TW202444422A

TW202444422A - 一種含艾日布林衍生物藥物偶聯物的醫藥組成物

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Publication number: TW202444422A
Application number: TW113102269A
Authority: TW
Inventors: 吳婷婷; 杜敏
Original assignee: 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司; 大陸商上海恆瑞醫藥有限公司
Priority date: 2023-01-19
Filing date: 2024-01-19
Publication date: 2024-11-16
Also published as: WO2024153224A1

Abstract

本揭露涉及一種含艾日布林衍生物藥物偶聯物的醫藥組成物。具體而言，本揭露涉及一種醫藥組成物，包含抗體藥物偶聯物和緩衝劑，其中該抗體藥物偶聯物具有如式I所示的結構，其中Ab為帕妥珠單抗(Pertuzumab)。本揭露的醫藥組成物具備良好的穩定性。

Description

一種含艾日布林衍生物藥物偶聯物的醫藥組成物

本揭露屬於藥物製劑領域，具體涉及一種含艾日布林衍生物藥物偶聯物的醫藥組成物。

抗體藥物偶聯物(antibody drug conjugate，ADC)把單株抗體或者抗體片段藉由穩定的化學接頭化合物與具有生物活性的藥物相連，充分利用了抗體對正常細胞和腫瘤細胞表面抗原結合的特異性和藥物的高效性，同時又避免了前者療效偏低和後者毒副作用過大等缺陷。這也就意味著，與以往傳統的化療藥物相比，抗體藥物偶聯物能精准地結合腫瘤細胞並降低將對正常細胞的影響。

微管為與包括細胞內遷移和轉運、細胞信號傳導和維持細胞形狀的多種細胞功能相關的有力的細絲狀細胞骨架蛋白。微管也在有絲分裂細胞分裂中藉由形成染色體分成兩個子細胞所需的有絲分裂紡錘體而起到關鍵作用。所有細胞中微管的生物功能大部分由其聚合動力學調節，這藉由α和β微管蛋白二聚物可逆、非共價地加在微管兩端進行。這種動力學行為和所產生的對微管長度的控制為有絲分裂紡錘體的適當功能所不可缺少的。甚至微管動力學的微小改變也會牽涉軸檢查點，抑制有絲分裂時細胞週期進展，且隨後引起細胞死亡。由於癌細胞的細胞分裂快速，所以與正常細胞相比，其一般對結合於微管蛋白且破壞其正常功能的化合物更加敏感。因此，微管蛋白抑制劑及其抗體藥物偶聯物有望成為一類有前景的治療癌症的藥物。

ADC具有比抗體更複雜的異質結構，因此，對用於治療目的ADC製劑提出了更大的挑戰。

本揭露提供一種醫藥組成物，包含抗體藥物偶聯物和緩沖劑，其中該抗體藥物偶聯物具有如式I所示的結構：

其中，

Ab為帕妥珠單抗(Pertuzumab)；

n為1至10；

該緩衝劑選自枸櫞酸鹽緩衝劑、組胺酸緩衝劑和琥珀酸鹽緩衝劑。

在一些實施方案中，該緩衝劑選自組胺酸-鹽酸組胺酸、枸櫞酸-枸櫞酸鈉和琥珀酸-琥珀酸鈉。

在一些實施方案中，藥物載量(n)的範圍可以是每個Pertuzumab抗體結合細胞毒性藥物的平均數，非限制性的實施例包括每個抗體結合細胞毒性藥物的平均個數為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12以及這些點值之間的任意範圍。例如可以是2-8，2-7，2-6，2-5，2-4，3-4，3-5，3.5~4.7，5-6，5-7，5-8和6-8。示例性的，藥物載量(n)可以為1，2，3，4，5，6，7，8，9，10的均值。n是小數或整數。在一些實施方案中，n為1至8，或3至5。

在一些實施方案中，該醫藥組成物的pH為3.5至5.5，非限制性的實施例包括3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5，以及這些點值之間的任意範圍。在一些實施方案中，pH為3.5至5.0，或pH為3.7至4.7。

在一些實施方案中，醫藥組成物中緩衝劑濃度為5mM至50mM，非限制性的實施例包括5mM、10mM、12mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、30mM、40mM、50mM以及這些點值之間的任意範圍；在一些實施方案中，緩衝及濃度為10mM至50mM；在一些實施方案中，緩衝及濃度為20mM至40mM；在一些實施方案中，緩衝及濃度為30mM。

在一些實施方案中，醫藥組成物還包含表面活性劑。可選自聚山梨酯、泊洛沙姆、聚羥亞烴、Triton、十二烷基磺酸鈉、月桂基磺酸鈉、辛基糖甙鈉、月桂基-磺基甜菜鹼、肉豆蔻基-磺基甜菜鹼、亞油基-磺基甜菜鹼、硬脂基-磺基甜菜鹼、月桂基-肌胺酸、肉豆蔻基-肌胺酸、亞油基-肌胺酸、硬脂基-肌胺酸、亞油基-甜菜鹼、肉豆蔻基-甜菜鹼、鯨蠟基-甜菜鹼、月桂醯胺基丙基-甜菜鹼、柯卡醯胺基丙基-甜菜鹼、亞油醯胺基丙基-甜菜鹼、肉豆蔻醯胺基丙基-甜菜鹼、棕櫚醯胺基丙基-甜菜鹼、異硬脂醯胺基丙基-甜菜鹼、肉豆蔻醯胺基丙基-二甲基胺、棕櫚醯胺基丙基-二甲基胺、異硬脂醯胺基丙基-二甲基胺、甲基可可醯基鈉、甲基油基牛磺酸鈉、聚乙二醇、聚丙二醇和乙烯與丙烯二醇的共聚物等等。在一些實施方案中，表面活性劑是泊洛沙姆或聚山梨酯，例如泊洛沙姆188、聚山梨酯20、聚山梨酯80。

在一些實施方案中，醫藥組成物中表面活性劑的濃度為0.01mg/mL至1.0mg/mL，或0.1mg/mL至0.8mg/mL，或0.3mg/mL至0.8mg/mL，在一些實施方案中，表面活性劑的濃度為0.6mg/mL，非限制性的實施例包括0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.3mg/mL、0.35mg/mL、0.4mg/mL、0.45mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL，以及這些點值之間的任意範圍。

在一些實施方案中，前述醫藥組成物還包含糖。本揭露的“糖”包含常規組成物(CH₂O)_n及其衍生物，包括單糖、二糖、三糖、多糖、糖醇、還原性糖、非還原性糖等等。該糖可選自葡萄糖、蔗糖、海藻糖、α,α-海藻糖二水合物、乳糖、果糖、麥芽糖、右旋糖苷、甘油、赤藻糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、密裡二糖、松三糖、蜜三糖、甘露三糖、水蘇糖、麥芽糖、乳果糖、麥芽酮糖、山梨醇、麥芽糖醇、乳糖醇、異-麥芽酮糖等等。在一些實施方案中，糖為蔗糖。

在一些實施方案中，前述醫藥組成物中糖的濃度為25mg/mL至80mg/mL，或者30mg/mL至50mg/mL，非限制性的實施例包括25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL以及這些點值之間的任意範圍。在一些實施方案中，濃度為40mg/mL。

