TW202444889A - 具有錳輸入蛋白質活性受調節的重組微生物及使用該微生物用以製造ｏ－磷絲胺酸、半胱胺酸或半胱胺酸衍生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本揭露係關於一種重組微生物，在該重組微生物中，具有錳輸入活性的蛋白質之活性受調節，以及使用該微生物用以製造O-磷絲胺酸、半胱胺酸或半胱胺酸衍生物的方法。
Description
本揭露係關於一種具有錳輸入蛋白質活性受調節的重組微生物，以及使用該微生物用以製造O-磷絲胺酸、半胱胺酸或半胱胺酸衍生物的方法。
L-半胱胺酸係一種在全部活生物體中在硫代謝中發揮重要作用的胺基酸，其不僅用於合成生物蛋白質諸如毛髮角蛋白等、麩胱甘肽、生物素、甲硫胺酸及其他含硫代謝物，還用作輔酶A之生物合成的前驅物。
本領域中已知的使用微生物來製造L-半胱胺酸之方法包括：1)使用微生物將D,L-2-胺基噻唑啉-4-羧酸(D,L-ATC)生物地轉化為L-半胱胺酸之方法，2)藉由使用大腸桿菌(E.coli)的直接醱酵來製造L-半胱胺酸之方法(EP0885962B；Wada M and Takagi H,Appl.Microbiol.Biochem.,73：48-54,2006)，
及3)藉由使用微生物醱酵來製造O-磷絲胺酸(後文稱為「OPS」)，然後藉由使O-磷絲胺酸與硫化物O-硫絲胺酸硫化氫解酶(後文稱為「OPSS」)之催化作用下反應而將O-磷絲胺酸轉化為L-半胱胺酸之方法(US 8557549 B2)等等。
特別地，為了藉由方法3)以高收率製造半胱胺酸，應以過量製造前驅物OPS。
本揭露之技術問題係提供一種重組微生物，在該重組微生物中，具有錳輸入活性的蛋白質之活性受調節，以及使用該微生物用以製造O-磷絲胺酸、半胱胺酸及半胱胺酸衍生物的方法。
本揭露之一個目的係提供一種製造O-磷絲胺酸之重組微生物，在該重組微生物中，與內源性活性相比，MntH蛋白之活性經增強。
本揭露之另一目的係提供使用本揭露之製造O-磷絲胺酸蛋白之重組微生物製造O-磷絲胺酸之方法。
本揭露之又一目的係提供使用本揭露之製造O-磷絲胺酸蛋白之重組微生物製造半胱胺酸或半胱胺酸衍生物之方法。
當使用本揭露之製造O-磷絲胺酸之重組微生物(在該重組微生物中，與內源性活性相比，MntH蛋白之活性經增強)來製造O-磷絲胺酸時，與在使用現有未經修飾之菌株時相比，可以以高收率製造O-磷絲胺酸。
本揭露將詳細揭示如下。同時，本文揭露之各說明及實施方案可分別應用於其他說明及實施方案。換言之，本文所揭露之各種元件的全部組合落入本揭露之範疇內。再者，本揭露之範疇並不為下揭之具體說明所限。此外，本說明書通篇業經引用大量論文及專利檔案。所引用之論文及專利檔案的內容藉由引用以其整體併入本文，且本揭露所屬之技術領域水準及本揭露之內容將予以更明確地說明。
本揭露之一個方面提供一種製造O-磷絲胺酸之重組微生物，在該重組微生物中，與內源性活性相比，MntH蛋白之活性經增強。
如本文所用，術語「O-磷絲胺酸(後文稱為「OPS」)」指代一種絲胺酸之磷酸酯，其充當多種蛋白質之構建組分。OPS係L-半胱胺酸之前驅物且可藉由與硫化物在OPS硫化氫解酶(後文稱為「OPSS」)之催化作用下反應而經轉化為半胱胺酸，但不限於此(US 2012-0190081 A1)。
如本文所用，術語「MntH蛋白」係一種具有二價離子轉運蛋白活性的蛋白質，其係經分類到NRAMP家族中，且在一個示例中，其可係Mn2+攝取NRAMP。如本文所用，術語「Mn2+攝取NRAMP(天然抗性相關巨噬細胞蛋白)轉運蛋白(MntH)」指代具有Mn2+/Fe2+：H+同向運輸蛋白之活性的蛋白質，且具有將錳(Mn)輸入到細胞中的活性。
MntH蛋白之胺基酸序列可從已知資料庫NCBI之GenBank等獲得。
在一個示例中，本揭露之MntH蛋白可係源自微生物。該微生物可具體地源自艾氏菌(Escherichia)屬之微生物，但不限於此。
在另一示例中，本揭露之ntH蛋白之胺基酸序列可係源自大腸桿菌(Escherichia coli(E.coli))的WP000186369.1或EEW8215783.1，但很明顯，其可包括來自各種來源的具有MntH蛋白活性之蛋白質。
於本揭露中，MntH蛋白可具有、包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列，或由該胺基酸序列所組成，或可基本上由上述胺基酸序列所組成。
於本揭露中，MntH蛋白可包括與SEQ ID NO：1之胺基酸序列具有至少70%或更多、75%或更多、76%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、99%或更多、99.5%或更多、99.7%或更多、或99.9%或更多同源性或同一性的胺基酸序列。此外，很明顯，具有其中部分序列缺失、經修飾、經取代、經保留式取代或經添加的胺基酸序列之任何蛋白質亦可落入本揭露之範疇內，只要該胺基酸序列具有此類同源性或同一性且展現出對應於包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列的蛋白質的功效即可。在一個示例中，MntH蛋白可由412至428個胺基酸構成，包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
例如，其可為不改變本揭露之蛋白質的功能的添加，天然存在的突變，其中的緘默突變，或在N-末端、C-末端處及/或胺基酸序列內的保留式取代。
如本文所用，術語「保留式取代」指代將一個胺基酸取代為另一個具有類似結構特性及/或化學特性之胺基酸。此類胺基酸取代通常可基於殘基
之極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性、及/或兩親特性而出現。典型地，保留式取代對蛋白質或多肽之活性可具有輕微效應或無效應。
如本文所用，術語「同源性」或「同一性」指代兩個給定胺基酸序列或核苷酸序列之間的相關性程度，且可表示為百分比。術語同源性及同一性一般可與彼此互換使用。
保留式多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可藉由標準比對演算法確定，且可與由所使用之程式建立的預設空位罰分合用。實質上，同源或同一序列通常係經預期在中等或高度嚴苛條件下與該等序列之全部或部分雜交。很明顯，亦包括與在雜交多核苷酸中含有通用密碼子或簡併密碼子之多核苷酸進行的雜交。
任何兩個多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、類似性或同一性可藉由已知電腦演算法諸如「FASTA」程式，使用如Pearson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444中之缺省參數來確定。或者，其可使用Needleman-Wunsch演算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48：443-453)確定，其係使用EMBOSS程式包之Needleman程式(EMBOSS：歐洲分子生物學開放軟體套件，Rice et al.,2000,Trends Genet.16：276-277)(5.0.0版或更高版本)(GCG程式包(Devereux,J.et al.,Nucleic Acids Research 12：387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.et al.,J MOLEC BIOL 215：403(1990)；；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994；及CARILLO et al.(1988)SIAM J Applied Math48：1073)進行。例如，同源性、相似性或同一性可使用BLAST或美國國家生物技術資訊中心之ClustalW來確定。
