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TW202430568A - 抗b7h3抗體以及其使用方法 - Google Patents

抗b7h3抗體以及其使用方法 Download PDF

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TW202430568A
TW202430568A TW112151374A TW112151374A TW202430568A TW 202430568 A TW202430568 A TW 202430568A TW 112151374 A TW112151374 A TW 112151374A TW 112151374 A TW112151374 A TW 112151374A TW 202430568 A TW202430568 A TW 202430568A
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seq
antibody
antigen
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chain variable
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TW112151374A
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唐曉燕
劉琦
薛柳
肖毅仁
丁曉
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英屬開曼群島商百濟神州有限公司
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Abstract

本揭露提供了結合人4Ig-B7H3的抗體或其抗原結合片段，識別人4Ig-B7H3作為一個抗原和至少一個其他抗原的多特異性抗體或其抗原結合片段，進一步與細胞毒素軛合的抗人4Ig-B7H3抗體或其抗原結合片段，包含所述抗體或其抗原結合片段的藥物組成物，以及該抗體、多特異性抗體或該組成物用於治療疾病例如癌症之用途。

Description

抗B7H3抗體以及其使用方法
本文揭露了特異性結合人4Ig-B7H3的抗體以及分離的核酸、載體和宿主細胞。該等抗體可用於與其他形式（例如第二腫瘤相關抗原（TAA）、免疫檢查點或免疫刺激因子）一起構建多特異性抗體、構建抗體藥物軛合物（ADC）或形成融合蛋白。最後，本文揭露的抗人4Ig-B7H3抗體可用於治療多種癌症。
B7H3或B7-H3（CD276或B7RP-2）係2001年從樹突狀細胞（DC）cDNA文庫中鑒定出的一種I型跨膜蛋白（Chapoval等人, (2001) Nat. Immunol. [自然-免疫學] 2(3): 269-274）。作為B7免疫調節家族的一部分，B7H3在人體中有兩種同種型：4Ig-B7H3和2Ig-B7H3。4Ig-B7H3係在惡性細胞中表現的主要同種型（Steinberger等人, (2004) J. Immunol. [免疫學雜誌] 172(4): 2352-2359）。小鼠B7H3的細胞外結構域由單對免疫球蛋白可變（IgV）樣和免疫球蛋白恒定（IgC）樣結構域組成，而由於外顯子複製，人B7H3包含單對或相同的兩對上述結構域（Sun等人, (2002) J. Immunol. [免疫學雜誌] 168(12): 6294-6297；Steinberger等人, (2004) J. Immunol. [免疫學雜誌] 172(4): 2352-2359）。B7H3的細胞內結構域較短，並且沒有已知的傳訊模體（Picarda等人, (2016) Clin. Cancer. Res. [臨床癌症研究] 22(14): 3425-3431）。除跨膜形式外，B7H3還可以可溶形式存在，該形式係藉由蛋白酶從膜B7H3上切割下來的或藉由選擇性剪接造成的（Zhang等人, (2008) Immunology. [免疫學] 123(4): 538-546）。
B7H3屬於B7蛋白家族，與其他B7家族配體具有20%-27%的胺基酸同一性，但受體仍有待闡明（Chapoval等人, (2001) Nat. Immunol. [自然-免疫學] 2(3): 269-274）。迄今為止，B7H3參與免疫逃避的分子機制尚不清楚，並且B7H3在T細胞介導的適應性免疫中的功能仍存在爭議。儘管最初被鑒定為T細胞共刺激分子（Chapoval等人, (2001) Nat. Immunol. [自然-免疫學] 2(3): 269-274；Zhang等人, (2004) Acta Biochim. Biophys. Sin. [生物化學與生物物理學報] 36(6): 430-436），但後來的研究表明它主要起到免疫抑制作用（Suh等人, (2003) Nat. Immunol. [自然-免疫學] 4(9): 899-906；Prasad等人, (2004) J. Immunol. [免疫學雜誌] 173(4): 2500-2506；Fukushima等人 (2007) Immunol. Lett. [免疫學快報] 113(1): 52-57；Veenstra等人, (2015) Blood. [血液] 125(21): 3335-3346）。同時，小鼠B7H3的晶體結構表明，FG環對於mB7H3介導的T細胞增殖抑制非常重要（Vigdorovich等人, (2013) Structure. [結構] 21(5): 707-717）。值得注意的是，B7H3高表現的NSCLC與較低數量的腫瘤浸潤淋巴球相關，並且對抗PD1治療而言係難治性的，表明B7H3在免疫逃避中起一定作用。因此，B7H3靶向治療與抗PD-1/PD-L1抗體治療組合係用於B7H3表現性NSCLC的一種有前景的方法（Altan等人, (2017) Clin. Cancer. Res. [臨床癌症研究] 23(17): 5202-5209）。
除免疫調節外，B7H3還具有固有的促腫瘤功能。TCGA分析顯示，B7H3表現與各種癌症類型的EGFR/PI3K/AKT通路、MAPK通路和EMT過程相關。異常B7H3表現促進腫瘤轉移、血管生成、糖酵解代謝和耐藥性（Tekle等人, (2012) Int. J. Cancer. [國際癌症雜誌] 130(10): 2282-2290；Liu等人, (2015) Mol. Med. Rep. [分子醫學報告] 12(4): 5455-5460；Lee等人, (2017) Cell Res. [細胞研究] 27(8): 1034-1045；Flem-Karlsen等人, (2018) Trends Cancer. [癌症趨勢] 4(6): 401-404；Liu等人, (2019) Oncogene. [致癌基因] 38(1): 88-102；Lai等人, (2020) Immunol. Res. [免疫學研究] 68(3): 177）。因此，在許多癌症類型中，B7H3過表現與預後不良和較差臨床結局相關（Crispen等人, (2008) Clin. Cancer Res. [臨床癌症研究] 14(16): 5150-5157；Bachawal等人, (2015) Cancer Res. [癌症研究] 75(12): 2501-2509；Fan等人, (2016) Pak. J. Med. Sci. [巴基斯坦醫學科學雜誌] 32(6): 1568-1573；Song等人, (2016) Onco. Targets Ther. [腫瘤靶點與治療] 9: 6257-6263；Wu等人, (2016) Oncotarget. [腫瘤靶點] 7(49): 81750-81756；Benzon等人, (2017) Prostate Cancer Prostatic Dis. [前列腺癌和前列腺疾病] 20(1): 28-3）。
許多研究已報告B7H3在多種實性瘤和腫瘤脈管系統中高度過表現，但在正常組織中的表現有限（Loo等人, (2012) Clin. Cancer Res. [臨床癌症研究] 18(14): 3834-3845；Seaman等人, (2017) Cancer Cell. [癌細胞] 31(4): 501-515 e508；Du等人, (2019) Cancer Cell. [癌細胞] 35(2): 221-237 e228；Yamato等人, (2022) Mol. Cancer Ther. [分子癌症治療] 21(4): 635-646），使其成為癌症治療的有吸引力的靶點。大多數B7H3靶向產品處於早期開發階段。Y-Mabs公司開發了具有放射性核素（包括I131或Lu177）的奧博妥單抗（omburtamab），並且其主要產品係靶向腦腫瘤的I131-奧博妥單抗。依布妥組單抗（enoblituzumab）係處於I/II期的Fc增強型B7H3 Ab，並且與抗PD1抗體組合時，在抗PD1/PD-L1難治性患者中表現出有限的抗腫瘤療效。B7H3 ADC在I期研究中顯示出初步的抗腫瘤活性，並且具有耐受性良好的安全性特徵，其包括巨集基因公司（MacroGenics）的MGC018和第一三共株式會社（Daiichi Sankyo）的DS-7300。
尚無批准的針對B7H3的治療性抗體，並且對於靶向B7H3的治療劑的醫療需求仍未得到滿足。
相關申請的交叉引用
本申請要求於2022年12月29日提交的申請案號PCT/CN2022/143248的優先權，將其藉由引用以其全文併入本文。
本揭露包含針對人4Ig-B7H3的特異性抗體和其抗體片段。此外，本文揭露的抗體及其抗體片段可用於與其他形式（例如第二腫瘤相關抗原（TAA）、免疫檢查點或免疫刺激因子）一起構建多特異性抗體、或構建抗體藥物軛合物（ADC）或形成融合蛋白。4Ig-B7H3抗體單獨或與其他治療劑組合可潛在地用於治療或預防癌症。
本揭露關於特異性結合人4Ig-B7H3的抗體及其抗原結合片段。
本揭露涵蓋以下實施方式。
一種特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含： (i) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 11的HCDR1（重鏈互補決定區1）、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 14的HCDR3，以及輕鏈可變區（VL），該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 23的LCDR1（輕鏈互補決定區1）、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (ii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 1的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 3的HCDR3，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 4的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (iii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 11的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 3的HCDR3，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 4的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (iv) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 1的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 14的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 4的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (v) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 1的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 17的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 4的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (vi) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 1的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 3的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 20的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (vii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 1的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 3的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 23的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3；或者 (viii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 11的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 28的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 23的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3。
該抗體或其抗原結合片段，其中： (i) 重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 26具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，並且輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 24具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列； (ii) 重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 7具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，並且輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 8具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列； (iii) 重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 12具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，並且輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 8具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列； (iv) 重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 15具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，並且輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 8具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列； (v) 重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 18具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，並且輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 8具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列； (vi) 重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 7具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，並且輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 21具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列； (vii) 重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 7具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，並且輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 24具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列；或者 (viii) 重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 29具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，並且輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 24具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。
該抗體或其抗原結合片段，其中SEQ ID NO: 26和24、SEQ ID NO: 7和8、SEQ ID NO: 12和8、SEQ ID NO: 15和8、SEQ ID NO: 18和8、SEQ ID NO: 7和21、SEQ ID NO: 7和24、SEQ ID NO: 29和24中已插入、缺失或取代一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸。
該抗體或其抗原結合片段，其中： (i) 重鏈可變區包含SEQ ID NO: 26，並且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 24； (ii) 重鏈可變區包含SEQ ID NO: 7，並且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 8； (iii) 重鏈可變區包含SEQ ID NO: 12，並且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 8； (iv) 重鏈可變區包含SEQ ID NO: 15，並且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 8； (v) 重鏈可變區包含SEQ ID NO: 18，並且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 8； (vi) 重鏈可變區包含SEQ ID NO: 7，並且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 21； (vii) 重鏈可變區包含SEQ ID NO: 7，並且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 24；或者 (viii) 重鏈可變區包含SEQ ID NO: 29，並且輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 24。
該抗體或其抗原結合片段，其係單株抗體、人工程化抗體、單鏈抗體（scFv）、Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2片段。
該抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含scFv，該scFv包含具有SEQ ID NO: 26的胺基酸的VH和具有SEQ ID NO: 24的胺基酸的VL，視需要該VH和VL經由胺基酸連接子連接，視需要該胺基酸連接子係SEQ ID NO: 35至SEQ ID NO: 77中的任何序列。
該抗體或其抗原結合片段，其中胺基酸連接子係SEQ ID NO: 77。
該抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含具有SEQ ID NO: 32的胺基酸序列的scFv。
一種多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含特異性結合人4Ig-B7H3的至少第一抗原結合結構域，其中該第一抗原結合結構域係本文所述之抗體或其抗原結合片段；以及特異性結合第二人腫瘤相關抗原（TAA）的至少第二抗原結合結構域。
該多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該多特異性抗體係雙特異性抗體。
該多特異性抗體或其抗原結合片段，其進一步包含胺基酸連接子，其中該胺基酸連接子係SEQ ID NO: 35至SEQ ID NO: 77中的任何序列。
該抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞類的重鏈恒定區和/或κ或λ類型的輕鏈恒定區。
該抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含IgG1亞類的重鏈恒定區和κ類型的輕鏈恒定區。
該抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有抗體依賴性細胞毒性（ADCC）或補體依賴性細胞毒性（CDC）。
該抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有降低的糖基化或無糖基化或係低岩藻糖基化的。
該抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含增加的二等分GlcNac結構。
該抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與細胞毒素軛合。
該抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段經由細胞毒素連接子與細胞毒素軛合。
該抗體或其抗原結合片段，其中： (1) 該抗體或其抗原結合片段特異性結合包含人4Ig-B7H3（SEQ ID NO: 80）的胺基酸殘基29-139或由其組成的表位；並且/或者 (2) 該抗體或其抗原結合片段特異性結合包含人4Ig-B7H3（SEQ ID NO: 80）的胺基酸殘基243-357或由其組成的表位。
在一些實施方式中，(3) 該抗體或其抗原結合片段不與包含人4Ig-B7H3（SEQ ID NO: 80）的胺基酸殘基145-238或由其組成的表位結合；並且/或者 (4) 該抗體或其抗原結合片段不與包含人4Ig-B7H3（SEQ ID NO: 80）的胺基酸殘基363-456或由其組成的表位結合。
一種藥物組成物，其包含本文所述之抗體或其抗原結合片段和藥學上可接受的載劑。
