TW202430183A

TW202430183A - Ｔｏｌｌ樣受體調節劑與ｄｓＲＮＡ的聯合治療

Info

Publication number: TW202430183A
Application number: TW112149086A
Authority: TW
Inventors: 李云飛; 張瑱; 林曉燕; 黃曉玲; 鄧永岩
Original assignee: 大陸商上海拓界生物醫藥科技有限公司
Priority date: 2022-12-16
Filing date: 2023-12-15
Publication date: 2024-08-01
Also published as: WO2024125636A1

Abstract

本揭露涉及Toll樣受體調節劑與dsRNA的聯合治療。具體而言，本揭露涉及Toll樣受體調節劑與dsRNA聯合在製備預防和/或治療B型肝炎病毒感染或與B型肝炎病毒相關的疾病的藥物中的用途。

Description

Toll樣受體調節劑與dsRNA的聯合治療

本揭露涉及Toll樣受體調節劑與dsRNA聯合在製備預防和/或治療B型肝炎病毒感染或與B型肝炎病毒相關的疾病的藥物中的用途，屬於醫藥領域。

Toll樣受體(TLR)家族在病原體識別和先天免疫激活中起著重要作用，Toll樣受體8(TLR-8)主要由骨髓免疫細胞表達，該受體的激活會刺激廣泛的免疫反應。TLR-8的激動劑激活髓樣樹突細胞、單核細胞、單核細胞衍生的樹突細胞和Kupffer細胞，導致促炎細胞因子和趨化因子的產生，例如白細胞介素18(IL-18)、白細胞介素12(IL-12)、腫瘤壞死因子-α(TNF-a)和干擾素-γ(IFN-g)。此類激動劑還促進共刺激分子如CD8+細胞、主要組織相容性複合物分子(MAIT、NK細胞)和趨化因子受體的表達增加。TLR8調節化合物包括WO2020007275A中描述的那些。總的來說，這些先天性和適應性免疫反應的激活會誘導免疫反應，並在涉及自身免疫、炎症、過敏、哮喘、移植物排斥、移植物抗宿主病(GvHD)、感染、癌症和免疫缺陷的各種病症中提供治療益處。例如，對於B型肝炎，專職抗原呈遞細胞(pAPC)和其他肝內免疫細胞上TLR8的激活與IL-12和促炎細胞因子的誘導有關，這有望增強HBV特異性T細胞反應，激活肝內NK細胞並驅動抗病毒免疫的重建。

RNA干擾(RNAi)是一種有效的沉默基因表達的方式，利用RNA干擾技術，可以根據編碼這些蛋白的mRNA，設計合適的siRNA，特異性靶向目標mRNA並降解目標mRNA，從而達到抑制相關的蛋白生成的目的。採用靶向配體綴合siRNA，利用靶向配體與細胞膜表面的受體分子結構，從而內吞進入到細胞內，是一種有效的藥物遞送方式。例如，去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)是肝細胞特異性表達的受體，在肝細胞表面具有高豐度，胞內外轉換快速的特點。半乳糖、半乳糖胺、N-乙醯半乳糖胺等單糖和多糖分子對ASGPR有高親和性。文獻報導(10.16476/j.pibb.2015.0028)使用胺基半乳糖分子簇(GalNAc)可以有效遞送siRNA到肝細胞，GalNAc分子被設計成三價或四價的分子簇可以顯著提高單價或二價的GalNAc分子靶向肝細胞的能力。

目前患有慢性HBV感染的患者使用的主要藥物是核苷/核苷酸逆轉錄酶抑制劑(NRTI)，NRTI抑制感染性病毒粒子的產生，並且通常將血清HBVDNA減少到不可檢測。然而，NRTI不直接消除cccDNA，所以病毒蛋白質繼續轉錄和轉譯。因此，肝細胞上病毒表位的表達、亞病毒粒子的分泌和免疫功能異常在很大程度上保持不受NRTI療法的影響。導致的結果是需要長時間的甚至終身的治療。因此，臨床上對有效、耐受良好並且不需要終身服藥的新HBV療法仍有需求。WO2022241134A揭露了一種TLR8調節劑聯合dsRNA，以及PD-1/PD-L1抑制劑治療和/或預防受試者的B型肝炎病毒感染的方法，WO2020232024A揭露一種用於治療HBV感染的組成物及方法，具體涉及dsRNA與PEG-INF。

本揭露涉及一種雙鏈核糖核酸(dsRNA)聯合Toll樣受體8(TLR8)調節劑在製備預防和/或治療B型肝炎病毒感染或與B型肝炎病毒相關的疾病的藥物中的用途。

本揭露還提供了一種預防和/或治療受試者的B型肝炎病毒(HBV)感染或與B型肝炎病毒相關的疾病的方法，給與受試者dsRNA和TLR8調節劑。

本揭露還提供了一種TLR8調節劑，其與dsRNA聯合，用於預防和/或治療B型肝炎病毒感染或與B型肝炎病毒相關的疾病。

本揭露還提供一種dsRNA，其與TLR8調節劑或其可藥用鹽聯合，用於預防和/或治療B型肝炎病毒感染或與B型肝炎病毒相關的疾病。

本揭露還提供一種抑制靶基因或其mRNA表達的方法，其包括向受試者給予有效量或有效劑量的本揭露所述的dsRNA和TLR8調節劑。

一些實施方案中，該與B型肝炎病毒相關的疾病選自慢性肝炎、急性B型肝炎、慢性B型肝炎、D型肝炎病毒感染、D型肝炎、肝纖維化、晚期肝病或肝細胞癌。

一些實施方案中，該與B型肝炎病毒相關的疾病是慢性肝炎，該受試者是HBeAg陽性或HBeAg陰性。

一些實施方案中，該Toll樣受體8(TLR8)調節劑是如式(II)所示的化合物或其可藥用鹽，

一些實施方案中，所述dsRNA，其包含：

siRNA和一個或多個與其綴合的配體；

該siRNA包含有義鏈和反義鏈，

該反義鏈在其5’端起第7位核苷酸位置處包含式(II)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽：

該式(I)所示的化學修飾選自以下任一結構：

、

、

，B與該反義鏈5’端起第7位核苷酸未被修飾時的鹼基相同；

該配體是以下結構所示或其藥學上可接受的鹽：

該有義鏈和反義鏈選自以下任一組：

有義鏈包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

有義鏈包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；

該有義鏈的3’端與所述配體綴合；

該B選自腺嘌呤、鳥嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、6-二甲基胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

本揭露中，按照5’-3’方向，

SEQ ID NO：1是GUGUGCACUUCGCUUCACC；

SEQ ID NO：2是AGUGAAGCGAAGUGCACACGG；

SEQ ID NO：3是IGUGAAGCGAAGUGCACACGG。

一些實施方案中，該dsRNA中的配體藉由磷酸酯基團或硫代磷酸酯基團與該siRNA末端連接。

一些實施方案中，該dsRNA中的配體藉由磷酸二酯基團或硫代磷酸二酯基團與該siRNA末端連接。

一些實施方案中，該dsRNA中的配體藉由磷酸二酯基團與該siRNA末端連接。

一些實施方案中，該dsRNA中的配體藉由磷酸酯基團或硫代磷酸酯基團與該siRNA末端間接連接。

一些實施方案中，該dsRNA中的配體藉由磷酸酯基團或硫代磷酸酯基團與該siRNA末端直接連接。

一些實施方案中，該dsRNA中的該配體藉由磷酸酯基團或硫代磷酸酯基團與該siRNA的有義鏈3’末端直接連接。

一些實施方案中，該dsRNA中的磷酸酯基團為磷酸一酯基團或磷酸二酯基團。在一些實施方案中，該磷酸酯基團為磷酸二酯基團。

一些實施方案中，該dsRNA中的硫代磷酸酯基團為硫代磷酸一酯基團或硫代磷酸二酯基團。

一些實施方案中，該dsRNA中的硫代磷酸酯基團為硫代磷酸二酯基團。

一些實施方案中，該dsRNA可為以下結構或其藥學上可接受的鹽，

其中，Z為siRNA，該siRNA的有義鏈的3’末端藉由磷酸二酯基團與配體直接連接，該siRNA如本揭露所定義。

一些實施方案中，該dsRNA在包含式(I)所示化學修飾以外的其餘位置處，該有義鏈和/或反義鏈中至少一個另外的核苷酸為修飾的核苷酸。

一些實施方案中，該dsRNA中的修飾的核苷酸選自：2'-甲氧基修飾的核苷酸、2'-經取代的烷氧基修飾的核苷酸、2'-烷基修飾的核苷酸、2'-經取代的烷基修飾的核苷酸、2'-胺基修飾的核苷酸、2'-經取代的胺基修飾的核苷酸、2'-氟修飾的核苷酸、2'-脫氧核苷酸、2'-脫氧-2'-氟修飾的核苷酸、3'-脫氧-胸腺嘧啶核苷酸、異核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA、GNA。

一些實施方案中，該dsRNA中的修飾的核苷酸相互獨立地選自：2'-甲氧基修飾的核苷酸或2'-氟修飾的核苷酸。

一些實施方案中，該dsRNA的有義鏈含有連續三個具有相同修飾的核苷酸。

一些實施方案中，該三個具有相同修飾的核苷酸為2'-氟修飾的核苷酸。

一些實施方案中，按照5'端到3'端的方向，該反義鏈的第2、4、6、10、12、14、16和18位的核苷酸各自獨立地為2'-氟修飾的核苷酸。

一些實施方案中，該siRNA的反義鏈與靶序列至少部分地反向互補。在一些實施方案中，該反義鏈與靶序列之間存在不多於5個、不多於4個、

不多於3個、不多於2個、不多於1個錯配。在一些實施方案中，該反義鏈與靶序列完全反向互補。

一些實施方案中，該siRNA的有義鏈與反義鏈至少部分地反向互補以形成雙鏈區。在一些實施方案中，該有義鏈與反義鏈之間存在不多於5個、不多於4個、不多於3個、不多於2個、不多於1個錯配。在一些實施方案中，該有義鏈與反義鏈完全反向互補。

一些實施方案中，該siRNA的有義鏈和反義鏈各自獨立地具有16至35個、16至34個、17至34個、17至33個、18至33個、18至32個、18至31個、18至30個、18至29個、18至28個、18至27個、18至26個、18至25個、18至24個、18至23個、19至25個、19至24個或19至23個核苷酸(例如19、20、21、22、23個核苷酸)。

