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TW202430521A - 用於改善病毒生產之化合物 - Google Patents

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TW202430521A
TW202430521A TW112139228A TW112139228A TW202430521A TW 202430521 A TW202430521 A TW 202430521A TW 112139228 A TW112139228 A TW 112139228A TW 112139228 A TW112139228 A TW 112139228A TW 202430521 A TW202430521 A TW 202430521A
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alkyl
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cycloalkyl
hdac6 inhibitor
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TW112139228A
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一峰 靖
小龍 梁
婉翊 林
查理斯 強納森 斐勒斯
穆罕默德 阿里 曼德格
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美商特納亞治療股份有限公司
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Abstract

本發明提供使用選擇性HDAC6抑制劑(例如式I、式II或式III化合物)改善(例如增加)哺乳動物細胞(例如HEK293或HEK293T細胞)中之病毒粒子(例如AAV)之生產的方法。相對於此項技術中已知之方法，本文中所描述之某些方法實現顯著更大之病毒力價產量(例如，大2倍或更多倍之產量)。

Description

用於改善病毒生產之化合物
本發明大體上係關於用於改善哺乳動物細胞中之病毒粒子(例如，AAV)之生產的化合物及方法。
為了成功在臨床上使用基於病毒之基因療法，需要實現病毒粒子之大規模、高力價產量生產。需要改善細胞中之病毒生產以實現比使用已知生產方法所實現之力價產量更高的力價產量。
鑒於腺相關病毒(adeno-associated virus；AAV)基因療法及其他生醫應用之優點，尤其存在對改善AAV粒子生產之方法的需求。
此項技術中仍需要改善病毒生產之方法。
在一些態樣中，本發明提供一種生產病毒粒子及/或增加病毒粒子力價之方法，其包含：用病毒粒子或將在細胞中封裝成病毒粒子之重組病毒載體轉染或轉導細胞培養物中之細胞，向細胞培養物中添加選擇性HDAC6抑制劑，且在細胞培養物中培養細胞。
在一些實施例中，細胞培養物中之細胞為哺乳動物細胞。在一些實施例中，哺乳動物細胞係選自由以下細胞或細胞株組成之群：HEK293、HEK293T、HeLa、Vero、MDCK、MRC-5、PER.C6、BHK21及CHO。在一些實施例中，哺乳動物細胞為HEK293或HEK293T細胞或細胞株。
在一些實施例中，病毒粒子或重組病毒載體中之病毒為腺病毒、腺相關病毒(AAV)、慢病毒、逆轉錄病毒、疱疹病毒、單純疱疹病毒、牛痘病毒、流感病毒、輪狀病毒、A型肝炎病毒、CMV病毒、RSV病毒、輪狀病毒、水泡性口炎病毒或狂犬病病毒。在一些實施例中，病毒為AAV病毒。在一些實施例中，病毒為慢病毒。在一些實施例中，病毒為逆轉錄病毒。
在一些實施例中，與HDAC之所有其他同功酶相比，選擇性HDAC6抑制劑對HDAC6之選擇性高至少50倍或至少100倍。在一些實施例中，與HDAC之所有其他同功酶相比，選擇性HDAC6抑制劑對HDAC6之選擇性高至少500倍或至少1000倍。
在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑為氟烷基-㗁二唑衍生物。
在一些態樣中，選擇性HDAC6抑制劑為式I化合物： (I)，或其鹽，其中 R 1係選自由以下組成之群： R a係選自由H、鹵基、C 1 - 3烷基、環烷基、鹵烷基及烷氧基組成之群； R 2及R 3獨立地選自由以下組成之群：H、鹵素、烷氧基、鹵烷基、芳基、雜芳基、烷基及環烷基，其各自視情況經取代，或R 2及R 3與其所連接之原子一起形成環烷基或雜環基； R 4及R 5獨立地選自由以下組成之群：H、-(SO 2)R 2、-(SO 2)NR 2R 3、-(CO)R 2、-(CONR 2R 3)、芳基、芳基雜芳基、伸烷基芳基、雜芳基、環烷基、雜環基、烷基、鹵烷基及烷氧基，其各自視情況經取代，或R 4及R 5與其所連接之原子一起形成環烷基或雜環基，其各自視情況經取代； R 9係選自由H、C 1-C 6烷基、鹵烷基、環烷基及雜環基組成之群； X 1係選自由S、O、NH及NR 6組成之群，其中R 6係選自由C 1-C 6烷基、烷氧基、鹵烷基、環烷基及雜環基組成之群； Y係選自由CR 2、O、N、S、SO及SO 2組成之群，其中當Y為O、S、SO或SO 2時，R 5不存在且當R 4及R 5與其所連接之原子一起形成環烷基或雜環基時，Y為CR 2或N；及 n係選自0、1及2。
在一些態樣中，選擇性HDAC6抑制劑為具有下式之化合物： (Iy)，或其鹽，其中： X 1為S； R a係選自由H、鹵素及C 1 - 3烷基組成之群； R 1為 或 ； R 2係選自由以下組成之群：烷基、烷氧基及環烷基，其各自視情況經取代； R 3為H或烷基； R 4係選自由烷基、-(SO 2)R 2、-(SO 2)NR 2R 3及-(CO)R 2組成之群；及 R 5為芳基或雜芳基；或R 4及R 5與其所連接之原子一起形成雜環基，其各自視情況經取代。
在一些實施例中，R 1為 。
在一些態樣中，選擇性HDAC6抑制劑為式(Ic)化合物： (Ic)，或其鹽，其中： R a係選自由H、鹵基、C 1 - 3烷基、環烷基、鹵烷基及烷氧基組成之群； R 2係選自由以下組成之群：烷基、烷氧基及環烷基，其各自視情況經取代； R 3為H、烷基或芳基； R 4係選自由以下組成之群：H、-(SO 2)R 2、-(SO 2)NR 2R 3、-(CO)R 2、-(CONR 2R 3)、芳基、芳基雜芳基、伸烷基芳基、雜芳基、環烷基、雜環基、烷基、鹵烷基及烷氧基，其各自視情況經取代； R 5為芳基、芳基雜芳基、伸烷基芳基、雜芳基、環烷基、雜環基、烷基、鹵烷基及烷氧基，其各自視情況經取代；或R 4及R 5與其所連接之原子一起形成雜環基，其各自視情況經取代。 R 9係選自由H、C 1-C 6烷基、鹵烷基、環烷基及雜環基組成之群。
在一些實施例中，R a為H。
在一些實施例中，R 4為-(SO 2)R 2。在一些實施例中，-(SO 2)R 2為-(SO 2)烷基、-(SO 2)伸烷基雜環基、-(SO 2)鹵烷基、-(SO 2)鹵烷氧基或-(SO 2)環烷基。
在一些實施例中，R 5為雜芳基。在一些實施例中，雜芳基為5員至6員雜芳基。在一些實施例中，5員至6員雜芳基係選自由以下組成之群： 、 、 及 ，其中R b為鹵素、烷基、烷氧基、環烷基、-CN、鹵烷基或鹵烷氧基；且m為0或1。
在一些實施例中，R b為F、Cl、-CH 3、-CH 2CH 3、-CF 3、-CHF 2、-CF 2CH 3、-CN、-OCH 3、-OCH 2CH 3、-OCH(CH 3) 2、-OCF 3、-OCHF 2、-OCH 2CF 2H及環丙基。
在一些實施例中，R 5為芳基。在一些實施例中，芳基係選自由以下組成之群：苯基、3-氯苯基、3-氯-4-氟苯基、3-三氟甲基苯基、3,4-二氟苯基及2,6-二氟苯基。
在一些態樣中，選擇性HDAC6抑制劑為式(Ik)化合物： (Ik)，或其鹽，其中： R b為H、鹵素、烷基、環烷基、-CN、鹵烷基或鹵烷氧基；及 R 4為烷基、烷氧基、鹵烷基或環烷基，其各自視情況經取代。
在一些實施例中，式(Ik)化合物為具有以下結構之化合物： (Ik-1)，或其鹽。
在一些實施例中，式(Ik)化合物為具有以下結構之化合物： (Ik-2)，或其鹽。
在式(Ik)、(Ik-1)及(Ik-2)之一些實施例中，R b為鹵素、烷基、烷氧基、環烷基、-CN、鹵烷基或鹵烷氧基。在一些實施例中，R b為H、鹵素、鹵烷基或鹵烷氧基。在一些實施例中，R b為F、Cl、-CH 3、-CH 2CH 3、-CF 3、-CHF 2、-CF 2CH 3、-CN、-OCH 3、-OCH 2CH 3、-OCH(CH 3) 2、-OCF 3、-OCHF 2、-OCH 2CF 2H及環丙基。
在式(Ik)、(Ik-1)及(Ik-2)之一些實施例中，R 4為視情況經取代之烷基或環烷基。在一些實施例中，R 4為視情況經取代之烷基。在一些實施例中，R 4為烷基。
在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑為下式化合物： ，或其類似物或鹽。
在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑為下式化合物： ，或其類似物或鹽。
在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑為下式化合物： ，或其類似物或鹽。
在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑為下式化合物： ，或其類似物或鹽。
在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑為下式化合物： ，或其類似物或鹽。
在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑為下式化合物： ，或其類似物或鹽。
在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑為下式化合物： ，或其類似物或鹽。
在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑為下式化合物： ，或其類似物或鹽。
在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑為下式化合物： ，或其類似物或鹽。
在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑為下式化合物： 或其類似物或鹽。
在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑為下式化合物： 或其類似物或鹽。
在一些態樣中，選擇性HDAC6抑制劑為式(II)化合物： (II)，或其鹽， 其中： n為0或1； X為O、NR 4或CR 4R 4'； Y為鍵，CR 2R 3或S(O) 2； R 1係選自由以下組成之群：H、醯胺基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基； R 2及R 3獨立地選自由以下組成之群：H、鹵素、烷基、碳環基、雜環基、芳基、雜芳基、-(CH 2)-碳環基、-(CH 2)-雜環基、-(CH 2)-芳基及-(CH 2)-雜芳基；或 R 1及R 2與其所連接之碳原子一起形成碳環基或雜環基；或 R 2及R 3與其所連接之碳原子一起形成碳環基或雜環基；及 R 4及R 4'各自獨立地選自由以下組成之群：H、烷基、-CO 2-烷基、碳環基、雜環基、芳基、雜芳基、-(CH 2)-碳環基、-(CH 2)-雜環基、-(CH 2)-芳基及-(CH 2)-雜芳基；或 R 4及R 4'與其所連接之碳原子一起形成碳環基或雜環基； 其中各烷基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代：鹵素、鹵烷基、側氧基、羥基、烷氧基、-OCH 3、-CO 2CH 3、-C(O)NH(OH)、-CH 3、𠰌啉及-C(O)N-環丙基。
在一些實施例中，式(II)化合物係選自由以下組成之群： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 ；或其類似物或鹽。
在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑為表2、表3、表4或表5之化合物。在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑為表2、表3、表4或表5之化合物，其IC 50等於或小於0.03 µM。在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑為表2之化合物，例如其IC 50等於或小於0.03 µM。在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑為表3之化合物，例如其IC 50等於或小於0.03 µM。在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑為表4之化合物，例如其IC 50等於或小於0.03 µM。在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑為表5之化合物，例如其IC 50等於或小於0.03 µM。
在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑不為異羥肟酸。在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑不為羅西司他(rocilinostat)。
在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑係以有效達成其在細胞培養物中之濃度介於0.1 µM與100 µM之間的量添加至細胞培養物中。在一些實施例中，細胞培養物中之選擇性HDAC6抑制劑之濃度介於約0.2 µM與50 µM之間。在一些實施例中，細胞培養物中之選擇性HDAC6抑制劑介於約0.2 µM與50 µM之間。在一些實施例中，細胞培養物中之選擇性HDAC6抑制劑之濃度介於約0.5 µM與15 µM之間。在一些實施例中，細胞培養物中之選擇性HDAC6抑制劑介於約1 µM與5 µM之間。
在一些實施例中，在轉染或轉導前的7天至轉染或轉導後的7天，將選擇性HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在轉染或轉導後的至少1、2、3、4、5、6或7天，將選擇性HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在轉染或轉導前的3天至轉染或轉導後的3天，將選擇性HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在轉染或轉導前的1天至轉染或轉導後的1天，將選擇性HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在轉染或轉導之6或12小時內，將選擇性HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在轉染或轉導前的至少1、2、3、4、5、6或7天，將選擇性HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在轉染或轉導後的至少或不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天，將選擇性HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。
在一些實施例中，在轉染或轉導的同時將選擇性HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。
在一些實施例中，細胞在轉染或轉導後培養至少約2、3、4、5、6、7、8、9或10天。在一些實施例中，細胞在轉染或轉導後培養約3天或至少約3天。
在一些實施例中，細胞在以下兩種情形後培養至少約2、3、4、5、6、7、8、9或10天：(i)轉染或轉導，及(ii)選擇性HDAC6抑制劑之添加。在一些實施例中，細胞在以下兩種情形後培養約3天或至少約3天：(i)轉染或轉導，及(ii)選擇性HDAC6抑制劑之添加。
在一些實施例中，在細胞培養物中培養細胞後採集細胞。
在一些實施例中，自細胞分離或純化藉由本發明方法所生產之病毒粒子。
在一些實施例中，細胞經以下轉染：(i)將在細胞中封裝成病毒粒子之一或多種重組病毒載體，且其中細胞包含以下或進一步經以下轉染：(ii)包含一或多個輔助基因之一或多種輔助質體；及/或(iii)包含一或多個基因之一或多種質體，該一或多個基因編碼病毒複製及/或衣殼化所需之一或多個結構蛋白。
在一些實施例中，細胞經以下轉染：(i)將在細胞中封裝成病毒粒子之一或多種重組病毒載體，其中病毒載體為AAV；且其中細胞包含以下或進一步經以下轉染：(ii)包含一或多個輔助基因之一或多種輔助質體；(iii)包含rep基因及cap基因之一或多種質體。在一些實施例中，AAV為AAV9或AAV5。在一些實施例中，細胞經(i)、(ii)及(iii)同時轉染。在一些實施例中，細胞經(i)、(ii)及/或(iii)暫時轉染。在一些實施例中，細胞經(i)、(ii)及/或(iii)穩定轉染。在一些實施例中，細胞經(ii)及/或(iii)穩定轉染。
在一些實施例中，一或多種輔助質體表現腺病毒E1a基因、E1b基因、E2a基因、E4基因及VA基因中之一或多者。在一些實施例中，包含rep基因及cap基因之一或多種質體表現能夠封裝重組病毒載體之rep蛋白及cap蛋白。
在一些實施例中，用於轉染或轉導細胞培養物中之細胞的重組病毒載體包含轉殖基因。在一些實施例中，轉殖基因表現治療蛋白。在一些實施例中，重組病毒載體編碼siRNA或shRNA。在一些實施例中，重組病毒載體編碼引導RNA。
在一些實施例中，與在相同條件下但缺乏任何病毒敏化劑之情況下的病毒粒子力價相比，病毒粒子力價增加至少或超過20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、1000%或5000%。在一些實施例中，與在相同條件下但缺乏選擇性HDAC6抑制劑之情況下的病毒粒子力價相比，病毒粒子力價增加至少或超過20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、1000%或5000%。
在一些實施例中，方法進一步包含向細胞培養物中添加一或多種選自由以下組成之群的額外化合物：凋亡蛋白酶抑制劑、干擾素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes；STING)抑制劑及泛HDAC抑制劑。
在一些態樣中，本發明提供一種生產病毒粒子及/或增加病毒粒子力價之方法，其包含：用將在細胞中封裝成病毒粒子之重組AAV9載體轉染細胞培養物中之哺乳動物細胞；向細胞培養物中添加氟烷基-㗁二唑衍生物(例如式(I)、式(Ic)、式(Ik)、式(Ik-1)、式(Ik-2)或式(Iv)化合物)；及在細胞培養物中培養細胞。
在一些態樣中，本發明提供一種生產病毒粒子及/或增加病毒粒子力價之方法，其包含：用將在細胞中封裝成病毒粒子之重組AAV5載體轉染細胞培養物中之哺乳動物細胞；向細胞培養物中添加氟烷基-㗁二唑衍生物(例如式(I)、式(Ic)、式(Ik)、式(Ik-1)、式(Ik-2)或式(Iv)化合物)；及在細胞培養物中培養細胞。
在一些態樣中，氟烷基-㗁二唑衍生物為具有下式之化合物： (Iy)，或其鹽， 其中： X 1為S； R a係選自由H、鹵素及C 1 - 3烷基組成之群； R 1為 或 ； R 2係選自由以下組成之群：烷基、烷氧基及環烷基，其各自視情況經取代； R 3為H或烷基； R 4係選自由烷基、-(SO 2)R 2、-(SO 2)NR 2R 3及-(CO)R 2組成之群；及 R 5為芳基或雜芳基；或R 4及R 5與其所連接之原子一起形成雜環基，其各自視情況經取代。
在一些實施例中，R a為H。
在一些實施例中，R 1為 。
在一些實施例中，R 4為-(SO 2)R 2。在一些實施例中，-(SO 2)R 2為-(SO 2)烷基、-(SO 2)伸烷基雜環基、-(SO 2)鹵烷基、-(SO 2)鹵烷氧基或-(SO 2)環烷基。
在一些實施例中，R 5為雜芳基。在一些實施例中，雜芳基為5員至6員雜芳基。在一些實施例中，5員至6員雜芳基係選自由以下組成之群： 、 、 及 ，其中R b為鹵素、烷基、烷氧基、環烷基、-CN、鹵烷基或鹵烷氧基；且m為0或1。在一些實施例中，R b為F、Cl、-CH 3、-CH 2CH 3、-CF 3、-CHF 2、-CF 2CH 3、-CN、-OCH 3、-OCH 2CH 3、-OCH(CH 3) 2、-OCF 3、-OCHF 2、-OCH 2CF 2H及環丙基。
在一些實施例中，R 5為芳基，且芳基係選自由以下組成之群：苯基、3-氯苯基、3-氯-4-氟苯基、3-三氟甲基苯基、3,4-二氟苯基及2,6-二氟苯基。
在一些實施例中，氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
在一些實施例中，氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
在一些實施例中，氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
在一些實施例中，氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
在一些實施例中，氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
在一些實施例中，氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
在一些實施例中，氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
在一些實施例中，氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
在一些實施例中，氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
在一些實施例中，氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
在一些實施例中，氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
在一些實施例中，氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
在一些實施例中，氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
在一些實施例中，哺乳動物細胞為HEK293或HEK293T細胞或細胞株。在一些實施例中，HEK293或HEK293T細胞或細胞株具有早期譜系。在一些實施例中，細胞為ATCC 1573 HEK或類似早期譜系之另一細胞株。在一些實施例中，早期譜系具有100代或更少。
在一些實施例中，氟烷基-㗁二唑衍生物係以可有效達成其在細胞培養物中之濃度介於0.1 µM與100 µM之間，或0.2 µM與50 µM之間的量添加至細胞培養物中。在一些實施例中，細胞培養物中之氟烷基-㗁二唑衍生物之濃度介於約0.5 µM與15 µM之間。在一些實施例中，細胞培養物中之氟烷基-㗁二唑衍生物之濃度介於約1.25 µM與5 µM之間。
在一些實施例中，經轉染之哺乳動物細胞包含以下或進一步經以下轉染：包含一或多個輔助基因之一或多種輔助質體，及/或包含rep基因及cap基因之一或多種質體；視情況其中細胞經重組AAV載體、一或多種輔助質體及/或包含rep基因及cap基因之一或多種質體同時或依序轉染。在一些實施例中，一或多種輔助質體表現腺病毒E1a基因、E1b基因、E2a基因、E4基因及VA基因中之一或多者，且其中包含rep基因及cap基因之一或多種質體表現能夠封裝重組AAV之rep蛋白及cap蛋白。在一些實施例中，重組AAV包含表現治療蛋白、siRNA、shRNA或引導RNA之轉殖基因。
在一些實施例中，在轉染前的7天至轉染後的7天，將氟烷基-㗁二唑衍生物添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在轉染或轉導前的2天至轉染或轉導後的2天，將氟烷基-㗁二唑衍生物添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在轉染的同時或在轉染之12小時內，將氟烷基-㗁二唑衍生物添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在轉染前的3至10天，或在轉染前的7至10天，將氟烷基-㗁二唑衍生物添加至細胞培養物中。
在一些實施例中，與在相同條件下但缺乏氟烷基-㗁二唑抑制劑之情況下的病毒粒子力價相比，病毒粒子力價增加至少或超過20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、1000%或5000%。
在本發明方法之一些實施例中，在細胞培養物中培養細胞後採集細胞，且自細胞分離或純化病毒粒子。
在一些實施例中，本發明提供一種生產病毒粒子及/或增加病毒粒子力價之方法，其包含：用將在細胞中封裝成病毒粒子之重組AAV9載體轉染細胞培養物中之哺乳動物細胞；向細胞培養物中添加氟烷基-㗁二唑衍生物(例如式(II)或式(III)化合物)；及在細胞培養物中培養細胞。
在一些實施例中，在細胞培養物中培養細胞後採集細胞，且自細胞分離或純化病毒粒子。
在一些態樣中，本發明提供一種生產病毒粒子及/或增加病毒粒子力價之方法，其包含：用將在細胞中封裝成病毒粒子之重組AAV5載體轉染細胞培養物中之哺乳動物細胞；向細胞培養物中添加異羥肟酸衍生物(例如式(II)或式(III)化合物)；及在細胞培養物中培養細胞。
在一些實施例中，方法進一步包含向細胞培養物中添加一或多種選自由以下組成之群的額外化合物：凋亡蛋白酶抑制劑、干擾素基因刺激蛋白(STING)抑制劑及泛HDAC抑制劑。
相關申請案之交互參照
本申請案主張2022年10月14日申請之美國臨時專利申請案第63/379,567號及2023年5月17日申請之美國臨時專利申請案第63/502,894號之權利及優先權，該等案中之各者的內容以全文引用之方式併入本文中。 序列表 之 參照
與本申請案相關之序列表以電子方式提供於XML檔案型式中且特此以全文引用之方式併入本說明書中。含有序列表之XML檔案的名稱為TENA_040_01WO_SeqList_ST26.xml。XML檔案為175,560個位元組，在2023年10月11日創建，且以電子方式提交。
在一些態樣中，本發明提供用於生產病毒粒子之方法，其包含： (i) 將病毒粒子或病毒載體引入細胞培養物中之細胞中， (ii) 將選擇性HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中，及 (iii) 在細胞培養物中培養細胞。
在一些態樣中，本發明提供用於增加病毒粒子力價之方法，其包含： (i) 將病毒粒子或病毒載體引入細胞培養物中之細胞中， (ii) 將選擇性HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中，及 (iii) 在細胞培養物中培養細胞。
在一些實施例中，細胞為哺乳動物細胞，諸如HEK293細胞及HEK293T細胞。其他哺乳動物細胞，諸如通常用於病毒生產之哺乳動物細胞，亦可用於本文中所描述之方法中。
在一些實施例中，HDAC6抑制劑(HDACi)為本文中所描述或此項技術中已知的任何選擇性HDAC6抑制劑。
在一些實施例中，非選擇性HDAC6抑制劑不用於本文中所描述之方法中。在一些實施例中，泛HDAC抑制劑不用於本文中所描述之方法中。
在一些實施例中，病毒為腺病毒、腺相關病毒(AAV)、慢病毒、逆轉錄病毒、疱疹病毒、單純疱疹病毒、牛痘病毒、流感病毒、輪狀病毒、A型肝炎病毒、CMV病毒、RSV病毒、輪狀病毒或狂犬病病毒。在一些實施例中，病毒載體或病毒粒子為野生型或天然的。在一些實施例中，病毒載體或病毒粒子經基因修飾。在一些實施例中，病毒載體或病毒粒子減弱。
在一些實施例中，將病毒載體引入已包含編碼病毒封裝所需因子之基因的細胞中。在一些實施例中，將病毒載體連同攜載編碼病毒封裝所需因子之基因的一或多種質體一起引入細胞中。
在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑之添加增加細胞中之病毒生產。在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑之添加增加病毒力價及產量。
在一些實施例中，使用本文中所描述之方法在病毒生產、力價或產量方面比使用此項技術中已知用於相同目的之另一病毒敏化劑實現顯著更佳之改善。在一些實施例中，使用本文中所描述之方法在病毒生產、力價或產量方面比使用非選擇性HDAC抑制劑或泛HDAC抑制劑實現顯著更佳之改善。
本發明係基於選擇性HDAC6抑制劑(諸如本文中所描述之抑制劑)在增加各種哺乳動物細胞中之病毒生產方面的意外功效之發現。 術語
除非上下文另外指示，否則尤其意欲可以任何組合使用本文中所描述之各種特徵。此外，本發明亦涵蓋在一些實施例中，可排除或省略本文中所闡述之任何特徵或特徵之組合。舉例說明，若本說明書陳述複合物包含組分A、B及C，則尤其意欲可單獨地或以任何組合形式省略及捨棄A、B或C中之任一者或其組合。
所有數值名稱(例如，時間、濃度，包括範圍)均為近似值，其視需要藉由1.0或0.1之增量或替代地藉由+/- 15%、或替代地10%、或替代地5%、或替代地2%之變化而變化(+)或(-)。應理解，儘管未必總是明確陳述，但所有數值名稱前存在術語「約」。應理解，此類範圍型式出於便利及簡潔起見而使用，且應靈活地理解為不僅包括明確指定為範圍限制之數值，且亦包括涵蓋於此範圍內之所有個別數值或子範圍，如同明確指定各數值及子範圍一般。舉例而言，約1至約200應理解為包括1及200之明確列舉之限值，且亦包括諸如約10至約50、約20至約100等之子範圍。亦應理解，儘管未必始終明確陳述，但本文中所描述之試劑僅為例示性的，且此類試劑之等效物為此項技術中已知的。
亦如本文中所使用，「及/或」係指且涵蓋相關所列項中之一或多者的任何及所有可能組合，以及在以替代項(「或」)解釋時缺少組合。
術語「一(a)」或「一(an)」係指實體中之一或多者，亦即可指複數個參考物。因此，術語「一(a)」、「一(an)」、「一或多個」及「至少一個」在本文中可互換地使用。另外，藉由不定冠詞「一(a)」或「一(an)」提及「一元素」並不排除存在超過一種元素之可能性，除非上下文明確要求存在一種且僅存在元素中之一者。
在本申請案通篇，術語「約」用於指示值包括用以測定該值之裝置及方法之誤差的固有變化，或存在於所量測之樣品中的變化。除非另外說明或另外自上下文顯而易見，否則術語「約」意謂在高於或低於所報告數值之10%以內(除非此類數值將超過可能值之100%或低於0%)。除非另外指示，否則當與一系列值結合使用時，術語「約」適用於範圍之端點或系列中所列舉之值中之各者。如本申請案中所使用，術語「約」與「大約」等效使用。
「AAV」為腺相關病毒之縮寫。該術語涵蓋AAV之所有亞型(除指定亞型以外)，以及天然存在之形式及重組形式兩者。縮寫「rAAV」係指重組腺相關病毒。「AAV」包括AAV或任何亞型。「AAV5」係指AAV亞型5。「AAV9」係指AAV亞型9。AAV之各種血清型的基因體序列，以及天然反向末端重複(inverted terminal repeats；ITR)、Rep蛋白及衣殼次單元之序列可見於文獻或公共資料庫，諸如GenBank中。參見例如，GenBank寄存編號NC_002077 (AAV1)、AF063497 (AAV1)、NC_001401 (AAV2)、AF043303 (AAV2)、NC_001729 (AAV3)、NC_001829 (AAV4)、U89790 (AAV4)、NC_006152 (AAV5)、AF513851 (AAV7)、AF513852 (AAV8)、NC_006261 (AAV8)及AY530579 (AAV9)。描述AAV之出版物包括Srivistava等人(1983) J. Virol.45:555；Chiorini等人(1998) J. Virol.71:6823；Chiorini等人(1999) J. Virol.73:1309；Bantel-Schaal等人(1999) J. Virol.73:939；Xiao等人(1999) J. Virol.73:3994；Muramatsu等人(1996) Virol.221:208；Shade等人(1986) J. Virol.58:921；Gao等人(2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA99: 11854；Moris等人(2004) Virology33:375-383；國際專利公開案第WO2018/222503A1號、第WO2012/145601A2號、第WO2000/028061A2號、第WO1999/61601A2號及第WO1998/11244A2號；美國專利申請案第15/782,980號及第15/433,322號；及美國專利第10,036,016號、第9,790,472號、第9,737,618號、第9,434,928號、第9,233,131號、第8,906,675號、第7,790,449號、第7,906,111號、第7,718,424號、第7,259,151號、第7,198,951號、第7,105,345號、第6,962,815號、第6,984,517號及第6,156,303號。
如此項技術中所使用，「AAV載體」或「rAAV載體」係指封裝於rAAV病毒顆粒中之DNA或rAAV病毒顆粒本身，此視上下文而定。如本文中所使用，除非另外自上下文顯而易見，否則rAAV載體係指包含能夠封裝於rAAV病毒顆粒中之聚核苷酸序列，但具有rAAV病毒顆粒之衣殼或其他蛋白質的核酸(通常為質體)。通常，rAAV載體包含異源聚核苷酸序列(亦即，非AAV起源之聚核苷酸)及一或兩個側接異源聚核苷酸序列之AAV反向末端重複序列(ITR)。兩個ITR中僅一者可封裝於rAAV中且仍可維持所得rAAV病毒顆粒之感染性。參見Wu等人(2010) Mol Ther. 18:80。rAAV載體可經設計以產生單股rAAV載體(ssAAV)或自我互補rAAV載體(scAAV)。參見McCarty D. (2008) Mo . Ther. 16:1648-1656；WO2001/11034；WO2001/92551；WO2010/129021。
「AAV粒子」係指包括至少一個病毒衣殼蛋白(例如VP1)及包括衣殼蛋白之經衣殼化AAV載體(或其片段)的胞外病毒粒子。
為簡潔及清晰起見，本發明係指AAV之「一或多種衣殼蛋白」。熟習此項技術者理解，此類提及物係指VP1、VP2或VP3，或VP1、VP2與VP3之組合。如同野生型AAV及大部分重組表現系統，VP1、VP2及VP3係自相同開讀框表現，對編碼VP3之序列進行工程改造不可避免地改變VP1及VP2之C端域之序列。衣殼蛋白亦可自不同開讀框表現，在此情況下，所得rAAV病毒顆粒之衣殼可含有野生型衣殼蛋白與經工程改造之衣殼蛋白的混合物，及經工程改造之不同衣殼蛋白的混合物。
「輔助病毒功能」係指輔助病毒基因體中所編碼之功能，其允許複製及封裝。
AAV之「輔助病毒」係指允許AAV (例如野生型AAV)由哺乳動物細胞複製及封裝之病毒。輔助病毒可為腺病毒、疱疹病毒或痘病毒，諸如痘瘡。
「封裝」係指引起病毒粒子之組裝的一系列胞內事件，例如rAAV病毒粒子或病毒顆粒之組裝，包括rAAV載體之衣殼化。AAV「 rep」及「 cap」基因係指編碼腺相關病毒之複製及衣殼化蛋白之聚核苷酸序列。AAV rep及 cap在本文中稱為AAV「封裝基因」。封裝需要輔助病毒本身，或更通常存在於重組系統中之輔助病毒功能，該輔助病毒功能係由無輔助系統(亦即，一或多種輔助質體)供應。
本文中提及之病毒粒子或病毒顆粒為如下感染性病毒粒子：包含具組裝能力之病毒衣殼且能夠將聚核苷酸組分遞送至病毒粒子對其具有向性之細胞中。在一些實施例中，本文中所描述之病毒粒子具複製能力(亦即，能夠在受感染細胞中進行複製)。
如本文中所使用，術語「HDAC6」係指在人類中由 HDAC6基因編碼之酶。
如本文中所使用，術語「HDAC6抑制劑」係指抑制HDAC6之至少一種酶活性的化合物。
HDAC6抑制劑可為「選擇性」HDAC6抑制劑。如本文中所使用，術語「選擇性」係指針對此項技術中已知為「同功酶」之其他HDAC的選擇性。在一些實施例中，HDAC6相對於HDAC1之選擇性比率為約5至約30,0000，例如約5、約10、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約1000、約2000、約3000、約4000、約5000、約6000、約7000、約8000、約9000、約10,000、約15,000、約20,000、約25,000或約30,000，包括其間所有值及範圍。
舉例而言，與所有其他HDAC同功酶相比，HDAC6抑制劑對HDAC6之選擇性可為至少100倍。在一些情況下，選擇性可藉由參考另一HDAC抑制劑(諸如泛HDAC抑制劑，亦即除HDAC6以外，仍抑制除HDAC6以外之HDAC的抑制劑)判定。吉維司他(Givinostat)為泛HDAC抑制劑之實例。在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑抑制除HDAC6以外之HDAC的效果比泛HDAC抑制劑(例如，吉維司他)低至少10倍、效果低至少20倍、效果低至少30倍、效果低至少40倍、效果低至少50倍、效果低至少60倍、效果低至少70倍、效果低至少80倍、效果低至少90倍或效果低至少100倍。在一些實施例中，選擇性HDAC6抑制劑抑制除HDAC6以外之HDAC的效果比吉維司他低至少100倍。
「烷基(alkyl)」或「烷基(alkyl group)」係指具有一至十二個碳原子且藉由單鍵連接至分子之其餘部分的完全飽和、直鏈或分支鏈烴鏈。包含1至12之任何數目個碳原子之烷基包括在內。包含至多12個碳原子之烷基為C 1-C 12烷基，包含至多10個碳原子之烷基為C 1-C 10烷基，包含至多6個碳原子之烷基為C 1-C 6烷基，且包含至多5個碳原子之烷基為C 1-C 5烷基。C 1-C 5烷基包括C 5烷基、C 4烷基、C 3烷基、C 2烷基及C 1烷基(亦即甲基)。C 1-C 6烷基不僅包括上文針對C 1-C 5烷基所描述之全部部分，而且包括C 6烷基。C 1-C 10烷基不僅包括上文針對C 1-C 5烷基及C 1-C 6烷基所描述之全部部分，而且包括C 7、C 8、C 9及C 10烷基。類似地，C 1-C 12烷基不僅包括全部前述部分，而且包括C 11及C 12烷基。C 1-C 12烷基之非限制性實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、二級丙基、正丁基、異丁基、二級丁基、三級丁基、正戊基、三級戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一基及正十二基。除非在本說明書中另外特定說明，否則烷基可視情況經取代。
「伸烷基」或「伸烷基鏈」係指具有一至十二個碳原子之完全飽和、直鏈或分支鏈二價烴鏈基團。C 1-C 12伸烷基之非限制性實例包括亞甲基、伸乙基、伸丙基、伸正丁基及其類似基團。伸烷基鏈係經由單鍵連接至分子之其餘部分且經由單鍵連接至基團(例如，本文中所描述之基團)。伸烷基鏈與分子之其餘部分及與基團之連接點可經由鏈內之一個碳或任何兩個碳實現。除非在本說明書中另外特定說明，否則伸烷基鏈可視情況經取代。
「烯基(alkenyl)」或「烯基(alkenyl group)」係指具有二至十二個碳原子且具有一或多個碳-碳雙鍵之直鏈或分支鏈烴鏈。各烯基係藉由單鍵連接至分子之其餘部分。包含2至12之任何數目個碳原子之烯基包括在內。包含至多12個碳原子之烯基為C 2-C 12烯基，包含至多10個碳原子之烯基為C 2-C 10烯基，包含至多6個碳原子之烯基為C 2-C 6烯基，且包含至多5個碳原子之烯基為C 2-C 5烯基。C 2-C 5烯基包括C 5烯基、C 4烯基、C 3烯基及C 2烯基。C 2-C 6烯基不僅包括上文針對C 2-C 5烯基所描述之全部部分，而且包括C 6烯基。C 2-C 10烯基不僅包括上文針對C 2-C 5烯基及C 2-C 6烯基所描述之全部部分，而且包括C 7、C 8、C 9及C 10烯基。類似地，C 2-C 12烯基不僅包括全部前述部分，而且包括C 11及C 12烯基。C 2-C 12烯基之非限制性實例包括乙烯基(ethenyl/vinyl)、1-丙烯基、2-丙烯基(烯丙基)、異丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、4-庚烯基、5-庚烯基、6-庚烯基、1-辛烯基、2-辛烯基、3-辛烯基、4-辛烯基、5-辛烯基、6-辛烯基、7-辛烯基、1-壬烯基、2-壬烯基、3-壬烯基、4-壬烯基、5-壬烯基、6-壬烯基、7-壬烯基、8-壬烯基、1-癸烯基、2-癸烯基、3-癸烯基、4-癸烯基、5-癸烯基、6-癸烯基、7-癸烯基、8-癸烯基、9-癸烯基、1-十一烯基、2-十一烯基、3-十一烯基、4-十一烯基、5-十一烯基、6-十一烯基、7-十一烯基、8-十一烯基、9-十一烯基、10-十一烯基、1-十二烯基、2-十二烯基、3-十二烯基、4-十二烯基、5-十二烯基、6-十二烯基、7-十二烯基、8-十二烯基、9-十二烯基、10-十二烯基及11-十二烯基。除非在本說明書中另外特定說明，否則烷基可視情況經取代。
「伸烯基」或「伸烯基鏈」係指具有一或多個烯烴及二至十二個碳原子之不飽和、直鏈或分支鏈二價烴鏈基團。C 2-C 12伸烯基之非限制性實例包括伸乙烯基、伸丙烯基、伸正丁烯基及其類似基團。伸烯基鏈係經由單鍵連接至分子之其餘部分且經由單鍵連接至基團(例如，本文中所描述之基團)。伸烯基鏈與分子之其餘部分及與基團之連接點可經由鏈內之一個碳或任何兩個碳實現。除非在本說明書中另外特定說明，否則伸烯基鏈可視情況經取代。
「炔基(alkynyl)」或「炔基(alkynyl group)」係指具有二至十二個碳原子且具有一或多個碳-碳參鍵之直鏈或分支鏈烴鏈。各炔基係藉由單鍵連接至分子之其餘部分。包含2至12之任何數目個碳原子的炔基包括在內。包含至多12個碳原子之炔基為C 2-C 12炔基，包含至多10個碳原子之炔基為C 2-C 10炔基，包含至多6個碳原子之炔基為C 2-C 6炔基，且包含至多5個碳原子之炔基為C 2-C 5炔基。C 2-C 5炔基包括C 5炔基、C 4炔基、C 3炔基及C 2炔基。C 2-C 6炔基不僅包括上文針對C 2-C 5炔基所描述之全部部分，而且包括C 6炔基。C 2-C 10炔基不僅包括上文針對C 2-C 5炔基及C 2-C 6炔基所描述之全部部分，而且包括C 7、C 8、C 9及C 10炔基。類似地，C 2-C 12炔基不僅包括全部前述部分，而且包括C 11及C 12炔基。C 2-C 12炔基之非限制性實例包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基及其類似基團。除非在本說明書中另外特定說明，否則烷基可視情況經取代。
「伸炔基」或「伸炔基鏈」係指具有一或多個炔烴及二至十二個碳原子之不飽和、直鏈或分支鏈二價烴鏈基團。C 2-C 12伸炔基之非限制性實例包括伸乙炔基、伸丙炔基、伸正丁炔基及其類似基團。伸炔基鏈係經由單鍵連接至分子之其餘部分且經由單鍵連接至基團(例如，本文中所描述之基團)。伸炔基鏈與分子之其餘部分及與基團之連接點可經由具有適合價位之鏈內的任何兩個碳實現。除非本說明書中另外特定說明，否則伸炔基鏈可視情況經取代。
「烷氧基」係指式-OR a之基團，其中R a為如上文所定義之含有一至十二個碳原子的烷基、烯基或炔基。除非在本說明書中另外特定說明，否則烷氧基可視情況經取代。
「芳基」係指包含氫、6至18個碳原子及至少一個芳族環且藉由單鍵連接至分子之其餘部分的烴環系統。出於本發明之目的，芳基可為單環、雙環、三環或四環環系統，其可包括稠合或橋接環系統。芳基包括(但不限於)衍生自以下之芳基：乙烯合蒽、乙烯合萘、乙烯合菲、蒽、薁、苯、　(chrysene)、丙二烯合茀、茀、 as-二環戊二烯并苯、 s-二環戊二烯并苯、茚烷、茚、萘、萉、菲、七曜烯、芘及聯伸三苯。除非本說明書中另外特定說明，否則「芳基」可視情況經取代。
「碳環基」、「碳環(carbocyclic ring)」或「碳環(carbocycle)」係指其中形成環之原子各自為碳，且藉由單鍵連接至分子之其餘部分的環結構。碳環在環中可包含3至20個碳原子。碳環包括本文中所定義之芳基及環烷基、環烯基及環炔基。除非在本說明書中另外特定說明，否則碳環基可視情況經取代。
「碳環基烷基」係指式-R b-R d之基團，其中R b為如上文所定義之伸烷基、伸烯基或伸炔基且R d為如上文所定義之碳環基。除非在本說明書中另外特定說明，否則碳環基烷基可視情況經取代。
「環烷基」係指僅由碳原子及氫原子組成之穩定非芳族單環或多環完全飽和烴，其可包括稠合或橋接環系統，具有三至二十個碳原子(例如具有三至十個碳原子)且藉由單鍵連接至分子之其餘部分。單環環烷基包括例如環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基及環辛基。多環環烷基包括例如金剛烷基、降𦯉基(norbornyl)、十氫萘基、7,7-二甲基-雙環[2.2.1]庚基及其類似基團。除非在本說明書中另外特定說明，否則環烷基可視情況經取代。
「環烯基」係指僅由碳原子及氫原子組成之穩定非芳族單環或多環烴，其具有一或多個碳-碳雙鍵，可包括稠合或橋接環系統，具有三至二十個碳原子，較佳具有三至十個碳原子，且藉由單鍵連接至分子之其餘部分。單環環烯基包括例如環戊烯基、環己烯基、環庚烯基、環辛烯基及其類似基團。多環環烯基包括例如雙環[2.2.1]庚-2-烯基及其類似基團。除非在本說明書中另外特定說明，否則環烯基可視情況經取代。
「環炔基」係指僅由碳原子及氫原子組成之穩定非芳族單環或多環烴，其具有一或多個碳-碳參鍵，可包括稠合或橋接環系統，具有三至二十個碳原子，較佳具有三至十個碳原子，且藉由單鍵連接至分子之其餘部分。單環環炔基包括例如環庚炔基、環辛炔基及其類似基團。除非在本說明書中另外特定說明，否則環炔基可視情況經取代。
「鹵烷基」係指如上文所定義經一或多個鹵基取代之烷基，例如三氟甲基、二氟甲基、三氯甲基、2,2,2-三氟乙基、1,2-二氟乙基、3-溴-2-氟丙基、1,2-二溴乙基及其類似基團。除非在本說明書中另外特定說明，否則鹵烷基可視情況經取代。
「雜環基」、「雜環(heterocyclic ring)」或「雜環(heterocycle)」係指穩定之飽和、不飽和或芳族3員至20員環，其係由二至十九個碳原子及一至六個選自由氮、氧及硫組成之群的雜原子組成，且藉由單鍵連接至分子之其餘部分。雜環基或雜環包括雜芳基、雜環基烷基、雜環基烯基及雜環基炔基。除非在本說明書中另外特定說明，否則雜環基可為單環、雙環、三環或四環環系統，其可包括稠合或橋連環系統；且雜環基中之氮、碳或硫原子可視情況經氧化；氮原子可視情況經四級銨化；且雜環基可部分或完全飽和。此類雜環基之實例包括(但不限於)二氧戊烷基、噻吩基[1,3]二噻烷基、十氫異喹啉基、咪唑啉基、咪唑啶基、異噻唑啶基、異㗁唑啶基、𠰌啉基、八氫吲哚基、八氫異吲哚基、2-側氧基哌𠯤基、2-側氧基哌啶基、2-側氧基吡咯啶基、㗁唑啶基、哌啶基、哌𠯤基、4-哌啶酮基、吡咯啶基、吡唑啶基、　啶基、噻唑啶基、四氫呋喃基、三噻烷基、四氫哌喃基、硫代𠰌啉基、噻𠰌啉基、1-側氧基-硫代𠰌啉基及1,1-二側氧基-硫代𠰌啉基。除非在本說明書中另外特定說明，否則雜環基可視情況經取代。
「雜芳基」係指5員至20員環系統，其包含氫原子、一至十九個碳原子、一至六個選自由氮、氧及硫組成之群的雜原子、至少一個芳族環且藉由單鍵連接至分子之其餘部分。出於本發明之目的，雜芳基可為單環、雙環、三環或四環環系統，其可包括稠合或橋接環系統；且雜芳基中之氮、碳或硫原子可視情況經氧化；氮原子可視情況經四級銨化。實例包括(但不限於)氮雜卓基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并吲哚基、苯并二氧雜環戊烯基、苯并呋喃基、苯并㗁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[ b][1,4]二㗁呯基、1,4-苯并二㗁烷基、苯并萘并呋喃基、苯并㗁唑基、苯并二氧雜環戊烯基、苯并二氧雜環己烯基、苯并哌喃基、苯并哌喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基(benzothienyl/enzothiophenyl)、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、㖕啉基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、異噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、異吲哚基、吲哚啉基、異吲哚啉基、異喹啉基、吲哚𠯤基、異㗁唑基、㖠啶基、㗁二唑基、2-側氧基氮雜卓基、㗁唑基、環氧乙基、1-氧離子基吡啶基、1-氧離子基嘧啶基、1-氧離子基吡𠯤基、1-氧離子基嗒𠯤基、1-苯基-1 H-吡咯基、啡𠯤基、啡噻𠯤基、啡㗁𠯤基、呔𠯤基、喋啶基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡啶基、吡𠯤基、嘧啶基、嗒𠯤基、喹唑啉基、喹喏啉基、喹啉基、　啶基、異喹啉基、四氫喹啉基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三𠯤基及噻吩基(thiophenyl) (亦即，噻吩基(thienyl))。除非在本說明書中另外特定說明，否則雜芳基可視情況經取代。
「雜環基烷基」係指式-R b-R e之基團，其中R b為如上文所定義之伸烷基、伸烯基或伸炔基且R e為如上文所定義之雜環基。除非在本說明書中另外特定說明，否則雜環烷基烷基可視情況經取代。
本文中所使用之術語「經取代」意謂本文中所描述之基團中之任一者(例如烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、芳烷基、碳環基、環烷基、環烯基、環炔基、鹵烷基、雜環基及/或雜芳基)，其中至少一個氫原子經連接至諸如(但不限於)以下之非氫原子的鍵置換：鹵素原子，諸如F、Cl、Br及I；諸如羥基、烷氧基及酯基之基團中之氧原子；諸如硫醇基、硫代烷基、碸基、磺醯基及亞碸基之基團中之硫原子；諸如胺、醯胺、烷基胺、二烷基胺、芳基胺、烷基芳基胺、二芳基胺、N-氧化物、醯亞胺及烯胺之基團中之氮原子；諸如三烷基矽烷基、二烷基芳基矽烷基、烷基二芳基矽烷基及三芳基矽烷基之基團中之矽原子；及各種其他基團中之其他雜原子。「經取代」亦意謂以上基團中之任一者中的一或多個氫原子藉由高價鍵(例如雙鍵或參鍵)置換為雜原子，諸如側氧基、羰基、羧基及酯基中之氧；及諸如亞胺、肟、腙及腈之基團中之氮。舉例而言，「經取代」包括以上基團中之任一者中的一或多個氫原子經-NR gR h、-NR gC(=O)R h、-NR gC(=O)NR gR h、-NR gC(=O)OR h、-NR gSO 2R h、-OC(=O)NR gR h、-OR g、-SR g、-SOR g、-SO 2R g、-OSO 2R g、-SO 2OR g、=NSO 2R g及-SO 2NR gR h置換。「經取代」亦意謂以上基團中之任一者中的一或多個氫原子經-C(=O)R g、-C(=O)OR g、-C(=O)NR gR h、-CH 2SO 2R g、-CH 2SO 2NR gR h置換。在前述內容中，R g及R h相同或不同且獨立地為氫、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基胺基、硫代烷基、芳基、芳烷基、環烷基、環烯基、環炔基、環烷基烷基、鹵烷基、鹵烯基、鹵炔基、雜環基、 N-雜環基、雜環基烷基、雜芳基、 N-雜芳基及/或雜芳基烷基。「經取代」進一步意謂以上基團中之任一者中的一或多個氫原子經連接至以下的鍵置換：胺基、氰基、羥基、亞胺基、硝基、側氧基、硫酮基、鹵基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基胺基、硫代烷基、芳基、芳烷基、環烷基、環烯基、環炔基、環烷基烷基、鹵烷基、鹵烯基、鹵炔基、雜環基、 N-雜環基、雜環基烷基、雜芳基、 N-雜芳基及/或雜芳基烷基。另外，前述取代基中之各者亦可視情況經以上取代基中之一或多者取代。
如本文中所使用，符號「 」(下文可稱為「連接點鍵」)表示作為兩個化學實體之間之連接點的鍵，其中之一者描繪為連接至連接點鍵且其中之另一者不描繪為連接至連接點鍵。舉例而言，「 」指示化學實體「XY」係經由連接點鍵而鍵結至另一化學實體。此外，連接至未描繪之化學實體的特定連接點可藉由推斷指定。舉例而言，化合物CH 3-R 3，其中R 3為H或「 」推斷當R 3為「XY」時，連接點鍵與描繪為R 3鍵結至CH 3之鍵相同。
術語「醫藥學上可接受」在本文中用於指在合理醫學判斷範疇內，適用於與人類及動物之組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症、與合理益處/風險比相稱之此等化合物、材料、組合物及/或劑型。
術語「鹽」包括藉由使充當鹼之活性化合物與無機或有機酸反應以形成鹽而獲得的鹽，例如鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、甲烷磺酸鹽、樟腦磺酸鹽、草酸鹽、順丁烯二酸鹽、丁二酸鹽、檸檬酸鹽、甲酸鹽、氫溴酸鹽、苯甲酸鹽、酒石酸鹽、反丁烯二酸鹽、水楊酸鹽、杏仁酸鹽、碳酸鹽等。熟習此項技術者將進一步認識到，酸加成鹽可藉由經由多種已知方法中之任一者使化合物與適當無機或有機酸反應來製備。
術語「培養」或「細胞培養」意謂在人工活體外環境中維持細胞。「細胞培養系統」在本文中用於指其中細胞群體可以單層形式或以懸浮形式培養之培養條件。本文中所使用之「培養基」係指用於細胞之培養、生長或增殖的培養液。培養基可藉由功能特性表徵，諸如(但不限於)將細胞維持在特定狀態(例如多能狀態、靜態等)或使細胞成熟之能力；特定言之，在一些情況下，促進前驅細胞分化成特定譜系之細胞(例如心肌細胞)的能力。
如本文中所使用，術語「轉染」係指外源核酸分子被細胞吸收。當外源核酸已引入細胞膜內部時，細胞已經「轉染」。此項技術中通常已知多種轉染技術。參見例如，Graham等人(1973) Virology, 52:456，Sambrook等人(1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York，Davis等人(1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier及Chu等人(1981) Gene13:197。此類技術可用於將一或多個外源核酸分子引入適合之宿主細胞中。
如本文中所使用，術語「轉導」係指外源性核酸藉由病毒粒子或病毒顆粒轉移至細胞中。
術語「經修飾」係指與相應未經修飾之物質或化合物相比已改變或變化之物質或化合物(例如細胞、聚核苷酸序列及/或多肽序列)。
如本文中所使用，術語「轉殖基因」係指編碼蛋白質或RNA (例如，治療蛋白)之核酸序列，該核酸序列對於引入其之轉殖基因動物或細胞為部分或全部異源的(亦即，外來的)，或與引入其之轉殖基因動物或細胞之內源基因為同源的，但該核酸序列經設計以插入、或插入動物之基因體中，以此方式以便改變插入該核酸序列之細胞的基因體(例如，該核酸序列在不同於天然基因之位置處插入或其插入引起基因剔除)。轉殖基因可包括一或多個轉錄調節序列及可能為所選擇核酸之最佳表現所必需的任何其他核酸，諸如內含子。
術語「表現卡匣」係指包含編碼序列之聚核苷酸卡匣，該編碼序列編碼用於實現基因產物在靶細胞中之表現的所關注之基因產物，其可操作地連接至啟動子。除非另外說明，否則AAV載體之表現卡匣僅包括ITR之間的聚核苷酸(而不包括ITR)。
「可操作地連接(operatively linked)」或「可操作地連接(operably linked)」係指基因元件之並接，其中元件呈允許其以預期方式操作之關係。舉例而言，若啟動子有助於起始編碼序列之轉錄，則該啟動子係可操作地連接至編碼區。在啟動子與編碼區之間可能存在介入殘基，只要維持此功能關係即可。
「重組」應用於聚核苷酸時意謂，該聚核苷酸為選殖、限制或接合步驟與其他程序之各種組合的產物，從而產生與自然界中所發現之聚核苷酸不同的構築體，或該聚核苷酸係由合成寡核苷酸組裝。「重組」蛋白質為由重組多肽產生之蛋白質。重組病毒顆粒為包含重組聚核苷酸及/或重組蛋白(例如重組衣殼蛋白)之病毒顆粒。
術語「經分離」意謂與其中病毒顆粒、細胞、組織、聚核苷酸、肽、多肽或蛋白質通常天然締合之成分、細胞物質及其他物質分離。舉例而言，經分離之細胞為與具有相異表現型或基因型之組織或細胞分離的細胞。
如本文中所使用，術語「經純化」係指已在減少或排除不相關材料(亦即，雜質)存在之條件下分離的材料，包括製得該材料之天然材料。舉例而言，經純化之rAAV載體DNA較佳實質上不含細胞或培養組分，包括組織培養組分、污染物及其類似物。
除非另外指示，否則本發明之實踐將使用屬於此項技術之技能範圍內的組織培養、免疫學、分子生物學、細胞生物學及重組DNA之習知技術。參見例如，Sambrook及Russell編(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第3版；Ausubel等人編(2007) Current Protocols in Molecular Biology; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；MacPherson等人(1991) PCR 1: A Practical Approach (Oxford University Press之IRL Press)；MacPherson等人(1995) PCR 2: A Practical Approach；Harlow及Lane編(1999) Antibodies, A Laboratory Manual；Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique,第5版；Gait編(1984) Oligonucleotide Synthesis；美國專利第4,683,195號；Hames及Higgins編(1984) Nucleic Acid Hybridization；Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization；Hames及Higgins編(1984) Transcription and Translation；IRL Press (1986) Immobilized Cells and Enzymes；Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller及Calos編(1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides編(2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells；Mayer及Walker編(1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London)；Herzenberg等人編(1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology；Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual,第3版(2002) Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sohail (2004) Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application (CRC Press)；及Sell (2013) Stem Cells Handbook。 根據本發明改善病毒生產之方法
本發明提供選擇性組蛋白去乙醯酶6抑制劑(HDAC6抑制劑或HDACi)，其用於改善細胞中之病毒生產。在一些實施例中，本發明提供選擇性HDAC6i，其用於增加哺乳動物細胞(例如，HEK293或HEK293T)中之病毒生產。在一些實施例中，本文中所描述之方法增加病毒力價。在一些實施例中，本文中所描述之方法增加病毒產量。在一些實施例中，當用於至少或至多3公升(L)、50 L或200 L細胞培養物(例如，在生物反應器中生產)時，本文中所描述之方法增加病毒生產。在一些實施例中，當用於至少或至多1 kL細胞培養物(例如，在生物反應器中生產)時，本文中所描述之方法增加病毒生產。在一些實施例中，本文中所描述之方法在至多或至少200 L細胞培養物中(例如在生物反應器中)實現或維持一致之病毒產量。在一些實施例中，使用本文中所描述之方法改善病毒生產並不依賴生產規模。在一些實施例中，使用本文中所描述之方法改善病毒生產並不依賴培養基。在一些實施例中，使用本文中所描述之方法改善病毒生產並不依賴細胞或細胞株。在一些實施例中，本文中所描述之方法增加病毒重現或複製。在一些實施例中，本文中所描述之方法增加病毒封裝。在一些實施例中，本文中所描述之方法對病毒產物品質無影響(例如，藉由所產生之AAV中之一致VP1/VP2/VP3比率所量測)。在一些實施例中，本文中所描述之方法對病毒產物純化回收無影響。在一些實施例中，本文中所描述之方法對病毒產物活體內轉導效率(例如，心臟轉導及/或肝臟轉導)無影響。在一些實施例中，本文中所描述之方法增加以下中之一或多者：(i)用病毒載體或病毒進行之細胞轉染或轉導，(ii)病毒擴散，及(iv)病毒之轉殖基因表現。在一些實施例中，本文中所描述之方法增加活體外病毒感染性。在一些實施例中，本文中所描述之方法增加活體外RNA及/或蛋白質表現(例如，病毒之轉殖基因表現)。在一些實施例中，本文中所描述之方法增加活體內病毒感染力。在一些實施例中，本文中所描述之方法增加病毒之轉殖基因之活體內RNA及/或蛋白質表現。
在一些實施例中，本文提供一種用於生產病毒粒子之方法，其包含： (i) 將病毒載體，視情況連同攜載用於封裝病毒載體之基因的一或多種質體一起，引入細胞培養物中之細胞中； (ii) 將選擇性HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中，該添加可在步驟(i)之前、同時或之後進行； (iii) 在細胞培養物中培養細胞某一時段，及 (iv) 分離及/或純化包含經封裝之病毒載體之病毒粒子。
適用於本文中所描述之方法的例示性細胞描述於下文中。如本文中所描述，在一些實施例中，細胞為適用於病毒生產之哺乳動物細胞，諸如HEK293或HEK293T細胞。
在一些實施例中，本文中所描述之細胞或細胞株維持在細胞培養基(諸如本文中所描述或此項技術中已知的任何細胞培養基)中。在一些實施例中，本文中所描述之細胞或細胞株維持在含有血清(例如，FBS)之細胞培養基中。在一些實施例中，本文中所描述之細胞或細胞株維持在無血清之細胞培養基中。
適用於本文中所描述之方法的例示性病毒及病毒載體描述於下文中。如本文中所描述，在一些實施例中，所產生之病毒為AAV、慢病毒或逆轉錄病毒。
在一些實施例中，細胞經一或多種攜載轉殖基因之病毒載體轉染。轉殖基因可為任何轉殖基因，例如攜載編碼治療蛋白之轉殖基因。或者，病毒載體可用於表現治療RNA分子，諸如siRNA、shRNA或引導RNA，以用於選擇性靶向與疾病或病症相關之蛋白質之表現。
在一些實施例中，細胞進一步經一或多種輔助質體或輔助病毒(諸如腺病毒)轉染。在一些實施例中，細胞經攜載宿主細胞之病毒生產所需之輔助功能基因(諸如AAV複製)的質體轉染。在一些實施例中，細胞進一步經包含病毒結構蛋白(例如，包含攜載轉殖基因之載體中缺乏之病毒結構蛋白)的一或多種載體或質體轉染。在一些實施例中，細胞進一步經一或多種載體或質體轉染，該一或多種載體或質體包含攜載轉殖基因之載體的複製及/或衣殼化所需之病毒結構蛋白。在一些實施例中，病毒生產所需之基因物質經暫時轉染至細胞中。在一些實施例中，病毒生產所需之基因物質經穩定插入至細胞基因體中。在一些實施例中，細胞為封裝細胞，其包含病毒生產所需之基因但不包含攜載轉殖基因之載體基因體。在一些實施例中，細胞為生產細胞，其包含病毒生產所需之基因及攜載轉殖基因之載體基因體。
在一些實施例中，細胞經攜載轉殖基因之AAV載體、輔助質體及攜載編碼rep蛋白及cap蛋白之基因的一或多種載體或質體轉染。攜載轉殖基因之例示性病毒載體、例示性輔助質體及攜載編碼rep蛋白及cap蛋白之基因的例示性載體展示於 圖 1 至圖 8中，且其序列展示於表6中。
在一些實施例中，複製及/或衣殼化所需之一或多個編碼病毒結構蛋白之核酸經穩定整合至細胞，諸如用於病毒生產之生產細胞中。在一些實施例中，此類核酸係以染色體形式整合至細胞中。在一些實施例中，複製及/或衣殼化所需之一或多個編碼病毒結構蛋白之核酸經暫時轉染至細胞，諸如用於病毒生產之生產細胞中。
在一些實施例中，一或多個輔助功能基因(諸如宿主細胞之病毒生產所需的此等功能基因，例如AAV複製)經穩定整合至細胞，諸如用於病毒生產之生產細胞中。在一些實施例中，此類基因係以染色體形式整合至細胞中。在一些實施例中，一或多個輔助功能基因(諸如宿主細胞之病毒生產所需的此等功能基因，例如AAV複製)經暫時轉染至細胞，諸如用於病毒生產之生產細胞中。
在一些實施例中，一或多個轉殖基因(例如，編碼治療性基因產物)經穩定整合至細胞，諸如用於病毒生產之生產細胞中。在一些實施例中，此類轉殖基因係以染色體形式整合至細胞中。在一些實施例中，一或多個轉殖基因(例如，編碼治療性基因產物)經暫時轉染至細胞，諸如用於病毒生產之生產細胞中。
在一些實施例中，編碼rep蛋白之基因、編碼cap蛋白之基因、編碼輔助功能之基因及編碼治療性基因產物之轉殖基因中之一者、兩者、三者或更多者經穩定整合至細胞，諸如用於病毒生產之生產細胞中。在一些實施例中，此類經穩定整合之基因係以染色體形式整合至細胞中。在一些實施例中，編碼rep蛋白之基因、編碼cap蛋白之基因、編碼輔助功能之基因及/或編碼治療性基因產物之轉殖基因中之一者、兩者、三者或更多者經暫時整合至細胞，諸如用於病毒生產之生產細胞中。
在一些實施例中，編碼rep蛋白之基因、編碼cap蛋白之基因、編碼輔助功能之基因及編碼治療性基因產物之轉殖基因全部暫時轉染至細胞中。
在一些實施例中，細胞與上文所描述之載體/質體(諸如攜載轉殖基因之病毒載體、輔助質體及攜載病毒複製及/或衣殼化所需之結構蛋白的載體/質體)同時轉染。在一些實施例中，細胞與上文所描述之載體/質體(諸如攜載轉殖基因之病毒載體、輔助質體及攜載病毒複製及/或衣殼化所需之結構蛋白的載體/質體)依序轉染。
在一些實施例中，已包含rep、cap及/或輔助功能基因(例如，經rep、cap及/或輔助功能基因穩定轉染)之細胞隨後進一步經攜載轉殖基因之AAV載體轉染。
在一些實施例中，當細胞存活率達到約或超過90%時，細胞經載體或質體轉染。在一些實施例中，當轉染時之細胞密度介於約0.5E+6至50E+6個細胞/毫升之間時，細胞經載體或質體轉染。在一些實施例中，當轉染時之細胞密度介於約0.5E+6至25E+6個細胞/毫升之間時，細胞經載體或質體轉染。在一些實施例中，當轉染時之細胞密度介於約1E+6至25E+6個細胞/毫升之間時，細胞經載體或質體轉染。在一些實施例中，當轉染時之細胞密度介於約1E+6至10E+6個細胞/毫升之間時，細胞經載體或質體轉染。在一些實施例中，當轉染時之細胞密度介於約1E+6至5E+6個細胞/毫升之間時，細胞經載體或質體轉染。在一些實施例中，當轉染時之細胞密度介於約1.5E+6至3E+6個細胞/毫升之間時，細胞經載體或質體轉染。在一些實施例中，當轉染時之細胞密度為約2E+6個細胞/毫升時，細胞經載體或質體轉染。在一些實施例中，轉染時之細胞密度介於約0.5E+6至50E+6個細胞/毫升之間。在一些實施例中，轉染時之細胞密度介於約0.5E+6至25E+6個細胞/毫升之間。在一些實施例中，轉染時之細胞密度介於約1E+6至25E+6個細胞/毫升之間。在一些實施例中，轉染時之細胞密度介於約1E+6至10E+6個細胞/毫升之間。在一些實施例中，轉染時之細胞密度介於約1E+6至5E+6個細胞/毫升之間。在一些實施例中，轉染時之細胞密度介於約1.5E+6至3E+6個細胞/毫升之間。在一些實施例中，轉染時之細胞密度為約2E+6個細胞/毫升。在一些實施例中，本文中所提及之細胞密度為活細胞密度。
細胞之轉染可使用此項技術中已知或本文中所描述之任何轉染方法及試劑進行。在一些實施例中，轉染為基於化學之轉染。適合之轉染試劑包括(但不限於)基於磷酸鈣、基於陽離子性聚合物、基於陽離子型脂質及基於非脂質體之試劑。在一些實施例中，轉染為物理轉染。物理轉染方法包括(但不限於)電穿孔、聲穿孔(sonoporation)及基於磁性奈米粒子之方法。
在一些實施例中，任何適合之培養基均可用於本文中所描述之細胞培養物中。適合之培養基為此項技術中已知的。在一些實施例中，使用無血清培養基。在一些實施例中，使用化學成分確定之培養基。在一些實施例中，培養基包含血清。在一些實施例中，培養基包含胎牛血清(FBS)。在一些實施例中，培養基為DMEM、MEM或已知用於哺乳動物細胞(諸如HEK293細胞)之任何培養基。在一些實施例中，培養基包含一或多種緩衝液、鹽、營養素、維生素或其他添加劑。在一些實施例中，培養基不包含已知會改善病毒生產之任何試劑(除了所添加之選擇性HDAC6抑制劑以外)。在一些實施例中，培養基為可商購之培養基，且不包含任何添加劑。
在一些實施例中，細胞在懸浮培養物中培養。在一些實施例中，細胞在貼壁依附性培養物中培養。在一些實施例中，細胞在燒瓶(例如，轉瓶)中生長。在一些實施例中，細胞在生物反應器中生長。
適用於本文中所描述之方法的例示性HDAC6抑制劑描述於下文中。在一些實施例中，將HDAC6抑制劑添加至於溶液中之細胞培養物中。
在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係在細胞解凍(將用於病毒生產)時添加至細胞培養物中。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係在細胞培養維持及/或擴增期間添加至細胞培養物中。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係在經一或多種質體或載體轉染時添加至細胞培養物中。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑與一或多種質體或載體同時添加至細胞培養物中。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係在經一或多種質體或載體轉染的同一天添加至細胞培養物中。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑與一或多種質體或載體依序(例如，依序但在同一天，或依序且在不同天)添加至細胞培養物中。
在一些實施例中，在經攜載轉殖基因之病毒載體轉染前的10天至轉染後的10天，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在經攜載轉殖基因之病毒載體轉染前的10天或更短時間(例如，轉染前至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1天)，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在經攜載轉殖基因之病毒載體轉染後的10天或更短時間(例如，轉染後至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天)，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在經本文中所描述之載體/質體(諸如攜載轉殖基因之病毒載體、輔助質體或病毒，及/或編碼病毒複製及/或衣殼化所需之結構蛋白的載體或質體)轉染前約10天(例如，轉染前的10、9、8、7、6、5、4、3、2或1天)至轉染後約10天(例如，轉染後的10、9、8、7、6、5、4、3、2或1天) (及此等值之間的任何時間值)，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。
在一些實施例中，在經攜載轉殖基因之病毒載體轉染前約7天至轉染後的7天，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在經本文中所描述之載體/質體(諸如攜載轉殖基因之病毒載體、輔助質體或病毒，及/或編碼病毒複製及/或衣殼化所需之結構蛋白的載體或質體)轉染前約7天至轉染後的7天，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。
在一些實施例中，在經攜載轉殖基因之病毒載體轉染前約5天至轉染後的5天，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在經本文中所描述之載體/質體(諸如攜載轉殖基因之病毒載體、輔助質體或病毒，及/或編碼病毒複製及/或衣殼化所需之結構蛋白的載體或質體)轉染前約5天至轉染後的5天，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。
在一些實施例中，在經攜載轉殖基因之病毒載體轉染前約3天至轉染後的3天，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在經本文中所描述之載體/質體(諸如攜載轉殖基因之病毒載體、輔助質體或病毒，及/或編碼病毒複製及/或衣殼化所需之結構蛋白的載體或質體)轉染前約3天至轉染後的3天，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。
在一些實施例中，在經攜載轉殖基因之病毒載體轉染前約1天至轉染後的1天，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在經本文中所描述之載體/質體(諸如攜載轉殖基因之病毒載體、輔助質體或病毒，及/或編碼病毒複製及/或衣殼化所需之結構蛋白的載體或質體)轉染前的1天至轉染後約1天，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。
在一些實施例中，在與經攜載轉殖基因之病毒載體轉染時約相同時間(例如，在3、6、12或18小時內)，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在與經本文中所描述之載體/質體(諸如攜載轉殖基因之病毒載體、輔助質體或病毒，及/或編碼病毒複製及/或衣殼化所需之結構蛋白的載體或質體)轉染時約相同時間(例如，在3、6、12或18小時內)，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。
在一些實施例中，在經本文中所描述之載體/質體(諸如攜載轉殖基因之病毒載體、輔助質體或病毒，及/或編碼病毒複製及/或衣殼化所需之結構蛋白的載體或質體)轉染的同一天(例如，在6、12或24小時內)，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在經攜載轉殖基因之病毒載體轉染的同一天(例如，在6、12或24小時內)，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在經本文中所描述之載體/質體(諸如攜載轉殖基因之病毒載體、輔助質體或病毒，及/或編碼病毒複製及/或衣殼化所需之結構蛋白的載體或質體)轉染的同時，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在經攜載轉殖基因之病毒載體轉染的同時，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。
在一些實施例中，在經攜載轉殖基因之病毒載體轉染前約1至7天，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在經攜載轉殖基因之病毒載體轉染前的至少1、2、3、4、5、6或7天(例如，轉染前的至少3天)，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在經本文中所描述之載體/質體(諸如攜載轉殖基因之病毒載體、輔助質體或病毒，及/或編碼病毒複製及/或衣殼化所需之結構蛋白的載體或質體)轉染前約1至7天，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在經本文中所描述之載體/質體(諸如攜載轉殖基因之病毒載體、輔助質體或病毒，及/或編碼病毒複製及/或衣殼化所需之結構蛋白的載體或質體)轉染前的至少1、2、3、4、5、6或7天(例如，轉染前的至少3天)，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。
在一些實施例中，在經攜載轉殖基因之病毒載體轉染前約5至10天或7至10天，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在經攜載轉殖基因之病毒載體轉染前的至少5天，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在經攜載轉殖基因之病毒載體轉染前的至少7天，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在經攜載轉殖基因之病毒載體轉染前不超過10天，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在經本文中所描述之載體/質體(諸如攜載轉殖基因之病毒載體、輔助質體或病毒，及/或編碼病毒複製及/或衣殼化所需之結構蛋白的載體或質體)轉染前約5至10天或7至10天，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在經本文中所描述之載體/質體(諸如攜載轉殖基因之病毒載體、輔助質體或病毒，及/或編碼病毒複製及/或衣殼化所需之結構蛋白的載體或質體)轉染前的至少5或7天，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在經本文中所描述之載體/質體(諸如攜載轉殖基因之病毒載體、輔助質體或病毒，及/或編碼病毒複製及/或衣殼化所需之結構蛋白的載體或質體)轉染前不超過10天，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。
