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TW202430564A - 抗原結合蛋白 - Google Patents

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TW202430564A
TW202430564A TW112139750A TW112139750A TW202430564A TW 202430564 A TW202430564 A TW 202430564A TW 112139750 A TW112139750 A TW 112139750A TW 112139750 A TW112139750 A TW 112139750A TW 202430564 A TW202430564 A TW 202430564A
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seq
binding protein
binding
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艾利森 畢爾
尼可萊 貝爾亞耶夫
派翠克 柯恩尼格
傑爾 麥瑞納
艾許卡 派特爾
映暉 容
亦雯 俞
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英商葛蘭素史密斯克藍智慧財產權有限公司
美商２３與我有限公司
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Abstract

本發明係關於抑制FLT3LG與FLT3之間相互作用的FLT3LG結合蛋白，及利用該等FLT3LG結合蛋白治療自體免疫性疾病之方法。

Description

抗原結合蛋白
本發明之實施例係關於包含抗FLT3LG抗體之FLT3LG結合蛋白及其於治療自體免疫性疾病中之用途。
當身體之免疫系統利用自身抗體或自身反應性T細胞異常攻擊健康組織時，自體免疫性疾病發生。已識別至少80種自體免疫性疾病，包括全身性紅斑狼瘡(SLE)、乳糜瀉、類風濕性關節炎、類肉瘤病及休格連氏(Sjogren’s)症候群。雖然認為遺傳及環境因素起一定作用，但是自體免疫性疾病之原因未知。
本文中提供FLT3LG結合蛋白，其包含： a.(i)選自SEQ ID NO: 4之CDRH1、CDRH2及/或CDRH3及/或SEQ ID NO: 12之CDRL1、CDRL2及/或CDRL3之CDR中之任一者或組合；或 (ii) (i)之CDR變異體，其中該變異體具有1、2或3個胺基酸修飾；或 b.包含與SEQ ID NO: 8之序列至少80%相同之序列之VH區及/或包含與SEQ ID NO: 16之序列至少80%相同之序列之VL區。
本文中亦提供FLT3LG結合蛋白，其包含下列6個CDR： SEQ ID NO: 26之CDRH1、SEQ ID NO: 27之CDRH2、SEQ ID NO: 28之CDRH3、SEQ ID NO: 38之CDRL1、SEQ ID NO: 39之CDRL2、及SEQ ID NO:40之CDRL3。
本文中亦提供FLT3LG結合蛋白，其結合至人類FLT3LG及與參考FLT3LG結合蛋白競爭結合至人類FLT3LG，該參考FLT3LG結合蛋白包含： SEQ ID NO: 8之VH區序列及SEQ ID NO: 16之VL區序列。
本文中亦提供核酸序列，其編碼如本文中所定義之FLT3LG結合蛋白之HC及LC中之一者或二者。
本文中亦提供表現載體，其包含如本文中所定義之一或多個核酸序列。
本文中亦提供重組宿主細胞，其包含如本文中所定義之核酸序列或表現載體。
本文中亦提供用於產生一或多種FLT3LG結合蛋白之方法，其包括將如本文中所定義之重組宿主細胞在適用於該(等)核酸序列或表現載體之表現之條件下培養，藉此產生包含FLT3LG結合蛋白之多肽。
本文中亦提供經工程改造以表現如本文中所定義之FLT3LG結合蛋白之細胞系。
本文中亦提供醫藥組合物，其包含如本文中所定義之FLT3LG結合蛋白及醫藥上可接受之賦形劑。
本文中亦提供治療有需要個體之自體免疫性疾病之方法，其包括向該個體投與治療上有效量之如本文中所定義之FLT3LG結合蛋白或醫藥組合物。
本文中亦提供如本文中所定義之FLT3LG結合蛋白及醫藥組合物，其用於療法中。
本文中亦提供如本文中所定義之FLT3LG結合蛋白及醫藥組合物，其用於治療自體免疫性疾病。
聯合研究協議各方之名稱本申請案所主張之標的由聯合研究協議之各方作出或代表各方作出，其在作出所主張標的日期時或之前生效；作為於聯合研究協議之範圍內採取之活動之結果，作出所主張之標的；及聯合研究協議之各方包含：GlaxoSmithKline Intellectual Property (No.3) Limited及23andMe, Inc。
聯合研究協議為由以上提及之各方達成以進行所主張標的之領域中之實驗、開發或研究工作之書面合同、撥款或合作協議。
如本文中所用，「FLT3LG」意指任何FMS相關之酪胺酸激酶3配位體。FLT3LG之假名包括FLT3配位體、Flt3配位體、FL、Flt3L、FLT3L、FLG3L及FMS相關受體酪胺酸激酶3配位體。FLT3LG為藉由人類之 FLT3LG基因及藉由其他物種之推定同源物編碼之分子。FLT3LG特異性結合至FMS相關受體酪胺酸激酶3 (FLT3)受體。FLT3LG可以細胞表面膜結合形式表現。FLT3LG可為可溶性分子或自細胞表面脫落。一般而言，除非另有指定，否則「hFLT3LG」係指細胞表面膜結合人類FLT3LG及人類可溶性FLT3LG二者。
如本文中所用，「FLT3」係指FLT3LG之類FMS酪胺酸激酶3 (FLT3)受體。FLT3之假名包括CD135、FLK2及STK1。FLT3藉由人類之 FLT3基因及藉由其他物種之推定同源物編碼，及為III類受體酪胺酸激酶家族分子。FLT3由具有5個類Ig域之細胞外區、跨膜域及具有近膜域及兩個酪胺酸激酶域之細胞質區組成。在FLT3LG與FLT3相互作用後，FLT3均二聚化，從而導致酪胺酸激酶域之磷酸化及下游信號傳導。於一些實例中，FLT3為人類FLT3 (hFLT3)。於一些實例中，FLT3可為另一有機體(例如，小鼠、大鼠、牛、犬、貓、豬、猴等)。
如本文中所用，術語「抗原結合蛋白」係指抗體、其抗原結合片段及其他蛋白質構築體，諸如能結合至抗原之域。如本文中所用，術語「FLT3LG結合蛋白」係指能結合至FLT3LG之抗原結合蛋白。FLT3LG結合蛋白可能結合至人類FLT3LG及另一有機體(例如，小鼠、大鼠、牛、犬、貓、豬、猴等)之FLT3LG蛋白中之一或多者。FLT3LG結合蛋白可能結合至FLT3LG之片段、變異體或突變體。如本文中所用，FLT3LG結合蛋白不同於天然產生之結合FLT3LG之蛋白(例如，FLT3)。
本文中以最廣義使用術語「抗體」以係指具有類免疫球蛋白域(例如，IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)之分子及包括單株抗體、重組抗體、多株抗體、嵌合抗體、人類抗體、人源化抗體、多特異性抗體(包含雙特異性抗體)及異結合抗體；單可變域(例如，域抗體(DAB))、抗原結合抗體片段、Fab、F(ab’) 2、Fv、二硫鍵連接之Fv、單鏈Fv、二硫鍵連接之scFv、二抗體、TANDABS等及上述任一者之修飾的版本。
本文中提供之抗體(亦稱作免疫球蛋白或Ig)可包括具有約150,000道爾頓(dalton)之分子量之異四聚體醣蛋白。抗體包含藉由共價二硫鍵連接之兩條重鏈(HC) (其通常相同)及兩條輕鏈(LC) (其通常相同)。此H 2L 2結構可折疊以形成三功能域：兩個片段抗原結合區(Fab區)及可結晶片段區(Fc區)。Fab區包含包含在在胺基端之可變重(VH)鏈及可變輕(VL)鏈之可變域，及包含在羧基端之恆定重鏈(CH)及恆定輕鏈(CL)之第一域之恆定域。Fc區包含由兩條恆定重鏈(CH)之成對第二及第三域(CH2及CH3)之二聚化形成的兩個域。Fc區可引起效應功能，例如，藉由結合至免疫細胞上之受體或藉由結合C1q，C1q為經典補體路徑之第一組分。五種類別之抗體IgM、IgA、IgG、IgE及IgD藉由不同重鏈胺基酸序列定義：µ、α、γ、ε及δ；各重鏈可與Κ或λ輕鏈配對。通常，血清中之大多數抗體屬於IgG類別；存在人類IgG之四種同型(IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)，其序列主要於其鉸鏈區中不同。
本文中提供之抗體可為全人類抗體，及可使用各種方法，例如，使用人類抗體或片段之庫結合抗體顯示系統(如噬菌體或酵母顯示)或使能產生人類抗體庫之轉殖基因動物(例如，小鼠)免疫來獲得。於一些情況下，可將已經修飾以表現人類免疫球蛋白基因之轉殖基因動物用所關注之抗原免疫及可將抗原特異性人類抗體使用各種抗體發現技術(包括B-細胞選殖、雜交瘤及庫定序)分離。然後可針對所需性質(諸如活性、親和力、可開發性及選擇性)篩選使用此等技術產生之人類抗體。
替代抗體形式可包括替代支架，其中可將抗原結合蛋白之一或多個CDR安置至適宜非免疫球蛋白蛋白支架或骨架(諸如親和抗體、SpA支架、LDL受體A類域、艾菲爾親和聚體(avimer)或EGF域)上。
本文中提供之抗體可為「人源化抗體」，其係指一種具有源自非人類供體免疫球蛋白之CDR之經工程改造之抗體，該分子之其餘免疫球蛋白源部分源自一或多個人類免疫球蛋白。此外，可改變框架支撐殘基以保留結合親和力。適宜人類受體抗體可為選自習知資料庫(例如，KABAT資料庫、Los Alamos資料庫及Swiss Protein資料庫)或與供體抗體之核苷酸及/或胺基酸序列同源者。藉由與供體抗體之框架區同源(基於胺基酸)表徵之人類抗體可適於提供用於插入供體CDR之重鏈恆定區及/或重鏈可變框架區。可以相似方式選擇能供輕鏈恆定區或可變框架區之適宜受體抗體。應注意，受體抗體重鏈及輕鏈可源自相同受體抗體或不同受體抗體。
本文中所述之抗原結合蛋白中之一或多者可為抗體或其抗原結合片段。抗原結合蛋白可為人源化抗體或其抗原結合片段。抗原結合蛋白可包含以下中之一者、複數者或所有：人源化VH區或人源化重鏈(HC)序列；及/或人源化VL區或人源化輕鏈(LC)序列。
術語「供體抗體」係指促進其可變區、CDR或其他功能片段或其類似物中之一或多者之胺基酸序列至第一免疫球蛋白搭檔的抗體。因此，供體提供改變之免疫球蛋白編碼區及所得之表現改變之抗體與抗原特異性並中和供體抗體之活性特性。
術語「受體抗體」係指與供體抗體異源之抗體，其促進編碼其重鏈及/或輕鏈框架區及/或其重鏈及/或輕鏈恆定區之胺基酸序列之所有(或任何部分)至第一免疫球蛋白搭檔。人類抗體可為受體抗體。
術語「域」係指可獨立於多肽之其餘部分保留其三級結構之折疊多肽結構。一般而言，域負責多肽之離散功能性質及於許多情況下，可添加、移除或轉移至其他多肽而不失去蛋白質及/或域之其餘部分之功能。
術語「單可變域」係指包含抗體可變域之序列特性之折疊多肽域。因此，其包含完整抗體可變域(諸如VH、VHH及VL)及/或修飾之抗體可變域，例如，其中一或多個環已經非抗體可變域之特性之序列替換，或已經截短或包含N-或C-端延長之抗體可變域，以及至少保留全長域之結合活性及特異性之可變域的折疊片段。本文中單可變域能獨立於不同可變區或域結合抗原或抗原決定基。「域抗體」或「DAB」可為人類「單可變域」。單可變域可為人類單可變域，但是亦可為來自非人類物種，諸如嚙齒動物(例如，如WO 00/29004中)、鏽鬚鯊或駱駝科之單可變域。應注意，駱駝科VHH為源自駱駝科物種(諸如駱駝、美洲鴕、羊駝、單峰駱駝及原駝)之免疫球蛋白單可變域多肽，其僅產生天然不含輕鏈之重鏈抗體。此等VHH域可根據此項技術中可得之標準技術人源化，及此等域可為「單可變域」。
抗原結合片段可藉助一或多個CDR在一或多個非抗體蛋白質支架上之排列提供。如本文中所用，「蛋白質支架」包括(但不限於)免疫球蛋白(Ig)支架，例如，IgG支架，其可為四鏈或二鏈抗體，或其可僅包含抗體之Fc區，或其可包含抗體之一或多個恆定區，該等恆定區可為人類或靈長類動物來源，或其可為人類及靈長類動物恆定區之人工嵌合體。
蛋白質支架可為Ig支架，例如，IgG或IgA支架。IgG支架可包含抗體之一些或所有域(即，CH1、CH2、CH3、VH、VL)。抗原結合蛋白可包括選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgG4PE之IgG支架。例如，支架可為IgG1。支架可由抗體之Fc區或其片段組成或包含抗體之Fc區或其片段。
蛋白質支架可為選自由以下組成之群之支架之衍生物：CTLA-4、脂質運載蛋白、蛋白A源分子(諸如蛋白A之Z-域(艾菲爾抗體(Affibody), SpA)、A-域(艾菲爾親和聚體/最大抗體(Maxibody)))；熱休克蛋白，諸如GroEl及GroES；轉鐵蛋白(轉體)；錨蛋白重複蛋白(DARPin)；肽適體；C-型凝集素域(四聯蛋白(Tetranectin))；人類g-結晶蛋白及人類泛素(affilin)；PDZ域；人類蛋白酶抑制劑之蠍毒素庫尼茲(kunitz)型域；及已經歷蛋白質工程改造以獲得與抗原(諸如FLT3)而非天然配位體結合之纖連蛋白(fibronectin/adnectin)。
術語多特異性抗原結合蛋白係指包含至少兩個不同抗原結合位點之抗原結合蛋白。此等抗原結合位點各者可能結合至與抗原結合位點之另一者不同的抗原決定基；該等抗原結合位點可存在於相同抗原或不同抗原上。多特異性抗原結合蛋白可具有針對超過一種抗原(例如，兩種抗原或三種抗原或四種抗原)之特異性。具有針對兩種抗原之特異性之多特異性抗原結合蛋白可稱作雙特異性抗原結合蛋白。
雙特異性抗原結合蛋白(即，雙特異性)可經分類為具有對稱或不對稱架構。雙特異性抗原結合蛋白可為雙特異性抗體。雙特異性可具有Fc區或可係片段基(缺少Fc區)。片段基雙特異性可將不具有Fc區或具有Fc區之一部分之多個抗原結合片段，例如，Fab-scFv、Fab-scFv 2、正交Fab-Fab、Fab-Fv、串聯scFc (例如，BiTE及BiKE分子)、二抗體、DART、TandAb、sc二抗體、串聯dAb等於一個分子中組合。
對稱形式可將多個結合特異性於單多肽鏈或單一HL對中組合。實例可包括片段基形式或將一或多個抗體片段融合至抗體分子或其他抗原結合蛋白之形式之Fc-融合蛋白。對稱形式之實例可包括DVD-Ig、TVD-Ig、CODV-Ig、(scFv)4-Fc、IgG-(scFv)2、四價DART-Fc、F(ab) 4CrossMab、IgG-HC-scFv、IgG-LC-scFv、mAb-dAb等。
不對稱形式可藉由在三條(若使用共同重鏈或輕鏈)或四條多肽鏈之共同表現期間強制正確HL鏈配對及/或促進H鏈異二聚體化儘可能接近天然抗體之初始架構保留，例如，Triomab、不對稱再工程改造技術免疫球蛋白(ART-Ig)、CrossMab、Biclonics共同輕鏈、ZW1共同輕鏈、DuoBody及臼包杵(knobs into holes) (KiH)、DuetMab、κλ體、Xmab、YBODY、HET-mAb、HET-Fab、DART-Fc、SEED體、小鼠/大鼠嵌合IgG。
雙特異性形式亦可包括融合至非Ig支架之抗體，諸如Affimab、Fynomab、Zybodies、抗運載蛋白(Anticalin)-IgG融合或ImmTAC。
本文中所述之一或多種抗原結合蛋白可顯示在人類FLT3LG與來自其他物種之FLT3LG (諸如食蟹獼猴FLT3LG或恆河猴FLT3LG)之間之交叉反應性。本文中所述之抗原結合蛋白可特異性結合人類FLT3LG及食蟹獼猴FLT3LG。可在臨床前研究期間，例如，於一或多個非人類靈長類動物系統(諸如恆河猴或食蟹獼猴)中探索此交叉反應性。可在人類中測試抗原結合蛋白之前進行此臨床前研究。可探索此交叉反應性以進行一或多個使用本文中抗原結合蛋白之並列比較。在其他物種之間之交叉反應性可用於疾病模型(諸如犬或另一猴)中。視情況，抗原結合蛋白針對至少食蟹獼猴FLT3LG之結合親和力及針對人類FLT3LG之結合親和力差異不超過2、5、10、50或100之倍數。
親和力(亦稱作「結合親和力」)為在單一相互作用位點處之結合強度，即，一個分子，例如，本發明之抗原結合蛋白與另一分子(例如， FLT3LG)在單一結合位點處之結合強度。抗原結合蛋白與其標靶之結合親和力可藉由平衡方法(例如，使用酶聯免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA))或動力學(例如，BIACORE分析)測定。例如，如實例3中所述之SPR方法可用於量測結合親和力。
抗體親抗原性(Avidity) (亦稱作功能親和力)為在多個相互作用位點處之累積結合強度，例如，兩個分子(或更多個，例如，於雙特異性或多特異性分子之情況下)彼此在多個位點處之結合強度的加總，例如，考慮相互作用之價。
抗原結合蛋白-FLT3LG相互作用之平衡解離常數(KD)可為100 nM或更少、10 nM或更少、5 nM或更少、2 nM或更少、或1 nM或更少。或者，KD可介於5與10 nM之間或介於1與2 nM之間。KD可介於1 pM與500 pM之間或介於500 pM與1 nM之間。KD可介於100 pM與500 pM之間或介於100 pM與1 nM之間。KD可介於100 pM與2 nM之間或介於100 pM與5 nM之間。針對本文中之抗原結合蛋白，更小KD數值對應於與抗原(諸如FLT3LG)之更強結合。KD之倒數(即，1/KD)為平衡締合常數(KA)，及可表示為M -1。針對本文中之抗原結合蛋白，更大KA數值對應於與抗原(諸如FLT3LG)之更強結合。
解離速率常數(kd)或「解離速率」描述抗原結合蛋白-抗原(例如，FLT3LG)複合體之穩定性，即，每秒衰變之複合體之分率。例如，0.01 s -1之kd等於每秒衰變1%之複合體。抗原結合蛋白- FLT3LG相互作用之解離速率常數(kd)可為1 x 10 -3s -1或更少、1 x 10 -4s -1或更少、1 x 10 -5s -1或更少、或1 x 10 -6s -1或更少。或者，kd可介於1 x 10 -5s -1與1 x 10 -4s -1之間或介於1 x 10 -4s -1與1 x 10 -3s -1之間。或者，kd可介於1 x 10 -3s -1與1 x 10 -2s -1之間。
締合速率常數(ka)或「締合速率」描述抗原結合蛋白-抗原(例如，FLT3LG)複合體形成之速率。抗原結合蛋白- FLT3LG相互作用之ka可為約1.5 x 10 5M -1s -1。或者，ka可介於1 x 10 6M -1s -1與1 x 10 5M -1s -1之間。後者，ka可介於1 x 10 5M -1s -1與5 x 10 5M -1s -1之間或介於1 x 10 5M -1s -1與8 x 10 5M -1s -1之間。
於一些實例中，FLT3LG結合蛋白對野生型FLT3LG之結合親和力及對具有一或多個突變之變異體FLT3LG之結合親和力差異至少2、至少5、至少10、至少50或至少100之倍數。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可結合至野生型FLT3LG及不結合至具有一或多個胺基酸突變之變異體FLT3LG。變異體FLT3LG可為包含在位置72處之丙胺酸之FLT3LG。野生型FLT3LG可為hFLT3LG。變異體FLT3LG可為hFLT3LG。FLT3LG結合蛋白可以小於或等於2 nM之KD結合至野生型FLT3LG，及以大於或等於2 nM之KD結合至變異體FLT3LG。FLT3LG結合蛋白可以小於或等於1 nM之KD結合至野生型FLT3LG，及以大於或等於1 nM之KD結合至變異體FLT3LG。FLT3LG結合蛋白可以小於或等於500 pM之KD結合至野生型FLT3LG，及以大於或等於500 pM之KD結合至變異體FLT3LG。FLT3LG結合蛋白可以小於或等於500 pM之KD結合至野生型FLT3LG，及以大於或等於1 nM之KD結合至變異體FLT3LG。例如，FLT3LG結合蛋白可以小於或等於500 pM之KD結合至野生型hFLT3LG，及以大於或等於1 nM之KD結合至包含在位置72處之丙胺酸之變異體hFLT3LG。FLT3LG結合蛋白可以大於或等於2 nM之KD結合至野生型FLT3LG，及以小於或等於2 nM之KD結合至變異體FLT3LG。FLT3LG結合蛋白可以大於或等於1 nM之KD結合至野生型FLT3LG，及以小於或等於1 nM之KD結合至變異體FLT3LG。FLT3LG結合蛋白可以大於或等於500 pM之KD結合至野生型FLT3LG，及以小於或等於500 pM之KD結合至變異體FLT3LG。FLT3LG結合蛋白可以大於或等於100 pM之KD結合至野生型FLT3LG，及以小於或等於100 pM之KD結合至變異體FLT3LG。FLT3LG結合蛋白可以大於或等於500 pM之KD結合至野生型FLT3LG，及以小於或等於100 pM之KD結合至變異體FLT3LG。如本文中所用，「分離」可於提及分子，諸如抗原結合蛋白、抗原、核酸、肽或另一分子自產生其之環境、自可於自然中發現其之環境或自另一環境移除而使用。
本文中所述之抗原結合蛋白(例如，抗FLT3LG抗體)可藉由一或多個經分離之核酸序列編碼。FLT3LG結合蛋白(諸如抗體)之產生可於細胞或活有機體中藉由遞送編碼FLT3LG結合蛋白(例如，抗體之重鏈及輕鏈)之外源經分離之核酸達成。FLT3LG結合蛋白(諸如抗體)之產生可於細胞中於活體外或於活體內藉由遞送編碼FLT3LG結合蛋白(例如，抗體之重鏈及輕鏈)之外源經分離之核酸達成。有需要個體可經遞送一或多種編碼本文中提供之抗原結合蛋白(諸如抗FLT3LG抗體之重鏈及輕鏈)之核酸。抗體之重鏈及輕鏈可藉由相同或分開核酸遞送。該等核酸可為DNA或RNA。可將編碼FLT3LG結合蛋白之核酸裸露(即，不具有封裝粒子)或包裝(即，於脂質體或聚合物基媒劑中封裝)遞送至個體。編碼FLT3LG結合蛋白之核酸可不利用遞送媒劑(即，「裸露」)遞送或利用病毒或非病毒遞送媒劑(即，作為於脂質體或聚合物基媒劑中吸附或封裝之病毒載體及類似者)遞送。該核酸可包括諸如poly-A尾、5’及/或3’未轉譯區(UTR)之元件。該等核酸可為mRNA。mRNA可包含帽結構。mRNA可為自我複製RNA。
編碼FLT3LG結合蛋白之核酸可經修飾或未經修飾。編碼FLT3LG結合蛋白之核酸可包含至少一個化學修飾。核酸(例如，mRNA)可經修飾以藉由包含一或多個化學修飾來增強穩定性。此等化學修飾包括(但不限於)經修飾之核苷酸、經修飾之糖骨架及類似者。本文中亦提供一種於細胞、組織或有機體中產生FLT3LG結合蛋白之方法，其包括使該細胞、組織或有機體與包含包含至少一個化學修飾且編碼FLT3LG結合蛋白之經分離之核酸的組合物接觸。本文中亦提供一種於細胞、組織或有機體中產生FLT3LG結合蛋白之方法，其包括使該細胞、組織或有機體與包含包含至少一個化學修飾且編碼FLT3LG結合蛋白之多核苷酸之組合物接觸。本文中亦提供一種於細胞中於活體外或於活體內產生FLT3LG結合蛋白之方法，其包括使該細胞與包含包含至少一個化學修飾且編碼FLT3LG結合蛋白之核酸之組合物接觸。
本文中亦提供表現載體，其中表現載體可為經分離之核酸，其可用於將所關注之核酸引入細胞(諸如真核細胞或原核細胞)或無細胞表現系統(其中所關注之核酸序列以肽鏈，諸如蛋白質表現)中。所關注之核酸可包含本文中提供之抗原結合蛋白或其片段之核酸序列。此等表現載體可為(例如)包含所關注之核酸之黏粒、質粒、病毒序列、轉位子及線性核酸。一旦將表現載體引入細胞或無細胞表現系統(例如，網織紅細胞裂解物)中，藉由所關注之核酸編碼之蛋白質就藉由轉錄/轉譯機器產生。本發明範圍內之表現載體可提供真核細胞或原核細胞表現之必要元件及包括病毒啟動子驅動載體(諸如CMV啟動子驅動載體，例如，pcDNA3.1、pCEP4及其衍生物)、桿狀病毒(Baculovirus)表現載體、果蠅( Drosophila)表現載體及藉由哺乳動物基因啟動子(諸如人類Ig基因啟動子)驅動之表現載體。其他實例包括原核細胞表現載體，諸如T7啟動子驅動載體(例如，pET41)、乳糖啟動子驅動載體及阿拉伯糖基因啟動子驅動載體。一般技術者應知曉許多其他適宜表現載體及表現系統。
本文中亦提供重組宿主細胞。如本文中所用，術語「重組宿主細胞」係指包含所關注之核酸序列之細胞，該核酸序列在將其引入細胞中之前經分離。例如，所關注之核酸序列可於表現載體中，而細胞可為原核細胞或真核細胞。示例性真核細胞為哺乳動物細胞，諸如(但不限於) COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、HepG2、653、SP2/0、NS0、293、HeLa、黑色素瘤、淋巴瘤細胞或其任何衍生物。真核細胞可為HEK293、NS0、SP2/0或CHO細胞。大腸桿菌( E. coli)為示例性原核細胞。根據本發明之重組細胞可藉由轉染、細胞融合、永生或此項技術中熟知之其他程序產生。轉染至細胞中之所關注之核酸(諸如表現載體)可經染色體外或穩定整合至細胞之染色體中。
本文中亦提供抗原結合蛋白之互補決定區(CDR)胺基酸序列。此等為本文中之抗原結合蛋白之高可變區，諸如免疫球蛋白重鏈及輕鏈。通常，於抗原結合蛋白(諸如免疫球蛋白)之可變部分中存在三條重鏈及三條輕鏈CDR (或CDR區)。因此，如本文中所用，「CDR」可係指抗原結合蛋白之三條重鏈CDR、抗原結合蛋白之三條輕鏈CDR、抗原結合蛋白之所有重鏈及輕鏈CDR、或抗原結合蛋白之至少兩個CDR。
整篇本說明書，全長抗原結合序列內(例如，抗體重鏈序列或抗體輕鏈序列內)之可變域序列及可變域區域中之胺基酸殘基係根據Kabat編號慣例編號。相似地，用於實例中之術語「CDR」、「CDRL1」、「CDRL2」、「CDRL3」、「CDRH1」、「CDRH2」及「CDRH3」按照Kabat編號慣例。針對進一步資訊，參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)。
存在可變域序列及全長抗體序列中之胺基酸殘基之替代編號慣例。整篇本說明書，Fc區、抗體序列或全長抗原結合蛋白序列中之胺基酸殘基係根據EU索引編號慣例編號。
亦存在CDR序列之替代編號慣例，例如，Chothia等人(1989) Nature 342: 877-883中闡述之彼等。抗原結合蛋白之結構及蛋白質折疊可意指認為其他殘基為CDR序列之部分及將由熟習者理解為如此。
為熟習者可得之CDR序列之其他編號慣例包括「AbM」 (巴斯大學(University of Bath))及「contact」 (倫敦大學學院(University College London))方法。SEQ ID NO: 1-4及SEQ ID NO: 9-12之CDR區可藉由任何編號慣例(例如，Kabat、Chothia、AbM及contact慣例)定義。
下表1表示使用CDR之各編號慣例或本文中提供之結合單元的一個定義。於表1中使用Kabat編號方案以將可變域胺基酸序列編號。應注意，CDR定義可取決於所用之個別出版物變化。 表 1 ： CDR 編號
Kabat      CDR Chothia CDR AbM CDR Contact CDR