一種治療癌症之方法，該方法包括向有需要的患者投與有效量的本文所述之抗體或其抗原結合片段或藥物組成物。
該方法，其中該癌症係4Ig-B7H3陽性的。
該方法，其中該癌症係結直腸癌、前列腺癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、腎癌、肺癌或食管癌。
該方法，其中該肺癌係非小細胞肺癌（NSCLC）或小細胞肺癌（SCLC）。
該方法，其中該非小細胞肺癌為鱗狀非小細胞肺癌。
該方法，其中該食管癌係食管鱗狀細胞癌。
該方法，其中該抗體或其抗原結合片段與另一種治療劑組合投與。
該方法，其中該治療劑係紫杉醇或紫杉醇藥劑、多西他賽、卡鉑、托泊替康、順鉑、伊立替康、多柔比星、來那度胺或5-氮雜胞苷。
該方法，其中該治療劑係免疫檢查點抑制劑。
該方法，其中該治療劑係抗PD-1抗體。
該方法，其中該抗PD1抗體係替雷利珠單抗（Tislelizumab）。
一種分離的核酸，其編碼本文所述之抗體或其抗原結合片段。
一種載體，其包含本文所述之核酸。
一種宿主細胞，其包含本文所述之核酸或載體。
一種用於生產抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包括培養本文所述之宿主細胞並從培養物中回收抗體或抗體片段。
一種特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或其抗原結合片段，其中： (1) 該抗體或其抗原結合片段特異性結合包含人4Ig-B7H3（SEQ ID NO: 80）的胺基酸殘基29-139或由其組成的表位；並且/或者 (2) 該抗體或其抗原結合片段特異性結合包含人4Ig-B7H3（SEQ ID NO: 80）的胺基酸殘基243-357或由其組成的表位。
在一些實施方式中，(3) 該抗體或其抗原結合片段不與包含人4Ig-B7H3（SEQ ID NO: 80）的胺基酸殘基145-238或由其組成的表位結合；並且/或者 (4) 該抗體或其抗原結合片段不與包含人4Ig-B7H3（SEQ ID NO: 80）的胺基酸殘基363-456或由其組成的表位結合。
在一些實施方式中，本揭露提供了抗人4Ig-B7H3抗體或其抗原結合片段，其顯示特異性結合人4Ig-B7H3並且對其具有高親和力。
在一些實施方式中，本揭露提供了抗人4Ig-B7H3抗體或其抗原結合片段，其顯示增加的結合親和力和/或增加的內化（例如增加的內化率）。
本揭露提供了抗人4Ig-B7H3抗體及其抗原結合片段。此外，本揭露提供了具有期望的結合親和力、期望的內化（例如增加的內化率）及其他期望的屬性的抗體。抗人4Ig-B7H3抗體可用於與其他形式（例如第二腫瘤相關抗原（TAA）、免疫檢查點或免疫刺激因子）一起構建多特異性抗體、或構建抗體藥物軛合物（ADC）或與其他結構域融合形成融合蛋白。此外，抗人4Ig-B7H3抗體及其構建體可用於治療癌症和相關障礙。 I. 抗 4Ig-B7H3 抗體
本揭露提供了特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或其抗原結合片段。本揭露的抗體或抗原結合片段包括但不限於如下所述產生的抗體或其抗原結合片段。
本揭露提供了特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）包含具有SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 29的胺基酸序列（ 表 7）的VH結構域。本揭露還提供了特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含具有 表 7中列出的HCDR中的任一個的胺基酸序列的HCDR。在一方面，本揭露提供了特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體包含具有 表 7中列出的HCDR中的任一個的胺基酸序列的一個、兩個、三個或更多個HCDR。
本揭露提供了特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）包含具有SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 21的胺基酸序列（ 表 7）的VL結構域。本揭露還提供了特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含具有 表 7中列出的LCDR中的任一個的胺基酸序列的LCDR。在一方面，本揭露提供了特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體包含具有 表 7中列出的LCDR中的任一個的胺基酸序列的一個、兩個、三個或更多個LCDR。
在一個實施方式中，特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或其抗原結合片段包含一或多個互補決定區（CDR），該等CDR包含選自由以下組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 23。
在另一個實施方式中，特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或其抗原結合片段包含：(a) 含有一或多個互補決定區的重鏈可變區（HCDR），該等HCDR包含選自由以下組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 28，和/或 (b) 含有一或多個互補決定區的輕鏈可變區（LCDR），該等LCDR包含選自由以下組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 23。
在另一個實施方式中，特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或其抗原結合片段包含：(a) 含有三個互補決定區的重鏈可變區（HCDR），其中該等HCDR係包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的HCDR1；包含SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的HCDR2；以及包含SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的HCDR3；和/或 (b) 含有三個互補決定區的輕鏈可變區（LCDR），其中該等LCDR係包含SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 20或SEQ ID NO: 23的胺基酸序列的LCDR1；包含SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的LCDR2；以及包含SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的LCDR3。
在另一個實施方式中，特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或其抗原結合片段包含：(a) 含有三個互補決定區的重鏈可變區（HCDR），其中該等HCDR係：包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的HCDR3；包含SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的HCDR3；包含SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的HCDR3；包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO: 17的胺基酸序列的HCDR3；包含SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的HCDR3；或包含SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的HCDR2，以及包含SEQ ID NO: 28的胺基酸序列的HCDR3，和/或 (b) 含有三個互補決定區的輕鏈可變區（LCDR），其中該等LCDR係包含SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的LCDR2，以及包含SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的LCDR3；包含SEQ ID NO: 20的胺基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的LCDR2，以及包含SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的LCDR3；或包含SEQ ID NO: 23的胺基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的LCDR2，以及包含SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的LCDR3。
在一個實施方式中，特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或其抗原結合片段包含：(i) 來自SEQ ID NO: 26中所示的重鏈可變區（VH）的HCDR1（重鏈互補決定區1）、HCDR2和HCDR3；(ii) 來自SEQ ID NO: 7中所示的重鏈可變區（VH）的HCDR1、HCDR2和HCDR3；(iii) 來自SEQ ID NO: 12中所示的重鏈可變區（VH）的HCDR1、HCDR2和HCDR3；(iv) 來自SEQ ID NO: 15中所示的重鏈可變區（VH）的HCDR1、HCDR2和HCDR3；(v). 來自SEQ ID NO: 18中所示的重鏈可變區（VH）的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或 (vi) 來自SEQ ID NO: 29中所示的重鏈可變區（VH）的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和/或 (i) 來自SEQ ID NO: 24中所示的輕鏈可變區（VL）的LCDR1（輕鏈互補決定區1）、LCDR2和LCDR3；(ii) 來自SEQ ID NO: 21中所示的輕鏈可變區（VL）的LCDR1、LCDR2和LCDR3；(iii) 來自SEQ ID NO: 8中所示的輕鏈可變區（VL）的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一個實施方式中，特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或其抗原結合片段包含： (i) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 11的HCDR1（重鏈互補決定區1）、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 14的HCDR3，以及輕鏈可變區（VL），該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 23的LCDR1（輕鏈互補決定區1）、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (ii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 1的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 3的HCDR3，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 4的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (iii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 11的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 3的HCDR3，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 4的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (iv) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 1的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 14的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 4的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (v) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 1的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 17的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 4的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (vi) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 1的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 3的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 20的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (vii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 1的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 3的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 23的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3；或者 (viii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 11的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 28的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 23的LCDR1，(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2，和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3，根據Kabat定義。
在一個實施方式中，本揭露的抗體或其抗原結合片段包含：(a) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 29的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 29中的任一個具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，和/或 (b) 輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 21的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 21中的任一個具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。
在一個實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含： (i) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 26具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 24具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列； (ii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 7具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 8具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列； (iii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 12具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 8具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列； (iv) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 15具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 8具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列； (v) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 18具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 8具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列； (vi) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 7具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 21具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列； (vii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 7具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 24具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列；或者 (viii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 29具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 24具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。
在一個實施方式中，本揭露提供了一種抗體或其抗原結合片段，其中SEQ ID NO: 26和24、SEQ ID NO: 7和8、SEQ ID NO: 12和8、SEQ ID NO: 15和8、SEQ ID NO: 18和8、SEQ ID NO: 7和21、SEQ ID NO: 7和24、SEQ ID NO: 29和24中已插入、缺失或取代一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸。
在一個實施方式中，本揭露提供了該抗體或其抗原結合片段，其包含： (i) 含有SEQ ID NO: 26的重鏈可變區，以及含有SEQ ID NO: 24的輕鏈可變區； (ii) 含有SEQ ID NO: 7的重鏈可變區，以及含有SEQ ID NO: 8的輕鏈可變區； (iii) 含有SEQ ID NO: 12的重鏈可變區，以及含有SEQ ID NO: 8的輕鏈可變區； (iv) 含有SEQ ID NO: 15的重鏈可變區，以及含有SEQ ID NO: 8的輕鏈可變區； (v) 含有SEQ ID NO: 18的重鏈可變區，以及含有SEQ ID NO: 8的輕鏈可變區； (vi) 含有SEQ ID NO: 7的重鏈可變區，以及含有SEQ ID NO: 21的輕鏈可變區； (vii) 含有SEQ ID NO: 7的重鏈可變區，以及含有SEQ ID NO: 24的輕鏈可變區；或者 (viii) 含有SEQ ID NO: 29的重鏈可變區，以及含有SEQ ID NO: 24的輕鏈可變區。
本揭露的其他抗體或其抗原結合片段包括已被改變、但在CDR區中與 表 7中揭露的CDR區相比具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性百分比的胺基酸。在一些方面，其包括胺基酸改變（插入、缺失或取代，視需要保守胺基酸取代），其中當與 表 7中描述的序列中描繪的CDR區相比時，CDR區中不超過1、2、3、4或5個胺基酸發生改變，同時保持結合特異性和親和力。
本揭露的其他抗體包括可變區（例如，可變區的框架區）中的胺基酸或編碼胺基酸的核酸已被改變；但與 表 7中描述的可變區的序列具有至少60%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性百分比，同時保留結合特異性/親和力，視需要CDR的相應序列不改變的那些抗體。在一些方面，其包括胺基酸序列中的改變，其中當與 表 7中描述的序列中描繪的可變區相比時，可變區（例如，可變區的框架區）中不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸發生改變，同時保留結合特異性/親和力，視需要CDR的相應序列不改變。
在另一個實施方式中，本揭露提供了抗體或其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段以1 x 10 -6M至1 x 10 -11M的結合親和力（K D）與人4Ig-B7H3特異性結合。在另一個實施方式中，抗4Ig-B7H3抗體或其抗原結合片段以約1 x 10 -6M、約1 x 10 -7M、約1 x 10 -8M、約1 x 10 -9M、約1 x 10 -10M或約1 x 10 -11M的結合親和力（K D）與人4Ig-B7H3結合。
本揭露還提供了編碼特異性結合人4Ig-B7H3的抗體的VH或VL的核酸序列。可以優化這樣的核酸序列以在哺乳動物細胞中表現。
本揭露還提供了結合與 表 7中描述的抗4Ig-B7H3抗體相同的表位的抗體及其抗原結合片段。因此，另外的抗體及其抗原結合片段可以基於它們在結合測定中與 表 7中描述的抗體交叉競爭（例如，以統計學顯著的方式競爭性抑制其結合）的能力來鑒定。測試抗體抑制本揭露的抗體及其抗原結合片段結合4Ig-B7H3的能力證明測試抗體可與該抗體或其抗原結合片段競爭結合4Ig-B7H3。不受任何一種理論的束縛，這樣的抗體可以結合4Ig-B7H3上的與其競爭的抗體或其抗原結合片段相同或相關（例如，在結構上相似或在空間上鄰近）的表位。在某些方面，結合4Ig-B7H3上的與本揭露的抗體或其抗原結合片段相同的表位的抗體係人或人源化單株抗體。這樣的人或人源化單株抗體可以如本文所述製備和分離。
在一些實施方式中，本揭露提供了特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合包含人4Ig-B7H3（SEQ ID NO: 80）的胺基酸殘基29-139、主要由其組成、或由其組成的表位。
在一些實施方式中，本揭露提供了特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合包含人4Ig-B7H3（SEQ ID NO: 80）的胺基酸殘基243-357、主要由其組成、或由其組成的表位。