多核苷酸或多肽之同源性、類似性或同一性可藉由使用例如GAP電腦程式諸如Needleman et al.(1970),J Mol Biol.48：443、如在Smith and Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2：482中所揭露者將序列資訊進行比較來確定。總之，GAP程式將同源性、類似性或同一性定義為藉由將經類似比對之符號(亦即，核苷酸或胺基酸)之數目除以兩個序列中較短者中符號之總數來獲得的值。用於GAP程式之預設參數可包括(1)二元比較矩陣(含有針對同一性的值1及針對非同一性的值0)，及Gribskov et al.(1986)Nucl Acids Res.14：6745之加權比較矩陣(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4之EMBOSS版本)取代矩陣)，如Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas Of Protein Sequence And Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)中所揭露；(2)針對各空位之3.0罰分及針對各空位中個符號之額外0.10罰分(或10之空位開放罰分及0.5之空位延伸罰分)；及(3)對於端空位無罰分。
本揭露之MntH蛋白可由mntH基因編碼。
在一個示例中，mntH基因可係編碼源自大腸桿菌之EEW8215783.1的多核苷酸，但不限於此。在另一示例中，mntH基因可係編碼源自大腸桿菌之WP_000186369.1的多核苷酸，且在又一示例中，其可係包括在源自大腸桿菌之CP116188.1中的序列，但不限於此，並且很明顯，該基因可包括編碼具有來自各種來源之MntH蛋白活性之蛋白質的mntH基因。
如本文所用，術語「多核苷酸」，作為由藉由共價鍵連結為長鏈形式之核苷酸單體所構成的核苷酸之聚合物，係具有至少某一長度的DNA或RNA股。更詳而言，其可指代編碼該蛋白質的多核苷酸片段。
本揭露之編碼MntH蛋白的多核苷酸可包括編碼SEQ ID NO：1之胺基酸序列的核苷酸序列。作為本揭露之一個示例，本揭露之多核苷酸可具有或可包括SEQ ID NO：2之核苷酸序列。此外，本揭露之多核苷酸可由SEQ ID NO：2之序列組成或可基本上由其組成。詳而言，mntH可由SEQ ID NO：2之核苷酸序列所表示之多核苷酸編碼。
由於密碼子簡併性或慮及在MntH蛋白待於其中表現之有機物中較佳的密碼子，本揭露之多核苷酸可在不改變MntH蛋白之胺基酸序列的範疇內在編碼區中經歷各種修飾。詳而言，本揭露之多核苷酸可具有或包括與SEQ ID NO：2之序列具有70%或更多、75%或更多、76%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、或99%或更多同源性或同一性的核苷酸序列，或可由與SEQ ID NO：2之序列具有70%或更多、75%或更多、76%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、或99%或更多同源性或同一性的核苷酸序列組成或基本上由其組成，但不限於此。
此外，本揭露之多核苷酸可包括可從已知基因序列製備之探針，例如，可與互補於本揭露之多核苷酸序列中之全部或部分的序列在嚴苛條件下雜交而無限制的任何多核苷酸序列。「嚴苛條件」指代允許在多核苷酸之間進行特異性雜交的條件。此類條件係詳細揭露於文獻(參見，冷泉港出版社印行之《分子選殖實驗室手冊(第二版)》(J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989)；約翰威立出版公司印行之《分子生物學現代方法》(F.M.Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York,9.50-
9.51,11.7-11.8))中。例如，嚴苛條件可包括下列條件，在該等條件下，具有高同源性或同一性的多核苷酸(亦即具有70%或更多、75%或更多、76%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、或99%或更多同源性或同一性的多核苷酸)與彼此雜交，而具有低於上述同源性或同一性之同源性或同一性的多核苷酸不與彼此雜交；或者可包括Southern雜交的通常洗滌條件，亦即，在對應於60℃、1×SSC、0.1% SDS，詳而言60℃、0.1×SSC、0.1% SDS，且更詳而言68℃、0.1×SSC、0.1% SDS的鹽濃度及溫度下洗滌一次，詳而言兩次或三次。
雜交需要兩個核酸具有互補序列，但取決於雜交的嚴苛性，鹼基之間的錯配係可能的。術語「互補」係用於揭示可與彼此雜交的核苷酸鹼基之間的關係。例如，就DNA而言，腺嘌呤係與胸苷互補，而胞苷係與鳥苷互補。因此，本揭露之多核苷酸亦可包括與完整序列互補的單離之核酸片段以及實質上與其類似的核酸序列。
具體地，與本揭露之多核苷酸具有同源性或同一性的多核苷酸可使用雜交條件進行檢測，該雜交條件包括在55℃之Tm值的雜交步驟在上揭條件下。再者，Tm值可係60℃、63℃或65℃，但不限於此，且可由所屬技術領域具有通常知識者依據其目的適當地進行調節。
用於雜交多核苷酸的適當嚴苛性取決於多核苷酸之長度及互補性程度，且此等變數係本領域中習知者(例如，Sambrook et al.，如前文)。
如本文所用，術語「載體」指代一種DNA構建體，其含有編碼與合適之表現調節序列可操作地鏈接之標靶蛋白的核苷酸序列，以能夠在合適的宿主細胞中表現該標靶蛋白。表現調節序列可包括能夠起始轉錄的啟動子、用於
調節轉錄的任何操縱子序列、編碼合適mRNA核糖體結合位點的序列、及用於調節轉錄及轉譯之終止的序列。一旦經轉形至合適宿主細胞中，載體即可複製或獨立於宿主基因體發揮作用，或者可經整合至其基因體中。
本揭露中所使用之載體無特別限制，只要其可在宿主細胞中經複製即可，且可使用本領域中已知的任何載體。典型使用之載體之示例包括天然或重組質體、黏質體、病毒及噬菌體。例如，作為噬菌體載體或黏質體載體，可使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A及Charon21A等；且作為質體載體，可使用彼等基於pDZ、pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL及pET等。詳而言，可使用pSKH130(美國申請公開號2020-0048619)、pSK、pDZ、pDC、pDCM2、pDC24、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC載體等。
將多核苷酸插入到染色體中可藉由本領域中已知之任何方法進行，例如，同源重組，但不限於此。
如本文所用，術語「轉形」指代將含有編碼標靶蛋白質多核苷酸的重組載體引入宿主細胞中，使得由該多核苷酸所編碼之蛋白質在該宿主細胞中表現。只要經轉形之多核苷酸可在宿主細胞中表現，無需考慮經轉形之多核苷酸是否經整合到該宿主細胞之染色體中及是否定位在染色體中或定位在染色體外，且可包括這兩種情況。用於轉形載體之方法包括將核酸引入細胞中之任何方法，且可藉由依據宿主細胞來選擇合適的標準技術如本領域中已知者來進行。例如，轉形可經由電穿孔、磷酸鈣(CapO4)沉澱、氯化鈣(CaCl2)沉澱、顯微注射、聚乙二醇(PEG)技術、DEAE-聚葡糖技術、陽離子脂質體技術、乙酸鋰-DMSO技術等來執行，但該方法並不限於此。
再者，如本文所用，術語「可操作地鏈接」意指多核苷酸序列與啟動子序列或表現調節區功能性地鏈接，該啟動子序列或表現調節區起始並媒介本揭露之編碼標靶蛋白的多核苷酸之轉錄。可操作的鍵聯可使用本領域中已知之基因重組技術來製備，且位點特異性DNA裂解及鍵聯可使用本領域中已知之裂解及鏈接酶來製備，但不限於此。
本揭露之微生物不限於其類型，只要其可製造OPS即可，並且可係任何原核或真核微生物，且詳而言係真核微生物。在一個示例中，其可包括屬於艾氏菌屬、伊文氏桿菌屬(Erwinia)、鋸桿菌(Serratia)屬、普羅威登斯菌(Providencia)屬、棒狀桿菌(Corynebacterium)屬及短桿菌(Brevibacterium)屬之微生物，且詳而言屬於艾氏菌屬之微生物，且更詳而言大腸桿菌，但不限於此。例如，在屬於艾氏菌屬之微生物的情況下，OPS及L-絲胺酸可透過SerA、SerC及SerB(其等係L-絲胺酸之生物合成路徑的酶)製造(Ahmed Zahoor,Computational and structural biotechnology journal,vol 3,2012 October；Wendisch V F et al.,Curr Opin Microbiol.2006 Jun;9(3):268-74；Peters-Wendisch P et al.,Appl Environ Microbiol.2005 Nov;7 1(11):7 139-44)。
