TW202426479A

TW202426479A - Apoe基因療法

Info

Publication number: TW202426479A
Application number: TW112138516A
Authority: TW
Inventors: 泰勒格倫德馬雷斯特; 丹尼爾科恩
Original assignee: 美商星火治療公司
Priority date: 2022-10-10
Filing date: 2023-10-06
Publication date: 2024-07-01
Also published as: WO2024081604A1; AU2023360721A1; AR130730A1

Abstract

本發明係關於編碼視情況含有一或多個內含子之ApoE3相關蛋白的聚核苷酸構築體。不同構築體之潛在用途包括靶向一或多種疾病或病症的基因療法，例如與膽固醇含量相關之疾病或病症、動脈粥樣硬化、冠心病、失智症、類澱粉腦血管病變或阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)。

Description

APOE基因療法

ApoE經合成以作為含有18胺基酸前導序列之317個胺基酸之前驅蛋白。前導序列之裂解產生含有299個胺基酸之ApoE之成熟形式。(Khalil等人, Atherosclerosis (2021) 328:11-22及Tudorache等人, (2017) Computational and Structural Biotechnology Journal 15:359-365)。

ApoE主要參與脂質代謝且提供不同活性，包括介導血漿脂蛋白之肝及肝外吸收以及來自負載脂質之巨噬細胞的膽固醇流出。指示涉及ApoE之過程包括神經保護、抗微生物防護及氧化應力。(Khalil等人, Atherosclerosis (2021) 328:11-22及Tudorache等人, (2017) Computational and Structural Biotechnology Journal 15:359-365)。

在人類中存在三種主要ApoE同功型：ApoE2、ApoE3及ApoE4。不同同功型係藉由兩個位置中之胺基酸來區分。相對於成熟ApoE，ApoE2在胺基酸112處具有半胱胺酸且在胺基酸158處具有半胱胺酸，ApoE3在胺基酸112處具有半胱胺酸且在胺基酸158處具有精胺酸，而ApoE4在胺基酸112處具有精胺酸且在胺基酸158處具有精胺酸。(Khalil等人, Atherosclerosis (2021) 328:11-22及Tudorache等人, (2017) Computational and Structural Biotechnology Journal 15:359-365)。

不同ApoE同功型，包括微小形式，與不同疾病或病症之風險增加相關。(Zhou等人, (2021) Current Opinion is Neurobiology 69:58-67)。經鑑別，ApoE基因型(當按ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4排序時)與LDL-C及冠狀動脈風險具有近似線性關係。(Bennet等人, JAMA. (2007) 298(11):1300-1311)。其他相關性包括ApoE2同型接合性通常引起III型高脂蛋白血症，且ApoE4與阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)相關。(Khalil等人, Atherosclerosis (2021) 328:11-22及Tudorache等人, (2017) Computational and Structural Biotechnology Journal 15:359-365)。

鑑別為基督城取代(Christchurch substitution)之取代提供ApoE 136精胺酸成為絲胺酸之取代。含有基督城取代之ApoE2似乎顯著促成高脂血症。(Wardel等人, J. Clin. Invest. (1987) 80(2):483-490)。具有含有基督城取代之ApoE3 (「ApoE3(ch)」)之兩個複本的患者經指示對體染色體顯性阿茲海默氏病具有抗性，且具有升高之三酸甘油酯及總膽固醇。(Arboleda-Velasquez等人, Nature Medicine (2019) 25:1680-1683)。

國際專利公開案第WO2022/115535號、第WO2021/108809號及第WO2020/243346號提及阿茲海默氏病之治療。

本發明之特徵在於聚核苷酸構築體，其包含具有與SEQ ID NO: 63-67中之任一者之序列或SEQ ID NO: 95-105或124-130之核苷酸55至951具有至少85%序列一致性之區域的核苷酸序列；及與SEQ ID NO: 119-121中之任一者相關之CpG減少之內含子。較佳之構築體為與天然ApoE3序列相比CpG減少之構築體且可進一步包含與天然序列相比之其他變化形式。聚核苷酸構築體可用於例如靶向一或多種疾病或病症，例如與膽固醇含量相關之疾病或病症、動脈粥樣硬化、冠心病、失智症(例如，血管型失智症(vascular dementia)或額顳葉型失智症(frontotemporal dementia))、類澱粉腦血管病變或阿茲海默氏病之基因療法中。

因此，本發明之第一態樣描述一種聚核苷酸，其包含與SEQ ID NO: 63-67中之任一者之序列或SEQ ID NO: 95-105或124-130之核苷酸55至951具有至少85%之序列一致性的ApoE編碼核苷酸序列，其中聚核苷酸編碼包含與SEQ ID NO: 32至少90%一致之胺基酸序列的ApoE3相關蛋白，其中該蛋白質包含在對應於SEQ ID NO: 32之胺基酸112之位置處的半胱胺酸及在對應於SEQ ID NO: 32之胺基酸158之位置處的精胺酸，且其中ApoE編碼核苷酸序列視情況包含一或多個內含子。與SEQ ID NO: 63-67中之任一者或SEQ ID NO: 95-105或124-130之核苷酸55至951至少85%一致係獨立於ApoE編碼核酸中可能存在之任何內含子。

SEQ ID NO: 63-67之核苷酸1至951編碼胺基酸。SEQ ID NO: 63-67之核苷酸952至954編碼終止密碼子。

提及與兩個或更多個參考序列之指定百分比一致性，及在本說明書通篇提供與兩個或更多個參考序列之指定百分比一致性的類似語言，提供獨立於參考序列中之各者的指定百分比一致性或百分比一致性範圍。在測定聚核苷酸之百分比一致性時，RNA及對應之DNA在未提及聚核苷酸為RNA或DNA之情況下視為相同的。對應之RNA及DNA包括尿嘧啶與胸腺嘧啶及核糖主鏈與去氧核糖主鏈之置換。

本文提供不同聚核苷酸構築體，其包括編碼ApoE3相關蛋白之聚核苷酸；包含表現卡匣之聚核苷酸，該表現卡匣包含可操作地連接至一或多個表現控制元件的編碼ApoE3相關蛋白之核酸序列；包含重組病毒載體核酸之聚核苷酸，其中聚核苷酸之5'及/或3'端具有提供用於封裝至病毒載體及/或病毒複製，及載體基因體質體中之元件。

提及一或多個表現控制元件「可操作地連接」或「可操作地偶合」至ApoE編碼核酸指示該一或多個表現控制元件影響ApoE3相關蛋白表現。ApoE3相關蛋白表現可以不同方式受影響，諸如ApoE3相關蛋白mRNA轉錄本之產生增加、mRNA轉錄本之核轉運及穩定性增加，以及mRNA轉譯增加。

本發明之另一態樣係關於投與本文中所描述之聚核苷酸構築體以實現以下中之一或多者：降低膽固醇、降低LDL/VLDL、增加HDL或降低總膽固醇/HDL比率；或治療高膽固醇血症、III型家族性高脂蛋白血症、家族性高膽固醇血症、類澱粉腦血管病變、失智症、支架後再狹窄(post-stent restenosis)、動脈粥樣硬化、冠心病或阿茲海默氏病或降低該等病症之可能性。

其他態樣包括本文中所描述之聚核苷酸構築體，其用於醫學中或實現以下中之一或多者：降低膽固醇、降低LDL/VLDL、增加HDL或降低總膽固醇/HDL比率；或治療高膽固醇血症、III型家族性高脂蛋白血症、家族性高膽固醇血症、類澱粉腦血管病變、失智症、支架後再狹窄、動脈粥樣硬化、冠心病或阿茲海默氏病或降低該等病症之可能性；及本文中所描述之構築體之用途，其用於製備用於醫學中或實現以下中之一或多者的藥劑：降低膽固醇、降低LDL/VLDL、增加HDL或降低總膽固醇/HDL比率；或治療高膽固醇血症、III型家族性高脂蛋白血症、家族性高膽固醇血症、類澱粉腦血管病變、失智症、支架後再狹窄、動脈粥樣硬化、冠心病或阿茲海默氏病或降低該等病症之可能性。

其他態樣包括AAV載體基因體；製造rAAV載體之方法；獲得rAAV載體之方法；及與任何SEQ ID NO: 119-121相關之聚核苷酸，其中聚核苷酸具有0至5個CpG。

本發明之其他特徵及優點係自本文中所提供之額外描述(包括不同實例)顯而易見。所提供之實例說明適用於實施本發明之不同組分及方法。此類實例並不限制所主張之本發明。基於本發明，熟習此項技術者可鑑別及使用適用於實踐本發明之其他組分及方法。

相關申請案之交互參照

本申請案主張2022年10月10日申請之美國臨時申請案第63/378,960號之優先權，該案之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。對以電子方式提交之序列表之參照

電子序列表(065830_11WO1.xml；大小：210,461位元組；及創建日期：2023年10月5日)之內容以全文引用之方式併入本文中。

本發明之特徵在於聚核苷酸構築體，其包含與SEQ ID NO: 63-67中之任一者之序列或SEQ ID NO: 95-105或124-130之核苷酸55至951具有至少85%序列一致性之ApoE編碼核苷酸序列，其中聚核苷酸編碼包含與SEQ ID NO: 32至少90%一致之胺基酸序列的ApoE3相關蛋白，其中該蛋白質包含在對應於SEQ ID NO: 32之胺基酸112之位置處的半胱胺酸及在對應於SEQ ID NO: 32之胺基酸158之位置處的精胺酸，且其中ApoE編碼核苷酸序列視情況包含一或多個內含子。ApoE3(ch)為一種ApoE3相關蛋白，其包含在對應於SEQ ID NO: 32之胺基酸136之位置處的絲胺酸。

所提供之構築體可用於不同方法中，包括靶向個體中與膽固醇、脂蛋白含量、心血管疾病、失智症或阿茲海默氏病相關之不同疾病或病症的基因療法。下文提供之實例說明例如ApoE基因剔除小鼠中編碼ApoE3(ch)及ApoE3表現之不同轉殖基因降低總膽固醇含量、增加HDL、降低LDL/VLDL、降低總膽固醇/HDL比率、減少動脈粥樣硬化病變(動脈粥狀瘤)、減少發炎蛋白、增加突觸發生及改良在新穎物體識別測試中之認知功能的能力。

提及「個體」指示哺乳動物，包括人類；非人類靈長類動物，諸如猿、長臂猿、大猩猩、黑猩猩、紅毛猩猩及短尾猿；家畜，諸如狗及貓；農畜，諸如家禽、鴨、馬、母牛、山羊、綿羊及豬；以及實驗動物，諸如小鼠、大鼠、兔及天竺鼠。較佳之個體為人類。

編碼ApoE3相關蛋白之聚核苷酸可使用非病毒或病毒遞送來遞送。可用於基因療法中之病毒載體包括逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、AAV載體及單純疱疹病毒載體。非病毒遞送包括裸DNA及使用奈米粒子。

提及「一致」、「一致性」百分比及類似術語係相對於在特定區域中具有最大比對之兩個序列而言。所提供之區域係相對於所指示之參考序列而言。舉例而言，與人類成熟ApoE3蛋白之序列「一致」或「一致性」可藉由測定比對序列中之一致胺基酸之數目，除以SEQ ID NO: 32中之胺基酸之總數目(299個胺基酸)並乘以100來計算。核酸序列之「一致」或「一致性」百分比可以類似方式確定，其中核苷酸與參考序列經比對以達成最大比對，除以參考序列中之核苷酸之總數目並乘以100。獨立於任何內含子測定之ApoE編碼序列之「一致」或「一致性」百分比指示出於計算目的，內含子在比對之前移除。

術語「核酸」及「聚核苷酸」在本文中可互換地使用以指所有核酸、寡核苷酸形式，包括去氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)。在論述核酸時，特定聚核苷酸之序列或結構在本文中可根據在5'至3'方向上提供序列之慣例來描述。

在某些實施例中，核酸包括基因體DNA、cDNA、反義DNA/RNA、質體DNA、線性DNA、(聚核苷酸及寡核苷酸)、染色體DNA、剪接或未經剪接之mRNA、rRNA、tRNA抑制性DNA或RNA (RNAi，例如小或短髮夾(sh) RNA、微小RNA (miRNA)、小或短干擾(si) RNA、反式剪接RNA或反義RNA)、鎖核酸類似物(LNA)、單股及雙股寡核苷酸DNA (ODN)、免疫刺激序列(ISS)、核糖開關及核酶。

在某些實施例中，核酸包括天然存在、合成及刻意修飾或改變之聚核苷酸。核酸可為單螺旋、雙螺旋或三螺旋、四螺旋，線性或環狀的，且可具有任何長度。

根據某些實施例，聚核苷酸為單股(ssDNA)或雙股DNA (dsDNA)分子。根據某些實施例，dsDNA分子為微型環、奈米質體、開放式線性雙螺旋DNA或封閉端線性雙螺旋DNA (CELiD/ceDNA/狗骨狀(doggybone) DNA)。根據某些實施例，ssDNA分子為閉環或開放式線性DNA。

「轉殖基因」係指預期或已引入細胞中且可操作地連接至啟動子之核酸。轉殖基因包括異源聚核苷酸序列，諸如編碼ApoE3相關蛋白之核酸及異源啟動子。

較佳之聚核苷酸構築體為「CpG減少」或「CpG耗盡」的。「CpG減少」或「CpG耗盡」係指(i)其中CpG二核苷酸(或模體)中之一或多者自參考核酸序列移除之核苷酸序列；及/或(ii)所提及之聚核苷酸中之CpG的百分比為0%至15%。在不同實施例中，CpG百分比為0%、約0.5%、約1.0%、約2.0%、約3.0%、約4.0%或約5.0%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%或約15%之CpG；及/或至多約0.5%、至多約1.0%、至多約2.0%、至多約3.0%、至多約4.0%、至多約5.0%、至多約6%、至多約7%、至多約8%、至多約9%、至多約10%、至多約11%、至多約12%、至多約13%、至多約14%或至多約15%之CpG。

CpG模體在編碼ApoE3相關蛋白之核苷酸序列及在存在於特定構築體(例如表現卡匣及病毒載體)中之其他序列中可適當地減少或消除。可能存在之其他序列包括非編碼序列，諸如5'及3'非轉譯區(UTR)、填充序列、啟動子、強化子、聚腺苷酸化信號、ITR及內含子。

除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」包括複數個參考物。

在多個所列舉之元件之間的結合術語「及/或」涵蓋個別及組合選項兩者。舉例而言，在兩個要素係由「及/或」連接時，第一選項係指第一選項在無第二選項之情況下之適用性，第二選項係指第二選項在無第一選項之情況下之適用性，且第三選項係指第一選項及第二選項在一起之適用性。選項中之任一者應理解為屬於含義內，且因此滿足術語「及/或」之要求。選項中之多於一者的並行適用性亦應理解為屬於術語「及/或」之含義內。

除非所使用之上下文以其他方式明確指示，否則術語「或」及「及」與「及/或」具有相同含義。

提及後接不同成員或實例之術語(諸如「包括」、「例如(for example)」、「例如(e.g.)」、「諸如」)為開放式描述，其中所列成員或實例為說明性的且可提供或使用其他成員或實例。

術語「多肽」、「蛋白質」及「肽」可互換地使用以指胺基酸序列而不考慮功能。多肽及肽含有至少兩個胺基酸，而蛋白質含有至少約10個胺基酸。所提供之胺基酸包括天然存在之胺基酸及藉由細胞修飾所提供之胺基酸。

提及相對於要素或一組要素使用之「包含(comprise)」及變化形式(諸如「包含(comprises)」及「包含(comprising)」)為開放式的，且不排除其他未列舉之要素或方法步驟。諸如「包括」、「含有」及「由……表徵」之術語與包含同義。在本文中所描述之不同態樣及實施例中，提及諸如「包含」之開放式術語可經「組成」或「基本上由……組成」置換。

提及「由……組成」排除所列申請專利範圍要素中未規定之任何要素、步驟或成分，其中此類要素、步驟或成分與所主張之本發明相關。

提及「基本上由……組成」將申請專利範圍之範疇限於規定材料或步驟及實質上不影響所主張之本發明之基礎及新穎特徵的材料或步驟中。

術語「約」係指在基礎參數之10%以內(亦即，加或減10%)的值。舉例而言，「約1:10」包括1.1:10.1或0.9:9.9，且「約5小時」包括4.5小時或5.5小時。在一連串值開頭之術語「約」以10%來修飾值中之各者。

除非上下文另外明確指示，否則所有數值或數值範圍包括此類範圍內之整數及範圍內之值或整數的分數。因此，為了說明，提及減少95%或更多包括95%、96%、97%、98%、99%、100%，以及95.1%、95.2%、95.3%、95.4%、95.5%等、96.1%、96.2%、96.3%、96.4%、96.5%等，且提及數值範圍，諸如「1至4」包括1、2、3、4，以及1.1、1.2、1.3、1.4等。作為進一步說明，「1至4週」包括7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天。

此外，提及數值範圍，諸如「0.01至10」包括0.011、0.012、0.013等，以及9.5、9.6、9.7、9.8、9.9等。舉例而言，個體之約「0.01 mg/kg至約10 mg/kg」體重之劑量包括0.011 mg/kg、0.012 mg/kg、0.013 mg/kg、0.014 mg/kg、0.015 mg/kg等，以及9.5 mg/kg、9.6 mg/kg、9.7 mg/kg、9.8 mg/kg、9.9 mg/kg等。

提及多於(大於)或小於之整數分別包括大於或小於參考數目之數值。因此，舉例而言，提及超過2包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多；且投與「兩次或更多次」包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多次。

在先前技術及本說明書通篇中引用或描述各種參考文獻，包括文章及專利公開案。此等參考文獻中之各者以全文引用之方式併入本文中。就所揭示或主張之任何發明而言，不承認參考文獻中之任一者為先前技術。在一些情況下，指示特定參考文獻以引用之方式併入本文中來突顯併入。

本文中所提供之定義(包括本申請案之本部分及其他部分中之定義)適用於本申請案通篇。

除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬之此項技術者通常所理解相同之含義。

本說明書已分成各種部分及段落，且提供各種實施例之實例。此等分離不應視為一個段落或部分或實施例之主旨與另一段落或部分或實施例之主旨無關聯。所提供之描述具有廣泛應用且涵蓋可考慮之各種部分、段落及句子的所有組合。任何實施例之論述僅意謂為例示性的，且並不意欲表明本發明之範疇(包括申請專利範圍(除非申請專利範圍中另外提供))限於此等實例。

本文中使用肯定之語言描述本發明之多個實施例來大體上揭示本發明。特定言之，本發明亦包括其中完全或部分地排除諸如物質或材料、方法步驟及條件、方案或程序之特定標的物之實施例。舉例而言，在本發明之某些實施例中，排除材料及/或方法步驟。因此，即使本文中未就本發明未包括之內容來大體上表述本發明，但本文中仍揭示了本發明中未明確排除之實施例。

I. 編碼聚核苷酸之 ApoE 蛋白

ApoE編碼核苷酸序列編碼包含與SEQ ID NO: 32至少90%一致之胺基酸序列的ApoE3相關蛋白，其中該蛋白質含有在對應於SEQ ID NO: 32之胺基酸112之位置處的半胱胺酸及在對應於SEQ ID NO: 32之胺基酸158之位置處的精胺酸。若存在內含子，則獨立於內含子測定百分比一致性。在某些實施例中，編碼ApoE之核酸中不存在內含子。

在不同實施例中，ApoE3相關蛋白與SEQ ID NO: 32之胺基酸序列至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致；與SEQ ID NO: 32之差異為1、至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9或至多10個胺基酸；由SEQ ID NO: 32提供。

在不同實施例中，ApoE3相關蛋白進一步包含在對應於SEQ ID NO: 32之胺基酸136之位置處的絲胺酸，且與SEQ ID NO: 32之胺基酸序列至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致；與SEQ ID NO: 33之ApoE3(ch)之差異為1、至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9或至多10個胺基酸；或由SEQ ID NO: 32或33提供。在對應於SEQ ID NO: 32之胺基酸136之位置處的絲胺酸提供基督城取代。

基於不同ApoE域及不同ApoE序列之現有知識，可使用SEQ ID NO: 32及SEQ ID NO: 33之ApoE3序列作為起始構築體來獲得其他ApoE3相關蛋白。描述不同域及序列之參考文獻之實例包括Khalil等人, Atherosclerosis(2021) 328:11-22及Tudorache等人, (2017) Computational and Structural Biotechnology Journal15:359-365。

在某些實施例中，ApoE編碼序列包含與SEQ ID NO: 63-67中之任一者，及SEQ ID NO: 3-10、12-14、16-19、21-25、27-30及SEQ ID NO: 95-105或124-130中之任一者之核苷酸55至954具有至少85%之序列一致性的序列。在其他實施例中，所提供之序列一致性為與SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67中之任一者，SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67中之任一者之核苷酸1至951；或SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104及SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129及SEQ ID NO: 130中之任一者之核苷酸55至951或55至954至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致。

在某些實施例中，ApoE編碼序列係由一個、兩個或多於兩個終止密碼子封端。

提及本申請案中所提供之包括終止密碼子的序列，包括其中不存在終止密碼子、存在多個終止密碼子及存在不同終止密碼子之實施例。

成熟ApoE3相關蛋白可自進一步包含信號肽之成熟ApoE序列於胞內形成。信號肽為提供蛋白分泌之短N端胺基酸序列。信號肽引導蛋白質進入或穿過內質網分泌路徑且通常在分泌之前於內質網內裂解。因此，與缺乏信號肽之對應多肽之分泌量相比，信號肽促進多肽自細胞分泌。

在某些實施例中，ApoE3相關蛋白包含信號肽。信號肽可完全或部分衍生自經分泌之多肽的分泌信號及/或可完全或部分合成。通常，已知信號肽之長度為約10-15至50-60個胺基酸。此外，可改變或修飾來自經分泌之多肽的已知分泌信號(例如藉由胺基酸之取代、缺失、截短或插入)，只要所得分泌信號序列用以增強多肽分泌。

在某些實施例中，信號肽包含天然存在之分泌信號序列或其修飾、基本上由天然存在之分泌信號序列或其修飾組成或由天然存在之分泌信號序列或其修飾組成。合成或人工分泌信號肽之實例提供於例如Barash等人, Biochem. Biophys. Res. Comm.(2002)中。

在某些實施例中，信號肽係選自ApoE3信號肽、人類胰凝乳蛋白酶原B2信號肽(「sp7」；NCBI參考序列NP_001020371之18胺基酸信號肽)、α 2-HS-醣蛋白(AHSG)信號肽、CD300信號肽、溶酶體相關膜醣蛋白1 (LAMP1)信號肽、Notch 2信號肽、血清類黏蛋白1 (ORM1)信號肽、運鐵蛋白(TF)信號肽、secrecon (描述於Barash等人, Biochem Biophys Res Commun.2002;294: 835-842中之人工信號序列)、小鼠IgKVIII、人類IgKVIII、CD33、tPA、a-1抗胰蛋白酶信號肽及天然分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)。

在某些實施例中，信號肽與選自由SEQ ID NO: 36、42、44、46、48、50、52、54及56組成之群的胺基酸序列具有至少90%之一致性。在其他實施例中，信號肽與SEQ ID NO: 36、42、44、46、48、50、52、54、56及68-71中之任一者具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之一致性；或與SEQ ID NO: 36、42、44、46、48、50、52、54、56及68-71中之任一者之差異為1、2或3個胺基酸中之任一者。

在不同實施例中，ApoE3相關蛋白包含信號肽且與SEQ ID NO: 34或35之胺基酸序列至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致；與SEQ ID NO: 34或35之差異為1、至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9或至多10個胺基酸；由SEQ ID NO: 34提供；或由SEQ ID NO: 35提供。SEQ ID NO: 34提供包含ApoE3信號肽之天然ApoE3序列，而SEQ ID NO: 35提供包含ApoE3信號肽之ApoE3(ch)。

在某些實施例中，ApoE編碼核苷酸序列包含一或多個內含子。內含子係藉由提供內含子邊界以及分支點處之腺苷的5'及3'剪接共通序列表徵。腺苷參與斷裂在上游外顯子-內含子邊界處之磷酸二酯鍵。在某些實施例中，5'及3'剪接共通序列包含5' GU……AG 3'。在某些實施例中，5'及3'剪接共通序列包含5' AU……AC 3'。共通剪接位點描述於例如Jurica及Roybal, RNA Splicing, Lennarz及Lane編, Encyclopedia of Biological Chemistry ( 第二版 ), Academic Press,2013,第185至190頁；及Qu等人, Front Genet.2017年4月11日;8:38中；其各者特此以全文引用之方式併入本文中。

分支點通常亦位於3'受體位點上游約18至40個核苷酸之共通序列(例如七聚體序列)中且聚嘧啶通道(polypyrimidine tract)通常將分支點與3'剪接位點分離。在某些實施例中，包含腺苷之分支點在3'受體位點上游為約18至40個核苷酸，且存在主要包含C及U殘基之聚嘧啶通道。RNA剪接描述於例如Jurica及Roybal, RNA Splicing, Lennarz及Lane編, Encyclopedia of Biological Chemistry ( 第二版 ), Academic Press, 2013,第185至190頁；及Berger等人, Wiley Interdiscip Rev RNA.2016年7月;7(4):487-98中；其各者特此以全文引用之方式併入本文中。

在其他實施例中，ApoE編碼核苷酸序列具有1或2個內含子及/或內含子位於天然存在之位置中。編碼序列中之天然內含子剪接位點位於SEQ ID NO: 1之核苷酸43與44之間的密碼子15處(分裂Gly G/GC)；SEQ ID NO: 1之核苷酸236與237之間的密碼子79處(分裂Arg AG/G)。

在某些實施例中，ApoE編碼核苷酸序列(ApoE轉殖基因)依5'至3'，包含： (a) 對應於SEQ ID NO: 1之核苷酸1至43的第一外顯子，其中第一外顯子與SEQ ID NO: 3-31、95-105或124-130中之任一者之核苷酸1至43具有至少85%之序列一致性，其限制條件為第一外顯子之末端3'核苷酸為G，在關於第一外顯子之其他實施例中，第一外顯子與SEQ ID NO: 3-31、95-105及124-130中之任一者之核苷酸1至43具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性； (b) 在對應於SEQ ID NO: 1之核苷酸43與44之間的位置處之第一內含子； (c) 對應於SEQ ID NO: 1之核苷酸44至236的第二外顯子；其中第二外顯子與SEQ ID NO: 3-31、95-105或124-130中之任一者之核苷酸44至236具有至少85%之序列一致性，其限制條件為第二外顯子之末端5'核苷酸為G且第二外顯子之末端3'核苷酸為AG，在關於第二外顯子之其他實施例中，第二外顯子與SEQ ID NO: 3-31、95-105或124-130中之任一者之核苷酸44至236具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性； (d) 在對應於SEQ ID NO: 1之核苷酸236與237之間的位置處之第二內含子， (e) 對應於SEQ ID NO: 1之核苷酸237至951的第三外顯子，其中第三外顯子與SEQ ID NO: 3-31、95-105或124-130中之任一者之核苷酸237至951具有至少85%之序列一致性，其限制條件為第三外顯子之末端5'核苷酸為G，在關於第三外顯子之其他實施例中，第三外顯子與SEQ ID NO: 3-31、95-105或124-130中之任一者之核苷酸237至951具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性；其中第一、第二及第三外顯子一起編碼包含與SEQ ID NO: 35至少95%一致之胺基酸序列的ApoE3相關蛋白，在其他實施例中，ApoE相關蛋白包含與SEQ ID NO: 35具有至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之一致性的胺基酸序列，與SEQ ID NO: 35之差異為1、2、3、4或5個胺基酸，或包含SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。

