FANCD2、 MPL、 CCR5、 CXCR4、 F5、 F2、抗凝血酶III基因和蛋白C基因。在一些實施例中，所述靶核苷酸序列位於選自以下的基因的調節區內： HBB、 HBG1、 HBG2、 HBA1、 HBA2、 HBD、 BCL11A、 BACH2、 KLF1、 LRF、 ADA、 DCLREIC、 IL2RG、 RAG1、 RAG2、 JAK3、 BTK、 WAS、 F8、 F9、 F11、 F10、 PKLR、 RPS19、 CYBA、 CYBB、 NCF1、 NCF1B、 NCF1C、 NCF2、 NCF4、 ELANE、 ABCD1、 ARSA、 FXN、 GBA、 IDS、 IDUA、 TCIRG、 AICDA、 UNG、 CD40、 CD40LG、 FOXP3、 IL4、 IL10、 IL13、 IL7R、 PRF1、 FANCA、 FANCB、 FANCC、 FANCD1/BRACA2、 FANCD2、 MPL、 CCR5、 CXCR4、 F5、 F2、抗凝血酶III基因和蛋白C基因。在一些實施例中，所述靶核苷酸序列位於選自以下的基因的強化子區或抑制子區內： HBB、 HBG1、 HBG2、 HBA1、 HBA2、 HBD、 BCL11A、 BACH2、 KLF1、 LRF、 ADA、 DCLREIC、 IL2RG、 RAG1、 RAG2、 JAK3、 BTK、 WAS、 F8、 F9、 F11、 F10、 PKLR、 RPS19、 CYBA、 CYBB、 NCF1、 NCF1B、 NCF1C、 NCF2、 NCF4、 ELANE、 ABCD1、 ARSA、 FXN、 GBA、 IDS、 IDUA、 TCIRG、 AICDA、 UNG、 CD40、 CD40LG、 FOXP3、 IL4、 IL10、 IL13、 IL7R、 PRF1、 FANCA、 FANCB、 FANCC、 FANCD1/BRACA2、 FANCD2、 MPL、 CCR5、 CXCR4、 F5、 F2、抗凝血酶III基因和蛋白C基因。 [0325]在一些實施例中，所述靶核苷酸序列位於 BCL11A紅系細胞強化子內。在一些實施例中，所述靶核苷酸序列包含 BCL11A紅系細胞強化子的多核苷酸序列。在一些實施例中，所述靶核苷酸序列包含 BCL11A基因的內含子2中的多核苷酸序列。在一些實施例中，所述靶核苷酸序列包含在 BCL11A轉錄起始位點（TSS）的下游（在3'方向上）約+54 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含在 BCL11ATSS的下游約+54 kb與約+56 kb之間的多核苷酸序列、約+57 kb與約+59 kb之間的多核苷酸、或約+62 kb與約+63 kb之間的多核苷酸、或其任何組合。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含在 BCL11ATSS的下游約+54 kb與約+56 kb之間的多核苷酸序列。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含在 BCL11ATSS的下游約+57 kb與約+59 kb之間的多核苷酸序列。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列強化子包含在 BCL11ATSS的下游約+62 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列。在一些實施例中，所述靶核苷酸序列包含在 BCL11ATSS的下游+55 kb、+58 kb或+62 kb處核苷酸位置的約100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1.0 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb或1.5 kb距離內的多核苷酸序列或其組合。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含在 BCL11ATSS的下游+55 kb處核苷酸位置的約100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1.0 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb或1.5 kb距離內的多核苷酸序列。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含在 BCL11ATSS的下游+58 kb處核苷酸位置的約100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1.0 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb或1.5 kb距離內的多核苷酸序列。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含在 BCL11ATSS的下游+62 kb處核苷酸位置的約100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1.0 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb或1.5 kb距離內的多核苷酸序列。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含GTGATAAAAGCAACTGTTAG（SEQ ID NO: 62）的多核苷酸序列，或其包含至多10（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10）個核苷酸取代的變體。 [0326]在一些實施例中，所述靶核苷酸序列包含選自以下的基因的編碼區的至少15個連續核苷酸： HBB 、 HBG1 、 HBG2 、 HBA1 、 HBA2 、 HBD 、 BCL11A 、 BACH2 、 KLF1、 LRF 、 ADA、DCLREIC、 IL2RG、 RAG1、 RAG2、 JAK3、 BTK 、 WAS 、 F8 、 F9 、 F11 、 F10 、 PKLR 、 RPS19 、 CYBA 、 CYBB 、 NCF1 、 NCF1B 、 NCF1C 、 NCF2 、 NCF4 、 ELANE 、 ABCD1 、 ARSA 、 FXN 、 GBA 、 IDS 、 IDUA 、 TCIRG 、 AICDA 、 UNG 、 CD40 、 CD40LG、FOXP3、 IL4、 IL10、 IL13、 IL7R、 PRF1、 FANCA、 FANCB、 FANCC、 FANCD1/BRACA2、 FANCD2、 MPL、 CCR5、 CXCR4、 F5、 F2、抗凝血酶III基因和蛋白C基因。在一些實施例中，所述靶核苷酸序列包含選自以下的基因的周圍5'非轉譯區或3’非轉譯區的至少15個連續核苷酸： HBB 、 HBG1 、 HBG2 、 HBA1 、 HBA2 、 HBD 、 BCL11A 、 BACH2 、 KLF1、 LRF 、 ADA、DCLREIC、 IL2RG、 RAG1、 RAG2、 JAK3、 BTK 、 WAS 、 F8 、 F9 、 F11 、 F10 、 PKLR 、 RPS19 、 CYBA 、 CYBB 、 NCF1 、 NCF1B 、 NCF1C 、 NCF2 、 NCF4 、 ELANE 、 ABCD1 、 ARSA 、 FXN 、 GBA 、 IDS 、 IDUA 、 TCIRG 、 AICDA 、 UNG 、 CD40 、 CD40LG、FOXP3、 IL4、 IL10、 IL13、 IL7R、 PRF1、 FANCA、 FANCB、 FANCC、 FANCD1/BRACA2、 FANCD2、 MPL、 CCR5、 CXCR4、 F5、 F2、抗凝血酶III基因和蛋白C基因。在一些實施例中，所述靶核苷酸序列包含與選自以下的基因相關的內含子區或外顯子區的至少15個連續核苷酸： HBB 、 HBG1 、 HBG2 、 HBA1 、 HBA2 、 HBD 、 BCL11A 、 BACH2 、 KLF1、 LRF 、 ADA、DCLREIC、 IL2RG、 RAG1、 RAG2、 JAK3、 BTK 、 WAS 、 F8 、 F9 、 F11 、 F10 、 PKLR 、 RPS19 、 CYBA 、 CYBB 、 NCF1 、 NCF1B 、 NCF1C 、 NCF2 、 NCF4 、 ELANE 、 ABCD1 、 ARSA 、 FXN 、 GBA 、 IDS 、 IDUA 、 TCIRG 、 AICDA 、 UNG 、 CD40 、 CD40LG、FOXP3、 IL4、 IL10、 IL13、 IL7R、 PRF1、 FANCA、 FANCB、 FANCC、 FANCD1/BRACA2、 FANCD2、 MPL、 CCR5、 CXCR4、 F5、 F2、抗凝血酶III基因和蛋白C基因。在一些實施例中，所述靶核苷酸序列包含與選自以下的基因相關的調節區的至少15個連續核苷酸： HBB 、 HBG1 、 HBG2 、 HBA1 、 HBA2 、 HBD 、 BCL11A 、 BACH2 、 KLF1、 LRF 、 ADA、DCLREIC、 IL2RG、 RAG1、 RAG2、 JAK3、 BTK 、 WAS 、 F8 、 F9 、 F11 、 F10 、 PKLR 、 RPS19 、 CYBA 、 CYBB 、 NCF1 、 NCF1B 、 NCF1C 、 NCF2 、 NCF4 、 ELANE 、 ABCD1 、 ARSA 、 FXN 、 GBA 、 IDS 、 IDUA 、 TCIRG 、 AICDA 、 UNG 、 CD40 、 CD40LG、FOXP3、 IL4、 IL10、 IL13、 IL7R、 PRF1、 FANCA、 FANCB、 FANCC、 FANCD1/BRACA2、 FANCD2、 MPL、 CCR5、 CXCR4、 F5、 F2、抗凝血酶III基因和蛋白C基因。在一些實施例中，所述靶核苷酸序列包含與選自以下的基因相關的強化子區的至少15個連續核苷酸： HBB 、 HBG1 、 HBG2 、 HBA1 、 HBA2 、 HBD 、 BCL11A 、 BACH2 、 KLF1、 LRF 、 ADA、DCLREIC、 IL2RG、 RAG1、 RAG2、 JAK3、 BTK 、 WAS 、 F8 、 F9 、 F11 、 F10 、 PKLR 、 RPS19 、 CYBA 、 CYBB 、 NCF1 、 NCF1B 、 NCF1C 、 NCF2 、 NCF4 、 ELANE 、 ABCD1 、 ARSA 、 FXN 、 GBA 、 IDS 、 IDUA 、 TCIRG 、 AICDA 、 UNG 、 CD40 、 CD40LG、FOXP3、 IL4、 IL10、 IL13、 IL7R、 PRF1、 FANCA、 FANCB、 FANCC、 FANCD1/BRACA2、 FANCD2、 MPL、 CCR5、 CXCR4、 F5、 F2、抗凝血酶III基因和蛋白C基因。在一些實施例中，所述靶核苷酸序列包含與選自以下的基因相關的抑制子區的至少15個連續核苷酸： HBB 、 HBG1 、 HBG2 、 HBA1 、 HBA2 、 HBD 、 BCL11A 、 BACH2 、 KLF1、 LRF 、 ADA、DCLREIC、 IL2RG、 RAG1、 RAG2、 JAK3、 BTK 、 WAS 、 F8 、 F9 、 F11 、 F10 、 PKLR 、 RPS19 、 CYBA 、 CYBB 、 NCF1 、 NCF1B 、 NCF1C 、 NCF2 、 NCF4 、 ELANE 、 ABCD1 、 ARSA 、 FXN 、 GBA 、 IDS 、 IDUA 、 TCIRG 、 AICDA 、 UNG 、 CD40 、 CD40LG、FOXP3、 IL4、 IL10、 IL13、 IL7R、 PRF1、 FANCA、 FANCB、 FANCC、 FANCD1/BRACA2、 FANCD2、 MPL、 CCR5、 CXCR4、 F5、 F2、抗凝血酶III基因和蛋白C基因。在一些實施例中，所述靶核苷酸序列包含 BCL11A紅系細胞強化子或位於其內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含 BCL11A基因的內含子2中的多核苷酸序列或位於其內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含在 BCL11A轉錄起始位點（TSS）的下游約+54 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列或位於其內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含在 BCL11ATSS的下游約+54 kb與約+56 kb之間的多核苷酸序列、約+57 kb與約+59 kb之間的多核苷酸序列、或約+62 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列、或其組合，或位於它們內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含在 BCL11ATSS的下游+55 kb、+58 kb或+62 kb處核苷酸位置的約100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1.0 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb或1.5 kb距離內的多核苷酸序列或其組合，或位於它們內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含GTGATAAAAGCAACTGTTAG（SEQ ID NO: 62）的多核苷酸序列，或其包含至多10（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10）個核苷酸取代的變體。 [0327]在一些實施例中，所述有效載荷包括gRNA或pegRNA，其與包含 BCL11A紅系細胞強化子的多核苷酸的至少15個連續核苷酸具有至少80%同一性或互補性。在一些實施例中，所述有效載荷的gRNA或pegRNA包含以下序列，所述序列與包含 BCL11A紅系細胞強化子的多核苷酸的至少15個連續核苷酸具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性或互補性。在一些實施例中，所述有效載荷的gRNA或pegRNA包含以下序列，所述序列與包含 BCL11A紅系細胞強化子的多核苷酸的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個連續核苷酸具有至少80%同一性或互補性。在一些實施例中，所述有效載荷的gRNA或pegRNA包含以下序列，所述序列與包含 BCL11A紅系細胞強化子的多核苷酸的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個連續核苷酸具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性或互補性。在一些實施例中，所述有效載荷的gRNA或pegRNA包含以下序列，所述序列與包含 BCL11A紅系細胞強化子的多核苷酸的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個連續核苷酸具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性或互補性。在某些實施例中，所述有效載荷的gRNA或pegRNA包含以下序列，所述序列與 BCL11A基因的內含子2中的多核苷酸序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個連續核苷酸具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性或互補性。在某些實施例中，所述有效載荷的gRNA或pegRNA包含以下序列，所述序列與 BCL11A轉錄起始位點（TSS）的下游約+54 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個連續核苷酸具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性或互補性。在某些實施例中，所述有效載荷的gRNA或pegRNA包含以下序列，所述序列與在 BCL11ATSS的下游約+54 kb與約+56 kb之間的多核苷酸序列、約+57 kb與約+59 kb之間的多核苷酸序列、或約+62 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列、或其組合的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個連續核苷酸具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性或互補性。在某些實施例中，所述有效載荷的gRNA或pegRNA包含以下序列，所述序列與在 BCL11ATSS的下游+55 kb、+58 kb或+62 kb處核苷酸位置的約100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1.0 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb或1.5 kb距離內的多核苷酸序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個連續核苷酸具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性或互補性。在某些實施例中，所述gRNA包含GTGATAAAAGCAACTGTTAG（SEQ ID NO: 62）的多核苷酸序列，或其包含至多10（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10）個核苷酸取代的變體。 [0328]在某些實施例中，所述LNP組合物可以包括一種或多種其他組分，包括但不限於一種或多種醫藥上可接受的賦形劑、疏水性小分子、治療劑、碳水化合物、聚合物、滲透性增強分子和表面改變劑。 [0329]在一些實施例中，在所得的LNP組合物中所述脂質組分與所述有效載荷（例如核酸，例如mRNA）的wt/wt比是從約1 : 1至約50 : 1。在某些實施例中，在所得的組合物中所述脂質組分與所述有效載荷（例如核酸，例如mRNA）的wt/wt比是從約5 : 1至約50 : 1。在某些實施例中，wt/wt比是從約5 : 1至約40 : 1。在某些實施例中，wt/wt比是從約10 : 1至約40 : 1。在某些實施例中，wt/wt比是從約15 : 1至約25 : 1。 [0330]在某些實施例中，在所述脂質奈米粒子中所述有效載荷（例如核酸，例如mRNA）的包封效率是至少50%。在某些實施例中，包封效率是至少80%、至少90%或大於90%。 [0331]可以設計脂質組合物用於一種或多種特定的應用或靶標。例如，LNP組合物可以被設計成向哺乳動物體內的特定細胞、組織、器官或系統或其組遞送核酸（例如，mRNA、gRNA和/或供體範本核酸）。可以改變LNP組合物的物理化學特性，以便增加對受試者內的特定靶位點的選擇性。例如，可以基於不同器官的開窗大小來調整細微性。LNP組合物中包括的核酸還可以取決於一種或多種所需的遞送靶標。例如，可以選擇mRNA、gRNA和/或供體範本核酸用於特定疾病和/或用於遞送至特定細胞、組織、器官或系統或其組（例如，局部或特異性遞送）。 [0332]LNP組合物中核酸（例如，mRNA、gRNA和/或供體範本核酸）的量可以取決於核酸的大小、序列和其他特徵。LNP中核酸的量還可以取決於所述LNP組合物的大小、組成、所需的靶標和其他特徵。核酸和其他要素（例如，脂質）的相對量也可以變化。可以例如使用吸收光譜法（例如，紫外-可見光譜法）測量LNP組合物中核酸的量。 [0333]在一些實施例中，可以選擇所述一種或多種核酸（例如，mRNA、gRNA和/或供體範本核酸）、脂質和聚合物及其量，以提供特定的N : P比（可帶正電荷的脂質或聚合物胺（N = 氮）基團與帶負電荷的核酸磷酸（P）基團的比率）。所述組合物的N : P比是指一種或多種脂質中的氮原子與核酸中的磷酸基團數的莫耳比。通常，優選較低的N : P比。N : P比可以取決於特定的脂質及其pKa。在某些實施例中，可以選擇所述核酸（例如，mRNA、gRNA和/或供體範本核酸）和LNP組合物和/或其相對量，以提供從約1 : 1至約30 : 1或從約1 : 1至約20 : 1的N : P比。在某些實施例中，N : P比可以是例如1 : 1、2 : 1、3 : 1、4 : 1、5 : 1、6 : 1、7 : 1或8 : 1。在某些實施例中，N : P比可以是從約2 : 1至約5 : 1。在某些實施例中，N : P比可以是約4 : 1。在其他實施例中，N : P比是從約4 : 1至約8 : 1。例如，N : P比可以是約4 : 1、約4.5 : 1、約4.6 : 1、約4.7 : 1、約4.8 : 1、約4.9 : 1、約5.0 : 1、約5.1 : 1、約5.2 : 1、約5.3 : 1、約5.4 : 1、約5.5 : 1、約5.6 : 1、約5.7 : 1、約6.0 : 1、約6.5 : 1或約7.0 : 1。 [0334]脂質奈米粒子組合物中核酸（例如，mRNA、gRNA和/或供體範本核酸）的量可以取決於核酸的大小、序列和其他特徵。脂質奈米粒子組合物中核酸的量還可以取決於所述奈米粒子組合物的大小、組成、所需的靶標和其他特徵。核酸和其他要素（例如，脂質）的相對量也可以變化。在一些實施例中，脂質奈米粒子組合物中所述脂質組分與核酸（例如，mRNA、gRNA和/或供體範本核酸）的wt/wt比可以是從約5 : 1至約50 : 1，如5 : 1、6 : 1、7 : 1、8 : 1、9 : 1、10 : 1、11 : 1、12 : 1、13 : 1、14 : 1、15 : 1、16 : 1、17 : 1、18 : 1、19 : 1、20 : 1、25 : 1、30 : 1、35 : 1、40 : 1、45 : 1和50 : 1。例如，所述脂質組分與mRNA的wt/wt比可以是從約10 : 1至約40 : 1。可以例如使用吸收光譜法（例如，紫外-可見光譜法）測量奈米粒子組合物中核酸的量。 [0335]核酸（例如，mRNA、gRNA和/或供體範本核酸）的包封效率描述了相對於所提供的初始量，在製備後包封或以其他方式與脂質組合物締合的核酸的量。包封效率理想地高（例如，接近100%）。可以例如通過比較在用一種或多種有機溶劑或去污劑分解所述LNP組合物之前和之後含有所述LNP組合物的溶液中核酸的量來測量包封效率。螢光可以用於測量溶液中游離核酸的量。對於本發明的LNP組合物，核酸的包封效率可以是至少50%，例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在某些實施例中，包封效率可以是至少80%。 i. RNA 有效載荷 [0336]在某些實施例中，所述RNA有效載荷包括mRNA、指導RNA（gRNA）、先導編輯指導RNA（pegRNA）、CRISPR-RNA（crRNA）、反式啟動CRISPR RNA（tracrRNA）、tRNA、微小RNA和/或siRNA。 [0337]在某些實施例中，所述脂質奈米粒子組合物被優化用於遞送RNA，例如，用於在靶細胞（例如HSC）內轉譯的mRNA和/或用於與靶細胞（例如HSC）內的定點核酸酶（例如CRISPR相關（Cas）核酸酶）複合的gRNA或pegRNA。mRNA可以是天然或非天然存在的mRNA。mRNA、gRNA或pegRNA可以包括一個或多個經修飾的核鹼基、核苷或核苷酸。 [0338]所述核鹼基可以選自由以下組成的非限制性組：腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-羥基甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、假尿嘧啶、二氫尿嘧啶、N1-甲基假尿嘧啶、次黃嘌呤和黃嘌呤。在一些實施例中，核鹼基是N1-甲基假尿嘧啶。 [0339]RNA（例如mRNA或gRNA）的核苷是包括糖分子（例如，5碳或6碳糖，如戊糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖或其去氧衍生物）與核鹼基的組合的化合物。核苷可以是經典核苷（例如，腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷、5-甲基尿苷、去氧腺苷、去氧鳥苷、去氧胞苷、去氧尿苷和胸苷）或其類似物，並且可以包括一個或多個取代或修飾。 [0340]RNA（例如mRNA或gRNA）的核苷酸是含有核苷和磷酸基團或替代基團（例如，硼酸磷酸酯、硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、膦酸酯、烷基、醯胺化物和甘油）的化合物。核苷酸可以是經典核苷酸（例如，腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷、5-甲基尿苷、去氧腺苷、去氧鳥苷、去氧胞苷、去氧尿苷和胸苷單磷酸）或其類似物，並且可以包括一個或多個取代或修飾，包括但不限於烷基、芳基、鹵基、側氧基、羥基、烷氧基和/或硫代取代；一個或多個稠環或開環；核鹼基、糖和/或磷酸或替代組分的氧化和/或還原。核苷酸可以包括一個或多個磷酸或替代基團。例如，核苷酸可以包括核苷和三磷酸基團。「核苷三磷酸」（例如，鳥苷三磷酸、腺苷三磷酸、胞苷三磷酸和尿苷三磷酸）可以指代經典核苷三磷酸或其類似物或衍生物，並且可以包括如本文所述的一個或多個取代或修飾。 [0341]RNA（例如mRNA或gRNA）可以包括任何數目的鹼基對，包括數十、數百或數千個鹼基對。任何數目（例如，全部、一些或沒有）的核鹼基、核苷或核苷酸可以是經典種類的、取代的、修飾的或以其他方式非天然存在的類似物。在某些實施例中，可以修飾特定核鹼基類型的全部。例如，RNA（例如mRNA或gRNA）中的所有胞嘧啶可以是5-甲基胞嘧啶。在某些實施例中，一個或多個或所有尿苷鹼基可以是N1-甲基假尿苷。mRNA可以包括5'非轉譯區、3'非轉譯區和/或編碼或轉譯序列。 [0342]在某些實施例中，mRNA可以包括5'帽結構、鏈終止核苷酸、莖環、polyA序列和/或多腺苷酸化信號。 [0343]帽結構或帽種類是包括通過連接子連接的兩個核苷部分的化合物，並且可以選自天然存在的帽、非天然存在的帽或帽類似物。帽種類可以包括一個或多個經修飾的核苷和/或連接子部分。例如，天然mRNA帽可以包括在其5'位處通過三磷酸鍵連接的鳥嘌呤核苷酸和在7位處甲基化的鳥嘌呤（G）核苷酸，例如m7G(5')ppp(5')G，通常寫成m7GpppG。帽種類也可以是抗反向帽類似物。可能的帽種類的非限制性列表包括m7GpppG、m7Gpppm7G、m73'dGpppG、m7Gpppm7G、m73'dGpppG和m27 02'GppppG。 [0344]可替代地或另外，mRNA可以包括鏈終止核苷。例如，鏈終止核苷可以包括在其糖基的2'和/或3'位處去氧的那些核苷。此類種類可以包括3'-去氧腺苷（蟲草素）、3'-去氧尿苷、3'-去氧胞嘧啶、3'-去氧鳥苷、3'-去氧胸腺嘧啶和2',3'-二去氧核苷，如2',3'-二去氧腺苷、2',3'-二去氧尿苷、2',3'-二去氧胞嘧啶、2',3'-二去氧鳥苷和2',3'-二去氧胸腺嘧啶。 [0345]可替代地或另外，mRNA可以包括莖環，如組蛋白莖環。莖環可以包括1、2、3、4、5、6、7、8個或更多個核苷酸鹼基對。例如，莖環可以包括4、5、6、7或8個核苷酸鹼基對。莖環可以位於mRNA的任何區域。例如，莖環可以位於非轉譯區（5'非轉譯區或3'非轉譯區）、編碼區或polyA序列或尾中，在其之前或在其之後。 [0346]可替代地或另外，mRNA可以包括polyA序列和/或多腺苷酸化信號。polyA序列可以完全或主要由腺嘌呤核苷酸或其類似物或衍生物組成。polyA序列可以是位於mRNA的3'非轉譯區附近的尾。 [0347]mRNA可以編碼任何目的多肽，包括任何天然或非天然存在的或以其他方式修飾的多肽。由mRNA編碼的多肽可以具有任何大小，並且可以具有任何二級結構或活性。在一些實施例中，當在細胞中表現時，由mRNA編碼的多肽可以具有治療效果。在一些實施例中，所述mRNA可以編碼抗體、酶、生長因子、激素、細胞因子、病毒蛋白（例如，病毒衣殼蛋白）、抗原、疫苗或受體。在一些實施例中，所述mRNA可以編碼一種或多種能夠編輯靶細胞內（例如，HSC內）的基因組序列的多肽。因此，在一些實施例中，所述mRNA編碼一種或多種作為基因編輯系統的一部分起作用的多肽。在某些實施例中，所述mRNA編碼定點核酸酶、化學鹼基編輯器、先導編輯器或表觀基因組編輯器。在某些實施例中，所述LNP包含編碼CRISPR相關（Cas）核酸酶或鹼基編輯器的mRNA，並且還包含gRNA。在其他實施例中，所述LNP包含編碼先導編輯器的mRNA，並且還包含先導編輯器，並且還包含pegRNA。 [0348]在某些實施例中，gRNA或pegRNA可以包含一個或多個經化學修飾的核苷酸或核苷，導致gRNA的穩定性增加以及RNA指導的基因編輯系統（例如，Cas核酸酶/gRNA系統、鹼基編輯器/gRNA系統、或先導編輯器/pegRNA系統）的效率增加和脫靶編輯降低。例如，gRNA可以包括具有2'-核糖取代（例如，2'-O-甲基取代或2'-氟取代）的一個或多個核苷酸。另外，gRNA可以包括一個或多個連接修飾，如硫代磷酸酯修飾、膦醯乙酸酯修飾或硫代膦醯乙酸酯修飾。通常，將連接修飾和2'-核糖取代組合，例如，將2'-O-甲基取代和硫代磷酸酯連接組合，或將2'-O-甲基取代和硫代膦醯乙酸酯連接組合。在某些實施例中，所述gRNA包含2'-O-甲基取代和硫代磷酸酯連接兩者。在一些情形下，gRNA可以另外地或可替代地包括在核苷酸的糖部分內產生分子內連接的修飾，例如，在核糖的2'氧和4'碳之間具有連接的鎖核酸（LNA）和橋接核酸（BNA）。LNA和BNA可以摻入例如gRNA的20個核苷酸的指導序列中。gRNA還可以包括一個或多個DNA核苷酸。此類修飾可以在gRNA內的任何核苷酸或連接處摻入，例如在gRNA的一個或多個5'末端殘基或一個或多個3'末端殘基處摻入。gRNA可以在gRNA的一個、兩個、三個、四個、五個、十個或更多個5'末端核苷酸和/或3'末端核苷酸處包含本文所述的修飾。 [0349]RNA（包括mRNA和gRNA）的另外的修飾是本領域已知的，並且描述於例如以下文獻中：Chen等人（「Recent advances in chemical modifications of guide RNA, mRNA and donor template for CRISPR-mediated genome editing.」 Advanced Drug Delivery Reviews168 (2021): 246-258），以及Qui等人（「Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3」 Proc Natl Acad Sci, 2021; 118(10):e2020401118）。 [0350]除了所述LNP或所述脂質共混物中存在的脂質外，所述LNP組合物還可以包含有效載荷，例如本文所述的有效載荷。在一些實施例中，所述有效載荷是核酸，例如DNA或RNA，例如mRNA、轉移RNA（tRNA）、微小RNA或小干擾RNA（siRNA）。在某些實施例中，所述有效載荷是mRNA，例如，編碼如本文所述的定點核酸酶、化學鹼基編輯器、先導編輯器或表觀基因組編輯器的mRNA。 [0351]在某些實施例中，所述核酸中的核苷酸數是從約400至約6000。 (g) 脂質奈米粒子的物理特性 [0352]LNP組合物的特徵可以取決於脂質奈米粒子（LNP）組合物中含有的組分、其絕對或相對量。特徵還可以根據所述LNP組合物的製備方法和條件而變化。 [0353]可以改變LNP組合物的物理化學特性，以便增加對受試者內的特定靶位點的選擇性。例如，可以基於不同器官的開窗大小來調整細微性。LNP組合物中包括的mRNA RNA（例如，mRNA和/或gRNA）還可以取決於一種或多種所需的遞送靶標。例如，可以選擇mRNA和/或gRNA用於特定疾病和/或用於遞送至特定細胞、組織、器官或系統或其組（例如，局部或特異性遞送）。 [0354]LNP組合物中RNA（例如，mRNA和/或gRNA）mRNA的量可以取決於mRNA的大小、序列和其他特徵。LNP中RNA（例如，mRNA和/或gRNA）mRNA的量還可以取決於所述LNP組合物的大小、組成、所需的靶標和其他特徵。RNA（例如，mRNA和/或gRNA）mRNA和其他要素（例如，脂質）的相對量也可以變化。可以例如使用吸收光譜法（例如，紫外-可見光譜法）測量LNP組合物中RNA（例如，mRNA和/或gRNA）mRNA的量。 [0355]在一些實施例中，可以選擇所述一種或多種mRNA、脂質和聚合物及其量，以提供特定的N : P比（可帶正電荷的脂質或聚合物胺（N = 氮）基團與帶負電荷的核酸磷酸（P）基團的比率）。組合物的N : P比是指一種或多種脂質中的氮原子與mRNA中的磷酸基團數的莫耳比。通常，優選較低的N : P比。N : P比可以取決於特定的脂質及其pKa。在某些實施例中，可以選擇所述mRNA和LNP組合物和/或其相對量，以提供從約1 : 1至約30 : 1或從約1 : 1至約20 : 1的N : P比。在某些實施例中，N : P比可以是例如1 : 1、2 : 1、3 : 1、4 : 1、5 : 1、6 : 1、7 : 1或8 : 1。在某些實施例中，N : P比可以是從約2 : 1至約5 : 1。在某些實施例中，N : P比可以是約4 : 1。在其他實施例中，N : P比是從約4 : 1至約8 : 1。例如，N : P比可以是約4 : 1、約4.5 : 1、約4.6 : 1、約4.7 : 1、約4.8 : 1、約4.9 : 1、約5.0 : 1、約5.1 : 1、約5.2 : 1、約5.3 : 1、約5.4 : 1、約5.5 : 1、約5.6 : 1、約5.7 : 1、約6.0 : 1、約6.5 : 1或約7.0 : 1。 [0356]可以通過多種方法來表徵LNP組合物。例如，顯微鏡檢查（例如，透射電子顯微鏡檢查或掃描電子顯微鏡檢查）可以用於檢查LNP組合物的形態和大小分佈。動態光散射或電位測定法（例如，電位滴定）可以用於測量ζ電位。動態光散射還可以用於確定細微性。諸如Zetasizer Nano ZS（Malvern Instruments Ltd，英國烏斯特郡瑪律文）等儀器也可以用於測量LNP組合物的多種特徵，如細微性、多分散性指數和ζ電位。通過依賴於RNA結合染料（用於確定染料可及RNA的比例的ribogreen、cybergreen）的方法和LNP去配製（de-formulation）的組合，然後對總RNA含量進行HPLC分析來確定RNA包封效率。 [0357]在一些實施例中，所述LNP可以具有在1-250 nm、1-200 nm、1-150 nm、1-100 nm、50-250 nm、50-200 nm、50-150 nm、50-100 nm、75-250 nm、75-200 nm、75-150 nm、75-100 nm、100-250 nm、100-200 nm、100-150 nm範圍內的平均直徑。在某些實施例中，所述LNP組合物可以具有約1 nm、約10 nm、約20 nm、約30 nm、約40 nm、約50 nm、約60 nm、約70 nm、約80 nm、約90 nm、約100 nm、約110 nm、約120 nm、約130 nm、約140 nm、約150 nm、約160 nm、約170 nm、約180 nm、約190 nm或約200 nm的平均直徑。在一些實施例中，所述LNP具有約100 nm的平均直徑。 [0358]可替代地或另外，所述LNP組合物可以具有在從0.05-1、0.05-0.75、0.05-0.5、0.05-0.4、0.05-0.3、0.05-0.2、0.08-1、0.08-0.75、0.08-0.5、0.08-0.4、0.08-0.3、0.08-0.2、0.1-1、0.1-0.75、0.1-0.5、0.1-0.4、0.1-0.3、0.1-0.2範圍內的多分散性指數。在某些實施例中，多分散性指數在0.1-0.25、0.1-0.2、0.1-0.19、0.1-0.18、0.1-0.17、0.1-0.16或0.1-0.15的範圍內。 [0359]可替代地或另外，所述LNP組合物可以具有約-30 mV至約+30 mV的ζ電位。在某些實施例中，所述LNP組合物具有約-10 mV至約+20 mV的ζ電位。ζ電位可以隨著pH的變化而變化。因此，在某些實施例中，所述LNP組合物在pH 5.5或pH 5下可以具有約0 mV至約+30 mV、或約+10 mV至+30 mV、或約+20 mV至約+30 mV的ζ電位，和/或在pH 7.4下可以具有約-30 mV至約+5 mV或約-20 mV至約+15 mV的ζ電位。 [0360]在一些實施例中，本文提供的LNP包含可電離陽離子脂質以及固醇、中性磷脂、PEG-脂質和脂質-HSC靶向基團接合物（例如脂質-抗體接合物）中的一種或多種。在一些實施例中，所述LNP包含脂質15、結合HSC表面抗原的HSC靶向基團以及有效載荷，所述HSC靶向基團包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH結構域以及含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL結構域，其中所述VH結構域與SEQ ID NO: 7所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同一性，其中所述VL結構域與SEQ ID NO: 8所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同一性，並且所述有效載荷包含編碼靶向一個或多個基因座的基因編輯系統的組分的一種或多種核酸，其中基因編輯導致HbF增加，從而用於治療鐮狀細胞病或β-地中海貧血。在一些實施例中，所述靶核苷酸序列位於 BCL11A紅系細胞強化子內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於 BCL11A基因的內含子2中的多核苷酸序列內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於在 BCL11A轉錄起始位點（TSS）的下游約+54 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於在 BCL11ATSS的下游約+54 kb與約+56 kb之間的多核苷酸序列內、約+57 kb與約+59 kb之間的多核苷酸序列內、或約+62 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列內、或其組合內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於在 BCL11ATSS的下游+55 kb、+58 kb或+62 kb處核苷酸位置的約100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1.0 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb或1.5 kb距離內的多核苷酸序列內或其組合內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含GTGATAAAAGCAACTGTTAG（SEQ ID NO: 62）的多核苷酸序列，或其包含至多10（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10）個核苷酸取代的變體。在一些實施例中，所述LNP包含脂質15、結合HSC表面抗原的HSC靶向基團以及有效載荷，所述HSC靶向基團包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH結構域以及含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL結構域，其中所述VH結構域包含SEQ ID NO: 7所示的胺基酸序列，其中所述VL結構域包含SEQ ID NO: 8所示的胺基酸序列，並且所述有效載荷包含編碼靶向一個或多個基因座的基因編輯系統的組分的一種或多種核酸，其中基因編輯導致HbF增加，從而用於治療鐮狀細胞病或β-地中海貧血。