如本文所用，術語「O-磷絲胺酸(OPS)製造微生物」指代一種具有天然地製造O-磷絲胺酸之能力的微生物或者其中已經經製造O-磷絲胺酸之能力輸入至沒有製造O-磷絲胺酸之能力的親本菌株的微生物。詳而言，該微生物可係製造OPS之微生物，該微生物由於天然或仍基因修飾而具有增強的MntH蛋白活性。為了本揭露之目的，製造OPS之微生物可係藉由本揭露之方法來增強MntH蛋白之活性、從而能夠製造O-磷絲胺酸之任何微生物。如本文所用，「O-
磷絲胺酸(OPS)製造微生物」可與「製造O-磷絲胺酸(OPS)之微生物」或「具有O-磷絲胺酸(OPS)製造能力之微生物」可互換地使用。
在一個實施方案中，本揭露之OPS製造微生物可係經基因修飾之微生物或重組微生物，於該微生物中，MntH蛋白之活性經增強，從而增加所欲之OPS製造能力，但不限於此。重組微生物可係其中O-磷絲胺酸製造能力與內源性O-磷絲胺酸製造能力相比係經增強的微生物。
本揭露之微生物可具有與內源性活性相比增加的MntH蛋白活性。詳而言，本揭露之微生物可係其中微生物MntH蛋白或編碼該蛋白質之mntH基因係經增強的微生物；或業經基因修飾以增強MntH蛋白或編碼該蛋白質之mntH基因的微生物(例如，重組微生物)，但不限於此。
如本文所用，術語多肽(例如，由各酶之名稱指定的蛋白質)之「增強」意指多肽之活性與其內源性活性相比有所增加。增強可與術語諸如活化、上調、過表現、增加等可互換地使用。特定而言，活化、增強、上調、過表現及增加可包括兩種情況，其中起初不具備之活性係經展現，或活性與內源性活性或修飾前之活性相比係經增強。「內源性活性」指代，當透過由天然或人工因素改變形狀時轉形前之親本菌株或未經修飾之微生物所起初具備的特定多肽之活性，且可與「修飾前之活性」可互換地使用。多肽之活性與內源性活性相比的「增強」、「上調」、「過表現」或「增加」意指，與轉形前之親本菌株或未經修飾之微生物所起初具備的特定多肽相比，該多肽之活性及/或濃度(表現量)係經增強。
增強可藉由引入外來多肽或藉由增強內源性多肽之活性及/或濃度(表現量)來達成。多肽之活性的增強可藉由多肽活性量級、表現級、或從該多肽分泌之產物量的增加來證實。
為了本揭露之目的，本揭露之微生物具有增強的MntH蛋白活性，從而增強OPS製造能力。其中MntH蛋白未經增強的未經修飾之微生物，作為用於比較OPS製造能力或MntH蛋白之增加的標靶菌株，可係：CA07-0012(KCCM 11121P，US 8557549 B2)，其係OPS製造菌株，其中內源性磷絲胺酸磷酸酶(SerB)業經缺失並因此削弱OPS分解能力；其中CA07-0012菌株中之具有OPS輸出能力之YhhS的表現有所增強的菌株(本揭露之CA07-4821菌株)；及其中CA07-4821中之NADH：醌氧化還原酶活性經進一步增強的菌株(本揭露之CA07-4828)，但不限於此。
多肽活性之增強可藉由本領域中習知之各種方法應用，且該方法並無限制，只要與修飾前之微生物相比，其可增強標靶多肽之活性即可。詳而言，可使用彼等具有本領域技藝者所習知的作為分子生物學之常用方法的基因工程及/或蛋白質工程，但該方法不限於此(例如，Sitnicka et al.Functional Analysis of Genes.Advances in Cell Biology.2010,Vol.2.1-16；Sambrook et al.Molecular Cloning 2012等等)。
具體地，本揭露之多肽活性之增強可藉由下列達成：
1)增加編碼多肽的多核苷酸之細胞內複本數；
2)修飾染色體之編碼多肽的基因之表現調節序列；
3)修飾編碼起始密碼子的核苷酸序列或編碼多肽之基因轉錄本的5'-UTR；
4)修飾多肽之胺基酸序列，使得該多肽之活性增強；
5)修飾編碼多肽的多核苷酸序列，使得該多肽之活性增強(例如，修飾多肽基因之多核苷酸序列以編碼業經修飾以增強該多肽活性的多肽)；
6)引入展現多肽活性的外來多肽或者引入編碼該外來多肽的外來多核苷酸；
7)對編碼多肽的多核苷酸進行密碼子優化；
8)分析多肽之三級結構且藉此選擇並修飾所曝露之位點，或對其進行化學修飾；
9)調節多肽之細胞定位；或
10)選自上述1)至9)之兩者或更多者的組合，但不限於此。
更具體地，
增加編碼多肽的多核苷酸之細胞內複本數之1)方法可藉由將載體引入宿主細胞中來達成，該載體與編碼多肽的多核苷酸可操作地鏈接並且能夠複製並發揮功能，而無論宿主細胞如何。或者，該方法可藉由將編碼多肽的多核苷酸之一個或兩個複本引入宿主細胞之染色體中來達成。引入染色體中可藉由將載體引入宿主細胞中來進行，該載體能夠將多核苷酸插入到宿主細胞之染色體中，但不限於此。
使用具有強活性之序列來替換染色體的編碼多肽的基因之表現調節區(或表現調節序列)之2)方法可藉由下述者達成：例如，藉由透過缺失、插入、非保留式或保留式取代、或其組合來誘導序列上的修飾，以進一步增強該表現調節區之活性；或者藉由將該序列替換為具有更強活性的序列。表現調節區可包括但不特別限於，啟動子、操縱子序列、編碼核糖體結合位點之序列、及調節轉錄
及轉譯之終止的序列等。該方法可特異性地包括將強啟動子插入到初始啟動子之下游，但不限於此。
已知強啟動子之示例可包括CJ1至CJ7啟動子(US 7662943 B2)、lac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、tac啟動子、λ噬菌體(lambda phage)PR啟動子、PL啟動子、tet啟動子、gapA啟動子、SPL7啟動子、SPL13(sm3)啟動子(US 10584338 B2)、O2啟動子(US 10273491 B2)、tkt啟動子、yccA啟動子、rmf啟動子、serC啟動子等，但強啟動子不限於此。
修飾編碼起始密碼子的核苷酸序列或編碼多肽之基因轉錄本的5'-UTR的3)方法可藉由下述者達成：例如，藉由將核苷酸序列取代為編碼另一起始啟動子的核苷酸序列，與內源性起始啟動子相比，該另一起始啟動子具有更高的多肽表現率，但不限於此。
修飾胺基酸序列或多核苷酸序列的4)及5)方法可藉由下述者達成：藉由透過多肽之胺基酸序列或編碼該多肽的多核苷酸序列之缺失、插入、非保留式或保留式取代、或其組合來誘導序列上的修飾，以增強多肽之活性；或者藉由將該序列替換為經修飾以具有更強活性的胺基酸序列或多核苷酸序列、或經修飾以增強活性的胺基酸序列或多核苷酸序列，但不限於此。該替換可藉由同源重組將多核苷酸插入到染色體中來進行，但不限於此。
本文所使用之載體可復包括選擇標記以證實插入到染色體中。選擇標記係用於選擇經載體轉形之細胞，換言之，用於證實待引入之基因的插入，且可使用提供選擇性表型諸如藥物抗性、營養缺陷性、對細胞毒性劑之抗性、或表面多肽之表現的標記，但不限於此。此外，只有表現該選擇標記之細胞方能夠在經選擇性劑處理的環境下存活或顯示不同表型，且因此可選擇經轉形之細胞。
引入展現多肽之活性的外來多核苷酸的6)方法可藉由下述者達成：將編碼展現出與該多肽相同/相似活性之多肽的外來多核苷酸引入宿主細胞中。可使用外來多核苷酸而無限制，無論其起源或序列如何，只要其展現出與該多肽相同/相似之活性即可。該引入可由彼等所屬技術領域中具有通常知識者藉由適當地選擇本領域中已知之轉形方法來進行，並且所引入之多核苷酸在宿主細胞中之表現實現該多肽之製造，藉此增加其活性。
對編碼多肽的多核苷酸進行密碼子的優化7)方法可藉由下述者達成：藉由對內源性多核苷酸進行密碼子優化以增加宿主細胞內的轉錄或轉譯；或者藉由優化其密碼子，使得外來多核苷酸的經優化之轉錄及轉譯可在宿主細胞內達成。
分析多肽之三級結構並且藉此選擇並修飾所曝露之位點、或對其進行化學修飾的8)方法可藉由下述者達成：例如，藉由將待分析之多肽的序列資訊與其中儲存已知蛋白質之序列資訊的資料庫進行比較，以根據序列類似性之程度來確定模板蛋白候選物，且因此基於該資訊證實結構，藉此選擇並轉形或修飾待修飾或化學修飾的所曝露之位點。
調節多肽之細胞內定位的9)方法可藉由將多肽靶向至細胞內之特定胞器或特定空間來達成。例如，其可藉由下述者達成：透過添加或去除在靶向多肽中發揮作用的前導者序列來將多肽靶向至周質或細胞質，但不限於此。
在一個實施方案中，MntH蛋白活性之增強可藉由上述2)的修飾染色體的編碼多肽的基因之表現調節區來達成。
在上述實施方案之任一者中，本揭露之MntH蛋白活性之增強可係編碼MntH蛋白的基因之表現之增加。在上述實施方案之任一者中，MntH蛋
白活性之增強可包括在編碼該蛋白的基因上游具有增強的活性之基因表現調節序列。詳而言，編碼MntH蛋白的基因上游可係mntH基因上游。在一個實施方案中，MntH蛋白活性之增強可係藉由修飾mntH基因之表現調節序列的基因序列表現之增強。具體地，表現調節序列之修飾可係將具有增強的活性之基因表現調節序列插入在mntH基因之內源性啟動子與mntH基因之間，例如，該基因表現調節序列可係啟動子，但不限於此。