在一些實施方式中，本揭露提供了特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合人4Ig-B7H3的IgV1結構域。在一些實施方式中，本揭露提供了特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合人4Ig-B7H3的IgV2結構域。在一些實施方式中，本揭露提供了特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合人4Ig-B7H3的IgV1和IgV2結構域。
在一些實施方式中，本揭露提供了特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段不與包含人4Ig-B7H3（SEQ ID NO: 80）的胺基酸殘基145-238、主要由其組成、或由其組成的表位結合。
在一些實施方式中，本揭露提供了特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段不與包含人4Ig-B7H3（SEQ ID NO: 80）的胺基酸殘基363-456、主要由其組成、或由其組成的表位結合。
在一些實施方式中，本揭露提供了特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段不與人4Ig-B7H3的IgC1結構域結合。在一些實施方式中，本揭露提供了特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段不與人4Ig-B7H3的IgC2結構域結合。在一些實施方式中，本揭露提供了特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段不與人4Ig-B7H3的IgC1和IgC2結構域結合。
在一些實施方式中，本揭露提供了特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合與參比抗體DS-7300的表位不重疊的表位。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段係單株抗體、人工程化抗體、單鏈抗體（scFv）、Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2片段。
在一個實施方式中，抗體或其抗原結合片段呈scFv形式，其包含N-末端到C-末端方向的VH-VL或N-末端到C-末端方向的VL-VH。在一些實施方式中，VH和VL經由本文所述之胺基酸連接子連接。在一些實施方式中，VH包含SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 29中的任一個的胺基酸序列。在一些實施方式中，VL包含SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 21中的任一個的胺基酸序列。在一些實施方式中，VH係 表 7中描述的VH中的任一個。在一些實施方式中，VL係 表 7中描述的VL中的任一個。在一些實施方式中，胺基酸連接子具有包含SEQ ID NO: 35-77中的任一個的胺基酸序列。在一些實施方式中，胺基酸連接子係SEQ ID NO: 35-77中的任何序列。在一個實施方式中，胺基酸連接子係SEQ ID NO: 77。
在一個實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含具有SEQ ID NO: 32的胺基酸序列的scFv。在另一個實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO: 32的scFv。 II. 抗 4Ig-B7H3 多特異性抗體
在一個實施方式中，本文揭露的抗4Ig-B7H3抗體可用於與其他形式（例如第二人腫瘤相關抗原（TAA）、免疫檢查點或免疫刺激因子）一起構建多特異性抗體，其中4Ig-B7H3作為第一TAA。
在一個實施方式中，本文揭露的抗4Ig-B7H3抗體可以摻入抗4Ig-B7H3xTAA多特異性抗體中，其中TAA係針對任何人腫瘤相關抗原的抗體或其片段。抗體分子係多特異性抗體分子，例如，其包含多個抗原結合結構域，其中至少一個抗原結合結構域序列特異性結合作為第一表位的4Ig-B7H3，並且第二抗原結合結構域序列特異性結合作為第二表位的第二TAA。在一個實施方式中，多特異性抗體包含第三、第四或第五抗原結合結構域。在一個實施方式中，多特異性抗體係雙特異性抗體、三特異性抗體或四特異性抗體。
在一個實施方式中，多特異性抗體係雙特異性抗體。如本文所用，雙特異性抗體僅特異性結合兩種抗原。雙特異性抗體包含特異性結合人4Ig-B7H3的第一抗原結合結構域和特異性結合第二TAA的第二抗原結合結構域。這包括雙特異性抗體，其包含特異性結合第二TAA的第二重鏈可變結構域和第二輕鏈可變結構域以及特異性結合人4Ig-B7H3的第一重鏈可變結構域和第一輕鏈可變結構域。在一些實施方式中，雙特異性抗體包含抗原結合片段，其中該抗原結合片段可為Fab、F(ab’) 2、Fv、單鏈Fv（scFv）或單結構域抗體。
在一個實施方式中，本揭露的多特異性抗體以1 x 10 -6M至1 x 10 -10M或甚至1 x 10 -11M的結合親和力（K D）與第二人TAA和/或人4Ig-B7H3結合。在另一個實施方式中，本揭露的多特異性抗體以約1 x 10 -6M、約1 x 10 -7M、約1 x 10 -8M、約1 x 10 -9M、約1 x 10 -10M或約1 x 10 -11M的結合親和力（K D）與第二人TAA和/或人4Ig-B7H3結合。
在一個實施方式中，本揭露提供了多特異性抗體或其抗原結合片段，其中特異性結合人4Ig-B7H3的第一抗原結合結構域包含： (i) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 11的HCDR1（重鏈互補決定區1）、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 14的HCDR3，以及輕鏈可變區（VL），該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 23的LCDR1（輕鏈互補決定區1）、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (ii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 1的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 3的HCDR3，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 4的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (iii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 11的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 3的HCDR3，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 4的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (iv) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 1的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 14的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 4的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (v) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 1的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 17的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 4的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (vi) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 1的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 3的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 20的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (vii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 1的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 3的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 23的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3；或者 (viii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 11的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 28的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 23的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3；並且 第二抗原結合結構域特異性結合第二人TAA。
在另一個實施方式中，本揭露提供了多特異性抗體或其抗原結合片段，其中特異性結合人4Ig-B7H3的第一抗原結合結構域包含： (i) 含有SEQ ID NO: 26的重鏈可變區，以及含有SEQ ID NO: 24的輕鏈可變區； (ii) 含有SEQ ID NO: 7的重鏈可變區，以及含有SEQ ID NO: 8的輕鏈可變區； (iii) 含有SEQ ID NO: 12的重鏈可變區，以及含有SEQ ID NO: 8的輕鏈可變區； (iv) 含有SEQ ID NO: 15的重鏈可變區，以及含有SEQ ID NO: 8的輕鏈可變區； (v) 含有SEQ ID NO: 18的重鏈可變區，以及含有SEQ ID NO: 8的輕鏈可變區； (vi) 含有SEQ ID NO: 7的重鏈可變區，以及含有SEQ ID NO: 21的輕鏈可變區； (vii) 含有SEQ ID NO: 7的重鏈可變區，以及含有SEQ ID NO: 24的輕鏈可變區；或者 (viii) 含有SEQ ID NO: 29的重鏈可變區，以及含有SEQ ID NO: 24的輕鏈可變區，並且 第二抗原結合結構域特異性結合第二人TAA。
先前的實驗（Coloma和Morrison Nature Biotech.[自然生物技術] 15: 159-163 (1997)）描述了四價雙特異性抗體，其藉由在lgG3抗丹磺醯基抗體的C末端（CH3-scFv）之後或鉸鏈（鉸鏈-scFv）之後融合編碼單鏈抗丹磺醯基抗體Fv（scFv）的DNA進行工程化。本揭露提供了具有至少兩個抗原結合結構域的多價抗體（例如，四價抗體），其可藉由編碼抗體多肽鏈的核酸的重組表現容易地產生。本文的多價抗體包含三至八個、但較佳的是四個抗原結合結構域，其特異性結合至少兩種抗原。
在一個實施方式中，多特異性抗體係雙特異性抗體。在另一個實施方式中，多特異性抗體進一步包含本文所述之胺基酸連接子，例如SEQ ID NO: 35至SEQ ID NO: 77中的任一個。 III. 與細胞毒素軛合的抗人 4Ig-B7H3 抗體
抗人4Ig-B7H3抗體可用於構建抗體藥物軛合物（ADC）。在一個實施方式中，抗體或其抗原結合片段與細胞毒素軛合。在另一個實施方式中，抗體或其抗原結合片段經由細胞毒素連接子與細胞毒素軛合。 細胞毒素
細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞生長、活力或增殖有害的任何試劑，包括但不限於微管蛋白相互作用劑和DNA損傷劑。可與本揭露的抗體軛合的合適的細胞毒性劑和化療劑之實例包括例如1-(2-氯乙基)-1,2-二甲磺醯基醯肼、1,8-二羥基-雙環[7.3.1]十三-4,9-二烯-2,6-二炔-13-酮、1-脫氫睪酮、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、9-胺基喜樹鹼、放線菌素D、瓢菌素、胺基蝶呤、蛇形菌素（anguidine）、蒽環素、胺茴黴素（anthramycin，AMC）、澳瑞他汀（auristatins）、博萊黴素、白消安、丁酸、刺孢黴素（例如，刺孢黴素γ1）、喜樹鹼、洋紅黴素（carminomycins）、卡莫司汀、西馬多丁、順鉑、秋水仙鹼、考布他汀、環磷醯胺、阿糖胞苷、細胞鬆弛素B、放線菌素、道諾黴素、胺烯咪胺、雙乙醯氧基戊基多柔比星、二溴甘露醇、二羥基蒽二酮、地索拉唑類（disorazoles）、尾海兔素（例如，尾海兔素10）、多柔比星、倍癌黴素（duocarmycin）、棘黴素（echinomycins）、艾榴塞洛素（eleutherobins）、吐根鹼（emetine）、埃博黴素、埃斯培拉黴素（esperamicin）、雌莫司汀、溴化乙錠、依托泊苷、氟尿嘧啶、格爾德黴素、短桿菌肽D、糖皮質激素、伊立替康、紡錘體驅動蛋白（KSP）抑制劑、來普黴素、洛諾生（leurosines）、利多卡因、洛莫司汀（CCNU）、美登素生物鹼類（maytansinoids）、雙氯乙基亞胺（mechlorethamine）、黴法蘭、巰基嘌呤（mercatopurines）、甲基葉酸（methopterins）、胺甲喋呤、光輝黴素、絲裂黴素、米托蒽醌、N8-乙醯基亞精胺、鬼臼毒素、普魯卡因、心得安、蝶啶類、嘌呤黴素、吡咯并苯并二氮呯類（pyrrolobenzodiazepines，PBD）、根黴素、鏈佐黴素、太利蘇黴素（tallysomycins）、紫杉醇、替尼泊苷、四卡因、硫噴妥苯丁酸氮芥（thioepa chlorambucil）、茅層黴素（tomaymycins）、托泊替康、微管溶素（tubulysin）、長春鹼、長春新鹼、長春地辛、長春瑞濱及任何上述的衍生物。 細胞毒素連接子
細胞毒素連接子或ADC連接子係將本文所述之抗體或抗原結合蛋白與治療部分（例如，細胞毒性劑）連結、連接或鍵合的任何基團或部分。合適的連接子可在例如以下中找到：Antibody-Drug Conjugates and Immunotoxins [抗體-藥物軛合物和免疫毒素]; Phillips, G. L, 編輯; Springer Verlag [施普林格出版公司]: 紐約, 2013；Antibody-Drug Conjugates [抗體-藥物軛合物]; Ducry, L, 編輯; Humana Press [胡馬納出版社], 2013；Antibody-Drug Conjugates [抗體-藥物軛合物]; Wang, J., Shen, W.-C,和Zaro, J. L, 編輯; Springer International Publishing [施普林格國際出版公司], 2015，其各自的內容藉由引用以其全文併入本文。
用於本文所述之抗體軛合物的合適的黏合劑或細胞毒素連接子係足夠穩定以利用抗體的循環半衰期，並且同時能夠在抗原介導的軛合物內化後釋放其有效載荷的那些。連接子可為可切割的或不可切割的。可切割的連接子包括在內化後藉由細胞內代謝切割的連接子，例如通過水解、還原或酶促反應切割。不可切割的連接子包括在內化後通過抗體的溶酶體降解釋放所附接的有效載荷的連接子。合適的連接子包括但不限於酸不穩定連接子、水解不穩定連接子、酶促可切割的連接子、還原不穩定連接子、自消連接子和不可切割的連接子。合適的連接子還包括但不限於係或包含肽、葡糖苷酸、琥珀醯亞胺-硫醚、聚乙二醇（PEG）單元、腙、馬來醯亞胺基-己醯基（mal-caproyl）單元、二肽單元、纈胺酸-瓜胺酸單元和對胺基苄基（PAB）單元的那些。
本領域已知的任何細胞毒素連接子分子或連接子技術可用於創建或構建本揭露的ADC。在某些實施方式中，細胞毒素連接子係可切割的連接子。根據其他實施方式，連接子係不可切割的連接子。可用於本揭露上下文的示例性連接子包括，包含或由以下組成的連接子，例如GGFG、MC（6-馬來醯亞胺基己醯基）、MP（馬來醯亞胺基丙醯基）、val-cit（纈胺酸-瓜胺酸）、val-ala（纈胺酸-丙胺酸）、蛋白酶可切割連接子中的二肽位點、ala-phe（丙胺酸-苯丙胺酸）、蛋白酶可切割連接子中的二肽位點、PAB（對胺基苄氧羰基）、SPP（N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶硫代)戊酸酯）、SMCC（N-琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1羧酸酯）、SIAB（N-琥珀醯亞胺基(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸酯）及其變體和組合。可在本揭露的上下文中使用的另外的連接子之實例在例如以下中提供：US 7,754,681和Ducry, Bioconjugate Chem. [生物軛合化學], 2010, 27:5-13以及其中引用的參考文獻，其內容藉由引用以其全文併入本文。
在某些實施方式中，細胞毒素連接子在生理條件中係穩定的。在某些實施方式中，連接子係可切割的，例如，能夠在存在酶的情況下或在特定的pH範圍或數值下釋放至少有效載荷部分。在一些實施方式中，連接子包含酶可切割的部分。說明性酶可切割的部分包括但不限於肽鍵、酯鍵、腙和二硫鍵。在一些實施方式中，連接子包括組織蛋白酶可切割的連接子。
在一些實施方式中，細胞毒素連接子包含不可切割的部分。
合適的細胞毒素連接子還包括但不限於化學鍵合到單一黏合劑（例如，抗體）的兩個半胱胺酸殘基的那些。這樣的連接子可用於模擬因軛合過程而被破壞的抗體的二硫鍵。
在一些實施方式中，細胞毒素連接子包含一或多個胺基酸。合適的胺基酸包括天然、非天然、標準、非標準、蛋白原性、非蛋白原性和L-或D-胺基酸。在一些實施方式中，細胞毒素連接子包含丙胺酸、纈胺酸、甘胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸或瓜胺酸、其衍生物或其組合。在某些實施方式中，胺基酸的一或多條側鏈連接到側鏈基團，如下所述。在一些實施方式中，連接子包含纈胺酸和瓜胺酸。在一些實施方式中，細胞毒素連接子包含離胺酸、纈胺酸和瓜胺酸。在一些實施方式中，連接子包含離胺酸、纈胺酸和丙胺酸。在一些實施方式中，連接子包含纈胺酸和丙胺酸。 IV. 靶向人 4Ig-B7H3 的融合蛋白
抗人4Ig-B7H3抗體可用於與其他蛋白質或其他功能結構域融合，以形成融合蛋白或嵌合蛋白。
在一些實施方式中，將抗人4Ig-B7H3抗體與免疫檢查點、免疫刺激因子、細胞介素或第二TAA直接或間接地經由本文所述之胺基酸連接子融合。
在一個實施方式中，將抗人4Ig-B7H3抗體與功能結構域或受體亞基融合，該等功能結構域或受體亞基可用於轉導來自scFv的訊息並將抗體特異性賦予免疫細胞，例如T細胞、NK細胞以及其他效應細胞。
在一些實施方式中，抗人4Ig-B7H3抗體用於構建嵌合抗原受體（CAR）。有關CAR構建體的詳細資訊，可在Guedan等人, (2019) Mol. Ther. Methods Clin. Dev. [分子治療方法與臨床開發] 12:145-156中找到。
功能結構域或受體亞基包含跨膜結構域、鉸鏈區、細胞內傳訊結構域、共刺激結構域等。 V. 其他修飾 恒定區和 Fc 區
重鏈恒定區可為來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞類的重鏈恒定區的野生型序列。輕鏈恒定區可為來自κ或λ類型的輕鏈的野生型序列。在一個實施方式中，重鏈恒定區係來自IgG1的恒定區的野生型序列。輕鏈恒定區係來自κ鏈的輕鏈的野生型序列。在一個實施方式中，重鏈恒定區具有SEQ ID NO: 20的胺基酸序列，並且輕鏈恒定區具有SEQ ID NO: 21的胺基酸序列。在另一個實施方式中，重鏈恒定區具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，其包含突變E116P、L117A、L118A、G119del和P212A。該等胺基酸突變對應於EU編號中的E233P、L234A、L235A、G236del和P329A。
在一個實施方式中，Fc區可為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞類的野生型Fc區。在一個實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含具有降低的效應子功能的IgG1或IgG4的Fc結構域。
在一個實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含具有延長的半衰期的Fc結構域。在另一個實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含IgG1的Fc結構域，其中引入位於IgG Fc區的CH2的YTE突變（M252Y/S254T/T256E，EU編號，如US 7658921中所述）。
在另一個實施方式中，本揭露的抗體具有強大的Fc介導的效應子功能，並且抗體介導針對靶細胞的抗體依賴性細胞毒性（ADCC）。
在其他方面，藉由用不同的胺基酸殘基替代至少一個胺基酸殘基來改變Fc區，以改變抗體的效應子功能。例如，可以用不同的胺基酸殘基替代一或多個胺基酸，使得抗體對效應配體具有改變的親和力，但保留親本抗體的抗原結合能力。親和力改變的效應配體可為例如Fc受體或補體的C1組分。此方法描述於例如Winter等人的美國專利案號5,624,821和5,648,260中。
在另一方面，可以用一或多個不同的胺基酸殘基替代一或多個胺基酸殘基，使得抗體具有改變的C1q結合和/或降低的或消除的補體依賴性細胞毒性（CDC）。此方法描述於例如Idusogie等人的美國專利案號6,194,551中。
在又另一方面，改變一或多個胺基酸殘基從而改變抗體固定補體的能力。此方法描述於例如Bodmer等人的公開WO 94/29351中。在特定的方面，本揭露的抗體或其抗原結合片段的一或多個胺基酸被IgG1亞類和κ同種型的一或多個同種異型胺基酸殘基替代。同種異型胺基酸殘基還包括但不限於IgG1、IgG2和IgG3亞類的重鏈恒定區以及κ同種型的輕鏈恒定區，如Jefferis等人, (2009) MAbs. [單株抗體] 1:332-338所述。
在另一方面，藉由修飾一或多個胺基酸來修飾Fc區以增加抗體介導抗體依賴性細胞毒性（ADCC）的能力和/或增加抗體對Fcγ受體的親和力。此方法描述於例如Presta的公開WO 00/42072中。此外，已經繪製了在人IgG1上FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的結合位點，並且已經描述了具有改善的結合的變體（參見Shields等人, (2001) J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 276:6591-6604）。
在另一方面，抗體的糖基化被修飾。例如，可以製備無糖基化抗體（即，抗體缺乏或具有降低的糖基化）。例如，可以改變糖基化以增加抗體對抗原的親和力。這樣的碳水化合物修飾可以藉由例如改變抗體序列內的一或多個糖基化位點來實現。例如，可以進行一或多個胺基酸取代，其導致消除一或多個可變區框架糖基化位點，從而消除該位點的糖基化。這樣的無糖基化可以增加抗體對抗原的親和力。此方法描述於例如Co等人的美國專利案號5,714,350和6,350,861中。