一些實施方案中，該siRNA的有義鏈和反義鏈長度相同或不同，該有義鏈的長度為19-23個核苷酸，該反義鏈的長度為19-26個核苷酸。本揭露提供的dsRNA中的有義鏈和反義鏈的長度比可以是19/19、19/20、19/21、19/22、 19/23、19/24、19/25、19/26、20/19、20/20、20/21、20/22、20/23、20/24、20/25、20/26、21/20、21/21、21/22、21/23、21/24、21/25、21/26、22/20、22/21、22/22、22/23、22/24、22/25、22/26、23/20、23/21、23/22、23/23、23/24、23/25或23/26。

一些實施方案中，該siRNA有義鏈和反義鏈的長度比為19/21、21/23或23/25。在一些實施方案中，該有義鏈和反義鏈的長度比為19/21。

一些實施方案中，該siRNA包含一個或兩個平端。

一些具體的實施方案中，siRNA的每條鏈各自獨立地包含具有1至2個未配對的核苷酸，形成突出端。

一些實施方案中，該siRNA包含位於該反義鏈3’端的突出端。

一些實施方案中，siRNA有義鏈中位於5’端第7-9位的三個連續核苷酸為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，該siRNA的有義鏈含有如下式所示的核苷酸序列(5’-3’)：

N_aN_aN_aN_aXN_aN_bN_bN_bN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a

其中，每個X獨立地為N_a或N_b；N_a為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，該siRNA有義鏈含有如下式所示的核苷酸序列：

5’-N_aN_aN_aN_aN_aN_aN_bN_bN_bN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a-3’；或，

5’-N_aN_aN_aN_aN_bN_aN_bN_bN_bN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a-3’；

其中，N_a為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，該siRNA反義鏈含有如下式所示的核苷酸序列：

5’-N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’W’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’-3’；

其中，N_a’為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b’為2'-氟修飾的核苷酸；W，表示2'-甲氧基修飾的核苷酸或包含式(I)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽修飾的核苷酸。

在一些具體的實施方案中，W’表示包含式(I)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽的核苷酸。

在一些具體的實施方案中，式(I)所示的化學修飾選自：

、

和

；其中，B選自鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。在一些具體的實施方案中，B與該反義鏈在其5’端起第7位核苷酸未被修飾時的鹼基相同。

在一些具體的實施方案中，式(I)所示的化學修飾選自：

、

和

；其中，M為O或S；其中，B選自鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶。在一些具體的實施方案中，B與該反義鏈在其5’端起第7位核苷酸未被修飾時的鹼基相同。

在一些具體的實施方案中，該M為S。

一些具體的實施方案中，該M為O。

在一些實施方案中，該有義鏈和/或反義鏈中至少一個磷酸酯基為具有修飾基團的磷酸酯基。該修飾基團使得該siRNA在生物樣品或環境中具有增加的穩定性。在一些實施方案中，該具有修飾基團的磷酸酯基為硫代磷酸酯基。在一些實施方案中，該具有修飾基團的磷酸酯基為硫代磷酸二酯基。

在一些實施方案中，該硫代磷酸二酯基存在於以下位置中的至少一處：

該有義鏈的5'端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；

該有義鏈的5'端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

該反義鏈的5'端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；

該反義鏈的5'端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

該反義鏈的3'端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；以及

該反義鏈的3'端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間。

在一些實施方案中，該有義鏈和/或反義鏈中包括多個硫代磷酸二酯基，該硫代磷酸二酯基存在於：

該有義鏈的5'端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；和，

該有義鏈的5'端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；和，

該反義鏈的5'端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；和，

該反義鏈的5'端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；和，

該反義鏈的3'端第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；和，

該反義鏈的3'端第2個核苷酸和第3個核苷酸之間。

在一些實施方案中，該有義鏈包含如下式所示的核苷酸序列：

5’-NmsNmsNmNmNfNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNm-3’，或，

5’-NmsNmsNmNmNmNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNm-3’，

其中，Nm表示2'-甲氧基修飾的任意核苷酸，例如2'-甲氧基修飾的C、G、U、A；Nf表示2'-氟修飾的任意核苷酸，例如2'-氟修飾的C、G、U、A；

小寫字母s表示與該字母s左右相鄰的兩個核苷酸之間為硫代磷酸二酯基連接；小寫字母s在3’端第一個時表示與該字母s上游(5'方向)相鄰的一個核苷酸末端為硫代磷酸二酯基。

在一些實施方案中，該反義鏈包含如下式所示的核苷酸序列：

5’-Nm’sNf’sNm’Nf’Nm’Nf’W’Nm’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’sNm’sNm’-3’；

其中，Nm’表示2'-甲氧基修飾的任意核苷酸，例如2'-甲氧基修飾的C、G、U、A；Nf’表示2'-氟修飾的任意核苷酸，例如2'-氟修飾的C、G、U、A；

小寫字母s表示與該字母s左右相鄰的兩個核苷酸之間為硫代磷酸二酯基連接，小寫字母s在3’端第一個時表示與該字母s上游相鄰的一個核苷酸末端為硫代磷酸二酯基；

W’表示2'-甲氧基修飾的核苷酸或包含式(I)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，該dsRNA選自以下任一組：

包含SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5；

包含SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6。

在一些實施方案中，該dsRNA選自以下任一組：

包含或選自SEQ ID NO：4所示的有義鏈和SEQ ID NO：5所示的反義鏈；

本揭露中，按照5’-3’方向，

SEQ ID NO：4是

GmsUmsGmUmGmCmAfCfUfUmCmGmCmUmUmCmAmCmCm-NAG0052’；

SEQ ID NO：5是

AmsGfsUmGfAmAf(-)hmpNA(G)CmGmAfAmGfUmGfCmAfCmAfCmsGmsGm；

SEQ ID NO：6是

ImsGfsUmGfAmAf(-)hmpNA(G)CmGmAfAmGfUmGfCmAfCmAfCmsGmsGm；

其中，Af=腺嘌呤2'-F核糖核苷(adenine 2'-F ribonucleoside)；Cf=胞嘧啶2'-F核糖核苷(cytosine 2'-F ribonucleoside)；Uf=尿嘧啶2'-F核糖核苷(uracil 2'-F ribonucleoside)；Gf=鳥嘌呤2'-F核糖核苷(guanine 2'-F ribonucleoside)；Am=腺嘌呤2'-OMe核糖核苷(adenine 2'-OMe ribonucleoside)；Cm=胞嘧啶2'-OMe核糖核苷(cytosine 2'-OMe ribonucleoside)；Gm=鳥嘌呤2'-OMe核糖核苷(guanine 2'-OMe ribonucleoside；Um=尿嘧啶2'-OMe核糖核苷(uracil 2'-OMe ribonucleoside)；Im=次黃嘌呤2'-OMe核糖核苷(hypoxanthine 2'-OMe ribonucleoside)

如無特別說明，核苷藉由之間為磷酸二酯基連接，s表示與該字母s左右相鄰的兩個核苷之間為硫代磷酸二酯基連接；

NAG0052’表示

，

(-)hmpNA(G)表示

。

在一些實施方案中，該dsRNA選自如下結構或其藥學上可接受的鹽：

其中，

Af=腺嘌呤2'-F核糖核苷(adenine 2'-F ribonucleoside)；

Cf=胞嘧啶2'-F核糖核苷(cytosine 2'-F ribonucleoside)；

Gf=鳥嘌呤2'-F核糖核苷(guanine 2'-F ribonucleoside)；

Uf=尿嘧啶2'-F核糖核苷(uracil 2'-F ribonucleoside)；

Am=腺嘌呤2'-OMe核糖核苷(adenine 2'-OMe ribonucleoside)；

Cm=胞嘧啶2'-OMe核糖核苷(cytosine 2'-OMe ribonucleoside)；

Gm=鳥嘌呤2'-OMe核糖核苷(guanine 2'-OMe ribonucleoside)；

Um=尿嘧啶2'-OMe核糖核苷(uracil 2'-OMe ribonucleoside)；

Im=次黃嘌呤2'-OMe核糖核苷(Inosine 2'-OMe ribonucleoside)；

表示硫代磷酸二酯基陰離子形式，

表示磷酸二酯基陰離子形式，

表示硫代磷酸二酯基，

表示磷酸二酯基；

表示；

表示

表示

；

表示

。

在一些實施方案中，該藥學上可接受的鹽可為本領域常規的鹽，包括但不限於：鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、胺鹽等。

在一些具體的實施方案中，該dsRNA選自TRD007970、TJR100259。

在一些實施方案中，該dsRNA為TRD007970，其為如下結構：

在一些實施方案中，該dsRNA為TJR100259，其為如下結構：

其中，Af=腺嘌呤2'-F核糖核苷(adenine 2'-F ribonucleoside)；Cf=胞嘧啶2'-F核糖核苷(cytosine 2'-F ribonucleoside)；Gf=鳥嘌呤2'-F核糖核苷(guanine 2'-F ribonucleoside)；Uf=尿嘧啶2'-F核糖核苷(uracil 2'-F ribonucleoside)；

Am=腺嘌呤2-OMe核糖核苷(adenine 2'-OMe ribonucleoside)；Cm=胞嘧啶2'-OMe核糖核苷(cytosine 2-OMe ribonucleoside)；Gm=鳥嘌呤2'-OMe核糖核苷(guanine 2'-OMe ribonucleoside)；Um=尿嘧啶2'-OMe核糖核苷(uracil 2'-OMe ribonucleoside)；Im=次黃嘌呤2'-OMe核糖核苷(Inosine 2'-OMe ribonucleoside)。

表示硫代磷酸二酯基陰離子形式，

表示磷酸二酯基陰離子形式，

表示

表示

。

在一些實施方案中，該式(II)所示化合物或其可藥用鹽按照固定劑量給藥，給藥劑量選自0.02mg-50mg，具體的給藥劑量可選自0.02mg、0.25mg、0.50mg、0.75mg、1.00mg、1.25mg、1.50mg、1.75mg、2.00mg、2.25mg、2.50mg、2.75mg、3.00mg、3.25mg、3.50mg、3.75mg、4.00mg、4.25mg、4.50mg、4.75mg、5.00mg、5.25mg、5.50mg、5.75mg、6.00mg、6.25mg、6.50mg、6.75mg、7.00mg、7.25mg、7.50mg、7.75mg、8.00mg、8.25mg、8.50mg、8.75mg、9.00mg、9.25mg、9.50mg、9.75mg或10.00mg，或者任意兩點之間的點值。