多肽活性之此類增強可意指對應的多肽之活性或濃度相對於在修飾前之野生型菌株中表現的該多肽之活性或濃度有所增加，或者自該多肽製造之產物的量有所增加，但不限於此。
如本文所用，術語「修飾前之菌株」或「修飾前之微生物」不排除含有可能天然存在於微生物中之突變的菌株，且可指代天然型菌株本身，或在性狀由於天然或人工因素所致之基因修飾而改變之前的菌株。於本揭露中，性狀之修飾可係MntH蛋白活性之增強。「修飾前之菌株」或「修飾前之微生物」可與「非突變型菌株」、「未經修飾之菌株」、「非突變型微生物」、「未經修飾之微生物」或「參考微生物」可互換地使用。
對本揭露之微生物中的一部分或全部多核苷酸之修飾可藉由下述者達成：(a)使用用於將染色體插入到微生物中的載體進行同源重組或使用經工程化之核酸酶(例如，CRISPR-Cas9)進行基因編輯，及/或(b)藉由光諸如紫外線及輻射等及/或化學處理來引入，但不限於此。修飾一部分或全部基因之方法可包括使用DNA重組技術之方法。例如，一部分或全部基因可藉由將核苷酸序列或含有與標靶基因同源的核苷酸序列之載體注入到微生物中以誘導同源重組。所注射之核苷酸序列或載體可包括顯性遺傳選擇標記，但不限於此。
本揭露之微生物可係具有增強的OPS製造能力之微生物。
為了本揭露之目的，本揭露之重組微生物可係藉由增強天然野生型微生物中之MntH蛋白或編碼該蛋白的多核苷酸而具有增強的OPS製造能力之微生物；或OPS製造微生物，與天然野生型微生物相比，其包括MntH蛋白或編碼該蛋白的多核苷酸；或包括MntH蛋白或編碼該蛋白的多核苷酸之OPS製造微生物，但不限於此。例如，包括MntH蛋白或編碼該蛋白的多核苷酸之天然野生型微生物或OPS製造微生物可係標靶菌株用以比較OPS製造能力或MntH蛋白活性之增加，但不限於此。
在一個示例中，與修飾前之親本菌株或未經修飾之微生物的OPS製造能力相比，具有增加的OPS製造能力之重組菌株可具有增加約1%或更多，詳而言約1.7%或更多、2%或更多、約2.3%或更多、約3%或更多、約4%或更多、約5%或更多、約5.3%或更多、約6%或更多、約7%或更多、約8%或更多、約9%或更多、約10%或更多(上限並無特別限制，例如，約200%或更少、約150%或更少、約100%或更少、約50%或更少、約40%或更少、約30%或更少、約20%或更少、或約15%或更少)的OPS製造能力，但不限於此，只要其與修飾前之親本菌株或未經修飾之微生物相比具有增加的+值即可。在另一示例中，與修飾前之親本菌株或未經修飾之微生物的OPS製造能力相比，具有增加的OPS製造能力之微生物可具有增加1.01倍或更多、約1.017倍或更多、約1.02倍或更多、約1.023倍或更多、約1.03倍或更多、約1.04倍或更多、約1.05倍或更多、約1.053倍或更多、約1.06倍或更多、約1.07倍或更多、約1.08倍或更多、約1.09倍或更多、或約1.10倍或更多(上限並無特別限制，例如，約10倍或更少、約5倍或更少、約3倍或更少、或約2倍或更少)的OPS製造能力，但不限於此。
該製造能力可藉由量測藉由在培養基中培養獲得之所欲產物的製造量來進行評估。該評估可使用本領域中已知之合適方法來量測所欲產物之製造量。例如，可使用HPLC(高效液相層析術)、GC(氣相層析術)、GC/MS(氣相層析術-質譜)、LC/MS(液相層析術-質譜)、GPC(凝膠滲透層析術)或其組合，且所欲產物之製造量可使用本領域中已知的合適方法量測。
本揭露之微生物可進一步增強製造OPS之能力及/或將OPS輸出到細胞外之能力；或可包括增強OPS分解能力及/或輸入能力的修飾。
增強製造OPS之能力及/或將OPS輸出到細胞外之能力、或者增強OPS分解及/或輸入能力的修飾之示例可包括NADH：醌氧化還原酶活性之增強；磷絲胺酸燐酸酶(SerB)活性之削弱；磷絲胺酸輸出蛋白(YhhS)活性之增強；或此等修飾之組合，但不限於此。
如本文所用，術語多肽活性之「弱化」係包括與其內源性活性相比降低或無活性兩者的綜合概念。弱化可與術語諸如滅活、缺乏、下調、減少、降低、削弱等可互換地使用。
該弱化亦可包括其中多肽活性本身由於編碼該多肽的多核苷酸之突變而與微生物所初始具備之活性相比有所減少或經去除的情況；其中細胞內多肽活性之總體含量及/或濃度(表現量)由於對編碼該多肽的多核苷酸之基因表現的抑制或對轉譯為該多肽的抑制等而與天然菌株相比有所減少的情況；其中多核苷酸根本未經表現的情況；及/或其中甚至在該多核苷酸經表現時仍未觀察到多肽活性的情況。如本文所用，術語「內源性活性」指代，當透過由天然或人工因素改變形狀時轉形前之親本菌株、野生型或未經修飾之微生物所起初具備的特定多肽之活性，且可與「修飾前之活性」可互換地使用。多肽活性與其內源
性活性相比經「弱化、滅活、缺乏、減少、下調、降低或削弱」的表述意指該多肽活性與轉形前之親本菌株或未經修飾之微生物所初始具備的特定多肽之活性相比有所減少。
多肽活性之弱化可藉由本領域中已知之任何方法進行，但該方法不限於此，且可藉由應用本領域中習知之各種方法來達成(例如，Nakashima N et al.,Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing.Int J Mol Sci.2014；15(2)：2773-2793；Sambrook et al.Molecular Cloning 2012等等)。
具體地，本揭露之多肽活性之弱化可藉由下列達成：
1)使編碼多肽的基因之一部分或全部缺失；
2)修飾表現調節區(表現調節序列)，使得編碼多肽的基因之表現減少；
3)修飾構建多肽的胺基酸序列，使得多肽活性經去除或弱化(例如，胺基酸序列的一個或多個胺基酸之缺失/取代/添加)；
4)修飾編碼多肽的基因序列，使得多肽活性經去除或弱化(例如，多肽基因之核苷酸序列的一個或多個核苷酸之缺失/取代/添加，以編碼業經修飾以去除或弱化該多肽活性的多肽)；
5)修飾編碼起始密碼子、夏因-達爾加諾序列(Shine-Dalgarno(SD))序列、或編碼多肽的基因轉錄本之5'-UTR的核苷酸序列；
6)引入與編碼多肽的基因轉錄本互補地結合之反義寡核苷酸(例如，反義RNA)；
7)將與夏因-達爾加諾序列(Shine-Dalgarno(SD))序列互補的序列添加在編碼多肽的基因之該SD序列之前端，以形成二級結構，藉此抑制核糖體接附；
8)反轉錄工程化(RTE)，其將待經反轉錄之啟動子添加在編碼多肽的基因序列之開讀框(ORF)之3'末端；
9)調節多肽之細胞定位；或
10)選自上述方法1)至9)之兩者或更多者的組合，但不限於此。
例如，
使編碼多肽的基因之一部分或全部缺失的1)方法可藉由下述者達成：藉由使編碼染色體內之內源性標靶多肽的多核苷酸全部缺失；或者藉由將該多核苷酸替換為具有經特定缺失之核苷酸的多核苷酸或替換為標記基因。
修飾表現調節區(表現調節序列)的2)方法可藉由下述者達成：藉由透過缺失、插入、非保留式取代或保留式取代、或其組合將修飾引入到表現調節區(表現調節序列)；或者藉由將該序列替換為具有較弱活性之序列。表現調節區可包括啟動子、操縱子序列、編碼核糖體結合位點之序列、以及用於調節轉錄及轉譯終止之序列，但不限於此。
修飾胺基酸序列或多核苷酸序列的3)及4)方法可藉由下述者達成：藉由透過多肽之胺基酸序列或編碼該多肽的多核苷酸序列之缺失、插入、非保留式或保留式取代、或其組合來誘導序列的修飾，以弱化多肽之活性；或者藉由將該序列替換為經修飾以具有更弱活性的胺基酸序列或多核苷酸序列、或經修飾以不具有活性的胺基酸序列或多核苷酸序列，但不限於此。例如，基因之表現可藉由將突變引入多核苷酸序列中以形成終止密碼子來抑制或弱化，但不限於此。
修飾編碼起始密碼子的核苷酸序列或編碼多肽之基因轉錄本的5'-UTR的5)方法可藉由下述者達成：例如，藉由將核苷酸序列取代為編碼另一
起始啟動子的核苷酸序列，與內源性起始啟動子相比，該另一起始啟動子具有更低的多肽表現率，但不限於此。
引入與編碼多肽的基因轉錄本互補地結合之反義寡核苷酸(例如，反義RNA)的6)方法可見於文獻中[Weintraub,H.et al.,Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis,Reviews-Trends in Genetics,Vol.1(1)1986]。
將與夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno(SD))序列互補的序列添加在編碼多肽的基因之該SD序列之前端以形成二級結構、藉此抑制核糖體接附的7)方法可藉由抑制mRNA轉譯或降低其速度來達成。