HH1 31-35/35A/35B 26-32/33/34 26-35/35A/35B 30-35/35A/35B
HH2 50-65 52-56 50-58 47-58
HH3 95-102 95-102 95-102 93-101
LL1 24-34 24-34 24-34 30-36
LL2 50-56 50-56 50-56 46-55
LL3 89-97 89-97 89-97 89-96
本文中提供FLT3LG結合蛋白，其包含選自以下之CDR中之任一者或組合： 1. SEQ ID NO: 17之CDRH1、SEQ ID NO: 18之CDRH2、SEQ ID NO: 19之CDRH3、SEQ ID NO: 29之CDRL1、SEQ ID NO: 30之CDRL2、及SEQ ID NO: 31之CDRL3； 2. SEQ ID NO: 20之CDRH1、SEQ ID NO: 21之CDRH2、SEQ ID NO: 22之CDRH3、SEQ ID NO: 32之CDRL1、SEQ ID NO: 33之CDRL2、及SEQ ID NO: 34之CDRL3； 3. SEQ ID NO: 23之CDRH1、SEQ ID NO: 24之CDRH2、SEQ ID NO: 25之CDRH3、SEQ ID NO: 35之CDRL1、SEQ ID NO: 36之CDRL2、及SEQ ID NO: 37之CDRL3； 或 4. SEQ ID NO: 26之CDRH1、SEQ ID NO: 27之CDRH2、SEQ ID NO: 28之CDRH3、SEQ ID NO: 38之CDRL1、SEQ ID NO: 39之CDRL2、及SEQ ID NO: 40之CDRL3。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含選自以下之所有6個CDR： 1. SEQ ID NO: 17之CDRH1、SEQ ID NO: 18之CDRH2、SEQ ID NO: 19之CDRH3、SEQ ID NO: 29之CDRL1、SEQ ID NO: 30之CDRL2、及SEQ ID NO: 31之CDRL3； 2. SEQ ID NO: 20之CDRH1、SEQ ID NO: 21之CDRH2、SEQ ID NO: 22之CDRH3、SEQ ID NO: 32之CDRL1、SEQ ID NO: 33之CDRL2、及SEQ ID NO: 34之CDRL3； 3. SEQ ID NO: 23之CDRH1、SEQ ID NO: 24之CDRH2、SEQ ID NO: 25之CDRH3、SEQ ID NO: 35之CDRL1、SEQ ID NO: 36之CDRL2、及SEQ ID NO: 37之CDRL3； 或 4. SEQ ID NO: 26之CDRH1、SEQ ID NO: 27之CDRH2、SEQ ID NO: 28之CDRH3、SEQ ID NO: 38之CDRL1、SEQ ID NO: 39之CDRL2、及SEQ ID NO: 40之CDRL3。
本文中提供之FLT3LG結合蛋白之CDR可藉由一個或超過一個胺基酸置換、缺失或添加修飾，其中該變異體FLT3LG結合蛋白實質上保留未經修飾之蛋白質之生物特性，諸如抑制FLT3LG至FLT3之結合。
應瞭解，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3各者可單獨或與任何其他CDR組合以任何排列或組合來修飾。CDR可藉由至多3個胺基酸(例如，1個或2個胺基酸，例如，1個胺基酸)之置換、缺失或添加來修飾。本文中提供之CDR、VH、VL或其他蛋白質之各修飾可為保守置換。修飾可為保守置換，例如，如下表2a或表2b中所示。 表 2a . 按 側鏈類型之保守置換之實例
側鏈 成員
疏水性 Met、Ala、Val、Leu、Ile
中性親水性 Cys、Ser、Thr
酸性 Asp、Glu
鹼性 Asn、Gln、His、Lys、Arg
影響鏈定向之殘基 Gly、Pro
芳族 Trp、Tyr、Phe
表 2b . 按 胺基酸之保守置換之實例
胺基酸 保守置換
A D、E、G、S、T
C G、R、S、W、Y
D A、E、G、H、N、V、Y
E A、D、G、K、Q、V
F I、L、Y
G A、C、D、E、R
H D、L、N、P、Q、R、Y
I F、L、M、N、V
K E、M、N、Q、R、T
L F、H、I、M、P、Q、R、V、W
M I、K、L、R、T、V
N D、H、I、K、S、T、Y
P H、L、Q、R、S
Q E、H、L、L、P、R
R C、G、H、K、L、M、P、Q、T、W
S A、C、N、P、T、W、Y
T A、K、M、N、R、S
V D、E、I、L、M
W C、L、R、S
Y C、D、F、H、N、S
例如，於變異體CDR中，包含CDR作為替代定義(例如，Kabat或Chothia)之部分之一或多個側接殘基可經保守胺基酸殘基置換。
包含如上所述之變異體CDR之此等抗原結合蛋白於本文中可稱作「功能CDR變異體」。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含： a.(i)選自SEQ ID NO: 1之CDRH1、CDRH2及/或CDRH3及/或SEQ ID NO: 9之CDRL1、CDRL2及/或CDRL3之CDR中之任一者或組合；或 (ii) (i)之CDR變異體，其中該變異體具有1、2或3個胺基酸修飾；或 b.包含與SEQ ID NO: 5之序列至少80%相同之序列之VH區及/或包含與SEQ ID NO: 13之序列至少80%相同之序列之VL區。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含： a.(i)選自SEQ ID NO: 2之CDRH1、CDRH2及/或CDRH3及/或SEQ ID NO: 10之CDRL1、CDRL2及/或CDRL3之CDR中之任一者或組合；或 (ii) (i)之CDR變異體，其中該變異體具有1、2或3個胺基酸修飾；或 b.包含與SEQ ID NO: 6之序列至少80%相同之序列之VH區及/或包含與SEQ ID NO: 14之序列至少80%相同之序列之VL區。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含： a.(i)選自SEQ ID NO: 3之CDRH1、CDRH2及/或CDRH3及/或SEQ ID NO: 11之CDRL1、CDRL2及/或CDRL3之CDR中之任一者或組合；或 (ii) (i)之CDR變異體，其中該變異體具有1、2或3個胺基酸修飾；或 b.包含與SEQ ID NO: 7之序列至少80%相同之序列之VH區及/或包含與SEQ ID NO: 15之序列至少80%相同之序列之VL區。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含： a.(i)選自SEQ ID NO: 4之CDRH1、CDRH2及/或CDRH3及/或SEQ ID NO: 12之CDRL1、CDRL2及/或CDRL3之CDR中之任一者或組合；或 (ii) (i)之CDR變異體，其中該變異體具有1、2或3個胺基酸修飾；或 b.包含與SEQ ID NO: 8之序列至少80%相同之序列之VH區及/或包含與SEQ ID NO: 16之序列至少80%相同之序列之VL區。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含選自SEQ ID NO: 17之CDRH1、SEQ ID NO: 18之CDRH2、SEQ ID NO: 19之CDRH3、SEQ ID NO: 29之CDRL1、SEQ ID NO: 30之CDRL2及/或SEQ ID NO: 31之CDRL3之CDR中之任一者或組合。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含選自SEQ ID NO: 20之CDRH1、SEQ ID NO: 21之CDRH2、SEQ ID NO: 22之CDRH3、SEQ ID NO: 32之CDRL1、SEQ ID NO: 33之CDRL2及/或SEQ ID NO: 34之CDRL3之CDR中之任一者或組合。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含選自SEQ ID NO: 23之CDRH1、SEQ ID NO: 24之CDRH2、SEQ ID NO: 25之CDRH3、SEQ ID NO: 35之CDRL1、SEQ ID NO: 36之CDRL2及/或SEQ ID NO: 37之CDRL3之CDR中之任一者或組合。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含選自SEQ ID NO: 26之CDRH1、SEQ ID NO: 27之CDRH2、SEQ ID NO: 28之CDRH3、SEQ ID NO: 38之CDRL1、SEQ ID NO: 39之CDRL2及/或SEQ ID NO: 40之CDRL3之CDR中之任一者或組合。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含人源化序列。人源化可藉由採用選自SEQ ID NO: 1之CDRH1、CDRH2及/或CDRH3及/或SEQ ID NO: 9之CDRL1、CDRL2及/或CDRL3之CDR中之任一者或組合及放入人類框架中來進行。人源化可藉由採用選自SEQ ID NO: 2之CDRH1、CDRH2及/或CDRH3及/或SEQ ID NO: 10之CDRL1、CDRL2及/或CDRL3之CDR中之任一者或組合及放入人類框架中來進行。人源化可藉由採用選自SEQ ID NO: 3之CDRH1、CDRH2及/或CDRH3及/或SEQ ID NO: 11之CDRL1、CDRL2及/或CDRL3之CDR中之任一者或組合及放入人類框架中來進行。人源化可藉由採用選自SEQ ID NO: 4之CDRH1、CDRH2及/或CDRH3及/或SEQ ID NO: 12之CDRL1、CDRL2及/或CDRL3之CDR中之任一者或組合及放入人類框架中來進行。
CDR L1、L2、L3、H1及H2可結構上展示許多主鏈構型中之一者。CDR之特定正規結構類別可藉由CDR之長度及環包裝二者定義，藉由位於CDR及框架區二者之關鍵位置處之殘基(結構測定殘基或SDR)確定。Martin及Thornton (1996; J Mol Biol 263:800-815)生成自動方法以定義「關鍵殘基」正規模板。使用簇分析定義CDR組之正規類別，及然後藉由分析埋藏之疏水性氫鍵結殘基及保守甘胺酸及脯胺酸來識別正規模板。抗體序列之CDR可藉由比較該等序列與關鍵殘基模板及將各模板使用同一性或相似性矩陣評分來指定為正規類別。
下表3中提供CDR規範之實例。所用胺基酸編號為Kabat。 表 3. CDR 規範
抗體 CDR CDR 定義
North IMGT Chothia
b1.126 H1 H1-13-A H1-8-A H1-7-A
H2 H2-9-A H2-7-A H2-5-A
L1 L1-12-A L1-7-A L1-12-A
L2 L2-8-A L2-3-A L2-7-A
L3 無 無 無
b1.017 H1 H1-13-A H1-8-A H1-7-A
H2 H2-9-A H2-7-A H2-5-A
L1 L1-11-A L1-6-A L1-11-A
L2 L2-8-A L2-3-A L2-7-A
L3 無 無 無
b1.021 H1 H1-13-A H1-8-A H1-7-C
H2 H2-10-A H2-8-A H2-6-A
L1 L1-11-A L1-6-A L1-11-A
L2 L2-8-A L2-3-A L2-7-A
L3 無 無 無
b1.078 H1 H1-13-A H1-8-A H1-7-A
H2 H2-10-B H2-8-B H2-6-B
L1 無 無 無
L2 L2-8-A L2-3-A L2-7-A
L3 無 無 無
(正規命名法[xx-yy-zz]：xx = CDR；yy =長度；zz =簇大小排序)
每CDR、每對應CDR、每結合單元、每重鏈或輕鏈可變區、每重鏈或輕鏈或每抗原結合蛋白可存在多個變異體CDR正規位置。因此，置換之任何組合可存在於本文中提供之抗原結合蛋白中，只要維持CDR之正規結構使得抗原結合蛋白能特異性結合FLT3LG。
如上所討論，CDR之特定正規結構類別可藉由CDR之長度及環包裝二者定義，藉由位於CDR及框架區二者之關鍵位置處之殘基確定。
如本文中所用，術語「抗原決定基」係指與本文中提供之抗原結合蛋白之特定結合域(即，抗體結合部位)接觸之抗原(例如，FLT3LG)的一部分。抗原決定基可為線性、構型或不連續。構型或不連續抗原決定基包含例如藉由一或多個其他胺基酸分離之胺基酸殘基，即，當藉由多肽鏈之三級折疊組裝時，不於抗原之一級序列中之連續序列中。雖然殘基可來自多肽鏈之不同區域，但是其可於抗原之三維結構中緊密靠近。例如，針對多聚體抗原，構型或不連續抗原決定基可包含來自不同肽鏈之殘基。包含於抗原決定基中之特定殘基可經由電腦建模程序或經由透過結構方法(諸如X-射線結晶學)獲得之一或多個三維結構測定。抗原決定基可使用抗原決定基定位，諸如藉由一或多種技術，例如，基於肽之方法，諸如肽掃描技術測定，藉此可使用一或多種技術(諸如ELISA)或藉由肽或蛋白質突變體之大庫(例如)在噬菌體上之活體外顯示篩選一系列重疊肽用於結合。詳細抗原決定基資訊可藉由結構技術，例如，X-射線結晶學、溶液核磁共振(NMR)光譜及低溫電子顯微鏡(cryo-EM)測定。誘變(諸如丙胺酸掃描)可為有效方法，藉此結合分析之損失可用於抗原決定基定位。另一方法為與蛋白水解及液相層析法質譜法(LC-MS)分析組合之氫/氘交換(HDX)以表徵不連續或構型抗原決定基。
本文中術語「抗原結合位點」係指能特異性結合至抗原(例如，FLT3LG)之抗原(例如，FLT3LG) 結合蛋白上之位點。抗原結合位點可為單可變域，或其可為成對一或多個VH/VL域，諸如抗體。單鏈Fv (ScFv)域亦可提供抗原結合位點。
在本文中所述之抗原(例如，FLT3LG)結合蛋白與參考FLT3LG結合蛋白(例如，參考抗體)之間之競爭可藉由熟習者已知之一或多種技術(諸如ELISA、FMAT、表面電漿共振(SPR)或FORTEBIO OCTET生物層干涉測量法(BLI))測定。此等技術可稱作抗原決定基分組(binning)。競爭分析可(例如)使用基於流動式細胞測量術之抗原決定基分組進行。例如，當兩個蛋白質結合至相同或重疊抗原決定基時，當存在結合之空間抑制時，或於第一蛋白質之結合誘導抗原之構型改變，其可防止或減少第二蛋白質之結合的情況下，競爭可發生。FLT3LG結合蛋白可結合至人類FLT3LG及與參考FLT3LG結合蛋白競爭結合至人類FLT3LG。參考FLT3LG結合蛋白可包含(a) SEQ ID NO: 5之VH區序列及SEQ ID NO: 13之VL區序列；(b) SEQ ID NO: 6之VH區序列及SEQ ID NO: 14之VL區序列；(c) SEQ ID NO: 7之VH區序列及SEQ ID NO: 15之VL區序列；(d) SEQ ID NO: 8之VH區序列及SEQ ID NO: 16之VL區序列。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白可與包含包含SEQ ID NO: 5之VH區及包含SEQ ID NO: 13之VL區；包含SEQ ID NO: 6之VH區及包含SEQ ID NO: 14之VL區；包含SEQ ID NO: 7之VH區及包含SEQ ID NO: 15之VL區；或包含SEQ ID NO: 8之VH區及包含SEQ ID NO: 16之VL區的參考FLT3LG結合蛋白共用重疊抗原決定基。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可與包含包含SEQ ID NO: 47之HC序列及包含SEQ ID NO: 55之LC序列；包含SEQ ID NO: 48之HC序列及包含SEQ ID NO: 56之LC序列；包含SEQ ID NO: 49之HC序列及包含SEQ ID NO: 57之LC序列；或包含SEQ ID NO: 50之HC序列及包含SEQ ID NO: 58之LC序列的參考FLT3LG結合蛋白共用重疊抗原決定基。
FLT3LG結合蛋白可為拮抗劑，諸如拮抗劑抗體。拮抗劑可包括抗原決定基結合蛋白，諸如能(例如)藉由完全或部分阻斷抗原與受體之結合或藉由中和活性(諸如可藉由抗原之生物活性啟動之信號傳導)而完全或部分抑制其結合之抗原之生物活性的抗體或其片段。
本文中FLT3LG結合蛋白可為中和。「中和」係指於活體外或於活體內與不存在FLT3LG結合蛋白下抗原之生物活性相比，在存在如本文中所述之FLT3LG結合蛋白下，抗原(例如，FLT3LG)之生物活性之減少或消除。中和可由於阻斷FLT3LG與其受體結合、預防FLT3LG活化其受體、下調FLT3LG或其受體、或影響效應功能中之一或多者。中和可使用一或多種分析(例如，如本文中所述)測定或量測。例如，實例3中所述之阻斷分析方法可用於評估本文中抗原結合蛋白之中和能力。
FLT3LG結合蛋白對FLT3LG與FLT3之間之相互作用之效應可係部分或完全。中和FLT3LG結合蛋白可將FLT3LG-FLT3相互作用(例如，結合)之活性相對於在不存在FLT3LG結合蛋白下之FLT3LG-FLT3相互作用中和至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可抑制人類FLT3LG與人類FLT3之相互作用70%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、或95%或更多。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可抑制可溶性FLT3LG與FLT3之結合70%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、或95%或更多。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可抑制膜結合FLT3LG與FLT3之結合70%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、或95%或更多。
在查詢核酸序列與標的核酸序列之間之「同一性百分比」或「同一性%」為以百分比表示之「同一性」值，其在查詢序列之長度上於使用適宜演算法(例如，Needleman-Wunsch或GenePAST/KERR)或軟體(例如，DNASTAR Lasergene或GenePAST/KERR)進行比對(諸如成對全域序列比對)後使用適宜演算法(例如，BLASTN、FASTA、Needleman-Wunsch、Smith-Waterman、LALIGN或GenePAST/KERR)或軟體(例如，DNASTAR Lasergene、GenomeQuest、EMBOSS針或EMBOSS infoalign)計算。查詢核酸序列可為本文中，特定言之申請專利範圍中之一或多者中所揭示之核酸序列。
在查詢胺基酸序列與標的胺基酸序列之間之「同一性百分比」或「同一性%」為以百分比表示之「同一性」值，其在查詢序列之長度上於使用適宜演算法(例如，Needleman-Wunsch或GenePAST/KERR)或軟體(例如，DNASTAR Lasergene或GenePAST/KERR)進行比對(諸如成對全域序列比對)後使用適宜演算法(例如，BLASTN、FASTA、Needleman-Wunsch、Smith-Waterman、LALIGN或GenePAST/KERR)或軟體(例如，DNASTAR Lasergene、GenomeQuest、EMBOSS針或EMBOSS infoalign)計算。查詢胺基酸序列可由本文中，特定言之申請專利範圍中之一或多者中所揭示之胺基酸序列描述。
查詢序列可與標的序列100%相同，或如與標的序列相比，其可包含至多整數個胺基酸或核苷酸更改，諸如同一性%小於100%。例如，查詢序列可與標的序列至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同。於核酸序列之情況下，此等更改可包含至少一個核苷酸殘基缺失、置換或插入，其中該等更改可在查詢序列之5’-或3’-端位置處，在彼等末端位置之間之一或多個位置處發生，在查詢序列之核苷酸殘基中或查詢序列內之一或多個相鄰基團中個別散佈。於胺基酸序列之情況下，此等更改可包含至少一個胺基酸殘基缺失、置換(包括保守及非保守置換)或插入，其中該等更改可在查詢序列之胺基或羧基端位置處或在彼等末端位置之間之一或多個位置處發生，在查詢序列之胺基酸殘基中或查詢序列內之一或多個相鄰基團中個別散佈。
針對抗體序列，同一性%可跨查詢序列之整個長度(包含CDR)測定。經計算之同一性%可不包括CDR中之一或多者或所有。例如，抗體之所有CDR可與標的序列100%相同，而查詢序列之其餘部分(例如，框架序列)之同一性%可小於100%，使得CDR序列經固定及完整。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 19、22、25或28中之任一者100%相同之CDRH3。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 19 100%相同之CDRH3。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 22 100%相同之CDRH3。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 25 100%相同之CDRH3。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 28 100%相同之CDRH3。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 17 100%相同之CDRH1；與SEQ ID NO: 18 100%相同之CDRH2；與SEQ ID NO: 19 100%相同之CDRH3；與SEQ ID NO: 29 100%相同之CDRL1；與SEQ ID NO: 30 100%相同之CDRL2；及/或與SEQ ID NO: 31 100%相同之CDRL3。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 20 100%相同之CDRH1；與SEQ ID NO: 21 100%相同之CDRH2；與SEQ ID NO: 22 100%相同之CDRH3；與SEQ ID NO: 32 100%相同之CDRL1；與SEQ ID NO: 33 100%相同之CDRL2；及/或與SEQ ID NO: 34 100%相同之CDRL3。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 23 100%相同之CDRH1；與SEQ ID NO: 24 100%相同之CDRH2；與SEQ ID NO: 25 100%相同之CDRH3；與SEQ ID NO: 35 100%相同之CDRL1；與SEQ ID NO: 36 100%相同之CDRL2；及/或與SEQ ID NO: 37 100%相同之CDRL3。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 26 100%相同之CDRH1；與SEQ ID NO: 27 100%相同之CDRH2；與SEQ ID NO: 28 100%相同之CDRH3；與SEQ ID NO: 38 100%相同之CDRL1；與SEQ ID NO: 39 100%相同之CDRL2；及/或與SEQ ID NO: 40 100%相同之CDRL3。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 17 100%相同之CDRH1；與SEQ ID NO: 18 100%相同之CDRH2；與SEQ ID NO: 19 100%相同之CDRH3；與SEQ ID NO: 29 100%相同之CDRL1；與SEQ ID NO: 30 100%相同之CDRL2；及與SEQ ID NO: 31 100%相同之CDRL3。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 20 100%相同之CDRH1；與SEQ ID NO: 21 100%相同之CDRH2；與SEQ ID NO: 22 100%相同之CDRH3；與SEQ ID NO: 32 100%相同之CDRL1；與SEQ ID NO: 33 100%相同之CDRL2；及與SEQ ID NO: 34 100%相同之CDRL3。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 23 100%相同之CDRH1；與SEQ ID NO: 24 100%相同之CDRH2；與SEQ ID NO: 25 100%相同之CDRH3；與SEQ ID NO: 35 100%相同之CDRL1；與SEQ ID NO: 36 100%相同之CDRL2；及與SEQ ID NO: 37 100%相同之CDRL3。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 26 100%相同之CDRH1；與SEQ ID NO: 27 100%相同之CDRH2；與SEQ ID NO: 28 100%相同之CDRH3；與SEQ ID NO: 38 100%相同之CDRL1；與SEQ ID NO: 39 100%相同之CDRL2；及與SEQ ID NO: 40 100%相同之CDRL3。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 5至少90%相同之VH區及與SEQ ID NO: 13至少90%相同之VL區。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 5至少95%相同之VH區及與SEQ ID NO: 13至少95%相同之VL區。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 6至少90%相同之VH區及與SEQ ID NO: 14至少90%相同之VL區。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 6至少95%相同之VH區及與SEQ ID NO: 14至少95%相同之VL區。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 7至少90%相同之VH區及與SEQ ID NO: 15至少90%相同之VL區。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 7至少95%相同之VH區及與SEQ ID NO: 15至少95%相同之VL區。