在一些實施方案中，前述醫藥組成物還包含胺基酸，例如甘胺酸。

在一些實施方案中，前述醫藥組成物中該胺基酸的濃度為6mg/mL至15mg/mL，例如，7mg/mL至11mg/mL，或7mg/mL至10mg/mL，非限制性的實施例包括6mg/mL、6.5mg/mL、7mg/mL、7.2mg/mL、7.6mg/mL、7.8mg/mL、8mg/mL、8.5mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、10.2mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL以及這些點值之間的任意範圍。在一些實施方案中，濃度為9mg/mL。

在一些實施方案中，醫藥組成物中該抗體藥物偶聯物濃度為以蛋白濃度計，1mg/mL至100mg/mL，非限制性的實施例包括1mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、21mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、24mg/mL、25mg/mL、26mg/mL、27mg/mL、28mg/mL、29mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL以及這些點值之間的任意範圍；在一些實施方案中，該抗體藥物偶聯物濃度為以蛋白濃度計，10mg/mL至30mg/mL，例如20mg/mL。具體的，非限制性的實施例包括20.1mg/mL、20.2mg/mL、20.3mg/mL、20.4mg/mL、20.5mg/mL、20.6mg/mL、20.7mg/mL、20.8mg/mL、20.81mg/mL、20.82mg/mL、20.83mg/mL、20.84mg/mL、20.85mg/mL、20.86mg/mL、20.87mg/mL、20.88mg/mL、20.89mg/mL、20.9mg/mL、20.91mg/mL、20.92mg/mL、20.93mg/mL、20.94mg/mL、20.95mg/mL、20.96mg/mL、20.97mg/mL、20.98mg/mL、20.99mg/mL、21mg/mL以及這些點值之間的任意範圍。該以蛋白濃度計，是指以抗體藥物偶聯物中的抗體部分的濃度計。

在一些實施方案中，該醫藥組成物，其包含：

(a)以蛋白濃度計，1mg/mL至100mg/mL的該抗體藥物偶聯物，(b)0.1mg/mL至0.8mg/mL的泊洛沙姆或聚山梨酯，(c)30mg/mL至50mg/mL的蔗糖，(d)6mg/mL至15mg/mL甘胺酸，和(e)10mM至50mM的琥珀酸-琥珀酸鈉緩衝劑；該醫藥組成物的pH為3.5至5.5。

在一些實施方案中，該醫藥組成物，其包含：

(a)以蛋白濃度計，1mg/mL至50mg/mL的該抗體藥物偶聯物，(b)0.2mg/mL至0.8mg/mL的泊洛沙姆或聚山梨酯，(c)30mg/mL至50mg/mL的蔗糖，(d)6mg/mL至15mg/mL甘胺酸，和(e)20mM至40mM的琥珀酸-琥珀酸鈉緩衝劑；該醫藥組成物的pH為3.7至4.7。

在一些實施方案中，該醫藥組成物，其包含：

(a)以蛋白濃度計，20mg/mL的該抗體藥物偶聯物，(b)0.6mg/mL的泊洛沙姆188或0.2mg/mL的聚山梨酯80，(c)40mg/mL的蔗糖，(d)9mg/mL甘胺酸和(e)30mM琥珀酸-琥珀酸鈉緩衝劑，該醫藥組成物的pH為4.2。

在一些實施方案中，前述任一項的醫藥組成物是液體製劑。本揭露的液體製劑或者複溶後的製劑，具有較好的穩定性。進一步的，穩定的液體製劑包括這樣的液體製劑：其在包括40℃的溫度保存1個月後表現出期望的特徵。

本揭露還提供一種含抗體藥物偶聯物的凍乾製劑，其中該製劑複溶後可形成如上所述的醫藥組成物。

本揭露還提供一種製備含抗體藥物偶聯物的凍乾製劑的方法，其中包括將如上所述的醫藥組成物經冷凍乾燥的步驟。

在一些實施方案中，該凍乾製劑於40℃穩定至少7天、至少14天、至少28天或至少30天。

本揭露還提供一種包含抗體藥物偶聯物的凍乾製劑，該凍乾製劑藉由將如上所述的抗體藥物偶聯物的醫藥組成物冷凍乾燥獲得。

本揭露還提供一種含抗體藥物偶聯物的複溶溶液，其中該複溶溶液是藉由將如上所述的凍乾製劑複溶製備獲得。

本揭露還提供製備上述複溶溶液的方法，其中包括將前述凍乾製劑經複溶的步驟，其複溶所用溶液選自但不限於注射用水、生理鹽水或葡萄糖溶液。

本揭露還提供一種製品，其包括容器，該容器中裝有如上所述的醫藥組成物、凍乾製劑或複溶溶液。在一些實施方案中，該容器為中性硼矽玻璃管製注射劑瓶。

本揭露還提供前述的醫藥組成物或凍乾製劑或複溶溶液或製品在製備治療或預防腫瘤的藥物中的應用。

本揭露還提供治療疾病的方法，包括向有需要的患者施用前述的醫藥組成物或凍乾製劑或複溶溶液或製品。

本揭露還提供作為藥物的前述的醫藥組成物、或凍乾製劑、或複溶溶液、或製品，用於治療疾病。

本揭露還提供作為藥物的前述的醫藥組成物、或凍乾製劑、或複溶溶液、或製品，用於治療腫瘤。

本揭露還提供作為藥物的前述的醫藥組成物、或凍乾製劑、或複溶溶液、或製品，在製備治療腫瘤的藥物中的用途。

在一些實施方案中，其中該腫瘤為與HER2的結構域II表達相關的癌症。

在一些實施方案中，其中該腫瘤選自乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮癌、前列腺癌、腎癌、尿道癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、肉瘤、肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌、白血病、骨癌、皮膚癌、甲狀腺癌、胰腺癌和淋巴瘤。

以下為Pertuzumab的重、輕鏈的可變區序列：

輕鏈可變區

SEQ ID NO：1

重鏈可變區

SEQ ID NO：2

以下為Pertuzumab的序列：

輕鏈

SEQ ID NO.3

重鏈

SEQ ID NO.4

如所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的，本揭露中所述各個實施方案的一項、一些或所有特性可以進一步組合以形成本揭露的其它實施方案。本揭露的以上實施方案和藉由組合得到的其他實施方案藉由下面的詳述進一步說明。

發明詳述

本揭露提供一種更利於生產和給藥，性能穩定的醫藥組成物。其中，不期望的不穩定性可包括下列任何一項或多項：聚集、脫醯胺化(例如Asn脫醯胺化)、氧化(例如Met氧化)、異構化(例如Asp異構化)、剪裁(clipping)/水解/片段化(例如鉸鏈區片段化)、琥珀醯亞胺形成、不成對的半胱胺酸、毒素的解離等。具體地，本揭露所述的醫藥組成物包含抗體藥物偶聯物和緩衝劑。

術語

為了更容易理解本揭露，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本揭露所屬領域的一具有通常知識者通常理解的含義。

