TW202444758A

TW202444758A - 新結合分子

Info

Publication number: TW202444758A
Application number: TW113110767A
Authority: TW
Inventors: 朗尼佛克; 肯霍內克; 漢娜勞登; 麗莎桑德斯朱; 馬汀拉哈馬爾
Original assignee: 瑞典商生物極公司
Priority date: 2023-03-24
Filing date: 2024-03-22
Publication date: 2024-11-16
Also published as: WO2024200271A1; WO2024200267A1

Abstract

本發明係關於結合至人類運鐵蛋白受體1 (TfR1)之蛋白酶樣域的結合分子(例如抗體或其抗原結合片段)，以及關於其治療與診斷用途。

Description

新結合分子

本發明係關於結合至人類運鐵蛋白受體1 (TfR1)之蛋白酶樣域的結合分子，例如抗體或其抗原結合片段，且係關於其治療及診斷用途。

由於腦血管對血流中所攜載之大部分物質具有不滲透性，因此腦及神經疾病之治療模式受到限制(Freskgard及Urich (2017), Neuropharmacology 120:38-55; Stanimirovic等人(2018), BioDrugs 32:547-559)。腦之小血管(毛細管)統稱為血腦障壁(BBB)，與身體周邊中發現之血管相比係獨特的。BBB內皮細胞(EC)與諸如星形膠質細胞、外被細胞及神經元等神經細胞緊密並置，誘導產生有助於觀測到的不滲透性之表型特徵。BBB中EC之間的緊密連接限制旁細胞轉運，而缺乏被動胞飲囊泡及內皮窗孔限制非特異性跨細胞轉運。此等因素共同限制了自血液至腦之分子通量，一般限制為尺寸小於500 Da且具有親脂性之分子。因此，使用血流之大傳質表面積(人類腦中600 km的毛細管超過20 m ²)作為遞送媒劑的前景在很大程度上係不可行的，除了在具有所需藥理特性之藥物偶然具有允許其穿過BBB之尺寸及親脂性屬性的彼等情況下。由於此類限制，據估計超過98%之所有小分子藥劑及接近100%之新興類別之蛋白質及基因治療劑不會穿過BBB。

WO91/03259提出穿過BBB轉運神經藥劑之原理，其涉及將藥劑結合至與運鐵蛋白受體具有反應性之抗體。根據本發明，結合物與運鐵蛋白受體之結合使得結合物穿過BBB主動轉運。後續工作已進一步發展此概念，例如WO2012/075037、WO2014/033074、WO2018/011353及WO2022/258841中所描述，所有者皆描述藉由利用運鐵蛋白受體實現生物藥劑穿過BBB轉運的不同形式。

存在兩種形式之人類運鐵蛋白受體。運鐵蛋白受體1 (TfR1)為本發明之結合分子的目標。TfR1為鐵轉運蛋白，其藉由透過經格形蛋白塗佈之囊泡介導之內飲作用將鐵載體蛋白運鐵蛋白(Tf)及鐵蛋白(Ft)特異性結合至細胞中而識別及內化，從而保持細胞鐵含量。TfR1在許多細胞及器官中表現，但表現量各不相同，且重要的是，TfR1在BBB內皮細胞上之表現程度高於在其他內皮細胞上之表現程度，使得受體成為神經藥劑遞送之目標。在結構上，TfR1為包含胺基酸序列SEQ ID NO: 85之二聚跨膜醣蛋白，其具有較大的胞外域(殘基89-760)、膜內區(殘基62-88)及細胞質域(殘基1-61)。胞外域又具有三個不同的域，經由莖區(殘基89-120)與細胞表面分開。胞外域之此三個部分為螺旋域(殘基606-760)、蛋白酶樣域(殘基121-183、384-605)及頂端域(殘基184-383) (Lawrence等人(1999), Science 286:779-782)。

在經由TfR1進行BBB轉運之上下文中，已描述對TfR1具有親和力之抗體及其片段。舉例而言，WO2014/189973中揭示多種TfR1結合抗體，其中抗體根據表位特異性分組為I至IV類(參見例如圖3及第30頁第11至15行之相關圖式描述)。WO2014/189973之I-III類被表示為「頂端結合劑」，而IV類抗體被表示為「非頂端結合劑」。其他TfR1結合抗體揭示於EP3088518、EP3315606及EP3560958中，然而沒有關於此等所揭示之抗體之表位特異性的任何資訊。

因此，對使用TfR1作為結合及BBB轉運之目標的大部分工作均集中於頂端結合劑。此被認為係因為頂端域為TfR1內似乎會引起強烈的免疫反應且因此在用作免疫原時觸發動物內之抗體產生的結構。因此，針對TfR1之大部分已知的抗體結合劑具有位於頂端域內之表位。頂端域含有易於與各種配位體接合之結構的另一跡象為病毒已被描述為利用頂端域內之表位進入細胞(Cohen-Dvashi等人(2020), Nat Commun 11:67)。

此外，最近確定了TfR1及鐵蛋白複合物之詳細結構(Montemiglio等人(2019), Nat Commun 10:1121)，示出TfR1與鐵蛋白之間的界面位於頂端域內。此表明，若將TfR1頂端結合劑用於BBB轉運，則其可能會干擾鐵蛋白與TfR1之結合，且以此方式影響鐵蛋白在鐵轉運中之正常功能。此外，H-鐵蛋白之結合及吸收已示出為由TfR1介導(Li等人(2010), Proc Natl Acad Sci USA 107(8):3505-10)。因此，有理由得出以下結論：針對TfR1之頂端域的結合劑，尤其是結合至鐵蛋白所使用之結合位點的結合劑，可能會對鐵蛋白經由結合至TfR1轉運鐵的重要功能產生不利影響。

已報導，TfR1頂端結合劑可誘導急性臨床徵象及循環網狀紅血球減少(Couch等人(2013), Sci Transl Med 5:183ra57)。TfR1亦被描述為與貧血及缺鐵有關(Braga等人(2014), Clin Chim Acta 431:143-147)。亦已描述由TfR1自體抗體所致之貧血(Hyman等人(1984), N Engl J Med 311:214-218)。綜合而言，資料表明TfR1結合且干擾鐵轉運蛋白(諸如運鐵蛋白及/或鐵蛋白)可導致安全問題，諸如網狀紅血球含量降低及貧血。

迄今為止，本領域內之焦點為避免干擾所描述之TfR1配位體中之一者，亦即運鐵蛋白。此已引導本領域利用TfR1之頂端域中遠離運鐵蛋白之結合位點的結合位點。然而，此類頂端結合劑仍可干擾其他重要的TfR1配位體、鐵蛋白，導致鐵轉運及功能之干擾。

在此背景下，本領域仍需要抗體及其他結合分子，其對TfR1具有結合親和力，但不展現與迄今已知的結合分子相關之缺點及風險。

本發明之目標為藉由提供TfR1結合分子來滿足此需求，該結合分子利用TfR1上與天然存在之配位體不同的結合位點。

一個此類目標為提供TfR1結合分子，其利用TfR1上與運鐵蛋白不同之結合位點。

另一此類目標為提供TfR1結合分子，其利用TfR1上與鐵蛋白不同之結合位點。

又一此類目標為提供TfR1結合分子，其利用TfR1上與HFE (恆穩鐵調節子)不同之結合位點。

本發明之相關目標為提供TfR1結合分子，其以使對TfR1自身及/或其正常功能之干擾減至最小的方式與TfR1相互作用。

本發明之另一目標為提供TfR1結合分子，其在經配置以通過BBB轉運之構築體中適用作融合搭配物。

熟習此項技術者自本文中之教示顯而易見的此等目標及其他目標中之一或多者藉由本發明之各種態樣實現。

因此，在第一態樣中，本發明提供一種運鐵蛋白受體1 (TfR1)結合分子，其能夠選擇性結合至位於由SEQ ID NO: 85中之胺基酸殘基121-183及384-605定義的TfR1之蛋白酶樣域中之表位。不希望受理論所束縛，預期在蛋白酶樣域內TfR1與表位或結合位點之結合在避免與已知的TfR1結合劑，特別是對位於TfR1之頂端域中的表位或結合位點具有親和力之彼等已知的結合劑相關之缺點方面提供優勢。

在特定實施例中，本發明之TfR1結合分子的表位或結合位點包含SEQ ID NO: 85中之胺基酸殘基150、151、154、158、159、161、163及385。在另一實施例中，本發明之TfR1結合分子的表位或結合位點由SEQ ID NO: 85中之胺基酸殘基150、151、154、158、159、161、163及385組成。在替代性特定實施例中，TfR1結合分子之表位或結合位點包含SEQ ID NO: 85中之胺基酸殘基150、151、154、158、159、161、163及385中的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個或全部八個或由其組成。依以下實例中所示，例如參考圖12，本文所鑑別及揭示之結合分子的表位之此實施例確保不干擾天然的TfR1配位體運鐵蛋白及鐵蛋白的結合。

依熟習此項技術者已知，表位(或「抗原決定子」)係暴露於分子表面上之一組胺基酸或其他化學基團，通常為蛋白質，此處為hTfR1，其可產生抗原反應且結合抗體。表位為由免疫系統，尤其是抗體識別之抗原之表面上的局部化區。構形表位由位於抗原蛋白質表面結構上之相鄰胺基酸殘基構成。構形表位結合其在B細胞受體及/或抗體中之互補式互補位。在本發明之一個實施例中，結合分子所結合之表位為構形表位。

在結合分子之一個實施例中，其包含免疫球蛋白重鏈可變區(VH)及免疫球蛋白輕鏈可變區(VL)，該VH區及該VL區形成包含抗原結合表面之VH/VL對，其中該抗原結合表面為結合分子提供選擇性結合至該表位之能力。該VH/VL對可例如以全長傳統抗體形式提供，或以選自由以下組成之群的抗體片段形式提供：Fab片段、單鏈Fab (scFab)片段、Fv片段及單鏈(scFv)片段。在特定實施例中，VH/VL對形成scFv之部分。與VH/VL對相關使用的「VH/VL」之名稱不將構築體限於多肽鏈中VH區及VL區之任何特定次序，而是僅用於表達VH區及VL區均存在，且該VH區及該VL區能夠成對關聯以形成具有抗原結合表面之Ig域。因此，術語「VH/VL對」涵蓋例如其中VL區在單鏈Fv中位於VH區之前的構築體、其中VH區在單鏈Fv中位於VL區之前的構築體以及其中VH區及VL區彼此非共價關聯的構築體。

關於VH/VL對之抗原結合表面，其可適當地由來自該VH區之三個互補決定區(CDR)及來自該VL區之三個CDR構成。在一個實施例中，該等CDR包含以下： VHCDR1： X1X2NMX3(SEQ ID NO: 1)，其中 X1係選自D及A； X2係選自Y及A；且 X3係選自D及A； VHCDR2： X4INPX5X6X7TTSX8X9X10KFKG(SEQ ID NO: 2)，其中 X4係選自D及A； X5係選自D、N及A； X6係選自Y及A； X7係選自D及A； X8係選自Y及A； X9係選自N及S；且 X10係選自E及Q； VLCDR1： KSSQSLLX11SX12NX13KNX14LA(SEQ ID NO: 4)，其中 X11係選自Y及A； X12係選自T及S； X13係選自Q及R；且 X14係選自Y及A； VLCDR2： X15ASTRES(SEQ ID NO: 5) 其中 X15係選自W及A；及 VLCDR3： QQX16X17X18X19PX20T(SEQ ID NO: 6) 其中 X16係選自Y及A； X17係選自F及Y； X18係選自I及N； X19係選自Y及A；且 X20係選自R及Y。

在一個實施例中，CDR進一步包含： VHCDR3： GGX21SGSSX22X23HPMX24X25(SEQ ID NO: 3) 其中 X21係選自Y及A； X22係選自Y及A； X23係選自Y及A； X24係選自D及A；且 X25係選自Y及A。

在替代性實施例中，CDR進一步包含： VHCDR3： SEAGNYYWYFDV(SEQ ID NO: 35)

依本文所定義，包含VH/VL對的本發明之第一態樣之結合分子的實施例在確定其結合能力之區中具有特定的胺基酸序列，諸如重鏈及/或輕鏈可變域之CDR，或實際上整個VL及/或VH域或區之CDR。本文提供依實例1-9中所描述產生及表徵之特異性抗體的此類特定的胺基酸序列之非限制性實例。經考慮，針對所產生之抗體提供的特定序列資訊使得熟習此項技術者能夠在本發明之範疇內定義此等序列之組合及變化，諸如包括藉由提供為SEQ ID NO: 1至6之一般CDR序列之變化獲得的組合及變化。

在一個實施例中，該等CDR進一步包含： VHCDR3： GGX21SGSSX22X23HPMX24X25(SEQ ID NO: 3) 其中 X21係選自Y及A； X22係選自Y及A； X23係選自Y及A； X24係選自D及A；且 X25係選自Y及A。

在一個實施例中，該VHCDR2為： VHCDR2： X4INPX5X6X7TTSX8NEKFKG(SEQ ID NO: 7)，其中 X4係選自D及A； X5係選自D及A； X6係選自Y及A； X7係選自D及A；且 X8係選自Y及A。

在一個實施例中，該VLCDR1為： VLCDR1： KSSQSLLX11STNQKNX14LA(SEQ ID NO: 8)，其中 X11係選自Y及A；且 X14係選自Y及A。

在一個實施例中，該VLCDR3為： VLCDR3： QQX16FIX19PRT(SEQ ID NO: 9) 其中 X16係選自Y及A； X19係選自Y及A。

在一個實施例中，該VHCDR1之胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 10及16至18組成之群。

在一個實施例中，該VHCDR2之胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 11、19至23及34組成之群，例如選自由SEQ ID NO: 11及19至23組成之群。

在一個實施例中，該VHCDR3之胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 12、24至28及35組成之群，例如選自由SEQ ID NO: 12及24至28組成之群。

在一個實施例中，該VLCDR1之胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 13、29、30及36組成之群，例如選自由SEQ ID NO: 13、29及30組成之群。

在一個實施例中，該VLCDR2之胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 14及31組成之群。

在一個實施例中，該VLCDR3之胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 15、32、33及37組成之群，例如選自由SEQ ID NO: 15、32及33組成之群。

在一些實施例中，CDR序列可在以上列出之選項當中自由組合。舉例而言，此類實施例包括但不限於實例9中針對本發明之結合分子之h26D3實施例的經丙胺酸取代之變異體例示的彼等組合。

在包含VH/VL對之本發明之結合分子的一個特定實施例中，六個CDR之胺基酸序列如下： VHCDR1： DYNMD(SEQ ID NO: 10)， VHCDR2： DINPDYDTTSYNEKFKG(SEQ ID NO: 11)， VHCDR3： GGYSGSSYYHPMDY(SEQ ID NO: 12) VLCDR1： KSSQSLLYSTNQKNYLA(SEQ ID NO: 13)， VLCDR2： WASTRES(SEQ ID NO: 14) VLCDR3： QQYFIYPRT(SEQ ID NO: 15)

在包含VH/VL對之本發明之結合分子的另一特定實施例中，六個CDR之胺基酸序列如下： VHCDR1： DYNMD(SEQ ID NO: 10)， VHCDR2： DINPDADTTSYNEKFKG(SEQ ID NO: 21)， VHCDR3： GGYSGSSYYHPMDY(SEQ ID NO: 12) VLCDR1： KSSQSLLYSTNQKNYLA(SEQ ID NO: 13)， VLCDR2： WASTRES(SEQ ID NO: 14) VLCDR3： QQYFIYPRT(SEQ ID NO: 15)

在包含VH/VL對之本發明之結合分子的另一特定實施例中，六個CDR之胺基酸序列如下： VHCDR1： DYNMD(SEQ ID NO: 10)， VHCDR2： DINPNYDTTSYSQKFKG(SEQ ID NO: 34)， VHCDR3： SEAGNYYWYFDV(SEQ ID NO: 35) VLCDR1： KSSQSLLYSSNRKNYLA(SEQ ID NO: 36)， VLCDR2： WASTRES(SEQ ID NO: 14) VLCDR3： QQYYNYPYT(SEQ ID NO: 37)

在包含VH/VL對之本發明之結合分子的另一特定實施例中，六個CDR之胺基酸序列如下： VHCDR1： NYWLG(SEQ ID NO: 38)， VHCDR2： DIFPGSDNTYYNEKFKG(SEQ ID NO: 39)， VHCDR3： SGNFYAMDY(SEQ ID NO: 40) VLCDR1： SASSSVNYMN(SEQ ID NO: 41)， VLCDR2： DTSKLAS(SEQ ID NO: 42) VLCDR3： FQGSGYPFT(SEQ ID NO: 43)

在一個實施例中，包含於本發明之結合分子中之抗原結合界面中的CDR序列使用Kabat定則所定義，該Kabat定則為抗體技術領域的技術人員所熟知(參見例如Kabat (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 來自美國衛生與公眾服務部(US Department of Health and Human Services)之第91-3242號NIH公開案)。

在包含VH/VL對之本發明之結合分子的一個實施例中，該VH區包含選自以下之胺基酸序列或由其組成： (i) 由SEQ ID NO: 44至57、65及67組成之群，例如由SEQ ID NO: 44至57組成之群，例如由SEQ ID NO: 44及50組成之群；及 (ii) 與(i)中所定義之序列具有至少80%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之序列，其限制條件為CDR區之序列與(i)中所定義之序列的彼等100%一致。

在包含VH/VL對之本發明之結合分子的一個實施例中，該VL區包含選自以下之胺基酸序列或由其組成： (i) 由SEQ ID NO: 58至64、66及68組成之群，例如由SEQ ID NO: 58至64組成之群；及 (ii) 與(i)中所定義之序列具有至少80%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之序列，其限制條件為CDR區之序列與(i)中所定義之序列的彼等100%一致。

在一個特定此類實施例中，VH區及VL區均依上文所定義，亦即VH包含選自SEQ ID NO: 44至57之序列及與該序列具有至少80%序列一致性的序列或由其組成，且VL包含選自SEQ ID NO: 58至64之序列及與該序列具有至少80%序列一致性的序列或由其組成。

在包含VH/VL對之本發明之結合分子的另一實施例中，該VH區包含選自SEQ ID NO: 69之胺基酸序列及與SEQ ID NO: 69具有至少80%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的序列或由其組成，其限制條件為CDR區之序列與SEQ ID NO: 69之彼等具有100%一致性。

在包含VH/VL對之本發明之結合分子的另一實施例中，該VL區包含選自SEQ ID NO: 70之胺基酸序列及與SEQ ID NO: 70具有至少80%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的序列或由其組成，其限制條件為CDR區之序列與SEQ ID NO: 70之彼等具有100%一致性。

在一個特定此類實施例中，VH區及VL區均依上文所定義，亦即VH包含序列SEQ ID NO: 69及與其具有至少80%序列一致性的序列或由其組成，且VL包含序列SEQ ID NO: 70及與其具有至少80%序列一致性的序列或由其組成。

在包含VH/VL對之本發明之結合分子的一個實施例中，該VH區包含SEQ ID NO: 44且該VL區包含選自SEQ ID NO: 58至64之序列。

在包含VH/VL對之本發明之結合分子的一個實施例中，該VH區包含選自SEQ ID NO: 44至57之序列且該VL區包含SEQ ID NO: 58。

在包含VH/VL對之本發明之結合分子的一個實施例中，該VH區包含SEQ ID NO: 44且該VL區包含SEQ ID NO: 58。

在包含VH/VL對之本發明之結合分子的一個實施例中，該VH區包含SEQ ID NO: 50且該VL區包含SEQ ID NO: 58。

在某些實施例中，VH及VL序列(當存在於結合分子中時)係選自所列序列及與其具有至少80%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%一致性的序列中之任一者。

在包含VH/VL對之本發明之結合分子的一個實施例中，該VH/VL對形成抗體構築體之部分。

在一個此類實施例中，該抗體構築體具有多於一個結合特異性。其可例如為雙特異性或三特異性的，或具有多於三個結合特異性。在特定實施例中，結合分子為雙特異性的，例如為雙特異性抗體構築體。