在一些實施例中，在經攜載轉殖基因之病毒載體轉染後約1至7天，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在經攜載轉殖基因之病毒載體轉染後的至少1、2、3、4、5、6或7天(例如，轉染後的至少3天)，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在經本文中所描述之載體/質體(諸如攜載轉殖基因之病毒載體、輔助質體或病毒，及/或編碼病毒複製及/或衣殼化所需之結構蛋白的載體或質體)轉染後約1至7天，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。在一些實施例中，在經本文中所描述之載體/質體(諸如攜載轉殖基因之病毒載體、輔助質體或病毒，及/或編碼病毒複製及/或衣殼化所需之結構蛋白的載體或質體)轉染後的至少1、2、3、4、5、6或7天(例如，轉染後的至少3天)，將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養物中。
在一些實施例中，細胞培養物與HDAC6抑制劑接觸至少或超過1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在一些實施例中，細胞培養物與HDAC6抑制劑接觸至少或超過2或3天。
在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以約0.1 µM至100 µM之間的濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以約0.2 µM至75 µM之間的濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以約0.2 µM至50 µM之間的濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以約0.5 µM至25 µM之間的濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以約0.5 µM至20 µM之間的濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以約0.5 µM至10 µM之間的濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以約0.5 µM至5 µM之間的濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以約0.75 µM至15 µM之間的濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以約0.75 µM至10 µM之間的濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以約0.75 µM至5 µM之間的濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以約1 µM至3 µM之間的濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以約1 µM至2.5 µM之間的濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以約1.25 µM至2.5 µM之間的濃度使用。
本文中所描述之HDAC6抑制劑之濃度係在將本文中所描述之HDAC6抑制劑添加至細胞培養基之後細胞培養基中之最終濃度。
在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以低於500 µM之濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以低於250 µM之濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以低於200 µM之濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以低於150 µM之濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以等於或低於100 µM之濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以等於或低於75 µM之濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以等於或低於約50 µM之濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以等於或低於約25 µM之濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以等於或低於約15 µM之濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以等於或低於約10 µM之濃度使用。
在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以約0.75 µM之濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以約1 µM之濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以約1.25 µM之濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以約1.5 µM之濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以約2 µM之濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以約2.5 µM之濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以約3 µM之濃度使用。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑係以約5 µM之濃度使用。
在一些實施例中，在轉染後的3至10天之間採集細胞以用於病毒粒子分離及/或純化。在一些實施例中，在轉染後的至少或超過3天採集細胞以用於病毒粒子分離及/或純化。在一些實施例中，在轉染後的至少或超過4天採集細胞以用於病毒粒子分離及/或純化。在一些實施例中，在轉染後的至少或超過5天採集細胞以用於病毒粒子分離及/或純化。在一些實施例中，在轉染後的至少或超過6天採集細胞以用於病毒粒子分離及/或純化。在一些實施例中，在轉染後的至少或超過7天採集細胞以用於病毒粒子分離及/或純化。在一些實施例中，在轉染後的至少或超過8天採集細胞以用於病毒粒子分離及/或純化。在一些實施例中，在轉染後的10天或更短時間採集細胞以用於病毒粒子分離及/或純化。在一些實施例中，在轉染後的9天或更短時間採集細胞以用於病毒粒子分離及/或純化。在一些實施例中，在轉染後的8天或更短時間採集細胞以用於病毒粒子分離及/或純化。在一些實施例中，在轉染後的7天或更短時間採集細胞以用於病毒粒子分離及/或純化。
在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑可以0.25 mM至1 mM之儲備液濃度稀釋於1 mM至100 mM DMSO中。隨後可在轉染前的7天至轉染後的7天，將儲備溶液以0.1 µM至100 µM之間的工作濃度添加至細胞培養物(例如，HEK293或HEK293T細胞)中。隨後可在轉染後的3天至10天之間採集細胞以用於病毒粒子純化。
在一些實施例中，細胞經處理以釋放病毒粒子。在一些實施例中，藉由溶解採集細胞。可藉由此項技術中已知之任何化學或酶方法進行溶解。舉例而言，蛋白酶、核酸酶、核酸內切酶、清潔劑或界面活性劑可用於細胞溶解。或者，可藉由此項技術中已知之任何物理破壞方法(例如，音波處理、冷凍/解凍)進行細胞溶解。在一些實施例中，在無細胞溶解之情況下，例如藉由收集所分泌之病毒粒子來收集病毒。
在一些實施例中，病毒粒子自細胞溶解物或所收集之上清液進一步純化以移除細胞碎片。可使用此項技術中已知之任何方法進行病毒粒子之純化。可使用之例示性方法包括(但不限於)親和力層析法(諸如瓊脂糖親和樹脂)、陰離子交換層析法及密度梯度純化(諸如基於碘克沙醇及基於氯化銫)。離心及/或過濾方法可用於病毒粒子純化。
可使用此項技術中已知之任何方法對病毒粒子產量進行定量。舉例而言，可使用定量PCR、光密度或點狀墨點雜交(dot-blot hybridization)。
在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑使病毒產量或力價增強至少或超過20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%、2000%、3000%、4000%、5000%、6000%、7000%、8000%、9000%、10000%、11000%、12000%或15000% (例如，相對於在相同條件下但不含本文中所描述之HDAC6抑制劑之病毒產量或力價)。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑使病毒產量或力價增強至少或超過20%。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑使病毒產量或力價增強至少或超過25%。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑使病毒產量或力價增強至少或超過30%。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑使病毒產量或力價增強至少或超過40%。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑使病毒產量或力價增強至少或超過50%。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑使病毒產量或力價增強至少或超過5000%。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑使病毒產量或力價增強至少或超過9000%。
在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑使病毒產量或力價增強至少或超過20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%、2000%、3000%、4000%、5000%、6000%、7000%、8000%、9000%、10000%、11000%、12000%或15000% (例如，相對於不含本文中所描述之HDAC6抑制劑之病毒產量或力價)。
在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑使慢病毒產量或力價增強至少或超過20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%、2000%、3000%、4000%、5000%、6000%、7000%、8000%、9000%、10000%、11000%、12000%或15000% (例如，相對於不含本文中所描述之HDAC6抑制劑之病毒產量或力價)。
在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑使逆轉錄病毒產量或力價增強至少或超過20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%、2000%、3000%、4000%、5000%、6000%、7000%、8000%、9000%、10000%、11000%、12000%或15000% (例如，相對於不含本文中所描述之HDAC6抑制劑之病毒產量或力價)。
在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑使病毒產量或力價(例如，AAV、慢病毒或逆轉錄病毒)增強至少或超過1.25倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍或100倍(例如，相對於在相同條件下但不含本文中所描述之HDAC6抑制劑之病毒產量或力價)。在一些實施例中，本文中所描述之HDAC6抑制劑使病毒產量或力價(例如，AAV、慢病毒或逆轉錄病毒)增強至少或超過2倍。 用於本文中所描述之方法中的細胞
在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的細胞為哺乳動物細胞。
在一些實施例中，任何哺乳動物細胞或細胞株均可用於本文中所描述之方法中。在一些實施例中，哺乳動物細胞或細胞株為此項技術中已知將用於生產病毒載體或粒子(例如，AAV、慢病毒或逆轉錄病毒)之任何哺乳動物細胞或細胞株。在一些實施例中，哺乳動物細胞或細胞株為此項技術中已知將用作生產病毒載體或粒子(例如，AAV、慢病毒或逆轉錄病毒)之寄主細胞的任何哺乳動物細胞或細胞株。在一些實施例中，任何可商購之哺乳動物細胞株均可用於本文中所描述之方法中，例如已知適用於生產病毒載體或粒子之方法中之任一者。
在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的細胞為人類細胞。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的細胞為哺乳動物細胞株。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的細胞為人類細胞株。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的細胞為哺乳動物胚胎細胞(例如，人類胚胎細胞)。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的細胞為哺乳動物胚胎細胞株(例如，人類胚胎細胞株)。
在一些實施例中，細胞為靈長類細胞。在一些實施例中，細胞為小鼠、狗、貓、大鼠、豬或馬之細胞及其類似細胞。
在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的細胞為腎細胞。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的細胞為人類胚胎腎細胞。
在一些實施例中，細胞為早期譜系細胞。在一些實施例中，細胞為藉由倍增或世代之總數目所評定之早期譜系細胞。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的細胞已經歷100次或更少之倍增或世代。
在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的細胞或細胞株係選自由以下組成之群：HEK293、HEK293T、HeLa、Vero、MDCK、MRC-5、PER.C6、BHK21及CHO。
在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的細胞為HEK293或HEK293T細胞。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的細胞為HEK293細胞株或HEK293T細胞株。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的細胞為HEK293細胞或細胞株。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的細胞為HEK293T細胞或細胞株。在一些實施例中，本文中所描述或此項技術中已知的任何HEK293或HEK293T細胞均可用於本文中所描述之方法中。
在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的細胞為HEK293細胞之殖株衍生物。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的細胞為HEK293F細胞、HEK293T細胞或HEK293-EXPI293細胞。
在一些實施例中，細胞為「年輕」或早期譜系之HEK293或HEK293T細胞。在一些實施例中，HEK293或HEK293T細胞比可商購之HEK293細胞株(例如，ThermoFisher之Thermo Expi293)年輕至少或超過100、125、150、200、250、500或1000代。在一些實施例中，已經歷200次或更少之倍增或世代的HEK293細胞係用於本文中所描述之方法中。在一些實施例中，已經歷100次或更少之倍增或世代的HEK293細胞係用於本文中所描述之方法中。在一些實施例中，已經歷200次或更少之倍增或世代的HEK293T細胞係用於本文中所描述之方法中。在一些實施例中，已經歷100次或更少之倍增或世代的HEK293T細胞係用於本文中所描述之方法中。
在一些實施例中，HEK293或HEK293T細胞係選自由以下組成之群：Expi-293細胞、Expi-239細胞、VPC 2.0 HEK293、ATCC 1573 HEK細胞及ATCC 3216 HEK293T。
在一些實施例中，Expi-293細胞或細胞株係用於本文中所描述之方法中(諸如此項技術中已知或本文中所描述之任何Expi-293)。
在一些實施例中，Expi-239細胞或細胞株係用於本文中所描述之方法中(諸如此項技術中已知或本文中所描述之任何Expi-239)。
在一些實施例中，VPC 2.0 HEK293細胞或細胞株係用於本文中所描述之方法中(諸如此項技術中已知或本文中所描述之任何VPC 2.0 HEK293)。
在一些實施例中，ATCC 1573 HEK細胞或細胞株係用於本文中所描述之方法中(諸如此項技術中已知或本文中所描述之任何ATCC 1573 HEK)。
在一些實施例中，ATCC 3216 HEK293T細胞或細胞株係用於本文中所描述之方法中(諸如此項技術中已知或本文中所描述之任何ATCC 3216 HEK293T)。
在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的細胞或細胞株為以下中之任一者：HeLa、Vero、MDCK、MRC-5、PER.C6、BHK21及CHO。在一些實施例中，HeLa細胞或細胞株係用於本文中所描述之方法中。在一些實施例中，Vero細胞或細胞株係用於本文中所描述之方法中。在一些實施例中，MDCK細胞或細胞株係用於本文中所描述之方法中。在一些實施例中，MRC-5細胞或細胞株係用於本文中所描述之方法中。在一些實施例中，PER.C6細胞或細胞株係用於本文中所描述之方法中。在一些實施例中，BHK21細胞或細胞株係用於本文中所描述之方法中。在一些實施例中，CHO細胞或細胞株係用於本文中所描述之方法中。
在一些實施例中，本文中所描述之細胞或細胞株維持在細胞培養基(諸如本文中所描述或此項技術中已知的任何細胞培養基)中。在一些實施例中，本文中所描述之細胞或細胞株維持在含有血清之細胞培養基中。在一些實施例中，本文中所描述之細胞或細胞株維持在無血清之細胞培養基中。 用於本文中所描述之方法中的病毒載體及粒子
在一些實施例中，本文中所描述之方法中的病毒載體或粒子為(或衍生自)腺病毒、腺相關病毒(AAV)、慢病毒、逆轉錄病毒、疱疹病毒、單純疱疹病毒、牛痘病毒、流感病毒、輪狀病毒、A型肝炎病毒、CMV病毒、RSV病毒、狂犬病病毒、微小病毒、披衣病毒、痘病毒、α病毒、金絲雀痘病毒(canarypox virus)、副黏液病毒(paramyoxovirus)、水泡性口炎病毒、桿狀病毒、BacMam病毒或仙台病毒(Sendai virus)。
在一些實施例中，本文中所描述之方法中的病毒載體或粒子為(或衍生自)腺病毒、腺相關病毒(AAV)、慢病毒、逆轉錄病毒、疱疹病毒、單純疱疹病毒、牛痘病毒、流感病毒、輪狀病毒、A型肝炎病毒、CMV病毒、RSV病毒、水泡性口炎病毒或狂犬病病毒。
在一些實施例中，病毒載體或粒子為(或衍生自) AAV (例如，重組AAV，rAAV)。
在一些實施例中，病毒載體或粒子為(或衍生自)慢病毒(例如，重組慢病毒)。
在一些實施例中，病毒載體或粒子為(或衍生自)逆轉錄病毒(例如，重組逆轉錄病毒)。
在一些實施例中，病毒載體或粒子為(或衍生自)腺病毒(例如，重組腺病毒)。
在一些實施例中，病毒載體或粒子為(或衍生自)疱疹病毒(例如，重組疱疹病毒)。
在一些實施例中，病毒載體或粒子為(或衍生自)單純疱疹病毒(例如，重組單純疱疹病毒)。
在一些實施例中，病毒載體或粒子為(或衍生自)牛痘病毒(例如，重組牛痘病毒)。
在一些實施例中，病毒載體或粒子為(或衍生自)流感病毒(例如，重組流感病毒)。
在一些實施例中，病毒載體或粒子為(或衍生自)輪狀病毒(例如，重組輪狀病毒)。
在一些實施例中，病毒載體或粒子為(或衍生自) A型肝炎病毒(例如，A型肝炎病毒)。
在一些實施例中，病毒載體或粒子為(或衍生自) CMV病毒(例如，重組CMV病毒)。
在一些實施例中，病毒載體或粒子為(或衍生自) RSV病毒(例如，重組RSV病毒)。
在一些實施例中，病毒載體或粒子為(或衍生自)狂犬病病毒(例如，重組狂犬病病毒)。
在一些實施例中，病毒載體或粒子為(或衍生自)水泡性口炎病毒(例如，重組水泡性口炎病毒)。
在一些實施例中，病毒載體或病毒為天然的。
在一些實施例中，病毒載體或病毒經減弱。
在一些實施例中，病毒載體或病毒經基因修飾。
在一些實施例中，本文中所描述之病毒載體無複製能力。
在一些實施例中，本文中所描述之病毒載體具複製能力。
在一些實施例中，本文中所描述之病毒載體不具有毒性或具有低毒性(亦即，對細胞(諸如正常宿主細胞)之生理學無影響)。
在一些實施例中，本文中所描述之病毒載體為非病原性及複製缺陷型的。
在一些實施例中，病毒載體僅含有起始病毒DNA複製及封裝所需之病毒序列。
在一些實施例中，載體輔助依賴型載體(亦即，其生產需要在單獨載體或質體中向細胞提供所需結構蛋白)。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的病毒載體要求輔助病毒(例如，無複製能力之輔助病毒)或輔助質體(例如，編碼缺陷型輔助病毒基因體之輔助質體，參見例如Saeki等人, 2001, Mol. Ther. 3:591-601中所描述之輔助質體)。
在一些實施例中，本文中所描述之載體能夠遞送至分裂細胞及非分裂細胞兩者。在一些實施例中，本文中所描述之載體能夠遞送至分裂細胞。在一些實施例中，本文中所描述之載體能夠遞送至非分裂細胞。
在一些實施例中，本文中所描述之載體中之任一者為重組載體。
本文中所描述之任何載體可經轉導或引入至細胞中。
在一些實施例中，本文中所描述之載體包含轉殖基因，例如作為轉殖基因表現卡匣之一部分。轉殖基因可為需要由病毒載體攜載或表現之任何轉殖基因。在一些實施例中，本文中所描述之載體進一步包含一或多種調節元件。在一些實施例中，本文中所描述之載體包含可操作地連接至轉殖基因之啟動子及/或強化子。在一些實施例中，病毒載體之轉殖基因表現卡匣包含轉殖基因、啟動子、視情況選用之強化子及視情況選用之通常在所使用之病毒中發現的一或多種元件。
在一些實施例中，調節元件為載體之非轉譯區(例如，複製起點、選擇卡匣、啟動子、強化子、轉譯起始信號(Shine Dalgarno序列或Kozak序列)內含子、聚腺苷酸化序列、5'及3'非轉譯區)，其與宿主細胞蛋白相互作用以進行轉錄及轉譯。此類元件之強度及特異性可變化。在一些實施例中，調節元件為在真核細胞(例如，哺乳動物細胞)中發揮功能之調節元件。在一些實施例中，編碼本文中所描述之心臟保護性基因、基因產物或抑制性RNA之聚核苷酸序列可操作地連接至允許聚核苷酸在真核(例如，哺乳動物)細胞中表現之多個控制元件。
在一些實施例中，啟動子為組織特異性啟動子(例如，心臟組織特異性啟動子，諸如TNNT2啟動子)。在一些實施例中，啟動子為普遍存在的(在廣泛範圍之細胞中具有強烈活性) (例如，CAG啟動子及CMB啟動子，參見Yue等人 BioTechniques33:672-678 (2002))。在一些實施例中，啟動子為組成型(持續活性)啟動子。在一些實施例中，啟動子為誘導型啟動子。在一些實施例中，啟動子為細胞類型特異性啟動子。在一些實施例中，啟動子為心肌細胞特異性啟動子。心臟特異性或心肌細胞特異性啟動子之實例包括(但不限於) TNNT2啟動子、α肌凝蛋白重鏈啟動子、肌凝蛋白輕鏈2v啟動子、α肌凝蛋白重鏈啟動子、α-心臟肌動蛋白啟動子、α-肌旋蛋白啟動子、心臟肌鈣蛋白C啟動子、心臟肌鈣蛋白I啟動子、心臟肌凝蛋白-結合蛋白C啟動子及肌質網/內質網Ca 2+ATP酶(SERCA)啟動子(例如，SERCA2之同功型2)。可使用之其他啟動子包括(但不限於)：巨細胞病毒(CMV)即刻早期、單純疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、病毒猿猴病毒40 (SV40) (例如早期及晚期SV40)、脾臟病灶形成病毒(SFFV)啟動子、來自逆轉錄病毒之長末端重複序列(LTR) (例如，莫洛尼鼠類白血病病毒(Moloney murine leukemia virus；MoMLV) LTR啟動子或勞斯氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus；RSV) LTR)、單純疱疹病毒(HSV) (胸苷激酶)啟動子、來自牛痘病毒之H5、P7.5及P11啟動子、延長因子1-α (EF1α)啟動子、早期生長反應蛋白1 (early growth response 1；EGR1)啟動子；鐵蛋白H (FerH)啟動子、鐵蛋白L (FerL)啟動子、甘油醛3-磷酸去氫酶(GAPDH)啟動子、真核轉譯起始因子4A1 (EIF4A1)啟動子、熱休克70kDa蛋白5 (HSPA5)啟動子、熱休克蛋白90kDa β，成員1 (HSP90B1)啟動子、熱休克蛋白70kDa (HSP70)啟動子、β-驅動蛋白(β-KIN)啟動子、人類ROSA 26基因座(Irions等人, Nature Biotechnology25, 1477-1482 (2007))、泛素C (Ubiquitin C；UBC)啟動子、磷酸甘油酸激酶-1 (PGK)啟動子、巨細胞病毒強化子/雞β-肌動蛋白(CAG)啟動子、β-肌動蛋白啟動子，及骨髓增殖性肉瘤病毒強化子、陰性對照區缺失、dl587rev引子-結合位點取代(MND)之啟動子，及小鼠金屬硫蛋白-l。
在一些實施例中，強化子為組織特異性強化子(例如，心臟組織特異性強化子)。強化子可操作地連接至啟動子且調節可操作地連接至啟動子之轉殖基因的表現。在一些實施例中，強化子包含ACTC1心臟強化子(ACTC1e)。在一些實施例中，強化子包含αMHC強化子(αMHCe)。
在一些實施例中，本文中所描述之載體為AAV。在一些實施例中，AAV含有通常見於AAV中之元件中之任一或多者，例如聚腺苷酸化序列(例如，BGH聚(腺苷酸)序列或SV40聚(腺苷酸)序列)、內含子(例如，CMV內含子或嵌合內含子)、轉譯後調節元件(例如，土拔鼠轉錄後調節元件(Woodchuck Post-transcriptional Regulatory Element；WPRE)或經修飾之WPRE)，及/或轉錄終止信號。在一些實施例中，含有轉殖基因表現卡匣之AAV載體基因體側接反向末端重複序列(諸如5' ITR及3' ITR)。在一些實施例中，AAV載體需要輔助因子以進行複製。輔助因子可藉由共感染輔助病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒或乳突狀瘤病毒)或輔助質體來提供。例示性輔助病毒及質體描述於本文中。此項技術中已知之任何輔助病毒或質體均可用於本文中所描述之方法中(參見例如，Meier等人, 202, Viruses 12(6):662)。在一些實施例中，輔助基因可為腺病毒E1a、E1b、E2a、E4及VA基因中之任一或多者。在一些實施例中，輔助質體包含腺病毒E2a及E4基因及視情況選用之VA RNA。
在一些實施例中，病毒載體為任何血清型之AAV載體。在一些實施例中，病毒載體為選自由血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、rh.10、rh.20、rh.74及其所衍生之嵌合AAV組成之群的AAV。在一些實施例中，AAV為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.10、AAVrh.20、AAVrh.74或其變異體。
在一些實施例中，AAV為AAV9或其變異體。
在一些實施例中，AAV為AAV5或其變異體。
本發明之rAAV病毒顆粒或粒子包含衣殼蛋白。衣殼蛋白為結構蛋白，其構成含有表現卡匣之rAAV病毒顆粒的組裝二十面體封裝。衣殼蛋白係藉由血清型分類。rAAV病毒顆粒中之野生型衣殼血清型可為例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.10、AAVrh.20或AAVrh.74 (Naso等人 BioDrugs31:317-334 (2017))。經工程改造之衣殼類型包括嵌合衣殼及鑲嵌衣殼(Choi等人 Curr Gene Ther. 5: 299-310 (2005))。基於rAAV病毒顆粒轉導特定組織或細胞類型之能力來選擇其衣殼(Liu等人 Curr Pharm Des. 21:3248-56 (2015))。
如本文中所描述，可使用可促進rAAV病毒顆粒轉導至心臟細胞中以遞送轉殖基因的任何衣殼蛋白。rAAV病毒顆粒中用於將轉殖基因遞送至產生高表現之心臟細胞的衣殼蛋白可為例如AAV4、AAV6、AAV7、AAV8及AAV9 (Zincarelli等人 Mol . Ther. 16:P1073-1080 (2008))。人工衣殼，諸如經由組合庫產生之嵌合衣殼亦可用於向心臟細胞進行轉殖基因遞送，從而產生高表現(參見US 63/012,703，其內容以引用之方式併入本文中)。具有各種特徵之其他衣殼蛋白亦可用於本發明之rAAV病毒顆粒中。AAV載體及衣殼提供於以下中：美國專利公開案第US10011640B2號；第US7892809B2號、第US8632764B2號、第US8889641B2號、第US9475845B2號、第US10889833B2號、第US10480011B2號及第US10894949B2號，該等公開案之內容以引用之方式併入本文中；及國際專利公開案第WO2020198737A1號、第WO2019028306A2號、第WO2016054554A1號、第WO2018152333A1號、第WO2017106236A1號、第WO2008124724A1號、第WO2017212019A1號、第WO2020117898A1號、第WO2017192750A1號、第WO2020191300A1號及第WO2017100671A1號，該等公開案之內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，本發明之rAAV病毒顆粒包含經工程改造之衣殼蛋白。經工程改造之衣殼蛋白可衍生自親本(例如野生型)衣殼且包括例如相對於親本衣殼序列在一或多個位點處之變異體多肽序列。舉例而言，親本衣殼之變異位點可存在於VR-IV位點、VR-V位點、VR-VII位點及/或VR-VIII位點處(參見例如，Büning及Srivastava. Mol Ther Methods Clin Dev. 12:248-265 (2019))。
在一些實施例中，衣殼蛋白為AAV5/AAV9嵌合衣殼蛋白。在一些實施例中，至少一個多肽區段係衍生自AAV5衣殼蛋白且至少一個多肽區段係衍生自AAV9衣殼蛋白。在一些實施例中，嵌合親本序列之一或多個位點係選自與AAV9衣殼蛋白之VR-IV位點、VR-V位點、VR-VII位點及VR-VIII位點等效的位點。
在一些實施例中，突變體衣殼蛋白係用於本文中所描述之方法中，諸如本文中所描述或此項技術中已知的任何突變體。在一些實施例中，與相應野生型衣殼蛋白相關，或已知會產生比相應野生型衣殼蛋白更低之病毒產量的突變體衣殼蛋白係用於本文中所描述之方法中。在一些實施例中，突變體衣殼蛋白係用於本文中所描述之方法中，其中突變與不具有突變之衣殼蛋白相關，或已知會產生相對於不具有突變之衣殼蛋白更低之病毒產量。
在一些實施例中，突變體AAV (例如AAV9)衣殼蛋白係用於本文中所描述之方法中，諸如本文中所描述或此項技術中已知的任何突變體。在一些實施例中，與相應野生型衣殼蛋白相關，或已知會產生比相應野生型衣殼蛋白更低之病毒產量的突變體AAV (例如AAV9)衣殼蛋白係用於本文中所描述之方法中。在一些實施例中，突變體AAV (例如AAV9)衣殼蛋白係用於本文中所描述之方法中，其中突變與不具有突變之衣殼蛋白相關，或已知會產生相對於不具有突變之衣殼蛋白更低之病毒產量。
在一些實施例中，本文中所描述之載體為慢病毒載體(LV)。在一些實施例中，LV含有通常在慢病毒載體中發現之元件中之任一或多者，例如載體基因體封裝信號、Rev反應元件(RRE)、聚嘌呤區(例如，中心聚嘌呤區、3'聚嘌呤區等)及/或轉譯後調節元件(例如，土拔鼠轉錄後調節元件(WPRE)或經修飾之WPRE)。在一些實施例中，含有轉殖基因表現卡匣之LV載體基因體側接順式作用之長末端重複序列。在一些實施例中，LV不自我活化(SIN)。在一些實施例中，本文中所描述之LV為TAT非依賴性的。 用於方法中之 AAV 病毒衣殼蛋白
在一些實施例中，本文中所描述之方法中的病毒載體或粒子為(或衍生自)涉及重組、工程改造或以其他方式修飾之腺衣殼蛋白的AAV。基於rAAV病毒顆粒轉導特定組織或細胞類型之能力來選擇其衣殼。在一些實施例中，本文中所提及之AAV衣殼蛋白為此項技術中已知或本文中所描述之任何血清型之任何AAV衣殼蛋白，或其變異體。在一些實施例中，AAV血清型係選自由血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、rh.10、rh.20、rh.74及自其衍生之嵌合AAV組成之群。在一些實施例中，AAV為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.10、AAVrh.20、AAVrh.74或其變異體。
野生型AAV9 VP1具有SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。野生型AAV9 VP2具有SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。野生型AAV9 VP3具有SEQ ID NO: 13之胺基酸序列。在一些實施例中，如下文所示，本文中所描述之衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 11有共通的至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致性之序列。在一些實施例中，本文中所描述之衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 12有共通的至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致性之序列。在一些實施例中，本文中所描述之衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 13有共通的至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致性之序列。VP1、VP2及VP3之N端殘基，以及VR位點(VR-1、VR-11、VR-IV、VR-V、VR-VII及VR-VIII)指示(粗體且加下劃線)於以下全長VP1之序列(SEQ ID NO: 11)中。
如上述AAV9 VP1 (SEQ ID NO: 11)中所標記，VR-IV位點介於親本序列中之胺基酸452與458之間(「NGSGQNQ」，SEQ ID NO: 15)；VR-V位點介於親本序列中之胺基酸497與502之間(「NNSEFA」，SEQ ID NO: 16)；VR-VII位點介於親本序列中之胺基酸549與553之間(「GRDNV」，SEQ ID NO: 17)；VR-VIII位點介於親本序列中之胺基酸581與594之間(「ATNHQSAQAQAQTG」，SEQ ID NO: 18)。在一些實施例中，衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 11有共通的至少約80% (例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%)一致性之序列，其不包括VR-IV、VR-V、VR-VII及/或VR-VIII位點。在一些實施例中，衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 11有共通的至少約80% (例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%)一致性之序列，其不包括VR-IV及/或VR-VIII位點。在一些實施例中，衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 11有共通的至少約80% (例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%)一致性之序列，其不包括VR-IV位點。在一些實施例中，衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 11有共通的至少約80% (例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%)一致性之序列，其不包括VR-VIII位點。在一些實施例中，衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 12有共通的至少約80% (例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%)一致性之序列，其不包括VR-IV、VR-V、VR-VII及/或VR-VIII位點。在一些實施例中，衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 12有共通的至少約80% (例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%)一致性之序列，其不包括VR-IV及/或VR-VIII位點。在一些實施例中，衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 12有共通的至少約80% (例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%)一致性之序列，其不包括VR-IV位點。在一些實施例中，衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 12有共通的至少約80% (例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%)一致性之序列，其不包括VR-VIII位點。在一些實施例中，衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 13有共通的至少約80% (例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%)一致性之序列，其不包括VR-IV、VR-V、VR-VII及/或VR-VIII位點。在一些實施例中，衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 13有共通的至少約80% (例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%)一致性之序列，其不包括VR-IV及/或VR-VIII位點。在一些實施例中，衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 13有共通的至少約80% (例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%)一致性之序列，其不包括VR-IV位點。在一些實施例中，衣殼蛋白包含與SEQ ID NO: 13有共通的至少約80% (例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%)一致性之序列，其不包括VR-VIII位點。
在一些實施例中，衣殼蛋白為本文中所描述之任何衣殼蛋白或其變異體，例如本文中所描述之野生型AAV9衣殼蛋白序列中的AAV9變異體衣殼蛋白(例如，包含一或多個取代或插入)。
在一些實施例中，衣殼蛋白包含VR-VIII位點中之一個、兩個、三個、四個或更多個取代。在一些實施例中，衣殼蛋白包含VR-VIII位點中之一個、兩個、三個、四個或更多個插入。在一些實施例中，相對於參考SEQ ID NO: 11，衣殼蛋白包含VR-VIII位點中之584至590之位置處的一個、兩個、三個、四個或更多個取代，或VR-VIII位點中之585至590之位置處的一個、兩個、三個、四個或更多個取代。在一些實施例中，相對於參考SEQ ID NO: 11，衣殼蛋白包含VR-VIII位點中之584至590之位置處的一個、兩個、三個、四個或更多個插入，或VR-VIII位點中之585至590之位置處的一個、兩個、三個、四個或更多個插入。
在一些實施例中，衣殼蛋白包含VR-VIII位點中之至少兩個、三個、四個、五個或更多個取代。在一些實施例中，衣殼蛋白包含VR-VIII位點中之至少兩個、三個、四個或更多個插入。在一些實施例中，相對於參考SEQ ID NO: 11，衣殼蛋白包含VR-VIII位點中之584至590之位置處的至少兩個、三個、四個、五個或更多個取代，或VR-VIII位點中之585至590之位置處的至少兩個、三個、四個、五個或更多個取代。在一些實施例中，相對於參考SEQ ID NO: 11，衣殼蛋白包含VR-VIII位點中之584至590之位置處的至少兩個、三個、四個或更多個插入，或VR-VIII位點中之585至590之位置處的至少兩個、三個、四個或更多個插入。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含在位置584處之胺基酸插入(相對於參考序列SEQ ID NO: 11)，其包含天冬醯胺(N)、蘇胺酸(T)、酪胺酸(Y)、苯丙胺酸(F)及丙胺酸(A)中之一或多者。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含在位置585處之胺基酸插入(相對於參考序列SEQ ID NO: 11)，其包含組胺酸(H)及甲硫胺酸(M)中之一或多者。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含在位置586處之胺基酸插入(相對於參考序列SEQ ID NO: 11)，其包含組胺酸(H)、酪胺酸(Y)、纈胺酸(V)、蘇胺酸(T)、丙胺酸(A)、異白胺酸(I)、色胺酸(W)、甲硫胺酸(M)及白胺酸中之一或多者。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含在位置587處之胺基酸插入(相對於參考序列SEQ ID NO: 11)，其包含異白胺酸(I)及脯胺酸(P)中之一或多者。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含在位置588處之胺基酸插入(相對於參考序列SEQ ID NO: 11)，其包含異白胺酸(I)、蘇胺酸(T)及脯胺酸(P)中之一或多者。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：N452K、N452A、N452V、G453A、G453N、S454T、S454D、G455N、Q456L、Q456K、N457L、N457V、Q458I及Q458H (相對於參考序列SEQ ID NO: 11)。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：T582D、T582L、T582E、T582A、T582F、T582R、T582P、N583V、N583T、H584R、H584Q、H584K、H584V、H584Y、H584M、H584T、H584W、H584E、H584D、Q585T、Q585C、Q585V、Q585L、Q585N、Q585S、Q585P、Q585A、Q585M、Q585E、Q585Y、Q585G、Q585H、Q585I、S586D、S586T、S586G、S586K、S586M、S586N、S586I、S586Q、S586L、S586P、S586F、S586R、A587F、A587S、A587T、A587N、A587L、A587P、A587V、A587K、A587I、A587R、A587H、A587G、A587M、A587D、A587W、Q588L、Q588S、Q588F、Q588N、Q588G、Q588R、Q588I、Q588V、Q588T、Q588Y、Q588H、Q588M、Q588K、Q588D、A589R、A589I、A589N、A589S、A589V、A589Q、A589F、A589T、A589K、A589H、A589E、A589W、A589L、A589Y、A589M、Q590I、Q590S、Q590N、Q590G、Q590D、Q590R、Q590H、Q590T、Q590M、Q590F、Q590Y、Q590L、A591I、G594Q及G594D (相對於參考序列SEQ ID NO: 11)。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含在位置584處之由TY、FN或AT組成之胺基酸插入(相對於參考序列SEQ ID NO: 11)。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含在位置585處之由MH組成之胺基酸插入(相對於參考序列SEQ ID NO: 11)。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含在位置586處之由HY、VT、AI、WM或ML組成之胺基酸插入(相對於參考序列SEQ ID NO: 11)。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含在位置587處之由PI組成之胺基酸插入(相對於參考序列SEQ ID NO: 11)。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含在位置588處之由IT或PT組成之胺基酸插入(相對於參考序列SEQ ID NO: 11)。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：T582D、T582E、N583V、H584Q、S586K、A587P、A587S、Q588G、Q588M、A589S、A591I、G594Q及G594D (相對於參考序列SEQ ID NO: 11)。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：T582L、T582A、T582F、T582R、T582P、H584R、H584K、H584V、H584Y、H584M、H584Q、H584W、H584E、H584D、Q585T、Q585N、Q585M、Q585E、Q585V、Q585H、S586T、S586G、S586Q、S586I、S586L、S586F、S586D、S586R、S586M、A587F、A587I、A587H、A587M、A587N、A587W、Q588Y、Q588S、Q588T及Q588R (相對於參考序列SEQ ID NO: 11)。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：Q585C、Q585S及S586I (相對於參考序列SEQ ID NO: 11)。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：Q585V、Q585T、Q585L、Q585C、Q585N、Q585S、Q585M、Q585E、Q585P、Q585A、Q585G、Q585H、Q585I、S586D、S586G、S586T、S586M、S586N、S586L、S586R、S586I、S586K、A587S、A587T、A587N、A587L、A587V、A587K、A587I、A587F、A587P、A587R、A587D、Q588L、Q588S、Q588F、Q588N、Q588R、Q588I、Q588V、Q588T、Q588H、Q588Y、Q588M、Q588K、Q588D、Q588G、A589R、A589I、A589N、A589S、A589V、A589Q、A589F、A589T、A589K、A589H、A589E、A589W、A589L、A589Y、A589M、Q590I、Q590S、Q590N、Q590G、Q590D、Q590R、Q590H、Q590T、Q590M、Q590F、Q590Y及Q590L (相對於參考序列SEQ ID NO: 11)。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：A587V及A587G (相對於參考序列SEQ ID NO: 11)。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含兩個或更多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：N452K、N452A、N452V、G453A、G453N、S454T、S454D、G455N、Q456L、Q456K、N457L、N457V、Q458I及Q458H (相對於參考序列SEQ ID NO: 11)。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含胺基酸取代N452K、N452A或N452V。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 211，衣殼蛋白包含N452K取代。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含胺基酸取代G453A或G453N (相對於參考序列SEQ ID NO: 11)。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含胺基酸取代S454T或S454D (相對於參考序列SEQ ID NO: 11)。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含胺基酸取代G455N (相對於參考序列SEQ ID NO: 11)。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含胺基酸取代Q456L或Q456K (相對於參考序列SEQ ID NO: 11)。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含胺基酸取代N457L或N457V (相對於參考序列SEQ ID NO: 11)。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含胺基酸取代Q458I或Q458H (相對於參考序列SEQ ID NO: 11)。
在一些實施例中，衣殼蛋白可包含相對於參考序列SEQ ID NO: 11在位置452至458處或在約位置452至458處的選自以下之胺基酸序列：KGSGQNQ (SEQ ID NO: 27)、NASGQNQ (SEQ ID NO:28)、NGTGQNQ (SEQ ID NO: 29)、NGSGLNQ (SEQ ID NO: 30)、ANDNKLI (SEQ ID NO: 31)、VNDNKVI (SEQ ID NO: 32)、NGSGQNH (SEQ ID NO: 33)及ANDNKVI (SEQ ID NO: 34)。在一些此等實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 11，衣殼蛋白包含N452K取代。
在一些實施例中，衣殼蛋白在VR-VIII位點處包含選自以下之胺基酸序列：ENTVSI (SEQ ID NO: 35)、QTLFNS (SEQ ID NO: 36)、NSTYLG (SEQ ID NO: 37)、GSILTH (SEQ ID NO: 38)、MMTTAR (SEQ ID NO: 39)及CSTSIR (SEQ ID NO: 40)。衣殼蛋白可包含相對於參考序列SEQ ID NO: 11在位置585至590處或在約位置585至590處的選自以下之胺基酸序列：ENTVSI (SEQ ID NO: 35)、QTLFNS (SEQ ID NO: 36)、NSTYLG (SEQ ID NO: 37)、GSILTH (SEQ ID NO: 38)、MMTTAR (SEQ ID NO: 39)及CSTSIR (SEQ ID NO: 40)。在一些此等實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 11，衣殼蛋白包含N452K取代。
在一些實施例中，衣殼蛋白在VR-VIII位點或在相對於參考序列SEQ ID NO: 11之胺基酸位置581至594處包含胺基酸序列ATNHNSTYLGAQTG (SEQ ID NO: 41)，且視情況其中衣殼蛋白進一步包含胺基酸取代N452K。
在一些實施例中，衣殼蛋白在VR-VIII位點或在相對於參考序列SEQ ID NO: 11之胺基酸位置581至594處包含胺基酸序列ATNHMMTTARAQTG (SEQ ID NO: 42)，且視情況其中衣殼蛋白進一步包含胺基酸取代N452K。
在一些實施例中，衣殼蛋白在VR-VIII位點處或在相對於參考序列SEQ ID NO: 11之胺基酸位置581至594處包含胺基酸序列ATNHCSTSIRAQTG (SEQ ID NO:43)，且視情況其中衣殼蛋白進一步包含胺基酸取代N452K。
在一些實施例中，衣殼蛋白包含本文中所描述之任何衣殼核酸或胺基酸序列(例如，參見本文中呈現之圖及序列)。
在一些實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 23具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，衣殼蛋白為本文中所描述之ZC375之衣殼蛋白，或與本文中所描述之ZC375之衣殼蛋白具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 24具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，衣殼蛋白為本文中所描述之ZC401之衣殼蛋白，或與本文中所描述之ZC401之衣殼蛋白具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 25具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，衣殼蛋白為本文中所描述之ZC428之衣殼蛋白，或與本文中所描述之ZC428之衣殼蛋白具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 26具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，衣殼蛋白為本文中所描述之ZC478之衣殼蛋白，或與本文中所描述之ZC478之衣殼蛋白具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 44具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，衣殼蛋白為本文中所描述之ZC96之衣殼蛋白，或與本文中所描述之ZC96之衣殼蛋白具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，衣殼蛋白包含在(例如AAV9衣殼蛋白或其變異體之)VR-VIII位點處的胺基酸序列X 1DVQX 2X 3PGFX 4X 5X 6X 7X 8(SEQ ID NO:45)，其中X 1、X 2、X 3、X 4、X 5、X 6、X 7及X 8中之各者為任何胺基酸。
在一些實施例中，X 1為丙胺酸(A)。
在一些實施例中，X 2為麩醯胺酸(Q)。
在一些實施例中，X 7為蘇胺酸(T)。
在一些實施例中，X 5為丙胺酸(A)或脯胺酸(P)。
在一些實施例中，X 6為麩醯胺酸(Q)或麩胺酸(E)。
在一些實施例中，X 4為麩醯胺酸(Q)、甘胺酸(G)、精胺酸(R)、天冬醯胺(N)、組胺酸(H)、甲硫胺酸(M)、脯胺酸(P)或絲胺酸(S)。
在一些實施例中，X 8為麩胺酸(E)、甲硫胺酸(M)、麩醯胺酸(Q)、天冬胺酸(D)、白胺酸(L)、丙胺酸(A)、半胱胺酸(C)、組胺酸(H)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、蘇胺酸(T)、纈胺酸(V)、異白胺酸(I)、絲胺酸(S)或天冬醯胺(N)。在一些實施例中，X 8為麩胺酸(E)。
在一些實施例中，X 3為白胺酸(L)、組胺酸(H)、纈胺酸(V)、半胱胺酸(C)、麩醯胺酸(Q)、甘胺酸(G)、異白胺酸(I)、甲硫胺酸(M)、苯丙胺酸(F)、脯胺酸(P)、蘇胺酸(T)或酪胺酸(Y)。
在一些實施例中，X 1為A，X 2為Q，X 7為T，及/或衣殼蛋白包含VR-VIII位點中之胺基酸序列ADVQQX 3PGFX 4X 5X 6TX 8(SEQ ID NO:46)，其中X 3、X 4、X 5、X 6及X 8中之各者為任何胺基酸。
在一些實施例中，X 5為A或P，且X 6為Q或E，及/或衣殼蛋白包含VR-VIII位點中之胺基酸序列X 1DVQX 2X 3PGFX 4AQX 7X 8(SEQ ID NO: 47)、X 1DVQX 2X 3PGFX 4AEX 7X 8(SEQ ID NO: 48)、X 1DVQX 2X 3PGFX 4PQX 7X 8(SEQ ID NO: 49)、X 1DVQX 2X 3PGFX 4PEX 7X 8(SEQ ID NO: 50)、ADVQQX 3PGFX 4AQTX 8(SEQ ID NO: 51)、ADVQQX 3PGFX 4AETX 8(SEQ ID NO: 52)、ADVQQX 3PGFX 4PQTX 8(SEQ ID NO: 53)或ADVQQX 3PGFX 4PETX 8(SEQ ID NO: 54)，其中X 1、X 2、X 3、X 4、X 7及X 8中之各者為任何胺基酸。
在一些實施例中，X 4為Q，X 5為A，且X 6為Q，及/或衣殼蛋白包含VR-VIII位點中之胺基酸序列X 1DVQX 2X 3PGFQAQX 7X 8(SEQ ID NO: 55)或ADVQQX 3PGFQAQTX 8(SEQ ID NO: 56)，其中X 1、X 2、X 3、X 7及X 8中之各者為任何胺基酸。
在一些實施例中，X 3為L，且X 8為E，及/或衣殼蛋白包含VR-VIII位點中之胺基酸序列X 1DVQX 2LPGFX 4X 5X 6X 7E (SEQ ID NO: 57)或ADVQQLPGFX 4X 5X 6TE (SEQ ID NO: 58)，其中X 1、X 2、X 4、X 5、X 6及X 7中之各者為任何胺基酸。
在一些實施例中，X 4為Q，及/或衣殼蛋白包含VR-VIII位點中之胺基酸序列X 1DVQX 2X 3PGFQX 5X 6X 7X 8(SEQ ID NO: 59)或ADVQQX 3PGFQX 5X 6TX 8(SEQ ID NO: 60)，其中X 1、X 2、X 3、X 5、X 6、X 7及X 8中之各者為任何胺基酸。
在一些實施例中，衣殼蛋白包含與VR-VIII位點(相對於參考序列SEQ ID NO: 11之位置581至594)處之以下序列中之任一者具有至少約80% (例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5 %或100%)一致性且具有至多1、2或3個取代的序列，基本上由該序列組成或由該序列組成：ADVQQLPGFQAQTE (SEQ ID NO: 61)、ADVQQHPGFQAQTE (SEQ ID NO: 62)、ADVQQVPGFQAQTM (SEQ ID NO: 63)、ADVQQVPGFQAQTQ (SEQ ID NO: 64)、ADVQQLPGFGAQTE (SEQ ID NO: 65)、ADVQQLPGFRPETE (SEQ ID NO: 66)及ADVQQLPGFNAQTE (SEQ ID NO: 67)。
在一些實施例中，衣殼蛋白包含本文中所描述之任何取代及/或插入模體。在一些實施例中，衣殼蛋白包含與本文中所描述之任何取代模體具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之取代模體。在一些實施例中，衣殼蛋白包含與本文中所描述之任何插入模體具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之插入模體。
應注意，上文經修飾之VR-VIII模體僅出於說明之目的描述於AAV9衣殼蛋白之上下文中，且並不意謂受限於AAV9衣殼蛋白。相反，本文中所描述之任何經修飾之VR-VIII模體均可例如藉由用本文中所描述之經修飾之VR-VIII模體中之任一者置換在相應衣殼蛋白之VR-VIII位點(例如，根據SEQ ID NO: 19之野生型AAV5 VP1衣殼蛋白序列之胺基酸位置570至583、野生型AAVrh.10 VP1衣殼蛋白序列之胺基酸位置583至596，或野生型AAVrh.74 VP1衣殼蛋白序列之胺基酸位置583至596)處的野生型序列而應用於不同血清型(例如，AAV5、AAVrh.10或AAVrh.74)之其他AAV衣殼蛋白，以產生特定血清型之衣殼蛋白之變異體。在一些實施例中，衣殼蛋白為AAV5、AAV9、AAVth.10或AAVrh.74衣殼蛋白之變異體。
在一些實施例中，與野生型或親本衣殼蛋白相比，衣殼蛋白包含插入多肽或插入模體。在一些實施例中，衣殼蛋白另外包含衍生其之野生型或親本衣殼蛋白序列之胺基酸序列中的一或多個胺基酸取代。在一些實施例中，插入模體插入在衣殼蛋白之表面環區處，例如依所描述之VR-IV、VR-V、VR-VII及/或VR-VIII位點處。
在一些實施例中，插入模體包含胺基酸序列「RGDAARL」(SEQ ID NO: 68)或由該胺基酸序列組成；及/或衣殼蛋白包含胺基酸序列「RGDAARL」(SEQ ID NO: 68)。
在一些實施例中，插入模體包含胺基酸序列「SHVRGDL」(SEQ ID NO: 69)或由該胺基酸序列組成；及/或衣殼蛋白包含胺基酸序列「SHVRGDL」(SEQ ID NO: 69)。
在一些實施例中，插入模體包含胺基酸序列「VVSSGAR」(SEQ ID NO: 70)或由該胺基酸序列組成；及/或衣殼蛋白包含胺基酸序列「VVSSGAR」(SEQ ID NO: 70)。
在一些實施例中，插入模體包含胺基酸序列「VRGD」(SEQ ID NO: 71)或由該胺基酸序列組成；及/或衣殼蛋白包含胺基酸序列「VRGD」(SEQ ID NO: 71)。
插入模體可存在(例如插入)於衣殼蛋白之任何位置處，例如衣殼蛋白之表面或暴露區域處。在一些實施例中，經工程改造之AAV衣殼蛋白包含依本文所描述之插入模體，其插入在衣殼蛋白之表面環區，例如衣殼蛋白之VR-I、VR-II、VR-IV、VR-V、VR-VII及/或VR-VIII位點處。在一些實施例中，經工程改造之AAV衣殼蛋白包含依所描述之插入模體，其插入在衣殼蛋白之VR-IV及/或VR-VIII位點處。在某些此等實施例中，經工程改造之衣殼蛋白另外包含在與插入相同之VR位點中或在與插入不同之位置處的一或多個胺基酸取代。
在一些實施例中，衣殼蛋白為變異體AAV9衣殼蛋白，其包含參考SEQ ID NO: 11之野生型全長AAV9衣殼蛋白，在VR-VIII位點處，例如在VR-VIII位點內之胺基酸588 (麩醯胺酸(Q))與589 (丙胺酸(A))之間的插入多肽或插入模體。在一些實施例中，參考SEQ ID NO: 11之野生型全長AAV9衣殼蛋白，變異體AAV9衣殼蛋白進一步包含在VR-VIII位點(包括例如在胺基酸位置587至590中之一或多者)內的一或多個胺基酸取代。在某些此等實施例中，插入模體包含胺基酸序列RGDAARL (SEQ ID NO: 68)、RTDLKGL (SEQ ID NO: 72)、YPSTGSG (SEQ ID NO: 73)、FAGSLTRA (SEQ ID NO: 74)、DRTLTTR (SEQ ID NO: 75)、RIAGRDV (SEQ ID NO: 76)或SLGSGVR (SEQ ID NO: 77)。
在一些實施例中，衣殼蛋白為經工程改造之AAV9衣殼蛋白，其包含參考SEQ ID NO: 11之野生型全長AAV9衣殼蛋白，在VR-IV位點處，例如在VR-IV位點內之胺基酸453 (甘胺酸(G))與454 (絲胺酸(S))之間及/或胺基酸456 (麩醯胺酸(Q))與457 (天冬醯胺(N))之間的插入多肽或插入模體。在某些此等實施例中，插入模體包含胺基酸序列SHVRGDL (SEQ ID NO: 69)、VVSSGAR (SEQ ID NO: 70)、PQYGRGG (SEQ ID NO: 78)、LQVSRVS (SEQ ID NO: 79)、VRSYSSN (SEQ ID NO: 80)、「TMRVGSL」 (SEQ ID NO: 81)、GAYSRGV (SEQ ID NO: 82)、LRGGSLG (SEQ ID NO: 83)或「VYGTGVR」 (SEQ ID NO: 84)。
在一些實施例中，衣殼蛋白為經工程改造之AAV5衣殼蛋白，其包含參考SEQ ID NO: 19之野生型全長AAV5衣殼蛋白，在VR-VIII位點處，例如在VR-VIII位點內之胺基酸574 (麩醯胺酸(Q))與575 (絲胺酸(S))之間的插入多肽或插入模體。在某些此等實施例中，插入模體包含胺基酸序列DKLIIVS (SEQ ID NO: 85)、AEDRTKL (SEQ ID NO: 86)、LSASASL (SEQ ID NO: 87)、LADQTKL (SEQ ID NO: 88)、LLLKLQE (SEQ ID NO: 89)、ELPVKTG (SEQ ID NO: 90)、LDLKVVG (SEQ ID NO: 91)或RDAVL (SEQ ID NO: 92)。
在一些實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 93之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 93具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，衣殼蛋白為本文中所描述之ZC621之衣殼蛋白，或與本文中所描述之ZC621之衣殼蛋白具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 94之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 94具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，衣殼蛋白為本文中所描述之ZC623之衣殼蛋白，或與本文中所描述之ZC623之衣殼蛋白具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 95之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 95具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，衣殼蛋白為本文中所描述之ZC625之衣殼蛋白，或與本文中所描述之ZC625之衣殼蛋白具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 96之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 96具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，衣殼蛋白為本文中所描述之ZC626之衣殼蛋白，或與本文中所描述之ZC626之衣殼蛋白具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 97之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 97具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，衣殼蛋白為本文中所描述之ZC630之衣殼蛋白，或與本文中所描述之ZC630之衣殼蛋白具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 98之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 98具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，衣殼蛋白為本文中所描述之ZC631之衣殼蛋白，或與本文中所描述之ZC631之衣殼蛋白具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 99具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，衣殼蛋白為本文中所描述之ZC632之衣殼蛋白，或與本文中所描述之ZC632之衣殼蛋白具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 100具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，衣殼蛋白為本文中所描述之ZC633之衣殼蛋白，或與本文中所描述之ZC633之衣殼蛋白具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 101具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，衣殼蛋白為本文中所描述之ZC634之衣殼蛋白，或與本文中所描述之ZC634之衣殼蛋白具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 102之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 102具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，衣殼蛋白為本文中所描述之ZC635之衣殼蛋白，或與本文中所描述之ZC635之衣殼蛋白具有至少80%、85%、90%、95%或98%之序列一致性的胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供包含本文中所描述之衣殼蛋白中之任一者及載體基因體的重組腺相關病毒(rAAV)病毒顆粒。載體基因體可包含側接反向末端重複序列(ITR)之表現卡匣。表現卡匣可包含編碼治療性基因產物之核酸序列。 組合物及套組
在一些實施例中，本發明提供包含根據本文中所描述之方法所生產的經分離之病毒粒子(例如，rAAV) (例如，經純化之病毒粒子)的組合物。在一些實施例中，本發明提供一種醫藥學上可接受之組合物，其包含根據本文中所描述之方法所生產的經分離及純化之病毒粒子(例如，rAAV)，及醫藥學上可接受之載劑。
在一些實施例中，本發明提供一種套組，其包含(i)一或多種本文中所描述之HDAC6抑制劑；(ii)一或多種本文中所描述之病毒、病毒載體或質體(例如，攜載轉殖基因之載體、攜載輔助基因之質體及/或攜載病毒複製及/或衣殼化所需之基因的質體)；(iii)一或多種本文中所描述之細胞，及/或(iv)細胞培養基；或(i)至(iv)之任何組合。 用於本文中所描述之方法中的 HDAC6 抑制劑
組蛋白去乙醯酶(「HDAC」)為一類具有去乙醯酶活性及廣泛範圍之基因體及非基因體受質的酶。基於序列一致性及催化活性而分類之鋅依賴性HDAC酶有十一種(Haberland等人, 2009)。
據描述，組蛋白去乙醯酶抑制劑為一種腫瘤學(Yoon及Eom, 2016)、神經退化(Butler等人, 2010)、自體免疫疾病(Choi等人, 2018)、化學療法誘導之外周神經病變(Krukowski等人, 2017)及心臟適應症(Zhang等人, 2002)之治療劑。鑒於核HDAC對調節基因轉錄之作用，已知抑制此等類別之標靶在各種細胞類型中具有多效性作用；尤其是產生細胞毒性。因此，限制泛HDAC抑制劑之毒性已成為廣泛利用此類化合物之主要障礙。另外，已在臨床中觀測到泛HDAC抑制劑(例如SAHA及帕比司他(Panabinostat))之顯著不良作用，包括疲乏、噁心、腹瀉及血小板減少症(Subramanian等人, 2010)。
HDAC6屬於IIb類酶且含有兩種催化域，泛素結合域及細胞質滯留域(Haberland等人, 2009)。HDAC6主要為細胞質酶且其最具特徵之受質包括微管蛋白、HSP90及皮層肌動蛋白(cortactin) (Brindisi等人, 2020)。
HDAC6之藥理學抑制阻斷其去乙醯酶活性，由此引起其受質(尤其是微管蛋白)高度乙醯化(Hubbert等人, 2002)。
已知HDAC6選擇性抑制劑由於HDAC6受質之細胞質性質而具有降低之細胞毒性且對核標靶(包括H3K9及c-MYC)及整體轉錄之影響降低(Nebbioso等人, 2017)。
異羥肟酸為鋅螯合劑，且已廣泛用於開發泛選擇性抑制劑及HDAC選擇性抑制劑。然而，大多數基於異羥肟酸之HDAC抑制劑缺乏所需選擇性或展現較差生體可用率及較差藥物動力學概況(Butler等人, 2010；Santo等人, 2012)。
在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的HDAC6抑制劑為本文中所描述之任何HDAC6抑制劑。
在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的HDAC6抑制劑為選擇性HDAC6抑制劑。
各種選擇性HDAC6為此項技術中已知的。另外，通常使用已知方法篩選化合物以鑑別其他選擇性HDAC6抑制劑。特定言之，鑒於已知HDAC6抑制劑，熟習此項技術者可鑑別化合物之哪些類似物具有選擇性HDAC6活性。
在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的HDAC6抑制劑為此項技術中已知的任何選擇性HDAC6抑制劑。
在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的HDAC6抑制劑不為非選擇性HDAC6抑制劑。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的HDAC6抑制劑不為泛HDAC抑制劑。
在一些實施例中，組合使用本文中所描述之選擇性HDAC6抑制劑中之兩者或更多者。 已知 HDAC6 抑制劑
在一些實施例中，HDAC6抑制劑為CAY10603、妥巴辛(tubacin)、羅西司他(ACY-1215)、西他司他(citarinostat) (ACY-241)、ACY-738、ACY-775、ACY-1083、QTX-153、QTX-125、KA2507、A452、WT161、BRD73954、JBI-802、萊克司他A (nexturastat A)、妥巴他汀A (tubastatin A)、HPOB、SKLB-23bb、CKD-504、CKD-506、CKD-509、CKD-510、CS3003、ITF-3753、AJ302或其類似物。在一些實施例中，HDAC6抑制劑為羅西司他(ACY-1215)、西他司他(ACY-241)、KA2507、CKD-504、CKD-506、CKD-509、CKD-510、CS3003或其類似物。
在一些實施例中，HDAC6抑制劑為具有以下結構之化合物：
CAY 10603 妥巴辛
羅西司他(ACY-1215) 西他司他(ACY-241)
ACY-738 ACY-775
ACY-1083 KA2507
QTX-125 妥巴他汀A
萊克司他A BRD73954
WT161 JBI-802
HPOB A452
CKD-504 (異羥肟酸)
或其鹽。 表1.已知HDAC6抑制劑及其特性之非限制性清單
化合物 描述 IC 50
CAY10603 CAY10603為一種強效及選擇性HDAC6抑制劑，其IC50為2 pM，其選擇性比其他HDAC ＞200倍。 2 pM
妥巴辛 妥巴辛為一種高效及選擇性、可逆、細胞可滲透之HDAC6抑制劑，其IC50為4 nM，選擇性為HDAC1的約350倍。 4 nM
羅西司他(ACY-1215) 羅西司他(ACY-1215)為一種選擇性HDAC6抑制劑，其IC50為5 nM。其對HDAC6之選擇性比HDAC1/2/3 (I類HDAC) ＞10倍，對HDAC8具有輕微活性，對HDAC4/5/7/9/11、長壽蛋白1 (Sirtuin1)及長壽蛋白2具有極小活性。2期。 4.7 nM