在一些實施例中，所述靶核苷酸序列位於 BCL11A紅系細胞強化子內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於 BCL11A基因的內含子2中的多核苷酸序列內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於在 BCL11A轉錄起始位點（TSS）的下游約+54 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於在 BCL11ATSS的下游約+54 kb與約+56 kb之間的多核苷酸序列內、約+57 kb與約+59 kb之間的多核苷酸序列內、或約+62 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列內、或其組合內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於在 BCL11ATSS的下游+55 kb、+58 kb或+62 kb處核苷酸位置的約100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1.0 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb或1.5 kb距離內的多核苷酸序列內或其組合內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含GTGATAAAAGCAACTGTTAG（SEQ ID NO: 62）的多核苷酸序列，或其包含至多10（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10）個核苷酸取代的變體。在一些實施例中，將本文提供的示例性LNP遞送至患有疾病的受試者，用於進行體內基因編輯和所述疾病的治療。在一些實施例中，將本文提供的示例性LNP遞送至患有鐮狀細胞病或β-地中海貧血的受試者，用於進行受試者的體內基因編輯和治療。在一些實施例中，本文提供的示例性LNP用於治療受試者的鐮狀細胞病的用途是安全且有效的。在一些實施例中，本文提供的示例性LNP用於治療受試者的β-地中海貧血的用途是安全且有效的。 III. 生產脂質奈米粒子的方法 [0361]在一些實施例中，通過使用經由軌道渦旋器快速混合或者通過微流體混合來產生所述LNP。通過以下方式完成軌道渦旋器混合：將脂質的乙醇溶液快速添加到目的核酸的水溶液中，然後立即以2,500 rpm渦旋。在一些實施例中，使用微流體混合步驟產生所述LNP。在一些實施例中，通過使用例如以優化的混合室幾何形狀為特色的NanoAssemblr裝置和微流體晶片（Precision Nanosystems，不列顛哥倫比亞省溫哥華）在微流體通道中在受控的流速下將水流和有機流混合來實現微流體混合。在一些實施例中，所述LNP使用微流體混合步驟產生，所述微流體混合步驟快速混合乙醇脂質溶液和核酸水溶液，使所述核酸包封在所述固體脂質奈米粒子中。然後使用選擇的膜過濾裝置將奈米粒子懸浮液進行緩衝液交換到全水緩衝液中，以進行乙醇去除和奈米粒子成熟。 [0362]在某些實施例中，所得的LNP組合物包含脂質共混物，其含有例如從約40莫耳百分比至約60莫耳百分比的本文所述的一種或多種可電離陽離子脂質、從約35莫耳百分比至約50莫耳百分比的一種或多種固醇、從約5莫耳百分比至約15莫耳百分比的一種或多種中性脂質以及從約0.5莫耳百分比至約5莫耳百分比的一種或多種PEG-脂質。 V. 配製和遞送方式 [0363]本發明的LNP組合物可以全部或部分配製成醫藥組合物。所述醫藥組合物還可以包括一種或多種醫藥上可接受的賦形劑或輔助成分，如本文所述的那些。用於配製和製造醫藥組合物和藥劑的一般指南可在例如Remington's (2006) 同上中獲得。常規賦形劑和輔助成分可以用於本發明的任何醫藥組合物中，除非任何常規賦形劑或輔助成分可能與本發明的LNP組合物的一種或多種組分不相容。如果賦形劑或輔助成分與LNP組合物的組分的組合可能導致任何不希望的生物學作用或在其他方面有害的作用，則它可能與所述組分不相容。 [0364]在一些實施例中，一種或多種賦形劑或輔助成分可以構成包括本發明的LNP組合物的醫藥組合物的總質量或體積的大於50%。例如，所述一種或多種賦形劑或輔助成分可以構成醫藥組合物的30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在某些實施例中，所述賦形劑例如被美國食品和藥物管理局批准用於在人中使用和用於獸醫用途。在某些實施例中，所述賦形劑是藥物級的。在某些實施例中，賦形劑符合美國藥典（USP）、歐洲藥典（EP）、英國藥典和/或國際藥典的標準。 [0365]醫藥組合物中所述一種或多種脂質或LNP、一種或多種醫藥上可接受的賦形劑和/或任何另外的成分的相對量將根據所治療受試者的身份、體型和/或狀況以及進一步根據投予組合物的途徑而變化。 [0366]可以將脂質組合物和/或包括一種或多種LNP組合物的醫藥組合物投予任何受試者，包括可以受益於由將核酸例如RNA（例如，mRNA、gRNA、tRNA或siRNA）遞送至一種或多種特定細胞、組織、器官或系統或其組（如腎系統）提供的治療效果的人類患者。儘管本文提供的關於LNP組合物和包括LNP組合物的醫藥組合物的描述主要針對適用於投予人的組合物，但熟練技術人員應理解，此類組合物通常適用於投予任何其他哺乳動物。理解對適用於投予人的組合物進行修飾，以便使所述組合物適用於投予各種動物。 [0367]根據本公開文本的醫藥組合物可以作為單一單位劑量和/或作為多個單一單位劑量製備、包裝和/或散裝出售。如本文所用，「單位劑量」是離散量的醫藥組合物，其包含預定量的活性成分（例如，有效載荷）。 [0368]本發明的醫藥組合物可以製備成適用於多種投予途徑和方法的多種形式。例如，本發明的醫藥組合物可以製備成液體劑型（例如，乳劑、微乳劑、奈米乳劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑和酏劑）、可注射形式、固體劑型（例如，膠囊劑、片劑、丸劑、散劑和顆粒劑）、用於局部和/或經皮投予的劑型（例如，軟膏劑、糊劑、乳膏劑、洗劑、凝膠劑、散劑、溶液劑、噴霧劑、吸入劑和貼劑）、混懸劑、散劑和其他形式。 [0369]用於口服和腸胃外投予的液體劑型包括但不限於醫藥上可接受的乳劑、微乳劑、奈米乳劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑和/或酏劑。除了活性成分外，液體劑型還可以包含本領域中常用的惰性稀釋劑，例如像水或其他溶劑、增溶劑和乳化劑，如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油（特別是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油）、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和脫水山梨醇的脂肪酸酯、以及其混合物。除了惰性稀釋劑以外，口服組合物還可以包括輔助劑，如潤濕劑、乳化劑和助懸劑、甜味劑、調味劑和/或芳香劑。 [0370]可以根據已知技術使用合適的分散劑、潤濕劑和/或助懸劑配製可注射製劑，例如，無菌可注射水性或油性混懸劑。無菌可注射製劑可以是在無毒的腸胃外可接受的稀釋劑和/或溶劑中的無菌可注射溶液、懸浮液和/或乳液，例如作為1,3-丁二醇中的溶液。可以採用的可接受的媒介物和溶劑尤其是水、林格氏溶液、U.S.P.和等滲氯化鈉溶液。常規採用無菌不揮發性油作為溶劑或懸浮介質。為此目的，可以採用任何溫和的不揮發性油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。諸如油酸等脂肪酸可以用於注射劑的製備中。 [0371]可注射配製品可以例如通過以下方式來滅菌：經細菌截留過濾器過濾，和/或併入呈無菌固體組合物形式的滅菌劑，所述組合物可以在使用前溶解或分散於無菌水或其他無菌可注射介質中。 (a) 其他組分 [0372]另外，設想了所述醫藥組合物可以包括除了本文所述的那些外的一種或多種組分。 [0373]所述醫藥組合物還可以包括一種或多種滲透性增強劑分子、碳水化合物、聚合物、治療劑、表面改變劑或其他組分。滲透性增強劑分子可以是描述於例如美國專利申請公開號2005/0222064中的分子。碳水化合物可以包括單糖（例如，葡萄糖）和多糖（例如，糖原及其衍生物和類似物）。 [0374]所述醫藥組合物還可以含有表面改變劑，包括例如陰離子蛋白（例如，牛血清白蛋白）、表面活性劑（例如，陽離子表面活性劑，如二甲基二十八烷基-溴化銨）、糖或糖衍生物（例如，環糊精）、聚合物（例如，肝素、聚乙二醇和泊洛沙姆）、粘液溶解劑（例如，乙醯半胱胺酸、艾蒿（mugwort）、鳳梨蛋白酶、木瓜蛋白酶、大青屬（clerodendrum）、溴己新、羧甲司坦、依普拉酮、美司鈉、胺溴索、索布瑞醇、多米奧醇、來托司坦、司替羅寧、硫普羅寧、凝溶膠蛋白、胸腺素β4、阿法鏈道酶、奈替克新和厄多司坦）和DNA酶（例如，rhDNA酶）。表面改變劑可以放置在本文所述的組合物內和/或其表面上。 [0375]除了這些組分外，含有本發明的LNP組合物的醫藥組合物還可以包括可用於醫藥組合物的任何物質。例如，所述醫藥組合物可以包括一種或多種醫藥上可接受的賦形劑或輔助成分，如但不限於一種或多種溶劑、分散介質、稀釋劑、分散助劑、懸浮助劑、制粒助劑、崩解劑、填充劑、助流劑、液體媒介物、粘合劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑或乳化劑、緩衝劑、潤滑劑、油、防腐劑和其他種類。還可以包括諸如蠟、黃油、著色劑、包衣劑、調味劑和芳香劑等賦形劑。醫藥上可接受的賦形劑是本領域熟知的（參見例如，Remington's (2006) 同上）。 [0376]分散劑可以選自由以下組成的非限制性列表：馬鈴薯澱粉、玉米澱粉、木薯澱粉、澱粉羥乙酸鈉、粘土、海藻酸、瓜爾膠、柑橘渣、瓊脂、膨潤土、纖維素和木製品、天然海綿、陽離子交換樹脂、碳酸鈣、矽酸鹽、碳酸鈉、交聯聚(乙烯基-吡咯啶酮)（交聚維酮）、羧甲基澱粉鈉（澱粉羥乙酸鈉）、羧甲基纖維素、交聯羧甲基纖維素鈉（交聯羧甲纖維素）、甲基纖維素、預膠化澱粉（澱粉1500）、微晶澱粉、水不溶性澱粉、羧甲基纖維素鈣、矽酸鎂鋁（VEEGUM®）、十二烷基硫酸鈉、四級銨化合物和/或其組合。 [0377]表面活性劑和/或乳化劑可以包括但不限於天然乳化劑（例如，阿拉伯膠、瓊脂、海藻酸、海藻酸鈉、黃蓍膠、chondrux、膽固醇、黃原膠、果膠、明膠、蛋黃、酪蛋白、羊毛脂、膽固醇、蠟和卵磷脂）、膠質粘土（例如，膨潤土 [矽酸鋁] 和VEEGUM® [矽酸鎂鋁]）、長鏈胺基酸衍生物、高分子量醇（例如，硬脂醇、鯨蠟醇、油醇、三醋精單硬脂酸酯、乙二醇二硬脂酸酯、單硬脂酸甘油酯和丙二醇單硬脂酸酯、聚乙烯醇）、卡波姆（例如，基聚伸甲基、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物和羧基乙烯聚合物）、角叉菜膠、纖維質素生物（例如，羧甲基纖維素鈉、粉狀纖維素、羥甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素）、脫水山梨醇脂肪酸酯（例如，聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯 [TWEEN® 20]、聚氧乙烯脫水山梨醇 [TWEEN® 60]、聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯 [TWEEN® 80]、脫水山梨醇單棕櫚酸酯 [SPAN® 40]、脫水山梨醇單硬脂酸酯 [SPAN® 60]、脫水山梨醇三硬脂酸酯 [SPAN® 65]、單油酸甘油酯、脫水山梨醇單油酸酯 [SPAN® 80]）、聚氧乙烯酯（例如，聚氧乙烯單硬脂酸酯 [MYRJ® 45]、聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚乙氧基化蓖麻油、聚甲醛硬脂酸酯和SOLUTOL®）、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯（例如，CREMOPHOR®）、聚氧乙烯醚（例如，聚氧乙烯十二烷基醚 [BRIJ® 30]）、聚(乙烯基-吡咯啶酮)、二乙二醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、油酸鈉、油酸鉀、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、十二烷基硫酸鈉、PLURONIC®F 68、POLOXAMER® 188、西曲溴銨、西吡氯銨、苯紮氯銨、多庫酯鈉和/或其組合。 [0378]防腐劑的例子可以包括但不限於抗氧化劑、螯合劑、抗微生物防腐劑、抗真菌防腐劑、醇防腐劑、酸性防腐劑和/或其他防腐劑。抗氧化劑的例子包括但不限於α生育酚、抗壞血酸、抗壞血酸棕櫚酸酯、丁羥茴醚、丁羥甲苯、單硫代甘油、偏亞硫酸氫鉀、丙酸、沒食子酸丙酯、抗壞血酸鈉、亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉和/或亞硫酸鈉。螯合劑的例子包括乙二胺四乙酸（EDTA）、檸檬酸一水合物、依地酸二鈉、依地酸二鉀、依地酸、富馬酸、蘋果酸、磷酸、依地酸鈉、酒石酸和/或依地酸三鈉。抗微生物防腐劑的例子包括但不限於苯紮氯銨、苄索氯銨、苯甲醇、溴硝丙二醇、溴棕三甲銨、西吡氯銨、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲酚、甲酚、乙醇、丙三醇、海克替啶、咪脲、酚、苯氧乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇和/或硫柳汞。抗真菌防腐劑的例子包括但不限於對羥苯基甲酸丁酯、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羥基苯甲酸、苯甲酸鉀、山梨酸鉀、苯甲酸鈉、丙酸鈉和/或山梨酸。醇防腐劑的例子包括但不限於乙醇、聚乙二醇、苯甲醇、酚、酚類化合物、雙酚、氯丁醇、羥基苯甲酸酯和/或苯乙醇。酸性防腐劑的例子包括但不限於維生素A、維生素C、維生素E、β-胡蘿蔔素、檸檬酸、乙酸、脫氫抗壞血酸、抗壞血酸、山梨酸和/或植酸。其他防腐劑包括但不限於生育酚、乙酸生育酚、甲磺酸去鐵胺、溴棕三甲銨、丁羥茴醚（BHA）、丁羥甲苯（BHT）、乙二胺、十二烷基硫酸鈉（SLS）、十二烷基醚硫酸鈉（SLES）、亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鉀、偏亞硫酸氫鉀。 [0379]緩衝劑的例子包括但不限於檸檬酸鹽緩衝溶液、乙酸鹽緩衝溶液、磷酸鹽緩衝溶液、氯化銨、碳酸鈣、氯化鈣、檸檬酸鈣、葡乳醛酸鈣、葡庚糖酸鈣、葡糖酸鈣、d-葡糖酸、甘油磷酸鈣、乳酸鈣、乳糖醛酸鈣、丙酸、乙醯丙酸鈣、戊酸、二鹼式磷酸鈣、磷酸、三鹼式磷酸鈣、磷酸氫氧化鈣、乙酸鉀、氯化鉀、葡糖酸鉀、鉀混合物、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鉀混合物、乙酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、檸檬酸鈉、乳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鈉混合物、胺丁三醇、胺基磺酸鹽緩衝液（例如，HEPES）、氫氧化鎂、氫氧化鋁、海藻酸、無熱原水、等滲鹽水、林格氏溶液、乙醇和/或其組合。 [0380]在某些實施例中，所述脂質奈米粒子組合物及其配製品適於靜脈內、肌內、皮內、皮下、骨內輸注、動脈內、腫瘤內或通過吸入投予。在某些實施例中，將約0.001 mg/kg至約10 mg/kg的劑量投予受試者。根據本公開文本的組合物可以配製成劑量單位形式以便於投予和劑量的一致性。然而，應理解，本公開文本的組合物的總日用量將由主治醫師在合理的醫學判斷範圍內決定。 [0381]對於任何特定患者，具體的治療有效、預防有效或在其他方面適當的劑量水準（例如，用於成像）將取決於多種因素，包括所治療疾病（如果有的話）的嚴重程度和身份；所採用的一種或多種核酸（例如，mRNA、gRNA和/或供體範本核酸）；所採用的具體組合物；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；所採用的具體醫藥組合物的投予時間、投予途徑和排泄速率；治療的持續時間；與所採用的具體醫藥組合物組合或同時使用的藥物；以及醫學領域熟知的類似因素。 VI. 將核酸遞送至造血幹細胞的方法 [0382]本公開文本提供了將有效載荷遞送至靶細胞或組織（例如，受試者的靶細胞或組織）的方法以及用於在此類方法中使用的LNP或含有所述LNP的醫藥組合物。本文中關於例如將核酸遞送至細胞、或者例如在細胞中表現目的多肽的方法的任何公開內容也應被解釋為關於用於在此類方法中使用的LNP或包含所述LNP的醫藥組合物的公開內容。 [0383]在一些態樣，本文提供了將核酸遞送至造血幹細胞（HSC）的方法。在某些實施例中，所述方法包括在哺乳動物HSC中產生目的多肽（例如，目的蛋白質，例如定點核酸酶、化學鹼基編輯器、先導編輯器或表觀基因組編輯器）以及用於在此類方法中使用的LNP或含有所述LNP的醫藥組合物。在HSC中產生多肽的方法涉及使一個或多個HSC與包含目的mRNA（例如，編碼定點核酸酶、化學鹼基編輯器、先導編輯器或表觀基因組編輯器的mRNA，以及任選地gRNA或pegRNA）的LNP組合物接觸。在使所述HSC與所述LNP組合物接觸後，所述mRNA可以被吸收並在所述細胞中轉譯以產生目的多肽。 [0384]通常，使哺乳動物HSC與包括編碼目的多肽的mRNA的LNP組合物接觸的步驟可以在體內、離體或在體外進行。與細胞接觸的LNP組合物的量和/或其中的核酸（例如，mRNA）的量可以取決於所接觸HSC或組織的類型、投予方式、所述LNP組合物和其中的mRNA的物理化學特徵（例如，大小、電荷和化學成分）以及其他因素。通常，有效量的LNP組合物將允許在所述HSC中有效地產生多肽。效率度量可以包括多肽轉譯（由多肽表現指示）、mRNA降解水準和免疫應答指標。 [0385]使包括mRNA的LNP組合物與細胞接觸的步驟可以涉及或引起轉染，其中所述LNP組合物可以與細胞膜融合以允許將所述mRNA遞送至所述細胞中。在引入所述細胞的細胞質中後，然後經由所述細胞的細胞質內的蛋白質合成機制將所述mRNA轉譯成蛋白質或肽。 [0386]本公開文本提供了將核酸（例如，mRNA）遞送至哺乳動物HSC或組織（例如，受試者的哺乳動物HSC或組織）的方法。將核酸（例如，mRNA）遞送至這種細胞或組織涉及將包括所述核酸（例如，mRNA）的LNP組合物投予受試者，例如通過注射（例如，經由肌內注射）或血管內遞送至所述受試者。投予後，所述LNP可以靶向和/或接觸HSC。在使所述HSC與所述LNP組合物接觸後，可轉譯的mRNA可以在細胞中轉譯以產生目的多肽（例如，基因編輯系統的多肽）。 [0387]在某些實施例中，本發明的LNP組合物可以靶向特定類型或類別的細胞，例如HSC。可以使用本文所述的脂質促進這種靶向以形成LNP，其還可以包括用於靶向目的細胞的靶向基團。在某些實施例中，特異性遞送可以導致與到達另一目標（例如，不表現或僅低水準表現所述表面抗原的細胞）相比，到達靶向目標（例如，以高水準表現與所述LNP的抗體-脂質接合物結合的某些表面抗原（例如，CD105和/或CD117）的HSC）的核酸（例如，mRNA）的量增加大於2倍、5倍、10倍、15倍或20倍。 [0388]在一些實施例中，不超過1%、不超過2%、不超過3%、不超過4%、不超過5%、不超過6%、不超過7%、不超過8%、不超過9%、不超過10%、不超過15%、不超過20%、不超過25%、不超過30%、不超過35%、不超過40%、不超過45%或不超過50%的不意在成為所述遞送的目標的細胞被所述LNP轉染。在一些實施例中，不意在成為所述遞送的目標的細胞是除造血幹細胞以外的任何細胞。在一些實施例中，不超過1%、不超過2%、不超過3%、不超過4%、不超過5%、不超過6%、不超過7%、不超過8%、不超過9%、不超過10%、不超過15%、不超過20%、不超過25%、不超過30%、不超過35%、不超過40%、不超過45%或不超過50%的不意在成為所述遞送的目標的非HSC細胞被所述LNP轉染。在一些實施例中，不意在成為所述遞送的目標的細胞是不被所述方法靶向的細胞。在一些實施例中，不意在成為所述遞送的目標的細胞是不被所述方法靶向的受試者細胞。 [0389]在一些實施例中，由本文所述的LNP遞送至所述HSC的核酸或由所述LNP遞送的核酸所編碼且在所述HSC中表現的多肽的半衰期比由參考LNP遞送至所述HSC的核酸或由所述參考LNP遞送的核酸所編碼且在所述HSC中表現的多肽的半衰期長至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍。 [0390]在一些實施例中，所述LNP的組合物與所述參考LNP的組合物在以下方面不同：可電離陽離子脂質的類型、可電離陽離子脂質的相對量、PEG脂質中脂錨鉤的長度、PEG脂質的骨架或頭基、PEG脂質的相對量或HSC靶向基團的類型（例如，結合CD105和/或CD117的抗體的類型）或其任何組合。在一些實施例中，所述LNP的組合物與所述參考LNP的組合物僅在可電離陽離子脂質的類型方面不同。在一些實施例中，所述LNP的組合物與所述參考LNP的組合物僅在PEG脂質的量方面不同。在一些實施例中，所述參考LNP包含陽離子脂質Dlin-KC3-DMA，但是在其他方面與所測試的LNP相同。在一些實施例中，所述參考LNP包含陽離子脂質Dlin-KC2-DMA，但是在其他方面與所測試的LNP相同。在一些實施例中，所述參考LNP包含陽離子脂質ALC-0315，但是在其他方面與所測試的LNP相同。在一些實施例中，所述參考LNP包含陽離子脂質SM-102，但是在其他方面與所測試的LNP相同。在一些實施例中，PEG脂質是游離PEG脂質。 [0391]在一些實施例中，至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%或更多的HSC被所述LNP轉染。在一些實施例中，至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%或更多的意在成為所述遞送的目標的HSC被所述LNP轉染。在一些實施例中，所述HSC是受試者的HSC。在一些實施例中，所述HSC是被所述方法靶向的HSC（例如，被所述方法靶向的HSC的亞群）。在一些實施例中，所述HSC是被所述方法靶向的受試者的HSC（例如，被所述方法靶向的受試者的HSC的亞群）。 [0392]在一些實施例中，由所述LNP遞送的核酸的表現水準比由參考LNP遞送的核酸在相同HSC中的表現水準高至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、或至少20倍。在一些實施例中，用本文所述的方法測量和比較表現水準。在一些實施例中，通過表現所編碼多肽的HSC（例如，經轉染的HSC）的比率來測量表現水準。在一些實施例中，用FACS測量表現水準。在一些實施例中，通過在HSC中表現的所編碼多肽的平均量來測量表現水準。在一些實施例中，表現水準被測量為平均螢光強度。在一些實施例中，通過所編碼多肽或由HSC分泌的其他材料的量來測量表現水準。 [0393]在另一個態樣，本文提供了將核酸的遞送靶向至受試者的造血幹細胞（HSC）的方法。在一些實施例中，所述方法包括使所述HSC與脂質奈米粒子（LNP）接觸。在一些實施例中，所述LNP包含可電離陽離子脂質。在一些實施例中，所述LNP包含含有下式的化合物的接合物：[脂質] - [任選的連接子] - [HSC靶向基團]。在某些實施例中，所述LNP包含含有下式的化合物的脂質-抗體接合物：[脂質] - [任選的連接子] - [抗體]，其中所述抗體結合CD105和/或CD117。在一些實施例中，結合CD117的抗體包含如表B中所述的Ab1的胺基酸序列。在一些實施例中，結合CD117的抗體包含如表B中所述的Ab2的胺基酸序列。在一些實施例中，結合CD105的抗體包含如表B中所述的Ab3的胺基酸序列。在一些實施例中，結合CD117的抗體是Ab1。在一些實施例中，結合CD117的抗體是Ab2。在一些實施例中，結合CD105的抗體是Ab3。在一些實施例中，所述LNP包含固醇或其他結構脂質。在一些實施例中，所述LNP包含中性磷脂。在一些實施例中，所述LNP包含游離聚乙二醇（PEG）脂質。在一些實施例中，所述LNP包含一種或多種核酸。在一些實施例中，所述LNP包含編碼基因編輯系統的一種或多種核酸，所述基因編輯系統靶向一個或多個基因座，其中基因編輯導致HbF增加，從而用於治療疾病（例如，鐮狀細胞病和β-地中海貧血）。 [0394]在一些實施例中，本公開文本的一個態樣涉及如本文所公開的LNP或含有其的醫藥組合物，用於在將核酸的遞送靶向至受試者的造血幹細胞（HSC）的方法中使用。這種方法可以用於治療如下文所公開的疾病。在一些實施例中，如本文所公開的方法可以包括使受試者的HSC在體外或離體地與脂質奈米粒子（LNP）接觸。在優選的實施例中，如本文所公開的方法可以包括使受試者的HSC在體外與脂質奈米粒子（LNP）接觸。在一些實施例中，所述LNP是如本公開文本中所述的LNP。 [0395]在一些實施例中，所述LNP提供以下益處中的至少一種： (i) 與參考LNP相比，靶向遞送至HSC的特異性增加； (ii) 與參考LNP相比，所述核酸或由所述核酸編碼的多肽在所述HSC中的半衰期增加； (iii) 與參考LNP相比，轉染率增加；以及 (iv) 低水準的染料可及核酸（例如mRNA和/或gRNA；＜ 15%）和高的核酸（例如mRNA和/或gRNA）包封效率，其中相對於在LNP分批製備中使用的總核酸（例如mRNA和/或gRNA），在最終配製品中回收至少80%核酸（例如mRNA和/或gRNA）。 [0396]在一些態樣，提供了在受試者的靶向HSC中表現目的多肽的方法。在一些實施例中，所述方法包括使所述HSC與脂質奈米粒子（LNP）接觸。在一些實施例中，所述LNP包含可電離陽離子脂質。在一些實施例中，所述LNP包含含有以下結構的接合物：[脂質] - [任選的連接子] - [HSC靶向基團]。在某些實施例中，所述LNP包含含有下式的化合物的脂質-抗體接合物：[脂質] - [任選的連接子] - [抗體]，其中所述抗體結合CD105和/或CD117。在一些實施例中，結合CD117的抗體包含如表B中所述的Ab1的胺基酸序列。在一些實施例中，結合CD117的抗體包含如表B中所述的Ab2的胺基酸序列。在一些實施例中，結合CD105的抗體包含如表B中所述的Ab3的胺基酸序列。在一些實施例中，結合CD117的抗體是Ab1。在一些實施例中，結合CD117的抗體是Ab2。在一些實施例中，結合CD105的抗體是Ab3。在一些實施例中，所述LNP包含固醇或其他結構脂質。在一些實施例中，所述LNP包含中性磷脂。在一些實施例中，所述LNP包含游離聚乙二醇（PEG）脂質。在一些實施例中，所述LNP包含編碼所述多肽的核酸。在一些實施例中，本公開文本的一個態樣涉及如本文所公開的LNP或含有其的醫藥組合物，用於在受試者的靶向HSC中表現目的多肽的方法中使用。這種方法可以用於治療如下文所公開的疾病。在一些實施例中，如本文所公開的方法可以包括使受試者的HSC在體外或離體地與脂質奈米粒子（LNP）接觸。在優選的實施例中，如本文所公開的方法可以包括使受試者的HSC在體外與脂質奈米粒子（LNP）接觸。 [0397]在一些實施例中，所述LNP提供以下益處中的至少一種： (i) 與參考LNP相比，在所述HSC中的表現水準增加； (ii) 與參考LNP相比，在所述HSC中的表現的特異性增加； (iii) 與參考LNP相比，所述核酸或由所述核酸編碼的多肽在所述HSC中的半衰期增加； (iv) 與參考LNP相比，轉染率增加；以及 (v) 低水準的染料可及核酸（例如mRNA和/或gRNA；＜ 15%）和高的核酸（例如mRNA和/或gRNA）包封效率，其中相對於在LNP分批製備中使用的總核酸（例如mRNA和/或gRNA），在最終配製品中回收至少80%核酸（例如mRNA和/或gRNA）。本公開文本中公開的和所要求保護的LNP適用於上述方法。 [0398]在一些實施例中，本文提供的方法中遞送的LNP包含脂質15、結合HSC表面抗原的HSC靶向基團以及有效載荷，所述HSC靶向基團包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH結構域以及含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL結構域，其中所述VH結構域與SEQ ID NO: 7所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同一性，其中所述VL結構域與SEQ ID NO: 8所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同一性，並且所述有效載荷包含編碼靶向一個或多個基因座的基因編輯系統的組分的一種或多種核酸，其中基因編輯導致HbF增加，從而用於治療鐮狀細胞病或β-地中海貧血。在一些實施例中，所述靶核苷酸序列位於 BCL11A紅系細胞強化子內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於 BCL11A基因的內含子2中的多核苷酸序列內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於在 BCL11A轉錄起始位點（TSS）的下游約+54 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於在 BCL11ATSS的下游約+54 kb與約+56 kb之間的多核苷酸序列內、約+57 kb與約+59 kb之間的多核苷酸序列內、或約+62 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列內、或其組合內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於在 BCL11ATSS的下游+55 kb、+58 kb或+62 kb處核苷酸位置的約100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1.0 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb或1.5 kb距離內的多核苷酸序列內或其組合內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含GTGATAAAAGCAACTGTTAG（SEQ ID NO: 62）的多核苷酸序列，或其包含至多10（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10）個核苷酸取代的變體。在一些實施例中，本文提供的方法中遞送的LNP包含脂質15、結合HSC表面抗原的HSC靶向基團以及有效載荷，所述HSC靶向基團包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH結構域以及含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL結構域，其中所述VH結構域包含SEQ ID NO: 7所示的胺基酸序列，其中所述VL結構域包含SEQ ID NO: 8所示的胺基酸序列，並且所述有效載荷包含編碼靶向一個或多個基因座的基因編輯系統的組分的一種或多種核酸，其中基因編輯導致HbF增加，從而用於治療鐮狀細胞病或β-地中海貧血。在一些實施例中，所述靶核苷酸序列位於 BCL11A紅系細胞強化子內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於 BCL11A基因的內含子2中的多核苷酸序列內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於在 BCL11A轉錄起始位點（TSS）的下游約+54 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於在 BCL11ATSS的下游約+54 kb與約+56 kb之間的多核苷酸序列內、約+57 kb與約+59 kb之間的多核苷酸序列內、或約+62 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列內、或其組合內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於在 BCL11ATSS的下游+55 kb、+58 kb或+62 kb處核苷酸位置的約100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1.0 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb或1.5 kb距離內的多核苷酸序列內或其組合內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含GTGATAAAAGCAACTGTTAG（SEQ ID NO: 62）的多核苷酸序列，或其包含至多10（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10）個核苷酸取代的變體。在一些實施例中，使用本文提供的示例性LNP的遞送來在體外、離體和體內編輯HSC細胞。在一些實施例中，使用本文提供的示例性LNP來在體內編輯HSC細胞。在一些實施例中，將本文提供的示例性LNP遞送至患有疾病的受試者，用於進行體內基因編輯和所述疾病的治療。在一些實施例中，將本文提供的示例性LNP遞送至患有鐮狀細胞病或β-地中海貧血的受試者，用於進行受試者的體內基因編輯和治療。在一些實施例中，本文提供的示例性LNP用於治療受試者的鐮狀細胞病的用途是安全且有效的。在一些實施例中，本文提供的示例性LNP用於治療受試者的β-地中海貧血的用途是安全且有效的。 VII. 在造血幹細胞中進行基因編輯的方法 [0399]本公開文本提供了將編碼基因編輯系統（例如，定點核酸酶，以及任選地指導RNA）的有效載荷遞送至靶細胞或組織（例如，受試者的靶細胞或組織）的方法以及用於在此類方法中使用的LNP或含有所述LNP的醫藥組合物。本公開文本還提供了在受試者體外和體內對造血幹細胞（HSC）進行遺傳修飾的方法。本文中關於例如治療疾病、或者例如將核酸遞送至細胞（例如，所述核酸在細胞中表現基因編輯系統）、或者例如對細胞進行遺傳修飾的方法的任何公開內容也應被解釋為關於用於在此類方法中使用的LNP或包含所述LNP的醫藥組合物的公開內容。 (a) 基因編輯系統和方法 [0400]在一些實施例中，本文所公開的LNP可以包含編碼基因編輯系統的組分的一種或多種核酸。基因編輯系統被設計為特異性識別DNA分子中的靶核酸序列，從而誘導DNA分子中的修飾。所述修飾可以包括DNA分子的核苷酸序列中的修飾，或者可以包括DNA分子中的一個或多個核苷酸的化學修飾（例如，甲基化）。可用於本文所公開的方法中的基因編輯系統包括例如定點核酸酶基因編輯系統、化學鹼基編輯器、先導編輯器和表觀基因組編輯器。 [0401]在特定實施例中，本文所公開的方法利用LNP，所述LNP包含一種或多種編碼定點核酸酶基因編輯系統組分的核酸，例如編碼定點核酸酶的mRNA。定點核酸酶可以在靶核苷酸序列中產生一個或多個單鏈DNA切口或雙鏈DNA斷裂（DSB）。在一些情形下，可以通過使用產生單鏈切口的兩種核酸酶（切口酶）在包含靶核苷酸序列的DNA分子中實現DSB。每種切口酶可以切割DNA的一條鏈，並且使用兩種或更多種切口酶可以在靶核苷酸序列中產生DSB（例如，交錯的DSB）。在優選的實施例中，所述定點核酸酶與供體範本核酸組合使用，所述供體範本核酸經由同源重組引入靶核苷酸序列中的DNA DSB位點處。 [0402]在一些實施例中，本文所公開的LNP可以包含編碼定點核酸酶的mRNA。在本文所公開的方法中，定點核酸酶可以在靶核苷酸序列中產生一個或多個單鏈DNA切口或雙鏈DNA斷裂（DSB）。在一些情形下，可以通過使用產生單鏈切口的兩種核酸酶（切口酶）在包含靶核苷酸序列的DNA分子中實現DSB。每種切口酶可以切割DNA的一條鏈，並且使用兩種或更多種切口酶可以在靶核苷酸序列中產生DSB（例如，交錯的DSB）。在優選的實施例中，所述定點核酸酶與供體範本核酸組合使用，所述供體範本核酸經由同源重組引入靶核苷酸序列中的DNA DSB位點處。 [0403]定點核酸酶可以包含一個或多個DNA結合結構域和一個或多個DNA切割結構域（例如，一個或多個核酸內切酶和/或核酸外切酶結構域）、以及任選地一個或多個多肽連接子。可以從天然存在的定點核酸酶或從先前工程化的定點核酸酶設計和/或修飾定點核酸酶。工程化定點核酸酶還可以包含一個或多個另外的功能結構域，例如，表現出3-5′核酸外切酶（例如，Trex2）、5-3′鹼性核酸外切酶、5-3′核酸外切酶、5'瓣狀核酸內切酶、解旋酶或非範本依賴性DNA聚合酶活性的末端加工酶的末端加工酶促結構域。 [0404]本文所述的LNP可以包含編碼任何已知的定點核酸酶的mRNA，所述定點核酸酶包括例如成簇規律間隔短回文重複序列（CRISPR）相關（Cas）核酸酶、鋅指核酸酶（ZFN）、轉錄啟動因子樣效應物核酸酶（TALEN）、megaTAL和歸巢核酸內切酶（大範圍核酸酶）。在一些情形下，定點核酸酶是RNA指導的核酸酶，並且需要RNA序列以將所述核酸酶靶向靶位點（例如，CRISPR/Cas）。在其他情形下，定點核酸酶包含一個或多個異源DNA結合結構域和切割結構域（例如，ZFN、TALEN、megaTAL）。在又其他情形下，可以改變天然存在的核酸酶的DNA結合結構域以結合選擇的靶位點（例如，已被工程化以結合與同源結合位點不同的位點的大範圍核酸酶）。 i. CRISPR/Cas 基因編輯系統 [0405]在一些實施例中，所述定點核酸酶是Cas核酸酶。可以將CRISPR（成簇規律間隔短回文重複序列）/Cas（CRISPR相關）核酸酶系統引入細胞中並工程化以結合靶核苷酸序列並將單鏈切口或雙鏈斷裂（DSB）引入靶核苷酸序列中。CRISPR/Cas基因編輯系統基於已用於哺乳動物基因組工程化的天然細菌系統。CRISPR-Cas系統是本領域已知的，並且描述於例如以下文獻中：Jinek（「A programmable dual-RNA–guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.」 Science337.6096 (2012): 816-821）；Jinek（「RNA-programmed genome editing in human cells.」 Elife2 (2013): e00471）；Mali（「RNA-guided human genome engineering via Cas9.」 Science339.6121 (2013): 823-826）；Qi（「Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.」 Cell152.5 (2013): 1173-1183）；Ran（「Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.」 Nature protocols8.11 (2013): 2281-2308）；Zetsche（「Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.」 Cell163.3 (2015): 759-771.）。 [0406]在一些實施例中，所述LNP包含編碼Cas核酸酶的mRNA和賦予所述Cas核酸酶與所述靶核苷酸序列的結合的一種或多種RNA，例如反式啟動cRNA（tracrRNA）和CRISPR RNA（crRNA）或更常見地指導RNA（gRNA，也稱為單指導RNA（sgRNA）），其中將crRNA和tracrRNA工程化到一個RNA分子中。 [0407]在一些情形下，所述Cas核酸酶被工程化為雙鏈DNA核酸內切酶、切口酶或催化失活型Cas（dCas），並且與gRNA或crRNA/tracrRNA形成靶標複合物，用於在靶核苷酸序列處進行位點特異性DNA識別。gRNA和cRNA包含與靶核苷酸序列的原型間隔子靶序列共用同源性/互補性的原型間隔子序列。原型間隔子賦予Cas/gRNA複合物與靶核苷酸序列的結合。原型間隔子靶序列鄰接短的原型間隔子鄰近基序（PAM），所述PAM在將Cas/RNA複合物募集到靶位點中起作用。不同類型的Cas核酸酶識別不同的具體PAM基序。CRISPR/Cas系統可以用於靶向和切割靶核苷酸序列，所述靶核苷酸序列側接有對CRISPR/Cas系統的特定Cas核酸酶具有特異性的特定3' PAM序列。用於具體Cas核酸酶的PAM是本領域已知的，並且還可以使用本領域（包括例如Esvelt（「Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing.」 Nature methods10.11 (2013): 1116-1121））中描述的生物資訊學方法或實驗方法來鑒定。 [0408]在某些實施例中，所述Cas核酸酶可以包含一個或多個異源DNA結合結構域，所述一個或多個異源DNA結合結構域可以增加靶核苷酸序列處的DNA切割效率和特異性。