一些實施方案中，該式(II)所示化合物或其可藥用鹽的給藥頻次選自每週兩次、每週一次、每兩週一次和每四週一次。

一些實施方案中，該式(II)所示化合物或其可藥用鹽給藥的維持時間選自四週、八週、十二週、二十四週、三十六週、四十八週、六十週、七十二週、八十四週等。

在一些實施方案中，該式(II)所示化合物或其可藥用鹽的給藥劑量選自0.50mg、0.75mg、1.00mg、1.25mg、1.50mg、1.75mg、2.50mg或3mg，給藥頻次為每週一次。

在一些實施方案中，該式(II)所示化合物或其可藥用鹽的給藥劑量為0.50mg，給藥頻次為每週一次。

在一些實施方案中，該式(II)所示化合物或其可藥用鹽的給藥劑量為0.75mg，給藥頻次為每週一次。

在一些實施方案中，該式(II)所示化合物或其可藥用鹽的給藥劑量為1.00mg，給藥頻次為每週一次。

在一些實施方案中，該式(II)所示化合物或其可藥用鹽的給藥劑量為1.25mg，給藥頻次為每週一次。

在一些實施方案中，該式(II)所示化合物或其可藥用鹽的給藥劑量為1.50mg，給藥頻次為每週一次。

在一些實施方案中，該式(II)所示化合物或其可藥用鹽的給藥劑量為1.75mg，給藥頻次為每週一次。

在一些實施方案中，該式(II)所示化合物或其可藥用鹽的給藥劑量為2.50mg，給藥頻次為每週一次。

在一些實施方案中，該式(II)所示化合物或其可藥用鹽的給藥劑量為3mg，給藥頻次為每週一次。

在一些實施方案中，該dsRNA按照固定劑量給藥，給藥劑量選自10mg至1500mg，具體可選50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、 450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg、625mg、650mg、675mg、700mg、725mg、750mg、775mg、800mg、825mg、850mg、875mg、900mg、925mg、950mg、975mg、1000mg、1025mg、1050mg、1075mg、1100mg、1125mg、1150mg、1175mg、1200mg、1225mg、1250mg、1275mg、1300mg、1325mg、1350mg、1375mg、1400mg、1425mg、1450mg、1475mg或1500mg，或者任意兩點之間的點值。

在一些實施方案中，該dsRNA按照體重給藥，給藥劑量選自約0.001mg/kg體重至約200mg/kg體重、約0.01mg/kg體重至約100mg/kg體重或約0.5mg/kg體重至約50mg/kg體重，約1mg/kg至20mg/kg。

在一些實施方案中，該dsRNA的給藥頻次選自每週一次及後續減少頻次，具體可以是每週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每五週一次、每六週一次、每七週一次，每八週一次、每九週一次、每十週一次、每十一週一次或每十二週一次。

在一些實施方案中，該dsRNA的給藥頻次選自每週一次、每兩週一次、每四週一次、每八週一次或每十二週一次。

在一些實施方案中，該dsRNA按照固定劑量給藥，給藥劑量選自100mg，給藥頻次為每四週一次。

在一些實施方案中，該dsRNA按照固定劑量給藥，給藥劑量選自200mg，給藥頻次為每四週一次。

在一些實施方案中，該dsRNA按照固定劑量給藥，給藥劑量選自400mg，給藥頻次為每四週一次。

在一些實施方案中，該dsRNA按照固定劑量給藥，給藥劑量選自600mg，給藥頻次為每四週一次。

在一些實施方案中，該dsRNA按照固定劑量給藥，給藥劑量選自900mg，給藥頻次為每四週一次。

在一些實施方案中，該dsRNA的給藥的維持時間各自獨立地選自四週、八週、十二週、二十四週、三十六週、四十八週、六十週、七十二週、八十四週等。

各種遞藥系統是已知的，並且可以用於本揭露中的dsRNA，例如封裝在脂質體中、微粒、微囊、能夠表達該化合物的重組細胞、受體介導的細胞內吞作用、構建核酸作為逆轉錄病毒或其他載體的一部分。

在一些實施方案中，本揭露所述的dsRNA、TLR8調節劑的給藥方式是常規的，可藉由局部給藥(例如，直接注射或植入)或全身給藥，也可藉由口服、直腸或胃腸外途徑進行給藥，該腸胃外途徑包括但不限於皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、透皮給藥、吸入給藥(如氣溶膠)、黏膜給藥(如舌下、鼻內給藥)、顱內給藥等。

在一些實施方案中，本揭露提供的dsRNA可以藉由注射給予，例如，靜脈內、肌內、皮內、皮下、十二指腸內或腹膜內注射。

在一些實施方案中，本揭露提供的TLR8調節劑給藥方式為口服給藥。

在一些實施方案中，本揭露提供的TLR8調節劑需要空腹給藥。

在一些實施方案中，本揭露提供的dsRNA可被包裝在試劑盒中。

一些實施方案中，該用途還包含聯合一種或多種其他治療劑。

一些具體的實施方案中，該其他治療劑選自治療選自抗病毒劑、反轉錄酶抑制劑、免疫刺激劑、治療性疫苗、病毒侵入抑制劑、抑制HbsAg的分泌或釋出的寡核苷酸、殼體抑制劑、共價閉合環狀(ccc)HBV DNA抑制劑。

本揭露提供了一種預防和/或治療受試者的B型肝炎病毒(HBV)感染或與B型肝炎病毒相關的疾病的方法，給與受試者前述的雙鏈核糖核酸(dsRNA)和式(II)所示化合物或其可藥用鹽。

在一些實施方案中，該雙鏈核糖核酸(dsRNA)和式(II)所示化合物或其可藥用鹽是有效量的。

在一些實施方案中，該與B型肝炎病毒相關的疾病是慢性肝炎，該受試者是HBeAg陽性或HBeAg陰性。

在一些實施方案中，該與B型肝炎病毒相關的疾病是急性B型肝炎、慢性B型肝炎、D型肝炎病毒感染、D型肝炎、肝纖維化、晚期肝病和肝細胞癌。

在一些實施方案中，該另一種治療劑選自抗病毒劑、反轉錄酶抑制劑、免疫刺激劑、治療性疫苗、病毒侵入抑制劑、抑制HbsAg分泌或釋出的寡核苷酸、殼體抑制劑、cccDNA抑制劑，及上述任一者的組合。

本揭露提供一種式(II)所示化合物或其可藥用鹽，其與前述的雙鏈核糖核酸(dsRNA)聯合，用於預防和/或治療B型肝炎病毒感染或與B型肝炎病毒相關的疾病。

本揭露還提供一種前述雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其與式(II)所示化合物或其可藥用鹽聯合，用於預防和/或治療B型肝炎病毒感染或與B型肝炎病毒相關的疾病。

另一方面，本揭露提供了一種抑制靶基因或其mRNA表達的方法，其包括向受試者給予有效量或有效劑量的前述dsRNA和式(II)所示化合物或其可藥用鹽。

在一些實施方案中，該靶基因包括但不限於HBV(例如HBV-S、HBV-X)。

在一些實施方案中，該對象已在先前被鑑定為在靶向的細胞、細胞群、組織或受試者中具有靶基因或其mRNA的病理性上調。

本揭露還提供了抑制細胞中B型肝炎病毒(HBV)複製的方法，該方法包括使細胞與本揭露的前述dsRNA和式(II)所示化合物或其可藥用鹽，從而抑制細胞中HBV的複製。在一些實施方案中，細胞在受試者體內。在一些實施方案中，細胞是體外的。

本揭露還提供了降低感染了HBV的受試者中B型肝炎病毒(HBV)抗原水平的方法，其包括向受試者給與治療有效量的本揭露所述的前述dsRNA和式(II)所示化合物或其可藥用鹽，從而降低受試者中HBV抗原的水平。在一些實施方案中，HBV抗原是HBsAg。在一些實施方案中，HBV抗原是HBeAg。在一些實施方案中，該受試者是HBeAg陽性。在一些實施方案中，該受試者是HBeAg陰性。

一些實施方案中，本揭露提供的用途或方法，使得受試者的血清中的HBsAg水平降低至少0.5log 10IU/ml。

一些實施方案中，本揭露提供的用途或方法，使得受試者的血清中的HBsAg水平降低至少1log10IU/ml。

本揭露引證WO2022028462A1、WO2022206946A1、PCT/CN2022/103275全文。

術語解釋

為了更容易理解本揭露，以下具體定義了一些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本揭露所屬領域的具有通常知識者通常理解的含義。

本揭露化合物可以存在特定的幾何或立體異構體形式。本揭露設想所有的這類化合物，包括順式和反式異構體、(-)-和(+)-對對映體、(R)-和(S)-對映體、非對映異構體、(D)-異構體、(L)-異構體，及其外消旋混合物和其他混合物，例如對映異構體或非對映體富集的混合物，所有這些混合物都屬於本揭露的範圍之內。烷基等取代基中可存在另外的不對稱碳原子。所有這些異構體以及它們的混合物，均包括在本揭露的範圍之內。本揭露的含有不對稱碳原子的化合物可以以光學活性純的形式或外消旋形式被分離出來。光學活性純的形式可以從外消旋混合物拆分，或藉由使用手性原料或手性試劑合成。

可以藉由的手性合成或手性試劑或者其他常規技術製備光學活性的(R)-和(S)-異構體以及D和L異構體。如果想得到本揭露某化合物的一種對映體，可以藉由不對稱合成或者具有手性助劑的衍生作用來製備，其中將所得非對映體混合物分離，並且輔助基團裂開以提供純的所需對映異構體。或者，當分子中含有鹼性官能團(如胺基)或酸性官能團(如羧基)時，與適當的光學活性的酸或鹼形成非對映異構體的鹽，然後藉由本領域所公知的常規方法進行非對映異構體拆分，然後回收得到純的對映體。此外，對映異構體和非對映異構體的分離通常是藉由使用色譜法完成的，該色譜法採用手性固定相，並視需要地與化學衍生法相結合(例如由胺生成胺基甲酸鹽)。

本揭露所述化合物的化學結構中，鍵“

”表示未指定構型，即如果化學結構中存在手性異構體，鍵“

”可以為“

”或“

”，或者同時包含“

”和“

”兩種構型。本揭露所述化合物的化學結構中，鍵“

”並未指定構型，即鍵“

”的構型可以為E型或Z型，或者同時包含E和Z兩種構型。

在本揭露的化學結構式中，“

”、“

”、“

”可以根據本文所述發明範圍連接一個或多個任何基團；星號“*”表示手性中心。

在不指明構型的情況下，本揭露的化合物和中間體還可以以不同的互變異構體形式存在，並且所有這樣的形式包含於本揭露的範圍內。術語“互變異構體”或“互變異構體形式”是指可經由低能壘互變的不同能量的結構異構體。例如，質子互變異構體(也稱為質子轉移互變異構體)包括經由質子遷移的互變，如酮-烯醇及亞胺-烯胺、內醯胺-內醯亞胺異構化。內醯胺-內醯亞胺平衡實例是在如下所示的A和B之間。