再者，其將待經反轉錄之啟動子添加在編碼多肽的基因序列之開讀框(ORF)之3'末端的8)反轉錄工程化(RTE)可藉由下述者來達成：形成與編碼多肽的基因轉錄本互補之反義核苷酸以弱化活性。
調節多肽之細胞內定位的9)方法可藉由將多肽靶向至細胞內之特定胞器或特定空間來達成。例如，其可藉由下述者達成：透過添加或去除在靶向多肽中發揮作用的前導者序列來將多肽靶向至周質或細胞質，但不限於此。
多肽活性之此類弱化可意指對應的多肽之活性或濃度相對於在修飾前之野生型菌株中表現的該多肽之活性或濃度有所減少，或者自該多肽製造之產物的量有所減少，但不限於此。
在一個實施方案中，本揭露之重組微生物可係下述微生物，其中與內源性活性相比，選自NADH：醌氧化還原酶及O-磷絲胺酸輸出蛋白中之一者或多者的活性復經增強。
在上揭實施方案之任一者中，本揭露之重組微生物可係其中NADH：醌氧化還原酶活性經增強的微生物。
如本文所用，術語「NADH：醌氧化還原酶(後文稱為「Nuo」)」係一種酶，其藉由氧化微生物之電子轉運鏈中之NADH來還原細胞膜中的醌。該酶蛋白亦可名為NADH脫氫酶-1(NDH-1)。編碼該蛋白質的基因可係，例如，nuoABCEFGHIJKLMN基因簇，但不限於此。nuoABCEFGHIJKLMN基因簇構建nuo操縱組，且其表現可由該操縱組之前的啟動子以及核糖體結合位點中的多核苷酸調節。於本揭露中「nuoABCEFGHIJKLMN基因」可與「編碼NADH：醌氧化還原酶的基因」、「nuoABCEFGHIJKLMN基因」、「nuo操縱組」及「nuo基因」可互換地使用。
Nuo係13種次單元蛋白(NuoA、NuoB、NuoC、NuoE、NuoF、NuoG、NuoH、NuoI、NuoJ、NuoK、NuoL、NuoM、NuoN)之複合物。兩種類型之操縱組，亦即nuoABCEFGHIJKL及nuoMN，係用作各次單元蛋白之轉譯中的模板。nuo操縱組之結構可見於EcoCyc中(www.biocyc.org)(登錄號：EG12082)。nuo操縱組係已知包括結構基因及表現調節區。nuo操縱組之「表現調節區」指代一個區，其存在於構建nuo操縱組的結構基因上游且因此可調節該結構基因之表現。nuo操縱組之表現調節區可包括啟動子(nuoA啟動子/或nuoM啟動子)，不包括該結構基因及操縱子，且可特異性地包括啟動子。
操縱組係如上所揭示。
在一個實施方案中，NADH：醌氧化還原酶活性之增強可藉由下述來達成：進行修飾，使得NADH：醌氧化還原酶之活性與內源性活性相比有所增強；或者藉由強化或引入nuo操縱組。
因為本揭露之nuo操縱組由於OPS生物合成路徑之增強而降低NADH蓄積，業經修飾以增強NADH：醌氧化還原酶活性的微生物、或向其中引
入nuo操縱組的微生物可具有增加OPS製造之特性，且因此可用於OPS之製造。
nuo操縱組可包括核苷酸序列，該核苷酸序列編碼與由SEQ ID NOS：45至57表示之胺基酸序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%或更多同源性或同一性的胺基酸序列。具體地，nuo操縱組可包括：結構基因序列，其編碼SEQ ID NOS：45至57之胺基酸序列或與其具有同源性或同一性的胺基酸序列並且展現處對應的功能；及表現調節區，其調節該結構基因序列之表現。SEQ ID NOS：45至57之序列可見於已知資料庫NCBI之Genbank中。
具體地，nuo操縱組可係SEQ ID NO：3之核苷酸序列及/或與SEQ ID NO：3具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%或更多同源性或同一性的核苷酸序列。此外，很明顯，其中一部分序列缺失、經修飾、經取代、或經添加的任何核苷酸序列亦可落入本揭露之範疇內，只要該核苷酸序列具有此類同源性或同一性且展現出對應於nuo操縱組的功能即可。
在上揭實施方案中之任一者中，本揭露之重組微生物可係其中SerB活性有所削弱的微生物。
本揭露之「SerB」具有將OPS轉化為L-絲胺酸之活性，且因此經修飾以弱化SerB活性之微生物具有在其中蓄積OPS之特性，其可有用於OPS之製造。本揭露之SerB可係具有或包括由SEQ ID NO：4表示之胺基酸序列的蛋白質，或者可係由或基本上由SEQ ID NO：4所表示之胺基酸序列組成的蛋白質，但不限於此。此外，本揭露之SerB可具有或包括與由SEQ ID NO：4表示之胺基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%、或99%或更多同源性或同一性的胺基
酸序列，只要其顯示SerB活性即可。此外，本揭露之SerB可由或基本上由與由SEQ ID NO：4表示之胺基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%、或99%或更多同源性或同一性的胺基酸序列組成，但不限於此。此外，編碼SerB的多核苷酸可具有或包括編碼SEQ ID NO：4表示之胺基酸序列的核苷酸序列。再者，編碼SerB的多核苷酸可由或基本上由編碼由SEQ ID NO：4表示之胺基酸序列的核苷酸序列組成。由於密碼子簡併性或慮及在SerB蛋白待於其中表現之有機物中較佳的密碼子，本揭露之編碼SerB的多核苷酸可在不改變SerB蛋白之胺基酸序列的範疇內在編碼區中經歷各種修飾。本揭露之編碼SerB的多核苷酸可具有或包括與SEQ ID NO：5之核苷酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%或更多同源性或同一性的核苷酸序列。此外，本揭露之編碼SerB的多核苷酸可由以下組成或基本上由以下組成：與SEQ ID NO：5之核苷酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%或更多同源性或同一性的核苷酸序列，但不限於此。
在上揭實施方案之任一者中，本揭露之重組微生物可係其中O-磷絲胺酸輸出蛋白活性有所增強的微生物。例如，其可係其中YhhS活性有所增強的微生物。
本揭露之「YhhS」具有輸出OPS之活性，且因此經修飾以增強YhhS活性之微生物具有在輸出OPS之特性，其可有用於OPS之製造。本揭露之YhhS可係具有或包括由SEQ ID NO：6表示之胺基酸序列的蛋白質，或者可係由或基本上由SEQ ID NO：6所表示之胺基酸序列組成的蛋白質，但不限於此。此外，本揭露之YhhS可具有或包括與由SEQ ID NO：6表示之胺基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%、或99%或更多同源性或同一性的胺基酸序列，只要其顯示YhhS活性即可。此外，本揭露之YhhS可由或基本上由與由SEQ ID
NO：6表示之胺基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%、或99%或更多同源性或同一性的胺基酸序列組成，但不限於此。此外，編碼YhhS的多核苷酸可具有或包括編碼SEQ ID NO：6表示之胺基酸序列的核苷酸序列。再者，編碼YhhS的多核苷酸可由或基本上由編碼由SEQ ID NO：6表示之胺基酸序列的核苷酸序列組成。由於密碼子簡併性或慮及在YhhS蛋白待於其中表現之有機物中較佳的密碼子，本揭露之編碼YhhS的多核苷酸可在不改變YhhS蛋白之胺基酸序列的範疇內在編碼區中經歷各種修飾。本揭露之編碼YhhS的多核苷酸可具有或包括與SEQ ID NO：7之核苷酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%或更多同源性或同一性的核苷酸序列。此外，本揭露之編碼YhhS的多核苷酸可由以下組成或基本上由以下組成：與SEQ ID NO：7之核苷酸序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%或更多同源性或同一性的核苷酸序列，但不限於此。
在一個實施方案中，包括修飾以增強製造OPS之能力及/或將OPS輸出到細胞外之能力、或以增強OPS分解及/或輸入能力的修飾之微生物可係CA07-0012(KCCM 11121P；US2012-0190081A)、CA07-4821或CA07-4828，但不限於此。關於OPS製造微生物之含量，除了彼等上揭者之外，韓國專利公告號1381048或美國申請公開號2012-0190081等中之揭露亦可用作本揭露之參考，但不限於此。