Cas核酸酶可以任選地包含一個或多個連接子和/或另外的功能結構域，例如，表現出5-3′核酸外切酶、5-3′鹼性核酸外切酶、3-5′核酸外切酶（例如，Trex2）、5′瓣狀核酸內切酶、解旋酶或非範本依賴性DNA聚合酶活性的末端加工酶的末端加工酶促結構域。在一些實施例中，可以用末端加工酶將Cas核酸酶引入到造血幹細胞（HSC）中，所述末端加工酶表現出5-3′核酸外切酶、5-3′鹼性核酸外切酶、3-5′核酸外切酶（例如，Trex2）、5′瓣狀核酸內切酶、解旋酶或非範本依賴性DNA聚合酶活性。所述Cas核酸酶和3′加工酶可以分別引入例如不同的載體或單獨的核酸中，或例如作為融合蛋白一起引入，或引入由病毒自切割肽或IRES元件分開的多順反子構建體中。 [0409]在各種實施例中，所述Cas核酸酶是Cas9或Cpf1。 [0410]適用於特定實施例的Cas9核酸酶可以例如從以下細菌物種獲得，所述細菌物種包括但不限於：屎腸球菌（ Enterococcus faecium）、義大利腸球菌（ Enterococcus italicus）、無害李斯特菌（ Listeria innocua）、單核細胞增生李斯特菌（ Listeria monocytogenes）、斯氏李斯特菌（ Listeria seeligeri）、依氏李斯特菌（ Listeria ivanovii）、無乳鏈球菌（ Streptococcus agalactiae）、咽峽炎鏈球菌（ Streptococcus anginosus）、牛鏈球菌（ Streptococcus bovis）、停乳鏈球菌（ Streptococcus dysgalactiae）、馬鏈球菌（ Streptococcus equinus）、解沒食子酸鏈球菌（ Streptococcus gallolyticus）、獼猴鏈球菌（ Streptococcus macacae）、變形鏈球菌（ Streptococcus mutans）、假豕鏈球菌（ Streptococcus pseudoporcinus）、釀膿鏈球菌（ Streptococcus pyogenes）、嗜熱鏈球菌（ Streptococcus thermophilus）、格氏鏈球菌（ Streptococcus gordonii）、嬰兒鏈球菌（ Streptococcus infantarius）、馬其頓鏈球菌（ Streptococcus macedonicus）、緩症鏈球菌（ Streptococcus mitis）、巴氏鏈球菌（ Streptococcus pasteurianus）、豬鏈球菌（ Streptococcus suis）、前庭鏈球菌（ Streptococcus vestibularis）、血鏈球菌（ Streptococcus sanguinis）、汗毛鏈球菌（ Streptococcus downei）、桿菌狀奈瑟菌（ Neisseria bacilliformis）、灰色奈瑟菌（ Neisseria cinerea）、黃色奈瑟菌（ Neisseria flavescens）、乳糖奈瑟菌（ Neisseria lactamica）、腦膜炎奈瑟菌（ Neisseria meningitidis）、微黃奈瑟菌（ Neisseria subflava）、短乳桿菌（ Lactobacillus brevis）、布氏乳桿菌（ Lactobacillus buchneri）、乾酪乳桿菌（ Lactobacillus casei）、副乾酪乳桿菌（ Lactobacillus paracasei）、發酵乳桿菌（ Lactobacillus fermentum）、格氏乳桿菌（ Lactobacillus gasseri）、詹氏乳桿菌（ Lactobacillusjensenii）、約氏乳桿菌（ Lactobacillus johnsonii）、鼠李糖乳桿菌（ Lactobacillus rhamnosus）、瘤胃乳桿菌（ Lactobacillus ruminis）、唾液乳桿菌（ Lactobacillus salivarius）、三藩市乳桿菌（ Lactobacillus sanfranciscensis）、擁擠棒狀桿菌（ Corynebacterium accolens）、白喉棒狀桿菌（ Corynebacterium diphtheriae）、馬氏棒狀桿菌（ Corynebacterium matruchotii）、空腸彎曲桿菌（ Campylobacter jejuni）、產氣莢膜梭菌（ Clostridium perfringens）、文氏密螺旋體（ Treponema vincentii）、蝕瘡潰瘍密螺旋體（ Treponema phagedenis）和齒垢密螺旋體（ Treponema denticola）。在一些情形下，編碼所述Cas9核酸酶的核苷酸包含來自本文所述的任一種細菌物種的Cas9核酸酶序列的一部分。 [0411]同樣地，適用於特定實施例的Cpf1核酸酶可以從以下細菌物種獲得，所述細菌物種包括但不限於：法蘭西斯氏菌屬（ Francisellaspp.）、胺基酸球菌屬（ Acidaminococcusspp.）、普雷沃菌屬（ Prevotellaspp.）、毛螺菌科（ Lachnospiraceaespp.）等。在一些情形下，編碼所述Cpfl核酸酶的核苷酸包含來自本文所述的任一種細菌物種的Cas9核酸酶序列的一部分。 [0412]Cas9直向同源物的保守區域包括中央HNH核酸內切酶結構域和分裂的RuvC/RNA酶H結構域。Cpf1直系同源物具有RuvC/RNA酶H結構域，但不具有可辨別的HNH結構域。所述HNH和RuvC樣結構域各自負責切割雙鏈DNA靶序列的一條鏈。所述Cas9核酸酶的HNH結構域切割與tracrRNA:crRNA或sgRNA互補的DNA鏈。所述Cas9核酸酶的RuvC樣結構域切割與tracrRNA:crRNA或sgRNA不互補的DNA鏈。預測Cpf1作為二聚體起作用，其中Cpf1的每個RuvC樣結構域切割靶位點的互補鏈或非互補鏈。在特定實施例中，考慮了Cas9核酸酶變體（例如，Cas9切口酶），其在HNH或RuvC樣核酸內切酶結構域中包含降低或消除所述變體結構域的核酸酶活性的一個或多個胺基酸添加、缺失、突變或取代。 [0413]在一些實施例中，本文所述的方法包括改變Cas9核酸酶活性。在一些實施例中，Cas9核酸酶活性被降低或消除。所述結構域中降低或消除所述核酸酶活性的Cas9 HNH突變的說明性例子包括但不限於：釀膿鏈球菌（ S. pyogenes）（D10A）；嗜熱鏈球菌（ S. thermophilis）（D9A）；齒垢密螺旋體（ T. denticola）（D13A）；以及腦膜炎奈瑟菌（ N. meningitidis）（D16A）。所述結構域中降低或消除所述核酸酶活性的Cas9 RuvC樣結構域突變的說明性例子包括但不限於：釀膿鏈球菌（D839A、H840A或N863A）；嗜熱鏈球菌（D598A、H599A或N622A）；齒垢密螺旋體（D878A、H879A或N902A）；以及腦膜炎奈瑟菌（D587A、H588A或N611A）。在一些情形下，本文所述的方法包括降低針對生物靶標的Cas9核酸酶的活性和/或效率。在一些情形下，本文所述的方法包括降低針對疾病靶標的Cas9核酸酶的活性和/或效率。 [0414]類似地，Cas9等效物、變體、同源物、直系同源物或旁系同源物（無論是天然存在的還是非天然存在的（例如，工程化的或重組的））以及來自任何2類CRISPR系統（例如，II型和V型）的Cas9等效物（包括Cas12a（Cpf1）、Cas12e（CasX）、Cas12b1（C2c1）、Cas12b2和Cas12c（C2c3））適用於本公開文本的特定實施例。另外的Cas等效物描述於以下文獻中：Makarova等人, 「C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector,」 Science 2016; 353(6299)；以及Makarova等人, 「Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?,」 The CRISPR Journal, 第1卷. 第5期, 2018。 [0415]CasX（Cas12e）是Cas9等效物，據報導其具有與Cas9相同的功能，但其通過趨同進化而進化。因此，考慮將Liu等人, 「CasX enzymes comprises a distinct family of RNA-guided genome editors,」 Nature, 2019, 第566卷: 218-223中描述的CasX（Cas12e）蛋白與本文所述的基因編輯系統一起使用。另外，CasX（Cas12e）的任何變體或修飾是可想到的並且在本公開文本的範圍內。 [0416]在各種其他實施例中，本文所述的Cas核酸酶（例如，Cas9、Cas12a（Cpf1）、Cas12e（CasX）、Cas12d（CasY）、Cas12b1（C2c1）、Cas12c（C2c3）、Cas12g、Cas12h、Cas14或其變體）適用於本公開文本的特定實施例。 ii. 歸巢核酸內切酶 / 大範圍核酸酶 [0417]在各種實施例中，將多種歸巢核酸內切酶或大範圍核酸酶引入細胞中，並將其工程化以在多個基因組靶位點中結合並引入單鏈切口或雙鏈斷裂（DSB），所述基因組靶位點包括但不限於編碼與具體疾病（例如，鐮狀細胞病）相關的蛋白質的基因。在一些實施例中，歸巢核酸內切酶或大範圍核酸酶適用於本公開文本的特定實施例。另外，核酸內切酶或大範圍核酸酶的任何變體或修飾是可想到的並且在本公開文本的範圍內。「歸巢核酸內切酶」和「大範圍核酸酶」可互換使用，並且是指天然存在的核酸酶或工程化的大範圍核酸酶，其識別12-45個鹼基對切割位點，並且通常基於序列和結構基序被分為五個家族：LAGLIDADG（SEQ ID NO: 61）、GIY-YIG、HNH、His-Cys box和PD-(D/E)XK。 [0418]工程化He不存在於自然界中，並且可以通過重組DNA技術或通過隨機誘變獲得。可以通過在天然存在的HE或先前工程化的HE中進行一個或多個胺基酸改變（例如，突變、取代、添加或缺失一個或多個胺基酸）來獲得工程化He。在特定實施例中，工程化HE包含對於DNA識別介面的一個或多個胺基酸改變。 [0419]在特定實施例中考慮的工程化He還可以包含一個或多個連接子和/或另外的功能結構域，例如，表現出5-3′核酸外切酶、5-3′鹼性核酸外切酶、3-5′核酸外切酶（例如，Trex2）、5′瓣狀核酸內切酶、解旋酶或非範本依賴性DNA聚合酶活性的末端加工酶的末端加工酶促結構域。在特定實施例中，用末端加工酶將工程化He引入T細胞中，所述末端加工酶表現出5-3′核酸外切酶、5-3′鹼性核酸外切酶、3-5′核酸外切酶（例如，Trex2）、5′瓣狀核酸內切酶、解旋酶或非範本依賴性DNA聚合酶活性。所述HE和3′加工酶可以分別引入例如不同的載體或單獨的mRNA中，或例如作為融合蛋白一起引入，或引入由病毒自切割肽或IRES元件分開的多順反子構建體中。 [0420]「DNA識別介面」是指與核酸靶鹼基相互作用的HE胺基酸殘基以及相鄰的那些殘基。對於每種HE，所述DNA識別介面包含側鏈-側鏈和側鏈-DNA接觸的廣泛網路，其中大部分對於識別特定的核酸靶序列是必需獨特的。因此，DNA識別介面的對應於特定核酸序列的胺基酸序列顯著變化，並且是任何天然或工程化HE的一個特徵。作為非限制性例子，在特定實施例中考慮的工程化HE可以通過構建HE變體的文庫來得到，在所述文庫中，位於天然HE（或先前工程化HE）的DNA識別介面中的一個或多個胺基酸殘基是變化的。可以使用切割測定來篩選文庫的針對每個預測的TCRα基因座靶位點的靶切割活性（參見例如，Jarjour等人, 2009 . Nuc. Acids Res.37(20): 6871-6880）。 [0421]LAGLIDADG（SEQ ID NO: 61）歸巢核酸內切酶（LHE）是最充分研究的大範圍核酸酶家族，其主要在古細菌、以及綠藻和真菌的細胞器DNA中編碼，並顯示出最高的總體DNA識別特異性。LHE包含一個或兩個LAGLIDADG（SEQ ID NO: 61）催化基序/蛋白質鏈，並且分別作為同二聚體或單鏈單體起作用。LAGLIDADG（SEQ ID NO: 61）蛋白的結構研究鑒定了高度保守的核心結構（Stoddard 2005），其特徵在於αββαββα折疊，其中LAGLIDADG（SEQ ID NO: 61）基序屬於該折疊的第一螺旋。LHE的高效和特異性切割代表了一種可得出新的、高度特異性的核酸內切酶的蛋白質支架。然而，將LHE工程化以結合並切割非天然或非經典靶位點需要選擇適當的LHE支架，檢查靶基因座，選擇推定的靶位點，以及廣泛改變LHE以在靶位點中的多達三分之二鹼基對位置處改變其DNA接觸點和切割特異性。 [0422]可以從其設計工程化LHE的LHE的說明性例子包括但不限於I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-NcrI、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI和I-Vdi141I。 [0423]可以從其設計工程化LHE的LHE的其他說明性例子包括但不限於I-CreI和I-SceI。 [0424]在一個實施例中，所述工程化LHE選自：I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI和SmaMI。 [0425]在一個實施例中，所述工程化LHE是I-OnuI。 [0426]在一個實施例中，從天然I-OnuI產生靶向人TCRα基因的工程化I-OnuI LHE。在優選的實施例中，從先前工程化I-OnuI產生靶向人TCRα基因的工程化I-OnuI LHE。 [0427]在特定實施例中，所述工程化I-OnuI LHE在DNA識別介面中包含一個或多個胺基酸取代。在特定實施例中，所述I-OnuI LHE與I-OnuI或I-OnuI的工程化變體的DNA識別介面具有至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性（Taekuchi等人 2011 . Proc Natl Acad Sci U.S.A2011年8月9日; 108(32): 13077-13082）。 [0428]在一個實施例中，所述I-OnuI LHE與I-OnuI或I-OnuI的工程化變體的DNA識別介面具有至少70%，更優選至少80%，更優選至少85%，更優選至少90%，更優選至少95%，更優選至少97%，更優選至少99%序列同一性（Taekuchi等人 2011 . Proc Natl Acad Sci U.S.A2011年8月9日; 108(32): 13077-13082）。 [0429]在特定實施例中，工程化I-OnuI LHE在I-OnuI的DNA識別介面中，特別是在位於位置24-50、68至82、180至203和223至240的亞結構域中包含一個或多個胺基酸取代或修飾。 [0430]在一個實施例中，工程化I-OnuI LHE在位於整個I-OnuI序列內任何位置的另外位置處包含一個或多個胺基酸取代或修飾。可以被取代和/或修飾的殘基包括但不限於直接或經由水分子與核酸靶標接觸或與核酸骨架或核苷酸鹼基相互作用的胺基酸。在一個非限制性例子中，本文考慮的工程化I-OnuI LHE在選自由以下位置組成的位置組的至少一個位置中包含一個或多個取代和/或修飾，優選至少5個，優選至少10個，優選至少15個，更優選至少20個，甚至更優選至少25個取代和/或修飾：I-OnuI的位置19、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、68、70、72、75、76、77、78、80、82、168、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238、240。 iii. MegaTAL [0431]在各種實施例中，將多個megaTAL引入細胞中，並將其工程化以在多個基因組靶位點中結合並引入DSB。在一些實施例中，megaTAL適用於本公開文本的特定實施例。另外，megaTAL的任何變體或修飾是可想到的並且在本公開文本的範圍內。「megaTAL」是指包含工程化TALE DNA結合結構域的工程化核酸酶和工程化大範圍核酸酶，並且任選地包含一個或多個連接子和/或另外的功能結構域，例如，表現出5-3′核酸外切酶、5-3′鹼性核酸外切酶、3-5′核酸外切酶（例如，Trex2）、5′瓣狀核酸內切酶、解旋酶或非範本依賴性DNA聚合酶活性的末端加工酶的末端加工酶促結構域。在特定實施例中，可以用末端加工酶將megaTAL引入T細胞中，所述末端加工酶表現出5-3′核酸外切酶、5-3′鹼性核酸外切酶、3-5′核酸外切酶（例如，Trex2）、5′瓣狀核酸內切酶、解旋酶或非範本依賴性DNA聚合酶活性。所述megaTAL和3′加工酶可以分別引入例如不同的載體或單獨的mRNA中，或例如作為融合蛋白一起引入，或引入由病毒自切割肽或IRES元件分開的多順反子構建體中。 [0432]「TALE DNA結合結構域」是轉錄啟動因子樣效應物（TALE或TAL效應物）的DNA結合部分，其類比植物轉錄啟動因子以操縱植物轉錄組（參見例如，Kay等人, 2007. Science 318:648-651）。在特定實施例中考慮的TALE DNA結合結構域是從頭工程化的或來自天然存在的TALE，例如來自野油菜黃單胞菌瘡痂致病變種（ Xanthomonas campestrispv. Vesicatoria）、加氏黃單胞菌（ Xanthomonas gardneri）、半透明黃單胞菌（ Xanthomonas translucens）、地毯草黃單胞菌（ Xanthomonas axonopodis）、穿孔黃單胞菌（ Xanthomonas perforans）、苜蓿黃單胞菌（ Xanthomonas alfalfa）、柑橘黃單胞菌（ Xanthomonas citri）、 Xanthomonas euvesicatoria和稻黃單胞菌（ Xanthomonas oryzae）的AvrBs3，以及來自茄科羅爾斯通氏菌（ Ralstonia solanacearum）的brg11和hpx17。用於得到和設計DNA結合結構域的TALE蛋白的說明性例子披露於美國專利號9,017,967和其中引用的參考文獻中，將所有這些文獻通過引用以其整體併入本文。 [0433]在特定實施例中，megaTAL包含TALE DNA結合結構域，所述TALE DNA結合結構域包含參與TALE DNA結合結構域與其相應靶DNA序列的結合的一個或多個重複單元。單個「重複單元」（也稱為「重複」）的長度通常為33-35個胺基酸。每個TALE DNA結合結構域重複單元包括組成重複可變二殘基（RVD）的1個或2個DNA結合殘基，通常位於所述重複的位置12和/或13處。已確定用於這些TALE DNA結合結構域的DNA識別的天然（經典）代碼，使得在位置12和13處的HD序列與胞嘧啶（I）結合，NG與T結合，NI與A結合，NN與G或A結合，並且NG與T結合。在某些實施例中，考慮了非經典（非典型）RVD。 [0434]適用於特定實施例中考慮的特定megaTAL的非經典RVD的說明性例子包括但不限於用於識別鳥嘌呤（G）的HH、KH、NH、NK、NQ、RH、RN、SS、NN、SN、KN；用於識別腺嘌呤（A）的NI、KI、RI、HI、SI；用於識別胸腺嘧啶（T）的NG、HG、KG、RG；用於識別胞嘧啶（C）的RD、SD、HD、ND、KD、YG；用於識別A或G的NV、HN；以及用於識別A或T或G或C的H*、HA、KA、N*、NA、NC、NS、RA、S*，其中（*）意指位置13處的胺基酸不存在。適用於特定實施例中考慮的特定megaTAL的RVD的另外說明性例子還包括在美國專利號8,614,092中所述的那些，將所述專利通過引用以其整體併入本文。 [0435]在特定實施例中，本文考慮的megaTAL包含含有3至30個重複單元的TALE DNA結合結構域。在某些實施例中，megaTAL包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個TALE DNA結合結構域重複單元。在優選的實施例中，本文考慮的megaTAL包含TALE DNA結合結構域，所述TALE DNA結合結構域包含5-16個重複單元，更優選7-15個重複單元，更優選9-12個（專利不明顯）重複單元，並且更優選9、10或11個重複單元。 [0436]在特定實施例中，本文考慮的megaTAL包含TALE DNA結合結構域，所述TALE DNA結合結構域包含3至30個重複單元以及含有位於一組TALE重複單元的C末端的20個胺基酸的另外的單個截短的TALE重複單元，即，另外的C末端半TALE DNA結合結構域重複單元（下文在本文其他地方公開的C-帽的胺基酸-20至-1）。因此，在特定實施例中，本文考慮的megaTAL包含含有3.5至30.5個重複單元的TALE DNA結合結構域。在某些實施例中，megaTAL包含3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、11.5、12.5、13.5、14.5、15.5、16.5、17.5、18.5、19.5、20.5、21.5、22.5、23.5、24.5、25.5、26.5、27.5、28.5、29.5或30.5個TALE DNA結合結構域重複單元。在優選的實施例中，本文考慮的megaTAL包含TALE DNA結合結構域，所述TALE DNA結合結構域包含5.5-13.5個重複單元，更優選7.5-12.5個重複單元，更優選9.5-11.5個重複單元，並且更優選9.5、10.5或11.5個重複單元。 [0437]在特定實施例中，megaTAL包含「N末端結構域（NTD）」多肽、一個或多個TALE重複結構域/單元、「C末端結構域（CTD）」多肽和工程化大範圍核酸酶。 [0438]如本文所用，術語「N末端結構域（NTD）」多肽是指位於天然存在的TALE DNA結合結構域的N末端部分或片段的側翼的序列。所述NTD序列（如果存在的話）可以是任何長度，只要所述TALE DNA結合結構域重複單元保留結合DNA的能力即可。在特定實施例中，所述NTD多肽包含所述TALE DNA結合結構域N末端的至少120個至至少140個或更多個胺基酸（0是最N末端重複單元的胺基酸1）。在特定實施例中，所述NTD多肽包含所述TALE DNA結合結構域N末端的至少約120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或至少140個胺基酸。在一個實施例中，本文考慮的megaTAL包含黃單胞菌屬（ Xanthomonas）TALE蛋白的至少約+1至+122至至少約+1至+137胺基酸的NTD多肽（0是最N末端重複單元的胺基酸1）。在特定實施例中，所述NTD多肽包含黃單胞菌屬TALE蛋白的TALE DNA結合結構域的N末端的至少約122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136或137個胺基酸。在一個實施例中，本文考慮的megaTAL包含羅爾斯通氏菌屬（ Ralstonia）TALE蛋白的至少+1至+121胺基酸的NTD多肽（0是最N末端重複單元的胺基酸1）。在特定實施例中，所述NTD多肽包含羅爾斯通氏菌屬TALE蛋白的TALE DNA結合結構域的N末端的至少約121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136或137個胺基酸。 [0439]如本文所用，術語「C末端結構域（CTD）」多肽是指位於天然存在的TALE DNA結合結構域的C末端部分或片段的側翼的序列。所述CTD序列（如果存在的話）可以是任何長度，只要所述TALE DNA結合結構域重複單元保留結合DNA的能力即可。在特定實施例中，所述CTD多肽包含所述TALE DNA結合結構域的最後一個完整重複的C末端的至少20個至至少85個或更多個胺基酸（前20個胺基酸是最後一個C末端完整重複單元的C末端的半重複單元）。在特定實施例中，所述CTD多肽包含所述TALE DNA結合結構域的最後一個完整重複的C末端的至少約20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或至少85個胺基酸。在一個實施例中，本文考慮的megaTAL包含黃單胞菌屬TALE蛋白的至少約-20至-1胺基酸的CTD多肽（-20是最後一個C末端完整重複單元的C末端的半重複單元的胺基酸1）。在特定實施例中，所述CTD多肽包含黃單胞菌屬TALE蛋白的TALE DNA結合結構域的最後一個完整重複的C末端的至少約20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸。在一個實施例中，本文考慮的megaTAL包含羅爾斯通氏菌屬TALE蛋白的至少約-20至-1胺基酸的CTD多肽（-20是最後一個C末端完整重複單元的C末端的半重複單元的胺基酸1）。在特定實施例中，所述CTD多肽包含羅爾斯通氏菌屬TALE蛋白的TALE DNA結合結構域的最後一個完整重複的C末端的至少約20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸。 [0440]在特定實施例中，本文考慮的megaTAL包含融合多肽，所述融合多肽包含任選地用本文其他地方考慮的一個或多個連接子多肽彼此連接的經工程化以結合靶序列的TALE DNA結合結構域、經工程化以結合並切割靶序列的大範圍核酸酶、以及任選地NTD和/或CTD多肽。不希望受任何特定理論束縛，考慮將包含TALE DNA結合結構域以及任選地NTD和/或CTD多肽的megaTAL與連接子多肽融合，所述連接子多肽進一步與工程化大範圍核酸酶融合。因此，所述TALE DNA結合結構域結合DNA靶序列，所述DNA靶序列與所述大範圍核酸酶的DNA結合結構域結合的靶序列相距約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸。以這種方式，本文考慮的megaTAL增加了基因組編輯的特異性和效率。 [0441]在特定實施例中，本文考慮的megaTAL包含一個或多個TALE DNA結合重複單元和選自以下的工程化LHE：I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-CreI、I-SceI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-NcrI、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMII、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI和I-Vdi141I，或優選I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI和SmaMI，或更優選I-OnuI。 [0442]在特定實施例中，本文考慮的megaTAL包含NTD、一個或多個TALE DNA結合重複單元、CTD和選自以下的工程化LHE：I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-CreI、I-SceI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-NcrI、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI和I-Vdi141I，或優選I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI和SmaMI，或更優選I-OnuI。 [0443]在特定實施例中，本文考慮的megaTAL包含NTD、約9.5至約11.5個TALE DNA結合重複單元和選自以下的工程化I-OnuI LHE：I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-CreI、I-SceI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-NcrI、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI和I-Vdi141I，或優選I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI和SmaMI，或更優選I-OnuI。 [0444]在特定實施例中，本文考慮的megaTAL包含約122個胺基酸至137個胺基酸的NTD，約9.5個、約10.5個或約11.5個結合重複單元，約20個胺基酸至約85個胺基酸的CTD，和選自以下的工程化I-OnuI LHE：I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-CreI、I-SceI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-NcrI、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI和I-Vdi141I，或優選I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI和SmaMI，或更優選I-OnuI。 [0445]megaTAL進一步描述於例如Boisse（「megaTALs: a rare-cleaving nuclease architecture for therapeutic genome engineering,」 Nucleic Acids Research, 2013, 42(4):2591-2601）中。 iv. Talen [0446]在各種實施例中，將多種轉錄啟動因子樣效應物核酸酶（TALEN）引入細胞中，並將其工程化以在多個基因組靶位點中結合並引入單鏈切口或雙鏈斷裂（DSB）。在一些實施例中，TALEN適用於本公開文本的特定實施例。另外，TALEN的任何變體或修飾是可想到的並且在本公開文本的範圍內。「TALEN」是指包含本文其他地方考慮的工程化TALE DNA結合結構域和核酸內切酶結構域（或其核酸內切酶半結構域）的工程化核酸酶，並且任選地包含一個或多個連接子和/或另外的功能結構域，例如，表現出5-3′核酸外切酶、5-3′鹼性核酸外切酶、3-5′核酸外切酶（例如，Trex2）、5′瓣狀核酸內切酶、解旋酶或非範本依賴性DNA聚合酶活性的末端加工酶的末端加工酶促結構域。在特定實施例中，可以用末端加工酶將TALEN引入T細胞中，所述末端加工酶表現出5-3′核酸外切酶、5-3′鹼性核酸外切酶、3-5′核酸外切酶（例如，Trex2）、5′瓣狀核酸內切酶、解旋酶或非範本依賴性DNA聚合酶活性。所述TALEN和3′加工酶可以分別引入例如不同的載體或單獨的mRNA中，或例如作為融合蛋白一起引入，或引入由病毒自切割肽或IRES元件分開的多順反子構建體中。 [0447]在一個實施例中，用兩種TALEN實現靶向雙鏈切割，包含核酸內切酶半結構域的每種TALEN可以用於重構催化活性切割結構域。在另一個實施例中，使用包含TALE DNA結合結構域和兩個核酸內切酶半結構域的單一多肽實現靶向雙鏈切割。 [0448]在特定實施例中考慮的TALEN包含NTD、TALE DNA結合結構域（其包含約3至30個重複單元，例如約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個重複單元）以及核酸內切酶結構域或半結構域。 [0449]在特定實施例中考慮的TALEN包含NTD、TALE DNA結合結構域（其包含約3.5至30.5個重複單元，例如約3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、11.5、12.5、13.5、14.5、15.5、16.5、17.5、18.5、19.5、20.5、21.5、22.5、23.5、24.5、25.5、26.5、27.5、28.5、29.5或30.5個重複單元）、CTD以及核酸內切酶結構域或半結構域。 [0450]在特定實施例中考慮的TALEN包含如本文其他地方所公開的約121個胺基酸至約137個胺基酸的NTD、含有約9.5個至約11.5個重複單元（即，約9.5個、約10.5個或約11.5個重複單元）的TALE DNA結合結構域、約20個胺基酸至約85個胺基酸的CTD以及核酸內切酶結構域或半結構域。 [0451]在特定實施例中，TALEN包含一種類型的限制性核酸內切酶的核酸內切酶結構域。限制性核酸內切酶（限制酶）存在於許多物種中，並且能夠與DNA（在識別位點）進行序列特異性結合，並能夠在結合位點或結合位點附近切割DNA。某些限制酶（例如，IIS型）在遠離識別位點的位點處切割DNA，並且具有可分離的結合結構域和核酸內切酶結構域。在一個實施例中，TALEN包含來自至少一種IIS型限制酶的核酸內切酶結構域（或核酸內切酶半結構域）和本文其他地方考慮的一個或多個TALE DNA結合結構域。 [0452]適用於特定實施例中考慮的TALEN的IIS型限制性核酸內切酶結構域的說明性例子包括在「rebase.neb.com/cgi-bin/sublist?S」中披露的至少1633種IIS型限制性核酸內切酶的核酸內切酶結構域。 [0453]適用於特定實施例中考慮的TALEN的IIS型限制性核酸內切酶結構域的另外說明性例子包括選自以下核酸內切酶的那些核酸內切酶結構域：Aar I、Ace III、Aci I、Alo I、Alw26 I、Bae I、Bbr7 I、Bbv I、Bbv II、BbvC I、Bcc I、Bce83 I、BceA I、Bcef I、Bcg I、BciV I、Bfi I、Bin I、Bmg I、Bpu10 I、BsaX I、Bsb I、BscA I、BscG I、BseR I、BseY I、Bsi I、Bsm I、BsmA I、BsmF I、Bsp24 I、BspG I、BspM I、BspNC I、Bsr I、BsrB I、BsrD I、BstF5 I、Btr I、Bts I、Cdi I、CjeP I、Drd II、Earl、Eci I、Eco31 I、Eco57 I、Eco57M I、Esp3 I、Fau I、Fin I、Fok I、Gdi II、Gsu I、Hga I、Hin4 II、Hph I、Ksp632 I、Mbo II、Mly I、Mme I、Mnl I、Pfl1108、I Ple I、Ppi I Psr I、RleA I、Sap I、SfaN I、Sim I、SspD5 I、Sth132 I、Sts I、TspDT I、TspGW I、Tth111 II、UbaP I、Bsa I和BsmB I。 [0454]在一個實施例中，本文考慮的TALEN包含Fok I IIS型限制性核酸內切酶的核酸內切酶結構域。 [0455]在一個實施例中，本文考慮的TALEN包含TALE DNA結合結構域和來自至少一種IIS型限制性核酸內切酶的核酸內切酶半結構域（以增強切割特異性），任選地其中所述核酸內切酶半結構域包含最小化或防止同源二聚化的一個或多個胺基酸取代或修飾。 [0456]適用於特定實施例中考慮的特定實施例的切割半結構域的說明性例子包括在美國專利公開號20050064474、20060188987、20080131962、20090311787、20090305346、20110014616和20110201055中披露的那些，將所述文獻各自通過引用以其整體併入本文。 [0457]TALEN進一步描述於例如Christia（「Targeting DNA Double-Strand Breaks with TAL Effector Nucleases,」 Genetics. 2010年10月;186(2):757-61）中。 v. 鋅指核酸酶 [0458]在各種實施例中，將多種鋅指核酸酶（ZFN）引入細胞中，並將其工程化以在多個基因組靶位點中結合並引入單鏈切口或雙鏈斷裂（DSB）。在一些實施例中，ZFN適用於本公開文本的特定實施例。另外，ZFN的任何變體或修飾是可想到的並且在本公開文本的範圍內。「ZFN」是指包含一個或多個鋅指DNA結合結構域和核酸內切酶結構域（或其核酸內切酶半結構域）的工程化核酸酶，並且任選地包含一個或多個連接子和/或另外的功能結構域，例如，表現出5-3′核酸外切酶、5-3′鹼性核酸外切酶、3-5′核酸外切酶（例如，Trex2）、5′瓣狀核酸內切酶、解旋酶或非範本依賴性DNA聚合酶活性的末端加工酶的末端加工酶促結構域。在特定實施例中，可以用末端加工酶將ZFN引入T細胞中，所述末端加工酶表現出5-3′核酸外切酶、5-3′鹼性核酸外切酶、3-5′核酸外切酶（例如，Trex2）、5′瓣狀核酸內切酶、解旋酶或非範本依賴性DNA聚合酶活性。所述ZFN和3′加工酶可以分別引入例如不同的載體或單獨的mRNA中，或例如作為融合蛋白一起引入，或引入由病毒自切割肽或IRES元件分開的多順反子構建體中。 [0459]在一個實施例中，使用兩種ZFN實現靶向雙鏈切割，包含核酸內切酶半結構域的每種ZFN可以用於重構催化活性切割結構域。在另一個實施例中，用包含一個或多個鋅指DNA結合結構域和兩個核酸內切酶半結構域的單一多肽實現靶向雙鏈切割。 [0460]在一個實施例中，ZNF包含本文其他地方考慮的TALE DNA結合結構域、鋅指DNA結合結構域和本文其他地方考慮的核酸內切酶結構域（或核酸內切酶半結構域）。 [0461]在一個實施例中，ZNF包含鋅指DNA結合結構域和本文其他地方考慮的大範圍核酸酶。 [0462]在特定實施例中，所述ZFN包含具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個或更多個鋅指基序的鋅指DNA結合結構域和核酸內切酶結構域（或核酸內切酶半結構域）。通常，單個鋅指基序的長度為約30個胺基酸。鋅指基序包括經典的C 2H 2鋅指和非經典的鋅指，例如C 3H鋅指和C 4鋅指。 [0463]鋅指結合結構域可以被工程化以結合任何DNA序列。已經鑒定了針對給定3 bp DNA靶序列的候選鋅指DNA結合結構域，並且已經設計了模組化組裝策略，用於將多個所述結構域連接到靶向相應複合DNA靶序列的多指肽中。本領域已知的其他合適的方法也可以用於設計和構建編碼鋅指DNA結合結構域的核酸，所述方法例如噬菌體展示、隨機誘變、組合文庫、電腦/理性設計、親和選擇、PCR、從cDNA或基因組文庫選殖、合成性構建等。（參見例如，美國專利5,786,538；Wu等人, PNAS92:344-348 (1995)；Jamieson等人, Biochemistry33:5689-5695 (1994)；Rebar和Pabo, Science263:671-673 (1994)；Choo和Klug, PNAS91:11163-11167 (1994)；Choo和Klug, PNAS91: 11168-11172 (1994)；Desjarlais和Berg, PNAS90:2256-2260 (1993)；Desjarlais和Berg, PNAS89:7345-7349 (1992)；Pomerantz等人, Science267:93-96 (1995)；Pomerantz等人, PNAS92:9752-9756 (1995)；Liu等人, PNAS94:5525-5530 (1997)；Griesman和Pabo, Science275:657-661 (1997)；Desjarlais和Berg, PNAS91:11-99-11103 (1994)）。 [0464]各個鋅指基序結合三個或四個核苷酸序列。鋅指結合結構域被工程化以與其結合的序列（例如，靶序列）的長度將決定工程化的鋅指結合結構域中的鋅指基序的數目。例如，對於其中鋅指基序不與重疊亞位點結合的ZFN，六核苷酸靶序列被二指結合結構域結合；九核苷酸靶序列被三指結合結構域結合等。在特定實施例中，靶位點中的各個鋅指基序的DNA結合位點不需要是連續的，而是可以被一個或幾個核苷酸隔開，這取決於多指結合結構域中的鋅指基序之間的連接子序列的長度和性質。 [0465]在特定實施例中，本文考慮的ZNF包含含有兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個或更多個鋅指基序的鋅指DNA結合結構域和來自至少一種IIS型限制酶的核酸內切酶結構域或半結構域以及本文其他地方考慮的一個或多個TALE DNA結合結構域。 [0466]在特定實施例中，本文考慮的ZNF包含含有三個、四個、五個、六個、七個或八個或更多個鋅指基序的鋅指DNA結合結構域，和來自至少一種選自以下的IIS型限制酶的核酸內切酶結構域或半結構域：Aar I、Ace III、Aci I、Alo I、Alw26 I、Bae I、Bbr7 I、Bbv I、Bbv II、BbvC I、Bcc I、Bce83 I、BceA I、Bcef I、Bcg I、BciV I、Bfi I、Bin I、Bmg I、Bpu10 I、BsaX I、Bsb I、BscA I、BscG I、BseR I、BseY I、Bsi I、Bsm I、BsmA I、BsmF I、Bsp24 I、BspG I、BspM I、BspNC I、Bsr I、BsrB I、BsrD I、BstF5 I、Btr I、Bts I、Cdi I、CjeP I、Drd II、Earl、Eci I、Eco31 I、Eco57 I、Eco57M I、Esp3 I、Fau I、Fin I、Fok I、Gdi II、Gsu I、Hga I、Hin4 II、Hph I、Ksp632 I、Mbo II、Mly I、Mme I、Mnl I、Pfl1108、I Ple I、Ppi I Psr I、RleA I、Sap I、SfaN I、Sim I、SspD5 I、Sth132 I、Sts I、TspDT I、TspGW I、Tth111 II、UbaP I、Bsa I和BsmB I。 [0467]在特定實施例中，本文考慮的ZNF包含含有三個、四個、五個、六個、七個或八個或更多個鋅指基序的鋅指DNA結合結構域和來自Fok I IIS限制性核酸內切酶的核酸內切酶結構域或半結構域。 [0468]在一個實施例中，本文考慮的ZFN包含鋅指DNA結合結構域和來自至少一種IIS型限制性核酸內切酶的核酸內切酶半結構域（以增強切割特異性），任選地其中所述核酸內切酶半結構域包含最小化或防止同源二聚化的一個或多個胺基酸取代或修飾。 (b) 造血幹細胞的體外基因編輯 [0469]在某些實施例中，本文所述的LNP組合物可以用於遞送編碼基因編輯系統的一種或多種核酸，所述基因編輯系統靶向細胞內的一個或多個基因座。例如，LNP組合物中包括的mRNA可以編碼多肽並在接觸和/或進入（例如，轉染）細胞後產生基因編輯。在某些實施例中，包括在本發明的LNP組合物中的mRNA可以編碼多肽，所述多肽可以通過靶向本文所述的功能失調蛋白的一個或多個靶標或所需靶標的核苷酸序列來改善細胞的功能或健康。 [0470]本文提供了一種在細胞中在體外對造血幹細胞（HSC）進行遺傳修飾的方法，所述方法包括向所述細胞投予前述實施例中任一個所述的LNP。在一些實施例中，所述方法包括使所述細胞與LNP接觸，所述LNP包含脂質-抗體接合物、可電離陽離子脂質以及佈置於其中的一種或多種核酸。在一些實施例中，所述佈置於其中的一種或多種核酸包括編碼定點核酸酶、化學鹼基編輯器、先導編輯器或表觀基因組編輯器的mRNA。 [0471]在一些實施例中，本文所述的LNP組合物靶向造血幹細胞（HSC）的特異性細胞表面標記。在一些實施例中，所述LNP包含特異性靶向HSC表面抗原的HSC靶向基團（例如，抗體或脂質-抗體接合物）。在一些實施例中，所述LNP包含靶向CD105和/或CD117的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，所述LNP包含靶向CD117的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，所述LNP包含靶向CD105的抗體或其抗原結合片段。 [0472]在一些實施例中，佈置於其中的所述一種或多種核酸編碼靶向本文所述的一種或多種靶標的核苷酸序列的基因編輯系統。在一些實施例中，佈置於其中的所述一種或多種核酸包括mRNA，所述mRNA編碼靶向本文所述的一種或多種靶標的核苷酸序列的基因編輯系統。在一些實施例中，所述靶標是與受試者的細胞內蛋白質功能障礙和/或疾病相關的細胞內的一個或多個基因座。在一些實施例中，前述實施例中任一個所述的靶向細胞內的一個或多個基因座的LNP導致HbF增加。在一些實施例中，前述實施例中任一個所述的LNP用於增加細胞中的HbF的用途可以是治療受試者的鐮狀細胞病或β-地中海貧血。 [0473]在一些實施例中，所述方法包括用本文所述的LNP處理HSC，其中RNA濃度保持恒定。在一些實施例中，由所述LNP遞送的RNA的濃度在約0.1與10 μg/mL之間。在一些實施例中，由所述LNP遞送的RNA的濃度在約0.5與8 μg/mL、0.6與7 μg/mL、0.7與6 μg/mL、0.8與5 μg/mL、0.9與4 μg/mL或1與3 μg/mL之間。在一些實施例中，由所述LNP遞送的RNA的濃度是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大μg/mL。在一些實施例中，由所述LNP遞送的RNA的濃度為1 μg/mL。 [0474]在一些實施例中，所述方法包括將所述HSC與本文所述的LNP一起培育，其中將HSC與LNP一起培育至少4小時。在一些實施例中，將所述HSC與所述LNP一起培育約4至96小時之間。在一些實施例中，將所述HSC與所述LNP一起培育約6至90小時、8至80小時、10至70小時、12至60小時、18至50小時、24至48小時或30至36小時之間。 (c) 造血幹細胞的體內基因編輯 [0475]在某些實施例中，本文所述的LNP組合物可以用於將治療劑或預防劑遞送至受試者。例如，包括在LNP組合物中的mRNA可以編碼多肽並在接觸和/或進入（例如，轉染）細胞後產生治療性或預防性多肽。在某些實施例中，包括在本發明的LNP組合物中的mRNA可以編碼多肽，所述多肽可以通過靶向本文所述的疾病的一個或多個靶標的核苷酸序列來改善受試者的健康。 [0476]本文提供了一種在受試者體內對造血幹細胞（HSC）進行遺傳修飾的方法，所述方法包括向所述受試者投予前述實施例中任一個所述的LNP。在一些實施例中，所述方法包括向所述受試者投予LNP，所述LNP包含脂質-抗體接合物、可電離陽離子脂質以及佈置於其中的一種或多種核酸。在一些實施例中，所述佈置於其中的一種或多種核酸包括編碼定點核酸酶、化學鹼基編輯器、先導編輯器或表觀基因組編輯器的mRNA。 [0477]在一些態樣，在受試者體內對造血幹細胞（HSC）進行遺傳修飾的方法還包括向所述受試者投予HSC動員劑。在一些實施例中，所述方法包括向所述受試者靜脈內投予所述LNP。在一些實施例中，在投予所述LNP之前、期間或者之前和期間向所述受試者投予所述HSC動員劑。在一些實施例中，在投予所述LNP之前向所述受試者投予所述HSC動員劑。在一些實施例中，在投予所述LNP期間向所述受試者投予所述HSC動員劑。在一些實施例中，在投予所述LNP之前和期間向所述受試者投予所述HSC動員劑。在一些實施例中，所述HSC動員劑包括普樂沙福（plerixafor）、粒細胞集落刺激因子（G-CSF）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）或其任何組合。在一些實施例中，所述HSC動員劑包括普樂沙福和G-CSF。 [0478]本文還提供了一種治療有需要的受試者的疾病的方法。在一些實施例中，所述方法包括向所述受試者投予前述實施例中任一個所述的LNP。在一些實施例中，所述方法包括向所述受試者投予LNP，所述LNP包含脂質-抗體接合物、可電離陽離子脂質以及佈置於其中的一種或多種核酸。在一些實施例中，所述佈置於其中的一種或多種核酸包括編碼定點核酸酶、化學鹼基編輯器、先導編輯器或表觀基因組編輯器的mRNA。 [0479]在一些方法，所述治療疾病的方法還包括向所述受試者投予HSC動員劑。在一些實施例中，所述方法包括向所述受試者靜脈內投予所述LNP。在一些實施例中，在投予所述LNP之前、期間或者之前和期間向所述受試者投予所述HSC動員劑。在一些實施例中，在投予所述LNP之前向所述受試者投予所述HSC動員劑。在一些實施例中，在投予所述LNP期間向所述受試者投予所述HSC動員劑。在一些實施例中，在投予所述LNP之前和期間向所述受試者投予所述HSC動員劑。在一些實施例中，所述HSC動員劑包括普樂沙福（plerixafor）、粒細胞集落刺激因子（G-CSF）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）或其任何組合。在一些實施例中，所述HSC動員劑包括普樂沙福和G-CSF。 [0480]在一些態樣，提供了調節受試者的靶造血幹細胞（HSC）的細胞功能的方法。在一些實施例中，所述方法包括向所述受試者投予脂質奈米粒子（LNP）。在一些實施例中，所述LNP包含可電離陽離子脂質。在一些實施例中，所述LNP包含含有以下結構的接合物：[脂質] - [任選的連接子] - [抗體]。在一些實施例中，所述LNP包含固醇或其他結構脂質。在一些實施例中，所述LNP包含中性磷脂。在一些實施例中，所述LNP包含游離聚乙二醇（PEG）脂質。在一些實施例中，所述LNP包含編碼用於調節所述HSC的細胞功能的多肽的核酸。在一些實施例中，本公開文本的一個態樣涉及如本文所公開的LNP或含有其的醫藥組合物，用於在調節受試者的靶向HSC細胞的細胞功能的方法中使用。這種方法可以用於治療如下文所公開的疾病。在一些實施例中，如本文所公開的方法可以包括使受試者的HSC細胞在體外或離體地與脂質奈米粒子（LNP）接觸。 [0481]在一些實施例中，將本文提供的LNP用於體內編輯HSC的方法中，其中所述LNP包含脂質15、結合HSC表面抗原的HSC靶向基團以及有效載荷，所述HSC靶向基團包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH結構域以及含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL結構域，其中所述VH結構域與SEQ ID NO: 7所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同一性，其中所述VL結構域與SEQ ID NO: 8所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同一性，並且所述有效載荷包含編碼靶向一個或多個基因座的基因編輯系統的組分的一種或多種核酸，其中基因編輯導致HbF增加，從而用於治療鐮狀細胞病或β-地中海貧血。在一些實施例中，所述靶核苷酸序列位於 BCL11A紅系細胞強化子內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於 BCL11A基因的內含子2中的多核苷酸序列內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於在 BCL11A轉錄起始位點（TSS）的下游約+54 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於在 BCL11ATSS的下游約+54 kb與約+56 kb之間的多核苷酸序列內、約+57 kb與約+59 kb之間的多核苷酸序列內、或約+62 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列內、或其組合內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於在 BCL11ATSS的下游+55 kb、+58 kb或+62 kb處核苷酸位置的約100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1.0 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb或1.5 kb距離內的多核苷酸序列內或其組合內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含GTGATAAAAGCAACTGTTAG（SEQ ID NO: 62）的多核苷酸序列，或其包含至多10（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10）個核苷酸取代的變體。在一些實施例中，將本文提供的LNP用於體內編輯HSC的方法中，其中所述LNP包含脂質15、結合HSC表面抗原的HSC靶向基團以及有效載荷，所述HSC靶向基團包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH結構域以及含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL結構域，其中所述VH結構域包含SEQ ID NO: 7所示的胺基酸序列，其中所述VL結構域包含SEQ ID NO: 8所示的胺基酸序列，並且所述有效載荷包含編碼靶向一個或多個基因座的基因編輯系統的組分的一種或多種核酸，其中基因編輯導致HbF增加，從而用於治療鐮狀細胞病或β-地中海貧血。在一些實施例中，所述靶核苷酸序列位於 BCL11A紅系細胞強化子內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於 BCL11A基因的內含子2中的多核苷酸序列內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於在 BCL11A轉錄起始位點（TSS）的下游約+54 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於在 BCL11ATSS的下游約+54 kb與約+56 kb之間的多核苷酸序列內、約+57 kb與約+59 kb之間的多核苷酸序列內、或約+62 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列內、或其組合內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於在 BCL11ATSS的下游+55 kb、+58 kb或+62 kb處核苷酸位置的約100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1.0 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb或1.5 kb距離內的多核苷酸序列內或其組合內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含GTGATAAAAGCAACTGTTAG（SEQ ID NO: 62）的多核苷酸序列，或其包含至多10（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10）個核苷酸取代的變體。在一些實施例中，使用本文提供的示例性LNP來在體內編輯HSC細胞。在一些實施例中，將本文提供的示例性LNP遞送至患有疾病的受試者，用於進行體內基因編輯和所述疾病的治療。在一些實施例中，將本文提供的示例性LNP遞送至患有鐮狀細胞病或β-地中海貧血的受試者，用於進行受試者的體內基因編輯和治療。在一些實施例中，本文提供的示例性LNP用於治療受試者的鐮狀細胞病的用途是安全且有效的。在一些實施例中，本文提供的示例性LNP用於治療受試者的β-地中海貧血的用途是安全且有效的。 [0482]可以使用有效地預防、治療、診斷或成像疾病和/或任何其他目的的任何合理的量和任何投予途徑，將本文所述的治療性和/或預防性組合物投予受試者。投予給定受試者的具體量可以根據受試者的物種、年齡和一般狀況、投予目的、特定組合物、投予方式等而變化。根據本公開文本的組合物可以配製成劑量單位形式以便於投予和劑量的一致性。然而，應理解，本公開文本的組合物的總日用量將由主治醫師在合理的醫學判斷範圍內決定。 [0483]可以通過多種途徑投予包括一種或多種mRNA的LNP組合物，例如口服、靜脈內、肌內、動脈內、髓內、鞘內、皮下、室內、經皮或皮內、皮內、經直腸、陰道內、腹膜內、局部、經粘膜、經鼻、腫瘤內投予。在某些實施例中，可以靜脈內、肌內、皮內、動脈內、腫瘤內或皮下投予LNP組合物。然而，本公開文本涵蓋通過任何適當的途徑遞送本發明的LNP組合物（考慮到藥物遞送科學的可能進步）。通常，最適當的投予途徑將取決於多種因素，包括包含一種或多種mRNA的LNP組合物的性質（例如，它在諸如血流和胃腸道等各種身體環境中的穩定性）、患者的情況（例如，患者是否能夠耐受特定的投予途徑）等。 [0484]包括一種或多種mRNA的LNP組合物可以與一種或多種其他治療劑、預防劑、診斷劑或成像劑組合使用。「與……組合」並不旨在暗示藥劑必須同時投予和/或被配製以供一起遞送，但這些遞送方法在本公開文本的範圍內。例如，包括一種或多種不同mRNA的一種或多種LNP組合物可以組合投予。組合物可以與一種或多種其他所需的治療劑或醫療程序同時、在其之前或在其之後投予。通常，每種藥劑將以針對該藥劑確定的劑量和/或時間表來投予。在一些實施例中，本公開文本涵蓋與如下藥劑組合遞送本發明的組合物或者其成像、診斷或預防組合物，所述藥劑改進其生物利用度、降低和/或修改其代謝、抑制其排泄和/或修改其在體內的分佈。 [0485]應進一步理解的是，組合利用的治療、預防、診斷或成像活性劑可以在單一組合物中一起投予或者在不同組合物中單獨投予。通常，期望組合利用的藥劑將以不超過單獨利用它們時的水準的水準來利用。在一些實施例中，組合利用的水準可以低於單獨利用的水準。 [0486]在組合方案中採用的特定療法（治療劑或程序）組合將考慮所希望的治療劑和/或程序的相容性以及待實現的所需治療效果。還應理解的是，所採用的療法可以實現對相同疾病的期望效果（例如，可用於治療癌症的組合物可以與化學治療劑同時投予），或者它們可以實現不同的效果（例如，控制任何有害作用）。 VIII. 治療與造血幹細胞相關的疾病的方法 [0487]本公開文本提供了治療受試者的疾病的方法，所述方法通過將編碼一種或多種核酸的有效載荷（例如基因編輯系統，例如定點核酸酶，以及任選地指導RNA）遞送至受試者體內的HSC從而治療所述疾病。在一些實施例中，將包含編碼定點核酸酶的一種或多種核酸的有效載荷遞送至受試者體內的HSC可能導致生物靶標的修飾。在一些實施例中，本文提供的方法包括遞送還包含指導RNA的有效載荷。在一些實施例中，有效載荷的遞送可能導致生物靶標的沉默。所述生物靶標可以與要通過本文所述的方法治療的疾病相關。本文中治療疾病的方法的任何公開內容也應被解釋為關於用於在此類方法中使用的LNP或包含所述LNP的醫藥組合物的公開內容。 [0488]在一些態樣，提供了治療、改善或預防有需要的受試者的疾病的症狀的方法。在一些實施例中，所述方法包括向所述受試者投予本文提供的脂質奈米粒子（LNP）。本發明的LNP組合物可以用於治療如下疾病，所述疾病的特徵在於HSC或從HSC分化的細胞（例如，單核細胞、嗜中性粒細胞、血小板、紅細胞和免疫細胞（如自然殺傷（NK）細胞、B細胞、T細胞等））中蛋白質或多肽活性缺失或異常。在將編碼基因編輯系統的一種或多種核酸遞送至受試者的HSC後，基因編輯系統的表現可以誘導HSC中的遺傳修飾，從而減少或消除由多肽活性缺失或異常引起的問題。所述遺傳修飾可以修飾編碼所述缺失或異常蛋白質的基因，例如，以校正所述基因的蛋白質編碼序列中的突變，或修飾與所述基因相關的調節序列以增加天然功能性蛋白質的表現。在一些情形下，所述遺傳修飾可以替換編碼所述缺失或異常蛋白質的基因，例如，通過插入編碼對所述天然蛋白質進行編碼的基因的轉基因。本領域已知或本文所述的任何基因編輯系統可以用於本文所述的治療方法中。 [0489]特徵在於功能失調或異常的蛋白質或多肽活性且可以對其投予本發明的組合物的疾病包括但不限於血液病、血紅蛋白病、原發性免疫缺陷（PID）、先天性血球減少、血友病、血栓形成傾向、先天性代謝缺陷或神經病。在一些實施例中，所述血液病是α-血紅蛋白病、β-血紅蛋白病（例如β-地中海貧血）或鐮狀細胞病。在一些實施例中，所述PID可以包括例如重症聯合免疫缺陷（SCID）、威斯科特-奧爾德里奇症候群、慢性肉芽腫病、X連鎖多內分泌腺病腸病伴免疫失調（IPEX）、高IgM症候群或X連鎖無丙種球蛋白血症。在一些實施例中，所述SCID是Artemis-SCID（ART-SCID）、重組啟動基因SCID（RAG-SCID）、X連鎖SCID（X-SCID）、腺苷脫胺酶缺乏型SCID、白介素7受體缺陷型SCID或JAK3 SCID。在一些實施例中，所述先天性血球減少是範可尼貧血、施瓦赫曼-戴蒙德症候群、布萊克梵-戴蒙德貧血、先天性角化不良、先天性無巨核細胞血小板減少症或網狀組織發育不全。在一些實施例中，所述血友病是血友病A、血友病B或血友病C。在一些實施例中，所述血栓形成傾向是無巨核細胞血小板減少症或因子X缺乏症。在一些實施例中，所述先天性代謝缺陷是苯丙酮尿症、中鏈醯基輔酶A脫氫酶（MCAD）缺乏症、溶酶體貯積病、糖原貯積障礙、過氧化物酶體障礙、法布裡病、戈謝病、赫勒症候群、亨特症候群、沃爾曼病或丙酮酸激酶缺乏症。在一些實施例中，所述過氧化物酶體障礙是X連鎖腎上腺腦白質營養不良。在一些實施例中，所述溶酶體貯積病是異染性腦白質營養不良、粘多糖貯積症I或粘多糖貯積症II。在一些實施例中，所述神經病是弗裡德賴希共濟失調。在一些實施例中，所述病毒性疾病是HIV/AIDS。 [0490]多種疾病的特徵可以在於蛋白質活性缺失（或大幅減少，使得不發生正確的蛋白質功能）。此類蛋白質可能不存在，或者它們可能基本上是非功能性的。在一些實施例中，由靶向脂質奈米粒子遞送至HSC的有效載荷包括導致人類疾病的治療的定點核酸酶。例如，β-血紅蛋白病（如鐮狀細胞病和β-地中海貧血）是由β-球蛋白（ HBB）基因突變引起的，所述突變導致正常成人HbA血紅蛋白（由兩個α-球蛋白和兩個β-球蛋白亞基組成的異四聚體）減少，和/或異常血紅蛋白（例如HbS，其是兩個α-球蛋白和兩個異常β-球蛋白亞基的異四聚體）的產生。血紅蛋白的可替代形式是胎兒血紅蛋白（HbF），其是一種由兩個α-球蛋白和兩個γ-球蛋白亞基組成的異四聚體。在整個出生後生活中，編碼γ-球蛋白的 HBG （ HBG1和 HBG2）基因的表現被沉默因子B細胞淋巴瘤11A（BCL11A）、Krüppel樣因子1（KLF1）和ZBTB7A抑制。不希望受理論束縛，破壞或沉默HSC中的 BCL11A基因的遺傳修飾可能導致紅血球的發育，紅細胞表現編碼γ-球蛋白的 HBG1和/或 HBG2基因並產生HbF，從而在可能另外已表現異常β-球蛋白和/或不足量的正常β-球蛋白的細胞中恢復血紅蛋白功能。例如，對存在於 BCL11A基因的內含子2中的一個或多個 BCL11A內含子紅系細胞特異性強化子序列（在本文中稱為「 BCL11A紅系細胞強化子」）的破壞可能導致BLC11A蛋白的表現和活性降低，從而增加紅細胞中HbF的表現。術語「 BCL11A紅系細胞強化子」是指在內含子2中包含一個或多個 BCL11A紅系細胞強化子序列的多核苷酸，所述內含子區在 BCL11A基因的外顯子2與外顯子3之間。 BCL11A紅系細胞強化子序列包括例如在 BCL11A轉錄起始位點的下游（在3'方向上）約+55千鹼基（kb）至約+62 kb（例如，在約+55 kb、約+58 kb和/或約+62 kb）核苷酸距離處的核苷酸序列。 BCL11A紅系細胞強化子序列進一步描述於例如以下文獻中：Bauer等人（201“. 「An erythroid enhancer of BCL11A subject to genetic variation determines fetal hemoglobin level.」 Science342.6155: 253-257）；Lettre和Bauer（201“. 「Fetal haemoglobin in sickle-cell disease: from genetic epidemiology to new therapeutic strategies.」 The Lancet387.10037: 2554-2564）；以及Antoniani等人（201“. 「Concise review: epigenetic regulation of hematopoiesis: biological insights and therapeutic applications.」 Stem cells translational medicine6.12: 2106-2114）。 [0491]所述BCL11A紅系細胞強化子包括BCL11A基因的內含子2中的多核苷酸序列。例如，在一些實施例中，所述BCL11A紅系細胞強化子包含在 BCL11A轉錄起始位點（TSS）的下游（在3'方向上）約+54 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列。在某些實施例中，所述BCL11A紅系細胞強化子包含在 BCL11ATSS的下游約+54 kb與約+56 kb之間的多核苷酸序列、約+57 kb與約+59 kb之間的多核苷酸、或約+62 kb與約+63 kb之間的多核苷酸、或其任何組合。在某些實施例中，所述BCL11A紅系細胞強化子包含在 BCL11ATSS的下游約+54 kb與約+56 kb之間的多核苷酸序列。在某些實施例中，所述BCL11A紅系細胞強化子包含在 BCL11ATSS的下游約+57 kb與約+59 kb之間的多核苷酸序列。在某些實施例中，所述BCL11A紅系細胞強化子包含在 BCL11ATSS的下游約+62 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列。在一些實施例中，所述BCL11A紅系細胞強化子包含在 BCL11ATSS的下游+55 kb、+58 kb或+62 kb處核苷酸位置的約100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1.0 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb或1.5 kb距離內的多核苷酸序列或其組合。在某些實施例中，所述BCL11A紅系細胞強化子包含在 BCL11ATSS的下游+55 kb處核苷酸位置的約100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1.0 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb或1.5 kb距離內的多核苷酸序列。在某些實施例中，所述BCL11A紅系細胞強化子包含在 BCL11ATSS的下游+58 kb處核苷酸位置的約100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1.0 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb或1.5 kb距離內的多核苷酸序列。在某些實施例中，所述BCL11A紅系細胞強化子包含在 BCL11ATSS的下游+62 kb處核苷酸位置的約100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1.0 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb或1.5 kb距離內的多核苷酸序列。在某些實施例中，所述BCL11A紅系細胞強化子包含GTGATAAAAGCAACTGTTAG（SEQ ID NO: 62）的多核苷酸序列，或其包含至多10（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10）個核苷酸取代的變體。 [0492]在一些實施例中，靶向脂質奈米粒子向HSC的遞送由此導致 BCL11A紅系細胞強化子的靶向編輯（例如， BCL11A基因的內含子2中的多核苷酸序列的編輯，例如，缺失、插入、或取代 BCL11A轉錄起始位點（TSS）的下游約+54 kb與約+63 kb之間的一個或多個多核苷酸，例如，缺失、插入或取代 BCL11ATSS的下游約+54 kb與約+56 kb之間的一個或多個多核苷酸、約+57 kb與約+59 kb之間的多核苷酸、或約+62 kb與約+63 kb之間的多核苷酸、或其組合），以用於治療β-血紅蛋白病。在某些實施例中，靶向脂質奈米粒子向HSC的遞送由此導致 BCL11A基因的內含子2中的一個或多個 BCL11A紅系細胞強化子核苷酸序列的靶向編輯（例如，缺失、插入、或取代 BCL11A轉錄起始位點（TSS）的下游約+54 kb與約+63 kb之間的一個或多個多核苷酸，例如，缺失、插入或取代 BCL11ATSS的下游約+54 kb與約+56 kb之間的一個或多個多核苷酸、約+57 kb與約+59 kb之間的多核苷酸、或約+62 kb與約+63 kb之間的多核苷酸、或其組合），從而導致 BCL11A基因的表現降低（例如， BCL11AmRNA和/或蛋白質減少）和/或胎兒血紅蛋白減少。 [0493]本公開文本提供了一種通過投予LNP組合物來治療受試者中的此類疾病的方法，所述LNP組合物包含：可電離陽離子脂質，含有以下結構的接合物：[脂質] - [任選的連接子] - [HSC靶向基團]，以及編碼基因編輯系統的一種或多種核酸（例如，編碼定點核酸酶、化學鹼基編輯器、先導編輯器或表觀基因組編輯器的mRNA，以及任選地gRNA或pegRNA），其中所述基因編輯系統被配置為靶向靶標、修飾與要治療的特定疾病相關的靶核苷酸序列。 [0494]可以使用有效地預防、治療、診斷或成像疾病和/或任何其他目的的任何合理的量和任何投予途徑，將本文所述的治療性和/或預防性組合物投予受試者。投予給定受試者的具體量可以根據受試者的物種、年齡和一般狀況、投予目的、特定組合物、投予方式等而變化。根據本公開文本的組合物可以配製成劑量單位形式以便於投予和劑量的一致性。然而，應理解，本公開文本的組合物的總日用量將由主治醫師在合理的醫學判斷範圍內決定。 [0495]包括一種或多種核酸的LNP組合物可以通過多種途徑投予，例如，靜脈內、骨內（進入骨髓）、口服、肌內、動脈內、經皮或皮內、皮內、經直腸、腹膜內或經粘膜。在一些實施例中，可以靜脈內、骨內或動脈內投予LNP組合物。在某些實施例中，可以在投予HSC動員劑（例如，普瑞沙福和/或G-CSF）期間或之後靜脈內或動脈內投予LNP組合物。然而，本公開文本涵蓋通過任何適當的途徑遞送本發明的LNP組合物（考慮到藥物遞送科學的可能進步）。通常，最適當的投予途徑將取決於多種因素，包括LNP組合物的性質、要治療的疾病、患者的情況（例如，患者是否能夠耐受特定的投予途徑）等。 [0496]包括一種或多種mRNA的LNP組合物可以與一種或多種其他治療劑、預防劑、診斷劑或成像劑組合使用。「與……組合」並不旨在暗示藥劑必須同時投予和/或被配製以供一起遞送，但這些遞送方法在本公開文本的範圍內。例如，包括一種或多種不同mRNA的一種或多種LNP組合物可以組合投予。組合物可以與一種或多種其他所需的治療劑或醫療程序同時、在其之前或在其之後投予。通常，每種藥劑將以針對該藥劑確定的劑量和/或時間表來投予。在一些實施例中，本公開文本涵蓋與如下藥劑組合遞送本發明的組合物或者其成像、診斷或預防組合物，所述藥劑改進其生物利用度、降低和/或修改其代謝、抑制其排泄和/或修改其在體內的分佈。 [0497]應進一步理解的是，組合利用的治療、預防、診斷或成像活性劑可以在單一組合物中一起投予或者在不同組合物中單獨投予。通常，期望組合利用的藥劑將以不超過單獨利用它們時的水準的水準來利用。在一些實施例中，組合利用的水準可以低於單獨利用的水準。 [0498]在組合方案中採用的特定療法（治療劑或程序）組合將考慮所希望的治療劑和/或程序的相容性以及待實現的所需治療效果。還應理解的是，所採用的療法可以實現對相同疾病的所需效果，或者它們可以實現不同的效果（例如，控制任何有害作用）。 [0499]在一些態樣，提供了治療、改善或預防有需要的受試者的疾病的症狀的方法。在一些實施例中，所述方法包括向所述受試者投予脂質奈米粒子（LNP）以將核酸遞送至所述受試者體內的造血幹細胞（HSC）。在一些實施例中，所述LNP包含可電離陽離子脂質。在一些實施例中，所述LNP包含含有以下結構的接合物：[脂質] - [任選的連接子] - [HSC靶向基團]。在某些實施例中，所述LNP包含含有以下結構的脂質-抗體接合物：[脂質] - [任選的連接子] - [抗體]，其中所述抗體結合CD105和/或CD117。在一些實施例中，結合CD117的抗體是Ab1。在一些實施例中，結合CD117的抗體是Ab2。在一些實施例中，結合CD105的抗體是Ab3。在一些實施例中，所述LNP包含固醇或其他結構脂質。在一些實施例中，所述LNP包含中性磷脂。在一些實施例中，所述LNP包含游離聚乙二醇（PEG）脂質。在一些實施例中，所述LNP包含編碼基因編輯系統的一種或多種核酸。在某些實施例中，所述一種或多種核酸包括編碼定點核酸酶、化學鹼基編輯器、先導編輯器或表觀基因組編輯器的mRNA，以及任選地gRNA或pegRNA。在一個實施例中，所述一種或多種核酸包括編碼Cas核酸酶的mRNA和指導RNA。 [0500]在一些實施例中，所述基因編輯系統誘導HSC內的一個或多個基因的遺傳修飾，從而治療疾病。在一些實施例中，本公開文本的一個態樣涉及如本文所公開的LNP或含有其的醫藥組合物，用於在治療、改善或預防有需要的受試者的疾病的症狀的方法中使用。疾病可以是如本文所公開的。在一些實施例中，如本文所公開的方法可以包括使受試者體內的HSC與本文所述的LNP接觸。 [0501]在一些實施例中，所述LNP提供以下益處中的至少一種： (i) 與參考LNP相比，將所述核酸遞送至所述HSC的特異性增加； (ii) 與參考LNP相比，轉染率增加； (iii) 所述LNP可以以與參考LNP相比更低的劑量投予，以達到相同的治療功效； (iv) 低水準的染料可及mRNA（＜ 15%）和高RNA包封效率，其中相對於在LNP批量製備中使用的總RNA，在最終配製品中回收至少80%的mRNA；以及 (v) 減少所述受試者中所述疾病的症狀的發生和/或嚴重程度。 [0502]本文提供的LNP可用於治療與造血幹細胞（HSC）相關的任何疾病，或HSC替代療法可作為可行治療方法的任何疾病。在一些實施例中，所述疾病是血液病。在某些實施例中，所述疾病是血紅蛋白病、原發性免疫缺陷（PID）、先天性血球減少、血友病、血栓形成傾向、先天性代謝缺陷或神經病。 [0503]在一些實施例中，本文提供了一種治療α-血紅蛋白病或β-血紅蛋白病的方法。在一些實施例中，本文提供了一種治療α-血紅蛋白病的方法。在一些實施例中，本文提供了一種治療β-血紅蛋白病的方法。在某些實施例中，所述β-血紅蛋白病是β-地中海貧血。在某些實施例中，所述β-血紅蛋白病是鐮狀細胞病。在一些實施例中，投予所述LNP導致以下中的一項或多項：a) HBB轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中；b) 所述受試者中β-球蛋白的表現增加；b) 所述受試者的α2β2成人血紅蛋白（HbA）的量增加；c) HBG1轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中；d) HBG2轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中；e) 所述受試者中γ-球蛋白的表現增加；f) 所述受試者中α2γ2胎兒血紅蛋白（HbF）的量增加；g) HBA1基因、HBA2基因或其組合在所述受試者的至少一個HSC中遭到破壞；h) 所述受試者中α-球蛋白的表現降低；以及 i) 所述受試者中α4 α-球蛋白異四聚體的量減少。在一些實施例中，所述方法包括向所述受試者投予本文所述的LNP，其中所述LNP包含編碼基因編輯系統的一種或多種核酸，所述基因編輯系統被配置為誘導HSC中的靶核苷酸序列的遺傳修飾。在一些實施例中，所述LNP包含編碼Cas核酸酶的mRNA和含有賦予與靶核苷酸序列的結合的核苷酸序列的gRNA（例如，含有與所述靶核苷酸序列的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20個連續核苷酸具有至少80%、至少90%、至少95%或100%同一性的核苷酸序列的gRNA）。在其中所述疾病是β-地中海貧血或鐮狀細胞病的某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20個連續核苷酸並位於基因的編碼區、與基因相關的內含子區、與基因相關的外顯子區、與基因相關的5'非轉譯區或與基因相關的3'非轉譯區內，其中所述基因是 HBB基因、 HBG1基因、 HBG2基因、 HBA1基因、 HBA2基因、 HBD基因、 BCL11A基因、 BACH2基因、 KLF1基因或 LRF基因。在其中所述疾病是β-地中海貧血或鐮狀細胞病的某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20個連續核苷酸並位於基因的調節區內，其中所述基因是 HBB基因、 HBG1基因、 HBG2基因、 HBA1基因、 HBA2基因、 HBD基因、 BCL11A基因、 BACH2基因、 KLF1基因或 LRF基因。在其中所述疾病是β-地中海貧血或鐮狀細胞病的某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20個連續核苷酸並位於基因的強化子區內或基因的抑制子區內，其中所述基因是 HBB基因、 HBG1基因、 HBG2基因、 HBA1基因、 HBA2基因、 HBD基因、 BCL11A基因、 BACH2基因、 KLF1基因或 LRF基因。在其中所述疾病是β-地中海貧血或鐮狀細胞病的某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含 BCL11A基因內的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20個連續核苷酸。在其中所述疾病是β-地中海貧血或鐮狀細胞病的某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20個連續核苷酸並位於 BCL11A基因的內含子2中的多核苷酸序列內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20個連續核苷酸，並位於 BCL11A轉錄起始位點（TSS）的下游約+54 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20個連續核苷酸，並位於 BCL11ATSS的下游約+54 kb與約+56 kb之間的多核苷酸序列、約+57 kb與約+59 kb之間的多核苷酸序列、或約+62 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列內或其組合內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20個連續核苷酸，並位於 BCL11ATSS的下游+55 kb、+58 kb或+62 kb處核苷酸位置的約100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1.0 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb或1.5 kb距離內的多核苷酸序列內或其組合內。在其中所述疾病是β-地中海貧血或鐮狀細胞病的某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、或全部20個連續核苷酸，並位於GTGATAAAAGCAACTGTTAG（SEQ ID NO: 62）的多核苷酸序列或其包含至多10（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10）個核苷酸取代的變體內。在一些實施例中，本文提供了一種治療鐮狀細胞病的方法。 [0504]在一些實施例中，本文提供了一種治療疾病的方法，其中所述疾病是PID。在一些實施例中，所述PID是重症聯合免疫缺陷（SCID）、威斯科特-奧爾德里奇症候群、慢性肉芽腫病、X連鎖多內分泌腺病腸病伴免疫失調（IPEX）、高IgM症候群或X連鎖無丙種球蛋白血症。在一些實施例中，所述PID是SCID。在一些實施例中，所述SCID是Artemis-SCID（ART-SCID）、重組啟動基因SCID（RAG-SCID）、X連鎖SCID（X-SCID）、腺苷脫胺酶缺乏型SCID、白介素7受體缺陷型SCID或JAK3 SCID。在一些實施例中，所述SCID是ART-SCID，並且其中投予所述LNP導致 DCLREIC轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，所述受試者中功能性Artemis蛋白的表現增加，或其組合。在一些實施例中，所述SCID是RAG-SCID，並且其中投予所述LNP導致 RAG1轉基因或 RAG2轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，所述受試者中功能性RAG1蛋白或RAG2蛋白的表現增加，或其組合。在一些實施例中，所述SCID是X-SCID，並且其中投予所述LNP導致 IL2RG轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，所述受試者中功能性IL2RG蛋白的表現增加，或其組合。在一些實施例中，所述PID是威斯科特-奧爾德里奇症候群。在一些實施例中，所述PID是威斯科特-奧爾德里奇症候群，並且其中投予所述LNP導致 WAS轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，所述受試者中功能性WASP蛋白表現的表現增加，或其組合。在一些實施例中，所述PID是慢性肉芽腫病。在一些實施例中，所述PID是X連鎖慢性肉芽腫病。在一些實施例中，所述PID是慢性肉芽腫病，並且其中投予所述LNP導致以下中的一項或多項：(i) CYBA轉基因、 CYBB轉基因、 NCF1轉基因、 NCF2轉基因或 NCF4轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，(ii) 在所述受試者的至少一個HSC的 CYBB基因中引入點676C＞T點突變；(iii) 所述受試者中功能性CYBA蛋白、CYBB蛋白、NCF1蛋白、NCF2蛋白或NCF4蛋白的表現增加；以及 (v) 所述受試者中功能性NADPH氧化酶複合物的量增加。