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 8至少90%相同之VH區及與SEQ ID NO: 16至少90%相同之VL區。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 8至少95%相同之VH區及與SEQ ID NO: 16至少95%相同之VL區。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 5 100%相同之VH區及與SEQ ID NO: 13 100%相同之VL區；與SEQ ID NO: 6 100%相同之VH區及與SEQ ID NO: 14 100%相同之VL區；與SEQ ID NO: 7 100%相同之VH區及與SEQ ID NO: 15 100%相同之VL區；或與SEQ ID NO: 8 100%相同之VH區及與SEQ ID NO: 16 100%相同之VL區。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 5 100%相同之VH區及與SEQ ID NO: 13 100%相同之VL區。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 6 100%相同之VH區及與SEQ ID NO: 14 100%相同之VL區。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 7 100%相同之VH區及與SEQ ID NO: 15 100%相同之VL區。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 8 100%相同之VH區及與SEQ ID NO: 16 100%相同之VL區。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 47至少90%相同之重鏈(HC)序列及/或與SEQ ID NO: 55至少90%相同之輕鏈(LC)序列。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 47至少95%相同之重鏈(HC)序列及/或與SEQ ID NO: 55至少95%相同之輕鏈(LC)序列。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 48至少90%相同之重鏈(HC)序列及/或與SEQ ID NO: 56至少90%相同之輕鏈(LC)序列。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 48至少95%相同之重鏈(HC)序列及/或與SEQ ID NO: 56至少95%相同之輕鏈(LC)序列。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 49至少90%相同之重鏈(HC)序列及/或與SEQ ID NO: 57至少90%相同之輕鏈(LC)序列。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 49至少95%相同之重鏈(HC)序列及/或與SEQ ID NO: 57至少95%相同之輕鏈(LC)序列。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 50至少90%相同之重鏈(HC)序列及/或與SEQ ID NO: 58至少90%相同之輕鏈(LC)序列。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 50至少95%相同之重鏈(HC)序列及/或與SEQ ID NO: 58至少95%相同之輕鏈(LC)序列。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 47 100%相同之重鏈(HC)序列及/或與SEQ ID NO: 55 100%相同之輕鏈(LC)序列；與SEQ ID NO: 48 100%相同之重鏈(HC)序列及/或與SEQ ID NO: 56 100%相同之輕鏈(LC)序列；與SEQ ID NO: 49 100%相同之重鏈(HC)序列及/或與SEQ ID NO: 57 100%相同之輕鏈(LC)序列；或與SEQ ID NO: 50 100%相同之重鏈(HC)序列及/或與SEQ ID NO: 58 100%相同之輕鏈(LC)序列。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 47 100%相同之重鏈(HC)序列及/或與SEQ ID NO: 55 100%相同之輕鏈(LC)序列。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 48 100%相同之重鏈(HC)序列及/或與SEQ ID NO: 56 100%相同之輕鏈(LC)序列。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 49 100%相同之重鏈(HC)序列及/或與SEQ ID NO: 57 100%相同之輕鏈(LC)序列。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含與SEQ ID NO: 50 100%相同之重鏈(HC)序列及/或與SEQ ID NO: 58 100%相同之輕鏈(LC)序列。
本文中所提供之FLT3LG結合蛋白可包含為變異體胺基酸序列之序列。本文中所提供之FLT3LG結合蛋白之核酸序列可包含變異體核酸序列。本文中之變異體核酸序列可為本文中所提供之FLT3LG結合蛋白或其變異體之核酸序列。
VH或VL (或HC或LC)序列可為本文中提供之VH或VL (或HC或LC)序列之變異體序列，具有至多10個胺基酸置換、添加或缺失。此變異體序列可具有10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸置換、添加或缺失。
HC序列可為本文中提供之HC序列之變異體序列，具有至多40個胺基酸置換、添加或缺失。HC變異體序列可具有至多35個、至多30個、至多25個、至多20個、至多15個、或至多10個胺基酸置換、添加或缺失。HC變異體序列可具有10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸置換、添加或缺失。
LC序列可為本文中提供之LC序列之變異體序列，具有至多20個胺基酸置換、添加或缺失。LC變異體序列可具有至多15個、至多10個或至多5個胺基酸置換、添加或缺失。LC變異體序列可具有10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸置換、添加或缺失。
序列變化可不包括CDR中之一或多者或所有。例如，VH或VL (或HC或LC)序列之CDR部分可不含序列變化，及變化可存在於VH或VL (或HC或LC)序列之非CDR部分中，即，使得CDR序列完整。
變化可為置換，諸如保守置換，例如，如表2a或表2b中所提供。
具有變異體序列之抗原結合蛋白可實質上保留未經修飾之抗原結合蛋白之生物特性，諸如抑制FLT3LG與FLT3之結合。具有變異體序列之FLT3LG結合蛋白之結合性質(例如，KD、Kd或Ka)可與未經修飾之FLT3LG結合蛋白實質上相同。變異體序列之結合性質(例如，KD、Kd或Ka)可與未經修飾之FLT3LG結合蛋白至少75%、至少90%、至少95%或至少99%相同。
在於宿主細胞中產生抗原結合蛋白(諸如抗體)後，轉譯後修飾可發生。例如，轉譯後修飾可包括一或多個前導序列之裂解、一或多個糖部分(諸如)以糖基化形式之添加、非酶促糖基化、脫醯胺、氧化、二硫鍵混雜及其他半胱胺酸變異體(諸如包含游離巰基、外消旋二硫化物、硫醚及三硫鍵之彼等)、異構化、C-端離胺酸剪切及N-端麩胺醯胺環化。本文中本發明包含使用已經受或經歷一或多個轉譯後修飾之抗原結合蛋白。因此，本文中「抗原結合蛋白」或「抗體」可各自包含已經歷諸如本文中所述之轉譯後修飾之「抗原結合蛋白」或「抗體」。
轉譯後修飾可包括糖基化，其為在還原糖(諸如葡萄糖)與蛋白質中之游離胺基之間之轉譯後非酶促化學反應，及通常在離胺酸側鏈之ε胺或抗原結合蛋白之N端處觀察到。糖基化可在生產及儲存期間僅在存在還原糖下發生。
轉譯後修飾可包括脫醯胺，其可在生產及儲存期間發生，為主要將天冬醯胺(N)轉化成約3:1比率之異天冬胺酸(異天冬胺酸鹽)及天冬胺酸(天冬胺酸鹽) (D)之酶促反應。因此，此脫醯胺反應可與天冬胺酸鹽(D)至異天冬胺酸鹽之異構化相關。天冬醯胺之脫醯胺及天冬胺酸鹽之異構化均涉及中間體琥珀醯亞胺。在更小程度上，脫醯胺可利用麩胺醯胺殘基以相似方式發生。脫醯胺可(例如)於抗原結合蛋白之CDR中、Fab (非CDR區)中、或Fc區中發生。
轉譯後修飾可包括氧化，其可在生產及儲存期間(即，在存在氧化條件下)發生及可導致直接藉由反應性氧物質或間接藉由與氧化應力之二級副產物反應誘導之蛋白質之共價修飾。氧化可主要在甲硫胺酸殘基上發生。氧化可在色胺酸及游離半胱胺酸殘基處發生。氧化可於抗原結合蛋白之CDR中、Fab (非CDR區)中、或Fc區中發生。
轉譯後修飾可包括二硫鍵混雜，其可在生產及鹼性儲存條件期間發生。一或多個二硫鍵可斷裂或不正確形成，其可導致一或多個未成對半胱胺酸殘基(-SH)。此等游離(未成對)巰基(-SH)可促進抗原結合蛋白之洗牌。
轉譯後修飾可包括硫醚之形成及二硫鍵之外消旋化，其可在鹼性條件下，於生產或儲存中，透過經由脫氫丙胺酸及過硫化物中間體回到半胱胺酸殘基之二硫橋之β消除發生。脫氫丙胺酸及半胱胺酸之後續交聯可導致硫醚鍵之形成或游離半胱胺酸殘基可與抗原結合蛋白中之 D-及 L-半胱胺酸之混合物重新形成二硫鍵。
三硫化物自硫原子至二硫鍵之插入形成(Cys-S-S-S-Cys)及由於於生產細胞培養物中存在硫化氫而形成。
重鏈及/或輕鏈中之N-端麩胺醯胺(Q)或麩胺酸鹽(麩胺酸) (E)可能經由環化形成焦麩胺酸鹽(pGlu)。大多數pGlu形成於生產生物反應器中發生，但是其可非酶促形成，取決於製程及儲存條件之pH及溫度。N-端Q或E之環化通常可於天然人類抗體中觀察到。
C-端離胺酸剪取為藉由羧肽酶催化之酶促反應，及通常於重組及天然人類抗體中觀察到。此過程之變異體包括由於來自重組宿主細胞之細胞酶，離胺酸自一條或兩條重鏈之移除。向個體或人類患者投與可能導致任何剩餘C-端離胺酸之移除。
生產方法抗原結合蛋白可藉由許多習知技術中之任一者製備。例如，抗原結合蛋白可自一或多個天然表現其之細胞純化(例如，抗體可自產生其之雜交瘤純化)或於重組表現系統中產生。超過一種抗原結合蛋白可自此天然細胞或重組表現系統表現(及因此純化)。
許多不同表現系統及純化方案可用於產生抗原結合蛋白。一般而言，可將宿主細胞用編碼抗原結合蛋白之重組表現載體轉形。該表現載體可作為單獨遺傳元件藉由宿主維持或取決於表現系統整合至宿主染色體中。可採用廣泛宿主細胞，例如，原核細胞(包括革蘭氏(Gram)陰性或革蘭氏陽性細菌，例如，大腸桿菌( Escherichia coli)、桿菌屬( Bacilli sp.)、假單胞菌屬( Pseudomonas sp.)、棒狀桿菌屬( Corynebacterium sp.))；真核細胞，包括酵母(例如，釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)、畢赤酵母( Pichia pastoris))、真菌(例如，麯黴屬( Aspergilus sp.))或更高等真核細胞，包括昆蟲細胞及哺乳動物來源之細胞系(例如，CHO、NS0、PER.C6、HEK293、HeLa)。
宿主細胞可為經分離之宿主細胞。宿主細胞通常非多細胞有機體(例如，植物或動物)之一部分。例如，宿主細胞可為單細胞有機體，或可為多細胞有機體之個別細胞，其自該有機體分離。宿主細胞可為多細胞有機體(例如，植物或動物)之一部分。宿主細胞可為非人類宿主細胞。
適宜選殖及表現載體可經設計或工程改造以與細菌、真菌、酵母及哺乳動物宿主細胞使用。市售載體可經獲得及工程改造為用於表現本文中提供之FLT3LG結合蛋白之載體。
表現系統之細胞可在促進抗原結合蛋白之表現之條件下使用適宜設備中之一或多者(包括搖瓶、轉瓶及生物反應器)培養。抗原結合蛋白可藉由習知蛋白質純化程序或其修改回收。蛋白質純化程序可包含一系列單元操作，其包括經開發以選擇性分離及/或濃縮抗原結合蛋白之一或多個過濾或層析製程或其組合。經純化之抗原結合蛋白可呈醫藥上可接受之組合物調配。
可應用Fc工程改造方法以修改包含Fc區之抗原結合蛋白(諸如抗體)之功能或藥物動力學性質。與Fcy結合可促進ADCC活性；因此，ADCC活性可藉由於Fc區中製造突變來更改，該等突變可增加或減少與Fcy受體之結合。與C1q結合可促進CDC活性；因此，CDC活性可藉由於Fc區中製造突變來更改，該等突變可增加或減少與C1q受體之結合。亦可進行抗原結合蛋白之糖基化模式之修改以改變效應功能。抗原結合蛋白之活體內半衰期可藉由製造突變更改，該等突變影響Fc區與FcRn (新生兒Fc受體)之結合。
如本文中所用，術語「效應功能」係指一或多種抗原結合蛋白(例如，抗體)介導之效應，包括(但不限於)抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體介導之補體活化(包括補體依賴性細胞毒性(CDC))、補體依賴性細胞介導之吞噬(CDCP)、抗體依賴性補體介導之細胞溶解(ADCML)及Fc-介導之吞噬或抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)。
包含Fc區之抗原結合蛋白(諸如抗體)之Fc區與各種Fc受體(FcR)，包括FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)、FcγRIII (CD16)、FcRn、C1q及II型Fc受體之間之相互作用可介導抗原結合蛋白之效應功能。顯著生物效應可為效應功能之結果。介導效應功能之能力可需要抗原結合蛋白與抗原之結合。抗原結合蛋白可介導效應功能中之一者、複數者或各者。
效應功能可以許多方式評估，包括例如藉由評估自然殺手(NK)細胞經由FcγRIII或單核細胞/巨噬細胞經由FcγRI介導之包覆標靶細胞之抗體的ADCC效應功能，或藉由評估補體級聯經由C1q介導之包覆標靶細胞之抗原結合蛋白的CDC效應功能。例如，可於自然殺手細胞分析中評估本文中所述之抗原結合蛋白之ADCC效應功能。
可評估突變(包括Fc區中之突變)對效應功能(包括，但不限於，FcRn結合、FcγRs及C1q結合、CDC、ADCML、ADCC及/或ADCP)之作用。抗原結合蛋白可包含此等突變中之一或多者。
本文中提供之抗原結合蛋白之人類恆定區之一些同型，特別是IgG4及IgG2同型，可部分或完全缺少a)補體藉由經典路徑之活化及b) ADCC之功能。可取決於所需效應性質進行抗原結合蛋白之重鏈恆定區之各種修改以更改效應功能。已描述含有減少與Fc受體結合及減少效應功能(諸如ADCC及CDC)之特定突變之IgG1恆定區。
本文中提供包含恆定區之抗原結合蛋白使得該抗原結合蛋白具有減少之效應功能，諸如減少之ADCC及/或CDC。重鏈恆定區可包含IgG2或IgG4同型之天然失能恆定區或突變IgG1恆定區。適合修飾之非限制性實例述於EP0307434中。例如，恆定區可包含在位置235及237 (EU索引編號)經丙胺酸取代，即L235A及G237A (通常稱作「LAGA」突變)。其他實例可包括在位置234及235 (EU索引編號)經丙胺酸取代，即L234A及L235A (通常稱作「LALA」突變)。另外實例可包括在位置234、235及237 (EU索引編號)經丙胺酸取代，即L234A、L235A及G237A (稱作「LALAGA」突變)。其他實例，諸如於EP2691417及US8969526中所述，可包括Fc區(包含IgG1 Fc區)在位置329經甘胺酸或精胺酸取代(即P329G或P329R)與LALA突變組合(EU索引編號)。又另外實例可包括Fc區(包含IgG4 Fc區)在位置329經甘胺酸或精胺酸取代(即P329G或P329R)與在位置228經脯胺酸取代及在位置235經麩胺酸取代(即S228P及L235E) (EU索引編號)組合。
可採用以減少效應功能之其他突變可包括(除非另有指定，否則參考IgG1)：無糖基化N297A或N297Q或N297G；L235E；IgG4: F234A/L235A；或嵌合IgG2/IgG4。可採用包含H268Q/V309L/A330S/ P331S或V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S取代之IgG2以減少FcγR及/或C1q結合。
可採用以減少效應功能之其他突變可包括L234F/L235E/ P331S；使用來自人類IgG2之CH1及鉸鏈區及來自人類IgG4之CH2及CH3區產生之嵌合抗體；IgG2m4，基於IgG2同型與源自IgG4之四個關鍵胺基酸殘基變化(H268Q、V309L、A330S及P331S)；含有V234A/G237A / P238S/H268A/V309L/A330S/P331S取代以消除對Fcγ受體及C1q補體蛋白質之親和力之IgG2σ；IgG4 (S228P/L234A/L235A)；huIgG1 L234A/L235A (AA)；huIgG4 S228P/L234A/L235A；IgG1s (L234A/ L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S)；IgG4s1 (S228P/F234A/ L235A/G237A/P238S)；及IgG4s2 (S228P/F234A/L235A/DG236/ G237A/P238S，其中D表示缺失) (Tam等人，Antibodies 2017, 6(3))。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含包含N297G突變之IgG1恆定區。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含包含N297G突變之Fc區。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可包含包含SEQ ID NO: 41之Fc區。
半衰期(t 1/2)係指抗原結合蛋白之血清濃度達到其原始值之一半(即，在投與後達成之測定之血清濃度之一半)所需的時間。蛋白質之血清半衰期可藉由藥物動力學研究，例如，根據將放射標記蛋白質靜脈內注射至小鼠中之方法量測及以時間(例如，於注射後約3分鐘至約72小時)之函數定期量測其血漿濃度。可由熟習技工設想藥物動力學分析及測定分子半衰期之其他方法。
IgG抗體之長半衰期可取決於其與FcRn之結合。因此，可採用(例如)藉由將恆定區工程改造來增加IgG與FcRn在pH 6.0下之結合親和力，同時維持與標靶相互作用之pH依賴性的置換。本文中所述之抗原結合蛋白之活體內半衰期可(例如)藉由修飾重鏈恆定域或修飾其中FcRn結合域來更改。
於成人哺乳動物中，FcRn (亦稱作新生兒Fc受體)可藉由充當結合IgG同型抗體及挽救IgG同型抗體免於降解之保護性受體於維持血清抗體水平中起著關鍵作用。IgG分子藉由內皮細胞內吞，及若其結合至FcRn，則將離開細胞再循環回至循環中。相反地，進入細胞且未與FcRn結合之IgG分子經靶向至溶酶體路徑並在其中被降解。
FcRn可涉及抗體清除及跨組織之胞吞作用二者。測定與人類FcRn直接相互作用之人類IgG1殘基包括Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434及His435。可於本文中之抗原結合蛋白中採用此等位置中之任一者之突變(例如)以使能增加本文中提供之抗原結合蛋白之血清半衰期及/或更改本文中提供之抗原結合蛋白之效應性質。
本文中所述之抗原結合蛋白可具有增加恆定域或其片段對FcRn之親和力之胺基酸修飾。增加治療性及診斷性IgG抗體及其他生物活性分子之半衰期(即，血清半衰期)可提供效益，該等效益可包括降低此等分子之量及/或給藥頻率。抗原結合蛋白可包含具有下列胺基酸修飾中之一或多者之IgG恆定域之所有或一部分(FcRn結合部分)。
例如，參考IgG1，M252Y/S254T/T256E (通常稱作「YTE」突變)及M428L/N434S (通常稱作「LS」突變)可增加FcRn在pH 6.0下之結合。YTE或LS修飾可增加FcRn在高於6.0之pH或低於6.0之pH下之結合。
半衰期亦可藉由本文中提供之抗原結合蛋白中之T250Q/M428L、V259I/V308F/M428L、N434A及T307A/E380A/N434A突變(參考IgG1及Kabat編號)而增加。
半衰期及FcRn結合亦可藉由於本文中提供之抗原結合蛋白中引入H433K及N434F突變(通常稱作「HN」或「NHance」突變) (參考IgG1) (WO2006/130834)而增加。
本文中提供之抗原結合蛋白可包含具有更改之FcRn結合親和力之變異體Fc區，其可包含在Fc區之胺基酸位置238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439及447 (EU索引編號)中之任一者或多者處之胺基酸修飾。
包含抗原結合蛋白之IgG恆定域之經修飾之IgG可包含相對於野生型IgG恆定域之一或多個胺基酸修飾，其中該經修飾之IgG可具有與具有野生型IgG恆定域之IgG之半衰期相比之增加的半衰期，且其中一或多個胺基酸修飾係在位置251、253、255、285至290、308至314、385至389及428至435中之一或多者處。
可採用丙胺酸掃描誘變以更改本文中提供之抗原結合蛋白(例如，人類IgG1抗體)之Fc區中之殘基，及因此更改與人類FcRn之結合。當變成丙胺酸時可有效廢除與FcRn結合之位置包括I253、S254、H435及Y436。其他位置可導致當突變時結合之較不明顯減少，例如，如下：E233-G236、R255、K288、L309、S415及H433。當變成丙胺酸時，若干胺基酸位置可展示FcRn結合之改善；尤其此等包括P238、T256、E272、V305、T307、Q311、D312、K317、D376、E380、E382、S424及N434。其他胺基酸位置可展示FcRn結合之稍微改善(D265、N286、V303、K360、Q362及A378)或不改變(S239、K246、K248、D249、M252、E258、T260、S267、H268、S269、D270、K274、N276、Y278、D280、V282、E283、H285、T289、K290、R292、E293、E294、Q295、Y296、N297、S298、R301、N315、E318、K320、K322、S324、K326、A327、P329、P331、E333、K334、T335、S337、K338、K340、Q342、R344、E345、Q345、Q347、R356、M358、T359、K360、N361、Y373、S375、S383、N384、Q386、E388、N389、N390、K392、L398、S400、D401、K414、R416、Q418、Q419、N421、V422、E430、T437、K439、S440、S442、S444及K447)。
於本文中提供之一些抗原結合蛋白中，組合變異體可產生關於改善之FcRn結合之明顯效應。例如，至少在pH 6.0下，E380A/N434A變異體可顯示與FcRn結合相對於野生型IgG1之超過8倍增加，與針對E380A 2倍增加及針對N434A 3.5倍增加相比。T307A至此組合(E380A/N434A/T307A)之添加可導致結合相對於野生型IgG1之12倍增加。本文中所述之抗原結合蛋白可包含E380A/N434A或E380A/N434A/T307A突變及具有與FcRn增加之結合。
於本文中提供之一些抗原結合蛋白中，當取代位於跨Fc-FcRn介面之帶之殘基(例如，M252、S254、T256、H433、N434及Y436)或周圍之殘基(例如，V308、L309、Q311、G385、Q386、P387及N389)時，IgG1-人類FcRn複合體穩定性之改善可發生。可將M252Y/S254T/T256E (「YTE」)及H433K/N434F/Y436H突變組合以產生對人類FcRn之高親和力。於一些情況下，此組合可展示親和力相對於野生型IgG1之57倍增加。此突變之人類IgG1之活體內行為可展示如與野生型IgG1相比多達至少4倍之血清半衰期增加。此血清半衰期增加可於人類、食蟹獼猴或另一個體之血清中。
亦提供具有與FcRn最佳結合之抗原結合蛋白。抗原結合蛋白可包含該抗原結合蛋白之Fc區中之至少一個胺基酸修飾，例如，其中該修飾係在選自由以下組成之群之胺基酸位置處：Fc區之226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、311、315、317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、384、385、386、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401 403、404、408、411、412、414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446及447。FLT3LG結合蛋白可具有該FLT3LG結合蛋白之Fc區中之此等胺基酸修飾中之2、3、4、5、6者或更多者。FLT3LG結合蛋白可具有該FLT3LG結合蛋白之Fc區中之另一胺基酸位置處之胺基酸修飾，代替或除了本文中提供之胺基酸修飾。
FLT3LG結合蛋白可具有修改之半衰期，藉由將FcRn-結合多肽引入抗原結合蛋白中(例如，如WO97/43316、US5869046、US5747035、WO96/32478或WO91/14438中)，藉由將抗原結合蛋白與保留FcRn-結合親和力，但是極大減少對其他Fc受體之親和力之抗體融合(例如，如於WO99/43713中)，或藉由將抗原結合蛋白與抗體之FcRn結合域融合(例如，如於WO00/09560或US4703039中)。
本文中抗原結合蛋白可包含FcRn親和力增強之Fc變異體，其可改善在pH 6.0下之抗體細胞毒性及/或半衰期。此等IgG變異體可作為低岩藻糖基化分子產生。所得變異體可導致hFcRn小鼠中之增加之血清持久性，以及保留之增強之ADCC。示例性變異體可包括(參考IgG1及Kabat編號)：P230T/V303A/K322R/N389T/F404L/N434S、P228R/N434S、Q311R/K334R/Q342E/N434Y、C226G/Q386R/N434Y、T307P/N389T/N434Y、P230S/N434S、P230T/V305A/T307A/A378V/L398P/N434S、P23OT/P387S/N434S、P230Q/E269D/N434S、N276S/A378V/N434S、T307A/N315D/A330V/382V/N389T/N434Y、T256N/A378V/S383N/N434Y、N315D/A330V/N361D/A387V/N434Y、V259I/N315D/M428L/N434Y、P230S/N315D/M428L/N434Y、F241L/V264E/T307P/A378V/H433R、T250A/N389K/N434Y、V305A/N315D/A330V/P395A/N434Y、V264E/Q386R/P396L/N434S/K439R、或E294del/T307P/N434Y (其中「del」指示缺失)。