本揭露之另一方面提供一種用於製造O-磷絲胺酸之方法，其包括在培養基中培養製造O-磷絲胺酸之重組微生物，在重組微生物中，與內源性活性相比，MntH蛋白之活性經增強。
MntH蛋白、內源性活性、增強、O-磷絲胺酸及微生物係如上所揭示。
如本文所用，術語「培養」意指使本揭露之文生物在適當受控之環境條件下生長。本揭露之培養過程可在本領域中已知的適當培養基及培養條件下進行。此類培養過程可由所屬技術領域具有通常知識者根據所選擇之菌株輕易地調節。詳而言，培養可係分批培養、連續培養及/或補料分批培養，但不限於此。
在培養微生物中，培養基可復含有甘胺酸或絲胺酸。甘胺酸可以經純化之甘胺酸、含甘胺酸之酵母萃取物、或胰腖的形式提供。培養基中待包含之甘胺酸的濃度通常係0.1g/L至10g/L，且詳而言0.5g/L至3g/L。此外，絲胺酸可以經純化之絲胺酸、含絲胺酸之酵母萃取物、或胰腖的形式提供。培養基中待包含之絲胺酸的濃度通常係0.1g/L至5g/L，且詳而言0.1g/L至1g/L。
培養基中待包含之碳源的示例可包括醣類及碳水化合物類，諸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、甘露糖、澱粉及纖維素；油類及脂肪類，諸如大豆油、葵花籽油、花生油及椰子油；脂肪酸類，諸如棕櫚酸、硬脂酸及亞麻油酸；醇類，諸如甘油及乙醇；以及有機酸類，諸如乙酸。此等碳源可單獨使用或組合使用，但不限於此。
培養基中待包含之氮源的示例可包括有機氮源，諸如蛋白腖、酵母萃取物、肉汁、麥芽萃取物、玉米浸液及豆粉；以及無機氮源，諸如脲、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨及硝酸銨。此等氮源可單獨使用或組合使用，但不限於此。
培養基中待包含之磷源的示例可包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、及對應的含鈉鹽，但不限於此。
此外，培養基可包括金屬鹽，諸如硫酸鎂或硫酸鐵，且可復包含胺基酸、微生物及適當前驅物。此等培養基或前驅物可以分批培養或連續培養的形式添加至培養中，但不限於此。
在培養期間，可以適當的方式藉由添加化合物諸如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨、磷酸及硫酸來調節培養之pH。此外，在培養期間，可使用消泡劑諸如脂肪酸聚二醇酯來防止氣泡形成。再者，可將氧氣或含氧氣體注入培養中以便維持培養之好氧條件；或者可注入氮氣、氫氣或二氧化碳以維持厭氧或微好氧條件而不注入氣體。培養之溫度可係25℃至40℃且詳而言30℃至35℃之範圍。培養可係連續的，直至可獲得可用材料之製造，具體地達10小時至100小時，但不限於此等示例性示例。
本揭露之製造OPS的方法可復包括製備本揭露之微生物的步驟、製備用於培養該微生物的培養基的步驟、或此等步驟(不考慮次序，以任意次序)之組合，例如，在培養步驟之前。
本揭露之製造OPS的方法可復包括從培養基(培養物於其上生長)或經培養之微生物回收OPS之步驟。回收步驟可復包括在培養步驟後。
在回收步驟中，所欲之OPS可使用本揭露之培養微生物之方法來收集，例如，根據分批培養、連續培養、或補料分批培養方法使用本領域中已知的合適方法。例如，可使用方法諸如離心、過濾、用蛋白質結晶沉澱劑處理(鹽析方法)、萃取、超音破碎、超濾、透析、各種層析術(諸如分子篩層析術(凝膠滲透)、吸附層析術、離子交換層析術、親和層析術等)、HPLC或其組合，且所欲之OPS可使用本領域中已知的合適方法從培養基或微生物回收。
再者，本揭露之製造OPS之方法可復包括純化步驟，其可使用本領域中已知的適當方法進行。在一個示例中，當本揭露之製造OPD之方法包括回收步驟及純化步驟兩者時，該回收步驟及該純化步驟可連續進行或可間歇進行而無論次序如何，或者可同步進行或整合在一個步驟中進行，但該方法不限於此。因此，所回收之OPS可係經純化之狀態或含OPS之微生物醱酵液。此外，OPS之回收可藉由將本領域中之合適方法添加到培養步驟之前及之後以及回收步驟之前及之後來有效地進行。
本揭露之又一方面提供一種製造半胱胺酸或其衍生物之方法，該方法包括：
a)在培養基中培養製造O-磷絲胺酸之重組微生物以製造O-磷絲胺酸或含有O-磷絲胺酸之培養基，在該重組微生物中，與內源性活性相比，MntH蛋白之活性經增強；以及
b)使步驟a)中製造之O-磷絲胺酸或含有O-磷絲胺酸之培養基與硫化物在O-磷絲胺酸硫化氫解酶(OPSS)或包括該酶之微生物的存在下反應。
步驟a)及b)不必由該次序限制，亦即，該等步驟係連續或依序進行，且在此等步驟之間無時間間隔，並且該等步驟可同時進行，或者以數秒鐘、數分鐘、數小時、數天之間隔進行。
MntH蛋白、內源性活性、增強、O-磷絲胺酸(OPS)及微生物係如上所揭示。
如本文所用，術語「衍生物」指代藉由對任何化合物之部分進行化學修飾而獲得的類似化合物。該術語通常指代其中氫原子或特定原子群組係經另一原子或原子群組取代的化合物。
如本文所用，術語「半胱胺酸衍生物」指代其中半胱胺酸之氫原子或特定原子群組係經另一原子或原子群組取代的化合物。例如，半胱胺酸衍生物可具有其中半胱胺酸之胺基(-NH2)之氮原子或巰基(-SH)之硫原子具有與其接附之另一原子或原子群組的形式，且半胱胺酸衍生物之示例可包括N-乙醯基半胱胺酸(NAC)、S-羧基甲基半胱胺酸(SCMC)、BOC-CYS(ME)-OH、(R)-S-(2-胺基-2-羧基乙基)-L-高半胱胺酸、(R)-2-胺基-3-磺基丙酸、D-2-胺基-4-(乙硫基)丁酸、3-亞磺基-L-丙胺酸、茀基甲氧基羰基-半胱胺酸(第三丁氧基羰基-甲基)-OH(Fmoc-Cys(Boc-甲基)-OH)、硒代-L-胱胺酸(Seleno-L-cystine)、S-(2-噻唑基)-L-半胱胺酸、S-(2-噻吩基)-L-半胱胺酸、S-(4-甲苯基)-L-半胱胺酸等，但不限於此。
只要根據本揭露之方法製造半胱胺酸，就可藉由本領域中習知的方法將半胱胺酸轉化為各種半胱胺酸衍生物，以輕易地轉化半胱胺酸衍生物。
於本揭露中，製造半胱胺酸衍生物之方法可復包括將步驟b)中製造之半胱胺酸轉化為半胱胺酸衍生物。
具體地，於本揭露中，製造半胱胺酸衍生物之方法可包括以下步驟：根據上揭之本揭露之方法製造半胱胺酸；以及將所製造之半胱胺酸轉化為半胱胺酸衍生物。
所製造之半胱胺酸轉化為半胱胺酸衍生物可藉由本領域中習知的方法進行，例如，半胱胺酸可藉由與乙醯化劑反應而合成為N-乙醯基半胱胺酸(NAC)，或者可藉由與鹵乙酸在鹼性條件下根據病領域中已知的方法反應而合成為S-羧基甲基半胱胺酸(SCMC)，但該等示例不限於此。
此等半胱胺酸衍生物主要作為醫藥材料用於止咳劑、咳嗽緩解劑，以及作為治療劑用於支氣管炎、支氣管性氣喘、咽喉炎等，但不限於此。
如本文所用，術語「O-磷絲胺酸硫化氫解酶(OPSS)」指代一種酶，其催化一反應，藉由該反應，藉由從巰基(SH)提供給OPS而將OPS轉化為半胱胺酸。該酶業經首次見於敏捷氣熱菌(Aeropyrum pernix)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatics)及陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)(Mino K and Ishikawa K,FEBS Letters,551：133-138,2003；Burns K E et al.,J.Am.Chem.Soc.,127：11602-11603,2005)。此外，OPSS不僅可包括野生型OPSS蛋白，而且可包括變異體蛋白，其中序列之一部分係在編碼OPSS的多核苷酸序列中經缺失、取代或添加，其顯示等於或高於野生型OPSS蛋白之生物活性的活性，且亦可包括韓國申請公開號2012-0041115及韓國專利公告號1208267中揭露之全部OPSS蛋白、及其變異體蛋白。
硫化物可係任何硫化物，不僅以本領域中通常使用之固體形式提供，而且由於不同pH、壓力及溶解度而以液體或氣體形式提供，且因此可經轉換為硫化物(S2-)、硫代硫酸鹽(S2O3 2-)等形式的巰基(SH)基團，而無限制。詳而言，硫化物可包括Na2S、NaSH、(NH4)2S、H2S或Na2S2O3，其可提供巰基至OPS，但不限於此。在反應中，單一巰基係經供給至單一反應性OPS基團，以製造單一半胱胺酸或其衍生物。本文中，基於OPS之莫耳濃度，硫化物可以0.1至3莫耳當量，且詳而言1至2莫耳當量的量添加，但不限於此。