另外地或替代性地，可以製備具有改變的糖基化類型的抗體，如具有減少量的岩藻糖基殘基的低岩藻糖基化抗體或具有增加的二等分GlcNac結構的抗體。已經證明這樣的改變的糖基化模式增加抗體的ADCC能力。這樣的碳水化合物修飾可藉由例如在具有改變的糖基化途徑的宿主細胞中表現抗體來實現。具有改變的糖基化途徑的細胞已經在本領域中描述並且可以用作宿主細胞，在其中表現重組抗體從而產生具有改變的糖基化的抗體。例如，Hang等人的EP 1,176,195描述了具有功能破壞的FUT8基因的細胞系，該基因編碼岩藻糖基轉移酶，使得在這樣的細胞系中表現的抗體表現出低岩藻糖基化。Presta的公開WO 03/035835描述了變體CHO細胞系Lecl3細胞，其具有降低的將岩藻糖連接至Asn（297）-連接的碳水化合物的能力，也導致在該宿主細胞中表現的抗體的低岩藻糖基化（還參見Shields等人, (2002) J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 277:26733-26740）。Umana等人的WO 99/54342描述了被工程化以表現糖蛋白修飾的糖基轉移酶（例如，β(1,4)-N乙醯胺基葡萄糖轉移酶III（GnTIII））的細胞系，使得在工程化的細胞系中表現的抗體表現出增加的二等分GlcNac結構，這導致抗體的ADCC活性增加（還參見Umana等人, (1999) Nat. Biotech. [自然生物技術] 17:176-180）。
在另一方面，如果期望ADCC的降低，許多先前的報告顯示人抗體亞類IgG4僅具有適度的ADCC並且幾乎沒有CDC效應子功能（Moore G L等人 (2010) Mabs. [單株抗體] 2:181-189）。然而，發現天然IgG4在應激條件下（如在酸性緩衝液中或在升高的溫度下）較不穩定（Angal, S. (1993) Mol. Immunol. [分子免疫學] 30:105-108；Dall'Acqua, W.等人, (1998) Biochemistry. [生物化學] 37:9266-9273；Aalberse等人, (2002) Immunol. [免疫學] 105:9-19）。降低ADCC可以藉由將抗體可操作地連接到用降低FcγR結合或C1q結合活性的改變的組合工程化的IgG4 Fc從而降低或消除ADCC和CDC效應子功能來實現。考慮到抗體作為生物藥物的物理化學特性，IgG4的較不期望的固有特性之一係其兩條重鏈在溶液中動態分離以形成半抗體，這導致通過稱為「Fab臂交換」的過程在體內產生雙特異性抗體（Van der Neut Kolfschoten M等人, (2007) Science. [科學] 317:1554-157）。228位（EU編號系統）絲胺酸突變為脯胺酸表現出對IgG4重鏈分離的抑制作用（Angal, S. (1993) Mol. Immunol. [分子免疫學] 30:105-108；Aalberse等人, (2002) Immunol. [免疫學] 105:9-19）。據報告，鉸鏈區和γFc區中的一些胺基酸殘基對抗體與Fcγ受體的相互作用具有影響（Chappel S. M.等人, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊], 88:9036-9040；Mukherjee, J.等人, (1995) FASEB J. [美國實驗生物學會聯合會雜誌] 9:115-119；Armour, K. L.等人, (1999) Eur. J. Immunol. [歐洲免疫學雜誌] 29:2613-2624；Clynes, R. A.等人, (2000) Nature Medicine. [自然醫學] 6:443-446；Arnold J. N., (2007) Annu. Rev. Immunol. [免疫學年鑒] 25:21-50）。此外，在人群中一些罕見的IgG4同種型也可引起不同的物理化學特性（Brusco, A.等人, (1998) Eur. J. Immunogenet. [歐洲免疫遺傳學雜誌] 25:349-55；Aalberse等人, (2002) Immunol. [免疫學] 105:9-19）。為了產生具有低ADCC和CDC但具有良好穩定性的多特異性抗體，可以修飾人IgG4的鉸鏈區和Fc區並引入許多改變。該等經修飾的IgG4 Fc分子可在Li等人的美國專利案號8,735,553的SEQ ID NO: 83-88中找到。
在另一個實施方式中，本揭露的抗體包含具有S228P和/或R409K取代（根據EU編號系統）的人IgG4的Fc結構域。 胺基酸連接子
應理解，是否存在胺基酸連接子對本揭露的抗體或蛋白質的活性影響極小。
還應理解，抗體或蛋白質的多肽鏈的結構域和/或區可被各種長度的連接子區分開。在一些實施方式中，抗原結合結構域藉由連接子區與CL、CH1、鉸鏈、CH2、CH3或整個Fc區彼此分開。例如，VL1-CL-（連接子）VH2-CH1。這樣的連接子區可以包含隨機分類的胺基酸，或一組受限的胺基酸。此類連接子區可為柔性的或剛性的（參見US 2009/0155275）。
已經藉由以下方式構建了多特異性抗體：使用或不使用柔性連接子基因融合兩種單鏈Fv（scFv）或Fab片段（Mallender等人, (1994) J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 269:199-206；Mack等人, (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. [美國國家科學院院刊] 92:7021-5；Zapata等人, (1995) Protein Eng.[蛋白質工程] 8.1057-62），經由二聚化裝置（例如白胺酸拉鍊）（Kostelny等人, (1992) J. Immunol. [免疫學雜誌] 148:1547-53；de Kruif等人 (1996) J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 271:7630-4）和Ig C/CH1結構域（Muller等人, (1998) FEBS Lett. [歐洲生物化學聯合會快報] 422:259-64）；藉由雙抗體（Holliger等人, (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. USA. [美國國家科學院院刊] 1998 90:6444-8；Zhu等人, (1996) Bio/Technology [生物/技術] (NY). 14:192-6）；Fab-scFv融合（Schoonjans等人, (2000) J. Immunol. [免疫學雜誌] 165:7050-7）；以及微型抗體形式（Pack等人, (1992) Biochemistry [生物化學] 31:1579-84；Pack等人, (1993) Bio/Technology. [生物/技術] 11:1271-7）。
本文揭露的抗體或蛋白質在其一或多個抗原結合結構域、CL結構域、CH1結構域、鉸鏈區、CH2結構域、CH3結構域或Fc區中之間包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或更多個胺基酸殘基的胺基酸連接子區。在一些實施方式中，胺基酸甘胺酸和絲胺酸包含在連接子區內。在另一個實施方式中，連接子可為GS（SEQ ID NO: 35）、GGS（SEQ ID NO: 36）、GSG（SEQ ID NO: 37）、SGG（SEQ ID NO: 38）、GGG（SEQ ID NO: 39）、GGGS（SEQ ID NO: 40）、SGGG（SEQ ID NO: 41）、GGGGS（SEQ ID NO: 42）、GGGGSGS（SEQ ID NO: 43）、GGGGSGS（SEQ ID NO: 44）、GGGGSGGS（SEQ ID NO: 45）、GGGGSGGGGS（SEQ ID NO: 46）、GGGGSGGGGSGGGGS（SEQ ID NO: 47）、AKTTPKLEEGEFSEAR（SEQ ID NO: 48）、AKTTPKLEEGEFSEARV（SEQ ID NO: 49）、AKTTPKLGG（SEQ ID NO: 50）、SAKTTPKLGG（SEQ ID NO: 51）、AKTTPKLEEGEFSEARV（SEQ ID NO: 52）、SAKTTP（SEQ ID NO: 53）、SAKTTPKLGG（SEQ ID NO: 54）、RADAAP（SEQ ID NO: 55）、RADAAPTVS（SEQ ID NO: 56）、RADAAAAGGPGS（SEQ ID NO: 57）、RADAAAA（G 4S） 4（SEQ ID NO: 58）、SAKTTP（SEQ ID NO: 59）、SAKTTPKLGG（SEQ ID NO: 60）、SAKTTPKLEEGEFSEARV（SEQ ID NO: 61）、ADAAP（SEQ ID NO: 62）、ADAAPTVSIFPP（SEQ ID NO: 63）、TVAAP（SEQ ID NO: 64）、TVAAPSVFIFPP（SEQ ID NO: 65）、QPKAAP（SEQ ID NO: 66）、QPKAAPSVTLFPP（SEQ ID NO: 67）、AKTTPP（SEQ ID NO: 68）、AKTTPPSVTPLAP（SEQ ID NO: 69）、AKTTAP（SEQ ID NO: 70）、AKTTAPSVYPLAP（SEQ ID NO: 71）、ASTKGP（SEQ ID NO: 72）、ASTKGPSVFPLAP（SEQ ID NO: 73）、GENKVEYAPALMALS（SEQ ID NO: 74）、GPAKELTPLKEAKVS（SEQ ID NO: 75）和GHEAAAVMQVQYPAS（SEQ ID NO: 76）、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS（SEQ ID NO: 77）或其任何組合（參見WO 2007/024715）。 二聚化特異性胺基酸
在一個實施方式中，多價抗體包含至少一個二聚化特異性胺基酸改變。二聚化特異性胺基酸改變導致「突起到孔中」相互作用，並增加正確多價抗體的組裝。二聚化特異性胺基酸可以在CH1結構域或CL結構域或其組合內。用於將CH1結構域與其他CH1結構域（CH1-CH1）和CL結構域與其他CL結構域（CL-CL）配對的二聚化特異性胺基酸至少可以在WO 2014082179、WO 2015181805家族和WO 2017059551的揭露內容中找到。二聚化特異性胺基酸也可以在Fc結構域內，並且可以與CH1或CL結構域內的二聚化特異性胺基酸組合。在一個實施方式中，本揭露提供了包含至少一個二聚化特異性胺基酸對的雙特異性抗體。 抗體產生
抗體及其抗原結合片段可藉由本領域已知的任何方法產生，包括但不限於抗體四聚體的重組表現、化學合成和酶消化，而全長單株抗體可藉由例如融合瘤或重組產生獲得。重組表現可以來自本領域已知的任何適當的宿主細胞，例如哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞等。
本揭露進一步提供了編碼本文所述之抗體或蛋白質的多核苷酸，例如編碼包含本文所述之互補決定區的重鏈可變區或輕鏈可變區的多核苷酸。在一些方面，編碼重鏈可變區的多核苷酸與選自SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 27或SEQ ID NO: 30的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列同一性。在一些方面，編碼輕鏈可變區的多核苷酸與選自SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 22或SEQ ID NO: 25的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列同一性。
本揭露還提供了編碼本文所述之scFv的多核苷酸，例如編碼SEQ ID NO: 32的胺基酸序列的多核苷酸。
本揭露的多核苷酸可編碼本文所述之多特異性抗體的可變區序列。它們還可以編碼多特異性抗體的可變區和恒定區。在另一個實施方式中，本揭露的多核苷酸可編碼本文所述之融合蛋白的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本文所述之多核苷酸可以經密碼子優化以在宿主細胞（例如，真核細胞，更特別地，哺乳動物細胞（例如，CHO細胞））中表現。
本揭露還提供了用於產生本文抗體的表現載體和宿主細胞。表現載體的選擇取決於要表現該載體的預期宿主細胞。典型地，表現載體含有可操作地連接到編碼抗體鏈或抗原結合片段的多核苷酸的啟動子和其他調節序列（例如，強化子）。在一些方面，除了在誘導條件的控制下，採用誘導型啟動子來防止插入序列的表現。誘導型啟動子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金屬硫蛋白啟動子或熱激啟動子。可以在非誘導條件下擴增轉化的生物體的培養物，而不使群體偏向於其表現產物被宿主細胞更好地耐受的編碼序列。除啟動子外，其他調節元件也可為有效表現抗體或抗原結合片段所需要或期望的。該等元件典型地包括ATG起始密碼子和相鄰的核糖體結合位點或其他序列。此外，藉由包含適合於使用中的細胞系統的強化子，可以提高表現效率（參見例如，Scharf等人, (1994) Results Probl. Cell Differ. [細胞分化中的結果和問題] 20:125；Bittner等人, (1987) Meth. Enzymol. [酶學方法], 153:516）。例如，SV40強化子或CMV強化子可以用於增加哺乳動物宿主細胞中的表現。
用於攜帶並表現抗體鏈的宿主細胞可為原核細胞或真核細胞。大腸桿菌係一種可用於選殖和表現本揭露多核苷酸的原核宿主。其他適用的微生物宿主包括桿菌，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），和其他腸桿菌科（enterobacteriaceae），如沙門氏菌屬（Salmonella）、沙雷氏菌屬（Serratia）和各種假單胞菌屬（Pseudomonas）物種。在該等原核宿主中，還可以製備表現載體，其典型地含有與宿主細胞相容的表現控制序列（例如，複製起點）。此外，將存在任何數量的多種眾所周知的啟動子，如乳糖啟動子系統、色胺酸（trp）啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或來自噬菌體λ的啟動子系統。啟動子典型地視需要用操縱子序列控制表現，並具有核糖體結合位點序列等，用於啟動和完成轉錄和翻譯。其他微生物如酵母也可用於表現抗體。也可以使用昆蟲細胞與桿狀病毒載體的組合。在其他方面，哺乳動物宿主細胞用於表現和產生本揭露的抗體。例如，它們可為表現內源性免疫球蛋白基因的融合瘤細胞系或攜帶外源性表現載體的哺乳動物細胞系。該等包括任何正常死亡或正常或異常永生化動物或人細胞。例如，已經開發了幾種能夠分泌完整免疫球蛋白的合適宿主細胞系，包括CHO細胞系、各種COS細胞系、HEK 293細胞、骨髓瘤細胞系、轉化的B細胞和融合瘤。使用哺乳動物組織細胞培養物來表現多肽一般在例如Winnacker, From Genes to Clones [從基因到殖株], VCH Publishers [VCH出版社], 紐約, 紐約州, 1987中討論。哺乳動物宿主細胞的表現載體可包括表現控制序列，如複製起點、啟動子和強化子（參見例如，Queen等人, (1986) Immunol. Rev. [免疫學評論] 89:49-68），以及必要的處理資訊位點，如核糖體結合位點、RNA剪接位點、多腺苷酸化位點和轉錄終止序列。該等表現載體通常含有衍生自哺乳動物基因或哺乳動物病毒的啟動子。合適的啟動子可為組成型的、細胞類型特異性的、階段特異性的、和/或可調控的或可調節的。有用的啟動子包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、組成型腺病毒主要晚期啟動子、地塞米松誘導型MMTV啟動子、SV40啟動子、MRP polIII啟動子、組成型MPSV啟動子、四環素誘導型CMV啟動子（如人立即早期CMV啟動子）、組成型CMV啟動子和本領域已知的啟動子-強化子組合。 檢測和診斷方法
本揭露的抗體或抗原結合片段可用於多種應用，包括但不限於檢測4Ig-B7H3之方法。在一方面，抗體或抗原結合片段可用於檢測生物樣本中4Ig-B7H3的存在。如本文所用的術語「檢測」包括定量或定性檢測。在某些方面，生物樣本包括細胞或組織。在其他方面，這樣的組織包括相對於其他組織以更高水平表現4Ig-B7H3的正常和/或癌性組織。
在一方面，本揭露提供了檢測生物樣本中4Ig-B7H3的存在之方法。在某些方面，該方法包括在允許抗體與抗原結合的條件下，使生物樣本與抗4Ig-B7H3抗體接觸，並檢測抗體與抗原之間是否形成複合物。生物樣本可以包括但不限於尿液、組織、痰或血液樣本。
還包括診斷與4Ig-B7H3表現相關的障礙之方法。在某些方面，該方法包括使測試細胞與抗4Ig-B7H3抗體接觸；藉由檢測抗4Ig-B7H3抗體與4Ig-B7H3多肽的結合來測定測試細胞表現的4Ig-B7H3的表現水平（定量或定性）；並且將測試細胞的表現水平與對照細胞（例如，與測試細胞相同組織來源的正常細胞或非表現4Ig-B7H3的細胞）中的4Ig-B7H3表現水平進行比較，其中與對照細胞相比，測試細胞中較高水平的4Ig-B7H3表現表明存在與4Ig-B7H3表現相關的障礙。 治療方法
本揭露的抗體或抗原結合片段可用於多種應用，包括但不限於治療4Ig-B7H3相關障礙或疾病之方法。在一方面，4Ig-B7H3相關障礙或疾病係癌症。在一些實施方式中，癌症係4Ig-B7H3陽性的。
在一方面，本揭露提供了治療癌症之方法。在某些方面，該方法包括向有需要的患者投與有效量的抗4Ig-B7H3抗體或抗原結合片段或含有4Ig-B7H3抗體的多特異性抗體。在另一方面，本揭露提供了抗4Ig-B7H3抗體或抗原結合片段或多特異性抗體，或藥物組成物，用於在治療癌症中使用。在另一方面，本揭露提供了抗4Ig-B7H3抗體或抗原結合片段、多特異性抗體或其抗原結合片段或藥物組成物在生產用於治療癌症的藥物中之用途。
癌症可以包括但不限於結直腸癌、前列腺癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、腎癌、肺癌或食管癌。在一個實施方式中，肺癌係非小細胞肺癌（NSCLC）或小細胞肺癌（SCLC）。在另一個實施方式中，非小細胞肺癌係鱗狀非小細胞肺癌。在另一個實施方式中，食管癌係食管鱗狀細胞癌。
本文揭露的抗體或抗原結合片段可以藉由任何合適的方式投與，包括腸胃外、肺內和鼻內，並且如果期望用於局部治療，則病灶內投與。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。給藥可以藉由任何合適的途徑，例如藉由注射，如靜脈內或皮下注射，這部分取決於投與是短暫的還是長期的。本文考慮了多種給藥方案，包括但不限於單次投與或在不同時間點的多次投與、推注投與、和脈衝輸注。
本揭露的抗體或抗原結合片段可以以符合良好醫學實踐的方式配製、給藥和投與。關於這點要考慮的因素包括治療的特定障礙、治療的特定哺乳動物、個體患者的臨床病症、障礙的起因、藥劑的遞送位點、投與方法、投與方案、和醫療從業者已知的其他因素。抗體不需要但視需要與目前用於預防或治療所研究的障礙的一或多種藥劑一起配製。此類其他藥劑的有效量取決於配製劑中存在的抗體的量、障礙或治療的類型、以及上文討論的其他因素。
為預防或治療疾病，本揭露的抗體或抗原結合片段的合適的劑量將取決於待治療的疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重程度和病程、投與抗體是用於預防還是治療目的、先前療法、患者的臨床病史和對抗體的響應、以及主治醫生的判斷。 組合療法
在一方面，本揭露的抗4Ig-B7H3抗體或含有抗4Ig-B7H3抗體的多特異性抗體可與其他治療劑組合使用。可以與本揭露的4Ig-B7H3抗體一起使用的其他治療劑包括但不限於化療劑（例如，紫杉醇或紫杉醇藥劑；（例如Abraxane®）、多西他賽；卡鉑；拓撲替康；順鉑；伊立替康、多柔比星、來那度胺、5-氮雜胞苷、異環磷醯胺、奧沙利鉑、培美曲塞二鈉、環磷醯胺、依托泊苷、地西他濱、氟達拉濱、長春新鹼、苯達莫司汀、苯丁酸氮芥、白消安、吉西他濱、黴法蘭、噴司他丁、米托蒽醌、培美曲塞二鈉）、酪胺酸激酶抑制劑（例如，EGFR抑制劑（例如，厄洛替尼））、多激酶抑制劑（例如，MGCD265、RGB-286638）、CD20靶向劑（例如，利妥昔單抗、奧法妥木單抗、RO5072759、LFB-R603）、CD52靶向劑（例如，阿侖單抗）、普賴蘇穠、達依泊汀α、來那度胺、Bcl-2抑制劑（例如，奧利默森鈉）、極光激酶抑制劑（例如，MLN8237、TAK-901）、蛋白酶體抑制劑（例如，硼替佐米）、CD-19靶向劑（例如，MEDI-551、MOR208）、MEK抑制劑（例如，ABT-348）、JAK-2抑制劑（例如，INCB018424）、mTOR抑制劑（例如，替西羅莫司、依維莫司）、BCR/ABL抑制劑（例如，伊馬替尼）、ET-A受體拮抗劑（例如，ZD4054）、TRAIL受體2（TR-2）促效劑（例如，CS-1008）、EGEN-001、Polo樣激酶1抑制劑（例如，BI 672））。
本揭露的抗4Ig-B7H3抗體可與其他治療劑（例如其他免疫檢查點抗體）組合使用。這樣的免疫檢查點抗體可包括抗PD1抗體。抗PD1抗體可包括但不限於替雷利珠單抗、派姆單抗（Pembrolizumab）或納武利尤單抗（Nivolumab）。替雷利珠單抗（ 表 7中的SEQ ID No: 22和23）揭露於US 8,735,553中。派姆單抗（曾用名MK-3475）揭露於US 8,354,509和US 8,900,587中，並且係人源化lgG4-K免疫球蛋白，其靶向PD1受體並抑制PD1受體配體PD-L1和PD-L2的結合。派姆單抗已被批准用於轉移性黑色素瘤和轉移性非小細胞肺癌（NSCLC）的適應症，並且正在進行用於治療頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）和難治性何杰金氏淋巴瘤（cHL）的臨床研究。納武利尤單抗（如由百時美施貴寶公司（Bristol-Meyers Squibb）所揭露的）係全人lgG4-K單株抗體。納武利尤單抗（殖株5C4）揭露於美國專利案號US 8,008,449和WO 2006/121168中。納武利尤單抗被批准用於治療黑色素瘤、肺癌、腎癌、和何杰金氏淋巴瘤。
在一個實施方式中，本揭露提供了抗4Ig-B7H3抗體或含有抗4Ig-B7H3抗體的多特異性抗體和抗PD-1抗體（例如替雷利珠單抗或上述其他抗PD-1抗體）的組合在生產用於治療癌症（例如上述癌症）的藥物中之用途。在另一個實施方式中，本揭露提供了抗4Ig-B7H3抗體或含有抗4Ig-B7H3抗體的多特異性抗體和抗PD-1抗體（例如替雷利珠單抗或上述其他抗PD-1抗體）的組合，用於在治療癌症（例如上述癌症）中使用。
組合療法旨在意指並確實係指並包括以下任何一項： 向需要治療的患者同時投與這樣的組合療法，此時將這樣的組分一起配製成單一劑型，該單一劑型基本上同時向所述患者釋放所述組分， 向需要治療的患者基本上同時投與這樣的組合，此時這樣的組分彼此分開地配製成由所述患者在基本上相同的時間服用的單獨的劑型，由此所述組分在基本上相同的時間釋放給所述患者， 向需要治療的患者順序投與這樣的組合療法，此時這樣的組分彼此分開地配製成由所述患者在連續的時間服用的單獨的劑型，在每次投與之間具有顯著的時間間隔，由此所述組分在基本上不同的時間釋放給所述患者；並且 向需要治療的患者順序投與這樣的組合，此時將這樣的組分一起配製成以受控方式釋放所述組分的單一劑型，由此它們在相同和/或不同時間同時、連續和/或重疊地釋放給所述患者，其中每個部分可以藉由相同或不同的途徑投與。 藥物組成物
還提供了包含抗4Ig-B7H3抗體或其抗原結合片段（包括多特異性抗體）或含有編碼抗體或抗原結合片段的序列的多核苷酸的組成物，包括藥物配製劑。在某些實施方式中，組成物包含一或多種抗4Ig-B7H3抗體或抗原結合片段，或含有編碼一或多種抗4Ig-B7H3抗體或抗原結合片段的序列的一或多種多核苷酸。該等組成物可進一步包含合適的載劑，如本領域熟知的藥學上可接受的賦形劑，包括緩衝液。