雖然恆定區中之置換可顯著提高抗原結合蛋白(諸如治療性IgG抗體)之功能，但是嚴格保守恆定區中之置換可於人類中產生免疫原性，而高度多樣可變區序列之置換可係更少免疫原性。本文中提供之抗原結合蛋白之CDR殘基可經工程改造以提高抗原結合蛋白與抗原(例如，FLT3LG)之親和力。CDR及/或框架殘基可經工程改造以提高本文中提供之抗原結合蛋白之穩定性及降低該抗原結合蛋白之免疫原性風險。對抗原(例如，FLT3LG)之提高之親和力可藉由親和力成熟使用隨機庫之噬菌體或核糖體展示達成。
本文中提供之抗原結合蛋白之提高之穩定性可自基於序列或結構之合理設計合理獲得。降低抗原結合蛋白之免疫原性風險(去免疫)可(例如)藉由一或多種人源化方法及/或移除潛在T-細胞抗原決定基實現，其於一些情況下可使用電腦模擬技術預測或藉由活體外分析預期。另外，抗原結合蛋白之可變區可經工程改造以降低抗體之等電點(pI)。針對抗原結合蛋白，更長半衰期可與與野生型抗原結合蛋白相比之此減少之pI相關聯，於一些情況下，儘管可比較FcRn結合。半衰期之相似增加可利用其他抗原結合蛋白達成。工程改造或選擇具有pH依賴性抗原結合之抗原結合蛋白可用於修改抗原結合蛋白及/或抗原(例如，FLT3LG)半衰期。例如，當結合至抗原時，若抗原介導之清除機制可降解抗體，則IgG2抗體之半衰期可縮短。相似地，抗原:抗體複合體可影響抗原(例如，FLT3LG)之半衰期，例如，藉由保護抗原免於典型降解過程而延長半衰期，或藉由經由抗體介導之降解(例如，標靶介導之藥物處置)而縮短半衰期。FLT3LG結合蛋白可具有在pH 7.4下如與內體pH (即，pH 5.5至6.0)相比對抗原更高親和力使得在pH 5.5/pH 7.4下或在pH 6.0/pH 7.4下之KD比率可為2或更高。例如，為增強抗原結合蛋白之藥物動力學(PK)及藥效學(PD)性質，與抗原結合蛋白之pH-敏感性結合可藉由引入一或多個組胺基酸殘基至CDR中之一或多者中來達成。
本文中之抗原結合蛋白可包含經工程改造之回收抗體使得單一抗體分子可與抗原結合多次。回收抗體可在酸性條件下於細胞內自抗原(例如，FLT3LG)解離。結合至膜結合抗原之抗體可以pH-依賴性方式自抗原解離。然後經解離之抗體可藉由FcRn再循環，同時抗原經轉移至溶酶體及降解。此機制可使抗體能於血漿中重複結合至其他抗原且降低抗體清除率。
抗原結合蛋白可包括掃除抗體，其可(例如)使用使抗體能於血漿中與抗原(例如，FLT3LG)結合及於內體中自抗原解離(之後抗原經歷溶酶體降解)之可變區工程改造(如上描述為「pH轉換」)及增加抗體-抗原複合體至內體介導(例如，透過FcRn)之FcγRIIb或潛在其他表面受體之細胞攝取之恆定區工程改造的組合工程改造。清除抗體可治療上靶向可溶性抗原(例如，FLT3LG)，增強抗原自循環之消除。於一些情況下，具有與FcRn之增強之結合之一組Fc變異體(包括M252Y、V308P或N434Y)中之一或多者，具有與FcRn之增強之結合與標靶抗原(例如，FLT3LG)之pH-依賴性結合組合可與野生型Fc區相比增強標靶抗原(例如，FLT3LG)之清除率。FcγRIIb可用於加速抗體-抗原複合體至細胞之攝取速率。FLT3LG結合蛋白可包括FcγRIIb清除抗體或其Fc區，其中pH‐依賴性抗體之Fc區可經工程改造以選擇性增加人類FcγRIIb結合以增強抗體-抗原複合體之攝取速率。此抑制性受體可介導抗體-抗原複合體至肝內皮細胞(LSEC)之攝取。因此，抗原結合蛋白(例如，抗體):抗原複合體至細胞之攝取藉由FcγRIIb (例如，人類FcγRIIb)之介導可降低抗原(例如，FLT3LG)於循環中之濃度。FLT3LG結合蛋白可包含包含下列突變：E233D/G237D/P238D/H268D/P271G/A330R之Fc變異體(v12)，及可具有對人類FcγRIIb之選擇性增加之結合親和力。於一些情況下，此v12變異體可加速抗原(例如，FLT3LG)之清除率優於具有野生型hIgG1之pH‐依賴性抗體，同時維持可比較藥物動力學。
醫藥組合物本文中提供醫藥組合物，其中醫藥組合物可包含本文中提供之抗原結合蛋白。本文中醫藥組合物可用於治療本文中所述之疾病(包括人類疾病)。該醫藥組合物可包含抗原結合蛋白，視情況與一或多種醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑組合。
此等組合物可包含醫藥上可接受之載劑，例如，如由目前醫藥實務所知及所需。
醫藥組合物可藉由注射或連續輸注經由可包括(例如)靜脈內、腹膜內、皮內、皮下、肌肉內、眼內、門內或另一途徑之途徑投與。醫藥組合物可適用於靜脈內投與。醫藥組合物可適用於皮下投與。醫藥組合物可適用於局部投與(其可包括(但不限於)經皮、鼻內或眼部投與)、吸入投與或經腸投與(其可包括(但不限於)口、陰道或直腸投與)。
本文中提供之醫藥組合物可包含有效量之抗原結合蛋白，諸如FLT3LG結合蛋白。醫藥組合物可包含介於0.5 mg與10 g之間之FLT3LG結合蛋白，及於一些情況下，可包含介於5 mg與1 g之間之FLT3LG結合蛋白。醫藥組合物可包含介於5 mg與500 mg之間之FLT3LG結合蛋白，及於一些情況下，可包含介於5 mg與50 mg之間之FLT3LG結合蛋白。醫藥組合物可包含介於0.5 mg與10 g之間、介於5 mg與1 g之間、介於5 mg與500 mg之間或介於5 mg與50 mg之間之包含包含SEQ ID NO: 47之HC及包含SEQ ID NO: 55之LC的FLT3LG結合蛋白。醫藥組合物可包含介於0.5 mg與10 g之間、介於5 mg與1 g之間、介於5 mg與500 mg之間或介於5 mg與50 mg之間之包含包含SEQ ID NO: 48之HC及包含SEQ ID NO: 56之LC的FLT3LG結合蛋白。醫藥組合物可包含介於0.5 mg與10 g之間、介於5 mg與1 g之間、介於5 mg與500 mg之間或介於5 mg與50 mg之間之包含包含SEQ ID NO: 49之HC及包含SEQ ID NO: 57之LC的FLT3LG結合蛋白。醫藥組合物可包含介於0.5 mg與10 g之間、介於5 mg與1 g之間、介於5 mg與500 mg之間或介於5 mg與50 mg之間之包含包含SEQ ID NO: 50之HC及包含SEQ ID NO: 58之LC的FLT3LG結合蛋白。醫藥組合物可包含介於0.5 mg與10 g之間、介於5 mg與1 g之間、介於5 mg與500 mg之間或介於5 mg與50 mg之間之包含包含SEQ ID NO: 63之HC及包含SEQ ID NO: 71之LC的FLT3LG結合蛋白。醫藥組合物可包含介於0.5 mg與10 g之間、介於5 mg與1 g之間、介於5 mg與500 mg之間或介於5 mg與50 mg之間之包含包含SEQ ID NO: 64之HC及包含SEQ ID NO: 72之LC的FLT3LG結合蛋白。醫藥組合物可包含介於0.5 mg與10 g之間、介於5 mg與1 g之間、介於5 mg與500 mg之間或介於5 mg與50 mg之間之包含包含SEQ ID NO: 65之HC及包含SEQ ID NO: 73之LC的FLT3LG結合蛋白。醫藥組合物可包含介於0.5 mg與10 g之間、介於5 mg與1 g之間、介於5 mg與500 mg之間或介於5 mg與50 mg之間之包含包含SEQ ID NO: 66之HC及包含SEQ ID NO: 74之LC的FLT3LG結合蛋白。醫藥組合物可包含介於0.5 mg與10 g之間、介於5 mg與1 g之間、介於5 mg與500 mg之間或介於5 mg與50 mg之間之超過一種本文中提供之FLT3LG結合蛋白各者。
醫藥組合物可包含於套組中，該套組含有抗原結合蛋白連同其他藥劑，及/或使用說明。出於便利，該套組可包含預先確定之量之試劑與使用說明。該套組亦可包含一或多種裝置，諸如注射器、針、一段管或可用於投與醫藥組合物之另一裝置。
術語「個體」、「受試者」及「患者」於本文中可互換使用。受試者可為動物。受試者可為哺乳動物，諸如靈長類動物，例如，狨或猴。受試者可為人類。
本文中所述之抗原結合蛋白亦可用於治療方法中。熟習此項技術者應瞭解，本文中提及治療係指確立之病狀之治療。然而，取決於病狀，本文中揭示之抗原結合蛋白亦可用於預防某些疾病。本文中所述之抗原結合蛋白以有效量用於治療性、預防性(prophylactic/preventative)治療。本文中所述之抗原結合蛋白之治療上有效量為有效改善或減少疾病之一或多種症狀，或預防或治癒疾病之量。
本文中提供治療有需要個體之自體免疫性疾病之方法，其包括向該個體投與治療上有效量之如本文中所定義之FLT3LG結合蛋白或醫藥組合物。該個體可為動物或人類。該個體可為人類。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白經提供用於療法中。FLT3LG結合蛋白經提供用於治療自體免疫性疾病。FLT3LG結合蛋白經提供用於治療自體免疫性疾病，其中該FLT3LG結合蛋白包含包含SEQ ID NO: 5之VH區及包含SEQ ID NO: 13之VL區。FLT3LG結合蛋白經提供用於治療自體免疫性疾病，其中該FLT3LG結合蛋白包含包含SEQ ID NO: 6之VH區及包含SEQ ID NO: 14之VL區。FLT3LG結合蛋白經提供用於治療自體免疫性疾病，其中該FLT3LG結合蛋白包含包含SEQ ID NO: 7之VH區及包含SEQ ID NO: 15之VL區。FLT3LG結合蛋白經提供用於治療自體免疫性疾病，其中該FLT3LG結合蛋白包含包含SEQ ID NO: 8之VH區及包含SEQ ID NO: 16之VL區。FLT3LG結合蛋白經提供用於治療自體免疫性疾病，其中該FLT3LG結合蛋白包含包含SEQ ID NO: 47之HC區及包含SEQ ID NO: 55之LC區。FLT3LG結合蛋白經提供用於治療自體免疫性疾病，其中該FLT3LG結合蛋白包含包含SEQ ID NO: 48之HC區及包含SEQ ID NO: 56之LC區。FLT3LG結合蛋白經提供用於治療自體免疫性疾病，其中該FLT3LG結合蛋白包含包含SEQ ID NO: 49之HC區及包含SEQ ID NO: 57之LC區。FLT3LG結合蛋白經提供用於治療自體免疫性疾病，其中該FLT3LG結合蛋白包含包含SEQ ID NO: 50之HC區及包含SEQ ID NO: 58之LC區。亦提供FLT3LG結合蛋白於製造用於治療自體免疫性疾病之藥劑中的用途。亦提供FLT3LG結合蛋白於製造用於治療自體免疫性疾病之藥劑中的用途，其中該FLT3LG結合蛋白包含包含SEQ ID NO: 5之VH區及包含SEQ ID NO: 13之VL區。亦提供FLT3LG結合蛋白於製造用於治療自體免疫性疾病之藥劑中的用途，其中該FLT3LG結合蛋白包含包含SEQ ID NO: 6之VH區及包含SEQ ID NO: 14之VL區。亦提供FLT3LG結合蛋白於製造用於治療自體免疫性疾病之藥劑中的用途，其中該FLT3LG結合蛋白包含包含SEQ ID NO: 7之VH區及包含SEQ ID NO: 15之VL區。亦提供FLT3LG結合蛋白於製造用於治療自體免疫性疾病之藥劑中的用途，其中該FLT3LG結合蛋白包含包含SEQ ID NO: 8之VH區及包含SEQ ID NO: 16之VL區。
亦提供一種治療有需要個體之自體免疫性疾病之方法，其包括向該個體投與治療上有效量之本文中所述之FLT3LG結合蛋白或醫藥組合物。亦提供一種治療有需要個體之自體免疫性疾病之方法，其包括向該個體投與治療上有效量之FLT3LG結合蛋白，其中該FLT3LG結合蛋白包含包含SEQ ID NO: 5之VH區及包含SEQ ID NO: 13之VL區。亦提供一種治療有需要個體之自體免疫性疾病之方法，其包括向該個體投與治療上有效量之FLT3LG結合蛋白，其中該FLT3LG結合蛋白包含包含SEQ ID NO: 6之VH區及包含SEQ ID NO: 14之VL區。亦提供一種治療有需要個體之自體免疫性疾病之方法，其包括向該個體投與治療上有效量之FLT3LG結合蛋白，其中該FLT3LG結合蛋白包含包含SEQ ID NO: 7之VH區及包含SEQ ID NO: 15之VL區。亦提供一種治療有需要個體之自體免疫性疾病之方法，其包括向該個體投與治療上有效量之FLT3LG結合蛋白，其中該FLT3LG結合蛋白包含包含SEQ ID NO: 8之VH區及包含SEQ ID NO: 16之VL區。可治療之考慮之疾病包括急性或慢性發炎性疾病，包括1型及2型糖尿病、慢性腎病(CKD) (包括由糖尿病引起之CKD)、糖尿病性腎病、高血壓、動脈粥樣硬化、阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)、癌症及此等疾病之相關併發症。可治療之另外考慮之疾病包括自體免疫性疾病，包括(但不限於) NIH之自體免疫性疾病列表，其包括(但不限於)斑禿、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫性肝炎、皮肌炎、糖尿病、腎小球腎炎(例如，IgA腎病)、肉芽腫病伴多發性腦炎、格雷夫氏病(Graves’ Disease)、吉蘭-巴雷(Guillain-Barre)症候群、特發性血小板減少性紫癜、青少年特發性關節炎、重症肌無力、心肌炎、多發性硬化(MS)、天疱瘡/類天疱瘡、惡性貧血、結節性多動脈炎、多發性肌炎、原發性膽汁性肝硬化、牛皮癬、類風濕性關節炎、硬皮病/全身性硬化、休格連氏症候群、全身性紅斑狼瘡(SLE)、甲狀腺炎、葡萄膜炎及白斑病。可治療之另外自體免疫性疾病包括(但不限於)自體免疫性新生兒血小板減少症、自體免疫性嗜中性白血球減少症、自體免疫性細胞減少症、抗磷脂症候群、皮膚炎、穀蛋白敏感性腸病、過敏性腦脊髓炎、復發性多軟骨炎、風濕性心臟病、神經炎、葡萄膜炎眼炎、多內分泌病變、紫癜(例如，Henoch-Schonlein紫癜)、瑞特氏病(Reiter's Disease)、僵硬人症候群、自體免疫性肺發炎、緻密沉積物病、風濕性心臟病、胰島素依賴性糖尿病及自體免疫性發炎性眼病、自體免疫性甲狀腺炎、甲狀腺功能減退(即，橋本氏(Hashimoto's)甲狀腺炎)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、盤狀狼瘡、古德帕斯特氏(Goodpasture's)症候群、天疱瘡、受體自體免疫(諸如，例如，(a)格雷夫氏病，(b)重症肌無力，及(c)胰島素抗性)、自體免疫性血小板減少性紫癜、具有抗膠原抗體之硬皮病、混合結締組織病、特發性愛迪生氏病(Addison's disease)、不孕、大疱性類天疱瘡、糖尿病及腎上腺素能藥物抗性(包括伴隨哮喘或囊性纖維化之腎上腺素能藥物抗性)、慢性活性肝炎、其他內分泌腺衰竭、血管炎、後MI、心臟切口術症候群、蕁麻疹、異位性皮膚炎、哮喘、發炎性肌病及其他發炎性、肉芽腫性、退行性、萎縮性病症、全身性硬化、全身性風濕性疾病、視覺神經炎、肌炎、硬皮病性狼瘡及重疊症候群。自體免疫性疾病可係急性或慢性且可影響基本上所有器官及身體系統。自體免疫性疾病可包括具有自身抗體、組織特異性自身抗原或非組織特異性自身抗原之疾病、膠原或結締組織病症及膠原血管疾病。更廣泛自體免疫性疾病列表亦可在www.autoimmuneinstitute.org/resources/autoimmune-disease-list (2023年9月8日最後一次訪問)及www.autoimmuneregistry.org/autoimmune-diseases (2023年9月8日最後一次訪問)上見到。
待治療之自體免疫性疾病可自增加之樹突狀細胞(DC)分化及生存經由FLT3LG-誘導之FLT3信號傳導產生。因此，本文中所述之FLT3LG結合蛋白可於治療自體免疫性疾病中有效，其中DC增強自體免疫反應。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可抑制可溶性FLT3LG與固定之FLT3受體之結合。可溶性FLT3LG結合至固定FLT3受體之FLT3LG結合蛋白抑制之半最大抑制濃度(IC50)可使用可溶性FLT3LG阻斷ELISA分析(例如，實例3B中所述之分析)測定。於一些實例中，FLT3LG結合蛋白可以小於或等於1 nM、小於或等於0.5 nM、小於或等於0.25 nM、小於或等於0.2 nM、或小於或等於0.1 nM之IC50抑制可溶性FLT3LG與固定FLT3受體之結合。
FLT3LG可以細胞表面膜結合形式及可溶性形式二者存在。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可結合至細胞表面FLT3LG。結合至細胞表面FLT3LG之FLT3LG結合蛋白之半最大有效濃度(EC50)可使用流動式細胞測量術細胞表面FLT3LG結合分析(例如，實例3D中所述之分析)測定。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可以小於或等於10 nM、小於或等於5 nM、小於或等於1 nM或小於或等於0.5 nM之EC50結合至293T-hFLT3LG細胞。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白可抑制可溶性FLT3LG與細胞表面FLT3受體之結合。可溶性FLT3LG結合至細胞表面FLT3受體之FLT3LG結合蛋白抑制之IC50可使用可溶性FLT3LG阻斷分析(例如，實例3E中所述之分析)測定。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可以小於或等於2 nM、小於或等於1.5 nM或小於或等於1 nM之IC50抑制可溶性FLT3LG與細胞表面FLT3受體之結合。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白可抑制可溶性FLT3LG-誘導之FLT3受體內化。可溶性FLT3LG-誘導之FLT3受體內化之FLT3LG結合蛋白抑制之IC50可使用FLT3內化流動式細胞測量術分析(例如，實例4A中所述之分析)測定。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可以小於或等於1 nM、小於或等於0.5 nM或小於或等於0.2 nM之IC50抑制可溶性FLT3LG-誘導之FLT3受體內化。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白可抑制膜結合FLT3LG-誘導之FLT3受體內化。膜結合FLT3LG-誘導之FLT3受體內化之FLT3LG結合蛋白抑制之IC50可使用FLT3內化流動式細胞測量術分析(例如，實例4B中所述之分析)測定。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可以小於或等於5 nM、小於或等於3 nM或小於或等於2 nM之IC50抑制膜結合FLT3LG-誘導之FLT3受體內化。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白可抑制藉由FLT3LG與FLT3受體之間之相互作用誘導之p-AKT信號傳導。FLT3表現細胞上之可溶性FLT3LG誘導之p-AKT信號傳導之FLT3LG結合蛋白抑制的IC50可使用p-AKT信號轉導分析(例如，實例5中所述之分析)量測。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可以小於或等於5 nM、小於或等於2 nM或小於或等於1.5 nM之IC50抑制藉由FLT3LG與FLT3受體之間之相互作用誘導之p-AKT信號傳導。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白可抑制可溶性FLT3LG誘導之DC分化。可溶性FLT3LG誘導之DC分化之FLT3LG結合蛋白抑制之IC50可使用DC分化分析(例如，實例6中所述之分析)量測。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可以小於或等於5 nM、小於或等於4 nM或小於或等於3 nM之IC50抑制可溶性FLT3LG誘導之DC分化。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白可結合至在人類T細胞上表現之內源FLT3LG。結合至在T細胞上表現之FLT3LG之GFLT3LG結合蛋白之EC50可使用流動式細胞測量術分析(例如，實例7中所述之分析)量測。本文中所述之FLT3LG結合蛋白可以小於或等於2 nM、小於或等於1.5 nM、小於或等於1 nM或小於或等於0.5 nM之EC50結合至人類T細胞。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白可減少脾中之hFLT3LG誘導之DC之數目及/或頻率。該等DC可為cDC、cDC1、cDC2、pDC及/或預pDC。FLT3LG結合蛋白對DC之數目及/或頻率之效應可使用活體內小鼠模型(例如，實例8中所述之活體內小鼠模型)測定。
本文中所述之FLT3LG結合蛋白可與FLT3LG二聚體形成複合體。例如，FLT3LG結合蛋白可形成2 FLT3LG 2: 2 mAb複合體。FLT3LG結合蛋白可形成具有2 FLT3LG 2: 2 mAb複合體之複合體，其中FLT3LG結合蛋白之Fab臂之間之角度大於90度、大於95度、大於100度、大於105度、大於110度、大於115度、大於120度、大於125度、大於130度、大於135度、大於140度、大於145度、大於150度、大於155度、或大於160度。
條項闡述本發明之另外實施例之條項係如下： 1.一種FLT3LG結合蛋白，其包含： a.(i)選自SEQ ID NO: 4之CDRH1、CDRH2及/或CDRH3及/或SEQ ID NO: 12之CDRL1、CDRL2及/或CDRL3之CDR中之任一者或組合； 選自SEQ ID NO: 1之CDRH1、CDRH2及/或CDRH3及/或SEQ ID NO: 9之CDRL1、CDRL2及/或CDRL3之CDR中之任一者或組合； 選自SEQ ID NO: 2之CDRH1、CDRH2及/或CDRH3及/或SEQ ID NO: 10之CDRL1、CDRL2及/或CDRL3之CDR中之任一者或組合；或 選自SEQ ID NO: 3之CDRH1、CDRH2及/或CDRH3及/或SEQ ID NO: 11之CDRL1、CDRL2及/或CDRL3之CDR中之任一者或組合； 或 (ii) (i)之CDR變異體，其中該變異體具有1、2或3個胺基酸修飾；或 b.包含與SEQ ID NO: 8之序列至少80%相同之序列之VH區及/或包含與SEQ ID NO: 16之序列至少80%相同之序列之VL區； 包含與SEQ ID NO: 5之序列至少80%相同之序列之VH區及/或包含與SEQ ID NO: 13之序列至少80%相同之序列之VL區； 包含與SEQ ID NO: 6之序列至少80%相同之序列之VH區及/或包含與SEQ ID NO: 14之序列至少80%相同之序列之VL區；或 包含與SEQ ID NO: 7之序列至少80%相同之序列之VH區及/或包含與SEQ ID NO: 15之序列至少80%相同之序列之VL區。 2.如條項1之FLT3LG結合蛋白，其中該a.(i)之CDR為： SEQ ID NO: 26之CDRH1、SEQ ID NO: 27之CDRH2、SEQ ID NO: 28之CDRH3、SEQ ID NO: 38之CDRL1、SEQ ID NO: 39之CDRL2、及/或SEQ ID NO: 40之CDRL3； SEQ ID NO: 17之CDRH1、SEQ ID NO: 18之CDRH2、SEQ ID NO: 19之CDRH3、SEQ ID NO: 29之CDRL1、SEQ ID NO: 30之CDRL2、及/或SEQ ID NO: 31之CDRL3； SEQ ID NO: 20之CDRH1、SEQ ID NO: 21之CDRH2、SEQ ID NO: 22之CDRH3、SEQ ID NO: 32之CDRL1、SEQ ID NO: 33之CDRL2、及/或SEQ ID NO: 34之CDRL3；或 SEQ ID NO: 23之CDRH1、SEQ ID NO: 24之CDRH2、SEQ ID NO: 25之CDRH3、SEQ ID NO: 35之CDRL1、SEQ ID NO: 36之CDRL2、及/或SEQ ID NO: 37之CDRL3。 3.如條項1或2之FLT3LG結合蛋白，其中所有6個CDR係存在於該結合蛋白中且選自： SEQ ID NO: 26之CDRH1、SEQ ID NO: 27之CDRH2、SEQ ID NO: 28之CDRH3、SEQ ID NO: 38之CDRL1、SEQ ID NO: 39之CDRL2、及SEQ ID NO:40之CDRL3； SEQ ID NO: 17之CDRH1、SEQ ID NO: 18之CDRH2、SEQ ID NO: 19之CDRH3、SEQ ID NO: 29之CDRL1、SEQ ID NO: 30之CDRL2、及SEQ ID NO: 31之CDRL3； SEQ ID NO: 20之CDRH1、SEQ ID NO: 21之CDRH2、SEQ ID NO: 22之CDRH3、SEQ ID NO: 32之CDRL1、SEQ ID NO: 33之CDRL2、及SEQ ID NO: 34之CDRL3；或 SEQ ID NO: 23之CDRH1、SEQ ID NO: 24之CDRH2、SEQ ID NO: 25之CDRH3、SEQ ID NO: 35之CDRL1、SEQ ID NO: 36之CDRL2、及SEQ ID NO: 37之CDRL3。 4.一種FLT3LG結合蛋白，其包含選自下列之6個CDR： SEQ ID NO: 26之CDRH1、SEQ ID NO: 27之CDRH2、SEQ ID NO: 28之CDRH3、SEQ ID NO: 38之CDRL1、SEQ ID NO: 39之CDRL2、及SEQ ID NO:40之CDRL3； SEQ ID NO: 17之CDRH1、SEQ ID NO: 18之CDRH2、SEQ ID NO: 19之CDRH3、SEQ ID NO: 29之CDRL1、SEQ ID NO: 30之CDRL2、及SEQ ID NO: 31之CDRL3； SEQ ID NO: 20之CDRH1、SEQ ID NO: 21之CDRH2、SEQ ID NO: 22之CDRH3、SEQ ID NO: 32之CDRL1、SEQ ID NO: 33之CDRL2、及SEQ ID NO: 34之CDRL3；或 SEQ ID NO: 23之CDRH1、SEQ ID NO: 24之CDRH2、SEQ ID NO: 25之CDRH3、SEQ ID NO: 35之CDRL1、SEQ ID NO: 36之CDRL2、及SEQ ID NO: 37之CDRL3。 