在包含VH/VL對之本發明之結合分子的一個實施例中，VH/VL對存在於選自由以下組成之群的抗體片段中：Fab片段、單鏈Fab (scFab)片段、Fv片段及單鏈(scFv)片段。在此類結合分子之特定實施例中，該抗體片段為scFv。

在本文所揭示之結合分子的重要實施例中，除提供與hTfR1之選擇性結合的VH/VL對以外，其進一步包含抗體或其抗原結合片段。在一個此類實施例中，此額外抗體或其片段能夠選擇性結合至哺乳動物腦之腦中所存在之目標。在一些實施例中，該目標係選自由以下組成之群：澱粉樣蛋白-β肽或其衍生物或片段、α-突觸核蛋白或其衍生物或片段、TAR DNA結合蛋白43 (TDP-43)或其衍生物或片段、骨髓細胞觸發受體2 (TREM2)、β-分泌酶1 (BACE1)、超氧化物歧化酶(SOD)、杭丁頓蛋白(huntingtin)、運甲狀腺素蛋白、P-分泌酶1、表皮生長因子、表皮生長因子受體2、Tau、磷酸化Tau或其片段、脂蛋白元E4、CD20、普里昂蛋白(prion protein)、富含白胺酸之重複激酶2、帕金蛋白(parkin)、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6、澱粉樣蛋白-β前驅蛋白、p75神經營養因子受體、神經調節蛋白及凋亡蛋白酶6。在更特定的實施例中，該目標係選自由以下組成之群：澱粉樣蛋白-β肽或其衍生物或片段、α-突觸核蛋白或其衍生物或片段、TAR DNA結合蛋白43 (TDP-43)或其衍生物或片段、骨髓細胞觸發受體2 (TREM2)、Tau、磷酸化Tau或其片段及脂蛋白元E4。在甚至更特定的實施例中，該目標係選自由以下組成之群：澱粉樣蛋白-β肽或其衍生物或片段、α-突觸核蛋白或其衍生物或片段及TAR DNA結合蛋白43 (TDP-43)或其衍生物或片段。

在一個實施例中，能夠選擇性結合至哺乳動物之腦中所存在之目標的該抗體或其抗原結合片段為抗Aβ抗體，例如選自由以下組成之群的抗體：侖卡奈單抗(lecanemab)、更汀蘆單抗(gantenerumab)、阿杜卡努單抗(aducanumab)、多奈單抗(donanemab)、PBD-C06及KHK6640。

在另一實施例中，能夠選擇性結合至哺乳動物之腦中所存在之目標的該抗體或其抗原結合片段為抗α-突觸核蛋白抗體，例如選自由以下組成之群的抗體：普拉西單抗(prasinezumab)、UCB7853、Lu AF82422、TAK-341及BAN0805。

針對目標之親和力依本文所使用，術語「特異性結合至X」、「選擇性結合至X」及「針對X之親和力」(其中X為目標(例如抗原或表位，諸如由上文所定義之結合分子之VH/VL對結合的TfR1))係指結合分子之特性，諸如抗體或其抗原結合片段之特性或併入此類抗體或抗原結合片段的雙特異性或多特異性構築體之特性，其可例如藉由ELISA、表面電漿子共振(SPR)或生物層干涉術(BLI)進行測試。熟習此項技術者瞭解此等方法及其他方法。

舉例而言，針對目標、抗原或表位X之結合親和力可在如下實驗中進行測試，其中將待測試之結合分子捕捉在塗覆有X或包含表位X之分子的ELISA盤上，且添加生物素標記的偵測抗體，隨後添加鏈黴抗生物素蛋白結合的辣根過氧化酶(HRP)。替代地，該偵測抗體可與HRP直接結合。添加四甲基聯苯胺(TMB)受質，且使用ELISA多孔盤讀取器來量測在450 nm下之吸光度。接著，熟習此項技術者可解釋藉由此類實驗獲得之結果，以至少確立針對結合分子之X的結合親和力的定性量測。若需要定量量測例如以確定相互作用之EC50值(半數最大有效濃度)，則亦可使用ELISA。依上文所描述，結合分子針對X之稀釋系列之反應可使用ELISA來量測。接著，熟習此項技術者可解釋藉由此類實驗獲得之結果，且可使用例如GraphPad Prism v.9及非線性回歸，自該等結果計算EC50值。

依本文所使用，術語「EC50」係指在指定暴露時間之後，誘導基線至最大值之間一半的反應之結合分子的半數最大有效濃度。

另外或替代地，抑制ELISA可用於藉由確定「IC50」(半數最大抑制濃度)獲得相互作用之定量量測。在抑制ELISA中，藉由偵測預期信號輸出中之干擾來量測流體樣本中目標X之濃度。原則上，使用已知的目標或攜帶表位之物質來塗覆多孔盤。同時，添加對X具有推定親和力之結合分子且與含有不同濃度之目標的溶液一起培育。在標準阻斷及洗滌步驟之後，將含有該結合分子及該目標之混合物的樣本添加至孔中。接著，使用相關受質(例如TMB)施加對結合分子具有親和力之標記的偵測抗體進行偵測。原則上，若流體樣本中存在高濃度之目標，則將觀測到信號輸出顯著降低。相比之下，若流體樣本中存在極少目標，則預期信號輸出將極少降低。熟習此項技術者應瞭解，信號輸出亦視結合分子針對該目標之親和力而定。

依本文所使用，術語「IC50」係指在指定暴露時間之後，誘導基線至最大抑制之間一半的反應之結合分子的半數最大抑制濃度。本文中，與較高IC50值相比，較低IC50值指示干擾偵測抗體與已知的塗覆在培養盤上之目標之結合所需的目標之濃度較低。因此，較低IC50值通常對應於較高親和力。

結合分子之結合親和力亦可藉由表面電漿子共振(SPR)進行測試。舉例而言，可在如下實驗中測試該親和力，其中將目標或表位X固定於儀器之感測器晶片上，且將含有待測試之結合分子的樣本通過晶片上方。替代地，可將待測試之結合分子固定於儀器之感測器晶片上，且將含有X之樣本通過晶片上方。接著，熟習此項技術者可解釋藉由此類實驗獲得之結果，以至少確立針對結合分子之X的結合親和力的定性量測。若需要定量量測例如以確定相互作用之K _D值，則亦可使用SPR。結合值可例如在Biacore (Cytiva)或ProteOn XPR 36 (Bio-Rad)儀器中定義。將目標或表位適當地固定於儀器之感測器晶片上，且藉由連續稀釋製備待確定其親和力之結合分子的樣本且注射。接著，可使用例如通常由儀器製造商提供之Biacore Insight評估軟體2.0或其他合適軟體之1:1朗繆爾(Langmuir)結合模型自結果計算K _D值。

亦可藉由生物層干涉術(BLI) (一種用於量測分子互動組內之生物分子相互作用的無標記技術)量測結合親和力。該技術為分析由兩個表面反射之白光之干涉圖案的光學分析技術，該兩個表面亦即生物感測器尖端上之固定蛋白質層及內部參考層。溶液中固定於生物感測器尖端表面上之配位體(目標或表位X)與分析物(諸如對X具有推定親和力之結合分子)之間的結合使得生物感測器尖端處之光學厚度增加，從而產生波長偏移Δλ，其為生物層厚度之變化的直接量測。即時量測相互作用，從而提供精確且準確地監測結合特異性、結合及解離之速率或濃度的能力。

熟習此項技術者應瞭解，以上所提及之方法及其他用於定性或定量或兩者量測結合分子針對目標或表位X之親和力的方法。

醫藥組合物在第二態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本文所描述之結合分子及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。

用於調配多肽(諸如用於人類治療用途之抗體及其衍生物)之技術為此項技術中熟知的，且綜述於例如Wang等人(2007), J Pharm Sci, 96:1-26中，其內容整體併入本文中。

可用於調配組合物之醫藥學上可接受之賦形劑包括但不限於離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白(諸如人類血清白蛋白)、緩衝物質(諸如磷酸鹽)、甘胺酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸之偏甘油酯混合物、水、鹽或電解質(諸如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽)、膠態二氧化矽、三矽酸鎂、聚乙烯吡咯啶酮、基於纖維素之物質(例如羧甲基纖維素鈉)、聚乙二醇、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇及羊毛脂。

在某些實施例中，醫藥組合物經調配用於經由包括但不限於以下之任何合適的投與途徑來向個體投與：肌肉內、靜脈內、皮內、腹膜內注射、皮下、硬膜外、經鼻、經口、經直腸、局部、吸入、經頰(例如舌下)及經皮投與。在較佳實施例中，組合物經調配用於靜脈內或皮下投與。

預防、治療、診斷、預後及偵測之方法根據本發明之結合分子可適用作治療劑、預防劑、診斷劑及/或預後劑。

因此，在本發明之另一態樣中，提供一種根據第一態樣之結合分子或根據第二態樣之醫藥組合物，其用作藥劑。

在本發明之又一態樣中，提供一種根據第一態樣之結合分子或根據第二態樣之醫藥組合物，其用作診斷劑。

在本發明之又一態樣中，提供一種根據第一態樣之結合分子或根據第二態樣之醫藥組合物，其用作預後劑。

亦提供預防、治療或診斷疾病或評定疾病預後之方法，其中本文所揭示之結合分子係向有需要之個體(通常為人類個體)投與。

亦提供所揭示之結合分子用於製造用於預防、治療、診斷及/或預後所列疾病中之任一者的組合物(諸如藥劑)的用途。

因此，在一個實施例中，結合分子或包含該結合分子之醫藥組合物適用於治療、預防、診斷及/或預後神經退化性病症，例如選自以下之病症：阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)及與Aβ蛋白質聚集相關之其他病症、創傷性腦損傷(TBI)、路易體失智症(Lewy body dementia，LBD)、唐氏症候群(Down's syndrome，DS)、肌肉萎縮性側索硬化(ALS)、額顳葉型失智症、Tau蛋白病、全身性澱粉樣變性、動脈粥樣硬化、巴金森氏症(Parkinson's disease，PD)、巴金森氏症失智症(Parkinson's disease dementia，PDD)、阿茲海默氏症之路易體變異(Lewy body variant of Alzheimer's disease)、多發性系統萎縮症、精神病、精神分裂症、庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、杭丁頓氏舞蹈症(Huntington's disease)及家族性澱粉樣神經病變。

在更特定的實施例中，該病症係選自以下：阿茲海默氏症及與Aβ蛋白質聚集相關之其他病症、路易體失智症(LBD)、唐氏症候群(DS)、肌肉萎縮性側索硬化(ALS)、額顳葉型失智症、Tau蛋白病、巴金森氏症(PD)、巴金森氏症失智症(PDD)及阿茲海默氏症之路易體變異。

在甚至更特定的實施例中，該病症係選自以下：阿茲海默氏症及與Aβ蛋白質聚集相關之其他病症、路易體失智症(LBD)、肌萎縮性側索硬化(ALS)及巴金森氏症(PD)，特別是阿茲海默氏症。

在替代性實施例中，結合分子或包含該結合分子之醫藥組合物適用於治療、預防、診斷及/或預後另一種病症，例如選自腦癌、多發性硬化症及溶酶體貯積病之病症。

在另一態樣中，提供一種治療、預防、診斷及/或預後上文所列之病症的方法，該方法包含向該哺乳動物投與一定量，諸如治療有效量之結合分子，或包含該結合分子之醫藥組合物。

以引用方式之併入本申請案中引用多個公開案，其中之各者以全文引用之方式併入本文中。

雖然已參考各種例示性態樣及實施例描述本發明，但熟習此項技術者將理解，在不脫離本發明之範疇的情況下，可作出各種變化，且等效物可取代其要素。另外，在不脫離本發明的基本範疇之情況下，可進行許多修改以使特定情形或分子適應本發明之教示。因此，意欲本發明不限於任何特定實施例，且本發明將包括落入隨附申請專利範圍之範疇內的所有實施例。

本發明將藉由以下非限制性實例來進一步說明。出於說明之目的而提供該等非限制性實例，且並不意欲以任何方式限制本發明。熟習此項技術者將易於識別出可改變或修改以產生基本上相同結果之各種非關鍵參數。已作出努力以確保所使用數字的準確性(例如，量、溫度等)，但可能存在一些實驗誤差及偏差。除非另外指示，否則本發明之實踐將採用本領域技能內之蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術及藥理學之習知方法。在現有文獻中充分解釋該等技術。另外，熟習此項技術者將顯而易見，本文中應用之蛋白質工程改造方法亦可應用於本文所描述之其他構築體且本案發明人預期該等構築體落入本發明之範疇內。

實例 1 藉由免疫接種及篩選鑑別人類 TfR1 之結合劑 免疫接種及融合瘤篩選為了鑑別結合人類運鐵蛋白受體1 (hTfR1)之單株抗體，用免疫原及佐劑對四隻6至10週齡的Balb/c或C57BL/6小鼠進行皮下免疫接種。hTfR1免疫原經設計以含有人類TfR1蛋白質之胞外域，經由GSS連接子與來自破傷風毒素P2 (Kovacs-Nolan及Mine (2006), Biochim Biophys Acta 1760:1884-1893)之T細胞表位N端融合，及N端10×組胺酸標記(His ₁₀-P2-hTfR1；SEQ ID NO: 71)。在基因構築之後，使用Expi293™表現系統(Gibco)，藉由在Hek293細胞中短暫轉染而產生重組His ₁₀-P2-hTfR1蛋白質，在鎳管柱(HisTrap FF, 目錄號為17-5255-01, GE Healthcare)上純化，將緩衝液更換為PBS且濃縮至1 mg/ml。將表現之TfR1免疫原等分且儲存在-80℃下，直至使用。除不包括佐劑之最終加強注射以外，Quil-A佐劑(vac-quil, InvivoGen)適用於所有免疫接種。使用時，以1 mg/ml之濃度將Quil-A再懸浮於ddH ₂O中，無菌過濾且等分為0.1 ml等分試樣，儲存於-80℃下。以10微克/小鼠之劑量投與Quil-A。

每月用重組產生之免疫原His ₁₀-P2-hTfR1對動物進行免疫接種，該免疫原與Quil-A混合且共投與。在每次免疫接種之後三週，收集血液樣本，且分析血漿中是否存在對重組產生之人類TfR1及小鼠TfR1具有反應性之抗體。當在1/100,000稀釋度下ELISA反應超過空白組(亦即背景)之平均值加上空白組之3個標準差時，效價被視為足夠高。此研究中使用的四隻小鼠各自接受4次至6次免疫接種。

在融合之前三天，在無佐劑之情況下對小鼠進行最終腹膜內加強注射。在處死時，用異氟醚麻醉小鼠。藉由打開腹腔收集完整的脾臟且進行解剖。簡言之，製備來自免疫接種小鼠之脾臟之單細胞懸浮液且以3:1比率與Sp2/0細胞混合。使用PEG融合細胞，且將細胞添加至ClonaCell™-HY培養基D (STEMCELL Technologies)之瓶中。隨後將每孔60至70 µl分配於96孔盤中。在6至7天之後，將150 µl HAT培養基添加至半固體96孔盤之各孔中。第二天，自各孔中丟棄120 µl上清液，且添加100 µl新鮮的HAT培養基。次日，自各孔取出100 µl上清液且將其轉移至儲存盤，且根據以下方案在塗覆有鎳之培養盤上使用間接ELISA測試是否存在針對小鼠TfR1之抗體。藉由在第12天添加120 µl HAT培養基且3天後將25 µl上清液轉移至ELISA盤以篩選針對小鼠TfR1之反應性來進行融合瘤盤之重複篩選(兩次篩選均稱為「初級篩選」)。將對小鼠TfR1呈陽性且OD＞0.2之殖株轉移至24孔盤，培養至少3天，且使用生物層干涉術(BLI)對溶液中之鼠類、人類及食蟹獼猴TfR1的反應性進行二級篩選(稱為「二級篩選」)。儘管指示與hTfR1及食蟹獼猴TfR1之結合，但在二級篩選中針對mTfR1僅偵測到極弱的結合或未偵測到結合。依下文所描述，亦使用直接塗覆的TfR1盤及塗覆有鎳之培養盤，針對His標記之hTfR1的結合以及缺乏針對His標記之澱粉樣蛋白-β前驅蛋白(APP；陰性對照)的結合篩選來自24孔盤之上清液。亦使用直接TfR1塗層分析對食蟹獼猴TfR1 (cTfR1)之結合。值得注意的是，與hTfR1及cTfR1相比，mTfR1之ELISA反應(OD450值)極低，表明對於所有陽性殖株，與結合至hTfR1及cTfR1相比mTfR1之結合更弱。

使用限制稀釋分析(LDA)來稀釋所選擇之殖株以達到單株性。在LDA及擴增之後，藉由ELISA在單株培養物上重新測試針對小鼠TfR1及人類TfR1之反應性。

間接 ELISA 篩選根據標準ELISA方案進行ELISA分析，以篩選免疫接種之後對靶抗原具有反應性之血漿樣本，或鑑別產生對TfR1靶蛋白具有反應性之抗體的融合瘤殖株。簡言之，用1 µg/ml His ₁₀-mTfR1 (SEQ ID NO: 72)或His ₁₀-hTfR1 (SEQ ID NO: 73)塗覆96孔半區盤(Corning)。使用上文針對His ₁₀-P2-hTfR1免疫原所描述之程序來重組產生及純化His ₁₀-mTfR1及His ₁₀-hTfR1。在室溫下，在搖動(600至900 rpm)下，用150微升/孔之無蛋白質阻斷溶液(Pierce)將培養盤阻斷1 h。用含有0.1% TWEEN ^®-20及Kathon™之PBS將培養盤洗滌四次。將自1/450之起始稀釋度連續稀釋之血漿樣本或稀釋為1/2的融合瘤上清液添加至培養盤(50微升/孔；稀釋緩衝液：含0.1% BSA及0.05% TWEEN ^®-20之PBS)中且在室溫下培育2 h，且隨後將培養盤洗滌四次。以50微升/孔添加偵測抗體(HRP結合的抗小鼠IgG, Southern Biotech, 目錄號為1030-05, 以1/5000稀釋於稀釋緩衝液中)，且在室溫下將培養盤培育1 h。再次洗滌(如上所述)之後，添加50微升/孔TMB受質(K-Blue ^®Aqueous, Neogen)，且在10至15 min之後以50微升/孔之0.5 M H ₂SO ₄停止反應。使用盤讀取器(Tecan)讀取450 nm下之光學密度。端點效價定義為高於空白組孔(背景)之平均值加上空白組孔之3個標準差的稀釋度。

使用塗覆有鎳之ELISA盤進行產生對靶蛋白具有反應性之抗體的融合瘤殖株之初級篩選。簡言之，將用BSA預阻斷之所供應的96孔塗覆有Ni之培養盤(PIERCE)與3 µg/ml (100 µl) His ₁₀-mTfR1一起培育，而無需在4℃下隔夜搖動。用含有0.1% TWEEN ^®-20及Kathon™之PBS將培養盤洗滌四次。將稀釋為1/4之融合瘤上清液添加至培養盤(稀釋緩衝液：含0.1% BSA及0.05% TWEEN ^®-20之PBS)中且在室溫下培育2 h，且隨後將培養盤洗滌四次。以100微升/孔添加偵測抗體(HRP結合的抗小鼠IgG, Southern Biotech, 目錄號為1030-05, 以1/5000稀釋於稀釋緩衝液中)，且在室溫下將培養盤培育1 h。再次洗滌(如上所述)之後，添加100微升/孔之K-Blue ^®Aqueous受質(Neogen)，且在10至15 min之後用100微升/孔之0.5 M H ₂SO ₄停止反應。使用ELISA盤讀取器(Tecan)讀取450 nm下之光學密度。

在結合小鼠TfR1及人類TfR1中被視為陽性殖株之實例展示於表1中。亦藉由ELISA證實此等殖株能夠結合His標記之hTfR及cTfR，且缺乏與His標記之APP的結合(陰性對照)。在各種分析中進一步表徵所選擇之殖株。表1：來自融合瘤篩選之所鑑別殖株之實例