“抗體藥物偶聯物(antibody drug conjugate，ADC)是把抗體藉由連接單元與具有生物活性的細胞毒素或具有細胞殺傷活性的小分子藥物相連。

“載藥量”或“藥物載量”也稱藥物抗體比例(Drug-to-Antibody Ratio，DAR)，即ADC中每個抗體所偶聯的藥物的平均數量。其可在例如每個抗體偶聯1至10個藥物的範圍內，並且在某些實施例中，在每個抗體偶聯1至8個藥物的範圍內，較佳自2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、3-4、3-5、5-6、5-7、5-8和6-8。示例性的，載藥量可以為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的均值。本揭露的ADC通式包括與前述一定範圍內的藥物偶聯的抗體的集合。在本揭露的實施方式中，載藥量可表示為n。可用常規方法如UV/可見光光譜法、質譜、ELISA試驗和HPLC測定載藥量。

術語“接頭單元”或“連接片段”或“連接單元”是指一端與抗體或其抗原結合片段連接而另一端與藥物相連的化學結構片段或鍵，也可以連接其他接頭後再與藥物相連。

接頭，包括延伸物、間隔物和胺基酸單元，可以藉由本領域已知方法合成，諸如US20050238649A1中所記載的。接頭可以是便於在細胞中釋放藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩定接頭(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接頭、光不穩定接頭、二甲基接頭、或含二硫化物接頭(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)；美國專利No.5,208,020)。

術語“藥物連接臂片段”或“藥物-接頭片段”是指藥物與接頭單元相連形成的片段，其可藉由接頭單元另一端與抗體相連。

可以用以下非限制性方法控制細胞毒性藥物的載量，包括：

(1)控制連接藥物連接臂片段和單抗的莫耳比，

(2)控制反應時間和溫度，

(3)選擇不同的反應試劑。

本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

本揭露所述的“抗體”以最廣義使用，並且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於全長抗體和抗體片段(或抗原結合片段，或抗原結合部分)，只要它們展現出期望的抗原結合活性。通常，天然的完整抗體由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。

本揭露工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。陽性的株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用pH梯度法沖提結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。

“緩衝劑”指藉由其酸-鹼共軛組分的作用而耐受pH變化的緩衝劑。將pH控制在適當範圍中的緩衝劑的例子包括醋酸鹽、琥珀酸鹽、葡萄糖酸鹽、組胺酸、草酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、枸櫞酸鹽、酒石酸鹽、延胡索酸鹽、甘胺醯甘胺酸和其它有機酸緩衝劑。

“組胺酸緩衝劑”是包含組胺酸的緩衝劑。組胺酸緩衝劑的實例包括組胺酸-鹽酸組胺酸，組胺酸-醋酸組胺酸，組胺酸-磷酸組胺酸，組胺酸-硫酸組胺酸等緩衝劑，較佳組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑。組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑可由組胺酸與鹽酸配製而成，或者由組胺酸與鹽酸組胺酸配製而成。

“枸櫞酸鹽緩衝劑”是包括枸櫞酸根離子的緩衝劑。枸櫞酸鹽緩衝劑的實例包括枸櫞酸-枸櫞酸鈉、枸櫞酸-枸櫞酸鉀、枸櫞酸-枸櫞酸鈣、枸櫞酸-枸櫞酸鎂等。較佳的枸櫞酸鹽緩衝劑是枸櫞酸-枸櫞酸鈉。

“琥珀酸鹽緩衝劑”是包括琥珀酸根離子的緩衝劑。琥珀酸鹽緩衝劑的實例包括琥珀酸-琥珀酸鈉鹽、琥珀酸-琥珀酸鉀、琥珀酸-琥珀酸鈣鹽等。較佳的琥珀酸鹽緩衝劑是琥珀酸-琥珀酸鈉鹽。示例性的，該琥珀酸-琥珀酸鈉可由琥鉑酸與氫氧化鈉配製而成，或由琥鉑酸與琥珀酸鈉鹽配製而成。

“磷酸鹽緩衝劑”是包括磷酸根離子的緩衝劑。磷酸鹽緩衝劑的實例包括磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉-枸櫞酸等。較佳的磷酸鹽緩衝劑是磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉。

“醋酸鹽緩衝劑”是包括醋酸根離子的緩衝劑。醋酸鹽緩衝劑的實例包括醋酸-醋酸鈉、組胺酸-醋酸組胺酸、醋酸-醋酸鉀、醋酸-醋酸鈣、醋酸-醋酸鎂等。較佳的醋酸鹽緩衝劑是醋酸-醋酸鈉。

“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述抗體藥物偶聯物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是保持抗體活性成分的穩定性，促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。

本揭露中，“醫藥組成物”和“製劑”並不互相排斥。

本揭露中所述醫藥組成物的溶液形式，若無特殊說明，其中的溶劑均為水。

“凍乾製劑”表示液體或溶液形式的醫藥組成物或液體或溶液製劑經真空冷凍乾燥步驟之後獲得的製劑或醫藥組成物。

本文所用術語“約”、“大約”是指數值在由所屬技術領域中具有通常知識者所測定的具體值的可接受誤差範圍內，該數值部分取決於怎樣測量或測定(即測量體系的限度)。例如，在本領域每一次實行中“約”可意味著在1內或超過1的標準差。或者，“約”或“基本上包含”可意味著至多20%的範圍。此外，特別對於生物學系統或過程而言，該術語可意味著至多一個數量級或數值的至多5倍。除非另外說明，否則當具體值在本揭露和申請專利範圍中出現時，“約”或“基本上包含”的含義應該假定為在該具體值的可接受誤差範圍內。

本揭露中數值為儀器測量值或儀器測量後計算值，存在一定程度的誤差，一般而言，正負10%均屬於合理誤差範圍內。當然需要考慮該數值所用之處的上下文，例如，總雜質的含量，該數值為測量後誤差變化不超過正負10%，可以為正負9%、正負8%、正負7%、正負6%、正負5%、正負4%、正負3%、正負2%或正負1%，較佳正負5%。

本揭露所述的醫藥組成物能夠達到一種穩定的效果：其中的抗體藥物偶聯物在貯藏後基本上保留其物理穩定性和/或化學穩定性和/或生物學活性的醫藥組成物；較佳地，醫藥組成物在貯藏後基本上保留其物理和化學穩定性以及其生物學活性。貯藏期一般基於醫藥組成物的預定保存期來選擇。目前有多種測量蛋白質或抗體藥物偶聯物穩定性的分析技術，可測量在選定溫度貯藏選定時間段後的穩定性。

穩定的製劑是在下述情況下沒有觀察到顯著變化的製劑：在冷藏溫度(2-8℃)保存至少3個月、較佳6個月、更佳1年。另外，穩定的液體製劑包括這樣的液體製劑：其在包括25℃的溫度保存包括1個月、2個月、3個月在內的時段後表現出期望的特徵。進一步的，穩定的液體製劑包括這樣的液體製劑：其在包括40℃的溫度保存包括10天、20天、1個月在內的時段後表現出期望的特徵。穩定性的典型的例子：藉由SEC-HPLC測得，通常不超過約10%、較佳不超過約5%的抗體單體發生聚集或降解。藉由視覺分析，製劑是淡黃色近無色澄明液體或者無色，或澄清至稍微乳白色。該製劑的濃度、pH和重量克分子滲透壓濃度具有不超過±10%變化。通常觀察到不超過約10%、較佳不超過約5%的減少。通常形成不超過約10%、較佳不超過約5%的聚集。