在一些實施例中，所述PID是IPEX。在一些實施例中，所述PID是IPEX，並且其中投予所述LNP導致 FOXP3轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，所述受試者中功能性FOXP3蛋白的表現增加，或其組合。在一些實施例中，所述PID是高IgM症候群。在一些實施例中，所述PID是高IgM症候群，並且其中投予所述LNP導致以下中的一項或多項：(i) AICDA轉基因、 UNG轉基因、 CD40轉基因或 CD40LG轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中；(ii) 所述受試者中功能性AICDA蛋白、UNG蛋白、CD40蛋白或CD40LG蛋白的表現增加；(iii) 所述受試者中IgM抗體的量減少；和 (iv) 所述受試者中IgG、IgA、或IgE抗體的量增加。 [0505]在一些實施例中，本文提供了一種治療疾病的方法，其中所述疾病是先天性血球減少。在一些實施例中，所述先天性血球減少是範可尼貧血、施瓦赫曼-戴蒙德症候群、布萊克梵-戴蒙德貧血、先天性角化不良、先天性無巨核細胞血小板減少症或網狀組織發育不全。在一些實施例中，所述先天性血球減少是範可尼貧血，並且其中投予所述LNP導致以下中的一項或多項： FANC基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，所述受試者中一種或多種功能性FANC蛋白的表現增加，或其組合。在一些實施例中，所述先天性血球減少是範可尼貧血，並且其中投予所述LNP導致 FANCA轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，所述受試者中功能性FANCA的表現增加，或其組合。 [0506]在一些實施例中，本文提供了一種治療疾病的方法，其中所述疾病是血友病。在一些實施例中，所述血友病是血友病A、血友病B或血友病C。在一些實施例中，所述疾病是血友病，並且其中投予所述LNP導致 (i) F8轉基因、 F9轉基因或 F11或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中；(ii) 所述受試者中功能性因子VIII蛋白、因子IX蛋白或因子XI蛋白的表現增加；以及 (iii) 所述受試者中血液凝固增加。 [0507]在一些實施例中，本文提供了一種治療疾病的方法，其中所述疾病是血栓形成傾向。在一些實施例中，所述血栓形成傾向是無巨核細胞血小板減少症或因子X缺乏症。在一些實施例中，所述疾病是血栓形成傾向，並且其中投予所述LNP導致以下中的一項或多項：(i) F5轉基因、 F2轉基因、編碼抗凝血酶III的轉基因、編碼蛋白C的轉基因或編碼蛋白S的轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，(ii) 所述受試者中功能性因子V蛋白、因子II蛋白、抗凝血酶III蛋白、蛋白C或蛋白S的表現增加；以及 (iii) 所述受試者中血液凝固減少。 [0508]在一些實施例中，本文提供了一種治療疾病的方法，其中所述疾病是先天性代謝缺陷。在一些實施例中，所述先天性代謝缺陷是苯丙酮尿症、中鏈醯基輔酶A脫氫酶（MCAD）缺乏症、溶酶體貯積病、糖原貯積障礙、過氧化物酶體障礙、法布裡病、戈謝病、赫勒症候群、亨特症候群、沃爾曼病或丙酮酸激酶缺乏症。在一些實施例中，所述過氧化物酶體障礙是X連鎖腎上腺腦白質營養不良。在一些實施例中，所述溶酶體貯積病是異染性腦白質營養不良、粘多糖貯積症I或粘多糖貯積症II。 [0509]在一些實施例中，本文提供了一種治療疾病的方法，其中所述疾病是神經病。在一些實施例中，所述神經病是弗裡德賴希共濟失調。 [0510]在一些實施例中，本文提供了一種治療疾病的方法，其中所述疾病是病毒性疾病。在一些實施例中，所述病毒性疾病是HIV/AIDS。在一些實施例中，所述病毒性疾病是HIV/AIDS，並且其中投予所述LNP預防被HIV感染、防止HIV/AIDS進展或其組合。 [0511]本公開文本中所述的LNP適用於所述的方法。 [0512]在一些實施例中，本文提供的治療方法包括遞送LNP，所述LNP包含脂質15、結合HSC表面抗原的HSC靶向基團以及有效載荷，所述HSC靶向基團包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH結構域以及含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL結構域，其中所述VH結構域與SEQ ID NO: 7所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同一性，其中所述VL結構域與SEQ ID NO: 8所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的序列同一性，並且所述有效載荷包含編碼靶向一個或多個基因座的基因編輯系統的組分的一種或多種核酸，其中基因編輯導致HbF增加，從而用於治療鐮狀細胞病或β-地中海貧血。在一些實施例中，所述靶核苷酸序列位於 BCL11A紅系細胞強化子內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於 BCL11A基因的內含子2中的多核苷酸序列內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於在 BCL11A轉錄起始位點（TSS）的下游約+54 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於在 BCL11ATSS的下游約+54 kb與約+56 kb之間的多核苷酸序列內、約+57 kb與約+59 kb之間的多核苷酸序列內、或約+62 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列內、或其組合內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於在 BCL11ATSS的下游+55 kb、+58 kb或+62 kb處核苷酸位置的約100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1.0 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb或1.5 kb距離內的多核苷酸序列內或其組合內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含GTGATAAAAGCAACTGTTAG（SEQ ID NO: 62）的多核苷酸序列，或其包含至多10（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10）個核苷酸取代的變體。在一些實施例中，本文提供的治療方法包括遞送LNP，所述LNP包含脂質15、結合HSC表面抗原的HSC靶向基團以及有效載荷，所述HSC靶向基團包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的VH結構域以及含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的VL結構域，其中所述VH結構域包含SEQ ID NO: 7所示的胺基酸序列，其中所述VL結構域包含SEQ ID NO: 8所示的胺基酸序列，並且所述有效載荷包含編碼靶向一個或多個基因座的基因編輯系統的組分的一種或多種核酸，其中基因編輯導致HbF增加，從而用於治療鐮狀細胞病或β-地中海貧血。在一些實施例中，所述靶核苷酸序列位於 BCL11A紅系細胞強化子內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於 BCL11A基因的內含子2中的多核苷酸序列內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於在 BCL11A轉錄起始位點（TSS）的下游約+54 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於在 BCL11ATSS的下游約+54 kb與約+56 kb之間的多核苷酸序列內、約+57 kb與約+59 kb之間的多核苷酸序列內、或約+62 kb與約+63 kb之間的多核苷酸序列內、或其組合內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列位於在 BCL11ATSS的下游+55 kb、+58 kb或+62 kb處核苷酸位置的約100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1.0 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb或1.5 kb距離內的多核苷酸序列內或其組合內。在某些實施例中，所述靶核苷酸序列包含GTGATAAAAGCAACTGTTAG（SEQ ID NO: 62）的多核苷酸序列，或其包含至多10（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10）個核苷酸取代的變體。在一些實施例中，使用本文提供的示例性LNP的遞送來體內編輯HSC細胞並治療受試者的疾病，其中所述疾病是鐮狀細胞病或β-地中海貧血。在一些實施例中，通過遞送本文提供的示例性LNP對 BCL11A紅系細胞強化子進行基因編輯導致對受試者的鐮狀細胞病的治療。在一些態樣，所述治療疾病的方法還包括向所述受試者投予HSC動員劑，其中所述HSC動員劑包括普樂沙福和G-CSF。在一些實施例中，本文提供的示例性LNP用於治療受試者的鐮狀細胞病的用途是安全且有效的。在一些實施例中，本文提供的示例性LNP用於治療受試者的β-地中海貧血的用途是安全且有效的。 IX. 用於在醫療應用中使用的套組 [0513]本發明的另一個態樣提供了用於治療疾病的套組。所述套組可以包含以下一種或多種：可電離陽離子脂質，脂質-HSC靶向基團或其接合物（例如脂質-抗體接合物，例如其中所述抗體結合CD105和/或CD117），包含可電離陽離子脂質和/或脂質-HSC靶向基團或其接合物（例如脂質-抗體接合物，例如其中所述抗體結合CD105和/或CD117）的脂質奈米粒子組合物，具有或不具有包封的有效載荷（例如核酸，例如，編碼定點核酸酶、化學鹼基編輯器、先導編輯器或表觀基因組編輯器的mRNA，以及任選地gRNA或pegRNA），以及用於治療本文所述的醫學疾病（例如鐮狀細胞病）的說明書。 實例 [0514]通過參考以下實例將更好地理解本發明公開的主題，所述實例是作為本發明的示例提供的，而不是通過限制的方式提供的。 實例 1 ：可電離陽離子脂質的製備 [0515]本實例描述了各種陽離子脂質的合成。 用於合成脂質 1 至脂質 25 的通用方案 [0516]在下面的方案1中提供了用於合成脂質1至脂質25的通用方案。在下面的 表 1 至表 3中提供了每種脂質的相應R和R’。 方案 1. 使用醯化和還原胺化合成脂質 1 至脂質 16 中間體 13-11 和 13-11a 的合成 [0517]通過將二羥基丙酮（13-10）用亞油酸醯化來合成中間體13-11（方案2）。在50 mL DCM中，在DIPEA（55 mmol，9.6 mL，2.5當量）、DMAP（4.4 mmol，540 mg，0.2當量）存在下，在室溫下，使用EDCI（55 mmol，10.5 g，2.5當量）活化，使二羥基丙酮（22 mmol，2 g，1當量）與亞油酸1-5（55 mmol，15.4 g，2.5當量）反應，產生11.1 g（79%）粗產物。通過柱層析法獲得純化的產物，並通過質子NMR譜進行表徵（ 圖 2）。 方案 2. 使用 EDCI 介導的亞油酸與二羥基丙酮的 O- 醯化反應合成中間體 13-11 [0518]通過將二羥基丙酮（13-10）用油醯氯醯化來合成中間體13-11a（方案3）。在吡啶（133.3 mmol，11 mL，3當量）、DMAP（13.3 mmol，1.63 g，0.3當量）存在下，在80 mL DCM中，在室溫下，使二羥基丙酮（44.4 mmol，4 g，1當量）與油醯氯1-6a（111 mmol，36.7 mL，2.5當量）反應，產生14.9 g（54%）粗產物。通過柱層析純化粗產物，並通過質子NMR譜進行表徵（ 圖 3A）。 方案 3. 通過油醯氯與二羥基丙酮的 O- 醯化合成中間體 13-11a 中間體 13-0a 和 13-11b 的合成 [0519]分別通過中間體13-11和13-11a的還原胺化來合成中間體13-0a和13-11b。 [0520]通過使用在DCM（10 mL）中的N1,N1-二甲基丙烷-1,3-二胺15-3（26 mmol，3.2 mL，2.0當量），通過使用乙酸（26.0 mmol，1.50 mL，2當量）和三乙醯氧基硼氫化鈉（4.32 mmol，3.3 g，1.2當量），通過中間體13-11（13.1 mmol，8.1 g，1.0當量）的還原胺化（方案4）來產生中間體13-0，產生3.1 g（32%）粗產物。柱純化得到純化的產物（分別如 圖 4A和 圖 4B所示的質子NMR譜和LC-CAD層析圖）。 方案 4. 通過用 N1,N1- 二甲基丙烷 -1,3- 二胺還原胺化中間體 13-11 合成中間體 13-0 [0521]通過使用在DCM（60 mL）中的N1,N1-二甲基丙烷-1,3-二胺15-3（48.4 mmol，6.05 mL，2.0當量），通過使用乙酸（48.4 mmol，2.8 mL，2當量）和三乙醯氧基硼氫化鈉（29.1 mmol，6.05 g，1.2當量），通過中間體13-11a（24.2 mmol，14.9 g，1.0當量）的還原胺化（方案5）來產生中間體13-11b，產生6 g（35%）粗產物。柱純化得到純化的產物（分別如 圖 3B和 圖 3C所示的質子NMR譜和LC-ELSD層析圖）。 方案 5. 通過用 N1,N1- 二甲基丙烷 -1,3- 二胺還原胺化中間體 13-11a 合成中間體 13-11b 表 1. 脂質 1 至 8 的 R （ O- 醯基）和 R' （ N- 醯基）基團 表 2. 脂質 9 至 16 的 R （ O- 醯基）和 R' （ N- 醯基）基團 表 3. 脂質 17 至 25 的 R （ O- 醯基）和 R' （ N- 醯基）基團 表 4. 命名的可電離脂質的預期和觀察質量（ m/z ）
條目 化合物代碼 預期質量（ g/mol ） 觀察質量（ m/z ）
1 脂質1 854.75 855.7、856.7、857.7（M+1、M+2、M+3）
2 脂質2 840.73 841.7、842.7、843.7（M+1、M+2、M+3）
3 脂質3 840.73 841.7、842.7、843.7（M+1、M+2、M+3）
4 脂質4 845.39 845.7、846.7、847.7（M、M+1、M+2）
5 脂質5 (S) 異構體 827.33 827.7、828.7、829.7（M、M+1、M+2）
6 脂質6 868.76 869.7、870.7、871.7（M+1、M+2、M+3）
7 脂質7 868.76 869.7、870.7、871.7（M+1、M+2、M+3）
8 脂質8 854.75 855.7、856.7、857.7（M+1、M+2、M+3）
9 脂質9 940.78 941.7、942.7、943.7（M+1、M+2、M+3）
10 脂質10 (S) 異構體 912.75 913.7、914.7、915.7（M+1、M+2、M+3）
11 脂質11 (S) 異構體 970.76 971.7、972.7、973.7（M+1、M+2、M+3）
12 脂質12  999.51 999.0、1001、1002（M+1、M+2、M+3）
13 脂質13 984.77 985.7、986.7、987.6（M+1、M+2、M+3）
15 脂質15 944.82 945.1、946.1、947.1（M+1、M+2、M+3）
16 脂質16 916.78 917.2、918.2、919.2（M+1、M+2、M+3）
17 脂質19 892.78 893.7、894.7、895.7（M+1、M+2、M+3）
18 脂質20 1064.86 1065.1、1066.1、1067.1、1068.1（M+1、M+2、M+3、M+4）
19 脂質31 854.75 855.1、856.1、857.1（M+1、M+2、M+3）
20 脂質32 854.75 855.7、856.7、857.7（M+1、M+2、M+3）
21 脂質33 840.73 841.7、842.7、843.7（M+1、M+2、M+3）
22 脂質34 868.76 869.7、870.7、871.7（M+1、M+2、M+3）
23 脂質35 884.76
通過中間體 13-0 或 13-11b 的 N- 醯化合成脂質 1 至 24 [0522]中間體13-0和13-11b與化合物R'CO 2H或R'COCl（ 表1至 表 3中所示的R'結構）的N-醯化產生脂質1至24，如以下實例中所述。 使用相應的醯氯，通過中間體 13-0 的 N- 醯化合成脂質 1 、 3 、 4 、 5 、 6 和 7 脂質 1 的合成 [0523]如下文方案6中所提供地並且如下合成脂質1。通過使用在6 mL苯中的草醯氯（3.7 mmol，320 µl，5當量）和DMF（10 µl，催化量），將起始材料13l-1（0.75 mmol，130 mg，1.0當量）轉化為醯氯（步驟1）。產物（143 mg，98%）在TLC上僅顯示一個斑點（為甲酯），並且其不經進一步純化而用於中間體13-0的醯化（步驟2）。通過使用TEA（240 µL，5當量，1.8 mmol）和DMAP（10 mg，催化量），將中間體13-0（0.35 mmol，250 mg，1.0當量）用粗醯氯13l-1（0.75 mmol，143 mg，1.7當量）醯化。將粗產物通過柱層析法純化（2次），產生124 mg（76%）純脂質1（通過LC-ELSD得到 ≥ 99%純度），並通過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質1 NMR譜，參見 圖 5A-1；關於產物質量，參見 表 4）。 方案 6. 脂質 1 的合成 脂質 3 的合成 [0524]如下文方案7中所提供地並且如下合成脂質3。通過使用在60 mL苯中的草醯氯（2.8 mmol，2.4 ml，5當量）和DMF（100 µl，催化量），將起始材料13-13（8.3 mmol，1.30 g，1.0當量）轉化為醯氯13-13a（步驟1）。產物（1.44 g，98%）在TLC上僅顯示一個斑點（為甲酯），並且其不經進一步純化而用於中間體13-0的醯化（步驟2）。通過使用在苯（100 mL）中的TEA（3.76 mL，5當量，27 mmol）和DMAP（50 mg，催化劑，催化量），將中間體13-0（5.4 mmol，3.78 g，1.0當量）用粗醯氯13-13a（1.44 g，1.5當量，8.1 mmol）醯化。將粗產物通過柱層析法純化（2次），產生2.1 g（46.3%）純脂質3（通過LC-ELSD得到 ≥ 99%純度），並通過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質3 NMR譜，參見 圖 5B-1；關於脂質3 LC-MS，參見 圖 5B-2；關於產物質量，參見 表 4）。 方案 7. 脂質 3 的合成 脂質 4 的合成 [0525]如下文方案7中所提供地並且如下合成脂質4。通過使用在6 mL苯中的草醯氯（3.23 mmol，227 µl，3.4當量）和DMF（10 µl，催化量），將起始材料13-18（0.95 mmol，150 mg，1當量）轉化為醯氯13-18’（步驟1）。產物在TLC上僅顯示一個斑點（為甲酯），並且其不經進一步純化而用於中間體13-11b的醯化（步驟2）。通過使用在苯（10 mL）中的TEA（445 µL，5.0當量，3.2 mmol）和DMAP（10 mg，催化量），將中間體13-11b（0.63 mmol，444 mg，1.0當量）用粗醯氯13-18’（167 mg，1.5當量，0.95 mmol）醯化。將粗產物通過柱層析法純化（5次），產生140 mg（26%）純脂質4（通過LC-ELSD得到97%純度），並通過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質4 NMR譜，參見圖5C-1；關於脂質4 LC-MS，參見 圖 5C-2；關於產物質量，參見 表 4）。 方案 8. 脂質 4 的合成 脂質 5 及其 (S) 異構體的合成 [0526]如下文方案9-1中所提供地並且如下合成脂質5的 (S) 異構體。通過使用在3 mL苯中的草醯氯（320 µL，1.0當量，3.7 mmol）和DMF（20 µl，催化量），在回流2小時下，將起始材料乙基己烯酸13m-1（110 mg，1.0當量，0.75 mmol）轉化為醯氯13m-2（步驟1）。產物在TLC上僅顯示一個斑點（為甲酯），並且其不經進一步純化而用於中間體13-0的醯化（步驟2）。在室溫下，通過使用在10 mL苯中的TEA（240 µL，5.0當量，1.8 mmol）和DMAP（10 mg，催化量），將中間體13-0（250 mg，1.0當量，0.35 mmol）用粗醯氯13m-2（120 mg，1.8當量，0.75 mmol）醯化，反應隔夜。將粗產物通過柱層析法純化（2次），產生95 mg（32%）純脂質5（通過LC-ELSD得到 ≥ 99%純度），並通過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質5 NMR譜，參見 圖 5D-1；關於脂質5 LC-MS，參見 圖 5D-2；關於產物質量，參見 表 4）。 方案 9-1. 脂質 5 (S) 異構體的合成 [0527]如下文方案9-2中所提供地，類似地合成作為外消旋混合物的脂質5。 方案 9-2. 脂質 5 的合成 脂質 6 的合成 [0528]如下文方案10中所提供地並且如下合成脂質6。通過使用在6 mL苯中的草醯氯（207 µl，3.4當量，2.4 mmol）和DMF（10 µl，催化量），將起始材料2-乙基壬酸13-14（132 mg，0.17 mmol，1當量）轉化為醯氯13-14’（步驟1）。產物在TLC上僅顯示一個斑點（為甲酯），並且其不經進一步純化而用於中間體13-0的醯化（步驟2）。通過使用在10 mL苯中的TEA（327 µL，5.0當量，2.4 mmol）和DMAP（10 mg，催化量），將中間體13-0（0.47 mmol，330 mg，1當量）用粗醯氯13-14’（145 mg，1.5當量，0.7 mmol）醯化。將粗產物通過柱層析法純化（2次），產生75 mg（18%）純脂質6（通過LC-ELSD得到 ≥ 99%純度），並通過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質6 NMR譜，參見 圖 5E-1；關於脂質6 LC-MS，參見 圖 5E-2；關於產物質量，參見 表 4）。 方案 10. 脂質 6 的合成 脂質 7 的合成 [0529]如下文方案11中所提供地並且如下合成脂質7。通過使用在HMPA（4.4 mL）和30 mL THF中的二異丙胺（7.2 mL，2.2當量，51 mmol），將起始材料庚酸13-15（23.1 mmol，3.0 g，1當量）用正丁基溴13-16（2.5 mL，1.0當量，23.1 mmol）和2.5 M在己烷中的正丁基鋰（20.0 mL，2.2當量，51 mmol）烷基化（步驟1）。通過快速層析法從反應混合物中分離1.5 g（35%）2-丁基庚酸13-17。通過使用在3 mL苯中的草醯氯（6.6 mmol，568 µl，3.4當量）和DMF（5 µl，催化量），將中間體13-17（360 mg，0.94 mmol，1當量）轉化為醯氯13-17’（步驟2）。產物在TLC上僅顯示一個斑點（為甲酯），並且其不經進一步純化而用於中間體13-0的醯化（步驟3）。將中間體13-0（0.64 mmol，450 mg，1當量）用在10 mL苯中的粗醯氯13-17'（395 mg，3.0當量，1.94 mmol）、TEA（446 µL，5.0當量，3.2 mmol）、DMAP（10 mg）醯化。將粗產物通過柱層析法純化（2次），產生228 mg（41%）純脂質7（通過LC-ELSD得到 ≥ 99%純度），並通過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質7 NMR譜，參見 圖 5F-1；關於脂質7 LC-MS，參見 圖 5F-2；關於產物質量，參見 表 4）。 方案 11. 脂質 7 的合成 使用相應羧酸的碳二亞胺活化，通過中間體 13-0 的 N- 醯化合成脂質 2 、 8 、 9 和 10 [0530]如下文方案12中所提供地並且如下合成脂質2。將中間體13-0（0.14 mmol，320 mg，1.0當量）用在5 mL DCM中的壬酸13-12（1.15 mmol，198 uL，2.5當量）、EDCI（1.15 mmol，221 mg，2.5當量）、DIPEA（1.15 mmol，198 uL，2.5當量）和DMAP（0.05 mmol，6.4 mg，0.1當量）醯化。將粗產物通過柱層析法純化（3次），產生107 mg（%）純脂質2（通過LC-ELSD得到 ≥ 99%純度），並通過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質2 NMR譜，參見 圖 5G-1；關於脂質2 LC-MS，參見 圖 5G-2；關於產物質量，參見 表 4）。 方案 12. 脂質 2 的合成 脂質 8 的合成 [0531]如下文方案13中所提供地並且如下合成脂質8。經由辛-3-酮13-46（2 g，15.6 mmol）與2-(二乙氧基磷醯基)乙酸乙酯13-47（7.0 g，2.0當量，31.2 mmol）、在THF中的2M NaHMDS（15.6 mL，2.0當量，31.2 mmol）和9 ml THF溶劑的HWE反應（步驟1）獲得烯烴13-48。反應後處理產生2.38 g（77%）經NMR、產物質量和單一TLC斑點確認的13-48。通過使用在8 mL乙酸乙酯中的Pd/C（50 mg），使烯烴13-48（5.1 mmol，1 g，1當量）氫化（步驟2），產生中間體13-48（958 mg，77%）。使用THF/MeOH/1M LiOH（3.0/2.0/3.0 mL）進行13-49（5.1 mmol，412 mg）的酯水解（步驟3），產生羧酸中間體13-50（336 mg，95%）。通過使用在2 mL DCM中的EDCI（0.66 mmol，102 mg，2.0當量）、DIPEA（0.66 mmol，114 µL，2.0當量）、DMAP（0.33 mmol，41 mg，1.0當量），將中間體13-0（0.33 mmol，234 mg）用13-50（0.66 mmol，115 mg，2.0當量）醯化，產生77 mg（27%）純脂質8（通過LC-ELSD得到 ≥ 99%純度），並通過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質8 NMR譜，參見 圖 5H-1；關於脂質8 LC-MS，參見 圖 5H-2；關於產品質量，參見 表 4）。 方案 13. 脂質 8 的合成 脂質 9 的合成 [0532]如下文方案14中所提供地並且如下合成脂質9。通過使用在5 mL THF中的DMAP（3.55 g，1.0當量，32.0 mmol）和吡啶（5.0 ml），將起始材料癸-4-醇13-29（32.0 mmol，5.0 g，1.0當量）用琥珀酸13-30（6.3 g，2.0當量，63.0）醯化。將粗產物通過柱層析法純化（1次），以獲得4.26 g（81%）純酸中間體13-31。通過使用在50 mL DCM中的DIPEA（745 µL，4.26 mmol，2.5當量）、EDCI（820 mg，4.26 mmol，2.5當量）和DMAP（480 mg，0.43 mmol，0.25當量），將中間體13-0（2.1 mmol，1.5 g，1當量）用13-31（2.13 mmol，0.554 g，1.1當量）醯化。將粗產物通過柱層析法純化（3次），產生1.4 g（73%）純脂質9（通過LC-ELSD得到 ≥ 99%純度），並通過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質9 NMR譜，參見 圖 5I-1；關於脂質9 LC-MS，參見 圖 5I-2；關於產物質量，參見 表 4）。 方案 14. 脂質 9 的合成 脂質 10 及其 (S) 異構體的合成 [0533]如下文方案15-1中所提供地並且如下合成脂質10的 (S) 異構體。通過使用在2 mL THF和6 mL DCM中的DMAP（1.72 g，1.0當量，15.3 mmol）和吡啶（2.0 ml），將起始材料辛-3-醇13-46（2.0 g，1.0當量，15.3 mmol）用琥珀酸13-30（3.1 g，2.0當量，30.6 mmol）醯化。將粗產物通過柱層析法純化（1次），以獲得1.1 g（31%）純酸中間體13-47。通過使用在5 mL DCM中的EDCI（207 mg，3.0當量，1.80 mmol）、DIPEA（188 µL，3.0當量，1.8 mmol）和DMAP（15.0 mg，3.0當量，0.018 mmol），將中間體13-0（250 mg，1.0當量，0.36 mmol）用13-47（123 mg，1.5當量，0.53 mmol）醯化。將粗產物通過柱層析法純化（2次），產生261 mg（54%）純脂質10（通過LC-ELSD得到 ≥ 99%純度），並通過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質10 NMR譜，參見 圖 5J-1；關於脂質10 LC-MS，參見 圖 5J-2；關於產物質量，參見 表 4）。 方案 15-1. 脂質 10 (S) 異構體的合成 [0534]如下文方案15-2中所提供地，類似地合成作為外消旋混合物的脂質10。通過使用在2 mL THF和6 mL DCM中的DMAP（1.72 g，1.0當量，15.3 mmol）和吡啶（2.0 ml），將起始材料辛-3-醇13-46（2.0 g，1.0當量，15.3 mmol）用琥珀酸13-30（3.1 g，2.0當量，30.6 mmol）醯化，以獲得中間體13-47。將粗產物通過柱層析法純化（1次），以獲得1.1 g（31%）純酸中間體13-47。通過使用在5 mL DCM中的DIPEA（188 µL，3.0當量，1.8 mmol）、EDCI（207 mg，3.0當量，1.80 mmol）和DMAP（15.0 mg，3.0當量，0.018 mmol），將13-0（250 mg，1.0當量，0.36 mmol）用13-38（123 mg，1.5當量，0.53 mmol）醯化。將粗產物通過柱層析法純化（2次），產生261 mg（54%）純脂質10（通過LC-ELSD得到 ≥ 99%純度），並通過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質10 NMR譜，參見 圖 5J-1；關於脂質10 LC-MS，參見 圖 5J-2；關於產物質量，參見 表 4）。 方案 15-2. 脂質 10 的合成 使用相應的醯氯，通過中間體 13-0 的 N- 醯化合成脂質 11 脂質 11 及其 (S) 異構體的合成 [0535]如下文方案16-1中所提供地並且如下合成脂質5的 (S) 異構體。使用EDCI（5.4 g，1.5當量，27.8 mmol）、DIPEA（4.6 mL，1.5當量，27.8 mmol）和DMAP（463 mg，0.2當量，3.7 mmol），使用起始材料苯甲醇13-39'（18.5 mmol，2 g）來醯化化合物13-39（4.8 g，1.5當量，27.8 mmol），產生3.6 g（74%）經柱純化的中間體13-40（通過質譜法和質子NMR確認的產物）。使中間體13-40（684 mg，2.6 mmol，1當量）在乙酸中脫保護，以獲得中間體13-41（約600 mg，定量，並通過質譜法和質子NMR確認產物結構）。生成另外量的中間體13-41，並通過使用在20 mL DCM中的TBSCl（1.7 g，11.25 mmol，1.5當量）、TEA（5.3 mL，5.0當量，37.5 mmol）和DMAP（92 mg，0.75 mmol，0.1當量），對1.68 g、7.5 mmol的13-41在羥基處進行選擇性保護，產生受保護的中間體13-41a（約2.5 g，定量）（通過質譜法和質子NMR確認產物質量）。通過使用在11.0 mL DCM中的EDCI（2.76 g，14.2 mmol，3.0當量）、DIPEA（1.6 mL，2.0當量，9.52 mmol）和DMAP（580 mg，4.76 mmol，1.0當量），將中間體13-41a（1.61 g，4.76 mmol）用正己醇13-34（2.94 mL，23.8 mmol，5.0當量）酯化，以獲得13-41b（0.95 g，48%）。生成另外量的13-41b，並使用在30 mL THF中的HF-吡啶（5.8 mL，80.6 mmol，25當量）使總計1.36 g（3.2 mmol）脫保護，以獲得中間體13-41c（837 mg，84%）。將中間體13-41c（456 mg，1.48 mmol）用在4.0 mL吡啶（4.0 mL）中的正丁醯氯13-42（760 µL，7.4 mmol，5.0當量）醯化，產生化合物13-44（505 mg，90%）。使用在3.0 mL乙酸乙酯中的Pd/C（30 mg），使中間體13-44（505 mg，1.34 mmol）脫保護，產生化合物13-45（370 mg，96%）。使用在3 mL苯中的草醯氯（190 µg，3.4當量，2.2 mmol）和DMF（10 µL，催化量），將化合物13-45（188 mg，0.65 mmol）轉化為醯氯中間體。產物在TLC上僅顯示一個斑點（為甲酯），並且其不經進一步純化而用於中間體13-0的醯化（步驟9）。將中間體13-0（152 mg，0.22 mmol，1當量）用在5 mL苯中的粗醯氯13-45'（200 mg，3.0當量，0.65 mmol）、TEA（152 µL，5.0當量，1.1 mmol）、DMAP（10 mg）醯化，以獲得脂質11。將粗產物通過柱層析法純化，以產生77 mg（37%）純脂質11（通過LC-ELSD得到 ≥ 99%純度），並通過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質11 NMR譜，參見 圖 5K-1；關於脂質11 LC-MS，參見 圖 5K-2；關於產物質量，參見 表 4）。 方案 16. 脂質 11 (S) 異構體的合成 [0536]如下文方案16-2中所提供地，類似地合成作為外消旋混合物的脂質11。 方案 16-2. 脂質 11 的合成 脂質 12 的合成 [0537]如下文方案34中所提供地並且如下合成脂質12。在室溫下，在三氟乙酸酐（11.27 g，2.4當量，53.69 mmol）和苄醇（15 mL）中，對起始材料 14-3（3 g，1.0當量，22.37 mmol）進行選擇性保護，反應隔夜，產生中間體 14-4 。將粗產物通過柱層析法純化（1次），以獲得4.7 g（96%）純化的14-4。隨後在室溫下，通過使用在10 mL DCM中的EDCI（1.71 g，2當量，8.92 mmol）和DMAP（1.089 g，2當量，8.92 mmol），用正丁醇13-34（4.55 g，10.0當量，44.60 mmol）醯化14-4（1.0當量，4.44 mmol），反應隔夜，產生14-5。將粗產物通過柱層析法純化（1次），以獲得800 mg（58%）純化的14-5。在室溫下，通過使用在10 mL甲苯中的TEA（1.31 g，5當量，12.97 mmol）和DMAP（10 mg，催化量），將14-5（800 mg，1.0當量，2.59 mmol）的游離羥基用己醯氯（1.39 g，4.0當量，10.37 mmol）醯化，反應隔夜，產生中間體14-7。通過柱層析法純化（1次）粗產物，產生470 mg（46%）純化的14-7。中間體14-7（470 mg，1當量，3.4 mmol）產生340 mg（93%）游離酸14-8。在室溫下，使用在1 mL甲苯中的草醯氯（50 µL，3.4當量，0.60 mmol）和DMF（0.2 µL，催化量），將粗品14-8（56 mg，1當量，0.18 mmol）轉化為相應的氯化物14-8'，反應隔夜，以提供56 mg粗氯化物14-8'。通過使用在3 mL甲苯中的TEA（39.0 µL，5.0當量，0.29 mmol）和DMAP（10 mg，催化量），將13-0（42 mg，1當量，0.059 mmol）用14-8'（56.0 mg，3.0當量，0.17 mmol）進行N-醯化，產生脂質12。將粗產物通過柱層析法純化（1次），以獲得純脂質12（23 mg，39%）（通過LC-ELSD得到 ≥ 99%純度），並通過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質12 NMR譜，參見 圖 5L-1；關於脂質12 LC-ELSD層析圖，參見 圖 5L-2；關於產物質量，參見 表 4）。 方案 34. 脂質 12 的合成 使用相應羧酸的碳二亞胺活化，通過中間體 13-0 的 N- 醯化合成脂質 13 脂質 13 的合成 [0538]如下文方案17中所提供地並且如下合成脂質13。通過使用在20 mL DCM中的EDCI（4.8 g，2當量，25.0 mmol）、DIPEA（4.35 mL，2當量，25.0 mmol）和DMAP（280 mg，0.2當量，2.5 mmol），將起始材料13-32（4.8 g，2.0當量，25.0 mmol）用1-丁醇（1.13 mL，1當量，12.4 mmol）酯化，以獲得中間體13-33。將粗產物通過柱層析法純化，以獲得2.78 g（44%）純中間體13-33。通過使用在50 mL乙腈中的NaHCO 3（3.95 g，1.0當量，47.0 mmol），通過將正己醇（2 g，2.4當量，19.6 mmol）用2-溴乙醯溴13-35（5.05 g，1.3當量，25.0 mmol）醯化來獲得中間體13-36。將粗產物通過柱層析法純化（1次），以獲得4.32 g（97%）純中間體13-36。 方案 17. 脂質 13 的合成 [0539]通過使用在8 mL DMF中的NaH（200 mg，1.0當量，5.0 mmol）並與中間體13-36（1.1 g，1.0當量，5.0 mmol）進行置換反應，通過原位生成13-33（1.25 g，1.0當量，5.0 mmol）的親核負碳離子來獲得中間體13-37。將粗產物通過柱層析法純化（2次），以獲得1.15 g（58%）純中間體13-37。通過使中間體13-37（1.15 g，1.0當量，2.9 mmol）脫保護（230 mg Pd/C催化劑和在甲醇中的氫氣）來獲得游離酸中間體13-38。將粗產物通過柱層析法純化（4次），以獲得88 mg（9%）純中間體13-38。通過使用在2 mL DCM中的DIPEA（78 µL，3.0當量，0.45 mmol）、EDCI（87 mg，3.0當量，0.45 mmol）和DMAP（5 mg，0.3當量，0.04 mmol），將中間體13-0（105 mg，1.0當量，0.04 mmol）用13-38（2.13 mmol，0.554 g，1.1當量）醯化。將粗產物通過柱層析法純化（3次），產生41 mg（27%）純脂質13（通過LC-ELSD得到 ≥ 99%純度），並通過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質13 NMR譜，參見 圖 5M-1；關於脂質13 LC-MS，參見 圖 5M-2；關於產物質量，參見 表 4）。 使用相應的醯氯，通過中間體 13-11a 的 N- 醯化合成脂質 15 脂質 15 的合成 [0540]如下文方案18中所提供地並且如下合成脂質15。通過使用在5 mL THF和15 mL DCM中的DMAP（7.7 g，63 mmol，1當量）和吡啶（5.0 ml），將起始材料癸-4-醇13-29（10.0 g，63.0 mmol）用琥珀酸13-30（12.6 g，126 mmol，2.0當量）醯化，以獲得中間體13-31。將粗產物通過柱層析法純化（3次），以獲得8.9 g（55%）純酸中間體13-31。使用在5 mL苯中的草醯氯（1.43 mL，3.4當量，16.66 mmol）和DMF（50 µL，催化量），將中間體13-31（1.26 g，4.9 mmol）轉化為醯氯中間體13-31’。產物在TLC上僅顯示一個斑點（為甲酯），並且其不經進一步純化而用於中間體13-11b的醯化（步驟3）。將中間體13-11b（275 mg，0.39 mmol）用在10 mL苯中的粗醯氯13-31'（324 mg，3.0當量，1.17 mmol）、TEA（270 µL，5.0當量，1.95 mmol）、DMAP（20 mg，催化量）醯化，以獲得脂質15。