藉由將具有所期望純度的這樣的抗體或抗原結合片段與一或多種視需要的藥學上可接受的載劑混合來製備本文所述之抗4Ig-B7H3抗體或抗原結合片段的藥物配製劑（Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition [雷明頓藥物科學第16版], Osol, A.編輯(1980)），呈凍乾配製劑或水溶液的形式。藥學上可接受的載劑在所採用的劑量和濃度下對於接受者通常是無毒性的，並且包括但不限於：緩衝液，如磷酸鹽、檸檬酸鹽、和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫胺酸；防腐劑（如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；殺藻銨；氯化本索寧；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚）；低分子量（少於約10個殘基）的多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子，如鈉；金屬錯合物（例如，Zn-蛋白複合物）；和/或非離子型界面活性劑，如聚乙二醇（PEG）。本文的示例性藥學上可接受的載劑進一步包括間質藥物分散劑，例如可溶性中性活性透明質酸酶糖蛋白（sHASEGP），例如人可溶性PH-20透明質酸酶糖蛋白，如rHuPH20（HYLENEX ®，百特國際有限公司（Baxter International, Inc.））。在美國專利案號US 7,871,607和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20。在一方面，將sHASEGP與一或多種另外的糖胺聚糖酶如軟骨素酶組合。
示例性凍乾抗體配製劑描述於美國專利案號6,267,958中。水性抗體配製劑包括美國專利案號6,171,586和WO 2006/044908中所述之那些，後者的配製劑包含組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
可以製備緩釋製劑。緩釋製劑的合適實例包括含有該抗體的固體疏水性聚合物的半透性基質，該等基質為成形製品的形式，例如膜或微膠囊。
用於體內投與的配製劑通常是無菌的。無菌可以例如通過無菌過濾膜過濾而容易地實現。 定義
除非在本文件的其他地方特別定義，否則本文所用的所有其他技術和科學術語具有本領域的普通技術者通常理解的含義。
如本文所用，包括所附申請專利範圍，除非上下文另外明確說明，否則如「一個」、「一種」和「該」的單數形式包括它們相應的複數指代。
除非上下文另外明確說明，否則術語「或」意指術語「和/或」並且可與術語「和/或」互換使用。
如本文所用的術語「抗癌劑」係指可用於治療細胞增殖性障礙（如癌症）的任何藥劑，包括但不限於細胞毒性劑、化療劑、放射療法和放射治療劑、靶向性抗癌劑、和免疫治療劑。
術語「人4Ig-B7H3」係指人體中I型跨膜蛋白B7H3的4Ig同種型。在一些實施方式中，人4Ig-B7H3的胺基酸序列包含SEQ ID NO: 80。
如本文所用的術語「投與（administration/administering）」和「治療（treating/treatment）」，當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，意指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與該動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體接觸。細胞的處理涵蓋試劑與細胞的接觸以及試劑與流體的接觸，其中流體與細胞接觸。術語「投與」和「治療/處理」也意指體外和離體處理，例如，藉由試劑、診斷劑、結合化合物或藉由另一種細胞對細胞進行處理。本文的術語「受試者」包括任何生物體，較佳的是動物，更較佳的是哺乳動物（例如，大鼠、小鼠、犬、貓、兔），並且最較佳的是人。在一方面，治療任何疾病或障礙係指改善該疾病或障礙（即，減緩或阻止或減少疾病或其至少一種臨床症狀的發展）。在另一方面，「治療（treat/treating/treatment）」係指緩解或改善至少一個身體參數，包括患者可能無法辨別的那些。在又另一方面，「治療（treat/treating/treatment）」係指在身體上（例如，可辨別症狀的穩定化）、在生理上（例如，身體參數的穩定化）或兩者上調節疾病或障礙。在又另一方面，「治療（treat/treating/treatment）」係指預防或延遲疾病或障礙的發作或發展或進展。
在本揭露的上下文中，術語「受試者」係哺乳動物，例如，靈長類動物，較佳的是高等靈長類動物，例如人（例如，患有本文所述之障礙或處於患上本文所述之障礙的風險中的患者）。
如本文所用的術語「親和力」係指抗體與抗原之間相互作用的強度。在抗原內，抗體的可變區通過非共價力與抗原在許多位點相互作用。通常，相互作用越多，親和力越強。
如本文所用的術語「抗體」係指免疫球蛋白家族的多肽，其可以非共價地、可逆地和以特異性方式結合相應的抗原。例如，天然存在的IgG抗體係包含藉由二硫鍵相互連接的至少兩條重（H）鏈和兩條輕（L）鏈的四聚體。每條重鏈由重鏈可變區（本文縮寫為VH）和重鏈恒定區構成。重鏈恒定區由三個結構域CH1、CH2和CH3構成。每條輕鏈由輕鏈可變區（本文縮寫為VL或Vκ）和輕鏈恒定區構成。輕鏈恒定區由一個結構域CL構成。VH和VL區可以進一步細分為高變區，稱為互補決定區（CDR），其間插有更保守的區域，稱為框架區（FR）。每個VH和VL由從胺基末端到羧基末端按以下順序排列的三個CDR和四個框架區（FR）構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恒定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子（包括免疫系統的各種細胞（例如，效應細胞）以及經典補體系統的第一組分（Clq））的結合。
術語「抗體」包括但不限於單株抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體和抗獨特型（抗Id）抗體、人工程化抗體、單鏈抗體（scFv）、單結構域抗體、Fab片段、Fab'片段或F(ab') 2片段。抗體可以屬於任何同種型/類別（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）或亞類（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）。此外，抗體包括其衍生劑，例如融合蛋白、多特異性抗體或抗體-藥物軛合物（ADC）。此外，抗體包括其衍生劑，藉由與另一藥劑（如其他藥物或抗體）直接或間接連接或與另一藥劑形成複合物。
術語「嵌合抗體」意指由來自不同物種的結構域組成的分子，即將來自一個宿主物種（例如，小鼠、兔、美洲駝等）的抗體的可變結構域與來自不同物種（例如人）的抗體的恒定結構域融合。
在一些實施方式中，抗4Ig-B7H3抗體包含至少一個抗原結合位點，至少一個可變區。在一些實施方式中，抗4Ig-B7H3抗體包含來自本文所述之4Ig-B7H3抗體的抗原結合片段。在一些實施方式中，抗4Ig-B7H3抗體係分離的或重組的。在一些實施方式中，抗4Ig-B7H3抗體還涵蓋靶向4Ig-B7H3作為至少一個臂和靶向一或多個其他抗原作為另外的一或多個臂的多特異性抗體。
本文中的術語「單株抗體」或「mAb」或「Mab」係指基本上同質的抗體的群體，即，除了可能少量存在的可能天然發生的突變外，該群體中包含的抗體分子在胺基酸序列上係相同的。相比之下，常規（多株）抗體製劑典型地包括在其可變結構域中具有不同胺基酸序列的多種不同抗體，特別地其互補決定區（CDR），它們通常對不同的表位具有特異性。修飾語「單株」指示獲得自基本上均質的抗體群體的抗體的特徵並且不應理解為要求藉由任何特定方法產生抗體。可以藉由熟悉該項技術者已知的方法獲得單株抗體（mAb）。參見，例如Kohler等人, (1975) Nature [自然]. 256:495-497；美國專利案號4,376,110；Ausubel等人, (1992) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY [分子生物學實驗指南]；Harlow等人, (1988) ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL [抗體：實驗室手冊], Cold spring Harbor Laboratory [冷泉港實驗室]；和Colligan等人, (1993) CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY [免疫學實驗室指南]。本文揭露的抗體可以屬於任何免疫球蛋白類別（包括IgG、IgM、IgD、IgE、IgA），及其任何亞類（例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）。產生單株抗體的融合瘤可以在體外或在體內培養。高效價的單株抗體可以在體內產生中獲得，其中將來自單個融合瘤的細胞腹膜內注射到小鼠中，例如原始引發的Balb/c小鼠，以產生含有高濃度所期望抗體的腹水。可以使用熟悉該項技術者熟知的柱層析方法從這樣的腹水，或從培養物上清液中純化同種型IgM或IgG的單株抗體。
通常，基本抗體結構單元包含四聚體。每個四聚體包括兩對相同的多肽鏈，每對具有一條「輕鏈」（約25 kDa）和一條「重鏈」（約50-70 kDa）。每條鏈的胺基末端部分包括主要負責抗原識別的約100至110或更多個胺基酸的可變區。重鏈的羧基末端部分可以定義為主要負責效應子功能的恒定區。典型地，人輕鏈被分類為κ和λ輕鏈。此外，人重鏈典型地分類為α、δ、ε、γ或μ，並且分別將抗體的同種型定義為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在輕鏈和重鏈內，可變區和恒定區藉由約12個或更多個胺基酸的「J」區連接，重鏈還包括約10個以上胺基酸的「D」區。
每個輕鏈/重鏈（VL/VH）對的可變區形成抗體結合位點。因此，一般而言，完整抗體具有兩個結合位點。除了在雙功能或雙特異性抗體中，兩個結合位點通常在一級序列中係相同的。
典型地，重鏈和輕鏈的可變結構域包含三個高變區，也稱為「互補決定區（CDR）」，其位於相對保守的框架區（FR）之間。CDR通常由框架區對齊，使得能夠結合特異性表位。一般而言，從N末端到C末端，輕鏈和重鏈可變結構域兩者都包含FR-1（或FR1）、CDR-1（或CDR1）、FR-2（FR2）、CDR-2（CDR2）、FR-3（或FR3）、CDR-3（CDR3）和FR-4（或FR4）。CDR和框架區的位置可以使用本領域各種眾所周知的定義來確定，例如Kabat、Chothia、AbM和IMGT（參見例如Johnson等人, (2001) Nucleic Acids Res. [核酸研究] 29:205-206；Chothia和Lesk, (1987) J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 196:901-917；Chothia等人, (1989) Nature. [自然] 342:877-883；Chothia等人, (1992) J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 227:799-817；Al-Lazikani等人(1997) J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 273:927-748；ImMunoGenTics（IMGT））編號（Lefranc, M.-P., (1999) The Immunologist. [免疫學者] 7, 132-136；Lefranc, M.-P.等人, (2003) Dev. Comp. Immunol. [發育與比較免疫學] 27, 55-77（「IMGT」編號方案））。抗原組合位點的定義還在以下文獻中描述：Ruiz等人, (2000) Nucleic Acids Res. [核酸研究] 28:219-221；和Lefranc, M. P., (2001) Nucleic Acids Res. [核酸研究] 29:207-209；MacCallum等人, (1996) J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 262:732-745；和Martin等人, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊], 86:9268-9272；Martin等人, (1991) Methods Enzymol [酶學方法]. 203:121-153；和Rees等人, 在Sternberg M. J. E.（編輯）, Protein Structure Prediction [蛋白質結構預測], Oxford University Press [牛津大學出版社], 牛津, 141-172 (1996)中。例如，根據Kabat，將重鏈可變結構域（VH）中的CDR胺基酸殘基編號為31-35（HCDR1）、50-65（HCDR2）和95-102（HCDR3）；並且輕鏈可變結構域（VL）中的CDR胺基酸殘基編號為24-34（LCDR1）、50-56（LCDR2）和89-97（LCDR3）。根據Chothia，VH中的CDR胺基酸編號為26-32（HCDR1）、52-56（HCDR2）和95-102（HCDR3）；VL中的胺基酸殘基編號為26-32（LCDR1）、50-52（LCDR2）和91-96（LCDR3）。藉由結合Kabat和Chothia的CDR定義，CDR由人VH中的胺基酸殘基26-35（HCDR1）、50-65（HCDR2）和95-102（HCDR3）以及人VL中的胺基酸殘基24-34（LCDR1）、50-56（LCDR2）和89-97（LCDR3）組成。根據IMGT，VH中的CDR胺基酸殘基編號為約26-35（HCDR1）、51-57（HCDR2）和93-102（HCDR3），VL中的CDR胺基酸殘基編號為約27-32（LCDR1）、50-52（LCDR2）和89-97（LCDR3）（編號根據Kabat）。根據IMGT，可以使用程式IMGT/DomainGap Align確定抗體的CDR區。
術語「高變區」係指抗體中負責抗原結合的胺基酸殘基。高變區包含來自「CDR」（例如，輕鏈可變結構域中的LCDR1、LCDR2和LCDR3以及重鏈可變結構域中的HCDR1、HCDR2和HCDR3）的胺基酸殘基。參見，Kabat等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest [免疫學相關蛋白質序列], 第5版Public Health Service [公共衛生署], National Institutes of Health [美國國立衛生研究院], 貝塞斯達, 馬里蘭州（藉由序列定義抗體的CDR區）；還參見Chothia和Lesk (1987) J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 196: 901-917（藉由結構定義抗體的CDR區）。術語「框架」或「FR」殘基意指除了本文定義為CDR殘基的高變區殘基之外的那些可變結構域殘基。
除非另有說明，否則「抗原結合片段」意指抗體的抗原結合片段，即保留與全長抗體結合的抗原特異性結合的能力的抗體片段，例如保留一或多個CDR區的片段。抗原結合片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子，例如單鏈Fv（ScFv）；奈米抗體以及從抗體片段形成的多特異性抗體。
如本文所用，抗體「特異性結合」靶蛋白，係指與其他蛋白相比，抗體表現出優先結合靶蛋白，但這種特異性不需要絕對的結合特異性。在描述抗原（例如，蛋白質）與抗體或抗原結合抗體片段之間的相互作用的上下文中使用的抗體「特異性結合」或「選擇性結合」係指決定抗原在蛋白質和其他生物製劑的異質群體（例如在生物樣本、血液、血清、血漿或組織樣本中）中存在的結合反應。因此，在某些指定的免疫測定條件下，抗體或其抗原結合片段與特定抗原特異性結合係背景水平的至少兩倍，並且不以顯著量與樣本中存在的其他抗原特異性結合。在一方面，在指定的免疫測定條件下，抗體或其抗原結合片段與特定抗原的特異性結合係背景結合水平的至少十（10）倍，並且不以顯著量與樣本中存在的其他抗原特異性結合。
如本文所用的「抗原結合結構域」，包含至少六個CDR且與表位（或三個CDR，就單結構域抗體而言）特異性結合。多特異性抗體（例如，雙特異性抗體）的「抗原結合結構域」包含與第一表位特異性結合的第一抗原結合結構域和與第二表位特異性結合的第二抗原結合結構域。多特異性抗體可為雙特異性抗體、三特異性抗體、四特異性抗體等，具有針對每個特定表位的抗原結合結構域。多特異性抗體可為多價抗體（例如，雙特異性四價抗體），其包含多個抗原結合結構域，例如與第一表位特異性結合的2、3、4或更多個抗原結合結構域和與第二表位特異性結合的2、3、4或更多個抗原結合結構域。
本文中的術語「人抗體」意指僅包含人免疫球蛋白蛋白質序列的抗體。如果在小鼠、小鼠細胞或源自小鼠細胞的融合瘤中產生，人抗體可以包含鼠碳水化合物鏈。類似地，「小鼠抗體」或「大鼠抗體」意指分別僅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白蛋白質序列的抗體。
術語「人源化」或「人源化抗體」意指含有來自非人（例如，鼠、兔、美洲駝等）抗體以及人抗體的序列的抗體形式。這樣的抗體含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗體將包含基本上至少一個、並且典型地兩個可變結構域的全部，其高變環的全部或基本上全部對應於非人免疫球蛋白的那些，並且FR的全部或基本上全部係人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體還將視需要包含免疫球蛋白恒定區（Fc）的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的至少一部分。當有必要區分人源化抗體與親本齧齒動物抗體時，將前綴「hum」、「hu」、「Hu」或「h」添加到抗體殖株名稱中。齧齒動物/駱駝科動物抗體的人源化形式通常包含親本齧齒動物抗體的相同CDR序列，但是可包括某些胺基酸取代以增加親和力、增加人源化抗體的穩定性、去除翻譯後修飾或出於其他原因。
術語「相應的人種系序列」係指編碼人可變區胺基酸序列或亞序列的核酸序列，與由人種系免疫球蛋白可變區序列編碼的所有其他已知可變區胺基酸序列相比，其與參考可變區胺基酸序列或亞序列具有最高確定的胺基酸序列同一性。相應的人種系序列也可以指與所有其他評估的可變區胺基酸序列相比，與參考可變區胺基酸序列或亞序列具有最高胺基酸序列同一性的人可變區胺基酸序列或亞序列。相應的人種系序列可以僅是框架區，僅互補決定區，框架和互補決定區，可變區段（如上定義），或包含可變區的序列或亞序列的其他組合。可以使用本文所述之方法確定序列同一性，例如使用BLAST、ALIGN或本領域已知的另一種比對演算法比對兩個序列。相應的人種系核酸或胺基酸序列可以與參考可變區核酸或胺基酸序列具有至少約90%、91、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。此外，如果抗體含有恒定區，則恒定區還衍生自這樣的人序列，例如，人種系序列或突變形式的人種系序列，或含有衍生自人框架序列分析的共有框架序列的抗體，例如，如Knappik等人, (2000) J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 296:57-86所述。
術語「平衡解離常數（K D，M）」係指解離速率常數（kd，時間 -1）除以締合速率常數（ka，時間 -1，M -l）。平衡解離常數可以使用本領域任何已知的方法測量。本揭露的抗體通常將具有小於約10 -7或10 -8M，例如小於約10 -9M或10 -10M，在一些方面，小於約10 -11M、10 -12M或10 -13M的平衡解離常數。
本文中的術語「癌症」或「腫瘤」具有如本領域理解的最廣泛的含義，並且係指哺乳動物中典型地以不受調控的細胞生長為特徵的生理病症。在本揭露的上下文中，癌症不限於某個類型或位置。
在本揭露的上下文中，當提及胺基酸序列時，術語「保守取代」意指原始胺基酸被新胺基酸取代，該新胺基酸基本上不改變抗體或片段的化學、物理和/或功能性質，例如其與4Ig-B7H3的結合親和力。特別地，胺基酸的常見保守取代係本領域熟知的。
如本文所用的術語「杵-臼（knob-into-hole）」技術係指在體外或體內藉由在兩個多肽相互作用的介面處將空間突起（杵）引入一個多肽中並將穴袋或空腔（臼）引入另一個多肽中來指導將兩個多肽配對在一起的胺基酸。例如，杵-臼已經被引入了抗體的Fc:Fc結合介面、C L:C H介面、或V H/V L介面（參見例如US 2011/0287009、US 2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431和Zhu等人, (1997) Protein Science [蛋白質科學]. 6:781-788）。在一些實施方式中，杵-臼確保了多特異性抗體製造期間兩個不同重鏈正確配對在一起。例如，在其Fc區中具有杵臼胺基酸的多特異性抗體還可包含與每個Fc區連接的單個可變結構域，或者進一步包含與相似或不同輕鏈可變結構域配對的不同重鏈可變結構域。杵臼技術還可在VH或VL區中使用，以確保正確配對。
如本文在「杵-臼」技術的上下文中所用的術語「杵」係指向多肽在該多肽與另一多肽相互作用的介面處引入突起（杵）的胺基酸改變。在一些實施方式中，另一多肽具有臼突變。
如本文在「杵臼」的上下文中所用的術語「臼」係指向多肽在該多肽與另一多肽相互作用的介面處引入穴袋或空腔（臼）的胺基酸改變。在一些實施方式中，另一多肽具有杵突變。
適用於確定序列同一性和序列相似性百分比的演算法之實例係BLAST演算法，其分別描述於Altschul等人, (1977) Nuc. Acids Res. [核酸研究] 25:3389-3402；和Altschul等人, (1990) J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 215:403-410中。用於進行BLAST分析的軟體可通過國家生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information）揭露獲得。此演算法包括首先藉由鑒定查詢序列中短字長W鑒定高得分序列對（HSP），當與數據庫序列中相同字長比對時，其匹配或滿足一些正值閾值得分T。T被稱為鄰域字得分閾值。該等初始鄰域字命中作為開始搜索以找到包含它們的較長HSP的值。字命中沿著每個序列在兩個方向上延伸，直到累積比對得分可以增加為止。對於核苷酸序列，使用參數M（一對匹配殘基的獎勵得分；始終＞ 0）和N（錯配殘基的罰分；始終＜ 0）來計算累積得分。對於胺基酸序列，使用得分矩陣來計算累積得分。在以下情況下，將停止字命中在每個方向上的延伸：累積比對得分從其最大實現值下降了數量X；由於一或多個負得分殘基比對的累積，累積得分趨於零或更低；或者到達任一序列的末端。BLAST演算法參數W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLASTN程式（對於核苷酸序列）默認使用字長（W）11，期望值（E）10，M = 5，N = -4並比較兩條股。對於胺基酸序列，BLAST程式預設使用字長3，期望值（E）10和BLOSUM62得分矩陣（參見Henikoff和Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院學報] 89: 10915）比對（B）50，期望值（E）10，M = 5，N = -4並比較兩條股。
BLAST演算法還對兩個序列之間的相似性進行統計分析（參見例如Karlin和Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 90:5873-5787, 1993）。BLAST演算法提供的一種相似性度量係最小總和概率（P(N)），其提供了兩個核苷酸或胺基酸序列之間偶然發生匹配的概率的指示。例如，如果測試核酸與參考核酸的比較中最小總和概率小於約0.2，更較佳的是小於約0.01，最較佳的是小於約0.001，則認為該核酸與參考序列相似。