如果在目檢顏色和/或澄清度後，或者藉由UV光散射、尺寸排阻色譜法(SEC)和動態光散射(DLS)測得，抗體藥物偶聯物沒有顯示出顯著的聚集增加、沉澱和/或變性，那麼該抗體藥物偶聯物在藥物製劑中“保留它的物理穩定性”。蛋白構象的變化可以藉由螢光光譜法(其確定蛋白三級結構)和藉由FTIR光譜法(其確定蛋白二級結構)來評價。

如果抗體藥物偶聯物沒有顯示出顯著的化學改變，那麼該抗體藥物偶聯物在藥物製劑中“保留它的化學穩定性”。藉由檢測和定量化學上改變的形式的蛋白，可以評估化學穩定性。經常改變蛋白化學結構的降解過程包括水解或截短(藉由諸如尺寸排阻色譜法和CE-SDS等方法來評價)、氧化(藉由諸如與質譜法或MALDI/TOF/MS結合的肽譜法等方法來評價)、脫醯胺作用(藉由諸如離子交換色譜法、毛細管等電聚焦、肽譜法、異天冬胺酸測量等方法來評價)和異構化(藉由測量異天冬胺酸含量、肽譜法等來評價)。

如果抗體藥物偶聯物在給定時間的生物活性是在製備藥物製劑時表現出的生物活性的預定範圍內，那麼該抗體藥物偶聯物在藥物製劑中“保留它的生物活性”。

“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如，“視需要包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。

“取代的”指基團中的一個或多個氫原子，較佳為最多5個，更佳為1~3個氫原子彼此獨立地被相應數目的取代基取代。不言而喻，取代基僅處在它們的可能的化學位置，所屬技術領域中具有通常知識者能夠在不付出過多努力的情況下確定(藉由實驗或理論)可能或不可能的取代。例如，具有游離氫的胺基或羥基與具有不飽和(如烯屬)鍵的碳原子結合時可能是不穩定的。

常規的醫藥組成物的製備見中國藥典。

術語“載體”用於本揭露的藥物，是指能改變藥物進入人體的方式和在體內的分佈、控制藥物的釋放速度並將藥物輸送到靶向器官的體系。藥物載體釋放和靶向系統能夠減少藥物降解及損失，降低副作用，提高生物利用度。如可作為載體的高分子表面活性劑由於其獨特的兩親性結構，可以進行自組裝，形成各種形式的聚集體，較佳的實例如膠束、微乳液、凝膠、液晶、囊泡等。這些聚集體具有包載藥物分子的能力，同時又對膜有良好的滲透性，可以作為優良的藥物載體。

“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組成物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。

“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本揭露的任一種結合化合物的組成物，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床可測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本揭露的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann 和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。

“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。

“置換”是指溶解抗體蛋白或抗體藥物偶聯物的溶劑體系的置換，例如，使用穩定製劑的緩衝體系經物理操作方式將含抗體蛋白或抗體藥物偶聯物的高鹽或高滲溶劑體系置換，從而使抗體蛋白或抗體藥物偶聯物存在於穩定製劑中。所稱物理操作方式包括但不限於超濾、透析或離心後複溶。

在本文中，"帕妥珠單抗(Pertuzumab)"指包含分別在SEQ ID No.1和2中的輕鏈和重鏈可變區胺基酸序列的抗體。若Pertuzumab是完整抗體，則它較佳包含分別在SEQ ID No.3和4中的輕鏈和重鏈胺基酸序列。

圖1為N87/16-8皮下移植瘤模型小鼠腫瘤體積變化圖。

圖2為N87/16-8皮下移植瘤模型小鼠體重變化圖。

圖3為JIMIT-1皮下移植瘤模型小鼠腫瘤體積變化圖。

圖4為JIMIT-1皮下移植瘤模型小鼠體重變化圖。

以下結合實施例進一步描述本揭露，但這些實施例並非是對本揭露範圍的限制。本揭露實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如參照冷泉港實驗室出版的《抗體技術實驗手冊》，《分子選殖手冊》；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

化合物的結構是藉由核磁共振(NMR)或/和質譜(MS)來確定的。NMR位移(δ)以10^-6(ppm)的單位給出。NMR的測定是用Bruker AVANCE-400核磁儀，測定溶劑為氘代二甲基亞碸(DMSO-d ₆)、氘代氯仿(CDCl₃)、氘代甲醇(CD₃OD)，內標為四甲基矽烷(TMS)。

MS的測定用Agilent 1200/1290 DAD-6110/6120 Quadrupole MS液質聯用儀(生產商：Agilent，MS型號：6110/6120 Quadrupole MS)。

waters ACQuity UPLC-QD/SQD(生產商：waters，MS型號：waters ACQuity Qda Detector/waters SQ Detector)THERMO Ultimate 3000-Q Exactive(生產商：THERMO，MS型號：THERMO Q Exactive)

高效液相色譜法(HPLC)分析使用Agilent HPLC 1200DAD、Agilent HPLC 1200VWD和Waters HPLC e2695-2489高壓液相色譜儀。

手性HPLC分析測定使用Agilent 1260 DAD高效液相色譜儀。

高效液相製備使用Waters 2545-2767、Waters 2767-SQ Detecor2、Shimadzu LC-20AP和Gilson GX-281製備型色譜儀。

手性製備使用Shimadzu LC-20AP製備型色譜儀。

CombiFlash快速製備儀使用Combiflash Rf200(TELEDYNE ISCO)。

薄層層析矽膠板使用煙臺黃海HSGF254或青島GF254矽膠板，薄層色譜法(TLC)使用的矽膠板採用的規格是0.15mm至0.2mm，薄層層析分離純化產品採用的規格是0.4mm至0.5mm。

矽膠管柱色譜法一般使用煙臺黃海矽膠200至300目矽膠為載體。

本發明的已知的起始原料可以採用或按照本領域已知的方法來合成，或可購買自ABCR GmbH & Co.KG，Acros Organics，Aldrich Chemical Company，韶遠化學科技(Accela ChemBio Inc)、達瑞化學品等公司。

實施例中無特殊說明，反應能夠均在氬氣氛或氮氣氛下進行。

氬氣氛或氮氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氬氣或氮氣氣球。

氫氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氫氣氣球。

加壓氫化反應使用Parr 3916EKX型氫化儀和清藍QL-500型氫氣發生器或HC2-SS型氫化儀。

氫化反應通常抽真空，充入氫氣，重複操作3次。

微波反應使用CEM Discover-S 908860型微波反應器。

實施例中無特殊說明，溶液是指水溶液。

實施例中無特殊說明，反應的溫度為室溫，為20℃至30℃。

純化化合物採用的管柱層析的沖提劑的體系和薄層色譜法的展開劑的體系包括：A：二氯甲烷和異丙醇體系，B：二氯甲烷和甲醇體系，C：石油醚和乙酸乙酯體系，溶劑的體積比根據化合物的極性不同而進行調節，也可以加入少量的三乙胺和酸性或鹼性試劑等進行調節。

本文所述的如式I所示的抗體藥物偶聯物可依照PCT/CN2022/107479的方法製備。

一、抗體偶聯物的製備

實施例1

步驟1：化合物1b的製備

冰水浴下，將化合物1a(艾日布林，參照ZL201010236637.2方法製備獲得)(72.91mg，0.1mmol)溶於10mL的四氫呋喃中，加入Fmoc-OSu(芴甲氧羰醯琥珀醯亞胺，41mg，0.12mmol)，然後在室溫攪拌至反應完全。減壓濃縮得粗品，直接用於下一步反應。