此外，製造半胱胺酸衍生物之方法可復包括回收藉由反應步驟製造之半胱胺酸的步驟。本文中，所欲之半胱胺酸可藉由使用本領域中已知的合適方法從反應溶液單離及純化半胱胺酸來收集。
本揭露之又一方面提供用於製造O-磷絲胺酸、半胱胺酸或半胱胺酸衍生物之組成物，該組成物包括：O-磷絲胺酸製造重組微生物，在該重組微生
物中，與內源性活性相比，MntH蛋白之活性經增強；於其上培養該微生物的培養基；或其組合。
本揭露之組成物可復包括在用於製造-磷絲胺酸、半胱胺酸或半胱胺酸衍生物之組成物中常用的任何合適賦形劑，且此類賦形劑可包括，例如，防腐劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、緩衝劑、穩定劑或等張劑等，但不限於此。
本揭露之甚至另一方面提供一種用於製造O-磷絲胺酸製造重組微生物之方法，該方法包括，與內源性活性相比，增強MntH蛋白之活性。
本揭露之再另一方面提供製造O-磷絲胺酸之重組微生物在製造O-磷絲胺酸、半胱胺酸或半胱胺酸衍生物之用途，在該重組微生物中，與內源性活性相比，MntH蛋白之活性經增強。
該方面之MntH蛋白、內源性活性、增強、O-磷絲胺酸(OPS)、半胱胺酸、半胱氨酸衍生物及微生物係如上所揭示。
[實施本發明之模式]
後文中將藉由實施例來詳細揭示本揭露。惟，此等實施例係僅做示例性說明目的之用的較佳實施例，且因此，本揭露之範疇不旨在經限制為此等實施例或為此等實施例所限制。同時，本文未揭示之技術特徵可由本揭露之技術領域或類似技術領域具有通常知識者充分理解並容易地實施。
[實施例]
實施例1：製備具有增強的YhhS表現之O-磷絲胺酸(OPS)製造菌株
1-1.製備用於增強YhhS表現之載體
基於野生型大腸桿菌ATCC27325染色體DNA作為模板來進行PCR，以使用引子對SEQ ID NO：10及11獲得在yhhS基因(SEQ ID NO：7)之野
生型啟動子之上游區中的基因片段，其中同源重組發生在染色體上，並且使用引子對SEQ ID NO：14及15獲得在yhhS基因之野生型啟動子下游的基因片段。此外，基於pCL_Ptrc-gfp(WO 2016-024771 A1)作為模板來進行PCR，以使用引子對SEQ ID NO：12及13獲得Ptrc啟動子(SEQ ID N：59)。
SolgTM Pfu-X DNA聚合酶係用於PCR，且該PCR係在下述PCR擴增條件下進行：於95℃變性2分鐘；之後進行30個於95℃變性30秒、於60。℃低溫黏合30秒、並於72℃聚合60秒之循環；隨後於72℃聚合5分鐘。
使用浸入選殖套組(Clontech Laboratories,Inc.)，將藉由上述製程獲得之yhhS啟動子之上游片段及下游片段、及Ptrc啟動子片段在用限制酶EcoRV切割後用用於染色體轉形之pSKH130載體(SEQ ID NO：58，美國申請公開號2020-0048619)進行選殖，以獲得重組質體，並將其命名為pSKH_Ptrc-yhhS。
上文使用之引子序列係顯示於表1中。
[表1]
1-2.製備具有增強的YhhS表現之菌株
將實施例1-1中製備之pSKH_Ptrc-yhhS引入CA07-0012(KCCM 11121P，美國專利公開號US 8557549 B2)中，該菌株係OPS製造菌株，其中OPS分解能力業經藉由使野生型大腸桿菌K-12 W3110中之內源性磷絲胺酸燐酸酶
(SerB)缺失而有所弱化，以增強YhhS(SEQ ID NO：6，其係具有OPS輸出能力之蛋白質)之表現，藉此進一步增強OPS輸出能力。
藉由電穿孔(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541-545)將實施例1-1中製備之pSKH_Ptrc-yhhS轉形至CA07-0012菌株中，然後使用R6K及康黴素在第一次交叉時獲得所欲之菌株。之後，該菌株在含有蔗糖之培養基中經歷次級交叉以獲得其中康黴素抗性基因經缺失且Ptrc啟動子之核苷酸序列經插入在yhhS基因之野生型啟動子之核苷酸序列末端處的菌株。Ptrc啟動子之核苷酸序列的插入係透過基因體定序及使用引子對SEQ ID NO：16及17進行之PCR擴增來證實，該PCR擴增可分別擴增同源重組之上游區及下遊區的外部區。如是獲得之菌株係命名為CA07-4821(CA07-0012 Δ Pn_yhhS：：Ptrc_yhhS)。
上文使用之引子序列係顯示於表2中。
[表2]
實施例2：製備引入有nuo操縱組的OPS製造菌株
2-1.製備用於引入nuo操縱組之載體
基於野生型大腸桿菌ATCC27325染色體DNA作為模板來進行PCR，以使用引子對SEQ ID NO：18及19獲得在nuo操縱組(SEQ ID NO：3)之野生型啟動子之上游區的基因片段，並且使用引子對SEQ ID NO：20及21獲得在nuo操縱組之野生型啟動子下游的基因片段。此外，基於野生型大腸桿菌
ATCC27325染色體DNA作為模板來進行PCR，以使用引子對SEQ ID NO：22及23獲得rmf基因(SEQ ID NO：8)之啟動子區。
SolgTM Pfu-X DNA聚合酶係用於PCR，且該PCR係在下述PCR擴增條件下進行：於95。℃變性2分鐘；之後進行30個於95℃變性30秒、於60℃低溫黏合30秒、並於72℃聚合60秒之循環；隨後於72℃聚合5分鐘。
使用浸入選殖套組，將藉由上述製程獲得之nuo啟動子之上游片段、及rmf啟動子片段在用限制酶EcoRV切割後用用於染色體轉形之pSKH130進行選殖，以獲得重組質體，並將其命名為pSKH_Ptrc-yhhS。
上文使用之引子序列係顯示於表3中。
[表3]
2-2.製備引入有nuo操縱組之菌株
藉由電穿孔將實施例2-1中製備之pSKH_Prmf-nuoA轉形到CA07-4821菌株中，該菌株係OPS製造菌株，其中OPS分解能力業經藉由使內源性磷絲胺酸燐酸酶(SerB)缺失而有所弱化，然後使用R6K及康黴素在首次交叉時獲得所欲之菌株。之後，該菌株在含有蔗糖之培養基中經歷次級交叉以獲得其中康黴素抗性基因經缺失且rmf基因之啟動子核苷酸序列經插入在nuo基因之野生型啟動子之核苷酸序列末端處的菌株。rmf啟動子之核苷酸序列的插入係
透過基因體定序及使用引子對SEQ ID NO：24及25進行之PCR擴增來證實，該PCR擴增可分別擴增同源重組之上游區及下遊區的外部區。如是獲得之菌株係命名為CA07-4828(CA07-4821 Δ Pn_nuoA：：Prmf_nuoA)。
上文使用之引子序列係顯示於下表4中。
[表4]
實施例3：製備具有增強或缺失的MntH表現之菌株
3-1.製備用於增強MntH表現之載體
作為先前研究之結果，發現mntH、serC及rmf基因在OPS製造宿主菌株中的平均轉錄量級分別為698、6215及32205，如下表5中所示，藉此證實，與mntH基因之平均轉錄量級相比，rmf基因之平均轉錄量級高出46倍，且serC基因之平均轉錄量級高出8.9倍。據此證實，與mntH啟動子相比，rmf基因啟動子及serC基因啟動子係相對較強的啟動子。
[表5]
因此，藉由進一步將經發現具有較強活性的rmf啟動子及serC啟動子(SEQ ID NO：9)插入到OPS製造微生物中mntH基因(SEQ ID NO：2)之啟動子的末端處來製備具有增強的MntH表現之菌株。
基於野生型大腸桿菌ATCC27325染色體DNA作為模板來進行PCR，以使用引子對SEQ ID NO：26及27獲得在mntH基因之野生型啟動子之上游區中的基因片段，並且使用引子對SEQ ID NO：28及29獲得在mntH基因之野生型啟動子下游的基因片段。此外，基於野生型大腸桿菌ATCC27325染色體DNA作為模板來進行PCR，以使用引子對SEQ ID NO：30及31獲得rmf基因之啟動子區。
SolgTM Pfu-X DNA聚合酶係用於PCR，且該PCR係在下述PCR擴增條件下進行：於95℃變性2分鐘；之後進行30個於95℃變性30秒、於60℃低溫黏合30秒、並於72℃聚合60秒之循環；隨後於72℃聚合5分鐘。
使用浸入選殖套組，將藉由上述製程獲得之nmtH啟動子之上游片段、及rmf啟動子片段在用限制酶EcoRV切割後用用於染色體轉形之pSKH130進行選殖，以獲得重組質體，並將其命名為pSKH130_Prmf-mntH。
基於野生型大腸桿菌ATCC27325染色體DNA作為模板來進行PCR，以使用引子對SEQ ID NO：32及33獲得在mntH基因之野生型啟動子之上游區中的基因片段，並且使用引子對SEQ ID NO：34及35獲得在mntH基因之野生型啟動子下游的基因片段。此外，基於野生型大腸桿菌ATCC27325染色體DNA作為模板來進行PCR，以使用引子對SEQ ID NO：36及37獲得serC基因之啟動子區。