對於所提供之各序列及序列一致性，(a)、(b)、(c)、(d)及(e)內之各可能性可獨立地組合。舉例而言，(1)第一外顯子可獨立於第二及第三外顯子而與SEQ ID NO: 3-31、95-105、124-130中之任一者之核苷酸1至43具有至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性；(2)第二外顯子可獨立於第一及第三外顯子而與SEQ ID NO: 3-31、95-105或124-130中之任一者之核苷酸44至236具有至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性；及(3)第三外顯子可獨立於第一及第二外顯子而與SEQ ID NO: 3-31、95-105或124-130中之任一者之核苷酸44至236具有至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性。

提及參考序列(例如，SEQ ID NO:1)之「對應」核苷酸或核苷酸區域，指示對應核苷酸位置或核苷酸區域(例如外顯子或內含子)為當發生最大比對時與參考序列之指示位置或區域匹配的位置或區域。最大比對考慮任何添加、缺失及/或取代。較佳地，僅存在取代。

在某些實施例中，第一內含子包含與SEQ ID NO: 119-122中之任一者具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性的序列，且第二內含子獨立地包含與SEQ ID NO: 119-122中之任一者具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之序列一致性的序列。

在某些實施例中，第一內含子由SEQ ID NO: 119-121中之任一者之序列或與SEQ ID NO: 119-121中之任一者之差異為1至10個核苷酸之序列組成，且第二內含子獨立地由SEQ ID NO: 119-121中之任一者之序列或與SEQ ID NO: 119-121中之任一者之差異為1至10個核苷酸之序列組成。

在某些實施例中，第一外顯子與SEQ ID NO: 11、15、20、26、31或95-105中之任一者之核苷酸1至43具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性；第二外顯子與SEQ ID NO: 11、15、20、26、31或95-105中之任一者之核苷酸44至236具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性；及第三外顯子與SEQ ID NO: 11、15、20、26、31或95-105中之任一者之核苷酸237至951具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性，其中ApoE相關蛋白包含與SEQ ID NO: 35具有至少98%或至少99%之一致性的胺基酸序列，與SEQ ID NO: 35之差異為1、2、3、4或5個胺基酸，或包含SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。

在某些實施例中，ApoE編碼核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 106-115中之任一者具有至少85%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性之序列一致性的序列。

在某些實施例中，一或多個內含子係選自具有剪接供體/剪接受體之兔β-血球蛋白內含子、具有剪接供體/剪接受體之SV40內含子、人類β-血球蛋白內含子、人類血紅蛋白β基因之內含子2、人類凝血因子IX基因之內含子1 (intron 1 of the human coagulation factor IX gene；hFIX int1)、CBA-rHHB (來源於雞β肌動蛋白基因之內含子1與兔血紅蛋白β之內含子2之融合物的合成內含子)、CBA (雞β肌動蛋白基因之內含子1)、hGH (人類生長激素基因之內含子1)、hFIX synth (來源於人類凝血因子IX基因之不同部分且存在於pLIVE載體(Mirus Bio, Madison, WI)中之合成內含子)；人類血紅蛋白次單元β (HBB2)合成內含子及最佳化HBB2；及嵌合內含子，諸如由第一人類β-血球蛋白內含子之5'剪接供體及來自免疫球蛋白基因重鏈可變區之前導子及主體之間的內含子之分支及3'受體位點構成的內含子。(Buck等人, Int. J. Mol. Sci. (2020), 21, 4197；Ronzitti等人Mol. Ther. Methods Clin Dev. (2016) 7月20日;3:16049；及由pCMVNT™載體提供之HBB-IGG內含子)。

在某些實施例中，內含子為50個鹼基至1,500個鹼基。

在某些實施例中，本文中所提供之ApoE編碼核苷酸序列及內含子中之任一者含有0至5、0至10或0至15個CpG；0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81及82個CpG；0%、約0.5%、約1.0%、約2.0%、約3.0%、約4.0%或約5.0%之CpG；及/或至多約0.5%、至多約1.0%、至多約2.0%、至多約3.0%、至多約4.0%或至多約5.0%之CpG；較佳為0個CpG。

II. 表現卡匣

聚核苷酸表現卡匣含有可操作地連接至一或多個表現控制元件之ApoE編碼核酸。「表現控制元件」為影響編碼ApoE之核酸之表現的核酸序列。表現控制可能例如在轉錄、轉譯、剪接及訊息穩定性層面上受到影響。表現控制元件通常位於經轉錄之核酸之5' (「上游」)或3' (「下游」)。表現控制元件亦可位於轉錄本內(例如內含子中)。表現控制元件可位於鄰近經轉錄之序列或與經轉錄之序列相距一定距離的位置。可存在一或多個表現控制元件。表現控制元件之實例包括啟動子、強化子、內含子、聚腺苷酸化信號、Kozak序列、轉錄後調節元件及終止序列。

啟動子為轉錄起始之DNA區。一般而言，經轉錄之核酸位於啟動子序列之3'。在某些實施例中，啟動子序列與強化子偶合。強化子為增加啟動子轉錄之DNA區。強化子可與啟動子相鄰或可位於遠端。通常，強化子位於啟動子上游，但亦可位於啟動子序列下游或其內。

諸如啟動子及強化子之表現控制元件可經選擇以優先驅動特定細胞或組織類型中之表現。表現控制元件通常在特定細胞、組織或器官中具有活性，因為其係由特定細胞、組織或器官類型所特有之轉錄活化因子蛋白或轉錄之其他調節因子識別。(參見例如，Green, M.及Sambrook, J. (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第 4 版 , 第 II 卷 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York；及Ausubel等人, (2010) Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons, New York)。

表現構築體中之組織特異性調節元件之併入為ApoE3相關蛋白之表現提供至少部分組織向性。提及對特定細胞類型之組織具有特異性之啟動子或強化子，指示啟動子或強化子在指定細胞或組織類型中提供較高水平之表現及/或分泌。對肝臟具有特異性之啟動子之實例為甲狀腺素運載蛋白(TTR)基因啟動子；人類α 1-抗胰蛋白酶(hAAT)啟動子；脂蛋白A-I啟動子；白蛋白，Miyatake等人, J. Virol., 71:5124-32 (1997)；B型肝炎病毒核心啟動子，Sandig等人, Gene Ther.3:1002-9 (1996)；α-胎兒蛋白(AFP)，Arbuthnot等人, Hum. Gene. Ther., 7:1503-14 (1996)；人類因子IX啟動子；甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子；TTR極小強化子/啟動子；α-抗胰蛋白酶啟動子；LSP (845 nt) (需要無內含子之scAAV)；及LSP1啟動子。在肝臟中具有活性之強化子之實例為脂蛋白E (ApoE) HCR-1及HCR-2 (Allan等人, J. Biol. Chem., 272:29113-19 (1997))。

表現控制元件亦包括普遍存在或混雜之啟動子及能夠驅動許多不同細胞類型中之聚核苷酸表現的啟動子/強化子。此類元件包括巨細胞病毒(CMV)即刻早期啟動子/強化子序列、勞斯氏肉瘤病毒(RSV)啟動子/強化子序列、磷酸甘油酸激酶(PKG)啟動子、CAG (CMV強化子、雞β肌動蛋白啟動子(CBA)及兔β血球蛋白內含子之複合物) (參見例如，Boshart等人, (1985) Cell, 41:521-530)、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子及細胞質b-肌動蛋白啟動子。

CNS特異性啟動子之實例包括：神經元特異性啟動子，諸如神經元特異性烯醇酶(neuronal specific enolase；NSE)、突觸蛋白或NeuN、血小板衍生生長因子(PDGF)、血小板衍生生長因子B鏈(PDGF-β)、甲基-CpG結合蛋白2 (MeCP2)、Ca ²/攜鈣蛋白依賴性蛋白激酶II (CaMKII)、代謝型麩胺酸受體2(mGluR2)、神經絲輕鏈(NFL)或神經絲重鏈(NFH)、β-血球蛋白小型基因nβ2、前腦啡肽原(PPE)、腦啡肽(Enk)及興奮性胺基酸轉運蛋白2 (EAAT2)啟動子；星形膠質細胞特異性啟動子，諸如膠質纖維酸性蛋白(GFAP)及EAAT2啟動子；寡樹突膠細胞特異性啟動子，諸如髓磷脂鹼性蛋白(MBP)/髓磷脂相關醣蛋白及寡樹突膠細胞轉錄因子2啟動子；神經元/下丘腦特異性啟動子，諸如前腦啡-促黑細胞素-促皮質素(proopiomelanocortin；POMC)啟動子；及神經元/脊髓特異性啟動子。(參見例如，美國專利公開案第2021/214749號及Adeno-Associated Virus Vectors (2019), Castle.編,第1版, Springer New York, New York, NY.；兩者均特此以全文引用之方式併入本文中)。

其他啟動子包括SV40早期啟動子、超氧歧化酶1 (SOD1)啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒LTR啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)、單純疱疹病毒(HSV)啟動子、SFFV啟動子、大鼠胰島素啟動子、TBG啟動子、肌間線蛋白啟動子及類似肌肉特異性啟動子、EF1-α啟動子、合成啟動子、雜合啟動子及具有多組織特異性之啟動子。

表現控制元件亦可能以可由信號或刺激調節之方式影響表現，增加或減少表現。回應於信號或刺激而增加經轉錄之核酸之表現的可調節元件亦稱為「誘導元件」(亦即，由信號誘導)。通常，由此類元件賦予之增加或減少之量與存在之信號或刺激之量成比例。特定實例包括鋅誘導型綿羊金屬硫蛋白(MT)啟動子；類固醇激素誘導型小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子；T7聚合酶啟動子系統(國際專利公開案第WO1998/10088號)；四環素可抑制系統(Gossen等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992))；四環素誘導型系統(Gossen等人, Science. 268:1766-1769 (1995)；亦參見Harvey等人, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:512-518 (1998))；RU486誘導型系統(Wang等人, Nat. Biotech. 15:239-243 (1997)及Wang等人, Gene Ther. 4:432-441 (1997)；及雷帕黴素(雷帕黴素)誘導型系統(Magari等人, J. Clin. Invest. 100:2865-2872 (1997)；及Rivera等人, Nat. Medicine. 2:1028-1032 (1996))。可調節控制元件之其他實例包括藉由特定生理狀態(諸如溫度、急性期或發育)調節之控制元件。

在某些實施例中，表現卡匣進一步包含獨立於編碼核苷酸之ApoE的一或多個內含子。各種不同內含子可用於增強基因表現。可使用之內含子之實例包括具有剪接供體/剪接受體之兔β-血球蛋白內含子、具有剪接供體/剪接受體之SV40內含子、人類β-血球蛋白內含子、人類血紅蛋白β基因之內含子2、人類凝血因子IX基因之內含子1 (intron 1 of the human coagulation factor IX gene；hFIX int1)、CBA-rHHB (自雞β肌動蛋白基因之內含子1與兔血紅蛋白β之內含子2之融合物衍生的合成內含子)、CBA (雞β肌動蛋白基因之內含子1)、hGH (人類生長激素基因之內含子1)、hFIX synth (自人類凝血因子IX基因之不同部分衍生且存在於pLIVE載體(Mirus Bio, Madison, WI)中之合成內含子)；人類血紅蛋白次單元β (HBB2)合成內含子及最佳化HBB2；及嵌合內含子，諸如由第一人類β-血球蛋白內含子之5'剪接供體及來自免疫球蛋白基因重鏈可變區之前導子及主體之間的內含子之分支及3'受體位點構成的內含子。(Buck等人, Int. J. Mol. Sci. (2020), 21, 4197；Ronzitti等人Mol. Ther. Methods Clin Dev. (2016) 7月20日;3:16049；及由pCMVNT™載體提供之HBB-IGG內含子)。

在某些實施例中，表現卡匣包含轉錄後調節元件。轉譯後調節元件，諸如土拔鼠(Woodchuck)轉錄後調節元件(WPRE)及B型肝炎調節元件可增加基因表現。(Buck等人 ,Int. J. Mol. Sci. (2020), 21, 4197)。

聚腺苷酸化信號序列提供聚腺苷酸尾之形成，其有助於核輸出、轉譯及/或mRNA穩定性，且亦可參與轉錄終止。聚腺苷酸化信號序列之實例包括SV40晚期聚腺苷酸化信號、牛生長激素聚腺苷酸(bGHpA)信號序列、合成聚腺苷酸、小鼠β-血球蛋白pA、兔β-血球蛋白pA及基於H4之pA (Buck等人, Int. J. Mol. Sci. (2020), 21, 4197)。

在某些實施例中，表現卡匣包含Kozak共通序列或其變化形式。Kozak共通序列在轉譯起始中發揮作用。Kozak共通序列及變化形式提供於例如McClements等人, (2021) Molecular vision, 27, 233-242中。

在某些實施例中，表現卡匣依5'至3'，包含可操作地偶合至ApoE編碼序列之：啟動子或啟動子/強化子、內含子、Kozak序列、ApoE編碼序列及聚腺苷酸化信號。

在某些實施例中，表現卡匣進一步包含miRNA標靶序列，其在其他實施例中併入表現卡匣之3' UTR中。miRNA靶序列係由特定細胞或組織中存在之miRNA識別，從而引起mRNA轉錄本之降解。基於特定細胞中某些miRNA之存在，併入miRNA標靶序列可用於減少某些細胞或組織類型中之表現。miRNA標靶序列之多個縱排重複序列可用於增加降解。(Geisle等人, (2016) World Journal of Experimental Medicine6(2): 37-54)。

在某些實施例中，表現卡匣包含背根節、肝臟或免疫細胞之miRNA標靶序列。

在某些實施例中，編碼核苷酸序列之表現卡匣含有0至5、0至10、0至15、0至50或0至100個CpG中之任一者；0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81及82個CpG；0%、約0.5%、約1.0%、約2.0%、約3.0%、約4.0%、約5.0%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%或約15%之CpG；及/或至多約0.5%、至多約1.0%、至多約2.0%、至多約3.0%、至多約4.0%、至多約5.0%、至多約6%、至多約7%、至多約8%、至多約9%、至多約10%、至多約11%、至多約12%、至多約13%、至多約14%或至多約15%之CpG。

III. 重組病毒載體核酸

聚核苷酸重組病毒核酸含有提供病毒封裝之5'及/或3'病毒元件且可提供額外活性，諸如自我引發、DNA複製、啟動子活性、基因體整合或游離型串聯體化(concatermerization)。5'及3'元件通常位於或接近重組病毒核酸之5'及3'末端且可為天然存在之序列的天然存在或經修飾之型式。5'及3'元件之實例包括腺病毒ITR、腺相關病毒ITR及封裝序列；及逆轉錄病毒5'及3'長末端重複序列(LTR)及封裝序列。(Naso等人, (2017) BioDrugs, 31(4), 317-334；Bulcha等人, (2021) Sig. Transduct. Target Ther. 6:53 (2021)；以及Liu及Seol (2020) BMB Reports; 53(11):565-575)。

作為核酸或載體之修飾語的術語「重組」指示自然界中不存在之要素之組合。舉例而言，重組病毒載體核酸提供5'及/或3'病毒元件以及含有一或多個並非天然與5'及/或3'元件相關之元件的表現卡匣。類似地，病毒載體，諸如rAAV載體，可含有使重組病毒載體核酸殼體化之天然存在或經修飾之殼體。

聚核苷酸、表現卡匣及病毒載體核酸與特定病毒載體相容。舉例而言，rAAV包含ssDNA、包含dsDNA之腺病毒載體及包含ssRNA之逆轉錄病毒載體。

在某些實施例中，病毒載體核酸含有0至5、0至10、0至15、0至50、0至100或0至150個CpG中之任一者；0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81及82個CpG；0%、約0.5%、約1.0%、約2.0%、約3.0%、約4.0%、約5.0%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%或約15%之CpG；及/或至多約0.5%、至多約1.0%、至多約2.0%、至多約3.0%、至多約4.0%、至多約5.0%、至多約6%、至多約7%、至多約8%、至多約9%、至多約10%、至多約11%、至多約12%、至多約13%、至多約14%或至多約15%之CpG。

IV. 病毒載體

在某些實施例中，基因遞送載具(gene delivery vehicle)為病毒載體。病毒載體包含使重組病毒核酸殼體化之蛋白殼體且可將核酸遞送至細胞或組織。視特定載體而定，病毒載體可進一步包含病毒套膜。可用於基因療法之病毒載體之實例包括腺病毒載體、rAAV、逆轉錄病毒載體及單純疱疹病毒載體。

不同類型之病毒內存在不同血清型。不同血清型可提供不同活性，諸如細胞或組織向性及產生宿主免疫反應之可能性。術語「血清型」大體上係指血清學上獨特之病毒以及可能屬於給定血清型之亞群或變異體的血清學上並不獨特之病毒兩者。血清學獨特性可基於與一種殼體相比，抗體與另一殼體之間缺乏交叉反應性而判定。此類交叉反應性差異通常歸因於殼體蛋白序列/抗原決定子之差異(例如歸因於AAV血清型之VP1、VP2及/或VP3序列差異)。

隨著更多天然存在之病毒分離株之發現及/或殼體突變體之產生，與目前現有血清型中之任一者可能存在或可能不存在血清學差異。因此，在新病毒無血清學差異之情況下，此新病毒將為對應血清型之亞群或變異體。

IV.A. 腺病毒載體

腺病毒為無包膜之雙股DNA病毒。重組腺病毒載體包含缺乏參與病毒複製之一或多種蛋白質的重組腺病毒核酸，且進一步包含腺病毒殼體。可產生含有不同量之腺病毒DNA的重組腺病毒載體。Ad基因體係由其末端長度自30至371 bp變化之髮夾樣反向末端重複序列(ITR)側接。ITR充當促進引子酶非依賴性DNA複製之自我引發結構。病毒基因體封裝需要位於基因體之左臂的封裝信號。(Liu及Seol (2020) BMB Reports; 53(11):565-575；及Bulcha等人, (2021) Sig. Transduct. Target Ther. 6:53)。

在某些實施例中，重組腺病毒載體為第三代載體，其亦稱為「無腸(gutless)」或「輔助依賴型(helper-dependent)」。無腸載體可由重組腺病毒核酸產生，其中除ITR及封裝信號以外，所有或實質上所有之病毒序列不存在。無腸腺病毒載體為能夠容納至多約36 kb之DNA插入序列之高容量載體。較佳之重組腺病毒核酸為約27 kb至約37 kb。填充序列可添加至重組腺病毒核酸以增加核酸尺寸及殼體併入。較佳之填充序列避免編碼序列、重複序列、重組序列及免疫原性序列。(Liu及Seol (2020) BMB Reports; 53(11):565-575；Bulcha等人, (2021) Sig. Transduct. Target Ther. 6:53；及Sandig等人, PNAS(2000) 97(3):1002-1007，其各者特此以全文引用之方式併入本文中)。

在某些實施例中，可基於稀有人類血清型或黑猩猩血清型產生重組腺病毒載體。由於預先存在之免疫性，使用黑猩猩及稀有人類血清型可有助於減少針對重組腺病毒載體之宿主免疫反應。(Guo等人, (2018) Human vaccines & immunotherapeutics, 14(7):1679-1685及Bulcha等人, (2021) Sig. Transduct. Target Ther. 6:53)。

可藉由使用例如適當輔助病毒或質體及細胞株提供反式產生載體所需之病毒蛋白來產生腺病毒載體。(Liu及Seol (2020) BMB Reports; 53(11):565-575；及Bulcha等人, (2021) Sig. Transduct. Target Ther. 6:53)。

IV.B. AAV 載體

重組腺相關病毒載體(在本文中亦稱為「rAAV」)係基於腺相關病毒。腺相關病毒為含有4.7-kb基因體之單股DNA病毒，其在基因體之兩端上側接有145-nt ITR。ITR活性對自我引發及封裝至關重要，且亦可提供諸如啟動子活性之額外活性。

rAAV含有AAV重組核酸及病毒殼體。rAAV重組核酸缺乏參與病毒複製之一或多種AAV蛋白。在某些實施例中，rAAV核酸為至少約2.5 kb。在某些實施例中，rAVV核酸之尺寸範圍為約4 kb至約5.2 kb。若需要，亦可使用填充序列來增加rAAV核酸尺寸及封裝效率。在不同實施例中，包括填充序列之rAAV核酸為4至5.2 kb、3.0至5.5 kb、4.0至5.0 kb、4.3至4.8 kb、約4.2 kb、約4.3 kb、約4.4 kb、約4.5 kb、約4.6 kb或約4.7 kb。較佳之填充序列避免編碼序列、重複序列、重組序列及免疫原性序列。

在某些實施例中，rAAV核酸包含5' ITR及/或3' ITR，其獨立地選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.10、AAVrh.74及AAV3B ITR中所提供之5'及3' ITR。在其他實施例中，存在5'及3' ITR，且兩種ITR均來自相同血清型基因體。

在其他實施例中，5' ITR包含與SEQ ID NO: 81、88、90、92及94中之任一者具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性的序列，且3' ITR獨立地包含與SEQ ID NO: 82、89、91及93中之任一者具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性的序列。

在某些實施例中，rAAV為自我互補之腺相關病毒載體(scAAV)或短髮夾腺相關病毒載體(shAAV)。scAAV及shAAV提供可併入AAV殼體中之雙股rAAV核酸。scAAV及shAAV包含提供分子內雙股DNA之反向二聚重複序列。scAAV可藉由突變ITR末端解鏈位點來產生，從而使得rep無法鏈裂末端解鏈位點。shAAV可利用短髮夾以產生雙股AAV核酸。scAAV及shAAV作為雙股DNA提供避開單股rAAV核酸進入細胞後所需之DNA合成步驟的優勢。scAAV及shAAV之潛在缺點為，與單股rAAV核酸相比，可併入之DNA插入序列之尺寸減小約一半。(美國專利第10,457,940號；Xie等人, Mol Ther.(2017) 25(6):1363-1374；及McCarty Mol. Ther.(2008) 16(10):1648-1656；其各者特此以全文引用之方式併入本文中)。

天然存在之AAV殼體含有病毒蛋白VP1、VP2及VP3，比率為約1:1:10。可產生AAV載體，其中全部三種病毒蛋白係基於特定血清型或其中一種、兩種或全部三種病毒蛋白係基於不同血清型或其變異體。

在某些實施例中，AAV殼體係基於VP1、VP2或VP3，其與AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.74、AAV3B、AAV-2i8、AAVrh.10、AAVrh.8、AAVHSC、AAV-B1、AAV-AS、AAV1/rh.10、SEQ ID NO: 83及SEQ ID NO:84中之任一者之VP1、VP2或VP3具有至少80%之序列一致性；以及其變異體(例如殼體變異體，諸如胺基酸插入、添加、取代及缺失)。(參見例如，揭示RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4及RHM15-6之美國專利第9,909,142號及第9,840,719號；揭示LK01、LK02及LK03之美國專利公開案第2013/0059732號及美國專利第9,169,299號；及美國專利第11,110,153號；其揭示內容以全文引用之方式併入本文中)。

重組AAV殼體及核酸可以基於相同血清型(或亞群或變異體)，或彼此可不同。在某些實施例中，rAAV核酸與殼體化之殼體蛋白具有相同之血清型基因體(例如ITR)。

在不同實施例中，rAAV殼體包含蛋白質，該蛋白質具有與AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.74、AAV3B、AAV-2i8、AAVrh.10、AAVrh.8、AAVHSC、AAV-B1、AAV-AS、AAV1/rh.10中之任一者之VP1、VP2或VP3；及SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO:84之VP1 (LK03 VP1)至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.9%或100%一致之序列。

在某些實施例中，rAAV殼體包含：包含SEQ ID NO: 83之VP1；包含SEQ ID NO: 122之VP2；及包含SEQ ID NO: 123之VP3。

在涉及CNS疾病或病症之治療的某些實施例中，殼體提供CNS表現。此類rAAV殼體之實例及能夠提供CNS表現之rAAV殼體之設計提供於Chen等人, (2021) Journal of Controlled Release333, 129-138 (例如AAV9、AAVrh.10、AAVrh.8、AAVHSC、AAV-B1、AAV-AS及AAV1/rh.10)、美國專利第9,585,971號、Goertsen等人, Nat. Neurosci.25, 106-115 (2022)及Ittner等人, Br. J. Pharmacol. (2019) 176:3649-3655中，其各者以全文引用之方式併入本文中。

可藉由使用例如適當輔助病毒或質體及細胞株提供反式產生載體所需之病毒蛋白來產生重組AAV。在某些實施例中，使用rAAV載體基因體質體產生rAAV。質體包含最後封裝或殼體化以形成病毒(例如rAAV)粒子之rAAV核酸之部分。「質體主鏈」含有對於增殖及重組病毒產生至關重要之元件。除可能之3' ITR及/或5' ITR選殖殘餘物以外，質體主鏈自身未封裝或殼體化成病毒(例如AAV)粒子。

可由不同類型之細胞株產生重組AAV。在某些實施例中，使用人類HEK293細胞(美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)寄存編號ATCC CRL1573)。適合於rAAV產生之其他宿主細胞株描述於例如Robert等人, (2017) Biotechnol. J., 12: 1600193；及國際申請案PCT/US2017/024951中，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。

AAV基因體含有兩種主要基因： rep及 cap。 rep基因之轉錄係由兩個不同啟動子起始，從而產生命名為Rep78、Rep68、Rep52及Rep40之非結構蛋白。rep蛋白在基因體複製及/或殼體化中發揮作用。 cap基因編碼構成殼體之結構蛋白(VP1、VP2及Vp3)；執行與殼體組裝相關之功能的非結構組裝-活化蛋白(APP)；及可能與複製週期之產生階段相關的膜相關輔助蛋白。(Maurer及Weitzman (2020) Hum. Gene Ther.31(9-10):499-511，其特此以全文引用之方式併入本文中)。

AAV需要輔助病毒功能以完成其複製週期。輔助病毒功能可由容許細胞株中之不同病毒提供。容許細胞株為能夠支持病毒複製之細胞株。AAV之輔助病毒之實例包括可與例如容許之靈長類細胞結合使用之腺病毒、HSV-1、HPV-16及HBoV1；及可與例如容許之昆蟲細胞(諸如sf9)結合使用之桿狀病毒。(Maurer及Weitzman (2020) Hum. Gene Ther.(2020) 31(9-10):499-511及Meier等人, (2020) Viruses19;12(6):662，其兩者均以全文引用之方式併入本文中)。

可藉由使用例如適當輔助病毒或質體及細胞株提供反式產生載體所需之病毒蛋白來產生重組AAV。在某些實施例中，使用rAAV載體基因體質體產生rAAV。質體包含最後封裝或殼體化以形成病毒(例如rAAV)載體之rAAV核酸之部分。「質體主鏈」含有對於增殖及重組病毒產生至關重要之元件。除可能之3' ITR及/或5' ITR選殖殘餘物以外，質體主鏈自身未封裝或殼體化成病毒粒子。

載體基因體質體可含有諸如複製起點及可選標記物之區域。可能存在之額外位點包括選殖位點。

重組AAV可由不同類型之細胞株產生，包括希拉(HeLa)、A549、BHK、Vero及HEK293或其衍生物。適合於rAAV載體產生之其他宿主細胞株描述於例如Robert等人, (2017) Biotechnol. J.(2017) 12(3), 1600193；及國際申請案PCT/US2017/024951中；其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。

重組AAV可在適用於提供細胞生長及基因表現之各種不同條件下培養。描述rAAV產生之參考文獻包括Clément及Grieger (2016) Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 16;3:16002；Robert等人, (2017) Biotechnol. J.12(3), 1600193；及Adeno-Associated Virus Vectors (2019), Castle.編,第1版, Springer New York, New York, NY.；其各者特此以本文中引用之方式併入本文中。