步驟2：化合物1c的製備

將上步所得化合物1b的粗品溶於10mL無水乙醚中，加入氧化銀(34.8mg，0.15mmol)，接著加入碘甲烷(28.4mg,0.2mmol)，然後於室溫攪拌至反應完全，過濾，然後減壓濃縮得粗品，直接進行下一步反應。

步驟3：化合物1的製備

將上步所得化合物1c粗品溶於10mL的四氫呋喃中，加入2mL的二乙胺，然後在室溫攪拌至反應完全，減壓濃縮得粗品，經矽膠管柱層析色譜法(沖提劑：二氯甲烷/乙酸乙酯/石油醚)純化，得3mg目標產物化合物1。

LC/MS(ESI)：m/z 744.2[M+H]⁺。

冰水浴下，將4a(50mg,0.08mmol，參照WO2017151979中方法製備)溶解到1.5mL的N,N-二甲基甲醯胺中，然後加入DIPEA(N,N-二異丙基乙胺，18mg,0.14mmol)，接著加入二(對硝基苯)碳酸酯(49mg,0.16mmol)，然後在室溫下攪拌10加入20mL甲基三級丁基醚，攪拌20分鐘，過濾，乾燥得到固體36mg，LC/MS(ESI)：m/z 784.1[M+H]⁺。

將化合物1(13.5mg,0.018mmol)溶於1.5mL的DMF中，加入DIPEA(7mg,0.054mmol)，然後分批加入化合物4b(18mg,1.3mmol)，攪拌至反應基本完全，濃縮得粗品，經HPLC製備分離得6.5mg化合物L-1，純度96.95%，LC/MS(ESI)：m/z 1388.3[M+H]⁺。

實施例2 ADC-001

在37℃條件下，向抗體Pertuzumab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，1.43mL，97nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP-HCl)的水溶液(10mM，24.2uL，242nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。

將化合物L-1(1.34mg，965nmol)溶解於60uL二甲亞碸中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到標題產物的PBS緩衝液(1.24mg/mL，9.8mL)，於4℃冷藏儲存。

CE-SDS計算平均值：n=3.17。

實施例3 ADC-001

在12℃條件下，在含有2.5mM EDTA的20mM組胺酸-鹽酸-Tris緩衝液(pH 7.2，7.73L)中，含135.32g Pertuzumab抗體(0.93mmol)與0.5880g三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(Sigma，2.05mmol)在恆溫水浴中攪拌反應120min，生成中間體I溶液。滴加2M醋酸調節反應液pH至5.2。

將化合物L-1(6.865g，4.94mmol)溶解於0.425L DMSO中，生成化合物L-1的DMSO溶液。向上述中間體I溶液中預加0.348L DMSO，再將上述化合物L-1的DMSO溶液加入到預加DMSO的中間體I溶液中，於水浴12℃下攪拌。滴加2M醋酸調節反應液pH至4.2。

將上述反應液經0.22μm濾器過濾後，使用琥珀酸緩衝液(pH=4.2)超濾，得到產物ADC-001(20g/L，反相色譜計算平均值：n=4.1)。

二、生物學測試

測試例1：對體外培養人乳腺癌BT-474和人胃癌NCI-N87,NCI-N87/16-8,NCI-N87/8-2細胞增殖的抑制作用

1.1 藥物信息

備註：以上樣品由上海恆瑞有限公司提供。其中帕妥珠單抗按照WO2006033700中類似方法製備獲得；kadcyla：曲妥珠單抗-美坦新偶聯物。

1.2 受試細胞

NCI-N87和BT-474細胞購自American Type Culture Collection(ATCC)。T-DM1長期作用NCI-N87誘導出的T-DM1耐藥的NCI-N87/16-8和NCI-N87/8-2細胞由本實驗室構建。細胞用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640/DMEM(1：1)培養液培養。

1.3 儀器及試劑

RPMI 1640和DMEM購自Gibco BRL公司；FBS購自Gibco公司；磺醯羅丹明B(SRB)購自Sigma公司。

酶標儀Synergy H4購自BioTek公司。

1.4 實驗步驟

接種一定數量的對數生長期細胞於96孔培養板。貼壁生長24小時後，加入不同濃度(10000、3000、1000、300、100、30、10、3、1ng/mL)的藥物。藥物處理120小時後，用三氯乙酸固定細胞。然後SRB溶液染色；最後加入Tris溶液溶解SRB，酶標儀510nm波長下測定OD值，以下列公式計算細胞生長抑制率：

抑制率=(OD值對照孔-OD值給藥孔)/OD值對照孔×100%

根據各濃度抑制率，用GraphPad Prism 7軟體計算半數抑制濃度IC₅₀。

表1.對HER2陽性腫瘤細胞增殖抑制作用IC₅₀(ng/mL)

測試例2：化合物1的體外細胞毒活性篩選

1.1. 實驗原理及方法

本實驗利用CTG檢測ATP含量，反映腫瘤細胞的存活情況。首先藉由種植不同密度的細胞並培養3天和5天，根據IC₅₀和最大抑制率確定最終培養條件。然後按照此條件檢測毒素分子的殺傷作用。

1.2. 細胞株的選擇

根據實驗目的，選擇乳腺癌、NSCLC兩種疾病模型，選出SKBR3腫瘤細胞(HER2+，ATCC，貨號HTB-30)、MDA-MB-468(HER2-，ATCC，貨號HTB-132)和A549(人非小細胞肺癌細胞，ATCC，貨號CCL-185)三株細胞用於篩選實驗。

1.3. 細胞培養條件的確定

1)細胞培養：A549、SK-BR-3和MDA-MB-468細胞分別用含10% FBS(Gibco，10099-141)的Ham’s F-12K(Kaighn’s)培養基(Gibco，21127030)和McCoy's 5A培養基(ThermoFisher，貨號16600108)培養及Leibovitz's L-15培養基(ThermoFisher，貨號11415-114)進行培養。

2)細胞鋪板：將A549用胰酶消化後，用上述培養基終止，計數後分別取4.3×10⁵、7.2×10⁵、11.5×10⁵個細胞加培養液使終體積均為26ml。在96孔板(康寧，貨號3903)第2列到第11列每孔加180ul細胞懸液，使得細胞密度分別為每孔3K、5K、8K。第12列為200ul培養液，剩餘孔用PBS填充。SKBR3和MDA-MB-468細胞重複上述操作。平行兩份。

2)藥物配製：在圓底96孔板(康寧，貨號3788)中，用DMSO配製陽性對照艾日布林和本揭露化合物儲備液。在配藥板1的第1列配製2mM(用DMSO將儲液稀釋10倍)，此後到第10列梯度10倍稀釋於DMSO中，第11列為DMSO。配藥板2第2列至第11列每孔加入相應培養液95ul，從配藥板1的第2列至第 11列吸取5ul溶液至配藥板2，混勻後，吸取20ul加入鋪好的細胞中，繼續培養3天和5天。

3)CTG檢測(Cell Titer-GloTM，發光細胞生存能力檢測，Promega公司)：分別在第3天和第5天取出細胞板，平衡至室溫。每孔加入90ul CTG，避光室溫反應10min，酶標儀讀取發光值並計算IC₅₀。