兩個胺基酸序列之間的同一性百分比還可使用以下的演算法來確定：E. Meyers和W. Miller, Comput. Appl. Biosci. [生物科學中的電腦應用] 4: 11-17, (1988)，其已併入ALIGN程式（2.0版本），使用PAM120權重殘基表，空位長度罰分為12，空位罰分為4。此外，可以使用以下確定兩個胺基酸序列之間的同一性百分比：Needleman和Wunsch, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 48:444-453 (1970) 的演算法，其已併入GCG套裝軟體中的GAP程式中，使用BLOSUM62矩陣或PAM250矩陣，空位權重為16、14、12、10、8、6或4，並且長度權重為1、2、3、4、5或6。
術語「核酸」在本文中可與術語「多核苷酸」互換使用，並且係指單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語涵蓋含有已知的核苷酸類似物或經修飾的主鏈殘基或連接的核酸，它們係合成的，天然存在的和非天然存在的，具有與參考核酸相似的結合特性，並且以與參考核苷酸相似的方式代謝。這樣的類似物之實例包括但不限於硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸（PNA）。
在核酸的上下文中，術語「可操作地連接」係指兩個或更多個多核苷酸（例如，DNA）區段之間的功能關係。典型地，它係指轉錄調節序列與轉錄序列的功能關係。例如，啟動子或強化子序列如果在合適的宿主細胞或其他表現系統中刺激或調節編碼序列的轉錄，則可操作地連接至編碼序列。通常，可操作地連接至轉錄序列的啟動子轉錄調節序列與轉錄序列在物理上鄰接，即它們係順式作用的。然而，一些轉錄調節序列（如強化子）不需要在物理上鄰接或緊鄰它們增強其轉錄的編碼序列。
在一些方面，本揭露提供了組成物，例如藥學上可接受的組成物，其包括與至少一種藥學上可接受的賦形劑一起配製的本文所述之抗4Ig-B7H3多特異性抗體。如本文所用，術語「藥學上可接受的賦形劑」包括生理學上相容的任何和所有溶劑、分散介質、等滲劑和吸收延遲劑等。賦形劑可適於靜脈內、肌內、皮下、腸胃外、直腸、脊柱或表皮投與（例如，藉由注射或輸注）。
本文揭露的組成物可為多種形式。該等包括例如液體、半固體和固體劑型，如液體溶液（例如，可注射和輸注溶液）、分散液或懸浮液、脂質體和栓劑。合適的形式取決於預期的投與方式和治療應用。典型的合適組成物係可注射或輸注溶液的形式。一種合適的投與方式係腸胃外（例如，靜脈內、皮下、腹膜內、肌內）。在一些實施方式中，抗體藉由靜脈輸注或注射來投與。在某些實施方式中，該抗體藉由肌內或皮下注射來投與。
如本文所用的術語「治療有效量」係指當投與於受試者以治療疾病、或疾病或障礙的至少一種臨床症狀時，足以影響該疾病、障礙或症狀的治療的抗體的量。「治療有效量」可以隨抗體，疾病，障礙，和/或疾病或障礙的症狀，疾病、障礙、和/或疾病或障礙的症狀的嚴重程度，待治療的受試者的年齡，和/或待治療的受試者的體重而變化。在任何給定情況下的合適量對於熟悉該項技術者而言係顯而易見的，或者可以藉由常規實驗確定。在組合療法的情況下，「治療有效量」係指用於有效治療疾病、障礙或病症的組成物件的總量。
術語「組合療法」係指投與兩種或更多種治療劑以治療在本揭露中所述之治療性病症或障礙。這樣的投與涵蓋以基本上同時的方式共同投與該等治療劑。這樣的投與也涵蓋在多個容器中或在每種活性成分的獨立容器（例如，膠囊、粉末和液體）中共同投與。可以將粉末和/或液體在投與之前複溶或稀釋至所期望的劑量。此外，這樣的投與也涵蓋在大致相同的時間或在不同的時間以順序方式使用每種類型的治療劑。在任何一種情況下，治療方案將在治療本文所述之病症或障礙方面提供藥物組合的有益作用。
如本文所用，短語「與…組合」意指將抗4IG-B7H3抗體在投與另外的治療劑的同時、之前即刻或之後即刻投與於受試者。在某些實施方式中，將抗4Ig-B7H3抗體作為與另外的治療劑的共同配製劑來投與。 等效物
應理解，雖然已經結合詳細描述對本發明進行了描述，但前面的描述旨在說明而非限制本發明之範圍，本發明之範圍由所附的請求項的範圍限定。其他方面、優點和修改在以下請求項的範圍內。
應理解，可組合本文所述之各種實施方式的一個、一些、任何或全部特徵，以形成本揭露的另外的實施方式。本揭露的該等和其他方面對於本領域的技術者而言將變得顯而易見。 實例 實例 1. 小鼠抗 B7H3 單株抗體的生成 免疫
為了產生針對B7H3的抗體，用人4Ig-B7H3抗原的細胞外結合結構域（ECD）對一個隊列5隻轉基因小鼠進行免疫，該等轉基因小鼠經過工程化以產生人變體區和大鼠恒定區，每個隊列都經受包含人B7H3抗原、劑量、注射途徑、佐劑的獨特組合的免疫策略。對1個隊列中的總共5隻動物進行了免疫。動物在0至100天的不同時期接受免疫。為了監測免疫響應，典型地在30-100天的2-6次免疫後，藉由ELISA篩選滴定的血清。篩選血清中與B7H3抗原結合的抗體（Ab）。測量每隻動物中的B7H3特異性抗體響應，並選擇具有足夠抗B7H3滴度的動物進行4天的最終加強免疫。 融合瘤融合和篩選
從如上所述免疫的小鼠中分離淋巴器官，包括脾臟和淋巴結。藉由基於PEG的融合與衍生自SP2/0的永生化小鼠骨髓瘤細胞融合產生融合瘤。使用補充有HAT的常規1640培養基（Gibco™）將所得細胞鋪板於96孔細胞培養板中以選擇融合瘤。在10-13天的培養基和生長培養基更換後，從各個孔中收集融合瘤培養物上清液並進行篩選以鑒定具有分泌的B7H3特異性抗體的孔。針對人ECD-4Ig-B7H3-hFc對全部上清液進行了初步篩選。通過ELISA測量抗體與人ECD-4Ig-B7H3-hFc的結合。篩選來自5個融合瘤融合體的上清液中的B7H3抗體。簡言之，將2 μg/mL人ECD-4Ig-B7H3-hFc包被在96孔ELISA板中，並將50 μl融合瘤培養物上清液與人ECD-4Ig-B7H3-hFc共同孵育30-60分鐘。然後洗滌並與軛合至HRP的抗大鼠IgG Fc二級Ab一起孵育。孵育和洗滌後，將板用HRP底物顯色並測量吸光度。
將來自陽性孔的融合瘤轉移至具有新鮮培養基的24孔板中生長2-3天，然後藉由流式細胞術再次篩選，以確認抗體與人4Ig-B7H3和cyno B7H3過表現細胞系的結合。
分別通過FACS測量抗體與人B7H3過表現細胞和cyno B7H3過表現細胞的結合。簡言之，將100 μl融合瘤培養物上清液和人4Ig-B7H3或cyno B7H3過表現細胞共同孵育30-60分鐘，洗滌，並與軛合至APC的抗IgG Fc二級Ab一起孵育。孵育和洗滌後，藉由流式細胞術測量螢光。 亞選殖和序列分析
將所選抗B7H3 Ab分泌型融合瘤亞選殖一次或兩次以確保單株性。簡言之，藉由限制性稀釋對陽性融合瘤殖株進行亞選殖。7-10天後，藉由ELISA篩選培養物上清液，並如先前所述進行流式細胞術以確認人和cyno B7H3抗原結合。對穩定的融合瘤亞殖株進行體外培養，以進行細胞冷凍保存以及抗體VH和VL基因選殖和定序。
用裂解緩衝液裂解亞選殖後的抗B7H3 Ab分泌型融合瘤。隨後，將含mRNA的裂解物轉移至96孔板中，根據製造商的說明，使用Super Script III第一股合成SuperMix™（英傑公司（Invitrogen））進行mRNA分離、cDNA合成和DNA定序。
所得人抗體BGA-3726的序列列於 表 7中。 實例 2. 藉由 SPR 測定抗 B7H3 抗體的結合動力學和親和力
純化抗B7H3 mAb BGA-3726，並使用BIAcore TMT-200（通用生命科學公司（GE Life Sciences））藉由SPR測定對其結合動力學進行表徵。簡言之，將抗小鼠IgG Fc抗體固定在激活的CM5生物感測器晶片（貨號BR100530，通用生命科學公司）上。純化的抗體流過晶片表面並被抗小鼠IgG Fc抗體捕獲。然後將人ECD-4Ig-B7H3-hFc的連續稀釋液流過晶片表面，並藉由使用一對一朗繆爾結合模型（BIA評價軟體，通用生命科學公司）分析表面電漿共振信號的變化以計算締合速率（ k on）和解離速率（ k off）。將平衡解離常數（ K D）計算為比率 k off/ k on。抗B7H3 mAb的結合親和力概況在 表 1和 圖 1中示出。 [ 表 1] . BGA-3726 的結合動力學
Ab 編號 抗原 ka （ 1/Ms ） kd （ 1/s ） KD （ M ）
BGA-3726 人B7H3 3.63E+05 4.49E-06 1.24E-11
實例 3. 測定抗 B7H3 抗體與穩定的細胞系上表現的 B7H3 的結合親和力
藉由FACS測定抗B7H3 mAb與人4Ig-B7H3和cyno B7H3過表現細胞系的結合親和力。簡言之，將人或cyno B7H3過表現細胞與連續稀釋的純化抗體一起孵育，洗滌，並與軛合至APC的抗小鼠IgG二級Ab一起孵育。孵育和洗滌後，藉由流式細胞術測量螢光。抗B7H3 mAb的結合親和力概況在 表 2-3和 圖 2A- 圖 2B中示出。 [ 表 2] . BGA-3276 與人 B7-H3 的細胞結合親和力
Ab 編號 細胞系 EC50 （ nM ）
BGA-3726 人B7H3 1.91
[ 表 3] . BGA-3276 與 cyno B7-H3 的細胞結合親和力
Ab 編號 細胞系 EC50 （ nM ）
BGA-3726 Cyno B7H3 1.32
實例 4. 抗 B7H3 抗體的非特異性結合的測定
藉由FACS測定抗B7H3 mAb BGA-3276的非特異性結合活性。簡言之，將不表現B7H3的Daudi細胞與純化的BGA-3276一起孵育，洗滌，並與軛合至APC的抗大鼠IgG二級Ab一起孵育。孵育和洗滌後，藉由流式細胞術測量螢光。結合MFI在 表 4中示出。BGA-3276未顯示與B7H3陰性細胞的任何非特異性結合。 [ 表 4] . BGA-3276 與 Daudi 結合的 MFI
Ab 編號 NK92mi 的 MFI
BGA-3726 4.15
mIgG 16.00
實例 5. 抗人 B7H3 mAb BGA-3726 的工程化
BGA-3726（SEQ ID NO: 1-10）係由全人Vh和Vk區組成的人抗體。為了改善其可開發性，對BGA-3726進行了重新工程化，以去除潛在的翻譯後修飾（PTM）並優化生物物理穩定性，用於人體治療用途。
使用內部開發的表現載體將BGA-3726和從BGA-3726工程化的抗體構建為人全長抗體形式，該等表現載體分別含有人IgG1變體（SEQ ID NO: 31）和κ鏈的恒定區，具有容易適應的亞選殖位點。藉由將重鏈和相應輕鏈構建體共轉染至293G細胞（內部開發）中並使用蛋白A層析柱純化，實現BGA-3726及其工程化抗體的表現和製備。將純化的抗體在PBS中濃縮至0.5-5 mg/mL並以等分試樣儲存在-80°C冰箱中。
基於BGA-3726原始殖株，在CDR中進行了幾次單突變，以去除潛在的翻譯後修飾（PTM）位點。潛在PTM位點包括HCDR中的潛在氧化位點W34、W96和W98（Kabat編號）以及LCDR1中的潛在脫醯胺位點N29（NG）。使用在特定位置含有突變的引物和位點定向誘變套組（kit）（目錄號FM111-02，全式金公司（TransGen），中國北京）進行所有突變。藉由定序分析驗證所期望的突變。該等BGA-3726變體抗體，即包含HCDR1中的W34Y的BGA-4826（SEQ ID No: 11、2-6、12、8、13、10）、包含HCDR3中的W96Y的BGA-4498（SEQ ID No: 1、2、14、4-6、15、8、16、10）、包含HCDR3中的W98Y的BGA-4269（SEQ ID No: 1、2、17、4-6、18、8、19、10）、包含LCDR1中的N29Q的BGA-4380（SEQ ID No: 1-3、20、5-6、7、21、9、22）以及包含LCDR1中的G30A的BGA-4265（SEQ ID No: 1-3、23、5-6、7、24、9、25）在SPR結合測定中進行了測試。
綜上所述，人源化單株抗體的工程化版本，即基於BGA-3726的包含HCDR1中的W34Y、HCDR3中的W96Y和LCDR1中的G30A的BGA-6938（SEQ ID No: 11、2、14、23、5-6、26、24、27、25）以及基於BGA-3726的包含HCDR1中的W34Y、HCDR3中的W96Y、HCDR3中的W98Y和LCDR1中的G30A的BGA-5488（SEQ ID No: 11、2、28、23、5-6、29、24、30、25）衍生自如上所述之突變過程，並對其進行了詳細表徵。結果顯示BGA-3726、BGA-6938和BGA-5488與重組B7H3的結合親和力相當。
對於親和力測定，抗體被抗人Fc表面捕獲，並用於基於表面電漿共振（SPR）技術的親和力測定。SPR測定的抗B7H3抗體與人4Ig-B7H3的ECD的結合概況的結果（義翹神州公司（Sinobiological），目錄號：11188-H08H）總結在 表 5中。BGA-6938（SEQ ID NO: 11、2、14、23、5-6、26、24、27、25）和BGA-5488（SQ ID NO: 11、2、28、23、5-6、29、24、30、25）具有相當的結合親和力，解離常數分別為0.443 nM和1.11 nM，與BGA-3726相當。 [ 表 5] . 藉由 SPR 比較 BGA-3726 及其工程化抗體與 B7H3 的結合親和力
Ab 測試1 測試2
k on（M -1s -1） k off（s -1） K D（M） k on（M -1s -1） k off（s -1） K D（M）
BGA-3726 3.21E+05 1.36E-04 4.24E-010 4.42E+05 2.07E-04 4.70E-010
BGA-4826 2.88E+05 1.71E-04 5.96E-010 - - -
BGA-4498 3.15E+05 1.99E-04 6.32E-010 - - -
BGA-4269 1.42E+05 1.36E-04 4.24E-010 - - -
BGA-4380 3.73E+05 2.37E-04 6.35E-010 - - -
BGA-4265 4.14E+05 1.28E-04 3.08E-010 - - -
BGA-6938 - - - 5.06E+04 2.24E-04 4.43E-010
BGA-5488 - - - 2.95E+04 3.26E-04 1.11E-09
為了評價BGA-6938和BGA-5488結合活細胞上天然B7H3的結合活性，將NK92mi細胞工程化以過表現人4Ig-B7H3。將活NK92mi/B7H3細胞接種在96孔板中，並與BGA-3726、BGA-6938和BGA-5488的連續稀釋液一起孵育。將山羊抗人IgG用作二級抗體，檢測與細胞表面結合的抗體。藉由使用GraphPad Prism將劑量-反應數據與四參數Logistic模型擬合來確定與人天然B7H3以劑量依賴性結合的EC 50值。如 圖 3A- 圖 3B和 表 6中所示出的。工程化抗體BGA-6938和BGA-5488保留了親本殖株BGA-3726與天然B7H3的結合親和力。 [ 表 6] . 藉由 FACS 比較 BGA-3726 及其人源化抗體對 NK92mi/B7H3 細胞的 EC50
抗體 NK92mi/B7H3 結合 EC50 （ nM ）
測試 1 測試 2
BGA-3726 1.44 -
BGA-6938 - 1.19
BGA-5488 - 1.45
[ 表 7] . 抗體序列
抗體 SEQ ID NO 序列
BGA-3726 SEQ ID NO: 1 HCDR1 （ Kabat ） TSNWWN
SEQ ID NO: 2 HCDR2 （ Kabat ） EIYPTGNTNYSPSLKS
SEQ ID NO: 3 HCDR3 （ Kabat ） GWNWFDP
SEQ ID NO: 4 LCDR1 （ Kabat ） RTSQSINGILLA
SEQ ID NO: 5 LCDR2 （ Kabat ） GASSRAT
SEQ ID NO: 6 LCDR3 （ Kabat ） QQYGSSPRT
SEQ ID NO: 7 VH AA QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISTSNWWNWVRQSPGKGLEWIGEIYPTGNTNYSPSLKSRVTISIDKSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARGWNWFDPWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 8 VL AA EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQSINGILLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLSISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 9 VH DNA CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGGGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTACTAGTAACTGGTGGAATTGGGTCCGCCAGTCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGAGAAATCTATCCTACTGGGAACACCAACTACAGCCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAATAGACAAGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTTAATTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTATTGTGCCAGAGGATGGAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 10 VL DNA GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGACCAGTCAGAGTATTAACGGCATCTTGTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCCGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCAGCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGCAGTTCACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
BGA-4826 SEQ ID NO: 11 HCDR1 （ Kabat ） TSNYWN
SEQ ID NO: 2 HCDR2 （ Kabat ） EIYPTGNTNYSPSLKS
SEQ ID NO: 3 HCDR3 （ Kabat ） GWNWFDP
SEQ ID NO: 4 LCDR1 （ Kabat ） RTSQSINGILLA
SEQ ID NO: 5 LCDR2 （ Kabat ） GASSRAT
SEQ ID NO: 6 LCDR3 （ Kabat ） QQYGSSPRT
SEQ ID NO: 12 VH AA QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISTSNYWNWVRQSPGKGLEWIGEIYPTGNTNYSPSLKSRVTISIDKSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARGWNWFDPWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 8 VL AA EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQSINGILLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLSISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 13 VH DNA CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGGGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTACTAGTAACTACTGGAATTGGGTCCGCCAGTCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGAGAAATCTATCCTACTGGGAACACCAACTACAGCCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAATAGACAAGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTTAATTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTATTGTGCCAGAGGATGGAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 10 VL DNA GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGACCAGTCAGAGTATTAACGGCATCTTGTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCCGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCAGCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGCAGTTCACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
BGA-4498 SEQ ID NO: 1 HCDR1 （ Kabat ） TSNWWN
SEQ ID NO: 2 HCDR2 （ Kabat ） EIYPTGNTNYSPSLKS
SEQ ID NO: 14 HCDR3 （ Kabat ） GYNWFDP
SEQ ID NO: 4 LCDR1 （ Kabat ） RTSQSINGILLA
SEQ ID NO: 5 LCDR2 （ Kabat ） GASSRAT
SEQ ID NO: 6 LCDR3 （ Kabat ） QQYGSSPRT
SEQ ID NO: 15 VH AA QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISTSNWWNWVRQSPGKGLEWIGEIYPTGNTNYSPSLKSRVTISIDKSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARGYNWFDPWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 8 VL AA EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQSINGILLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLSISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 16 VH DNA CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGGGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTACTAGTAACTGGTGGAATTGGGTCCGCCAGTCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGAGAAATCTATCCTACTGGGAACACCAACTACAGCCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAATAGACAAGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTTAATTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTATTGTGCCAGAGGATACAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 10 VL DNA GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGACCAGTCAGAGTATTAACGGCATCTTGTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCCGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCAGCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGCAGTTCACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