在某些實施例中，rAAV載體係由包含rAAV輔助病毒活性之rAAV生產細胞產生。rAAV生產細胞之基因體包含rAAV核酸、 rep基因及 cap基因。

在某些實施例中，rAAV載體係藉由培養包括AAV基因體質體之rAAV容許細胞而產生，其中rAAV容許細胞進一步包含作為細胞基因體之一部分及/或由一或多個獨立質體提供之 rep及 cap基因；及作為細胞基因體之一部分及/或由一或多個獨立質體提供之輔助病毒活性。在其他實施例中，(a) rAAV容許細胞株為封裝細胞，其中封裝細胞之基因體包含 cap基因及 rep基因；(b) rep基因、 cap基因及輔助活性係由相同質體提供；或(c) rep基因及 cap基因係由 rep/ cap質體提供且輔助活性係由輔助質體提供。

在涉及使用HSV輔助功能之某些實施例中，輔助功能係由編碼至少UL5、UL8、UL52及ICP8之基因提供。

在涉及使用腺病毒輔助功能之某些實施例中，輔助功能係由編碼至少E1A、E1B19K、E1B55K、E2A、E4orf6及VA RNA之基因提供。在某些實施例中，E1、E2A及VR RNA功能係由輔助質體提供，其中額外輔助功能係由宿主菌株提供。

在某些實施例中，rAAV載體係藉由使用本文中所描述之方法產生rAAV且純化rAAV而獲得。可使用技術(諸如基於梯度之純化、基於管柱之純化及組合方法)進行rAAV之純化。(參見例如，Ayuso等人, (2010), Curr Gene Ther.(2010) 10(6):423-36，其特此以全文引用之方式併入本文中)。

在某些實施例中，藉由在AAV表現載體轉染之前或與AAV表現載體同時用AAV輔助構築體轉染宿主細胞，將AAV輔助功能引入宿主細胞中。具有AAV輔助功能之宿主細胞可稱為「輔助細胞」或「封裝輔助細胞」。因此，AAV輔助構築體有時用於提供AAV rep及/或cap基因之至少短暫表現，以補充產生性AAV轉導必需之缺失AAV功能。AAV輔助構築體通常缺乏AAV ITR且既不可複製亦不可封裝自身。舉例而言，此等構築體可呈質體、噬菌體、轉位子、黏質體、病毒或病毒粒子之形式。已描述多種AAV輔助構築體，諸如編碼Rep及Cap表現產物兩者之質體pAAV/Ad及pIM29+45。已知多種編碼Rep及/或Cap表現產物之其他載體。重組AAV可例如以美國專利9,408,904；及國際申請案PCT/US2017/025396及PCT/US2016/064414中所描述而產生，該等案之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。

IV.C. 逆轉錄病毒載體

逆轉錄病毒為經包膜之單股RNA病毒，其包含5'及3' LTR及恰好位於LTR外部之信號封裝序列。不同類型之逆轉錄病毒載體可含有不同量之病毒基因體。在某些實施例中，逆轉錄病毒載體為基於HIV之慢病毒載體，其保留病毒RNA封裝、逆轉錄及前病毒DNA整合所需之所有順式作用序列，同時移除所有HIV蛋白編碼之基因。慢病毒載體具有至多約9 kb之封裝容量。若需要，亦可使用填充序列來增加rAAV核酸尺寸及封裝效率。可藉由使用適當質體及細胞株提供反式產生載體所需之病毒蛋白來產生慢病毒載體。(Bulcha等人, (2021) Sig. Transduct. Target Ther.6:53)。 V. 非病毒載體

在某些實施例中，基因遞送載具為非病毒載體。非病毒載體包括奈米粒子及裸核酸。較佳之非病毒載體為奈米粒子。可使用各種不同奈米粒子，包括脂質奈米粒子(LNP)、聚合物奈米粒子、脂質聚合物奈米粒子(LPNP)、基於蛋白質及肽之奈米粒子、基於DNA樹枝狀聚合物及DNA之奈米載體、碳奈米管、微粒、微膠囊、無機奈米粒子、肽籠奈米粒子及外泌體。(參見例如，Riley及Vermerris Nanomaterials(2017) 201, 7, 94；Thomas等人, Molecules(2019), 24, 3744；Bochicchio等人, (2021), 13, 198；Munagala等人, Cancer Letters(2021), 505, 58；Fu等人, (2020) NanoImpact20, 100261；Neshat等人(2020) Current Opin. Biotechnol.66:1-10；Ouranidis等人, (2022) Biomedicines, 10, 50；及Qin等人, Signal Transduct Target Ther. (2022) 5月21日;7(1):166，其各者特此以全文引用之方式併入本文中)。

視需要，奈米粒子可使用例如識別靶細胞受體之靶向配位體來靶向細胞類型。靶向配位體之實例包括碳水化合物(例如，半乳糖、甘露糖、葡萄糖及半乳甘露聚糖)、內源性配位體(例如，葉酸及運鐵蛋白)、抗體及蛋白質/肽(例如，RGD、表皮生長因子及低密度脂蛋白)及肽。(例如，Teo等人, Advanced Drug Delivery Reviews(2016), 98, 41)。

奈米粒子可用於將本文中所描述之編碼ApoE之聚核苷酸構築體遞送至細胞。在不同實施例中，奈米粒子可遞送額外治療化合物；且一或多種額外化合物提供於不同奈米粒子中。提及化合物包括小分子及大分子(例如治療蛋白及抗體)。

不同奈米粒子之產生以及核酸及其他化合物之併入為此項技術中所熟知。說明核酸併入諸如LPNP及LNP之特定奈米粒子中之公開案的實例包括Teo等人, Advanced Drug Delivery Reviews(2016) 98, 41；Bochicchio等人, Pharmaceutics(2021) 13, 198；Mahzabin及Das, IJPSR (2021) 12(1), 65；及Teixeira等人, (2017) Prog. Lipid Res.10月;68:1-11 (其各者特此以全文引用之方式併入本文中)。可影響小分子併入奈米粒子中之因素包括疏水性及可電離部分之存在。(參見例如，Nii及Ishii International Journal of Pharmaceutics(2005) 298, 198；及Chen等人, Journal of Controlled Release(2018) 286, 46)。 V.A. 基於脂質之遞送系統

基於脂質之遞送系統包括使用脂質作為組分。基於脂質之遞送系統之實例包括脂質體、LNP、微胞及胞外囊泡。

「脂質奈米粒子」或「LNP」係指適用於遞送核酸分子且具有奈米級尺寸的基於脂質之囊泡。在不同實施例中，奈米粒子為約10 nm至約1000 nm、約50 nm至約500 nm或約50 nm至約200 nm。

DNA帶負電。因此，對於LNP而言，包含諸如胺基脂質之陽離子型脂質係有利的。例示性胺基脂質描述於美國專利第9,352,042號、第9,220,683號、第9,186,325號、第9,139,554號、第9,126,966號、第9,018,187號、第8,999,351號、第8,722,082號、第8,642,076號、第8,569,256號、第8,466,122號及第7,745,651號以及美國專利公開案第2016/0213785號、第2016/0199485號、第2015/0265708號、第2014/0288146號、第2013/0123338號、第2013/0116307號、第2013/0064894號、第2012/0172411號及第2010/0117125號中，其均以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，LNP包含美國專利第9,512,073號中所描述之胺基脂質，該專利案已以全文引用之方式併入本文中。

術語「陽離子型脂質」及「胺基脂質」在本文中可互換地使用，以包括具有一個、二個、三個或更多個脂肪酸或脂肪烷基鏈及可滴定pH之胺基(例如，烷胺基或二烷胺基)之脂質及其鹽。陽離子型脂質通常在低於陽離子型脂質之pKa的pH下質子化(亦即帶正電)且在高於pKa的pH下實質上呈中性。陽離子型脂質亦可為可滴定陽離子型脂質。在某些實施例中，陽離子型脂質包含可質子化三級胺(例如，可滴定pH)基團；C18烷基鏈，其中各烷基鏈可獨立地具有一或多個雙鍵、一或多個參鍵；及頭基與烷基鏈之間的醚鍵、酯鍵或縮酮鍵。

陽離子型脂質包括1,2-二亞油氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亞麻氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-γ-亞麻氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(γ-DLenDMA)、2,2-二亞油基-4-(2-二甲胺基乙基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-C2-DMA，亦稱為DLin-C2K-DMA、XTC2及C2K)、2,2-二亞油基-4-二甲胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-DMA)、二亞油醯基甲基-3-二甲胺基丙酸酯(DLin-M-C2-DMA，亦稱為MC2)、4-(二甲胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31 Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-M-C3-DMA，亦稱為MC3)、其鹽及其混合物。其他陽離子型脂質亦包括1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DSDMA)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DODMA)、2,2-二亞油基-4-(3-二甲胺基丙基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-C3-DMA)、2,2-二亞油基-4-(3-二甲胺基丁基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-C4-DMA)、DLen-C2K-DMA、γ-DLen-C2K-DMA及(DLin-MP-DMA) (亦稱為1-B11)。

又其他陽離子型脂質包括2,2-二亞油基-5-二甲胺基甲基-[1,3]-二㗁烷(DLin-K6-DMA)、2,2-二亞油基-4-N-甲基哌𠯤并-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-MPZ)、1,2-二亞油基胺甲醯基氧基-3-二甲胺基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亞油氧基-3-(二甲胺基)乙醯氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亞油基氧基-3-𠰌啉基丙烷(DLin-MA)、1,2-二亞油醯基-3-二甲胺基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亞油基硫基-3-二甲胺基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亞油醯基-2-亞油氧基-3-二甲胺基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亞油氧基-3-三甲胺基丙烷氯鹽(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亞油醯基-3-三甲胺基丙烷氯鹽(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亞油氧基-3-(N-甲基哌𠯤基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二亞油基胺基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油烯基胺基)-1,2-丙烷二醇(DOAP)、1,2-二亞油基側氧基-3-(2-N,N-二甲胺基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、N,N-二油基-N,N-二甲基銨氯化物(DODAC)、N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲銨氯化物(DOTMA)、N,N-二硬脂醯基-N,N-二甲基銨溴化物(DDAB)、N-(1-(2,3-二油醯氧基)丙基)-N,N,N-三甲銨氯化物(DOTAP)、3-(N-(N',N'-二甲胺基乙烷)-胺甲醯基)膽固醇(DC-Chol)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基銨溴化物(DMRIE)、2,3-二油烯基氧基-N-[2(精胺-甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙銨三氟乙酸鹽(DOSPA)、二(十八烷基)醯胺基甘胺醯基精胺(DOGS)、3-二甲胺基-2-(膽甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(順,順-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5'-(膽甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧雜戊烯氧基)-3-二甲基-1-(順,順-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苯甲胺(DMOBA)、1,2-N,N'-二油烯基胺甲醯基-3-二甲胺基丙烷(DOcarbDAP)、1,2-N,N'-二亞油基胺甲醯基-3-二甲胺基丙烷(DLincarbDAP)、地塞米松-精胺(dexamethasone-sperimine；DS)及二取代精胺(D2S)或其混合物。

可使用多種市售陽離子型脂質製劑，諸如LIPOFECTIN® (包括DOTMA及DOPE，可購自GIBCO/BRL)及LIPOFECTAMINE® (包含DOSPA及DOPE，可購自GIBCO/BRL)。

可使用之額外可電離脂質包括C12-200、306Oi10、MC3、cKK-E12、bCKK-E12、脂質5、脂質9、ATX-002、ATX-003及Merck-32。美國專利申請公開案第2017/0367988號描述Merck-32。

在其他實施例中，陽離子型脂質可以約10莫耳%比率之LNP至約85莫耳%比率之LNP，或約50莫耳%比率之LNP至約75莫耳%比率之LNP的量存在。

LNP可包含中性脂質。中性脂質可包含在生理pH下以不帶電或中性兩性離子形式存在之脂質物種。此類脂質包括二醯基磷脂醯膽鹼、二醯基磷脂醯乙醇胺、腦醯胺、鞘磷脂、二氫鞘磷脂、腦磷脂及腦苷脂。通常藉由包括粒徑及穩定性之考量來引導中性脂質之選擇。在某些實施例中，中性脂質組分可為具有兩個醯基之脂質(例如，二醯基磷脂醯膽鹼及二醯基磷脂醯乙醇胺)。

具有不同鏈長及飽和度之各種醯基鏈基團的脂質為可用的或可經分離或合成。在某些實施例中，可使用含有飽和脂肪酸且碳鏈長度在C14至C22範圍內的脂質。在某些實施例中，使用具有單或二不飽和脂肪酸且碳鏈長度在C14至C22範圍內的脂質。另外，可使用具有飽和及不飽和脂肪酸鏈之混合物的脂質。例示性中性脂質包括1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷脂醯基-乙醇胺(DOPE)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1-軟脂醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)或磷脂醯膽鹼。中性脂質亦可包含鞘磷脂、二氫鞘磷脂或具有其他頭基之磷脂(諸如絲胺酸及肌醇)。

在提供中性脂質之其他實施例中，中性脂質可以約0.1重量%之LNP至約99重量%之LNP，或約5重量%之LNP至約15重量%之LNP，例如約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約99%之量存在。

LNP可含有諸如固醇及聚乙二醇之額外組分。固醇可賦予LNP流動性。如本文中所使用，「固醇」係指植物(植物固醇)或動物(動物固醇)來源之天然存在的固醇以及非天然存在之合成固醇，其均藉由類固醇A-環之3-位置處的羥基之存在表徵。適合之固醇包括習知用於脂質體、脂質囊泡或脂質粒子製劑之領域中的固醇，最常為膽固醇。植物固醇包括菜油固醇、植固醇及豆固醇。固醇亦包括經固醇修飾之脂質，諸如美國專利申請案公開案第2011/0177156號中所描述之脂質。在提供固醇之不同實施例中，固醇係以約1重量%之LNP至約80重量%之LNP或約10重量%之LNP至約25重量%之LNP的量存在。

聚乙二醇(PEG)為具有兩個末端羥基之乙烯PEG重複單元的線性水溶性聚合物。PEG係由其分子量分類；例如PEG 2000具有約2,000道爾頓(dalton)之平均分子量，且PEG 5000具有約5,000道爾頓之平均分子量。可商購自Sigma Chemical Co.及其他公司之PEG包括單甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、單甲氧基聚乙二醇-丁二酸酯(MePEG-S)、單甲氧基聚乙二醇-丁二酸丁二醯亞胺酯(MePEG-S-NHS)、單甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、單甲氧基聚乙二醇-三氟乙磺酸酯(MePEG-TRES)及單甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。

在關於PEG之某些實施例中，PEG具有約550至約10,000道爾頓之平均分子量且視情況經烷基、烷氧基、醯基或芳基取代。在其他實施例中，PEG在末端羥基位置處經甲基取代。在其他實施例中，PEG具有約750至約5,000道爾頓、或約1,000至約5,000道爾頓、或約1,500至約3,000道爾頓、或約2,000道爾頓或約750道爾頓之平均分子量。

經PEG修飾之脂質包括美國專利第8,936,942號及第7,803,397號中所描述之PEG-二烷氧基丙基結合物(PEG-DAA)。經PEG修飾之脂質(或脂質-聚氧化乙烯結合物)可具有各種「錨定」脂質部分以將PEG部分固定至脂質囊泡之表面。適合之經PEG修飾之脂質的實例包括經PEG修飾之磷脂醯乙醇胺及磷脂酸、美國專利第5,820,873號中所描述之PEG-腦醯胺結合物(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)、經PEG修飾之二烷基胺及經PEG修飾之1,2-二醯基氧基丙-3-胺。在某些實施例中，經PEG修飾之脂質可為經PEG修飾之二醯基甘油及二烷基甘油。在某些實施例中，PEG可呈約0.1重量%之LNP至約50重量%之LNP或約5重量%之LNP至約15重量%之LNP的量。

在有關LNP尺寸之其他實施例中，在囊封核酸之前，LNP具有在約10 nm至500 nm、或約50 nm至約200 nm、或75 nm至約125 nm範圍內的尺寸。

在有關LNP之某些實施例中，LNP係由Billingsley等人, Nano Lett. 2020, 20, 1578或Billingsley等人, International Patent Publication No. WO 2021/077066 (其兩者特此以全文引用之方式併入本文中)描述。Billingsley等人及WO2021/077066描述含有錨定脂質之PEG、膽固醇、磷脂及可電離脂質之LNP。在某些實施例中，LNP含有C14-4多胺核及/或具有約70 nm之粒徑。C14-4具有以下結構。

在某些實施例中，LNP係由美國專利第10,493,031號、美國專利第10,682,374號或第WO2021/077066號(其各者特此以全文引用之方式併入本文中)所描述之陽離子型脂質或脂肽製成。在某些實施例中，LNP含有陽離子型脂質、基於膽固醇之脂質及/或一或多種經PEG修飾之脂質。在某些實施例中，LNP含有cKK-E12 (Dong等人, PNAS (2014) 111(11), 3955)：

在某些實施例中，LNP包含經修飾形式之cKK-E12 (在本文中稱為「bCKK-E12」)，其具有以下結構：

在某些實施例中，LNP包含經Sabnis等人, Molecular Therapy 2018, 26:6, 1509-1519 (特此以全文引用之方式併入本文中)所描述之脂質1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在某些實施例中，LNP包含Sabnis等人中所描述之脂質5、8、9、10或11。

Sabnis等人之脂質5具有以下結構：

Sabnis等人之脂質9具有以下結構：

可使用之額外脂質包括由以下所描述之脂質：Roces等人, Pharmaceutics, 2020, 12,1095；Jayaraman等人, Angew. Chem. Int. Ed., 2012, 51, 8529-8533；Maier等人, www.moleculartherapy.org, 2013,第21卷,第8期, 1570-1578；Liu等人, Adv. Mater. 2019, 31, 1902575，例如BAMEA-O16B；Cheng等人, Adv. Mater., 2018, 30, 1805308，例如5A2-SC8；Hajj及Ball, Small, 2019 15, 1805097，例如306Oi10；Du等人, U.S. Patent Application Publication No. 20160376224；及Tanaka等人, Adv. Funct. Mater., 2020, 30, 1910575；其各者特此以全文引用之方式併入本文中。

在其他實施例中，奈米粒子為LNP。在其他實施例中，LNP包含莫耳%之以下組分，基本上由以下組分組成或由以下組分組成：(1)約20%至約65%之一或多種陽離子型脂質、約1%至約50%之一或多種磷脂脂質、約0.1%至約10%之一或多種PEG結合脂質及約0%至約70%之膽固醇；及(2)約20%至約50%之一或多種陽離子型脂質、約5%至約20%之一或多種磷脂脂質、約0.1%至約5%之一或多種PEG結合脂質及約20%至約60%之膽固醇。在其他實施例中，磷脂脂質為中性脂質；且磷脂脂質為DOPE或DSPC。

在其他實施例中，LNP包含莫耳%之以下組分，基本上由以下組分組成或由以下組分組成：(1) cKK-E12，約35%；C14-PEG2000，約2.5%；膽固醇，約46.5%；及DOPE，約16%；(2) bCKK-E12，約35%；C14-PEG2000，約2.5%；膽固醇，約46.5%；及DOPE，約16%；(3)脂質9 (進一步描述於Sabnis等人中)，約50%；C14-PEG2000，約1.5%；膽固醇，約38.5%；及DSPC，約10%；或(4)脂質5 (進一步描述於Sabnis等人中)，約50%；C14-PEG2000，約1.5%；膽固醇，約38.5%；及DSPC，約10%；及(5)可離子化脂質，約50%；DSPC，約10%；膽固醇，約37.5%；及穩定劑(PEG-脂質)，約2.5%；或(6)為 GenVoy-ILM™ LNP (Precision NanoSystems)。 V.B. 基於聚合物之奈米粒子

可由各種不同之天然及合成材料製備基於聚合物之遞送系統。DNA及其他化合物可截留於聚合物奈米粒子之聚合物基質中或可吸附或結合至奈米粒子之表面上。用於核酸遞送之常用聚合物之實例包括聚(乳酸-共-乙醇酸) (PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚(乙烯亞胺) (PEI)及PEI衍生物、聚葡萄胺糖、樹枝狀聚合物、聚酸酐、聚己內酯、聚甲基丙烯酸酯、聚-L-離胺酸、普魯蘭(pullulan)、聚葡萄糖及玻尿酸、聚-β-胺基酯。(Thomas等人, (2019) Molecules24, 3744)。

基於聚合物之奈米粒子可具有不同尺寸，範圍為約1 nm至約1000 nm、約10 nm至約500 nm、約50 nm至約200 nm、約100 nm至約150 nm及約150 nm或更小。 V.C. 脂質聚合物奈米粒子

脂質聚合物奈米粒子為提供脂質組分及聚合物組分兩者之雜合奈米粒子，且因此可視為LNP或LPNP。LPNP組態可提供外部聚合物及內部脂質或外部脂質及內部聚合物。兩種不同類型之材料的存在有助於設計奈米粒子以使得組分可延遲釋放。可考慮所遞送之材料來選擇不同脂質及聚合物組分。(例如，參見Teo等人, Advanced Drug Delivery Reviews(2016) 98, 41；Bochicchio等人, Pharmaceutics(2021) 13, 198；Mahzabin及Das, IJPSR(2021) 12(1), 65；及Teixeira等人, (2017) Prog. Lipid Res. 10月;68:1-11)。 V.D. 基於蛋白質及肽之奈米粒子

基於蛋白質及肽之系統可使用各種不同蛋白質及肽。可使用之蛋白質之實例包括明膠及彈性蛋白。基於肽之系統可使用例如CPP。

CPP為潛在地能夠進行胞內滲透以遞送治療性分子之短肽(6至30個胺基酸殘基)。大部分CPP主要由精胺酸及離胺酸殘基組成，使其成為陽離子型及親水性的，但CPP亦可為兩親媒性、陰離子型或疏水性的。CPP可衍生自天然生物分子(例如HIV-1 Tat蛋白)或藉由合成方法獲得(例如聚-L-離胺酸、聚精胺酸) (Singh等人, Drug Deliv.2018;25(1):1996-2006)。CPP之實例包括陽離子型CPP (高度帶正電)，諸如Tat肽、穿膜肽、魚精蛋白、聚-L-離胺酸及聚精胺酸；兩親媒性CPP (由不同來源構築之嵌合或融合肽，同時含有帶正電及帶負電胺基酸序列)，諸如轉運蛋白、VT5、牛抗菌肽-7 (Bac7)、富含脯胺酸之肽(PPR)、SAP (VRLPPP) ₃、TP10、pep-1及MPG；親膜CPP (同時展現疏水性及兩親媒性之性質兩者，且包含大芳族殘基及小殘基兩者)，諸如H625、SPIONs-PEG-CPP及NP；以及疏水性CPP (僅含有非極性模體或殘基)，諸如SG3、PFVYLI、pep-7及纖維母細胞生長因子。

蛋白質及肽奈米粒子可以不同尺寸提供，例如範圍為約1 nm至約1000 nm、約10 nm至約500 nm、約50 nm至約200 nm、約100 nm至約150 nm或約150 nm或更小。 V.E. 肽籠奈米粒子

基於肽籠之遞送系統可由能夠組裝成籠樣結構之蛋白質材料產生，該籠樣結構形成受限之內部環境。肽籠可包含自我組裝以形成蛋白質籠(例如具有內部空腔之結構，其為溶劑可自然進入的或可藉由改變溶劑濃度、pH或平衡比率而製成)之蛋白質殼體。蛋白質籠之單體可為天然存在之形式或變異體形式，包括胺基酸取代、插入及缺失(例如片段)。

可組裝不同類型之蛋白質「殼體」且使其負載有不同類型之材料。可使用病毒外殼蛋白(例如來自豇豆褪綠斑駁病毒(Cowpea Chlorotic Mottle Virus)蛋白質外殼)，以及非病毒蛋白(例如美國專利第6,180,389號及第6,984,386號、美國專利公開案第20040028694號及美國專利公開案第20090035389號，其各者以全文引用之方式併入本文中)來產生蛋白質籠。

衍生自非病毒蛋白之蛋白質籠之實例包括：真核或原核衍生之鐵蛋白及缺鐵鐵蛋白，諸如12及24次單元鐵蛋白；及熱休克蛋白(HSP)，諸如形成內部核心空間之24次單元熱休克蛋白類、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)之小HSP、大腸桿菌(E. coli)之十二聚體Dsp HSP；及MrgA蛋白。

蛋白質籠可具有不同核心尺寸，諸如範圍為約1 nm至約1000 nm、約10 nm至約500 nm、約50 nm至約200 nm、約100 nm至約150 nm或約150 nm或更小。 V.F. 外泌體

外泌體為小生物膜囊泡，包括小分子、肽、蛋白質及核酸，且用於遞送各種運載物。外泌體之尺寸通常在約30 nm至100 nm範圍內且可被細胞吸收並遞送其運載物。運載物可與外泌體表面結構締合或可囊封於外泌體雙層內。

可對促進運載物遞送及細胞靶向之外泌體進行各種修飾。用於促進運載物遞送之修飾包括與運載物締合之結構，諸如蛋白質骨架及聚合物。用於細胞靶向之修飾包括靶向配位體及修飾表面電荷。描述用於遞送不同運載物之外泌體之產生、修飾及使用的公開案包括Munagala等人, Cancer Letters(2021), 505, 58；Fu等人, (2020) NanoImpact 20, 100261；及Dooley等人, (2021) Molecular Therapy29(5), 1729 (其各者特此以引用之方式併入本文中)。 VI. 醫藥組合物

醫藥組合物包含有助於投與及/或儲存本文中所描述之聚核苷酸構築體、病毒載體及非病毒載體的醫藥學上可接受之載劑。提及「醫藥學上可接受」指示組分在所使用之量下不引起實質上非所需之生物作用。醫藥學上可接受之載劑可含有不同組分，諸如一或多種醫藥學上可接受之賦形劑，諸如鹽、糖、緩衝液、溶劑、防腐劑、蛋白質及界面活性劑。特定賦形劑可具有超過一種功能。可用於病毒載體之醫藥學上可接受之賦形劑及載劑的實例提供於例如國際專利公開案第WO2021/071835號中。

醫藥組合物可經調配以與特定投藥途徑或遞送相容。適用於非經腸投與之組合物包含水性及非水性溶液、懸浮液或乳液，該等製劑通常為無菌的且可與預期受體之血液等張。說明性實例包含水、緩衝鹽水、漢克氏溶液(Hanks' solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖、果糖、乙醇、動物植物及合成油。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之物質，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或聚葡萄糖。

在一實施例中，醫藥組合物含有能夠注射至個體中之調配物。可注射調配物組分之實例包括等張、無菌鹽水溶液、鹽(例如，磷酸單鈉或磷酸二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂及此類鹽之混合物)、緩衝鹽水、糖(例如，右旋糖)及注射用水。醫藥組合物包括乾燥(例如冷凍乾燥)組合物，其在添加滅菌水或生理鹽水後容許適用於投與之溶液復原。

另外，懸浮液可製備成適當油性注射懸浮液。適合之親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，諸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或三酸甘油酯；或脂質體。視情況，懸浮液亦可含有適合之穩定劑或增加化合物溶解度以有助於製備濃縮溶液之藥劑。

「有效量」或「足夠量」係指提供指定或所需作用之量。有效量可單獨或與一或多種其他組合物(例如，額外治療劑或免疫抑制劑)、治療、方案或治療方案組合以單次或多次劑量形式投與；且提供長期或短期反應。

可將包含編碼ApoE3相關蛋白之轉殖基因的醫藥組合物遞送至個體，以便允許產生所編碼之蛋白質。可活體內或離體進行遞送。在某些實施例中，醫藥組合物包含足夠之遺傳物質以使得受體能夠在個體中產生治療有效量之蛋白質。