本揭露中的所有化合物可以被畫成A型或B型。所有的互變異構形式在本發明的範圍內。化合物的命名不排除任何互變異構體。

本揭露還包括一些與本文中記載的那些相同的，但一個或多個原子被原子量或質量數不同於自然中通常發現的原子量或質量數的原子置換的同位素標記的本揭露化合物。可結合到本揭露化合物的同位素的實例包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘和氯的同位素，諸如分別為²H、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹³N、¹⁵N、¹⁵O、¹⁷O、¹⁸O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F、¹²³I、¹²⁵I和³⁶Cl等。

除另有說明，當一個位置被特別地指定為氘(D)時，該位置應理解為具有大於氘的天然豐度(其為0.015%)至少1000倍的豐度的氘(即，至少10%的氘摻入)。示例中化合物的具有大於氘的天然豐度可以是至少1000倍的豐度的氘、至少2000倍的豐度的氘、至少3000倍的豐度的氘、至少4000倍的豐度的氘、至少5000倍的豐度的氘、至少6000倍的豐度的氘或更高豐度的氘。本揭露還包括各種氘化形式的式(I)、式(I’)、式(II)化合物。與碳原子連接的各個可用的氫原子可獨立地被氘原子替換。所屬技術領域中具有通常知識者能夠參考相關文獻合成氘化形式的式(I)、式(I’)、式(II)化合物。在製備氘代形式的式(I)、式(I’)、式(II)化合物時可使用市售的氘代起始物質，或它們可使用常規技術採用氘代試劑合成，氘代試劑包括但不限於氘代硼烷、三氘代硼烷四氫呋喃溶液、氘代氫化鋰鋁、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。

除另有說明，“視需要地”、“視需要”、“可選的”或“可選”是指意味著隨後所描述的事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如“視需要地，R₁和R₂直接相連成環”是指R₁和R₂直接相連成環可以發生但不必須存在，該說明包括R₁和R₂直接相連成環的情形和R₁和R₂不成環的情形。

術語“約”、“大約”是指數值在由所屬技術領域中具有通常知識者所測定的具體值的可接受誤差範圍內，該數值部分取決於怎樣測量或測定(即測量體系的限度)。例如，“約”可意味著在標準差範圍內。或者，“約”或“基本上包含”可意味著至多20%的範圍，例如1%至15%之間、在1%至10%之間、在1% 至5%之間、在0.5%至5%之間、在0.5%至1%之間變化，本揭露中，數字或數值範圍之前有術語“約”的每種情況也包括給定數的實施方案。除非另外說明，否則當具體值在本申請和申請專利範圍中出現時，“約”或“基本上包含”的含義應該假定為在該具體值的可接受誤差範圍內。

本揭露中，術語“包含”可替換為“由......組成”。

如無特殊說明，本揭露的“化合物”、“化學修飾”、“配體”、“dsRNA”、“核酸”和“RNAi”均可獨立地以鹽、混合鹽或非鹽(例如游離酸或游離鹼)的形式存在。當以鹽或混合鹽的形式存在時，其可為藥學上可接受的鹽。

“藥學上可接受的鹽”可選自無機鹽或有機鹽，也可包括藥學上可接受的酸加成鹽和藥學上可接受的鹼加成鹽。

“藥學上可接受的酸加成鹽”是指能夠保留游離鹼的生物有效性而無其它副作用的，與無機酸或有機酸所形成的鹽。無機酸鹽包括但不限於鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等；有機酸鹽包括但不限於甲酸鹽、乙酸鹽、2,2-二氯乙酸鹽、三氟乙酸鹽、丙酸鹽、己酸鹽、辛酸鹽、癸酸鹽、十一碳烯酸鹽、乙醇酸鹽、葡糖酸鹽、乳酸鹽、癸二酸鹽、己二酸鹽、戊二酸鹽、丙二酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、油酸鹽、肉桂酸鹽、月桂酸鹽、蘋果酸鹽、谷胺酸鹽、焦谷胺酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、水楊酸鹽、4-胺基水楊酸鹽、萘二磺酸鹽等。這些鹽可藉由本領域已知的方法製備。

“藥學上可接受的鹼加成鹽”是指能夠保持游離酸的生物有效性而無其它副作用的、與無機鹼或有機鹼所形成的鹽。衍生自無機鹼的鹽包括但不限於鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、錳鹽、鋁鹽等。較佳的無機鹽為銨鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽及鎂鹽，較佳鈉鹽。衍生自有機鹼的鹽包括但不限於以下的鹽：一級胺類、二級胺類及三級胺類，被取代的胺類，包括天然的被取代胺類、環狀胺類及鹼性離子交換樹脂，例如胺、異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二甲基乙醇胺、2-二甲胺基乙醇、2-二乙胺基乙醇、二環己胺、賴胺酸、精胺酸、組胺酸、咖啡因、普魯卡因、膽鹼、甜菜鹼、乙二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可鹼、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺樹脂等。較佳的有機鹼包括異丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二環己基胺、膽鹼及咖啡因。這些鹽可藉由本領域已知的方法製備。

本揭露中，“磷酸酯基團”可為磷酸一酯基團、磷酸二酯基團或磷酸三酯基團，較佳磷酸二酯基團。

本揭露中，硫代磷酸二酯基是指一個非橋接氧原子被硫原子替代而修飾的磷酸二酯基，可用

、

(M為S原子)互換使用。

本揭露上下文中，基團

中的

可以替換為能夠與相鄰核苷酸實現連接的任意基團。

術語“連接”，當表示兩個分子之間的聯繫時，指兩個分子藉由共價鍵連接或者兩個分子經由非共價鍵(例如，氫鍵或離子鍵)關聯，包括直接連接、間接連接。

術語“直接連接”指第一化合物或基團與第二化合物或基團在沒有任何間插原子或原子基團的情況下連接。

術語“間接連接”指第一化合物或基團與第二化合物或基團藉由中間基團、化合物或分子(例如，連接基團)連接。

“藥物組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學可藥用的載體和賦形劑。藥物組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。

“藥學上可接受的賦形劑”包括但不限於任何已批准對於人類或家畜動物使用可接受的任何助劑、載體、助流劑、甜味劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、增香劑、表面活性劑、潤濕劑、分散劑、助懸劑、穩定劑、等滲劑、緩衝劑、溶劑或乳化劑。

如本文所使用的，術語“抑制”，可以與“減少”、“沉默”、“下調”、“阻抑”和其他類似術語交替使用，並且包括任何水平的抑制。抑制可藉由這些變量中的一個或多個與對照水平相比的絕對或相對水平的減少來評估。該對照水平可以是本領域中使用的任何類型的對照水平，例如給藥前基線水平或從類似的未經處理或經對照(例如僅緩衝液對照或惰性劑對照)處理的受試者、細胞、或樣品確定的水平。例如，可以採用mRNA剩餘表達量來表徵siRNA(或dsRNA)對靶基因表達的抑制程度，如mRNA剩餘表達量為不高於99%、不高於95%、不高於90%、不高於85%、不高於80%、不高於75%、不高於70%、不高於65%、不高於60%、不高於55%、不高於50%、不高於45%、不高於40%、不高於35%、不高於30%、不高於25%、不高於20%、不高於15%、或不高於10%。靶基因表達的抑制率可以採用Dual-Glo® Luciferase Assay System檢測，分別讀取螢火蟲(Firefly)化學發光值和海腎(Renilla)化學發光值，計算相對值Ratio=Ren/Fir，抑制率(%)=1-(Ratio+siRNA/僅報告基因)*100%；本揭露中，剩餘mRNA表達量比例(或剩餘活性%)=100%-抑制率(%)。

“有效量”或“有效劑量”包含足以改善或預防醫學病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。

如本文所使用的，“對象”、“患者”、“受試者”或“個體”可互換使用，包括人類或者非人類動物，例如哺乳動物，例如人或猴。

如本文所使用的，有義鏈(又稱SS、SS鏈或有義鏈)是指包含與靶mRNA序列相同或基本上相同的序列的鏈；反義鏈(又稱AS或AS鏈)是指具有與靶mRNA序列互補的序列的鏈。

本揭露中，有義鏈或反義鏈的“5’區域”也即“5’端”、“5’末端”，可替換使用。例如反義鏈5’區域的第2位至第8位的核苷酸，也可替換為反義鏈5’端起第2位至第8位的核苷酸。同理，有義鏈或反義鏈的“3’區域”、“3’末端”和“3’端”也可替換使用。

術語“dsRNA”是指能夠進行RNA干擾的雙鏈RNA分子，包含有義鏈和反義鏈。

在描述本文所述的siRNA有義鏈的上下文中，術語“與SEQ ID NO：1的核苷酸序列相差不超過3個核苷酸序列，且包含至少15個連續核苷酸”旨在表示本文所述的siRNA有義鏈包含SEQ ID NO：1有義鏈的至少15個連續核苷酸，或與SEQ ID NO：1有義鏈中至少15個連續核苷酸相差不超過3個核苷酸序列(視需要地，相差不超過2個核苷酸序列，視需要地，相差1個核苷酸序列)。視需要地，本文所述的siRNA有義鏈包含SEQ ID NO：1有義鏈的至少16個連續核苷酸，或與SEQ ID NO：1有義鏈的至少16個連續核苷酸相差不超過3個核苷酸序列(視需要地，相差不超過2個核苷酸序列，視需要地，相差1個核苷酸序列)。

在描述本文所述的siRNA反義鏈的上下文中，術語“與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3任一反義鏈相差不超過3個核苷酸序列，且包含至少15個連續核苷酸”旨在表示本文所述的siRNA反義鏈包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中任一反義鏈的至少15個連續核苷酸，或與SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中任一反義鏈的至少15個連續核苷酸相差不超過3個核苷酸序列(視需要地，相差不超過2個核苷酸序列，視需要地，相差1個核苷酸序列)。

如無特別說明，“G”、“C”、“A”、“T”與“U”分別代表核苷酸，其分別包含鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷與尿嘧啶的鹼基。本揭露上下文中，I等同於包含核鹼基次黃嘌呤(nucleobase hypoxanthine)的核苷酸。在一些實施方案中，本揭露所用的術語肌苷等同於包含次黃嘌呤和糖或修飾的糖的核苷(nucleoside comprising hypoxanthine and a sugar or modified sugar)。