將粗產物通過柱層析法純化（2次），以產生230 mg（64%）純脂質15（通過LC-ELSD得到 ≥ 99%純度），並通過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質15 NMR譜，參見 圖 5N-1；關於脂質15 LC-MS，參見 圖 5N-2；關於產物質量，參見 表 4）。 方案 18. 脂質 15 的合成 脂質 16 的合成 [0541]如下文方案19中所提供地並且如下合成脂質16。通過使用在5 mL THF和15 mL DCM中的DMAP（23.04 mmol，2.8 g，1.0當量）和吡啶（5.0 ml），將起始材料辛-3-醇13-48 rac（3 g，23 mmol）用琥珀酸13-30（46.08 mmol，4.61 g，2.0當量）醯化，以獲得中間體13-31。將粗產物通過柱層析法純化（1次），以獲得3.4 g（64%）純酸中間體13-47 rac。使用草醯氯（0.38 mL，4.4 mmol，3.4當量）和DMF（2 µL，催化量），將中間體13-47 rac（300 mg，0.42 mmol）轉化為醯氯中間體13-47' rac。產物在TLC上僅顯示一個斑點（為甲酯），並且其不經進一步純化而用於中間體13-11b的醯化（步驟3）。將中間體13-11b（270 mg，0.38 mmol）用在5 mL甲苯中的粗醯氯13-47’ rac（0.42 mmol，300 mg，3.0當量）、TEA（260 µL，5.0當量，1.9 mmol）、DMAP（20 mg，催化量）醯化，以獲得脂質16。將粗產物通過柱層析法純化（1次），以產生165 mg（47%）純脂質16（通過LC-ELSD得到99%純度），並通過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質16 NMR譜，參見 圖 5O-1；關於脂質16 LC-MS，參見 圖 5O-2；關於產物質量，參見 表 4）。 方案 19. 脂質 16 的合成 脂質 17 的合成 [0542]如下文方案20中所提供地合成脂質17。在室溫下，通過使用在50 mL DCM/DMF（1 : 1 v/v）（50 mL）中的EDCI（3.29 g，1.2當量，17.2 mmol）、DMAP（160 mg，0.12當量，1.72 mmol）和TEA（9.96 mL，5.0當量，71.5 mmol），將辛二酸13-51（5.0 g，2.0當量，28.5 mmol）用癸-3-醇13-29（2.75 mL，1.0當量，14.3 mmol）單醯化，反應隔夜，以獲得游離酸13-53。將粗產物通過柱層析法純化（1次），以獲得1.06 g（28%）純化的13-53。在室溫下，通過使用在15 mL DCM中的EDCI（816 mg，2.5當量，4.25 mmol）、DMAP（50 mg，0.25當量，0.43 mmol）和DIPEA（740 µL，2.5當量，4.3 mmol），使酸13-53（1.06 g，2當量，3.7 mmol）與二羥基丙酮（152 mg，1.0當量，1.7 mmol）反應，反應隔夜，以獲得酮13-54。將粗產物通過柱層析法純化（1次），以獲得890 mg（69%）純化的13-54。在室溫下，通過使用在20 mL DCM（20 ml）中的乙酸（150 µL，2.0當量，2.6 mmol）和三乙醯氧基硼氫化鈉Na(OAc) 3BH（331 mg，1.2當量，1.5 mmol），將13-54（890 mg，1.0當量，1.3 mmol）用胺15-3（327 µl，2.0當量，2.6 mmol）進行還原胺化3小時，產生中間體13-55。將粗產物通過柱層析純化（1次），以獲得純化的13-55（470 mg，47%）。使用酸13-31對中間體13-55進行N-醯化，並報導了用於脂質15的合成的N-醯化反應條件，產生脂質17。 方案 20. 脂質 17 的合成 脂質 18 及其異構體的合成 [0543]如下文方案21-1中所提供地合成脂質18的異構體。使用與針對脂質17所報導的方法類似的方法，通過在步驟1中用辛-2-醇代替癸-3-醇，來合成脂質18。 方案 21-1. 脂質 18 異構體的合成 [0544]如下文方案21-2中所提供地合成作為外消旋混合物的脂質18。 方案 21-2. 脂質 18 的合成 脂質 19 的合成 [0545]如下文方案22中所提供地並且如下合成脂質19。通過使用在10 mL DCM中的EDCI（2.24 g，2.5當量，11.71 mmol）、DIPEA（2.0 mL，2.5當量，11.71 mmol）和DMAP（115 mg，0.2當量，0.94 mmol），將起始材料二羥基丙酮（422 mg，4.7 mmol）用化合物13-56（3.0 g，2.5當量，11.71 mmol）醯化，產生2.1 g（79%）中間體13-57。通過使用在10.0 mL DCM中的乙酸（430 µL，2.0當量，7.4 mmol）、Na(OAc)3BH（923 mg，1.2當量，4.44 mmol），將13-57（2.1 g，1.0當量，3.7 mmol）用胺15-3（925 µL，2.0當量，7.4 mmol）進行還原胺化，產生1.55 g（65%）中間體13-58。如前文脂質9和脂質15的合成中所述地產生中間體13-31。在室溫下，通過使用在4.0 mL DCM中的EDCI（291 mg，2.0當量，1.48 mmol）、DIPEA（247 µL，2.0當量，1.48 mmol）和DMAP（45 mg，0.5當量，0.37 mmol），將中間體13-58（484 mg，1.0當量，0.74 mmol）用13-31（380 mg，2.0當量，1.48 mmol）進行N-醯化，反應隔夜，產生423 mg（63%）純脂質19（ ＞ 99%純度）。 [0546]關於脂質19 NMR譜，參見 圖 5P-1；關於脂質19反相LC-ELSD層析圖，參見 圖 5P-2；關於產物質量，參見 表 4。 方案 22. 脂質 19 的合成 脂質 20 的合成 [0547]如下文方案23中所提供地並且如下合成脂質20。使用硼烷-二甲基硫醚（6.2 mL，7.0當量，67.0 mmol），將單保護的琥珀酸13-59（2.0 g，1.0當量，9.65 mmol）還原為相應的醇，在0ºC-5ºC反應1小時，隨後在室溫反應隔夜。將粗產物通過柱層析法純化（2次），產生1.3 g（71%）純化合物13-60。在室溫下，通過使用在10.0 mL DCM中的EDCI（1.63 g，1.7當量，8.5 mmol）、DIPEA（1.48 mL，1.7當量，8.5 mmol）和DMAP（98 mg，0.17當量，0.85 mmol），使用中間體13-60（1.3 g，1.3當量，6.7 mmol）來醯化酸13-56（1.51 mL，1.0當量，5.0 mmol），反應隔夜。將粗產物通過柱層析法純化（1次），產生1.88 g（65%）純中間體13-61。隨後通過在甲醇中經Pd/C/氫氣（400 mg）氫化而進行脫保護，產生1.42 g游離酸13-62（99%）粗產物。在室溫下，通過使用在10.0 mL DCM中的EDCI（958 mg，2.6當量，5.0 mmol）、DIPEA（870 µL，2.6當量，5.0 mmol）和DMAP（56 mg，0.26當量，0.5 mmol），使用粗品13-62（1.32 g，2.2當量，4.2 mmol）來醯化二羥基丙酮13-10（172 mg，1.0當量，1.9 mmol），反應隔夜，以獲得酮13-63。將粗產物通過柱層析法純化，以獲得120 mg（3.8%）純13-63。在室溫下，通過使用在3 mL DCM中的乙酸（18 µL，2.0當量，7.8 mmol）和Na(OAc) 3BH（41 mg，1.2當量，0.19 mmol），將13-63（120 mg，1.0當量，0.16 mmol）用胺15-3（42 µl，2.0當量，0.32 mmol）進行還原胺化3小時，產生中間體13-64。將粗產物通過柱層析法純化（1次），以獲得23 mg（17%）純化的中間體13-64。在室溫下，通過使用在1.5 mL DCM中的EDCI（6.4 mg，1.2當量，0.034 mmol）、DIPEA（5.8 µL，1.2當量，0.034 mmol）和DMAP（1 mg，催化劑），將13-64（23 mg，1.0當量，0.028 mmol）用酸13-31（8.7 mg，1.2當量，0.034 mmol）進行N-醯化，反應隔夜，產生脂質20。將粗產物通過柱層析法純化（1次），以獲得21 mg（70%）純脂質20（99%）。 [0548]關於脂質20 NMR譜，參見 圖 5Q-1；關於脂質20反相LC-ELSD層析圖，參見 圖 5Q-2；關於產物質量，參見 表 4。 方案 23. 脂質 20 的合成 脂質 21 及其異構體的合成 [0549]如下文方案24-1中所提供地合成脂質21的異構體。簡而言之，通過使用二乙基鋅對醛13-77進行親核加成來獲得醇13-78（步驟1），隨後將其用於環酐13-52的開環加成中以獲得中間體13-79。使用脂質17的合成中所述的條件，將二羥基丙酮用中間體13-79進行O-醯化，產生酮13-80。使用脂質17的合成中所述的條件，將13-80用胺15-3進行還原胺化，產生中間體13-81。隨後使用類似於脂質9的合成所用的條件，將中間體13-81用酸13-31進行N-醯化，提供了脂質21。 方案 24-1. 脂質 21 異構體的合成 [0550]如下文方案24-2中所提供地合成作為外消旋混合物的脂質21。簡而言之，使用類似於針對脂質21異構體所述的方法來獲得脂質21（外消旋體），除了在步驟1中使用乙基鋰來獲得外消旋醇。 方案 24-2. 脂質 21 的合成 脂質 22 及其異構體的合成 [0551]如下文方案25-1中所提供地合成脂質22的異構體。簡而言之，將醇13-78（如上文針對脂質21的合成所述地那樣獲得）用於環酐13-73’的開環加成，以獲得中間體13-82。使用脂質17的合成中所述的條件，將二羥基丙酮用中間體13-82進行O-醯化，產生酮13-83。使用脂質17的合成中所述的條件，將13-83用胺15-3進行還原胺化，產生中間體13-84。隨後使用類似於脂質9的合成所用的條件，將中間體13-84用酸13-31進行N-醯化，提供了脂質22異構體。 方案 25-1. 脂質 22 異構體的合成 [0552]如下文方案25-2中所提供地合成作為外消旋混合物的脂質22。通過用外消旋醇13-78 rac代替醇異構體13-78，使用上文針對脂質22異構體所述的方法獲得脂質22。 方案 25-2. 脂質 22 的合成 脂質 23 的合成 [0553]如下文方案26中所提供地合成脂質23。簡而言之，使用脂質9的合成中所述的條件，將二羥基丙酮用酸13-31進行O-醯化，產生酮13-70。使用脂質9的合成中所述的條件，將13-70用胺15-3進行還原胺化，產生中間體13-71。隨後使用類似於脂質9的合成所用的條件，將中間體13-71用酸13-31進行N-醯化，提供了脂質23。 方案 26. 脂質 23 的合成 脂質 24 的合成 [0554]如下文方案27中所提供地合成脂質24。簡而言之，通過將單保護的二酸13-72用醇13-29進行O-醯化來獲得酸13-34，隨後使中間體13-73脫保護以產生酸13-74。使用脂質17的合成中所述的條件，將二羥基丙酮用中間體13-74進行O-醯化，產生酮13-75。使用脂質17的合成中所述的條件，將13-75用胺15-3進行還原胺化，產生中間體13-76。隨後使用類似於脂質9的合成所用的條件，將中間體13-76用酸13-31進行N-醯化，提供了脂質24。 方案 27. 脂質 24 的合成 脂質 25 的合成 [0555]如下文方案28中所提供地合成脂質25。簡而言之，進行醇13-29預環酐13-52’的開環加成，產生酸中間體13-85。使用脂質17的合成中所述的條件，將二羥基丙酮用中間體13-85進行O-醯化，產生酮13-86。使用脂質17的合成中所述的條件，將13-86用胺15-3進行還原胺化，產生中間體13-87。隨後使用類似於脂質9的合成所用的條件，將中間體13-87用酸13-31進行N-醯化，提供了脂質25。 方案 28. 脂質 25 的合成 脂質 31 的合成 [0556]如下文方案29中所提供地並且如下合成脂質31。通過使用在150 mL DCM中的吡啶（80 mmol，10.1 ml，1.2當量），將起始材料15-1（68 mmol，10 g，1當量）用對甲苯磺醯氯（70 mmol，13.3 g，1.03當量）處理，以獲得受保護的中間體15-2。將粗產物在乙酸乙酯和己烷中重結晶，產生20.4 g（99%）純中間體15.2。通過使15-2（16.5 mmol，5 g，1.2當量）和二胺15-3（33 mmol，3.35 g，2當量）在40 mL二㗁烷中在回流條件下反應來獲得中間體15-4。將粗產物通過柱層析法純化，以獲得3.5 g（91%）純中間體15-4。通過使用在10 mL DCM中的EDCI（0.67 mmol，128 mg，2.5當量）、DIEA（0.67 mmol，86 mg，2.5當量）和DMAP（3 mg），使用壬酸13-12（0.67 mmol，106 mg，2.5當量）將15-4（108 mg，0.268 mmol）進行N-醯化，產生胺15-5。將粗產物通過柱層析法純化，以獲得113 mg（65%）純化的二胺15-5。通過在室溫下使15-5（113 mg）在4 mL的1M HCl和THF（1:3 v/v）中脫保護8小時，來獲得定量產率（102 mg）的二醇中間體15-6。通過使用EDCI（0.9 mmol，172 mg，3當量）、DIPEA（0.9 mmol，116 mg）和DMAP（10 mg，催化量），將中間體15-6（0.3 mmol，100 mg，1當量）用亞油酸1-5（0.9 mmol，250 mg，3當量）醯化，以獲得脂質31。將粗產物通過柱層析法純化，產生120 mg（46%）純脂質31（通過LC-ELSD得到 ＞ 99%純度），並通過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質31 NMR譜，參見 圖 5R-1；關於脂質31 LC-MS，參見 圖 5R-2；關於產物質量，參見 表 4）。 方案 29. 脂質 31 的合成 脂質 32 的合成 [0557]如下文方案30中所提供地並且如下合成脂質32。如上文（步驟1和2，方案30）針對脂質31所述地產生中間體15-4。通過使用在100 mL DCM中的EDCI（10.85 mmol，2.07 g，2.5當量）、DIEA（10.85 mmol，1.40 g，2.5當量）和DMAP（10 mg），使用2-乙基庚酸13-13（10.85 mmol，1.71 g，2.5當量）將15-4（4.34 mmol，1 g，1.0當量）進行N-醯化，產生胺15-7。將粗產物通過柱層析法純化，以獲得724 mg（52%）純化的二胺15-7。通過在室溫下使15-7（714 mg）在3 mL的1M HCl和7 mL THF中脫保護1小時，來獲得定量產率的二醇中間體15-8。通過使用EDCI（6.49 mmol，1.23 g，3.4當量）、DIPEA（6.49 mmol，830 mg，3.4當量）和DMAP（20 mg，催化量），將中間體15-8（1.9 mmol，630 mg，1當量）用亞油酸1-5（6.49 mmol，1.82 g，3.4當量）醯化，以獲得脂質32。將粗產物通過柱層析法純化（4次），產生27 mg純級分脂質32（通過LC-ELSD得到 ＞ 98%純度），並通過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質32 NMR譜，參見 圖 5S-1；關於脂質32 LC-MS，參見 圖 5S-2；關於產物質量，參見 表 4）。 方案 30. 脂質 32 的合成 [0558]如下文方案31中所提供地並且如下合成脂質33。通過使用在200 mL DCM中的TEA（19.01 mL，4當量，137 mmol）和DMAP（30 mg），使用對甲苯磺醯氯TsCl（6.52 g，1當量，34.3 mmol）將起始材料15-1（34.3 mmol，5 g，1當量）進行甲苯磺酸化。將粗產物通過柱層析法純化（1次），以獲得10.2 g（98%）反應性中間體15-2。將15-2（10.0 mmol，2.3 g，1當量）與二胺15-9（9.24 mmol，1.0 mL，1.2當量）在10 mL二㗁烷（10 mL）中進行親核置換，產生1.6 g（97%）化合物15-10。使用另外的15-2（8.3 mmol，2.5 g，1當量）和二胺15-9（9.9 mmol，1.1 mL，1.2當量）在50 mL二㗁烷中重複親核置換反應，以獲得另外量的化合物15-10。將來自這兩個反應的粗產物通過柱層析法純化，以獲得總共1.7 g（約50%）純15-10。使用在8 mL DCM中的EDCI（1.4 g，1.8當量，7.1 mmol）、DIPEA（1.3 mL，1.8當量，7.1 mmol）和DMAP（90 mg，0.2當量，0.81 mmol），將15-10（4.05 mmol，875 mg，1當量）用壬酸13-12（7.1 mmol，1.24 mL，1.8當量）進行N-醯化，產生中間體15-11。將粗產物通過柱層析法純化（2次），以獲得230 mg（16%）純中間體15-11。使15-11（0.64 mmol，230 mg，1當量）在5 mL的於二㗁烷中的4M HCl中脫保護，產生中間體15-12。將粗產物通過柱層析法純化（1次），以獲得74 mg（37%）純中間體15-12。通過使用在5 mL DCM中的EDCI（120 mg，2.5當量，0.58 mmol）、DIPEA（102 µL，2.5當量，0.58 mmol）和DMAP（6 mg，0.2當量，0.048 mmol），將中間體15-12（0.24 mmol，74 mg，1當量）用亞油酸1-5（169 mg，2.5當量，0.58 mmol）醯化，以獲得脂質33。將粗產物通過柱層析法純化（2次），以產生64 mg（32%）純脂質33（通過LC-ELSD得到 ＞ 99%純度），並通過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質33 NMR譜，參見 圖 5T-1；關於脂質33 LC-MS，參見 圖 5T-2；關於產物質量，參見 表 4）。 方案 31. 脂質 33 的合成 脂質 34 的合成 [0559]如下文方案32中所提供地並且如下合成脂質34。如針對脂質33所述地獲得中間體15-2。將15-2（3.3 mmol，1 g，1當量）與二胺15-13（3.9 mmol，0.46 mL，1.2當量）在6 mL二㗁烷（10 mL）中進行親核置換，產生520 mg（64%）化合物15-14。重複反應以獲得另外400 mg純化合物15-14。使用在10 mL DCM中的EDCI（5.3 mmol，1.06 g，2.0當量）、DIPEA（923 µL，2.0當量，5.3 mmol）和DMAP（58 mg，0.2當量，0.05 mmol），將15-14（2.6 mmol，620 mg，1當量）用壬酸13-12（5.3 mmol，915 µL，2.0當量）進行N-醯化，產生中間體15-15。將粗產物通過柱層析法純化（2次），以獲得355 mg（35%）純中間體15-15。使15-15（1.03 mmol，355 mg，1當量）在7 mL的於二㗁烷中的4M HCl中脫保護，產生中間體15-16。將粗產物通過柱層析法純化（2次），以獲得40 mg（13%）純中間體15-16。通過使用在10 mL DCM中的EDCI（55 mg，2.5當量，0.29 mmol）、DIPEA（3.2 µL，2.5當量，0.29 mmol）和DMAP（2 mg，0.2當量，0.05 mmol），將中間體15-16（0.116 mmol，40 mg，1當量）用亞油酸1-5（81 mg，2.5當量，0.29 mmol）醯化，以獲得脂質34。將粗產物通過柱層析法純化（2次），以產生73 mg（73%）純脂質34（通過LC-ELSD得到 ＞ 99%純度），並通過質子NMR和質譜法進行表徵（關於脂質34 NMR譜，參見 圖 5U-1；關於脂質34 LC-MS，參見 圖 5U-2；關於產物質量，參見 表 4）。 方案 32. 脂質 34 的合成 脂質 35 的合成 [0560]如下文方案35中所提供地合成脂質35。 方案 33. 脂質 35 的合成 脂質 36 的合成 [0561]如下文方案36中所提供地合成脂質36。 方案 36. 脂質 36 的合成 實例 2 ：使用示例性可電離脂質通過微流體混合製備 LNP [0562]使用實例1中合成的陽離子脂質9和陽離子脂質15來產生示例性LNP。 [0563]通過使用線上微流體混合方法將mRNA水溶液和乙醇脂質共混物溶液（含有脂質比率如 表 5所示的可電離脂質、DSPC、DPG-PEG和膽固醇）混合來製備包封mRNA有效載荷的LNP。將mRNA（編碼eGFP的mRNA，TriLink Biotechnologies，美國加利福尼亞州）儲備溶液在pH 4乙酸鹽緩衝液中在21.7 mM pH 4乙酸鹽緩衝液中稀釋（產生133 µg/mL mRNA溶液）。將脂質組分以下 表 5中所示的相對比率溶解在無水乙醇中。 表 5. LNP 中脂質組分的比率。
脂質 來源 脂質與 mRNA 的比率（ nmol 脂質 /100 µg mRNA ） 在脂質溶液中的濃度（ mM ） 理論 LNP 脂質組成（ mol% ）
可電離陽離子脂質 - 1,500 6 49.2
膽固醇 Dishman，荷蘭 1,200 4.8 39.4
DSPC Avanti Polar Lipids，美國阿拉巴馬州 300 1.2 9.8
DPG-PEG(2000) NOF America，美國紐約 46 0.18 1.5
DiIC18(5)-DS Invitrogen，美國麻塞諸塞州 1.8 0.007 0.06
[0564]使用來自Precision Nanosystems Inc.（加拿大不列顛哥倫比亞省）的NanoAssemblr Ignite微流體混合裝置（產品型號NIN0001）和NxGen混合柱體（產品型號NIN0002）混合mRNA和脂質溶液。簡而言之，將mRNA和脂質溶液各自載入到單獨的聚丙烯注射器中。將混合柱體插入NanoAssemblr Ignite中，並且將注射器定向安裝到混合柱體的魯爾端口上。然後使用NanoAssemblr Ignite以9 mL/min的總流速以3 : 1 v/v比的mRNA溶液與脂質溶液混合這兩種溶液。將所得的懸浮液保持在室溫至少5分鐘，然後進行乙醇去除和緩衝液交換。 [0565]在混合後，使用不連續滲濾方法對所得的LNP懸浮液進行乙醇去除和緩衝液交換。將具有100,000 kDa MWCO再生纖維素膜的離心超濾裝置（Amicon Ultra-15，MilliporeSigma，美國麻塞諸塞州）用70%乙醇溶液消毒，然後用HBS交換緩衝液（具有150 mM NaCl的25 mM pH 7.4 HEPES緩衝液）洗滌兩次。然後將LNP懸浮液載入到裝置中並以500 RCF離心，直到體積減少一半。然後將懸浮液用交換緩衝液（25 mM pH 7.4 HEPES緩衝液）稀釋，使懸浮液恢復到原來的體積。將這種兩倍濃縮和兩倍稀釋的方法再重複五次，總共進行六個不連續滲濾步驟。然後通過用MBS稀釋十倍並以500 RCF離心直至體積減少十分之一，將LNP懸浮液交換到MBS（具有150 mL NaCl的25 mM pH 6.5 MES緩衝液）中。將用MBS稀釋十倍和濃縮十倍的步驟再重複一次。從離心超濾裝置中回收在MBS中的含有LNP的滲餘物，並且將其在4ºC儲存直到進一步使用。 實例 3 ： LNP 的表徵 [0566]本實例描述了根據實例2中所述的方法產生的LNP（例如，包含可電離陽離子脂質的LNP，其中所述可電離陽離子脂質是KC3或脂質15）的表徵。 [0567]表徵了實例2中產生的LNP樣品，以確定平均流體動力學直徑、ζ電位和mRNA含量（總mRNA和染料可及mRNA）。使用Zetasizer型號ZEN3600（Malvern Pananalytical，英國）通過動態光散射（DLS）確定流體動力學直徑。使用Zetasizer通過鐳射多普勒電泳在5 mM pH 5.5 MES緩衝液和5 mM pH 7.4 HEPES緩衝液中測量ζ電位。 [0568]使用Thermo Fisher Quant-iT RiboGreen RNA測定套組測量奈米粒子的RNA含量。通過以下方式來測量染料可及RNA（其包括未包封的RNA和可到達LNP表面的RNA兩者）：使用HEPES緩衝鹽水將奈米粒子稀釋至大約1 µg/mL mRNA，然後將Quant-iT試劑添加到混合物中。通過以下方式來測量總RNA含量：通過在HEPES緩衝鹽水中的0.5%曲通溶液中稀釋所述儲備LNP批次（通常為 ≥ 40 ug/mL RNA）來破壞奈米粒子懸浮液，以獲得1 ug/mL RNA溶液（基於配製品輸入值的最終標稱濃度），隨後在60ºC加熱30分鐘，然後添加Quant-It試劑。通過測量485/535 nm處的螢光來量化RNA，並且相對於同時運行的RNA標準曲線確定濃度。 實例 4. 能夠靶向造血幹細胞（ HSC ）的接合物的製備 [0569]本實例描述了一種用於產生脂質-HSC靶向基團接合物的方法，所述接合物用於摻入HSC靶向LNP（例如，包含可電離陽離子脂質的LNP，其中所述可電離陽離子脂質是KC3或脂質15）中。 [0570]經由馬來醯亞胺基團與重鏈（HC）中的C末端半胱胺酸之間的共價接合，將結合HSC特有靶標（CD117、CD105和CD34）的Fab和全長抗體與DSPE-PEG(2k)-馬來醯亞胺接合。在緩衝液交換到無氧pH 7磷酸鹽緩衝液中後，將蛋白質（3-4 mg/mL）在無氧pH 7磷酸鹽緩衝液中的0.2 mM TCEP中在室溫下還原1.5小時。使用40 kDa SEC柱分離還原的蛋白質以去除TCEP，並且緩衝液交換到新鮮的無氧pH 7磷酸鹽緩衝液中。 [0571]通過添加在無氧pH 5.7檸檬酸鹽緩衝液（1 mM檸檬酸鹽）中的DSPE-PEG-馬來醯亞胺（Avanti Polar Lipids，美國阿拉巴馬州）和30 mg/mL DSPE-PEG-OCH 3（vanti Polar Lipids，美國阿拉巴馬州）的10 mg/mL膠束懸浮液（根據蛋白質，使用1 : 1至1 : 3的重量比）來啟動接合反應。使用10 kDa再生纖維素膜將蛋白質溶液濃縮至3-4 mg/mL，隨後使用40 kDa尺寸排阻柱進行緩衝液交換到無氧pH 7磷酸鹽緩衝液中。在37ºC使用2-4 mg/mL蛋白質和3.5莫耳過量的馬來醯亞胺進行接合反應持續2小時，然後在室溫下再培育2-16小時。 [0572]通過HPLC監測所得的接合物的產生，並且將反應在1.5 mM半胱胺酸中淬滅。使用pH 7.4 HEPES緩衝鹽水（25 mM HEPES、150 mM NaCl）緩衝液、使用100 kDa Millipore再生纖維素膜過濾分離所得的接合物（DSPE-PEG(2k)-抗hSP34 Fab），並且在使用前在4ºC儲存。在淬滅後，最終的膠束組合物由DSPE-PEG-Fab、DSPE-PEG-馬來醯亞胺（以半胱胺酸終止）和DSPE-PEG-OCH 3的混合物組成。這三種組分的比率是DSPE-PEG-Fab : DSPE-PEG-馬來醯亞胺（以半胱胺酸終止） : DSPE-PEG-OCH 3= 1 : 2.45 : 3.45-10.35（按莫耳計）。 實例 5 ：含有 HSC 靶向基團的 LNP 的製備 [0573]本實例描述了用於將HSC靶向基團脂質接合物摻入預先形成的LNP（例如，包含可電離陽離子脂質的LNP，其中所述可電離陽離子脂質是KC3或脂質15）中的示例性方法。 [0574]將來自實例2的LNP和使用實例4中所述的方法製備的HSC靶向基團接合物在Eppendorf管中合併。將管以2,500 rpm渦旋10秒。將Eppendorf管在60ºC以300 rpm置於ThermoMixer中，持續1小時。隨後將所得的靶向性LNP懸浮液儲存在4ºC直至使用，或者可替代地在通過使用適當體積的50 wt.%蔗糖儲備溶液（在HEPES緩衝鹽水中；25 mM HEPES、150 mM NaCl）進行稀釋而重構成最終蔗糖濃度為9.6 wt.%的蔗糖培養基之後，冷凍儲存並在-80ºC冷凍儲存。 實例 6 ：使用示例性可電離脂質，通過微流體線上混合和切向流過濾製備 LNP [0575]本實例描述了使用可縮放單元操作（即線上微流體混合，然後是切向流過濾（TFF）用於乙醇去除和緩衝液交換）製備LNP（例如，包含可電離陽離子脂質的LNP，其中所述可電離陽離子脂質是KC3或脂質15）。 [0576]使用實例2中的混合方法，產生LNP混合物，總計12 mL，RNA的濃度為300 µg/mL。隨後使用切向流過濾（TFF）進行乙醇去除和緩衝液交換。 [0577]在混合後，使用中空纖維TFF模組（Repligen，US P/N C02-E300-05-N）對所得的LNP懸浮液進行乙醇去除和緩衝液交換。簡而言之，在使用前，將TFF模組用DI水沖洗並抽乾。然後將LNP添加到儲庫中，並且使用交換緩衝液（具有150 mM NaCl的25 mM pH 7.4 HEPES緩衝液）作為滲濾緩衝液。使TFF模組啟動，然後通過以下方式來啟動滲濾（DV）：將蠕動泵斜升至目標流速，並且調整滲餘物閥直到達到目標跨膜壓（TMP）。一旦滲濾已啟動，系統的目標指令引數為35 mL/min的流速和3.5 psi的TMP。在整個滲濾過程中，通過調整滲餘物閥使TMP保持恒定。監測滲透物流速，並且其不隨時間顯著降低。進行六次滲濾，在每次滲濾結束時將樣品放在一邊，以便稍後跟蹤緩衝液交換過程。最終乙醇含量 ＜ 0.1%，如通過對DV樣品進行折射率測量所測量的，並且pH測量確認了緩衝液交換到交換緩衝液中。在完成六次滲濾後，使泵停止，隨後對所得的LNP懸浮液進行濃縮。 [0578]使用在緩衝液交換過程期間使用的相同TFF模組進行LNP懸浮液的濃縮。維持緩衝液交換過程期間的TMP和流速（使泵斜升後），並且通過停止向滲余物儲器中添加滲濾緩衝液來使懸浮液濃縮。收集所得的LNP懸浮液並用0.2 µm注射器過濾器過濾。出於分析目的對懸浮液進行取樣，然後將其在4ºC儲存直到進一步使用。 [0579]使用實例3中的LNP表徵方法，表徵LNP批次以確定平均流體動力學直徑和mRNA含量（總的和染料可及的）。微流體混合方法與通過TFF進行的乙醇去除和緩衝液交換得到表現出窄的多分散性和良好的mRNA包封（＜ 20%的染料可及RNA）的低於100 nm的粒子。 實例 7 ：使用甲苯胺基 - 萘磺酸鹽（ TNS ）螢光探針測定 LNP 表觀 pKa 的方法 [0580]本實例描述了用於測量脂質奈米粒子（例如，包含可電離陽離子脂質的LNP，其中所述可電離陽離子脂質是KC3或脂質15）的表觀pK a的基於螢光染料的方法。表觀pK a決定了在生理pH條件下的奈米粒子表面電荷，通常在內體pH範圍（6-7.4）內的pKa值導致LNP在血漿或細胞外空間（pH 7.4）呈中性或微帶電，並且在酸性內體環境下變為強陽性。這種正表面電荷驅動LNP表面與帶負電荷的內體膜的融合，導致內體區室失穩和破裂並且LNP逃逸到胞質區室中，這是經由細胞核糖體機器的接合進行胞質遞送mRNA和蛋白質表現的關鍵步驟。 [0581]通過在覆蓋一定範圍的pH值（pH 4 - pH 10）的水性緩衝液中進行6-(對甲苯胺基)-2-萘磺酸（TNS）螢光測量來測定LNP的表觀pK a。TNS染料當在溶液中游離時不發螢光，但是在與帶正電荷的脂質奈米粒子締合時會發出強烈的螢光。在低於奈米粒子的pK a的pH值下，正LNP表面電荷導致染料在粒子介面處募集，產生TNS螢光。在高於LNP pK a的pH值下，LNP表面電荷被中和，並且TNS染料與粒子介面解離，導致螢光信號損失。LNP的表觀pK a被報告為螢光達到其最大值的50%時的pH，如使用四點邏輯曲線擬合所確定的。 實例 8 ：包封 mRNA 的基於脂質 1-8 、 9-15 和 31-34 的 LNP 的通用配製品和物理化學表徵方法 [0582]通過以下方式配製帶有核酸的脂質奈米粒子（LNP）（例如，包含可電離陽離子脂質的LNP，其中所述可電離陽離子脂質是KC3或脂質15）：使用以上實例2和6中所述的脂質和溶劑成分進行微流體混合方法，並使用離心超濾膜過濾裝置或切向流過濾（TFF）方法將緩衝液交換到pH 7.4 HEPES緩衝鹽水中（導致乙醇去除和pH調節）；並通過動態光散射（DLS）表徵流體動力學大小（直徑，nm）、多分散性（PDI）以及在pH 5.5和pH 7.4下的電荷（ζ電位，mV）。使用實例3中所述的方法測定mRNA包封效率（染料可及RNA的百分比）和總mRNA含量（LNP懸浮液中的ug/mL RNA）。隨後將配製的LNP進行緩衝液交換到pH 6.5 MES緩衝鹽水中，並且在與所需量的靶向抗體接合物（參見實例5）混合之前，通過DLS重新表徵大小分佈並在37ºC培育4小時以促進抗體插入（使用實例5中所述的方法），產生最終的抗體靶向性LNP。對獲得的靶向性LNP進行無菌過濾並使用實例3中所述的方法通過DLS進行表徵（大小（nm）和PDI）。 實例 9 ：使用示例性可電離脂質通過渦旋混合製備 LNP [0583]本實例提供了使用示例性可電離陽離子脂質（例如，在實例1中合成的那些或可商購的陽離子脂質，如KC3或脂質15）產生LNP的另外示例性方法。 [0584]通過渦旋混合水性mRNA溶液和乙醇脂質溶液產生了具有包封的mRNA有效載荷和脂質共混物的LNP。將mRNA（編碼eGFP的mRNA和用Cy5標記的eGFP mRNA的9 : 1 w/w混合物，TriLink Biotechnologies，美國加利福尼亞州）與pH 4乙酸鹽緩衝液混合，以提供含有133 µg/mL mRNA和21.7 mM乙酸鹽緩衝液的最終水性mRNA溶液。將脂質組分以相對比率溶解在無水乙醇中。 [0585]簡而言之，將mRNA溶液（375 µL）轉移到錐形底離心管中，並且將脂質溶液（125 µL）快速添加到含有mRNA溶液的管（mRNA溶液與脂質溶液的v/v比為3 : 1）中。立即將含有混合物的管加蓋並在2,500 rpm下渦旋15 s，然後在室溫下培育不少於5 min，然後進行乙醇去除和緩衝液交換。 [0586]在混合後，使用Sephadex G-25樹脂填充的SEC柱（PD MiniTrap G-25，Cytiva，美國麻塞諸塞州）通過重力流對所得的LNP懸浮液進行乙醇去除和緩衝液交換。簡而言之，將SEC柱用2.5 mL的交換緩衝液（具有150 mM NaCl的25 mM pH 7.4 HEPES緩衝液）沖洗五次，然後載入425 µL的LNP懸浮液。一旦將LNP懸浮液完全移入樹脂床中，便根據製造商的說明書，將75 µL堆垛體積的交換緩衝液施加到柱上，以達到柱的指定的目標載入體積並使回收最大化。在將堆垛體積完全移入樹脂床中後，將SEC柱轉移到新的離心管中，並且通過向柱中添加1.0 mL的交換緩衝液來洗脫LNP懸浮液。回收在交換緩衝液中的含有LNP的洗脫液並在4ºC儲存，直到進一步使用。 實例 10 ：用於 HSC 轉染的接合 Fab 的 LNP 的構建和篩選 [0587]在本實例中，配製與23種不同的靶向造血幹細胞（HSC）的Fab和全長抗體接合的脂質奈米粒子（LNP）（例如，包含可電離陽離子脂質的LNP，其中所述可電離陽離子脂質是KC3或脂質15），並篩選HSC的轉染。所述LNP-Fab接合物中的三種成功轉染原代HSC。 HSC 解凍和生長方法 [0588]使用來自StemCell™ Technologies的SFEM II培養基作為基礎培養基製備HSC培養基。用CD34+擴增補充劑補充SFEM II培養基以製備最終的HSC培養基配製品。使用HSC培養基解凍具有1000萬個原代人HSC（從G-CSF和普樂沙福動員的患者的leukopak中分離）的冷凍小瓶。解凍後，將1 mL培養基逐滴添加到小瓶中，並將整個體積轉移到15 mL錐形管中。將8 mL另外的培養基添加到細胞懸浮液中，並使用NC-202™自動細胞計數器計數細胞總數。將細胞減速旋轉並以100萬個細胞/1 mL培養基的濃度重懸。將細胞在適當的燒瓶中培養3天。在培養的第3天，在NC-202™上再次計數細胞。將新鮮的HSC培養基添加到細胞培養物中，以使HSC的濃度恢復至100萬個細胞/1 mL培養基。在培養的第4天，收集HSC用於使用LNP進行轉染。 體外 LNP 處理方法 [0589]在LNP處理當天，收集HSC並以75,000個細胞/100 μL的濃度重懸於新鮮的HSC培養基中。將40 μL的30,000個細胞接種到圓底96孔板的各個孔中。將LNP以指定劑量添加到細胞中。添加LNP後，將HSC培養基添加到各孔中，以使培養物的總體積達到100 μL。 [0590]在LNP處理當天，還對HSC進行CD34和CD117染色（CD34是普遍存在的HSC標記，CD117是長期HSC的標記），以確定HSC擴增後培養物的純度。染色後，通過流式細胞術分析細胞，並定量CD34+Cd117+細胞。 LNP 配製和接合 [0591]使用可商購的DLin-KC3-DMA（KC3）可電離陽離子脂質如實例2中所述配製LNP，除了通過省略實例2中所述的交換到MBS中而將LNP留在HBS中。首先將KC3 LNP與GFP mRNA一起配製，以鑒定可以成功使HSC轉染上mRNA的抗體。GFP mRNA採購自TriLink BioSciences並用N-1-甲基假尿苷進行修飾。如實例3中所述表徵所得的LNP，並且結果在下 表 6中給出。 表 6. LNP 表徵結果。
批號 DLS Z 平均直徑 (nm) DLS PDI 在 pH 5.5 下的 ζ 電位 (mV) 在 pH 7.4 下的 ζ 電位 (mV) 染料可及 mRNA(%)
EXP22002243-N01H 87 0.12 19.3 3.8 9.9
[0592]使用實例4和5中所述的方法，將包封GFP mRNA的KC3 LNP與23種Fab和商業獲得的全長抗體組合以超過3種Fab/抗體密度接合，所述Fab/抗體靶向HSC的特異性細胞表面標記，包括CD34、CD105和CD117（ 表 7）。為了與全長抗體接合，將LNP與鏈黴親和素部分融合，並用生物素標記所接合的全尺寸抗體。具體地，使鏈黴親和素上的離胺酸基團與特勞特試劑反應以共價附接硫醇基團。然後經由馬來醯亞胺基團和與鏈黴親和素附接的硫醇基團之間的共價接合使硫醇化的鏈黴親和素接合至DSPE-PEG(2k)-馬來醯亞胺上。然後使融合鏈黴親和素的脂質與生物素化的抗體反應。最後，通過在60ºC培育1小時將脂質-鏈黴親和素-抗體接合物插入LNP中。LNP還摻入了螢光脂質染料1,1'-雙十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚二碳菁-5,5'-二磺酸（DiIC(18)5-DS）。使用GFP mRNA來測量轉染，因為mRNA必須進入細胞並逃離內體以轉錄成蛋白質，從而發出螢光。將DiIC(18)5-DS用作LNP靶向的量度，因為只要LNP能夠與HSC結合，細胞就會具有DiI螢光。因此，GFP表現提供了LNP轉染的量度，同時DiI陽性事件代表靶向HSC的Fab。用恒定RNA濃度為1 μg/mL的LNP處理HSC。將HSC與LNP一起培育24小時和72小時，之後使用流式細胞術測量GFP螢光和DiI螢光。 表 7. 在篩選中測試的 HSC 靶向抗體。
形式 接合物 Fab 密度
Fab 抗HuCD105 Ab3 Fab bDS 5
Fab 抗HuCD105 Ab3 Fab bDS 15
Fab 抗HuCD105 muRH105 VH2/VL2 Fab bDS 5
Fab 抗HuCD105 muRH105 VH2/VL2 Fab bDS 15
Fab 抗HuCD105 Ab3 Fab bDS和抗HuCD105 muRH105 VH2/VL2 Fab bDS的混合物 5
Fab 抗HuCD105 Ab3 Fab bDS和抗HuCD105 muRH105 VH2/VL2 Fab bDS的混合物 15
Fab 抗HuCD117 Ab2 Fab bDS 5
Fab 抗HuCD117 Ab2 Fab bDS 15
Fab 抗HuCD117 Ab2 Fab bDS 45
Fab 抗HuCD117 Ab55 Fab bDS 5
Fab 抗HuCD117 Ab55 Fab bDS 15
Fab 抗HuCD117 Ab55 Fab bDS 45
Fab 抗HuCD117 Ab1 Fab bDS 5
Fab 抗HuCD117 Ab1 Fab bDS 15
Fab 抗HuCD117 Ab1 Fab bDS 45
Fab 抗HuCD117 CK6 Fab bDS 5
Fab 抗HuCD117 CK6 Fab bDS 15
Fab 抗HuCD117 CK6 Fab bDS 45
Fab 抗HuCD117 hSR-1 Fab bDS 5
Fab 抗HuCD117 hSR-1 Fab bDS 15
Fab 抗HuCD117 hSR-1 Fab bDS 45
Fab 抗HuCD117 6LUN1 Fab bDS 5
Fab 抗HuCD117 6LUN1 Fab bDS 15
Fab 抗HuCD117 6LUN1 Fab bDS 45
Ig 生物素抗HuCD34（殖株581） 5
Ig 生物素抗HuCD34（殖株581） 15
Ig 生物素抗HuCD34（殖株581） 45
Ig 生物素抗HuCD34（殖株QBEND/10） 5