術語「治療有效量」係指引發個體出現所需或指定生物學或醫學反應之活性成分或組分的量。可基於所觀測之症狀及/或經由使用與特定疾病或病症相關之生物標記物來確定治療有效量。特定有效劑量之選擇可在考慮不同因素之情況下最佳化，該等因素包括所治療或預防之疾病、所涉及之症狀、動物模型中之安全性及有效性、患者之身體質量及患者之免疫狀態。調配物中所使用之最佳劑量亦將視投藥途徑及疾病或病症之嚴重程度而定，且可根據患者之情況進行評估。有效劑量可由衍生自活體外或動物模型測試系統之劑量-反應曲線外推得到。

在某些實施例中，醫藥組合物包含有包含空AAV殼體之rAAV載體。在某些實施例中，在包含rAAV載體及空AAV殼體之醫藥組合物中，空AAV殼體與rAAV載體之比率在約100:1至50:1、約50:1至25:1、約25:1至10:1、約10:1至1:1、約1:1至1:10、約1:10至1:25、約1:25至1:50或約1:50至1:100內或之間。在某些實施例中，空AAV殼體與rAAV載體之比率為約2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。

醫藥組合物及遞送系統之額外指導及實例提供於例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2020)第23版, University of the Science in Philadelphia,由Elsevier出版；The Merck Index (2013)第15版, Whitehouse, NJ；Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.；以及Ansel及Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001)第11版, Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD。

VII. 投藥及治療

本文中所描述之聚核苷酸構築體、病毒載體及非病毒載體可投與至個體，較佳人類個體，以提供預防性治療，從而降低疾病或病症之可能性或嚴重程度及/或治療經診斷之疾病或病症。在某些實施例中，考慮進行治療之特定疾病或病症來選擇聚核苷酸組分、載體選擇、投藥途徑及/或特定醫藥組合物。

可例如基於症狀、生物標記物及基因標記物來鑑別患有特定疾病或病症或處於特定疾病或病症之增加風險中的個體。治療之實例包括以下中之一或多者：降低膽固醇、降低LDL/VLDL、增加HDL或降低總膽固醇/HDL比率；或治療高膽固醇血症、III型家族性高脂蛋白血症、家族性高膽固醇血症、類澱粉腦血管病變、失智症、支架後再狹窄、動脈粥樣硬化、冠心病或阿茲海默氏病或降低該等病症之可能性。

在某些實施例中，治療使得動脈粥樣硬化病變減少。

在某些實施例中，個體為具有一或兩個ApoE4對偶基因或兩個ApoE2對偶基因之人類個體。

在某些實施例中，治療係藉由提供周邊ApoE3相關表現，例如肝臟表現來進行。高肝臟表現可例如使用包含以下之聚核苷酸表現卡匣來實現：提供高肝臟表現之啟動子或啟動子/強化子；提供肝臟向性之病毒載體；及靶向肝臟之奈米粒子。在不同實施例中，啟動子為人類α 1-抗胰蛋白酶(hAAT)啟動子、脂蛋白A-I啟動子、白蛋白啟動子、B型肝炎病毒核心啟動子、α-胎兒蛋白(AFP)、人類因子IX啟動子、甲狀腺素結合球蛋白啟動子、TTR最小強化子/啟動子、α-抗胰蛋白酶啟動子或LSP1啟動子；及/或提供脂蛋白E (apoE) HCR-l及HCR-2強化子。在其他實施例中，rAAV具有基於AAV2、AAV3B或基於SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 84之VP1的血清型。

在某些實施例中，使用核酸表現組件、載體組件及/或提供ApoE3相關蛋白之CNS表現的技術來治療阿茲海默氏病；基於與阿茲海默氏病相關之生物標記物或基因標記物選擇個體；及/或個體經診斷患有阿茲海默氏病。在其他實施例中，ApoE3相關蛋白含有基督城取代。

在某些實施例中，使用核酸表現組件、載體組件及/或提供周邊ApoE3相關蛋白表現之技術來治療阿茲海默氏病。已指示，藉由血腦障壁與大腦中之同功型分離的周邊ApoE同功型對阿茲海默氏病之致病機制及認知產生不同影響。(Storz等人, (2022), Nature Neuroscience 25:1020-1033)。在其他實施例中，ApoE3相關蛋白含有基督城取代。

可基於認識能力之異常降低鑑別阿茲海默氏病個體，該認識能力之異常降低可與量測澱粉樣蛋白斑(例如，PET掃描或Lumipulse G β-澱粉樣蛋白比率(1至42/1至40)測試)一起進行。可基於與阿茲海默氏病相關之基因標記物來鑑別處於罹患阿茲海默氏病之較大風險中的個體。在不同實施例中，個體為具有一或兩個ApoE4對偶基因之人類個體，或為早老素1 (presenilin 1； PSEN1)突變攜帶者。Liu等人, Nature Neuroscience2022, 25, 1020-1033引用之證據表明，藉由血腦障壁與大腦分離之周邊ApoE同功型對阿茲海默氏病產生不同影響。

視靶向之疾病或病症而定，投藥可藉由不同途徑，諸如皮下、經表皮、皮內、鞘內、眶內、黏膜內、鼻內、腹膜內、經靜脈內、胸膜內、動脈內、腔內、經口、肝內、經由門靜脈、肌內、腦實質內、腦池內或腦室內投與來進行。在某些實施例中，病毒或非病毒載體係以醫藥學載劑形式經由輸注投與患者。

CNS投藥亦可使用促進穿過血腦障壁輸送之技術進行，包括破壞血腦障壁及使用血腦障壁載劑。(Chen等人, (2021) Journal of Controlled Release333, 129-138以及Bellettato及Scrapa, Italian Journal of Pediatrics(2018) 44(增刊2):131；Haumann等人, (2020) CNS Drugs34, 1121-1131；及Cammalleri等人, J. Clin. Neurophysiol.(2020) 3月;37(2):104-117，其各者特此以全文引用之方式併入本文中)。促進穿過血腦障壁之技術可用於基因遞送載具及/或ApoE3相關蛋白上。

在某些實施例中，使用在CNS外部提供表現(例如肝臟表現)之表現系統以及促進ApoE(ch)穿過血腦障壁輸送之技術來進行CNS疾病或病症(諸如阿茲海默氏病)之治療。

在某些實施例中，使用促進基因遞送載具穿過血腦障壁之技術來進行CNS疾病或病症(諸如阿茲海默氏病)之治療。在另一實施例中，使用聚焦式超音波以及微泡來促進穿過血腦障壁。(Cammalleri等人, J Clin Neurophysiol.(2020) 3月;37(2):104-117，其特此以全文引用之方式併入本文中)。

在某些實施例中，CNS疾病或病症(諸如阿茲海默氏病)之治療使用在CNS外部提供表現(例如高肝臟表現)之表現系統。

在某些實施例中，提供CNS表現之組分包含PGK啟動子、CBh啟動子或EF1 α啟動子。

在某些實施例中，使用提供CNS入口之AAV殼體。此類殼體之實例提供於Chen等人，(2021) Journal of Controlled Release333, 129-138 (例如AAV9、AAVrh.10、AAVrh.8、AAVHSC、AAV-B1、AAV-AS及AAV1/rh.10)、美國專利第9,585,971號及美國專利公開案第US202/1214749號中，其各者以全文引用之方式併入本文中。

CNS投藥亦可例如藉由使用針或導管直接投藥至大腦來進行。(例如，國際公開案第WO 2021/108809號、Cohen-Pferrer等人, Pediatric Neurology67 (2017) 23-35；及美國專利第10369329號；其各者特此以全文引用之方式併入本文中)。

用於CNS投藥之技術之另一實例為對流增強遞送。對流增強遞送包含大腦之手術暴露，隨後將導管直接置放於標靶區域中，隨後輸注治療劑。(美國專利公開案第2022/010001號；及Debinski等人(2009) Expert Rev Neurother. 9(10):1519-27；兩者均特此以全文引用之方式併入本文中)。

CNS遞送裝置、系統及技術亦包括描述於例如以下中之CNS遞送裝置、系統及技術：美國專利第8128600號、美國專利公開案第2020/0324089號、美國專利第11129643號、美國專利第11154377號、美國專利公開案第2021/0343397號、美國專利公開案第2021/0282866號、美國專利第9572928號、美國專利第8337458號及美國專利第10722265號、美國專利公開案第2021/214749號，其各者以全文引用之方式併入本文中。

最佳劑量可視不同因素(諸如特定治療劑及所需終點)而變化。考慮到治療或療法之不良副作用、併發症或其他風險因素及個體之狀態，劑量、數目、頻率或持續時間可按比例增加或減少。

「單位劑型」係指含有預定有效量之活性成分以及醫藥學上可接受之載劑的物理離散單位。單位劑型可提供於例如安瓿及小瓶內，該等安瓿及小瓶可包括醫藥學上可接受之載劑，或處於冷凍乾燥或凍乾狀態之組合物。在冷凍乾燥或凍乾狀態之情況下，可在投藥之前添加無菌液體載劑。個別單位劑型可包括於多劑量套組或容器中。

「有效量」實現所需或指定作用。舉例而言，治療有效量減少一或多種不良症狀，降低與疾病或病症相關之一或多種症狀的可能性，或減少疾病或病症進展。較佳之治療有效量可有效減少多種或所有不良症狀。

在某些實施例中，以適合於以下之劑量向個體投與包含病毒或非病毒載體之醫藥組合物：降低膽固醇、降低LDL/VLDL、增加HDL或降低總膽固醇/HDL比率；或治療高膽固醇血症、III型家族性高脂蛋白血症、家族性高膽固醇血症、類澱粉腦血管病變、失智症(例如，血管性失智症或額顳葉型失智症)、支架後再狹窄、動脈粥樣硬化、冠心病或阿茲海默氏病或降低該等病症之可能性。在不同實施例中，適合之劑量為每公斤個體體重約0.01 mg/kg至約10 mg/kg載體、每公斤個體體重約0.01 mg/kg至約0.1 mg/kg載體、每公斤個體體重約0.1 mg/kg至約1.0 mg/kg載體或每公斤個體體重約1.0 mg/kg至約10 mg/kg載體。

通常，rAAV劑量之範圍為至少1×10 ⁸個載體基因體/公斤(vg/kg)個體體重或更多，例如1×10 ⁹、1×10 ¹⁰、1×10 ¹¹、1×10 ¹²、1×10 ¹³或1×10 ¹⁴或更多個載體基因體/公斤(vg/kg)個體體重以實現治療作用。在不同實施例中，rAAV劑量為約5×10 ¹¹rAAV vg/kg或超過約5×10 ¹¹rAAV vg/kg；約1×10 ¹²rAAV vg/kg或超過約1×10 ¹²rAAV vg/kg；約2×10 ¹²rAAV vg/kg或超過約2×10 ¹²rAAV vg/kg；約3×10 ¹²rAAV vg/kg或超過約3×10 ¹²rAAV vg/kg；約4×10 ¹²rAAV vg/kg或超過約4×10 ¹²rAAV vg/kg；約5×10 ¹²rAAV vg/kg或超過約5×10 ¹²rAAV vg/kg；約1×10 ¹³rAAV vg/kg或超過約1×10 ¹³rAAV vg/kg；約2×10 ¹³rAAV vg/kg或超過約2×10 ¹³rAAV vg/kg；約3×10 ¹³rAAV vg/kg或超過約3×10 ¹³rAAV vg/kg；約4×10 ¹³rAAV vg/kg或超過約4×10 ¹³rAAV vg/kg；約5×10 ¹³rAAV vg/kg或超過約5×10 ¹³rAAV vg/kg；約6×10 ¹³rAAV vg/kg或超過約6×10 ¹³rAAV vg/kg。

rAAV vg/kg之劑量範圍之實例包括約5×10 ¹¹至約6×10 ¹³rAAV vg/kg之劑量範圍；約5×10 ¹¹至約5.5×10 ¹¹rAAV vg/kg之劑量範圍；約5.5×10 ¹¹至約6×10 ¹¹rAAV vg/kg之劑量範圍；約6×10 ¹¹至約6.5×10 ¹¹rAAV vg/kg之劑量範圍；約6.5×10 ¹¹至約7×10 ¹¹rAAV vg/kg之劑量範圍；約7×10 ¹¹至約7.5×10 ¹¹rAAV vg/kg之劑量範圍；約7.5×10 ¹¹至約8×10 ¹¹rAAV vg/kg之劑量範圍；約8×10 ¹¹至約8.5×10 ¹¹rAAV vg/kg之劑量範圍；約8.5×10 ¹¹至約9×10 ¹¹rAAV vg/kg之劑量範圍；約9×10 ¹¹至約9.5×10 ¹¹rAAV vg/kg之劑量範圍；約9.5×10 ¹¹至約1×10 ¹²rAAV vg/kg之劑量範圍；約1×10 ¹²至約1.5×10 ¹²rAAV vg/kg之劑量範圍；約1.5×10 ¹²至約2×10 ¹²rAAV vg/kg之劑量範圍；約2×10 ¹²至約2.5×10 ¹²rAAV vg/kg之劑量範圍；約2.5×10 ¹²至約3×10 ¹²rAAV vg/kg之劑量範圍；約3×10 ¹²至約3.5×10 ¹²rAAV vg/kg之劑量範圍；約3.5×10 ¹²至約4×10 ¹²rAAV vg/kg之劑量範圍；約4×10 ¹²至約4.5×10 ¹²rAAV vg/kg之劑量範圍；約4.5×10 ¹²至約5×10 ¹²rAAV vg/kg之劑量範圍；約5×10 ¹²至約5.5×10 ¹²rAAV vg/kg之劑量範圍；約5.5×10 ¹²至約6×10 ¹²rAAV vg/kg之劑量範圍；約6×10 ¹²至約6.5×10 ¹²rAAV vg/kg之劑量範圍；約6.5×10 ¹²至約7×10 ¹²rAAV vg/kg之劑量範圍；約7×10 ¹²至約7.5×10 ¹²rAAV vg/kg之劑量範圍；約7.5×10 ¹²至約8×10 ¹²rAAV vg/kg之劑量範圍；約8×10 ¹²至約8.5×10 ¹²rAAV vg/kg之劑量範圍；約8.5×10 ¹²至約9×10 ¹²rAAV vg/kg之劑量範圍；約9×10 ¹²至約9.5×10 ¹²rAAV vg/kg之劑量範圍；約9.5×10 ¹²至約1×10 ¹³rAAV vg/kg之劑量範圍；約1×10 ¹³至約1.5×10 ¹³rAAV vg/kg之劑量範圍；約1.5×10 ¹³至約2×10 ¹³rAAV vg/kg之劑量範圍；約2×10 ¹³至約2.5×10 ¹³rAAV vg/kg之劑量範圍；約2.5×10 ¹³至約3×10 ¹³rAAV vg/kg之劑量範圍；約3×10 ¹³至約3.5×10 ¹³rAAV vg/kg之劑量範圍；約3.5×10 ¹³至約4×10 ¹³rAAV vg/kg之劑量範圍；約4×10 ¹³至約4.5×10 ¹³rAAV vg/kg之劑量範圍；約4.5×10 ¹³至約5×10 ¹³rAAV vg/kg之劑量範圍；約5×10 ¹³至約5.5×10 ¹³rAAV vg/kg之劑量範圍；約5.5×10 ¹³至約6×10 ¹³rAAV vg/kg之劑量範圍；約6×10 ¹³至約1×10 ¹⁴rAAV vg/kg之劑量範圍。

在某些實施例中，以約5×10 ¹¹vg/kg、約6×10 ¹¹vg/kg、約7×10 ¹¹vg/kg、約8×10 ¹¹vg/kg、約9×10 ¹¹vg/kg、約1×10 ¹²vg/kg、約2×10 ¹²vg/kg、約3×10 ¹²vg/kg、約4×10 ¹²vg/kg、約5×10 ¹²vg/kg、約6×10 ¹²vg/kg、約7×10 ¹²vg/kg、約8×10 ¹²vg/kg、約9×10 ¹²vg/kg、約1×10 ¹³vg/kg、約2×10 ¹³vg/kg、約3×10 ¹³vg/kg、約4×10 ¹³vg/kg、約5×10 ¹³vg/kg或約6×10 ¹³vg/kg之劑量投與rAAV vg/kg。

在某些實施例中，其他病毒載體之劑量及劑量範圍係如本文關於rAAV所提供。舉例而言，在某些實施例中，重組腺病毒載體、重組逆轉錄病毒載體(例如慢病毒)及重組單純疱疹病毒載體之劑量及劑量範圍與上文關於rAAV所說明之劑量及劑量範圍相同。

在某些實施例中，本文中所描述之聚核苷酸構築體、病毒載體及非病毒載體與用於特定疾病或病症之額外化合物或治療組合投與；及/或與減少針對聚核苷酸、遞送載具及/或所產生之蛋白質而發生之免疫反應的化合物組合投與。額外化合物或治療可以不同模式提供，諸如分開投與；及在投與本文中所描述之聚核苷酸構築體、病毒載體及非病毒載體之前、大體上同時或之後投與或進行。

在某些實施例中，本文中所描述之聚核苷酸構築體、病毒載體及非病毒載體之投與係與免疫抑制劑或方案組合。可視需要使用此類藥劑及方案以實現免疫耐受性或減輕對所產生之ApoE3相關蛋白、所提供之聚核苷酸或所提供之遞送載具的免疫反應。免疫抑制劑及方案之實例包括甲胺喋呤、利妥昔單抗(rituximab)、靜脈內γ球蛋白(IVIG)、奧馬珠單抗(omalizumab)、ImmTOR ^®(合成疫苗粒子(SVP)-雷帕黴素(rapamycin) (囊封於生物可降解奈米粒子中之雷帕黴素))、ImmTOR-IL ^TM(ImmTOR及Treg選擇性IL-2促效劑)、B細胞耗盡、免疫吸附及血漿清除術。

在某些實施例中，病毒載體或非病毒載體與一或多種免疫抑制劑一起投與，其中在投與載體或非病毒載體之前、大體上同時或之後投與一或多種免疫抑制劑。在某些實施例中，一或多種免疫抑制劑與載體或非病毒載體同時投與。在某些實施例中，在病毒或非病毒載體投與之前的1至12、12至24或24至48小時；或2至4、4至6、6至8、8、10、10至14、14至20、20至25、25至30、30至50天或超過50天投與一或多種免疫抑制劑。在某些實施例中，在病毒或非病毒載體投與之後的1至12、12至24或24至48小時；或2至4、4至6、6至8、8至10、10至14、14至20、20至25、25至30、30至50天或超過50天投與一或多種免疫抑制劑。可在投與載體或非病毒載體之後的某一時段後，例如在初始表現量持續某一時段後(例如在載體或非病毒載體投與之後的20至25、25至30、30至50、50至75、75至100、100至150、150至200或超過200天)所編碼之蛋白質減少時完成免疫抑制劑之投與。

在某些實施例中，免疫抑制劑為抗發炎劑。在某些實施例中，免疫抑制劑為類固醇，例如皮質類固醇。在某些實施例中，免疫抑制劑為普賴松(prednisone)、普賴蘇穠(prednisolone)、鈣調神經磷酸酶抑制劑(例如環孢素(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus))、MMF (黴酚酸，例如CellCept®、Myfortic®)、CD52抑制劑(例如阿侖妥珠單抗(alemtuzumab))、CTLA4-Ig (例如阿巴西普(abatacept)、貝拉西普(belatacept))、抗CD3 mAb、抗LFA-1 mAb (例如艾法珠單抗(efalizumab))、抗CD40 mAb (例如ASKP1240) 抗CD22 mAb (例如依帕珠單抗(epratuzumab))、抗CD20 mAb (例如利妥昔單抗、奧瑞珠單抗(orelizumab)、奧伐木單抗(ofatumumab)、維妥組單抗(veltuzumab))、蛋白酶體抑制劑(例如硼替佐米(bortezomib))、TACI-Ig (例如阿塞西普(atacicept))、抗C5 mAb (例如艾庫組單抗(eculizumab))、黴酚酸酯、硫唑嘌呤、西羅莫司(sirolimus)、依維莫司(everolimus)、TNFR-Ig、抗TNF mAb、托法替尼(tofacitinib)、抗IL-2R (例如巴利昔單抗(basiliximab))、抗IL-17 mAb (例如蘇金單抗(secukinumab))、抗IL-6 mAb (例如，抗IL-6抗體西魯庫單抗(sirukumab)、抗IL-6受體抗體托珠單抗(tocilizumab) (Actemra®))、IL-10抑制劑、TGF-β抑制劑、B細胞靶向抗體(例如利妥昔單抗)、哺乳動物雷帕黴素靶蛋白(mTOR)抑制劑(例如雷帕黴素)、合成疫苗粒子(SVP™)-雷帕黴素(囊封於生物可降解奈米粒子中之雷帕黴素)、靜脈內γ球蛋白(IVIG)、奧馬珠單抗、甲胺喋呤、酪胺酸激酶抑制劑(例如依魯替尼(ibrutinib))、環磷醯胺、芬戈莫德(fingolimod)、B細胞活化因子(BAFF)之抑制劑(例如抗BAFF mAb，例如貝利單抗(belimumab))、增殖誘導之配位體之抑制劑(APRIL)、抗IL-1b mAb(例如卡那單抗(canakinumab) (Haris®))、C3a抑制劑、調節T細胞抗原決定基(Tregitope) (參見例如，美國專利第10,213,496號)或其組合及/或衍生物。

包括單獨或與IL-10組合使用雷帕黴素之免疫抑制方案可用於降低、減少、抑制、預防或阻斷針對ApoE3相關蛋白之體液及細胞免疫反應。使用病毒載體(例如rAAV)及非病毒載體之肝基因轉移可用於經由誘導調節T細胞(Treg)來誘導針對ApoE3相關蛋白之免疫耐受性。

減少(克服)或避免針對全身基因轉移中之病毒載體(諸如rAAV)的體液免疫性之策略包括投與高載體劑量；使用AAV空殼體作為誘餌以吸收抗AAV抗體；投與免疫抑制藥物以降低、減少、抑制、預防或根除對AAV之體液免疫反應；改變rAAV殼體血清型或工程化rAAV殼體以使其對中和抗體較不敏感；使用血漿交換循環以吸收抗AAV免疫球蛋白，由此減少抗AAV抗體效價；且使用諸如氣囊導管之遞送技術，隨後鹽水沖洗。此類策略描述於Mingozzi等人, (2013) Blood, 122:23-36中。其他策略包括使用AAV特異性血漿清除術管柱，以選擇性地耗盡抗AAV抗體而不耗盡來自血漿之總免疫球蛋白池，如Bertin等人, 2020, Sci. Rep.10:864中所描述。可將類似技術及策略用於其他類型之病毒載體。

用作誘餌探針之空殼體可以與病毒載體不同之比率提供。所投與之空殼體之量可基於特定個體中產生之抗體之量(效價)來校準。在某些實施例中，空AAV殼體與rAAV載體之比率在約100:1至50:1、約50:1至25:1、約25:1至10:1、約10:1至1:1、約1:1至1:10、約1:10至1:25、約1:25至1:50或約1:50至1:100內或之間。在特定態樣中，所投與之空AAV殼體與rAAV載體之比率為約2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。較佳地，空殼體之血清型與rAAV血清型相同。

在某些實施例中，使用繞過血流及病毒抗體之方法遞送病毒載體。此類技術之實例包括經由肝動脈遞送至肝臟；及內視鏡逆行性胰膽管攝影(endoscopic retrograde cholangiopancreatography；ERCP)遞送至肝臟。經由頸動脈遞送至CNS。諸如頜下腺之導管的其他導管系統亦可用作埠以將病毒載體遞送至出現或具有針對病毒載體之先前存在之抗體的個體中。

減少對rAAV之體液免疫性的其他策略(其可應用於其他病毒載體)包括移除、耗盡、捕獲及/或不活化AAV抗體之方法，該等方法通常稱為血球分離術，且更特定言之，涉及血液產物之血漿清除術。血球分離術或血漿清除術為一種方法，其中人類個體之血漿係經由在返回至患者之前經由添加、移除及/或置換組分來修飾血漿的裝置進行離體(體外)循環。血漿清除術可用於自血液產物(例如，血漿)移除人類免疫球蛋白(例如，IgG、IgE、IgA、IgD)。此程序可用於耗盡、捕獲、不活化、減少或移除結合AAV之免疫球蛋白(抗體)，由此降低經治療個體中可有助於rAAV中和之AAV抗體的效價。實例為使用由AAV殼體親和基質管柱構成之裝置，且經由AAV殼體親和基質穿過血液產物(例如血漿)，從而引起不同同型之AAV抗體結合。(參見例如，Bertin等人, 2020, Sci. Rep.10, 864，其特此以全文引用之方式併入本文中)。

在某些實施例中，聚核苷酸構築體、病毒載體及非病毒載體可與阻斷、抑制或減少IgG與新生兒Fc受體(FcRn)之相互作用的藥劑(諸如抗FcRn抗體)組合使用，以減少IgG活體內再循環且增強IgG清除；及/或與減少結合至重組病毒載體(或結合至由重組病毒載體包裹之聚核苷酸編碼的核酸或多肽、蛋白質或肽之重組病毒載體)或結合至聚核苷酸之循環抗體的藥劑組合使用。在某些實施例中，藉由減少IgG與FcRn、蛋白酶或醣苷酶之相互作用之藥劑來減少或抑制與病毒載體結合之抗體。

在某些實施例中，本文中所描述之聚核苷酸構築體、病毒載體及非病毒載體可與內肽酶(例如來自釀膿鏈球菌( Streptococcus pyogenes)之IdeS)或其經修飾之變異體，或內切醣苷酶(例如化膿性葡萄球菌( S. pyogenes) EndoS)或其經修飾之變異體組合使用。可例如進行此類治療以減少或清除針對基因遞送載具(例如病毒載體殼體)之中和抗體且能夠治療先前視為不適合於基因療法或產生因基因療法而出現之抗體的患者。此類策略描述於例如Leborgne等人, (2020) Nat. Med., 26:1096-1101中。

在某些實施例中，個體中之治療方法係與降低天然個體ApoE表現之化合物組合進行。可例如使用選擇性地靶向天然ApoE編碼序列之抑制性核酸來抑制天然ApoE表現。提及「選擇性地靶向」天然ApoE序列指示，編碼ApoE3相關蛋白之聚核苷酸之表現未受顯著影響。抑制性核酸可以在編碼ApoE3相關蛋白之相同聚核苷酸及/或載體上提供，或使用單獨病毒或非病毒載體提供。抑制性核酸之實例包括短髮夾RNA (shRNA)、短小干擾RNA (siRNA)、微小RNA (miRNA)、RNAi、核糖核酸酶及反義RNA。

在某些實施例中，表現卡匣進一步包含抑制性核酸，其選擇性地靶向編碼天然存在之ApoE2、ApoE3及ApoE4中之一或兩者的核酸。在其他實施例中，靶向ApoE2或靶向ApoE4。在某些實施例中，個體具有一個ApoE4對偶基因或具有兩個ApoE4對偶基因，且抑制性核酸靶向編碼ApoE4之核酸；且個體具有兩個ApoE2對偶基因，且抑制性核酸靶向ApoE2。在某些實施例中，結合使用包含基督城突變之ApoE3相關蛋白來靶向天然ApoE3。

在某些實施例中，本文中所描述之聚核苷酸構築體、病毒載體及非病毒載體與一或多種額外治療，諸如用於高脂血症、動脈粥樣硬化、心血管疾病及/或失智症之治療組合使用。在不同實施例中，額外治療包含斯他汀類藥物(statin) (例如阿托伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、羅素他汀(rosuvastatin)及辛伐他汀(simvastatin))、PCSK9抑制劑及/或依澤麥布(ezetimibe)。在某些實施例中，額外治療包含多奈哌齊(donepezil)、加蘭他敏(galantamine)、利佛斯狄明(rivastigmine)或美金剛(memantine)。在某些實施例中，額外失智症(例如阿茲海默氏病)治療包含斯他汀類藥物(例如阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、羅素他汀及辛伐他汀)、PCSK9抑制劑及/或依澤麥布。