如無特別說明，在本揭露上下文中，小寫字母d表示該字母d下游相鄰的一個核苷酸為脫氧核糖核苷酸；小寫字母m表示該字母m上游相鄰的一個核苷酸為2’-甲氧基修飾的核苷酸；小寫字母f表示該字母f上游相鄰的一個核苷酸為2’-氟修飾的核苷酸；小寫字母s表示與該字母s左右相鄰的兩個核苷酸之間為硫代磷酸二酯基連接。

如本揭露所使用的，術語“2'-氟(2’-F)修飾的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羥基被氟取代形成的核苷酸，“非氟修飾的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸或核苷酸類似物。

如本揭露所使用的，術語“2'-甲氧基(2’-OMe)修飾的核苷酸”指核糖基的2'-羥基被甲氧基取代而形成的核苷酸。

在本揭露的上下文中，一個核苷酸序列與另外一個核苷酸序列存在“核苷酸差異”，是指前者與後者相比，相同位置的核苷酸的鹼基種類發生了改變，例如，在後者中一個核苷酸鹼基為A時，在前者的相同位置處的對應核苷酸鹼基為U、C、G或者T的情況下，認定為兩個核苷酸序列之間在該位置處存在核苷酸差異。在一些實施方案中，以無鹼基核苷酸或其等同物代替原位置的核苷酸時，也可認為在該位置處產生了核苷酸差異。

如本文所使用的，術語“互補”或“反向互補”一詞可互相替代使用，並具有所屬技術領域中具有通常知識者周知的含義，即，在雙鏈核酸分子中，一條鏈的鹼基與另一條鏈上的鹼基以互補的方式相配對。在DNA中，嘌呤鹼基腺嘌呤始終與嘧啶鹼基胸腺嘧啶(或者在RNA中為尿嘧啶)相配對；嘌呤鹼基鳥嘌呤始終與嘧啶鹼基胞嘧啶相配對。每個鹼基對都包括一個嘌呤和一個嘧啶。當一條鏈上的腺嘌呤始終與另一條鏈上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配對，以及鳥嘌呤始終與胞嘧啶配對時，兩條鏈被認為是彼此相互補的，以及從其互補鏈的序列中可以推斷出該鏈的序列。與此相應地，“錯配”在本領域中意指在雙鏈核酸中，對應位置上的鹼基並未以互補的形式配對存在。

術語“化學修飾”或“修飾”包括核苷酸經化學手段的所有改變，例如化學部分的添加或去除、或以一個化學部分取代另一個化學部分。

術語“鹼基”包含任何已知的DNA和RNA鹼基、鹼基類似物，例如嘌呤或嘧啶，其還包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、次黃苷和天然類似物。鹼基類似物還可以是通用鹼基。

術語“平端”或“平末端”可互換使用，是指在siRNA的給定的末端沒有未配對的核苷酸或核苷酸類似物，即，沒有核苷酸突出。大多數情況下，兩個末端都是平末端的siRNA將在其整個長度範圍內是雙鏈的。

本揭露提供的siRNA可以藉由本領域常規的製備方法(例如固相合成和液相合成的方法)得到。其中，固相合成已經有商業化訂制服務。可以藉由使用具有相應修飾的核苷單體來將修飾的核苷酸基團引入本揭露所述的siRNA中，製備具有相應修飾的核苷單體的方法及將修飾的核苷酸基團引入siRNA的方法也是所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的。

本揭露所述的“聯用”、“聯合使用”是一種給藥方式，是指一定時間期限內給予至少一種劑量的dsRNA，以及至少一種劑量的另一種治療劑，其中給予的藥物都顯示藥理學作用。可以同時或依次給予dsRNA與另一種治療劑。這種期限包括這樣的治療，其中藉由相同給藥途徑或不同給藥途徑給予dsRNA與另一種治療劑。本揭露所述聯合的給藥方式選自同時給藥、獨立地配製並共給藥或獨立地配製並相繼給藥。

圖1為核酸外切酶穩定性凝膠電泳實驗結果。

圖2為5’核酸外切酶穩定性實驗定量結果。

圖3為3’核酸外切酶穩定性實驗定量結果。

圖4受試物對TLR8 AAV-HBV小鼠第7日血漿HBVDNA水平的影響(n=6，單因素方差分析，****P<0.0001,***P<0.001 vs.組1；###P<0.001 vs.組2；&P<0.05 vs.組3)。

以下結合實施例進一步描述本揭露，但這些實施例並非限制本揭露的範圍。本揭露實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，則該試劑可自任意分子生物學試劑的供應商以用於分子生物學應用的質量/純度而獲得。

實施例1：配體的製備(NAG0052、L96)

化合物NAG0024、NAG0026購買自天津藥明康德新藥開發有限公司。除非特別說明，以下實施例中所用的試劑均為市售商品。

化合物NAG0052的合成

起始原料化合物1採購自江蘇倍達醫藥科技有限公司。

化合物2

在0℃以及氮氣保護下，往化合物1(12.3mL,101mmol)的THF(300mL)溶液中分批加入NaH(12.2g,304mmol，純度60%)。該混合物在20℃下攪拌1小時之後再次冷卻到0℃，接著往體系中逐滴加入苄溴(36.3mL,304mmol)，並且在20℃攪拌12小時。將該反應液用H₂O(100mL)淬滅後，用EtOAc(200mL×2)萃取。合併後的有機相用飽和食鹽水(100mL)洗滌，Na₂SO₄乾燥，過濾，濃縮得到的殘留物經過矽膠管柱層析分離後得到目標化合物2(20.0g,51.8mmol，產率51%)。

LCMS：t_R=2.615 and 2.820min in 30-90AB_7min_220&254_Shimadzu.lcm(Xtimate C18,3um,2.1*30mm),MS(ESI)m/z=351.2[M+Na]⁺。

¹ H NMR：(400MHz,CDCl₃)δ ppm 7.35-7.12(m,10H),5.06-4.95(m,1H),4.51-4.39(m,4H),4.24-3.87(m,2H),3.50-3.40(m,2H),3.38-3.20(m,3H),2.20-1.91(m,2H)。

化合物3和化合物4

在20℃以及氮氣保護下，往化合物2(13.0g,33.6mmol)的DCM(300mL)溶液中一次性加入TMSCN(13.5mL,101mmol)，接著逐滴加入TMSOTf(9.14mL,50.5mmol)的DCM(30mL)溶液。該反應液在20℃下攪拌15小時。反應結束之後用飽和NaHCO₃水溶液(80mL)淬滅該體系，並且用DCM(150mL×2)萃取，合併後的有機相用飽和食鹽水(80mL)洗滌，Na₂SO₄乾燥，過濾以及濃縮後藉由矽膠管柱層析分離後得到目標化合物3(3.30g,9.18mmol，產率27%)以及淡黃色油狀液體化合物4(8.50g,9.18mmol，產率70%)。

化合物3

¹ H NMR：(400MHz,CDCl₃)δ ppm 7.42-7.29(m,10H),4.81(t,J=7.8Hz,1H),4.65-4.49(m,4H),4.30-4.21(m,2H),3.65-3.57(m,1H),3.57-3.49(m,1H),2.49-2.40(m,2H)。

化合物4

¹ H NMR：(400MHz,CDCl₃)δ ppm 7.42-7.26(m,10H),4.93-4.87(m,1H),4.65-4.48(m,4H),4.43-4.38(m,1H),4.21-4.17(m,1H),3.79-3.70(m,1H),3.54(d,J=4.0Hz,1H),2.45-2.37(m,2H)。

化合物5

在0℃及氮氣保護下將化合物4(3.00g,9.28mmol)的THF(15mL)溶液，滴加到LiAlH₄(0.79g,20.9mmol)的THF(15mL)溶液中，滴加完後體系在0℃反應1小時。TLC(PE：EtOAc=3：1)監測到原料完全消失。向反應液中緩慢加入十水硫酸鈉，加至不冒泡為止。之後將反應液過濾，濾餅用二氯甲烷(60mL)洗滌三次後，收集濾液旋乾，得目標化合物5(3.00g，產率90%)

¹ H NMR：(400MHz,DMSO-d ₆)δ ppm 7.40-7.14(m,10H),4.54-4.38(m,4H),4.06-3.99(m,2H),3.91(q,J=6.4Hz,1H),3.48-3.37(m,2H),2.67-2.52(m,2H),2.21-2.18(m,1H),1.77-1.73(m,1H)。

化合物6

在氮氣保護下，將化合物5(3.00g,8.25mmol)溶於DCM(30mL)，加入TEA(3.44mL,24.7mmol)和CbzCl(1.76mL,12.4mmol)，20℃反應2小時。LCMS顯示反應完成。將反應液加入二氯甲烷(30mL)和水(60mL)萃取。有機相用水(60mL×3)洗滌三次，無水硫酸鈉乾燥，濃縮用正向管柱純化(PE：EtOAc=1：1)，得到目標化合物6(2.5g，產率90%)。

LCMS：t_R=0.810min in 5-95AB_1min,MS(ESI)m/z=462.2[M+H]⁺。

¹ H NMR：(400MHz,CDCl₃)δ ppm 7.39-7.29(m,15H),5.35(s,1H),5.15-5.01(m,2H),4.72(d,J=6.0Hz,1H),4.54-4.40(m,3H),4.26(s,1H),4.23-4.18(m,1H),4.11-4.04(m,1H),3.54-3.41(m,3H),3.37-3.25(m,1H),2.34-2.23(m,1H),1.85-1.79(m,1H)。

化合物7

在氮氣保護下，將化合物6(2.00g,3.90mmol)溶於DCM(5mL)，在-78℃下加入BCl₃的THF溶液(1M,27.3mL)，反應1小時。TLC(DCM：MeOH=10：1)監測到原料完全消失。將反應液在-78℃下加入甲醇(20mL)淬滅，濃縮，用正向管柱純化(DCM：MeOH=10：1)，得到目標化合物7(2.00g，產率60%)。

¹ H NMR：(400MHz,CD₃OD)δ ppm 7.41-7.23(m,5H),5.08(s,2H),4.25-4.07(m,2H),3.85-3.75(m,1H),3.63-3.56(m,1H),3.54-3.48(m,1H),3.30-3.27(m,2H),2.34-2.21(m,1H),1.71-1.64(m,1H)。