殖株	藉由間接ELISA 之mTfR1 特異性(Ni 捕捉)	藉由 BLI 之 hTfR 結合	藉由 BLI 之 cynoTfR 結合	藉由 BLI 之 mTfR1 結合	同型( 根據定序)
24B4	OD＞0.2	有	有	無/弱	IgG2a/κ
26D3	OD＞0.2	有	有	無/弱	IgG2a/κ
37D10	OD＞0.2	有	有	無/弱	IgG2a/κ

生物層干涉術量測使用生物層干涉法(BLI)在Octet儀器(Octet Red384, ForteBio)上研究所選擇之殖株。在所使用之設置中，所採用之方法涉及自個別感測器尖端上之各別殖株捕捉IgG，以允許偵測結合至溶液中之目標的抗體。除提供結合之量測以外，BLI量測提供關於整體結合特性之更多細節，因為其包括締合速率及解離速率之估計。

圖1展示作為實例提供之三個所選擇之殖株的BLI量測結果，其中直接在粗製融合瘤上清液中量測結合。簡言之，在抗小鼠捕捉生物感測器(抗小鼠捕捉，AMC，分子裝置，目錄號為18-5580)上捕捉融合瘤上清液中之小鼠IgG抗體殖株，其以1:1稀釋於電泳緩衝液(PBS，0.02% TWEEN ^®-20及0.01% BSA)中。接下來，將具有固定IgG之感測器短暫洗滌10 s，隨後在電泳緩衝液中培育以建立基線信號。藉由在分析盤之孔中將感測器培育120 s來量測與靶抗原之結合，該等孔含有以下濃度之各別靶抗原：500 nM mTfR1、250 nM hTfR1及250 nM cTfR1。在電泳緩衝液中稀釋所有蛋白質。藉由在電泳緩衝液中將生物感測器培育90 s來量測目標解離。所有測試殖株，亦即24B4、26D3及37D10，皆與人類及食蟹獼猴TfR1結合，但與小鼠TfR1之結合非常弱。總體而言，大部分殖株展示對人類及食蟹獼猴TfR1之交叉反應性高於對小鼠TfR1之交叉反應性。

所選擇之殖株之定序將所關注之殖株低溫保藏且藉由全轉錄組鳥槍定序進行定序。在經定序之融合瘤殖株當中的殖株表示為26D3、24B4及37D10。針對此等抗體之各別重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區獲得之胺基酸序列在下表2中給出：表2：所選擇之初級抗體之可變區胺基酸序列

區	抗體胺基酸序列	SEQ ID NO:
	26D3
VH	EVQLQQFGVELVKPGASVKISCKASGYIFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDIN PDYDTTSYNEKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCARGGYSGSSY YHPMDYWGQGTSVTVSS	65
VL	DIVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPELLI YWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVRAEDLAVYYCQQYFIYPRTFGGGT KLEIK	66
	24B4
VH	EVQLQQFGAELVKPGTSVKISCKASGYTFTDYNMDWVKQGHGKGLEWIGDIN PNYDTTSYSQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCARSEAGNYYWY FDVWGAGTTVTVSS	67
VL	DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNRKNYLAWYRQKPGQSPKLLI YWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYSCQQYYNYPYTFGGGT KLEIK	68
	37D10
VH	QVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIF PGSDNTYYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARSGNFYAMD YWGQGTSVTVSS	69
VL	ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVNYMNWYQQKSSTFPKLWIYDTSKL ASGVPGRFSGSGSGKFYSLTISSMEAEDVATYYCFQGSGYPFTFGSGTKLEIK	70

使用Kabat定義鑑別此等抗體之互補決定區(CDR)，且在下表3中給出。表3：初級抗體之CDR序列

抗體	VHCDR1	VHCDR2	VHCDR3
26D3	DYNMD (SEQ ID NO: 10)	DINPDYDTTSYNEKFKG (SEQ ID NO: 11)	GGYSGSSYYHPMDY (SEQ ID NO: 12)
24B4	DYNMD (SEQ ID NO: 10)	DINPNYDTTSYSQKFKG (SEQ ID NO: 34)	SEAGNYYWYFDV (SEQ ID NO: 35)
37D10	NYWLG (SEQ ID NO: 38)	DIFPGSDNTYYNEKFKG (SEQ ID NO: 39)	SGNFYAMDY (SEQ ID NO: 40)
	VLCDR1	VLCDR2	VLCDR3
26D3	KSSQSLLYSTNQKNYLA (SEQ ID NO: 13)	WASTRES (SEQ ID NO: 14)	QQYFIYPRT (SEQ ID NO: 15)
24B4	KSSQSLLYSSNRKNYLA (SEQ ID NO: 36)	WASTRES (SEQ ID NO: 14)	QQYYNYPYT (SEQ ID NO: 37)
37D10	SASSSVNYMN (SEQ ID NO: 41)	DTSKLAS (SEQ ID NO: 42)	FQGSGYPFT (SEQ ID NO: 43)

實例 2 與人類及食蟹獼猴 TfR1 及表位篩選之活體外結合藉由BLI對經純化之選擇抗體進行更詳細的結合分析。研究來自鼠類抗體26D3、24B4及37D10之Fab片段與人類TfR1及食蟹獼猴TfR1的結合。舉例而言，BLI儀器Octet Red384用於量測固定TfR1與溶液中之測試Fab片段之間的結合。用與人類運鐵蛋白配位體(Tf)複合之TfR1量測結合至TfR1之抗體。藉由以下在鏈黴抗生物素蛋白生物感測器上形成Tf/TfR1複合物：首先用生物素標記之人類全運鐵蛋白裝載感測器，隨後藉由捕捉感測器上之hTfR1或cTfR1進行複合形成步驟。對於hTfR1及cTfR1兩者，感測器上之最終複合密度為類似的。在120 s之結合期及300 s之解離期量測結合至TfR1之抗體。圖2展示15 nM 24B4Fab、26D3Fab及37D10Fab中之各者以及來源於已知TfR1結合抗體8D3之Fab的感測圖譜(Boado等人(2009), Biotechnol Bioeng 102:1251-1258)。資料顯示，24B4-Fab及26D3-Fab兩者針對人類及cTfR1之類似結合分佈，且亦針對37D10-Fab偵測到與兩種物種之交叉反應性結合，同時未偵測到8D3-Fab針對人類或食蟹獼猴TfR1之顯著結合。重要的是，實驗展示當天然配位體運鐵蛋白與TfR1複合時，24B4-Fab、26D3-Fab及37D10-Fab皆結合至TfR1。

接下來，ELISA實驗展示抗體26D3、24B4及37D10結合至TfR1之蛋白酶樣域。在ELISA實驗中，使用人類、小鼠或三種不同的嵌合TfR1受體來塗覆ELISA盤(圖3)。根據實例1中所描述之間接ELISA稍微如下修改ELISA方案。簡言之，以1 μg/ml用以下His標記之抗原塗覆ELISA盤：人類TfR1 (His10-hTfR1；SEQ ID NO: 74)之胞外域、小鼠TfR1 (His10-mTfR1；SEQ ID NO: 75)之胞外域、由接枝於小鼠TfR1胞外域上之人類頂端域組成的嵌合TfR1 (h/m頂端域嵌合體，mhHD_TFR1；SEQ ID NO: 76)、由接枝於小鼠TfR1胞外域上之人類螺旋域組成的嵌合TfR1 (h/m螺旋域嵌合體，mhHD_TfR1；SEQ ID NO: 77)或由接枝於小鼠TfR1胞外域上之人類蛋白酶樣域組成的嵌合TfR1 (h/m蛋白酶樣域嵌合體，mhPLD_TfR1；SEQ ID NO: 78)。接著將塗覆的培養盤阻斷。在PBS中製備經分析抗體之小鼠IgG之稀釋系列且在ELISA盤上培育。接著，洗掉未結合的抗體，隨後用HRP結合的二級抗小鼠IgG將孔培育1 h。接著，再次洗滌培養盤，隨後添加HRP受質TMB以用於顯影及偵測結合至該等孔之抗體。藉由將0.5 M H ₂SO ₄添加至該等孔來停止TMB顯影，且在ELISA盤讀取器中以450 nm下之OD量測ELISA反應。依圖3中所繪示，26D3、24B4及37D10僅結合hTfR1 (A)而非mTfR1 (B)。不存在26D3、24B4或37D10與接枝於mTfR1胞外域(C)之其餘部分上的具有人類頂端域之構築體的結合。已知結合至人類頂端域之對照抗體15G11-1 (Yu等人(2014), Sci Transl Med 6:261ra154)展示如預期(C)結合至h/m頂端域嵌合體。另外，26D3、24B4及37D10結合至h/m蛋白酶樣域嵌合體(D)，但不結合至塗覆有其他嵌合受體(C及E)之任一培養盤。此外，在mTfR1之頂端域中具有表位之對照抗體8D3結合至塗覆有TfR1抗原之所有培養盤，包括此域，亦即mTfR1 (B)、h/m蛋白酶樣域嵌合體(D)及h/m螺旋域嵌合體(E)。總體而言，實驗證明26D3、24B4及37D10之一或多個表位主要位於hTfR1之蛋白酶樣域內，且此與對照抗體15G11-1及8D3形成對比。

在為表位分組(結合競爭)而進行的進一步BLI實驗中，隨後展示26D3及24B4之結合均靶向hTfR1之相同或重疊區，其中表位位於頂端域之外(圖4)。藉由以下在Octet Red384儀器(ForteBio)進行藉由BLI進行之表位鑑定實驗：首先(步驟1)將生物素標記之hTfR1固定至鏈黴抗生物素蛋白生物感測器(高精度生物感測器，ForteBio)。接下來(步驟2)，進行洗滌步驟。隨後(步驟3)，在緩衝液(非競爭性參考)或200 nM各別抗體(Ab)中培育裝載有hTfR1之感測器，以在感測器上形成hTfR1:Ab複合物。最後(步驟4)，在200 nM各別抗體中培育含有游離hTfR1 (參考)或各別預先形成的hTfR1:Ab複合物之感測器，以量測與競爭抗體複合物中之hTfR1的結合。圖4展示在所示主要分析步驟期間獲得之代表性BLI感測圖譜。步驟4中之信號指示兩種所分析之抗體之間的競爭程度。若抗體競爭結合至相同或重疊表位，則在步驟4中感測圖譜之信號不增加。反之，若兩種測試抗體結合至獨特的及不同的表位，則步驟4中之信號增加。

藉由上文所描述之表位鑑定進行競爭性篩選結合至hTfR1上之表位的抗體的結果繪示於圖5中。展示抗體26D3 (深灰色條)及24B4 (淺灰色條)以結合至重疊表位，其不同於對照抗體15G11-1 (黑色條)之hTfR1頂端域表位。圖5A展示當hTfR1與24B4複合時，26D3之結合反應降低了70%以上。如所預期，26D3與預先形成的hTfR1:26D3複合物之結合幾乎完全被抑制，說明該結合阻斷自身。類似地，圖5B展示當hTfR1與26D3複合且自身幾乎完全被抑制時，24B4之結合反應降低了70%。當hTfR1與對照抗體15G11-1複合時，24B4及26D3均保留對hTfR1之完全結合反應，該對照抗體之結合表位在hTfR1之頂端域內(圖5A及圖5B，黑色條)。依圖5C中所示，對照抗體15G11-1與hTfR1之頂端域具有類似結合反應，不管其是在無競爭抗體之情況下針對hTfR1進行測試還是在受體與24B4或26D3複合時進行測試。在圖5中，所有反應均根據各別抗體對游離hTfR1之最大結合反應進行標準化。

此外，研究結合至腦內皮細胞上之內源性hTfR1的抗體。使用流式細胞分析技術及人類hCMEC/D3細胞監測與細胞表面上之內源性hTfR1的結合(Weksler等人(2013), Fluids Barriers CNS 10:16)，已知該等細胞在其表面上表現顯著量之hTfR1。繪製對染色呈陽性之細胞，且平均螢光強度(MFI)展示於圖6中。圖6A (IgG1抗體)及圖6B (Fab片段)均展示，與具有較高的hTfR1親和力且程度高於較低的親和力對照抗體15G11-2之陽性對照抗體15G11-1相比，用24B4及26D3對hTfR1之細胞進行陽性染色，達到類似程度(MFI) (Yu等人(2014), 同上)。用陰性同型對照(圖6A)或非相關Fab片段Ly128 (圖6B)未偵測到背景染色。此等資料說明24B4及26D3均結合至在細胞表面上表現之hTfR1。

實例 3 競爭與鐵蛋白及運鐵蛋白之 hTfR1 結合評估根據本發明之結合劑與hTfR1的獨特結合、與hTfR1之蛋白酶樣域的結合且依實例1中所描述進行鑑別，以與天然TfR1配位體鐵蛋白(Ft)及運鐵蛋白(Tf)競爭。為了測試鐵蛋白與抗體的競爭，使用人類單核球性細胞株THP-1 (Sigma/ECACC)。證實scFv-Fc形式(參見以下實例4)及對照抗體(M-A712)與THP-1細胞表面上之hTfR1的結合，依圖7A中所示。為了評估鐵蛋白與所揭示之結合劑之間的競爭，在4℃下將細胞與連續稀釋之測試結合劑以及來自人類肝臟之鐵蛋白(BioRad, 4420-4804)一起培育1 h。在培育之後，使用針對人類肝臟鐵蛋白(BioRad, AHP2179G)之綿羊初級抗體捕捉與細胞表面上之hTfR1結合的鐵蛋白，且使用流式細胞分析技術進行分析。結果顯示於圖7B中，且展示26D3 scFv-Fc不與細胞表面上之鐵蛋白競爭，而已知與Ft (Maier等人(2016), Mol Ther Nucleic Acids 5:e321)結合至hTfR1上之相同表位的對照抗體抗CD71殖株M-A712明顯地與Ft結合競爭。此外，對於所鑑別之26D3 hTfR1結合劑，對Ft結合之影響要小得多，說明26D3在hTfR1上具有與Ft之結合位點不同的表位(圖7B)。

對於運鐵蛋白競爭，使用K562淋巴母細胞(Sigma/ECACC)。將細胞與連續稀釋之測試構築體連同Alexa Fluor 488結合的人類全運鐵蛋白(Thermo Fisher; T13342)一起培育，且在4℃下培育1 h。使用流式細胞分析技術捕捉結合至細胞表面上之hTfR1的運鐵蛋白，且繪製平均螢光強度。圖7C展示26D3結合劑與運鐵蛋白之間不存在競爭。當未標記(未結合)之Tf用作競爭之陽性對照時，以濃度依賴性方式降低經標記(AF488) Tf信號之結合。實驗說明針對TfR1之蛋白酶樣域的結合劑不與運鐵蛋白直接競爭相同的表位。

總體而言，此實例展示26D3與hTfR1之結合不會對兩種內源性配位體鐵蛋白及運鐵蛋白結合至受體之能力產生不利影響。

實例 4 人源化 hTfR1 結合劑 26D3分析依實例1至3中所描述鑑定及表徵之小鼠抗體26D3之Fab序列，且使用Bioluminate軟體(Schrödinger)產生26D3 Fab 3D結構之電腦模擬模型。將此鼠類Fab模型用作人源化之輸入。在此過程中，26D3之VH區及VL區之CDR (參見表3；SEQ ID NO: 10至15)電腦模擬地接枝於各種人類可變域中，且一些殘基在一些位置處回復突變為鼠類框架。自軟體產生且提取具有最少回復突變及另外合乎需要之特徵的三種變異體。選擇一種此類人源化變異體進行表現且表示為h26D3。h26D3具有SEQ ID NO: 44中所定義之VH區序列及SEQ ID NO: 58中所定義之VL區序列。人源化型式h26D3及鼠類初始序列26D3均藉由根據製造商說明書短暫轉染中國倉鼠卵巢細胞(ExpiCHO; Thermo Fisher Scientific)而表現為His標記之Fab。使用HiTrap IMAC Sepharose FF (Cytiva)純化收集之上清液，隨後在HiLoad Superdex 200pg 26/600 (Cytiva)上進行尺寸排阻層析。使用以下緩衝液：Ni-NTA洗滌緩衝液：20 mM Tris pH 8.0、10 mM咪唑及200 mM NaCl；Ni-NTA溶離緩衝液：20 mM Tris pH 8.0、200 mM NaCl及500 mM咪唑；尺寸排阻緩衝液(SEC)：1× dPBS (Thermo Fisher)。

在Biacore 8K儀器(Cytiva)上使用表面電漿子共振(SPR)評估經純化之Fab與人類及食蟹獼猴TfR1的結合，且結果展示於圖8中。根據製造商說明書，使用2型胺偶合套組(Cytiva, #BR100633)將1 µg/ml人類TfR1 (SEQ ID NO: 86之截斷的hTfR1)或食蟹獼猴TfR1 (SEQ ID NO: 87之截斷的cTfR1)固定在Cm5感測器晶片(Cytiva, #BR100399)上。以25 nM開始，使用2倍稀釋系列，分五個步驟將h26D3及26D3 Fab注射至晶片之上。使用單循環動力學方法來量測相互作用，其中接觸時間為120 s，流動速率為30 µl/ml，隨後解離時間為600 s。藉由注射3 M MgCl ₂進行循環之間的表面再生。將結合資料擬合於1:1相互作用模型。將Fab稀釋於HBS-EP+ (Cytiva, #BR100669)中。實驗在25℃下進行。資料證實26D3之人源化變異體，亦即h26D3，保留人類及食蟹獼猴TfR1之結合力(圖8)。在下表4中給出實驗中所獲得之動力學參數。表4：鼠類及人源化26D3 Fab與hTfR1及cTfR1之SPR分析

測試結合劑	目標	k _a(1/Ms)	k _d(1/s)	K _D(M)
26D3	hTfr1	2.8 x 10 ⁶	1.0 x 10 ^-3	3.6 x 10 ^-9
26D3	cTfR1	5.7 x 10 ⁶	6.2 x 10 ^-3	1.0 x 10 ^-8
h26D3	hTfr1	1.2 x 10 ⁶	4.5 x 10 ^-3	3.2 x 10 ^-9
h26D3	cTfR1	2.7 x 10 ⁶	1.5 x 10 ^-3	5.8 x 10 ^-9

將鼠類26D3及人源化變異體h26D3兩者轉化為scFv形式，且經證實保持了scFv的目標結合(圖9)。將鼠類及人源化26D3重新格式化為scFv (分別為SEQ ID NO: 79及SEQ ID NO: 80)且藉由採用杵-臼(knob-into-hole，KiH)技術產生為單價Fc融合之scFv抗體片段。在此形式中，一個scFv片段僅融合至Fc之杵半部(SEQ ID NO: 81)，而Fc之臼半部(SEQ ID NO: 82)保持不融合。所得抗體形式為單臂scFv-Fc。與Fc之杵半部融合的26D3 scFv具有完整胺基酸序列SEQ ID NO: 83，而與Fc之杵半部融合的h26D3 scFv具有完整胺基酸序列SEQ ID NO: 84。呈此scFv形式之鼠類及人源化26D3的結合分佈類似，且證實scFv形式之結合活性。結合反應與呈Fab形式之抗體的彼等一致。此藉由若干方法得以證實，包括使用BLI (結果展示於圖9A中)及ELISA (結果展示於圖9B中)之動力學實驗。藉由以下由BLI來量測鼠類及人源化26D3-scFv-Fc之結合動力學：首先將生物素標記之hTfR1固定至鏈黴抗生物素蛋白生物感測器(Fortebio)。接著在緩衝液(Kinetics buffer, Fortebio)中洗滌感測器，隨後在25 nM濃度下量測26D3-scFv-Fc (鼠類)與h26D3-scFv-Fc (人源化)的結合，接著進行500 s的解離期。在ELISA實驗中，使用hTfR1來塗覆培養盤以使用實例1中所描述之間接ELISA方案進行標準結合ELISA實驗。