1.4. 數據結果

表2

測試例3：化合物1藥物代謝動力學測試

1、概述

以Non-naïve的比格犬為受試動物，應用LC/MS/MS法測定了比格犬靜脈注射給予化合物1和艾日布林後不同時刻血漿中的藥物濃度。研究本揭露化合物在犬體內的藥物代謝動力學行為，評價其藥動學特徵。

2、試驗方案

2.1 試驗藥品

化合物1和艾日布林

2.2 試驗動物

比格犬6隻，雄性，平均分為2組，由美迪西普亞醫藥科技(上海)有限公司採購並進行動物給藥實驗。

2.3 藥物配製

稱取化合物1，加5%體積的DMSO，20%PG和20% PEG400使其溶解，然後加入55%生理鹽水配製成0.25mg/ml無色澄明溶液。

稱取艾日布林，加5%體積的DMSO，20%PG和20% PEG400使其溶解，然後加入55%生理鹽水配製成0.25mg/ml無色澄明溶液。

2.4 給藥

一組犬靜脈注射給藥化合物1，給藥劑量均為0.5mg/kg，給藥體積均為2ml/kg。

另一組犬靜脈注射給藥艾日布林，給藥劑量均為0.5mg/kg，給藥體積均為2ml/kg。

3、操作

犬注射給藥化合物1，於給藥前及給藥後5分鐘、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0小時採血1ml，將收集的血液樣本置於EDTA-K2抗凝型採血管中，將收集到的全血放在冰上，1小時內離心分離血漿(離心力2200g，離心10min，2-8℃)。血漿樣本在檢測前存放於-80℃冰箱內。

犬注射給藥艾日布林化合物，於給藥前及給藥後5分鐘、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0小時採血1ml，將收集的血液樣本置於EDTA-K2抗凝型採血管中，將收集到的全血放在冰上，1小時內離心分離血漿(離心力2200g，離心10min，2-8℃)。血漿樣本在檢測前存放於-80℃冰箱內。

測定藥物注射給藥後犬血漿中的待測化合物含量：取給藥後各時刻的犬血漿25μl，加入內標溶液喜樹鹼(中國生物製品檢定所)50μl(100ng/mL)和乙腈200μl，渦旋混合5分鐘，離心10分鐘(3700轉/分鐘)，血漿樣品取上清液3-4μl進行LC/MS/MS(API4000三重四極杆串聯質譜儀(No.2)，美國Applied Biosystems公司；Shimadzu LC-30AD超高效液相色譜系統，日本Shimadzu公司)分析。

4、藥物代謝動力學參數結果

本揭露化合物的藥物代謝動力學參數如下表3所示。

表3

測試例4：ADC-001對人胃癌NCI-N87/16-8裸小鼠皮下移植瘤的療效

1、實驗目的

評價ADC-001對人胃癌NCI-N87/16-8裸小鼠皮下移植瘤的療效。

2、試驗藥品

ADC-001，用生理鹽水稀釋至所需濃度。

3、細胞

人胃癌NCI-N87細胞購自American Type Culture Collection。NCI-N87經T-DM1長期誘導培養對T-DM1耐藥，命名為NCI-N87/16-8。細胞用10-cm培養皿培養，培養條件為RPMI 1640培養基(Gibco)中加10%胎牛血清以及青、鏈黴素，於37℃、含5% CO₂空氣的培養箱中培養。一週2-3次傳代，當細胞呈指數生長期時，胰酶消化，收集細胞，計數，接種。

4、試驗動物

BALB/cJGpt-Foxn1^nu/Gpt小鼠，4週，雌性，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司。生產許可證號：SCXK(蘇)2019-0009；動物合格證號202004958。飼養環境：SPF級。

5、試驗步驟

每隻裸小鼠皮下接種1×10⁷ NCI-N87/16-8細胞，待腫瘤生長至100-150mm³後，根據腫瘤體積和體重將動物分組(D0)。小鼠靜脈注射給予0.3和0.6mg/ml的ADC-001，給藥體積10mL/kg。每週測2次腫瘤體積，稱小鼠體重，記錄數據。

6、試驗指標

實驗指標為考察藥物對腫瘤生長的影響，具體指標為T/C%或腫瘤生長抑制率TGI(%)。

每週二次用游標卡尺測量腫瘤直徑，腫瘤體積(V)計算公式為：

V=1/2×a×b²其中a、b分別表示長、寬。

T/C(%)=(T-T₀)/(C-C₀)×100其中T、C為實驗結束時的腫瘤體積；T₀、C₀為實驗開始時的腫瘤體積。

生長抑制率TGI(%)=100-T/C(%)。

當腫瘤出現消退時，生長抑制率TGI(%)=100-(T-T₀)/T₀×100

如果腫瘤比起始體積縮小，即T<T₀或C<C₀時，即定義為腫瘤部分消退(PR)；如果腫瘤完全消失，即定義為腫瘤完全消退(CR)。

實驗結束、達到實驗終點、或溶劑組平均腫瘤體積達到1500mm³，CO₂麻醉處死動物，隨後解剖取瘤並拍照。

7、統計學分析

除非特別說明，二組腫瘤體積之間比較採用雙尾Student’s t檢驗，P<0.05定義為有統計學顯著性差異。

8、結果

單次給藥後第22天，3mg/k和6mg/kg，ADC-001可以抑制NCI-N87/16-8細胞在裸小鼠皮下移植瘤模型中的生長，抑瘤率分別為46.77%和90.18%(P<0.01 vs PBS control)。荷瘤小鼠對能ADC-001很好耐受，沒有體重減輕等症狀發生。

9、結論

ADC-001能夠有效抑制人胃癌NCI-N87/16-8細胞在裸小鼠皮下移植瘤模型中的生長，荷瘤小鼠對ADC-001能很好耐受。

測試例5：ADC-001對JIMIT-1細胞在裸小鼠皮下移植瘤的療效

1、試驗藥品

ADC-001，用PBS稀釋至所需濃度。

2、細胞

人乳腺癌JIMIT-1細胞。

4、試驗動物

雌性Balb/c nude小鼠

5、試驗步驟

BALB/c nude小鼠右側背部皮下接種JIMT1細胞5×10⁵ JIMT1細胞，待腫瘤體積達80-100mm³時，根據腫瘤體積和小鼠體重隨機分組，每組6隻，分組當天開始給藥。HRA00092-C063-004採用PBS稀釋至0.6mg/ml靜脈注射給藥，給藥體積為10ml/kg，對照組靜脈注射給予相同體積的PBS。

每週二次用游標卡尺測量腫瘤長徑和短徑，並測量小鼠體重。

腫瘤體積(V)計算公式為：

V=1/2×a×b²其中a、b分別表示長、寬。

生長抑制率TGI(%)=100-T/C(%)。

6、結果

單次給藥後第24天，ADC-001可以顯著抑制JIMIT-1細胞在裸小鼠皮下移植瘤模型中的生長，抑瘤率為121.3%，其中5隻小鼠中的腫瘤都出現了消退(<50mm³)。荷瘤小鼠對能ADC-001很好耐受，沒有體重減輕等症狀發生。