5.如條項4之FLT3LG結合蛋白，其中該結合蛋白包含： 與SEQ ID NO: 8至少80%相同之VH區及與SEQ ID NO: 16至少80%相同之VL區； 與SEQ ID NO: 5至少80%相同之VH區及與SEQ ID NO: 13至少80%相同之VL區； 與SEQ ID NO: 6至少80%相同之VH區及與SEQ ID NO: 14至少80%相同之VL區；或 與SEQ ID NO: 7至少80%相同之VH區及與SEQ ID NO: 15至少80%相同之VL區。 6.如前述條項中任一項之FLT3LG結合蛋白，其中該結合蛋白包含： 與SEQ ID NO: 50至少80%相同之重鏈(HC)序列及/或與SEQ ID NO: 58至少80%相同之LC序列； 與SEQ ID NO: 47至少80%相同之HC序列及/或與SEQ ID NO: 55至少80%相同之輕鏈(LC)序列； 與SEQ ID NO: 48至少80%相同之HC序列及/或與SEQ ID NO: 56至少80%相同之LC序列；或 與SEQ ID NO: 49至少80%相同之HC序列及/或與SEQ ID NO: 57至少80%相同之LC序列。 7.如前述條項中任一項之FLT3LG結合蛋白，其中該結合蛋白以小於或等於1 nM之KD結合至人類FLT3LG。 8.如前述條項中任一項之FLT3LG結合蛋白，其中該結合蛋白以約2 nM或更少之IC50抑制可溶性FLT3LG誘導之p-AKT信號傳導。 9.如前述條項中任一項之FLT3LG結合蛋白，其中該結合蛋白以約1 nM或更少之IC50抑制可溶性FLT3LG誘導之FLT3受體內化。 10.一種FLT3LG結合蛋白，其結合至人類FLT3LG及與參考FLT3LG結合蛋白競爭結合至人類FLT3LG，該參考FLT3LG結合蛋白包含： SEQ ID NO: 8之VH區序列及SEQ ID NO: 16之VL區序列； SEQ ID NO: 5之VH區序列及SEQ ID NO: 13之VL區序列； SEQ ID NO: 6之VH區序列及SEQ ID NO: 14之VL區序列；或 SEQ ID NO: 7之VH區序列及SEQ ID NO: 15之VL區序列。 11.如前述條項中任一項之FLT3LG結合蛋白，其中該結合蛋白為抗體或其抗原結合片段。 12.如條項11之FLT3LG結合蛋白，其中該抗體或其抗原結合片段抑制人類FLT3LG結合至FLT3。 13.如條項12之FLT3LG結合蛋白，其中該抗體或其抗原結合片段以約2 nM或更少之IC50抑制人類可溶性FLT3LG結合至FLT3。 14.如條項11至13中任一項之FLT3LG結合蛋白，其中該抗體或其抗原結合片段包含經修飾之Fc區。 15.如條項14之FLT3LG結合蛋白，其中該經修飾之Fc區包含胺基酸置換N297G (如根據EU索引編號)。 16.一種核酸序列，其編碼如前述條項中任一項中所定義之FLT3LG結合蛋白之HC及LC中之一者或二者。 17.如條項16之核酸序列，其中該序列包含編碼該HC之SEQ ID NO: 63-66中之任一者及/或編碼該LC之SEQ ID NO: 71-74中之任一者。 18.一種表現載體，其包含如條項16或17中所定義之核酸序列。 19.一種重組宿主細胞，其包含如條項16或17中所定義之該(等)核酸序列或如條項18中所定義之該(等)表現載體。 20.一種產生FLT3LG結合蛋白之方法，該方法包括將如條項19中所定義之宿主細胞在適用於該(等)核酸序列或表現載體之表現之條件下培養，藉此產生包含該FLT3LG結合蛋白之多肽。 21.一種藉由如條項20之方法產生之FLT3LG結合蛋白。 22.一種經工程改造以表現如條項1至15或21中任一項之FLT3LG結合蛋白的細胞系。 23.一種醫藥組合物，其包含如條項1至15或21中任一項中所定義之FLT3LG結合蛋白及醫藥上可接受之賦形劑。 24.一種治療有需要個體之自體免疫性疾病之方法，其包括向該個體投與治療上有效量之如條項1至15或21中任一項中所定義之FLT3LG結合蛋白或如條項23中所定義之醫藥組合物。 25.如條項24之方法，其中該自體免疫性疾病為全身性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關節炎(RA)、類肉瘤病、休格連氏症候群、或乳糜瀉。 26.如條項25之方法，其中該自體免疫性疾病為SLE。 27.如條項24或25之方法，其中該個體為人類。 28.如條項1至15或21中任一項中所定義之FLT3LG結合蛋白或如條項23中所定義之醫藥組合物，其用於療法中。 29.如條項1至15或21中任一項中所定義之FLT3LG結合蛋白或如條項23中所定義之醫藥組合物，其用於治療自體免疫性疾病。 30.如條項29之FLT3LG結合蛋白，其中該自體免疫性疾病為全身性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關節炎(RA)、類肉瘤病、休格連氏症候群、或乳糜瀉。
實例本發明之各種特徵及實施例於下列代表性實例中說明，該等實例意欲係說明性且非限制性。熟習此項技術者應容易理解，特定實例僅說明本發明，如於其後跟隨之申請專利範圍中更充分描述。本申請案中所述之每個實施例及特徵應瞭解為與其中含有之每個實施例可互換及可組合。
實例 1 ：抗 FLT3LG 抗體之產生及選擇此實例說明抗FLT3LG抗體使用B-細胞選殖技術之產生。
方法 A. 免疫接種將四隻雌性7週齡BALB/C及Swiss Webster小鼠用50 μg hFLT3LG蛋白質(R&D Systems，本文中稱作R&D，NS0細胞衍生，308-FKN/CF)免疫接種。R&D hFLT3LG不同於在位置72處之野生型可溶性hFLT3LG (UniProt寄存編號P49771.1)；R&D hFLT3LG具有丙胺酸突變，而野生型hFLT3LG具有甘胺酸。簡言之，將小鼠藉由每週腹膜內及皮下注射用與類鐸受體佐劑之混合物混合之200 μL重組hFLT3LG蛋白免疫接種。於4次免疫接種後，收集來自經免疫小鼠之血清以使用ELISA測試hFLT3LG特異性抗體效價。
B. B 細胞分選於最終加強5天後自經免疫之小鼠收穫脾及淋巴結及製備單細胞懸浮液。將B細胞濃化，然後將細胞用螢光團標記之抗體組及用Alexa647及Alexa488標記之hFLT3LG (R&D，NS0細胞衍生，308-FKN/CF)染色以分離hFLT3LG特異性B細胞。然後收集經染色細胞用於經由SONY MA900細胞分選器之細胞分選。收集經單轉儲(dump)通道 -/CD19 +/IgM -/hFLT3LG duel+染色之B細胞及處理用於10x基因組運行及根據製造商之說明定序。
C. 單細胞定序及序列分析將定序庫使用Illumina NextSeq定序儀結合mid輸出定序套組(Illumina，目錄號：20024904)定序。自定序資料使用Cell ranger軟體(10x基因組)收集VH及VL序列。進一步分析Cell ranger輸出以使能使用定製管線進行純系選擇，該管線： 1.將精確含有一個VH及一個VL序列之細胞之資料過濾， 2.將序列基於VH生殖系、CDRH3長度及CDRH3序列同一性分組至純系型， 3.計算由至少5個純系組成之純系型之共有序列及彼等純系型中之各純系與共有序列之漢明(hamming)距離，及 4.識別CDR之潛在序列傾向。
該分析識別屬於773種獨特純系型之具有成對VH及VL序列之3272個細胞。
自免疫庫序列，基於下列標準選擇124個純系用於基因合成及小規模表現： 1.較大純系型尺寸， 2.與純系型共有序列之小漢明距離，及 3. CDR序列之潛在序列傾向之最小數目。
D. 結合劑之小規模表現及純化來自hFL3LG B-細胞定序資料組之124種選定純系藉由DNA合成及轉錄活化PCR (TAP)作為嵌合人類IgG1/κ抗體產生。簡言之，合成具有5′-及3′-TAP通用序列之抗體可變區DNA (IDT DNA)。利用兩輪重疊PCR，將可變區DNA、啟動子DNA片段及重鏈或輕鏈恆定區末端DNA片段組裝及擴增以產生兩個單獨線性TAP產物，一個編碼重鏈及另一個編碼輕鏈。PCR產物藉由瓊脂糖凝膠電泳驗證及使用E-Z 96 Cycle Pure套組(Omega Biotek)純化。將以1:2比率之重鏈及輕鏈TAP片段使用ExpiFectamine™ 293轉染套組(Gibco，目錄號2401600)按照製造商之說明以3 mL規模瞬時共轉染至Expi293細胞中。將細胞培育6天，之後藉由離心收穫上清液及然後使用蛋白A層析法純化表現抗體。
實例 2 ：抗 FLT3LG 抗體之篩選及表徵此實例證實用於篩選及選擇抗FLT3LG抗體的方法，該等抗FLT3LG抗體有效阻斷FLT3LG與FLT3受體之間之相互作用，與膜結合hFLT3LG之結合及與cyno-FLT3LG之交叉反應。
A. 酶聯免疫吸附分析 (ELISA)為檢測結合至FLT3LG之抗體純系，在如實例1中產生及純化之TAP表現嵌合抗體上進行ELISA。
方法：將96孔微量滴定盤用1 μg/mL之hFLT3LG (R&D，NS0細胞衍生，308-FKN/CF)或獼猴FLT3LG (LSBIO，目錄號：G5864；NB獼猴-FLT3LG (UniProt條目：F6ZGW9與cyno-FLT3LG (Genebank條目：XP_005589969)相同)塗覆過夜，然後用300 μL含1%牛血清白蛋白之具有0.05%吐溫20之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS-T)阻斷2小時。將抗體(10 μg/mL)於阻斷緩衝液中稀釋及添加100 μL/孔並在室溫下培育1小時。然後，作為二級試劑以100 μL/孔添加於PBS-T中以1:5000稀釋之經辣根過氧化酶(HRP)標記之山羊抗人類IgG Fc抗體(Jackson ImmunoResearch，目錄號：109-035-098)。將ELISA板使用3, 3’, 5, 5’-四甲基聯苯胺(TMB)溶液顯影，及藉由添加50 μL 2M H 2SO 4停止反應。在VersaMax微板閱讀器上在450 nm下讀取吸光度。
結果：測試來自124個選定B細胞純系之116種TAP表現抗體與FLT3LG之結合。採用ELISA量測116種TAP表現抗體各者(10 μg/mL)與hFLT3LG (x-軸)及cyno-FLT3LG (y-軸)各者之結合，如圖1中所示。所有116種抗體顯示與hFLT3LG之特異性結合，及116種抗體中之106者亦顯示與cyno-FLT3LG之交叉結合活性(截止值為0.5；OD450)，於圖1之虛線框中指示。
B. 流動式細胞測量術 (FACS) 細胞表面結合分析為測定於ELISA分析中識別之顯示與hFLT3LG特異性結合之116種抗體是否亦結合至細胞表面表現FLT3LG，進行流動式細胞測量術細胞表面結合分析。
方法：將293T細胞慢病毒轉導以穩定且構成表現(序列NCBI NM_001459.4；UniProt P49771)。將穩定表現hFLT3LG之0.5 x 10 6個293T細胞在4℃下用100 μL抗FLT3LG抗體(10 μg/mL)/孔培育30分鐘。於初級抗體培育及洗滌後，將100 μL 1:100稀釋之PE-結合山羊抗人類IgG，F(ab')₂ (Jackson ImmunoResearch，目錄號109-116-097)抗體添加至細胞中及將混合物在4℃下培育30分鐘。於洗滌後，將細胞於100 μL DAPI中培育5分鐘用於活力染色。將經染色之細胞用4%多聚甲醛(PFA)固定及使用CYTOFLEX流式細胞計量測螢光染色信號。
結果：圖2說明抗體與hFLT3LG之結合，如於實例2A中經由ELISA所量測以及抗體與293T細胞上之細胞表面hFLT3LG之結合。在ELISA分析中顯示與hFLT3LG之特異性結合之116種抗體中，該等抗體中之112者亦顯示與膜結合hFLT3LG-過度表現293T細胞之結合。於圖2之虛線框中強調如藉由ELISA所量測結合至hFLT3LG之抗體及如藉由流動式細胞測量術所量測結合至膜結合hFLT3LG過度表現293T細胞之抗體。
C. 阻斷分析FLT3LG以2.31E-10 M之KD結合至FLT3受體，如藉由SPR所量測。為檢測阻斷可溶性hFLT3LG與hFLT3之結合之抗體，進行競爭性ELISA分析。
方法：將96-孔Maxisorp板用1 µg/m之抗hFLT3抗體(R&D，MAB812)於PBS中在4℃下塗覆過夜。將板用PBS-T阻斷緩衝液阻斷2小時。然後在板上捕獲hFLT3 (1 µg/mL) (R&D，368-ST/CF)及用預混合之經生物素化hFLT3LG (BT-hFLT3LG) (R&D，NS0細胞衍生，308-FKN/CF)在0.65 nM之預先確定之EC50下及抗FLT3LG抗體(100 nM)探測。結合BT-hFLT3LG係利用鏈黴抗生物素(streptavidin)-HRP結合物(THERMO SCIENTIFIC，目錄號：21140)檢測及用3, 3’, 5, 5’- 四甲基聯苯胺(TMB)受質顯影。於用50 μL 2M H 2SO 4淬滅後，在 VERSAMAX微板閱讀器上在450 nm下讀取吸光度。
結果：針對於競爭性ELISA分析中阻斷hFLT3LG與hFLT3結合之能力篩選116種hFLT3LG-反應性抗體，如圖3中所提供。與人類IgG1同型對照抗體相比，116種抗體中之55者在100 nM之抗體濃度下抑制hFLT3LG與hFLT3之結合大於50%，如由圖3中之虛線框所指示。
D. 食蟹獼猴交叉反應性分析為測定以上實例2C中識別之55種阻斷抗FLT3LG抗體與cyno-FLT3LG及hFLT3LG二者之交叉反應性及結合動力學，進行表面電漿共振(SPR)分析。
方法：藉由SPR量測使用BIACORE 8K儀器測定抗體締合及解離速率。藉由蛋白A晶片(CYTIVA，目錄號：29127556)捕獲含於HBS-P (0.01M HEPES，0.15M NaCl及0.05%表面活性劑P20)運行緩衝液中之0.5 μg/mL之各抗體。為量測結合動力學，將以3倍連續稀釋之100 nM至11 nM之hFLT3LG (R&D，NS0細胞衍生，308-FKN/CF)或cyno-FLT3LG (LSBIO，目錄號：G5864)以及用於基線減法之空白緩衝液以30 μL/分鐘注射120秒，接著10分鐘解離週期。蛋白A表面之再生在各運行循環之間經由10 mM甘胺酸(pH 1.5)以50 μL/分鐘達成。在25℃下進行此實例中之動力學實驗。
結果：55種阻斷抗體中之52者顯示與hFLT3LG之結合，及該等抗體中之48者顯示與cyno-FLT3LG之交叉結合，具有範圍自100 pm至40 nM之對hFLT3LG及cyno-FLT3LG二者之結合親和力(K D)，如圖4中所述。
E. 用於人源化之純系之向下選擇 (Down-selection)於哺乳動物細胞中合成、選殖及表現124個VH及VL DNA序列對。吾人發現124個純系中之116者提供穩健蛋白質表現，具有3 mL培養物中之約100 µg經純化IgG之中值產率。自於ELISA及SPR二者中顯示與膜結合hFLT3LG蛋白之結合以及與hFLT3LG及cyno-FLT3LG之結合之48種阻斷抗體，基於至少阻斷活性及hFLT3LG及cyno-FLT3LG結合親和力選擇15個純系用於人源化，及提供於表4中。 表 4 ： 針對人源化所選之15個純系之阻斷及結合性質
純系 ID ELISA 阻斷 IC50 (nM) hFLT3LG 結合 cyno-FLT3LG 結合
Ka (1/ms) Kd (1/s) K D(M) Ka (1/ms) Kd (1/s) K D(M)
b1.118 0.061 4.58E+05 9.79E-05 2.14E-10 2.20E+08 8.37E-01 3.81E-09
b1.121 0.064 4.33E+05 1.05E-04 2.43E-10 1.09E+06 2.82E-04 2.58E-10
b1.123 0.087 4.02E+05 1.41E-04 3.51E-10 2.64E+07 7.62E-02 2.88E-09
b1.126 0.098 3.71E+05 1.89E-04 5.10E-10 1.50E+06 1.50E-04 1.00E-10
b1.094 0.045 1.32E+05 2.52E-04 1.91E-09 7.36E+05 4.70E-04 6.39E-10
b1.095 0.055 9.63E+04 1.65E-04 1.72E-09 2.76E+05 1.46E-04 5.29E-10
b1.078 0.073 2.31E+05 2.55E-04 1.11E-09 5.69E+05 4.89E-04 8.60E-10
b1.015 0.070 2.79E+05 1.81E-04 6.50E-10 6.60E+05 5.22E-04 7.92E-10
b1.062 0.093 1.55E+05 8.54E-05 5.50E-10 8.41E+05 2.02E-03 2.40E-09
b1.017 0.057 2.89E+05 1.53E-04 5.31E-10 5.93E+05 1.17E-04 1.97E-10
b1.021 0.041 3.25E+05 1.40E-04 4.33E-10 1.30E+07 9.88E-03 7.63E-10
b1.039 0.049 4.14E+05 1.26E-04 3.04E-10 1.13E+06 6.97E-03 6.19E-09
b1.038 0.041 4.83E+05 1.14E-04 2.37E-10 1.62E+07 1.01E-02 6.22E-10
b1.054 0.048 8.02E+05 1.89E-04 2.36E-10 8.52E+09 4.64E+00 5.45E-10
b1.004 1.574 1.26E+06 1.33E-04 1.05E-10 4.00E+05 3.50E-04 8.75E-10
實例 3 ：候選抗 FLT3LG 抗體之人源化及表徵將於實例2中向下選擇之15種抗FLT3LG抗體(b1.118、b1.121、b1.123、b1.126、b1.094、b1.095、b1.078、b1.015、b1.062、b1.017、b1.021、b1.039、b1.038、b1.054及b1.004)人源化以得到針對FLT3LG之15種人源化抗體(h_b1.118、h_b1.121、h_b1.123、h_b1.126、h_b1.094、h_b1.095、h_b1.078、h_b1.015、h_b1.062、h_b1.017、h_b1.021、h_b1.039、h_b1.038、h_b1.054及h_b1.004)。
合成選定人源化抗體序列及選殖至含有人類之IgG1 (N297G)重鏈或κ輕鏈恆定區之哺乳動物表現載體中。將Expi293細胞用該等載體轉染用於抗體表現及純化。
A. 人源化抗 FLT3LG 抗體之 SPR 分析為測定選定15種重組人源化抗FLT3LG抗體純系之結合動力學/親和力，如下所述進行SPR。
方法：經由SPR使用BIACORE 8K儀器如上實例2D中所述測定人源化抗體組之締合及解離速率。在25℃或37℃下進行動力學實驗。
除了以上提及之結合形式，經由第二種形式使用BIACORE 8K 儀器測定人源化抗體與hFLT3LG之兩種不同來源(R&D，NS0細胞衍生，308-FKN/CF，或Acrobiosystems，FLL-H5223 (本文中稱作「Acro」) (僅選擇抗體))之結合動力學。注射經生物素化之hFLT3LG (BT-hFLT3LG) (0.2 μg/mL)及藉由經鏈黴抗生物素塗覆之Sensor CAP晶片(GE Healthcare，目錄號：2205463-AB)捕獲。將各抗體(100 nM於運行緩衝液中)於運行緩衝液中3倍連續稀釋及然後以50 µL/min注射120秒，接著解離10分鐘。將表面利用注射再生緩衝液(1M NaOH)再生。
結果：如上所述量測選定15種人源化抗體純系之Kon、Koff及KD值。15種人源化抗體在37℃下與hFLT3LG之結合動力學述於表5中，15種人源化抗體在25℃下與hFLT3LG之結合動力學述於表6中，15種人源化抗體在25℃下與cyno-FLT3LG之結合動力學述於表7中，及15種人源化抗體在25℃下與hFLT3LG (經生物素化之分析形式)之結合動力學述於表8(R&D hFLT3LG)及表9 (Acro hFLT3LG)中(僅選擇抗體)。利用「ND」表示具有與BT-hFLT3LG之極弱結合之抗體。利用「ND*」表示具有與晶片非特異性結合之抗體。 表 5 ： 15 種人源化抗體在 37℃ 下與 hFLT3LG 之結合動力學
純系名稱 BIACORE ，蛋白 A ， 37℃ ，重組 hIgG1 ， hFLT3LG
Kon (1/Ms) Koff (1/s) K D(M)
h_b1.004 6.22E+05 3.51E-04 5.64E-10
h_b1.015 9.42E+05 4.06E-04 4.32E-10
h_b1.017 5.70E+05 4.76E-04 8.35E-10
h_b1.021 8.63E+05 3.36E-04 3.89E-10
h_b1.038 1.07E+06 3.27E-04 3.05E-10
h_b1.039 1.14E+06 4.33E-04 3.81E-10
h_b1.054 1.26E+06 3.41E-04 2.71E-10
h_b1.062 3.54E+05 3.79E-04 1.07E-09
h_b1.078 7.50E+05 5.04E-04 6.72E-10
h_b1.094 4.77E+05 6.29E-04 1.32E-09
h_b1.095 1.50E+05 3.90E-04 2.60E-09
h_b1.118 1.02E+06 3.25E-04 3.17E-10
h_b1.121 8.55E+05 4.82E-04 5.63E-10
h_b1.123 1.10E+06 4.57E-04 4.16E-10
h_b1.126 1.56E+06 3.36E-04 2.14E-10
表 6 ： 15 種人源化抗體在 25℃ 下與 hFLT3LG 之結合動力學
純系名稱 BIACORE ，蛋白 A ， 25℃ ，重組 hIgG1 ， hFLT3LG
Kon (1/Ms) Koff (1/s) K D(M)
h_b1.004 2.71E+05 1.52E-04 5.63E-10
h_b1.015 5.18E+05 1.24E-04 2.40E-10
h_b1.017 2.29E+05 1.03E-04 4.52E-10
h_b1.021 5.48E+05 1.06E-04 1.94E-10
h_b1.038 7.20E+05 9.96E-05 1.38E-10
h_b1.039 6.73E+05 1.24E-04 1.84E-10
h_b1.054 8.71E+05 1.13E-04 1.30E-10
h_b1.062 2.18E+05 8.00E-05 3.67E-10
h_b1.078 4.30E+05 1.66E-04 3.87E-10
h_b1.094 2.86E+05 1.78E-04 6.22E-10
h_b1.095 9.62E+04 1.07E-04 1.11E-09
h_b1.118 6.91E+05 1.23E-04 1.78E-10
h_b1.121 3.97E+05 1.12E-04 2.83E-10
h_b1.123 5.86E+05 1.67E-04 2.84E-10
h_b1.126 7.70E+05 1.17E-04 1.52E-10
表 7 ： 15 種人源化抗體在 25℃ 下與 cyno-FLT3LG 之結合動力學
純系名稱 BIACORE ，蛋白 A ， 25℃ ， Cyno-FLT3LG ，抗體組
Kon (1/Ms) Koff (1/s) K D(M) 穩態親和力 (M)
h_b1.004 4.12E+05 1.73E-04 4.20E-10 -
h_b1.015 4.74E+05 1.46E-04 3.09E-10 -
h_b1.017 3.27E+05 9.17E-05 2.81E-10 -
h_b1.021 2.10E+06 3.04E-04 1.45E-10 -
h_b1.038 1.42E+07 5.00E-03 3.52E-10 -
h_b1.039 1.26E+10 3.05E+01 2.42E-09 3.70E-09
h_b1.054 1.32E+07 2.03E-03 1.54E-10 -
h_b1.062 1.13E+06 8.46E-04 7.48E-10 -
h_b1.078 7.42E+05 1.88E-04 2.53E-10 -
h_b1.094 7.92E+05 2.38E-04 3.01E-10 -
h_b1.095 1.27E+05 1.00E-04 7.91E-10 -
h_b1.118 2.81E+09 4.30E+00 1.53E-09 5.94E-09
h_b1.121 1.28E+06 8.62E-04 6.74E-10 -
h_b1.123 2.21E+07 2.73E-02 1.24E-09 -
h_b1.126 1.04E+06 1.06E-04 1.02E-10 -
表 8 ： 15 種人源化抗體在 25℃ 下與 hFLT3LG (BT-hFLT3LG ， R&D) 之結合動力學
純系名稱 BIACORE ， CAP ， 25℃ ，重組 huIgG1 ， BT-hFLT3LG (R&D)
Kon (1/Ms) Koff (1/s) K D(M)
h_b1.004 2.14E+05 7.97E-04 3.73E-09
h_b1.015 2.92E+05 1.58E-04 5.39E-10
h_b1.017 2.22E+05 3.43E-05 1.55E-10
h_b1.021 3.53E+05 3.21E-05 9.09E-11
h_b1.038 2.49E+05 4.05E-05 1.63E-10
h_b1.039 2.38E+05 1.29E-04 5.43E-10
h_b1.054 3.12E+05 1.31E-04 4.19E-10
h_b1.062 1.42E+05 4.07E-05 2.88E-10
h_b1.078 1.78E+05 2.88E-04 1.61E-09
h_b1.094 ND* ND* ND*
h_b1.095 ND ND ND
h_b1.118 2.58E+05 1.79E-04 6.94E-10
h_b1.121 2.17E+05 2.77E-04 1.28E-09
h_b1.123 2.88E+05 2.43E-05           8.45E-10
h_b1.126 6.40E+05 6.38E-05 9.96E-11