西他司他(ACY-241) 西他司他(ACY-241，HDAC-IN-2)為一種經口有效之選擇性HDAC6抑制劑，其對HDAC6及HDAC3之IC50分別為2.6 nM及46 nM。與HDAC1-3相比，其對HDAC6之選擇性大13至18倍。 2.6 nM
KA2507 KA2507為一種高選擇性及強效HDAC6抑制劑。 2.5 nM
ACY-738 ACY-738以低奈莫耳濃度(IC50=1.7 nM)抑制HDAC6，且其選擇性比I類HDAC大60至1500倍。 1.7 nM
QTX-125 選擇性比HDAC1大11倍之HDAC6抑制劑 0.6 nM
CKD-506 選擇性比HDAC1大80倍之HDAC6抑制劑 2.9 nM
萊克司他A 萊克司他A為一種強效及選擇性HDAC6抑制劑，其IC50為5 nM，選擇性比其他HDAC ＞190倍。 5 nM
妥巴他汀A 妥巴他汀A為一種強效及選擇性HDAC6抑制劑，其IC50為15 nM。其對除HDAC8 (57倍)以外的所有其他同功酶(1000倍)具有選擇性。 15 nM
HPOB HPOB為一種強效、選擇性HDAC6抑制劑，其IC50為56 nM，選擇性比其他HDAC ＞30倍。 56 nM
其他說明性HDAC6抑制劑提供於美國專利公開案第US8227516B2號、第US20100292169A1號、第US20070207950A1號、第US8222423B2號、第US20100093824A1號、第US20100216796A1號、第US8673911B2號、第US8217076B2號、第US8440716B2號、第US20110195432A1號、第US8624040B2號、第US9096518B2號、第US8431538B2號、第US20120258993A1號、第US8546588B2號、第US8513421B2號、第US20140031368A1號、第US20120015943A1號、第US20120015942A1號、第US20140243335A1號、第US20130225543A1號、第US8471026B2號、第US9238028B2號、第US8765773B2號、第USRE47009E1號、第US20140294856A1號、第US9512083B2號、第US9670193B2號、第US9345905B2號、第US9409858B2號、第US9663825B2號、第US20150119327A1號、第US20150250786A1號、第US10041046B2號、第US9586973B2號、第US20160069887A1號、第US20140357512A1號、第US9751832B2號、第US20160228434A1號、第US20150105358A1號、第US10660890B2號、第US20160271083A1號、第US20150176076A1號、第US20200405716A1號、第US9890136B2號、第US10287255B2號、第US20170173083A1號、第US10016421B2號、第US9987258B2號、第US10568854B2號、第US10106540B2號、第US10266489B2號、第US9993459B2號、第US10183934B2號、第US10494354B2號、第US10494353B2號、第US10112915B2號、第US10377726B2號、第US10829462B2號、第US10829461B2號、第US20210009539A1號、第US20210009538A1號、第US10239845B2號、第US10472337B2號、第US10479772B2號、第US10464911B2號、第US10584117B2號、第US10538498B2號、第US10011611B2號、第US10494355B2號、第US10040769B2號、第US10858323B2號、第US10654814B2號、第US20190209559A1號、第US20190185462A1號、第US20190192521A1號、第US20190321361A1號、第US20200046698A1號、第US20190262337A1號、第US20190282573A1號、第US20190282574A1號、第US20200071288A1號、第US10745389B2號、第US10357493B2號、第US20200171028A1號、第US20200054773A1號、第US20200308174A1號、第US20200155549A1號、第US10435399B2號、第US20200216563A1號、第US20190216751A1號、第US20200339569A1號、第US20210078963A1號、第US20210077487A1號、第US20190270733A1號、第US20190270744A1號、第US20200022966A1號及第US20210094944A1號中，該等公開案出於鑑別可用於本文中所揭示之方法中的HDAC6抑制劑之目的併入本文中。
在一些實施例中，與任何其他(例如HDAC1)或所有其他HDAC同功酶相比，用於本文中所描述之方法中的選擇性HDAC6抑制劑對HDAC6之選擇性大至少15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、160倍、170倍、180倍、190倍、200倍、210倍、220倍、230倍、240倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10000倍、15000倍、20000倍、25000倍、30000倍或更多倍(亦即，比其他HDAC更能抑制HDAC6)。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的HDAC6抑制劑抑制HDAC6之選擇性比任一或所有其他HDAC (例如HDAC1)大至少20倍。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的HDAC6抑制劑抑制HDAC6之選擇性比任一或所有其他HDAC (例如HDAC1)大至少30倍。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的HDAC6抑制劑抑制HDAC6之選擇性比任一或所有其他HDAC (例如HDAC1)大至少40倍。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的HDAC6抑制劑抑制HDAC6之選擇性比任一或所有其他HDAC (例如HDAC1)大至少50倍。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的HDAC6抑制劑抑制HDAC6之選擇性比任一或所有其他HDAC (例如HDAC1)大至少60倍。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的HDAC6抑制劑抑制HDAC6之選擇性比任一或所有其他HDAC (例如HDAC1)大至少100倍。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的HDAC6抑制劑抑制HDAC6之選擇性比任一或所有其他HDAC (例如HDAC1)大至少200倍。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的HDAC6抑制劑抑制HDAC6之選擇性比任一或所有其他HDAC (例如HDAC1)大至少500倍。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的HDAC6抑制劑抑制HDAC6之選擇性比任一或所有其他HDAC (例如HDAC1)大至少1000倍。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的HDAC6抑制劑抑制HDAC6之選擇性比任一或所有其他HDAC (例如HDAC1)大至少2000倍。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的HDAC6抑制劑抑制HDAC6之選擇性比任一或所有其他HDAC (例如HDAC1)大至少5000倍。
在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的選擇性HDAC6抑制劑抑制除HDAC6以外之HDAC的效果比泛HDAC抑制劑(例如，吉維司他)低至少10倍、效果低至少20倍、效果低至少30倍、效果低至少40倍、效果低至少50倍、效果低至少60倍、效果低至少70倍、效果低至少80倍、效果低至少90倍、效果低至少100倍、效果低至少200倍、效果低至少500倍、效果低至少1000倍、效果低至少5000倍或效果低至少10000倍。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的選擇性HDAC6抑制劑抑制除HDAC6以外之HDAC的效果比吉維司他低至少100倍。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的選擇性HDAC6抑制劑抑制除HDAC6以外之HDAC的效果比吉維司他低至少500倍。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的選擇性HDAC6抑制劑抑制除HDAC6以外之HDAC的效果比吉維司他低至少1000倍。在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的選擇性HDAC6抑制劑抑制除HDAC6以外之HDAC的效果比吉維司他低至少5000倍。
在一些實施例中，HDAC6抑制劑不為非選擇性HDAC6抑制劑。在一些實施例中，HDAC6抑制劑不為泛HDAC抑制劑。在一些實施例中，HDAC6抑制劑不為異羥肟酸。在一些實施例中，HDAC6抑制劑不為羅西司他。
在一些實施例中，本文中所描述之方法不包括使用非選擇性HDAC6抑制劑。在一些實施例中，本文中所描述之方法不包括使用泛HDAC抑制劑。在一些實施例中，本文中所描述之方法不包括使用異羥肟酸。在一些實施例中，本文中所描述之方法不包括使用羅西司他。 氟烷基 - 㗁二唑衍生物
在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的HDAC6抑制劑為氟烷基-㗁二唑衍生物。可用作HDAC6抑制劑之說明性氟烷基-㗁二唑衍生物包括本文中所描述之此等衍生物及以WO2021127643A1公開之國際專利申請案第PCT/US2020/066439號中所描述之衍生物，該申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。以WO2021127643A1公開之PCT/US2020/066439亦描述合成此類化合物之方法，該申請案以引用之方式特定併入本文中。
在一些實施例中，HDAC6抑制劑為式I化合物： (I)，其中 R 1係選自由以下組成之群：
及 ；
R a係選自由H、鹵基、C 1 - 3烷基、環烷基、鹵烷基及烷氧基組成之群； R 2及R 3獨立地選自由以下組成之群：H、鹵素、烷氧基、鹵烷基、芳基、雜芳基、烷基及環烷基，其各自視情況經取代，或R 2及R 3與其所連接之原子一起形成環烷基或雜環基； R 4及R 5獨立地選自由以下組成之群：H、-(SO 2)R 2、-(SO 2)NR 2R 3、-(CO)R 2、-(CONR 2R 3)、芳基、芳基雜芳基、伸烷基芳基、雜芳基、環烷基、雜環基、烷基、鹵烷基及烷氧基，其各自視情況經取代，或R 4及R 5與其所連接之原子一起形成環烷基或雜環基，其各自視情況經取代； R 9係選自由H、C 1-C 6烷基、鹵烷基、環烷基及雜環基組成之群； X 1係選自由S、O、NH及NR 6組成之群，其中R 6係選自由C 1-C 6烷基、烷氧基、鹵烷基、環烷基及雜環基組成之群； Y係選自由CR 2、O、N、S、SO及SO 2組成之群，其中當Y為O、S、SO或SO 2時，R 5不存在且當R 4及R 5與其所連接之原子一起形成環烷基或雜環基時，Y為CR 2或N；及 n係選自0、1及2。
在式(I)之一些實施例中，n為0。在一些實施例中，n為1。在一些實施例中，n為2。在一些實施例中，n為0或1。在一些實施例中，n為1或2。在一些實施例中，n為0或2。
在式(I)之一些實施例中，X 1為O。在一些實施例中，X 1為S。在一些實施例中，X 1為NH。在一些實施例中，X 1為NR 6。在一些實施例中，X 1係選自由S、O及NR 6組成之群。在一些實施例中，X 1係選自由S、O及NCH 3組成之群。在一些實施例中，X 1為S或O。在一些實施例中，X 1為S或NR 6。在一些實施例中，R 6為C 1-C 6烷基。
在式(I)之一些實施例中，R 2及R 3為H。
在式(I)之一些實施例中，Y為N、CR 2或O。在一些實施例中，Y為N或O。在一些實施例中，Y為N。在一些實施例中，Y為CR 2。在一些實施例中，Y為O。
在一些實施例中，R 4及R 5獨立地選自由以下組成之群：H、-(SO 2)R 2、-(SO 2)NR 2R 3、-(CO)R 2、-(CONR 2R 3)、芳基、芳基雜芳基、雜芳基、伸烷基芳基、環烷基、伸烷基環烷基、雜環基、伸烷基雜環基、烷基、鹵烷基及烷氧基，其各自視情況經取代，或R 4及R 5與其所連接之原子一起形成環烷基或雜環基，其各自視情況經取代。
在式(I)之一些實施例中，R 4係選自由以下組成之群：-C(O)-烷基、-C(O)-環烷基、-C(O)-芳基、-C(O)-雜芳基、-(SO 2)NR 2R 3、-SO 2-烷基及-SO 2-環烷基，其各自視情況經取代。在一些實施例中，R 4係選自由以下組成之群：-C(O)-烷基、-C(O)-環烷基、-SO 2-烷基、-SO 2-鹵烷基、-SO 2-環烷基及-(SO 2)NR 2R 3，其各自視情況經取代。在一些實施例中，芳基視情況經一或多個鹵素取代。在式(I)之一些實施例中，R 4係選自由-SO 2烷基、-SO 2鹵烷基或-SO 2環烷基組成之群。在式(I)之一些實施例中，R 4係選自由-SO 2Me、-SO 2Et及-SO 2- cPr組成之群。在一些實施例中，R 2及R 3各自獨立地為-C 1 - 5烷基。在一些實施例中，R 2及R 3與其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之雜環基。在一些實施例中，視情況經取代之雜環基為𠰌啉、硫代𠰌啉或硫代𠰌啉1,1-二氧化物。 在式(I)之一些實施例中，R 5係選自由以下組成之群：H、-(SO 2)R 2、-(SO 2)NR 2R 3、-(CO)R 2、-(CONR 2R 3)、芳基、芳基雜芳基、伸烷基芳基、雜芳基、環烷基、雜環基、烷基、鹵烷基及烷氧基，其各自視情況經取代。
在一些實施例中，R 5為芳基、雜芳基或環烷基，其各自視情況經取代。
在一些實施例中，R 5為芳基。在一些實施例中，芳基為 ，其中R b係選自由以下組成之群的一或多者：氫、鹵素、鹵烷基、烷基、O烷基、O鹵烷基、伸烷基-O鹵烷基、環烷基、雜環基芳基、雜芳基、烷基腈或CN。在一些實施例中，鹵烷基係選自CF 3、CF 2CH 3、CHF 2或CH 2F。在一些實施例中，烷基為-C 1 - 5烷基。在一些實施例中，-C 1 - 5烷基為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基或三級丁基。在一些實施例中，甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基或三級丁基視情況經OH取代。在一些實施例中，環烷基為C 3 - 6環烷基。在一些實施例中，芳基為苯基。在一些實施例中，雜芳基為具有1、2或3個選自N、O及S之雜原子的5員或6員雜芳基。在一些實施例中，雜環基為具有1或2個選自N、O及S之雜原子的4員至7員雜環基。在一些實施例中，O鹵烷基係選自OCF 3、OCHF 2或OCH 2F。在一些實施例中，O烷基為O-甲基、O-乙基、O-丙基、O-異丙基、O-丁基或O-三級丁基。
在一些實施例中，R 5為雜芳基。在一些實施例中，雜芳基為視情況經取代之5員至14員雜芳基。在一些實施例中，雜芳基為具有1、2或3個選自由N、O及S組成之群之雜原子的視情況經取代之5員至14員雜芳基。在一些實施例中，視情況經取代之5員至14員雜芳基係選自由以下組成之群：吡唑基、咪唑基、㗁唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、吡𠯤基、嗒𠯤基、喹啉基、異喹啉基、喹喏啉基、㖕啉基、吲哚𠯤基、氮雜吲哚𠯤基、吲哚基、氮雜吲哚基、苯并㗁唑基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、咪唑并吡啶基、咪唑并吡𠯤基及苯并咪唑基。在一些實施例中，視情況經取代之5員至14員雜芳基係選自由以下組成之群：吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡𠯤基、嗒𠯤基、苯并㗁唑基、咪唑并吡啶基及咪唑并吡𠯤基。在一些實施例中，R 5為 、 、 或 ，其中R b為選自由以下組成之群的一或多者：鹵素、鹵烷基、烷基、O烷基、O鹵烷基、伸烷基-O鹵烷基、環烷基、雜環基芳基、雜芳基、烷基腈或CN。在一些實施例中，鹵烷基係選自CF 3、CF 2CH 3、CHF 2或CH 2F。在一些實施例中，烷基為-C 1 - 5烷基。在一些實施例中，-C 1 - 5烷基為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基或三級丁基。在一些實施例中，甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基或三級丁基視情況經OH取代。在一些實施例中，環烷基為C 3 - 6環烷基。在一些實施例中，芳基為苯基。在一些實施例中，雜芳基為具有1、2或3個選自N、O及S之雜原子的5員或6員雜芳基。在一些實施例中，雜環基為具有1或2個選自N、O及S之雜原子的4員至7員雜環基。在一些實施例中，O鹵烷基係選自OCF 3、OCHF 2或OCH 2F。在一些實施例中，O烷基為O-甲基、O-乙基、O-丙基、O-異丙基、O-丁基或O-三級丁基。
在一些實施例中，R 5為環烷基。在一些實施例中，環烷基為環丙基、環丁基、環戊基或環己基，其各自視情況經取代。在一些實施例中，視情況經取代之環烷基為 或 。
在一些實施例中，R 5係選自由以下組成之群：苯基、3-氯苯基、3-氯-4-氟苯基、3-三氟甲基苯基、3,4-二氟苯基及2,6-二氟苯基。在一些實施例中，R 5為環丙基。在一些實施例中，R 5係選自由吡啶-3-基及1-甲基吲唑-6-基組成之群。在一些實施例中，R 5係選自由以下組成之群：H、苯基、3-氯苯基、3-氯-4-氟苯基、3-三氟甲基苯基、3,4-二氟苯基、環丙基、吡啶-3-基、1-甲基吲唑-6-基、3,3-二氟環丁基及4,4-二氟環己基。在一些實施例中，R 5為3-氯苯基。在一些實施例中，R 5為H。在一些實施例中，R 5為 或 。在一些實施例中，R 5為-CH 2CH 2Ph。在一些實施例中，R 5係選自由以下組成之群：H、芳基、雜芳基、伸烷基芳基、環烷基、雜環基、烷基及鹵烷基，其各自視情況經取代，或R 4及R 5與其所連接之原子一起形成視情況經取代之雜環基。
在式(I)之一些實施例中，R 5視情況經一或多個鹵素、鹵烷基、烷基、O烷基、O鹵烷基、環烷基、雜環基芳基或雜芳基取代。在一些實施例中，鹵烷基係選自CF 3、CHF 2或CH 2F。在一些實施例中，烷基為-C 1 - 5烷基。在一些實施例中，-C 1 - 5烷基為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基或三級丁基。在一些實施例中，環烷基為C 3 - 6環烷基。在一些實施例中，芳基為苯基。在一些實施例中，雜芳基為具有1、2或3個選自N、O及S之雜原子的5員或6員雜芳基。在一些實施例中，雜環基為具有1或2個選自N、O及S之雜原子的4員至7員雜環基。在一些實施例中，O鹵烷基係選自OCF 3、OCHF 2或OCH 2F。在一些實施例中，O烷基為O-甲基、O-乙基、O-丙基、O-異丙基、O-丁基或O-三級丁基。
在式(I)之一些實施例中，R 4為H或-C 1 - 5烷基，且R 5為芳基。在一些實施例中，R 4為H或-C 1 - 5烷基，且R 5為雜芳基。在一些實施例中，R 4為H或-C 1 - 5烷基，且R 5為環烷基。在一些實施例中，-C 1 - 5烷基為甲基、乙基或丙基。在一些實施例中，-C 1 - 5烷基為甲基。在一些實施例中，芳基為視情況經取代之苯基。在一些實施例中，雜芳基為具有1、2或3個選自由N、O及S組成之群之雜原子的5員至14員雜芳基。在一些實施例中，視情況經取代之5員至14員雜芳基係選自由以下組成之群：吡唑基、咪唑基、㗁唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、吡𠯤基、嗒𠯤基、喹啉基、異喹啉基、喹喏啉基、㖕啉基、吲哚𠯤基、氮雜吲哚𠯤基、吲哚基、氮雜吲哚基、苯并㗁唑基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、咪唑并吡啶基、咪唑并吡𠯤基及苯并咪唑基。在一些實施例中，雜芳基為5員或6員雜芳基環。在一些實施例中，5員雜芳基為視情況經取代之吡唑基、咪唑基或㗁唑基。在一些實施例中，6員雜芳基為視情況經取代之吡啶基、嘧啶基、吡𠯤基或嗒𠯤基。在一些實施例中，環烷基為視情況經取代之環丙基、環丁基、環戊基或環己基。在一些實施例中，芳基視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代：鹵素、C 1 - 6鹵烷基、C 1 - 6烷基、O-C 1 - 6烷基、O-C 1 - 6鹵烷基或C 3 - 6環烷基。在一些實施例中，雜芳基視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代：鹵素、C 1 - 6鹵烷基、C 1 - 6烷基、O-C 1 - 6烷基、O-C 1 - 6鹵烷基或C 3 - 6環烷基。
在式(I)之一些實施例中，R 4為-(CO)R 2，且R 5為芳基。在一些實施例中，R 4為-(CO)R 2，且R 5為雜芳基。在一些實施例中，R 4為-(CO)R 2，且R 5為環烷基。在一些實施例中，芳基為視情況經取代之苯基。在一些實施例中，芳基為視情況經取代之苯基。在一些實施例中，雜芳基為具有1、2或3個選自由N、O及S組成之群之雜原子的5員至14員雜芳基。在一些實施例中，視情況經取代之5員至14員雜芳基係選自由以下組成之群：吡唑基、咪唑基、㗁唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、吡𠯤基、嗒𠯤基、喹啉基、異喹啉基、喹喏啉基、㖕啉基、吲哚𠯤基、氮雜吲哚𠯤基、吲哚基、氮雜吲哚基、苯并㗁唑基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、咪唑并吡啶基、咪唑并吡𠯤基及苯并咪唑基。在一些實施例中，雜芳基為5員或6員雜芳基環。在一些實施例中，5員雜芳基為視情況經取代之吡唑基、咪唑基、㗁唑基。在一些實施例中，6員雜芳基為視情況經取代之吡啶基、嘧啶基、吡𠯤基或嗒𠯤基。在一些實施例中，環烷基為視情況經取代之環丙基、環丁基、環戊基或環己基。在一些實施例中，芳基視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代：鹵素、C 1 - 6鹵烷基、C 1 - 6烷基、O-C 1 - 6烷基、O-C 1 - 6鹵烷基或C 3 - 6環烷基。在一些實施例中，雜芳基視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代：鹵素、C 1 - 6鹵烷基、C 1 - 6烷基、O-C 1 - 6烷基、O-C 1 - 6鹵烷基或C 3 - 6環烷基。
在式(I)之一些實施例中，R 4為-(SO 2)R 2，且R 5為芳基。在一些實施例中，R 4為-(SO 2)R 2，且R 5為雜芳基。在一些實施例中，R 4為-(SO 2)R 2，且R 5為環烷基。在一些實施例中，芳基為視情況經取代之苯基。在一些實施例中，雜芳基為具有1、2或3個選自由N、O及S組成之群之雜原子的5員至14員雜芳基。在一些實施例中，視情況經取代之5員至14員雜芳基係選自由以下組成之群：吡唑基、咪唑基、㗁唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、吡𠯤基、嗒𠯤基、喹啉基、異喹啉基、喹喏啉基、㖕啉基、吲哚𠯤基、氮雜吲哚𠯤基、吲哚基、氮雜吲哚基、苯并㗁唑基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、咪唑并吡啶基、咪唑并吡𠯤基及苯并咪唑基。在一些實施例中，雜芳基為5員或6員雜芳基環。在一些實施例中，5員雜芳基為視情況經取代之吡唑基、咪唑基或㗁唑基。在一些實施例中，6員雜芳基為視情況經取代之吡啶基、嘧啶基、吡𠯤基或嗒𠯤基。在一些實施例中，環烷基為視情況經取代之環丙基、環丁基、環戊基或環己基。在一些實施例中，芳基視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代：鹵素、C 1 - 6鹵烷基、C 1 - 6烷基、O-C 1 - 6烷基、O-C 1 - 6鹵烷基或C 3 - 6環烷基。在一些實施例中，雜芳基視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代：鹵素、C 1 - 6鹵烷基、C 1 - 6烷基、O-C 1 - 6烷基、O-C 1 - 6鹵烷基或C 3 - 6環烷基。在一些實施例中，C 1 - 6鹵烷基為CF 3、CHF 2或CH 2F。在一些實施例中，O-C 1 - 6鹵烷基為OCF 3、OCHF 2或OCH 2F。在一些實施例中，環烷基視情況經鹵素、C 1 - 6烷基或O-C 1 - 6烷基取代。
在式(I)之一些實施例中，R 4及R 5與其所連接之原子一起形成環烷基或雜環基。在一些實施例中，R 4及R 5與其所連接之原子一起形成環烷基或雜環基，其各自視情況經取代。在一些實施例中，環烷基或雜環基視情況經-NS(O 2)(烷基)(芳基)取代。在一些實施例中，烷基為C 1 - 5烷基且芳基為視情況經一或多個鹵素原子取代之苯基。在一些實施例中，雜環基為4員至10員雜環基。在一些實施例中，雜環基為飽和4員至7員雜環基。
在式(I)之一些實施例中，n為0且R 4及R 5與其所連接之原子一起形成選自由以下組成之群的視情況經取代之雜環基： 、 及 。在一些實施例中，視情況經取代之雜環基為 。在一些實施例中，視情況經取代之雜環基為 。在一些實施例中，視情況經取代之雜環基為 。
在式(I)之一些實施例中，R 1係選自由以下組成之群： 及 。
在式(I)之一些實施例中，R 1為 。在一些實施例中，R 1為 。在一些實施例中，R 1為 。在一些實施例中，R 1為 。
在式(I)之一些實施例中，R a為H、鹵基、C 1 - 3烷基或鹵烷基。在一些實施例中，R a為H。在一些實施例中，R a為C 1 - 3烷基。在一些實施例中，R a為鹵烷基。在一些實施例中，鹵基為F。在一些實施例中，C 1 - 3烷基為甲基、乙基或異丙基。在一些實施例中，鹵烷基為CF 3、CHF 2或CH 2F。
在式(I)之一些實施例中，Y為CH且R 4及R 5為H。
在式(I)之一些實施例中，Y為N，R 4為H，且R 5為視情況經-N(S(O 2)烷基)(芳基)或-N(S(O 2)環烷基)(芳基)取代之乙基。在一些實施例中，烷基為C 1 - 5烷基、環烷基為C 3 - 6環烷基，且芳基為視情況經一或多個鹵素原子取代之苯基。
在式(I)之一些實施例中，n為1，X 1為O或N，Y為N，R 1為 或 ，R 2及R 3為H，R 4為H、-C 1 - 5烷基、-C(O)烷基、-C(O)環烷基、-(SO 2)NR 2R 3、-SO 2烷基、-SO 2鹵烷基及-SO 2環烷基，其各自視情況經取代，且R 5為芳基、雜芳基或環烷基，其各自視情況經取代。
在式(I)之一些實施例中，n為1，X 1為O或N，Y為O，R 1為 或 ，R 2及R 3為H，且R 5為芳基、雜芳基、環烷基或伸烷基環烷基，其各自視情況經取代。
在式(I)之一些實施例中，n為0，X 1為O或N，Y為N，R 1為 或 ， 且R 4及R 5與其所連接之原子一起形成環烷基或雜環基，其各自視情況經取代。
在一些實施例中，本發明提供一種式(Ia)化合物或其鹽： (Ia)，其中： R 1、R 2、R 3、R 4、R 5、R a、X 1、n及Y係如上文關於式(I)所定義。
在式(Ia)之一些實施例中，R 1為 或 ；n為1；Y為N；X 1為S或O；且變數R 2、R 3、R 4、R 5及R a係如上文關於式(I)所定義。
在式(Ia)之一些實施例中，n為1，X 1為S，Y為N，R 1為 或 ，R 2及R 3為H，R 4為-SO 2烷基、-SO 2鹵烷基或-SO 2環烷基，其各自視情況經取代，R 5為雜芳基，其各自視情況經取代，且R a為H或F。在一些其他實施例中，R 4為-SO 2C 1 - 5烷基、-SO 2環丙基、-SO 2CF 3或-SO 2CHF 2，且雜芳基為視情況經取代之吡啶或吡𠯤。在一些其他實施例中，雜芳基為視情況經取代之吡啶。
在式(Ia)之一些實施例中，n為1，X 1為S，Y為N，R 1為 或 ， R 2及R 3為H，R 4為-SO 2Me、-SO 2Et或-SO 2環丙基，其各自視情況經取代，R 5為吡啶或吡𠯤，其各自視情況經取代，且R a為H。在一些實施例中，R 5為視情況經取代之吡啶。
在式(Ia)之一些實施例中，n為1，X 1為S，Y為N，R 1為 或 ， R 2及R 3為H，R 4為-SO 2烷基或-SO 2環烷基，其各自視情況經取代，R 5為 或 ， 其中R b係如本文中所定義。在一些實施例中，R b係選自由以下組成之群：H、鹵素、-C 1 - 5烷基、鹵烷基、-OC 1 - 5烷基、-O鹵烷基、-CH 2O鹵烷基、環丙基及CN，且R a為H。在一些實施例中，鹵素為F或Cl。在一些實施例中，鹵烷基為CF 3、CHF 2、CH 2CF 3或CF 2CH 3。在一些實施例中，-C 1 - 5烷基為甲基。
在式(Ia)之一些實施例中，n為1，X 1為S，Y為N，R 1為 ， R 2及R 3為H，R 4為-SO 2Me、-SO 2Et或-SO 2環丙基，其各自視情況經取代，且R 5為 或 ， 其中R b係如本文中所定義。在一些實施例中，R b係選自由以下組成之群：鹵素、-C 1 - 5烷基、鹵烷基、-OC 1 - 5烷基、-O鹵烷基、-CH 2O鹵烷基、環丙基及CN，且R a為H。在一些實施例中，鹵素為F或Cl。在一些實施例中，鹵烷基為CF 3、CHF 2、CH 2CF 3或CF 2CH 3。在一些實施例中，-C 1 - 5烷基為甲基。
在式(Ia)之一些實施例中，n為1，X 1為S，Y為N，R 1為 R 2及R 3為H，R 4為-SO 2Me、-SO 2Et或-SO 2環丙基，其各自視情況經取代，且R 5為 其中R b係如本文中所定義。在一些實施例中，R b係選自由以下組成之群：H、Cl、F、Me、環丙基、CF 3、CHF 2、CF 2CH 3、OCF 3、OCHF 2、OCH 2CF 2H及CN，且R a為H。
在一些實施例中，本發明提供一種式(Ib)化合物或其鹽： (Ib)，其中： R 1、R 2、R 3、R 4、R 5、R a、X 1、n及Y係如上文關於式(I)所定義。
在式(I)至(Ib)之一些實施例中，各視情況經取代之烷基獨立地為視情況經取代之C 1 - 6烷基。在一些實施例中，C 1 - 6烷基為Me或Et。
在式(I)至(Ib)之一些實施例中，各視情況經取代之鹵烷基獨立地為視情況經取代之C 1 - 6鹵烷基。在一些實施例中，C 1 - 6鹵烷基為CF 3、CHF 2或CH 2F。在一些實施例中，C 1 - 6鹵烷基為CF 3或CHF 2。
在式(I)至(Ib)之一些實施例中，各視情況經取代之環烷基獨立地為視情況經取代之C 3 - 12環烷基。在一些實施例中，環烷基為C 3 - 6環烷基。在一些實施例中，環烷基係選自由環丙基、環丁基、環戊基及環己基組成之群。
在式(I)至(Ib)之一些實施例中，各視情況經取代之雜環基獨立地為具有1或2個獨立地選自N、O及S之雜原子的視情況經取代之3員至12員雜環烷基。在一些實施例中，各視情況經取代之雜環基獨立地為具有1或2個獨立地選自N、O及S之雜原子的視情況經取代之3員至6員雜環烷基。在其他實施例中，雜環烷基為具有1或2個獨立地選自N、O及S之雜原子的視情況經取代之5員或6員雜環。在一些實施例中，雜環基係選自由氮雜環丙烷基、氮雜環丁烷基、吡咯啶基、哌啶基及𠰌啉基及硫代𠰌啉基組成之群。
在式(I)至(Ib)之一些實施例中，各視情況經取代之芳基獨立地為C 6 - 12芳基。在其他實施例中，C 6 - 12芳基為視情況經取代之苯基。
在式(I)至(Ib)之一些實施例中，各視情況經取代之雜芳基獨立地為具有1、2或3個獨立地選自N、O及S之雜原子的5員至12員雜芳基。在一些實施例中，各視情況經取代之雜芳基獨立地為具有3個獨立地選自N、O及S之雜原子的5員至12員雜芳基。在一些實施例中，各視情況經取代之雜芳基獨立地為具有2個獨立地選自N、O及S之雜原子的5員至12員雜芳基。在一些實施例中，各視情況經取代之雜芳基獨立地為具有1個獨立地選自N、O及S之雜原子的5員至12員雜芳基。在其他實施例中，各視情況經取代之雜芳基為具有1個獨立地選自N、O及S之雜原子的視情況經取代之5員或6員雜芳基。在一些實施例中，各雜芳基獨立地選自由以下組成之群：四唑、㗁二唑、噻二唑、咪唑、吡唑、噻唑或㗁唑，其各自視情況經取代。
在一些實施例中，式(I)化合物係選自由以下組成之群：
在一些實施例中，本發明提供一種式(Ic)化合物或其鹽： (Ic)， 其中： R a為H、Me或F；及 R 4及R 5係如本文例如在式(I)中所定義。
在式(Ic)之一些實施例中，R a為H。在一些實施例中，R a為F。在一些實施例中，R a為Me。
在式(Ic)之一些實施例中，R 4係選自由以下組成之群：伸烷基烷氧基、伸烷基雜環基、-S(O) 2烷基、-S(O) 2環烷基、-S(O) 2伸烷基環烷基、-S(O) 2伸烷基雜環基、-S(O) 2N(H)伸烷基雜環基、-C(O)烷基、-C(O)環烷基、-C(O)伸烷基環烷基、-C(O)伸烷基雜環基及-C(O)N(H)伸烷基雜環基。在一些實施例中，R 4係選自由以下組成之群：伸烷基雜環基、-S(O) 2烷基、-S(O) 2環烷基、-S(O) 2伸烷基雜環基、-C(O)伸烷基雜環基及-C(O)N(H)伸烷基雜環基。在一些實施例中，R 4係選自由以下組成之群：-S(O) 2烷基、-S(O) 2環烷基及-S(O) 2伸烷基雜環基。在一些實施例中，R 4為-S(O) 2烷基。在一些實施例中，R 4為-S(O) 2環烷基。在一些實施例中，R 4為-S(O) 2N(H)伸烷基雜環基。在一些實施例中，伸烷基為C 1 - 5伸烷基且雜環基為具有1、2或3個選自由N、O及S組成之群之雜原子的視情況經取代之4員至10員雜環基。在一些實施例中，伸烷基為C 1 - 5伸烷基且雜環基為具有1、2或3個選自由N、O及S組成之群之雜原子的視情況經取代之4員至7員雜環基。在一些實施例中，伸烷基為C 2 - 4伸烷基且雜環基為具有1、2或3個選自由N、O及S組成之群之雜原子的視情況經取代之6員雜環基。在一些實施例中，雜環基係選自由以下組成之群：哌啶、𠰌啉、硫代𠰌啉、硫代𠰌啉1-氧化物、硫代𠰌啉1,1-二氧化物及哌𠯤，其各自視情況經取代。在一些實施例中，視情況選用之取代基係選自由以下組成之群：烷基、鹵烷基、烷氧基、醯基、磺醯基、雜芳基及雜環基。
在式(Ic)之一些實施例中，R 5係選自由以下組成之群： 、 、 及 。在一些實施例中，R 5為 。在一些實施例中，R 5為 。在一些實施例中，R 5為 。在一些實施例中，R 5為 。在一些實施例中，R b係選自由以下組成之群：鹵素、鹵烷基、烷基、O烷基、O鹵烷基、伸烷基-O鹵烷基、環烷基、雜環基芳基、雜芳基、烷基腈或CN。在一些實施例中，R b係選自由以下組成之群：鹵素、烷基、鹵烷基、烷氧基、鹵烷氧基、醯基、磺醯基、環烷基、雜芳基及雜環基。在一些實施例中，鹵烷基係選自CF 3、CF 2CH 3、CHF 2或CH 2F。在一些實施例中，烷基為-C 1 - 5烷基。在一些實施例中，-C 1 - 5烷基為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基或三級丁基。在一些實施例中，甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基或三級丁基視情況經OH取代。在一些實施例中，環烷基為C 3 - 6環烷基。在一些實施例中，芳基為苯基。在一些實施例中，雜芳基為具有1、2或3個選自N、O及S之雜原子的5員或6員雜芳基。在一些實施例中，雜環基為具有1或2個選自N、O及S之雜原子的4員至7員雜環基。在一些實施例中，O鹵烷基係選自OCF 3、OCHF 2或OCH 2F。在一些實施例中，O烷基為O-甲基、O-乙基、O-丙基、O-異丙基、O-丁基或O-三級丁基。在一些實施例中，R b係選自由以下組成之群：F、Cl、-CH 3、-CH 2CH 3、-CF 3、-CHF 2、-CF 2CH 3、-CN、-OCH 3、-OCH 2CH 3、-OCH(CH 3) 2、-OCHF 2、-OCH 2CF 2H及環丙基。在一些實施例中，m為0、1或2。在一些實施例中，m為0或1。在一些實施例中，m為0。在一些實施例中，m為1。在一些實施例中，m為2。
在一些實施例中，本發明提供一種式(Id)化合物或其鹽： (Id)， 其中： U為NR d、O、S、S(O)、S(O) 2、CH 2、CHF或CF 2； R a為H、Me或F； R b各自獨立地為鹵基、烷基、鹵烷基、烷氧基、鹵烷氧基、-C(O)R e、-C(O)OR e、-C(O)N(R e)(R e ')、-S(O 2)R e、環烷基、雜芳基或雜環基； R c各自獨立地為F、烷基、鹵烷基、烷氧基、鹵烷氧基、-C(O)R e、-C(O)OR e、-C(O)N(R e)(R e ')、-S(O 2)R e、雜芳基或雜環基，及/或兩個R c基團與其所連接之碳原子一起形成橋接或稠合C 3 - 7環烷基、橋接或稠合4員至7員雜環基；或5員或6員雜芳基，其各自視情況經取代； R d為H、烷基、醯基、磺醯基、環烷基、芳基或雜芳基； R e及R e '各自獨立地為H、烷基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、-CH 2環烷基、-CH 2雜環基、-CH 2芳基或-CH 2雜芳基； m為0、1、2或3； p為0、1、2或3； q為0、1或2；及 r為1、2、3或4。
在一些實施例中，本發明提供一種式(Ie)化合物或其鹽： (Ie)， 其中： U為NR d、O、S、S(O)、S(O) 2、CH 2、CHF或CF 2； R a為H、Me或F； R b各自獨立地為鹵基、烷基、鹵烷基、烷氧基、鹵烷氧基、-C(O)R e、-C(O)OR e、-C(O)N(R e)(R e ')、磺醯基、環烷基、雜芳基或雜環基； R c各自獨立地為F、烷基、鹵烷基、烷氧基、鹵烷氧基、-C(O)R e、-C(O)OR e、-C(O)N(R e)(R e ')、-S(O 2)R e、雜芳基或雜環基，及/或兩個R c基團與其所連接之碳原子一起形成橋接或稠合C 3 - 7環烷基、橋接或稠合4員至6員雜環基；或5員或6員雜芳基，其各自視情況經取代； R d為H、烷基、醯基、磺醯基、環烷基、芳基或雜芳基； R e及R e '各自獨立地為H、烷基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、-CH 2環烷基、-CH 2雜環基、-CH 2芳基或-CH 2雜芳基； m為0、1、2或3； p為0、1、2或3； q為0、1或2；及 r為1、2、3或4。
在一些實施例中，本發明提供一種式(If)化合物或其鹽： (If)， 其中： U為NR d、O、S、S(O)、S(O) 2、CH 2、CHF或CF 2； R a為H、Me或F； R b各自獨立地為鹵基、烷基、鹵烷基、烷氧基、鹵烷氧基、-C(O)R e、-C(O)OR e、-C(O)N(R e)(R e ')、磺醯基、環烷基、雜芳基或雜環基； R c各自獨立地為F、烷基、鹵烷基、烷氧基、鹵烷氧基、-C(O)R e、-C(O)OR e、-C(O)N(R e)(R e ')、-S(O 2)R e、雜芳基或雜環基，及/或兩個R c基團與其所連接之碳原子一起形成橋接或稠合C 3 - 7環烷基、橋接或稠合4員至7員雜環基；或5員或6員雜芳基，其各自視情況經取代； R d為H、烷基、醯基、磺醯基、環烷基、芳基或雜芳基； R e及R e '各自獨立地為H、烷基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、-CH 2環烷基、-CH 2雜環基、-CH 2芳基或-CH 2雜芳基； m為0、1、2或3； p為0、1、2或3； q為0、1或2；及 r為1、2、3或4。
在一些實施例中，本發明提供一種式(Ig)化合物或其鹽： (Ig)， 其中： U為NR d、O、S、S(O)、S(O) 2、CH 2、CHF或CF 2； R a為H、Me或F； R b各自獨立地為鹵基、烷基、鹵烷基、烷氧基、鹵烷氧基、-C(O)R e、-C(O)OR e、-C(O)N(R e)(R e ')、磺醯基、環烷基、雜芳基或雜環基； R c各自獨立地為F、烷基、鹵烷基、烷氧基、鹵烷氧基、-C(O)R e、-C(O)OR e、-C(O)N(R e)(R e ')、-S(O 2)R e、雜芳基或雜環基，及/或兩個R c基團與其所連接之碳原子一起形成橋接或稠合C 3 - 7環烷基、橋接或稠合4員至7員雜環基；或5員或6員雜芳基，其各自視情況經取代； R d為H、烷基、醯基、磺醯基、環烷基、芳基或雜芳基； R e及R e '各自獨立地為H、烷基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、-CH 2環烷基、-CH 2雜環基、-CH 2芳基或-CH 2雜芳基； m為0、1、2或3； p為0、1、2或3； q為0、1或2；及 r為1、2、3或4。
在一些實施例中，化合物具有下式： (Id-1)、 (Ie-1)、 (If-1)或 (Ig-1)，其中： U、R a、R b、m及r係如上文在式(Id)、(Ie)、(If)及(Ig)中所定義；及 V為O或NR d。
在式(Id)至(Ig)及(Id-1)至(Ig-1)之一些實施例中，U為NR d、O或S且V為O。在一些實施例中，U為N、O或S且V為NR d。在一些實施例中，U為NR d且V為NR d。在一些實施例中，U為O且V為NR d。在一些實施例中，U為S且V為NR d。在一些實施例中，U為NR d且V為O。在一些實施例中，U為O且V為O。在一些實施例中，U為S且V為O。
在式(Id)至(Ig)及(Id-1)至(Ig-1)之一些實施例中，U為O、S、S(O) 2、CH 2或NR d。在一些實施例中，U為O、S、CH 2或NR d。在一些實施例中，U為O、S或NR d。在一些實施例中，U為O或CH 2。在一些實施例中，U為O。在一些實施例中，U為S。在一些實施例中，U為NR d。在一些實施例中，U為S(O) 2。
在式(Id)至(Ig)及(Id-1)至(Ig-1)之一些實施例中，R a為H。在一些實施例中，R a為F。在一些實施例中，R a為Me。
在式(Id)至(Ig)及(Id-1)至(Ig-1)之一些實施例中，R a為鹵基、烷基、鹵烷基、烷基、鹵烷氧基、環烷基、雜環基、雜芳基或腈。在一些實施例中，R b為鹵基、烷基、鹵烷基、烷基、鹵烷氧基、環烷基或腈。在一些實施例中，鹵烷基係選自CF 3、CF 2CH 3、CHF 2或CH 2F。在一些實施例中，烷基為-C 1 - 5烷基。在一些實施例中，-C 1 - 5烷基為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基或三級丁基。在一些實施例中，環烷基為C 3 - 6環烷基。在一些實施例中，雜芳基為具有1、2或3個選自N、O及S之雜原子的5員或6員雜芳基。在一些實施例中，雜環基為具有1或2個選自N、O及S之雜原子的4員至7員雜環基。在一些實施例中，鹵烷氧基係選自OCF 3、OCHF 2或OCH 2F。在一些實施例中，烷氧基為O-甲基、O-乙基、O-丙基、O-異丙基、O-丁基或O-三級丁基。在一些實施例中，R b為-C(O)R e、-C(O)OR e、-C(O)N(R e)(R e ')。
在式(Id)至(Ig)之一些實施例中，R c為F、C 1 - 5烷基、鹵烷基、C 1 - 5烷氧基、鹵烷氧基、醯基、磺醯基、5員或6員雜芳基或C 3 - 6雜環基。在一些實施例中，R c為-C(O)R e、-C(O)OR e、-C(O)N(R e)(R e ')。在一些實施例中，兩個R c基團與其所連接之碳原子一起形成橋接或稠合C 3 - 7環烷基、橋接或稠合5員或6員雜環基，或5員或6員雜芳基，其各自視情況經取代。在一些實施例中，兩個R c基團與其所連接之碳原子一起形成視情況經取代之橋接或稠合C 3 - 7環烷基。在一些實施例中，兩個R c基團與其所連接之碳原子一起形成視情況經取代之橋接或稠合5員或6員雜環基。在一些實施例中，兩個R c基團與其所連接之碳原子一起形成烷氧基或胺基烷基橋。在一些實施例中，視情況選用之取代基為一或多個R b，其係如上文所定義。在一些實施例中，視情況選用之取代基係選自由以下組成之群：F、C 1 - 5烷基、C 1 - 5烷氧基、CF 3、CF 2H、CFH 2、-OCF 3、-OCF 2H、-OCFH 2、-C(O)R e、-C(O)OR e、-C(O)N(R e)(R e ')及-SO 2R e。在一些實施例中，視情況選用之取代基係選自由以下組成之群：F、C 1 - 5烷基、C 1 - 5烷氧基、CF 3、CF 2H、CFH 2、-OCF 3、-OCF 2H及-OCFH 2。在一些實施例中，視情況選用之取代基為F或C 1 - 5烷基。在一些實施例中，視情況選用之取代基為F。在一些實施例中，視情況選用之取代基為C 1 - 5烷基。在一些實施例中，C 1 - 5烷基為甲基。在一些實施例中，C 1 - 5烷基為乙基。在一些實施例中，C 1 - 5烷基為丙基。在一些實施例中，C 1 - 5烷基為異丙基。
在式(Id)至(Ig)及(Id-1)至(Ig-1)之一些實施例中，R e及R e '各自獨立地為H、烷基、環烷基或-CH 2環烷基。在一些實施例中，烷基為-C 1 - 5烷基。在一些實施例中，-C 1 - 5烷基為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基或三級丁基。在一些實施例中，環烷基為C 3 - 6環烷基。在一些實施例中，環烷基為環丙基。在一些實施例中，R e及R e '為H。
在式(Id)至(Ig)及(Id-1)至(Ig-1)之一些實施例中，m為0、1或2。在一些實施例中，m為0或1。在一些實施例中，m為0。在一些實施例中，m為1。在一些實施例中，m為2。
在式(Id)至(Ig)之一些實施例中，p為0、1或2。在一些實施例中，p為0或1。在一些實施例中，p為1或2。在一些實施例中，p為0。在一些實施例中，p為1。在一些實施例中，p為2。
在式(Id)至(Ig)及(Id-1)至(Ig-1)之一些實施例中，r 為1、2或3。在一些實施例中，r為1或2。在一些實施例中，r為2或3。在一些實施例中，r為1。在一些實施例中，r為2。在一些實施例中，r為3。在一些實施例中，r為4。
在式(Id)至(Ig)之一些實施例中，q為0或1。在一些實施例中，q為0。在一些實施例中，q為1。在一些實施例中，q為2。
在式(Id)至(Ig)之一些實施例中，r為1且p為1。在一些實施例中，r為2且p為1。在一些實施例中，r為3且p為1。
在一些實施例中，本發明提供一種式(Ih)化合物或其鹽： (Ih)， 其中： U為NR d、O、S、S(O)、S(O) 2、CH 2、CHF或CF 2； X 1、X 2、X 3及X 4各自獨立地為CH或N； R a為H、Me或F； R b各自獨立地為鹵基、烷基、鹵烷基、烷氧基、鹵烷氧基、-C(O)R e、-C(O)OR e、-C(O)N(R e)(R e ')、-SO 2R e、環烷基、雜芳基或雜環基； R c各自獨立地為F、烷基、鹵烷基、烷氧基或鹵烷氧基，及/或兩個R c基團與其所連接之原子一起形成視情況經取代之C 3 - 7環烷基； R d為H、烷基、醯基、磺醯基、環烷基、芳基或雜芳基； R e及R e '各自獨立地為H、烷基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、-CH 2環烷基、-CH 2雜環基、-CH 2芳基或-CH 2雜芳基； m為0、1、2或3； p為0、1、2或3；及 q為0、1或2。
在一些實施例中，本發明提供一種式(Ii)化合物或其鹽： (Ii)， 其中： U為NR d、O、S、S(O)、S(O) 2、CH 2、CHF或CF 2； X 1、X 2、X 3及X 4各自獨立地為CH或N； R a為H、Me或F； R b各自獨立地為鹵基、烷基、鹵烷基、烷氧基、鹵烷氧基、-C(O)R e、-C(O)OR e、-C(O)N(R e)(R e ')、-SO 2R e、環烷基、雜芳基或雜環基； R c各自獨立地為F、烷基、鹵烷基、烷氧基或鹵烷氧基，及/或兩個R c基團與其所連接之原子一起形成視情況經取代之C 3 - 7環烷基； R d為H、烷基、-C(O)R e、磺醯基、環烷基、芳基或雜芳基； R e及R e '各自獨立地為H、烷基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、-CH 2環烷基、-CH 2雜環基、-CH 2芳基或-CH 2雜芳基； m為0、1、2或3； p為0、1、2或3；及 q為0、1或2。
在一些實施例中，本發明提供一種式(Ij)化合物或其鹽： (Ij)， 其中： U為NR d、O、S、S(O)、S(O) 2、CH 2、CHF或CF 2； X 1、X 2、X 3及X 4各自獨立地為CH或N； R a為H、Me或F； R b各自獨立地為鹵基、烷基、鹵烷基、烷氧基、鹵烷氧基、-C(O)R e、-C(O)OR e、-C(O)N(R e)(R e ')、-SO 2R e、環烷基、雜芳基或雜環基； R c各自獨立地為F、烷基、鹵烷基、烷氧基或鹵烷氧基，及/或兩個R c基團與其所連接之原子一起形成視情況經取代之C 3 - 7環烷基； R d為H、烷基、-C(O)R e、磺醯基、環烷基、芳基或雜芳基； R e及R e '各自獨立地為H、烷基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、-CH 2環烷基、-CH 2雜環基、-CH 2芳基或-CH 2雜芳基； m為0、1、2或3； p為0、1、2或3；及 q為0、1或2。
在式(Ih)至(Ij)之一些實施例中，NR d、O、S、S(O) 2或CH 2。在一些實施例中，U為NR d、O、S或CH 2。在一些實施例中，U為O或CH 2。在一些實施例中，U為O。在一些實施例中，U為CH 2。在一些實施例中，U為S。在一些實施例中，U為S(O) 2。在一些實施例中，U為NR d。
在式(Ih)至(Ij)之一些實施例中，X 1、X 2、X 3及X 4中之各者為CH。在一些實施例中，X 1、X 2、X 3及X 4中之一者為N。在一些實施例中，X 1、X 2、X 3及X 4中之兩者為N。在一些實施例中，X 1為N且X 2、X 3及X 4中之各者為CH。在一些實施例中，X 2為N且X 1、X 3及X 4中之各者為CH。在一些實施例中，X 3為N且X 1、X 2及X 4中之各者為CH。在一些實施例中，X 4為N且X 1、X 2及X 3中之各者為CH。
在式(Ih)至(Ij)之一些實施例中，U為CH 2且X 1、X 2、X 3及X 4中之一者為N。在一些實施例中，U為CH 2，X 1為N且X 2、X 3及X 4中之各者為CH。在一些實施例中，U為CH 2，X 2為N且X 1、X 3及X 4中之各者為CH。在一些實施例中，U為CH 2，X 3為N且X 1、X 2及X 4中之各者為CH。在一些實施例中，U為CH 2，X 4為N且X 1、X 2及X 3中之各者為CH。在一些實施例中，p為0。在一些實施例中，p為1。
在式(Ih)至(Ij)之一些實施例中，U為O且X 1、X 2、X 3及X 4中之一者為N。在一些實施例中，U為O，X 1為N且X 2、X 3及X 4中之各者為CH。在一些實施例中，U為O，X 2為N且X 1、X 3及X 4中之各者為CH。在一些實施例中，U為O，X 3為N且X 1、X 2及X 4中之各者為CH。在一些實施例中，U為O，X 4為N且X 1、X 2及X 3中之各者為CH。
在式(Ih)至(Ij)之一些實施例中，R a為H。在一些實施例中，R a為F。在一些實施例中，R a為Me。
在式(Ih)至(Ij)之一些實施例中，R b為鹵基、烷基、鹵烷基、烷基、鹵烷氧基、環烷基、雜環基、雜芳基或腈。在一些實施例中，R b為鹵基、烷基、鹵烷基、烷基、鹵烷氧基、環烷基或腈。在一些實施例中，鹵烷基係選自CF 3、CF 2CH 3、CHF 2或CH 2F。在一些實施例中，烷基為-C 1 - 5烷基。在一些實施例中，-C 1 - 5烷基為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基或三級丁基。在一些實施例中，環烷基為C 3 - 6環烷基。在一些實施例中，雜芳基為具有1、2或3個選自N、O及S之雜原子的5員或6員雜芳基。在一些實施例中，雜環基為具有1或2個選自N、O及S之雜原子的4員至7員雜環基。在一些實施例中，鹵烷氧基係選自OCF 3、OCHF 2或OCH 2F。在一些實施例中，烷氧基為O-甲基、O-乙基、O-丙基、O-異丙基、O-丁基或O-三級丁基。
在式(Ih)至(Ij)之一些實施例中，R c為F、C 1 - 5烷基、鹵烷基、C 1 - 5烷氧基、鹵烷氧基、醯基、磺醯基、5員或6員雜芳基或C 3 - 6雜環基。在一些實施例中，R c為F、C 1 - 5烷基、鹵烷基、C 1 - 5烷氧基或鹵烷氧基。在一些實施例中，R c為F或C 1 - 5烷基。在一些實施例中，R c為F或甲基。在一些實施例中，R c為F。在一些實施例中，R c為甲基。在一些實施例中，兩個R c基團係連接至同一碳原子，此亦可稱為生發取代(germinal substitution)。在一些實施例中，兩個R c基團與其所連接之原子一起形成視情況經取代之C 3 - 6環烷基。在一些實施例中，兩個R c基團與其所連接之原子一起形成視情況經取代之環丙基。在一些實施例中，視情況選用之取代基為一或多個R b，其係如上文所定義。在一些實施例中，視情況選用之取代基係選自由以下組成之群：F、C 1 - 5烷基、C 1 - 5烷氧基、CF 3、CF 2H、CFH 2、-OCF 3、-OCF 2H、-OCFH 2、-C(O)R e、-C(O)OR e、-C(O)N(R e)(R e ')及-SO 2R e。在一些實施例中，視情況選用之取代基係選自由以下組成之群：F、C 1 - 5烷基、C 1 - 5烷氧基、CF 3、CF 2H、CFH 2、-OCF 3、-OCF 2H及-OCFH 2。在一些實施例中，視情況選用之取代基為F或C 1 - 5烷基。在一些實施例中，視情況選用之取代基為F。在一些實施例中，視情況選用之取代基為C 1 - 5烷基。在一些實施例中，C 1 - 5烷基為甲基。在一些實施例中，C 1 - 5烷基為乙基。在一些實施例中，C 1 - 5烷基為丙基。在一些實施例中，C 1 - 5烷基為異丙基。在一些實施例中，兩個視情況選用之取代基係連接至同一碳，此亦稱為生發取代。
在式(Ih)至(Ij)之一些實施例中，當U為NR d時，R d及R c與其所連接之原子一起形成5員至7員雜環基。在一些實施例中，R d及R c與其所連接之原子一起形成6員雜環基。在一些實施例中，雜環基包含1或2個選自N、O及S之雜原子。
在一些實施例中，本發明提供一種式(Ih-1)、式(Ii-1)或式(Ij-1)化合物： 其中R a、R b、R c、X 1、X 2、X 3、X 4、U及m係如上文在式(Ih)、式(Ii)及式(Ij)中所定義。
在式(Ih-1)、式(Ii-1)及式(Ij-1)之一些實施例中，各R c為F。在一些實施例中，各R c為Me。在一些實施例中，兩個R c基團與其所連接之碳原子一起形成視情況經取代之C 3 - 6環烷基。在一些實施例中，兩個R c基團與其所連接之碳原子一起形成環丙基或環丁基，其各自視情況經取代。在一些實施例中，兩個R c基團與其所連接之碳原子一起形成視情況經取代之環丙基。在一些實施例中，視情況選用之取代基為F或C 1 - 5烷基。在一些實施例中，視情況選用之取代基為F。在一些實施例中，視情況選用之取代基為C 1 - 5烷基。在一些實施例中，C 1 - 5烷基為甲基。在一些實施例中，C 1 - 5烷基為乙基。在一些實施例中，C 1 - 5烷基為丙基。在一些實施例中，C 1 - 5烷基為異丙基。在一些實施例中，兩個視情況選用之取代基係連接至同一碳，此亦稱為生發取代。
在一些實施例中，R d為H、烷基或環烷基。在一些實施例中，R d為H。在一些實施例中，R d為烷基。在一些實施例中，R d為環烷基。在一些實施例中，烷基為甲基、乙基、丙基、異丙基或三級丁基。在一些實施例中，環烷基為環丙基、環戊基或環己基。
在一些實施例中，m為0、1或2。在一些實施例中，m為0或1。在一些實施例中，m為0。在一些實施例中，m為1。在一些實施例中，m為2。
在一些實施例中，p為0、1或2。在一些實施例中，p為0或1。在一些實施例中，p為1或2。在一些實施例中，p為0。在一些實施例中，p為1。在一些實施例中，p為2。
在一些實施例中，q為0或1。在一些實施例中，q為0。在一些實施例中，q為1。在一些實施例中，q為2。
在一些實施例中，HDAC6抑制劑具有下式： ， 或其鹽， 其中： X 1為S； R a係選自由H、鹵素及C 1 - 3烷基組成之群； R 1為 或 ； R 2係選自由以下組成之群：烷基、烷氧基及環烷基，其各自視情況經取代； R 3為H或烷基； R 4係選自由烷基、-(SO 2)R 2、-(SO 2)NR 2R 3及-(CO)R 2組成之群；及 R 5為芳基或雜芳基；或R 4及R 5與其所連接之原子一起形成雜環基，其各自視情況經取代。
在一些實施例中，R a為H。
在一些實施例中，R 1為 。
在一些實施例中，R 4為-(SO 2)R 2。
在一些實施例中，-(SO 2)R 2為-(SO 2)烷基、-(SO 2)伸烷基雜環基、-(SO 2)鹵烷基、-(SO 2)鹵烷氧基或-(SO 2)環烷基。
在一些實施例中，R 5為雜芳基。
在一些實施例中，雜芳基為5員至6員雜芳基。
在一些實施例中，5員至6員雜芳基係選自由以下組成之群： 、 、 及 ，其中R b為鹵素、烷基、烷氧基、環烷基、-CN、鹵烷基或鹵烷氧基；且m為0或1。
在一些實施例中，R b為鹵素、鹵烷基或鹵烷氧基。在一些實施例中，R b為F、Cl、-CH 3、-CH 2CH 3、-CF 3、-CHF 2、-CF 2CH 3、-CN、-OCH 3、-OCH 2CH 3、-OCH(CH 3) 2、-OCF 3、-OCHF 2、-OCH 2CF 2H及環丙基。
在一些實施例中，芳基係選自由以下組成之群：苯基、3-氯苯基、3-氯-4-氟苯基、3-三氟甲基苯基、3,4-二氟苯基及2,6-二氟苯基。
在一些實施例中，HDAC6抑制劑具有式(Ik)： (Ik)， 或其鹽， 其中： R b為H、鹵素、烷基、環烷基、-CN、鹵烷基或鹵烷氧基；及 R 4為烷基、烷氧基、鹵烷基或環烷基，其各自視情況經取代。
在一些實施例中，R b為H、鹵素、鹵烷基或鹵烷氧基。在一些實施例中，R b為鹵素、鹵烷基或鹵烷氧基。在一些實施例中，R b為F、Cl、-CH 3、-CH 2CH 3、-CF 3、-CHF 2、-CF 2CH 3、-CN、-OCH 3、-OCH 2CH 3、-OCH(CH 3) 2、-OCF 3、-OCHF 2、-OCH 2CF 2H及環丙基。
在一些實施例中，R 4為視情況經取代之烷基或環烷基。
在一些實施例中，HDAC6抑制劑具有以下結構： (Ik-1)， 或其鹽， 其中： R b為H、鹵素、烷基、環烷基、-CN、鹵烷基或鹵烷氧基；及 R 4為烷基、烷氧基、鹵烷基或環烷基，其各自視情況經取代。
在一些實施例中，R b為H、鹵素、鹵烷基或鹵烷氧基。在一些實施例中，R b為鹵素、鹵烷基或鹵烷氧基。在一些實施例中，R b為F、Cl、-CH 3、-CH 2CH 3、-CF 3、-CHF 2、-CF 2CH 3、-CN、-OCH 3、-OCH 2CH 3、-OCH(CH 3) 2、-OCF 3、-OCHF 2、-OCH 2CF 2H及環丙基。
在一些實施例中，R 4為視情況經取代之烷基或環烷基。
在一些實施例中，R 4為烷基。
在一些實施例中，HDAC6抑制劑具有以下結構： (Ik-2) 或其鹽， 其中： R b為H、鹵素、烷基、環烷基、-CN、鹵烷基或鹵烷氧基；及 R 4為烷基、烷氧基、鹵烷基或環烷基，其各自視情況經取代。
在一些實施例中，R b為H、鹵素、鹵烷基或鹵烷氧基。在一些實施例中，R b為鹵素、鹵烷基或鹵烷氧基。在一些實施例中，R b為F、Cl、-CH 3、-CH 2CH 3、-CF 3、-CHF 2、-CF 2CH 3、-CN、-OCH 3、-OCH 2CH 3、-OCH(CH 3) 2、-OCF 3、-OCHF 2、-OCH 2CF 2H及環丙基。
在一些實施例中，R 4為視情況經取代之烷基。
在一些實施例中，HDAC6抑制劑為具有下式之化合物： (Iy)， 或其鹽， 其中： X 1為S； R a係選自由H、鹵素及C 1 - 3烷基組成之群； R 1為 或 ； R 2係選自由以下組成之群：烷基、烷氧基及環烷基，其各自視情況經取代； R 3為H或烷基； R 4係選自由烷基、-(SO 2)R 2、-(SO 2)NR 2R 3及-(CO)R 2組成之群；及 R 5為芳基或雜芳基；或R 4及R 5與其所連接之原子一起形成雜環基，其各自視情況經取代。
在式(Iy)之一些實施例中，R a為H。
在式(Iy)之一些實施例中，R 1為 。
在式(Iy)之一些實施例中，R 4為-(SO 2)R 2。
在式(Iy)之一些實施例中，-(SO 2)R 2為-(SO 2)烷基、-(SO 2)伸烷基雜環基、-(SO 2)鹵烷基、-(SO 2)鹵烷氧基或-(SO 2)環烷基。
在式(Iy)之一些實施例中，R 5為雜芳基。
在式(Iy)之一些實施例中，雜芳基為5員至6員雜芳基。
在式(Iy)之一些實施例中，5員至6員雜芳基係選自由以下組成之群： 、 、 及 ，其中R b為鹵素、烷基、烷氧基、環烷基、-CN、鹵烷基或鹵烷氧基；且m為0或1。
在式(Iy)之一些實施例中，R b為鹵素、鹵烷基或鹵烷氧基。在一些實施例中，R b為F、Cl、-CH 3、-CH 2CH 3、-CF 3、-CHF 2、-CF 2CH 3、-CN、-OCH 3、-OCH 2CH 3、-OCH(CH 3) 2、-OCF 3、-OCHF 2、-OCH 2CF 2H及環丙基。
在式(Iy)之一些實施例中，芳基係選自由以下組成之群：苯基、3-氯苯基、3-氯-4-氟苯基、3-三氟甲基苯基、3,4-二氟苯基及2,6-二氟苯基。
在一些實施例中，HDAC6抑制劑具有以下結構： 。
在一些實施例中，HDAC6抑制劑具有以下結構： 。
在一些實施例中，HDAC6抑制劑具有以下結構： 。
在一些實施例中，HDAC6抑制劑具有以下結構： 。
在一些實施例中，HDAC6抑制劑具有以下結構： 。
在一些實施例中，HDAC6抑制劑具有以下結構： 。
在一些實施例中，HDAC6抑制劑具有以下結構： 。
在一些實施例中，HDAC6抑制劑具有以下結構： 。
在一些實施例中，HDAC6抑制劑具有以下結構： 。
在一些實施例中，HDAC6抑制劑具有以下結構： 。
在一些實施例中，氟烷基-㗁二唑衍生物為TYA-018或其類似物。TYA-018之結構為 。
TYA-018之類似物包括(但不限於)表2中所列舉之化合物。 表2. TYA-018類似物之非限制性實例
在一些實施例中，HDAC6抑制劑為選自由以下組成之群的化合物： 5 - 氟菸鹼醯胺衍生物
在一些實施例中，用於本文中所描述之方法中的HDAC6抑制劑為5-氟菸鹼醯胺衍生物。可用作HDAC6抑制劑之說明性5-氟菸鹼醯胺衍生物包括本文中所描述之此等衍生物及以WO2021067859A1公開之國際專利申請公開案第PCT/US2020/054134號中所描述之衍生物，該公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。以WO2021067859A1公開之PCT/US2020/054134亦描述合成此類化合物之方法，該公開案以引用之方式特定併入本文中。
在一些實施例中，HDAC6抑制劑為式(II)化合物： (II)；其中 n為0或1； X為O、NR 4或CR 4R 4'； Y為鍵，CR 2R 3或S(O) 2； R 1係選自由以下組成之群：H、醯胺基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基； R 2及R 3獨立地選自由以下組成之群：H、鹵素、烷基、碳環基、雜環基、芳基、雜芳基、-(CH 2)-碳環基、-(CH 2)-雜環基、-(CH 2)-芳基及-(CH 2)-雜芳基；或 R 1及R 2與其所連接之碳原子一起形成碳環基或雜環基；或 R 2及R 3與其所連接之碳原子一起形成碳環基或雜環基；及 R 4及R 4'各自獨立地選自由以下組成之群：H、烷基、-CO 2-烷基、碳環基、雜環基、芳基、雜芳基、-(CH 2)-碳環基、-(CH 2)-雜環基、-(CH 2)-芳基及-(CH 2)-雜芳基；或 R 4及R 4 '與其所連接之碳原子一起形成碳環基或雜環基； 其中各烷基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代：鹵素、鹵烷基、側氧基、羥基、烷氧基、-OCH 3、-CO 2CH 3、-C(O)NH(OH)、-CH 3、𠰌啉及-C(O)N-環丙基。
在一些實施例中，式(II)化合物係選自由以下組成之群： ； 或其鹽。
在一些實施例中，式(II)化合物係選自由以下組成之群： 、 、 、 及 ；或其鹽。
在一些實施例中，本發明提供一種式(III)化合物或其鹽： (III)； 其中： n為0或1； p為0、1、2、3或4； q各自獨立地為0、1或2； X為O、S(O) 2、NR 12或CHR 12； R 11各自獨立地為H、F、烷基或側氧基；或 兩個相鄰R 11與其所連接之碳原子一起形成芳基、雜芳基或雜環基環；或 兩個不相鄰R 11與其所連接之原子一起形成碳環基或雜環基環； R 12係選自由以下組成之群：烷基、碳環基、雜環基、芳基、雜芳基、-(CH 2)-碳環基、-(CH 2)-雜環基、-(CH 2)-芳基及-(CH 2)-雜芳基；或 R 11及R 12與其所連接之碳及/或氮原子一起形成芳基、雜芳基環或雜環基環；及 其中各烷基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代：鹵素、側氧基、羥基、烷氧基、-OCH 3、-CO 2CH 3及-CH 3。
在一些實施例中，式(III)化合物係選自由以下組成之群： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 及 ；或其鹽。
在一些實施例中，HDAC6抑制劑為具有以下結構中之一者的化合物： 與額外化合物之組合
在一些實施例中，本發明技術之選擇性HDAC6抑制劑可在本文中所描述之方法中與一或多種額外化合物組合使用。如工作實例中所示，選擇性HDAC6抑制劑與額外化合物之組合在本文中所描述之方法中可進一步增加來自細胞培養物(例如，HEK293細胞培養物)之病毒生產的產量。在一些實施例中，額外化合物包含選自由以下組成之群的一或多者：凋亡蛋白酶(例如，凋亡蛋白酶-3及/或凋亡蛋白酶-7)抑制劑、干擾素基因刺激蛋白(STING)抑制劑及泛HDAC抑制劑。在一些實施例中，凋亡蛋白酶抑制劑包含Ac-DEVD-CHO (N-Ac-Asp-Glu-Val-Asp-CHO)。在一些實施例中，STING抑制劑包含SN-011。在一些實施例中，泛HDAC抑制劑包含羅西司他。在一些實施例中，凋亡蛋白酶抑制劑、STING抑制劑及/或泛HDAC抑制劑可以1至20 µM、1至15 µM、1至10 µM或1至5 µM，例如約1.25 µM、約2.5 µM、約3.75 µM或約5 µM之濃度範圍用於細胞培養物中。 轉殖基因
本文中所描述之轉殖基因為非限制性的。任何轉殖基因均可用於根據本文中所描述之方法所生產之病毒載體中。
轉殖基因可為編碼產物或其功能片段之基因或核苷酸序列。產物可為例如多肽或非編碼核苷酸。非編碼核苷酸意謂自轉殖基因或核苷酸序列轉錄之序列不轉譯成多肽。在一些實施例中，由可操作地連接至本文中所描述之強化子之轉殖基因或核苷酸編碼的產物為非編碼聚核苷酸。非編碼聚核苷酸可為RNA，諸如微小RNA (miRNA或mIR)、短髮夾RNA (shRNA)、長非編碼RNA (lnRNA)及/或短干擾RNA (siRNA)。在一些實施例中，轉殖基因編碼由心臟細胞(例如心肌細胞)原生表現之產物。在一些實施例中，轉殖基因編碼在除心臟細胞以外之細胞類型中原生表現的產物。
在一些實施例中，轉殖基因編碼多肽。在一些實施例中，轉殖基因編碼非編碼聚核苷酸，諸如微小RNA (miRNA或mIR)。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼選自以下之產物的序列：鈣黏蛋白(cadherin)、連結蛋白(connexin)、Cx43、生長因子(諸如纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor；FGF)-2及轉型生長因子-β)、細胞介素(諸如介白素(IL)-1β及IL-6家族)、白血病抑制因子、心肌營養素-1、心因性轉錄因子、胰島素樣生長因子、GATA4、MEF2C、TBX5、ESRRG、MESP1、MYOCD、ZFPM2、HAND2、miR-1、miR-133、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、SRF、SMARCD3、Nkx2-5、Akt、PKB、Baf60c、BMP4、miR-208及miR-499。
在一些實施例中，轉殖基因編碼將非功能性心臟蛋白置換或修復成功能性心臟蛋白之基因體編輯核酸內切酶(視情況具有引導RNA、單引導RNA及/或修復模板)。在一些實施例中，轉殖基因編碼心肌鈣蛋白T；心臟肌原纖維蛋白；β-肌凝蛋白重鏈；肌凝蛋白心室必需之輕鏈1；肌凝蛋白心室調節性輕鏈2；心臟a-肌動蛋白；a-肌旋蛋白；心肌鈣蛋白I；心臟肌凝蛋白結合蛋白C；四加半LIM蛋白1 (four-and-a-half LIM protein 1)；肌聯蛋白；5'-AMP活化之蛋白激酶次單元γ-2；3型肌鈣蛋白I、肌凝蛋白輕鏈2、肌動蛋白α心肌1；心臟LIM蛋白；小窩蛋白3 (caveolin 3；CAV3)；半乳糖苷酶α (GLA)；溶酶體相關膜蛋白2 (LAMP2)；粒線體轉移RNA甘胺酸(MTTG)；粒線體轉移RNA異白胺酸(MTTI)；粒線體轉移RNA離胺酸(MTTK)；粒線體轉移RNA麩醯胺酸(MTTQ)；肌凝蛋白輕鏈3 (MYL3)；肌鈣蛋白C (TNNC1)；甲狀腺素運載蛋白(transthyretin；TTR)；肌漿網鈣-ATP酶2a (SERCA2a)；基質衍生因子-1 (SDF-1)；腺苷酸環化酶-6 (AC6)；β-腎上腺素受體激酶C末端(β-adrenergic receptor kinase C terminus；β-ARKct)；纖維母細胞生長因子(FGF)；血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor；PDGF)；血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor；VEGF)；肝細胞生長因子；低氧誘導型生長因子；胸腺素β4 (TMSB4X)；氧化氮合酶-3 (NOS3)；優諾卡汀(unocartin 3；UCN3)；整聯蛋白(melusin)；脂蛋白元-E (ApoE)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase；SOD)；及S100A1 (小鈣結合蛋白；參見例如Ritterhoff及Most (2012) Gene Ther. 19:613；Kraus等人(2009) Mol. Cell. Cardiol. 47:445)。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼選自以下之產物的序列：血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF同功型、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-D dNdC、VEGF-A 116A、VEGF-A 165、VEGF-A 121、VEGF-2、胎盤生長因子(placenta growth factor；PIGF)、纖維母細胞生長因子4 (FGF-4)、人類生長因子(HGF)、人類顆粒球群落刺激因子(human granulocyte colony-stimulating factor；hGCSF)及低氧誘導型因子1α (HIF-1α)。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼選自以下之產物的序列：SERCA2a、基質細胞衍生因子-1 (SDF-1)、6型腺苷酸環化酶、S100A1、miRNA-17-92、miR-302-367、抗miR-29a、抗miR-30a、抗miR-141、週期素A2、週期素依賴性激酶2、Tbx20、miRNA-590、miRNA-199、針對Lp(a)之反義寡核苷酸、針對PCSK9之干擾RNA、針對脂蛋白元C-III之反義寡核苷酸、脂蛋白脂酶 S447X、針對脂蛋白元B之反義寡核苷酸、針對c-myc之反義寡核苷酸及E2F寡核苷酸誘餌。
在一些實施例中，轉殖基因編碼表現會彌補引起遺傳病症之基因缺陷的基因產物。本發明提供編碼以下中之一或多者的聚核苷酸：例如用於(不限於)圓括號中所指示之病症，或用於由以下各者引起之其他病症：TAZ (巴氏症候群(Barth syndrome))；FXN (弗里德賴希氏運動失調(Freidrich's Ataxia))；CASQ2 (CPVT)；FBN1 (Marfan)；RAF1及SOS1 (Noonan)；SCN5A (Brugada)；KCNQ1及KCNH2 (長QT症候群)；DMPK (肌強直性營養不良1)；LMNA (肢帶型營養不良1B型)；JUP (Naxos)；TGFBR2 (Loeys-Dietz)；EMD (X性聯EDMD)；及ELN (SV主動脈狹窄)。在一些實施例中，聚核苷酸編碼以下中之一或多者：心肌鈣蛋白T (TNNT2)；BAG家族分子伴護蛋白調節因子3 (BAG3)；肌凝蛋白重鏈(MYH7)；肌旋蛋白1 (TPM1)；肌凝蛋白結合蛋白C (MYBPC3)；5'-AMP活化之蛋白激酶次單元γ-2 (PRKAG2)；3型肌鈣蛋白I (TNNI3)；肌聯蛋白(titin；TTN)；肌凝蛋白輕鏈2 (MYL2)；肌動蛋白，α心肌1 (ACTC1)；電位閘控型鉀離子通道(potassium voltage-gated channel)，KQT樣亞家族成員1 (KCNQ1)；肌細胞強化因子2c (MEF2C)；及心臟LIM蛋白(CSRP3)。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼選自以下之蛋白質的核苷酸序列：DWORF、連接蛋白(例如JPH2)、BAG家族分子伴護蛋白調節因子3 (BAG3)、受磷蛋白( phospholamban；PLN)、α-晶狀體球蛋白B鏈(CRYAB)、LMNA (諸如核片層蛋白A (Lamin A)及核片層蛋白C (Lamin C)同功型)、3型肌鈣蛋白I (TNNI3)、溶酶體相關膜蛋白2 (LAMP2，諸如LAMP2a、LAMP2b及LAMP2c同功型)、橋粒斑蛋白(desmoplakin；DSP，諸如DPI及DPII同功型)、橋粒醣蛋白2 (desmoglein 2；DSG2)、連接斑珠蛋白(junction plakoglobin；JUP)及斑菲素蛋白-2 (plakophilin-2；PKP2)。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼人類蛋白質之核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含人類核苷酸序列(人類DNA序列)。在一些實施例中，轉殖基因包含已經密碼子最佳化之DNA序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼野生型蛋白質或其功能活性片段之核苷酸序列。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼DWORF多肽之聚核苷酸序列。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼連接蛋白2 (JPH2)多肽之聚核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼全長JPH2多肽之聚核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼JPH2多肽之N端片段的聚核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼JPH2多肽之N端片段的聚核苷酸序列，其保留JPH2活性。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼BAG3多肽之聚核苷酸序列。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼CRYAB多肽之聚核苷酸序列。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼LMNA多肽之聚核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼LMNA之核片層蛋白A同功型的聚核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼LMNA之核片層蛋白C同功型的聚核苷酸序列。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼TNNI3多肽之聚核苷酸序列。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼PLN多肽之聚核苷酸序列。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼LAMP2多肽之聚核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼LAMP2a同功型之聚核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼LAMP2b同功型之聚核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼LAMP2c同功型之聚核苷酸序列。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼DSP多肽之聚核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼DSP之DPI同功型的聚核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼DSP之DPII同功型的聚核苷酸序列。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼DSG2多肽之聚核苷酸序列。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼JUP多肽之聚核苷酸序列。 實例