三、製劑

製劑製備與檢測過程中使用的設備及結果計算方法如下：

SEC分子排阻色譜法：

根據凝膠孔隙的孔徑大小與高分子樣品分子的線團尺寸間的相對關係而對溶質進行分離的分析的方法。

SEC%(SEC單體含量百分比)=A單體/A總×100%(A單體為樣品中主峰單體的峰面積，A總為所有峰面積之和)。△SEC%=穩定性放置前製劑的SEC%-穩定性放置後製劑的SEC%。

SEC測定用儀器：安捷倫1260；管柱：waters，XBridge BEH200Å SEC(300×7.8mm 3.5μm)

R-CE毛細管凝膠電泳：

將凝膠移到毛細管中作為支持介質進行的一種電泳，並在一定的電壓下根據樣品分子量的大小進行分離的方法。

R-CE%=A主峰/A總×100%(A主峰為樣品中輕鏈主峰+重鏈主峰的峰面積，A總為所有峰面積之和。)△R-CE%=穩定性放置前製劑的R-CE%-穩定性放置後製劑的R-CE%。

CE測定用儀器：Beckman型號plus800

滲透壓測定：

冰點法測定滲透壓，以冰點下降值與溶液的摩爾濃度成正比例關係為基礎，採用高靈敏度感溫元件，測定溶液結冰點，藉由電量轉化為滲透壓。儀器廠家羅澤Loser，型號OM815。

蛋白濃度：

以下實施例所採用的蛋白為抗Her2-ADC。

蛋白的濃度測定用儀器：紫外可見分光光度計，型號：Nano Drop 2000，光程為1mm。

本揭露中的抗體藥物偶聯物濃度以蛋白的濃度計，即以抗體藥物偶聯物中抗體部分的濃度。

因為抗體藥物偶聯物中的毒素在蛋白特徵吸收波長280nm下幾乎沒有吸收，同時該毒素在370nm下幾乎沒有吸收，故用以下公式對上述蛋白濃度進行計算：

A_280nm=(C_mAb×E_mAb-280)×l即：

式中，A_280nm：供試品溶液單份樣品在光程為1cm時在280nm波長處的吸光度平均值；

E_mAb-280：蛋白在280nm波長處的質量消光係數，為1.45g^-1cm^-1L；

C_mAb：蛋白的濃度，mg/mL；

l：光程長度，cm(此處光程為1cm)。

若供試液經過稀釋，則蛋白濃度為：C(mg/mL)=C_mAb×N，N為稀釋倍數。

游離毒素測定(RP-UPLC反相法)：

將樣品中的蛋白用ACN沉澱除去，取上清氮氣吹乾後複溶，根據樣品中的毒素的極性不一樣進行分離，再藉由毒素標準品濃度-峰面積擬合的線性方程公式計算樣品中的毒素含量。

測定儀器：waters ACQuity H class；

色譜管柱：waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18，1.7μm，2.1*150mm

游離毒素測定(LC-MS法)：

本研究藉由液相色譜聯用質譜法對ADC產品中的毒素及相關雜質進行定量測定。本方法直接將樣品稀釋後上樣UPLC-MS進行檢測，同時藉由外標曲線法結合毒素標準品的提取離子流色譜峰面積測定檢測樣品中的游離毒素含量。

儀器：Waters,Acquity UPLC_Rda(Bioaccord)

管柱：Waters,ACQUITY UPLC BEH C4,1.7μm,2.1×50mm

製劑實施例1. pH和緩衝體系篩選

製備含表4所示的緩衝體系、20mg/mL蛋白、0.2mg/mL聚山梨酯80(PS80)、40mg/mL蔗糖、9mg/mL甘胺酸的製劑。對樣品進行強制降解研究(40℃放置一個月)，以SEC為評價指標，考察不同緩衝體系對蛋白穩定性的影響。

結果見表4。SEC數據顯示，40℃放置一個月後，含His-HCl或SA的製劑SEC單體下降幅度小於CA組。較佳His-HCl和SA體系。

表4 pH和緩衝體系篩選結果

備註：His-HCl代表組胺酸-鹽酸組胺酸；CA代表枸櫞酸-枸櫞酸鈉鹽；SA代表琥珀酸-琥珀酸鈉鹽；40℃ M1：40℃放置一個月，△SEC%：D0與40℃ M1SEC單體差值，下同。

製劑實施例2. 緩衝體系pH對游離毒素的影響

製備含表5所示的緩衝體系、20mg/mL蛋白、0.2mg/mL PS80、40mg/mL蔗糖、9mg/mL甘胺酸的製劑。對樣品進行2~8℃穩定性研究，以游離毒素為評價指標，考察不同pH緩衝體系對游離毒素的影響。

結果見表5。游離毒素數據顯示，2~8℃放置一個月後，游離毒素隨著緩衝體系pH的降低而減少。pH5.5優於pH6.5.

表5 pH對游離毒素的影響

備註：2-8℃ M1表示2~8℃放置一個月。

製劑實施例3. pH和緩衝體系對游離毒素的影響

製備含表6所示的緩衝體系、20mg/mL蛋白、0.2mg/mL聚山梨酯80(PS80)、40mg/mL蔗糖、9mg/mL甘胺酸的製劑。對樣品進行穩定性研究(室溫放置一天、2-8℃放置一天、-35℃與2~8℃之間重複凍融2個循環)，以游離毒素為評價指標，考察不同pH和緩衝體系對游離毒素的影響。

結果見表6。游離毒素數據顯示，隨著pH的降低，游離毒素的增長速度變慢，緩衝體系SA優於His-AA。因此緩衝體系較佳為30mM SA pH4.2。

表6 pH和緩衝體系對游離毒素的影響結果

備註：RT24H表示室溫放置一天，2-8℃D1表示2-8℃放置一天，FT2C表示-35℃與2~8℃之間重複凍融2個循環，△游離毒素表示放置後游離毒素與0時比增加的值，同下。

製劑實施例4. 緩衝體系pH的優化

製備含表7所示的緩衝體系、20mg/mL蛋白、0.6mg/ml泊洛沙姆188(F68)、40mg/mL蔗糖、9mg/mL甘胺酸的溶液劑和凍乾粉製劑。對樣品進行穩定性研究(溶液劑樣品室溫放置24小時、2-8℃放置3天、-35℃與2~8℃之間重複凍融5個循環，凍乾粉樣品40℃放置4週)，以外觀、SEC、R-CE、游離毒素為評價指標，考察不同緩衝體系pH對蛋白穩定性和游離毒素的影響。

結果見表7、8。結果顯示，溶液劑：pH4.0-4.2各條件下SEC/CE/游離毒素穩定性均較好，pH4.6游離毒素RT24h及2-8℃ D3略有增長，但整體游離毒素依然較低，穩定性可以接受。凍乾劑pH4.0-4.64度及40度放置4週穩定性較好，組間無差異。綜合溶液及凍乾結果，緩衝體系較佳為30mM SA pH4.2。