SolgTM Pfu-X DNA聚合酶係用於PCR，且該PCR係在下述PCR擴增條件下進行：於95℃變性2分鐘；之後進行30個於95℃變性30秒、於60℃低溫黏合30秒、並於72℃聚合60秒之循環；隨後於72℃聚合5分鐘。
使用浸入選殖套組，將藉由上述製程獲得之nmtH啟動子之上游片段、及serC啟動子片段在用限制酶EcoRV切割後用用於染色體轉形之pSKH130進行選殖，以獲得重組質體，並將其命名為pSKH130_Prmf-mntH。
3-2.製備用於使MntH缺失之載體
基於野生型大腸桿菌ATCC27325染色體DNA作為模板來進行PCR，以使用引子對SEQ ID NO：38及39獲得在mntH基因之野生型啟動子之上游區中的基因片段，並且使用引子對SEQ ID NO：40及41獲得在mntH基因之野生型啟動子下游的基因片段。
以與實施例3-1中相同之方式進行PCR以獲得mntH啟動子之上游及下游片段，並以與實施例3-1中相同之方式選殖該等片段以獲得重組質體。如是獲得之質體係命名為pSKH_Δ mntH。
實施例3-1及3-2中使用之引子序列係顯示於下表6中。
[表6]
3-3.製備具有增強的MntH表現之菌株
藉由電穿孔將實施例3-1中製備之pSKH_PserC-mntH轉形到實施例1-2之CA07-4821菌株中，該菌株係具有增強的YhhS表現之OPS製造菌株，然後經歷次級交叉以獲得其中serC基因之啟動子核苷酸序列經插入在mntH基因之野生型啟動子之核苷酸序列末端處的菌株。serC啟動子之核苷酸序列的插入係透過基因體定序及使用引子對SEQ ID NO：42及43進行之PCR擴增來證實，該PCR擴增可分別擴增同源重組之上游區及下遊區的外部區。如是獲得之菌株係命名為CA07-4895(CA07-4821 Δ Pn_mntH：：PserC_mntH)。
藉由電穿孔將實施例3-1中製備之pSKH_Prmf-mntH及pSKH_PserC-mntH各自轉形到實施例2-2之CA07-4828菌株中，該菌株係經引入有nuo操縱組的OPS製造菌株，然後經歷次級交叉以獲得其中serC或rmf基
因之啟動子核苷酸序列分別經插入在mntH基因之野生型啟動子之核苷酸序列末端處的菌株。serC啟動子或rmf啟動子之核苷酸序列的插入係透過基因體定序及使用引子對SEQ ID NO：42及43進行之PCR擴增來證實，該PCR擴增可分別擴增同源重組之上游區及下遊區的外部區。如是獲得之菌株分別命名為CA07-4898(CA07-4828 Δ Pn_mntH：：PserC_mntH)及CA07-4899(CA07-4828 Δ Pn_mntH：：Prmf_mntH)。
3-4.製備具有缺失的MntH之菌株
藉由電穿孔將實施例3-2中製備之pSKH_Δ mntH轉形到實施例2-2之CA07-4828菌株中，其係引入有nuo操縱組的OPS製造菌株，然後經歷次級交叉以獲得具有缺失的mntH基因之菌株。mntH核苷酸序列之缺失係透過基因體定序及使用引子對SEQ ID NO：42及44進行之PCR擴增來證實，該PCR擴增可分別擴增同源重組之上游區及下遊區的外部區。如是獲得之菌株命名為CA07-4897(CA07-4828 Δ mntH)。
實施例3-3及3-4中使用之引子序列係顯示於下表7中。
[表7]
實施例4：評估菌株的OPS製造能力
進行燒瓶醱酵效價評估，以便量測以下菌株之OPS製造能力：實施例3-3之CA07-4895菌株、CA07-4898菌株及CA07-4899菌株，其等係具有增強的MntH表現之菌株；實施例3-4之CA07-4897菌株，其係具有缺失的MntH
之菌株；及實施例1-2之CA07-0012菌株，其係親本菌株；實施例1-2之CA07-4821菌株及實施例2-2之CA07-4828菌株，其等係對照菌株。
將該等菌株中之各者鋪板於固體LB培養基上，並於33℃培養箱中孵育越夜。於固體LB培養基中培養越夜的菌株係IGN接種至25mL的下列效價培養基中，然後在培養箱中以200rpm之速率於33℃培養48小時。培養完成後，使用HPLC量測OPS的濃度，並且結果係顯示於下表8中。
<效價培養基>
葡萄糖40g/L、KH2PO4 6g/L、(NH4)2SO4 17g/L、MgSO4．7H2O 1g/L、MnSO4．4H2O 5mg/L、FeSO4．7H2O 10mg/L、L-甘胺酸1.5g/L、酵母萃取物2.5g/L、CaCO3 30g/L，pH 6.8
[表8]
如表8中所示，與親本菌株相比，使用YhhS增強之CA07-4821菌株作為親本菌株的MntH增強之CA07-4895菌株顯示增加9.4%的OPS製造能力。
與YhhS增強之CA07-4821菌株相比，其中YhhS及nuo操縱組經同步增強的CA07-4828菌株顯示增加7.9%的OPS製造能力。
此外，與親本菌株相比，使用具有增強的nuo操縱組之CA07-4828作為親本菌株的MntH增強之CA07-4898及CA07-4899菌株分別顯示增加2.3%及5.3%的OPS製造能力。與親本菌株相比，具有缺失的MntH之CA07-4897菌株顯示減少-10.3%的OPS製造能力。
據此，證實MntH之增強增加了OPS產生能力。
根據前述內容，本揭露所屬領域具有通常知識者將能夠理解，本揭露可以其他特定形式實施而不改變本申請之技術概念或基本特徵。就此而言，本文揭露之示例性實施方案僅作示例性說明目的之用，且不應視為限制本揭露之範疇。相反，本揭露旨在不僅覆蓋例示性實施方案而且覆蓋各種替代、修飾、均等物，及可包括在如所附申請專利範圍所限定之精神及範疇內的其他實施方案。
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Claims (15)
- 一種製造O-磷絲胺酸之重組微生物，在該重組微生物中，與內源性活性相比，MntH蛋白之活性經增強。
- 如請求項1所述之微生物，其中，與內源性O-磷絲胺酸製造活性相比，該重組微生物具有增強的O-磷絲胺酸製造能力。
- 如請求項1所述之微生物，其中，該MntH蛋白包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
- 如請求項1所述之微生物，其中，編碼該MntH蛋白的多核苷酸包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列。
- 如請求項1所述之微生物，其中，與內源性活性相比，選自NADH：醌氧化還原酶及O-磷絲胺酸輸入蛋白中之一者或多者的活性復經增強。
- 如請求項1所述之微生物，其中，該重組微生物屬於艾氏菌屬。
- 一種用於製造O-磷絲胺酸之方法，其包含在培養基中培養製造O-磷絲胺酸之重組微生物，在該重組微生物中，與內源性活性相比，MntH蛋白之活性經增強。
- 如請求項7所述之方法，其中，該方法復包含從經培養的培養基或微生物回收O-磷絲胺酸。
- 如請求項7所述之方法，其中，該MntH蛋白包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
- 如請求項7所述之方法，其中，編碼該MntH蛋白的多核苷酸包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列。
- 一種用於製造半胱胺酸及其衍生物之方法，該方法包含：a)在培養基中培養製造O-磷絲胺酸之重組微生物以製造O-磷絲胺酸或含有O-磷絲胺酸之培養基，在該重組微生物中，與內源性活性相比，MntH之活性經增強；以及b)使步驟a)中製造之O-磷絲胺酸或含有O-磷絲胺酸之培養基與硫化物在O-磷絲胺酸硫化氫解酶(OPSS)或包含該酶之微生物的存在下反應。
- 如請求項11所述之方法，其中，該硫化物係選自由Na2S、NaSH、(NH4)2S、H2S及Na2S2O3所組成之群組之一者或多者。
- 如請求項11所述之方法，其中，該MntH蛋白包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
- 如請求項11所述之方法，其中，編碼該MntH蛋白的多核苷酸包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列。
- 一種製造O-磷絲胺酸之重組微生物在製造O-磷絲胺酸、半胱胺酸或半胱胺酸衍生物之用途，在該重組微生物中，與內源性活性相比，MntH蛋白之活性經增強。
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