表 9 ： 10 種人源化抗體在 25℃ 下與 hFLT3LG (BT-hFLT3LG ， Acrobiosystems) 之結合動力學
純系名稱 BIACORE ， CAP ， 25℃ ，重組 huIgG1 ， BT-hFLT3LG (Acro)
Kon (1/Ms) Koff (1/s) K D (M)
h_b1.004 3.98E+05 5.46E-04 1.37E-09
h_b1.017 4.74E+05 5.03E-05 1.06E-10
h_b1.021 2.80E+06 2.54E-03 9.09E-10
h_b1.038 ND ND ND
h_b1.054 ND ND ND
h_b1.078 4.96E+05 1.56E-04 3.14E-10
h_b1.094 ND* ND* ND*
h_b1.095 1.08E+06 6.28E-04 5.81E-10
h_b1.121 ND ND ND
h_b1.126 2.97E+06 8.67E-04 2.92E-10
B. 人源化抗 FLT3LG 抗體之阻斷 ELISA為測定及比較15種選定人源化抗FLT3LG抗體在可溶性hFLT3LG與hFLT3之間之阻斷功效，進行競爭性ELISA分析。
方法：將96-孔Maxisorp板在4℃下用PBS中之1 µg/mL之市售抗hFLT3抗體(R&D，目錄號：MAB812)塗覆過夜及然後用PBS-T阻斷緩衝液阻斷2小時。然後在板上捕獲hFLT3 (1 µg/mL) (R&D，目錄號：368-ST/CF)，接著添加100 µL預先培育之經生物素化之hFLT3LG (BT-hFLT3LG) (R&D，NS0細胞衍生，308-FKN/CF) (BT-hFLT3LG在預先確定之EC80: 0.55 nM下)。以100 nM開始以3倍連續稀釋測試抗體。利用鏈黴抗生物素聚-HRP結合物(THERMO SCIENTIFIC，目錄號：21140)檢測結合之BT-hFLT3LG及用3, 3’, 5, 5’-四甲基聯苯胺(TMB)受質顯影。於用50 μL 2M H 2SO 4淬滅後，在VERSAMAX微板閱讀器上在450 nm下讀取吸光度。
結果：於競爭性ELISA分析中經滴定之人源化抗FLT3LG抗體對hFLT3LG與hFLT3受體之結合之抑制曲線提供於圖5小組A(所有15種人源化抗FLT3LG抗體)及小組B(4種選定人源化抗FLT3LG抗體之子集；評估15種抗體各者於四種不同分析(BIACORE結合分析(實例3A)、阻斷ELISA分析(實例3B)、受體內化分析(實例4)及p-AKT信號轉導分析(實例5)中之性能)中，及選擇來自抗原決定基分組A (h_b1.21)及箱D (h_b1.78)之一種抗體及來自箱C之兩種抗體(h_b1.17及h_b1.126)。將市售抗FLT3LG抗體(R&D，MAB608)用作實驗中之陽性對照。
所有15種人源化抗FLT3LG抗體抑制BT-hFLT3LG與經板捕獲之hFLT3受體之結合。針對各抗體計算IC50，及如表10中詳述，15種人源化抗FLT3LG抗體各展示0.03 nM至0.28 nM之範圍內之阻斷IC50。大多數人源化抗FLT3LG抗體顯示與MAB608 (0.04 nM)可比較的IC50。
C. 人源化抗 FLT3LG 抗體之抗原決定基分組 (binning)為測定15種選擇之人源化抗FLT3LG抗體是否結合至hFLT3LG上之相同或不同抗原決定基，進行基於流動式細胞測量術之抗原決定基分組分析。
方法：採取基於流動式細胞測量術之分析(Chan等人，SLAS Discov. 2018年8月：23 (7): 613-623)以測定人源化抗體研究組(panel)之抗原決定基分組。簡言之，將BT-hFLT3LG (R&D，NS0細胞衍生，308-FKN/CF)/LumAvidin珠粒(Luminex，定製Magplex-抗生物素蛋白(Avidin)微球)用作為參考抗體之15種人源化抗FLT3LG抗體以5 μg/mL預先塗覆，1.25 × 10 6個珠粒/mL，在RT下45分鐘。然後將珠粒用FACS緩衝液洗2次，匯集，及將濃度調整至1.25 × 10 6個總珠粒/mL。將人源化抗體研究組(panel)轉移至96孔V底板以20 μL/孔(最終3.3 μg/mL)，接著添加40 μL經匯集之珠粒(各珠5000個/孔)，及在室溫培育45分鐘。然後將珠粒用FACS緩衝液洗2次，及然後在室溫使用FITC結合之山羊抗人類IgG Fc抗體(Jackson ImmunoResearch，目錄號：109-135-098)以5 μg/mL最終濃度，50 μL/孔檢測結合抗體15分鐘。然後將珠粒用FACS緩衝液洗1次，再懸浮於50 μL中，及在CYTOFLEX細胞計數器上讀取。僅具有參考抗體之匯集珠粒包含於分析中以使能計算超過參考抗體之二級抗體。各抗體相對於參考抗體之結合係藉由總螢光信號減去參考螢光信號來測定(淨流動式細胞測量術幾何平均值=研究組抗體(Ab)及參考Ab總幾何平均值–參考Ab幾何平均值)。各抗體之此系列數據點產生其競爭性結合譜。任何兩個結合譜之間之相似度藉由計算校正係數來定量，該校正係數係跨所有結合譜組合計算。然後將校正值聚集以識別具有相似競爭模式之抗體，然後將其分組至抗原決定基分組。使用Microsoft Excel及R進行數據分析及數據繪圖。
結果：針對整個15種人源化抗體研究組，一起比較競爭性結合譜。計算跨所有結合譜組合之校正值及基於相似性聚集。基於該聚集，分配抗原決定基分組。識別15種人源化抗體研究組之四個抗原決定基分組A、B、C及D，如表10中所述。
D. 流動式細胞測量術細胞表面結合分析為測定選擇之抗FLT3LG人源化抗體與細胞表面表現之FLT3LG之結合，進行流動式細胞測量術細胞表面結合分析。
方法：將穩定轉染hFLT3LG之293T細胞以0.5 x 10 6個細胞/孔與以100 nM開始3倍連續稀釋之100 μL抗FLT3LG抗體在4℃培育30分鐘，接著100 μL經1:100稀釋之抗人類IgG Fc-APC (Jackson ImmunoResearch，目錄號：109-135-098)抗體在4℃培育30分鐘。於洗後，將細胞於100 μL DAPI中培育5分鐘用於活力染色。將經染色細胞用4%多聚甲醛(PFA)固定及使用CYTOFLEX流動式細胞計數器獲取螢光數據。
結果：圖6顯示人源化抗體研究組(圖6，小組A)及4種選定人源化抗FLT3LG抗體之子集(圖6，小組B)之細胞表面hFLT3LG結合，如使用流動式細胞測量術所測定。表10中詳述15種人源化抗FLT3LG抗體之組之EC50值(連同指定抗原決定基分組及先前於實例3B/C中測定之IC50阻斷值)。利用ND (未測定)表示未達到結合飽和之抗體。所有15種人源化抗FLT3LG抗體顯示結合至膜結合293T-hFLT3LG細胞之能力。無抗體顯示結合至未經轉染之293T對照細胞(數據未顯示)。 表 10 ： 15 種選定人源化抗 FLT3LG 抗體之特 性
純系 ID 抗原決定基分組 阻斷 IC50 (nM) hFLT3LG- 細胞結合 EC50 (nM)
h_b1.021 A 0.04 0.401
h_b1.038 A 0.03 0.5429
h_b1.062 A 0.1 0.7186
h_b1.054 A 0.04 0.898
h_b1.015 A 0.09 0.74
h_b1.039 A 0.04 0.5916
h_b1.118 A 0.05 2.805
h_b1.123 A 0.08 0.5839
h_b1.121 A 0.15 0.7652
h_b1.094 B 0.06 ND
h_b1.095 B 0.03 ND
h_b1.126 C 0.05 0.3673
h_b1.017 C 0.12 0.65
h_b1.004 C 0.28 0.6
h_b1.078 D 0.06 ND
E. 可溶性 FLT3LG 結合阻斷分析為證實4種選定人源化抗FLT3LG抗體於阻斷可溶性FLT3LG結合至細胞表面FLT3受體中的活性，開發利用RS4;11細胞之可溶性FLT3LG結合阻斷分析。RS4;11細胞顯示可檢測FLT3表面表現。使用經生物素化之可溶性FLT3LG，與FLT3受體之配位體結合可使用螢光團結合之鏈黴抗生物素分子藉由流動式細胞測量術量測。配位體結合使用抗FLT3LG抗體之抑制可以平均螢光強度減少量測。
方法：為創建經生物素化hFLT3LG分析，首先將來自1M NiCl2之鎳以1 NTA-Tris-生物素與4.5 NiCl2比率裝載至NTA-Tris-生物素(Sigma 目錄75543)上。在室溫下，將Ni-NTA-Tris-生物素用重組hFLT3LG-His (Acro Biosystems目錄FLL-H5223)以1 FLT3LG-His : 1.5 Ni-NTA-Tris-生物素比率培育；本文中將此化合物表示為「NTA-Tris-BT-hFLT3LG」。
為測定hFLT3LG與RS4;11細胞之結合及其藉由人源化抗FLT3LG抗體之阻斷，首先將1 x 10 5個RS4;11細胞/孔用活/死染色劑(Biolegend目錄423102)培育20分鐘。於用流動式細胞測量術緩衝液(Thermo 目錄00-4222-26)洗滌一次後，將細胞用Fc受體阻斷溶液(Biolegend目錄422302)培育10分鐘及然後用FACS緩衝液洗滌一次。然後，添加0.75 nM (NTA-Tris-BT-FLT3LG與RS4;11細胞結合之預先確定之EC80) NTA-Tris-BT-hFLT3LG以改變抗體之濃度持續15分鐘，之後添加至細胞中持續30分鐘。將細胞用流動式細胞測量術緩衝液洗滌及然後用鏈黴抗生物素-PE (Biolegend目錄405204)培育30分鐘。於將細胞用流動式細胞測量術緩衝液洗滌一次後，將細胞用4%多聚甲醛(Thermo目錄J61899.AP)固定20分鐘。在室溫下進行所有步驟。於洗滌一次及再懸浮於流動式細胞測量術緩衝液中後，使用CytoFLEX流動式細胞計分析細胞。使用FlowJo分析流動數據及將MFI值使用Graphpad Prism作圖及分析。
結果：觀察到可溶性hFLT3LG與FLT3之結合藉由四種選定阻斷人源化抗FLT3LG抗體之抑制。在存在抗體下，受體與配位體之間之相互作用經阻斷，如藉由觀察到之螢光減少所指示。圖7中提供R&D 抗FLT3LG抗體與四種選定人源化抗FLT3LG抗體(h_b1.017 (小組A)、h_b1.021 (小組B)、h_b1.078 (小組C)、及h_b1.126 (小組D))相比針對0.75 nM hFLT3LG之抑制曲線。表11中提供使用抑制曲線測定之相同四種選定人源化抗FLT3LG抗體之IC50值。利用ND (未測定)表示不顯示完全阻斷活性之抗體。不希望侷限於理論，因為於分析中採用Acro hFLT3LG (其與用於抗體產生之R&D hFLT3LG在胺基酸位置72處不同)，所以假設人源化抗FLT3LG抗體h_b1.021於可溶性FLT3LG阻斷分析中不顯示完全阻斷活性。假設結合至抗原決定基分組A之抗體(包括h_b1.021)結合至包含在hFLT3LG之位置72處之丙胺酸之抗原決定基，該丙胺酸僅於R&D hFLT3LG中存在。 表 11 ： 選定人源化抗 FLT3LG 抗體之 IC50 值，如藉由可溶性 hFLT3LG 結合阻斷分析所量測
純系 IC50 (nM)
h_b1.017 1.263
h_b1.021 ND
h_b1.078 0.7621
h_b1.126 0.8209
R&D 0.342
R&D同型 ND
人類IgG同型 ND
此實例證實選定人源化抗FLT3LG抗體抑制可溶性FLT3LG與細胞表面FLT3受體之結合。
實例 4 ： FLT3LG 誘導之受體內化藉由抗 FLT3LG 抗體之抑制先前實例顯示選定人源化抗FLT3LG抗體有效阻斷FLT3LG與細胞表面上之FLT3受體之結合。進行FLT3受體內化分析以測定人源化抗FLT3LG抗體是否相似抑制FLT3LG誘導之受體內化。
A. 可溶性 FLT3LG 誘導之 FLT3 受體內化藉由抗 FLT3LG 抗體之阻斷 方法：測試四種選定人源化抗FLT3LG阻斷抗體連同抗hFLT3LG抗體(純系編號40416) (R&D，目錄號MAB608)阻斷可溶性hFLT3LG誘導之FLT3受體內化之能力。將該等抗hFLT3LG抗體在37℃下用218 pM (可溶性hFLT3LG誘導之FLT3內化之預先確定之EC80劑量) hFLT3LG-His (Acrobiosystems，目錄號FLL-H5223)培育30分鐘。將於RPMI 1640 (GIBCO，目錄號：11875101) +10%熱滅活FBS (R&D，目錄號S12450H) + 1 x 抗生素-抗真菌劑(GIBCO，目錄號15240-062) + 1 x  GlutaMAX (GIBCO，目錄號35050-061)中培養之RS4;11細胞(ATCC，目錄號：CRL-1873，批號：70036117)以100,000個細胞/孔接種於96孔圓底板(CORNING，目錄號3799)中。將細胞於各孔中藉由離心製成小球及再懸浮於抗體及hFLT3LG混合物中及在37℃下培育2小時。以50 nM之起始濃度及以針對11點之自3倍連續稀釋產生之濃度測試抗體。將細胞在冰上用LIVE/DEAD™可固定紫色死細胞染色劑染色以測定細胞活力(INVITROGEN，目錄號L34955)，及將在此等細胞上表現之任何人類Fc受體用TruStain FcX人類Fc受體阻斷溶液(BIOLEGEND，目錄號422302)阻斷。經由流動式細胞測量術使用用PE (INVITROGEN，目錄號12-1357-42)螢光標記之抗FLT3抗體(純系BV10A4H2)測定細胞表面FLT3與小鼠IgG1 κ同型對照(純系P3.6.2.8.1)、PE (INVITROGEN，目錄號12-4714-82)比較。在CytoFLEX流動式細胞計(BECKMAN COULTER)上獲取數據，使用FLOWJO門戶分析，及使用Prism (GraphPad)繪圖。
結果：抗FLT3LG抗體阻斷RS4;11細胞上之可溶性hFLT3LG誘導之FLT3受體內化，如藉由增加之螢光(MFI)相對於增加之抗體濃度所指示，如圖8中針對純系h_b1.017 (小組A)、純系h_b1.021 (小組B)、純系h_b1.078 (小組C)及h_b1.126 (小組D)所示。自此受體內化阻斷數據，計算選定人源化阻斷抗體各者之IC50值，如表12中所呈現。h_b1.21抗體不產生完整曲線及因此將IC50值標記為ND (未測定)。假設於內化分析中針對h_b1.021觀察到之較低阻斷活性發生，由於使用Acro hFLT3LG，其不可藉由特異性針對抗原決定基分組A之抗體強烈結合。 表 12 ： 選定人源化抗 FLT3LG 抗體之 IC50 值，如藉由可溶性 FLT3LG 誘導之受體內化分析所量測
純系名稱 IC50 (nM)
h_b1.017 0.183
h_b1.021 ND
h_b1.078 0.64
h_b1.126 0.838
R&D 0.139
B. 膜 FLT3LG 誘導之 FLT3 受體內化藉由抗 FLT3LG 抗體之阻斷當將細胞混合時，在293T細胞上穩定表現之FLT3LG能誘導RS4;11細胞上之FLT3受體內化。吾人測試吾人候選抗體阻斷此膜FLT3LG誘導之FLT3內化之能力。
方法：測試四種選定人源化阻斷抗體連同抗hFLT3LG抗體(純系編號40416) (R&D，目錄號MAB608)阻斷膜表現之hFLT3LG誘導之FLT3受體內化的能力。將於RPMI 1640 (GIBCO，目錄號：11875101) +10%熱滅活FBS (R&D，目錄號S12450H) + 1 x  Anti-Anti (GIBCO，目錄號15240-062) + 1 x  GlutaMAX (GIBCO，目錄號35050-061)中培養之293T-hFLT3LG細胞以4,000個細胞/孔(自細胞滴定實驗先前測定之EC80)接種於96孔經組織培養物處理之平底板(CORNING，目錄號3596)中，及允許於CO 2培育箱中在37℃下黏附過夜。第二天藉由輕輕攪動自293T-hFLT3LG細胞移除已用介質，接著用培養基輕輕洗滌。將抗FLT3LG抗體在37℃下用293T-hFLT3LG細胞培育30分鐘。然後，將100,000個RS4;11細胞 (ATCC，目錄號：CRL-1873，批號：70036117)添加至各孔，然後在37℃下培育2小時。於培育後，將RS4;11細胞轉移至96孔圓底板(CORNING，目錄號3799)中及在冰上用LIVE/DEAD™可固定紫色死細胞染色劑染色以測定細胞活力(INVITROGEN，目錄號L34955)，及將在此等細胞上表現之人類Fc受體用人類Fc受體阻斷溶液TruStain FcX (BIOLEGEND，目錄號422302)阻斷。將RS4;11細胞基於其CD19染色使用用APC/Cy7 (BIOLEGEND，目錄號302218)螢光標記之抗人類CD19抗體(純系HIB19)特異性門控。藉由流動式細胞測量術使用用PE (INVITROGEN，目錄號12-1357-42)螢光標記之抗FLT3抗體(純系BV10A4H2)測定細胞表面FLT3之下調與小鼠IgG1 κ同型對照(純系P3.6.2.8.1)、PE (INVITROGEN，目錄號12-4714-82)比較。在CytoFLEX流動式細胞計(BECKMAN COULTER)上獲取數據，使用FLOWJO門戶分析，及使用Prism (GraphPad)繪圖。
結果：抗FLT3LG抗體阻斷細胞表面表現之RS4;11細胞上之FLT3LG誘導之FLT3受體內化，如藉由增加之螢光(MFI)相對於增加之抗體濃度所指示，如圖9中針對純系h_b1.017 (小組A)、純系h_b1.021 (小組B)、純系h_b1.078 (小組C)及純系h_b1.126 (小組D)所示。藉由選定人源化阻斷抗體阻斷受體內化之能力計算該等阻斷抗體各者之IC50值，如表13中所呈現。h_b1.21抗體不產生完整曲線及因此將IC50值標記為ND (未測定)。 表 13 ： 選定人源化抗 FLT3LG 抗體之 IC50 值，如藉由膜 FLT3LG 誘導之受體內化分析所量測
純系名稱 IC50 (nM)
h_b1.017 0.671
h_b1.021 ND
h_b1.078 1.485
h_b1.126 1.928
R&D 0.641
實例 5 ： p-AKT 信號轉導分析絲胺酸/蘇胺酸激酶AKT之磷酸化在FLT3LG結合至其受體FLT3之下游發生，導致控制FLT3表現細胞之細胞生存及增殖之路徑。人類細胞系RS4;11內源表現FLT3且對hFLT3LG處理反應，其可透過AKT之磷酸化檢測到。
進行磷酸化-AKT (p-AKT)轉導分析以測定抗FLT3LG抗體是否藉由FLT3表現RS4;11細胞抑制可溶性hFLT3LG誘導之AKT磷酸化。
方法：將RS4;11細胞(ATCC，目錄號：CRL-1873，批號：70036117)以2.0 x 10 5個細胞/孔之密度接種於96孔經TC處理之板(Corning，目錄號：CLS3595)中及藉由於1X PBS (Gibco目錄號：14040141)中洗滌及在37℃下於RPMI 1640培養基(Gibco，目錄號：11875101)中培育6小時來血清飢餓。藉由在室溫下混合15分鐘來製備細胞處理物，以0.2 nM之預先確定之EC80添加重組人類FLT3LG (R&D，目錄號：308-FKN/CF)及自100 nM之起始濃度與3倍連續稀釋滴定四種選定人源化抗hFLT3LG阻斷抗體。然後將預混合細胞處理物以一式三份添加至血清飢餓細胞中及在37℃下培育10分鐘。藉由快速添加來自CISBIO磷酸化-AKT HTRF套組(PERKIN-ELMER，目錄號64AKSPEH)之裂解緩衝液及在4℃下移動至板振動器1小時使細胞於相同板中裂解。將16 µL/孔之裂解細胞溶離份轉移至CISBIO不透明低體積96孔板(PERKIN-ELMER，目錄號66PL96100)中。每孔添加來自相同HTRF套組(PERKIN-ELMER，目錄號64AKSPEH)之4 µL預混合之磷酸化-AKT檢測抗體。將板密封及在4℃下培育過夜及經由配備有HTRF檢測濾筒(Molecular Devices，目錄號：0200-7011POS)之SPECTRAMAX i3x微板閱讀器讀取結果。於Prism中分析所得數據以獲得最佳擬合曲線及IC50值。
結果：使用p-AKT信號轉導分析測定四種選定阻斷人源化抗FLT3LG抗體阻斷藉由hFLT3LG與FLT3之間之相互作用誘導之p-AKT信號的能力。四種抗體各具有可比較p-AKT阻斷活性，如圖10小組A (純系h_b1.017)、小組B (純系h_b1.021)、小組C (純系h_b1.078)及小組D (純系h_b1.126)中所顯示。將R&D同型MAB002及人類IgG同型用作陰性對照，及將R&D工具抗體MAB608用作陽性對照。以均相時差式螢光(Homogeneous Time Resolved Fluorescence/HTRF)比率測定p-AKT信號傳導。
藉由選定人源化抗FLT3LG阻斷抗體阻斷藉由hFLT3LG與FLT3之間之相互作用誘導之p-AKT信號傳導之能力計算該等阻斷抗體各者之IC50值，如表14中所呈現。 表 14 ： 選定人源化抗 FLT3LG 抗體之 IC50 值，如藉由 p-AKT 信號轉導分析所量測
純系名稱 IC50 (nM)
h_b1.017 1.29
h_b1.021 1.12
h_b1.078 0.98
h_b1.126 1.14
R&D 0.86 nM
實例 6 ：原代 DC 分化分析FLT3受體於造血祖細胞及穩態DC中高度表現及對主要DC子集之分化、增殖/擴增及生存係必需的。
進行使用MS5進料線及人類CD34+祖細胞之共培養分析以測定抗FLT3LG抗體是否抑制可溶性FLT3LG誘導之DC分化。
方法：使MS5基底細胞(DSMZ；目錄號：ACC 441)於補充有10%熱滅活FBS、盤尼西林(penicillin)/鏈黴素(streptomycin)、2 mM L-麩胺醯胺及2 mM丙酮酸鈉之完全α-MEM (Gibco；目錄號：12571063)培養基中生長並維持在37℃及5% CO 2下。於用0.05%胰蛋白酶(trypsin)-EDTA溶液(Gibco；目錄號：25300054)培育5至10分鐘後，收穫MS5細胞，洗滌，及用10 μg/mL絲裂黴素(mitomycin) C (THERMO SCIENTIFIC；目錄號：AAJ67460XF)於完全α-MEM培養基中在37℃及5% CO 2下處理3至4小時以抑制增殖。然後將經絲裂黴素C處理之MS5細胞用1X PBS洗滌，再懸浮於完全α-MEM培養基中，及在37℃及5% CO 2下以25,000個細胞/孔之密度接種於12孔經TC處理之板中24小時。將來自健康供體之外周血(STEMCell；目錄號：70060)之經低溫保存之人類CD34+細胞以50,000個細胞/孔之密度輕輕覆蓋在MS5進料層上方，隨後添加細胞處理物。藉由將基於公開文獻之2.86 nM之預先確定之EC80之重組人類FLT3LG (R&D，目錄號：308-FKN/CF)及自28.6 nM之起始濃度與3倍連續稀釋滴定之四種選定人源化抗hFLT3LG阻斷抗體在室溫下混合15分鐘來製備細胞處理物。然後在CD34+細胞接種後第0、7及14天將預混合之處理物以一式兩份添加至細胞中，之後在第21天將DC收穫及染色用於流動式細胞測量術。
結果：經由流動式細胞測量術定義樹突狀細胞群體及以親本門控之頻率繪圖。針對阻斷人源化抗FLT3LG抗體之效價繪製跨供體之平均值，及經由最佳擬合曲線測定IC50值。數據表示兩個獨立實驗之組合，表示5個健康CD34+供體。四種抗FLT3LG抗體(純系h_b1.017、h_b1.021、h_b1.078及h_b1.126)及陽性對照MAB608 (R&D SYSTEMS，目錄號MAB608)各者具有針對FLT3LG誘導之自CD34+人類幹細胞祖細胞之DC分化之可比較的阻斷活性 (圖11，組A至C)。藉由選定人源化阻斷抗體抑制CD11c+ HLA-DR+ DC分化之能力計算該等阻斷抗體各者之IC50值，如表15中所示。 表 15 ：選定人源化抗 FLT3LG 抗體之 IC50 值，如藉由原代 DC 分化分析所量測
純系名稱 IC50 (M)
h_b1.017 3.497e-009
h_b1.021 2.431e-009
h_b1.078 4.610e-009
h_b1.126 5.000e-009
R&D MAB608 2.384e-009
實例 7 ：抗 FLT3LG 抗體與人類 T 細胞上之內源 FLT3LG 之結合為證實四種選定人源化抗FLT3LG抗體可結合至在T細胞上表現之內源 FLT3LG，將流動式細胞測量術分析最佳化以量測此等抗體與人類T細胞上之FLT3LG之結合。因為FLT3LG不在健康對照人類T細胞上高度表現，所以將分析最佳化以上調T細胞上之FLT3LG表現及然後藉由流動式細胞測量術以平均螢光強度量測抗FLT3LG抗體之結合。
方法：自新鮮健康人類對照血液獲得人類T細胞。此研究中包含兩個人類供體。於EDTA管中收集血液及藉由密度梯度離心使用FICOLL-PAQUE (GE，目錄號07907)及SEPMATE管(STEMCELL TECHNOLOGIES，目錄號85460)獲得單核細胞(MNC)，其包含T細胞。然後將T細胞藉由陰性選擇套組(STEMCELL TECHNOLOGIES，目錄號19661)經由磁性分離自MNC池分離。然後將T細胞以10 6/mL之密度於具有及不具有10 ng/mL IL-7 (R&D，目錄號BT-007)之IMMUNOCULT-XF T細胞擴增培養基(STEMCELL TECHNOLOGIES，目錄號10981) + 1%抗生素-抗真菌劑(GIBCO，目錄號15240062) + 10% FBS + 1% GLUTAMAX (GIBCO，目錄號35050061)中平板接種3天，其中IL-7誘導FLT3LG表現。在第3天，將細胞用PBS洗滌及以0.2 x 10 6/mL之細胞密度再懸浮於具有新鮮IL-7之新鮮培養基(參見以上配方)中及在培育3天。在第6天，收集T細胞及用流動式細胞測量術緩衝液(「流動緩衝液」，THERMOFISHER目錄號00-4222-26)洗滌。首先將2 x 10 5個細胞/孔用活/死染色劑(BIOLEGEND，目錄號423102)培育15至25分鐘。於用流動緩衝液洗滌一次後，將細胞用Fc受體阻斷溶液(BIOLEGEND，目錄號422302)培育80分鐘及然後用流動緩衝液洗滌一次。然後針對T細胞表面標誌物CD45 APC-Cy7 (BIOLEGEND，目錄號304014)、CD3 BV650 (BIOLEGEND，目錄號300468)、CD8 PacBlue (BIOLEGEND，目錄號344718)、CD4 FITC (BIOLEGEND，目錄號357406)將細胞染色30分鐘，連同以250 nM開始滴定選定抗FLT3LG抗體及針對10點向下滴定5倍。將細胞用流動緩衝液洗滌一次及然後用抗人類PE二級抗體(Jackson Immunoresearch，目錄號109-116-097)培育以檢測抗FLT3LG抗體與細胞之結合。將細胞洗滌及不固定或用4% PFA (THERMOFISHER，目錄號J61899.AP)固定20分鐘。於洗滌一次及再懸浮於流動式細胞測量術緩衝液中後，使用CYTOFLEX流動式細胞計分析細胞。在室溫下進行所有步驟。使用FLOWJO分析流動數據及將MFI值使用Graphpad Prism繪圖及分析。