BGA-4269 SEQ ID NO: 1 HCDR1 （ Kabat ） TSNWWN
SEQ ID NO: 2 HCDR2 （ Kabat ） EIYPTGNTNYSPSLKS
SEQ ID NO: 17 HCDR3 （ Kabat ） GWNYFDP
SEQ ID NO: 4 LCDR1 （ Kabat ） RTSQSINGILLA
SEQ ID NO: 5 LCDR2 （ Kabat ） GASSRAT
SEQ ID NO: 6 LCDR3 （ Kabat ） QQYGSSPRT
SEQ ID NO: 18 VH AA QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISTSNWWNWVRQSPGKGLEWIGEIYPTGNTNYSPSLKSRVTISIDKSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARGWNYFDPWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 8 VL AA EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQSINGILLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLSISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 19 VH DNA CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGGGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTACTAGTAACTGGTGGAATTGGGTCCGCCAGTCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGAGAAATCTATCCTACTGGGAACACCAACTACAGCCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAATAGACAAGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTTAATTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTATTGTGCCAGAGGATGGAACTACTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 10 VL DNA GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGACCAGTCAGAGTATTAACGGCATCTTGTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCCGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCAGCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGCAGTTCACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
BGA-4380 SEQ ID NO: 1 HCDR1 （ Kabat ） TSNWWN
SEQ ID NO: 2 HCDR2 （ Kabat ） EIYPTGNTNYSPSLKS
SEQ ID NO: 3 HCDR3 （ Kabat ） GWNWFDP
SEQ ID NO: 20 LCDR1 （ Kabat ） RTSQSIQGILLA
SEQ ID NO: 5 LCDR2 （ Kabat ） GASSRAT
SEQ ID NO: 6 LCDR3 （ Kabat ） QQYGSSPRT
SEQ ID NO: 7 VH AA QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISTSNWWNWVRQSPGKGLEWIGEIYPTGNTNYSPSLKSRVTISIDKSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARGWNWFDPWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 21 VL AA EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQSIQGILLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLSISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 9 VH DNA CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGGGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTACTAGTAACTGGTGGAATTGGGTCCGCCAGTCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGAGAAATCTATCCTACTGGGAACACCAACTACAGCCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAATAGACAAGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTTAATTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTATTGTGCCAGAGGATGGAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 22 VL DNA GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGACCAGTCAGAGTATTCAGGGCATCTTGTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCCGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCAGCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGCAGTTCACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
BGA-4265 SEQ ID NO: 1 HCDR1 （ Kabat ） TSNWWN
SEQ ID NO: 2 HCDR2 （ Kabat ） EIYPTGNTNYSPSLKS
SEQ ID NO: 3 HCDR3 （ Kabat ） GWNWFDP
SEQ ID NO: 23 LCDR1 （ Kabat ） RTSQSINAILLA
SEQ ID NO: 5 LCDR2 （ Kabat ） GASSRAT
SEQ ID NO: 6 LCDR3 （ Kabat ） QQYGSSPRT
SEQ ID NO: 7 VH AA QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISTSNWWNWVRQSPGKGLEWIGEIYPTGNTNYSPSLKSRVTISIDKSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARGWNWFDPWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 24 VL AA EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQSINAILLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLSISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 9 VH DNA CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGGGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTACTAGTAACTGGTGGAATTGGGTCCGCCAGTCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGAGAAATCTATCCTACTGGGAACACCAACTACAGCCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAATAGACAAGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTTAATTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTATTGTGCCAGAGGATGGAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 25 VL DNA GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGACCAGTCAGAGTATTAACGCCATCTTGTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCCGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCAGCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGCAGTTCACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
BGA-6938 SEQ ID NO: 11 HCDR1 （ Kabat ） TSNYWN
SEQ ID NO: 2 HCDR2 （ Kabat ） EIYPTGNTNYSPSLKS
SEQ ID NO: 14 HCDR3 （ Kabat ） GYNWFDP
SEQ ID NO: 23 LCDR1 （ Kabat ） RTSQSINAILLA
SEQ ID NO: 5 LCDR2 （ Kabat ） GASSRAT
SEQ ID NO: 6 LCDR3 （ Kabat ） QQYGSSPRT
SEQ ID NO: 26 VH AA QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISTSNYWNWVRQSPGKGLEWIGEIYPTGNTNYSPSLKSRVTISIDKSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARGYNWFDPWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 24 VL AA EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQSINAILLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLSISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 27 VH DNA CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGGGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTACTAGTAACTACTGGAATTGGGTCCGCCAGTCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGAGAAATCTATCCTACTGGGAACACCAACTACAGCCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAATAGACAAGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTTAATTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTATTGTGCCAGAGGATACAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 25 VL DNA GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGACCAGTCAGAGTATTAACGCCATCTTGTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCCGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCAGCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGCAGTTCACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
BGA-5488 SEQ ID NO: 11 HCDR1 （ Kabat ） TSNYWN
SEQ ID NO: 2 HCDR2 （ Kabat ） EIYPTGNTNYSPSLKS
SEQ ID NO: 28 HCDR3 （ Kabat ） GYNYFDP
SEQ ID NO: 23 LCDR1 （ Kabat ） RTSQSINAILLA
SEQ ID NO: 5 LCDR2 （ Kabat ） GASSRAT
SEQ ID NO: 6 LCDR3 （ Kabat ） QQYGSSPRT
SEQ ID NO: 29 VH AA QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISTSNYWNWVRQSPGKGLEWIGEIYPTGNTNYSPSLKSRVTISIDKSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARGYNYFDPWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 24 VL AA EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQSINAILLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLSISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 30 VH DNA CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGGGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTACTAGTAACTACTGGAATTGGGTCCGCCAGTCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGAGAAATCTATCCTACTGGGAACACCAACTACAGCCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAATAGACAAGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTTAATTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTATTGTGCCAGAGGATACAACTACTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 25 VL DNA GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGACCAGTCAGAGTATTAACGCCATCTTGTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCCGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCAGCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGCAGTTCACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
IgG1mf SEQ ID NO: 31 AA ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
來自IgG1的重鏈恒定區 SEQ ID NO: 33 AA ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
κ鏈的輕鏈恒定區 SEQ ID NO: 34 AA RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
替雷利珠單抗的VH SEQ ID NO: 78 AA QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVHWIRQPPGKGLEWIGVIYADGSTNYNPSLKSRVTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGNYWYIDVWGQGTTVTVSS
替雷利珠單抗的VL SEQ ID NO: 79 AA DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVSNDVAWYQQKPGQPPKLLINYAFHRFTGVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCHQAYSSPYTFGQGTKLEIK
全長人B7H3 SEQ ID NO: 80 AA MLRRRGSPGMGVHVGAALGALWFCLTGALEVQVPEDPVVALVGTDATLCCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFAEGQDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYQGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSILRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHSSVTITPQRSPTGAVEVQVPEDPVVALVGTDATLRCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFTEGRDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYRGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSVLRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHGSVTITGQPMTFPPEALWVTVGLSVCLIALLVALAFVCWRKIKQSCEEENAGAEDQDGEGEGSKTALQPLKHSDSKEDDGQEIA
實例 6. 人源化 Ab 的細胞結合和內化 結合
進行了結合分析以評價抗體的親和力。野生型IgG1/κ形式的BGA-6938和MABX-9001a（用於DS-7300a的人源化抗B7H3 IgG1單株抗體，Yamato等人，Mol. Cancer Ther. [分子癌症治療] 2022 1;21(4):635-646）和人IgG抗體被納入評價中。使用胰蛋白酶-EDTA（目錄號25200056，賽默飛世爾科技公司（ThermoFisher））將H358細胞從培養瓶中分離出來，並用結合緩衝液（含2% FBS的PBS，pH 7.2）洗滌。將洗滌後的細胞以0.2 mL結合緩衝液中約100,000個細胞的密度添加至含抗體的96孔板中。在與細胞的競爭反應中，一級抗體的最終濃度不同，從500 nM開始，然後以1 : 5倍稀釋遞減得到11種濃度。將細胞和抗體混合物在冰上孵育1小時。孵育1小時後，用結合緩衝液洗滌細胞兩次以分離游離抗體。用螢光標記的抗人Fc（目錄號：109-605-190，傑克遜免疫研究公司（Jackson ImmunoResearch））進一步標記洗滌的細胞，並在冰上孵育1小時。孵育1小時後，用結合緩衝液洗滌細胞兩次以分離游離抗體。使用LSRFortessa（BD）檢測螢光信號。BGA-6938和MABX-9001a以及人IgG抗體在H358上的結合曲線在 圖 4中示出。基於結合結果，與MABX-9001a相比，BGA-6938顯示出對B7H3更高的結合親和力。 內化
抗體與ADC軛合的一個期望屬性係能夠內化到細胞中。根據製造商的方案進行pHrodo™測定（目錄號：Z25612，賽默飛世爾科技公司）以確定BGA-6938和MABX-9001a的內化活性。使用Zenon™ pHrodo™ iFL IgG標記試劑（目錄號：Z25612，賽默飛世爾科技公司）和RPMI培養基標記一級抗體。在37°C下，將100,000個H358細胞懸浮於0.2 mL的抗體-pHrodo中並一起孵育。孵育1小時、4小時、8小時和24小時後，用結合緩衝液（含2% FBS的PBS，pH 7.2）洗滌細胞兩次以分離游離抗體。使用帶有PE通道的LSRFortessa™（BD）檢測螢光信號。螢光信號強度表示內化活性。BGA-6938和MABX-9001a以及人IgG抗體在H358上的曲線在 圖 5中示出。基於內化結果，與MABX-9001a相比，BGA-6938顯示出增加的內化活性。 實例 7. 細胞殺傷活性
為了評估BGA-6938和MAbX-9001a的ADC細胞殺傷活性，將靶細胞H1650、H441和H1048（全部係肺癌細胞系）以每孔1,000個細胞鋪板在96孔3D細胞培養板（目錄號：6055330，珀金埃爾默公司（Perkin Elmer））中的100 µl的RPM1-1640加10% FBS培養基中。24小時後，將另外50 µl含BGA-6938-GGFG-DXd（DAR8）和MABX-9001a-GGFG-DXd（DAR8或DAR4）濃度的連續稀釋液的培養基添加至三個重複孔中。有關MABX-9001a-GGFG-DXd的結構，請參見Yamato等人, Mol Cancer Ther [分子癌症治療] 2022 1;21(4):635-646中的圖2A。6天後，使用CellTiter-Glo發光細胞活力試劑（G7572；普洛麥格公司（Promega Corporation））和Tecan Spark測定細胞存活。使用GraphPad Prism 9分析殺傷曲線並在 圖 6中示出。與MABX-9001a-GGFG-DXd（DAR8）相比，BGA-6938-GGFG-DXd（DAR8）在H1650和H441中顯示出相當的殺傷活性，在H1048中顯示出增加的殺傷活性。 實例 8. B7H3 scFv 蛋白在 H358 腫瘤細胞系上的結合