化合物8

在氮氣保護下，將化合物7(0.50g,1.78mmol)溶於吡啶(5mL)中，在0℃下加入4A分子篩(500mg)和DMTrCl(0.66mL,2.13mmol)，之後升溫至20℃反應1.5小時。TLC(PE：EtOAc=2：1)監測到原料完全消失。將反應液加入乙酸乙酯(60mL)和水(60mL)萃取，有機相用水(60mL×3)洗滌三次後用無水硫酸鈉乾燥，濃縮，用正向管柱純化(PE：EtOAc=1：1)，得到目標化合物8(800mg，產率90%)。

¹ H NMR：(400MHz,CDCl₃)δ ppm 7.44(d,J=7.6Hz,2H),7.37-7.23(m,11H),7.22-7.15(m,1H),6.84(d,J=8.8Hz,4H),5.09(s,2H),4.31-4.17(m,2H),4.02-3.91 (m,1H),3.84-3.73(m,6H),3.33(s,1H),3.28(s,1H),3.19-3.01(m,2H),2.34-2.25(m,1H),1.70-1.62(m,1H)。

化合物9

將化合物8(800mg,1.234mmol)溶於EtOAc(5mL)，加入Pd/C 10%(800mg,7.517mmol)，反應在H₂條件(15Psi)，20℃下反應1小時。LCMS顯示反應已經完成。反應液過濾，濾餅用二氯甲烷(100mL)和甲醇(100mL)洗滌三次，濃縮，經過反相管柱分離得到化合物9(300mg,54%)。

LCMS：t_R=2.586min in 10-80CD_3min MS(ESI)m/z=450.2[M+H]⁺。

化合物11

將化合物10(435mg,1.780mmol)溶於DCM(10mL)，加入DIEA(0.441mL,2.67mmol)和HATU(677mg,1.78mmol)後，再加入化合物9(400mg,0.890mmol)，20℃反應1小時。TLC(DCM：MeOH=10：1)監測反應完成。將反應液加入二氯甲烷(60mL)和水(60mL)萃取，有機相用水(60mL×3)洗滌三次，無水硫酸鈉乾燥，濃縮用正向管柱純化(PE：EtOAc=0：1過管柱，在100%處出產品峰)，得到目標化合物11(600mg，產率90%)。

LCMS：t_R=2.745min in 30-90CD_3min,MS(ESI)m/z=698.4[M+Na]⁺。

¹ H NMR：(400MHz,CD₃OD)δ ppm 7.46-7.38(m,2H),7.35-7.24(m,6H),7.22-7.16(m,1H),6.90-6.78(m,4H),4.29-4.21(m,2H),4.02-3.95(m,1H),3.77(s,6H),3.66-3.62(m,3H),3.41(s,1H),3.18-3.04(m,2H),2.36-2.17(m,5H),1.71-1.50(m,5H),1.39-1.25(m,14H)。

化合物12

將化合物11(600mg,0.799mmol)溶於THF(3mL)和H₂O(1mL)，加入LiOH.H₂O(134mg,3.20mmol)，20℃反應12小時。TLC(DCM：MeOH=10：1)顯示反應完成。將反應液旋乾，用水(5mL)和甲醇(5mL)溶解，用反向管柱純化(H₂O：CH₃CN=1：1，在35%左右出峰)，得到目標化合物12(460mg，產率100%，鋰鹽)。

LCMS：t_R=1.346min in 10-80CD_3min,MS(ESI)m/z=684.3[M+Na]⁺。

HPLC：t_R=1.879min in 10-80CD_6min。

¹ H NMR：(400MHz,CD₃OD)δ ppm 7.47-7.39(m,2H),7.35-7.24(m,6H),7.22-7.15(m,1H),6.91-6.79(m,4H),4.31-4.18(m,2H),4.02-3.95(m,1H),3.78(s,6H),3.44-3.33(m,2H),3.18-3.04(m,2H),2.35-2.27(m,1H),2.24-2.10(m,4H),1.70-1.51(m,5H),1.31-1.23(m,12H)。

化合物13

室溫環境，氮氣保護下，將化合物NAG0024(271mg,0.151mmol)溶解於無水THF(2mL)和無水DMF(4mL)，加入3A分子篩，再依次加入化合物12(100mg,0.151mmol)、HOBt(25mg,0.181mmol)、DCC(38mg,0.181mmol)和DIEA(39mg,0.302mmol)。反應液45℃反應16h.LC-MS顯示反應完全後，加水淬滅，過濾。濾液濃縮後，經C18反相管柱純化(H₂O/MeCN)，得到化合物13(210mg，產率57%)。

化合物NAG0052

室溫環境下，化合物13(230mg，0.094mmol)溶於吡啶(5mL)，加入分子篩，加入DMAP(12mg，0.283mmol)，丁二酸酐(28mg，0.283mmol)。氮氣保護，50℃攪拌16小時。LCMS檢測反應完全，過濾旋乾。過C18反相管柱純化後，由製備HPLC二次純化，得到目標化合物NAG0052(123mg，0.048mmol，產率51%)。

MS(ESI)m/z=2535.3[M-1]^-.理論：2536.2。

¹H NMR(400MHz，乙腈-d ₃)δ 7.48-7.43(m,2H),7.37-7.12(m,11H),7.00-6.85(m,10H),6.66(s,1H),5.31(dd,J=3.4,1.1Hz,3H),5.20-5.13(m,1H),5.05(dd,J=11.3,3.4Hz,3H),4.56(d,J=8.5Hz,3H),4.30(dd,J=7.7,5.3Hz,1H),4.18-3.93(m,14H),3.79(s,10H),3.65(q,J=4.7,3.6Hz,13H),3.56-3.07(m,24H),2.56(s,6H),2.37(t,J=5.8Hz,10H),2.17(t,J=7.5Hz,9H),2.02-1.96(m,20H),1.88(s,8H),1.82-1.73(m,2H),1.60(dt,J=15.0,7.3Hz,16H),1.27(s,13H)。

化合物NAG0052經過固相合成連接到序列上，再經過胺解後，NAG0052結構脫去一部分官能團成為NAG0052’。

L96的合成

按照專利申請WO2014025805A1記載的方法製備獲得。

實施例2：合成dsRNA

1.自製帶有載體的樹脂

具體操作同實施例1。

2.使用帶有NAG0052的樹脂作為起始，按照核苷酸排布順序自3’-5’方向逐一連接核苷單體。每連接一個核苷單體都包括脫保護、偶聯、蓋帽、氧化或硫化四步反應。

製得的dsRNA具有表2和表3中所示的有義鏈和反義鏈。

表1.dsRNA列表

表2.dsRNA的有義鏈和反義鏈的對應的裸序列

表3.dsRNA的有義鏈和反義鏈

其中，(-)hmpNA(G)的結構

，

NAG0052’的結構為：

實施例3：dsRNA對HBV的在靶活性

表4中為陽性對照化合物。

表4.陽性對照化合物序列信息

其中，AD81890參照CN201980053789.8製備獲得；L96結構為

在HEK293A細胞中採用11個濃度梯度對表3及表4中的dsRNA序列進行體外分子水平模擬在靶活性篩選。

以HBV基因構建dsRNA對應的在靶序列，插入到psiCHECK-2質粒中。該質粒包含海腎螢光素酶基因及螢火蟲螢光素酶基因。作為雙報告基因系統，dsRNA的靶序列插入到海腎螢光素酶基因的3’ UTR區域，dsRNA對於靶標序列的活性可以藉由經螢火蟲螢光素酶校準後的海腎螢光素酶表達情況的檢測來反映，檢測使用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega，E2940)。

HEK293A細胞培養於含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，在37℃，5% CO₂條件下培養。轉染前24h，將HEK293A細胞接種於96孔板，接種密度為每孔8×10³個細胞，每孔100μL培養基。

按照說明書，使用Lipofectamine2000(ThermoFisher，11668019)對細胞共轉染dsRNA及對應質粒，Lipofectamine2000每孔使用0.2μL。質粒轉染量為20ng每孔。對於在靶序列質粒，dsRNA共設置11個濃度點，最高濃度點終濃度為20nM，3倍梯度稀釋，20nM、6.6667nM、2.2222nM、0.7407nM、0.2469nM、0.0823nM、0.0274nM、0.0091nM、0.0030nM、0.0010nM和0.0003nM。轉染後24h，採用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega，E2940)檢測在靶水平。

psiCHECK活性篩選實驗步驟具體如下：

在HEK293A細胞系藉由進行psi-CHECK篩選4條dsRNA序列的在靶活性。實驗材料和儀器詳見表5和表6。

Psi-CHECK質粒購自於生工生物工程(上海)股份有限公司。

表5.psi-CHECK實驗耗材和試劑

表6.psi-CHECK實驗儀器

psiCHECK實驗步驟：

(一)細胞鋪板

1.實驗準備：

1.1 HEK293A細胞準備：

購買於南京科佰，貼壁細胞消化完全後需要計數，若細胞活率大於等於95%即可用。

1.2 DMEM完全培養基(DMEM+10% FBS)儲存於4℃，實驗前取出平衡到室溫。

1.3 96孔板細胞板。

2.細胞鋪板

轉染前18h，計數完畢後將HEK293A細胞接種於96孔板中，接種密度為8×10³個細胞/孔，100μL培養基/孔；

2.1 將培養基放於37℃水浴鍋孵育20min備用；

2.2 吸取100μL均勻的細胞懸液與5μL細胞計數染料混勻，靜止染色1min，吸取15μL混懸液注入到細胞計數板上計算活細胞量(綠色)，細胞活率98.7%；

2.3 根據細胞計數結果，加入合適體積的培養基，取100μL鋪到96孔板中，保證細胞量為8×10³個細胞/孔，細胞板置於37℃，5% CO₂培養箱中進行培養。

(二)細胞轉染實驗

1.實驗準備：

1.1 dsRNA樣品和質粒準備：dsRNA樣品定量至20μM，psi-CHECK質粒測定其濃度，於-20℃儲存備用，使用前需要短暫離心；

1.2 轉染試劑Lipofectamine 2000儲存於4℃；

1.3 PCR 96孔板管和八連PCR管；

1.4 Opti-MEM培養基。

2.細胞轉染實驗

2.1 轉染前，預熱Opti-MEM培養基，細胞板中更換為Opti-MEM培養基，80μL培養基/孔。

2.2 配製轉染複合物：每個濃度設2個複孔，轉染複合物具體配製量如表18所示；

轉染複合物成分：

表7.孔板每孔所需轉染複合物用量

將配好的質粒分裝到相應8連管中，22μL/管，命名為：Tube A；

2.3 換液：將孔中的含10% FBS的H-DMEM完全培養基吸棄，換成80μL Opti-MEM，饑餓處理1.5h。

2.4 稀釋dsRNA：將dsRNA從-20℃拿出解凍，混勻，依照表8根據不同的實驗需求稀釋至不同濃度作為工作液備用，現用現配。

表8.dsRNA樣品多濃度稀釋方案

2.5 將稀釋好的dsRNA加入到相對應Tube A的8連管中，2.2μL/管，現配現用；

2.6 Lipofectamine 2000 Mix的配製：用Opti-MEM稀釋Lipofectamine 2000，靜置5min，Lipo Mix具體配製量如表19；

2.7 再將配製好的Lipo Mix分裝到對應Tube A的8連管中，22μL/管，吹打混勻後(不產生氣泡)，室溫孵育20min。

2.8 將上述Tube A混合物加入每孔細胞中，20μL/孔，加上原有80μL Opti-MEM，每孔終體積為100μL。4h溫箱培養後，每孔補加100μL含20% FBS的H-DMEM培養基。