結果：觀察到來自兩個供體之人類T細胞上之內源FLT3LG藉由人源化抗FLT3LG抗體h_b1.017、h_b1.078及h_b1.126之結合。圖12中提供四種選定人源化抗-FLT3LG抗體(h_b1.017 (小組A)、h_b1.021 (小組B)、h_b1.078 (小組C)及h_b1.126 (小組D))之內源FLT3LG之結合曲線。藉由選定人源化抗FLT3LG抗體結合至兩個供體之T細胞上之內源表現之FLT3LG之能力來計算該等抗體各者之EC50值，如表16中所示。 表 16 ：選定人源化抗 FLT3LG 抗體之 EC50 值，如藉由 T 細胞結合分析所量測
純系名稱 EC50 (nM)
h_b1.017 (供體1) 1.08
h_b1.017 (供體2) 1.25
h_b1.021 (供體1) ND
h_b1.021 (供體2) ND
h_b1.078 (供體1) 0.30
h_b1.078 (供體2) 0.24
h_b1.126 (供體1) 0.31
h_b1.126 (供體2) 0.36
實例 8 ：抗 FLT3LG 抗體對經 hFLT3LG 誘導之 DC 之活體內效應進行活體內研究以測定抗FLT3LG抗體對經hFLT3LG誘導之DC群體之頻率及數目的效應。
方法：所有小鼠到達場所及在任何操作之前休息至少3天。將NOG-EXL雌性小鼠(約5至6週齡)在120厘戈瑞(centigray/cGy)下照射。於休息至少4小時後，小鼠藉由眼後(r.o.)注射接受供體人類CD34+細胞。於此研究中使用兩個hCD34+供體(供體17及供體18)。於移植後0至2週(WPE)每日量測體重(BW)以監測於移植後之任何BW損失或痛苦徵兆。之後，每週兩次量測BW。
在約4個WPE下，將小鼠抽血(在異氟烷麻醉下之生存頜下抽血)以測定人源化水平(所有CD45 (hCD45+mCD45)之hCD45之%)。基於%hCD45，將小鼠分配至6個不同處理組，其中將7隻小鼠/供體分配至各組。在研究之第1天及第2天，將小鼠用15 µg/劑量之抗FLT3LG抗體(h_b1.017、h_b1.078或h_b1.126)經腹膜內(i.p.)給藥。在第0天及第3天，將hFLT3LG (R&D，目錄號308-FKN-250/CF，15 µg/劑量)經皮下(s.c.)注射至小鼠頸後之脖頸。在第7天，將小鼠安樂死，藉由心臟穿刺收集血液，及收集脾，稱重及處理成單細胞懸浮液用於流動式細胞測量術分析。
結果：於脾中量測經hFLT3LG誘導之cDC、cDC1、cDC2、pDC及預pDC群體之頻率(hCD45+細胞之%；小組A)及數目(小組B)，如圖13中所示。與IgG同型對照相比，選定抗FLT3LG抗體之投與於活體內降低經hFLT3LG誘導之DC之頻率及數目。
實例 9 ：抗 FLT3LG 抗體與 hFLT3LG 相互作用藉由 NS-EM 之評估 方法：藉由將0.4 µM his標記之人類FLT3LG (AcroBiosystems，目錄號FLL-H5223)與0.1 µM抗FLT3LG抗體h_b1.078或抗FLT3LG比較抗體O001混合來製備抗原/抗體複合體。將混合物在冰上培育70至85分鐘以允許複合體形成。將4 µl樣品添加至新鮮輝光放電連續碳格柵(Agar Scientific Ltd，目錄號AGS160-3)中及用2%乙酸雙氧鈾染色。將格柵在以200 kV及約90 K之溫度操作之THERMOFISHER SCIENTIFIC GLACIOS透射電子顯微鏡上成像。在Falcon 4i直接電子檢測器上使用EPU 3.2以0.94Å之像素尺寸、-1.4至-2.5 µm散焦及40 e -/Å 2之累積電子注量獲取影片。收集10幀/影片。使用軟體包處理數據，允許校正束誘導之樣品運動、圖像處理、粒子挑選及2D分類。與h_b1.078及O001相關之數據之呈現之2D類別平均值各自對應於10,017及2,033個粒子。使用FIJI ImageJ v1.53t對比調整呈現之圖像。
結果：收斂之2D類別平均值顯示抗體h_b1.078及O001主要形成2 FLT3LG 2: 2 mAb複合體。來自h_b1.078及O001之代表性2D類別平均值之比較表明fAb臂之間之角度明顯不同。2 FLT3LG 2: 2 h_b1.078複合體中之fAb臂之間之角度遠遠大於90度，然而2 FLT3LG 2: 2 O001複合體中之fAb臂之間之角度小於90度(示例性圖像示於圖14中)。
實例 10 ：抗體及其抗原結合片段之胺基酸及核酸序列表17中提供本文中提供之抗體及其抗原結合片段之可變重(VH)鏈及可變輕(VL)鏈之胺基酸序列。 表 17 ： 選定鼠科及人源化抗 FLT3LG 抗體之可變重鏈及輕鏈胺基酸序列
抗體鏈 SEQ ID NO: 胺基酸序列
b1.126 VH 1 QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTKSGVHWVRQSPGKGLEWLGIIWGDGYTDYNSAFKSRLSISKDISKSQVFLKMNSLQTDDTANYYCAKWDLYGNYGVYWGQGTTLTVSS
b1.017 VH 2 QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQSPGKGLEWLGLIWSDGSTDYNAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARNWQFPAWFAYWGQGTLVTVSA
b1.021 VH 3 QVQLQQPGAEIVRPGASVKLSCKASGYTFTDYWMNWVKQRPGQGLEWIGAIDPSDSYTRYSQKFKGKATLTVDTSSSSAYMQLSSLTSEDSAVYFCARGGRFYALDYWGQGTSVTVPS
b1.078 VH 4 DVQLVESGGGLVHPGGSRKLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPEKGVEWVAYISDNSGTIYYGDTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCTRRLLYYDYDGYAMDYWGQGTSVTVSS
h_b1.126 VH 5 EVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLTKSGVHWVRQPPGKALEWLGIIWGDGYTDYNSAFKSRLTISKDISKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCAKWDLYGNYGVYWGQGTLVTVSS
h_b1.017 VH 6 EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSLTSYGVHWVRQAPGKGLEWLGLIWSDGSTDYNAAFISRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARNWQFPAWFAYWGQGTLVTVSS
h_b1.021 VH 7 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWMNWVRQAPGQGLEWIGAIDPSDSYTRYSQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARGGRFYALDYWGQGTTVTVSS
h_b1.078 VH 8 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGVEWVAYISDNSGTIYYGDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRRLLYYDYDGYAMDYWGQGTTVTVSS
b1.126 VL 9 EIVLTQSPTTMAASPGEKITITCSARSSLSSNYLHWYQQKPGFSPKLLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSSVPFTFGSGTKLEIK
b1.017 VL 10 EIAMTQSHKFISTSVGDRVSITCKASQDVSIAVGWYQQKPGQSPKLLIYSASHRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSIPLTFGAGTKLELK
b1.021 VL 11 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCRASQDVSITVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSSPWTFGGGTKLEIK
b1.078 VL 12 DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYRASIRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELK
h_b1.126 VL 13 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSARSSLSSNYLHWYQQKPGKSPKLLIYRTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQGSSVPFTFGQGTKVEIK
h_b1.017 VL 14 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIAVGWYQQKPGKSPKLLIYSASHRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYSIPLTFGGGTKVEIK
h_b1.021 VL 15 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSITVAWYQQKPGKSPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSSPWTFGGGTKVEIK
h_b1.078 VL 16 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYRASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPLTFGGGTKVEIK
表18中提供本文中提供之抗體及其抗原結合片段之VH及VL鏈之互補決定區(CDR)的胺基酸序列。於一些實施例中，一或多個人源化CDR區可經密碼子最佳化。例如，以下提供之人源化抗FLT3LG抗體之DNA序列已自其鼠科對應物經密碼子最佳化用於合成、選殖及表現。結果，於一些實施例中，人源化純系中之CDR之DNA序列可自天然鼠科序列變化。通常，此密碼子最佳化不導致胺基酸序列差異。 表 18 ： 選定鼠科及人源化抗 FLT3LG 抗體之 CDR 胺基酸序列
抗體鏈 CDRH1 (AA) SEQ ID NO: CDRH2 (AA) SEQ ID NO: CDRH3 (AA) SEQ ID NO:
b1.126 VH; h_b1.126 VH KSGVH 17 IIWGDGYTDYNSAFKS 18 WDLYGNYGVY 19
b1.017 VH; h_b1.017 VH SYGVH 20 LIWSDGSTDYNAAFIS 21 NWQFPAWFAY 22
b1.021 VH; h_b1.021 VH DYWMN 23 AIDPSDSYTRYSQKFKG 24 GGRFYALDY 25
b1.078 VH; h_b1.078 VH TYGMH 26 YISDNSGTIYYGDTVKG 27 RLLYYDYDGYAMDY 28
抗體鏈 CDRL1 (AA) SEQ ID NO: CDRL2 (AA) SEQ ID NO: CDRL3 (AA) SEQ ID NO:
b1.126 VL; h_b1.126 VL SARSSLSSNYLH 29 RTSNLAS 30 QQGSSVPFT 31
b1.017 VL; h_b1.017 VL KASQDVSIAVG 32 SASHRYT 33 QQHYSIPLT 34
b1.021 VL; h_b1.021 VL RASQDVSITVA 35 SASYRYT 36 QQHYSSPWT 37
b1.078 VL; h_b1.078 VL KSSQSLLYSNNQKNYLA 38 RASIRES 39 QQYYSYPLT 40
表19中提供本文中提供之抗體及其抗原結合片段之片段可結晶(Fc)區的胺基酸序列。本文中提供之Fc區用於鼠科及人源化純系二者中，及為Fc禁用hIgG1 N297G；然而，可設想其他Fc區序列(包括野生型Fc)之使用。 表 19 ： Fc 區胺基酸序列
Fc 域 SEQ ID NO: AA 序列
hIgG1 N297G 41 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
表20中提供本文中提供之抗體及其抗原結合片段之輕鏈恆定(CL)域的胺基酸序列。本文中提供之CL域用於鼠科及人源化純系二者中；然而，可設想其他CL域序列之使用。 表 20 ： CL 域胺基酸序列
CL 域 SEQ ID NO: AA 序列
CL 42 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
表21中提供本文中提供之抗體及其抗原結合片段之具有本文中提供之VH及Fc區之全長重鏈(HC)及具有本文中提供之VL及CL區之輕鏈(LC)的胺基酸序列，及表22中提供本文中提供之抗體及其抗原結合片段之該全長HC及LC的核酸序列。 表 21: 非人源化及人源化抗 FLT3LG 抗體之全長重鏈及輕鏈胺基酸序列
抗體鏈 SEQ ID NO: FL AA 序列
b1.126 HC FC (包含N297G) 43 QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLT KSGVHWVRQSPGKGLEWLG IIWGDGYTDYNSAFKSRLSISKDISKSQVFLKMNSLQTDDTANYYCAK WDLYGNYGVYWGQGTTLTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
b1.017 HC FC (包含N297G) 44 QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLT SYGVHWVRQSPGKGLEWLG LI WSDGSTDYNAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCAR NWQFPAWFAYWGQGTLVTVSA ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
b1.021 HC FC (包含N297G) 45 QVQLQQPGAEIVRPGASVKLSCKASGYTFT DYWMNWVKQRPGQGLEWIG AIDPSDSYTRYSQKFKGKATLTVDTSSSSAYMQLSSLTSEDSAVYFCAR GGRFYALDYWGQGTSVTVPS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
b1.078 HC FC (包含N297G) 46 DVQLVESGGGLVHPGGSRKLSCAASGFTFS TYGMHWVRQAPEKGVEWVA YISDNSGTIYYGDTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCTR RLLYYDYDGYAMDYWGQGTSVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
h_b1.126 HC FC (包含N297G) 47 EVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLT KSGVHWVRQPPGKALEWLG IIWGDGYTDYNSAFKSRLTISKDISKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCAK WDLYGNYGVYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
h_b1.017 HC FC (包含N297G) 48 EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSLT SYGVHWVRQAPGKGLEWLG LIWSDGSTDYNAAFISRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR NWQFPAWFAYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
h_b1.021 HC FC (包含N297G) 49 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT DYWMNWVRQAPGQGLEWIG AIDPSDSYTRYSQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAR GGRFYALDYWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
h_b1.078 HC FC (包含N297G) 50 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS TYGMHWVRQAPGKGVEWVA YISDNSGTIYYGDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTR RLLYYDYDGYAMDYWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY G STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
b1.126 LC CL 51 EIVLTQSPTTMAASPGEKITITC SARSSLSSNYLHWYQQKPGFSPKLLIY RTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYC QQGSSVPFTFGSGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
b1.017 LC CL 52 EIAMTQSHKFISTSVGDRVSITC KASQDVSIAVGWYQQKPGQSPKLLIY SASHRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC QQHYSIPLTFGAGTKLELK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
b1.021 LC CL 53 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC RASQDVSITVAWYQQKPGQSPKLLIY SASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC QQHYSSPWTFGGGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
b1.078 LC CL 54 DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSC KSSQSLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIY RASIRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYC QQYYSYPLTFGAGTKLELK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
h_b1.126 LC CL 55 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC SARSSLSSNYLHWYQQKPGKSPKLLIY RTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYC QQGSSVPFTFGQGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
h_b1.017 LC CL 56 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC KASQDVSIAVGWYQQKPGKSPKLLIY SASHRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC QQHYSIPLTFGGGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
h_b1.021 LC CL 57 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDVSITVAWYQQKPGKSPKLLIY SASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQHYSSPWTFGGGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
h_b1.078 LC CL 58 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIY RASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QQYYSYPLTFGGGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
註釋：可變域經加下劃線；CDR係呈粗體。針對SEQ ID NO: 43至50，經斜體、加粗及加下劃線之殘基為N297G突變。 表 22 ： 非人源化及人源化抗 FLT3LG 抗體之全長重鏈及輕鏈核酸序列
抗體鏈 SEQ ID NO: FL NA 序列
b1.126 HC FC 59 CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTTGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACTGTCTCTGGTTTCTCATTAACC AAGTCTGGTGTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGA ATAATATGGGGTGATGGATACACAGATTATAATTCAGCTTTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACATTTCCAAGAGTCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCAACTACTACTGTGCCAAA TGGGACCTCTATGGTAACTACGGGGTCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCAGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCTAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTAC GGA AGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACTTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAGTAA
b1.017 HC FC 60 CAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACT AGCTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGACTGATA TGGAGTGATGGAAGCACAGACTATAATGCAGCTTTCATATCTAGACTGAGCATCAGCAAGGACAATTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTACAAGCTGATGACACAGCCATATATTACTGTGCCAGA AATTGGCAGTTCCCGGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCAGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCTAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTAC GGA AGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACTTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAGTAA
b1.021 HC FC 61 CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAAATTGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACC GACTATTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGA GCCATTGATCCTTCTGATAGTTATACTCGCTACAGTCAAAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACACCTCCTCCAGTTCAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGA GGGGGGCGATTCTATGCTCTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCCGTCACCGTCCCCTCA GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCAGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCTAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTAC GGA AGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACTTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAGTAA
b1.078 HC FC 62 GATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCACCCTGGAGGGTCCCGGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGT ACCTATGGAATGCACTGGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGGGTGGAGTGGGTCGCA TATATCAGTGATAACAGTGGTACCATCTACTATGGAGACACAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAATACCCTGTTCCTGCAAATGACCAGTCTAAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTACAAGA CGGCTCCTCTACTATGATTACGACGGGTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCAGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCTAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTAC GGA AGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACTTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAGTAA
h_b1.126 HC FC 63 GAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTGCTGGTGAAACCCACAGAGACCCTCACGCTGACCTGCACCGTCTCTGGGTTCTCACTCACC AAGAGCGGTGTGCACTGGGTGCGTCAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTTGGC ATCATTTGGGGCGACGGCTACACCGACTACAACAGCGCCTTCAAGAGCAGGCTCACCATCTCCAAGGACATCTCCAAAAGCCAGGTGGTCCTTACCATGACCAATATGGACCCTGTGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAAG TGGGACCTGTACGGCAACTACGGCGTGTACTGGGGCCAAGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCA GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCAGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCTAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTAC GGA AGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACTTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAGTAA
h_b1.017 HC FC 64 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCAGCCTGACC AGCTATGGCGTGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTAGAGTGGCTGGGC CTGATATGGAGCGACGGAAGTACCGACTACAACGCAGCCTTCATCAGCCGACTGACCATCTCCAAGGACAATTCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGA AACTGGCAGTTCCCCGCCTGGTTTGCCTACTGGGGCCAAGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCA GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCAGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCTAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTAC GGA AGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACTTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAGTAA
h_b1.021 HC FC 65 GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACC GACTACTGGATGAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGA GCCATCGACCCTAGTGACAGCTACACAAGATACAGCCAGAAGTTCAAGGGCAGAGCCACCCTGACCGTGGACACGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTTCTGTGCTAGA GGCGGCAGATTCTACGCCCTGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCAGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCTAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTAC GGA AGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACTTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAGTAA
h_b1.078 HC FC 66 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGT ACCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGGTGGAGTGGGTTGCC TACATTAGTGACAACAGCGGCACCATATACTACGGCGACACCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTTTATTACTGTACCAGA AGACTGCTGTACTACGACTACGACGGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCAGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCTAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTAC GGA AGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACTTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAGTAA
b1.126 LC CL 67 GAAATCGTGCTCACCCAGTCTCCAACCACCATGGCTGCATCTCCCGGGGAGAAGATCACTATCACCTGC AGTGCCAGATCAAGTTTAAGTTCCAATTACTTGCATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGATTCTCCCCTAAACTCTTGATTTAT AGGACATCCAATCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATTGGCACCATGGAGGCTGAAGATGTTGCCACTTACTACTGC CAGCAGGGTAGTAGTGTACCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCTTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
b1.017 LC CL 68 GAAATTGCGATGACCCAGTCTCACAAATTCATCTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGC AAGGCCAGTCAGGATGTGAGTATTGCTGTAGGCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAATTACTGATTTAC TCGGCATCCCACCGGTACACTGGAGTCCCTGATCGGTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTATTGT CAGCAACATTATAGTATTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCTTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
b1.021 LC CL 69 GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTCGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGC AGGGCCAGTCAGGATGTGAGTATTACTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTAC TCGGCATCCTACCGGTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGT CAGCAACATTATAGTAGTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCTTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
b1.078 LC CL 70 GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGC AAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGTAACAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTACTGATTTAC CGGGCATCCATTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGT CAGCAATATTATAGTTATCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAACTGGAGCTGAAA CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCTTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
h_b1.126 LC CL 71 GACATCCAGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGC AGCGCGAGAAGCAGCCTGAGCAGCAACTATTTACACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAAGCCCTAAGCTCCTGATCTAC AGAACCTCCAATTTGGCCAGCGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTACACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGT CAACAGGGCAGCAGCGTGCCTTTCACTTTTGGCCAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAG CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCTTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
h_b1.017 LC CL 72 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGC AAGGCGAGTCAGGACGTGAGCATCGCCGTGGGCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAAGCCCTAAGCTCCTGATCTAC AGCGCATCCCACAGATACACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGT CAACAGCACTACAGCATCCCTCTCACGTTCGGCGGAGGTACCAAGGTGGAGATCAAG CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCTTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
h_b1.021 LC CL 73 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGC CGGGCGAGTCAGGACGTGAGCATCACCGTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAAGCCCTAAGCTCCTGATCTAT AGCGCATCCTACAGATACACCGGGGTCCCATCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGT CAACAGCACTATAGTAGCCCTTGGACGTTCGGCGGAGGTACCAAGGTGGAGATCAAG CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCTTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
h_b1.078 LC CL 74 GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGC AAGTCCAGCCAGAGTCTGTTATACAGCAACAACCAGAAGAACTACTTAGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGAGCCCTAAGCTGCTCATTTAC AGAGCATCTATCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGT CAGCAATATTATAGTTACCCTCTCACGTTCGGCGGAGGTACCAAGGTGGAGATCAAG CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCTTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
註釋：可變域經加下劃線；CDR係呈粗體。針對SEQ ID NO: 59至66，經斜體、加粗及加下劃線之核酸殘基為N297G突變。
圖 1說明人類FLT3LG (hFLT3LG)及食蟹獼猴FLT3LG (cyno-FLT3LG)反應性純系 之ELISA結合篩選。
圖 2說明各自如藉由ELISA及流動式細胞測量術(FACS)結合分析所量測之結合至hFLT3LG及293T-hFLT3LG細胞之抗FLT3LG抗體。虛線框指示結合至hFLT3LG及膜結合hFLT3LG表現293T細胞二者之抗體。
圖 3說明hFLT3LG-hFLT3結合藉由116 hFLT3LG反應性抗體之阻斷，如藉由ELISA所量測。虛線框指示與同型IgG1相比，阻斷hFLT3LG與hFLT3結合超過50%之抗體。
圖 4說明55種針對hFLT3LG或cyno-FLT3LG之阻斷抗體之結合親和力(K D)，如使用SPR測定及使用1:1結合模型所計算得。
圖 5說明於15種人源化抗FLT3LG抗體(小組A)及4種選定人源化抗FLT3LG抗體之子集(小組B) (h_b1.017、h_b1.021、h_b1.078及h_b1.126)之競爭性ELISA分析中之hFLT3LG與hFLT3之結合的抑制。
圖 6說明人源化抗FLT3LG抗體小組之hFLT3LG細胞結合，如使用流動式細胞測量術針對人源化抗FLT3LG抗體(小組A)及4種選定人源化抗FLT3LG抗體之子集(小組B)所測定。
圖 7說明人源化抗FLT3LG抗體阻斷0.75 nM可溶性FLT3LG與細胞表面FLT3受體之結合之抑制曲線。將R&D SYSTEM之抗人類FLT3LG抗體(純系編號40416) (R&D SYSTEMS，目錄號MAB608)與四種選定人源化抗FLT3LG抗體：h_b1.017 (小組A)、h_b1.021 (小組B)、h_b1.078 (小組C)及h_b1.126 (小組D)比較。
圖 8說明於可溶性FLT3LG誘導之FLT3受體內化分析中抗體候選於純系h_b1.017 (小組A)、h_b1.021 (小組B)、純系h_b1.078 (小組C)及h_b1.126 (小組D)之RS4;11細胞的阻斷活性。顯示前導抗體各者及與R&D Systems之抗人類FLT3LG抗體(純系編號40416) (R&D Systems，目錄號MAB608)及同型對照比較。
圖 9說明於細胞間相互作用誘導之FLT3內化分析中抗FLT3LG抗體候選之阻斷活性。顯示前導抗FLT3LG抗體各者及與R&D Systems之抗人類FLT3LG抗體(純系編號40416) (R&D Systems，目錄號MAB608)及同型對照比較。
圖 10說明於磷酸-AKT轉導分析中於純系h_b1.017 (小組A)、純系h_b1.021 (小組B)、純系h_b1.078 (小組C)及純系h_b1.126 (小組D)之四種選定人源化阻斷抗體之抗FLT3LG抗體候選針對可溶性FLT3LG的阻斷活性。將前導抗體各者與R&D Systems之抗人類FLT3LG抗體(純系編號40416) (R&D Systems，目錄號MAB608)及同型對照比較。
圖 11說明於原代DC分化分析中抗FLT3LG抗體候選針對可溶性FLT3LG之阻斷活性。顯示前導抗體各者及與抗人類FLT3LG抗體(純系編號40416) (R&D Systems，目錄號MAB608)及同型對照針對CD11c+ HLA-DR+細胞(小組A)、漿細胞樣DC (pDC；BDCA2+ CD123+) (小組B)及2型習知DC (cDC2；BDCA1+) (小組C)之分化比較。
圖 12說明純系h_b1.017 (小組A)、純系h_b1.021 (小組B)、純系h_b1.078 (小組C)及純系h_b1.126 (小組D)之抗FLT3LG抗體候選與在原代人類T細胞上表現之內源性FLT3LG的結合。
圖 13說明於利用hFLT3LG給藥之經人類CD34移植小鼠之脾中抗FLT3LG抗體(h_b1.017、h_b1.078及h_b1.126)對DC群體之頻率(小組A)及DC群體之數目(小組B)的效應。將DC群體之頻率表示為hCD45+細胞之百分比。各數據點代表一隻小鼠。圓形代表經供體17 hCD34+細胞移植之小鼠。三角形代表經供體18 hCD34+細胞移植之小鼠。條代表平均值，及誤差條代表SD。17、78或126各自代表經抗FLT3LG抗體h_b1.017、h_b1.078或h_b1.126給藥之小鼠。
圖 14說明抗FLT3LG抗體(h_b1.078或比較抗體O001)與FLT3LG藉由NS-EM之示例性2D類別平均值。
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Claims (30)

  1. 一種FLT3LG結合蛋白，其包含： a.(i)選自SEQ ID NO: 4之CDRH1、CDRH2及/或CDRH3及/或SEQ ID NO: 12之CDRL1、CDRL2及/或CDRL3之CDRs中之任一者或組合；或 (ii) (i)之CDR變異體，其中該變異體具有1、2或3個胺基酸修飾；或 b.包含與SEQ ID NO: 8之序列至少80%相同之序列之VH區及/或包含與SEQ ID NO: 16之序列至少80%相同之序列之VL區。
  2. 如請求項1之FLT3LG結合蛋白，其中該a.(i)之CDR為： SEQ ID NO: 26之CDRH1、SEQ ID NO: 27之CDRH2、SEQ ID NO: 28之CDRH3、SEQ ID NO: 38之CDRL1、SEQ ID NO: 39之CDRL2、及/或SEQ ID NO:40之CDRL3。
  3. 如請求項1或2之FLT3LG結合蛋白，其中所有6個CDR係存在於該結合蛋白中。
  4. 一種FLT3LG結合蛋白，其包含下列6個CDR： SEQ ID NO: 26之CDRH1、SEQ ID NO: 27之CDRH2、SEQ ID NO: 28之CDRH3、SEQ ID NO: 38之CDRL1、SEQ ID NO: 39之CDRL2、及SEQ ID NO:40之CDRL3。
  5. 如請求項4之FLT3LG結合蛋白，其中該結合蛋白包含： 與SEQ ID NO: 8至少80%相同之VH區及與SEQ ID NO: 16至少80%相同之VL區。
  6. 如前述請求項中任一項之FLT3LG結合蛋白，其中該結合蛋白包含： 與SEQ ID NO: 50至少80%相同之HC序列及/或與SEQ ID NO: 58至少80%相同之LC序列。
  7. 如前述請求項中任一項之FLT3LG結合蛋白，其中該結合蛋白以小於或等於1 nM之KD結合至人類FLT3LG。
  8. 如前述請求項中任一項之FLT3LG結合蛋白，其中該結合蛋白以約2 nM或更少之IC50抑制可溶性FLT3LG誘導之p-AKT信號傳導。
  9. 如前述請求項中任一項之FLT3LG結合蛋白，其中該結合蛋白以約1 nM或更少之IC50抑制可溶性FLT3LG誘導之FLT3受體內化。
  10. 一種FLT3LG結合蛋白，其結合至人類FLT3LG，及與參考FLT3LG結合蛋白競爭結合至人類FLT3LG，該參考FLT3LG結合蛋白包含： SEQ ID NO: 8之VH區序列及SEQ ID NO: 16之VL區序列。
  11. 如前述請求項中任一項之FLT3LG結合蛋白，其中該結合蛋白為抗體或其抗原結合片段。
  12. 如請求項11之FLT3LG結合蛋白，其中該抗體或其抗原結合片段抑制人類FLT3LG結合至FLT3。
  13. 如請求項12之FLT3LG結合蛋白，其中該抗體或其抗原結合片段以約2 nM或更少之IC50抑制人類可溶性FLT3LG結合至FLT3。
  14. 如請求項11至13中任一項之FLT3LG結合蛋白，其中該抗體或其抗原結合片段包含經修飾之Fc區。
  15. 如請求項14之FLT3LG結合蛋白，其中該經修飾之Fc區包含胺基酸取代N297G (如根據EU索引編號)。
  16. 一種核酸序列，其編碼如前述請求項中任一項所定義之FLT3LG結合蛋白之HC及LC中之一者或二者。
  17. 如請求項16之核酸序列，其中該序列包含編碼該HC之SEQ ID NO: 66及/或編碼該LC之SEQ ID NO: 74。
  18. 一種表現載體，其包含如請求項16或17中所定義之核酸序列。
  19. 一種重組宿主細胞，其包含如請求項16或17中所定義之核酸序列或如請求項18中所定義之表現載體。
  20. 一種產生FLT3LG結合蛋白之方法，該方法包括將如請求項19中所定義之宿主細胞在適用於該(等)核酸序列或表現載體表現之條件下培養，藉此產生包含該FLT3LG結合蛋白之多肽。
  21. 一種藉由如請求項20之方法產生之FLT3LG結合蛋白。
  22. 一種經工程改造以表現如請求項1至15或21中任一項之FLT3LG結合蛋白的細胞系。
  23. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至15或21中任一項所定義之FLT3LG結合蛋白及醫藥上可接受之賦形劑。
  24. 一種治療有需要個體之自體免疫性疾病之方法，其包括向該個體投與治療上有效量之如請求項1至15或21中任一項中所定義之FLT3LG結合蛋白或如請求項23中所定義之醫藥組合物。
  25. 如請求項24之方法，其中該自體免疫性疾病為全身性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關節炎(RA)、類肉瘤病、休格連氏(Sjogren’s)症候群、或乳糜瀉。
  26. 如請求項25之方法，其中該自體免疫性疾病為SLE。
  27. 如請求項24或25之方法，其中該個體為人類。
  28. 如請求項1至15或21中任一項之FLT3LG結合蛋白或如請求項23之醫藥組合物，其用於療法中。
  29. 如請求項1至15或21中任一項之FLT3LG結合蛋白或如請求項23之醫藥組合物，其用於治療自體免疫性疾病。
  30. 如請求項29之FLT3LG結合蛋白，其中該自體免疫性疾病為全身性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關節炎(RA)、類肉瘤病、休格連氏症候群、或乳糜瀉。
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