藉由以下實例進一步說明本發明。以下實例為非限制性的，僅代表本發明之各種態樣。 實例 1 . 式 ( I ) 之所揭示之 HDAC6 抑制劑的合成、生物化學活性及效能
根據以WO2021127643A1公開之PCT/US2020/066439中所揭示之方法來合成本文中所揭示之化合物，尤其係式(I)化合物，該案以全文引用之方式併入本文中。在生物化學分析中測試此等化合物對HDAC6之效能及對HDAC1之選擇性。採用發光HDAC-Glo I/II分析法(Promega)進行生物化學分析，且量測HDAC6及HDAC1重組蛋白之相對活性。首先分別在存在HDAC6或HDAC1之情況下培育化合物，隨後添加發光受質。使用盤讀取器獲取資料且相應地根據資料計算生物化學IC 50。資料列於表3中。根據此等研究，確定本發明之化合物相對於HDAC1為HDAC6之選擇性抑制劑，提供約5至約30,0000之選擇性比率。 表 3 . 式 ( I ) 化合物之表徵資料及 HDAC6 活性。
化合物 結構 / 名稱 1 H NMR MS (m/z) (RT) HDAC6 IC 50(µM)
I-1 4-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-2,2-二甲基-2H-吡啶并[3,2-b][1,4]㗁𠯤-3(4H)-酮 1H NMR (400MHz, CDCl 3) δ 8.39 (s, 1 H), 8.01 - 8.05 (m, 1 H), 7.29 (dd, J = 8.1, 1.5 Hz, 1 H), 7.01 (dd, J = 8.1, 1.5 Hz, 1H), 6.89 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.70 (s, 2 H) LCMS: RT= 5.00 min, m/z= 394.0 0.107
I-2 N-(3-氯苯基)- N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400MHz, CDCl 3) δ 8.39 (s, 1 H), 7.48 (s, 1 H), 7.32 - 7.40 (m, 3 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.25 (s, 2 H), 3.07 (s, 3 H) LCMS: RT= 4.83 min, m/z= 421.0 0.021
I-3 N-(3-氯苯基)- N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400MHz, CDCl 3) δ 8.37 (s, 1 H), 7.48 (s, 1 H), 7.25 -  7.40 (m, 3 H), 6.19 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.28 (s, 2 H), 3.18 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.44 (t, J = 7.2 Hz, 3 H) LCMS: RT= 4.90 min, m/z= 435.0 0.0044
I-4 N-(3-氯苯基)-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)環丙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.53 (s, 1 H), 7.40 - 7.70 (m, 5 H), 5.43 (s, 2 H), 2.95 - 3.00 (m, 1 H), 1.00 - 1.05 (m, 2 H), 0.90 - 0.95 (m, 2 H) LCMS: RT= 5.10 min, m/z= 447.0 0.0042
I-5 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(3,4-二氟苯基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.38 (s, 1 H), 7.30 - 7.40 (m, 1 H), 7.15 - 7.25 (m, 2 H), 6.91 (t, J = 51.2 Hz, 1 H), 5.24 (s, 2 H), 3.17 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.44 (t, J = 5.7 Hz, 3 H) LCMS: RT= 4.92 min, m/z= 437.0 0.016
I-6 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(吡啶-3-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.71 (br s, 1 H), 8.58 (br s, 1 H), 8.38 (s, 1 H), 7.80 - 7.85 (m, 1 H), 7.31 - 7.35 (m 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.30 (s, 2 H), 3.21 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.46 (t, J = 7.6 Hz, 1 H) LCMS: RT= 3.39 min, m/z= 402.0 0.029
I-7 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.58 (s, 1 H) 7.52 (t, J = 51.2 Hz, 1 H) 7.22 - 7.35 (m, 2 H) 6.89 - 6.87 (m, 3 H) 4.80 (d, J = 6.1 Hz, 2 H) LCMS: RT 5.20 min, m/z= 377.0 0.222
I-8 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(3-(三氟甲基)苯基)菸鹼醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.50 - 8.60 (m, 1 H) 8.41 (s, 1 H) 7.71 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 7.50 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 7.35 - 7.45 (m, 2 H), 7.25 - 7.30 (m, 1 H) 7.20 - 7.25 (m, 1 H) 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H) 5.46 (s, 2 H) LCMS: RT= 4.22 min, m/z= 482.0 0.088
I-9 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-苯基甲烷磺醯胺 1H NMR (400MHz, CDCl 3) δ=  8.37 (s, 1 H), 7.33 - 7.49 (m, 5 H), 6.90  (t, 1 H, J= 51.6 Hz) 5.27 (s, 2 H), 3.05 (s, 3 H) ppm LCMS: RT= 4.42 min, m/z = 387.0 0.051
I-10 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-苯基乙烷磺醯胺 1H NMR (400MHz, CDCl 3) δ  8.35 (s, 1 H), 7.29 - 7.53 (m, 5 H), 6.90 (t, 1 H, J= 51.5 Hz), 5.30 (s, 2 H), 3.17 (q, J=7.34 Hz, 2 H), 1.45 (t, J=7.46 Hz, 4 H) ppm LCMS: RT= 4.65 min, m/z= 401.0 0.026
I-12 N-(3-氯苯基)-N-((5-(5-(三氟甲基)-1,2,4-㗁二唑-3-基)噻唑-2-基)甲基)環丙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz,氯仿- d) δ ppm 8.39 (s, 1 H) 7.51 (s, 1 H) 7.41 (br s, 1 H) 7.32 (br d, J=3.91 Hz, 2 H) 5.27 (s, 2 H) 2.48 - 2.59 (m, 1H) 1.10 - 1.17 (m, 2 H) 0.99 - 1.09 (m, 2 H) LCMS: RT= 5.84 min, m/z= 465 0.869
I-13 N-(3-氯-4-氟苯基)-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400MHz, CDCl 3) δ 8.40 (s, 1 H) 7.56 (dd, J=6.36, 2.69 Hz, 1 H) 7.32 - 7.41 (m, 1 H) 7.18 (t, J=8.56 Hz, 1 H) 6.76 -7.08 (m, 1 H) 5.22 (s, 2 H) 3.07 (s, 3 H) LCMS: RT= 4.93 min, m/z= 438.9 0.021
I-14 N-(3-氯-4-氟苯基)-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400MHz, CDCl 3) δ 8.38 (s, 1 H) 7.54 (dd, J=6.24, 2.32 Hz, 1 H) 7.33 - 7.40 (m, 1 H) 7.16 (t, J=8.68 Hz, 1 H) 6.76 -7.06 (m, 1 H) 5.23 (s, 2 H) 3.18 (q, J=7.34 Hz, 2 H) 1.45 (t, J=7.34 Hz, 3 H) LCMS: RT=  5.11 min, m/z = 453 0.014
I-15 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(1-甲基-1H-吲唑-6-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400MHz, CDCl 3) δ 8.36 (s, 1 H) 7.98 (d, J=0.98 Hz, 1 H) 7.75 (d, J=8.56 Hz, 1 H) 7.60 (s, 1 H) 7.18 (d, J=8.31 Hz, 1H) 6.75 - 7.05 (m, 1 H) 5.39 (s, 2 H) 4.09 (s, 3 H) 3.19 (q, J=7.17 Hz, 2 H) 1.46 (t, J=7.46 Hz, 3 H) LCMS: RT= 4.43 min, m/z = 455.0。 0.014
I-16 [(3-氯苯基)({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)胺磺醯基]二甲基胺 1H NMR (400MHz, CDCl 3) δ 8.36 (s, 1 H) 7.49 (s, 1 H) 7.28-7.42 (m, 3 H) 6.76-6.06 (m, 1 H) 5.17 (s, 2 H) 2.82 (s, 6 H) LCMS: RT= 5.18 min, m/z= 450.0 0.012
I-17 N-環丙基-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz,氯仿- d) δ ppm 8.42 (s, 1 H) 6.74 - 7.07 (m, 1 H) 4.83 (s, 2 H) 3.21 (q, J=7.50 Hz, 2 H) 2.70 (br s, 1 H) 1.41 (t, J=7.46 Hz, 3 H) 0.83 - 0.95 (m, 4 H) LCMS: RT= 4.34 min, m/z= 365.0 1.23
I-18 5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)-N-(1-(2,6-二氟苯基)環丙基)噻唑-2-胺 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ ppm 9.62 (br s, 1 H) 7.95 (br s, 1 H) 7.29 - 7.67 (重疊m, 2 H) 7.02 - 7.18 (m, 2 H) 1.35 (d, J=26.80 Hz, 4 H) LCMS: RT= 4.87 min, m/z= 371.1 1.95
I-19 5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)-N-苯乙基噻唑-2-胺 1H NMR (400 MHz,氯仿- d) δ ppm 7.86 (s, 1 H) 7.16 - 7.46 (m, 5 H) 6.68 - 7.03 (m, 1 H) 5.75 (br s, 1 H) 3.64 (br d, J=6.11 Hz, 2 H) 3.02 (br t, J=6.85 Hz, 2 H) LCMS: RT= 4.73 min, m/z= 323.0。 13.6
I-20 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(1-苯基環丙基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400MHz, CDCl 3-d 3) δ 8.78 (s, 1 H), 8.40 (s, 1 H), 7.50 (d, J=7.34 Hz, 2 H), 7.26-7.38 (m, 4 H), 7.04 (s, 0.25 H), 6.91 (s, 0.5 H), 6.78 (s, 0.25 H), 4.94 (s, 2 H), 2.81 (q, J=7.58 Hz, 2 H), 1.47 (m, 2 H), 1.31-1.22 (m, 5 H)。 LCMS: RT= 6.12, m/z = 441.1 4.14
I-21 1-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-3,3-二甲基-1-(吡啶-3-基)脲 1H NMR (400 MHz,甲醇- d4) δ ppm 9.55 (s, 1 H) 8.78 (br d, J=5.62 Hz, 1 H) 8.52 - 8.59 (m, 2 H) 8.06 (br d, J=7.83 Hz, 1 H) 7.26 (t, J=51.2 Hz, 1 H) 6.33 (s, 2 H) 3.09 (s, 6 H)。    LCMS RT= 2.85 min, m/z = 381.1 1.2
I-22 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(6-(4-甲基哌𠯤-1-基)吡啶-3-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.40 (s, 1 H), 8.15 (s, 1 H), 7.63 (m, 1 H), 7.21 (t, J = 51.2 Hz, 1H), 6.79 (m, 1 H), 5.24 (s, 2 H), 3.56 (m, 4 H), 3.25 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 2.51 (m, 4 H), 2.32 (s, 3 H), 1.40 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。    m/z = 500.1 0.143
I-23 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(6-N-𠰌啉基吡啶-3-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 8.51 (s, 1 H), 8.18 (s, 1 H), 7.69 (m, 1 H), 7.54 (t, J = 51.2 Hz, 1 H), 6.83 (m, 1 H), 5.28 (s, 1 H), 3.66 (m, 4 H), 3.44 (m, 4 H), 3.30 (q, J = 6.8 Hz, 2 H), 1.29 (t, J = 6.8 Hz, 3 H)。 m/z = 487.1 0.417
I-24 3-(N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)乙基磺醯胺基)苯甲酸甲酯 1H NMR (400MHz, DMSO-d 6) δ 8.50 (s, 1 H), 8.08 (s, 1 H), 7.95-7.83 (m, 2 H), 7.67-7.39 (m, 2 H), 5.43 (s, 2 H), 3.86 (s, 3 H), 3.45-3.33 (m, 2 ), 1.28 (t, J=7.21 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 4.73 min, m/z = 459.1 0.031
I-25 4-(N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基) 甲基)乙基磺醯胺基)苯甲酸三級丁酯 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ  8.36 (s, 1 H), 8.01 (m, 2 H), 7.53 (m, 2 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.34 (s, 2 H), 3.21 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1,57 (s, 9 H), 1.43 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。    m/z = 501.1 0.101
I-26 ((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)(吡啶-3-基)胺基甲酸甲酯 1H NMR (400 MHz,甲醇- d4) δ ppm 9.55 (s, 1 H) 8.85 (br d, J=5.87 Hz, 1 H) 8.57 (s, 1 H) 8.45 (br d, J=8.80 Hz, 1 H) 8.06 - 8.13 (m, 1 H) 7.26 (t, J=51.2 Hz, 1 H) 3.86 (s, 3 H)。    LCMS RT = 2.97 min, m/z = 368.0 2.5
I-27 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(嘧啶-5-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400MHz, DMSO-d 6) δ 9.12 (s, 1 H), 9.00 (s, 2 H), 8.53 (s, 1 H), 7.70-7.30 (m, 1 H), 5.50 (s, 2 H), 3.55-3.40 (m, 2 H), 1.31 (t, -7.34 Hz, 3 H )。    LCMS RT = 3.84 min, m/z = 403.0 0.050
I-28 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)吡啶-3-胺 1H NMR (400 MHz,甲醇- d4) δ ppm 8.58 (s, 1 H) 8.22 - 8.32 (m, 2 H) 7.69 - 7.78 (m, 2 H) 7.26 (t, J=51.2 Hz, 1 H) 6.17 (s, 2 H)。 LCMS RT = 1.24 min, m/z = 310.1 1.5
I-29 1H NMR (400MHz, CDCl 3-d 3) δ 8.55 (s, 1 H), 8.47 (s, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 7.67 (d, J=9.05 Hz, 1 H), 7.36-7.28 (m, 2 H), 7.19 (d, J=6.60 Hz, 2 H), 7.04-6.77 (m, 1 H), 5.22 (s, 2 H), 4.25 (s, 2 H), 2.74 (s, 3 H)。 LCMS RT = 5.23 min, m/z = 511.1 0.041
I-30 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(6-氟吡啶-3-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ  8.39 (s, 1 H), 8.31 (s, 1 H), 7.94 (m, 1 H), 7.02 (m, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.25 (s, 2 H), 3.21 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.21 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。    m/z = 420.0 0.011
I-31 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(吡啶-3-基)丙烷-2-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 8.72 (s, 1 H), 8.50 (m, 2 H), 8.02 (m, 1 H), 7.40-7.66 (m, 2 H), 5.46 (s, 2 H), 3.60 (m, 1 H), 1.34 (d, J = 6.8 Hz, 6 H)。 m/z = 416.1 0.042
I-32 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(1-甲基-6-側氧基-1,6-二氫吡啶-3-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400MHz,甲醇-d 4) δ 8.47 (s, 1 H), 7.96 (s, 1 H), 7.66 (d, J=9.54, 1 H), 7.35 (s, 0.25 H), 7.22 (s, 0.5 H), 7.09 (s, 0.25 H), 6.53 (d, J=9.54 Hz, 1 H), 5.22 (s, 2 H), 3.56 (s, 3 H), 3.35-3.30 (m, 2 H), 1.43 (t, J=7.34 Hz, 3 H)。    LCMS RT = 3.53 min, m/z = 432.1 0.411
I-33 N-(3-氯-4-氟苯基)-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)𠰌啉-4-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 8.52 (s, 1 H), 7.86-7.95 (m, 1 H), 7.35-7.69 (m, 3 H), 5.36 (s, 2 H), 3.58 (m, 4 H), 3.20 (m, 4 H)。    m/z = 510.0 0.047
I-34 N-(3-氯苯基)-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)硫代𠰌啉-4-磺醯胺1,1-二氧化物 1H NMR (400 MHz,氯仿- d) δ ppm 8.41 (s, 1 H) 7.48 (s, 1 H) 7.30 - 7.40 (m, 3 H) 6.91 (t, J=52.4 Hz, 1 H) 5.15 (s, 2 H) 3.73 - 3.82 (m, 4H) 3.05 - 3.13 (m, 4 H)。    LCMS RT = 4.83 min, m/z = 540.0 0.022
I-35 N-(4-(1H-咪唑-1-基)苯基)-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 8.51 (s, 1 H), 8.27 (s, 1 H), 7.69-7.76 (m, 5 H), 7.3 (t, J = 51.2 Hz, 1 H), 7.10 (s, 1 H), 5.41 (s, 2 H), 3.37 (q, J = 6.8 Hz, 2 H), 1.30 (t, J = 6.8 Hz, 3 H)。    m/z = 467.0 0.008
I-36 N-(3-氯苯基)-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)𠰌啉-4-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 8.52 (s, 1 H), 7.73 (m, 1 H), 7.54-7.58 (m, 2 H), 7.36-7.44 (m, 2 H), 5.38 (s, 2 H), 3.59 (m, 4 H), 3.18 (m, 4 H)。    m/z = 492.1 0.005
I-37 1H NMR (400MHz, DMSO-d 6) δ 8.63 (s, 1 H), 8.54 (d, J=9. Hz, 2 H), 8.10 (d, J=10.0 Hz, 1 H), 7.65-7.39 (m, 1 H), 5.41 (s, 2 H), 2.83 (s, 6 H)。 LCMS RT = 4.39 min, m/z = 435.1 0.013
I-38 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(5-氟吡啶-3-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400MHz, DMSO-d 6) δ 8.62-8.52 (m,  H), 8.13-8.09 (m, 1 H), 7.65-7.39 (m, 1 H), 5.46 (s, 2 H), 3.55 -3.45 (m, 2 H), 1.30 (t, J=7.34 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 4.32 min, m/z = 420.0 0.019
I-39 N-(4-(1H-吡唑-1-基)苯基)-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz,氯仿- d) δ ppm 8.36 (s, 1 H) 7.90 (s, 1 H) 7.69 - 7.77 (m, 3 H) 7.55 (d, J=8.31 Hz, 2 H) 6.90 (t, J=52.0 Hz, 1 H) 6.48 (s, 1 H) 5.31 (s, 2 H) 3.19 (d, J=7.34 Hz, 2 H) 1.46 (t, J=7.46 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 4.67 min, m/z = 467.0 0.010
I-40 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(吡啶-3-基)𠰌啉-4-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.57 (s, 1 H), 8.45 (s, 1 H), 8.27 (m, 1 H), 7.97 (m, 1 H), 7.73 (m, 1 H), 7.22 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 4.88 (s, 2 H), 3.36 (m, 4 H), 3.10 (m, 4 H)。 m/z = 459.1 4.22
I-43 (R)-3-(5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)-4-苯基㗁唑啶-2-酮 1H NMR (400 MHz,甲醇-d4 ) δ = 8.07 (s, 1 H) 7.40 (s, 5 H) 7.19 (t, 1 H, J= 51.6 Hz) 5.84 (dd, J=8.80, 3.67 Hz, 1 H) 5.03 (t, J=8.80 Hz, 1 H) 4.48 (dd, J=8.93, 4.03 Hz, 1 H) ppm LCMS: RT= 4.67 min, m/z = 365.1 0.085
I-44 (S)-3-(5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)-4-苯基㗁唑啶-2-酮 1H NMR (400 MHz,甲醇-d4 ) δ= 8.07 (s, 1 H), 7.40 (s, 4 H), 7.33 - 7.38 (m, 1 H), 7.19 (t, 1 H, J= 5.6 Hz), 5.84 (dd, J=8.56, 3.91 Hz, 1 H), 5.03 (t, J=8.93 Hz, 1 H), 4.43 - 4.51 (m, 1 H) ppm LCMS: RT = 4.95 min, m/z = 365.1 8.97
I-45 N-(1-(環丙基甲基)-1H-吡唑-4-基)-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 8.55 (s, 1 H), 8.27 - 8.24 (m, 2 H), 7.78 - 7.67 (m, 2 H), 7.23 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 6.15 (s, 2 H), 2.90 (s, 3 H)。 LCMS RT = 2.431 min, m/z = 324.0 1.3
I-46 N-(1-(環丙基甲基)-1H-吡唑-4-基)-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.40 (s, 1 H), 7.69 (s, 1 H), 7.49 (s, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.17 (s, 2 H), 3.93 (d, J = 7.2 Hz, 2 H), 3.18 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.42 (t, J = 7.6 Hz, 3 H), 1.31 - 1.22 (m, 1 H), 0.70 - 0.62 (m, 2 H), 0.38 - 0.32 (m, 2 H)。 LCMS RT = 2.417 min, m/z = 444.9 0.077
I-47 N-(1-環丙基-1H-吡唑-4-基)-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.40 (s,  1 H), 7.65 (s, 1 H), 7.46 (s, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.14 (s, 2 H), 3.58 - 3.52 (m, 1 H), 3.16 (q, J = 8.0 Hz , 2 H), 1.42 (t, J = 8.0 Hz, 3 H), 1.13 - 1.00 (m, 4 H)。 LCMS RT = 1.223 min, m/z = 430.9 0.070
I-48 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(1-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.35 (s, 1 H), 7.92 (s, 1 H), 7.66 (s, 1 H), 6.96 (t, J = 60.4 Hz, 1 H), 6.84 (t, J = 45.2 Hz, 1 H), 5.11 (s, 2 H), 3.10 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.33 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 3.543 min, m/z = 441.1 0.262
I-49 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.40 (s, 1 H), 7.65 (s, 1 H), 7.51 (s, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.15 (s, 2 H), 4.22 (t, J = 4.8 Hz, 2 H), 3.70 (t, J = 5.2 Hz, 2 H), 3.30 (s, 3 H), 3.17 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.41 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 3.093 min, m/z = 448.9 0.134
I-50 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(吡啶-3-基)環丙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.69 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.53 - 8.50 (m, 1 H), 8.30 (s, 1 H), 7.79 - 7.76 (m, 1 H), 7.30 - 7.26 (m, 1 H), 6.83 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.23 (s, 2 H), 2.53 - 2.46 (m, 1 H), 1.06 - 0.95 (m, 4 H)。 LCMS RT = 2.897 min, m/z = 414.1 0.036
I-51 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(吡啶-3-基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.54 (s, 1 H), 8.50 (s, 1 H), 7.93 - 7.90 (m, 1 H), 7.68 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.49 - 7.44 (m, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.84 (s, 2 H), 3.00 (s, 3 H)。 LCMS RT = 1.096 min, m/z = 387.9 0.676
I-52 N-(5-氰基吡啶-3-基)-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.96 (d, J = 2.8 Hz, 1 H), 8.82 (s, 1 H), 8.42 (s, 1 H), 8.18 - 8.17 (m, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.30 (s, 2 H), 3.21 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.44 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 0.752 min, m/z = 427.1 0.022
I-53 N-(6-(2-氰基丙-2-基)吡啶-3-基)-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.70 (d,  J = 2.8 Hz, 1 H), 8.40 (s, 1 H), 7.86 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.63 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.29 (s, 2 H), 3.22 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.75 (s, 6 H), 1.47 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 0.828 min, m/z = 469.2 0.317
I-54 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(5-氟苯并[d]㗁唑-2-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.45 (s, 1 H), 7.40 - 7.38 (m, 1 H), 7.10 - 6.91 (m, 3 H), 5.40 (s, 2 H), 3.29 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.52 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 3.800 min, m/z = 460.0 0.104
I-55 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(6-氟苯并[d]㗁唑-2-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.44 (s, 1 H), 7.29 - 7.21 (m, 2 H), 7.10 - 7.04 (m, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.42 (s, 2 H), 3.29 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.52 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 0.863 min, m/z = 459.7 0.124
I-56 N-(6-(二氟甲氧基)吡啶-3-基)-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.39 (s, 1 H), 8.28 (d, J = 2.8 Hz, 1 H), 7.85 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 7.41 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 7.06 - 6.76 (m, 2 H), 5.24 (s, 2 H), 3.20 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.47 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 0.886 min, m/z = 468.1 0.050
I-57 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.40 (s, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 6.13 (s, 1 H), 5.37 (s, 2 H), 3.70 (s, 3 H), 3.27 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 2.24 (s, 3 H), 1.42 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 3.486 min, m/z = 418.9 0.117
I-58 N-(5-環丙基吡啶-3-基)-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.45 (s, 1 H), 8.41 (s, 1 H), 8.35 (s, 1 H), 7.46 (s, 1 H),  6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.27 (s, 2 H), 3.19 (q, J = 8.0 Hz, 2 H), 1.92 - 1.89 (m, 1 H), 1.45 (t, J = 7.2 Hz, 3 H), 1.11 - 1.05 (m, 2 H), 0.76 - 0.74 (m, 2 H)。 LCMS RT = 0.992 min, m/z = 442.3 0.025
I-59 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(5-(三氟甲基)吡啶-3-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.93 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.83 (s, 1 H), 8.41 (s, 1 H), 8.10 (s, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.31 (s, 2 H), 3.22 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.45 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.190 min, m/z = 469.8 0.030
I-60 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(5-(二氟甲基)吡啶-3-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.85 (s, 1 H), 8.73 (s, 1 H), 8.40 (s, 1 H), 7.99 (s, 1 H), 6.91 (t, J = 52.0 Hz, 1 H), 6.74 (t, J = 56.0 Hz, 1 H), 5.31 (s, 2 H), 3.22 (q, J = 4.0 Hz, 2 H), 1.46 (t, J = 8.0 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 2.508 min, m/z = 452.1 0.070
I-61 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(6-異丙基吡啶-3-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.59 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.38 (s, 1 H), 7.75 - 7.71 (m, 1 H), 7.22 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.27 (s, 2 H), 3.20 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 3.11 - 3.03 (m, 1 H), 1.47 (t, J = 7.2 Hz, 3 H), 1.29 (d, J = 7.2 Hz, 6 H)。 LCMS RT = 0.757 min, m/z = 444.2 0.073
I-62 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(6-(二氟甲基)吡啶-2-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.30 (s, 1 H), 7.85 - 7.69 (m, 2 H), 7.39 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 6.81 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 6.47 (t, J = 79.2 Hz, 1 H), 5.54 (s, 2 H), 3.29 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.33 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 2.238 min, m/z = 452.1 0.0206
I-63 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(4,6-二甲基嘧啶-2-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.40 (s, 1 H), 6.89 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 6.77 (s, 1 H), 5.65 (s, 2 H), 3.95 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 2.44 (s, 6 H), 1.39 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 3.758 min, m/z = 431.2 0.018
I-64 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.40 (s, 1 H), 7.60 (s, 1 H), 7.49 (s, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.16 (s, 2 H), 4.12 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 3.17 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.50 - 1.40 (m, 6 H)。 LCMS RT = 1.418 min, m/z = 418.9 0.065
I-65 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 8.33 (s, 1 H), 7.71 (s, 1 H), 7.48 (s, 1 H), 7.11 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.10 (s, 2 H), 3.74 (s, 3 H), 3.14 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 2.950 min, m/z = 404.9 0.022
I-66 N-(6-氰基吡啶-3-基)-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.87 (s, 1 H), 8.40 (s, 1 H), 8.04 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.74 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.35 (s, 2 H), 3.23 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.43 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.030 min, m/z = 426.8 0.029
I-67 N-(5-氰基吡啶-2-基)-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.66 (s, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 7.96 - 7.78 (m, 2 H), 6.90 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.63 (s, 2 H), 3.48 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.43 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 2.180 min, m/z = 427.1 0.037
I-68 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(6-甲基吡𠯤-2-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.80 (s, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 8.29 (s, 1 H), 6.90 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.58 (s, 2 H), 3.38 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 2.55 (s, 3 H), 1.42 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.657 min, m/z = 417.1 0.100
I-69 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(4,6-二甲基吡啶-2-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.38 (s, 1 H), 7.27 (s, 1 H), 7.02 - 6.72 (m, 2 H), 5.58 (s, 2 H), 3.24 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 2.47 (s, 3 H), 2.33 (s, 3 H), 1.36 (t, J = 7.4 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 3.082 min, m/z = 429.9 0.071
I-70 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 8.42 (s, 1 H), 8.07 - 8.02 (m, 1 H), 7.92 - 7.89 (m, 1 H), 7.61 - 7.58 (m, 1 H), 7.19 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.62 (s, 2 H), 3.57 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.38 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 2.965 min, m/z = 470.1 0.0281
I-71 2-(2-((3-氯苯氧基)甲基)噻唑-5-基)-5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.49 (s, 1 H), 7.29 - 7.24 (m, 1 H), 7.06 - 7.04 (m, 2 H), 6.94 - 6.78 (m, 2 H), 5.43 (s, 2 H)。 LCMS RT = 1.840 min, m/z = 344.1 0.251
I-72 3-氯-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-甲基苯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.55 (s, 1 H), 7.43 - 6.70 (m, 5 H), 4.93 (s, 2 H), 3.26 (s, 3 H)。 LCMS RT = 3.547 min, m/z = 356.8 0.034
I-73 3-氯-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)苯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.37 (s, 1 H), 7.06 - 6.44 (m, 5 H), 4.66 (s, 3 H)。 LCMS RT = 2.368 min, m/z = 343.1 0.046
I-74 N-(6-環丙基吡啶-3-基)-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 8.46 (d, J = 2.4 Hz, 1 H),  8.41 (s, 1 H), 7.80 (dd, J = 8.4, 2.8 Hz, 1 H), 7.33 - 7.07 (m, 2 H), 5.33 (s, 2 H), 3.31 - 3.27 (m, 2 H), 2.11 - 2.08 (m, 1 H), 1.40 (t, J = 7.2 Hz, 3 H), 1.04 - 0.94 (m, 4 H)。 LCMS RT = 5.273 min, m/z = 441.9 0.016
I-75 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(吡𠯤-2-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 9.00 (s, 1 H), 8.43 (d, J = 2.8 Hz, 1 H), 8.39 - 8.35 (m, 2 H), 6.89 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.58 (s, 2 H), 3.41 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.43 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 2.823 min, m/z = 403.1 0.023
I-76 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(嗒𠯤-4-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 8.57 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 8.53 (s, 1 H), 8.23 (s, 1 H), 7.42 - 7.40 (m, 1 H), 7.22 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.85 (s, 2 H), 3.10 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.36 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 3.671 min, m/z = 402.9 0.097
I-77 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(2-(三氟甲基)嘧啶-5-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 9.10 (s, 2 H), 8.43 (s, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.32 (d, J = 12 Hz, 2 H), 3.25 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.44 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 2.594 min, m/z = 471.1 0.155
I-78 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(6-(三氟甲基)吡啶-3-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.86 (s, 1 H), 8.40 (s, 1 H), 8.10 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.74 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.34 (s, 2 H), 3.23 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.45 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 0.882 min, m/z = 470.1 0.059
I-79 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(6-甲基吡啶-3-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.55 (s, 1 H), 8.37 (s, 1 H), 7.73 -7.68 (m, 1 H), 7.20 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.27 (s, 2 H), 3.20 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 2.56 (s, 3 H), 1.46 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 0.616 min, m/z = 416.2 0.073
I-80 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(5-氟吡啶-2-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.37 (s, 1 H), 8.28 (s, 1 H), 7.70 - 7.60 (m, 1 H), 7.50 - 7.40 (m, 1 H), 6.89 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.54 (s, 2 H), 3.25 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.40 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 2.661 min, m/z = 419.9 0.0265
I-81 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(5-氟嘧啶-2-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.49 (s, 2 H), 8.40 (s, 1 H), 6.90 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.65 (s, 2 H), 3.91 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.45 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.977 min, m/z = 421.1 0.116
I-82 N-(3-氯苯基)-N-((4-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)丙醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.28 (s, 1 H), 7.37 - 7.32 (m, 2 H), 7.25 - 7.23 (m, 1 H), 7.10 - 7.07 (m, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.22 (s, 2 H), 2.19 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.21 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 0.931 min, m/z = 399.1 4.1
I-83 N-(3-氯苯基)-N-((4-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)環丙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.26 (s, 1 H), 7.51 (s, 1 H), 7.41 - 7.30 (m, 3 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.32 (s, 2 H), 2.59 - 2.52 (m, 1 H), 1.18 - 1.13 (m, 2 H), 1.08 - 1.04 (m, 2 H)。 LCMS RT = 0.944 min, m/z = 447.1 0.759
I-84 N-(3-氯苯基)-N-((4-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)環丙烷甲醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.27 (s, 1 H), 7.40 - 7.20 (m, 4 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.25 (s, 2 H), 1.50 - 1.40 (m, 1 H), 1.18 - 1.09 (m, 2 H), 0.83 - 0.74 (m, 2 H)。 LCMS RT = 1.163 min, m/z = 410.8 7.5
I-85 N-(3-氯苯基)-N-((4-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.26 (s, 1 H), 7.48 (s, 1 H), 7.37 - 7.31 (m, 3 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.32 (s, 2 H), 3.19 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.46 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 0.922 min, m/z = 435.0 0.584
I-86 N-(3-氯苯基)-N-((4-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)㗁唑-2-基)甲基)環丙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.36 (s, 1 H), 7.50 (s, 1 H), 7.39 - 7.37 (m, 1 H), 7.33 - 7.30 (m, 2 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.03 (s, 2 H), 2.69 - 2.65 (m, 1 H), 1.09 - 0.90 (m, 4 H)。 LCMS RT = 3.210 min, m/z = 431.1 8.0
I-87 N-(2-環丙基吡啶-4-基)-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.42 - 8.36 (m, 2 H), 7.31 (s, 1 H), 7.18 - 7.14 (m, 1 H), 6.90 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.37 (s, 2 H), 3.26 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 2.04 - 1.95 (m, 1 H), 1.42 (t, J = 7.2 Hz, 3 H), 1.05 - 1.00 (m, 4 H)。 LCMS RT = 1.094 min, m/z = 441.9 0.039
I-88 N-(6-(二氟甲氧基)吡啶-3-基)-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)環丙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.39 (s, 1 H), 8.33 (d, J = 2.8 Hz, 1 H), 7.87 (dd, J = 2.8, 8.8 Hz, 1 H), 7.42 (t, J = 72.0 Hz, 1 H), 7.06 - 6.77 (m, 2 H), 5.26 (s, 2 H), 2.64 - 2.48 (m, 1 H), 1.21 - 0.98 (m, 4 H)。 LCMS RT = 0.957 min, m/z = 479.9 0.048
I-89 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(5-(三氟甲基)吡啶-3-基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.95 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.87 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.44 (s, 1 H), 8.13 (s, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.31 (s, 2 H), 3.12 (s, 3 H)。 LCMS RT = 0.878 min, m/z = 455.9 0.049
I-90 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(吡𠯤-2-基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.00 (s, 1 H), 8.47 - 8.36 (m, 3 H), 6.91 (t, J = 51.2 Hz, 1 H), 5.58 (s, 2 H), 3.27 (s, 3 H)。 LCMS RT = 0.943 min, m/z = 389.1 0.041
I-91 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(吡𠯤-2-基)環丙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.02 (d, J = 1.2 Hz, 1 H), 8.46 - 8.35 (m, 3 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.58 (s, 2 H), 2.72 - 2.61 (m, 1 H), 1.27 - 1.21 (m, 2 H), 1.11 - 1.01 (m, 2 H)。 LCMS RT = 1.031 min, m/z = 415.1 0.018
I-92 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(5-氟吡啶-3-基)環丙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.61 (s, 1 H), 8.47 (d, J = 4.0 Hz, 1 H), 8.40 (s, 1 H), 7.68 - 7.62 (m, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.31 (s, 2 H), 2.63 - 2.52 (m, 1 H), 1.17 - 1.02 (m, 4 H)。 LCMS RT = 2.295 min, m/z = 431.9 0.014
I-93 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(5-甲基吡啶-3-基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.52 - 8.43 (m, 2 H), 8.40 (s, 1 H), 7.65 (s, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.27 (s, 2 H), 3.10 (s, 3 H), 2.39 (s, 3 H)。 LCMS RT = 0.828 min, m/z = 401.9 0.055
I-94 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(5-氟吡啶-3-基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.58 (s, 1 H), 8.49 (s, 1 H), 8.43 (s, 1 H), 7.68 - 7.65 (m, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.29 (s, 2 H), 3.12 (s, 3 H)。 LCMS RT = 1.877 min, m/z = 406.1 0.025
I-95 N-(5-氯吡啶-3-基)-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.62 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.57 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.43 (s, 1 H), 7.90 (s, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.27 (s, 2 H), 3.11 (s, 3 H)。 LCMS RT = 2.188 min, m/z = 421.8 0.0235
I-96 N-(5-(二氟甲氧基)吡啶-3-基)-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.63 (s, 1 H), 8.46 (s, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 7.68 (s, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 6.58 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.29 (s, 2 H), 3.22 (q, J = 7.2 Hz , 2 H), 1.44 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 0.907 min, m/z = 467.8 0.010
I-97 N-(6-氰基吡啶-3-基)-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)環丙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.89 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 8.05 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.74 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.35 (s, 2 H), 2.59 - 2.53 (m, 1 H), 1.16 - 1.07 (m, 4 H)。 LCMS RT = 0.859 min, m/z = 439.0 0.010
I-98 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.59 (d, J = 5.6 Hz, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 7.81 (s, 1 H), 7.61 - 7.53 (m, 1 H), 6.83 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.35 (s, 2 H), 3.24 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.35 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 0.956 min, m/z = 469.9 0.069
I-99 N-(5-氯吡啶-3-基)-N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.61 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.55 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.41 (s, 1 H), 7.89 (t, J = 2.2 Hz, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.28 (s, 2 H), 3.22 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.46 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 2.461 min, m/z = 435.9 0.0189
I-100 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(6-(二氟甲基)吡啶-3-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.77 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.47 (s, 1 H), 8.01 (dd, J = 2.4, 8.4 Hz, 1 H), 7.69 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 6.63 (t, J = 55.2 Hz, 1 H), 5.32 (s, 2 H), 3.21 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.45 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 2.547 min, m/z = 452.1 0.065