2.9 37℃ CO₂培養箱培養24h。

(三)Dual-Glo® Luciferase Assay System檢測

1.實驗準備：

1.1 Dual luciferase reporter gene assay kit(Promega,cat.E2940)組分及配製方法：Dual-Glo®Luciferase Buffer和vial Dual-Glo® Luciferase Substrate(lyophilized)預先進行混合，然後分裝到15mL的離心管中，每管7.5mL。Dual-Glo® Stop & Glo® Buffer提前進行分裝，每管12mL。在實驗前先將混合好的Dual-Glo®Luciferase進行複融，等平衡到室溫後每管加入7.5mL DMEM進行配製，現配現用。將Dual-Glo® Stop & Glo® Buffer進行複融，等平衡到室溫後與Dual-Glo® Stop & Glo®Substrate 100：1進行配製，現配現用。

2.信號採集

2.1 吸液：吸去96孔培養板中原有的培養基；

2.2 加受質(Dual-Glo®Luciferase)：每孔加入150μL LARII受質，搖床上搖10min；

2.3 移液：取120μL受質(Dual-Glo®Luciferase Mix)，轉移到96孔酶標板上，讀取Firefly化學發光值；

2.4 加受質(Dual-Glo® Stop & Glo)：再向每孔加入60μL Dual-Glo® Stop & Glo受質，搖床上搖10min，讀取Renilla化學發光值；

2.5 計算相對值Ratio=Ren/Fir(海腎/螢火蟲比值)；

2.6 計算抑制率1-(Ratio+dsRNA/僅報告基因)*100%=抑制率(%)；

本揭露中，剩餘活性%(也稱為mRNA剩餘表達量%或mRNA剩餘表達比例)=100%-抑制率(%)。

2.7 利用GraphPad Prism5作圖。

結果如表9所示。

表9.dsRNA的psi-CHECK在靶活性篩選結果

以上結果表明，參比對照化合物AD81890，TRD007970在psiCHECK系統針對HBV基因具有高水平的在靶抑制活性。

另外一批次結果如表10所示。

表10.dsRNA的psi-CHECK在靶活性篩選結果

以上結果表明，參比對照AD81890，本揭露的TRD007970、TJR100259在psiCHECK系統針對HBV基因具有更高水平的在靶抑制活性。

實施例4：應用HepG2.2.15細胞評價dsRNA體外抗HBV活性

在HepG2.2.15細胞中採用8個濃度梯度對dsRNA進行體外抗HBV活性評估。

第1天種HepG2.2.15細胞到96孔板，每孔2萬個細胞。種細胞同時用RNAiMax將不同濃度的dsRNA轉入HepG2.2.15細胞；第4天收集細胞培養上清，ELISA檢測HBsAg(剩餘上清凍存備用)。最後收集細胞，提取細胞內RNA，RT-PCR分別檢測總HBV RNA(包括3.5kb+2.4kb+2.1kb+0.7kb RNA)和3.5kb HBV RNA(包括pgRNA+preCore RNA)，同時檢測GAPDH基因RNA作為內參。待測化合物為8個濃度點，平行測定2複孔。培養液中DMSO的終濃度為0.5%。

抑制百分比計算公式如下：

% HBsAg抑制率=(1-樣品中HBsAg含量/DMSO對照組中HBsAg含量)×100

% HBV RNA抑制率=(1-樣品中HBV的RNA含量/DMSO對照組中HBV的RNA含量)×100

%細胞活力=(樣品吸光值-培養液對照的吸光值)/(DMSO對照的吸光值-培養液對照的吸光值)×100。

應用Graphpad Prism軟體分析(four parameter logistic equations)計算EC₅₀值。

結果如表11所示，參比對照AD81890，綜合抗病毒活性檢測指標，測試TRD007970在HepG2.2.15細胞上展現出優秀的抗病毒活性。

表11.dsRNA在HepG2.2.15的抗病毒活性

實施例5：應用PHH細胞評價dsRNA體外抗HBV活性(自由攝取)

分別針對TRD007970、TJR100259和AD81890進行體外抗HBV活性評價。

第0天，先dsRNA用PBS梯度稀釋7個濃度(100、25、6.25、1.563、0.391、0.098、0.024nM)，加入48孔板中。復蘇凍存的PHH，再將PHH鋪種到48孔板中；鋪板同時將測試化合物自由攝取(free uptake)進入細胞。

第1天，更換不含dsRNA的培養基，加入HBV感染PHH。

第2、4和6天，更換不含dsRNA的新鮮培養基。

第8天，收集上清，將收集的細胞上清用ELISA法檢測HBsAg和HBeAg，qPCR法檢測HBV DNA水平。實驗結果見表12。

表12.dsRNA在PHH的抗病毒活性

結果顯示，與對照AD81890相比，TRD007970和TJR100259在PHH上抗病毒活性更好。

實施例6：核酸外切酶穩定性實驗評價dsRNA的穩定性

分別針對TRD007970和TJR100259的siRNA裸序列TJR100381和TJR100382(見表13)進行外切酶穩定性評價，按照實驗的反應體系配製相應的反應液進行實驗，見表14-15。

表13.裸序列TJR100381和TJR100382

表14.5’核酸外切酶(PDII)穩定性反應體系(100ul)

表15.3’核酸外切酶(SVPD)穩定性反應體系(100ul)

5’核酸外切酶(PDII,Worthington，cat#LS003602)的終濃度為500U/mL,3’核酸外切酶(SVPD，Worthington,cat#LS003926)的終濃度為0.5U/mL。配製完成後，按時間0h、1.5h、2h、3h、4h五個時間點分裝到不同的8聯排管中(每孔16ul)，置於37℃中進行孵育，到時間點後立即取出反應液並加入含9M尿素的上樣緩衝液(每孔32u1)，放於-80℃冰箱備。後續藉由20%(7M尿素)PAGE膠進行電泳。電泳結束後將膠浸於gelred染料中，搖床染色10min，凝膠成像(312nm的UV)觀察並照相。實驗結果見圖1(凝膠電泳結果)，圖2(5’核酸外切酶定量結果)和圖3(3’核酸外切酶定量結果)，結果表明TJR100382的穩定性顯著優於TJR100381。

實施例7：肝臟S9代謝穩定性分析

分別針對TRD007970、TJR100259和AD81890進行食蟹猴的肝臟S9(食蟹猴肝S9，雄性，供應商Xenotech，批號1510192)，對dsRNA進行代謝穩定性分析，實驗過程如下：

1、製備8個96孔樣品板，命名為T0、T60、T120、T240、T360、T1440、T2880、空白。

2、將190μL/孔S9懸浮液(或空白緩衝液)加到每塊板，然後37℃孵育約10分鐘。

3、除基質孔外，每個板(T0、T60、T120、T240、T360、T1440、T2880)每孔加入10μL樣品或空白緩衝液。

4、除T0外，各時間點(60、120、240、360、1440、2880min)的TRD007970、TJR100259和AD81890樣品均在37℃水浴中孵育。

5、在每個時間點結束時，加入200μL(100mM NH4Ac pH 10.0、1mM EDTA和750ng/mL內標於水中)，在旋渦混合器上震盪60秒。

6、每孔加入200μL PCI(苯酚/氯仿/異戊醇(25：24：1))試劑和400μL二氯甲烷，在旋渦混合器上震盪10min後離心(4℃，3220g，20min)，獲得上清液。

7、將上清液轉移至新板上，在進行LC-MS分析前放4℃保存。

8、分別檢測AS鏈和SS鏈的單鏈的剩餘百分比，以表徵TRD007970、TJR100259和AD81890的剩餘含量。

9、使用以下公式計算：

剩餘%=各時間點分析物與內標的峰面積比/T0分析物與內標物的峰面積比×100%

C_t=C₀*e^-ke*t

T_1/2=Ln2/k_e=0.693/k_eCl_int(s9)=0.693/體外T_1/2*1/(mg/mL反應體系中S9蛋白)

Cl_int(liver)=Cl_int(S9)*(mgS9)/g肝*g肝/(kg體重)。

實驗結果見表16，結果表明，食蟹猴肝S9孵育48h，TJR100259反義鏈剩餘93.8%，AD81890反義鏈剩餘70.2%，TRD007970反義鏈剩餘61.0%。數據顯示，食蟹猴肝S9孵育48h，TJR100259中的反義鏈較AD81890中的反義鏈和TRD007970中的反義鏈更穩定。

食蟹猴肝S9孵育48h，TJR100259有義鏈剩餘21.0%，AD81890有義鏈剩餘12.2%，TRD007970有義鏈剩餘8.9%。數據顯示，食蟹猴肝S9孵育48h，TJR100259中的有義鏈較AD81890中的有義鏈和TRD007970中的有義鏈更穩定。

單鏈的剩餘率可以反映dsRNA的穩定性，剩餘率越高，穩定性越好。因此，TJR100259較AD81890和TRD007970在食蟹猴肝S9代謝穩定性實驗條件下穩定性更好。

表16.食蟹猴肝S9代謝穩定性分析

實施例8：組織分佈實驗

TRD007970、TJR100410和TJR100259進行組織分佈實驗，實驗過程如下：

72隻雄性C56BL/6J小鼠(7-8w，北京維通利華實驗動物技術有限公司)適應約1週，分成3組，每組24隻。TRD007970、TJR100259和TJR100410劑量均為10mg/kg，給藥後0.5h、1h、2h、4h、8h、24h、72h、168h(n=3)採集樣品。安樂死後心臟採血，採集左腎和肝左側最大葉，收集的臟器用生理鹽水沖洗乾淨。肝腎樣品經前處理後，使用高分辨質譜分析肝臟和腎臟中AS鏈濃度，以表徵TRD007970、TJR100259和TJR100410的濃度。