實例 5 與 hTfR1 複合之 h26D3-Fab 的結晶及結構確定此實例描述h26D3-Fab與hTfR1之間的複合物之結晶及結合界面之確定。根據製造商說明書，藉由短暫轉染人類胚胎腎細胞(Expi297; Thermo Fisher Scientific)來表現人類TfR1之胞外域(SEQ ID NO: 74)。使用HiTrap IMAC Sepharose FF (Cytiva)純化收集之上清液，隨後在HiLoad Superdex 200pg 26/600 (Cytiva)上進行尺寸排阻層析。所使用之緩衝液及人源化Fab之純化係依實例4中所描述。

人源化h26D3-Fab與hTfR1之間複合物的形成係藉由以1:1之莫耳比在1× dPBS中混合兩種組分且在室溫下培育1 h進行。隨後，依實例4中所描述，在HiLoad Superdex 200pg 26/600 (Cytiva)上使用尺寸排阻層析來純化複合物。

使用hTfR1-h26D3之儲備溶液在15 mg/ml PBS中進行結晶，該PBS在補充有4 mM β-巰基乙醇之PBS中稀釋至4 mg/ml。使用儲集器中之添加劑篩選液設置100+100 nl液滴：0.1 M磷酸鈉鉀pH 6.5、10% PEG 3000、0.05%二氯甲烷及2 mM β-巰基乙醇。在補充有8%甘油及16% PEG 400之儲集器溶液中將晶體快速冷凍。

如下進行X射線資料收集及優化。在鑽石光源光束線I04處收集之資料達至3.87 Å。光束線裝備有DECTRIS Eiger2 XE 16M偵測器。使用具有STARANISO各向異性縮放(Tickle等人(2018), Global Phasing Ltd)之XDS (Kabsch (2010), Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66:125-132)整合資料集，且沿著反晶格之c*方向繞射至3.87 Å，且在a*/b*平面上繞射至4.82 Å。三種錯合物發現於不對稱單元中。使用Buster優化軟體對結構進行優化，且在Coot中進行模型建構。在下表5中給出資料收集及優化參數以及統計資料。表5：X射線繞射資料收集及優化統計資料

解析度(Å)	110.81 - 3.87 (4.27 - 3.87)
波長(Å)	0.97950
空間群	P31 2 1
單位晶胞(Å)	a = b = 127.95，c = 472.91
球形完整性(%)	63.9 (12.7)
橢球形完整性(%)	93.8 (74.0)
觀測結果/獨特反射之數目	546922 / 27520 (27874 / 1378)
冗餘	19.9 (20.2)
＜I/σ(I)＞	9.8 (1.7)
CC(1/2) (%)	99.9 (81.5)
R合併(I) (%)	20.6 (200.9)
Rpim (I) (%)	6.6 (62.8)
R模型(F) (%)	26.0 (31.6)
R游離(F) (%)	31.4 (34.3)
非氫原子之數目	24858
水分子之數目	0
與理想幾何形狀之 rms 偏差
鍵長(Å)	0.009
鍵角(°)	1.1
平均B因子蛋白鏈A/B/C/D/E/F/G/H/L (Å ²)	76.9 / 110.0 / 103.0 / 132.2 / 134.4 / 87.2 / 101.0 / 79.9 / 83.4
平均B因子糖基化(Å ²)	70.7
拉曼圖 (Ramachandran plot) 品質
有利區(%)	93.4
允許區(%)	4.3
離群值(%)	2.3

展示整體摺疊之複合物之最終精製結構描繪於圖10中。依圖10A中所示，不對稱單元中存在三種獨立複合物。指示座標文件中所使用之鏈名稱。圖10B展示在hTfR1與h26D3-Fab之重鏈/輕鏈之間的界面處輪廓化的電子密度之實例。以草圖圖示繪製蛋白鏈，而以桿狀圖示展示糖部分。自X射線結構提取h26D3與人類TfR1之間的結合界面相互作用且描述於下文中，得到關於h26D3與人類TfR1之精確結合的資訊。

hTfR1與h26D3-Fab之間的結合界面描繪於圖10及圖11中，且在表6中所示之胺基酸殘基之間觀測到相互作用。表6：參與h26D3與hTfR1之間的相互作用之胺基酸殘基

h26D3 重鏈		人類 TfR1
50ASP	與相互作用	150Asn
57Thr	與相互作用	150Asn
59Ser	與相互作用	150Asn
105Ser	與相互作用	154Pro
105Ser	與相互作用	159Ser
105Ser	與相互作用	161Lys
106Tyr	與相互作用	161Lys
106Tyr	與相互作用	158Gly
107Tyr	與相互作用	151Ser

h26D3 輕鏈
32Ser	與相互作用	163Glu
32Ser	與相互作用	385Lys
33Thr	與相互作用	160Gln

表6描述根據晶體結構確定之表位/互補位界面中所涉及之兩側的關鍵殘基。附近之額外殘基對於h26D3與hTfR1之間的結合而言亦可能為重要的。另外，依以下實例9中所描述，觀測到的結合相互作用外的若干位置在h26D3與hTfR1之結合方面展示出重要參與。

在下表7中，列出人類TfR1中與h26D3、Ft及Tf之各別相互作用中所涉及之胺基酸。值得注意的是，h26D3之結合中所涉及之胺基酸均不形成內源性配位體之結合界面中之任一者的部分。此說明，藉由h26D3所例示，本發明之結合劑在Ft及Tf所用之結合位點外結合至hTfR1。表7：hTfR1中與各別配位體相互作用之胺基酸殘基

h26D3	鐵蛋白 *	運鐵蛋白 #
150Asn	195Ser	121Arg
151Ser	197Gln	123Tyr
154Pro	199Ser	125Asp
158Gly	201Ile	126Asp
159Ser	208Arg	622Val
161Lys	209Leu	623Arg
163Glu	210Val	626Asn
385Lys	212Leu	629Arg
	215Asn	640Gln
	343Glu	643Tyr
	343Lys	651Arg
	344Lys	661Gly
	348Asn	662Asn
	374Lys	663Ala
		664Glu
		667Asp
		757Asp
		758Asn

* Montemiglio等人(2019), Nat Commun 10:1121 # Eckenroth等人(2011), Proc Natl Acad Sci USA 108:13089

在圖12中進一步繪示hTfR1結構(pdb: 1SUV)上之不同表位。依圖12中所示，Ft結合位點位於hTfR1之頂端域上，Tf結合位點主要位於hTfR1之螺旋域上，且h26D3表位位於hTfR1之蛋白酶樣域上。結構說明不同的配位體及結合劑在hTfR1結構上使用不同的比表面積。hTfR1為具有兩個相同鏈之均二聚體，且僅在此等鏈中之一者上指示表位。

實例 6 產生及表徵 hTFR1 基因嵌入小鼠藉由同源重組(在Cyagen US進行之實驗工作)產生人類TfR1基因嵌入( hTfR1-KI ； TFR1C-KI)小鼠。藉由C57BL/6N ES細胞 Tfrc之原核顯微注射引入攜帶TFR1C (NCBI參考序列：NM_001128148.3)胞外域及鼠類 Tfrc跨膜及胞內域之cDNA載體。 Tfrc外顯子2加上部分內含子2之編碼區經 TFR1C嵌合盒(圖13A)置換。藉由南方墨點(Southern blot)及PCR驗證hTfR1 cDNA之正確插入。藉由qRT-PCR (圖13B)及西方墨點(圖13C)證實hTfR1-KI小鼠在腦組織方面的轉殖基因表現，從而指示內源性表現量。hTfR1-KI小鼠保持在C57BL/6N背景下，且僅使用異型接合之hTfR1-KI小鼠進行實驗。

實例 7 活體內 hTfR1 結合構築體之腦吸收為評估活體內hTfR1介導之腦吸收，產生針對四種不同的結合蛋白之單價Fc-scFv構築體(參見實例4)。使用hTfR1之已知結合劑15G11-1作為對照(Yu等人(2014), 同上)。據描述，此hTfR1結合劑在活體內具有活性，且用作腦吸收之陽性參考對照。另外，設計了含有基於抗澱粉樣蛋白β抗體mAb158之非hTfR1 scFv結合劑的構築體且將其包括為呈Fc融合構築體之形式的陰性對照(Fc-scFv158，在本文及圖式中亦簡稱為「158」)。以30 nmol/kg之等莫耳劑量(對應於大約2.3 mg/kg)將不同的Fc-scFv構築體靜脈內注射(i.v.)至依實例6中所描述產生之hTfR1基因嵌入(hTfR1-KI)小鼠(每個構築體n=4)中。給藥後24 h評估血漿及腦暴露。

使用異氟醚麻醉動物，且將終末血液樣本自眼血管叢收集至BD Microtainer K2EDTA管中。在4℃下在2400 × g下使樣本倒置且離心持續10 min。提取血漿且將其轉移至埃彭道夫管(Eppendorf tube)中，且在-80℃下冷凍。緊接在血液取樣之後，切開動物之腹部且將插管(21 G)插入至心臟之左心室中。在右心房中形成小切口，且用最少50 ml冷PBS進行經心灌注。灌注之後，提取腦且移除嗅球。將腦分成左半球及右半球，且自左半球移除小腦，其後將左半球稱重且在乾冰上速凍且在-80℃下儲存，直至使用基於Meso Scale Discovery (MSD)之分析進一步製備且分析所注射構築體之濃度。將右半球置於4%甲醛中且在4℃下儲存24 h，其後在冷PBS中沖洗該等右半球，將其轉移至在PBS中製備且儲存於4℃下之冷30%蔗糖溶液用於進一步免疫組織化學(IHC)處理(參見下文實例8)。

對於腦濃度量測，在冰上將冷凍的左半球解凍且藉由自動珠粒均質化在TBS中均質化。將曲拉通(Triton)添加至均質物中直至0.5%之最終曲拉通濃度，隨後在16 000 × g下離心，其後收集上清液。

使用偵測人類Fc之定製構築MSD分析來確定抗hTfR1 Fc-scFv之腦及血漿濃度。標準96孔MSD盤(MSD, #L15XA-3)塗覆有0.5 µg/ml山羊抗人類IgG、Fcγ片段特異性抗體(Jackson Immuno Research Europe Ltd, #109-005-098)，稀釋於1×PBS (Medicago AB, #09-9400-100)中。在4℃下培育隔夜之後，在1×PBS-TWEEN (Fisher Scientific, #09-9410-100)中將培養盤洗滌4次，且用每孔含150 µl 1% 阻斷劑A之PBS-TWEEN (MSD, #R93BA-4)阻斷。添加樣本及對應標準物(在1:4稀釋步驟中範圍為400 pM至0.1 pM)，且在室溫下以900 rpm培育2 h。包括用稀釋至0.5 µg/ml之小鼠抗人類IgG (Mabtech, 3850-1-1000, MT145)進行之1 h培育步驟，隨後在室溫下以900 rpm再培育一小時的情況下，將稀釋至0.5 µg/ml之SULFO-TAG結合的抗小鼠抗體(MSD, R32AC-1)培育1 h。在讀取MSD SECTOR成像器中之培養盤之前，每孔添加150 µl MSD讀取緩衝液(MSD, #R92TC)。在各培育步驟之間，在1×PBS-TWEEN中進行4次洗滌。除包被抗體外的所有抗體及樣本均在PBS-TWEEN中之1%阻斷劑A中稀釋，且以50微升/孔之體積添加。使用4PL曲線擬合演算法及標準曲線之曲線加權1/Y2，用MSD Workbench軟體評估樣本中分析物之濃度。使用結合杜凱氏事後檢定(Tukey's post hoctest)之單向ANOVA在GraphPad Prism (v. 9.0.0)中進行統計分析。

結果展示於圖14中。依圖14A中所示，與陰性對照(158)相比，在給藥後24 h，觀測到兩種測試構築體及陽性對照15G11-1之腦濃度顯著更高。依圖14B中所示，與158之血漿濃度相比，兩種測試構築體及陽性對照15G11-1之血漿濃度在24 h時較低，表明hTfR1接合使得血漿清除較快。腦-血漿濃度比率展示於圖14C中。與陰性對照相比，兩種測試構築體及陽性對照15G11-1展示相對於血漿之腦暴露顯著增強。綜合而言，資料支援此實驗中所測試之新型hTfR1結合劑的hTfR1介導之BBB轉運。

實例 8 關於腦暴露之免疫組織化學資料使用定性免疫組織化學(IHC)分析進一步研究Fc-scFv構築體對hTfR1進行之活體內接合。簡言之，使用低溫恆溫器(Microm NX50 CryoStar, Epredia)自實例7中所描述之小鼠的經PBS灌注之腦半球獲得厚度為20 µm的冠狀腦切片。將切片收集在Superfrost plus載玻片(Menzel-Gläser, #J1800AMNZ)上，且在IHC之前風乾。用PBS (pH 7.4)將腦切片洗滌15 min，且在室溫下在阻斷緩衝液(5% BSA，含0.25%曲拉通-X之PBS)中培育2 h。為使i.v.投與之構築體可視化，在室溫下將腦切片與結合至Alexa Fluor 488 (Invitrogen, #A11013)之二級山羊抗人類IgG (重鏈及輕鏈特異性)一起培育120 min，隨後在PBS中洗滌3×15 min。使用Fluoromount-G (Invitrogen, #00-4958-02)安裝載玻片以進行成像分析。使用配備有HC PL APO 40×/1.25 GLYC motCORR CS2物鏡(Leica, #11506423)之Leica Stellaris 5共軛焦系統捕捉大腦皮質的共軛焦影像。

在具有陽性參考模組15G11-1之腦毛細管中觀測到不同的IHC免疫螢光信號，而在來自注射有陰性對照158之小鼠的腦切片中偵測到最小的IHC信號(圖15)。觀測到兩種測試構築體h26D3及37D10之腦毛細管IHC信號，其中h26D3展示最強的免疫螢光信號，與陽性對照15G11-1相當。綜合而言，MSD (實例7)及IHC (此實例)分析證明，呈scFv形式之本發明之hTfR1結合劑在hTfR1-KI小鼠中展現增加之腦暴露。

實例 9 產生親和力變異體及親和力確定藉由將CDR中之酪胺酸、色胺酸及天冬胺酸殘基逐個取代為丙胺酸殘基而產生親本抗體h26D3之若干變異體。所得變異型VH區表示為HC1至HC13，且其胺基酸序列分別在序列表中提供為SEQ ID NO: 45至57。此等變異型VH區中所包含之變異型CDR序列分別列出為SEQ ID NO: 16至28。所得變異型VL區表示為LC1-LC6，且其胺基酸序列分別在序列表中提供為SEQ ID NO: 59至64。此等變異型VL區中所包含之變異型CDR序列分別列出為SEQ ID NO: 29至33。下表8提供丙胺酸變異體中之各者的特異性突變之概述。表8：h26D3之VH及VL之丙胺酸取代變異體

變異體	突變	變異體	突變	變異體	突變
LC1	Y31A	HC1	D31A	HC8	Y60A
LC2	Y38A	HC2	Y32A	HC9	Y101A
LC3	Y55A	HC3	D35A	HC10	Y106A
LC4	W56A	HC4	D50A	HC11	Y107A
LC5	Y97A	HC5	D54A	HC12	D111A
LC6	Y100A	HC6	Y55A	HC13	Y112A
		HC7	D56A

根據製造商說明書，藉由短暫轉染中國倉鼠卵巢細胞(ExpiCHO; Thermo Fisher Scientific)而將所產生之丙胺酸變異體表現為單突變型His標記之Fab。其中已分泌Fab之澄清培養基用於藉由BLI (Octet RED384, ForteBio)評估與hTfR1之結合。在240 s期間將所表現之Fab自細胞上清液裝載至抗Fab生物感測器上。其後，量測在1×動力學緩衝液(ForteBio)中稀釋至3.75 μg/ml之hTfR1 (SEQ ID NO: 74)的胞外域與裝載的感測器之結合持續300 s，隨後解離持續300 s。所有變異體均被證實與hTfR1結合，但受到不同程度之影響(圖16)。

選擇在篩選中展示與hTfR1之結合受影響的變異體進行進一步表徵。另外，藉由將重鏈及輕鏈與丙胺酸取代物組合來產生二重突變體。下表9提供所選擇之丙胺酸變異體中之各者的特異性突變之概述。表9：選擇用於進一步表徵之h26D3之VH及VL之變異體

變異體	突變 VL	突變VH
LC1	Y31A	無
LC5	Y97A	無
LC6	Y100A	無
HC2	無	Y32A
HC3	無	D35A
HC4	無	D50A
HC5	無	D54A
HC6	無	Y55A
HC8	無	Y60A
HC10	無	Y106A
HC11	無	Y107A
HC3 / LC1	Y31A	D35A
HC3 / LC5	Y97A	D35A
HC6 / LC1	Y31A	Y55A
HC6 / LC5	Y97A	Y55A
HC8 / LC1	Y31A	Y60A
HC8 / LC5	Y97A	Y60A
HC10 / LC1	Y31A	Y106A
HC10 / LC5	Y97A	Y106A

根據製造商說明書，藉由短暫轉染中國倉鼠卵巢細胞(ExpiCHO; Thermo Fisher Scientific)而將所選擇之變異體表現為His標記之Fab。根據製造商說明書，使用HisPur™ Ni-NTA磁珠(Thermo Scientific)以較小規模純化Fab，隨後將緩衝液更換為DPBS pH 7.4。亦藉由塗覆在HisTrap Excel管柱(Cytiva)上以較大規模純化所選擇之變異體，用20 mM Tris、200 mM NaCl及5 mM咪唑洗滌該管柱。用20 mM Tris、200 mM NaCl及500 mM咪唑溶離蛋白質，隨後使用HiPrep 26/10脫鹽管柱(Cytiva)將緩衝液更換為DPBS pH 7.4。使用Amicon Ultra離心濃縮器(30 MWCO; Millipore)濃縮蛋白質。藉由尺寸排阻層析(SEC; HiLoad 26/600 Superdex 200; Cytiva)在DPBS pH 7.4中進一步精緻純化所選擇之變異體。藉由UV蛋白質確定、SDS-PAGE及HPLC-SEC進行蛋白質之分析型表徵。

使用SPR (圖17)或間接ELISA (圖18)評估經純化之Fab與人類及食蟹獼猴TfR1的結合。對於SPR，使用Biacore 8K儀器(Cytiva)。根據製造商說明書，使用2型胺偶合套組(Cytiva, #BR100633)將1 μg/ml hTfR1 (SEQ ID NO: 86)或cTfR1 (SEQ ID NO: 87)固定在Cm5感測器晶片(Cytiva, #BR100399)上。以100 nM開始，使用2倍稀釋系列，分四個步驟將Fab注射至晶片之上。使用單循環動力學方法來量測相互作用，其中接觸時間為120 s，流動速率為30 µl/ml，隨後解離時間為1000 s。藉由注射3 M MgCl ₂進行循環之間的表面再生。將結合資料擬合於1:1相互作用模型。將Fab稀釋於HBS-EP+ (Cytiva, #BR100669)中。在25℃下進行實驗。結果展示於圖17中，且在下表10中給出所計算之K _D值。表10：變異體h26D3 Fab與hTfR1及cTfR1之SPR分析

變異體 h26D3 Fab	hTfR1 K _D(nM)	cTfR1 K _D(nM)
HC2	8.7	12
HC3	16	168
HC4	5.1	8
HC5	20	39
HC6	156	164
HC8	10	19
HC10	9.2	4.6
HC11	388	2.7
LC1	14	70
LC5	240	ND
LC6	8.5	9.4
h26D3	10	12