I-101 1-(5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)-5-苯基吡咯啶-2-酮 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.08 (s, 1 H), 7.38 - 7.30 (m, 3 H), 7.18 (d, J = 7.2 Hz, 2 H), 6.88 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.80 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 2.93 - 2.74 (m, 3 H), 2.25 - 2.20 (m, 1 H)。 LCMS RT = 2.937 min, m/z = 362.9 0.171
I-102 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(5-(2-羥基丙-2-基)吡啶-2-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.55 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.38 (s, 1 H), 7.86 (d, J = 6.8 Hz, 1 H), 7.60 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 6.89 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.58 (s, 2 H), 3.29 (q, J = 7.6 Hz , 2 H), 1.61 (s, 6 H), 1.39 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.017 min, m/z = 459.9 0.137
I-103 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-1-甲基-N-(吡啶-3-基)環丙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.74 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.58 (d, J = 3.6 Hz, 1 H), 8.35 (s, 1 H), 7.87 - 7.81 (m, 1 H), 7.38 - 7.31 (m, 1 H), 6.90 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.35 (s, 2 H), 1.59 (s, 3 H), 1.22  - 1.15 (m, 2 H), 0.79 - 0.72 (m, 2 H)。 LCMS RT = 0.956 min, m/z = 427.9 0.013
I-104 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(6-(甲氧基甲基)吡啶-3-基)乙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.63 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.38 (s, 1 H), 7.83 (dd, J = 2.4, 8.0 Hz, 1 H), 7.48 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.29 (s, 2 H), 4.57 (s, 2 H), 3.49 (s, 3 H), 3.20 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.46 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 0.789 min, m/z = 446.2 0.051
I-105 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(5-氟吡啶-2-基)丙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.37 (s, 1 H), 8.28 (d, J= 3.2 Hz, 1  H), 7.69 - 7.63 (m, 1 H), 7.51 - 7.43 (m, 1 H), 6.89 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 5.52 (s, 2 H), 3.20 - 3.14 (m, 2 H), 1.91 - 1.83 (m, 2 H), 1.05 (t, J= 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS R T= 0.684 min, m/z= 433.9 0.0268
I-106 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-[6-(2-羥基丙-2-基)吡啶-3-基]乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.55 (s, 1 H), 8.38 (s, 1 H), 7.85 (d, J= 8.8 Hz, 1 H), 7.60 (d, J= 8.4 Hz, 1 H), 6.89 (t, J= 52.0 Hz, 1 H), 5.58 (s, 2 H), 3.30 (q, J= 7.2 Hz, 2 H), 2.63 (s, 1 H), 1.39 (t, J= 7.6 Hz, 3 H), 1.30 - 1.23 (m, 6 H)。 LCMS R T= 1.467 min, m/z= 460.2 0.480
I-107 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-甲氧基-N-(吡啶-3-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.80 (s, 1 H), 8.57 (d, J= 3.6 Hz, 1 H), 8.34 (s, 1 H), 7.91 - 7.88 (m, 1 H), 7.36 - 7.33 (m, 1 H), 6.90 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 5.24 (s, 2 H), 3.87 (t, J= 5.2 Hz, 2 H), 3.51 (s, 3 H), 3.35 (t, J= 5.2 Hz, 2 H)。 LCMS R T= 1.284 min, m/z= 431.9 0.0212
I-108 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(5-乙氧基吡啶-3-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.40 (s, 1 H), 8.32 - 8.27 (m, 2 H), 7.42 - 7.38 (m, 1 H), 6.92 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 5.31 (s, 2 H), 4.10 (q, J= 6.8 Hz, 2 H), 3.22 (q, J= 7.2 Hz, 2 H), 1.49 - 1.43 (m, 6 H)。 LCMS R T= 0.604 min, m/z= 446.0 0.0138
I-109 N-(5-氯吡啶-3-基)-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)丙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.60 (d, J= 2.0 Hz, 1 H), 8.54 (s, 1 H), 8.40 (s, 1 H), 7.88 (t, J= 2.4 Hz, 1 H), 6.91 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 5.27 (s, 2 H), 3.22 - 3.00 (m, 2 H), 1.99 - 1.70 (m, 2 H), 1.09 (t, J= 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS R T= 0.668 min, m/z= 449.9 0.00392
I-110 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(5-氟吡啶-3-基)丙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.56 (s, 1 H), 8.46 (d, J= 2.4 Hz, 1 H), 8.40 (s, 1 H), 7.67 - 7.61 (m, 1 H), 6.91 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 5.29 (s, 2 H), 3.19 - 3.09 (m, 2 H), 1.97 - 1.85 (m, 2 H), 1.08 (t, J= 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS R T= 2.144 min, m/z= 434.2 0.0104
I-111 N-(5-氰基吡啶-3-基)-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.98 (d, J= 2.4 Hz, 1 H), 8.84 (s, 1 H), 8.45 (s, 1 H), 8.20 (s, 1 H), 6.93 (t, J= 51.2 Hz, 1 H), 5.29 (s, 2 H), 3.11 (s, 3 H)。 LCMS R T= 1.456 min, m/z= 412.8 0.0374
I-112 N-[5-(1,1-二氟乙基)吡啶-3-基]-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.79 (s, 1 H), 8.72 (s, 1 H), 8.40 (s, 1 H), 7.96 (s, 1 H), 6.91 (t, J= 52.0 Hz, 1 H), 5.30 (s, 2 H), 3.21 (q, J= 7.2 Hz, 2 H), 1.97 (t, J= 18.4 Hz, 3 H), 1.46 (t, J= 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS R T= 1.138 min, m/z= 466.2 0.0101
I-113 N-(5-氰基吡啶-3-基)-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)丙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.95 (d, J= 2.4 Hz, 1 H), 8.82 (d, J= 2.0 Hz, 1 H), 8.42 (s, 1 H), 8.20 - 8.12 (m, 1 H), 6.92 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 5.29 (s, 2 H), 3.19 - 3.08 (m, 2 H), 1.98 - 1.85 (m, 2 H), 1.09 (t, J= 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS R T= 1.560 min, m/z= 441.2 0.0429
I-114 N-苯基-N-({5-[5-(三氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.39 (s, 1 H), 7.48 - 7.38 (m, 5 H), 5.28 (s, 2 H), 3.06 (s, 3 H)。 LCMS R T= 2.568 min, m/z= 404.8 0.354
I-115 N-(5-氟吡啶-3-基)-N-({5-[5-(三氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.57 (s, 1 H), 8.47 (d, J= 2.4 Hz, 1 H), 8.42 (s, 1 H), 7.68 - 7.63 (m, 1 H), 5.31 (s, 2 H), 3.22 (q, J= 7.2 Hz, 2 H), 1.46 (t, J= 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS R T= 0.904 min, m/z= 437.9 0.022
I-116 N-[6-(1,1-二氟乙基)吡啶-3-基]-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.74 (d, J= 2.4 Hz, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 7.98 - 7.92 (m, 1 H), 7.70 (d, J= 8.4 Hz, 1 H), 6.91 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 5.32 (s, 2 H), 3.22 (q, J= 7.6 Hz, 2 H), 2.01 (t, J= 18.8 Hz, 3 H), 1.46 (t, J= 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS R T= 0.908 min, m/z= 465.9 0.0514
I-117 N-(5-氯吡啶-3-基)-N-({5-[5-(三氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.61 (d, J= 2.4 Hz, 1 H), 8.55 (d, J= 2.4 Hz, 1 H), 8.42 (s, 1 H), 7.88 (t, J= 2.0 Hz, 1 H), 5.29 (s, 2 H), 3.21 (q, J= 4.0 Hz, 2 H), 1.46 (t, J= 8.0 Hz, 3 H)。 LCMS R T= 2.591 min, m/z= 453.8 0.0245
I-118 N-(吡𠯤-2-基)-N-({5-[5-(三氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 9.00 (s, 1 H), 8.44 - 8.37 (m, 3 H), 5.58 (s, 2 H), 3.41 (d, J= 6.8 Hz, 2 H), 1.43 (t, J= 6.8 Hz, 3 H)。 LCMS R T= 0.895 min, m/z= 420.9 0.0278
I-119 N-(吡啶-3-基)-N-({5-[5-(三氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.73 (s, 1 H), 8.62 - 8.60 (m, 1 H), 8.41 (s, 1 H), 7.86 (d, J= 8.0 Hz, 1 H), 7.40 - 7.35 (m, 1 H), 5.32 (s, 2 H), 3.22 (q, J= 6.8 Hz, 2 H), 1.48 (t, J= 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS R T= 1.897 min, m/z= 420.1 0.042
I-120 N-(5-氰基吡啶-3-基)-N-({5-[5-(三氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.98 (d, J= 2.8 Hz, 1 H), 8.85 (s, 1 H), 8.46 (s, 1 H), 8.20 (t, J= 2.0 Hz, 1 H), 5.30 (s, 2 H), 3.11 (s, 3 H)。 LCMS R T= 2.105 min, m/z= 431.1 0.111
I-121 N-(3-氟苯基)-N-({5-[5-(三氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.40 (s, 1 H), 7.41 - 7.36 (m, 1 H), 7.28 (s, 1 H), 7.25 - 7.22 (m, 1 H), 7.09 - 7.04 (m, 1 H), 5.30 (s, 2 H), 3.19 (q, J= 7.6 Hz, 2 H), 1.45 (t, J= 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS R T= 1.978 min, m/z= 437.1 0.0839
I-122 N-苯基-N-({5-[5-(三氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.38 (s, 1 H), 7.50 - 7.30 (m, 5 H), 5.31 (s, 2 H), 3.17 (q, J= 7.2 Hz, 2 H), 1.45 (t, J= 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS R T= 0.973 min, m/z= 419.0 0.0249
I-123 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.42 (s, 1 H), 7.57 (s, 1 H), 7.48 (s, 1 H), 6.91 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 5.14 (s, 2 H), 3.88 (s, 3 H), 3.03 (s, 3 H)。 LCMS R T= 1.057 min, m/z= 390.9 0.0388
I-124 5-[({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)(甲基)胺基]吡啶-3-甲腈 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.46 (s, 1 H), 8.41 (s, 1 H), 8.33 (s, 1 H), 7.25 (s, 1 H), 6.90 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 4.92 (s, 2 H), 3.27 (s, 3 H)。 LCMS R T= 0.971 min, m/z= 349.0 0.0636
I-125 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(吡啶-3-基)丙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.71 (d, J= 2.4 Hz, 1 H), 8.60 - 8.56 (m, 1 H), 8.38 (s, 1 H), 7.85 - 7.82 (m, 1 H), 7.39 - 7.32 (m, 1 H), 6.91 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 5.29 (s, 2 H), 3.18 - 3.11 (m, 2 H), 1.98 - 1.89 (m, 2 H), 1.09 (t, J= 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS R T= 0.776 min, m/z= 416.1 0.0599
I-126 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-{1-[2-(三氟甲氧基)乙基]-1H-吡唑-4-基}乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.39 (s, 1 H), 7.64 (s, 1 H), 7.57 (s, 1 H), 6.91 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 5.16 (s, 2 H), 4.36 - 4.33 (m, 2 H), 4.30 - 4.23 (m, 2 H), 3.15 (q, J= 7.6 Hz, 2 H), 1.40 (t, J= 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS R T= 1.043 min, m/z= 502.9 0.134
I-127 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(5-氟吡啶-2-基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.37 (s, 1 H), 8.29 (d, J= 3.2 Hz, 1 H), 7.67 - 7.61 (m, 1 H), 7.53 - 7.46 (m, 1 H), 6.90 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 5.50 (s, 2 H), 3.10 (s, 3 H)。 LCMS R T= 0.854 min, m/z= 406.1 0.0215
I-128 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-1,1-二氟-N-(1-丙基-1H-吡唑-4-基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.42 (s, 1 H), 7.49 (d, J= 4.4 Hz, 2 H), 6.92 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 6.44 (t, J= 53.2 Hz, 1 H), 5.21 (s, 2 H), 4.02 (t, J= 7.2 Hz, 2 H), 1.94 - 1.78 (m, 2 H), 0.88 (t, J= 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS R T= 0.901 min, m/z= 455.1 0.251
I-129 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(1-丙基-1H-吡唑-4-基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.41 (s, 1 H), 7.58 (s, 1 H), 7.49 (s, 1 H), 6.91 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 5.14 (s, 2 H), 4.03 (t, J= 7.2 Hz, 2 H), 3.03 (s, 3 H), 1.92 - 1.81 (m, 2 H), 0.90 (t, J= 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS R T= 0.795 min, m/z= 418.9 0.118
I-130 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)環丙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.39 (s, 1 H), 7.56 (s, 1 H), 7.52 (s, 1 H), 6.91 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 5.15 (s, 2 H), 3.87 (s, 3 H), 2.58 - 2.50 (m, 1 H), 1.20 - 1.15 (m, 2 H), 1.07 - 1.01 (m, 2 H)。 LCMS R T= 1.320 min, m/z= 416.8 0.0348
I-131 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(5-甲基吡啶-3-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.50 (d, J= 2.4 Hz, 1 H), 8.41 (s, 1 H), 8.38 (s, 1 H), 7.65 (s, 1 H), 6.91 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 5.29 (s, 2 H), 3.20 (q, J= 7.6 Hz, 2 H), 2.37 (s, 3 H), 1.47 (t, J= 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS R T= 0.714 min, m/z= 416.2 0.013
I-132 N-[5-(2,2-二氟乙氧基)吡啶-3-基]-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.40 (s, 2 H), 8.32 (d, J= 2.4 Hz, 1 H), 7.45 (t, J= 2.4 Hz, 1 H), 6.91 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 6.25 - 5.96 (m, 1 H), 5.30 (s, 2 H), 4.30 - 4.20 (m, 2 H), 3.21 (q, J= 7.2 Hz, 2 H), 1.46 (t, J= 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS R T= 0.857 min, m/z= 482.2 0.00964
I-133 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-1,1-二氟-N-(5-氟吡啶-2-基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.39 (s, 1 H), 8.30 (d, J= 2.8 Hz, 1 H), 7.58 - 7.55 (m, 1 H), 7.54 - 7.48 (m, 1 H), 7.03 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 6.33 (t, J= 53.6 Hz, 1 H), 5.55 (s, 2 H)。 LCMS R T= 0.954 min, m/z= 441.9 0.0857
I-134 N-[1-(1-氰基-1-甲基乙基)-1H-吡唑-4-基]-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.42 (s, 1 H), 7.83 (s, 1 H), 7.63 (s, 1 H), 6.91 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 5.17 (s, 2 H), 3.17 (q, J= 7.2 Hz, 2 H), 1.99 (s, 6 H), 1.42 (t, J= 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS R T= 1.012 min, m/z= 458.1 0.121
I-135 3-氯-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-乙基苯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.45 (s, 1 H), 7.14 (t, J= 8.0 Hz, 1 H), 6.88 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 6.76 - 6.74 (m, 2 H), 6.64 - 6.60 (m, 1 H), 4.79 (s, 2 H), 3.58 (q, J= 7.2 Hz, 2 H), 1.30 (t, J= 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS R T= 1.098 min, m/z= 370.9 0.0531
I-136 N-(5-環丙基吡啶-3-基)-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.46 (s, 1 H), 8.41 (s, 1 H), 8.37 (s, 1 H), 7.46 (s, 1 H), 6.91 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 5.25 (s, 2 H), 3.09 (s, 3 H), 1.96 - 1.89 (m, 1 H), 1.14 - 1.06 (m, 2 H), 0.79 - 0.71 (m, 2 H)。 LCMS R T= 0.743 min, m/z= 427.9 0.013
I-137 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-[6-(二氟甲基)吡啶-2-基]甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.38 (s, 1 H), 7.90 (t, J= 8.0 Hz, 1 H), 7.77 (d, J= 8.4 Hz, 1 H), 7.48 (d, J= 7.6 Hz, 1 H), 6.89 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 6.54 (t, J= 55.2 Hz, 1 H), 5.59 (s, 2 H), 3.23 (s, 3 H)。 LCMS R T= 0.899 min, m/z= 437.9 0.0107
I-138 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-[1-(丙-2-基)-1H-吡唑-4-基]乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.37 (s, 1 H), 7.57 (s, 1 H), 7.46 (s, 1 H), 6.87 (t, J= 51.2 Hz, 1 H), 5.12 (s, 2 H), 4.44 - 4.34 (m, 1 H), 3.13 (q, J= 7.2 Hz, 2 H), 1.45 (d, J= 6.8 Hz, 6 H), 1.39 (t, J= 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS R T= 1.141 min, m/z= 433.2 0.043
I-139 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-[1-(丙-2-基)-1H-吡唑-4-基]甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.39 (s, 1 H), 7.58 (s, 1 H), 7.46 (s, 1 H), 6.88 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 5.11 (s, 2 H), 4.45 - 4.35 (m, 1 H), 3.00 (s, 3 H), 1.46 (d, J= 6.8 Hz, 6 H)。 LCMS R T= 0.997 min, m/z= 419.2 0.118
I-140 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.37 (s, 1 H), 7.95 - 7.85 (m, 2 H), 7.51 (d, J= 7.2 Hz, 1 H), 6.90 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 5.61 (s, 2 H), 3.29 (s, 3 H)。 LCMS R T= 1.112 min, m/z= 455.8 0.0576
I-141 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-1,1-二氟-N-(吡啶-3-基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.70 - 8.60 (m, 2 H), 8.39 (s, 1 H), 7.75 (d, J= 6.8 Hz, 1 H), 7.39 - 7.36 (m, 1 H), 6.92 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 6.49 (t, J= 53.2 Hz, 1 H), 5.35 (s, 2 H)。 LCMS R T= 0.965 min, m/z= 423.8 0.0655
I-142 3-氯-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(2-甲氧基乙基)苯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.44 (s, 1 H), 7.13 (t, J= 8.0 Hz, 1 H), 6.88 (t, J= 89.2 Hz, 1 H), 6.80 - 6.70 (m, 2 H), 6.68 - 6.55 (m, 1H), 4.94 (s, 2 H), 3.74 - 3.71 (m, 2 H), 3.70 - 3.65 (m, 2 H), 3.38 (s, 3 H)。 LCMS R T= 1.055 min, m/z= 400.9 0.0245
I-143 N-(5-氰基吡啶-3-基)-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)環丙烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.99 (d, J= 2.0 Hz, 1 H), 8.83 (s, 1 H), 8.41 (s, 1 H), 8.18 (t, J= 2.0 Hz, 1 H), 6.92 (t, J= 51.6 Hz, 1H), 5.31 (s, 2 H), 2.59 - 2.50 (m, 1 H), 1.13 - 1.08 (m, 4 H)。 LCMS R T= 0.834 min, m/z= 439.1 0.0153
I-144 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(1,5-二甲基-1H-吡唑-4-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.39 (s, 1 H), 7.38 (s, 1 H), 6.91 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 5.11 (s, 2 H), 3.76 (s, 3 H), 3.20 (q, J= 7.2 Hz, 2 H), 2.25 (s, 3 H), 1.47 (t, J= 7.4 Hz, 3 H)。 LCMS R T= 0.751 min, m/z= 419.0 0.102
I-145 N-[5-(二氟甲氧基)吡啶-3-基]-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)丙烷-2-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.61 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.45 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.38 (s, 1 H), 7.68 (t, J = 2.0 Hz, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 6.58 (t, J = 72.0 Hz, 1 H), 5.31 (s, 2 H), 3.40 - 3.29 (m, 1 H), 1.45 (d, J = 6.8 Hz, 6 H)。 LCMS RT = 1.625 min, m/z = 482.2 0.0102
I-146 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(5-乙基吡啶-3-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.59 (s, 1 H), 8.40 (s, 2 H), 8.02 (s, 1 H), 7.19 (t, J = 51.2 Hz, 1 H), 5.40 (s, 2 H), 3.40 - 3.30 (m, 2 H), 2.73 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.39 (t, J = 7.6 Hz, 3 H), 1.25 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.215 min, m/z = 430.2 0.0162
I-147 N-[5-(二氟甲氧基)吡啶-3-基]-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.62 (s, 1 H), 8.49 (s, 1 H), 8.43 (s, 1 H), 7.69 (s, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 6.59 (t, J = 72.0 Hz, 1 H), 5.28 (s, 2 H), 3.12 (s, 3 H)。 LCMS RT = 1.512 min, m/z = 453.8 0.019
I-148 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(5-甲氧基吡啶-3-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.39 (s, 1 H), 8.30 - 8.28 (m, 2 H), 7.38 (s, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.30 (s, 2 H), 3.87 (s, 3 H), 3.21 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.46 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.360 min, m/z = 431.9 [M + H]+ 0.0192
I-149 N-(5-氰基吡啶-3-基)-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)丙烷-2-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.95 (d, J = 2.8 Hz, 1 H), 8.80 (s, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 8.16 (s, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.30 (s, 2 H), 3.39 - 3.25 (m, 1 H), 1.45 (d, J = 6.8 Hz, 6 H)。 LCMS RT = 1.584 min, m/z = 440.9 0.0231
I-150 N-[5-(1,1-二氟乙基)吡啶-3-基]-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.80 (s, 1 H), 8.75 (s, 1 H), 8.43 (s, 1 H), 7.98 (s, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.29 (s, 2 H), 3.12 (s, 3 H), 1.98 (t, J = 18.0 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.554 min, m/z = 451.8 0.0255
I-151 N-(5-氯吡啶-2-基)-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.37 (d, J = 4.0 Hz, 2 H), 7.74 - 7.67 (m, 2 H), 6.90 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.56 (s, 2 H), 3.29 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.39 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.826 min, m/z = 436.1 0.0315
I-152 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-[5-(丙-2-基氧基)吡啶-3-基]乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.39 (s, 1 H), 8.25 (s, 2 H), 7.35 (s, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.29 (s, 2 H), 4.61 - 4.55 (m, 1 H), 3.25 - 3.18 (m, 2 H), 1.61 (s, 3 H), 1.36 (d, J = 4.4 Hz, 6 H)。 LCMS RT = 1.666 min, m/z = 459.9 0.0429
I-153 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(5-甲基吡啶-2-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.22 (s, 1 H), 8.10 (s, 1 H), 7.40 (s, 2 H), 6.75 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.42 (s, 2 H), 3.09 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 2.18 (s, 3 H), 1.23 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.666 min, m/z = 416.2 0.043
I-155 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(4-甲基吡啶-2-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.39 (s, 1 H), 8.29 (d, J= 4.8 Hz, 1 H), 7.47 (s, 1 H), 7.01 (d, J= 4.8 Hz, 1 H), 6.90 (t, J= 51.6 Hz, 1 H), 5.60 (s, 2 H), 3.28 (q, J= 7.6 Hz, 2 H), 2.40 (s, 3 H), 1.39 (t, J= 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.635 min, m/z= 416.2 0.0528
I-156 N-(5-氯吡啶-3-基)-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-(𠰌啉-4-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 8.68 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.52 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.44 (s, 1 H), 8.17 (t, J = 2.0 Hz, 1 H),  7.22 (t, J = 52.0 Hz, 1 H), 5.45 (s, 2 H), 3.73 - 3.70 (m, 4 H), 3.58 (t, J = 7.6 Hz, 2 H), 2.89 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.58 - 2.51 (m, 4 H)。 LCMS RT = 0.992 min, m/z = 521.2 0.00253
I-157 N-[5-(二氟甲氧基)吡啶-3-基]-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-甲基丙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.59 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.47 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.40 (s, 1 H), 7.67 (t, J = 2.4 Hz, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 6.59 (t, J = 72.0 Hz, 1 H), 5.28 (s, 2 H), 3.05 (d, J = 8.0 Hz, 2 H), 2.40 - 2.30 (m, 1 H), 1.12 (d, J = 6.8 Hz, 6 H)。 LCMS RT = 0.644 min, m/z = 496.1 0.00693
I-158 N-(5-氯吡啶-3-基)-2-氰基-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.63 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.60 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.46 (s, 1 H), 7.91 (t, J = 2.4 Hz, 1 H), 6.93 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.30 (s, 2 H), 3.54 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 2.98 (t, J = 7.2 Hz, 2 H)。 LCMS RT = 0.576 min, m/z = 461.1 0.00722
I-159 N-[5-(1,1-二氟乙基)吡啶-3-基]-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-甲氧基乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.85 (s, 1 H), 8.56 (s, 1 H), 8.72 (s, 1 H), 8.35 (s, 1 H), 8.01 (s, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.26 (s, 2 H), 3.87 (t, J = 5.2 Hz, 2 H), 3.50 (s, 3 H), 3.36 (t, J = 5.2 Hz, 2 H), 1.97 (t, J = 18.4 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.701 min, m/z = 495.9 0.00994
I-160 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(5-甲基吡啶-3-基)丙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.49 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.41 (s, 1 H), 8.38 (s, 1 H), 7.65 (s, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.27 (s, 2 H), 3.16 - 3.08 (m, 2 H), 2.37 (s, 3 H), 1.99 - 1.85 (m, 2 H), 1.09 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.815 min, m/z = 430.2 0.0109
I-161 N-(5-氯吡啶-3-基)-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-甲氧基乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.67 (s, 1 H), 8.53 (s, 1 H), 8.35 (s, 1 H), 7.90 (t, J = 2.0 Hz, 1 H), 6.90 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.22 (s, 2 H), 3.86 (t, J = 5.6 Hz, 2 H), 3.49 (s, 3 H), 3.36 (t, J = 5.6 Hz, 2 H)。 LCMS RT = 1.529 min, m/z = 466.1 0.012
I-162 N-[5-(二氟甲氧基)吡啶-3-基]-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)丙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.60 (s, 1 H), 8.47 (s, 1 H), 8.40 (s, 1 H), 7.67 (s, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 6.59 (t, J = 72.0 Hz, 1 H), 5.29 (s, 2 H), 3.19 - 3.11 (m, 2 H), 1.99 - 1.86 (m, 2 H), 1.09 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.794 min, m/z = 481.9 0.0144
I-163 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-甲基-N-(吡啶-3-基)丙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.70 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.60 - 8.55 (m, 1 H), 8.41 (s, 1 H), 8.07 - 8.01 (m, 1 H), 7.53 - 7.47 (m, 1 H) , 7.20 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.37 (s, 2 H), 3.20 (d, J = 6.4 Hz, 2 H), 2.34 - 2.22 (m, 1 H), 1.10 (d, J = 6.4 Hz, 6 H)。 LCMS RT = 1.423 min, m/z = 430.2 0.0161
I-164 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-(𠰌啉-4-基)-N-(吡啶-3-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.73 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.60 - 8.55 (m, 1 H), 8.38 (s, 1 H), 7.87 - 7.81 (m, 1 H), 7.38 - 7.33 (m, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.32 (s, 2 H), 3.76 - 3.72 (m, 4 H), 3.37 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 2.90 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.52 - 2.50 (m, 4 H)。 LCMS RT = 0.430 min, m/z = 487.2 0.0173
I-165 N-[5-(二氟甲氧基)吡啶-3-基]-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-甲氧基乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.59 (s, 1 H), 8.40 (s, 2 H), 7.87 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 7.19 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 6.97 (t, J = 72.8 Hz, 1 H), 5.34 (s, 2 H), 3.83 (t, J = 5.2 Hz, 2 H), 3.52 (t, J = 5.6 Hz, 2 H), 3.30 (t, J = 1.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.533 min, m/z = 498.2 0.0196
I-166 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-甲氧基-N-(5-甲基吡啶-3-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.49 (s, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 8.34 (s, 1 H), 7.87 (s, 1 H), 7.20 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.31 (s, 2 H), 3.83 (t, J = 5.2 Hz, 2 H), 3.49 (t, J = 5.6 Hz, 2 H), 3.43 (s, 3 H), 2.38 (s, 3 H)。 LCMS RT = 2.329 min, m/z = 446.5 0.0266
I-167 N-(5-氯吡啶-2-基)-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)丙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.40 - 8.35 (m, 2 H), 7.73 - 7.68 (m, 1 H), 7.66 - 7.60 (m, 1 H), 6.89 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.55 (s, 2 H), 3.26 - 3.17 (m, 2 H), 1.93 - 1.81 (m, 2 H), 1.05 (t, J = 7.4 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 2.072 min, m/z = 449.8 0.0266
I-168 N-(5-氰基吡啶-3-基)-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-甲基丙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.95 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.82 (s, 1 H), 8.42 (s, 1 H), 8.16 (s, 1 H), 6.92 (t, J = 52.0 Hz, 1 H), 5.28 (s, 2 H), 3.03 (d, J = 6.4 Hz, 2 H), 2.42 - 2.28 (m, 1 H), 1.12 (d, J = 6.8 Hz, 6 H)。 LCMS RT = 1.690 min, m/z = 455.2 0.0305
I-169 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(6-甲基吡啶-2-基)丙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.38 (s, 1 H), 7.61 (t, J = 7.6 Hz, 1 H), 7.45 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.02 - 6.75 (m, 2 H), 5.59 (s, 2 H), 3.22 - 3.15 (m, 2 H), 2.52 (s, 3 H), 1.93 - 1.80 (m, 2 H), 1.03 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.942 min, m/z = 429.9 0.0309
I-170 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(吡啶-3-基)丁烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.70 (s, 1 H), 8.58 (d, J = 4.8 Hz, 1 H), 8.38 (s, 1 H), 7.90 - 7.80 (m, 1 H), 7.45 - 7.31 (m, 1 H), 6.91 (t, J = 51.2 Hz, 1 H), 5.29 (s, 2 H), 3.21 - 3.06 (m, 2 H), 1.92 - 1.83 (m, 2 H), 1.52 - 1.43 (m, 2 H), 0.96 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 0.623 min, m/z = 429.9 0.0264
I-171 1-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-1,2,3,4-四氫-1,7-㖠啶-2-酮 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.55 (s, 1 H), 8.42 (s, 1 H), 8.31 (d, J = 3.6 Hz, 1 H), 7.16 (d, J = 4.4 Hz, 1 H), 6.89 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.52 (s, 2 H), 3.04 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.81 (t, J = 8.0 Hz, 2 H)。 LCMS RT = 1.398 min, m/z = 363.9 0.0215
I-172 4-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2H,3H,4H-吡啶并[4,3-b][1,4]㗁𠯤-3-酮 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.52 (s, 1 H), 8.43 (s, 1 H), 8.27 (d, J = 5.6 Hz, 1 H), 6.96 (d, J = 5.2 Hz, 1 H), 6.90 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.52 (s, 2 H), 4.85 (s, 2 H)。 LCMS RT = 0.418 min, m/z = 366.0 0.025
I-173 4-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-2,2-二甲基-2H-吡啶并[3,2-b][1,4]㗁𠯤-3(4H)-酮 1H NMR (400MHz, CDCl 3) δ 8.39 (s, 1 H), 8.01 - 8.05 (m, 1 H), 7.29 (dd, J = 8.1, 1.5 Hz, 1 H), 7.01 (dd, J = 8.1, 1.5 Hz, 1H), 6.89 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.70 (s, 2 H) LCMS: RT= 5.00 min, m/z  = 394.0 0.108
I-174 N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(吡啶-3-基)-2-(四氫-1H-呋喃并[3,4-c]吡咯-5(3H)-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.76 (s, 1 H), 8.58 (d, J = 4.4 Hz, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 7.89 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.40 - 7.35 (m, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.33 (s, 2 H), 3.75 - 3.70 (m, 4 H), 3.49 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 3.07 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.99 - 2.96 (m, 4 H), 2.49 (d, J = 6.0 Hz, 2 H)。 LCMS RT = 1.435 min, m/z = 513.0 0.022
I-175 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(5-氟吡啶-3-基)-3-(𠰌啉-4-基)丙醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.55 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.43 - 8.36 (m, 2 H), 7.50 - 7.44 (m, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.20 (s, 2 H), 3.71 - 3.66 (m, 4 H), 2.81 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.50 - 2.22 (m, 6 H)。 LCMS RT = 0.400 min, m/z = 469.2 0.496
I-176 1-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-1H,2H,3H-吡啶并[3,4-b][1,4]㗁𠯤-2-酮 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.54 - 8.53 (m, 1 H), 8.13 - 8.10 (m, 1 H), 7.22 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 6.97 - 6.89 (m, 1 H), 5.84 - 5.78 (m, 1 H), 4.72 - 4.45 (m, 4 H)。 LCMS RT = 1.091 min, m/z = 365.8 2.52
I-177 N-[5-(二氟甲氧基)吡啶-3-基]-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)丁烷-2-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.59 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.45 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.37 (s, 1 H), 7.67 (t, J = 2.4 Hz, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 6.58 (t, J = 72.0 Hz, 1 H), 5.38 - 5.20 (m, 2 H), 3.15 - 3.07 (m, 1 H), 2.13 - 2.02 (m, 1 H), 1.73 - 1.60 (m, 1 H), 1.43 (d, J = 6.8 Hz, 3 H), 1.05 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.580 min, m/z = 496.2 0.006
I-178 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-[(吡啶-3-基)甲基]乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.62 - 8.55 (m, 2 H), 8.42 (s, 1 H), 7.88 - 7.82 (m, 1 H), 7.38 - 7.34 (m, 1 H), 6.88 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 4.71 (s, 2 H), 4.60 (s, 2 H), 3.19 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.44 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.031 min, m/z = 416.2 4.35
I-179 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-{3-氧雜-6-氮雜雙環[3.1.1]庚-6-基}-N-(吡啶-3-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.76 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.58 (d, J = 3.2 Hz, 1 H), 8.38 (s, 1 H), 7.89 - 7.86 (m, 1 H), 7.39 - 7.35 (m, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.34 (s, 2 H), 4.22 (d, J = 11.2 Hz, 2 H), 3.81 (d, J = 11.6 Hz, 2 H), 3.64 (d, J = 6.4 Hz, 2 H), 3.36 - 3.20 (m, 4 H), 2.74 - 2.69 (m, 1 H), 1.91 (d, J = 8.8 Hz, 1 H)。 LCMS RT = 1.438 min, m/z = 499.0 0.013
I-180 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(5-氟吡啶-3-基)-2-{六氫-1H-呋喃并[3,4-c]吡咯-5-基}乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.62 (s, 1 H), 8.45 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.38 (s, 1 H), 7.75 - 7.70 (m, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.35 (s, 2 H), 3.78 - 3.69 (m, 4 H), 3.34 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.94 (t, J = 6.4 Hz, 2 H), 2.87 - 2.86 (m, 2 H), 2.72 - 2.68 (m, 2 H), 2.49 - 2.46 (m, 2 H)。 LCMS RT = 0.417 min, m/z = 531.2 0.010
I-181 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-[(5-氟吡啶-2-基)甲基]乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.44 (t, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.41 (s, 1 H), 7.44 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 7.42 (s, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 4.86 (s, 2 H), 4.65 (s, 2 H), 3.23 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.42 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.338 min, m/z = 434.2 3.46
I-182 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(5-氟吡啶-3-基)-2-{3-氧雜-6-氮雜雙環[3.1.1]庚-6-基}乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.61 (s, 1 H), 8.46 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 7.72 - 7.65 (m, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.35 (s, 2 H), 4.19 (d, J = 11.2 Hz, 2 H), 3.78 (d, J = 11.2 Hz, 2 H), 3.56 (d, J = 6.4 Hz, 2 H), 3.29 - 3.25 (m, 2 H), 3.21 - 3.18 (m, 2 H), 2.70 - 2.65 (m, 1 H), 1.89 (d, J = 8.4 Hz, 1 H)。 LCMS RT = 0.844 min, m/z = 517.3 0.018
I-183 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-[(吡啶-2-基)甲基]乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.59 (d, J = 4.4 Hz, 1 H), 8.40 (s, 1 H), 7.76 - 7.69 (m, 1 H), 7.39 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 7.25 (s, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 4.89 (s, 2 H), 4.68 (s, 2 H), 3.25 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.42 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 0.932 min, m/z = 416.2 2.54
I-184 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-{6-氧雜-3-氮雜雙環[3.1.1]庚-3-基}-N-(吡啶-3-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.73 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.60 (d, J = 3.2 Hz, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 7.89 - 7.82 (m, 1 H), 7.40 - 7.33 (m, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.31 (s, 2 H), 4.53 (d, J = 6.4 Hz, 2 H), 3.46 - 3.42 (m, 2 H), 3.21 - 3.02 (m, 5 H), 2.86 (d, J = 11.2 Hz, 2 H), 2.29 (d, J = 8.4 Hz, 1 H)。 LCMS RT = 1.352 min, m/z = 498.9 0.014
I-185 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-3-(𠰌啉-4-基)-N-(吡啶-3-基)丙醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.65 (d, J = 4.4 Hz, 1 H), 8.55 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.38 (s, 1 H), 7.63 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.43 - 7.39 (m, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.21 (s, 2 H), 3.65 (t, J = 4.4 Hz, 4 H), 2.73 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 2.38 - 2.33 (m, 6 H)。 LCMS RT = 0.411 min, m/z = 451.2 0.516
I-186 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(5-氟吡啶-3-基)-2-(1,4-㗁氮雜環庚-4-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.58 (s, 1 H), 8.47 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.40 (s, 1 H), 7.70 - 7.67 (m, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.32 (s, 2 H), 3.81 (t, J = 6.4 Hz, 2 H), 3.75 (t, J = 4.8 Hz, 2 H), 3.41 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 3.12 (t, J = 7.6 Hz, 2 H), 2.84 - 2.76 (m, 4 H), 1.97 - 1.92 (m, 2 H)。 LCMS RT = 0.414 min, m/z = 519.2 0.0276