為了評價BGA-6938的scFv在活H358腫瘤細胞表面上的結合能力，藉由親和層析然後粒徑排阻層析純化scFv蛋白（參見 表 8）。對於測定，將2 x 10 5個H358細胞接種到96孔板中。藉由向細胞中添加連續稀釋的scFv蛋白（3.38 pM至200 nM）生成劑量反應曲線，並使用His標籤抗體iFluor 488（目錄號A01800）檢測結合的scFv。使用Satorius iQue3™系統測量各細胞群的MFI。使用四參數Logistic模型測定每個scFv的EC50和MFImax。結果在 表 9 和圖 7中示出。BGA-6938的ScFv對H358腫瘤細胞上的B7H3抗原顯示出2.047 nM的EC50。 [ 表 8] . B7H3 scFv 蛋白序列
BGA-6938的scFv VL-VH SEQ ID NO: 32 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQSINAILLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLSISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIKggggsggggsggggsggggsQVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISTSNYWNWVRQSPGKGLEWIGEIYPTGNTNYSPSLKSRVTISIDKSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARGYNWFDPWGQGTLVTVSSHHHHHH
[ 表 9] ： scFv 片段在 H358 細胞系上的劑量依賴性結合
抗體 EC50 （ nM ） MFI
BGA-6938 的 scFv 2.047 782469
實例 9. 抗 B7H3 抗體的表位作圖
為了研究抗B7H3 mAb BGA-6938的結合表位，藉由融合來自人B7H3（SEQ ID NO: 80）胞外區的每個Ig樣結構域，即IgV1（SEQ ID NO: 80的胺基酸29-139）、IgC1（SEQ ID NO: 80的胺基酸145-238）、IgV2（SEQ ID NO: 80的胺基酸243-357）和IgC2（SEQ ID NO: 80的胺基酸363-456）及其跨膜和細胞內結構域生成截短的人B7-H3結構域。截斷版本的B7H3也與N-末端FLAG標籤融合。圖8A中示出的所得截短人B7H3構建體含有N-末端FLAG標籤，然後係Ig樣結構域和B7H3 C-末端結構域，包括跨膜和細胞內結構域。將編碼截短版本B7H3的DNA選殖到pcDNA 3.4載體中。
使用含有該等截短的B7H3構建體的質體轉染ExpiCHO™細胞以進行瞬時蛋白表現，然後將細胞與100 nM純化的BGA-6938以及來自第一三共株式會社的參比抗體DS-7300（US 2022/0064312 A1）一起孵育。藉由使用Alexa Fluor 647兔抗人IgG（目錄號：309-605-008，傑克遜免疫研究公司）進行檢測來評價BGA-6938和DS-7300與不同B7H3截短形式的結合。將轉染的細胞與抗FLAG mAb（目錄號：A01809，金斯瑞公司（Genscript））一起孵育後，藉由檢測N-末端的FLAG標籤來驗證每個構建體的表現。圖8B中的數據顯示BGA-6938特異性結合B7H3 V1和V2結構域，並且顯示不與B7H3 C1和C2結構域結合。相比之下，參比抗體DS-7300與B7H3的C1和C2結構域結合，並且不與V1和V2結構域結合（圖8B）。因此，BGA-6938和DS-7300具有非重疊表位。
無
圖1示出了藉由SPR進行的純化的B7H3 mAb BGA-3726（鼠嵌合）對人B7H3抗原的親和力測定。特別地，傳感圖示出了作為源自玻璃晶片表面的信號的結合的變化。玻璃晶片係電漿共振表面，與BGA-3726結合。抗BGA-3726抗體由抗小鼠IgG Fc抗體捕獲並固定在晶片上。固定後，將人或cyno B7H3外結構域的連續稀釋液通過晶片。由於B7H3係BGA-3726的靶標，將結合程度視覺化為反應單位（RU）（Y軸），並與以秒為單位的結合時間（X軸）成比例。因此，淺灰色線係人B7H3蛋白的連續稀釋液，並且深灰色線係對應於不同人B7H3濃度的擬合曲線。虛線係B7H3蛋白的最高濃度。結果用於計算BGA-3295的締合速率（ Kon）和解離速率（ Koff）。 圖2A-圖2B示出了藉由FACS測定進行的純化的抗4Ig-B7H3 mAb BGA-3726與人4Ig-B7H3（圖2A）和cyno B7H3（圖2B）過表現細胞的結合親和力。 圖3A-圖3B示出了藉由FACS測定進行的衍生自BGA-3726的工程化抗體與人4Ig-B7H3過表現細胞的結合親和力比較。圖3A示出了BGA-3726與人4Ig-B7H3過表現細胞的劑量依賴性結合曲線。圖3B示出了BGA-6938和BGA-5488與人4Ig-B7H3過表現細胞的劑量依賴性結合曲線。 圖4示出了藉由FACS測定進行的BGA-6938和MABX-9001a與B7H3陽性腫瘤細胞H358細胞的結合親和力比較。hIgG同種型Ab用作非結合對照。 圖5示出了藉由FACS測定進行的在所指示的時間點BGA-6938和MABX-9001a與B7H3陽性腫瘤細胞H358細胞的內化活性比較。hIgG同種型Ab用作非結合對照。 圖6示出了BGA-6938-GGFG-DXd（DAR8）、MABX-9001a-GGFG-DXd（DAR8）和MABX-9001a-GGFG-DXd（DAR4）在H1650、H441和H1048細胞模型中的細胞殺傷活性。Iso-GGFG-DXd（DAR8）用作非靶向對照。 圖7示出了BGA-6938的scFv與H358細胞的結合親和力。 圖8A-8B示出了BGB-6938之表位作圖。圖8A示出了截短的人B7H3的構建體設計。圖8B示出了藉由結構域截短進行的BGB-6938的表位鑒定以及與DS-7300的表位比較。
無
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Claims (36)

  1. 一種特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含： (i) 重鏈可變區（VH），該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 11的HCDR1（重鏈互補決定區1）、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 14的HCDR3，以及輕鏈可變區（VL），該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 23的LCDR1（輕鏈互補決定區1）、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (ii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 1的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 3的HCDR3，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 4的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (iii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 11的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 3的HCDR3，以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 4的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (iv) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 1的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 14的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 4的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (v) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 1的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 17的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 4的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (vi) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 1的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 3的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 20的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3； (vii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 1的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 3的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 23的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3；或者 (viii) 重鏈可變區，該重鏈可變區包含 (a) SEQ ID NO: 11的HCDR1、(b) SEQ ID NO: 2的HCDR2和 (c) SEQ ID NO: 28的HCDR3；以及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(d) SEQ ID NO: 23的LCDR1、(e) SEQ ID NO: 5的LCDR2和 (f) SEQ ID NO: 6的LCDR3。
  2. 如請求項1所述之抗體或其抗原結合片段，其中： (i) 該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 26具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，並且該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 24具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列； (ii) 該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 7具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，並且該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 8具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列； (iii) 該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 12具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，並且該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 8具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列； (iv) 該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 15具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，並且該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 8具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列； (v) 該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 18具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，並且該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 8具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列； (vi) 該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 7具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，並且該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 21具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列； (vii) 該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 7具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，並且該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 24具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列；或者 (viii) 該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 29具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，並且該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 24具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。
  3. 如請求項2所述之抗體或其抗原結合片段，其中SEQ ID NO: 26和24、SEQ ID NO: 7和8、SEQ ID NO: 12和8、SEQ ID NO: 15和8、SEQ ID NO: 18和8、SEQ ID NO: 7和21、SEQ ID NO: 7和24、SEQ ID NO: 29和24中已插入、缺失或取代一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸。
  4. 如前述請求項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中： (i) 該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 26，並且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 24； (ii) 該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 7，並且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 8； (iii) 該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 12，並且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 8； (iv) 該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 15，並且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 8； (v) 該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 18，並且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 8； (vi) 該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 7，並且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 21； (vii) 該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 7，並且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 24；或者 (viii) 該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 29，並且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 24。
  5. 如前述請求項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段係單株抗體、人工程化抗體、單鏈抗體（scFv）、Fab片段、Fab'片段或F(ab’)2片段。
  6. 如請求項5所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含scFv，該scFv包含具有該SEQ ID NO: 26的胺基酸的VH和具有SEQ ID NO: 24的胺基酸的VL，視需要該VH和VL經由胺基酸連接子連接，視需要該胺基酸連接子係SEQ ID NO: 35至SEQ ID NO: 77中的任何序列。
  7. 如請求項6所述之抗體或其抗原結合片段，其中該胺基酸連接子係SEQ ID NO: 77。
  8. 如請求項6所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含具有該SEQ ID NO: 32的胺基酸序列的scFv。
  9. 一種多特異性抗體或其抗原結合片段，該多特異性抗體或其抗原結合片段包含特異性結合人4Ig-B7H3的至少第一抗原結合結構域，其中該第一抗原結合結構域係如請求項1-8中任一項所述之抗體或其抗原結合片段；以及 特異性結合第二人腫瘤相關抗原（TAA）的至少第二抗原結合結構域。
  10. 如請求項9所述之多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該多特異性抗體係雙特異性抗體。
  11. 如請求項9-10中任一項所述之多特異性抗體或其抗原結合片段，該多特異性抗體或其抗原結合片段進一步包含胺基酸連接子，其中該胺基酸連接子係SEQ ID NO: 35至SEQ ID NO: 77中的任何序列。
  12. 如前述請求項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞類的重鏈恒定區和/或κ或λ類型的輕鏈恒定區。
  13. 如前述請求項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含IgG1亞類的重鏈恒定區和κ類型的輕鏈恒定區。
  14. 如前述請求項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有抗體依賴性細胞毒性（ADCC）或補體依賴性細胞毒性（CDC）。
  15. 如前述請求項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有降低的糖基化或無糖基化或係低岩藻糖基化的。
  16. 如前述請求項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含增加的二等分GlcNac結構。
  17. 如前述請求項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與細胞毒素軛合。
  18. 如前述請求項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段經由細胞毒素連接子與細胞毒素軛合。
  19. 如前述請求項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中： (1) 該抗體或其抗原結合片段特異性結合包含人4Ig-B7H3（SEQ ID NO: 80）的胺基酸殘基29-139或由其組成的表位；並且/或者 (2) 該抗體或其抗原結合片段特異性結合包含人4Ig-B7H3（SEQ ID NO: 80）的胺基酸殘基243-357或由其組成的表位。
  20. 一種藥物組成物，該藥物組成物包含如前述請求項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，和藥學上可接受的載劑。
  21. 一種治療癌症之方法，該方法包括向有需要的患者投與有效量的如請求項1-19中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，或如請求項20所述之藥物組成物。
  22. 如請求項21所述之方法，其中該癌症係4Ig-B7H3陽性的。
  23. 如請求項21-22中任一項所述之方法，其中該癌症係結直腸癌、前列腺癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、腎癌、肺癌或食管癌。
  24. 如請求項23所述之方法，其中該肺癌係非小細胞肺癌（NSCLC）或小細胞肺癌（SCLC）。
  25. 如請求項24所述之方法，其中該非小細胞肺癌係鱗狀非小細胞肺癌。
  26. 如請求項23所述之方法，其中該食管癌係食管鱗狀細胞癌。
  27. 如請求項21-26中任一項所述之方法，其中該抗體或其抗原結合片段與另一種治療劑組合投與。
  28. 如請求項27所述之方法，其中該治療劑係紫杉醇或紫杉醇藥劑、多西他賽、卡鉑、托泊替康、順鉑、伊立替康、多柔比星、來那度胺或5-氮雜胞苷。
  29. 如請求項27所述之方法，其中該治療劑係免疫檢查點抑制劑。
  30. 如請求項27所述之方法，其中該治療劑係抗PD-1抗體。
  31. 如請求項30所述之方法，其中該抗PD1抗體係替雷利珠單抗。
  32. 一種分離的核酸，該分離的核酸編碼如請求項1至19中任一項所述之抗體或其抗原結合片段。
  33. 一種載體，該載體包含如請求項32所述之核酸。
  34. 一種宿主細胞，該宿主細胞包含如請求項32所述之核酸或如請求項33所述之載體。
  35. 一種生產抗體或其抗原結合片段之製程，該製程包括培養如請求項34所述之宿主細胞和從該培養物中回收該抗體或抗體片段。
  36. 一種特異性結合人4Ig-B7H3的抗體或其抗原結合片段，其中： (1) 該抗體或其抗原結合片段特異性結合包含人4Ig-B7H3（SEQ ID NO: 80）的胺基酸殘基29-139或由其組成的表位；並且/或者 (2) 該抗體或其抗原結合片段特異性結合包含人4Ig-B7H3（SEQ ID NO: 80）的胺基酸殘基243-357或由其組成的表位。
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