對於間接ELISA，在4℃下用PBS中1 μg/ml hTfR1 (SEQ ID NO: 74)之重組胞外域塗覆半區96孔盤(Corning, #3690)隔夜。在室溫下，在搖動下，使用Pierce無蛋白質阻斷溶液(Thermo Fisher Scientific, #37572)將塗覆的培養盤阻斷1 h，且在含有0.1% TWEEN-20之PBS中洗滌四次。在室溫下，將培育緩衝液(1% BSA，含0.1% TWEEN-20之PBS)中不同的表現構築體之連續稀釋液(1:3)培育1 h。在四個洗滌步驟之後，在培育緩衝液中(1 h，室溫)藉由以1:5000稀釋度添加抗人類IgG F(ab') ₂-HRP抗體(Jackson Immuno Research, #109-036-003)來偵測結合的測試構築體。在四次洗滌步驟之後，在室溫下將K-Blue® Aqueous TMB受質(Neogen, #331177)添加至孔中持續15 min，隨後用1:1稀釋度之0.5 M H ₂SO ₄停止反應。記錄450 nm下之光學密度(Spark, Tecan)且在分析之前減去背景信號。所獲得之結果展示於圖18中。

基於Biacore及ELISA量測，在人類TfR1之廣泛親和力範圍內鑑別出若干變異體。許多變異體展現與食蟹獼猴TfR1之保留的交叉反應性。

最後，將所選擇之變異體重新格式化為scFv，且在WO2022/258841中所揭示之雙特異性結合分子形式的上下文中使用。依上文所描述，包含由h26D3構築之scFv模組及所選擇之丙胺酸突變體的雙特異性結合分子表現於ExpiCHO細胞中。將經過濾之上清液塗覆至MabSelect SuRe管柱(Cytiva)，隨後用DPBS pH 7.4洗滌該管柱。藉由塗覆0.7% HAc pH 2.5，接著將樣本直接中和至pH 7.5來溶離經表現之結合分子。藉由使經純化之樣本經受尺寸排阻層析(SEC; HiLoad 26/600 Superdex 200; Cytiva)而在DPBS pH 7.4中進一步精緻純化該等樣本。使用離心濃縮器Amicon Ultra (30 MWCO, Millipore)濃縮經純化之構築體。使用SDS-PAGE、尺寸排阻層析(Superdex 200 Increase 3.2/300; Cytiva)及UV蛋白質確定對各經純化之表現構築體進行表徵。依上文所描述，使用SPR評估與hTfR1之結合，其中視變異體而定調整濃度間隔。依圖19及下表11中所示，不同的測試變異體展現對hTfR1目標之親和力範圍。表11：呈雙特異性形式之變異體h26D3 scFv與hTfR1之SPR分析

變異體	K _D 與hTfR1 (nM)
h26D3	~10
LC1	~40
HC6	~100-200
LC5	~400-500

實例 10 具有「 VH 優先 」或「 VL 優先」 scFv 模組之 Gen 2A 雙特異性結合蛋白的設計使用最初描述於WO2022/258841 (圖4，左側圖)中之「Gen 2A」形式，使用上文以兩種不同的組態描述之hTfR1結合劑h26D3 HC6之scFv形式來設計十四個不同的雙特異性結合蛋白構築體，由SEQ ID NO: 88表示「VH優先」且由SEQ ID NO: 89表示「VL優先」。其中七個構築體係使用「VH優先」組態(#1-7，具有分別由SEQ ID NO: 90至96表示之單鏈組分)設計，而另外七個構築體係使用「VL優先」組態(#8-14，具有分別由SEQ ID NO: 97至103表示之單鏈組分)設計。所有此等構築體中使用的抗體重鏈相同且由SEQ ID NO: 104表示。

圖20提供不同的測試構築體之示意性概述。構築體#1-7 (VH優先)及#8-14 (VL優先)被產生為一系列不同的連接子長度組合，依表12中所示，以研究連接子長度及VH與VL優先組態以及h26D3 HC6 scFv結合劑對與hTfR1之結合及hTfR1在細胞表面上表現時抗體的定位之影響。表12：呈Gen 2A形式之測試構築體之連接子特性

構築體#	連接子1 [L1]	所量測的必需連接子長度 [L1] (Å)	連接子2 [L2]	所量測的必需連接子長度 [L2] (Å)	總連接子尺寸 (Å)	總所量測的必需尺寸 (Å)
VH 優先組態
2A-3 #1	1x G ₄S	≈44	4x G ₄S	≈40	≈95	≈88
2A-3 #2	2x G ₄S	4x G ₄S	≈114	≈88
2A-3 #3	3x G ₄S	4x G ₄S	≈133	≈88
2A-3 #4	1x G ₄S	5x G ₄S	≈114	≈88
2A-3 #5	2x G ₄S	5x G ₄S	≈133	≈88
2A-3 #6	3x G ₄S	5x G ₄S	≈154	≈88
2A-3 #7	5x G ₄S	5x G ₄S	≈192	≈88
VL 優先組態
2A-3 #8	1x G ₄S	≈46	4x G ₄S	≈60	≈95	≈106
2A-3 #9	2x G ₄S	4x G ₄S	≈114	≈106
2A-3 #10	3x G ₄S	4x G ₄S	≈133	≈106
2A-3 #11	1x G ₄S	5x G ₄S	≈114	≈106
2A-3 #12	2x G ₄S	5x G ₄S	≈133	≈106
2A-3 #13	3x G ₄S	5x G ₄S	≈154	≈106
2A-3 #14	5x G ₄S	5x G ₄S	≈192	≈106

實例 11 經設計 Gen 2A 構築體之產生及純化根據製造商說明書，藉由短暫轉染中國倉鼠卵巢細胞(ExpiCHO; Thermo Fisher Scientific)而功能性地表現經設計為描述於實例10中之十四個構築體。將經過濾之細胞培養上清液塗覆至MabSelect SuRe管柱(Cytiva)，隨後用DPBS pH 7.4洗滌該管柱。藉由塗覆0.7% HAc pH 2.5，接著將樣本中和至pH 7.5來溶離經表現之結合蛋白。藉由尺寸排阻層析(SEC; HiLoad 26/600 Superdex 200; Cytiva)在DPBS pH 7.4中進一步精緻純化經純化之樣本。使用SDS-PAGE、尺寸排阻層析(Superdex 200 Increase 3.2/300; Cytiva)及UV蛋白質濃度確定對各經純化之表現構築體進行表徵。

在表13中給出純化之結果。經純化之構築體之代表性SDS-PAGE分析展示於圖21中。未還原的凝膠展示一個約175 kDa之條帶。還原的凝膠展示Gen 2A形式之預期雙條帶分佈，其中抗體重鏈為約50 kDa且單鏈組分包含兩個連接至hTfR1結合scFv之輕鏈，分子量約為75 kDa。依表13中所示，雙特異性結合蛋白之單體含量較高(一般＞98%)且其以較低的mg/l水準產生。表13：測試構築體之純化

構築體#	批次	單體%	量 (mg)	產量 (mg/l 培養物 )
2A-3 #1	220909	96.3	1.0	2.8
2A-3 #2	220915	96.5	5.4	14.3
2A-3 #3	220811	99.8	1.6	8.2
2A-3 #4	220811	97.3	2.8	13.8
2A-3 #5	220812	98.6	1.1	5.3
2A-3 #5	220915	99.5	0.5	1.2
2A-3 #6	220812	99.2	0.4	2.2
2A-3 #6	220915	99.9	0.1	0.3
2A-3 #7	220829	99.9	0.5	2.6
2A-3 #7	220913	99.9	1.0	2.4
2A-3 #8	220915	97.9	0.2	0.5
2A-3 #9	220826	99.6	3.2	8.5
2A-3 #9	220915	99.9	0.5	1.3
2A-3 #10	220913	99.1	6.7	15.8
2A-3 #11	220916	93.6	0.6	1.5
2A-3 #12	220913	93.0	1.2	3.3
2A-3 #13	220829	99.9	0.7	3.6
2A-3 #13	220913	99.3	0.6	1.7
2A-3 #14	220829	99.7	0.7	3.6
2A-3 #14	220913	99.8	0.8	2.0

實例 12 使用 SPR 分析 Gen 2A 與 hTfR1 之結合使用SPR (Biacore 8K, Cytiva)評估依實例11中所描述表現及純化之雙特異性結合蛋白與hTfR1的結合。根據製造商說明書，使用2型胺偶合套組(Cytiva, #BR100633)將2 µg/ml之hTfR1固定在Cm5感測器晶片(Cytiva, #BR100399)上。以200 nM開始，使用2倍稀釋系列，分四個步驟將雙特異性結合蛋白注射至晶片之上。使用單循環動力學方法來量測相互作用，其中接觸時間為120 s，流動速率為30 µl/min，隨後解離時間為600 s。藉由注射3 M MgCl ₂進行循環之間的表面再生。將結合資料擬合於1:1相互作用模型。雙特異性結合蛋白稀釋於HBS-EP+ (Cytiva, #BR100669)中。在25℃下進行實驗。圖22中之資料展示所有經設計及產生的Gen 2A構築體均結合至hTfR1。與hTfR1結合劑h26D3 HC6之對照Fab構築體相比，所有構築體均展示類似的結合速率及解離速率。此說明所有經表現之構築體為功能性的，且連接子長度及「VH優先」/「VL優先」組態均不直接影響構築體與hTfR1之結合。

實例 13 與在細胞表面上表現之 hTfR1 之結合在永生化人類B淋巴細胞株Ramos (Sigma，目錄號：85030802)上量測與細胞上之hTfR1的結合。已知此細胞株在細胞表面上表現高含量之hTfR1。在4℃下，使用Fc受體阻斷劑(Innovex biosciences, #NB309-4X-40)將Fcγ受體阻斷30 min，其後在PBS中洗滌細胞。將細胞接種於96孔V形底培養盤(#249570, Thermo Scientific Nunc)中，且添加連續稀釋之Gen 2A構築體，且在4℃下將培養盤培育隔夜。用含有1% BSA之PBS洗滌細胞，且隨後在室溫下用新鮮製備的稀釋於PBS中之4%甲醛(Thermo Scientific Pierce, #28906)固定細胞持續15 min。用含有1% BSA之PBS洗滌細胞，且隨後進行染色。使用螢光標記之二級山羊F(ab') ₂抗人類IgG(γ)-Alexa fluor 488 (Invitrogen Life technologies, #H10120)透過其共用IgG重鏈組分偵測結合至細胞表面上之hTfR1的雙特異性結合蛋白。在4℃下，進行染色持續30 min。在與偵測試劑一起培育之後，用含有1% BSA之PBS洗滌細胞。最後，將細胞再懸浮於200 µl含1% BSA之PBS中，且使用BD FACSLyric流式細胞儀系統(BD Biosciences)獲取。使用flowJo軟體(BD Biosciences)分析樣本。針對結合蛋白濃度繪製所量測的中值螢光強度(MFI)且顯示於圖23中。結果表明，所有測試Gen 2A構築體，無論連接子長度及「VH優先」/「VL優先」組態如何，均以類似之方式與細胞表面上表現之hTfR1結合。

實例 14 補體依賴性細胞毒性 (CDC) 分析藉由C1q與例如抗體之Fc部分結合而引發補體活性，進一步導致其他補體因子結合，最終導致細胞死亡。為了評估給定雙特異性測試構築體是否藉由使C1q與Fc結合而產生任何CDC活性，將Ramos細胞(Sigma，目錄號：85030802)用作CDC分析之靶細胞。為了量測細胞死亡，用細胞活性染料Calcein-AM (Sigma, 17783)標記Ramos細胞。隨後，在混合人類補體血清(Innovative Research Inc, #39337)存在下，在37℃、5% CO ₂下，用連續稀釋之雙特異性測試構築體處理此等標記之細胞持續4 h。作為陰性對照，在C1q耗盡人類血清(Sigma, #234401)存在下，用類似濃度之雙特異性構築體處理細胞。作為陽性對照，亦在兩種條件(混合補體血清及C1q耗盡血清)下測試單株抗體利妥昔單抗(rituximab) (MabThera; Roche)。

使用BD BDLyric流式細胞儀(BD Biosciences)獲取經處理之細胞。使用flowJo軟體(BD Biosciences)分析樣本。在鈣黃綠素AM中止之閘控細胞上確定細胞死亡頻率，且針對測試雙特異性構築體或對照物之濃度繪製。構築體#1-7 (「VH優先」)之結果展示於圖24中，且構築體#8-14 (「VL優先」)之結果展示於圖25中。清楚地觀測到，具有「VH優先」組態介導之CDC活性的雙特異性結合蛋白導致細胞死亡(圖24)。另一方面，「VL優先」組態中之雙特異性結合蛋白均不介導任何CDC活性(圖25)，從而得出以下結論：「VL優先」組態介導之hTfR1結合抑制C1q與抗體之Fc域的結合。

實例 15 具有 hTfR1 親和力變異體之 Gen2A 構築體之血漿及腦暴露為了評估本發明之雙特異性結合蛋白構築體隨時間的腦及血漿暴露，類似於實例10，基於Gen 2A形式產生額外構築體。此實例利用具有或不具有hTfR1結合模組h26D3之三種親和力變異體的Fc突變K322A研究呈hIgG1形式之抗體mAb158 (參見實例9)。在表14中給出測試構築體及其胺基酸序列。表14：測試構築體及胺基酸序列

名稱	重鏈	輕鏈
mAb158 hIgG1-K322A	SEQ ID NO: 110	SEQ ID NO: 108
2A3#2-LC1-K322A	SEQ ID NO: 110	SEQ ID NO: 111
2A3#2-HC6-K322A	SEQ ID NO: 110	SEQ ID NO: 70
2A3#2-LC5-K322A	SEQ ID NO: 110	SEQ ID NO: 91

以40 nmol/kg (與約6-7 mg/kg相對應)之等莫耳劑量將不同的親和力變異體以及比較物mAb158 hIgG1靜脈內注射(i.v.)至hTfR1基因嵌入(hTfR1-KI)小鼠中，依實例6如中所描述產生(每個測試物n=15)。在分別為4、24、72、168及240 h之五個連續終止時間點評估血漿及腦中之暴露，其中每個時間點及測試化合物n=3隻小鼠。在投與之後0.25、4、24、48、72、120、168及240 h，自在240 h時間點處死的動物組(n=3)對血液進行取樣，用於評估連續血漿濃度與時間曲線的關係。自隱靜脈對活體內血液進行取樣，隨後收集至Sarstedt Microvette CB300 K2E管中。

在個別終止時間點，使用異氟醚將動物深度麻醉，且將終末血液樣本自眼血管叢收集至BD Microtainer K2EDTA管中。在4℃下在2400 × g下使樣本倒置且離心持續10 min。提取血漿且將其轉移至埃彭道夫管中，且在-80℃下冷凍。緊接在血液取樣之後，切開動物之腹部且將插管(21 G)插入至心臟之左心室中。在右心房中形成小切口，且用冰冷的PBS進行經心灌注。灌注之後，提取腦，且移除嗅球。將腦分成左半球及右半球，且自左半球移除小腦，其後將左半球稱重且在乾冰上速凍且在-80℃下儲存，直至使用基於Meso Scale Discovery (MSD)之分析進一步製備且分析所注射的測試構築體之濃度。將右半球置於4%甲醛中且在4℃下儲存24 h，其後在冷PBS中沖洗該等右半球，將其轉移至在PBS中製備且儲存於4℃下之冷30%蔗糖溶液用於進一步免疫組織化學(IHC)處理(下文實例16)。

對於腦濃度量測，將冷凍的左半球在冰上解凍，且在6 m/s下使用具有裂解基質D (Lysing Matrix D)之MP Biomedical之FastPrep-24 5G系統藉由自動珠粒均質化在含有cOmplete蛋白酶抑制劑及phosSTOP磷酸酶抑制劑(#11836145001及#04906837001, Roche)的Tris緩衝生理鹽水(TBS)中均質化持續5 s。將曲拉通X-100 (#X100, Merck)添加至均質物中，使得最終曲拉通X-100濃度為0.5%，且重量與體積比為1:10。將均質物渦旋10 s，且在4℃下在16 000× g下離心1 h，其後收集上清液且用於腦抗體暴露量測。

使用偵測人類Fc之定製MSD分析確定2A3#2-LC1-K322A、2A3#2-HC6-K322A、2A3#2-LC5-K322A及mAb158 hIgG1-K322A之腦及血漿濃度。在4℃下，用25奈克/孔稀釋於1×PBS (#09-9400-100, Medicago AB)中之山羊抗人類IgG、Fcγ片段特異性抗體(#109-005-098, Jackson Immuno Research Europe Ltd)塗覆96孔MSD盤(#L15XA-3)隔夜。移除塗層，且用PBS-0.05% Tween20 (PBS-T) (#09-9410-100, Medicago AB)中之1%阻斷劑A (#R93BA-4, MSD)阻斷孔。用1×PBS-T洗滌4次之後，將稀釋於PBS-T中之1%阻斷劑A中的樣本及測試構築體校準劑添加至培養盤中，且在室溫(RT)下以900 rpm培育2 h。藉由在900 rpm RT下與二級抗體(小鼠抗人類IgG #3850-1-1000, MT145, Mabtech)連續培育1 h，接著在900 rpm RT下與SULFO-TAG結合的抗小鼠偵測抗體(R32AC-1, MSD)一起培育1 h進行結合抗體之偵測。在PBS-T中之1%阻斷劑A中，將二級抗體及偵測抗體兩者稀釋至25奈克/孔。在所有培育步驟之間用1×PBS-T洗滌4次。在最後一次洗滌之後，在讀取MSD SECTOR成像器中之培養盤之前，添加2×讀取緩衝液T (#R92TC, MSD)。使用4PL曲線擬合演算法及對應測試構築體校準劑曲線之曲線加權1/Y2，用MSD Discovery Workbench軟體評估樣本中之測試構築體濃度。

結果展示於圖26及圖27中。依圖26中之終末樣本所示，與單獨的mAb158 hIgG1-K322A相比，觀測到攜帶hTfR1結合模組之測試構築體在腦中之最大濃度更高，且隨時間腦暴露更高。依圖27中所示，與mAb158 hIgG1-K322A相比，攜帶hTfR1結合模組之測試構築體的血漿暴露更低，表明hTfR1接合且測試構築體自血漿清除至表現hTfR1之組織中。綜合而言，資料支援以下結論：測試構築體進行hTfR1-介導之BBB轉運，且hTfR1結合h26D3變異體之親和力影響腦及血漿暴露曲線。

實例 16 具有 hTfR1 親和力變異體之 Gen 2A 構築體之免疫組織化學使用定性免疫組織化學(IHC)分析進一步研究實例15之測試構築體(2A3#2-LC1-K322A、2A3#2-HC6-K322A、2A3#2-LC5-K322A及mAb158 hIgG1-K322A)與hTfR1之活體內接合。簡言之，將實例15中終止之動物之蔗糖中的右半球嵌入於O.C.T.化合物(LAMB/OCT, Thermo Fisher Scientific)中，且在乾冰中快速冷凍。將嵌入之右半球切片，且將矢狀20 µm載玻片收集至Superfrost冷凍載玻片(J1800AMNZ, Thermo Fisher Scientific)上，且在IHC之前風乾。在室溫下，用M.O.M.小鼠IgG阻斷試劑(MKB-2213-1, Vector Laboratories)預處理腦切片持續1 h。初級抗體稀釋於1×PBS 0.1%曲拉通X-100中且在4℃下培育隔夜，且二級抗體稀釋於1×PBS中且在室溫下培育1.5 h。利用抗膠原蛋白IV (1:100) (2150-1470, Biorad)及Alexa488抗兔IgG H+L (1:500) (A21206, Invitrogen)使血管可視化。用Alexa647抗人類IgG H+L (1:500) (A21206, Invitrogen)使i.v.投與之構築體可視化。所有培育均在PBS潮濕腔室中進行。培育後，在比色管中用1×PBS洗滌載玻片(通常為5×5 min)。使用Fluoromount-G (00-4958-02, Invitrogen, USA)安裝切片，且使用配備有HC PL APO 40×/1.25 GLYC motCORR CS2 (圖28)及HC PL APO 63×/1.40 OIL CS2 (圖29)物鏡(Leica, #11506423)的Leica Stellaris 5共軛焦系統捕捉影像。