I-187 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-[(1S,4S)-2-氧雜-5-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-基]-N-(吡啶-3-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.74 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.60 - 8.57 (m, 1 H), 8.38 (s, 1 H), 7.88 - 7.85 (m, 1 H), 7.40 - 7.26 (m, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.37 - 5.25 (m, 2 H), 4.47 (s, 1 H), 4.02 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 3.70 - 3.55 (m, 1 H), 3.58 (s, 1 H), 3.36 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 3.22 - 3.09 (m, 2 H), 3.00 - 2.92 (m, 1 H), 2.60 (d, J = 9.6 Hz, 1 H), 1.86 - 1.80 (m, 2 H)。 LCMS RT = 0.429 min, m/z = 499.2 0.0247
I-188 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(5-氟吡啶-3-基)-2-[(1R,4R)-2-氧雜-5-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-基]乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.58 (s, 1 H), 8.47 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 7.69 - 7.66 (m, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.37 - 5.27 (m, 2 H), 4.47 (s, 1 H), 4.02 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 3.68 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 1 H), 3.58 (s, 1 H), 3.38 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 3.22 - 3.09 (m, 2 H), 2.98 - 2.96 (m, 1 H), 2.60 (d, J = 10.0 Hz, 1 H), 1.85 - 1.83 (m, 2 H)。 LCMS RT = 0.457 min, m/z = 517.2 0.0151
I-189 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-[(2S)-2-甲基𠰌啉-4-基]-N-(吡啶-3-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.73 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.59 (d, J = 3.6 Hz, 1 H), 8.38 (s, 1 H), 7.88 - 7.85 (m, 1 H), 7.39 - 7.35 (m, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.32 (s, 2 H), 3.91 - 3.88 (m, 1 H), 3.71 - 3.62 (m, 2 H), 3.38 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.90 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 2.76 - 2.69 (m, 2 H), 2.28 - 2.21 (m, 1 H), 1.93 (t, J = 10.8 Hz, 1 H), 1.17 (d, J = 6.0 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.427 min, m/z = 500.9 0.0363
I-190 N-(5-氯吡啶-3-基)-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-{3-氧雜-6-氮雜雙環[3.1.1]庚-6-基}乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.65 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.54 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 7.95 (t, J = 2.4 Hz, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.34 (s, 2 H), 4.21 (d, J = 11.6 Hz, 2 H), 3.80 (d, J = 11.2 Hz, 2 H), 3.60 (d, J = 6.0 Hz, 2 H), 3.32 - 3.25 (m, 2 H), 3.24 - 3.17 (m, 2 H), 2.77 - 2.63 (m, 1 H), 1.91 (d, J = 8.4 Hz, 1 H)。 LCMS RT = 0.968 min, m/z = 533.2 0.016
I-191 N-(5-氯吡啶-3-基)-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-{6-氧雜-3-氮雜雙環[3.1.1]庚-3-基}乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.62 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.55 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.41 (s, 1 H), 7.90 (t, J = 2.4 Hz, 1 H), 6.91 (t, J = 51.2 Hz, 1 H), 5.29 (s, 2 H), 4.52 (d, J = 6.4 Hz, 2 H), 3.43 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 3.18 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 3.10 (d, J = 10.8 Hz, 2 H), 3.06 - 2.80 (m, 3 H), 2.28 (d, J = 8.0 Hz, 1 H)。 LCMS RT = 0.482 min, m/z = 533.2 0.0124
I-192 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(5-氟吡啶-3-基)-2-{6-氧雜-3-氮雜雙環[3.1.1]庚-3-基}乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.57 (s, 1 H), 8.46 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.40 (s, 1 H), 7.73 - 7.61 (m, 1 H), 6.92 (t, J = 51.2 Hz, 1 H), 5.31 (s, 2 H), 4.52 (d, J = 6.0 Hz, 2 H), 3.46 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 3.18 (t, J = 7.6 Hz, 2 H), 3.12 (d, J = 11.0 Hz, 2 H), 3.08 - 3.01 (m, 1 H), 2.86 (d, J = 11.2 Hz, 2 H), 2.27 (d, J = 8.0 Hz, 1 H)。 LCMS RT = 1.368 min, m/z = 517.2 0.0168
I-193 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-(1,4-㗁氮雜環庚-4-基)-N-(吡啶-3-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.73 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.58 (d, J = 4.0 Hz, 1 H), 8.38 (s, 1 H), 7.86 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.39 - 7.35 (m, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.32 (s, 2 H), 3.80 (t, J = 6.0 Hz, 2 H), 3.75 - 3.73 (m, 2 H), 3.37 (t, J = 7.6 Hz, 2 H), 3.10 (t, J = 6.4 Hz, 2 H), 2.79 - 2.75 (m, 4 H), 1.95 - 1.91 (m, 2 H)。 LCMS RT = 0.429 min, m/z = 501.2 0.0203
I-194 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-[(2R)-2-甲基𠰌啉-4-基]-N-(吡啶-3-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.73 (s, 1 H), 8.59 (d, J = 4.4 Hz, 1 H), 8.38 (s, 1 H), 7.86 - 7.83 (m, 1 H), 7.38 - 7.35 (m, 1 H), 6.91 (t, J = 51.2 Hz, 1 H), 5.31 (s, 2 H), 3.87 - 3.67 (m, 1 H), 3.66 - 3.64 (m, 2 H), 3.64 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.89 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.74 - 2.67 (m, 2 H), 2.24 - 2.23 (m, 1 H), 1.92 (t, J = 6.8 Hz, 1 H), 1.17 (d, J = 6.8 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 0.748 min, m/z = 501.2 0.0267
I-195 N-(5-氯吡啶-3-基)-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-3-(𠰌啉-4-基)丙醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.62 (s, 1 H), 8.44 (s, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 7.72 (s, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.18 (s, 2 H), 3.17 - 3.69 (m, 8 H), 2.86 - 2.83 (m, 2 H), 2.44 - 2.41 (m, 2 H)。 LCMS RT = 1.381 min, m/z = 485.3 0.312
I-196 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-[(1R,4R)-2-氧雜-5-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-基]-N-(吡啶-3-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.74 (s, 1 H), 8.59 (d, J = 4.0 Hz, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 7.87 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.39 - 7.35 (m, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.36 - 5.27 (m, 2 H), 4.48 (s, 1 H), 4.05 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 3.70 - 3.66 (m, 2 H), 3.43 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 3.26 - 3.13 (m, 2 H), 3.03 (d, J = 10.0 Hz, 1 H), 2.66 (d, J = 10.4 Hz, 1 H), 1.95 - 1.85 (m, 2 H)。 LCMS RT = 1.117 min, m/z = 499.2 0.0497
I-197 N-(5-氯吡啶-3-基)-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-[(2R)-2-甲基𠰌啉-4-基]乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.63 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.54 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 7.91 (t, J = 2.0 Hz, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.30 (s, 2 H), 3.93 - 3.85 (m, 1 H), 3.72 - 3.60 (m, 2 H), 3.36 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.88 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.75 - 2.65 (m, 2 H), 2.28 - 2.17 (m, 1 H), 1.91 (t, J = 10.8 Hz, 1 H), 1.17 (d, J = 6.4 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.558 min, m/z = 535.2 0.0472
I-198 N-(5-氯吡啶-3-基)-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)丙醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.62 (s, 1 H), 8.44 - 8.35 (m, 2 H), 7.67 (t, J = 2.0 Hz, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.18 (s, 2 H), 2.18 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.13 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.929 min, m/z = 400.2 0.299
I-199 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(吡啶-3-基)丙醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.64 (d, J = 4.0 Hz, 1 H), 8.53 (s, 1 H), 8.37 (s, 1 H), 7.61 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.42 - 7.36 (m, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.20 (s, 2 H), 2.15 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.12 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.372 min, m/z = 366.2 0.355
I-200 1-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-1H,2H,3H,4H,5H-吡啶并[4,3-b]氮呯-2-酮 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.56 (d, J = 5.2 Hz, 1 H), 8.46 (s, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 7.36 (d, J = 5.6 Hz, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.33 (s, 2 H), 2.80 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 2.44 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 2.36 - 2.24 (m, 2 H)。 LCMS RT = 0.993 min, m/z = 378.2 0.125
I-201 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(5-氟吡啶-3-基)-2-[(1S,4S)-2-氧雜-5-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-基]乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.57 (s, 1 H), 8.46 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 7.70 - 7.62 (m, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.39 - 5.25 (m, 2 H), 4.46 (s, 1 H), 4.00 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 3.69 - 3.64 (m, 1 H), 3.52 (s, 1 H), 3.34 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 3.19 - 3.07 (m, 2 H), 2.94 (d, J = 10.0 Hz, 1 H), 2.56 (d, J = 10.0 Hz, 1 H), 1.89 - 1.79 (m, 2 H)。 LCMS RT = 0.459 min, m/z = 517.2 0.0207
I-202 N-(5-氯吡啶-3-基)-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-[(2S)-2-甲基𠰌啉-4-基]乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.63 (s, 1 H), 8.54 (s, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 7.91 (s, 1 H), 6.91 (t, J = 51.2 Hz, 1 H), 5.30 (s, 2 H), 3.94 - 3.85 (m, 1 H), 3.74 - 3.62 (m,  2 H), 3.43 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.88 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.72 (t, J = 12.8 Hz, 2 H), 2.28 - 2.17 (m, 1 H), 1.92 (t, J = 9.6 Hz, 1 H), 1.17 (d, J = 6.0 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.561 min, m/z = 535.2 0.0127
I-203 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(5-氟吡啶-3-基)-2-[(2S)-2-甲基𠰌啉-4-基]乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.58 (s, 1 H), 8.47 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.40 (s, 1 H), 7.68 (d, J = 9.2 Hz, 1 H), 6.92 (t, J = 51.2 Hz, 1 H), 5.32 (s, 2 H), 3.91 - 3.71 (m, 1 H), 3.72 - 3.64 (m, 2 H), 3.41 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.91 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 2.73 (t, J = 12.8 Hz, 2 H), 2.29 - 2.22 (m, 1 H), 1.96 - 1.94 (m, 1 H), 1.17 (d, J = 6.4 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.660 min, m/z = 519.0 0.0254
I-204 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(5-氟吡啶-3-基)-2-[(2R)-2-甲基𠰌啉-4-基]乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.58 (s, 1 H), 8.47 (s, 1 H), 8.40 (s, 1 H), 7.70 - 7.66 (m, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.32 (s, 2 H), 3.89 (d, J = 9.6 Hz, 1 H), 3.70 - 3.60 (m, 2 H), 3.37 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.88 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.72 - 2.65 (m, 2 H), 2.26 - 2.20 (m, 1 H), 1.91 (t, J = 10.4 Hz, 1 H), 1.17 (d, J = 6.0 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.664 min, m/z = 518.9 0.0336
I-205 N-(5-氯吡啶-3-基)-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-[(1R,4R)-2-氧雜-5-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-基]乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.62 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.54 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.40 (s, 1 H), 7.91 (t, J = 2.0 Hz, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.40 - 5.21 (m, 2 H), 4.47 (s, 1 H), 4.02 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 3.68 - 3.63 (m, 1 H), 3.56 (s, 1 H), 3.35 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 3.25 - 3.05 (m, 2 H), 3.01 - 2.90 (m, 1 H), 2.59 (d, J = 10.0 Hz, 1 H), 1.93 - 1.80 (m, 2 H)。 LCMS RT = 0.919 min, m/z = 533.2 0.0159
I-206 N-(5-氯吡啶-3-基)-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-[(1S,4S)-2-氧雜-5-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-基]乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.62 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.54 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 7.91 (t, J = 2.0 Hz, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.37 - 5.25 (m, 2 H), 4.46 (s, 1 H), 4.01 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 3.69 - 3.62 (m, 1 H), 3.51 (s, 1 H), 3.31 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 3.18 - 3.07 (m, 2 H), 2.93 (d, J = 10.0 Hz, 1 H), 2.56 (d, J = 9.6 Hz, 1 H), 1.89 - 1.84 (q, J = 7.2 Hz, 2 H)。 LCMS RT = 0.472 min, m/z = 533.2 0.0162
I-207 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-{5-[(1S)-1-氟乙基]吡啶-3-基}乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.67 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.56 (s, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 7.83 (s, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.79 - 5.60 (m, 1 H), 5.30 (s, 2 H), 3.21 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.69 - 1.55 (m, 3 H), 1.46 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.500 min, m/z = 447.8 0.0137
I-208 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-{5-[(1R)-1-氟乙基]吡啶-3-基}乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.67 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.56 (s, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 7.83 (s, 1 H), 6.91 (t, J = 52.0 Hz, 1 H), 5.78 - 5.62 (m, 1 H), 5.30 (s, 2 H), 3.21 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.74 - 1.62 (m, 3 H), 1.46 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.503 min, m/z = 447.8 0.027
I-209 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(5-氟吡啶-3-基)丙醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.54 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.39 - 8.35 (m, 2 H), 7.44 - 7.40 (m, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.19 (s, 2 H), 2.19 (q, J = 6.8 Hz, 2 H), 1.13 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.755 min, m/z = 384.2 0.284
I-210 1-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-1,2,3,4-四氫-1,6-㖠啶-2-酮 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.49 - 8.37 (m, 3 H), 7.19 (d, J = 5.6 Hz, 1 H), 6.89 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.46 (s, 2 H), 3.10 - 3.01 (m, 2 H), 2.91 - 2.80 (m, 2 H)。 LCMS RT = 0.971 min, m/z = 364.2 0.0487
I-211 (2R)-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(吡啶-3-基)丁烷-2-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.70 (s, 1 H), 8.57 - 8.55 (m, 1 H), 8.35 (s, 1 H), 7.87 - 7.82 (m, 1 H), 7.38 - 7.32 (m, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.38 - 5.20  (m, 2 H), 3.14 - 3.06 (m, 1 H), 2.13 - 2.05 (m, 1 H), 1.72 - 1.65 (m, 1 H), 1.45 (d, J = 6.8 Hz, 3 H), 1.04 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 0.563 min, m/z = 430.1 0.0137
I-212 (2S)-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(吡啶-3-基)丁烷-2-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.70 (s, 1 H), 8.58 - 8.55 (m, 1 H), 8.35 (s, 1 H), 7.89 - 7.86 (m, 1 H), 7.34 (q, J = 4.8 Hz, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.39 - 5.23 (m, 2 H), 3.14 - 3.06 (m, 1 H), 2.14 - 2.04 (m, 1 H), 1.74 - 1.65 (m, 1 H), 1.45 (d, J = 6.8 Hz, 3 H), 1.04 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 0.563 min, m/z = 430.1 0.0105
I-213 N-(5-氰基吡啶-3-基)-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-(𠰌啉-4-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.96 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.82 (s, 1 H), 8.41 (s, 1 H), 8.19 (s, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.33 (s, 2 H), 3.74 (t, J = 4.8 Hz, 4 H), 3.38 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.89 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 2.50 (t, J = 4.8 Hz, 4 H)。 LCMS RT = 1.295 min, m/z = 512.2 0.0902
I-214 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(5-氟吡啶-3-基)-2-(𠰌啉-4-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.59 (s, 1 H), 8.47 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.40 (s, 1 H), 7.71 - 7.67 (m, 1 H), 6.93 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.33 (s, 2 H), 3.78 - 3.72 (m, 4 H), 3.40 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.91 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.53 - 2.51 (m, 4 H)。 LCMS RT = 0.908 min, m/z = 505.2 0.0154
I-215 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(吡啶-3-基)丁烷-2-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.72 (d, J = 2.8 Hz, 1 H), 8.58 - 8.56 (m, 1 H), 8.35 (s, 1 H), 7.89 - 7.86 (m, 1 H), 7.36 (q, J = 4.8 Hz, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.37 - 5.26 (m, 2 H), 3.14 - 3.05 (m, 1 H), 2.12 - 2.06 (m, 1 H), 1.75 - 1.69 (m, 1 H), 1.45 (d, J = 6.8 Hz, 3 H), 1.04 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 0.560 min, m/z = 430.1 0.00675
I-216 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-{5-[(1S)-1-氟乙基]吡啶-3-基}甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.68 (s, 1 H), 8.58 (s, 1 H), 8.42 (s, 1 H), 7.84 (s, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.80 - 5.61 (m, 1 H), 5.29 (s, 2 H), 3.11 (s, 3 H), 1.75 - 1.55 (m, 3 H)。 LCMS RT = 0.550 min, m/z = 434.1 0.0119
I-217 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-{5-[(1R)-1-氟乙基]吡啶-3-基}甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.70 (s, 1 H), 8.58 (s, 1 H), 8.42 (s, 1 H), 7.86 (s, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.81 - 5.60 (m, 1 H), 5.29 (s, 2 H), 3.11 (s, 3 H), 1.75 - 1.55 (m, 3 H)。 LCMS RT = 0.551 min, m/z = 434.1 0.0236
I-218 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-[5-(1-氟乙基)吡啶-3-基]甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.68 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.57 (s, 1 H), 8.41 (s, 1 H), 7.84 (s, 1 H), 6.91 (t, J = 51.2 Hz, 1 H), 5.79 - 5.62 (m, 1 H), 5.28 (s, 2 H), 3.11 (s, 3 H), 1.75 - 1.55 (m, 3 H)。 LCMS RT = 0.545 min, m/z = 434.1 0.0369
I-219 2-氰基-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(5-甲基吡啶-3-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.52 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.47 (s, 1 H), 8.45 (s, 1 H), 7.65 (s, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.28 (s, 2 H), 3.53 (t, J = 7.6 Hz, 2 H), 2.98 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 2.39 (s, 3 H)。 LCMS RT = 0.507 min, m/z = 441.1 0.0202
I-220 N-[5-(二氟甲氧基)吡啶-3-基]-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-2-(𠰌啉-4-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.61 (s, 1 H), 8.46 (s, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 7.70 (s, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 6.59 (t, J = 72.0 Hz, 1 H), 5.31 (s, 2 H), 3.77 - 3.69 (m, 4 H), 3.38 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.89 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 2.54 - 2.46 (m, 4 H)。 LCMS RT = 1.504 min, m/z = 553.2 0.0184
I-221 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(6-乙基吡啶-3-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.58 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.37 (s, 1 H), 7.75 - 7.70 (m, 1 H), 7.22 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.7 (s, 2 H), 3.20 (q, J = 7.6 Hz , 2 H), 2.83 (q, J = 7.6 Hz , 2 H), 1.46 (t, J = 7.2 Hz, 3 H), 1.30 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.134 min, m/z = 430.2 0.033
I-222 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-[5-(2-氟丙-2-基)吡啶-3-基]甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.64 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.60 (s, 1 H), 8.42 (s, 1 H), 7.86 (t, J = 2.0 Hz, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.28 (s, 2 H), 3.11 (s, 3 H), 1.75 (s, 3 H), 1.69 (s, 3 H)。 LCMS RT = 1.499 min, m/z = 447.9 0.0376
I-223 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(5-氟吡啶-3-基)-2-甲基丙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.58 (s, 1 H), 8.47 (d, J = 2.8 Hz, 1 H), 8.40 (s, 1 H), 7.68 - 7.62 (m, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.29 (s, 2 H), 3.05 (d, J = 2.0 Hz, 2 H), 2.40 - 2.30 (m, 1 H), 1.12 (d, J = 6.8 Hz, 6 H)。 LCMS RT = 1.790 min, m/z = 447.9 0.00563
I-224 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-[5-(2,2-二氟丙氧基)吡啶-3-基]甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.42 (s, 1 H), 8.39 - 8.33 (m, 2 H), 7.48 - 7.41 (m, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.28 (s, 2 H), 4.18 (t, J = 11.2 Hz, 2 H), 3.11 (s, 3 H), 1.79 (t, J = 18.8 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.492 min, m/z = 482.2 0.0204
I-225 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-[5-(2,2-二氟丙氧基)吡啶-3-基]乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.42 - 8.36 (m, 2 H), 8.33 (s, 1 H), 7.45 (s, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.30 (s, 2 H), 4.17 (t, J = 11.2 Hz, 2 H), 3.21 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.79 (t, J = 18.8 Hz, 3 H), 1.46 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.559 min, m/z = 496.2 0.00601
I-226 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-[5-(2-氟丙-2-基)吡啶-3-基]乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.66 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.59 (d, J = 1.2 Hz, 1 H), 8.40 (s, 1 H), 7.91 - 7.86 (m, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.30 (s, 2 H), 3.21 (q, J = 6.8 Hz, 2 H), 1.75 (s, 3 H), 1.69 (s, 3 H), 1.47 (t, J = 6.4 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.510 min, m/z = 462.2 0.0319
I-227 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-[5-(1-氟乙基)吡啶-3-基]乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.67 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.56 (s, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 7.83 (s, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.79 - 5.62 (m, 1 H), 5.30 (s, 2 H), 3.21 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.74 - 1.56 (m, 3 H), 1.47 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.518 min, m/z = 447.9 0.0123
I-228 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(6-乙基吡啶-3-基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.54 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 7.93 - 7.88 (m, 1 H), 7.35 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.17 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.31 (s, 2 H), 3.12 (s, 3 H), 2.78 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.24 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 0.981 min, m/z = 416.2 0.0435
I-229 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(5-乙基吡啶-3-基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.51 (s, 1 H), 8.42 (s, 1 H), 8.40 (s, 1 H), 7.89 (s, 1 H), 7.18 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.35 (s, 2 H), 3.14 (s, 3 H), 2.69 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.25 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.099 min, m/z = 416.2 0.0248
I-230 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(5-乙基吡啶-3-基)-2-甲氧基乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.50 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.38 (s, 1 H), 8.35 (s, 1 H), 7.88 (s, 1 H), 7.18 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.31 (s, 2 H), 3.82 (t, J = 5.6 Hz, 2 H), 3.48 (t, J = 5.2 Hz, 2 H), 3.43 (s, 3 H), 2.69 (q, J = 5.2 Hz, 2 H), 1.24 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.752 min, m/z = 460.2 0.033
I-231 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-{4H,6H,7H-吡唑并[3,2-c][1,4]㗁𠯤-2-基}乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.39 (s, 1 H), 6.90 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 6.12 (s, 1 H), 5.38 (s, 2 H), 4.77 (s, 2 H), 4.12 - 4.06 (m, 4 H), 3.27 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.42 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 0.552 min, m/z = 447.1 0.0924
I-232 N-[5-(二氟甲氧基)吡啶-3-基]-N-({5-[5-(三氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.63 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.51 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.46 (s, 1 H), 7.70 (s, 1 H), 6.61 (t, J = 71.6 Hz, 1 H), 5.30 (s, 2 H), 3.13 (s, 3 H)。 LCMS RT = 1.766 min, m/z = 471.8 0.0342
I-233 N-[5-(二氟甲氧基)吡啶-3-基]-N-({5-[5-(三氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)丙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.59 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.47 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.42 (s, 1 H), 7.67 (t, J = 2.4 Hz, 1 H), 6.59 (t, J = 72.0 Hz, 1 H), 5.29 (s, 2 H), 3.19 - 3.11 (m, 2 H), 1.97 - 1.88 (m, 2 H), 1.08 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 2.013 min, m/z = 499.9 0.0606
I-234 N-(5-氰基吡啶-3-基)-N-({5-[5-(三氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)丙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.95 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.82 (s, 1 H), 8.44 (s, 1 H), 8.16 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 5.29 (s, 2 H), 3.18 - 3.11 (m, 2 H), 2.00 - 1.80 (m, 2 H), 1.09 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.811 min, m/z = 459.2 0.184
I-235 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(1H-咪唑-5-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.43 (s, 1 H), 7.99 (s, 1 H), 7.39 - 7.03 (m, 2 H), 5.30 (s, 2 H), 3.39 - 3.28 (m, 2 H), 1.40 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.848 min, m/z = 390.8 0.323
I-236 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(6-甲基吡啶-2-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.39 (s, 1 H), 7.61 (t, J = 8.0 Hz, 1  H), 7.45 (d, J = 8.4 Hz, 1  H), 7.01 (s, 1 H), 6.89 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.60 (s, 2 H), 3.27 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 2.52 (s, 3 H), 1.37 (t, J = 7.4 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.704 min, m/z = 416.2 0.0592
I-237 N-(3-氟苯基)-N-({5-[5-(三氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.41 (s, 1 H), 7.44 - 7.36 (m, 1 H), 7.30 - 7.27 (m, 1 H), 7.24 - 7.20 (m, 1 H), 7.12 - 7.05 (m, 1 H), 5.27 (s, 2 H), 3.07 (s, 3 H)。 LCMS RT = 1.912 min, m/z = 422.8 0.0992
I-238 N-({5-[5-(三氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-[5-(三氟甲基)吡啶-3-基]甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.95 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.87 (s, 1 H), 8.46 (s, 1 H), 8.12 (t, J = 2.0 Hz, 1 H), 5.31 (s, 2 H), 3.12 (s, 3 H)。 LCMS RT = 1.905 min, m/z = 473.8 0.256
I-239 N-(5-環丙基吡啶-3-基)-N-({5-[5-(三氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.46 (s, 1 H), 8.42 (s, 1 H), 8.37 (s, 1 H), 7.45 (t, J = 2.4 Hz, 1 H), 5.26 (s, 2 H), 3.09 (s, 3 H), 2.00 - 1.90 (m, 1 H), 1.11 - 1.08 (m, 2 H), 0.78 - 0.75 (m, 2 H)。 LCMS RT = 1.621 min, m/z = 445.9 0.085
I-240 N-(5-氯吡啶-3-基)-N-({5-[5-(三氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.62 (s, 1 H), 8.57 (s, 1 H), 7.89 (s, 1 H), 5.28 (s, 2 H), 3.11 (s, 3 H)。 LCMS RT = 2.259 min, m/z = 440.1 0.062
I-241 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-[5-(2-甲氧基乙基)吡啶-3-基]乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.50 (s, 1 H), 8.48 (s, 1 H), 7.80 (s, 1 H), 7.65 (s, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.80 (s, 2 H), 3.60 (t, J = 6.0 Hz, 2 H), 3.33 (s, 3 H), 3.08 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 2.85 (t, J = 6.0 Hz, 2 H), 1.40 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 0.718 min, m/z = 460.2 0.994
I-242 N-(3-氟苯基)-N-({5-[5-(三氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)丙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.41 (s, 1 H), 7.43 - 7.37 (m, 1 H), 7.27 - 7.26 (m, 1 H),  7.25 - 7.22 (m, 1 H), 7.10 - 7.05 (m, 1 H), 5.30 (s, 2 H), 3.15 - 3.10 (m, 2 H), 1.97 - 1.89 (m, 2 H), 1.09 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 2.207 min, m/z = 450.8 0.053
I-243 N-(5-氰基吡啶-3-基)-N-({5-[5-(三氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.96 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.82 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.44 (s, 1 H), 8.17 (t, J = 2.0 Hz, 1 H), 5.30 (s, 2 H), 3.21 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.45 (t, J = 7.2 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.718 min, m/z = 444.8 0.129
I-244 N-(5-氯吡啶-3-基)-N-({5-[5-(三氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)丙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.61 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.55 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.42 (s, 1 H), 7.88 (t, J = 2.0 Hz, 1 H), 5.28 (s, 2 H), 3.19 - 3.11 (m, 2 H), 1.97 - 1.82 (m, 2 H), 1.09 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 2.027 min, m/z = 467.8 0.0872
I-245 (3R)-1-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-3-甲基-1H,2H,3H,4H,5H-吡啶并[3,4-b]氮呯-2-酮 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.96 (s, 1 H), 8.52 (d, J = 5.2 Hz, 1 H), 8.38 (s, 1 H), 7.52 (d, J = 5.2 Hz, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.47 - 5.27 (m, 2 H), 3.09 - 3.04 (m, 1 H), 2.83 - 2.78 (m, 1 H), 2.51 - 2.47 (m, 1 H), 2.26 - 2.21 (m, 1 H), 2.18 - 2.11 (m, 1 H), 1.16 (d, J = 6.4 Hz, 3 H) LCMS RT = 1.250 min, m/z = 392.3。 1.42
I-246 (3S)-1-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-3-甲基-1H,2H,3H,4H,5H-吡啶并[3,4-b]氮呯-2-酮 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.91 (s, 1 H), 8.50 (d, J = 5.2 Hz, 1 H), 8.37 (s, 1 H), 7.47 (d, J = 5.2 Hz, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.46 - 5.28 (m, 2 H), 3.11 - 2.85 (m, 1 H), 2.84 - 2.71 (m, 1 H), 2.548 - 2.45 (m, 1 H), 2.29 - 2.14 (m, 1 H), 2.18 - 2.07 (m, 1 H), 1.16 (d, J = 6.4 Hz, 3 H) LCMS RT = 1.251 min, m/z = 392.3。 0.039
I-247 1'-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-1',2'-二氫螺[環丙烷-1,3'-吡咯并[2,3-c]吡啶]-2'-酮 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.47 (s, 1 H), 8.44 - 8.40 (m, 2 H), 7.07 (d, J = 5.2 Hz, 1 H), 6.90 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.43 (s, 2 H), 2.17 - 2.10 (m, 2 H), 1.93 - 1.86 (m, 2 H) LCMS RT = 0.970 min, m/z = 376.2。 0.158
I-248 (4S)-1-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-4-甲基-1,2,3,4-四氫-1,7-㖠啶-2-酮 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.54 (s, 1 H), 8.41 (s, 1 H), 8.35 (d, J = 4.8 Hz, 1 H), 7.19 (d, J = 4.8 Hz, 1 H), 6.89 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.62 - 5.46 (m, 2 H), 3.23 - 3.16 (m, 1 H), 2.92 - 2.84 (m, 1 H), 2.66 - 2.55 (m, 1 H), 1.38 (d, J = 6.8 Hz, 3 H) LCMS RT =1.098 min, m/z = 378.3。 0.034
I-249 (4R)-1-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-4-甲基-1,2,3,4-四氫-1,7-㖠啶-2-酮 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.53 (s, 1 H), 8.40 (s, 1 H), 8.34 (d, J = 4.8 Hz, 1 H), 7.18 (d, J = 4.8 Hz, 1 H), 6.90 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.60 - 5.46 (m, 2 H), 3.23 - 3.15 (m, 1 H), 2.90 - 2.81 (m, 1 H), 2.64 - 2.55 (m, 1 H), 1.38 (d, J = 6.8 Hz, 3 H) LCMS RT = 1.028 min, m/z = 378.2。 0.089
I-250 (3R)-1-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-3-甲基-1,2,3,4-四氫-1,7-㖠啶-2-酮 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.54 (s, 1 H), 8.41 (s, 1 H), 8.31 (d, J = 3.6 Hz, 1 H), 7.18 (d, J = 4.4 Hz, 1 H), 6.89 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.62 - 5.36 (m, 2 H), 3.09 - 3.02 (m, 1 H), 2.89 - 2.79 (m, 2 H), 1.35 (d, J = 6.8 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 0.684 min, m/z = 378.2。 0.041
I-251 (3S)-1-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-3-甲基-1,2,3,4-四氫-1,7-㖠啶-2-酮 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.52 (s, 1 H), 8.41 (s, 1 H), 8.30 (d, J = 4.4 Hz, 1 H), 7.17 (d, J = 4.8 Hz, 1 H), 6.89 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.62 - 5.36 (m, 2 H), 3.09 - 3.02 (m, 1 H), 2.89 - 2.79 (m, 2 H), 1.34 (d, J = 6.8 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 0.521 min, m/z = 378.2。 0.034
I-252 1-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-3-甲基-1H,2H,3H,4H,5H-吡啶并[3,4-b]氮呯-2-酮 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.77 (s, 1 H), 8.46 (d, J = 4.8 Hz, 1 H), 8.37 (s, 1 H), 7.30 (d, J = 4.4 Hz, 1 H), 6.90 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.37 (s, 2 H), 2.99 - 2.90 (m, 1 H), 2.70 - 2.66 (m, 1 H), 2.55 - 2.49 (m, 1 H), 2.23 - 2.14 (m, 1 H), 2.18 - 2.04 (m, 1 H), 1.16 (d, J = 6.4 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.229 min, m/z = 392.3。 0.073
I-253 1-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-3,3-二甲基-1H,2H,3H,4H,5H-吡啶并[3,4-b]氮呯-2-酮 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.84 (s, 1 H), 8.47 (s, 1 H), 8.40 (s, 1 H), 7.42 (s, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.37 (s, 2 H), 2.91 (t, J = 6.0 Hz, 2 H), 2.18 (t, J = 6.4 Hz, 2 H), 1.04 (s, 6 H) LCMS RT = 1.946 min, m/z = 405.9。 0.035
I-254 1-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-3,3-二甲基-1H,2H,3H-吡咯并[2,3-c]吡啶-2-酮 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.45 - 8.43 (m, 2 H), 8.29 (s, 1 H), 7.24 (d, J = 4.8 Hz, 1 H), 6.89 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.33 (s, 2 H), 1.49 (s, 6 H) LCMS RT = 0.408 min, m/z = 378.1。 0.149
1-255 1-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-3-甲基-1,2,3,4-四氫-1,7-㖠啶-2-酮 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.59 (s, 1 H), 8.42 (s, 1 H), 8.34 (d, J = 4.8 Hz, 1 H), 7.26 (d, J = 4.8 Hz, 1 H), 6.90 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.63 - 5.37 (m, 2 H), 3.13 - 3.06 (m, 1 H), 2.92 - 2.80 (m, 2 H), 1.36 (d, J = 6.4 Hz, 3 H) LCMS RT = 0.583 min, m/z = 378.2。 0.036
I-256 1-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-4-甲基-1,2,3,4-四氫-1,7-㖠啶-2-酮 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.58 (s, 1 H), 8.45 - 8.34 (m, 2 H), 7.25 (d, J = 4.8 Hz, 1 H), 6.89 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.62 - 5.47 (m, 2 H), 3.27 - 3.20 (m, 1 H), 2.94 - 2.82 (m, 1 H), 2.67 - 2.56 (m, 1 H), 1.40 (d, J = 6.8 Hz, 3 H) LCMS RT = 0.580 min, m/z = 378.2。 0.057
I-257 N-[5-(二氟甲氧基)吡啶-3-基]-N-({2-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-5-基}甲基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.48 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.40 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 7.90 (s, 1 H), 7.77 (t, J = 2.4 Hz, 1 H), 7.23 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 6.97 (t, J = 72.8 Hz, 1 H), 5.35 (s, 2 H), 3.31 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.41 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) LCMS RT = 1.251 min, m/z = 468.2。 0.231
I-258 3-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-2-醇 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.40 (s, 1 H), 7.65 (s, 1 H), 7.50 (d, J = 6.8 Hz, 1 H), 7.17 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 6.94 (d, J = 6.8 Hz, 1 H), 4.27 (s, 2 H) LCMS RT = 0.778 min, m/z = 350.2。 0.069