VIII. 套組

本發明包括其中具有封裝材料及一或多種組分之套組。套組通常包括標籤或封裝插頁，其包括各組分之描述或其中各組分之活體外、活體內或離體使用說明書。套組可含有一系列此類組分，例如病毒或非病毒載體，且視情況含有第二活性物質，諸如另一化合物、藥劑、藥物或組合物。

套組係指容納一或多種組分之實體結構。封裝材料可維持組分無菌，且可由常用於此類目的之材料(例如紙、波紋狀纖維、玻璃、塑膠、箔、安瓿、小瓶及管)製成。

標籤或插頁可包括其中之一或多種組分之鑑別資訊、劑量、包括作用機制、藥物動力學及藥效學之活性成分之臨床藥理學。標籤或插頁可包括鑑別製造商資訊、批號、製造地點及日期、過期日期之資訊。標籤或插頁可包括關於可使用套組組分之疾病的資訊。標籤或插頁可包括臨床醫師或個體在方法、用途或治療方案或治療療法中使用套組組分中之一或多者的說明書。說明書可包括劑量、頻率或持續時間，及用於實踐本文中所描述之方法、用途、治療方案或防治或治療療法中之任一者的說明書。

標籤或插頁可包括關於組分可提供之一或多種益處之資訊，諸如防治或治療益處。標籤或插頁可包括關於潛在不良副作用、併發症或反應之資訊，諸如個體或臨床醫師關於其將不適合於使用特定組合物之情況的警告。不良副作用或併發症亦可能在個體已服用、將服用或目前正服用可能與組合物不相容之一或多種其他藥物，或個體已經歷、將經歷或目前正經歷將與組合物不相容之另一治療方案或治療療法時出現，且因此，說明書可能包括關於此類不相容性之資訊。

標籤或插頁包括「列印物」，例如紙或紙板，其為單獨的或附著至組分、套組或封裝材料(例如盒)或附接至含有套組組分之安瓿、管或小瓶。標籤或插頁可另外包括電腦可讀取媒體，諸如條形碼列印標籤；碟、光碟，諸如CD-ROM/RAM或DVD-ROM/RAM、DVD、MP3、磁帶；或電儲存媒體，諸如RAM及ROM，或此等之混合，諸如磁/光學儲存媒體、FLASH媒體或記憶型卡。

IX. mRNA 治療劑

在某些實施例中，編碼本文中所描述之ApoE相關蛋白之核酸的RNA型式提供為能夠在細胞內表現編碼蛋白質之mRNA構築體。mRNA構築體包含5'-帽、5' UTR、編碼RNA、3' UTR及聚(腺苷酸)尾。UTR及聚(腺苷酸)尾可提供不同功能，諸如參與mRNA次細胞定位、調節轉譯效率及mRNA穩定性。包括不同修飾之mRNA構築體之設計及產生說明於不同公開案中，諸如Ouranidis等人, (2022) Biomedicines, 10, 50、Qin等人, Signal Transduct Target Ther. (2022) 5月21日;7(1):166及美國專利公開案第U.S. 2013/0259924號，其各者特此以全文引用之方式併入本文中。

在某些實施例中，使用奈米粒子將mRNA構築體遞送至細胞或個體。奈米粒子之實例包括提供於上文之第V.A.至V.E.章節、Ouranidis等人, (2022) Biomedicines, 10, 50及美國專利公開案第U.S. 2013/0259924號中之奈米粒子。

關於治療劑投與及靶向疾病或病症之指導提供於例如上文之第VII.章節中。

X. 額外態樣及實施例

額外態樣、實施例及其組合包括以下：

第一態樣係關於一種聚核苷酸，其包含與SEQ ID NO: 63-67中之任一者之序列或SEQ ID NO: 95-105及124-130之核苷酸55至951具有至少85%之序列一致性的ApoE編碼核苷酸序列，其中聚核苷酸編碼包含與SEQ ID NO: 32至少90%一致之胺基酸序列的ApoE3相關蛋白，其中該蛋白質包含在對應於SEQ ID NO: 32之胺基酸112之位置處的半胱胺酸及在對應於SEQ ID NO: 32之胺基酸158之位置處的精胺酸；其中ApoE編碼核苷酸序列視情況包含一或多個內含子。百分比一致性係獨立於ApoE編碼核苷酸序列中存在之任何內含子而測定。

實施例E1a進一步描述第一態樣，其中ApoE編碼核酸序列包含一或多個內含子。

實施例E1b進一步描述第一態樣，其中ApoE編碼核酸序列不包含任何內含子。內含子可存在於聚核苷酸之其他部分中。

實施例E2a進一步描述第一態樣、實施例E1a及E1b，其中ApoE編碼核苷酸序列與SEQ ID NO: 3-10、12-14、16-19、21-25及27-30中之任一者之核苷酸55至951具有至少95%之序列一致性。在其他實施例中，ApoE編碼核酸序列與SEQ ID NO: 3-10、12-14、16-19、21-25及27-30中之任一者之核苷酸55至951或55至954具有至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之一致性；或與SEQ ID NO: 3-10、12-14、16-19、21-25及27-30中之任一者的核苷酸55至951或55至954中之任一者之差異為1至40個核苷酸、1至20個核苷酸或1至10個核苷酸。

實施例E2b進一步描述第一態樣及實施例E1a及E1b，其中ApoE編碼核苷酸序列與SEQ ID NO: 95-105及124-130中之任一者之核苷酸55至951具有至少95%之序列一致性。在其他實施例中，ApoE編碼核酸序列與SEQ ID NO: 95-105及124-130中之任一者之核苷酸55至951或55至954具有至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之一致性；或與SEQ ID NO: 95-105及124-130中之任一者的核苷酸55至951或55至954中之任一者之差異為1至40個核苷酸、1至20個核苷酸或1至10個核苷酸。較佳地，序列一致性係相對於SEQ ID NO: 95-105中之任一者。

實施例E3進一步描述第一態樣、實施例E1a及E1b，其中ApoE編碼核苷酸序列與SEQ ID NO: 63-67中之任一者具有至少95%之序列一致性。在其他實施例中，ApoE編碼核酸序列與SEQ ID NO: 63-67中之任一者或SEQ ID NO: 63-67中之任一者之核苷酸1至897具有至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之一致性；或與SEQ ID NO: 63-67中之任一者之差異為1至40個核苷酸、1至20個核苷酸或1至10個核苷酸。

實施例E4進一步描述第一態樣、實施例E1a、E1b、E2a、E2b及E3，其中ApoE3相關蛋白包含在對應於SEQ ID NO: 32之胺基酸136之位置處的絲胺酸。

實施例E5進一步描述第一態樣、實施例E1a、E1b、E2a、E2b及E3，其中ApoE3相關蛋白與SEQ ID NO: 32之序列具有至少95%之一致性。在其他實施例中，該蛋白質與SEQ ID NO: 32之序列具有至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之一致性；或與SEQ ID NO: 32之差異為1至10個胺基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸中之任一者。

實施例E6進一步描述第一態樣、實施例E1a、E1b、E2a、E2b及E3，其中ApoE3相關蛋白與SEQ ID NO: 33之序列具有至少95%之一致性。在其他實施例中，該蛋白質與SEQ ID NO: 33之序列具有至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之一致性；或與SEQ ID NO: 33之差異為1至10個胺基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸中之任一者。

實施例E7進一步描述第一態樣、實施例E1a、E1b、E2a、E2b、E3、E4、E5及E6，其中ApoE3相關蛋白進一步包含5'信號肽且ApoE3編碼核酸序列進一步包含編碼信號肽之核苷酸序列。

實施例E8進一步描述實施例E7，其中信號肽與選自由SEQ ID NO: 36、42、44、46、48、50、52、54、56及68-71組成之群的胺基酸序列具有至少90%之一致性。在其他實施例中，信號肽與SEQ ID NO: 36、42、44、46、48、50、52、54、56及68-71中之任一者具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之一致性；或與SEQ ID NO: 36、42、44、46、48、50、52、54、56及68-71中之任一者之差異為1、2或3個胺基酸中之任一者。

實施例E9進一步描述實施例E8，其中編碼信號肽序列之核苷酸序列與選自由SEQ ID NO: 37-41、43、45、47、49、51、53、55、57及72-75組成之群的序列包含至少90%之一致性。在其他實施例中，編碼信號肽之核苷酸序列與SEQ ID NO: 37-41、43、45、47、49、51、53、55、57及72-75中之任一者之序列具有至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之一致性；或與SEQ ID NO: 37-41、43、45、47、49、51、53、55、57及72-75中之任一者之差異為1至10個核苷酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸中之任一者。

實施例E10a進一步描述第一態樣、實施例E1a、E1b、E2a、E2b、E3、E4、E5、E6、E7、E8及E9，其中ApoE編碼核酸序列與SEQ ID NO: 3-31中之任一者之序列具有至少90%之序列一致性。在其他實施例中，ApoE編碼核酸序列與SEQ ID NO: 3-31中之任一者具有至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性；或與SEQ ID NO: 3-31中之任一者之差異為1至40個核苷酸、1至20個核苷酸或1至10個核苷酸。在其他實施例中，百分比一致性係相對於SEQ ID NO: 20、26、31、11或15；或相對於SEQ NO: 11及20。

實施例E10b進一步描述第一態樣、實施例E1a、E1b、E2a、E2b、E3、E4、E5、E6、E7、E8及E9，其中ApoE編碼核酸序列與SEQ ID NO: 95-105及124-130中之任一者之序列具有至少90%之序列一致性。在其他實施例中，ApoE編碼核酸序列與SEQ ID NO: 95-105及124-130中之任一者具有至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性；或與SEQ ID NO: 95-105及124-130中之任一者之差異為1至40個核苷酸、1至20個核苷酸或1至10個核苷酸。在其他實施例中，百分比一致性係相對於SEQ ID NO: 95-105。

實施例E11進一步描述第一態樣、實施例E1a、E1b、E2a、E2b、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10a及E10b，其中ApoE3相關序列包含SEQ ID NO: 34或35之序列。

實施例E12a進一步描述第一態樣、實施例E1a、E1b、E2a、E2b、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10a、E10b及E11，其中ApoE編碼核苷酸序列包含以下之序列：(i) SEQ ID NO: 3-10、12-14、16-19、21-25及27-30中之任一者之核苷酸55至951；(ii) SEQ ID NO: 3-10、12-14、16-19、21-25及27-30中之任一者之核苷酸55至954；(iii) SEQ ID NO: 63-67中之任一者之核苷酸1至897；(iv) SEQ ID NO: 63-67中之任一者；(v) SEQ ID NO: 3-31中之任一者之核苷酸1至951；或(vi) SEQ ID NO: 3-31中之任一者。

實施例E12b進一步描述第一態樣、實施例E1a、E1b、E2a、E2b、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10a、E10b及E11，其中ApoE編碼核苷酸序列包含以下之序列：(i) SEQ ID NO: 95-105及124-130中之任一者之核苷酸55至951；(ii) SEQ ID NO: 95-105及124-130中之任一者之核苷酸55至954；(iii) SEQ ID NO: 95-105及124-130中之任一者之核苷酸1至951；或(iv) SEQ ID NO: 95-105及124-130中之任一者。

實施例12c進一步描述第一態樣、實施例E1a、E1b、E2a、E2b、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10a、E10b及E11，其中ApoE編碼核苷酸序列包含與以下至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致或100%一致之序列：(i) SEQ ID NO: 3-10、12-14、16-19、21-25、27-30、95-105及124-130中之任一者之核苷酸55至951；(ii) SEQ ID NO: 3-10、12-14、16-19、21-25、27-30、95-105及124-130中之任一者之核苷酸55至954；(iii) SEQ ID NO: 63-67中之任一者之核苷酸1至897；(iv) SEQ ID NO: 63-67中之任一者；(v) SEQ ID NO: 3-31、95-105及124-130中之任一者之核苷酸1至951；或(vi) SEQ ID NO: 3-31、95-105及124-130中之任一者；且ApoE3相關蛋白包含SEQ ID NO: 34或35之胺基酸序列。

實施例12d進一步描述實施例1a，其中ApoE編碼核苷酸序列依5'至3'，包含： (a) 對應於SEQ ID NO: 1之核苷酸1至43的第一外顯子，其中第一外顯子與SEQ ID NO: 3-31、95-105或124-130中之任一者之核苷酸1至43具有至少85%之序列一致性，其限制條件為第一外顯子之末端3'核苷酸為G。在關於第一外顯子之其他實施例中，第一外顯子與SEQ ID NO: 3-31、95-105及124-130中之任一者之核苷酸1至43具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性；且在其他實施例中，序列一致性係相對於SEQ ID NO: 11、20及95-105中之任一者之核苷酸1至43； (b) 在對應於SEQ ID NO: 1之核苷酸43與44之間的位置處之第一內含子； (c) 對應於SEQ ID NO: 1之核苷酸44至236的第二外顯子；其中第二外顯子與SEQ ID NO: 3-31、95-105及124-130中之任一者之核苷酸44至236具有至少85%之序列一致性，其限制條件為第二外顯子之末端5'核苷酸為G且第二外顯子之末端3'核苷酸為AG。在關於第二外顯子之其他實施例中，第二外顯子與SEQ ID NO: 3-31、95-105及124-130中之任一者之核苷酸44至236具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性；且在其他實施例中，序列一致性係相對於SEQ ID NO: 11、20、95-105及124-130中之任一者之核苷酸44至236； (d) 在對應於SEQ ID NO: 1之核苷酸236與237之間的位置處之第二內含子； (e) 對應於SEQ ID NO: 1之核苷酸237至951的第三外顯子，其中第三外顯子與SEQ ID NO: 3-31、95-105及124-130中之任一者之核苷酸237至951具有至少85%之序列一致性，其限制條件為第三外顯子之末端5'核苷酸為G，其中第一、第二及第三外顯子一起編碼ApoE3相關蛋白。在關於第三外顯子之其他實施例中，第三外顯子與SEQ ID NO: 3-31、95-105及124-130中之任一者之核苷酸237至951具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性；且在其他實施例中，序列一致性係相對於SEQ ID NO: 11、20及95-105中之任一者之核苷酸237至951；其中ApoE相關蛋白包含與SEQ ID NO: 35至少95%一致之胺基酸序列，在其他實施例中，ApoE相關蛋白包含與SEQ ID NO: 35至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致之胺基酸序列，與SEQ ID NO: 35之差異為1、2、3、4或5個胺基酸，或包含SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35。

對於各序列，(a)、(b)、(c)、(d)及(e)內之各可能性可獨立地組合。舉例而言，(1)第一外顯子可獨立於第二及第三外顯子而與SEQ ID NO: 3-31、95-105及124-130中之任一者之核苷酸1至43具有至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性；(2)第二外顯子可獨立於第一及第三外顯子而與SEQ ID NO: 3-31、95-105及124-130中之任一者之核苷酸44至236具有至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性；及(3)第三外顯子可獨立於第一及第二外顯子而與SEQ ID NO: 3-31、95-105及124-130中之任一者之核苷酸44至236具有至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性。

實施例12e進一步描述實施例12d，其中第一內含子包含與SEQ ID NO: 119-122中之任一者具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性的序列，且第二內含子獨立地包含與SEQ ID NO: 119-122中之任一者具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之序列一致性的序列。

實施例12f進一步描述實施例12e，其中第一內含子係由SEQ ID NO: 119-121中之任一者之序列或與SEQ ID NO: 119-121中之任一者之差異為1至10個核苷酸之序列組成，且第二內含子獨立地由SEQ ID NO: 119-121中之任一者之序列或與SEQ ID NO: 119-121中之任一者之差異為1至10個核苷酸之序列組成。

實施例12g進一步描述實施例12d、12e及12f，其中，第一外顯子與SEQ ID NO: 11、20及95-105中之任一者之核苷酸1至43具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性；第二外顯子與SEQ ID NO: 11、20及95-105中之任一者之核苷酸44至236具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性；及第三外顯子與SEQ ID NO: 11、20及95-105中之任一者之核苷酸237至951具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性，其中ApoE相關蛋白與SEQ ID NO: 35具有至少98%之序列一致性。

實施例12h進一步描述實施例12g，其中ApoE編碼核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 106-115中之任一者具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性的序列。

實施例12i進一步描述實施例E12d、E12e、E12f、E12g及E12h，其中ApoE相關蛋白包含SEQ ID NO: 34或35之序列。

實施例E13進一步描述第一態樣、實施例E1a、E1b、E2a、E2b、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10a、E10b、E11、E12a、E12b、E12c、E12d、E12e、E12f、E12g、E12h及E12i，其中ApoE編碼核酸序列含有0至5、0至10或0至15個CpG；0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81及82個CpG；0%、約0.5%、約1.0%、約2.0%、約3.0%、約4.0%或約5.0%之CpG；及/或至多約0.5%、至多約1.0%、至多約2.0%、至多約3.0%、至多約4.0%或至多約5.0%之CpG。較佳為0至10、0至5或0個CpG。

實施例E14進一步描述實施例E1a、E1b、E2a、E2b、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10a、E10b、E11、E12a、E12b、E12c、E12d、E12e、E12f、E12g、E12h、E12i及E13，其中聚核苷酸為表現卡匣，其進一步包含可操作地連接至ApoE編碼核酸序列之一或多個表現控制元件。在其他實施例中，存在一或多個選自啟動子、啟動子/強化子、內含子、聚腺苷酸化信號及Kozak序列之表現控制元件。在其他實施例中，表現卡匣包含可操作地連接5'至ApoE編碼核酸序列之啟動子，及可操作地連接3'至編碼ApoE之核酸之聚腺苷酸化位點；或表現卡匣依5'至3'，包含可操作地連接至ApoE編碼核酸序列之啟動子、內含子、Kozak序列、ApoE編碼核酸序列及聚腺苷酸化信號。

實施例E15進一步描述實施例E14，其中啟動子為肝臟特異性啟動子。在另一實施例中，啟動子為hAAT。

實施例E16進一步描述實施例E14及E15，其中啟動子可操作地偶合至與SEQ ID NO: 58具有至少95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性的基於HCR1之強化子。

實施例E17進一步描述實施例E14，其中啟動子提供CNS細胞中之表現。在其他實施例中，啟動子為CAG啟動子、CBh啟動子、EF1α啟動子或人類突觸素(hSynapsin)啟動子。在其他實施例中，表現卡匣進一步包含抑制背根節、肝臟及/或免疫細胞表現之miRNA標靶序列。

實施例E18進一步描述實施例E14、E15、E16及E17，其中內含子包含SEQ ID NO: 60之序列。在另一實施例中，聚腺苷酸化信號包含SEQ ID NO: 61或SEQ ID NO: 62之序列。

實施例E19進一步描述實施例E14、E15、E16、E17及E18，其中表現卡匣進一步包含選擇性地靶向編碼ApoE2、ApoE3及ApoE4中之一或兩者之核酸的抑制性核酸。在其他實施例中，靶向ApoE2或靶向ApoE4。

實施例E20進一步描述實施例E14、E15、E16、E17、E18及E19，其中表現卡匣含有0至5、0至10、0至15、0至50或0至100個CpG中之任一者；0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81及82個CpG；0%、約0.5%、約1.0%、約2.0%、約3.0%、約4.0%、約5.0%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%或約15%之CpG；及/或至多約0.5%、至多約1.0%、至多約2.0%、至多約3.0%、至多約4.0%、至多約5.0%、至多約6%、至多約7%、至多約8%、至多約9%、至多約10%、至多約11%、至多約12%、至多約13%、至多約14%或至多約15%之CpG。

實施例E21進一步描述實施例E14、E15、E16、E17、E18、E19及E20，其中表現卡匣包含與SEQ ID NO: 76-80中之任一者具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的序列；包含與SEQ ID NO: 76-80中之任一者之差異為1至40個核苷酸、1至20個核苷酸或1至10個核苷酸的序列；或包含與經修飾之SEQ ID NO:76具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之序列一致性的序列，其中藉由用SEQ ID NO: 3-10、12-14、16-19、21-25、27-30、95-115及124-130中之任一者之序列置換核苷酸1295至2248來修飾SEQ ID NO:76。

實施例E22進一步描述E14、E15、E16、E17、E18、E19、E20及E21，其中聚核苷酸為重組病毒載體核酸，其包含表現卡匣及提供用於病毒封裝及/或複製之5'及/或3'病毒元件相關元件。在其他實施例中，重組病毒載體核酸為DNA；及/或基於AAV基因體且包含AAV 5'及3' ITR；重組病毒載體核酸為DNA且基於腺病毒基因體且包含5'及3' ITR及封裝信號；且重組病毒載體核酸為RNA且基於逆轉錄病毒基因體(例如慢病毒)且包含5'及3' LTR及封裝信號。提及「基於」病毒基因體指示複製及封裝於參考病毒之殼體中的能力。

實施例E23進一步描述E22，其中聚核苷酸為rAAV核酸，其包含側接聚核苷酸之5'末端及/或聚核苷酸之3'末端的ITR。在另一實施例中，ITR側接聚核苷酸之5'末端及3'末端。

實施例E24進一步描述E23，其中5'及/或3'病毒元件各自選自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.10、AAVrh.74及AAV3B。

實施例E25進一步描述E23，其中5' ITR包含與SEQ ID NO: 81、88、90、92及94中之任一者具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之序列一致性的序列，且3' ITR獨立地包含與SEQ ID NO: 82、89、91及93中之任一者具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性的序列。

實施例E26進一步描述E22、E23、E24及E25，其中重組病毒載體核酸含有0至5、0至10、0至15、0至50、0至100或0至150個CpG中之任一者；0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81及82個CpG；0%、約0.5%、約1.0%、約2.0%、約3.0%、約4.0%、約5.0%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%或約15%之CpG；及/或至多約0.5%、至多約1.0%、至多約2.0%、至多約3.0%、至多約4.0%、至多約5.0%、至多約6%、至多約7%、至多約8%、至多約9%、至多約10%、至多約11%、至多約12%、至多約13%、至多約14%或至多約15%之CpG。

實施例E27係關於一種基因遞送載具，其中基因遞送載具為包含如第一態樣、E1至E21中任一項之聚核苷酸或如E22至E26中任一項之重組病毒載體的病毒或非病毒載體。

實施例E28進一步描述E27，其中基因遞送載具為病毒載體。在其他實施例中，載具為rAAV載體、重組逆轉錄病毒(例如慢病毒)載體或重組腺病毒載體。

實施例E29進一步描述E28，其中病毒載體為重組AAV，且重組AAV載體包含殼體，該殼體包含與AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.74、AAV3B、AAV-2i8、AAVrh.10、AAVrh.8、AAVHSC、AAV-B1、AAV-AS、AAV1/rh.10、SEQ ID NO: 83及SEQ ID NO: 84中之任一者具有至少90%之序列一致性的VP1、VP2或VP3。在其他實施例中，重組AAV載體殼體包含與AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.74、AAV3B、AAV-2i8、AAVrh.10、AAVrh.8、AAVHSC、AAV-B1、AAV-AS、AAV1/rh.10、SEQ ID NO: 83及SEQ ID NO: 84中之任一者具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性的VP1、VP2或VP3。在另一實施例中，殼體包含：包含SEQ ID NO: 83之序列的VP1；包含SEQ ID NO: 122之序列的VP2；及包含SEQ ID NO: 123之序列的VP3。

實施例E30進一步描述E27，其中基因遞送載具為非病毒載體。在其他實施例中，非病毒載體為奈米粒子；為選自由以下組成之群的奈米粒子：脂質奈米粒子(LNP)、聚合物奈米粒子、脂質聚合物奈米粒子(LPNP)、基於蛋白質及肽之奈米粒子、基於DNA樹枝狀聚合物及DNA之奈米載體、碳奈米管、微粒、微膠囊、無機奈米粒子、肽籠奈米粒子及外泌體；為LPN；或為LPNP。

實施例E31係關於一種醫藥組合物，其包含如第一態樣、E1至E21中任一項之聚核苷酸、如E22至E26中任一項之重組病毒載體或如E27至E30中任一項之基因遞送載具；及醫藥學上可接受之載劑。

實施例E32進一步描述E31，其中組合物包含rAAV及空AAV殼體，且空AAV殼體與rAAV之比率為100:1至1:100。在其他實施例中，空AAV殼體與rAAV之比率為約100:1至50:1、約50:1至25:1、約25:1至10:1、約10:1至1:1、約1:1至1:10、約1:10至1:25、約1:25至1:50或約1:50至1:100。在其他實施例中，空AAV殼體與rAAV之比率為約2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。

本發明之第二態樣係關於一種降低膽固醇、降低LDL/VLDL、增加HDL或降低總膽固醇/HDL比率；或治療高膽固醇血症、III型家族性高脂蛋白血症、家族性高膽固醇血症、類澱粉腦血管病變、失智症、支架後再狹窄、動脈粥樣硬化、冠心病或阿茲海默氏病或降低該等病症之可能性的方法；該方法包含向個體投與有效量之如第一態樣、E1至E21中任一項之聚核苷酸、如E22至E26中任一項之重組病毒載體或如E27至E30中任一項之基因遞送載具，或如E31或E32之醫藥組合物。

實施例33進一步描述第二態樣，其中該方法降低有需要之個體之膽固醇、降低LDL/VLDL、增加HDL或降低總膽固醇/HDL比率。

實施例34進一步描述第二態樣或實施例E33，其中個體患有高膽固醇血症。

實施例35進一步描述第二態樣、實施例E33或E34，其中該方法治療個體之高膽固醇血症、III型家族性高脂蛋白血症、家族性高膽固醇血症、類澱粉腦血管病變、失智症、支架後再狹窄、動脈粥樣硬化、冠心病或阿茲海默氏病或降低該等病症之可能性。

實施例36進一步描述第二態樣、實施例E33、E34及E35，其中個體為斯他汀類藥物低反應者或對斯他汀類藥物不耐受。

實施例37進一步描述第二態樣，其中該方法係關於治療個體之阿茲海默氏病或降低該病症之可能性。

實施例38進一步描述第二態樣，其中該方法係關於治療個體之血管型失智症或額顳葉型失智症或降低該等病症之可能性。

實施例39a進一步描述實施例E37，其中投與包含腦實質內、腦池內或腦室內投與。

實施例39b進一步描述第二態樣及實施例E37、E36、E37及E38，其中投與包含靜脈內投與。

實施例40進一步描述第二態樣、實施例E33、E34、E35、E37、E38、E39a及E39b，其中個體具有至少一個ApoE4對偶基因，為EpoE4同型合子，或為 PSEN1突變攜帶者。

實施例41進一步描述第二態樣、實施例E33、E34、E35、E36、E37、E38、E39a、E39b及E40，其中天然ApoE表現受抑制。在其他實施例中，使用抑制性核酸來抑制天然ApoE表現；且抑制性核酸係選自短髮夾RNA (shRNA)、短小干擾RNA (siRNA)、微小RNA (miRNA)、RNAi、核糖核酸酶及反義RNA。

實施例42進一步描述第二態樣、實施例E33、E34、E35、E36、E37、E38、E39a、E39b、E40及E41，其中個體為人類。

第三態樣係關於如第一態樣、實施例E1至E21中任一項之聚核苷酸、如實施例E22至E26中任一項之重組病毒載體、如實施例E27至E30中任一項之基因遞送載具或如實施例E31或E32之醫藥組合物，其用於醫學及在第二態樣及實施例E33至E42中任一項中所提供之方法中之任一者中。