給藥後24 h，腦在LC1及HC6構築體之毛細管中展示不同的IHC免疫螢光信號(圖32)。LC5變異體及對照物(mAb158 hIgG1-K322A)在毛細管中沒有展示出可偵測的免疫螢光信號(圖28)。因為觀測到相同組之腦之間的某一變化，所以當解譯影像時考慮0至3之巨觀灌注成功之主觀評分。評分係基於提取之後腦之目視檢驗確定，其中評分0對應於任何血管中均無可見血液徵象之白色腦，評分1對應於少數血管中幾乎不可見之血液徵象的具有淺粉色著色之腦，評分2對應於血管中可見血液徵象的具有粉色著色之腦，且評分3對應於具有覆蓋大部分腦或較大血管之其餘血液之明顯可見徵象的紅色腦。灌注評分與影像良好匹配，此係因為注射有2A3#2-LC5-K322A及mAb158 hIgG1-K322A且在毛細管中展現免疫螢光信號的彼等腦係顯示為灌注不良的腦。進行用膠原蛋白IV染色以使載玻片上之所有毛細管可視化且與投與之構築體免疫螢光信號進行比較(圖29)。資料表明，當靜脈內投與時，包含hTfR1結合變異體之構築體被主動攝取至腦毛細管中。

實例 17 研究輸注相關之免疫反應在活體內輸注含有Fc之生物分子可能會發生免疫反應，例如展現由Couch及其同事描述之急性臨床症狀(Couch等人(2013), Sci Transl Med 5(183):183ra57, 1-12)的免疫反應。為了關於此類反應評估本發明之測試構築體，設計及表現表15中給出之測試構築體及對照構築體。表15：測試構築體及胺基酸序列

名稱	重鏈	輕鏈
2A2#2-8D3	SEQ ID NO: 104	SEQ ID NO: 113
2A2#2-15G11	SEQ ID NO: 104	SEQ ID NO: 114
2A2#2-8D3-K322A	SEQ ID NO: 110	SEQ ID NO: 113
2A3#10-WT	SEQ ID NO: 104	SEQ ID NO: 115
2A3#14-WT	SEQ ID NO: 104	SEQ ID NO: 116
2A3#3-WT	SEQ ID NO: 104	SEQ ID NO: 117
2A3#2-WT	SEQ ID NO: 104	SEQ ID NO: 118

產生具有鼠類(2A2#2-8D3)或人類(2A2#2-15G11)高親和力、頂端TfR1結合劑之構築體，該結合劑與在Fc域中具有完整效應功能的IgG1偶合。2A2#2-8D3-K322A係作為2A2#2-8D3之補體彈性比較物而產生。產生「VL優先」Gen 2A變異體2A3#10-WT及2A3#14-WT以及「VH優先」變異體2A3#3-WT及2A3#2-WT (其皆包含呈「VL優先」或「VH優先」scFv形式之本發明之h26D3 TfR1結合模組)以研究是否可藉由表位結合及結合模組定向來減輕輸注反應。以單次靜脈內(i.v.)注射形式將所有測試構築體投與至hTfR1基因嵌入(hTfR1-KI)小鼠中，其以2.5 nmol/kg、11 nmol/kg、40 nmol/kg或60 nmol/kg之劑量表現鼠類及人類TfR1 (實例6) (每劑量及測試構築體n=1至3隻小鼠)。各劑量及各測試構築體使用單獨的動物。為各測試構築體之第一組小鼠提供11 nmol/kg劑量。

根據瑞典及EU動物福利立法以及倫理批准及指南，對觀測到的症狀之程度及持續時間進行徹底評估後，隨後的更高或更低劑量之進展取決於在先前劑量水準下是否存在觀測到的輸液反應。將每隻個別小鼠之觀測的症狀評估為輕度、中度或重度。症狀範圍為給藥後約15-25 min出現邋遢、駝背形態、孤立及不活動、給藥後嚴重嗜睡、輕微運動功能障礙以及心率及呼吸加快等。輕度至中度症狀在數小時內完全逆轉，而嚴重或長期症狀使得動物立即處死。觀測結果(其中首次輸注反應(FIR)被報導為無、輕度、中度或重度反應)呈現於表16中。表16：i.v.投與測試構築體之後的首次輸注反應

	劑量(nmol/kg)
構築體	2.5	11	40	60
2A2#2-8D3		輕度至中度	輕度至中度	中度
2A2#2-8D3-K322A		無	無
2A2#2-15G11	無	重度
2A3#10-WT		無	無	無
2A3#14-WT		無	無	無
2A3#3-WT		無	無	無
2A3#2-WT		無	無	無至輕度

hTfR-KI小鼠表現鼠類及人類TfR1，且可因此與小鼠特異性8D3及人類特異性15G11-1 TfR1結合劑交叉反應，且與h26D3 WT變異體交叉反應。2A2#2-8D3在劑量高達60 nmol/kg時觀測到輕度至中度FIR。與活體外資料一致，藉由在貨物抗體之Fc域中引入K322A突變(2A2#2-8D3-K322A中所實施的那樣)來消除反應，從而阻止CDC反應，且因此省略依賴於補體活化的FIR。投與人類頂端結合劑2A2#2-15G11使得在11 nmol/kg劑量時已導致嚴重的FIR。在注射2A3#10-WT、2A3#14-WT或2A3#3-WT至60 nmol/kg之劑量後，未觀測到FIR症狀，而在注射60 nmol/kg之2A3#2-WT後，沒有症狀或可能有輕度症狀。此支援以下假設：抗體部分位於hTfR1結合scFv域下方，從而更接近於細胞膜。結果表明hTfR1上之scFv的結合表位及結合模組定向一起使得觀測的FIR減輕。相比之下，觀測到頂端TfR1結合劑8D3及15G11-1之FIR，不管此等是否與hTfR1-KI小鼠模型中之鼠類或人類TfR1結合。

所有小鼠均經受給藥前血液取樣，且具有逆轉之輕度至中度輸注反應之小鼠亦經受2 h血液取樣。將兩個活體內血液樣本自隱靜脈收集至Sarstedt Microvette CB300 K2E管中，以供進一步處理為血漿及隨後的細胞介素分析。在24 h終止時間點研究測試構築體之腦及血漿暴露。

在終止時且與樣本後分析無關，使用異氟醚將動物深度麻醉，且將終末血液樣本自眼血管叢收集至BD Microtainer K2EDTA管中。在4℃下在2400 × g下使樣本倒置且離心持續10 min。提取血漿且將其轉移至埃彭道夫管中，且在-80℃下冷凍。緊接在血液取樣之後，切開動物之腹部且將插管(21 G)插入至心臟之左心室中。在右心房中形成小切口，且用冰冷的PBS進行經心灌注。灌注之後，提取腦，且移除嗅球。將腦分成左半球及右半球，且自左半球移除小腦，其後將左半球稱重且在乾冰上速凍且在-80℃下儲存，直至使用基於Meso Scale Discovery (MSD)之分析進一步製備且分析所注射的測試構築體之濃度。

使用偵測人類Fc之定製MSD分析確定測試構築體2A3#2-WT、2A3#3-WT、2A3#10-WT、2A3#14-WT及2A2#2-8D3之腦及血漿濃度。在4℃下，用25奈克/孔稀釋於1×PBS (#09-9400-100, Medicago AB)中之山羊抗人類IgG、Fcγ片段特異性抗體(#109-005-098, Jackson Immuno Research Europe Ltd)塗覆96孔MSD盤(#L15XA-3)隔夜。移除塗層，且用PBS-0.05% Tween20 (PBS-T) (#09-9410-100, Medicago AB)中之1%阻斷劑A (#R93BA-4, MSD)阻斷孔。用1×PBS-T洗滌4次之後，將稀釋於PBS-T中之1%阻斷劑A中的樣本及測試構築體校準劑添加至培養盤中，且在室溫(RT)下以900 rpm培育2 h。藉由在900 rpm RT下與二級抗體(小鼠抗人類IgG #3850-1-1000, MT145, Mabtech)連續培育1 h，接著在900 rpm RT下與SULFO-TAG結合的抗小鼠偵測抗體(R32AC-1, MSD)一起培育1 h進行結合抗體之偵測。二級抗體及偵測抗體均在PBS-T中之1%阻斷劑A中稀釋至25奈克/孔，且在所有培育步驟之間用1×PBS-T進行4次洗滌。在最後一次洗滌之後，在讀取MSD SECTOR成像器中之培養盤之前，添加2×讀取緩衝液T (#R92TC, MSD)。使用4PL曲線擬合演算法及對應測試構築體校準劑曲線之曲線加權1/Y2，用MSD Discovery Workbench軟體評估樣本中之測試構築體濃度。對於構築體2A2#2-8D3，將2A3#2-WT用作校準劑。

所示測試構築體在給藥後24 h時之腦及血漿濃度展示於圖30中。依圖30中所示，在增加之血漿及腦暴露中反映劑量增加，證明了成功投與測試項目且在活體內與TfR1接合。

根據製造商說明書，使用預先形成的面板V-PLEX Plus Proinflammatory Panel 1小鼠套組(K15048G, Meso Scale Discovery (MSD))確定十種不同的細胞介素(IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p70、KC/GRO及TNF)之血漿濃度。簡言之，將培養盤與校準劑、對照樣本及10×稀釋之血漿樣本一起培育2 h，其後添加所有10個SULFO-TAG偵測抗體之混合物持續2 h。所有培育皆在室溫下以900 rpm進行。在各培育步驟之前及之後，在PBS-0.05% Tween20 (PBS-T) (#09-9410-100, Medicago AB)中進行4次洗滌。在最後一次洗滌之後，在讀取MSD SECTOR成像器中之培養盤之前，添加2×讀取緩衝液T (#R92TC, MSD)。使用4PL曲線擬合演算法及對應校準劑標準曲線之曲線加權1/Y2，用MSD Discovery Workbench軟體評估樣本中分析物之濃度。

相關測試細胞介素之子集之結果展示於圖31中。測試構築體引發不同的細胞介素反應，其中構築體2A3#3-WT及2A3#2-WT (「VH優先」)比構築體2A3#10-WT及2A3#14-WT (「VL優先」)反應更強烈。結果證明，將抗體部分安置於h26D3結合劑部分下且更接近於細胞膜會誘導細胞介素及趨化介素之含量降低。構築體2A2#2-8D3 (其與頂端域上之TfR1結合且基於上述觀測資料(表16)展現FIR)產生高含量之細胞介素/趨化介素，尤其是高含量之KC/GRO及IL-10。

實例 18 經設計 Gen 2D 構築體之產生及純化表現經設計為杵-臼抗體變異體之兩種雙特異性構築體，其各自含有連接至抗體杵重鏈之C端胺基酸殘基的h26D3之scFv。在第一變異體中，「mAb158-Gen2D-h26D3 VH優先」(SEQ ID NO: 105)，scFv之VH區的N端胺基酸殘基連接至Fc。在第二變異體中，「mAb158-Gen2D-h26D3 VL優先」(SEQ ID NO: 106)，scFv之VL區的N端胺基酸殘基連接至Fc。兩種構築體中所用之臼重鏈由SEQ ID NO: 107表示，而各抗體部分中存在於兩個複本中之輕鏈由SEQ ID NO: 108表示。

根據製造商說明書，藉由短暫轉染中國倉鼠卵巢細胞(ExpiCHO; Thermo Fisher Scientific)來表現經設計之「Gen 2D」構築體。將經過濾之細胞培養上清液塗覆至MabSelect SuRe管柱(Cytiva)，隨後用DPBS pH 7.4洗滌該管柱。藉由塗覆0.7% HAc pH 2.5，接著將樣本中和至pH 7.5來溶離經表現之結合蛋白。藉由在DPBS pH 7.4中進行尺寸排阻層析(SEC; HiLoad 26/600 Superdex 200; Cytiva)，或藉由例如HiTrap Q HP管柱(Cytiva)及將20 mM Trizma作為結合緩衝液進行陰離子交換，且用NaCl溶離來進一步精緻純化經純化之樣本。使用SDS-PAGE、尺寸排阻層析(Superdex 200 Increase 3.2/300; Cytiva)及UV蛋白質濃度確定對各經純化之表現構築體進行表徵。根據代表性SDS-PAGE分析，不同的構築體之純度之實例展示於圖32中。未還原的凝膠展示一個約175 kDa之條帶，而還原的凝膠展示Gen 2D形式之預期三個條帶：融合至h26D3 scFv之「杵」重鏈展示約75 kDa，相同輕鏈展示約25 kDa，且無融合scFv之「臼」重鏈展示約50 kDa。

實例 19 使用 SPR 分析 hTfR1 之 Gen 2D 雙特異性結合蛋白依實例12中針對Gen 2A構築體所描述評估經純化之雙特異性結合蛋白與hTfR1及cTfR1的結合。圖33中之資料展示所有經設計及產生的Gen 2D構築體均結合至hTfR1。與hTfR1結合劑h26D3之對照Fab片段相比，所有構築體均展示針對hTfR1 (SEQ ID NO: 86)及cTfR1 (SEQ ID NO: 87)之類似的結合速率及解離速率。結果說明所有產生之構築體為功能性的，且「VH優先」/「VL優先」組態不影響構築體與hTfR1之結合。

實例 20 ADCC 量測為了研究Gen 2D構築體之效應功能，使用抗體依賴性細胞毒性(ADCC)分析。為了評估ADCC活性，使用Jurkat效應細胞(Promega; #G7018)。細胞穩定表現FcγRIIIa受體、V158 (高親和力)變異體及NFAT反應元件，該NFAT反應元件驅動螢火蟲螢光素酶之表現作為ADCC活性之量度。當Fc部分結合至FcγR時，觸發效應細胞之活化信號，導致表面上塗覆有抗體之彼等靶細胞被殺死。將在細胞表面上表現高含量之hTfR1之Ramos細胞(Sigma，目錄號：85030802)用作靶細胞。在存在及不存在連續稀釋之測試構築體下，以效應細胞:靶細胞為6:1之比率使用效應細胞及靶細胞。所使用之對照物為單獨的抗體，亦即無hTfR1結合scFv，作為陰性對照，且將利妥昔單抗用作陽性對照。將具有測試構築體之靶細胞接種於96孔分析盤(Corning, #3917)中，與效應細胞混合，且在37℃及5% CO ₂下培育6 h。當含Fc蛋白質在靶細胞與效應細胞之間形成橋接子(透過Fc與FcγR之間的相互作用)時，其產生螢光素酶活性。在培育6 h之後，添加Bio-Glo螢光素酶試劑，且在SPARK盤讀取器(Tecan)中對螢光素酶信號進行定量。

首先，使用抗體利妥昔單抗作為陽性對照，以驗證ADCC活性及誘導倍數(圖34A)。已知利妥昔單抗為ADCC之強誘導劑，且此在分析設置中得到驗證。當排除靶細胞時，不存在ADCC之誘導。重要的是，當單獨測試時，Gen 2D測試構築體中使用的抗體(mAb158)不具有ADCC活性，此亦被證明，因為當排除靶細胞時，mAb158不具有ADCC活性(圖34A)。接下來，研究Gen 2D構築體「mAb158-Gen2D-h26D3 VL優先」，依實例18至19中所描述表現及分析。重要的是，儘管此構築體經由hTfR1結合劑與靶細胞強烈結合，但未偵測到ADCC活性(圖34B)。

接下來，K562細胞(Sigma/ECACC)用於細胞結合實驗。在4℃下，使用Fc受體阻斷劑(Innovex biosciences, #NB309-4X-40)將Fcγ受體阻斷30 min，其後在PBS中洗滌細胞。將細胞接種於96孔V形底培養盤(#249570, Thermo Scientific Nunc)中，且添加連續稀釋之測試Gen 2D構築體「mAb158-Gen2D-h26D3 VL優先」。在4℃下將培養盤培育隔夜。用含有1% BSA之PBS洗滌細胞，且隨後在室溫下用新鮮製備的稀釋於PBS中之4%甲醛(Thermo Scientific™ Pierce™, #28906)固定細胞持續10 min。用含有1% BSA之PBS洗滌細胞，且隨後用螢光標記為二級山羊F(ab') ₂抗人類IgG(γ)-Alexa fluor 488 (Invitrogen Life technologies, #H10120)染色。在4℃下，進行染色持續30 min。在與偵測試劑一起培育之後，用PBS、1% BSA洗滌細胞。最後，將細胞再懸浮於200 µl含1% BSA之PBS中，且使用BD FACSLyric流式細胞儀系統(BD Biosciences)獲取。使用flowJo軟體(BD Biosciences)分析樣本。針對結合蛋白濃度繪製所量測的中值螢光強度(MFI)且顯示於圖35中。結果表明，所測試的Gen 2D構築體結合至細胞表面上之hTfR1。

綜合而言，ADCC及細胞結合實驗表明，在具有「VL優先」組態之h26D3 scFv的Gen 2D構築體中，結合蛋白中存在之Fc部分無法與Fcγ受體接合且產生ADCC，即使在經由hTfR1結合至細胞表面之情況下亦如此。

實例 21 活體內 Gen 2D 構築體之血漿及腦暴露為進一步評估h26D3 HC6結合模組作為Gen 2D形式之scFv部分以及抗體結合澱粉樣蛋白β，在hTfR1基因嵌入(hTfR1-KI)小鼠中隨時間研究此類測試構築體之腦及血漿暴露(實例6)。在給藥後72 h，在雜交5×FAD×hTfR-KI小鼠中研究與腦澱粉樣蛋白β病理學之活體內靶接合。藉由在C57BL/6J背景(Northwestern University)下使5×FAD雄性小鼠與hTfR-KI雌性小鼠雜交而產生5×FAD×hTfR-KI小鼠。5×FAD小鼠模型為阿茲海默氏症(AD)模型，其具有表現人類APP及PSEN1轉殖基因之小鼠，總共有五種AD相關突變，包括APP中之瑞典型突變(K670N/M671L)、佛羅里達型突變(I716V)及倫敦型突變(V717I)，及PSEN1中之M146L突變及L286V突變。

在此實例中測試之構築體中，先前實例中所用之澱粉樣蛋白β結合抗體mAb158經另一種本文中表示為mAb000的澱粉樣蛋白β結合抗體置換。以與實例18之「mAb158-Gen2D-h26D3 VH優先」相同的形式產生構築體，且表示為mAb000-Gen2D-h26D3-HC6。為了檢查測試構築體及對照抗體在腦及血漿中之暴露，產生mAb000-Gen2D-h26D3-HC6及mAb000，且以40 nmol/kg (與約6-7 mg/kg相對應)之等莫耳劑量將其靜脈內注射(i.v.)至hTfR1-KI小鼠(每個測試構築體n=11)中。分別在24、72及336 h之三個連續終止時間點評估終末血漿及腦暴露，其中每個時間點及測試構築體n=3至5隻小鼠。在測試構築體投與之後，自在336 h時間點(n=5)及在以下時間點0.25、4、24、48、72、168、240及336 h處死之動物取樣用於評估連續血漿濃度與時間曲線的關係之血液。自隱靜脈對活體內血液樣本進行取樣，隨後收集至Sarstedt Microvette CB300 K2E管中。

為研究腦澱粉樣蛋白β靶接合，以40 nmol/kg (與約6-7 mg/Kg相對應)之等莫耳劑量將mAb000及mAb000-Gen2D-h26D3-HC6靜脈內注射(i.v.)至5×FAD×hTfR-KI小鼠(每個測試項目n=2-3)中。接著在給藥後72 h終止動物。

在個別終止時間點且與樣本後分析無關，使用異氟醚將動物深度麻醉，且將終末血液樣本自眼血管叢收集至BD Microtainer K2EDTA管中。在4℃下在2400 × g下使樣本倒置且離心持續10 min。提取血漿且將其轉移至埃彭道夫管中，且在-80℃下冷凍。緊接在血液取樣之後，切開動物之腹部且將插管(21 G)插入至心臟之左心室中。在右心房中形成小切口，且用冰冷的PBS進行經心灌注。灌注之後，提取腦，且移除嗅球。將腦分成左半球及右半球，且自左半球移除小腦，其後將左半球稱重且在乾冰上速凍且在-80℃下儲存，直至使用基於Meso Scale Discovery (MSD)之分析進一步製備且分析所注射的測試構築體之濃度。將右半球置於4%甲醛中且在4℃下儲存24 h，其後在冷PBS中沖洗該等右半球，將其轉移至在PBS中製備且儲存於4℃下之冷30%蔗糖溶液用於進一步免疫組織化學(IHC)處理(參見下文實例22)。