I-259 N-(5-氯吡啶-3-基)-N-({2-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-5-基}甲基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.55 - 8.51 (m, 2 H), 8.05 (t, J = 2.4 Hz, 1 H), 7.92 (s, 1 H), 7.25 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.36 (s, 2 H), 3.34 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.42 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) LCMS RT = 1.273 min, m/z = 436.2。 0.121
I-260 N-({2-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-5-基}甲基)-N-(吡啶-3-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.58 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.52 - 8.48 (m, 1 H), 7.98 (s, 1 H), 7.87 - 7.66 (m, 1 H), 7.56 (t, J = 51.2 Hz, 1 H), 7.45 - 7.42 (m, 1 H), 5.34 (s, 2 H), 3.37 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.30 (t, J = 7.2 Hz, 3 H) LCMS RT = 0.821 min, m/z = 402.2。 0.333
I-261 N-(3-氯苯基)-N-({2-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-5-基}甲基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.00 (s, 1 H), 7.56 (t, J = 51.2 Hz, 1 H), 7.41 - 7.36 (m, 4 H), 5.32 (s, 2 H), 3.36 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.29 (t, J = 8.0 Hz, 3 H) LCMS RT = 1.554 min, m/z = 435.1。 0.089
I-262 N-(5-氯吡啶-3-基)-N-({2-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-5-基}甲基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.61 - 8.47 (m, 2 H), 8.05 (t, J = 2.4 Hz, 1 H), 7.93 (s, 1 H), 7.23 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.32 (s, 2 H), 3.16 (s, 3 H) LCMS RT = 1.643 min, m/z = 422.1。 0.110
I-263 N-({2-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-5-基}甲基)-N-(5-氟吡啶-3-基)甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.48 (s, 1 H), 8.46 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 7.93 (s, 1 H), 7.88 - 7.82 (m, 1 H), 7.23 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.33 (s, 2 H), 3.16 (s, 3 H) LCMS RT = 1.478 min, m/z = 406.1。 0.108
I-264 N-({2-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-5-基}甲基)-N-(5-氟吡啶-3-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.48 (s, 1 H), 8.45 (d, J = 2.8 Hz, 1 H), 7.91 (s, 1 H), 7.86 - 7.80 (m, 1 H), 7.24 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.35 (s, 2 H), 3.31 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.41 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)。 LCMS RT = 1.618 min, m/z = 420.2。 0.087
I-265 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-[5-(三氟甲氧基)吡啶-3-基]甲烷磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.72 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 8.56 (s, 1 H), 8.44 (s, 1 H), 7.80 (s, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.30 (s, 2 H), 3.11 (s, 3 H) LCMS RT = 1.950 min, m/z = 472.1。 0.048
I-266 2-氰基-N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-(吡啶-3-基)乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.70 (d, J = 2.8 Hz, 1 H), 8.52 (d, J = 3.6 Hz, 1 H), 8.44 (s, 1 H), 8.07 - 8.01 (m, 1 H), 7.54 - 7.49 (m, 1 H), 7.21 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.41 (s, 2 H), 3.72 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 3.05 (t, J = 7.2 Hz, 2 H)。 LCMS RT = 1.287 min, m/z = 426.8。 0.042
I-267 N-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-N-[5-(三氟甲氧基)吡啶-3-基]乙烷-1-磺醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.71 (s, 1 H), 8.54 (s, 1 H), 8.41 (s, 1 H), 7.79 (s, 1 H), 6.92 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.30 (s, 2 H), 3.22 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.45 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) LCMS RT = 0.328 min, m/z = 486.1 0.044
I-268 3-[({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)(吡啶-3-基)胺磺醯基]丙醯胺 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.75 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 8.62 - 8.55 (m, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 7.90 - 7.84 (m, 1 H), 7.40 - 7.33 (m, 1 H), 6.91 (t, J = 52.0 Hz, 1 H), 5.27 (s, 2 H), 3.58 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 2.81 (t, J = 7.2 Hz, 2 H)。 LCMS RT = 0.783 min, m/z = 444.9。 0.013
I-269 1-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-1H,2H,3H,4H,5H-吡啶并[3,4-b]氮呯-2-酮 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.77 (s, 1 H), 8.46 (s, 1 H), 8.38 (s, 1 H), 7.28 (s, 1 H), 6.91 (t, J = 51.6 Hz, 1 H), 5.36 (s, 2 H), 2.84 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.49 - 2.37 (m, 2 H), 2.37 - 2.23 (m, 2 H)。 LCMS RT = 1.043 min, m/z = 378.2 0.018
I-270 1-({5-[5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基]-1,3-噻唑-2-基}甲基)-1,2,3,4-四氫喹啉 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.57 (s, 1 H), 7.51 (t, J = 51.2 Hz, 1 H), 7.00 - 6.90 (m, 2 H), 6.60 - 6.55 (m, 2 H), 4.86 (s, 2 H), 3.47 (t, J = 5.6 Hz, 2 H), 2.75 (t, J = 6.0 Hz, 2 H), 2.02 - 1.92 (m, 2 H) LCMS RT = 1.769 min, m/z = 349.2 0.539
實例 2 . 式 ( II ) 之各種 HDAC6 抑制劑之合成、生物化學活性及效能
根據WO 2021/067859中所揭示之方法來合成本文中所揭示之化合物，尤其係式(II)化合物，該案以全文引用之方式併入本文中。在生物化學分析中測試此等化合物對HDAC6之效能及對HDAC1之選擇性。採用發光HDAC-Glo I/II分析法(Promega)進行生物化學分析，且量測HDAC6及HDAC1重組蛋白之相對活性。首先分別在存在HDAC6或HDAC1之情況下培育化合物，隨後添加發光受質。使用盤讀取器獲取資料且相應地根據資料計算生物化學IC 50。資料列於表4中。根據此等研究，確定本發明之化合物相對於HDAC1為HDAC6之選擇性抑制劑，提供約5至約30,0000之選擇性比率。 表 4 . 所揭示之式 ( II ) 及式 ( III ) 異羥肟酸化合物之 HDAC6 活性。
化合物編號 HDAC6 IC50 (nM)
1 136
II-1 12.5
II-6 1.61
II-4 16.7
II-24 146
II-5 6.68
II-7A 1.5
II-7B 4.13
II-2 104
II-10 76.6
II-3 73
III-1 8.26
III-4 1.8
II-9A 0.351
III-2 0.677
III-3 3.35
II-9B 0.791
II-11 0.639
II-19 0.425
II-18 1.68
II-16 1.61
II-8B 0.275
II-13 73
II-14 28.3
II-17 1.12
4 1.2
II-25 0.669
III-9 0.595
II-21 0.601
II-22 3.36
II-23 1.59
I-1a 1.79
III-5 2.04
II-12B 0.809
III-10 2.3
III-7 1.1
III-6 4.06
III-8 10.3
II-15 2.64
II-20 3.78
II-8A 1.65
5 1.49
II-26A 4.57
II-26B 2.23
6 2.54
II-27 1.13
II-28A 1.81
II-29 13.2
II-30A 1.36
II-30B 7.91
II-31 13.8
II-32 13
II-33 27.9
II-34 2.32
II-35 21.7
II-36 5.22
實例2中所描述之式(II)化合物之結構、化學名稱及表徵提供於表5中。 表 5 . 式 ( II ) 及式 ( III ) 化合物之結構、化學名稱及表徵。
胺 化合物 表徵資料
2-胺基-N, 2-二甲基丙醯胺 II-33 1H NMR (400 MHz, MeOH- d4) δ 8.24 (s, 1 H), 7.62 (s, 1 H), 7.59 (s, 1 H), 2.69-2.65 (m, 3 H), 1.59 (s, 6 H)。 LC-MS：t R(min) 1.32 (含有0.1% TFA之20-100% ACN 6 min)，m/z [M+H] +C 11H 15FN 4O 2需要：270.3，實驗值：271.1 HPLCt R(min) 1.57，95% (含有0.1% TFA之20-100% ACN 10 min)。
3-胺基-1-甲基哌啶-2-酮 II-35 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 11.1-10.9 (br, s, 1 H), 8.98 (s, 1 H), 8.25 (s, 1 H), 7.73-7.53 (m, 1 H), 7.29-7.04 (m, 1 H), 4.80-4.50 (m, 1 H), 3.33-3.28 (m, 2 H), 2.83 (s, 3 H), 2.16-2.00 (m, 1 H), 1.90 (br, s, 3 H)。 LC-MS：tR (min) 1.28 (含有0.1% TFA之20-100% ACN 6 min)，m/z [M+H] +C 12H 15FN 4O 2需要：282.3，實驗值：283.1 HPLCtR (min) 3.66，95% (含有0.1% TFA之20-100% ACN 10 min)。
(S)-1-環丙基乙-1-胺 II-26A 1H NMR (400 MHz, MeOH- d4) δ 7.98 (s, 1 H), 7.32 (d, J=1.71 Hz, 1 H), 7.29 (d, J=1.71 Hz, 1 H), 3.45-3.35 (m, 1 H), 1.07 (d, J=6.60 Hz, 3 H), 0.86-0.74 (m, 1 H), 0.33-0.01 (m, 4 H)。 LC-MS：t R(min) 2.03 (含有0.1% TFA之20-100% ACN 6 min)，m/z [M+H] +C 11H 12FN 3O 2需要：239.3，實驗值：240.1 HPLCt R(min) 4.37，95% (含有0.1% TFA之20-100% ACN 10 min)。
(R)-1-環丙基乙-1-胺 II-26B 1H NMR (400 MHz, MeOH- d4) δ 7.98 (s, 1 H), 7.32 (d, J=1.71 Hz, 1 H), 7.29 (d, J=1.47 Hz, 1 H), 3.10-3.07 (m, 1 H), 1.07 (d, J=6.60 Hz, 3 H), 0.90-0.70 (m, 1 H), 0.33-0.00 (m, 4 H)。 LC-MS：t R(min) 2.03 (含有0.1% TFA之20-100% ACN 6 min)，m/z [M+H] +C 11H 12FN 3O 2需要：239.3，實驗值：240.1 HPLCt R(min) 3.74，95% (含有0.1% TFA之20-100% ACN 10 min)。
(R)-1-苯基丙-1-胺 II-28A 1H NMR (400 MHz, MeOH- d4) δ 8.20 (s, 1 H), 7.56 (d, J=11.7 Hz, 1 H), 7.39 (d, J=7.58 Hz, 2 H), 7.29 (t, J=7.46 Hz, 2 H), 7.24-7.11 (m, 1 H), 5.15-5.02 (m, 1 H), 2.00-1.75 (m, 2 H), 1.02-0.90 (m, 3 H)。 LC-MS：t R(min) 3.70 (含有0.1% TFA之20-100% ACN 6 min)，m/z [M+H] +C 13H 15FN 3O 2需要：289.3，實驗值：290.1 HPLCt R(min) 5.23，98% (含有0.1% TFA之20-100% ACN 10 min)。
(R)-1-環己基乙胺 II-30A 1H NMR (400 MHz, MeOH- d4) δ 8.24 (s, 1H), 7.56 (s, 1 H), 7.53 (s, 1 H), 4.63 (s, 2 H), 4.09 (t, J=6.72 Hz, 1 H), 1.88-1.65 (m, 5 H), 1.55-1.45 (m, 1 H), 1.31-1.22 (m, 3 H), 1.22-1.15 (m, 3 H), 1.10-0.90 (m, 2 H)。 LC-MS：t R(min) 3.37 (含有0.1% TFA之20-100% ACN 6 min)，m/z [M+H] +C 14H 20FN 3O 2需要：281.3，實驗值：282.2 HPLCt R(min) 4.84，97% (含有0.1% TFA之20-100% ACN 10 min)。
(S)-1-環己基乙胺 II-30B 1H NMR (400 MHz, MeOH- d4) δ 8.24 (s, 1H), 7.56 (s, 1 H), 7.53 (s, 1 H), 4.63 (s, 2 H), 4.09 (t, J=6.97 Hz, 1 H), 1.88-1.65 (m, 5 H), 1.51 (s, 1 H), 1.31-1.20 (m, 3 H), 1.22-1.18 (m, 3 H), 1.10-0.90 (m, 2 H)。 LC-MS：t R(min) 3.50 (含有0.1% TFA之20-100% ACN 6 min)，m/z [M+H] +C 14H 20FN 3O 2需要：281.3，實驗值：282.1 HPLCt R(min) 5.10，98% (含有0.1% TFA之20-100% ACN 10 min)。
 (1S, 2S)-2-甲氧基環戊胺 II-36 1H NMR (400 MHz, CDCl3- d) δ 8.27 (s, 1 H), 7.58-7.39 (m, 1 H), 5.06 (br, s, 1 H), 4.31 (br, s, 1 H), 3.68 (br, s, 1 H), 3.34 (s, 3 H), 2.25- 2.15 (m, 1 H), 1.93-1.88 (m, 1 H), 1.85-1.75 (m, 3 H), 1.50-1.40 (m, 1 H)。 LC-MS：t R(min) 1.93 (含有0.1% TFA之20-100% ACN 6 min)，m/z [M+H] +C 12H 16FN 3O 2需要：269.3，實驗值：270.1 HPLCt R(min) 3.71，97% (含有0.1% TFA之20-100% ACN 10 min)。
(3S, 4R)-4-甲氧基四氫呋喃-3-基)胺 II-38 1H NMR (400 MHz, MeOH- d4) δ 8.33 (s, 1 H), 7.60 (d, J=11.98 Hz, 1 H), 4.60 (br, s, 1 H), 4.20-4.05 (m, 2 H), 4.00-3.90 (m, 1 H), 3.85-3.75 (m, 2 H), 3.48 (s, 3 H)。 LC-MS：t R(min) 1.39 (含有0.1% TFA之20-100% ACN 6 min)，m/z [M+H] +C 11H 14FN 3O 2需要：271.3，實驗值：272.1 HPLCt R(min) 2.97，97% (含有0.1% TFA之20-100% ACN 10 min)。
3,3-二氟-1-(甲氧基甲基)環丁-1-胺 II-39 1H NMR (400 MHz, MeOH- d4) δ 8.16 (s, 1 H), 7.48 (d, J=12.2 Hz, 1 H), 4.52 (s, 2 H), 3.63 (s, 2 H), 3.26-3.23 (m, 3 H), 2.82-2.72 (m, 4H)。 LC-MS：t R(min) 3.00 (含有0.1% TFA之20-100% ACN 6 min)，m/z [M+H] +C 12H 14F 3N 3O 3需要：305.3，實驗值：306.1 HPLCt R(min) 5.02，93% (含有0.1% TFA之20-100% ACN 10 min)。
3-乙基氧雜環丁-3-胺 II-40 1H NMR (400 MHz, MeOH- d4) δ 8.22 (s, 1 H), 7.59 (d, J=11.98 Hz, 1 H), 4.80 (br, s, 2 H), 4.60 (br, s, 2 H), 2.22 (q, J=6.93 Hz, 2 H), 0.92 (t, J=6.95 Hz, 3 H)。 LC-MS：t R(min) 1.10 (含有0.1% TFA之20-100% ACN 6 min)，m/z [M+H] +C 11H 13FN 3O 3需要：255.2，實驗值：256.1 HPLCt R(min) 3.80，99% (含有0.1% TFA之20-100% ACN 10 min)。
1,1'-雙(環丙)-1-胺 II-41 1H NMR (400 MHz, MeOH- d4) δ 8.07 (s, 1 H), 7.32 (d, J=11.98 Hz, 1 H), 4.40 (br, s, 1 H), 3.08 (s, 1 H), 1.35-1.25 (m, 1 H), 0.48 (d, J=5.38 Hz, 4 H), 0.38-0.42 (m, 2 H), 0.01 (s, 2 H)。 LC-MS：t R(min) 1.20 (含有0.1% TFA之20-100% ACN 6 min)，m/z [M+H] +C 11H 13FN 3O 3需要：251.3，實驗值：252.1 HPLCt R(min) 3.17，96% (含有0.1% TFA之20-100% ACN 10 min)。
(S)-1-甲基-2-側氧基吡咯啶-3-胺 II-42A 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 11.05 (br, s, 1 H), 9.00 (br, s, 1 H), 8.50 (br, s, 1 H), 7.65 (d, J=12.0 Hz, 1 H), 7.45 (d, J= 8.80 Hz, 1 H), 4.90-4.80 (m, 1 H), 3.45-3.40 (m, 2 H), 2.76 (s, 3 H), 2.30-2.20 (m, 1 H), 1.90-2.00 (m, 1 H)。 LC-MS：t R(min) 1.10 (含有0.1% TFA之20-100% ACN 6 min)，m/z [M+H] +C 11H 13FN 3O 3需要：268.3，實驗值：269.1 HPLCt R(min) 1.54，96% (含有0.1% TFA之20-100% ACN 10 min)。
(S)-2-側氧基吡咯啶-3-胺 II-43A 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 11.05 (br, s, 1 H), 8.95 (br, s, 1 H), 8.25 (s, 1 H), 7.83 (s, 1 H), 7.65 (d, J=12.0 Hz, 1 H), 7.45 (d, J=8.80 Hz, 1 H), 4.70-4.85 (m, 1 H), 3.23 (d, J=6.34 Hz, 2 H), 2.40-2.30 (m, 1 H), 2.15-2.05 (m, 1 H)。 LC-MS：t R(min) 1.10 (含有0.1% TFA之20-100% ACN 6 min)，m/z [M+H] +C 12H 16FN 3O 3需要：254.2，實驗值：255.1 HPLCt R(min) 1.71，96% (含有0.1% TFA之20-100% ACN 10 min)。
(R)-1-甲基-2-側氧基吡咯啶-3-胺 II-42B 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 11.05 (br, s, 1 H), 8.99 (br, s, 1 H), 8.25 (s, 1 H), 7.65 (d, J=12.2 Hz, 1 H), 7.42 (d, d, J=8.07 Hz, 1 H), 4.82 (d, J=9.05 Hz, 1 H), 3.34-3.27  (m, 2 H), 2.76 (s, 3 H), 2.40-2.26 (m, 1 H), 2.03-1.92 (m, 1 H)。 LC-MS：t R(min) 1.20 (含有0.1% TFA之20-100% ACN 6 min)，m/z [M+H] +C 12H 16FN 3O3需要：268.3，實驗值：269.1 HPLCt R(min) 1.75，99% (含有0.1% TFA之20-100% ACN 10 min)。
(R)-2-側氧基吡咯啶-3-胺 II-43B 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 11.0 (br, s, 1 H), 9.05 (br, s, 1 H), 8.45 (s, 1 H), 7.84 (s, 1 H), 7.65 (d, J=12.0 Hz, 1 H), 7.34 (d, J=8.80 Hz, 1 H), 4.77 (d, J=9.29 Hz, 1 H), 3.18-3.28 (m, 2 H), 2.30-2.40 (m, 1 H), 2.15-2.05 (m, 1 H)。 LC-MS：tR (min) 1.15 (含有0.1% TFA之20-100% ACN 6 min)，m/z [M+H] +C 12H 16FN 3O 3需要：254.2，實驗值：255.1 HPLCtR (min) 1.55，93% (含有0.1% TFA之20-100% ACN 10 min)。
1-(2-甲氧基乙基)環丙基)胺 II-44 1H NMR (400 MHz, MeOH- d4) δ 8.32 (s, 1 H), 7.57 (d, J=11.98 Hz, 1 H), 3.55 (t, J=6.85, 2 H), 3.30 (s, 3 H), 1.96 (t, J=6.85 Hz, 2 H), 0.80 (s, 4 H)。 LC-MS：t R(min) 1.20 (含有0.1% TFA之20-100% ACN 6 min)，m/z [M+H] +C 12H 16FN 3O 3需要：269.3，實驗值：270.1 HPLCt R(min) 2.07，99% (含有0.1% TFA之20-100% ACN 10 min)。
3-苯基氧雜環丁-3-胺 II-27 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 10.95 (br s, 1 H), 8.97 (s, 1 H), 8.38 (m, 1 H), 8.02 (m, 1 H), 7.69 (m, 1 H), 7.53 (m, 2 H), 7.34 (m, 2 H), 7.24 (m, 1 H), 4.99 (m, 2 H), 4.78 (m, 2 H)。 LC-MS：m/z [M+H] +C 15H 14FN 3O 3需要：303.2，實驗值：304.1 HPLCt R(min) 4.81，95% (含有0.1% TFA之10-100% ACN 10 min)。
3-(吡啶-2-基)氧雜環丁-3-胺 II-56 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 10.97 (br s, 1 H), 8.97 (s, 1 H), 8.63 (m, 1 H), 8.46 (m, 1 H), 7.99 (m, 1 H), 7.71-7.66 (m, 2 H), 7.31-7.15 (m, 2 H), 5.01 (m, 2 H), 4.87 (m, 2 H)。 LC-MS：m/z [M+H] +C 14H 13FN 4O 3需要：304.2，實驗值：305.1 HPLCt R(min) 1.27，93% (含有0.1% TFA之10-100% ACN 10 min)。
胺 化合物 表徵資料
1H-吡咯并[2,3-b]吡啶 5 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 11.41 (br s, 1 H), 9.31 (s, 1 H), 8.57 (m, 1 H), 8.18 (m, 1 H), 7.98 (m, 2 H), 7.60 (m, 1 H), 7.08 (m, 1 H), 6.52 (m, 1 H), 5.71 (s, 2 H)。 LC-MS：m/z [M+H] +C 14H 11FN 4O 2需要：286.2，實驗值：287.1 HPLCt R(min) 3.21，98% (含有0.1% TFA之20-100% ACN 10 min)。
2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑 6 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 11.41 (br s, 1 H), 9.32 (s, 1 H), 8.51 (s, 1 H), 8.01 (m, 1 H), 7.63 (m, 1 H), 7.62 (m, 1 H), 7.53-7.27 (m, 3 H), 5.92 (s, 2 H)。 LC-MS：m/z [M+H] +C 15H 11F 3N 4O 2需要：336.2.1，實驗值：337.1 HPLCt R(min) 4.87，97% (含有0.1% TFA之10-100% ACN 10 min)。
2,2-二甲基-2H-吡啶并[3,2-b][1,4]㗁𠯤-3(4H)-酮 II-34 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 11.37 (br s, 1 H), 9.30 (s, 1 H), 8.52 (s, 1 H), 7.97 (m, 1 H), 7.88 (m, 1 H), 7.44 (m, 1 H), 7.03 (m, 1 H), 5.42 (s, 2 H), 1.51 (s, 6 H)。 LC-MS：m/z [M+H] +C 16H 15FN 4O 4需要：346.3，實驗值：347.1 HPLCt R(min) 5.04，100% (含有0.1% TFA之10-100% ACN 10 min)。
3-甲基-3,4-二氫喹唑啉-2(1H)-酮 II-47 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 11.40 (br s, 1 H), 9.30 (s, 1 H), 8.55 (s, 1 H), 7.94 (m, 1 H), 7.15-7.11 (m, 2 H), 6.93 (m, 1 H), 6.74 (m, 1 H), 5.22 (s, 2 H), 4.40 (s, 2 H), 2.90 (s, 3 H)。 LC-MS：m/z [M+H] +C 16H 15FN 4O 3需要：330.3，實驗值：331.1 HPLCt R(min) 4.93，100% (含有0.1% TFA之10-100% ACN 10 min)。
3,4-二氫-2H-噻吩并[3,2-b]吲哚1,1-二氧化物 II-48 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 8.62 (s, 1 H), 8.02 (m, 1 H), 7.56 (m, 2 H), 7.27 (m, 2 H), 5.68 (s, 2 H), 3.94 (m, 2 H), 3.46 (m, 2 H)。 LC-MS：m/z [M+H] +C 17H 14FN 3O 4S需要：375.3，實驗值：376.1 HPLCt R(min) 4.85，96% (含有0.1% TFA之10-100% ACN 10 min)。
2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑 II-49 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 11.41 (br s, 1 H), 9.33 (s, 1 H), 8.49 (s, 1 H), 8.04 (m, 1 H), 7.84 (m, 1  H), 7.72 (m, 1 H), 7.44 (m, 2 H), 5.95 (s, 2 H)。 LC-MS：m/z [M+H] +C 15H 10F 4N 4O 2需要：354.2，實驗值：355.1 HPLCt R(min) 4.94，98% (含有0.1% TFA之10-100% ACN 10 min)。
2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶 II-50 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 11.39 (br s, 1 H), 9.31 (s, 1 H), 8.51 (s, 1 H), 8.06 (m, 1 H), 7.97 (m, 1 H), 7.84 (m, 1 H), 7.03 (m, 1 H), 6.29 (s, 1 H), 5.69 (s, 2 H), 2.40 (s, 3 H)。 LC-MS：m/z [M+H] +C 15H 13FN 4O 2需要：300.2，實驗值：301.1 HPLCt R(min) 3.83，100% (含有0.1% TFA之20-100% ACN 10 min)。
2,3-二甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶 II-51 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 11.39 (br s, 1 H), 9.31 (s, 1 H), 8.51 (s, 1 H), 8.05 (m, 1 H), 7.95 (m, 1 H), 7.81 (m, 1 H), 7.01 (m, 1 H), 5.67 (s, 2 H), 2.31 (s, 3 H), 2.21 (s, 3 H)。 LC-MS：m/z [M+H] +C 16H 15FN 4O 2需要：314.3，實驗值：315.1 HPLCt R(min) 4.17，100% (含有0.1% TFA之20-100% ACN 10 min)。
㗁唑并[4,5-b]吡啶-2(3H)-酮 II-52 1H NMR (400 MHz, CD 3OD-d 4) δ 8.70 (s, 1 H), 7.98 (m, 2 H), 7.47 (m, 1 H), 7.38 (m, 1 H), 5.06 (s, 2 H), 3.64 (s, 3 H)。 LC-MS：m/z [M+H] +C 14H 13FN 4O 5需要：336.2，實驗值：337.1 HPLCt R(min) 4.18，96% (含有0.1% TFA之10-100% ACN 10 min)。
2-甲基-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶 II-53 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 11.30 (br s, 1 H), 9.27 (s, 1 H), 8.47 (s, 1 H), 8.12 (m, 1 H), 7.95 (m, 1 H), 7.88 (m, 1 H), 7.15 (m, 1 H), 5.68 (s, 2 H), 2.44 (s, 3 H)。 LC-MS：m/z [M+H] +C 14H 12FN 5O 2需要：301.2，實驗值：302.1 HPLCt R(min) 3.60，98% (含有0.1% TFA之10-100% ACN 10 min)。
4-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)𠰌啉 II-54 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 11.45 (br s, 1 H), 9.34 (s, 1 H), 8.59 (s, 1 H), 8.03 (m, 1 H), 7.45 (m, 1 H), 7.15-7.03 (m, 3 H), 5.55 (s, 2 H), 3.67 (m, 4 H), 3.14 (m, 4 H)。 LC-MS：m/z [M+H] +C 18H 18FN 5O 3需要：371.3，實驗值：372.1 HPLCt R(min) 3.66，95% (含有0.1% TFA之10-100% ACN 10 min)。
2-甲基-2,3,4,5-四氫-1H-吡啶并[4,3-b]吲哚 III-10 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 11.40 (br s, 1 H), 9.36 (s, 1 H), 8.61 (s, 1 H), 7.95 (m, 1 H), 7.35 (m, 2 H), 7.03-6.94 (m, 2 H), 5.50 (s, 2 H), 3.52 (s, 2 H), 2.83 (m, 2 H), 2.72 (m, 2 H), 2.42 (s, 3 H)。 LC-MS：m/z [M+H] +C 19H 19FN 4O 2需要：354.3，實驗值：355.2 HPLCt R(min) 4.58，99% (含有0.1% TFA之10-100% ACN 10 min)。
1,3,4,5-四氫哌喃并[4,3-b]吲哚 II-29 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 11.41 (br s, 1 H), 9.35 (s, 1 H), 8.61 (s, 1 H), 8.01 (m, 1 H), 7.40-7.32 (m, 2 H), 7.06-6.95 (m, 2 H), 5.54 (s, 2 H), 4.78 (s, 2 H), 3.95 (m, 2 H), 2.84 (m, 2 H)。 LC-MS：m/z [M+H] +C 18H 16FN 3O 3需要：341.3，實驗值：342.1 HPLCt R(min) 4.99，94% (含有0.1% TFA之10-100% ACN 10 min)。
化合物 表徵資料
II-25 1H NMR (400 MHz,溶劑) δ ppm 8.18 (s, 1 H) 7.50 (br d, J=11.98 Hz, 1 H) 7.31 - 7.38 (m, 2 H) 7.23 (br t, J=7.46 Hz, 2 H) 7.10 - 7.17 (m, 1 H) 3.74 (s, 2 H) 0.93 - 0.99 (m, 2 H) 0.80 - 0.86 (m, 2 H)
III-9 1H NMR (400 MHz,溶劑) δ ppm 8.39 (s, 1 H) 8.35 (d, J=4.65 Hz, 1 H) 7.64 - 7.76 (m, 2 H) 7.27 (dd, J=7.58, 5.14 Hz, 1 H) 4.86 (s, 2 H) 4.03 (t, J=5.87 Hz, 2 H) 3.10 (t, J=5.87 Hz, 2 H)
II-23 1H NMR (400 MHz,甲醇-d4 ) δ ppm 8.57 (s, 1 H) 7.77 (d, J=10.27 Hz, 1 H) 2.31 - 2.46 (m, 1 H) 1.08 - 1.16 (m, 4 H) LCMS R T= 2.79 min, m/z= 197.1 [M + H] +。
II-31 1H NMR (400 MHz,甲醇-d4 ) δ ppm 8.34 (s, 1 H) 7.60 (br d, J=11.49 Hz, 1 H) 3.22 - 3.28 (m, 1 H) 1.82 - 1.95 (m, 1 H) 1.21 - 1.31 (m, 1 H) 1.16 (br dd, J=10.03, 4.89 Hz, 1 H)
II-32 1H NMR (400 MHz,甲醇-d4 ) δ ppm 8.30 (s, 1 H) 7.61 (br d, J=11.74 Hz, 1 H) 4.32 - 4.47 (m, 1 H) 2.94 - 3.12 (m, 2 H) 2.54 - 2.76 (m, 2 H)
I-1a 1H NMR (400 MHz,甲醇-d4 ) δ ppm 8.21 (s, 1 H) 7.82 (br d, J=10.27 Hz, 1 H) 7.25 - 7.32 (m, 4 H) 7.15 - 7.23 (m, 1 H) 1.44 - 1.50 (m, 2 H) 1.36 - 1.43 (m, 2 H)
實例 3 . 材料及方法
所使用之HEK293/HEK293T細胞(所使用之特定細胞株指示於下表中)維持於含血清或無血清之細胞培養基中(所使用之特定條件指示於下表中)。
當細胞存活率達到＞90%時，在接種後的3天，使用基於聚乙亞胺(polyethyleneimine；PEI)之轉染試劑對具有轉殖基因、Rep/Cap質體(具有AAV複製蛋白及衣殼蛋白之質體)及輔助質體之載體進行轉染。在轉染時活細胞密度為2E+6個細胞/毫升。本文中所呈現之圖式展示所使用的具有轉殖基因( 圖 1)、輔助質體(Adhelper) ( 圖 2)及Rep/Cap質體( 圖 3 至圖 9)之載體的圖譜。此等載體/質體之序列提供於下文之序列表中。
HDAC6抑制劑以0.25 mM至1 mM之儲備液濃度稀釋於DMSO中。隨後在轉染當天，將儲備溶液以0.1 µM至100 µM之間的工作濃度(所使用之特定濃度指示於下表中)添加至細胞培養物中。
在轉染後的3天採集細胞以用於AAV純化。 實驗結果
實驗結果顯示，所測試之選擇性HDAC6抑制劑顯著改善病毒生產，且特定言之，增加哺乳動物細胞中(尤其HEK293/HEK293T細胞中)之病毒力價及產量。實驗結果亦顯示，諸如泛HDAC抑制劑之其他HDAC6抑制劑並未像本文中所描述之選擇性HDAC6抑制劑那樣改善病毒生產。
實驗#1
概述：表3之化合物I-6以1.25 µM及2.50 µM之最終濃度(於培養基中)增強AAV9在無血清培養基中培養之Expi-293細胞培養物中的產量。
實驗#1
AAV血清型 細胞 細胞培養基 一式兩份 增強劑 增強劑濃度(µM) 力價(vg/mL) 無增強劑對照力價(vg/mL) 相對於對照之力價改善%
AAV9 Expi-293 無血清 #1 I-6 1.25 2.37E+11 1.72E+11 38%
AAV9 Expi-293 無血清 #2 I-6 1.25 2.27E+11 1.72E+11 32%
AAV9 Expi-293 無血清 #1 I-6 2.50 2.46E+11 1.72E+11 43%
AAV9 Expi-293 無血清 #2 I-6 2.50 2.47E+11 1.72E+11 44%
實驗#2
概述：表3之化合物I-6以1.25 µM之濃度增強4種不同AAV9變異體在無血清培養基中培養之Expi-293細胞培養物中的產量。
實驗#2
AAV血清型 細胞 細胞培養基 一式兩份 增強劑 增強劑濃度(µM) 力價(vg/mL) 無增強劑對照力價(vg/mL) 相對於對照之力價改善%
AAV9變異體#1=pZC401 Expi-293 無血清 #1 I-6 1.25 1.59E+11 1.22E+11 30%
AAV9變異體#2=pZC428 Expi-293 無血清 #1 I-6 1.25 5.98E+10 4.45E+10 34%
AAV9變異體#3=pZC478 Expi-293 無血清 #1 I-6 1.25 8.84E+10 4.01E+10 120%
AAV9變異體#4=pZC375 Expi-293 無血清 #1 I-6 1.25 5.36E+10 3.92E+10 37%
實驗#3
概述：表3之化合物I-6、I-3及TYA以1.25 μM之濃度增強AAV9在無血清培養基中培養之Expi 293培養物中的產量。丁酸鈉或吉維司他均未顯現由本文中所描述之選擇性HDAC6抑制劑所展現之改善。TYA為式(I)內，以及例如式(Ic)、式(Ik)及式(Iy)內的化合物。下文提及TYA係指相同化合物。
實驗#3
AAV血清型 細胞 細胞培養基 一式兩份 增強劑 增強劑濃度(µM) 力價(vg/mL) 無增強劑對照力價(vg/mL) 相對於對照之力價改善%
AAV9 Expi-293 無血清 #1 I-6 1.25 1.6E+11 1.08E+11 48%
AAV9 Expi-293 無血清 #1 I-3 1.25 1.59E+11 1.08E+11 47%
AAV9 Expi-293 無血清 #1 TYA 1.25 1.66E+11 1.08E+11 54%
AAV9 Expi-293 無血清 #1 丁酸鈉 1.25 0.93E+10 1.08E+11 -14%
AAV9 Expi-293 無血清 #1 吉維司他 1.25 1.21E+11 1.08E+11 +11%
實驗#4
概述：表3之化合物I-6以0.50 μM、1.25 μM、2.25 μM及5.00 μM之濃度增強AAV9在化學成分確定之培養基中培養之VPC 2.0 HEK293培養物中的產量。
實驗#4
AAV血清型 細胞 細胞培養基 一式兩份 增強劑 增強劑濃度(µM) 力價(vg/mL) 無增強劑對照力價(vg/mL) 相對於對照之力價改善%
AAV9 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 I-6 0.50 2.28E+11 1.57E+11 45%
AAV9 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #2 I-6 0.50 2.49E+11 1.9E+11 31%
AAV9 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 I-6 1.25 2.51E+11 1.57E+11 60%
AAV9 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #2 I-6 1.25 3.01E+11 1.9E+11 58%
AAV9 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 I-6 2.50 2.3E+11 1.57E+11 46%
AAV9 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #2 I-6 2.50 2.65E+11 1.9E+11 39%
AAV9 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 I-6 5.00 2.4E+11 1.57E+11 53%
AAV9 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #2 I-6 5.00 2.59E+11 1.9E+11 36%
實驗#5
概述：表3之化合物I-3及TYA分別以0.01 μM、0.10 μM、0.50 μM及1.25 μM之濃度增強AAV在化學成分確定之培養基中培養之VPC 2.0 HEK293培養物中的產量。
實驗#5
AAV血清型 細胞 細胞培養基 一式兩份 增強劑 增強劑濃度(µM) 力價(vg/mL) 無增強劑對照力價(vg/mL) 相對於對照之力價改善%
AAV9 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 I-3 0.01 1.16E+11 9.01E+10 29%
AAV9 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 I-3 0.10 1.33E+11 9.01E+10 48%
AAV9 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 I-3 0.50 1.25E+11 9.01E+10 39%
AAV9 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 I-3 1.25 1.41E+11 9.01E+10 56%
AAV9 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 TYA 0.01 1.09E+11 9.01E+10 21%
AAV9 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 TYA 0.10 1.34E+11 9.01E+10 49%
AAV9 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 TYA 0.50 1.38E+11 9.01E+10 53%
AAV9 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 TYA 1.25 1.59E+11 9.01E+10 76%
實驗#6
概述：表3之化合物I-6及TYA分別以1.25 μM及2.50 μM之濃度增強AAV9變異體#5在化學成分確定之培養基中培養之VPC 2.0 HEK293培養物中的產量。
實驗#6
AAV血清型 細胞 細胞培養基 一式兩份 增強劑 增強劑濃度(µM) 力價(vg/mL) 無增強劑對照力價(vg/mL) 相對於對照之力價改善%
AAV9變異體#5=pZC96 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 I-6 1.25 9.70E+10 6.99E+10 39%
AAV9變異體#5=pZC96 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 I-6 2.50 8.13E+10 6.99E+10 16%
AAV9變異體#5=pZC96 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 TYA 1.25 8.56E+10 6.99E+10 22%
AAV9變異體#5=pZC96 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 TYA 2.50 8.98E+10 6.99E+10 28%
實驗#7
概述：
表3之化合物I-6及I-3以1.25 μM之濃度增強AAV9在化學成分確定之培養基中培養之VPC 2.0 HEK293培養物中的產量。
表3之化合物TYA以1.25 μM、2.50 μM、5.00 μM及10.00 μM之濃度增強AAV9在化學成分確定之培養基中培養之VPC 2.0 HEK293培養物中的產量。
實驗#7
AAV血清型 細胞 細胞培養基 一式兩份 增強劑 增強劑濃度(µM) 力價(vg/mL) 無增強劑對照力價(vg/mL) 相對於對照之力價改善%
AAV9 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 I-6 1.25 2.32E+11 1.71E+11 36%
AAV9 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 I-3 1.25 2.49E+11 1.71E+11 46%
AAV9 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 TYA 1.25 2.40E+11 1.71E+11 40%
AAV9 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 TYA 2.50 2.65E+11 1.71E+11 55%
AAV9 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 TYA 5.00 2.20E+11 1.71E+11 29%
AAV9 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 TYA 10.00 2.13E+11 1.71E+11 25%
實驗#8
概述：表3之化合物I-6、I-3及TYA以1.25 μM之濃度增強AAV5在化學成分確定之培養基中培養之VPC 2.0 HEK293中的產量。丁酸鈉或吉維司他均未顯現由本文中所描述之選擇性HDAC6抑制劑所展現之改善。
實驗#8
AAV血清型 細胞 細胞培養基 一式兩份 增強劑 增強劑濃度(µM) 力價(vg/mL) 無增強劑對照力價(vg/mL) 相對於對照之力價改善%
AAV5 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 I-6 1.25 2.09E+11 1.04E+11 101%
AAV5 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 I-3 1.25 2.19E+11 1.04E+11 111%
AAV5 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 TYA 1.25 1.97E+11 1.04E+11 89%
AAV5 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 丁酸鈉 1.25 1.01E+11 1.04E+11 -3%
AAV5 VPC 2.0 HEK293 化學成分確定 #1 吉維司他 1.25 1.23E+11 1.04+E11 +18%
實驗#9
概述：表3之化合物I-6、I-3及TYA以1.25 μM之濃度增強AAV在含有胎牛血清(FBS)之培養基中培養之ATCC 1573 HEK293細胞培養物中的產量。
實驗#9
AAV血清型 細胞 培養基 一式兩份 增強劑 增強劑濃度(µM) 力價(vg/mL) 無增強劑對照力價(vg/mL) 相對於對照之力價改善%
AAV9 ATCC 1573 HEK 含有FBS #1 I-6 1.25 9.52E+04 1.00E+03 9420%
AAV9 ATCC 1573 HEK 含有FBS #1 I-3 1.25 1.23E+05 1.00E+03 12200%
AAV9 ATCC 1573 HEK 含有FBS #1 TYA 1.25 1.01E+05 1.00E+03 10000%
實驗#10
概述：表3之化合物I-6、I-3及TYA以1.25 μM之濃度增強AAV在含有胎牛血清(FBS)之培養基中培養之ATCC 3216 HEK293T細胞培養物中的產量。
實驗#10
AAV血清型 細胞 培養基 一式兩份 增強劑 增強劑濃度(µM) 力價(vg/mL) 無增強劑對照力價(vg/mL) 相對於對照之力價改善%
AAV9 ATCC 3216 HEK293T 含有FBS #1 I-6 1.25 6.56E+10 4.85E+10 35%
AAV9 ATCC 3216 HEK293T 含有FBS #1 I-3 1.25 7.02E+10 4.85E+10 45%
AAV9 ATCC 3216 HEK293T 含有FBS #1 I-96 1.25 6.11E+10 4.85E+10 26%
實驗#11
概述：表3之化合物I-6以1.25 μM之濃度增強AAV9在3 L及50 L生物反應器中之無血清培養基中培養之Expi-293培養物中的產量。
實驗#11
AAV血清型 細胞 培養基 生物反應器規模 增強劑 增強劑濃度(μM) 力價(vg/mL) 無增強劑對照力價(vg/mL) 相對於對照之力價改善%
AAV9 Expi-239 無血清 3 L I-6 1.25 1.8 1.1 64%
AAV9 Expi-239 無血清 50 L I-6 1.25 3.8 1.1 245%
實例 4 . 藉由 HDAC6 抑制劑提昇基於 HEK293 之 AAV 生產的力價及規模
HEK293細胞培養物中病毒生產之主要限制為可擴展性及病毒生產力。此實例顯示本文中所描述之選擇性HDAC6抑制劑(在此實例中亦稱為小分子促進劑(SMB))，包括N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(吡啶-3-基)乙烷磺醯胺(化合物I-6，參見表3)可以不依賴於細胞株及細胞培養基之方式顯著提高AAV產量。另外，此實例顯示，此等化合物可藉由維持至少高達200 L之穩定產量來增強HEK293製程之可擴展性。此外，此實例顯示，此等化合物對AAV病毒載體之純度、品質、安全性及效能無影響，且可容易地在標準AAV純化過程中清除，此表明其可能在消除AAV製造瓶頸及降低AAV基因療法成本上具有潛在變革意義。
首先，藉由AAV-GFP強度對本文中所描述之選擇性HDAC6抑制劑，包括N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(吡啶-3-基)乙烷磺醯胺(化合物I-6，參見表3)及其他化合物進行篩選，該強度係在添加測試化合物之各培養物中量測( 圖 10A 至圖 10B)。
用於本文中所描述之實驗中的材料及方法與實例3中所描述之材料及方法一致。
為了測試HEK293製程之可擴展性的改良，在搖瓶中測試選擇性HDAC6抑制劑化合物。特定言之，基於每單位體積之功率(PV)，化合物I-6在3 L、50 L及200 L生物反應器(BRX)規模中均展現改良之產量、力價及生產力( 圖 11 、圖 12A 至圖 12C)，此證實能夠在至少高達200 L BRX規模上增強AAV製造製程之可擴展性及生產力。
隨後，測試向細胞培養物中添加選擇性HDAC6抑制劑化合物是否影響產物品質或純化效能。 圖 13A顯示來自小規模搖瓶生產之經親和力純化之AAV的西方墨點(Western blot) (重複2次，一次添加化合物I-6且一次不添加)。觀測到在添加及不添加選擇性HDAC6抑制劑時VP1/VP2/VP3之比率一致(化合物I-6係用於此處所展示之實驗中)。基於用AAV9:GFP進行之心肌細胞轉導( 圖 13B)，添加化合物I-6對AAV感染性無顯著影響。另外，根據毛細管電泳法(CE)電泳圖，發現在添加化合物I-6之培養物與對照物(不添加化合物)中生產時的VP1/VP2/VP3比率類似，此表明對產物品質無影響。另外，如 圖 14A 至圖 14B中所示，添加選擇性HDAC6抑制劑亦不影響純化效能。
隨後，如 圖 15中所示，選擇性HDAC6抑制劑亦對使用AAV進行之活體內轉導無影響。活體內研究係由兩個小組組成，第一組注射在無選擇性HDAC6抑制劑時所生產之AAV且第二組注射在有選擇性HDAC6抑制劑時所生產之AAV (化合物I-6係用於此處所展示之實驗中)。注射後的3週處死小鼠且採集心臟及肝臟組織，提取RNA及DNA且使用qPCR進行分析，以測定所關注之基因(gene of interest；GOI)相對於培養基中未添加選擇性HDAC6抑制劑之製程的倍數變化。在使用或不使用選擇性HDAC6抑制劑之小鼠病毒生產研究中未發現顯著差異。
此外，已證實，選擇性HDAC6抑制劑增加病毒力價而不影響所生產之產物的品質。如 圖 16中所示，比不使用選擇性HDAC6抑制劑之製程相比，使用選擇性HDAC6抑制劑(化合物I-6係用於此處所展示之實驗中)之慢病毒生產使效價增加＞39%，證實本文中所描述之選擇性HDAC6抑制劑化合物可有效增加諸如慢病毒之其他載體類型的病毒生產。
最後，如 圖 17中所示，本文中所描述之選擇性HDAC6抑制劑化合物展現獨特作用機制，其影響在HEL293細胞中生產AAV期間的許多不同路徑(化合物I-6係用於此處所展示之實驗中)。
總體而言，此實例中所呈現之資料證實，本文中所描述之選擇性HDAC6抑制劑(諸如化合物I-6)可即插即用至任何現有基於HEK之製程中，且始終顯示病毒生產力之顯著增加。觀測到之力價改良不依賴於培養基、細胞株及規模，且添加選擇性HDAC6抑制劑對活體外及活體內的產物品質、純度及轉導效率無可觀測之影響。 實例 5 . 藉由抑制劑之組合提昇基於 HEK293 之 AAV 生產的效價
為了進一步增加病毒生產力，測試本文中所描述之選擇性HDAC6抑制劑以及其他化合物(在此實例中亦統稱為小分子促進劑(SMB))。在此實例中，測試選擇性HDAC6抑制劑N-((5-(5-(二氟甲基)-1,3,4-㗁二唑-2-基)噻唑-2-基)甲基)-N-(吡啶-3-基)乙烷磺醯胺(化合物I-6，參見表3，在此實例中亦稱為TYA-004)以及(1) Ac-DEVD-CHO (N-Ac-Asp-Glu-Val-Asp-CHO)，一種凋亡蛋白酶-3及凋亡蛋白酶-7抑制劑；(2) SN-011，一種干擾素基因刺激蛋白(STING) (一種完整ER膜蛋白)之選擇性抑制劑；及/或(3)羅西司他，一種HDAC1、HDAC2及HDAC3之泛HDAC抑制劑，以及一種強效及選擇性HDAC6抑制劑。此實例證實，當與STING抑制劑、凋亡蛋白酶抑制劑及泛HDAC抑制劑組合使用時，所選HDAC6抑制劑可顯著增加HEK293細胞中之AAV產量。 材料及方法 搖瓶中之 HEK293 細胞培養物及用於在 HEK293 細胞中生產 AAV 之三重暫時轉染
如 圖 18中所繪示，使用Vi-CELL XR (Beckman Coulter)測定HEK293細胞之活細胞密度(VCD)，且將HEK293細胞以0.6-0.7E+6個細胞/毫升接種於搖瓶中之補充有GlutaMAX (Gibco；#35050061)的新鮮、預溫熱HEK ViP NX培養基(Sartorius；#892-0001)中。除非另外指出，否則此實例中細胞培養基之pH為約7.4。所使用之培養基體積與搖瓶尺寸之比率為30:125。舉例而言，在1 L搖瓶中使用240 mL經補充之HEK ViP NX培養基。在37℃培養箱中在相對濕度≥80%、8% CO 2下於定軌震盪器平台中培育搖瓶，直至培養物達到4-6xE+6個細胞/毫升之密度。在接種後的3天，以上文所描述測定HEK293培養物之VCD。將適當體積之質體(1 µg DNA/百萬個細胞之最終比率)解凍、短暫渦旋且添加至預定量的經預溫熱之高葡萄糖杜爾貝克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium) (DMEM；Gibco；#10566024)。對於各30 mL最終培養體積，使用1.5 mL (培養體積之5%)高葡萄糖DMEM。將FectoVIR-AAV (Polyplus；#101000004)短暫渦旋且添加至經稀釋之質體DNA/DMEM溶液中以得到轉染複合物溶液，最終轉染比率為1 µg DNA : 1 µl FectoVIR-AAV。將轉染複合物溶液短暫渦旋且在室溫下培育30分鐘。隨後將HEK293細胞稀釋至2.5-3E+6個細胞/毫升，且將轉染複合物溶液添加至細胞上。在37℃培養箱中在相對濕度≥80%及8% CO 2下於定軌震盪器平台中培育搖瓶4小時。轉染後的4小時，僅添加二甲亞碸(DMSO；Sigma；#D2438)或懸浮於DMSO中之不同小分子，從而TYA-004、Ac-DEVD-CHO (CAS號169332-60-9)、SN-011 (CAS號2249435-90-1)及羅西司他(CAS號1316214-52-4)之最終濃度分別為1.25 µM、2.50 µM、1.25 µM及1.25 µM。 AAV 生產採集
如 圖 19中所示，轉染後的68至72小時，測定經轉染之培養物的VCD，且分別以0.5% v/v、0.75% v/v、20 mM及25 EU/mL之最終濃度添加Triton X-100、tris鹼(3.3 M)、MgCl 2(1 M)及全能核酸酶(benzonase)以開始溶解過程。舉例而言，將150 µL Triton X-100、225 µL tris鹼(3.3 M)、60 µL MgCl 2(1 M)及3 µL全能核酸酶添加至30 mL經轉染之培養物中。在37℃於定軌振盪器培育箱中培育所得溶解物1小時。在培育之後，添加1% v/v之3.3 M tris HCl (對於30 mL培養物為300 µL)。使溶解物以4000 g離心10分鐘且穿過0.2 µm過濾器(ThermoFisher)。獲取樣品進行ddPCR分析以測定AAV病毒力價。 實驗結果
如 圖 20中所示，在DMSO對照培養物中量測到2.19E+11 vg/mL之病毒力價。向經轉染之培養物中單獨添加TYA-004產生顯著更高之3.30xE+11 vg/mL之AAV病毒力價。重要的是，與對照及單獨TYA-004相比，TYA-004、Ac-DEVD-CHO及SN-011之組合(TYA-004+CHO+SN-011)及TYA-004、Ac-DEVD-CHO、SN-011及羅西司他之組合(TYA-004+CHO+SN-011+羅西司他)進一步增加AAV病毒力價。此等結果證實，本發明技術之選擇性HDAC6抑制劑可與經描述之其他化合物組合使用，以進一步改善HEK293細胞中之病毒生產力。 表6.選擇性序列
描述 序列 SEQ ID NO:
攜載轉殖基因之病毒載體：jy08-paav2-1-第2代_ptnt600-hpkp2最佳化-wpre gcccttaagtcatggagaagacccaccttgcagatgtcctcactggggctggcagagccggcaacctgcccaaggctgctcagtccattaggagccagtagcctggaagatgtctttacccccagcatcagttcaagtggagcagcacataactcttgccctctgccttccaagattctggtgctgagacttatggagtgtcttggaggttgccttctgccccccaaccctgctcccagctggccctcccaggcctgggttgctggcctctgctttatcaggattctcaagagggacagctggtttatgttgcatgactgttccctgcatatctgctctggttttaaatagcttatctgagcagctggaggaccacatgggcttatatggcgtggggtacatgttcctgtagccttgtccctggcacctgccaaaatagcagccaacaccccccacccccaccgccatccccctgccccacccgtcccctgtcgcacattcctccctccgcagggctggctcaccaggccccagcccacatgcctgcttaaagccctctccatcctctgcctcacccagtccccgctgagactgagcagacgcctccagccaccatggctgctcctggtgctcctgccgagtacggctacatcagaacagtgctgggccagcagatcctgggacagctggattctagctctctggccctgccttctgaggccaagctgaaactggccggcagttctggaagaggcggccagacagtgaagtccctgcggatccaagaacaggtgcagcagaccctggccagaaagggcagatcttctgtcggcaacggcaacctgcacagaaccagctctgtgcccgagtacgtgtacaatctgcacctggtggaaaacgacttcgtcggcggcagatcccctgtgcctaagacctacgatatgctgaaggccggcaccaccgccacctatgaaggcagatggggaagaggcacagcccagtacagcagccagaaaagcgtggaagagagaagcctgcggcaccctctgcggagactggaaatcagccctgatagcagcccagagagagcccactacacccacagcgactaccagtactcccagagatctcaggccggccacacactgcaccaccaagagtctagaagggccgctctgctggtgcctcctagatacgccagatctgagatcgtgggcgtgtccagagccggcacaacaagcagacagagacacttcgacacctaccaccggcagtatcagcacggcagcgtgtccgataccgtgttcgatagcatccccgccaatcctgctctgctgacataccctagacctggcacctccagatccatgggcaatctgctggaaaaagagaactacctgaccgccggactgaccgtgggacaagttcgacctctggttcctctgcagcccgtgacacagaacagagccagcagaagcagctggcaccagtccagcttccacagcaccagaacactgagagaagctggccctagcgtggccgtggattcttctggtagaagggctcacctgacagttggccaagcagctgcaggcggaagcggaaatctgctgaccgagagaagcaccttcaccgacagccagctgggcaacgccgacatggaaatgacactggaacgggccgtgtccatgctggaagccgatcacatgctgcccagcagaattagcgccgctgccacctttatccagcacgagtgcttccagaagtctgaggcccggaagagagtgaaccagctgagaggcatcctgaagctgctgcagctcctgaaggtgcagaacgaggatgtgcagagggctgtgtgtggggccctgagaaatctggtgttcgaggacaacgacaacaagctggaagtggccgagctgaacggcgtgccaagactgctgcaggttctgaaacagacccgcgacctggaaacaaagaagcagatcaccggcctgctctggaacctgagcagcaacgacaagctgaagaacctgatgatcacagaggccctgctgaccctgacagagaacatcatcatccctttcagcggctggcccgagggcgattaccctaaagctaatggcctgctggacttcgacatcttctacaacgtgaccggctgcctgagaaacatgtctagcgctggcgccgatggcagaaaggccatgagaagatgtgacggcctgatcgacagcctggtgcactatgtgcggggcacaatcgccgattaccagcctgatgataaggccaccgagaactgcgtgtgcatcctgcacaacctgagctaccagctggaagcagagctgcccgagaagtacagccagaacatctacatccagaaccggaacatccagaccgacaacaacaagagcatcggctgcttcggcagccgcagccggaaagtgaaagaacagtaccaggacgtgcccatgcctgaggaaaagtctaaccccaaaggcgtggaatggctgtggcacagcatcgtgatccggatgtacctgagcctgatcgccaagagcgtgcggaattacacccaagaggcatctctgggcgccctgcagaatctgacagcaggatctggccctatgcctacctctgtggctcagaccgtggtgcagaaagagtctggcctgcagcacacccggaagatgctgcatgtgggagatcccagcgtgaagaaaaccgccatcagcctgctgagaaacctgagccggaatctgtctctgcagaatgagatcgccaaagagacactgcccgacctggtgtctatcatccctgacaccgtgcctagcaccgacctgctgattgagacaacagccagcgcctgctacaccctgaacaacatcattcagaactcctaccagaacgcccgcgatctgctgaacacaggcggcatccagaaaatcatggccatctctgccggcgacgcctacgcctctaacaaggcctctaaagccgccagcgtgctgctgtattctctgtgggcccataccgagctgcaccatgcctataagaaggcccagttcaaaaagaccgacttcgtgaacagccggaccgccaaggcctaccactctctgaaagattaataagcttggatccaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgagatctgcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggactggggactcgagttaagggcgaattcccgataaggatcttcctagagcatggctacgtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagccttaattaacctaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccccgatagacggtttttcgccctttgacgctggagttcacgttcctcaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggatttttccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttataatttcaggtggcatctttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatc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2