第四態樣係關於如第一態樣、實施例E1至E21中任一項之多肽、如實施例E22至E26中任一項之重組病毒載體、如實施例E27至E30中任一項之基因遞送載具或如實施例E31或E32之醫藥組合物的用途，其用於製備用於醫學中或如第二態樣及實施例E33至42中任一項中所提供的藥劑。

第五態樣係關於一種AAV載體基因體質體，其包含如實施例E22至26中任一項之重組病毒核酸。

實施例43進一步描述第五態樣，其中質體缺乏 rep及 cap基因。

第六態樣係關於一種產生rAAV載體之方法，該方法包含以下步驟：培養包含rAAV輔助病毒活性之rAAV生產細胞株，其中生產細胞之基因體包含如實施例E22至26中任一項之重組病毒載體核酸、 rep基因及 cap基因，其中產生rAAV載體。

實施例44係關於一種產生rAAV載體之方法，該方法包含以下步驟：培養包含如第六態樣或實施例43之AAV基因體質體的rAAV容許細胞，其中rAAV容許細胞進一步包含(a)作為細胞基因體之一部分及/或由一或多個獨立質體提供之 rep及 cap基因，及(b)由細胞基因體提供及/或由一或多個獨立質體提供之輔助病毒活性。

實施例45進一步描述實施例44，其中rAAV容許細胞為封裝細胞，其中封裝之基因體包含 cap基因及 rep基因。

實施例46進一步描述實施例44，其中(a) rep基因、 cap基因及輔助活性提供於單個質體中或(b) rep基因及該 cap基因係由 rep/ cap質體提供且輔助活性係由輔助質體提供。

第七態樣係關於一種獲得rAAV載體之方法，該方法包含以下步驟：(a)使用如第六態樣或實施例44至46中任一項之方法產生rAAV；及(b)純化rAAV。

第八態樣係關於一種聚核苷酸，其包含與SEQ ID NO: 119-121中之任一者之序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性的序列，其中聚核苷酸具有0至5個CpG。較佳地，聚核苷酸為可自由剪接體介導之mRNA前驅體轉錄本切除的內含子。

實施例47進一步描述第八態樣，其中聚核苷酸包含SEQ ID NO: 119-121中之任一者之序列，或與SEQ ID NO: 119-121中之任一者之差異為1至10個核苷酸之序列，其中聚核苷酸無CpG。在另一實施例中，聚核苷酸係由SEQ ID NO: 119-121中之任一者之序列組成。

XI. 序列

表1提供不同之核酸及胺基酸序列。以粗體指示之序列提供密碼子。

在不同實施例中，(1)聚核苷酸包含與表1中所提供之核酸序列中之任一者具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性的核酸序列；(2)聚核苷酸包含與表1中所提供之核酸序列中之任一者具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性的核酸序列，其中以粗體展示之終止密碼子並不存在及/或經不同終止密碼子置換；或(3)聚核苷酸包含與表1中所提供之胺基酸序列中之任一者具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性的胺基酸序列。

表 1

ApoE編碼序列

天然ApoE3 (SEQ ID NO: 1) ATGAAGGTTCTGTGGGCTGCGTTGCTGGTCACATTCCTGGCAGGATGCCAGGCCAAGGTGGAGCAAGCGGTGGAGACAGAGCCGGAGCCCGAGCTGCGCCAGCAGACCGAGTGGCAGAGCGGCCAGCGCTGGGAACTGGCACTGGGTCGCTTTTGGGATTACCTGCGCTGGGTGCAGACACTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTCAGCTCCCAGGTCACCCAGGAACTGAGGGCGCTGATGGACGAGACCATGAAGGAGTTGAAGGCCTACAAATCGGAACTGGAGGAACAACTGACCCCGGTGGCGGAGGAGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCATGCTCGGCCAGAGCACCGAGGAGCTGCGGGTGCGCCTCGCCTCCCACCTGCGCAAGCTGCGTAAGCGGCTCCTCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGCGCCTGGCAGTGTACCAGGCCGGGGCCCGCGAGGGCGCCGAGCGCGGCCTCAGCGCCATCCGCGAGCGCCTGGGGCCCCTGGTGGAACAGGGCCGCGTGCGGGCCGCCACTGTGGGCTCCCTGGCCGGCCAGCCGCTACAGGAGCGGGCCCAGGCCTGGGGCGAGCGGCTGCGCGCGCGGATGGAGGAGATGGGCAGCCGGACCCGCGACCGCCTGGACGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCGGAGGTGCGCGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATACGCCTGCAGGCCGAGGCCTTCCAGGCCCGCCTCAAGAGCTGGTTCGAGCCCCTGGTGGAAGACATGCAGCGCCAGTGGGCCGGGCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCCGTGGGCACCAGCGCCGCCCCTGTGCCCAGCGACAATCAC TGA

天然ApoE3ch (SEQ ID NO: 2) ATGAAGGTTCTGTGGGCTGCGTTGCTGGTCACATTCCTGGCAGGATGCCAGGCCAAGGTGGAGCAAGCGGTGGAGACAGAGCCGGAGCCCGAGCTGCGCCAGCAGACCGAGTGGCAGAGCGGCCAGCGCTGGGAACTGGCACTGGGTCGCTTTTGGGATTACCTGCGCTGGGTGCAGACACTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTCAGCTCCCAGGTCACCCAGGAACTGAGGGCGCTGATGGACGAGACCATGAAGGAGTTGAAGGCCTACAAATCGGAACTGGAGGAACAACTGACCCCGGTGGCGGAGGAGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTGCAGTACAGCGGCGAGGTGCAGGCCATGCTCGGCCAGAGCACCGAGGAGCTGCGGGTGCGCCTCGCCTCCCACCTGCGCAAGCTGCGTAAGCGGCTCCTCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGCGCCTGGCAGTGTACCAGGCCGGGGCCCGCGAGGGCGCCGAGCGCGGCCTCAGCGCCATCCGCGAGCGCCTGGGGCCCCTGGTGGAACAGGGCCGCGTGCGGGCCGCCACTGTGGGCTCCCTGGCCGGCCAGCCGCTACAGGAGCGGGCCCAGGCCTGGGGCGAGCGGCTGCGCGCGCGGATGGAGGAGATGGGCAGCCGGACCCGCGACCGCCTGGACGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCGGAGGTGCGCGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATACGCCTGCAGGCCGAGGCCTTCCAGGCCCGCCTCAAGAGCTGGTTCGAGCCCCTGGTGGAAGACATGCAGCGCCAGTGGGCCGGGCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCCGTGGGCACCAGCGCCGCCCCTGTGCCCAGCGACAATCAC TGA

ApoE3ch-1 (SEQ ID NO: 3) ATGAAGGTGCTGTGGGCTGCCCTGCTGGTGACTTTCCTGGCTGGCTGCCAGGCTAAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAGCCTGAGCTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGGCAGAGGTGGGAGCTGGCCCTGGGCAGGTTCTGGGACTATCTGAGGTGGGTGCAGACCCTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGAGCTCTCAGGTGACTCAGGAGCTGAGGGCCCTGATGGATGAGACCATGAAGGAGCTGAAGGCTTACAAGTCTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAGGAGACCAGAGCCAGGCTGAGCAAGGAGCTGCAGGCTGCTCAGGCTAGGCTGGGGGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGCAGGCTGGTGCAGTACTCTGGGGAGGTGCAGGCCATGCTGGGCCAGAGCACTGAGGAGCTGAGGGTGAGGCTGGCTTCTCACCTGAGGAAGCTGAGAAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGATCTGCAGAAGAGGCTGGCTGTGTACCAGGCTGGGGCCAGGGAAGGGGCTGAGAGGGGCCTGTCTGCCATTAGGGAGAGGCTGGGGCCCCTGGTGGAGCAGGGGAGGGTGAGGGCTGCCACTGTGGGCTCTCTGGCTGGCCAGCCCCTGCAGGAGAGAGCCCAGGCTTGGGGGGAGAGGCTGAGGGCCAGGATGGAGGAGATGGGCTCTAGGACCAGGGATAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTCAGGGCTAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATCAGGCTGCAGGCTGAGGCCTTCCAGGCCAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCTGGGCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGGACCTCTGCTGCCCCTGTGCCCTCTGACAATCAC TGA

ApoE3ch-2 (SEQ ID NO: 4) ATGAAGGTGCTGTGGGCTGCCCTGCTGGTGACCTTCCTGGCTGGCTGCCAGGCCAAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAGCCTGAGCTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGCCAGAGGTGGGAGCTGGCCCTGGGCAGATTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTGCAGACCCTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGAGCAGCCAGGTGACCCAGGAGCTGAGGGCCCTGATGGATGAGACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTATAAGTCTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAGGAGACCAGGGCTAGGCTGAGCAAGGAGCTGCAGGCTGCCCAGGCTAGGCTGGGGGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGGAGGCTGGTGCAGTACTCTGGGGAGGTGCAGGCCATGCTGGGCCAGAGCACTGAGGAGCTGAGGGTGAGGCTGGCCAGCCACCTGAGGAAGCTGAGAAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGATCTGCAGAAGAGACTGGCTGTGTACCAGGCTGGGGCCAGGGAGGGGGCTGAAAGGGGCCTGTCTGCTATCAGAGAGAGGCTGGGCCCCCTGGTGGAGCAGGGCAGGGTGAGGGCTGCCACTGTGGGCAGCCTGGCTGGGCAGCCCCTGCAGGAAAGAGCCCAGGCTTGGGGGGAGAGACTGAGGGCCAGGATGGAGGAGATGGGCAGCAGGACTAGGGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGAGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATCAGGCTGCAGGCTGAGGCCTTCCAGGCCAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAGGATATGCAGAGACAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGCACCTCTGCTGCCCCTGTGCCTTCTGACAACCAT TGA

ApoE3ch-3 (SEQ ID NO: 5) ATGAAGGTGCTGTGGGCTGCCCTGCTGGTGACCTTTCTGGCTGGGTGCCAGGCCAAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAGCCTGAGCTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGGCAGAGGTGGGAGCTGGCCCTGGGGAGGTTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTGCAGACTCTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGTCTAGCCAGGTGACCCAGGAGCTGAGGGCCCTGATGGATGAGACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGTCTGAGCTGGAAGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAGGAGACCAGGGCTAGGCTGAGCAAGGAACTGCAGGCTGCTCAGGCCAGGCTGGGGGCTGACATGGAAGATGTGTGTGGGAGGCTGGTGCAGTACTCTGGGGAGGTGCAGGCCATGCTGGGCCAGAGCACTGAGGAGCTGAGGGTGAGGCTGGCCAGCCACCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGGCTGGCTGTGTACCAGGCTGGGGCCAGGGAGGGGGCTGAGAGGGGCCTGTCTGCTATCAGGGAGAGGCTGGGCCCCCTGGTGGAGCAGGGCAGGGTGAGGGCTGCCACTGTGGGCAGCCTGGCTGGGCAGCCTCTGCAGGAGAGGGCCCAGGCCTGGGGGGAGAGGCTGAGAGCCAGGATGGAGGAGATGGGCTCTAGGACTAGGGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCTCAGCAGATCAGGCTGCAGGCTGAGGCTTTCCAGGCCAGGCTGAAGTCTTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAGGATATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGCACCTCTGCTGCCCCTGTGCCCTCTGACAACCAT TGA

ApoE3ch-4 (SEQ ID NO: 6) ATGAAGGTGCTGTGGGCTGCCCTGCTGGTGACCTTCCTGGCTGGCTGTCAGGCCAAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAGCCAGAGCTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGGCAGAGGTGGGAGCTGGCTCTGGGGAGGTTCTGGGACTACCTGAGATGGGTGCAGACCCTGTCTGAACAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGAGCAGCCAGGTGACCCAGGAGCTGAGAGCCCTGATGGATGAGACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGTCTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACTCCTGTGGCTGAGGAGACTAGGGCCAGGCTGTCTAAGGAGCTGCAGGCTGCCCAGGCCAGGCTGGGGGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGCAGGCTGGTGCAGTACTCTGGGGAGGTCCAGGCCATGCTGGGCCAGAGCACTGAGGAGCTGAGGGTGAGGCTGGCCAGCCACCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAAAGGCTGGCTGTGTACCAGGCTGGGGCCAGGGAGGGGGCTGAGAGAGGGCTGTCTGCCATTAGAGAGAGGCTGGGCCCCCTGGTGGAGCAGGGCAGGGTGAGGGCTGCTACTGTGGGCAGCCTGGCTGGGCAGCCTCTGCAGGAGAGGGCCCAGGCCTGGGGGGAGAGGCTGAGGGCTAGGATGGAGGAGATGGGCTCTAGGACCAGGGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATCAGGCTGCAGGCTGAGGCCTTCCAGGCTAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCTGGGCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGGACCTCTGCTGCTCCTGTGCCCTCTGACAACCAC TGA

ApoE3ch-5 (SEQ ID NO: 7) ATGAAGGTGCTGTGGGCTGCCCTGCTGGTGACCTTCCTGGCTGGGTGCCAGGCTAAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAACCTGAACTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGCCAGAGGTGGGAGCTGGCTCTGGGGAGGTTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTGCAGACTCTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGAGCAGCCAGGTGACCCAGGAGCTGAGGGCCCTGATGGATGAGACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGTCTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAGGAAACCAGGGCCAGGCTGTCTAAGGAGCTGCAGGCTGCTCAGGCTAGGCTGGGGGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGGAGACTGGTGCAGTATTCTGGGGAGGTGCAGGCCATGCTGGGCCAGAGCACTGAGGAGCTGAGGGTGAGGCTGGCTAGCCACCTGAGAAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGATCTGCAGAAGAGGCTGGCTGTGTATCAGGCTGGGGCCAGGGAGGGGGCTGAGAGGGGCCTGTCTGCCATCAGAGAGAGGCTGGGGCCTCTGGTGGAGCAGGGCAGGGTGAGGGCTGCTACTGTGGGCAGCCTGGCTGGCCAGCCCCTGCAGGAGAGGGCCCAGGCCTGGGGGGAGAGGCTGAGGGCTAGGATGGAGGAGATGGGCAGCAGAACCAGGGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGAGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCTCAGCAGATCAGGCTGCAGGCTGAGGCTTTCCAGGCTAGGCTGAAGTCTTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAAGATATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGCACCTCTGCTGCCCCTGTGCCCTCTGACAATCAT TGA

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APOE3-5 (SEQ ID NO: 22) ATGAAGGTCCTGTGGGCTGCCCTGCTGGTGACCTTCCTGGCTGGCTGCCAGGCCAAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAGCCTGAGCTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGGCAGAGGTGGGAGCTGGCCCTGGGCAGGTTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTGCAGACTCTGTCTGAACAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGAGCAGCCAGGTGACCCAGGAGCTGAGGGCCCTGATGGATGAGACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTATAAGTCTGAACTGGAGGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAGGAGACTAGGGCCAGGCTGAGCAAGGAGCTGCAGGCTGCTCAGGCCAGACTGGGGGCTGACATGGAGGATGTCTGTGGCAGACTGGTGCAGTACAGGGGGGAGGTGCAGGCTATGCTGGGGCAGAGCACTGAGGAGCTGAGGGTGAGGCTGGCCAGCCACCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGATCTGCAGAAGAGACTGGCTGTGTACCAGGCTGGGGCCAGAGAGGGGGCTGAGAGGGGGCTGTCTGCCATTAGGGAGAGACTGGGCCCCCTGGTGGAGCAGGGCAGGGTGAGGGCTGCCACTGTGGGCTCTCTGGCTGGCCAGCCTCTGCAGGAGAGGGCTCAGGCCTGGGGGGAGAGGCTGAGGGCTAGAATGGAGGAGATGGGGAGCAGGACCAGGGACAGGCTGGATGAGGTGAAAGAGCAGGTGGCTGAGGTCAGGGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATCAGGCTGCAGGCTGAGGCTTTCCAGGCTAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAGGATATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGCACTTCTGCTGCTCCTGTGCCCTCTGATAACCAC TGA

APOE3-6 (SEQ ID NO: 23) ATGAAGGTGCTGTGGGCTGCCCTGCTGGTGACCTTCCTGGCTGGCTGCCAGGCCAAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAGCCTGAACTGAGGCAGCAGACTGAATGGCAGTCTGGCCAGAGGTGGGAGCTGGCCCTGGGCAGATTCTGGGATTACCTGAGGTGGGTGCAGACCCTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAACTGCTGAGCAGCCAGGTGACTCAGGAGCTGAGGGCCCTGATGGATGAGACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTATAAATCTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAGGAGACTAGGGCCAGACTGTCTAAGGAGCTGCAGGCTGCCCAGGCCAGGCTGGGGGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGCAGGCTGGTGCAGTACAGGGGGGAGGTGCAGGCCATGCTGGGCCAGTCTACTGAGGAGCTGAGGGTGAGGCTGGCCAGCCACCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGGCTGGCTGTGTACCAGGCTGGGGCCAGGGAGGGGGCTGAGAGGGGCCTGTCTGCCATCAGAGAGAGGCTGGGCCCCCTGGTGGAGCAGGGCAGGGTGAGGGCTGCCACTGTGGGCTCCCTGGCTGGCCAGCCCCTGCAGGAGAGGGCCCAGGCCTGGGGGGAGAGGCTGAGGGCCAGGATGGAGGAGATGGGCAGCAGGACCAGAGACAGGCTGGATGAGGTCAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATCAGACTGCAGGCTGAGGCCTTCCAGGCTAGGCTGAAGTCTTGGTTTGAGCCACTGGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAAAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGCACCTCTGCTGCCCCTGTGCCCTCTGACAATCAC TGA

APOE3-7 (SEQ ID NO: 24) ATGAAGGTGCTGTGGGCTGCCCTGCTGGTGACCTTCCTGGCTGGCTGCCAGGCTAAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAGCCTGAGCTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGGCAGAGGTGGGAGCTGGCCCTGGGGAGGTTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTGCAGACTCTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGAGCTCTCAGGTGACTCAGGAGCTGAGGGCCCTGATGGATGAGACTATGAAGGAGCTGAAGGCTTACAAGTCTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACTCCTGTGGCTGAGGAGACCAGGGCCAGGCTGTCTAAGGAGCTGCAGGCTGCCCAGGCCAGACTGGGGGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGCAGGCTGGTGCAGTACAGGGGGGAGGTGCAGGCTATGCTGGGGCAGAGCACTGAGGAGCTGAGGGTGAGGCTGGCCAGCCATCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGACTGGCTGTGTATCAGGCTGGGGCCAGGGAAGGGGCTGAGAGGGGCCTGTCTGCCATCAGGGAGAGGCTGGGCCCCCTGGTGGAACAGGGGAGGGTGAGGGCTGCCACTGTGGGCAGCCTGGCTGGCCAGCCCCTGCAGGAGAGGGCTCAGGCTTGGGGGGAGAGGCTGAGGGCCAGGATGGAGGAGATGGGCAGCAGGACCAGGGATAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCTAAGCTGGAGGAGCAGGCTCAGCAGATCAGGCTGCAGGCTGAGGCTTTCCAGGCCAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTCCAGGCTGCTGTGGGCACTTCTGCTGCCCCTGTGCCCTCTGACAACCAT TGA

APOE3-8 (SEQ ID NO: 25) ATGAAGGTGCTGTGGGCTGCTCTGCTGGTGACCTTCCTGGCTGGCTGCCAGGCCAAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAGCCTGAGCTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGCCAGAGGTGGGAGCTGGCCCTGGGGAGGTTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTGCAGACCCTGTCTGAGCAGGTCCAGGAAGAGCTGCTGTCTTCTCAGGTGACCCAGGAACTGAGGGCCCTGATGGATGAGACCATGAAGGAACTGAAGGCCTACAAGTCTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAGGAGACCAGGGCTAGGCTGAGCAAGGAGCTGCAGGCTGCTCAGGCCAGGCTGGGGGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGGAGGCTGGTGCAGTACAGGGGGGAGGTGCAGGCCATGCTGGGCCAGAGCACTGAGGAGCTGAGGGTGAGACTGGCCAGCCATCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGGCTGGCTGTGTACCAGGCTGGGGCCAGGGAGGGGGCTGAGAGGGGCCTGTCTGCTATTAGGGAGAGGCTGGGCCCCCTGGTGGAGCAGGGGAGGGTGAGGGCTGCCACTGTGGGCAGCCTGGCTGGCCAGCCCCTGCAGGAGAGGGCCCAGGCCTGGGGGGAGAGGCTGAGGGCCAGGATGGAGGAGATGGGCAGCAGGACCAGGGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATCAGGCTGCAGGCTGAGGCCTTCCAGGCCAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGGACCTCTGCTGCCCCTGTGCCTTCTGACAACCAC TGA

APOE3-9 (SEQ ID NO: 26) ATGAAAGTGCTGTGGGCTGCTCTGCTGGTGACCTTCCTGGCTGGGTGCCAGGCCAAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAGCCTGAGCTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGCCAGAGGTGGGAGCTGGCCCTGGGGAGGTTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTGCAGACTCTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGTCTAGCCAGGTGACCCAGGAGCTGAGAGCCCTGATGGATGAGACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGTCTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAGGAGACCAGAGCTAGGCTGTCTAAGGAGCTGCAGGCTGCTCAGGCCAGGCTGGGGGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGCAGGCTGGTGCAGTATAGGGGGGAGGTCCAGGCCATGCTGGGGCAGAGCACTGAGGAGCTGAGGGTGAGGCTGGCCAGCCATCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGACTGGCTGTGTACCAGGCTGGGGCCAGGGAGGGGGCTGAGAGGGGCCTGTCTGCCATCAGGGAGAGGCTGGGGCCTCTGGTGGAGCAGGGCAGGGTGAGGGCTGCCACTGTGGGCTCTCTGGCTGGCCAGCCCCTGCAGGAGAGGGCCCAGGCTTGGGGGGAGAGGCTGAGAGCCAGAATGGAGGAGATGGGCAGCAGGACCAGGGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATCAGGCTGCAGGCTGAGGCCTTTCAGGCCAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAACCCCTGGTGGAGGACATGCAGAGACAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGCACCTCTGCTGCCCCTGTGCCCTCTGATAACCAC TGA

APOE3-10 (SEQ ID NO: 27) ATGAAGGTGCTGTGGGCTGCCCTGCTGGTGACCTTTCTGGCTGGGTGCCAGGCTAAAGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAGCCTGAGCTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGCCAGAGGTGGGAGCTGGCTCTGGGCAGGTTCTGGGACTATCTGAGGTGGGTGCAGACTCTGTCTGAACAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGAGCTCTCAGGTGACCCAGGAGCTGAGGGCTCTGATGGATGAGACTATGAAGGAACTGAAGGCCTACAAGTCTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAGGAGACTAGGGCTAGGCTGAGCAAGGAGCTGCAGGCTGCCCAGGCCAGACTGGGGGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGCAGGCTGGTGCAGTACAGGGGGGAGGTGCAGGCTATGCTGGGGCAGAGCACTGAGGAGCTGAGGGTGAGGCTGGCCTCTCATCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGGCTGGCTGTGTACCAGGCTGGGGCCAGGGAGGGGGCTGAGAGGGGCCTGTCTGCCATCAGGGAGAGGCTGGGCCCCCTGGTGGAGCAGGGGAGGGTGAGGGCTGCCACTGTGGGCAGCCTGGCTGGCCAGCCCCTGCAGGAGAGGGCTCAGGCCTGGGGGGAGAGACTGAGGGCTAGAATGGAGGAGATGGGGAGCAGGACCAGGGATAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATCAGGCTGCAGGCTGAGGCCTTTCAGGCCAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAAGATATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGCACCTCTGCTGCCCCTGTGCCCTCTGACAACCAC TGA

APOE3-11 (SEQ ID NO: 28) ATGAAGGTGCTGTGGGCTGCCCTGCTGGTGACCTTTCTGGCTGGGTGCCAGGCTAAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAGCCTGAACTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGCCAGAGGTGGGAGCTGGCCCTGGGCAGGTTCTGGGACTATCTGAGGTGGGTGCAGACCCTGTCTGAGCAGGTGCAGGAAGAGCTGCTGAGCTCTCAGGTGACTCAGGAGCTGAGGGCCCTGATGGATGAGACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGTCTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACTCCTGTGGCTGAAGAGACCAGGGCCAGGCTGAGCAAGGAGCTGCAGGCTGCCCAGGCTAGGCTGGGGGCTGATATGGAGGATGTGTGTGGGAGACTGGTGCAGTACAGGGGGGAGGTCCAGGCTATGCTGGGCCAGAGCACTGAGGAGCTGAGGGTGAGGCTGGCCTCTCACCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGACTGGCTGTGTACCAGGCTGGGGCTAGGGAGGGGGCTGAGAGGGGGCTGTCTGCTATCAGGGAGAGGCTGGGGCCTCTGGTGGAGCAGGGCAGGGTGAGGGCTGCCACTGTGGGCAGCCTGGCTGGCCAGCCCCTGCAGGAGAGGGCCCAGGCCTGGGGGGAGAGGCTGAGGGCCAGGATGGAGGAGATGGGGAGCAGGACCAGGGATAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCTAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATTAGGCTGCAGGCTGAGGCCTTTCAGGCTAGGCTGAAGTCTTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGCACCTCTGCTGCCCCTGTGCCCTCTGACAACCAC TGA

APOE3-12 (SEQ ID NO: 29) ATGAAGGTGCTGTGGGCTGCCCTGCTGGTGACTTTCCTGGCTGGCTGCCAGGCCAAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAGCCTGAGCTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGCCAGAGGTGGGAGCTGGCCCTGGGCAGGTTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTGCAGACCCTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGAGCAGCCAGGTGACTCAGGAGCTGAGGGCCCTGATGGATGAGACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAATCTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAGGAGACCAGGGCCAGGCTGAGCAAGGAGCTGCAGGCTGCTCAGGCCAGGCTGGGGGCTGATATGGAGGATGTGTGTGGCAGGCTGGTGCAGTACAGGGGGGAGGTGCAGGCCATGCTGGGCCAGAGCACTGAGGAGCTGAGGGTGAGGCTGGCCAGCCATCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGACTGCTGAGGGATGCTGATGATCTGCAGAAGAGGCTGGCTGTGTACCAGGCTGGGGCCAGGGAGGGGGCTGAGAGGGGCCTGTCTGCCATCAGGGAGAGGCTGGGCCCCCTGGTGGAGCAGGGCAGGGTGAGGGCTGCCACTGTGGGCAGCCTGGCTGGCCAGCCTCTGCAGGAGAGGGCCCAGGCTTGGGGGGAGAGACTGAGGGCCAGGATGGAAGAGATGGGGTCTAGGACCAGGGATAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCCAAGCTGGAGGAACAGGCTCAGCAGATCAGGCTGCAGGCTGAGGCCTTCCAGGCCAGACTGAAGAGCTGGTTTGAGCCTCTGGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAAGTGCAGGCTGCTGTGGGCACTTCTGCTGCCCCTGTGCCCTCTGACAACCAC TGA