使用偵測人類Fc之定製MSD分析來確定mAb000及mAb000-Gen2D-h26D3-HC6之腦及血漿濃度。在4℃下，用25奈克/孔稀釋於1×PBS (#09-9400-100, Medicago AB)中之山羊抗人類IgG、Fcγ片段特異性抗體(#109-005-098, Jackson Immuno Research Europe Ltd)塗覆96孔MSD盤(#L15XA-3)隔夜。移除塗層，且用PBS-0.05% Tween20 (PBS-T) (#09-9410-100, Medicago AB)中之1%阻斷劑A (#R93BA-4, MSD)阻斷孔。用1×PBS-T洗滌4次之後，將稀釋於PBS-T中之1%阻斷劑A中的樣本及測試構築體校準劑添加至培養盤中，且在室溫(RT)下以900 rpm培育2 h。藉由在900 rpm RT下與二級抗體(小鼠抗人類IgG #3850-1-1000, MT145, Mabtech)連續培育1 h，接著在900 rpm RT下與SULFO-TAG結合的抗小鼠偵測抗體(R32AC-1, MSD)一起培育1 h進行結合抗體之偵測。二級抗體及偵測抗體均在PBS-T中之1%阻斷劑A中稀釋至25奈克/孔，且在所有培育步驟之間用1×PBS-T進行4次洗滌。在最後一次洗滌之後，在讀取MSD SECTOR成像器中之培養盤之前，添加2×讀取緩衝液T (#R92TC, MSD)。使用4PL曲線擬合演算法及對應測試構築體校準劑曲線之曲線加權1/Y2，用MSD Discovery Workbench軟體評估樣本中之測試構築體濃度。

結果展示於圖36中。依圖36A中所示，與mAb000相比，在研究mAb000-Gen2D-h26D3-HC6之時間段內觀測到腦最大濃度以及腦暴露(視為曲線下面積)均更高。依圖36B中所示，與mAb000相比，mAb000-Gen2D-h26D3-HC6之血漿暴露較低，表明hTfR1接合且測試構築體自血漿清除至表現hTfR1之組織。綜合而言，資料支援以下結論：測試構築體mAb000-Gen2D-h26D3-HC6經歷hTfR1介導之BBB轉運。

實例 22 活體內 Gen 2D 構築體之免疫組織化學使用定性免疫組織化學(IHC)分析進一步研究測試構築體mAb000-Gen2D-h26D3-HC6及對照抗體mAb000 (參見實例21)對hTfR1及澱粉樣蛋白β之活體內接合。簡言之，將實例21中終止之動物之蔗糖中的右半球嵌入於O.C.T.化合物(LAMB/OCT, Thermo Fisher Scientific, USA)中，且在乾冰中快速冷凍。將嵌入之右半球切片，且將矢狀20 µm載玻片收集至Superfrost冷凍載玻片(J1800AMNZ, Thermo Fisher Scientific)上，且在IHC之前風乾。用4% PFA (HL96753.1000, HistoLab, Sweden)將腦切片預處理20 min，隨後用dH ₂O洗滌5 min且與70% FA一起培育5 min以進行抗原修復。用1×PBS洗滌2×10 min後，在室溫下用M.O.M.小鼠IgG阻斷試劑(MKB-2213-1, Vector Laboratories)阻斷載玻片持續1 h。初級抗體稀釋於1×PBS 0.1%曲拉通X-100中且在4℃下培育隔夜，且二級抗體稀釋於1×PBS中且在室溫下培育1.5 h。

用鼠類抗體6E10 (1 µg/ml) (803002, Biolegend)及4G8 (1 µg/ml) (800702, Biolegend)以及Alexa555抗小鼠IgG H+L (1:500) (A21424, Invitrogen)使澱粉樣蛋白β可視化。用Alexa647抗人類IgG H+L (1:500) (A21206, Invitrogen)使測試化合物可視化。所有培育均在PBS潮濕腔室中進行。培育後，在比色管中用1×PBS洗滌載玻片(通常為5×5 min)。用Fluoromount-G (00-4958-02, Invitrogen)安裝切片，且使用配備有HC PL APO 40×/1.25 GLYC motCORR CS2物鏡(Leica, #11506423)之Leica Stellaris 5共軛焦系統捕捉影像。

所得影像展示於圖37中。在7個月大的5XFAD/hTfR-KI腦中，觀測到hIgG及澱粉樣蛋白β抗體之共定位，說明在給藥後72 h，mAb000-Gen2D-h26D3-HC6之澱粉樣蛋白β靶接合廣泛(圖37A)。核心斑塊主要對mAb000-Gen2D-h26D3-HC6呈陽性，而對於缺乏hTfR1結合模組之mAb000抗體可見低澱粉樣蛋白β斑塊共定位(圖37B)。

實例 23 Gen 2D 構築體與抗體 M-A712 關於 hTfR1 結合之競爭在對實例3中所描述之研究的互補實驗中，利用另一方法來研究測試構築體關於hTfR1結合之競爭。所研究之測試構築體為呈「VH優先」及「VL優先」組態的實例18之「mAb158-Gen2D-h26D3 VH優先」及「mAb158-Gen2D-h26D3 VL優先」以及實例21之「mAb000-Gen2D-h26D3-HC6」，此處分別表示為「mAb000-Gen2D-h26D3-HC6 VH優先」及「mAb000-Gen2D-h26D3-HC6 VL優先」。

此實例之方法使用抗CD71 (抗hTfR1)抗體M-A712作為hTfR1之頂端域上的特異性表位之標記物。據報導，M-A712抗體在頂端域中結合hTfR1殘基208-212 (Radoshitzky等人(2008), PNAS 105(7):2664-2669; Maier等人(2016), Molecular Therapy Nucleic Acids 5:e321)。此位點與人類TfR1上針對人類鐵蛋白所描述之結合位點重疊(Montemiglio等人(2019), Nat Commun. 10(1):1121)。評估根據本發明之結合劑與hTfR1的結合，亦即與hTfR1之蛋白酶樣域的結合且依實例1中所描述進行鑑別，以與M-A712抗體競爭。另外，亦研究M-A712以與重組人類鐵蛋白重鏈1 (FTH1)競爭。

在競爭實驗中，使用K562淋巴母細胞(Sigma)。為評估M-A712與所揭示之結合劑之間的競爭且證實經標記之M-A712抗體的結合，首先在4℃下使細胞與人類Fc阻斷劑(BD Pharmingen, 564220)一起培育30 min以阻斷非特異性Fc受體介導之抗體結合。隨後將細胞與連續稀釋之測試構築體連同PE結合的M-A712抗體(單株, BD Pharmingen, 555537)一起培育，且在4℃下培育1 h。在培育之後，在染色緩衝液(1% BSA，含0.1%疊氮化鈉之1× DPBS)中將細胞洗滌3次。使用流式細胞分析技術分析結合至細胞表面上之hTfR1的M-A712抗體，且繪製平均螢光強度(MFI (PE))。圖38展示不同的所示構築體中之h26D3結合劑與M-A712之間不存在直接競爭。當未標記(未結合)之M-A712抗體用作競爭之陽性對照時，以濃度依賴性方式降低經標記(PE) M-A712信號之結合。實驗說明針對TfR1之蛋白酶樣域的結合劑不與M-A712抗體直接競爭相同的表位。

用Alexa647標記之人類鐵蛋白重鏈1 (FTH1; Sino Biologicals #13217-HNAE, 批號LC15NO0415)進行類似的實驗。依圖39中所見，與競爭之陽性對照(M-A712)相比，以更高的濃度證明競爭。此資料清楚地證明，與hTfR1之蛋白酶樣域結合的根據本發明之hTfR1結合劑不與對應於由鐵蛋白使用之結合位點的頂端域上之所描述的表位競爭。

實施例之編號清單1. 一種運鐵蛋白受體1 (TfR1)結合分子，其能夠選擇性結合至位於由SEQ ID NO: 85中之胺基酸殘基121-183及384-605定義的TfR1之蛋白酶樣域中之表位。 2. 如項目1之結合分子，該表位包含SEQ ID NO: 85中之胺基酸殘基150、151、154、158、159、161、163及385或由其組成。 3. 如任何前述項目之結合分子，其包含免疫球蛋白重鏈可變區(VH)及免疫球蛋白輕鏈可變區(VL)，該VH區及該VL區形成包含抗原結合表面之VH/VL對，其中該抗原結合表面為該結合分子提供選擇性結合至該表位之能力。 4. 如項目3之結合分子，其中該抗原結合表面由來自該VH區之三個互補決定區(CDR)及來自該VL區之三個CDR構成，且其中該等CDR包含以下： VHCDR1： X1X2NMX3(SEQ ID NO: 1)，其中 X1係選自D及A； X2係選自Y及A；且 X3係選自D及A； VHCDR2： X4INPX5X6X7TTSX8X9X10KFKG(SEQ ID NO: 2)，其中 X4係選自D及A； X5係選自D、N及A； X6係選自Y及A； X7係選自D及A； X8係選自Y及A； X9係選自N及S；且 X10係選自E及Q； VLCDR1： KSSQSLLX11SX12NX13KNX14LA(SEQ ID NO: 4)，其中 X11係選自Y及A； X12係選自T及S； X13係選自Q及R；且 X14係選自Y及A； VLCDR2： X15ASTRES(SEQ ID NO: 5) 其中 X15係選自W及A；及 VLCDR3： QQX16X17X18X19PX20T(SEQ ID NO: 6) 其中 X16係選自Y及A； X17係選自F及Y； X18係選自I及N； X19係選自Y及A；且 X20係選自R及Y。 5. 如項目4之結合分子，該等CDR進一步包含 VHCDR3： GGX21SGSSX22X23HPMX24X25(SEQ ID NO: 3) 其中 X21係選自Y及A； X22係選自Y及A； X23係選自Y及A； X24係選自D及A；且 X25係選自Y及A。 6. 如項目4至5中任一項之結合分子，其中該VHCDR2為： VHCDR2： X4INPX5X6X7TTSX8NEKFKG(SEQ ID NO: 7)，其中 X4係選自D及A； X5係選自D及A； X6係選自Y及A； X7係選自D及A；且 X8係選自Y及A。 7. 如項目4至6中任一項之結合分子，其中該VLCDR1為： VLCDR1： KSSQSLLX11STNQKNX14LA(SEQ ID NO: 8)，其中 X11係選自Y及A；且 X14係選自Y及A。 8. 如項目4至7中任一項之結合分子，其中該VLCDR3為： VLCDR3： QQX16FIX19PRT(SEQ ID NO: 9) 其中 X16係選自Y及A； X19係選自Y及A。 9. 如項目4至8中任一項之結合分子，其中該VHCDR1之胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 10及16至18組成之群。 10. 如項目4至9中任一項之結合分子，其中該VHCDR2之胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 11、19至23及34組成之群，例如選自由SEQ ID NO: 11及19至23組成之群。 11. 如項目4至10中任一項之結合分子，其中該VHCDR3之胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 12、24至28及35組成之群，例如選自由SEQ ID NO: 12及24至28組成之群。 12. 如項目4至11中任一項之結合分子，其中該VLCDR1之胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 13、29、30及36組成之群，例如選自由SEQ ID NO: 13、29及30組成之群。 13. 如項目4至12中任一項之結合分子，其中該VLCDR2之胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 14及31組成之群。 14. 如項目4至13中任一項之結合分子，其中該VLCDR3之胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 15、32、33及37組成之群，例如選自由SEQ ID NO: 15、32及33組成之群。 15. 如項目4至14中任一項之結合分子，其中該六個CDR之胺基酸序列如下： VHCDR1： DYNMD(SEQ ID NO: 10)， VHCDR2： DINPDYDTTSYNEKFKG(SEQ ID NO: 11)， VHCDR3： GGYSGSSYYHPMDY(SEQ ID NO: 12) VLCDR1： KSSQSLLYSTNQKNYLA(SEQ ID NO: 13)， VLCDR2： WASTRES(SEQ ID NO: 14) VLCDR3： QQYFIYPRT(SEQ ID NO: 15) 16. 如項目4至14中任一項之結合分子，其中該六個CDR之胺基酸序列如下： VHCDR1： DYNMD(SEQ ID NO: 10)， VHCDR2： DINPDADTTSYNEKFKG(SEQ ID NO: 21)， VHCDR3： GGYSGSSYYHPMDY(SEQ ID NO: 12) VLCDR1： KSSQSLLYSTNQKNYLA(SEQ ID NO: 13)， VLCDR2： WASTRES(SEQ ID NO: 14) VLCDR3： QQYFIYPRT(SEQ ID NO: 15) 17. 如項目4之結合分子，其中該六個CDR之胺基酸序列如下： VHCDR1： DYNMD(SEQ ID NO: 10)， VHCDR2： DINPNYDTTSYSQKFKG(SEQ ID NO: 34)， VHCDR3： SEAGNYYWYFDV(SEQ ID NO: 35) VLCDR1： KSSQSLLYSSNRKNYLA(SEQ ID NO: 36)， VLCDR2： WASTRES(SEQ ID NO: 14) VLCDR3： QQYYNYPYT(SEQ ID NO: 37) 18. 如項目3至17中任一項之結合分子，其中該VH區包含選自以下之胺基酸序列或由其組成： (i) 由SEQ ID NO: 44至57、65及67組成之群，例如由SEQ ID NO: 44至57組成之群，例如由SEQ ID NO: 44及50組成之群；及 (ii) 與(i)中所定義之序列具有至少80%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之序列，其限制條件為CDR區之序列與(i)中所定義之序列的彼等100%一致。 19. 如項目3至18中任一項之結合分子，其中該VL區包含選自以下之胺基酸序列或由其組成： (i) 由SEQ ID NO: 58至64、66及68組成之群，例如由SEQ ID NO: 58至64組成之群；及 (ii) 與(i)中所定義之序列具有至少80%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之序列，其限制條件為該等CDR區之該等序列與(i)中所定義之序列的彼等100%一致。 20. 如項目18至19中任一項之結合分子，其中該VH區係如項目18所定義且該VL區係如項目19所定義。 21. 如項目20之結合分子，其中該VH區包含SEQ ID NO: 44且該VL區包含選自SEQ ID NO: 58至64之序列。 22. 如項目20之結合分子，其中該VH區包含選自SEQ ID NO: 44至57之序列且該VL區包含SEQ ID NO: 58。 23. 如項目21至22中任一項之結合分子，其中該VH區包含SEQ ID NO: 44且該VL區包含SEQ ID NO: 58。 24. 如項目21至22中任一項之結合分子，其中該VH區包含SEQ ID NO: 50且該VL區包含SEQ ID NO: 58。 25. 如項目3之結合分子，其中該抗原結合表面由來自該VH區之三個互補決定區(CDR)及來自該VL區之三個CDR構成，且其中該等CDR包含以下： VHCDR1： NYWLG(SEQ ID NO: 38)， VHCDR2： DIFPGSDNTYYNEKFKG(SEQ ID NO: 39)， VHCDR3： SGNFYAMDY(SEQ ID NO: 40) VLCDR1： SASSSVNYMN(SEQ ID NO: 41)， VLCDR2： DTSKLAS(SEQ ID NO: 42) VLCDR3： FQGSGYPFT(SEQ ID NO: 43) 26. 如項目25之結合分子，其中該VH區包含選自SEQ ID NO: 69之胺基酸序列及與SEQ ID NO: 69具有至少80%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之序列或由其組成，其限制條件為CDR區之序列與SEQ ID NO: 69之彼等100%一致。 27. 如項目25至26中任一項之結合分子，其中該VL區包含選自SEQ ID NO: 70之胺基酸序列及與SEQ ID NO: 70具有至少80%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之序列或由其組成，其限制條件為該等CDR區之該等序列與SEQ ID NO: 70之彼等100%一致。 28. 如項目26至27中任一項之結合分子，其中該VH區係如項目26所定義且該VL區係如項目27所定義。 29. 如項目3至28中任一項之結合分子，其中該VH/VL對形成抗體構築體之部分。 30. 如項目29之結合分子，其中該抗體構築體具有多於一個結合特異性。 31. 如項目30之結合分子，其中該抗體構築體為雙特異性的。 32. 如項目31之結合分子，其中如項目3至28中任一項所定義之VH/VL對存在於選自由以下組成之群的抗體片段中：Fab片段、單鏈Fab (scFab)片段、Fv片段及單鏈(scFv)片段。 33. 如項目32之結合分子，其中該抗體片段為scFv。 34. 如項目30至33中任一項之結合分子，其進一步包含能夠選擇性結合至哺乳動物之腦中所存在之目標的抗體或其抗原結合片段。 35. 如項目34之結合分子，其中該目標係選自由以下組成之群：澱粉樣蛋白-β肽或其衍生物或片段、α-突觸核蛋白或其衍生物或片段、TAR DNA結合蛋白43 (TDP-43)或其衍生物或片段、骨髓細胞觸發受體2 (TREM2)、β-分泌酶1 (BACE1)、超氧化物歧化酶(SOD)、杭丁頓蛋白、運甲狀腺素蛋白、P-分泌酶1、表皮生長因子、表皮生長因子受體2、Tau、磷酸化Tau或其片段、脂蛋白元E4、CD20、普里昂蛋白、富含白胺酸之重複激酶2、帕金蛋白、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6、澱粉樣蛋白-β前驅蛋白、p75神經營養因子受體、神經調節蛋白及凋亡蛋白酶6。 36. 如項目35之結合分子，其中該目標係選自由以下組成之群：澱粉樣蛋白-β肽或其衍生物或片段、α-突觸核蛋白或其衍生物或片段、TAR DNA結合蛋白43 (TDP-43)或其衍生物或片段、骨髓細胞觸發受體2 (TREM2)、Tau、磷酸化Tau或其片段及脂蛋白元E4。 37. 如項目36之結合分子，其中該目標係選自由以下組成之群：澱粉樣蛋白-β肽或其衍生物或片段、α-突觸核蛋白或其衍生物或片段及TAR DNA結合蛋白43 (TDP-43)或其衍生物或片段。 38. 如項目34至37中任一項之結合分子，其中能夠選擇性結合至哺乳動物之腦中所存在之目標的該抗體或其抗原結合片段為抗Aβ抗體，例如選自由以下組成之群的抗體：侖卡奈單抗、更汀蘆單抗、阿杜卡努單抗、多奈單抗、PBD-C06及KHK6640。 39. 如項目34至37中任一項之結合分子，其中能夠選擇性結合至哺乳動物之腦中所存在之目標的該抗體或其抗原結合片段為抗α-突觸核蛋白抗體，例如選自由以下組成之群的抗體：普拉西單抗、UCB7853、Lu AF82422、TAK-341及BAN0805。 40. 一種醫藥組合物，其包含如任何前述項目之結合分子及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。 41. 如項目1至39中任一項之結合分子或如項目40之組合物，其用於治療，諸如用於治療性治療或用於預防性治療。 42. 如項目1至39中任一項之結合分子或如項目40之組合物，其用於活體內診斷或活體內預後。 43. 如項目41至42中任一項使用之結合分子或組合物，其中該治療、預防、活體內診斷或活體內預後係關於神經退化性病症，例如選自以下之病症：阿茲海默氏症及與Aβ蛋白質聚集相關之其他病症、創傷性腦損傷(TBI)、路易體失智症(LBD)、唐氏症候群(DS)、肌肉萎縮性側索硬化(ALS)、額顳葉型失智症、Tau蛋白病、全身性澱粉樣變性、動脈粥樣硬化、巴金森氏症(PD)、巴金森氏症失智症(PDD)、阿茲海默氏症之路易體變異、多發性系統萎縮症、精神病、精神分裂症、庫賈氏病、杭丁頓氏舞蹈症及家族性澱粉樣神經病變。 44. 如項目43使用之結合分子或組合物，其中該治療、預防、活體內診斷或活體內預後係關於選自以下之病症：阿茲海默氏症及與Aβ蛋白質聚集相關之其他病症、路易體失智症(LBD)、唐氏症候群(DS)、肌萎縮性側索硬化(ALS)、額顳葉型失智症、Tau蛋白病、巴金森氏症(PD)、巴金森氏症失智症(PDD)及阿茲海默氏症之路易體變異。 45. 如項目44使用之結合分子或組合物，其中該治療、預防、活體內診斷或活體內預後係關於選自以下之病症：阿茲海默氏症及與Aβ蛋白質聚集相關之其他病症、路易體失智症(LBD)、肌萎縮性側索硬化(ALS)及巴金森氏症(PD)。 46. 如項目45使用之結合分子或組合物，其中該治療、預防、活體內診斷或活體內預後係關於阿茲海默氏症。 47. 如項目41至42中任一項使用之結合分子或組合物，其中該治療、預防、活體內診斷或活體內預後係關於選自腦癌、多發性硬化症及溶酶體貯積病之病症。 48. 一種治療性或預防性治療患有病症或處於罹患病症之風險下之哺乳動物的方法，該方法包含向該哺乳動物投與治療有效量之如項目1至39中任一項之結合分子或如項目40之組合物。 49. 如項目48之方法，其中該病症為神經退化性病症，例如如項目43至46中任一項中所定義之神經退化性病症。 50. 如項目48之方法，其中該病症係如項目47所定義。