表7.緩衝體系pH的優化溶液劑結果

備註：D0表示0天，RT24H表示室溫24小時，D3表示3天，以此類推；FT1C表示-35℃與2~8℃之間重複凍融1個循環，以此類推。

表8 緩衝體系pH的優化凍乾粉結果

備註：FR表示凍乾粉用注射用水進行複溶；D0表示0天；W4表示4週。

製劑實施例5. 賦形劑及滲透壓調節劑的篩選

製備含表9所示賦形劑及滲透壓調節劑、30mM SA pH 4.2、20mg/mL蛋白、0.2mg/mL PS80的溶液劑。對樣品進行穩定性研究，以外觀、SEC和游離毒素為評價指標，考察不同濃度的賦形劑及滲透壓調節劑對蛋白穩定性的影響。

結果見表10。RT24H/2-8℃ D1/FT1C數據顯示，組間外觀和SEC無顯著性差異。但40mg/mL蔗糖+9mg/mL甘胺酸組游離毒素略優，因此較佳40mg/mL蔗糖+9mg/mL甘胺酸。

表9賦形劑及滲透壓調節劑信息表

表10賦形劑及滲透壓調節劑的篩選結果

備註：RT24H表示室溫放置24小時；2-8℃D1表示2-8℃放置1天；F/T1C表示-35℃與2~8℃之間重複凍融1個循環；N/A表示未檢測。

製劑實施例6. 表面活性劑篩選

製備含表11所示表面活性劑、30mM SA pH 4.2、20mg/mL蛋白、40mg/mL蔗糖、9mg/mL甘胺酸的溶液劑。對樣品進行穩定行放置(室溫放置7天和4℃放置7天)，以SEC和游離毒素為評價指標，考察不同表面活性劑對蛋白穩定性的影響。

結果見表11。數據顯示，組間游離毒素、SEC純度無顯著性區別。

表11表面活性劑種類篩選結果

製劑實施例7. 表面活性劑濃度篩選

製備含表12所示不同濃度的F68、30mM SA pH 4.2、20mg/mL蛋白、40mg/mL蔗糖、9mg/mL甘胺酸的溶液劑和凍乾粉製劑。對樣品進行穩定性研究(溶液樣品在2-8℃放置3天、-35℃和2~8℃之間重複凍融3次，凍乾後產品0時)，以外觀和SEC為評價指標，考察不同濃度的F68對蛋白穩定性的影響。

結果見表12。數據顯示，對溶液劑，0.4-0.6mg/mL F68處方在不同條件下，樣品外觀較好，SEC純度項無顯著性差異。凍乾複溶後外觀和SEC純度項無顯著差異。因此，表面活性劑濃度較佳0.4-0.6mg/mL。更佳0.6mg/ml。

表12表面活性劑濃度篩選結果

Claims

一種醫藥組成物，包含抗體藥物偶聯物和緩衝劑，其中該抗體藥物偶聯物具有如式I所示的結構：

其中，

Ab為帕妥珠單抗(Pertuzumab)；

n為1至10，較佳為1至8，更佳為3至5；

該緩衝劑選自枸櫞酸鹽緩衝劑、組胺酸緩衝劑和琥珀酸鹽緩衝劑，較佳組胺酸-鹽酸組胺酸、枸櫞酸-枸櫞酸鈉和琥珀酸-琥珀酸鈉。
如請求項1所述的醫藥組成物，其中該醫藥組成物的pH為3.5至5.5，較佳pH為3.5至5.0，更佳pH為3.7至4.7。
如請求項1所述的醫藥組成物，其中該緩衝劑的濃度為5mM至50mM，較佳為20mM至40mM，更佳為30mM。
如請求項1或2所述的醫藥組成物，其中該醫藥組成物還包含表面活性劑，該表面活性劑較佳為聚山梨酯或泊洛沙姆。
如請求項3所述的醫藥組成物，其中該表面活性劑濃度為0.01mg/mL至1.0mg/mL，較佳0.05mg/mL至1.0mg/mL，更佳為0.1mg/mL至1.0mg/mL。
如請求項1至4中任一項所述的醫藥組成物，其中該醫藥組成物還包含糖，該糖較佳為蔗糖。
如請求項5所述的醫藥組成物，其中該糖濃度為25mg/mL至80mg/mL，較佳為30mg/mL至50mg/mL，更佳為40mg/mL。
如請求項1至6中任一項所述的醫藥組成物，其中該醫藥組成物還包含胺基酸，該胺基酸較佳為甘胺酸。
如請求項7所述的醫藥組成物，其中該胺基酸的濃度為6mg/mL至15mg/mL，較佳為7mg/mL至11mg/mL，更佳為9mg/mL。
如請求項1至8中任一項所述的醫藥組成物，其中該抗體藥物偶聯物濃度為以蛋白濃度計，1mg/mL至100mg/mL，

較佳地，該抗體藥物偶聯物濃度為以蛋白濃度計，10mg/mL至30mg/mL，

更佳地，該抗體藥物偶聯物濃度為以蛋白濃度計，18mg/mL至22mg/mL。
如請求項1至9中任一項所述的醫藥組成物，其包含：

(a)以蛋白濃度計，1mg/mL至100mg/mL的該抗體藥物偶聯物，(b)0.1mg/mL至0.8mg/mL的泊洛沙姆或聚山梨酯，(c)30mg/mL至50mg/mL的蔗糖，(d)6mg/mL至15mg/mL甘胺酸，和(e)10mM至50mM的琥珀酸-琥珀酸鈉緩衝劑；該醫藥組成物的pH為3.5至5.5，

較佳的，該醫藥組成物包含：

(a)以蛋白濃度計，1mg/mL至50mg/mL的該抗體藥物偶聯物，(b)0.4mg/mL至0.8mg/mL的泊洛沙姆或聚山梨酯，(c)30mg/mL至50mg/mL的蔗糖，(d)6mg/mL至15mg/mL甘胺酸，和(e)20mM至40mM的琥珀酸-琥珀酸鈉緩衝劑；該醫藥組成物的pH為3.7至4.7

更佳的，該醫藥組成物包含：

(a)以蛋白濃度計，20mg/mL的該抗體藥物偶聯物，(b)0.6mg/mL的泊洛沙姆188或0.2mg/mL的聚山梨酯80，(c)40mg/mL的蔗糖，(d)9mg/mL甘胺酸和(e)30mM琥珀酸-琥珀酸鈉緩衝劑，該醫藥組成物的pH為4.2。
一種含抗體藥物偶聯物的凍乾製劑，其中該凍乾製劑複溶後可形成如請求項1至10中任一項所述的醫藥組成物。
一種含抗體藥物偶聯物的凍乾製劑，其中該凍乾製劑藉由將如請求項1至10中任一項所述的醫藥組成物冷凍乾燥獲得。
一種含抗體藥物偶聯物的複溶溶液，其中該複溶溶液是藉由將如請求項11或12所述的凍乾製劑複溶製備獲得。
一種製品，其包括容器，該容器中裝有如請求項1至10中任一項所述的醫藥組成物、如請求項11或12所述的凍乾製劑或如請求項13所述的複溶溶液。
一種如請求項1至10中任一項所述的醫藥組成物、如請求項11或12所述的凍乾製劑、如請求項13所述的複溶溶液或如請求項14所述製品在製備治療病毒感染、腫瘤或癌症的藥物中的用途；較佳的，該腫瘤為與HER2的結構域II表達相關的癌症；較佳的，該腫瘤選自乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮癌、前列腺癌、腎癌、尿道癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、肉瘤、肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌、白血病、骨癌、皮膚癌、甲狀腺癌、胰腺癌和淋巴瘤。