Ig 生物素抗HuCD34（殖株QBEND/10） 15
Ig 生物素抗HuCD34（殖株QBEND/10） 45
Ig 生物素抗HuCD34（殖株4H11） 5
Ig 生物素抗HuCD34（殖株4H11） 15
Ig 生物素抗HuCD34（殖株4H11） 45
Ig 生物素抗HuCD105（殖株43A3） 5
Ig 生物素抗HuCD105（殖株43A3） 15
Ig 生物素抗HuCD105（殖株43A3） 45
Ig 生物素抗HuCD105（殖株166707） 5
Ig 生物素抗HuCD105（殖株166707） 15
Ig 生物素抗HuCD105（殖株166707） 45
Ig 生物素抗HuCD105（殖株MEM-229） 5
Ig 生物素抗HuCD105（殖株MEM-229） 15
Ig 生物素抗HuCD105（殖株MEM-229） 45
Ig 生物素抗HuCD117（殖株104D2） 5
Ig 生物素抗HuCD117（殖株104D2） 15
Ig 生物素抗HuCD117（殖株104D2） 45
Ig 生物素抗HuCD117（殖株A3C6E2） 5
Ig 生物素抗HuCD117（殖株A3C6E2） 15
Ig 生物素抗HuCD117（殖株A3C6E2） 45
Ig 生物素抗HuCD117（殖株OTI3F9） 5
Ig 生物素抗HuCD117（殖株OTI3F9） 15
Ig 生物素抗HuCD117（殖株OTI3F9） 45
Ig 生物素抗HuCD117（殖株BA7.3C.9） 5
Ig 生物素抗HuCD117（殖株BA7.3C.9） 15
Ig 生物素抗HuCD117（殖株BA7.3C.9） 45
Ig 生物素抗HuCD117（殖株B-K15） 5
Ig 生物素抗HuCD117（殖株B-K15） 15
Ig 生物素抗HuCD117（殖株B-K15） 45
結果 [0593]多個Fab-LNP和抗體-LNP組合靶向HSC（ 圖 6A- 圖 6D），如陽性DiI螢光所示。然而，只有三種Fab-LNP，即，i) 抗HuCD117 Ab1 Fab bDS、ii) 抗HuCD117 Ab2 Fab bDS、和iii) 抗HuCD105 Ab3 Fab bDS成功地使原代HSC轉染有mRNA，如通過GFP和DiI螢光所示（ 圖 7A- 圖 7D）。單個抗CD117殖株具有最高的轉染效率（Ab1）（ 圖 8）。 實例 11 ：使用 LNP-Fab 接合物對 HSC 進行遺傳修飾 [0594]在本實例中，使用包封CRISPR-Cas編輯系統的靶向HSC的LNP-Fab接合物來對HSC的CD45基因進行遺傳修飾。觀察到CD45基因中雙鏈斷裂的誘導和CD45表現的敲除。 [0595]使用與或不與Ab1接合的LNP配製品（例如，包含可電離陽離子脂質的LNP，其中所述可電離陽離子脂質是KC3或脂質15）來包封Cas9 mRNA與對CD45（可以通過流式細胞術可靠地測量的替代HSC細胞表面標記）具有特異性的gRNA。Cas9 mRNA獲得自TriLink Biosciences，並且gRNA獲得自Integrated DNA Technologies（IDT）。使用實例2和4-5中所述的方法配製LNP並與Ab1接合。LNP內Cas9 mRNA與gRNA的比率為1 : 1。為了優化gRNA以用於基於LNP的CRISPR編輯，將摻入硫代磷酸酯鍵和2'-O-甲基取代的化學修飾模式與包封的Cas9 mRNA一起使用。使用實例1中所述的方法，用這些LNP以100至800 ng總RNA的劑量範圍處理原代人HSC，處理7天。 [0596]在轉染後第7天，用針對CD45、CD34和CD117的螢光抗體染色HSC。使用流式細胞術定量每種蛋白質的螢光。使用CD34和CD117來確定HSC群體。使用CD45螢光來確定CD45的敲除。通過整合上述策略以實現LNP靶向和CRISPR-mRNA編輯，在體外靶向LNP用劑後七天，原代人HSC中的CD45蛋白減少。KC3的結果示於 圖 9A- 圖 9B中，並且脂質15的結果示於 圖 10A- 圖 10B中。 [0597]另外，在轉染後第7天，收集HSC用於下一代測序（NGS），以使用靶向擴增子測序定量由Cas9和CD45 gRNA靶向的基因組基因座處的插入缺失率。對於擴增子測序，設計跨越所使用的CD45 gRNA的中靶切割位點周圍的300鹼基對區域的引子。擴增後，使用Illumina MiSeq定量300鹼基對序列。CRISPR-LNP處理在靶基因座處產生顯著的插入缺失，這進一步證實了我們觀察到的CD45蛋白的減少（ 圖 11）。 實例 12 ： HSC 中 BCL11a 紅系細胞強化子的破壞 [0598]使用實例2和4-5中所述的方法配製包封針對BCL11a的gRNA和Cas9 mRNA的LNP（例如，包含可電離陽離子脂質的LNP，其中所述可電離陽離子脂質是KC3或脂質15）並與Ab1和mutAb1接合。使用LNP來治療體外原代人HSC。MutAb1是衍生自Ab1的非靶向性Fab，其在所述抗體的輕鏈和重鏈的每個CDR環中具有丙胺酸突變，如下 表 8所示。 表 8.Ab1 和 mutAb1 CDR 序列。
抗體 Ab1 mutAb1
CDR-H1 F TFSNYAMS （SEQ ID NO: 1） F AAANYAMS （SEQ ID NO: 28）
CDR-H2 AISG SGGSTYYADSVKG （SEQ ID NO: 2） AISG AAASTYYADSVKG （SEQ ID NO: 29）
CDR-H3 AKGPPTY HTNYYYMDV （SEQ ID NO: 3） AKGPPTY AAAYYYMDV （SEQ ID NO: 30）
CDR-L1 RASQ GISSWLA （SEQ ID NO: 4） RASQ AAASWLA （SEQ ID NO: 31）
CDR-L2 AA SSLQS （SEQ ID NO: 5） AA ASLQS （SEQ ID NO: 32）
CDR-L3 QQT NSFPYT （SEQ ID NO: 6） QQT AAAPYT （SEQ ID NO: 33）
[0599]在處理後3天和7天收集HSC，然後使用靶向擴增子測序測定它們的基因編輯。 實例 13 ： HSC 的進一步體外靶向和遺傳修飾 13.1 ：針對用於 HSC 轉染的 LNP 的 Fab 接合物密度的篩選優化 [0600]在用於表徵接合Ab的LNP的另外實驗中，使用脂質15將脂質奈米粒子（LNP）與mCherry mRNA一起配製，並使用實例2中所述的方法直接交換到MBS中。使用美國專利號10,143,758（實例7）中所述的方法，通過體外轉錄產生修飾有N-1-甲基假尿苷的mCherry mRNA。如實例4中所述製備Fab Ab1、Ab2和MutAb1的接合物。然後使用實例4-5中所述的方法，將Fab接合物以下 表 9中列出的10種不同密度插入所配製的LNP中，其中修改為在37ºC進行插入4小時。 [0601]使用如實例11中所述的方法，針對HSC中的mCherry轉染水準，篩選LNP。具體地，用100 ug mRNA/孔劑量處理HSC，每孔30,000個細胞，並向各孔中添加培養基以使總體積達到100 uL。然後將HSC與LNP一起培育6小時，之後用新鮮的培養基替換含有LNP的培養基。24小時後，用針對CD34和CD117的螢光抗體染色HSC。對細胞門控CD34+和CD117+染色，並測定CD34+CD117+mCherry+細胞的百分比。為了使HSC靶向和細胞轉染最大化，發現Fab密度的最佳範圍為約3-9 g的Ab/mol脂質。選擇Ab密度的結果示於 圖 13中，其突出顯示了最佳範圍的Fab密度（3-9 g的Ab/mol脂質）。 表 9. 在優化中測試的 HSC 靶向抗體密度。
形式 接合物 Fab 密度 ( g Fab/mol 脂質 )
親本LNP 無 0
Fab 抗HuCD1117 Ab1 Fab bDS 1
Fab 抗HuCD1117 Ab1 Fab bDS 3
Fab 抗HuCD1117 Ab1 Fab bDS 6
Fab 抗HuCD1117 Ab1 Fab bDS 9
Fab 抗HuCD1117 Ab1 Fab bDS 12
Fab 抗HuCD1117 Ab1 Fab bDS 15
Fab 抗HuCD1117 Ab1 Fab bDS 18
Fab 抗HuCD1117 Ab1 Fab bDS 21
Fab 抗HuCD1117 Ab1 Fab bDS 27
Fab 抗HuCD1117 Ab2 Fab bDS 1
Fab 抗HuCD1117 Ab2 Fab bDS 3
Fab 抗HuCD1117 Ab2 Fab bDS 6
Fab 抗HuCD1117 Ab2 Fab bDS 9
Fab 抗HuCD1117 Ab2 Fab bDS 12
Fab 抗HuCD1117 Ab2 Fab bDS 15
Fab 抗HuCD1117 Ab2 Fab bDS 18
Fab 抗HuCD1117 Ab2 Fab bDS 21
Fab 抗HuCD1117 Ab2 Fab bDS 27
Fab 抗HuCD1117 MutAb1 Fab bDS 1
Fab 抗HuCD1117 MutAb1 Fab bDS 3
Fab 抗HuCD1117 MutAb1 Fab bDS 6
Fab 抗HuCD1117 MutAb1 Fab bDS 9
Fab 抗HuCD1117 MutAb1 Fab bDS 12
Fab 抗HuCD1117 MutAb1 Fab bDS 15
Fab 抗HuCD1117 MutAb1 Fab bDS 18
Fab 抗HuCD1117 MutAb1 Fab bDS 21
Fab 抗HuCD1117 MutAb1 Fab bDS 27
13.2 ：在 B2M 基因座處體外編輯原代 HSC [0602]接下來，在體外培養原代HSC並用LNP處理，所述LNP配製有脂質15並包封Cas核酸酶mRNA和對β-2-微球蛋白基因座（B2M）具有特異性的gRNA。使LNP包被有Ab1或非結合mutAb1。使用靶向B2M蛋白表現的流式細胞術定量B2M蛋白敲除的基因編輯效應。如 圖 14A- 圖 14C所示，使用與Ab1接合的LNP在體外HSC中成功地編輯了B2M基因座，而與mutAb1接合的LNP沒有產生編輯。 實例 14 ： HSC 的體內遺傳修飾 14.1 ：使用靶向 LNP 體內轉染長期造血幹細胞 [0603]使用實例1和2中所述的方法將LNP（例如，包含可電離陽離子脂質的LNP，其中所述可電離陽離子脂質是KC3或脂質15）與Ab1和mutAb1接合。向NSG小鼠中移植原代人HSC以建立鼠模型，由此可以觀察到用體內靶向LNP靶向人HSC。在初始實驗中，配製包封mCherry或eGFP mRNA的LNP。然後經由尾靜脈將LNP靜脈內注射到小鼠中。在24小時和48小時，對小鼠實施安樂死，收集小鼠的骨髓並通過流式細胞術進行分析，以測定HSC群體中的mCherry或eGFP螢光。 14.1.1 ：使用攜帶 mCherry mRNA 的靶向 LNP 體內轉染長期造血幹細胞 材料與方法 [0604]小鼠。通過常規方法分析移植人CD34 +造血幹細胞的NSG TM小鼠。用移植後12周的小鼠進行實驗。對於所有條件，經由尾靜脈注射作為推注投予1 mg/kg的LNP（從mCherry mRNA測量的總核苷酸）。用包被有Ab1 Fab的靶向LNP、包被有非結合mutAb1 Fab的脫靶向LNP或不具有Fab的親本LNP（未包被/裸）處理小鼠。處理後24 h對小鼠實施安樂死，並收集各種組織進行分析。經處理的Hu-CD34 +-NSG TM小鼠以未處理的Hu-CD34 +-NSG TM小鼠作為對照。 [0605] 流式細胞術分析。通過用含有5%胎牛血清（FBS）和2 mM EDTA的冷PBS（FACS緩衝液）沖洗經安樂死小鼠的脛骨和股骨來獲得骨髓細胞。在冷FACS緩衝液中收穫細胞，在室溫下用針對人CD45的單株抗體（殖株2D1，來自Biolegend™的目錄號368542）、針對小鼠CD45的單株抗體、針對人CD34的單株抗體（殖株561，來自Biolegend™的目錄號343614）和針對人CD117的單株抗體（殖株104D2，來自Biolegend™的目錄號313206）染色20 min，然後在NovoCyte Penteon（Agilent）上通過流式細胞術進行分析。使用抗小鼠和抗人CD45抗體二者來鑒定來自骨髓的人細胞，以在混合的骨髓細胞群中清楚地區分人和小鼠HSC。基於mCherry陽性分析細胞。 [0606] ELISA 。在冷藏室中，使用Tissuelyser（Qiagen），將約30 mg來自小鼠的冷凍肝組織在300 µL RIPA緩衝液與1x HALT蛋白酶抑制劑混合物（PI）（目錄號78441）中均質化（程式P1：30頻率，5 min，4ºC），然後在4ºC以12000 rpm減速旋轉5 min。基於製造商的建議進行mCherry ELISA（來自Abcam的目錄號ab221829）。使用SpectraMax與讀板儀在450 nm處測量產物吸光度（Molecular Devices，加利福尼亞州聖約瑟）。 [0607] 統計學。使用GraphPad Prism 9.0軟體進行統計分析。如果它們是正態分佈的，則使用雙尾Student t檢定進行個體比較。 結果 [0608]該分析的結果表明，工程化抗體靶向LNP可以識別、結合和轉染LT-HSC（CD117 +）以將mRNA遞送至細胞溶質中（ 圖 15A- 圖 15B）。另外，將來自多個實驗的轉染效率評價為：包被有Ab1 Fab的脂質15 LNP為30%、包被有非靶向性mutAb1 Fab的LNP為5%，以及未包被的LNP為16%（ 圖 15A- 圖 15C）。分別用包被有Ab1 Fab和mutAb1 Fab的KC3 LNP測量了類似的轉染效率，分別為25%和3%（ 圖 15D）。此外，包被Fab的脂質15 LNP比裸脂質15 LNP對肝細胞具有更低的趨向性，因為在從多隻經處理動物的2個不同肝葉提取蛋白質後，通過ELISA測量到少91%的mCherry信號（ 圖 15E）。最後，我們測量到來自KC3處理的肝細胞的信號相比於脂質15 LNP處理的肝細胞的信號少3倍（ 圖 15E- 圖 15F）。 14.1.2 ：使用攜帶 mCherry mRNA 的靶向 LNP 進一步體內轉染長期造血幹細胞 [0609]在第二個實驗中進一步評價人HSC在移植人CD34+ HSC的小鼠（n = 12）中的體內轉染。將雌性Hu-CD34+ NSG TM小鼠（Jax實驗室；Hu-CD34+；NSG™小鼠，NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl，儲備號005557）用包被有Ab1的脂質15 LNP處理，以在骨髓環境中轉染人HSC。用約50%脂質15、約40%膽固醇、約10% DSPC和約1.5% PEG（包含分子量為2,000 Da的PEG的DPG-PEG）製備LNP。將脂質15 LNP在室溫下解凍，通過倒置均勻混合，然後在鹽水溶液中稀釋，然後通過靜脈內注射（IV）作為單次推注以1.0 mg/kg用劑。處理後24小時，收集全骨髓、肝、脾、肺和卵巢組織，並通過流式細胞術、ELISA或IHC，使用mCherry報告物進行分析。 [0610]將從脛骨和股骨收集的骨髓細胞重懸於補充有10%胎牛血清（FBS）的DPBS中，作為單細胞懸浮液。將細胞用hCD45殖株2D1（Biolegend™）、hCD117殖株104D2（來自Biolegend™）、hCD34殖株561（Biolegend™）染色，並通過流式細胞術進行分析以評估轉染效率。如 圖 16所示，平均約20%的CD34+/CD117+人HSC對於mCherry螢光呈陽性，這證明包被有Ab1的脂質15 LNP在體內轉染了人LT-HSC。 [0611]將肝、脾和肺組織均質化以提取蛋白質（使用補充有1x HALT™蛋白酶抑制劑混合物的RIPA緩衝液[Thermo Fisher，目錄號78441]），並通過ELISA（ab221829 mCherry SimpleStep ELISA®套組，來自Abcam）進行分析。將卵巢組織包埋，切片，並使用M11217 Ab（來自Abcam）通過免疫組織化學（IHC）進行分析。由經認證的病理學家對IHC組織進行盲分析和分級。脫靶組織分析的結果示於表10中。 表 10.脫靶組織中的mCherry蛋白的檢測。
組織 mCherry蛋白 檢測方法
肝 54 ng/mg ELISA
脾 260 ng/mg
肺 3.5 ng/mg
卵巢 無信號 IHC
14.2 ：使用包封 gRNA 和 Cas 核酸酶 mRNA 的 LNP 對 HSC 進行體內編輯 [0612]接下來，配製包封gRNA（例如，靶向BCL11a紅系細胞強化子的gRNA）和編碼Cas核酸酶（例如Cas9）的mRNA的LNP，並將其注射到移植原代人HSC的NSG小鼠中。在注射後7天，對小鼠實施安樂死並收集骨髓。從骨髓細胞中分離gDNA，並對樣品進行NGS-擴增子測序以計算體內基因編輯。 14.3 ：在非人靈長類動物（ NHP ）中使用靶向 LNP 體內轉染長期造血幹細胞 [0613]配製包封mCherry mRNA的LNP並用於處理非人靈長類動物（NHP），特別是模里西斯來源的食蟹猴。 [0614]首先，在體外驗證靶向人HSC的LNP靶向食蟹猴HSC的能力。使用包被有Ab1且包封mCherry mRNA的脂質15 LNP來處理從食蟹猴分離的HSC。使用來自ThermoFisher™ Technologies的IMDM培養基作為基礎培養基製備食蟹猴HSC培養基。IMDM培養基補充有10% FBS（Gibco™）、rhSCF 100 ng/mL（PeproTech™）、血小板生成素100 ng/mL（PeproTech™）、rhuFlt3-L 100 ng/mL（PeproTech™）、白介素-3 100 ng/mL（PeproTech™）、白介素-6 100 ng/mL（PeproTech™）、G-CSF 100 ng/mL（PeproTech™），以製作最終的HSC培養基配方。將骨髓細胞重懸為單細胞懸浮液並在紅細胞（RBC）裂解緩衝液（來自Invitrogen的00-4333-57）中混合以消除紅血球。將細胞減速旋轉並以100萬個細胞/1 mL培養基的濃度重懸。將細胞在適當的燒瓶中培養3天。在培養的第3天，在NC-202™上再次計數細胞。將新鮮的HSC培養基添加到細胞培養物中，以使HSC的濃度恢復至100萬個細胞/1 mL培養基。在培養的第8天，收集HSC用於使用LNP進行轉染，並在第二天進行分析。使用流式細胞術分析樣品的mCherry表現以測量LT-HSC轉染。使用CD34和CD117標記鑒定食蟹猴LT-HSC。如 圖 17所示，在用包被有Ab1的脂質15 LNP處理的食蟹猴中，用mCherry mRNA轉染了約65%的食蟹猴HSC，這證實包被有Ab1的脂質15 LNP可以靶向食蟹猴LT-HSC。 [0615]接下來，評價NPH中LT-HSC的體內轉染。向雄性和雌性模里西斯來源的食蟹猴輸注脂質15 LNP或KC3 LNP的不同用劑方案，每種LNP包被有Ab1並包封mCherry mRNA以在骨髓環境中轉染HSC。用約40%膽固醇、約10% DSPC、約1.5% PEG（包含分子量為2,000 Da的PEG的DPG-PEG）和約50%脂質15（對於脂質15 LNP）或約50% KC3脂質（對於KC3 LNP）製備LNP。在LNP輸注前30 min，用2 mg/kg苯海拉明對NHP進行肌內預處理。將脂質15 LNP和KC3 LNP在室溫下解凍，通過倒置均勻混合，然後在鹽水溶液中稀釋，然後通過靜脈內注射（IV）作為單次緩慢輸注（經由泵，以5 mL/Kg）在1小時的持續時間內用劑。將脂質15 LNP以0.5 mg/kg和0.2 mg/kg用劑，並且將KC3 LNP以1.0 mg/kg、0.5 mg/kg和0.2 mg/kg用劑。在用LNP注射NHP後24小時，在處理後24 h通過從髂脊抽吸來收集全骨髓樣品。研究的設計示於表11中。 表 11.評價LT-HSC在模里西斯來源的食蟹猴中的體內轉染的研究設計。 [0616]使用流式細胞術測定骨髓抽吸物中具有mCherry螢光的NHP HSC。將骨髓細胞重懸為單細胞懸浮液並在紅細胞（RBC）裂解緩衝液（來自Invitrogen的00-4333-57）中混合以消除紅血球。洗滌細胞，重懸於補充有10%胎牛血清（FBS）的杜爾貝科磷酸鹽緩衝鹽水（DPBS）中，用抗CD34抗體（殖株561，來自Biolegend™的目錄號343614）和抗CD117抗體（殖株104D2，來自Biolegend的目錄號313206）染色，並通過流式細胞術進行分析以評估轉染效率。示例性流式細胞術結果示於 圖 18中，這些結果說明了用於鑒定食蟹猴LT-HSC的流式細胞術門控策略。 [0617] 圖 19A- 圖 19B顯示來自用包被有Ab1 Fab的、包封mCherry mRNA的脂質15 LNP（ 圖 19A）或KC3 LNP（ 圖 19B）處理的食蟹猴的呈mCherry陽性的HSC的平均百分比。測試的這兩種LNP以劑量依賴性方式在體內轉染陽性HSC。這證實人靶向性HSC LNP可以有效地在體內轉染食蟹猴LT-HSC。 實例 15 ：能夠體內靶向造血幹細胞（ HSC ）的 Fab’ 接合物的製備 [0618]本實例描述了一種用於產生脂質-HSC靶向基團接合物的方法，所述接合物用於摻入HSC靶向LNP（例如，包含可電離陽離子脂質的LNP，其中所述可電離陽離子脂質是KC3或脂質15）中。 [0619]經由在最初還原Fab’和(Fab’)2的混合物之後馬來醯亞胺基團與重鏈（HC）中的C末端半胱胺酸之間的共價接合，將結合HSC特有靶標（CD117、CD105）的Fab與DSPE-PEG(2k)-馬來醯亞胺接合。將10 mg/mL的所述蛋白質用分子生物學級水在磷酸鹽緩衝鹽水（10 mM磷酸鹽，140 mM NaCl pH 7.4）中重構，並在還原緩衝液中進一步稀釋至5 mg/mL，所述還原緩衝液具有50 mM磷酸鹽、10 mM檸檬酸鹽、75 mM NaCl、5 mM EDTA（pH 6.0）的最終濃度以及20 mM L-半胱胺酸還原劑，並在25ºC在氬氣氣氛下在攪拌下培育1小時。在室溫下，使用配備有HEPA空氣過濾系統的自動超濾/滲濾緩衝液交換（Unchained Labs，美國加利福尼亞州），使用在24孔聚丙烯過濾板中的10 kDa截留分子量再生纖維素膜，將還原的蛋白質立即進行緩衝液交換到99.9%接合緩衝液（5 mM檸檬酸鹽，140 mM NaCl，1 mM EDTA，pH 6.0）中。在還原和緩衝液交換後，根據製造商的方案（Thermo Fisher Scientific Peirce Biotechnology，美國伊利諾州），使用Ellman試劑（5,5'-二硫代-雙-[2-硝基苯甲酸]），還原和緩衝液交換後的游離巰基含量被測量為 ＜ 1.1/Fab分子。 [0620]在緩衝液交換後1小時內儘快通過添加在分子生物學級水中的具有12 mg/mL DSPE-PEG-OCH3（NOF America，美國紐約）和8 mg/mL DSPE-PEG-馬來醯亞胺（NOF America，美國紐約）的膠束懸浮液來啟動接合反應。接合反應以以下進行：最終濃度為3.8 mg/mL的Fab和8.25莫耳過量的馬來醯亞胺，在25ºC在氬氣氣氛下在攪拌下持續4小時。通過HPLC和SDS-PAGE監測所得接合物的產生。將反應在1.0 mM L-半胱胺酸中在室溫淬滅10 min，並在4ºC儲存12-16小時。在室溫下，使用配備有HEPA空氣過濾系統的自動超濾/滲濾緩衝液交換（Unchained Labs，美國加利福尼亞州），使用在24孔聚丙烯過濾板中的100 kDa截留分子量再生纖維素膜，將所得的含有DSPE-PEG(2k)-抗hCD117 Fab的粗接合反應物從游離Fab中純化，並進行緩衝液交換到99.9%緩衝液（10 mM檸檬酸鹽，10%（w/v）蔗糖，pH 7.0）中。通過HPLC和SDS-PAGE評估最終接合物的純度。在淬滅後，最終的膠束組合物由DSPE-PEG-Fab、DSPE-PEG-馬來醯亞胺（以半胱胺酸終止）和DSPE-PEG-OCH3的混合物組成。
無
[0087]通過結合附圖參考以下描述，可以理解本申請。 [0088] 圖 1描繪了用靶向性脂質奈米粒子（LNP）對造血幹細胞（HSC）進行體內CRISPR編輯的示例性治療策略。 [0089] 圖 2描繪了中間體13-11的質子NMR譜。 [0090] 圖 3A描繪了中間體13-11a的質子NMR譜； 圖 3B描繪了中間體13-11b的質子NMR譜； 圖 3C描繪了中間體13-11b的LC-ELSD。 [0091] 圖 4A描繪了中間體13-10的質子NMR譜； 圖 4B描繪了中間體13-10的LC-CAD層析圖。 [0092] 圖 5A-1描繪了脂質1的質子NMR譜； 圖 5A-2描繪了脂質1的LC-CAD層析圖。 [0093] 圖 5B-1描繪了脂質3的質子NMR譜； 圖 5B-2描繪了脂質3的LC-CAD層析圖。 [0094] 圖 5C-1描繪了脂質4的質子NMR譜；圖 5C-2描繪了脂質4的LC-CAD層析圖L。 [0095] 圖 5D-1描繪了脂質5的質子NMR譜； 圖 5D-2描繪了脂質5的LC-CAD層析圖。 [0096] 圖 5E-1描繪了脂質6的質子NMR譜； 圖 5E-2描繪了脂質6的LC-CAD層析圖。 [0097] 圖 5F-1描繪了脂質7的質子NMR譜； 圖 5F-2描繪了脂質7的LC-CAD層析圖。 [0098] 圖 5G-1描繪了脂質2的質子NMR譜； 圖 5G-2描繪了脂質2的LC-CAD層析圖。 [0099] 圖 5H-1描繪了脂質8的質子NMR譜； 圖 5H-2描繪了脂質8的LC-CAD層析圖。 [0100] 圖 5I-1描繪了脂質9的質子NMR譜； 圖 5I-2描繪了脂質9的LC-CAD層析圖。 [0101] 圖 5J-1描繪了脂質10的質子NMR譜； 圖 5J-2描繪了脂質10的LC-CAD層析圖。 [0102] 圖 5K-1描繪了脂質11的質子NMR譜； 圖 5K-2描繪了脂質11的LC-CAD層析圖。 [0103] 圖 5L-1描繪了脂質12的質子NMR譜； 圖 5L-2描繪了脂質12的LC-CAD層析圖。 [0104] 圖 5M-1描繪了脂質13的質子NMR譜； 圖 5M-2描繪了脂質13的LC-CAD層析圖。 [0105] 圖 5N-1描繪了脂質15的質子NMR譜； 圖 5N-2描繪了脂質15的LC-CAD層析圖。 [0106] 圖 5O-1描繪了脂質16的質子NMR譜； 圖 5O-2描繪了脂質16的LC-CAD。 [0107] 圖 5P-1描繪了脂質19的質子NMR譜； 圖 5P-2描繪了脂質19的LC-CAD層析圖。 [0108] 圖 5Q-1描繪了脂質20的質子NMR譜； 圖 5Q-2描繪了脂質20的LC-CAD層析圖。 [0109] 圖 5R-1描繪了脂質31的質子NMR譜； 圖 5R-2描繪了脂質31的LC-CAD層析圖。 [0110] 圖 5S-1描繪了脂質32的質子NMR譜； 圖 5S-2描繪了脂質32的LC-CAD層析圖。 [0111] 圖 5T-1描繪了脂質33的質子NMR譜； 圖 5T-2描繪了脂質33的LC-CAD層析圖。 [0112] 圖 5U-1描繪了脂質34的質子NMR譜； 圖 5U-2描繪了脂質34的LC-CAD層析圖。 [0113] 圖 6A- 圖 6D描繪了篩選LNP-Fab接合物和LNP-全長抗體接合物與HSC的結合的實驗的結果。將LNP-Fab接合物和LNP-抗體接合物與1,1'-雙十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽（DiI）一起配製並用於處理體外HSC。DiI螢光顯示為LNP靶向的量度，因為LNP-Fab接合物與HSC的結合導致HSC具有DiI螢光。每個LNP-Fab或LNP-抗體接合物的特異性Fab或抗體顯示在每個分圖的頂部。每一列顯示用以各種Fab/抗體密度製備的所示LNP-Fab或LNP-抗體接合物處理的HSC的DiI螢光，如詳細佈局圖例所示。將未接合的LNP和與抗CD8 mutOKT8抗體接合的LNP用作HSC靶向的陰性對照，因為CD8不被HSC表現。漢克斯平衡鹽溶液（HBS）也用作非LNP緩衝液對照。 圖 6A描繪了篩選第一組LNP-Fab接合物的HSC靶向的第一個實驗。 圖 6B描繪了篩選第一組LNP-Fab接合物的HSC靶向的第二個實驗。 圖 6C描繪了篩選第二組LNP-抗體接合物的HSC靶向的第一個實驗。 圖 6D描繪了篩選第二組LNP-抗體接合物的HSC靶向的第二個實驗。 [0114] 圖 7A- 圖 7D描繪了篩選LNP-Fab接合物和LNP-全長抗體接合物轉染HSC的實驗的結果。將LNP-Fab接合物和LNP-抗體接合物與DiI和編碼綠色螢光蛋白（GFP）的mRNA一起配製並用於處理體外HSC。DiI螢光和GFP螢光的組合顯示為LNP轉染的量度，因為LNP-Fab或LNP-抗體接合物與HSC的結合導致HSC具有DiI螢光，並且因為mRNA轉錄成GFP需要mRNA進入細胞並逃離內體。每個LNP-Fab或LNP-抗體接合物的特異性Fab或抗體顯示在每個分圖的頂部。每一列顯示用以各種Fab/抗體密度製備的所示LNP-Fab接合物或LNP-抗體接合物處理的HSC的DiI和GFP雙重螢光，如詳細佈局圖例所示。將未接合的LNP和與抗CD8 mutOKT8抗體接合的LNP用作HSC靶向的陰性對照，因為CD8不被HSC表現。漢克斯平衡鹽溶液（HBS）也用作非LNP緩衝液對照。 圖 7A描繪了篩選第一組LNP-Fab接合物的HSC轉染的第一個實驗。 圖 7B描繪了篩選第一組LNP-Fab接合物的HSC轉染的第二個實驗。 圖 7C描繪了篩選第二組LNP-抗體接合物的HSC轉染的第一個實驗。 圖 7D描繪了篩選第二組LNP-抗體接合物的HSC轉染的第二個實驗。 [0115] 圖 8描繪了HSC被與抗CD117 Ab1 Fab接合的LNP轉染。DiI螢光指示(Ab1)-LNP接合物與HSC的結合，並且GFP螢光指示用GFP mRNA成功轉染HSC。 [0116] 圖 9A- 圖 9B描繪了通過用與抗CD117 Ab1 Fab接合的KC3 LNP進行處理來體外編輯HSC。使用與或不與Ab1接合的KC3 LNP配製品來包封經N1-甲基-假尿苷化學修飾的Cas9 mRNA與對CD45具有特異性的gRNA。用這些LNP以100至800 ng的總RNA的劑量範圍處理原代人HSC，持續7天，之後用針對CD34和CD117的螢光抗體染色HSC以限定HSC細胞群，並用針對CD45的螢光抗體染色HSC以檢測CD45敲除。 圖 9A描繪了用接合Ab1的KC3 LNP處理的HSC的CD34和CD45螢光，並且示出了表現CD45的HSC隨著RNA載入量的增加而減少。 圖 9B描繪了用接合Ab1（KC3-Ab1）和未接合Ab1（KC3）的LNP處理的HSC中的CD45敲除的百分比。 [0117] 圖 10A- 圖 10B描繪了通過用與抗CD117 Ab1 Fab接合的脂質15 LNP進行處理來體外編輯HSC。使用與或不與Ab1接合的脂質15 LNP配製品來包封經N1-甲基-假-尿苷化學修飾的Cas9 mRNA與對CD45具有特異性的gRNA。用這些LNP以100至800 ng的總RNA的劑量範圍處理原代人HSC，持續7天，之後用針對CD34和CD117的螢光抗體染色HSC以限定HSC細胞群，並用針對CD45的螢光抗體染色HSC以檢測CD45敲除。 圖 10A描繪了用接合Ab1的脂質15 LNP處理的HSC的CD34和CD45螢光，並且示出了表現CD45的HSC隨著RNA載入量的增加而減少。 圖 10B描繪了用接合Ab1（Ab1脂質15）和未接合Ab1（脂質15）的LNP處理的HSC中的CD45敲除的百分比。 [0118] 圖 11描繪了LNP處理的HSC中CD45敲除百分比的圖，該敲除百分比如通過表型（CD45表現）和基因型（經由測序分析檢測的插入缺失）所測量的。每個單獨的點代表單個技術重複（即，單個孔的HSC）。表型KO%是不存在CD45蛋白的細胞的頻率。基因型KO%是在目標切割位點處包含不在正確狀態的插入缺失的讀段的百分比。 [0119] 圖 12描繪了各種Fab、VHH（Nb）、ScFv、Fab-ScFv和Fab-VHH雜交體的結構。 [0120] 圖 13描繪了用以不同的Fab密度與Ab1接合並包封mCherry mRNA的LNP對HSC進行體外轉染。 [0121] 圖 14A- 圖 14C描繪了使用與Ab1接合並攜帶用於基因編輯機制的RNA的LNP對HSC進行體外基因編輯。體外培養原代HSC，並用包封CRISPR mRNA和β-2-微球蛋白（B2M）指導蛋白的LNP進行處理。通過靶向細胞表面標記B2M的流式細胞術測量基因編輯效果。 圖 14A顯示與Ab1（結合性Ab）接合的識別長期造血幹細胞（LT-HSC）的LNP的示例性流式細胞術結果。 圖 14B顯示與突變型Ab1（mutAb1，非結合性Ab m）接合的LNP的示例性流式細胞術結果。 圖 14C顯示在用與Ab1和非結合性mutAb1接合的LNP處理的樣品中表現出B2M蛋白表現敲除的細胞的平均百分比。 [0122] 圖 15A- 圖 15F描繪了移植到NSG™小鼠中的人長期HSC（LT-HSC）的體內轉染。 圖 15A描繪了示例性流式細胞術結果，其示出了使用CD34和CD117標記（CD34是普遍存在的HSC標記，CD117是長期HSC的標記）鑒定LT-HSC的流式細胞術門控策略。通過測量mCherry陽性細胞的百分比來評價轉染效率。最初使用針對人和小鼠CD45 +細胞的抗體選擇細胞，以便從與小鼠HSC的混合物中區分出人HSC。 圖 15B描繪了另外的示例性流式細胞術結果，其顯示使用 圖 15A中所示的門控策略選擇的細胞中的mCherry表現。 圖 15C顯示用以下處理的小鼠的LT-HSC mCherry陽性的平均百分比：包被有Ab1 Fab的脂質15 LNP、包被有非靶向性mutAb1 Fab的脂質15 LNP或未包被的（裸）LNP，LNP均包封mCherry mRNA。 圖 15D顯示用以下處理的小鼠的LT-HSC mCherry陽性的平均百分比：包被有Ab1 Fab或非靶向性mutAb1 Fab的、包封mCherry mRNA的KC3 LNP。 圖 15E顯示在用以下處理的小鼠的肝組織中檢測到的mCherry蛋白的量（根據總蛋白標準化）：包被有Ab1 Fab的脂質15 LNP、包被有非靶向性mutAb1 Fab的脂質15 LNP或未包被的（裸）LNP，LNP均包封mCherry mRNA。 圖 15F顯示在用以下處理的小鼠的肝組織中檢測到的mCherry蛋白的量（根據總蛋白標準化）：包被有Ab1 Fab的KC3 LNP、包被有非靶向性mutAb1 Fab的KC3 LNP或未包被的（裸）LNP，LNP均包封mCherry mRNA。 在圖 15B- 圖 15E中，針對每個處理條件的樣本量為2-9只小鼠。橫條圖將資料顯示為平均值 ± SD；****表示P  ＜  0.0001；*表示P  ＜  0.05；「ns」表示不顯著。 [0123] 圖 16描繪了移植到NSG™小鼠中的人LT-HSC的體內轉染，其顯示來自包被有Ab1 Fab的、包封mCherry mRNA的脂質15 LNP處理的小鼠和來自未處理的小鼠的呈mCherry陽性的LT-HSC的平均百分比。 [0124] 圖 17描繪了具有包被有Ab1 Fab的LNP的食蟹猴HSC的體外轉染。從食蟹猴骨髓中分離LT-HSC，並使用CD34和CD117標記進行鑒定。顯示了用脂質15 LNP處理的樣品的呈mCherry陽性的LT-HSC的平均百分比，所述LNP包被有Ab1 Fab、包被有非靶向性mutAb1 Fab或未包被。 [0125] 圖 18描繪了示例性流式細胞術結果，其示出了使用食蟹猴CD34和CD117標記（CD34是普遍存在的HSC標記，CD117是長期HSC的標記）鑒定食蟹猴LT-HSC的流式細胞術門控策略。通過測量mCherry陽性細胞的百分比來評價轉染效率。 [0126] 圖 19A- 圖 19B描繪了LT-HSC在食蟹猴中的體內轉染。首先用劑量為2 mg/kg的苯海拉明肌內治療食蟹猴，30分鐘後用如x軸所示的各種劑量的HSC靶向LNP進行靜脈內治療。處理後24 h，通過從髂脊抽吸來收集全骨髓樣品，並使用mCherry報告蛋白通過流式細胞術進行分析。 圖 19A顯示來自用包被有Ab1 Fab的、包封mCherry mRNA的脂質15 LNP處理的食蟹猴的呈mCherry陽性的LT-HSC的平均百分比。 圖 19B顯示來自用包被有Ab1 Fab的、包封mCherry mRNA的KC3 LNP處理的食蟹猴的呈mCherry陽性的LT-HSC的平均百分比。如水準軸上所示，以各種劑量靜脈內投予LNP。標記的每個數據點代表單只食蟹猴，每個LNP和劑量組合測試一隻或兩隻食蟹猴。
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Claims (172)

  1. 一種用於將一種或多種核酸靶向遞送至造血幹細胞（HSC）中的脂質奈米粒子（LNP），其中所述LNP包含： (a) 脂質-抗體接合物，其包含式 (I) 的化合物： [脂質] - [任選的連接子] - [抗體] (I)， 其中所述抗體結合CD105和/或CD117； (b) 可電離陽離子脂質，其包含： i. 式 (II’) 的化合物： (II’)， 或其鹽，其中： R 1、R 2和R 3各自獨立地是鍵或C 1-3伸烷基； R 1A、R 2A和R 3A各自獨立地是鍵或C 1-10伸烷基； R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2、R 2A3、R 3A1、R 3A2和R 3A3各自獨立地是H、C 1-20烷基、C 1-20烯基、-(CH 2) 0-10C(O)OR a1或(CH 2) 0-10OC(O)R a2； R a1和R a2各自獨立地是C 1-20烷基或C 1-20烯基； R 3B是 ； R 3B1是C 1-6伸烷基；並且 R 3B2和R 3B3各自獨立地是H或任選地被一個或多個各自獨立地選自由-OH和-O-(C 1-6烷基)組成之群組的取代基取代的C 1-6烷基；或 ii. 具有以下結構的化合物： 或其鹽；以及 (c) 佈置於所述LNP中的一種或多種核酸。
  2. 如請求項1所述的LNP，其中所述LNP包含兩種含有式 (I) 的化合物的脂質-抗體接合物，其中第一脂質-抗體接合物和第二脂質-抗體接合物相同或不同。
  3. 如請求項1或請求項2所述的LNP，其中所述抗體包含抗體重鏈可變區（VH）和抗體輕鏈可變區（VL），其中： (a) 所述抗體結合CD117，並且其中 (i) 所述VH包含含有FTFSNYAMS（SEQ ID NO: 1）的胺基酸序列的CDR-H1、含有AISGSGGSTYYADSVKG（SEQ ID NO: 2）的胺基酸序列的CDR-H2以及含有AKGPPTYHTNYYYMDV（SEQ ID NO: 3）的胺基酸序列的CDR-H3，並且 (ii) 所述VL包含含有RASQGISSWLA（SEQ ID NO: 4）的胺基酸序列的CDR-L1、含有AASSLQS（SEQ ID NO: 5）的胺基酸序列的CDR-L2以及含有QQTNSFPYT（SEQ ID NO: 6）的胺基酸序列的CDR-L3； (b) 所述抗體結合CD117，並且其中 (i) 所述VH包含含有FTFSDADMD（SEQ ID NO: 10）的胺基酸序列的CDR-H1、含有RTRNKAGSYTTEYAASVKG（SEQ ID NO: 11）的胺基酸序列的CDR-H2以及含有AREPKYWIDFDL（SEQ ID NO: 12）的胺基酸序列的CDR-H3，並且 (ii) 所述VL包含含有RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 13）的胺基酸序列的CDR-L1、含有AASSLQS（SEQ ID NO: 14）的胺基酸序列的CDR-L2以及含有QQSYIAPYT（SEQ ID NO: 15）的胺基酸序列的CDR-L3；或 (c) 所述抗體結合CD105，並且其中 (i) 所述VH包含含有DAWMD（SEQ ID NO: 19）的胺基酸序列的CDR-H1、含有EIRSKASNHATYYAESVKG（SEQ ID NO: 20）的胺基酸序列的CDR-H2以及含有WRRFFDS（SEQ ID NO: 21）的胺基酸序列的CDR-H3，並且 (ii) 所述VL包含含有RASSSVSYMH（SEQ ID NO: 22）的胺基酸序列的CDR-L1、含有ATSNLAS（SEQ ID NO: 23）的胺基酸序列的CDR-L2以及含有QQWSSNPLT（SEQ ID NO: 24）的胺基酸序列的CDR-L3。
  4. 如請求項1-3中任一項所述的LNP，其中所述抗體結合CD117並且包含抗體重鏈可變區（VH）和抗體輕鏈可變區（VL），其中 (a) 所述VH包含含有FTFSNYAMS（SEQ ID NO: 1）的胺基酸序列的CDR-H1、含有AISGSGGSTYYADSVKG（SEQ ID NO: 2）的胺基酸序列的CDR-H2以及含有AKGPPTYHTNYYYMDV（SEQ ID NO: 3）的胺基酸序列的CDR-H3，並且 (b) 所述VL包含含有RASQGISSWLA（SEQ ID NO: 4）的胺基酸序列的CDR-L1、含有AASSLQS（SEQ ID NO: 5）的胺基酸序列的CDR-L2以及含有QQTNSFPYT（SEQ ID NO: 6）的胺基酸序列的CDR-L3。