圖1展示藉由生物層干涉術(BLI)對粗製融合瘤上清液中之人類(hTfR1)、食蟹獼猴(cTfR1)及小鼠(mTfR1) TfR1進行描述於實例1中之免疫接種的所示IgG抗體的結合篩選的結果。圖2展示描述於實例2中的針對小鼠抗體24B4、26D3及37D10之所示Fab片段且針對對照抗體8D3之Fab片段的BLI結合分析的結果。圖3展示實例2中所描述的抗體結合表位至hTfR1之蛋白酶域的映射，其藉由與塗覆有人類、小鼠或三個不同的嵌合人類/小鼠TfR1受體中之一者的ELISA盤的選擇性抗體結合來進行。抗體24B4、26D3及37D10結合至hTfR1 (A)，但不結合至mTfR1 (B)。另外，24B4、26D3及37D10亦結合至h/m蛋白酶，如域嵌合體(D)，但不結合至塗覆有其他嵌合受體(C及E)之任一培養盤。圖4繪示實例2中所描述的表位分組分析，具有以下四個主要步驟：步驟1為在感測器晶片上固定生物TfR1；步驟2為洗滌非結合物質；步驟3為將競爭結合劑結合至TfR1；步驟4為將結合劑與步驟3中形成之TfR1:結合劑複合物結合。步驟4中之資料確定兩種所研究之結合劑是否在結合至hTfR1方面存在競爭關係。圖5展示進行實例2中所描述的表位分組分析的結果，其展示了抗體之間同時結合至hTfR1之競爭程度。(A)抗體26D3、(B)抗體24B4及(C)對照抗體15G11-1與hTfR1之預先形成的複合物及所示抗體中之任一者的結合。所有抗體之結合反應皆相對於對游離hTfR1量測的結合反應(無競爭抗體)標準化。圖6展示所示結合劑與細胞表面上之hTfR1的結合，依實例2中所描述進行研究。兩個圖之Y軸均展示用(A)完整抗體及(B)所示結合劑之Fab片段對細胞進行染色時的平均螢光強度。用陰性同型對照IgG (A)或非相關Fab片段Ly128 (B)未偵測到背景染色。圖7展示實例3中所描述的所示結合劑與鐵蛋白及運鐵蛋白之競爭分析的結果。各圖展示(A)結合至THP-1細胞表面上表現之TfR1的所示結合劑之MFI；(B)當暴露於所示結合劑時細胞表面上之鐵蛋白之MFI，其中陽性對照抗體MA-712與鐵蛋白競爭；及(C)當暴露於所示結合劑時細胞表面上之運鐵蛋白之MFI。圖8為感測圖譜之集合，其展示了實例4 (h26D3)中所描述的初始26D3及人源化之26D3在結合至所指示之hTfR1及cTfR1時以Fab形式進行SPR分析的結果。圖9展示以實例4中所描述之scFv形式對小鼠及人源化型式之26D3進行的BLI及ELISA結合研究的結果。(A)藉由所示構築體與hTfR1之結合的BLI量測獲得的感測圖譜。(B)來自所示構築體與塗覆的TfR1之結合的ELISA量測的結合反應。圖10為依實例5中所描述確定的26D3-Fab及hTfR1之複合物之x射線結構的繪圖。指示座標文件中所使用之鏈名稱。(A)精細結構展示不對稱單元中三個獨立複合物之整體摺疊。(B)在1 σ水準下成型之電子密度(2m|Fo|-D|Fc|)之實例。以草圖圖示繪製蛋白鏈，而以桿狀圖示展示糖部分。圖11為用實例5中所描述之x射線結晶確定的h26D3-Fab人類TfR1複合物之帶狀圖示。以深灰色描繪h26D3-Fab且以白色描繪hTfR1。結合界面(表位/互補位)被包圍。圖12為hTfR1之表面積圖示，其中指定天然配位體鐵蛋白及運鐵蛋白之結合位點，以及本發明之結合劑26D3之表位。用圍繞各特定位點之圓圈描繪不同的結合位點及表位。圖13繪示產生且表徵hTfR1-KI小鼠模型之工作，依實例6中所描述。(A)基因轉殖hTfR1-KI小鼠構築體之示意性繪示。藉由同源重組將人類TFRC之細胞外域插入於鼠類Tfrc基因中。(B)腦中之小鼠Tfrc及人類TFRC基因表現之定量反轉錄PCR (RT-qPCR)分析(N=3/基因型)。hTfR1-KI小鼠(灰色圓圈)在全腦勻漿中表現人類TFRC及小鼠Tfrc，WT同胎仔畜僅表現小鼠Tfrc (白色)。(C)腦中hTfR1、總TfR1及hTfR1-KI之西方墨點分析(Western blot analysis)。hTfR1-KI動物在6至8個月(N=5)及15個月(N=4)時表現類似量之hTfR1蛋白質。總TfR1含量在hTfR1-KI基因轉殖與WT同胎仔畜(N=3)之間為類似的。圖14展示實例7中所描述的hTfR1-KI基因轉殖小鼠中各種所示hTfR1結合分子之活體內腦及血漿暴露分析的結果。(A)在i.v.投與所示hTfR1結合劑之後24 h的腦暴露。(B)在i.v.投與所示hTfR1結合劑之後24 h的血漿暴露。(C)在i.v.投與所示hTfR1結合劑之後24 h的腦:血漿比率。陰性對照表示為「158」，且陽性對照表示為「15G11-1」。圖15展示實例8中所描述的hTfR1-KI小鼠中各種所示hTfR1結合分子藉由免疫組織化學進行之活體內腦暴露分析的結果。針對若干結合分子，包括h26D3觀測到皮質腦毛細管染色。分別將參考hTfR1-結合劑「15G11-1」及非TfR1結合劑「158」用作陽性及陰性對照。圖16展示實例9中所描述的h26D3之所示丙胺酸變異體的BLI感測圖譜。各變異體展示不同的動力學分佈，說明產生對人類TfR1具有不同的親和力且在重鏈或輕鏈之CDR區中具有特異性突變之變異體的可能性。圖17展示h26D3之所示丙胺酸變異體與hTfR1及cTfR1之間的相互作用之代表性SPR感測圖譜，依實例9中所描述進行量測。圖18展示h26D3之所示丙胺酸變異體與hTfR1及cTfR1之結合的間接ELISA分析的結果，依實例9中所描述進行量測。圖19展示研究為實例9中所描述的雙特異性蛋白質形式內之scFv構建塊的h26D3之所示丙胺酸變異體之間的相互作用之SPR感測圖譜。圖20為依實例10中所描述設計及產生之兩種不同的Gen 2A構築體之繪示。圖21展示依實例11中所描述產生及純化之不同的Gen 2A構築體之純化結果。雙特異性結合蛋白之單體含量較高(一般＞98%)，且以較低的mg/l水準產生該等雙特異性結合蛋白。使用庫馬斯藍(Coomassie blue) SDS-PAGE染色分析純度。圖22展示來自十四個Gen 2A結合蛋白構築體及對照之SPR結合分析的感測圖譜，依實例12中所描述。展示各所示變異體之一個感測圖譜，說明所有構築體皆為功能性的且結合至hTfR1。圖23展示所示Gen 2A構築體之細胞結合資料，依實例13中所描述進行量測。所有測試構築體皆以與表現hTfR1之細胞類似的方式結合。圖24為展示在所示測試構築體#1-7 (「VH優先」組態)之情況下對實例14中所描述的Ramos細胞進行之CDC量測的結果的圖之集合。圖25為展示在所示測試構築體#8-14 (「VL優先」組態)之情況下對實例14中所描述的Ramos細胞進行之CDC量測的結果的圖之集合。圖26為展示實例15中所描述之活體內藥代動力學研究之結果的圖之集合。在i.v.投與所示測試構築體之後展示血漿及腦暴露，該等測試構築體來自在4、24、72、168及240 h收集之終末樣本，其中每個時間點及測試構築體n=3隻小鼠。資料呈現為平均值±SD。圖27為展示在依實例15中所描述i.v.投與之後用n=3隻小鼠/測試構築體進行之連續取樣的血漿濃度與時間曲線的圖。資料呈現為平均值±SD。圖28展示依實例16中所描述，給藥後24 h針對hIgG染色之hTfR-KI小鼠之大腦皮質之40× z型堆疊影像。表示每個所示組(LC1、HC6及LC5)三個複本(n=3)。在左下角之白色方塊內給出各腦之灌注評分(0至3)。由箭頭指示血管。圖29展示利用實例16中所描述之hIgG染色與膠原蛋白IV之各組的代表性63× z型堆疊影像。在左下角之白色方塊內給出各腦之灌注評分(0至3)。圖30為展示實例17中所描述之活體內研究之結果的一對圖。在三個所示劑量11 nmol/kg (圓圈)、40 nmol/kg (三角形)及60 nmol/kg (倒三角形)下所示測試構築體在24 h時的血漿(A)及腦(B)濃度。2A2#2-8D3之含量係基於2A3#2-WT製備的校準劑。圖31展示實例17中所描述之細胞介素反應分析之結果，其顯示了在給藥前及給藥後2 h下，在三個所示劑量11 nmol/kg (菱形)、40 nmol/kg (三角形)及60 nmol/kg (倒三角形)下所示測試構築體之所示細胞介素(A：TNF及KC/GRO；B：IL-6及IL-10)的個別及中值血漿含量。圖32展示在藉由利用庫馬斯藍之凝膠內蛋白質偵測染色對經純化構築體進行凝膠分析之後，實例18中所描述的Gen 2D構築體之產生及純化的結果。色帶如下：(1)標記物；(2)非還原性之mAb158-2D-h26D3-HC6；(3)還原之mAb158-2D-h26D3-HC6；(4)非還原之mAb158-2D-h26D3；(5)還原之mAb158-2D-h26D3。圖33展示來自Gen 2D結合蛋白構築體及對照之SPR結合分析的感測圖譜，依實例19中所描述。展示各所示變異體與hTfR1及cTfR1之結合的感測圖譜，說明所有構築體皆為功能性的且結合至hTfR1及cTfR1。包括h26D3之Fab片段作為陽性對照。圖34展示使用利妥昔單抗(rituximab)作為陽性對照之實例20中所描述的ADCC分析之結果。(A)用利妥昔單抗驗證分析設置，其在靶細胞存在下誘導較強的誘導倍數(標記為「利妥昔單抗」之圖)。在無靶細胞之情況下，利妥昔單抗不存在ADCC誘導(標記為「利妥昔單抗(不含靶細胞)」之圖)。類似地，在有或無靶細胞之情況下進行測試的為mAb158抗體，亦即不含所連接的hTfR1結合部分M1之抗體。(B)對Gen 2D形式之分析，其中處於「VL優先」組態之h26D3 scFv作為M1，且mAb158作為M2，未展示ADCC之誘導。在相同分析中，利妥昔單抗展現較強誘導，而單獨的抗體mAb158未展示ADCC活性之任何指示。圖35展示K562細胞上所示Gen 2D構築體之細胞結合資料，依實例20中所描述進行量測。圖36展示實例21中所描述之活體內藥代動力學研究之結果。A：在單次靜脈內注射40 nmol/kg (每個取樣時間點n=3至4)之後，hTfR-KI小鼠中mAb000-Gen2D-h26D3-HC6(菱形)及mAb000(方形)之平均(±SD)終末血漿(填充)及腦(開放)濃度-時間曲線。B：在單次靜脈內注射40 nmol/kg (n=4)之後，hTfR-KI小鼠中進行連續取樣之mAb000-Gen2D-h26D3-HC6(菱形)及mAb000(方形)之平均(±SD)血漿濃度-時間曲線。圖37展示實例22中所描述的來自注射mAb000-Gen2D-h26D3-HC6 (A)或mAb000 (B)後72 h的5XFAD×hTfR-KI小鼠之額葉皮質40× Z型堆疊影像。每組兩個複本(n=2)之總澱粉樣蛋白β及hIgG代表性影像。圖38為展示藉由實例23中所描述的流式細胞分析技術量測之所示測試構築體與抗體M-A712在細胞表面上之hTfR1結合的競爭的圖。圖39為展示藉由實例23中所描述的流式細胞分析技術量測之人類鐵蛋白與抗體M-A712在細胞表面上之hTfR1結合的競爭的圖。

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Claims

一種運鐵蛋白受體1 (TfR1)結合分子，其能夠選擇性結合至位於以SEQ ID NO: 85中胺基酸殘基121-183及384-605所界定的TfR1之蛋白酶樣域中之表位，該表位視情況包含SEQ ID NO: 85中胺基酸殘基150、151、154、158、159、161、163及385或由該等胺基酸殘基組成。
如請求項1之結合分子，其包含免疫球蛋白重鏈可變區(VH)及免疫球蛋白輕鏈可變區(VL)，該VH區及該VL區形成包含抗原結合表面之VH/VL對，其中該抗原結合表面為該結合分子提供選擇性結合至該表位之能力。
如請求項2之結合分子，其中該抗原結合表面由來自該VH區之三個互補決定區(CDR)及來自該VL區之三個CDR構成，且其中該等CDR包含以下： VHCDR1： X1X2NMX3(SEQ ID NO: 1)，其中 X1係選自D及A； X2係選自Y及A；且 X3係選自D及A； VHCDR2： X4INPX5X6X7TTSX8X9X10KFKG(SEQ ID NO: 2)，其中 X4係選自D及A； X5係選自D、N及A； X6係選自Y及A； X7係選自D及A； X8係選自Y及A； X9係選自N及S；且 X10係選自E及Q； VLCDR1： KSSQSLLX11SX12NX13KNX14LA(SEQ ID NO: 4)，其中 X11係選自Y及A； X12係選自T及S； X13係選自Q及R；且 X14係選自Y及A； VLCDR2： X15ASTRES(SEQ ID NO: 5) 其中 X15係選自W及A；及 VLCDR3： QQX16X17X18X19PX20T(SEQ ID NO: 6) 其中 X16係選自Y及A； X17係選自F及Y； X18係選自I及N； X19係選自Y及A；且 X20係選自R及Y；視情況進一步包含 VHCDR3： GGX21SGSSX22X23HPMX24X25(SEQ ID NO: 3) 其中 X21係選自Y及A； X22係選自Y及A； X23係選自Y及A； X24係選自D及A；且 X25係選自Y及A。
如請求項3之結合分子，其中該六個CDR之胺基酸序列如下： VHCDR1： DYNMD(SEQ ID NO: 10)， VHCDR2： DINPDYDTTSYNEKFKG(SEQ ID NO: 11)， VHCDR3： GGYSGSSYYHPMDY(SEQ ID NO: 12)， VLCDR1： KSSQSLLYSTNQKNYLA(SEQ ID NO: 13)， VLCDR2： WASTRES(SEQ ID NO: 14)， VLCDR3： QQYFIYPRT(SEQ ID NO: 15)。
如請求項3之結合分子，其中該六個CDR之胺基酸序列如下： VHCDR1： DYNMD(SEQ ID NO: 10)， VHCDR2： DINPDADTTSYNEKFKG(SEQ ID NO: 21)， VHCDR3： GGYSGSSYYHPMDY(SEQ ID NO: 12)， VLCDR1： KSSQSLLYSTNQKNYLA(SEQ ID NO: 13)， VLCDR2： WASTRES(SEQ ID NO: 14)， VLCDR3： QQYFIYPRT(SEQ ID NO: 15)。
如請求項2至5中任一項之結合分子，其中該VH區包含選自以下之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成： (i) 由SEQ ID NO: 44至57、65及67組成之群，例如由SEQ ID NO: 44至57組成之群，例如由SEQ ID NO: 44及50組成之群；及 (ii) 與(i)中所定義之序列具有至少80%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之序列，其限制條件為CDR區之序列與(i)中所定義之序列的彼等100%一致。
如請求項2至6中任一項之結合分子，其中該VL區包含選自以下之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成： (i) 由SEQ ID NO: 58至64、66及68組成之群，例如由SEQ ID NO: 58至64組成之群；及 (ii) 與(i)中所定義之序列具有至少80%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之序列，其限制條件為該等CDR區之該等序列與(i)中所定義之序列的彼等100%一致。
如請求項6至7中任一項之結合分子，其中該VH區係如請求項6所定義且該VL區係如請求項7所定義。
如請求項2至8中任一項之結合分子，其中該VH/VL對形成抗體構築體，例如雙特異性抗體構築體之部分。
如請求項9之結合分子，其中如請求項2至8中任一項所定義之VH/VL對存在於選自由以下組成之群的抗體片段中：Fab片段、單鏈Fab (scFab)片段、Fv片段及單鏈(scFv)片段，例如scFv。
如請求項9至10中任一項之結合分子，其進一步包含能夠選擇性結合至哺乳動物腦中所存在之目標的抗體或其抗原結合片段，例如其中該目標係選自由以下組成之群：澱粉樣蛋白-β肽或其衍生物或片段、α-突觸核蛋白或其衍生物或片段、TAR DNA結合蛋白43 (TDP-43)或其衍生物或片段、骨髓細胞觸發受體2 (TREM2)、β-分泌酶1 (BACE1)、超氧化物歧化酶(SOD)、杭丁頓蛋白(huntingtin)、運甲狀腺素蛋白、P-分泌酶1、表皮生長因子、表皮生長因子受體2、Tau、磷酸化Tau或其片段、脂蛋白元E4、CD20、普里昂蛋白(prion protein)、富含白胺酸之重複激酶2、帕金蛋白(parkin)、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6、澱粉樣蛋白-β前驅蛋白、p75神經營養因子受體、神經調節蛋白及凋亡蛋白酶6。
一種醫藥組合物，其包含如前述請求項中任一項之結合分子及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
如請求項1至11中任一項之結合分子或如請求項12之組合物，其用於治療，諸如用於治療性治療或用於預防性治療。
如請求項13使用之結合分子或組合物，其中治療或預防係關於神經退化性病症，例如選自以下之病症：阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)及與Aβ蛋白質聚集相關之其他病症、創傷性腦損傷(TBI)、路易體失智症(Lewy body dementia，LBD)、唐氏症候群(Down's syndrome，DS)、肌肉萎縮性側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis；ALS)、額顳葉型失智症、Tau蛋白病、全身性澱粉樣變性、動脈粥樣硬化、巴金森氏症(Parkinson's disease，PD)、巴金森氏症失智症(Parkinson's disease dementia，PDD)、阿茲海默氏症之路易體變異(Lewy body variant of Alzheimer's disease)、多發性系統萎縮症、精神病、精神分裂症、庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、杭丁頓氏舞蹈症(Huntington's disease)及家族性澱粉樣神經病變。