具有野生型AAV9 cap之rep/cap質體：pZC100_REP2_AAV9 tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattgacgcgtattgggatgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcggaattcgccctattagagtcctgtattagaggtcacgtgagtgttttgcgacattttgcgacaccatgtggtcacgctgggtatttaagcccgagtgagcacgcagggtctccattttgaagcgggaggtttgaacgcgcagccaccacggcggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgagcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccccggaggcccttttctttgtgcaatttgagaagggagagagctacttccacatgcacgtgctcgtggaaaccaccggggtgaaatccatggttttgggacgtttcctgagtcagattcgcgaaaaactgattcagagaatttaccgcgggatcgagccgactttgccaaactggttcgcggtcacaaagaccagaaatggcgccggaggcgggaacaaggtggtggatgagtgctacatccccaattacttgctccccaaaacccagcctgagctccagtgggcgtggactaatatggaacagtatttaagcgcctgtttgaatctcacggagcgtaaacggttggtggcgcagcatctgacgcacgtgtcgcagacgcaggagcagaacaaagagaatcagaatcccaattctgatgcgccggtgatcagatcaaaaacttcagccaggtacatggagctggtcgggtggctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtgattgacgggaactcaacgaccttcgaacaccagcagccgttgcaagaccggatgttcaaatttgaactcacccgccgtctggatcatgactttgggaaggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaataaatgacttaaaccaggtatggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacaaccttagtgaaggaattcgcgagtggtgggctttgaaacctggagcccctcaacccaaggcaaatcaacaacatcaagacaacgctcgaggtcttgtgcttccgggttacaaataccttggacccggcaacggactcgacaagggggagccggtcaacgcagcagacgcggcggccctcgagcacgacaaggcctacgaccagcagctcaaggccggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgccgagttccaggagcggctcaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcgggcgagcagtcttccaggccaaaaagaggcttcttgaacctcttggtctggttgaggaagcggctaagacggctcctggaaagaagaggcctgtagagcagtctcctcaggaaccggactcctccgcgggtattggcaaatcgggtgcacagcccgctaaaaagagactcaatttcggtcagactggcgacacagagtcagtcccagaccctcaaccaatcggagaacctcccgcagccccctcaggtgtgggatctcttacaatggcttcaggtggtggcgcaccagtggcagacaataacgaaggtgccgatggagtgggtagttcctcgggaaattggcattgcgattcccaatggctgggggacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaatcacctctacaagcaaatctccaacagcacatctggaggatcttcaaatgacaacgcctacttcggctacagcaccccctgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttctcaccacgtgactggcagcgactcatcaacaacaactggggattccggcctaagcgactcaacttcaagctcttcaacattcaggtcaaagaggttacggacaacaatggagtcaagaccatcgccaataaccttaccagcacggtccaggtcttcacggactcagactatcagctcccgtacgtgctcgggtcggctcacgagggctgcctcccgccgttcccagcggacgttttcatgattcctcagtacgggtatctgacgcttaatgatggaagccaggccgtgggtcgttcgtccttttactgcctggaatatttcccgtcgcaaatgctaagaacgggtaacaacttccagttcagctacgagtttgagaacgtacctttccatagcagctacgctcacagccaaagcctggaccgactaatgaatccactcatcgaccaatacttgtactatctctcaaagactattaacggttctggacagaatcaacaaacgctaaaattcagtgtggccggacccagcaacatggctgtccagggaagaaactacatacctggacccagctaccgacaacaacgtgtctcaaccactgtgactcaaaacaacaacagcgaatttgcttggcctggagcttcttcttgggctctcaatggacgtaatagcttgatgaatcctggacctgctatggccagccacaaagaaggagaggaccgtttctttcctttgtctggatctttaatttttggcaaacaaggaactggaagagacaacgtggatgcggacaaagtcatgataaccaacgaagaagaaattaaaactactaacccggtagcaacggagtcctatggacaagtggccacaaaccaccagagtgcccaagcacaggcgcagaccggctgggttcaaaaccaaggaatacttccgggtatggtttggcaggacagagatgtgtacctgcaaggacccatttgggccaaaattcctcacacggacggcaactttcacccttctccgctgatgggagggtttggaatgaagcacccgcctcctcagatcctcatcaaaaacacacctgtacctgcggatcctccaacggccttcaacaaggacaagctgaactctttcatcacccagtattctactggccaagtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaagcgctggaacccggagatccagtacacttccaactattacaagtctaataatgttgaatttgctgttaatactgaaggtgtatatagtgaaccccgccccattggcaccagatacctgactcgtaatctgtaattgcttgttaatcaataaaccgtttaattcgtttcagttgaactttggtctctgcgaaggcgcgccataacttcgttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcgggga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3
具有野生型AAV5 cap之rep/cap質體：pZC107_REP2-AAV5 tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattgacgcgtattgggatgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcggaattcgccctattagagtcctgtattagaggtcacgtgagtgttttgcgacattttgcgacaccatgtggtcacgctgggtatttaagcccgagtgagcacgcagggtctccattttgaagcgggaggtttgaacgcgcagccaccacggcggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgagcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccccggaggcccttttctttgtgcaatttgagaagggagagagctacttccacatgcacgtgctcgtggaaaccaccggggtgaaatccatggttttgggacgtttcctgagtcagattcgcgaaaaactgattcagagaatttaccgcgggatcgagccgactttgccaaactggttcgcggtcacaaagaccagaaatggcgccggaggcgggaacaaggtggtggatgagtgctacatccccaattacttgctccccaaaacccagcctgagctccagtgggcgtggactaatatggaacagtatttaagcgcctgtttgaatctcacggagcgtaaacggttggtggcgcagcatctgacgcacgtgtcgcagacgcaggagcagaacaaagagaatcagaatcccaattctgatgcgccggtgatcagatcaaaaacttcagccaggtacatggagctggtcgggtggctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtgattgacgggaactcaacgaccttcgaacaccagcagccgttgcaagaccggatgttcaaatttgaactcacccgccgtctggatcatgactttgggaaggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaataaatgacttaaaccaggtatgtcttttgttgatcaccctccagattggttggaagaagttggtgaaggtcttcgcgagtttttgggccttgaagcgggcccaccgaaaccaaaacccaatcagcagcatcaagatcaagcccgtggtcttgtgctgcctggttataactatctcggacccggaaacggtctcgatcgaggagagcctgtcaacagggcagacgaggtcgcgcgagagcacgacatctcgtacaacgagcagcttgaggcgggagacaacccctacctcaagtacaaccacgcggacgccgagtttcaggagaagctcgccgacgacacatccttcgggggaaacctcggaaaggcagtctttcaggccaagaaaagggttctcgaaccttttggcctggttgaagagggtgctaagacggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaagaaggctcggaccgaagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatcccagcagctgcaaatcccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgacaataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatgggggacagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagatcaaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtactttgactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggcttcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccaccaccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctacgtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacggttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagtactttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttccactccagcttcgctcccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtaccgcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacacctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgcgccagtgtcagcgccttcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttaccaggtgcccccgcagccgaacggcatgaccaacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacactatgatcttcaacagccagccggcgaacccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatcaccagcgagagcgagacgcagccggtgaaccgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaacaaccagagctccaccactgcccccgcgaccggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtggatggagagggacgtgtacctccaaggacccatctgggccaagatcccagagacgggggcgcactttcacccctctccggccatgggcggattcggactcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctgtgcccggaaatatcaccagcttctcggacgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggcaggtcaccgtggagatggagtgggagctcaagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtacacaaacaactacaacgacccccagtttgtggactttgccccggacagcaccggggaatacagaaccaccagacctatcggaacccgataccttacccgacccctttaacccattcatgtcgcataccctcaataaaccgtgtattcgtgtcagtaaaatactgcctcttgtggtttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactg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4
具有經修飾之AAV9 cap之rep/cap質體：pZC375_AAV9.VR-VIII-NSTYLG_VR-IV-KGSGQNQ tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattgacgcgtattgggatgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcggaattcgccctattagagtcctgtattagaggtcacgtgagtgttttgcgacattttgcgacaccatgtggtcacgctgggtatttaagcccgagtgagcacgcagggtctccattttgaagcgggaggtttgaacgcgcagccaccacggcggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgagcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccccggaggcccttttctttgtgcaatttgagaagggagagagctacttccacatgcacgtgctcgtggaaaccaccggggtgaaatccatggttttgggacgtttcctgagtcagattcgcgaaaaactgattcagagaatttaccgcgggatcgagccgactttgccaaactggttcgcggtcacaaagaccagaaatggcgccggaggcgggaacaaggtggtggatgagtgctacatccccaattacttgctccccaaaacccagcctgagctccagtgggcgtggactaatatggaacagtatttaagcgcctgtttgaatctcacggagcgtaaacggttggtggcgcagcatctgacgcacgtgtcgcagacgcaggagcagaacaaagagaatcagaatcccaattctgatgcgccggtgatcagatcaaaaacttcagccaggtacatggagctggtcgggtggctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtgattgacgggaactcaacgaccttcgaacaccagcagccgttgcaagaccggatgttcaaatttgaactcacccgccgtctggatcatgactttgggaaggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaataaatgacttaaaccaggtatggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacaaccttagtgaaggaattcgcgagtggtgggctttgaaacctggagcccctcaacccaaggcaaatcaacaacatcaagacaacgctcgaggtcttgtgcttccgggttacaaataccttggacccggcaacggactcgacaagggggagccggtcaacgcagcagacgcggcggccctcgagcacgacaaggcctacgaccagcagctcaaggccggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgccgagttccaggagcggctcaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcgggcgagcagtcttccaggccaaaaagaggcttcttgaacctcttggtctggttgaggaagcggctaagacggctcctggaaagaagaggcctgtagagcagtctcctcaggaaccggactcctccgcgggtattggcaaatcgggtgcacagcccgctaaaaagagactcaatttcggtcagactggcgacacagagtcagtcccagaccctcaaccaatcggagaacctcccgcagccccctcaggtgtgggatctcttacaatggcttcaggtggtggcgcaccagtggcagacaataacgaaggtgccgatggagtgggtagttcctcgggaaattggcattgcgattcccaatggctgggggacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaatcacctctacaagcaaatctccaacagcacatctggaggatcttcaaatgacaacgcctacttcggctacagcaccccctgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttctcaccacgtgactggcagcgactcatcaacaacaactggggattccggcctaagcgactcaacttcaagctcttcaacattcaggtcaaagaggttacggacaacaatggagtcaagaccatcgccaataaccttaccagcacggtccaggtcttcacggactcagactatcagctcccgtacgtgctcgggtcggctcacgagggctgcctcccgccgttcccagcggacgttttcatgattcctcagtacgggtatctgacgcttaatgatggaagccaggccgtgggtcgttcgtccttttactgcctggaatatttcccgtcgcaaatgctaagaacgggtaacaacttccagttcagctacgagtttgagaacgtacctttccatagcagctacgctcacagccaaagcctggaccgactaatgaatccactcatcgaccaatacttgtactatctctcaaagactattaagggctccggccagaatcagcaaacgctaaaattcagtgtggccggacccagcaacatggctgtccagggaagaaactacatacctggacccagctaccgacaacaacgtgtctcaaccactgtgactcaaaacaacaacagcgaatttgcttggcctggagcttcttcttgggctctcaatggacgtaatagcttgatgaatcctggacctgctatggccagccacaaagaaggagaggaccgtttctttcctttgtctggatctttaatttttggcaaacaaggaactggaagagacaacgtggatgcggacaaagtcatgataaccaacgaagaagaaattaaaactactaacccggtagcaacggagtcctatggacaagtggccacaaaccacaattccacctacctgggcgcgcagaccggctgggttcaaaaccaaggaatacttccgggtatggtttggcaggacagagatgtgtacctgcaaggacccatttgggccaaaattcctcacacggacggcaactttcacccttctccgctgatgggagggtttggaatgaagcacccgcctcctcagatcctcatcaaaaacacacctgtacctgcggatcctccaacggccttcaacaaggacaagctgaactctttcatcacccagtattctactggccaagtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaagcgctggaacccggagatccagtacacttccaactattacaagtctaataatgttgaatttgctgttaatactgaaggtgtatatagtgaaccccgccccattggcaccagatacctgactcgtaatctgtaattgcttgttaatcaataaaccgtttaattcgtttcagttgaactttggtctctgcgaaggcgcgccataacttcgttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcgggga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具有經修飾之AAV9 cap之rep/cap質體：pZC401_AAV9.VR-VIII-MMTTAR 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tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattgacgcgtattgggatgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcggaattcgccctattagagtcctgtattagaggtcacgtgagtgttttgcgacattttgcgacaccatgtggtcacgctgggtatttaagcccgagtgagcacgcagggtctccattttgaagcgggaggtttgaacgcgcagccaccacggcggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgagcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccccggaggcccttttctttgtgcaatttgagaagggagagagctacttccacatgcacgtgctcgtggaaaccaccggggtgaaatccatggttttgggacgtttcctgagtcagattcgcgaaaaactgattcagagaatttaccgcgggatcgagccgactttgccaaactggttcgcggtcacaaagaccagaaatggcgccggaggcgggaacaaggtggtggatgagtgctacatccccaattacttgctccccaaaacccagcctgagctccagtgggcgtggactaatatggaacagtatttaagcgcctgtttgaatctcacggagcgtaaacggttggtggcgcagcatctgacgcacgtgtcgcagacgcaggagcagaacaaagagaatcagaatcccaattctgatgcgccggtgatcagatcaaaaacttcagccaggtacatggagctggtcgggtggctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtgattgacgggaactcaacgaccttcgaacaccagcagccgttgcaagaccggatgttcaaatttgaactcacccgccgtctggatcatgactttgggaaggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaataaatgacttaaaccaggtatggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacaaccttagtgaaggaattcgcgagtggtgggctttgaaacctggagcccctcaacccaaggcaaatcaacaacatcaagacaacgctcgaggtcttgtgcttccgggttacaaataccttggacccggcaacggactcgacaagggggagccggtcaacgcagcagacgcggcggccctcgagcacgacaaggcctacgaccagcagctcaaggccggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgccgagttccaggagcggctcaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcgggcgagcagtcttccaggccaaaaagaggcttcttgaacctcttggtctggttgaggaagcggctaagacggctcctggaaagaagaggcctgtagagcagtctcctcaggaaccggactcctccgcgggtattggcaaatcgggtgcacagcccgctaaaaagagactcaatttcggtcagactggcgacacagagtcagtcccagaccctcaaccaatcggagaacctcccgcagccccctcaggtgtgggatctcttacaatggcttcaggtggtggcgcaccagtggcagacaataacgaaggtgccgatggagtgggtagttcctcgggaaattggcattgcgattcccaatggctgggggacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaatcacctctacaagcaaatctccaacagcacatctggaggatcttcaaatgacaacgcctacttcggctacagcaccccctgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttctcaccacgtgactggcagcgactcatcaacaacaactggggattccggcctaagcgactcaacttcaagctcttcaacattcaggtcaaagaggttacggacaacaatggagtcaagaccatcgccaataaccttaccagcacggtccaggtcttcacggactcagactatcagctcccgtacgtgctcgggtcggctcacgagggctgcctcccgccgttcccagcggacgttttcatgattcctcagtacgggtatctgacgcttaatgatggaagccaggccgtgggtcgttcgtccttttactgcctggaatatttcccgtcgcaaatgctaagaacgggtaacaacttccagttcagctacgagtttgagaacgtacctttccatagcagctacgctcacagccaaagcctggaccgactaatgaatccactcatcgaccaatacttgtactatctctcaaagactattaacggttctggacagaatcaacaaacgctaaaattcagtgtggccggacccagcaacatggctgtccagggaagaaactacatacctggacccagctaccgacaacaacgtgtctcaaccactgtgactcaaaacaacaacagcgaatttgcttggcctggagcttcttcttgggctctcaatggacgtaatagcttgatgaatcctggacctgctatggccagccacaaagaaggagaggaccgtttctttcctttgtctggatctttaatttttggcaaacaaggaactggaagagacaacgtggatgcggacaaagtcatgataaccaacgaagaagaaattaaaactactaacccggtagcaacggagtcctatggacaagtggccacaaaccattgtagcactagcatcagggcgcagaccggctgggttcaaaaccaaggaatacttccgggtatggtttggcaggacagagatgtgtacctgcaaggacccatttgggccaaaattcctcacacggacggcaactttcacccttctccgctgatgggagggtttggaatgaagcacccgcctcctcagatcctcatcaaaaacacacctgtacctgcggatcctccaacggccttcaacaaggacaagctgaactctttcatcacccagtattctactggccaagtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaagcgctggaacccggagatccagtacacttccaactattacaagtctaataatgttgaatttgctgttaatactgaaggtgtatatagtgaaccccgccccattggcaccagatacctgactcgtaatctgtaattgcttgttaatcaataaaccgtttaattcgtttcagttgaactttggtctctgcgaaggcgcgccataacttcgttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcgggga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8
具有經修飾之AAV9 cap之rep/cap質體：pZC96_REP2-CR9-10 tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattgacgcgtattgggatgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcggaattcgccctattagagtcctgtattagaggtcacgtgagtgttttgcgacattttgcgacaccatgtggtcacgctgggtatttaagcccgagtgagcacgcagggtctccattttgaagcgggaggtttgaacgcgcagccaccacggcggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgggcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccccggaggcccttttctttgtgcaatttgagaagggagagagctacttccacatgcacgtgctcgtggaaaccaccggggtgaaatccatggttttgggacgtttcctgagtcagattcgcgaaaaactgattcagagaatttaccgcgggatcgagccgactttgccaaactggttcgcggtcacaaagaccagaaatggcgccggaggcgggaacaaggtggtggatgagtgctacatccccaattacttgctccccaaaacccagcctgagctccagtgggcgtggactaatatggaacagtatttaagcgcctgtttgaatctcacggagcgtaaacggttggtggcgcagcatctgacgcacgtgtcgcagacgcaggagcagaacaaagagaatcagaatcccaattctgatgcgccggtgatcagatcaaaaacttcagccaggtacatggagctggtcgggtggctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtgattgacgggaactcaacgaccttcgaacaccagcagccgttgcaagaccggatgttcaaatttgaactcacccgccgtctggatcatgactttgggaaggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaataaatgacttaaaccaggtatggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacaaccttagtgaaggaattcgcgagtggtgggctttgaaacctggagcccctcaacccaaggcaaatcaacaacatcaagacaacgctcgaggtcttgtgcttccgggttacaaataccttggacccggcaacggactcgacaagggggagccggtcaacgcagcagacgcggcggccctcgagcacgacaaggcctacgaccagcagctcaaggccggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgccgagttccaggagcggctcaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcgggcgagcagtcttccaggccaaaaagaggcttcttgaacctcttggtctggttgaggaagcggctaagacggctcctggaaagaagaggcctgtagagcagtctcctcaggaaccggactcctccgcgggtattggcaaatcgggtgcacagcccgctaaaaagagactcaatttcggtcagactggcgacacagagtcagtcccagaccctcaaccaatcggagaacctcccgcagccccctcaggtgtgggatctcttacaatggcttcaggtggtggcgcaccagtggcagacaataacgaaggtgccgatggagtgggtagttcctcgggaaattggcattgcgattcccaatggctgggggacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaatcacctctacaagcaaatctccaacagcacatctggaggatcttcaaatgacaacgcctacttcggctacagcaccccctgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttctcaccacgtgactggcagcgactcatcaacaacaactggggattccggcctaagcgactcaacttcaagctcttcaacattcaggtcaaagaggttacggacaacaatggagtcaagaccatcgccaataaccttaccagcacggtccaggtcttcacggactcagactatcagctcccgtacgtgctcgggtcggctcacgagggctgcctcccgccgttcccagcggacgttttcatgattcctcagtacgggtatctgacgcttaatgatggaagccaggccgtgggtcgttcgtccttttactgcctggaatatttcccgtcgcaaatgctaagaacgggtaacaacttccagttcagctacgagtttgagaacgtacctttccatagcagctacgctcacagccaaagcctggaccgactaatgaatccactcatcgaccaatacttgtactatctctcaaagactattaacggttctggacagaatcaacaaacgctaaaattcagtgtggccggacccagcaacatggctgtccagggaagaaactacatacctggacccagctaccgacaacaacgtgtctcaaccactgtgactcaaaacaacaacagcgaatttgcttggcctggagcttcttcttgggctctcaatggacgtaatagcttgatgaatcctggacctgctatggccagccacaaagaaggagaggaccgtttctttcctttgtctggatctttaatttttggcaaacaaggaactggaagagacaacgtggatgcggacaaagtcatgataaccaacgaagaagaaattaaaactactaacccggtagcaacggagtcctatggacaagtggccacaaaccaccaggctaattatggtcaggcgcagaccggctgggttcaaaaccaaggaatacttccgggtatggtttggcaggacagagatgtgtacctgcaaggacccatttgggccaaaattcctcacacggacggcaactttcacccttctccgctgatgggagggtttggaatgaagcacccgcctcctcagatcctcatcaaaaacacacctgtacctgcggatcctccaacggccttcaacaaggacaagctgaactctttcatcacccagtattctactggccaagtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaagcgctggaacccggagatccagtacacttccaactattacaagtctaataatgttgaatttgctgttaatactgaaggtgtatatagtgaaccccgccccattggcaccagatacctgactcgtaatctgtaattgcttgttaatcaataaaccgtttaattcgtttcagttgaactttggtctctgcgaaggcgcgccataacttcgttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcgggga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9
REP蛋白 TAGFYEIVIKVPSDLDEHLPGISDSFVNWVAEKEWELPPDSDMDLNLIEQAPLTVAEKLQRDFLTEWRRVSKAPEALFFVQFEKGESYFHMHVLVETTGVKSMVLGRFLSQIREKLIQRIYRGIEPTLPNWFAVTKTRNGAGGGNKVVDECYIPNYLLPKTQPELQWAWTNMEQYLSACLNLTERKRLVAQHLTHVSQTQEQNKENQNPNSDAPVIRSKTSARYMELVGWLVDKGITSEKQWIQEDQASYISFNAASNSRSQIKAALDNAGKIMSLTKTAPDYLVGQQPVEDISSNRIYKILELNGYDPQYAASVFLGWATKKFGKRNTIWLFGPATTGKTNIAEAIAHTVPFYGCVNWTNENFPFNDCVDKMVIWWEEGKMTAKVVESAKAILGGSKVRVDQKCKSSAQIDPTPVIVTSNTNMCAVIDGNSTTFEHQQPLQDRMFKFELTRRLDHDFGKVTKQEVKDFFRWAKDHVVEVEHEFYVKKGGAKKRPAPSDADISEPKRVRESVAQPSTSDAEASINYADRYQNKCSRHVGMNLMLFPCRQCERMNQNSNICFTHGQKDCLECFPVSESQPVSVVKKAYQKLCYIHHIMGKVPDACTACDLVNVDLDDCIFEQ 10
AAV9 VP1蛋白 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL 11
AAV9 VP2蛋白 TAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL 12
AAV9 VP3蛋白 MASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL 13
AAP9組裝活化蛋白 LATQSQSQTLNQSENLPQPPQVWDLLQWLQVVAHQWQTITKVPMEWVVPREIGIAIPNGWGTESSPPAPEPGPCPPTTITSTSKSPTAHLEDLQMTTPTSATAPPGGILTSTDSTATSHHVTGSDSSTTTGDSGLSDSTSSSSTFRSKRLRTTMESRPSPITLPARSRSSRTQTISSRTCSGRLTRAASRRSQRTFS 14
AAV9 VR-IV NGSGQNQ 15
AAV9 VR-V NNSEFA 16
AAV9 VR-VII GRDNV 17
AAV9 VR-VIII ATNHQSAQAQAQTG 18
AAV5 VP1蛋白 MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL 19
AAV5 VP2蛋白 TAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL 20
AAV5 VP3蛋白 MSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL 21
AAP5組裝活化蛋白 LDPADPSSCKSQPNQPQVWELIQCLREVAAHWATITKVPMEWAMPREIGIAIPRGWGTESSPSPPEPGCCPATTTTSTERSKAAPSTEATPTPTLDTAPPGGTLTLTASTATGAPETGKDSSTTTGASDPGPSESKSSTFKSKRSRCRTPPPPSPTTSPPPSKCLRTTTTSCPTSSATGPRDACRPSLRRSLRCRSTVTRR 22
ZC375衣殼 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTIKGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHNSTYLGAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL 23
ZC401衣殼 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHMMTTARAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL 24
ZC428衣殼 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHNSTYLGAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL 25
ZC478衣殼 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHCSTSIRAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL 26
ZC96衣殼 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQANYGQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL 44
ZC621 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVADVQQLPGFQAQTEWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL 93
ZC623 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVADVQQHPGFQAQTEWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL 94
ZC625 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSHVRGDLSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL 95
ZC626 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGVVSSGARSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL 96
ZC630 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSSVRGDAARLAGAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL 97
ZC631 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVADVQQVPGFQAQTMWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL 98
ZC632 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVADVQQVPGFQAQTQWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL 99
ZC633 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVADVQQLPGFGAQTEWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL 100
ZC634 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVADVQQLPGFRPETEWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL 101
ZC635 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVADVQQLPGFNAQTEWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL 102
以引用之方式併入
本文引用諸如專利、專利申請案及公開案之各種參考文獻，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。此外，本文中所提及之所有參考文獻均以引用之方式特定併入以揭示及描述與所引用之公開案相關的方法及/或材料。
圖 1展示編碼轉殖基因(人類PKP2)之例示性rAAV載體之示意圖，該rAAV載體包含600 bp之cTnT啟動子、轉殖基因、WPRE、bGH聚(腺苷酸)，且其中此表現卡匣側接ITR。此載體稱為「jy08-paav-1-第2代_ptnt600-hpkp2最佳化-wpre」。PKP2轉殖基因用於實例中所描述之實驗中。
圖 2展示例示性輔助質體「pHelper」之示意圖。
圖 3展示包含rep序列及野生型AAV9 cap序列之例示性「pZC100_REP2_AAV9」rep/cap質體的示意圖。
圖 4展示包含rep序列及野生型AAV5 cap序列之例示性「pZC107_REP2_AAV5」rep/cap質體的示意圖。
圖 5展示包含rep序列及經修飾之AAV9 cap序列之例示性「pZC375_AAV9.VR-VIII-NSTYLG_VR-IV-KGSGQNQ」(「pZC375」) rep/cap質體的示意圖。
圖 6展示包含rep序列及經修飾之AAV9 cap序列之例示性「pZC401_AAV9.VR-VIII-MMTTAR」(「pZC401」) rep/cap質體的示意圖。
圖 7展示包含rep序列及經修飾之AAV9 cap序列之例示性「pZC428_AAV9.VR-VIII-NSTYLG」(「pZC428」) rep/cap質體的示意圖。
圖 8展示包含rep序列及經修飾之AAV9 cap序列之例示性「pZC478_AAV9.VR-VIII-CSTSIR」(「pZC478」) rep/cap質體的示意圖。
圖 9展示包含rep序列及經修飾之AAV9 cap序列之例示性「pZC96_REP2-CR9-10」(「pZC96」) rep/cap質體的示意圖。
圖 10A 至圖 10B展示在添加有所測試化合物(包括SMB)之HEK293細胞培養物中進行之AAV-GFP強度篩選( 圖 10A)及質譜分析( 圖 10B) (相對於基線之倍數改善)。 圖 10B展示純度＞99%之所測試化合物(SMB)之液相層析質譜法(LC/MS)波譜的例示性樣品。縮寫「SMB」係指小分子促進劑，其為選擇性HDAC6抑制劑。
圖 11展示當添加至培養基中時，所測試化合物改良50 L及200 L生物反應器(BRX)之擴大生產力。在50 L及200 L BRX規模上均成功實現規模化。在BRX規模上測試之AAV9及其他衣殼(AAV9變異體衣殼，稱為「新穎衣殼」1、2、3及4)中觀測到由SMB帶來之Vg力價提昇。在來自 圖 11至 圖 17之圖式中所提及之「SMB」為化合物I-6，其結構提供於表3中。「SF」係指搖瓶。
圖 12A 至圖 12C展示含有及不含有SMB時之3 L BRX可擴展性結果。 圖 12A展示細胞培養物中含有及不含有SMB時之活細胞密度及活細胞密度%比較。 圖 12B展示在3 L BRX中，與不含有SMB相比，含有SMB之Vg力價增加39%。 圖 12C展示搖瓶衛星中含有及不含有SMB之代謝物相當。
圖 13A展示來自小規模搖瓶生產的經親和力純化之AAV:GFP轉導的心肌細胞之西方墨點(Western blot)影像(重複2次，1次用SMB培養且1次不用SMB培養)。展示含有及不含有SMB時VP1/VP2/VP3之比率一致。 圖 13B展示經GFP轉導之心肌細胞影像及毛細管電泳法(capillary electrophoresis；CE)電泳圖以驗證SMB對AAV品質之影響。該圖展示：(i) SMB添加對AAV感染性無顯著影響，及(ii)根據CE電泳圖，發現VP1/VP2/VP3比率在含有及不含有SMB時類似。
圖 14A展示純化回收比較，且 圖 14B展示含有及不含有SMB之拋光步驟的層析。SMB添加對純化效能無影響。
圖 15展示來自注射含有及不含有SMB時所產生之AAV的小鼠之活體內肝臟及心臟樣品的qPCR分析。在含有及不含有SMB之培養物之間未觀測到肝臟及心臟之活體內轉導的顯著差異。
圖 16展示含有及不含有SMB時之慢病毒力價。相對於不添加SMB之製程，添加SMB之慢病毒生產的力價增加超過39%。
圖 17展示來自RNAseq分析的具有SMB之生產培養物相對於無SMB之生產培養物中富集及消耗路徑的熱圖。
圖 18展示在添加或不添加SMB (其可包括選擇性HDAC6抑制劑及/或額外化合物)時，在搖瓶中培養細胞用於AAV生產之過程的示意圖。
圖 19展示自細胞培養物中採集AAV以確定病毒力價之過程的示意圖。
圖 20展示DMSO對照細胞培養物及經單獨使用TYA-004 (一種選擇性HDAC6抑制劑)或其與其他額外化合物組合使用而處理之細胞培養物的AAV病毒力價。當將TYA-004添加至細胞培養物中時，病毒力價增加。藉由添加TYA-004、Ac-DEVD-CHO及SN-011 (TYA-004+CHO+SN-011)之組合及TYA-004、Ac-DEVD-CHO、SN-011及羅西司他(TYA-004+CHO+SN-011+羅西司他)之組合，進一步提昇病毒力價。
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Claims (127)

  1. 一種生產病毒粒子及/或增加病毒粒子力價之方法，其包含： 用病毒粒子或將在細胞中封裝成病毒粒子之重組病毒載體轉染或轉導細胞培養物中之細胞； 將選擇性HDAC6抑制劑添加至該細胞培養物中；及 在該細胞培養物中培養該等細胞。
  2. 如請求項1之方法，其中該等細胞為哺乳動物細胞。
  3. 如請求項2之方法，其中該等哺乳動物細胞係選自由以下組成之群：HEK293、HEK293T、HeLa、Vero、MDCK、MRC-5、PER.C6、BHK21及CHO。
  4. 如請求項3之方法，其中該等哺乳動物細胞為HEK293或HEK293T細胞或細胞株。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該等病毒粒子或重組病毒載體中之病毒為腺病毒、腺相關病毒(AAV)、慢病毒、逆轉錄病毒、疱疹病毒、單純疱疹病毒、牛痘病毒、流感病毒、輪狀病毒、A型肝炎病毒、CMV病毒、RSV病毒、輪狀病毒、水泡性口炎病毒或狂犬病病毒。
  6. 如請求項5之方法，其中該病毒或重組病毒載體為AAV病毒。
  7. 如請求項5之方法，其中該病毒或重組病毒載體為慢病毒或逆轉錄病毒。
  8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中與HDAC之所有其他同功酶相比，該選擇性HDAC6抑制劑對HDAC6之選擇性高至少50倍或至少100倍。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中與HDAC之所有其他同功酶相比，該選擇性HDAC6抑制劑對HDAC6之選擇性高至少500倍或至少1000倍。
  10. 如請求項1至9中任一項之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑為氟烷基-㗁二唑衍生物。
  11. 如請求項1至10中任一項之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑為式(I)化合物： (I)，或其鹽， 其中： R 1係選自由以下組成之群： R a係選自由H、鹵基、C 1 - 3烷基、環烷基、鹵烷基及烷氧基組成之群； R 2及R 3獨立地選自由以下組成之群：H、鹵素、烷氧基、鹵烷基、芳基、雜芳基、烷基及環烷基，其各自視情況經取代，或R 2及R 3與其所連接之原子一起形成環烷基或雜環基； R 4及R 5獨立地選自由以下組成之群：H、-(SO 2)R 2、-(SO 2)NR 2R 3、-(CO)R 2、-(CONR 2R 3)、芳基、芳基雜芳基、伸烷基芳基、雜芳基、環烷基、雜環基、烷基、鹵烷基及烷氧基，其各自視情況經取代，或R 4及R 5與其所連接之原子一起形成環烷基或雜環基，其各自視情況經取代； R 9係選自由H、C 1-C 6烷基、鹵烷基、環烷基及雜環基組成之群； X 1係選自由S、O、NH及NR 6組成之群，其中R 6係選自由C 1-C 6烷基、烷氧基、鹵烷基、環烷基及雜環基組成之群； Y係選自由CR 2、O、N、S、SO及SO 2組成之群，其中當Y為O、S、SO或SO 2時，R 5不存在且當R 4及R 5與其所連接之原子一起形成環烷基或雜環基時，Y為CR 2或N；及 n係選自0、1及2。
  12. 如請求項1至11中任一項之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑係選自表3中之任何HDAC6抑制劑。
  13. 如請求項12之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑為表3中之任何HDAC6抑制劑，其IC 50等於或小於0.03 µM。
  14. 如請求項1至13中任一項之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑為 或其類似物或鹽。
  15. 如請求項1至13中任一項之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑為 或其類似物或鹽。
  16. 如請求項1至13中任一項之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑為具有下式之化合物： (Iy)，或其鹽， 其中： X 1為S； R a係選自由H、鹵素及C 1 - 3烷基組成之群； R 1為 或 ； R 2係選自由以下組成之群：烷基、烷氧基及環烷基，其各自視情況經取代； R 3為H或烷基； R 4係選自由烷基、-(SO 2)R 2、-(SO 2)NR 2R 3及-(CO)R 2組成之群；及 R 5為芳基或雜芳基；或R 4及R 5與其所連接之原子一起形成雜環基，其各自視情況經取代。
  17. 如請求項16之方法，其中R a為H。
  18. 如請求項16或17之方法，其中R 1為 。
  19. 如請求項16至18中任一項之方法，其中R 4為-(SO 2)R 2。
  20. 如請求項19之方法，其中-(SO 2)R 2為-(SO 2)烷基、-(SO 2)伸烷基雜環基、-(SO 2)鹵烷基、-(SO 2)鹵烷氧基或-(SO 2)環烷基。
  21. 如請求項16至20中任一項之方法，其中R 5為雜芳基。
  22. 如請求項21之方法，其中該雜芳基為5員至6員雜芳基。
  23. 如請求項22之方法，其中該5員至6員雜芳基係選自由以下組成之群： ，其中R b為鹵素、烷基、烷氧基、環烷基、-CN、鹵烷基或鹵烷氧基；且m為0或1。
  24. 如請求項23之方法，其中R b為F、Cl、-CH 3、-CH 2CH 3、-CF 3、-CHF 2、-CF 2CH 3、-CN、-OCH 3、-OCH 2CH 3、-OCH(CH 3) 2、-OCF 3、-OCHF 2、-OCH 2CF 2H及環丙基。
  25. 如請求項16至24中任一項之方法，其中該芳基係選自由以下組成之群：苯基、3-氯苯基、3-氯-4-氟苯基、3-三氟甲基苯基、3,4-二氟苯基及2,6-二氟苯基。
  26. 如請求項1至13中任一項之方法，該選擇性HDAC6抑制劑為式(Ic)化合物： (Ic)，或其鹽， 其中： R a係選自由H、鹵基、C 1 - 3烷基、環烷基、鹵烷基及烷氧基組成之群； R 2係選自由以下組成之群：烷基、烷氧基及環烷基，其各自視情況經取代； R 3為H、烷基或芳基； R 4係選自由以下組成之群：H、-(SO 2)R 2、-(SO 2)NR 2R 3、-(CO)R 2、-(CONR 2R 3)、芳基、芳基雜芳基、伸烷基芳基、雜芳基、環烷基、雜環基、烷基、鹵烷基及烷氧基，其各自視情況經取代； R 5為芳基、芳基雜芳基、伸烷基芳基、雜芳基、環烷基、雜環基、烷基、鹵烷基及烷氧基，其各自視情況經取代；或R 4及R 5與其所連接之原子一起形成雜環基，其各自視情況經取代。
  27. 如請求項1至13中任一項之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑為式(Ik)化合物： (Ik)，或其鹽， 其中： R b為H、鹵素、烷基、環烷基、-CN、鹵烷基或鹵烷氧基；及 R 4為烷基、烷氧基、鹵烷基或環烷基，其各自視情況經取代。
  28. 如請求項27之方法，其中R b為H、鹵素、鹵烷基或鹵烷氧基。
  29. 如請求項27或28之方法，其中R 4為視情況經取代之烷基或環烷基。
  30. 如請求項27之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑為式(Ik-1)化合物： (Ik-1)，或其鹽， 其中： R b為H、鹵素、烷基、環烷基、-CN、鹵烷基或鹵烷氧基；及 R 4為烷基、烷氧基、鹵烷基或環烷基，其各自視情況經取代。
  31. 如請求項30之方法，其中R b為H、鹵素、鹵烷基或鹵烷氧基。
  32. 如請求項30或31之方法，其中R 4為視情況經取代之烷基或環烷基。
  33. 如請求項30之方法，其中R 4為烷基。
  34. 如請求項27之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑為式(Ik-2)化合物： (Ik-2)，或其鹽， 其中： R b為H、鹵素、烷基、環烷基、-CN、鹵烷基或鹵烷氧基；及 R 4為烷基、烷氧基、鹵烷基或環烷基，其各自視情況經取代。
  35. 如請求項34之方法，其中R b為H、鹵素、鹵烷基或鹵烷氧基。
  36. 如請求項34或35之方法，其中R 4為視情況經取代之烷基。
  37. 如請求項16之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑為下式化合物： ，或其類似物或鹽。
  38. 如請求項16之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑為下式化合物： ，或其類似物或鹽。
  39. 如請求項16之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑為下式化合物： ，或其類似物或鹽。
  40. 如請求項16之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑為下式化合物： ，或其類似物或鹽。
  41. 如請求項16之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑為下式化合物： ，或其類似物或鹽。
  42. 如請求項16之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑為下式化合物： ，或其類似物或鹽。
  43. 如請求項16之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑為下式化合物： ，或其類似物或鹽。
  44. 如請求項16之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑為下式化合物： ，或其類似物或鹽。
  45. 如請求項16之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑為下式化合物： ，或其類似物或鹽。
  46. 如請求項16之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑為下式化合物： ，或其類似物或鹽。
  47. 如請求項16之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑為下式化合物： ，或其類似物或鹽。
  48. 如請求項1至9中任一項之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑為式(II)化合物： (II)， 其中： n為0或1； X為O、NR 4或CR 4R 4 '； Y為鍵，CR 2R 3或S(O) 2； R 1係選自由以下組成之群：H、醯胺基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基； R 2及R 3獨立地選自由以下組成之群：H、鹵素、烷基、碳環基、雜環基、芳基、雜芳基、-(CH 2)-碳環基、-(CH 2)-雜環基、-(CH 2)-芳基及-(CH 2)-雜芳基；或 R 1及R 2與其所連接之碳原子一起形成碳環基或雜環基；或 R 2及R 3與其所連接之碳原子一起形成碳環基或雜環基；及 R 4及R 4'各自獨立地選自由以下組成之群：H、烷基、-CO 2-烷基、碳環基、雜環基、芳基、雜芳基、-(CH 2)-碳環基、-(CH 2)-雜環基、-(CH 2)-芳基及-(CH 2)-雜芳基；或 R 4及R 4'與其所連接之碳原子一起形成碳環基或雜環基； 其中各烷基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地視情況經一或多個選自由以下組成之群的取代基取代：鹵素、鹵烷基、側氧基、羥基、烷氧基、-OCH 3、-CO 2CH 3、-C(O)NH(OH)、-CH 3、𠰌啉及-C(O)N-環丙基。
  49. 如請求項48之方法，其中該式(II)化合物係選自由以下組成之群： ；或其類似物或鹽。
  50. 如請求項48之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑係選自表5中之任何HDAC6抑制劑。
  51. 如請求項50之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑為表5中之任何HDAC6抑制劑，其IC 50等於或小於0.03 µM。
  52. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑不為異羥肟酸。
  53. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑不為羅西司他(rocilinostat)。
  54. 如請求項1至53中任一項之方法，其中該選擇性HDAC6抑制劑係以有效達成其在該細胞培養物中之濃度介於0.1 µM與100 µM之間的量添加至該細胞培養物中。
  55. 如請求項54之方法，其中該細胞培養物中之該選擇性HDAC6抑制劑之濃度介於約0.2 µM與50 µM之間。
  56. 如請求項55之方法，其中該細胞培養物中之該選擇性HDAC6抑制劑之濃度介於約0.5 µM與15 µM之間。
  57. 如請求項56之方法，其中該細胞培養物中之該選擇性HDAC6抑制劑之濃度介於約1 µM與5 µM之間。
  58. 如請求項1至57中任一項之方法，其中在該轉染或轉導前的7天至該轉染或轉導後的7天，將該選擇性HDAC6抑制劑添加至該細胞培養物中。
  59. 如請求項58之方法，其中在該轉染或轉導前的3天至該轉染或轉導後的3天，將該選擇性HDAC6抑制劑添加至該細胞培養物中。
  60. 如請求項59之方法，其中在該轉染或轉導前的1天至該轉染或轉導後的1天，將該選擇性HDAC6抑制劑添加至該細胞培養物中。
  61. 如請求項60之方法，其中在該轉染或轉導之6或12小時內，將該選擇性HDAC6抑制劑添加至該細胞培養物中。
  62. 如請求項1至61中任一項之方法，其中在該轉染或轉導前的至少或不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天，將該選擇性HDAC6抑制劑添加至該細胞培養物中。
  63. 如請求項1至61中任一項之方法，其中在該轉染或轉導後的至少或不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天，將該選擇性HDAC6抑制劑添加至該細胞培養物中。
  64. 如請求項1至61中任一項之方法，其中在該轉染或轉導的同時將該選擇性HDAC6抑制劑添加至該細胞培養物中。
  65. 如請求項1至64中任一項之方法，其中該等細胞在該轉染或轉導後培養至少約2、3、4、5、6、7、8、9或10天。
  66. 如請求項65之方法，其中該等細胞在該轉染或轉導後培養約3天或至少約3天。
  67. 如請求項1至65中任一項之方法，其中該等細胞在以下兩種情形後培養至少約2、3、4、5、6、7、8、9或10天：(i)該轉染或轉導，及(ii)該選擇性HDAC6抑制劑之該添加。
  68. 如請求項1至65中任一項之方法，其中該等細胞在以下兩種情形後培養約3天或至少約3天：(i)該轉染或轉導，及(ii)該選擇性HDAC6抑制劑之該添加。
  69. 如請求項1至68中任一項之方法，其中在該細胞培養物中培養該等細胞後採集該等細胞。
  70. 如請求項1至69中任一項之方法，其中自該等細胞分離或純化該等病毒粒子。
  71. 如請求項1至70中任一項之方法，其中該等細胞經以下轉染： (i)    將在該等細胞中封裝成病毒粒子之一或多種該重組病毒載體， 且其中該等細胞包含以下或進一步經以下轉染： (ii)   包含一或多個輔助基因之一或多種輔助質體；及/或 (iii)  包含一或多個基因之一或多種質體，該一或多個基因編碼病毒複製及/或衣殼化所需之一或多個結構蛋白。
  72. 如請求項1至70中任一項之方法，其中該等細胞經以下轉染： (i)    將在該等細胞中封裝成病毒粒子之一或多種該重組病毒載體，其中該病毒載體為AAV； 且其中該等細胞包含以下或進一步經以下轉染： (ii)   包含一或多個輔助基因之一或多種輔助質體；及/或 (iii)  包含rep基因及cap基因之一或多種質體。
  73. 如請求項72之方法，其中該AAV為AAV9。
  74. 如請求項72之方法，其中該AAV為AAV5。
  75. 如請求項71至73中任一項之方法，其中該等細胞經(i)、(ii)及(iii)同時轉染。
  76. 如請求項71至75中任一項之方法，其中該等細胞經(i)、(ii)及/或(iii)暫時轉染。
  77. 如請求項71至74中任一項之方法，其中該等細胞經(i)、(ii)及/或(iii)穩定轉染。
  78. 如請求項77之方法，其中該等細胞經(ii)及/或(iii)穩定轉染。
  79. 如請求項72至78中任一項之方法，其中該一或多種輔助質體表現腺病毒E1a基因、E1b基因、E2a基因、E4基因及VA基因中之一或多者。
  80. 如請求項72至79中任一項之方法，其中包含rep基因及cap基因之該一或多種質體表現能夠封裝該重組病毒載體之rep蛋白及cap蛋白。
  81. 如請求項1至80中任一項之方法，其中該重組病毒載體包含轉殖基因。
  82. 如請求項81之方法，其中該轉殖基因表現治療蛋白。
  83. 如請求項1至80中任一項之方法，其中該重組病毒載體編碼siRNA或shRNA。
  84. 如請求項1至80中任一項之方法，其中該重組病毒載體編碼引導RNA。
  85. 如請求項1至84中任一項之方法，其中與在相同條件下但缺乏該選擇性HDAC6抑制劑之情況下的病毒粒子力價相比，該病毒粒子力價增加至少或超過20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、1000%或5000%。
  86. 如請求項1至85中任一項之方法，其中與在相同條件下但缺乏任何病毒敏化劑之情況下的病毒粒子力價相比，該病毒粒子力價增加至少或超過20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、1000%或5000%。
  87. 如請求項1至86中任一項之方法，其中該方法進一步包含向該細胞培養物中添加一或多種選自由以下組成之群的額外化合物：凋亡蛋白酶抑制劑、干擾素基因刺激蛋白(STING)抑制劑及泛HDAC抑制劑。
  88. 一種生產病毒粒子及/或增加病毒粒子力價之方法，其包含： 用將在細胞中封裝成病毒粒子之重組AAV9載體轉染細胞培養物中之哺乳動物細胞； 向該細胞培養物中添加氟烷基-㗁二唑衍生物；及 在該細胞培養物中培養該等細胞。
  89. 一種生產病毒粒子及/或增加病毒粒子力價之方法，其包含： 用將在細胞中封裝成病毒粒子之重組AAV5載體轉染細胞培養物中之哺乳動物細胞； 向該細胞培養物中添加氟烷基-㗁二唑衍生物；及 在該細胞培養物中培養該等細胞。
  90. 如請求項88或89之方法，其中該等哺乳動物細胞為HEK293或HEK293T細胞或細胞株。
  91. 如請求項90之方法，其中該等HEK293或HEK293T細胞或細胞株具有早期譜系，視情況其中該等細胞為ATCC 1573 HEK或類似早期譜系之另一細胞株，進一步視情況其中該早期譜系具有100代或更少。
  92. 如請求項88至91中任一項之方法，其中該氟烷基-㗁二唑衍生物為具有下式之化合物： (Iy)，或其鹽， 其中： X 1為S； R a係選自由H、鹵素及C 1 - 3烷基組成之群； R 1為 或 ； R 2係選自由以下組成之群：烷基、烷氧基及環烷基，其各自視情況經取代； R 3為H或烷基； R 4係選自由烷基、-(SO 2)R 2、-(SO 2)NR 2R 3及-(CO)R 2組成之群；及 R 5為芳基或雜芳基；或R 4及R 5與其所連接之原子一起形成雜環基，其各自視情況經取代。
  93. 如請求項92之方法，其中R a為H。
  94. 如請求項92或93之方法，其中R 1為 。
  95. 如請求項92至94中任一項之方法，其中R 4為-(SO 2)R 2。
  96. 如請求項92之方法，其中-(SO 2)R 2為-(SO 2)烷基、-(SO 2)伸烷基雜環基、-(SO 2)鹵烷基、-(SO 2)鹵烷氧基或-(SO 2)環烷基。
  97. 如請求項92至96中任一項之方法，其中R 5為雜芳基。
  98. 如請求項97之方法，其中該雜芳基為5員至6員雜芳基。
  99. 如請求項98之方法，其中該5員至6員雜芳基係選自由以下組成之群： ，其中R b為鹵素、烷基、烷氧基、環烷基、-CN、鹵烷基或鹵烷氧基；且m為0或1。
  100. 如請求項99之方法，其中R b為F、Cl、-CH 3、-CH 2CH 3、-CF 3、-CHF 2、-CF 2CH 3、-CN、-OCH 3、-OCH 2CH 3、-OCH(CH 3) 2、-OCF 3、-OCHF 2、-OCH 2CF 2H及環丙基。
  101. 如請求項92至100中任一項之方法，其中該芳基係選自由以下組成之群：苯基、3-氯苯基、3-氯-4-氟苯基、3-三氟甲基苯基、3,4-二氟苯基及2,6-二氟苯基。
  102. 如請求項88至91中任一項之方法，其中該氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
  103. 如請求項88至91中任一項之方法，其中該氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
  104. 如請求項88至91中任一項之方法，其中該氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
  105. 如請求項88至91中任一項之方法，其中該氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
  106. 如請求項88至91中任一項之方法，其中該氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
  107. 如請求項88至91中任一項之方法，其中該氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
  108. 如請求項88至91中任一項之方法，其中該氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
  109. 如請求項88至91中任一項之方法，其中該氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
  110. 如請求項88至91中任一項之方法，其中該氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
  111. 如請求項88至91中任一項之方法，其中該氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
  112. 如請求項88至91中任一項之方法，其中該氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
  113. 如請求項88至91中任一項之方法，其中該氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
  114. 如請求項88至91中任一項之方法，其中該氟烷基-㗁二唑衍生物為： ，或其類似物或鹽。
  115. 如請求項88至114中任一項之方法，其中該氟烷基-㗁二唑衍生物係以有效達成其在該細胞培養物中之濃度介於0.1 µM與100 µM之間，或介於0.2 µM與50 µM之間的量添加至該細胞培養物中。
  116. 如請求項115之方法，其中該細胞培養物中之該氟烷基-㗁二唑衍生物之濃度介於約0.5 µM與15 µM之間。
  117. 如請求項116之方法，其中該細胞培養物中之該氟烷基-㗁二唑衍生物之濃度介於約1.25 µM與5 µM之間。
  118. 如請求項88至117中任一項之方法，其中該等細胞包含以下或進一步經以下轉染： 包含一或多個輔助基因之一或多種輔助質體，及/或 包含rep基因及cap基因之一或多種質體； 視情況其中該等細胞經該重組AAV載體、該一或多種輔助質體及/或包含rep基因及cap基因之該一或多種質體同時或依序轉染。
  119. 如請求項118之方法，其中該一或多種輔助質體表現腺病毒E1a基因、E1b基因、E2a基因、E4基因及VA基因中之一或多者，且其中包含rep基因及cap基因之該一或多種質體表現能夠封裝該重組AAV之rep蛋白及cap蛋白。
  120. 如請求項88至119中任一項之方法，其中該重組AAV包含表現治療蛋白、siRNA、shRNA或引導RNA之轉殖基因。
  121. 如請求項88至120中任一項之方法，其中在該轉染前的7天至該轉染後的7天，將該氟烷基-㗁二唑衍生物添加至該細胞培養物中。
  122. 如請求項121之方法，其中在該轉染或轉導前的2天至該轉染或轉導後的2天，將該氟烷基-㗁二唑衍生物添加至該細胞培養物中。
  123. 如請求項88至122中任一項之方法，其中在該轉染的同時或在該轉染之12小時內，將該氟烷基-㗁二唑衍生物添加至該細胞培養物中。
  124. 如請求項88至120中任一項之方法，其中在該轉染前的3至10天，或在該轉染前的7至10天，將該氟烷基-㗁二唑衍生物添加至該細胞培養物中。
  125. 如請求項88至124中任一項之方法，其中在該細胞培養物中培養該等細胞後採集該等細胞，且自該等細胞分離或純化該等病毒粒子。
  126. 如請求項88至125中任一項之方法，其中與在相同條件下但缺乏該氟烷基-㗁二唑衍生物之情況下的病毒粒子力價相比，該病毒粒子力價增加至少或超過20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、1000%或5000%。
  127. 如請求項88至126中任一項之方法，其中該方法進一步包含向該細胞培養物中添加一或多種選自由以下組成之群的額外化合物：凋亡蛋白酶抑制劑、干擾素基因刺激蛋白(STING)抑制劑及泛HDAC抑制劑。
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