APOE3-13 (SEQ ID NO: 30) ATGAAGGTGCTGTGGGCTGCCCTGCTGGTGACTTTCCTGGCTGGCTGCCAGGCCAAGGTGGAGCAGGCTGTGGAAACTGAGCCTGAGCCTGAGCTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGCCAGAGGTGGGAGCTGGCTCTGGGCAGGTTTTGGGACTACCTGAGGTGGGTGCAGACCCTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGAGCAGCCAGGTGACCCAGGAGCTGAGAGCCCTGATGGATGAGACCATGAAGGAGCTGAAGGCTTACAAGTCTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACTCCTGTGGCTGAGGAGACCAGGGCTAGGCTGTCTAAGGAGCTGCAGGCTGCTCAGGCTAGGCTGGGGGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGCAGACTGGTGCAGTACAGGGGGGAGGTGCAGGCTATGCTGGGCCAGAGCACTGAGGAACTGAGGGTGAGGCTGGCCAGCCACCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGGCTGGCTGTGTACCAGGCTGGGGCCAGGGAGGGGGCTGAGAGGGGCCTGTCTGCCATCAGGGAGAGGCTGGGGCCTCTGGTGGAGCAGGGCAGGGTCAGGGCTGCCACTGTGGGCAGCCTGGCTGGCCAGCCCCTGCAGGAGAGGGCCCAGGCTTGGGGGGAGAGGCTGAGAGCTAGGATGGAGGAGATGGGCAGCAGGACTAGGGATAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCTAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATCAGGCTGCAGGCTGAGGCCTTTCAGGCCAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAGCCTCTGGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGGACCTCTGCTGCCCCTGTGCCCTCTGACAACCAT TGA

APOE3-15 (SEQ ID NO: 31) ATGAAGGTGCTGTGGGCTGCTCTGCTGGTGACCTTCCTGGCTGGCTGCCAGGCTAAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAGCCTGAGCTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGGCAGAGGTGGGAGCTGGCCCTGGGCAGGTTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTGCAGACCCTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGTCTAGCCAGGTGACCCAGGAACTGAGGGCCCTGATGGATGAGACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGTCTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAGGAGACCAGGGCCAGGCTGTCTAAGGAGCTGCAGGCTGCCCAGGCCAGGCTGGGGGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGCAGGCTGGTGCAGTATAGGGGGGAGGTGCAGGCTATGCTGGGCCAGAGCACTGAGGAGCTGAGGGTCAGGCTGGCCAGCCACCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGGCTGGCTGTGTACCAGGCTGGGGCCAGGGAGGGGGCTGAGAGGGGCCTGTCTGCCATCAGGGAGAGGCTGGGCCCTCTGGTGGAGCAGGGGAGGGTGAGGGCTGCCACTGTGGGCAGCCTGGCTGGCCAGCCCCTGCAGGAAAGGGCCCAGGCCTGGGGGGAGAGACTGAGGGCCAGGATGGAGGAGATGGGCAGCAGGACCAGAGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATTAGGCTGCAGGCTGAGGCCTTCCAGGCCAGGCTGAAGTCTTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAAGATATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGGACCTCTGCTGCTCCTGTGCCCTCTGACAACCAC TGA

ApoE多肽

成熟APOE3 SEQ ID NO: 32 (胺基酸序列) KVEQAVETEPEPELRQQTEWQSGQRWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEELLSSQVTQELRALMDETMKELKAYKSELEEQLTPVAEETRARLSKELQAAQARLGADMEDVCGRLVQYRGEVQAMLGQSTEELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQAGAREGAERGLSAIRERLGPLVEQGRVRAATVGSLAGQPLQERAQAWGERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAEVRAKLEEQAQQIRLQAEAFQARLKSWFEPLVEDMQRQWAGLVEKVQAAVGTSAAPVPSDNH

成熟APOE3ch (SEQ ID NO: 33) (胺基酸序列) KVEQAVETEPEPELRQQTEWQSGQRWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEELLSSQVTQELRALMDETMKELKAYKSELEEQLTPVAEETRARLSKELQAAQARLGADMEDVCGRLVQYSGEVQAMLGQSTEELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQAGAREGAERGLSAIRERLGPLVEQGRVRAATVGSLAGQPLQERAQAWGERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAEVRAKLEEQAQQIRLQAEAFQARLKSWFEPLVEDMQRQWAGLVEKVQAAVGTSAAPVPSDNH

全長APOE (SEQ ID NO: 34) (胺基酸序列) MKVLWAALLVTFLAGCQAKVEQAVETEPEPELRQQTEWQSGQRWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEELLSSQVTQELRALMDETMKELKAYKSELEEQLTPVAEETRARLSKELQAAQARLGADMEDVCGRLVQYRGEVQAMLGQSTEELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQAGAREGAERGLSAIRERLGPLVEQGRVRAATVGSLAGQPLQERAQAWGERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAEVRAKLEEQAQQIRLQAEAFQARLKSWFEPLVEDMQRQWAGLVEKVQAAVGTSAAPVPSDNH

全長APOE3ch (SEQ ID NO: 35) (胺基酸序列) MKVLWAALLVTFLAGCQAKVEQAVETEPEPELRQQTEWQSGQRWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEELLSSQVTQELRALMDETMKELKAYKSELEEQLTPVAEETRARLSKELQAAQARLGADMEDVCGRLVQYSGEVQAMLGQSTEELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQAGAREGAERGLSAIRERLGPLVEQGRVRAATVGSLAGQPLQERAQAWGERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAEVRAKLEEQAQQIRLQAEAFQARLKSWFEPLVEDMQRQWAGLVEKVQAAVGTSAAPVPSDNH

信號

Sp7 (SEQ ID NO: 36) MAFLWLLSCWALLGTTFG

Sp7_1 (SEQ ID NO: 37) ATGGCCTTCCTGTGGCTGCTGTCCTGCTGGGCACTGCTGGGCACCACATTTGGC

Sp7_2 (SEQ ID NO: 38) ATGGCCTTTCTGTGGCTGCTGTCCTGCTGGGCCCTGCTGGGGACCACCTTTGGC

Sp7_3 (SEQ ID NO: 39) ATGGCCTTCCTGTGGCTGCTGAGCTGCTGGGCCCTGCTGGGGACCACCTTTGGG

Sp7_4 (SEQ ID NO: 40) ATGGCCTTCCTGTGGCTCCTGAGCTGCTGGGCCCTCCTGGGGACCACCTTTGGG

Sp7_5 (SEQ ID NO: 41) ATGGCCTTCCTGTGGCTGCTGAGCTGCTGGGCCCTGCTGGGGACCACATTTGGC

AHSG (SEQ ID NO: 42) MKSLVLLLCLAQLWGCHS

AHSG (SEQ ID NO: 43) ATGAAGTCCCTCGTCCTGCTCCTTTGTCTTGCTCAGCTCTGGGGCTGCCACTCA

CD300 (SEQ ID NO: 44) MWLPWALLLLWVPGCFA

CD300 (SEQ ID NO: 45) ATGTGGCTGCCTTGGGCTCTGTTGCTTCTCTGGGTCCCAGGATGTTTTGCT

GLA (SEQ ID NO: 46) MQLRNPELHLGCALALRFLALVSWDIPGARA

GLA (SEQ ID NO: 47) ATGCAGCTGAGGAACCCAGAACTACATCTGGGCTGCGCGCTTGCGCTTCGCTTCCTGGCCCTCGTTTCCTGGGACATCCCTGGGGCTAGAGCA

LAMP1 (SEQ ID NO: 48) MAAPGSARRPLLLLLLLLLLGLMHCASA

LAMP1 (SEQ ID NO: 49) ATGGCGGCCCCCGGCAGCGCCCGGCGACCCCTGCTGCTGCTACTGCTGTTGCTGCTGCTCGGCCTCATGCATTGTGCGTCAGCA

Notch2 (SEQ ID NO: 50) MPALRPALLWALLALWLCCAAPAHA

Notch2 (SEQ ID NO: 51) ATGCCCGCCCTGCGCCCCGCTCTGCTGTGGGCGCTGCTGGCGCTCTGGCTGTGCTGCGCGGCCCCCGCGCATGCA

ORM1 (SEQ ID NO: 52) MALSWVLTVLSLLPLLEA

ORM1 (SEQ ID NO: 53) ATGGCGCTGTCCTGGGTTCTTACAGTCCTGAGCCTCCTACCTCTGCTGGAAGCC

TF (SEQ ID NO: 54) MRLAVGALLVCAVLGLCLA

TF (SEQ ID NO: 55) ATGAGGCTCGCCGTGGGAGCCCTGCTGGTCTGCGCCGTCCTGGGGCTGTGTCTGGCT

ApoE3信號胺基酸(SEQ ID NO: 56) MKVLWAALLVTFLAGCQA

ApoE3信號核苷酸(SEQ ID NO: 57) ATGAAGGTTCTGTGGGCTGCGTTGCTGGTCACATTCCTGGCAGGATGCCAGGCC

載體組件

ApoE HCR-1強化子(SEQ ID NO: 58) AGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGG

hAAT啟動子(SEQ ID NO: 59) GATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAAT

經修飾之HBB2內含子：(SEQ ID NO: 60) GATCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCATAGGAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTCTGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCTTGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACCTGCTGGTCTCTCTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAG

合成聚腺苷酸：(SEQ ID NO: 61) CTACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCACATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCAGTGGGCTCTATGG

BGH-聚腺苷酸：(SEQ ID NO: 62) CGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG

成熟ApoE

ApoE3-3之成熟編碼序列(SEQ ID NO: 63) AAAGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAGCCAGAGCTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGCCAGAGATGGGAGCTGGCTCTGGGCAGGTTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTGCAGACCCTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGTCTTCTCAGGTGACCCAGGAACTGAGGGCCCTGATGGATGAGACTATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGTCTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAGGAGACCAGGGCCAGGCTGAGCAAGGAGCTGCAGGCTGCCCAGGCCAGACTGGGGGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGCAGACTGGTGCAGTACAGGGGGGAGGTGCAGGCCATGCTGGGGCAGTCTACTGAGGAGCTGAGGGTGAGGCTGGCCAGCCACCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGGCTGGCTGTGTATCAGGCTGGGGCTAGGGAGGGGGCTGAGAGGGGCCTGTCTGCCATCAGGGAGAGGCTGGGGCCTCTGGTGGAGCAGGGCAGGGTGAGGGCTGCCACTGTGGGGAGCCTGGCTGGCCAGCCTCTGCAGGAGAGGGCTCAGGCCTGGGGGGAGAGGCTGAGGGCCAGGATGGAGGAGATGGGGAGCAGGACCAGGGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCCAAGCTGGAAGAGCAGGCCCAGCAGATCAGGCTGCAGGCTGAGGCCTTCCAGGCCAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGCACCTCTGCTGCCCCTGTGCCCTCTGACAATCAC TGA

ApoE3-9之成熟編碼序列(SEQ ID NO: 64) AAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAGCCTGAGCTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGCCAGAGGTGGGAGCTGGCCCTGGGGAGGTTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTGCAGACTCTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGTCTAGCCAGGTGACCCAGGAGCTGAGAGCCCTGATGGATGAGACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGTCTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAGGAGACCAGAGCTAGGCTGTCTAAGGAGCTGCAGGCTGCTCAGGCCAGGCTGGGGGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGCAGGCTGGTGCAGTATAGGGGGGAGGTCCAGGCCATGCTGGGGCAGAGCACTGAGGAGCTGAGGGTGAGGCTGGCCAGCCATCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGACTGGCTGTGTACCAGGCTGGGGCCAGGGAGGGGGCTGAGAGGGGCCTGTCTGCCATCAGGGAGAGGCTGGGGCCTCTGGTGGAGCAGGGCAGGGTGAGGGCTGCCACTGTGGGCTCTCTGGCTGGCCAGCCCCTGCAGGAGAGGGCCCAGGCTTGGGGGGAGAGGCTGAGAGCCAGAATGGAGGAGATGGGCAGCAGGACCAGGGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATCAGGCTGCAGGCTGAGGCCTTTCAGGCCAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAACCCCTGGTGGAGGACATGCAGAGACAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGCACCTCTGCTGCCCCTGTGCCCTCTGATAACCAC TGA

ApoE3-15之成熟編碼序列(SEQ ID NO: 65) AAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAGCCTGAGCTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGGCAGAGGTGGGAGCTGGCCCTGGGCAGGTTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTGCAGACCCTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGTCTAGCCAGGTGACCCAGGAACTGAGGGCCCTGATGGATGAGACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGTCTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAGGAGACCAGGGCCAGGCTGTCTAAGGAGCTGCAGGCTGCCCAGGCCAGGCTGGGGGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGCAGGCTGGTGCAGTATAGGGGGGAGGTGCAGGCTATGCTGGGCCAGAGCACTGAGGAGCTGAGGGTCAGGCTGGCCAGCCACCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGGCTGGCTGTGTACCAGGCTGGGGCCAGGGAGGGGGCTGAGAGGGGCCTGTCTGCCATCAGGGAGAGGCTGGGCCCTCTGGTGGAGCAGGGGAGGGTGAGGGCTGCCACTGTGGGCAGCCTGGCTGGCCAGCCCCTGCAGGAAAGGGCCCAGGCCTGGGGGGAGAGACTGAGGGCCAGGATGGAGGAGATGGGCAGCAGGACCAGAGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATTAGGCTGCAGGCTGAGGCCTTCCAGGCCAGGCTGAAGTCTTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAAGATATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGGACCTCTGCTGCTCCTGTGCCCTCTGACAACCAC TGA

ApoE3ch-9之成熟編碼序列(SEQ ID NO: 66) AAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCAGAGCCTGAGCTGAGGCAGCAGACTGAATGGCAGTCTGGCCAGAGGTGGGAGCTGGCCCTGGGCAGGTTCTGGGACTACCTGAGATGGGTGCAGACCCTGTCTGAGCAGGTCCAGGAGGAGCTGCTGTCTTCTCAGGTGACCCAGGAGCTGAGGGCCCTGATGGATGAGACTATGAAGGAGCTGAAGGCTTACAAGTCTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAGGAGACCAGGGCCAGACTGAGCAAGGAGCTGCAGGCTGCTCAGGCCAGGCTGGGGGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGCAGGCTGGTGCAGTATTCTGGGGAGGTGCAGGCTATGCTGGGCCAGAGCACTGAGGAACTGAGGGTGAGGCTGGCCTCTCATCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGGCTGGCTGTGTATCAGGCTGGGGCCAGGGAGGGGGCTGAGAGGGGGCTGTCTGCTATCAGGGAGAGGCTGGGCCCCCTGGTGGAGCAGGGGAGAGTGAGGGCTGCCACTGTGGGGTCTCTGGCTGGCCAGCCCCTGCAGGAGAGGGCCCAGGCCTGGGGGGAGAGGCTGAGGGCTAGAATGGAGGAGATGGGGTCTAGGACCAGGGACAGGCTGGATGAGGTCAAGGAACAGGTGGCTGAGGTCAGGGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATTAGGCTGCAGGCTGAGGCCTTTCAGGCCAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGCACTTCTGCTGCCCCTGTGCCCTCTGACAACCAT TGA

ApoE3ch-3之成熟編碼序列(SEQ ID NO: 67) AAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAGCCTGAGCTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGGCAGAGGTGGGAGCTGGCCCTGGGGAGGTTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTGCAGACTCTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGTCTAGCCAGGTGACCCAGGAGCTGAGGGCCCTGATGGATGAGACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGTCTGAGCTGGAAGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAGGAGACCAGGGCTAGGCTGAGCAAGGAACTGCAGGCTGCTCAGGCCAGGCTGGGGGCTGACATGGAAGATGTGTGTGGGAGGCTGGTGCAGTACTCTGGGGAGGTGCAGGCCATGCTGGGCCAGAGCACTGAGGAGCTGAGGGTGAGGCTGGCCAGCCACCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGGCTGGCTGTGTACCAGGCTGGGGCCAGGGAGGGGGCTGAGAGGGGCCTGTCTGCTATCAGGGAGAGGCTGGGCCCCCTGGTGGAGCAGGGCAGGGTGAGGGCTGCCACTGTGGGCAGCCTGGCTGGGCAGCCTCTGCAGGAGAGGGCCCAGGCCTGGGGGGAGAGGCTGAGAGCCAGGATGGAGGAGATGGGCTCTAGGACTAGGGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCTCAGCAGATCAGGCTGCAGGCTGAGGCTTTCCAGGCCAGGCTGAAGTCTTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAGGATATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGCACCTCTGCTGCCCCTGTGCCCTCTGACAACCAT TGA

信號

SNY1胺基酸(SEQ ID NO: 68) MKFALVAALALLLFLWSSCRA

SNY2胺基酸(SEQ ID NO: 69) MKFALVAALALLLFLWGCHS

SNY3胺基酸(SEQ ID NO: 70) MKWVTLLTLLLLLLFLWGCHS

SNY4胺基酸(SEQ ID NO: 71) MKWVTLLTLLLLLLFLWSSCRA

SNY1編碼核酸(SEQ ID NO: 72) ATGAAGTTCGCCCTGGTGGCCGCCCTGGCCCTGCTGCTGTTCCTGTGGAGCAGCTGCAGGGCC

SNY2編碼核酸(SEQ ID NO: 73) ATGAAGTTCGCCCTGGTGGCCGCCCTGGCCCTGCTGCTGTTCCTGTGGGGCTGCCACAGC

SNY3編碼核酸(SEQ ID NO: 74) ATGAAGTGGGTGACCCTGCTGACCCTGCTGCTGCTGCTGCTGTTCCTGTGGGGCTGCCACAGC

SNY4編碼核酸(SEQ ID NO: 75) ATGAAGTGGGTGACCCTGCTGACCCTGCTGCTGCTGCTGCTGTTCCTGTGGAGCAGCTGCAGGGCC

表現卡匣

ApoE3-3表現卡匣(SEQ ID NO: 76) GCGGCCTAGTAGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATAGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCATAGGAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTCTGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCTTGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACCTGCTGGTCTCTCTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGCACGCGTGCCACCATGAAGGTGCTGTGGGCTGCCCTGCTGGTGACCTTCCTGGCTGGCTGTCAGGCTAAAGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAGCCAGAGCTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGCCAGAGATGGGAGCTGGCTCTGGGCAGGTTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTGCAGACCCTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGTCTTCTCAGGTGACCCAGGAACTGAGGGCCCTGATGGATGAGACTATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGTCTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAGGAGACCAGGGCCAGGCTGAGCAAGGAGCTGCAGGCTGCCCAGGCCAGACTGGGGGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGCAGACTGGTGCAGTACAGGGGGGAGGTGCAGGCCATGCTGGGGCAGTCTACTGAGGAGCTGAGGGTGAGGCTGGCCAGCCACCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGGCTGGCTGTGTATCAGGCTGGGGCTAGGGAGGGGGCTGAGAGGGGCCTGTCTGCCATCAGGGAGAGGCTGGGGCCTCTGGTGGAGCAGGGCAGGGTGAGGGCTGCCACTGTGGGGAGCCTGGCTGGCCAGCCTCTGCAGGAGAGGGCTCAGGCCTGGGGGGAGAGGCTGAGGGCCAGGATGGAGGAGATGGGGAGCAGGACCAGGGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCCAAGCTGGAAGAGCAGGCCCAGCAGATCAGGCTGCAGGCTGAGGCCTTCCAGGCCAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGCACCTCTGCTGCCCCTGTGCCCTCTGACAATCACTGAAGATCTAGAGCTGAATTCCTGCAGCCAGGGGGATCAGCCTCTACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCACATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCAGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCAGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGAGATCCACTAGGGCCGC

ApoE3-9表現卡匣(SEQ ID NO: 77) GCGGCCTAGTAGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATAGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCATAGGAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTCTGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCTTGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACCTGCTGGTCTCTCTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGCACGCGTGCCACCATGAAAGTGCTGTGGGCTGCTCTGCTGGTGACCTTCCTGGCTGGGTGCCAGGCCAAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAGCCTGAGCTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGCCAGAGGTGGGAGCTGGCCCTGGGGAGGTTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTGCAGACTCTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGTCTAGCCAGGTGACCCAGGAGCTGAGAGCCCTGATGGATGAGACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGTCTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAGGAGACCAGAGCTAGGCTGTCTAAGGAGCTGCAGGCTGCTCAGGCCAGGCTGGGGGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGCAGGCTGGTGCAGTATAGGGGGGAGGTCCAGGCCATGCTGGGGCAGAGCACTGAGGAGCTGAGGGTGAGGCTGGCCAGCCATCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGACTGGCTGTGTACCAGGCTGGGGCCAGGGAGGGGGCTGAGAGGGGCCTGTCTGCCATCAGGGAGAGGCTGGGGCCTCTGGTGGAGCAGGGCAGGGTGAGGGCTGCCACTGTGGGCTCTCTGGCTGGCCAGCCCCTGCAGGAGAGGGCCCAGGCTTGGGGGGAGAGGCTGAGAGCCAGAATGGAGGAGATGGGCAGCAGGACCAGGGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATCAGGCTGCAGGCTGAGGCCTTTCAGGCCAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAACCCCTGGTGGAGGACATGCAGAGACAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGCACCTCTGCTGCCCCTGTGCCCTCTGATAACCACTGAAGATCTAGAGCTGAATTCCTGCAGCCAGGGGGATCAGCCTCTACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCACATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCAGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCAGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGAGATCCACTAGGGCCGC

ApoE3-15表現卡匣(SEQ ID NO: 78) GCGGCCTAGTAGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATAGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCATAGGAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTCTGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCTTGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACCTGCTGGTCTCTCTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGCACGCGTGCCACCATGAAGGTGCTGTGGGCTGCTCTGCTGGTGACCTTCCTGGCTGGCTGCCAGGCTAAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAGCCTGAGCTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGGCAGAGGTGGGAGCTGGCCCTGGGCAGGTTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTGCAGACCCTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGTCTAGCCAGGTGACCCAGGAACTGAGGGCCCTGATGGATGAGACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGTCTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAGGAGACCAGGGCCAGGCTGTCTAAGGAGCTGCAGGCTGCCCAGGCCAGGCTGGGGGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGCAGGCTGGTGCAGTATAGGGGGGAGGTGCAGGCTATGCTGGGCCAGAGCACTGAGGAGCTGAGGGTCAGGCTGGCCAGCCACCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGGCTGGCTGTGTACCAGGCTGGGGCCAGGGAGGGGGCTGAGAGGGGCCTGTCTGCCATCAGGGAGAGGCTGGGCCCTCTGGTGGAGCAGGGGAGGGTGAGGGCTGCCACTGTGGGCAGCCTGGCTGGCCAGCCCCTGCAGGAAAGGGCCCAGGCCTGGGGGGAGAGACTGAGGGCCAGGATGGAGGAGATGGGCAGCAGGACCAGAGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATTAGGCTGCAGGCTGAGGCCTTCCAGGCCAGGCTGAAGTCTTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAAGATATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGGACCTCTGCTGCTCCTGTGCCCTCTGACAACCACTGAAGATCTAGAGCTGAATTCCTGCAGCCAGGGGGATCAGCCTCTACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCACATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCAGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCAGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGAGATCCACTAGGGCCGC

ApoE3ch-9表現卡匣(SEQ ID NO: 79) GCGGCCTAGTAGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATAGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCATAGGAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTCTGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCTTGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACCTGCTGGTCTCTCTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGCACGCGTGCCACCATGAAGGTGCTGTGGGCTGCCCTGCTGGTGACTTTCCTGGCTGGCTGCCAGGCTAAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCAGAGCCTGAGCTGAGGCAGCAGACTGAATGGCAGTCTGGCCAGAGGTGGGAGCTGGCCCTGGGCAGGTTCTGGGACTACCTGAGATGGGTGCAGACCCTGTCTGAGCAGGTCCAGGAGGAGCTGCTGTCTTCTCAGGTGACCCAGGAGCTGAGGGCCCTGATGGATGAGACTATGAAGGAGCTGAAGGCTTACAAGTCTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAGGAGACCAGGGCCAGACTGAGCAAGGAGCTGCAGGCTGCTCAGGCCAGGCTGGGGGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGCAGGCTGGTGCAGTATTCTGGGGAGGTGCAGGCTATGCTGGGCCAGAGCACTGAGGAACTGAGGGTGAGGCTGGCCTCTCATCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGGCTGGCTGTGTATCAGGCTGGGGCCAGGGAGGGGGCTGAGAGGGGGCTGTCTGCTATCAGGGAGAGGCTGGGCCCCCTGGTGGAGCAGGGGAGAGTGAGGGCTGCCACTGTGGGGTCTCTGGCTGGCCAGCCCCTGCAGGAGAGGGCCCAGGCCTGGGGGGAGAGGCTGAGGGCTAGAATGGAGGAGATGGGGTCTAGGACCAGGGACAGGCTGGATGAGGTCAAGGAACAGGTGGCTGAGGTCAGGGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATTAGGCTGCAGGCTGAGGCCTTTCAGGCCAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGCACTTCTGCTGCCCCTGTGCCCTCTGACAACCATTGAAGATCTAGAGCTGAATTCCTGCAGCCAGGGGGATCAGCCTCTACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCACATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCAGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCAGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGAGATCCACTAGGGCCGC

ApoE3ch-3表現卡匣(SEQ ID NO: 80) GCGGCCTAGTAGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATAGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCATAGGAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTCTGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCTTGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACCTGCTGGTCTCTCTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGCACGCGTGCCACCATGAAGGTGCTGTGGGCTGCCCTGCTGGTGACCTTTCTGGCTGGGTGCCAGGCCAAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAGCCTGAGCTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGGCAGAGGTGGGAGCTGGCCCTGGGGAGGTTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTGCAGACTCTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGTCTAGCCAGGTGACCCAGGAGCTGAGGGCCCTGATGGATGAGACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGTCTGAGCTGGAAGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAGGAGACCAGGGCTAGGCTGAGCAAGGAACTGCAGGCTGCTCAGGCCAGGCTGGGGGCTGACATGGAAGATGTGTGTGGGAGGCTGGTGCAGTACTCTGGGGAGGTGCAGGCCATGCTGGGCCAGAGCACTGAGGAGCTGAGGGTGAGGCTGGCCAGCCACCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGGCTGGCTGTGTACCAGGCTGGGGCCAGGGAGGGGGCTGAGAGGGGCCTGTCTGCTATCAGGGAGAGGCTGGGCCCCCTGGTGGAGCAGGGCAGGGTGAGGGCTGCCACTGTGGGCAGCCTGGCTGGGCAGCCTCTGCAGGAGAGGGCCCAGGCCTGGGGGGAGAGGCTGAGAGCCAGGATGGAGGAGATGGGCTCTAGGACTAGGGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCTCAGCAGATCAGGCTGCAGGCTGAGGCTTTCCAGGCCAGGCTGAAGTCTTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAGGATATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGCACCTCTGCTGCCCCTGTGCCCTCTGACAACCATTGAAGATCTAGAGCTGAATTCCTGCAGCCAGGGGGATCAGCCTCTACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCTTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCACATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCAGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCAGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGAGATCCACTAGGGCCGC

ITR

5' ITR (SEQ ID NO: 81) CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT

3' ITR (SEQ ID NO: 82) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG

殼體

VP1: (SEQ ID NO: 83) MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL

VP1 (SEQ ID NO: 84) MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRPL

VP2 (SEQ ID NO: 122) MAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL

VP3 (SEQ ID NO: 123) MAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL

載體組件及ITR

CMV強化子：(SEQ ID NO: 85) ATCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA

雞β肌動蛋白啟動子(SEQ ID NO: 86) TGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGG

雞β肌動蛋白內含子(SEQ ID NO: 87) GGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCG

5' ITR_141bp (SEQ ID NO: 88) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT

3' ITR_141bp (SEQ ID NO: 89) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG

5' ITR_119bp (SEQ ID NO: 90) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT

3' ITR_119bp (SEQ ID NO: 91) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG

5' ITR_145bp_FLOP (SEQ ID NO: 92) TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT

3' ITR_AAV2 (SEQ ID NO: 93) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA

5' ITR_145bp_FLIP (SEQ ID NO: 94) TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT

成熟ApoE (無CpG)