  5. 如請求項1-3中任一項所述的LNP，其中所述抗體結合CD117並且包含抗體重鏈可變區（VH）和抗體輕鏈可變區（VL），其中 (a) 所述VH包含含有FTFSDADMD（SEQ ID NO: 10）的胺基酸序列的CDR-H1、含有RTRNKAGSYTTEYAASVKG（SEQ ID NO: 11）的胺基酸序列的CDR-H2以及含有AREPKYWIDFDL（SEQ ID NO: 12）的胺基酸序列的CDR-H3，並且 (b) 所述VL包含含有RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 13）的胺基酸序列的CDR-L1、含有AASSLQS（SEQ ID NO: 14）的胺基酸序列的CDR-L2以及含有QQSYIAPYT（SEQ ID NO: 15）的胺基酸序列的CDR-L3。
  6. 如請求項1-3中任一項所述的LNP，其中所述抗體結合CD105並且包含抗體重鏈可變區（VH）和抗體輕鏈可變區（VL），其中 (a) 所述VH包含含有DAWMD（SEQ ID NO: 19）的胺基酸序列的CDR-H1、含有EIRSKASNHATYYAESVKG（SEQ ID NO: 20）的胺基酸序列的CDR-H2以及含有WRRFFDS（SEQ ID NO: 21）的胺基酸序列的CDR-H3，並且 (b) 所述VL包含含有RASSSVSYMH（SEQ ID NO: 22）的胺基酸序列的CDR-L1、含有ATSNLAS（SEQ ID NO: 23）的胺基酸序列的CDR-L2以及含有QQWSSNPLT（SEQ ID NO: 24）的胺基酸序列的CDR-L3。
  7. 如請求項1-6中任一項所述的LNP，其中所述抗體包含抗體重鏈可變區（VH）和抗體輕鏈可變區（VL），其中 (a) 所述抗體結合CD117，並且其中所述VH包含SEQ ID NO: 7的胺基酸序列，並且所述VL包含SEQ ID NO: 8的胺基酸序列； (b) 所述抗體結合CD117，並且其中所述VH包含SEQ ID NO: 16的胺基酸序列，並且所述VL包含SEQ ID NO: 17的胺基酸序列；或 (c) 所述抗體結合CD105，並且其中所述VH包含SEQ ID NO: 25的胺基酸序列，並且所述VL包含SEQ ID NO: 26的胺基酸序列。
  8. 如請求項1-3中任一項所述的LNP，其中所述抗體結合CD117並且包含抗體重鏈可變區（VH）和抗體輕鏈可變區（VL），其中所述VH包含SEQ ID NO: 7的胺基酸序列並且所述VL包含SEQ ID NO: 8的胺基酸序列。
  9. 如請求項1-3中任一項所述的LNP，其中所述抗體結合CD117並且包含抗體重鏈可變區（VH）和抗體輕鏈可變區（VL），其中所述VH包含SEQ ID NO: 16的胺基酸序列並且所述VL包含SEQ ID NO: 17的胺基酸序列。
  10. 如請求項1-3中任一項所述的LNP，其中所述抗體結合CD105並且包含抗體重鏈可變區（VH）和抗體輕鏈可變區（VL），其中所述VH包含SEQ ID NO: 25的胺基酸序列並且所述VL包含SEQ ID NO: 26的胺基酸序列。
  11. 如請求項1-10中任一項所述的LNP，其中所述抗體包括Fab、F(ab')2、Fab'-SH、Fv、scFv片段或免疫球蛋白單可變結構域。
  12. 如請求項1-11中任一項所述的LNP，其中所述抗體包含Fab。
  13. 如請求項12所述的LNP，其中所述Fab包含重鏈結構域和輕鏈結構域，並且其中 (a) 所述Fab的重鏈和輕鏈結構域包含SEQ ID NO: 9和38所示的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 9和38所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%序列同一性； (b) 所述Fab的重鏈和輕鏈結構域包含SEQ ID NO: 18和39所示的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 18和39所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%序列同一性；或 (c) 所述Fab的重鏈和輕鏈結構域包含SEQ ID NO: 27和40所示的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 27和40所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%序列同一性。
  14. 如請求項12所述的LNP，其中所述Fab包含重鏈結構域和輕鏈結構域，並且其中所述Fab的重鏈和輕鏈結構域包含SEQ ID NO: 9和38所示的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 9和38所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%序列同一性。
  15. 如請求項12所述的LNP，其中所述Fab包含重鏈結構域和輕鏈結構域，並且其中所述Fab的重鏈和輕鏈結構域包含SEQ ID NO: 18和39所示的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 18和39所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%序列同一性。
  16. 如請求項12所述的LNP，其中所述Fab包含重鏈結構域和輕鏈結構域，並且其中所述Fab的重鏈和輕鏈結構域包含SEQ ID NO: 27和40所示的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 27和40所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%序列同一性。
  17. 如請求項12-16中任一項所述的LNP，其中所述Fab包含重鏈結構域和輕鏈結構域，並且其中所述重鏈結構域、所述輕鏈結構域或兩者在C末端包含半胱胺酸殘基。
  18. 如請求項1-17中任一項所述的LNP，其中所述抗體包含Fc結構域。
  19. 如請求項11-18中任一項所述的LNP，其中所述Fab在C末端缺乏天然鏈間二硫鍵。
  20. 如請求項11-19中任一項所述的LNP，其中所述Fab被工程化以用非半胱胺酸胺基酸替換天然恒定輕鏈和天然恒定重鏈上的形成天然鏈間二硫鍵的一個或兩個半胱胺酸，從而去除所述Fab中的天然鏈間二硫鍵。
  21. 如請求項11-20中任一項所述的LNP，其中所述Fab包含含有C233S取代的重鏈片段和含有C214S取代的輕鏈片段，根據Kabat編號。
  22. 如請求項11-21中任一項所述的LNP，其中所述Fab具有非天然鏈間二硫鍵。
  23. 如請求項11-22中任一項所述的LNP，其中所述Fab具有工程化的包埋的鏈間二硫鍵。
  24. 如請求項11-23中任一項所述的LNP，其中所述Fab在重鏈片段中包含F174C取代，並且在輕鏈片段中包含S176C取代，根據Kabat編號。
  25. 如請求項11-24中任一項所述的LNP，其中所述Fab在重鏈或輕鏈片段的C末端包含半胱胺酸。
  26. 如請求項11-25中任一項所述的LNP，其中所述Fab還包含在所述Fab的重鏈片段與所述C末端半胱胺酸之間的一個或多個胺基酸。
  27. 如請求項1-26中任一項所述的LNP，其中所述抗體包含免疫球蛋白單可變（ISV）結構域。
  28. 如請求項27所述的LNP，其中所述ISV結構域是Nanobody®ISV結構域。
  29. 如請求項27或28所述的LNP，其中所述免疫球蛋白單可變結構域在C末端包含半胱胺酸。
  30. 如請求項27-29中任一項所述的LNP，其中所述抗體包含兩個或更多個VHH結構域。
  31. 如請求項27-30中任一項所述的LNP，其中所述免疫球蛋白單可變結構域包含VHH結構域，並且還包含間隔子，所述間隔子包含在所述VHH結構域與所述C末端半胱胺酸之間的一個或多個胺基酸。
  32. 如請求項27-31中任一項所述的LNP，其中所述兩個或更多個VHH結構域通過胺基酸間隔子連接。
  33. 如請求項27-32中任一項所述的LNP，其中所述抗體包含與抗體CH1結構域連接的第一VHH結構域和與抗體輕鏈恒定結構域連接的第二VHH結構域。
  34. 如請求項27-33中任一項所述的LNP，其中所述抗體CH1結構域和所述抗體輕鏈恒定結構域通過一個或多個二硫鍵連接。
  35. 如請求項27-34中任一項所述的LNP，其中所述CH1結構域包含F174C和C233S取代，並且所述輕鏈恒定結構域包含S176C和C214S取代，根據Kabat編號。
  36. 如請求項1-35中任一項所述的LNP，其中所述抗體包含具有胺基酸序列AAA或具有SEQ ID NO: 45-60中任一個所示的胺基酸序列的胺基酸間隔子或連接子。
  37. 如請求項1-36中任一項所述的LNP，其中所述抗體包括雙特異性抗體。
  38. 如請求項1-37中任一項所述的LNP，其中所述一種或多種核酸是DNA或RNA。
  39. 如請求項38所述的LNP，其中所述RNA是mRNA。
  40. 如請求項1-39中任一項所述的LNP，其中所述一種或多種核酸包括編碼定點核酸酶、化學鹼基編輯器、先導編輯器或表觀基因組編輯器的mRNA。
  41. 如請求項1-40中任一項所述的LNP，其中所述一種或多種核酸包括編碼定點核酸酶的mRNA。
  42. 如請求項41所述的LNP，其中所述定點核酸酶是CRISPR相關（Cas）核酸酶、鋅指核酸酶（ZFN）、轉錄啟動因子樣效應物核酸酶（TALEN）或megaTAL。
  43. 如請求項41或請求項42所述的LNP，其中所述定點核酸酶是包含賦予與靶核苷酸序列的結合的胺基酸序列的Cas核酸酶、ZFN、TALEN或megaTAL。
  44. 如請求項1-43中任一項所述的LNP，其中所述一種或多種核酸包括 (a) 編碼CRISPR相關（Cas）核酸酶或化學鹼基編輯器的mRNA；和 (b) 包含賦予與靶核苷酸序列的結合的核苷酸序列的指導RNA（gRNA）。
  45. 如請求項1-43中任一項所述的LNP，其中所述一種或多種核酸包括 (a) 編碼先導編輯器的mRNA；和 (b) 包含賦予與靶核苷酸序列的結合的核苷酸序列的先導編輯指導RNA（pegRNA）。
  46. 如請求項44或請求項45所述的LNP，其中所述Cas核酸酶是II型或V型Cas酶或其變體。
  47. 如請求項44-46中任一項所述的LNP，其中所述Cas核酸酶是Cas9酶、Cas12酶、CasX酶、Cas14酶或其變體。
  48. 如請求項44-47中任一項所述的LNP，其中所述gRNA或pegRNA包含與所述靶核苷酸序列的至少15個連續核苷酸具有至少80%同一性的序列。
  49. 如請求項1-48中任一項所述的LNP，其中所述一種或多種核酸還包括供體範本核酸，所述供體範本核酸包含與所述靶核苷酸序列的至少15個連續核苷酸具有至少80%同一性的序列。
  50. 如請求項1-49中任一項所述的LNP，其中所述靶核苷酸序列包含至少15個連續核苷酸並且位於 a) 基因的編碼區； b) 與基因相關的內含子區； c) 與基因相關的外顯子區； d) 與基因相關的5'非轉譯區；或 e) 與基因相關的3'非轉譯區； 其中所述基因選自由以下組成之群組： HBB、 HBG1、 HBG2、 HBA1、 HBA2、 HBD、 BCL11A、 BACH2、 KLF1、 LRF、 ADA、 DCLREIC、 IL2RG、 RAG1、 RAG2、 JAK3、 BTK、 WAS、 F8、 F9、 F11、 F10、 PKLR、 RPS19、 CYBA、 CYBB、 NCF1、 NCF1B、 NCF1C、 NCF2、 NCF4、 ELANE、 ABCD1、 ARSA、 FXN、 GBA、 IDS、 IDUA、 TCIRG、 AICDA、 UNG、 CD40、 CD40LG、 FOXP3、 IL4、 IL10、 IL13、 IL7R、 PRF1、 FANCA、 FANCB、 FANCC、 FANCD1/BRACA2、 FANCD2、 MPL、 CCR5、 CXCR4、 F5、 F2、抗凝血酶III基因和蛋白C基因。
  51. 如請求項1-50中任一項所述的LNP，其中所述靶核苷酸序列位於選自由以下組成之群組的基因的調節區內，任選地位於強化子區或抑制子區內： HBB、 HBG1、 HBG2、 HBA1、 HBA2、 HBD、 BCL11A、 BACH2、 KLF1、 LRF、 ADA、 DCLREIC、 IL2RG、 RAG1、 RAG2、 JAK3、 BTK、 WAS、 F8、 F9、 F11、 F10、 PKLR、 RPS19、 CYBA、 CYBB、 NCF1、 NCF1B、 NCF1C、 NCF2、 NCF4、 ELANE、 ABCD1、 ARSA、 FXN、 GBA、 IDS、 IDUA、 TCIRG、 AICDA、 UNG、 CD40、 CD40LG、 FOXP3、 IL4、 IL10、 IL13、 IL7R、 PRF1、 FANCA、 FANCB、 FANCC、 FANCD1/BRACA2、 FANCD2、 MPL、 CCR5、 CXCR4、 F5、 F2、抗凝血酶III基因和蛋白C基因。
  52. 如請求項1-51中任一項所述的LNP，其中所述靶核苷酸序列在 BCL11A紅系細胞強化子內。
  53. 如請求項1-52中任一項所述的LNP，其中所述可電離陽離子脂質包含式 (II') 的化合物。
  54. 如請求項53所述的LNP，其中R 3B2和R 3B3各自獨立地是H或任選地被一個或多個各自獨立地選自由-OH和-O-(C 1-6烷基)的取代基取代的C 1-6烷基。
  55. 如請求項53或請求項54所述的LNP，其中R 3B2和R 3B3各自獨立地是甲基或乙基，其各自任選地被一個或多個-OH取代。
  56. 如請求項55所述的LNP，其中R 3B2和R 3B3各自是未取代的甲基。
  57. 如請求項55所述的LNP，其中 是 、 、 、 或 。
  58. 如請求項57所述的LNP，其中 是 。
  59. 如請求項5-58中任一項所述的LNP，其中R 1、R 2和R 3各自獨立地是鍵或伸甲基。
  60. 如請求項53-59中任一項所述的LNP，其中R 1和R 2各自是伸甲基並且R 3是鍵。
  61. 如請求項53-60中任一項所述的LNP，其中所述可電離陽離子脂質是式 (IIb) 的化合物： (IIb)。
  62. 如請求項53-61中任一項所述的LNP，其中R 1A、R 2A和R 3A各自獨立地是鍵或-(CH 2) 1-10-。
  63. 如請求項53-62中任一項所述的LNP，其中R 1A和R 2A各自獨立地是鍵、-CH 2-、-(CH 2) 2-、-(CH 2) 3-、-(CH 2) 4-、-(CH 2) 5-、-(CH 2) 6-、-(CH 2) 7-或-(CH 2) 8-。
  64. 如請求項53-63中任一項所述的LNP，其中R 1A和R 2A各自獨立地是鍵、-(CH 2) 2-、-(CH 2) 4-、-(CH 2) 6-、-(CH 2) 7-或-(CH 2) 8-。
  65. 如請求項53-64中任一項所述的LNP，其中R 3A是鍵、-CH 2-、-(CH 2) 2-或-(CH 2) 7-。
  66. 如請求項53-65中任一項所述的LNP，其中R 1A1、R 1A2、R 1A3、R 2A1、R 2A2和R 2A3各自獨立地是H、C 1-15烷基、-CH=CH-( 1-15烷基)、-CH=CH-CH 2-CH=CH-(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)、-(CH 2) 0-4OC(O)CH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-15烷基)或-(CH 2) 0-4OC(O)CH 2( 1-15烷基)。
  67. 如請求項53-66中任一項所述的LNP，其中R 1A1和R 2A1各自獨立地是-CH=CH-(C 1-15烷基)、-CH=CH-CH 2-CH=CH-(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)或-(CH 2) 0-4OC(O)CH(C 1-10烷基)(C 1-15烷基)；並且R 1A2、R 1A3、R 2A2和R 2A3各自是H。
  68. 如請求項53-67中任一項所述的LNP，其中R 1A1和R 2A1各自是 、 、 、 、 、 或 。
  69. 如請求項53-68中任一項所述的LNP，其中R 1A1和R 2A1各自是 。
  70. 如請求項53-69中任一項所述的LNP，其中R 3A1、R 3A2和R 3A3各自獨立地是H、C 1-15烷基、-(CH 2) 0-4C(O)OCH(C 1-5烷基)(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4OC(O)CH(C 1-5烷基)(C 1-10烷基)、-(CH 2) 0-4C(O)OCH 2(C 1-10烷基)或-(CH 2) 0-4OC(O)CH 2(C 1-10烷基)。
  71. 如請求項53-70中任一項所述的LNP，其中R 3A1和R 3A2各自獨立地是C 1-15烷基；並且R 3A3是H。
  72. 如請求項53-71中任一項所述的LNP，其中R 3A1和R 3A2各自獨立地是乙基、丙基、 、 、 或 。
  73. 如請求項53-72中任一項所述的LNP，其中R 3A1是丙基並且R 3A2是 。
  74. 如請求項53-73中任一項所述的LNP，其中所述可電離陽離子脂質是 。
  75. 如請求項53-73中任一項所述的LNP，其中所述可電離陽離子脂質是 。
  76. 如請求項53-73中任一項所述的LNP，其中所述可電離陽離子脂質是 。
  77. 如請求項53-73中任一項所述的LNP，其中所述可電離陽離子脂質包含具有以下結構的化合物 。
  78. 如請求項1-77中任一項所述的LNP，其中所述抗體經由含有聚乙二醇（PEG）的連接子與所述LNP中的脂質共價接合。
  79. 如請求項78所述的LNP，其中經由含有PEG的連接子與所述抗體共價接合的脂質是二硬脂醯甘油（DSG）、二硬脂醯磷脂醯乙醇胺（DSPE）、二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（DMPE）、二硬脂醯-甘油-磷酸甘油（DSPG）、二肉豆蔻醯-甘油（DMG）、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺（DPPE）、二棕櫚醯-甘油（DPG）或神經醯胺。
  80. 如請求項78和請求項79所述的LNP，其中所述PEG是PEG 2000或PEG 3400。
  81. 如請求項1-80中任一項所述的LNP，其中所述脂質抗體接合物包含[DSPE]-[PEG(2000)-馬來醯亞胺]-[抗hCD117 Fab]，其中所述[DSPE] -[PEG(2000)-馬來醯亞胺]經由所述馬來醯亞胺基團與所述抗hCD117 Fab的重鏈（HC）中的C末端半胱胺酸之間的共價接合與所述抗hCD117 Fab接合。
  82. 如請求項1-80中任一項所述的LNP，其中所述脂質抗體接合物包含[DSPE]-[PEG(2000)-馬來醯亞胺]-[抗hCD105 Fab]，其中所述[DSPE] -[PEG(2000)-馬來醯亞胺]經由所述馬來醯亞胺基團與所述抗hCD105 Fab的重鏈（HC）中的C末端半胱胺酸之間的共價接合與所述抗hCD105 Fab接合。
  83. 如請求項81或82所述的LNP，其中所述可電離陽離子脂質是 。
  84. 如請求項81-83中任一項所述的LNP，其中所述LNP還包含DSPE-PEG(2000)-馬來醯亞胺（以半胱胺酸終止）和DSPE-PEG-OCH 3。
  85. 如請求項1-84中任一項所述的LNP，其中所述脂質-抗體接合物以0.001至0.5莫耳百分比的範圍存在於所述LNP中。
  86. 如請求項1-85中任一項所述的LNP，其中所述脂質-抗體接合物以0.002-0.2莫耳百分比的範圍存在於所述LNP中。
  87. 如請求項1-86中任一項所述的LNP，其中所述LNP還包含結構脂質、中性磷脂和游離PEG-脂質中的一種或多種。
  88. 如請求項87所述的LNP，其中所述結構脂質是固醇。
  89. 如請求項88所述的LNP，其中所述固醇是膽固醇。
  90. 如請求項1-89中任一項所述的LNP，其中所述可電離陽離子脂質以30-70莫耳百分比的範圍存在於所述LNP中。
  91. 如請求項1-90中任一項所述的LNP，其中所述可電離陽離子脂質以40-60莫耳百分比的範圍存在於所述LNP中。
  92. 如請求項88-91中任一項所述的LNP，其中所述固醇以20-70莫耳百分比的範圍存在於所述LNP中。
  93. 如請求項88-92中任一項所述的LNP，其中所述固醇以30-50莫耳百分比的範圍存在於所述LNP中。
  94. 如請求項87所述的LNP，其中所述中性磷脂選自由以下組成之群組：磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、二硬脂醯-sn甘油-3-磷酸乙醇胺（DSPE）、1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DSPC）、1,2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）、1,2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DOPC）和鞘磷脂。
  95. 如請求項87或請求項94所述的LNP，其中所述中性磷脂以5-15莫耳百分比的範圍存在於所述LNP中。
  96. 如請求項87所述的LNP，其中所述游離PEG-脂質選自由以下組成之群組：PEG修飾的磷脂醯乙醇胺、PEG修飾的磷脂酸、PEG修飾的神經醯胺、PEG修飾的二烷基胺、PEG修飾的二醯基甘油和PEG修飾的二烷基甘油。
  97. 如請求項87或請求項96所述的LNP，其中所述游離PEG-脂質包括PEG-二油醯甘油（PEG-DOG）、PEG-二肉豆蔻醯-甘油（PEG-DMG）、PEG-二棕櫚醯甘油（PEG-DPG）、PEG-二亞油醯-甘油-磷脂醯乙醇胺（PEG-DLPE）、PEG-二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DMPE）、PEG-二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺（PEG-DPPE）、PEG-二硬脂醯甘油（PEG-DSG）、N-棕櫚醯-鞘胺醇-1-{琥珀醯[甲氧基(聚乙二醇)]（PEG-神經醯胺）、PEG-二硬脂醯-甘油-磷酸甘油（PEG-DSPG）、PEG-二油醯-甘油磷酸乙醇胺（PEG-DOPE）、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-雙十四烷基乙醯胺、PEG-二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺（PEG-DSPE）或其衍生物。
  98. 如請求項87、96和97中任一項所述的LNP，其中所述游離PEG-脂質包括二醯基磷脂醯乙醇胺，其包含二棕櫚醯（C16）鏈或二硬脂醯（C18）鏈，並且任選地所述游離PEG-脂質包括PEG-DPG和PEG-DMG。
  99. 如請求項87和96-98中任一項所述的LNP，其中所述游離PEG-脂質以1-4莫耳百分比的範圍存在於所述LNP中。
  100. 如請求項87和96-99中任一項所述的LNP，其中所述游離PEG-脂質包含與所述脂質-抗體接合物中的脂質相同或不同的脂質。
  101. 如請求項87和96-100中任一項所述的LNP，其中所述游離PEG-脂質包含具有至少2000道爾頓的分子量的PEG。
  102. 如請求項92所述的LNP，其中所述PEG具有約3000至5000道爾頓的分子量。
  103. 如請求項1-102中任一項所述的LNP，其中所述LNP具有在50-200 nm範圍內的平均直徑。
  104. 如請求項1-103中任一項所述的LNP，其中所述LNP具有約100 nm的平均直徑。
  105. 如請求項1-104中任一項所述的LNP，其中所述LNP具有在0.05至1範圍內的多分散性指數。
  106. 如請求項1-105中任一項所述的LNP，其中所述LNP在pH 5下具有從約+10 mV至約+30 mV的ζ電位。
  107. 如請求項1-105中任一項所述的LNP，其中所述LNP在pH 7.4下具有從約-30 mV至約5 mV的ζ電位。
  108. 如請求項87-107中任一項所述的LNP，其中所述LNP包含： (a) 所述可電離陽離子脂質； (b) 所述脂質-抗體接合物，其包含下式的化合物： [脂質] - [任選的連接子] - [抗體]， 其中所述抗體結合CD105和/或CD117； (c) 固醇或其他結構脂質； (d) 中性磷脂； (e) 游離聚乙二醇（PEG）脂質；以及 (f) 所述一種或多種核酸。
  109. 一種將核酸的遞送靶向至受試者的任選地離體或體內的造血幹細胞（HSC）的方法，所述方法包括向所述受試者投予如請求項1-108中任一項所述的LNP，其中所述LNP包含所述核酸。
  110. 如請求項109所述的方法，其中所述方法還包括向所述受試者投予HSC動員劑，並且其中向所述受試者靜脈內投予所述LNP。
  111. 如請求項110所述的方法，其中在投予所述LNP之前、期間或者之前和期間向所述受試者投予所述HSC動員劑。
  112. 如請求項110或請求項111所述的方法，其中所述HSC動員劑包括普樂沙福、粒細胞集落刺激因子（G-CSF）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）或其任何組合。
  113. 如請求項110-112中任一項所述的方法，其中所述HSC動員劑包括普樂沙福和G-CSF。
  114. 一種對受試者的任選地離體或體內的造血幹細胞（HSC）進行遺傳修飾的方法，所述方法包括向所述受試者投予如請求項1-108中任一項所述的LNP，其中佈置於所述LNP中的所述一種或多種核酸包括編碼定點核酸酶、化學鹼基編輯器、先導編輯器或表觀基因組編輯器的mRNA。
  115. 一種治療有需要的受試者的疾病的方法，所述方法包括向所述受試者投予如請求項1-108中任一項所述的LNP，其中佈置於所述LNP中的所述一種或多種核酸包括編碼定點核酸酶、化學鹼基編輯器、先導編輯器或表觀基因組編輯器的序列，任選地mRNA。
  116. 如請求項114或請求項115所述的方法，其中所述方法還包括向所述受試者投予HSC動員劑，並且其中向所述受試者靜脈內投予所述LNP。
  117. 如請求項116所述的方法，其中在投予所述LNP之前、期間或者之前和期間向所述受試者投予所述HSC動員劑。
  118. 如請求項116或請求項117所述的方法，其中所述HSC動員劑包括普樂沙福、粒細胞集落刺激因子（G-CSF）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）或其任何組合。
  119. 如請求項116-118中任一項所述的方法，其中所述HSC動員劑包括普樂沙福和G-CSF。
  120. 如請求項115-119中任一項所述的方法，其中所述疾病是血液疾病。
  121. 如請求項115-119中任一項所述的方法，其中所述疾病是血紅蛋白病、原發性免疫缺陷（PID）、先天性血球減少、血友病、血栓形成傾向、先天性代謝缺陷、神經病或病毒性疾病。
  122. 如請求項121所述的方法，其中所述疾病是α-血紅蛋白病或β-血紅蛋白病。
  123. 如請求項121或請求項122所述的方法，其中所述β-血紅蛋白病是β-地中海貧血或鐮狀細胞病。
  124. 如請求項121-123中任一項所述的方法，其中所述LNP的投予導致以下中的一項或多項： (a) HBB轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中； (b) 所述受試者中β-球蛋白的表現增加； (c) 所述受試者中α 2β 2成人血紅蛋白（HbA）的量增加； (d) HBG1轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中； (e) HBG2轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中； (f) 所述受試者中γ-球蛋白的表現增加； (g) 所述受試者中α 2γ 2胎兒血紅蛋白（HbF）的量增加； (h) 所述 HBA1基因、所述 HBA2基因或其組合在所述受試者的至少一個HSC中遭到破壞； (i) 所述受試者中α-球蛋白的表現降低；以及 (j) 所述受試者中α 4α-球蛋白異四聚體的量減少。
  125. 如請求項121所述的方法，其中所述疾病是PID。
  126. 如請求項125所述的方法，其中所述PID是重症聯合免疫缺陷（SCID）、威斯科特-奧爾德里奇症候群、慢性肉芽腫病、X連鎖多內分泌腺病腸病伴免疫失調（IPEX）、高IgM症候群或X連鎖無丙種球蛋白血症。
  127. 如請求項126所述的方法，其中所述PID是SCID。
  128. 如請求項127所述的方法，其中所述SCID是Artemis-SCID（ART-SCID）、重組啟動基因SCID（RAG-SCID）、X連鎖SCID（X-SCID）、腺苷脫胺酶缺乏型SCID、白介素7受體缺陷型SCID或JAK3 SCID。
  129. 如請求項128所述的方法，其中所述SCID是ART-SCID，並且其中投予所述LNP導致 DCLREIC轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，所述受試者中功能性Artemis蛋白的表現增加，或其組合。
  130. 如請求項128所述的方法，其中所述SCID是RAG-SCID，並且其中投予所述LNP導致 RAG1轉基因或 RAG2轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，所述受試者中功能性RAG1蛋白或RAG2蛋白的表現增加，或其組合。
  131. 如請求項128所述的方法，其中所述SCID是X-SCID，並且其中投予所述LNP導致 IL2RG轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，所述受試者中功能性IL2RG蛋白的表現增加，或其組合。
  132. 如請求項125或請求項126所述的方法，其中所述PID是威斯科特-奧爾德里奇症候群。
  133. 如請求項132所述的方法，其中所述PID是威斯科特-奧爾德里奇症候群，並且其中投予所述LNP導致 WAS轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，所述受試者中功能性WASP蛋白表現的表現增加，或其組合。
  134. 如請求項125或請求項126所述的方法，其中所述PID是慢性肉芽腫病。
  135. 如請求項125、126和134中任一項所述的方法，其中所述PID是X連鎖慢性肉芽腫病。
  136. 如請求項125、126和134中任一項所述的方法，其中所述PID是慢性肉芽腫病，並且其中所述LNP的投予導致以下中的一項或多項： (a) CYBA轉基因、 CYBB轉基因、 NCF1轉基因、 NCF2轉基因或 NCF4轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中； (b) 在所述受試者的至少一個HSC的 CYBB基因中引入點676C＞T點突變； (c) 所述受試者中功能性CYBA蛋白、CYBB蛋白、NCF1蛋白、NCF2蛋白或NCF4蛋白的表現增加；以及 (d) 所述受試者中功能性NADPH氧化酶複合物的量增加。
  137. 如請求項125和126中任一項所述的方法，其中所述PID是IPEX。
  138. 如請求項125、126和137中任一項所述的方法，其中所述PID是IPEX，並且其中投予所述LNP導致 FOXP3轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，所述受試者中功能性FOXP3蛋白的表現增加，或其組合。
  139. 如請求項125和126中任一項所述的方法，其中所述PID是高IgM症候群。
  140. 如請求項125、126和139中任一項所述的方法，其中所述PID是高IgM症候群，並且其中所述LNP的投予導致以下中的一項或多項： (a) AICDA轉基因、 UNG轉基因、 CD40轉基因或 CD40LG轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中； (b) 所述受試者中功能性AICDA蛋白、UNG蛋白、CD40蛋白或CD40LG蛋白的表現增加； (c) 所述受試者中IgM抗體的量減少；以及 (d) 所述受試者中IgG、IgA或IgE抗體的量增加。
  141. 如請求項121所述的方法，其中所述疾病是先天性血球減少。
  142. 如請求項141所述的方法，其中所述先天性血球減少是範可尼貧血、施瓦赫曼-戴蒙德症候群、布萊克梵-戴蒙德貧血、先天性角化不良、先天性無巨核細胞血小板減少症或網狀組織發育不全。
  143. 如請求項141或請求項142所述的方法，其中所述先天性血球減少是範可尼貧血，並且其中投予所述LNP導致以下中的一項或多項： FANC基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，所述受試者中一種或多種功能性FANC蛋白的表現增加，或其組合。
  144. 如請求項141-143中任一項所述的方法，其中所述先天性血球減少是範可尼貧血，並且其中投予所述LNP導致 FANCA轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中，所述受試者中功能性FANCA的表現增加，或其組合。
  145. 如請求項121所述的方法，其中所述疾病是血友病。
  146. 如請求項145所述的方法，其中所述血友病是血友病A、血友病B或血友病C。
  147. 如請求項121所述的方法，其中所述疾病是血友病，並且其中所述LNP的投予導致： (a) F8轉基因、 F9轉基因或 F11或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中； (b) 所述受試者中功能性因子VIII蛋白、因子IX蛋白或因子XI蛋白的表現增加；以及 (c) 所述受試者中血液凝固增加。
  148. 如請求項121所述的方法，其中所述疾病是血栓形成傾向。
  149. 如請求項148所述的方法，其中所述血栓形成傾向是無巨核細胞血小板減少症或因子X缺乏症。
  150. 如請求項121所述的方法，其中所述疾病是血栓形成傾向，並且其中所述LNP的投予導致以下中的一項或多項： (a) F5轉基因、 F2轉基因、編碼抗凝血酶III的轉基因、編碼蛋白C的轉基因或編碼蛋白S的轉基因或其片段插入所述受試者的至少一個HSC中； (b) 所述受試者中功能性因子V蛋白、因子II蛋白、抗凝血酶III蛋白、蛋白C或蛋白S的表現增加；以及 (c) 所述受試者中血液凝固減少。
  151. 如請求項121所述的方法，其中所述疾病是先天性代謝缺陷。
  152. 如請求項151所述的方法，其中所述先天性代謝缺陷是苯丙酮尿症（PKU）、中鏈醯基輔酶A脫氫酶（MCAD）缺乏症、溶酶體貯積病、糖原貯積障礙、過氧化物酶體障礙、法布裡病、戈謝病、赫勒症候群、亨特症候群、沃爾曼病或丙酮酸激酶缺乏症。
  153. 如請求項152所述的方法，其中所述過氧化物酶體障礙是X連鎖腎上腺腦白質營養不良。
  154. 如請求項152所述的方法，其中所述溶酶體貯積病是異染性腦白質營養不良、粘多糖貯積症I或粘多糖貯積症II。
  155. 如請求項121所述的方法，其中所述疾病是神經病。
  156. 如請求項155所述的方法，其中所述神經病是弗裡德賴希共濟失調。
  157. 如請求項121所述的方法，其中所述疾病是病毒性疾病。
  158. 如請求項157所述的方法，其中所述病毒性疾病是HIV/AIDS。
  159. 如請求項157或請求項158所述的方法，其中所述病毒性疾病是HIV/AIDS，並且其中投予所述LNP預防被HIV感染、防止HIV/AIDS進展或其組合。
  160. 如請求項109-159中任一項所述的方法，其中佈置於所述LNP中的所述一種或多種核酸包括編碼定點核酸酶的mRNA。
  161. 如請求項160所述的方法，其中所述定點核酸酶是CRISPR相關（Cas）核酸酶、鋅指核酸酶（ZFN）、轉錄啟動因子樣效應物核酸酶（TALEN）或megaTAL。
  162. 如請求項160或請求項161所述的方法，其中所述定點核酸酶是包含賦予與靶核苷酸序列的結合的胺基酸序列的Cas核酸酶、ZFN、TALEN或megaTAL。
  163. 如請求項109-162中任一項所述的方法，其中佈置於所述LNP中的所述一種或多種核酸包括： (a) 編碼CRISPR相關（Cas）核酸酶或化學鹼基編輯器的mRNA；和 (b) 包含賦予與靶核苷酸序列的結合的核苷酸序列的指導RNA（gRNA）。
  164. 如請求項109-163中任一項所述的方法，其中佈置於所述LNP中的所述一種或多種核酸包括： (a) 編碼先導編輯器的mRNA；和 (b) 包含賦予與靶核苷酸序列的結合的核苷酸序列的先導編輯指導RNA（pegRNA）。
  165. 如請求項161-164中任一項所述的方法，其中所述Cas核酸酶是II型或V型Cas酶或其變體。
  166. 如請求項161-165中任一項所述的方法，其中所述Cas核酸酶是Cas9酶、Cas12酶、CasX酶或Cas 14酶或其變體。
  167. 如請求項109-166中任一項所述的方法，其中所述gRNA或pegRNA包含與所述靶核苷酸序列的至少15個連續核苷酸具有至少80%同一性的序列。
  168. 如請求項109-167中任一項所述的方法，其中佈置於所述LNP中的所述一種或多種核酸還包括供體範本核酸，所述供體範本核酸包含與所述靶核苷酸序列的至少15個連續核苷酸具有至少80%同一性的序列。
  169. 如請求項162-168中任一項所述的方法，其中所述靶核苷酸序列包含至少15個連續核苷酸並且位於 a) 基因的編碼區； b) 與基因相關的內含子區； c) 與基因相關的外顯子區； d) 與基因相關的5'非轉譯區；或 e) 與基因相關的3'非轉譯區； 其中所述基因選自 HBB 、 HBG1 、 HBG2 、 HBA1 、 HBA2 、 HBD 、 BCL11A 、 BACH2 、 KLF1 、 LRF 、 ADA 、 DCLREIC 、 IL2RG 、 RAG1 、 RAG2 、 JAK3 、 BTK 、 WAS 、 F8 、 F9 、 F11 、 F10 、 PKLR 、 RPS19 、 CYBA 、 CYBB 、 NCF1 、 NCF1B 、 NCF1C 、 NCF2 、 NCF4 、 ELANE 、 ABCD1 、 ARSA 、 FXN 、 GBA 、 IDS 、 IDUA 、 TCIRG 、 AICDA 、 UNG 、 CD40 、 CD40LG 、 FOXP3 、 IL4 、 IL10 、 IL13 、 IL7R 、 PRF1 、 FANCA 、 FANCB 、 FANCC 、 FANCD1/BRACA2 、 FANCD2 、 MPL 、 CCR5 、 CXCR4 、 F5 、 F2、抗凝血酶III基因和蛋白C基因。
  170. 如請求項162-169中任一項所述的方法，其中所述靶核苷酸序列位於選自以下的基因的調節區內，任選地位於強化子區或抑制子區內： HBB、 HBG1、 HBG2、 HBA1、 HBA2、 HBD、 BCL11A、 BACH2、 KLF1、 LRF、 ADA、 DCLREIC、 IL2RG、 RAG1、 RAG2、 JAK3、 BTK、 WAS、 F8、 F9、 F11、 F10、 PKLR、 RPS19、 CYBA、 CYBB、 NCF1、 NCF1B、 NCF1C、 NCF2、 NCF4、 ELANE、 ABCD1、 ARSA、 FXN、 GBA、 IDS、 IDUA、 TCIRG、 AICDA、 UNG、 CD40、 CD40LG、 FOXP3、 IL4、 IL10、 IL13、 IL7R、 PRF1、 FANCA、 FANCB、 FANCC、 FANCD1/BRACA2、 FANCD2、 MPL、 CCR5、 CXCR4、 F5、 F2、抗凝血酶III基因和蛋白C基因。
  171. 如請求項162-170中任一項所述的方法，其中所述靶核苷酸序列在 BCL11A紅系細胞強化子內。
  172. 如請求項109-171中任一項所述的方法，其中所述受試者是人。
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