實驗結果見表17。結果表明，C56BL/6J小鼠組織分佈實驗中，TRD007970、TJR100259和TJR100410反義鏈肝腎暴露量比分別為：9.44、29.38和3.49。肝腎暴露量比值大提示在靶器官(肝臟)濃度較高，非靶器官(腎臟)濃度較低。因此，同等劑量下，TJR100259展現出高於TRD007970的肝腎比，TRD007970展現出高於TJR100410的肝腎比，提示TJR100259的出現腎臟毒性的風險低於TRD007970，TRD007970的出現腎臟毒性的風險低於TJR100410。

表17.組織分佈結果

實施例9：肝勻漿穩定性

TJR100410和TJR100259進行肝臟勻漿穩定性分析，實驗過程如下：

1.用Apricot把食蟹猴肝勻漿(由實驗單位藥明康德提供)加入190μL/孔，並將板子於37℃孵育約30分鐘。

2.除基質孔，每塊板每孔(T0、T1、T2、T4、T6、T24、T48，表32)加入10μL dsRNA或對照緩衝溶液，開始計時。

表18.各時間點表

2.1、樣品準備

(1)向指定孔中加入200μL的dsRNA。

(2)加入1000μL Clarify OTX裂解緩衝液。

(3)以800rpm的速度振盪5分鐘。

2.2、SPE

(1)條件：藉由飛諾美Clarity OTX SPE板(8e-s103-cga)用600μL的MeOH沖洗。

(2)平衡：藉由SPE板用600μL平衡緩衝液(pH 5.5的50mM NH4Ac含有0.0025% Triton X-100和0.01mg/mL半胱胺酸)沖洗。

(3)加載：藉由SPE板沖洗2.1中的樣品。

(4)清洗1：將600μL的清洗緩衝液1(25mM NH4Ac pH 5.5)藉由固相萃取板沖洗，然後再次重複上述步驟。

(5)清洗2：將600μL的清洗緩衝液2(25mM NH4Ac pH 5.5,50% CAN)藉由固相萃取板沖洗，並再次重複上述步驟。

(6)沖提：用150μL沖提緩衝液(100mM NH4HCO3，1mM TCEP pH 9.5含有40% ACN和10% THF)沖提樣品，並重複此步驟。

(7)使用N₂蒸發器在45℃乾燥樣品(約2小時)。

(8)用70μL的流動相A重組樣品。

(9)LC-MS/MS分析前，以800rpm的速度輕輕振盪0.5小時。

(10)使用以下公式計算。

C_t=C₀*e^-ke*t C_t=1/2C₀ T_1/2=Ln2/(-k_e)=0.693/(-k_e)。

其中，TJR100410為對照dsRNA，其有義鏈為：

GmsUmsGmUmGmCmAfCfUfUmCmGmCmUmUmCmAmCmCm-NAG1(SEQ ID NO：9)；

反義鏈為：

AmsGfsUmGfAmAf(-)hmpNA(G)CmGmAfAmGfUmGfCmAfCmAfCmsGmsGm(SEQ ID NO：10)；

NAG1的結構為

。

實驗結果見表19。

結果表明，食蟹猴肝勻漿孵育48h，TJR100259中的反義鏈剩餘94.6%，TJR100410中的反義鏈剩餘42.7%；TJR100259中的有義鏈剩餘18.3%，TJR100410中的有義鏈剩餘4.3%。數據顯示，食蟹猴肝勻漿孵育48h，TJR100259中的反義鏈較TJR100410中的反義鏈更穩定；TJR100259中的有義鏈較TJR100410中的有義鏈更穩定。

單鏈的剩餘率可以反映dsRNA的穩定性，剩餘率越高，穩定性越好。因此，TJR100259較TJR100410在食蟹猴肝勻漿穩定性實驗條件下穩定性更好。

表19.食蟹猴肝勻漿穩定性分析

實施例10：TRD007970和式(II)化合物在TLR8人源化小鼠AAV-HBV(腺相關病毒-B型肝炎病毒)感染模型中的藥效評價研究

50隻9週齡雌性human TLR8小鼠(上海南方模式生物科技股份有限公司，動物健康合格證編號20190002028579)經過5天的適應後，在Predose第0天由尾靜脈注射200μL rAAV8-1.3HBV病毒懸液(含1×1011 rAAV8-1.3HBV病毒拷貝，武漢樞密腦科學技術有限公司，批號ayw1-p4-220412)。在Predose第14天和25天(AAV-HBV注射14和25天後)，每隻小鼠藉由下頜靜脈取血製備(10+15)μL血清，用於HBV DNA定量檢測。

根據Predose第25天指標挑選24隻human TLR8小鼠，隨機分成4組，如表20所示。溶媒(Vehicle，組1)、式(II)化合物(可參考WO2020007275A說明書實施例6中的方法製備)(組2、4)在第0~7天灌胃給藥兩次(第0、3天)。TRD007970(組3、4)在第0-7天皮下給藥一次(第0天)。受試物的給藥體積均為5mL/kg。於第0、7天採血收集血漿，每隻動物每次50μL，儲存於2~8℃，用於HBVDNA定量檢測。

表20.實驗分組及給藥方案

結果如圖4所示，第7天血漿中HBVDNA水平，與溶媒組比較，TRD007970 9mg/kg組和式(II)化合物6mg/kg+TRD007970 9mg/kg組均有非常顯著的降低；與式(II)化合物6mg/kg組比較，式(II)化合物6mg/kg+TRD007970 9mg/kg組有非常顯著的降低；與TRD007970 9mg/kg組比較，式(II)化合物6mg/kg+TRD007970 9mg/kg組有明顯的降低。

上述結果顯示，式(II)化合物6mg/kg+TRD007970 9mg/kg組與單藥比較，第7天血漿中HBVDNA水平降低具有顯著性。因此，式(II)化合物6mg/kg與TRD007970 9mg/kg聯用在第7天小鼠血漿的HBVDNA水平降低上具有明顯的聯合治療效果。

TW202430183A_112149086_SEQL.xml

Claims

一種雙鏈核糖核酸(dsRNA)聯合式(II)所示化合物或其可藥用鹽在製備預防和/或治療B型肝炎病毒感染或與B型肝炎病毒相關的疾病的藥物中的用途，

該dsRNA，其包含：

siRNA和一個或多個與其綴合的配體；

該siRNA包含有義鏈和反義鏈，

該反義鏈在其5’端起第7位核苷酸位置處包含式(I)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽：

該式(I)所示的化學修飾選自以下任一結構：

、
、
，B與該反義鏈5’端起第7位核苷酸未被修飾時的鹼基相同；

該配體如以下結構所示或是其藥學上可接受的鹽：

該有義鏈和反義鏈選自以下任一組：

有義鏈包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

有義鏈包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，反義鏈包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；

該有義鏈的3’端與該配體綴合；

該B選自鳥嘌呤。
如請求項1所述的用途，其中，

該配體藉由磷酸酯基團或硫代磷酸酯基團與該siRNA末端連接；較佳藉由磷酸二酯基團或硫代磷酸二酯基團連接，更佳藉由磷酸二酯基團連接。
如請求項1或2所述的用途，其中，該有義鏈含有如下式所示的核苷酸：

5’-N_aN_aN_aN_aN_aN_aN_bN_bN_bN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a-3’；

其中，N_a為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b為2'-氟修飾的核苷酸；

該反義鏈含有如下式所示的核苷酸：

5’-N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’W’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’-3’；

N_a’為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b’為2'-氟修飾的核苷酸；

W’表示包含式(I)所示的化學修飾、其互變異構體或其藥學上可接受的鹽的核苷酸。
如請求項1至3中任一項所述的用途，其中，

該有義鏈和/或反義鏈中至少一個磷酸酯基為具有修飾基團的磷酸酯基；較佳地，該具有修飾基團的磷酸酯基為硫代磷酸二酯基。
如請求項1至4中任一項所述的用途，其中，

該dsRNA選自以下任一組：

包含SEQ ID NO：4所示的有義鏈和SEQ ID NO：5所示的反義鏈；

包含SEQ ID NO：4所示的有義鏈和SEQ ID NO：6所示的反義鏈。
如請求項1至5中任一項所述的用途，其中該dsRNA選自如下結構或其藥學上可接受的鹽：

其中，

Af=腺嘌呤2'-F核糖核苷；Cf=胞嘧啶2'-F核糖核苷；Gf=鳥嘌呤2'-F核糖核苷(guanine 2'-F ribonucleoside)；Uf=尿嘧啶2'-F核糖核苷；

Am=腺嘌呤2'-OMe核糖核苷；Cm=胞嘧啶2'-OMe核糖核苷；Gm=鳥嘌呤2'-OMe核糖核苷；Um=尿嘧啶2'-OMe核糖核苷；Im=次黃嘌呤2'-OMe核糖核苷；

表示硫代磷酸二酯基陰離子形式，
表示磷酸二酯基陰離子形式，

表示

表示
。
如請求項1至6中任一項所述的用途，其中所該式(II)所示化合物或其可藥用鹽的給藥方式為固定劑量給藥，給藥劑量選自0.02mg-50mg，給藥頻次選自每週兩次、每週一次、每兩週一次和每四週一次。
如請求項1至7中任一項所述的用途，其中該dsRNA的給藥方式為固定劑量給藥，給藥劑量選自10mg至1500mg，給藥頻次選自每週一次、每週兩次、每四週一次、每六週一次、每八週一次或每十二週一次。
如請求項1至8中任一項所述的用途，其中該與B型肝炎病毒相關的疾病選自：慢性肝炎、急性B型肝炎、慢性B型肝炎、D型肝炎病毒感染、D型肝炎、肝纖維化、晚期肝病、肝細胞癌。
一種抑制HBV靶基因或其mRNA表達的方法，其包括：向受試者給與有效量或有效劑量的如如請求項1至9中任一項所述的dsRNA和有效量或有效劑量的式(II)所示化合物或其可藥用鹽。
一種預防和/或治療受試者B型肝炎病毒感染或與B型肝炎病毒相關的疾病的方法，其包括：給與受試者如請求項1至9中任一項所述的dsRNA和式(II)所示化合物或其可藥用鹽。
一種式(II)所示化合物或其可藥用鹽，其與如請求項1至9中任一項所述的dsRNA聯合，用於預防和/或治療B型肝炎病毒感染或與B型肝炎病毒相關的疾病。
一種如請求項1至9中任一項所述的dsRNA，其與式(II)所示化合物或其可藥用鹽聯合，用於預防和/或治療B型肝炎病毒感染或與B型肝炎病毒相關的疾病。