ApoE3ch-40 (SEQ ID NO: 95) ATGAAGGTGTTGTGGGCAGCACTGCTGGTCACTTTCCTGGCAGGCTGCCAGGCCAAGGTGGAGCAGGCAGTAGAGACTGAACCAGAACCTGAACTGAGGCAACAGACTGAATGGCAGAGTGGTCAAAGATGGGAACTGGCCCTTGGAAGGTTTTGGGACTACCTGAGGTGGGTGCAGACCCTCAGTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGAGCTCCCAGGTGACCCAAGAACTAAGGGCTCTGATGGATGAGACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGTCTGAGCTGGAGGAACAGCTCACCCCAGTGGCTGAAGAGACTAGAGCAAGGCTCAGCAAGGAGTTGCAGGCTGCCCAGGCCAGGCTGGGGGCTGACATGGAAGATGTATGTGGAAGGCTTGTGCAGTACAGTGGTGAGGTGCAGGCCATGCTGGGACAGAGCACTGAAGAGCTGAGGGTCAGGCTGGCCTCCCACTTAAGGAAGCTAAGAAAAAGACTGCTCAGAGATGCTGATGACCTCCAGAAGAGACTGGCTGTGTACCAGGCTGGAGCCAGAGAGGGAGCAGAGAGAGGACTGAGTGCCATTAGGGAGAGATTGGGTCCCCTGGTAGAGCAGGGCAGGGTCAGAGCTGCCACAGTGGGCTCTTTGGCAGGCCAGCCTTTGCAGGAAAGAGCTCAGGCCTGGGGAGAGAGACTGAGAGCCAGGATGGAGGAGATGGGATCTAGGACCAGGGACAGACTGGATGAAGTCAAAGAACAAGTTGCTGAGGTGAGGGCCAAGCTGGAGGAGCAAGCCCAGCAGATTAGGCTACAGGCAGAGGCCTTCCAGGCCAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAGCCTTTGGTAGAGGACATGCAGAGACAGTGGGCTGGGTTGGTGGAGAAGGTCCAGGCTGCTGTTGGCACATCAGCAGCCCCTGTCCCCAGTGACAACCAC TGA

ApoE3ch-41 (SEQ ID NO: 96) ATGAAGGTCCTCTGGGCAGCCCTGCTGGTCACATTCCTGGCAGGCTGTCAAGCCAAGGTGGAACAAGCTGTGGAGACTGAGCCAGAGCCAGAGCTCAGGCAGCAAACAGAGTGGCAGTCTGGCCAGAGATGGGAATTGGCACTGGGAAGATTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTTCAGACCCTGTCAGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTCCTGAGCTCACAAGTCACTCAAGAGCTGAGAGCACTTATGGATGAAACCATGAAGGAATTAAAGGCCTACAAATCAGAATTGGAAGAGCAGCTGACACCTGTGGCTGAAGAGACCAGGGCCAGACTGAGTAAAGAACTGCAAGCAGCCCAGGCCAGACTTGGAGCTGACATGGAGGATGTTTGTGGCAGGCTGGTGCAGTACAGTGGTGAAGTCCAAGCCATGCTGGGACAATCCACAGAGGAGCTGAGGGTCAGGCTGGCCAGCCACCTAAGAAAACTGAGGAAGAGACTCCTGAGGGATGCTGATGATCTCCAGAAAAGGTTGGCTGTGTACCAAGCTGGAGCCAGGGAAGGAGCTGAAAGGGGACTCTCTGCCATCAGAGAAAGACTGGGTCCCCTGGTGGAGCAGGGCAGGGTGAGAGCAGCCACAGTGGGAAGCTTGGCAGGACAGCCACTCCAGGAAAGGGCACAGGCATGGGGAGAAAGGCTGAGGGCCAGGATGGAGGAGATGGGCAGCAGGACCAGGGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAACAAGTGGCAGAGGTAAGGGCAAAACTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATCAGGCTCCAGGCTGAAGCCTTCCAAGCAAGGTTGAAAAGCTGGTTTGAGCCTCTTGTGGAAGACATGCAGAGACAGTGGGCTGGCCTTGTGGAAAAAGTCCAAGCTGCAGTAGGCACCAGTGCAGCACCTGTCCCATCAGACAACCAT TGA

ApoE3ch-42 (SEQ ID NO: 97) ATGAAAGTCCTCTGGGCTGCCTTGCTGGTAACTTTCTTGGCTGGCTGCCAGGCCAAGGTGGAGCAAGCTGTGGAAACAGAGCCAGAGCCAGAGCTGAGGCAACAGACAGAATGGCAGTCAGGCCAGAGGTGGGAGCTGGCTCTGGGGAGATTCTGGGATTACCTGAGGTGGGTCCAGACACTCTCTGAACAAGTGCAAGAGGAGCTGCTGTCCTCCCAAGTCACCCAGGAGCTGAGAGCCTTGATGGATGAAACCATGAAAGAGCTGAAAGCTTACAAGTCTGAGCTGGAGGAACAGTTGACCCCAGTGGCTGAGGAGACCAGGGCCAGATTGTCCAAGGAACTGCAGGCTGCTCAGGCAAGGTTGGGGGCAGATATGGAGGATGTGTGTGGGAGGTTGGTGCAGTACAGTGGTGAGGTGCAGGCCATGCTGGGACAGAGCACTGAAGAGCTAAGGGTCAGATTAGCAAGTCATTTGAGGAAGCTGAGAAAGAGGCTGCTGAGAGATGCTGATGACCTTCAGAAGAGACTGGCTGTCTACCAAGCTGGTGCCAGAGAAGGGGCTGAAAGAGGTCTCTCAGCCATCAGGGAGAGGCTGGGGCCTCTGGTTGAGCAGGGTAGGGTGAGAGCAGCCACTGTGGGATCCCTGGCTGGTCAACCACTCCAAGAAAGAGCACAGGCCTGGGGGGAGAGACTGAGGGCCAGGATGGAGGAAATGGGCAGCAGGACAAGAGACAGGCTGGATGAGGTCAAGGAGCAAGTAGCAGAAGTGAGGGCCAAACTGGAGGAACAGGCCCAGCAGATCAGACTCCAAGCTGAGGCCTTCCAGGCCAGGCTGAAATCTTGGTTTGAGCCTTTGGTAGAAGACATGCAGAGGCAGTGGGCAGGGTTGGTAGAAAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGGACTTCAGCAGCCCCTGTGCCCTCAGACAATCAC TGA

ApoE3ch-43 (SEQ ID NO: 98) ATGAAGGTCCTCTGGGCTGCCCTGCTGGTCACCTTTCTAGCTGGGTGCCAGGCCAAGGTGGAACAAGCAGTGGAAACTGAGCCTGAGCCTGAGCTGAGGCAACAGACAGAGTGGCAGTCTGGTCAGAGGTGGGAGCTTGCACTGGGGAGGTTCTGGGATTACCTGAGGTGGGTCCAGACCCTGAGTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTCCTTAGCTCACAGGTTACTCAGGAGTTGAGAGCACTCATGGATGAAACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAAAGTGAACTGGAAGAACAGCTGACCCCTGTTGCAGAAGAAACCAGGGCAAGGCTCTCCAAAGAGCTGCAAGCTGCTCAGGCAAGACTGGGTGCTGACATGGAGGATGTCTGTGGCAGGCTGGTGCAGTATAGTGGTGAGGTGCAGGCAATGCTGGGGCAGTCCACTGAAGAGCTGAGGGTGAGGCTGGCCTCTCATCTTAGGAAGTTAAGGAAGAGGCTGCTCAGGGATGCTGATGACCTCCAGAAGAGGCTGGCTGTGTATCAGGCTGGGGCAAGGGAGGGGGCAGAGAGGGGCCTCTCTGCCATAAGGGAGAGACTGGGTCCACTGGTGGAACAGGGCAGGGTGAGAGCAGCCACAGTGGGCTCTCTGGCAGGGCAGCCCCTCCAAGAAAGAGCCCAGGCTTGGGGAGAAAGACTGAGGGCCAGGATGGAGGAAATGGGATCCAGGACAAGGGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCAAAGCTGGAAGAGCAAGCCCAGCAGATCAGGCTCCAGGCTGAAGCTTTCCAAGCAAGGCTGAAAAGCTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCAGGCCTGGTGGAGAAAGTTCAGGCAGCTGTGGGTACTTCAGCTGCACCTGTCCCTTCTGACAATCAC TGA

ApoE3ch-44 (SEQ ID NO: 99) ATGAAAGTCCTGTGGGCAGCCCTCCTGGTCACCTTCCTGGCTGGCTGTCAAGCTAAAGTGGAGCAGGCTGTGGAAACAGAGCCTGAGCCAGAACTTAGACAACAAACTGAGTGGCAGAGTGGGCAGAGGTGGGAGCTGGCCTTGGGCAGATTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTCCAGACTCTTTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTCCTGTCCAGTCAGGTGACCCAGGAGCTGAGGGCTCTCATGGATGAGACAATGAAAGAGCTGAAGGCCTACAAAAGTGAGCTGGAAGAGCAGCTGACCCCAGTGGCTGAAGAGACAAGGGCCAGGTTAAGCAAAGAGCTCCAGGCTGCCCAGGCCAGGCTGGGAGCAGACATGGAGGATGTCTGTGGCAGGCTGGTGCAGTATAGTGGGGAGGTGCAAGCCATGTTAGGCCAGAGCACTGAAGAGCTGAGGGTGAGGTTAGCTTCTCACCTGAGAAAATTAAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGGTTGGCTGTTTACCAGGCAGGGGCTAGAGAGGGAGCAGAGAGGGGCCTCTCTGCCATCAGAGAGAGGCTGGGCCCCCTTGTGGAGCAGGGCAGGGTGAGAGCAGCCACTGTTGGCTCACTTGCAGGGCAGCCTCTGCAGGAAAGAGCCCAGGCATGGGGGGAGAGACTGAGGGCAAGAATGGAAGAGATGGGCTCAAGGACAAGAGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCAGAAGTGAGGGCCAAGCTAGAGGAACAGGCCCAGCAGATCAGGCTCCAGGCAGAAGCCTTCCAGGCCAGGCTCAAGTCCTGGTTTGAGCCCTTAGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTACAGGCTGCTGTGGGGACTTCAGCAGCCCCAGTGCCCAGTGACAACCAC TGA

ApoE3ch-45 (SEQ ID NO: 100) ATGAAGGTCCTCTGGGCAGCTCTCCTGGTTACCTTCTTAGCTGGCTGTCAAGCCAAAGTAGAACAAGCAGTGGAAACAGAGCCAGAGCCAGAGCTCAGACAGCAAACAGAATGGCAGTCTGGTCAGAGATGGGAACTGGCACTGGGTAGGTTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTCCAGACCCTGTCAGAGCAGGTCCAGGAAGAGCTGCTGAGCAGCCAGGTGACTCAAGAGCTGAGGGCCCTCATGGATGAAACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGAGTGAGTTAGAAGAGCAGCTCACACCTGTGGCTGAAGAAACAAGGGCCAGGCTCAGCAAGGAGCTGCAAGCTGCACAGGCCAGGCTGGGTGCTGATATGGAGGATGTGTGTGGCAGGCTGGTGCAGTATAGTGGTGAAGTCCAGGCCATGTTGGGCCAATCCACAGAGGAGCTCAGGGTCAGGCTGGCCTCCCATCTCAGGAAACTAAGAAAGAGACTGCTCAGGGATGCTGATGACCTTCAGAAGAGGCTGGCTGTGTACCAGGCAGGAGCCAGAGAGGGGGCTGAGAGGGGTCTCTCAGCCATCAGGGAAAGACTTGGGCCCTTGGTTGAGCAGGGCAGGGTGAGAGCAGCCACAGTTGGGTCTCTGGCTGGCCAGCCCCTCCAGGAGAGAGCTCAGGCCTGGGGTGAGAGACTGAGGGCCAGGATGGAGGAGATGGGGAGCAGGACCAGGGACAGGTTGGATGAGGTCAAGGAGCAGGTGGCAGAAGTGAGAGCCAAGCTGGAAGAGCAGGCCCAGCAAATCAGGCTGCAAGCAGAGGCATTTCAGGCCAGGCTGAAGTCATGGTTTGAGCCTCTGGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCTGGGCTGGTGGAAAAGGTACAGGCTGCTGTGGGCACCAGTGCAGCACCTGTCCCATCTGATAACCAT TGA

ApoE3ch-46 (SEQ ID NO: 101) ATGAAAGTCCTGTGGGCAGCCCTCCTTGTGACCTTCCTGGCAGGCTGTCAAGCAAAGGTGGAGCAGGCTGTAGAGACTGAGCCAGAGCCTGAACTGAGGCAGCAGACAGAATGGCAGTCTGGCCAGAGATGGGAGCTGGCCCTGGGAAGATTTTGGGACTACCTGAGGTGGGTCCAGACCCTGTCAGAACAGGTTCAGGAAGAGCTGCTTTCCAGCCAAGTGACACAGGAGCTGAGAGCCCTTATGGATGAGACAATGAAAGAACTGAAGGCTTATAAAAGTGAGCTAGAGGAGCAGCTGACCCCAGTGGCTGAAGAGACCAGGGCCAGGCTCAGCAAAGAGCTCCAGGCTGCACAGGCCAGATTGGGAGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGGAGACTAGTGCAGTACAGTGGTGAAGTGCAGGCCATGCTGGGACAAAGCACAGAAGAGTTGAGAGTCAGGCTGGCATCCCACCTGAGGAAACTCAGGAAAAGACTGCTCAGGGATGCTGATGACCTCCAGAAGAGACTGGCAGTCTATCAGGCTGGTGCCAGAGAGGGGGCAGAGAGGGGACTCTCAGCCATCAGGGAGAGGCTGGGGCCTCTGGTTGAGCAGGGCAGAGTCAGAGCAGCAACAGTGGGGAGTCTGGCAGGCCAGCCCTTACAAGAGAGAGCTCAGGCATGGGGAGAGAGGCTGAGGGCCAGGATGGAAGAAATGGGATCAAGGACTAGAGACAGGTTGGATGAAGTAAAGGAGCAGGTGGCAGAAGTGAGGGCCAAGCTTGAGGAGCAGGCCCAGCAGATCAGGCTACAGGCTGAGGCATTTCAGGCCAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAGCCCTTGGTGGAGGATATGCAGAGGCAGTGGGCTGGATTGGTGGAAAAGGTACAGGCTGCTGTGGGCACCTCAGCAGCTCCTGTCCCCTCTGATAATCAT TGA

ApoE3ch-47 (SEQ ID NO: 102) ATGAAGGTCCTCTGGGCAGCCCTGCTGGTCACCTTCCTGGCTGGCTGCCAGGCCAAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCAGAGCCAGAGCTGAGGCAGCAGACAGAGTGGCAGTCTGGCCAGAGATGGGAGCTGGCCCTGGGAAGATTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTCCAGACCCTGTCAGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGAGCTCCCAGGTGACCCAGGAGCTGAGGGCCCTGATGGATGAAACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGAGTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAAGAGACCAGGGCCAGGCTCAGCAAGGAGCTGCAGGCTGCCCAGGCCAGGCTGGGAGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGCAGGCTGGTGCAGTACAGTGGTGAGGTGCAGGCCATGCTGGGACAGAGCACTGAAGAGCTGAGGGTCAGGCTGGCCTCCCACCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGACTGCTCAGGGATGCTGATGACCTCCAGAAGAGGCTGGCTGTGTACCAGGCTGGGGCCAGAGAGGGGGCAGAGAGGGGACTCTCAGCCATCAGGGAGAGGCTGGGGCCTCTGGTGGAGCAGGGCAGGGTGAGAGCAGCCACAGTGGGCTCTCTGGCAGGCCAGCCTCTCCAGGAAAGAGCTCAGGCCTGGGGAGAGAGACTGAGGGCCAGGATGGAGGAGATGGGCAGCAGGACCAGGGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATCAGGCTCCAGGCAGAGGCCTTCCAGGCCAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTCCAGGCTGCTGTGGGCACCTCAGCAGCCCCTGTCCCCAGTGACAACCAC TGA

ApoE3ch-31 (SEQ ID NO: 103) ATGAAAGTGCTGTGGGCTGCCCTGCTGGTCACATTCCTGGCTGGCTGCCAGGCCAAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACAGAGCCAGAGCCAGAACTGAGGCAGCAGACAGAGTGGCAGTCTGGCCAAAGATGGGAGCTAGCCCTGGGAAGATTCTGGGACTACCTGAGATGGGTGCAGACCCTCTCAGAACAAGTCCAGGAGGAGCTGCTGTCCTCACAGGTGACCCAGGAGCTGAGGGCCCTGATGGATGAAACAATGAAGGAGCTGAAGGCATATAAGTCAGAATTGGAGGAGCAGCTGACTCCTGTGGCTGAGGAGACCAGGGCTAGACTCTCCAAGGAGCTCCAGGCTGCCCAGGCCAGATTAGGAGCAGACATGGAGGATGTCTGTGGGAGGCTGGTGCAGTACAGTGGTGAGGTCCAGGCCATGCTGGGCCAAAGCACAGAGGAGCTGAGGGTCAGGCTGGCCAGCCATCTGAGGAAGCTGAGGAAAAGGCTGCTCAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGACTGGCAGTGTACCAGGCTGGTGCCAGAGAGGGGGCAGAGAGGGGGCTCTCAGCCATCAGAGAGAGGCTGGGGCCTCTGGTGGAGCAGGGCAGAGTGAGGGCTGCCACTGTGGGCTCCTTGGCAGGACAGCCCCTCCAAGAGAGAGCTCAGGCCTGGGGAGAGAGGCTCAGGGCCAGGATGGAGGAAATGGGCAGTAGGACCAGGGACAGGCTTGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTCAGAGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCTCAGCAGATTAGGCTGCAGGCAGAAGCCTTCCAGGCCAGGCTGAAATCCTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAAGACATGCAAAGGCAGTGGGCAGGGCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGCACATCAGCTGCCCCTGTGCCCAGTGATAACCAC TGA

ApoE3ch-33 (SEQ ID NO: 104) ATGAAAGTGCTATGGGCAGCCCTCTTGGTGACCTTCCTGGCTGGCTGCCAGGCCAAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACAGAGCCAGAACCAGAGCTGAGACAGCAAACTGAGTGGCAGTCAGGCCAGAGATGGGAGCTGGCCCTGGGGAGATTTTGGGACTACTTAAGGTGGGTCCAGACCCTCAGTGAGCAGGTGCAGGAAGAGCTGCTGAGCTCCCAGGTCACCCAGGAGCTGAGGGCCCTTATGGATGAAACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGTCAGAACTGGAGGAGCAGCTCACCCCTGTGGCTGAGGAGACCAGGGCAAGGCTCTCCAAGGAGCTACAGGCAGCCCAGGCCAGGCTGGGTGCAGACATGGAGGATGTCTGTGGGAGACTGGTGCAGTACAGTGGTGAAGTACAGGCCATGCTTGGCCAATCCACAGAGGAGTTGAGGGTGAGGCTGGCCTCCCACCTGAGGAAGCTGAGAAAGAGACTCCTCAGGGATGCAGATGACCTCCAGAAGAGGCTGGCAGTTTACCAGGCAGGGGCCAGAGAGGGTGCAGAAAGAGGGCTGTCAGCCATCAGGGAAAGGCTGGGCCCTCTGGTGGAGCAGGGCAGAGTGAGAGCAGCAACTGTTGGCTCCTTGGCTGGGCAGCCTCTGCAGGAGAGAGCTCAGGCCTGGGGGGAGAGACTCAGGGCCAGGATGGAGGAGATGGGCTCCAGGACAAGGGACAGGTTGGATGAAGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGAGCAAAGTTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATCAGGCTTCAGGCAGAGGCCTTCCAGGCCAGGCTGAAGTCCTGGTTTGAGCCACTGGTGGAGGATATGCAGAGACAGTGGGCAGGCCTGGTGGAGAAGGTCCAGGCAGCAGTGGGTACCTCTGCAGCCCCAGTTCCCAGTGACAATCAC TGA

ApoE3chAGT-co3 (SEQ ID NO: 105) ATGAAGGTGCTGTGGGCTGCCCTGCTGGTGACCTTCCTGGCTGGCTGTCAGGCTAAAGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAGCCAGAGCTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGCCAGAGATGGGAGCTGGCTCTGGGCAGGTTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTGCAGACCCTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGTCTTCTCAGGTGACCCAGGAACTGAGGGCCCTGATGGATGAGACTATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGTCTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAGGAGACCAGGGCCAGGCTGAGCAAGGAGCTGCAGGCTGCCCAGGCCAGACTGGGGGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGCAGACTGGTGCAGTACAGTGGGGAGGTGCAGGCCATGCTGGGGCAGTCTACTGAGGAGCTGAGGGTGAGGCTGGCCAGCCACCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGGCTGGCTGTGTATCAGGCTGGGGCTAGGGAGGGGGCTGAGAGGGGCCTGTCTGCCATCAGGGAGAGGCTGGGGCCTCTGGTGGAGCAGGGCAGGGTGAGGGCTGCCACTGTGGGGAGCCTGGCTGGCCAGCCTCTGCAGGAGAGGGCTCAGGCCTGGGGGGAGAGGCTGAGGGCCAGGATGGAGGAGATGGGGAGCAGGACCAGGGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCCAAGCTGGAAGAGCAGGCCCAGCAGATCAGGCTGCAGGCTGAGGCCTTCCAGGCCAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGCACCTCTGCTGCCCCTGTGCCCTCTGACAATCAC TGA

內含子插入序列在密碼子15處插入信號肽中之第一內含子(分裂Gly G/GC)；在密碼子79處插入ApoE3ch序列中之第二內含子(分裂Arg AG/G)

ApoE3ch-41-RBPi-FIXi(SEQ ID NO: 106) ATGAAGGTCCTCTGGGCAGCCCTGCTGGTCACATTCCTGGCAGGTCAGTGGCAGCCAGGGGCAGCTGCACCCTTTGCAGCTCCAGGGTTCCCCAAGGGCCCTGCCTGCTGATGGCCAGTGGGCATTGTGAAGGGAAGGGAGCACCAAATGGGTGGAGGGAGGGAGGAAGCCCTTTGCCCTGGCTTGGCTGAGGATCCCCTTGGCTTTTGCAGGCTGTCAAGCCAAGGTGGAACAAGCTGTGGAGACTGAGCCAGAGCCAGAGCTCAGGCAGCAAACAGAGTGGCAGTCTGGCCAGAGATGGGAATTGGCACTGGGAAGATTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTTCAGACCCTGTCAGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTCCTGAGCTCACAAGTCACTCAAGAGCTGAGGTTTGTTTCCTTTTTTATAATACATTGAGTATGCTTGCCTTTTAGATATAGAAATATCTGATTCTGTCTTCTTCACTAAATTTTGATTACATGATTTGACAGCAATATTGAAGAGTCTAACAGCCAGCACCCAGGTTGGTAAGTACTGGTTCTTTGTTAGCTAGGTTTTCTTCTTCTTCACTTTTAAAACTAAATAGATGGACAATGCTTATGATGCAATAAGGTTTAATAAACACTGTTCAGTTCAGTATTTGGTCATGTAATTCCTGTTAAAAAACAGTCATCTCCTTGGTTTAAAAAAATTAAAAGTGGGAAAACAAAGAAATAGCAGAATATAGTGAAAAAAAATAACCACAGTATTTTTGTTTGGACTTACCACTTTGAAATCAAATTAGAGGAAGGCATACAGGGAAGAAATTATCCCATTTGGACAAACAGCATGTTCTCACAGTAAGCACTTATCACACTTACTTGTCAACTTTTAGAATCAAATCTAGTAGCTGACAGTACCAGGATCAGGGGTGCCAACCCTAAGCACCCCCAGAAAGCTGACTGGCCCTGTGGTTCCCACTCCAGACATGATGTCAGCTGTGAAATCCACCTCCCTGGACCATAATTAGGCTTCTGTTCTTCAGGAGACATTTGTTCAAAGTCATTTGGGCAACCATATTCTGAAAACAGCCCAGCCAGGGTGATGGATCACTTTGCAAAGATCCTCAATGAGCTATTTTCAAGTGATGACAAAGTGTGAAGTTAAGGGCTCATTTGAGAACTTTCTTTTTCATCCAAAGTAAATTCAAATATGATTAGAAATCTGACCTTTTATTACTGGAATTCTCTTGACTAAAAGTAAAATTGAATTTTAATTCCTAAATCTCCATGTGTATACAGTACTGTGGGAACATCACAGATTTTGGCTCCATGCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAGATTATTTGGATTAAAAACAAAGACTTTCTTAAGAGATGTAAAATTTTCATGATGTTTTCTTTTTTGCTAAAACTAAAGAATTATTCTTTTACATTTCAGAGCACTTATGGATGAAACCATGAAGGAATTAAAGGCCTACAAATCAGAATTGGAAGAGCAGCTGACACCTGTGGCTGAAGAGACCAGGGCCAGACTGAGTAAAGAACTGCAAGCAGCCCAGGCCAGACTTGGAGCTGACATGGAGGATGTTTGTGGCAGGCTGGTGCAGTACAGTGGTGAAGTCCAAGCCATGCTGGGACAATCCACAGAGGAGCTGAGGGTCAGGCTGGCCAGCCACCTAAGAAAACTGAGGAAGAGACTCCTGAGGGATGCTGATGATCTCCAGAAAAGGTTGGCTGTGTACCAAGCTGGAGCCAGGGAAGGAGCTGAAAGGGGACTCTCTGCCATCAGAGAAAGACTGGGTCCCCTGGTGGAGCAGGGCAGGGTGAGAGCAGCCACAGTGGGAAGCTTGGCAGGACAGCCACTCCAGGAAAGGGCACAGGCATGGGGAGAAAGGCTGAGGGCCAGGATGGAGGAGATGGGCAGCAGGACCAGGGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAACAAGTGGCAGAGGTAAGGGCAAAACTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATCAGGCTCCAGGCTGAAGCCTTCCAAGCAAGGTTGAAAAGCTGGTTTGAGCCTCTTGTGGAAGACATGCAGAGACAGTGGGCTGGCCTTGTGGAAAAAGTCCAAGCTGCAGTAGGCACCAGTGCAGCACCTGTCCCATCAGACAACCAT TGA

ApoE3ch-42-RBPi-FIXi (SEQ ID NO: 107) ATGAAAGTCCTCTGGGCTGCCTTGCTGGTAACTTTCTTGGCTGGTCAGTGGCAGCCAGGGGCAGCTGCACCCTTTGCAGCTCCAGGGTTCCCCAAGGGCCCTGCCTGCTGATGGCCAGTGGGCATTGTGAAGGGAAGGGAGCACCAAATGGGTGGAGGGAGGGAGGAAGCCCTTTGCCCTGGCTTGGCTGAGGATCCCCTTGGCTTTTGCAGGCTGCCAGGCCAAGGTGGAGCAAGCTGTGGAAACAGAGCCAGAGCCAGAGCTGAGGCAACAGACAGAATGGCAGTCAGGCCAGAGGTGGGAGCTGGCTCTGGGGAGATTCTGGGATTACCTGAGGTGGGTCCAGACACTCTCTGAACAAGTGCAAGAGGAGCTGCTGTCCTCCCAAGTCACCCAGGAGCTGAGGTTTGTTTCCTTTTTTATAATACATTGAGTATGCTTGCCTTTTAGATATAGAAATATCTGATTCTGTCTTCTTCACTAAATTTTGATTACATGATTTGACAGCAATATTGAAGAGTCTAACAGCCAGCACCCAGGTTGGTAAGTACTGGTTCTTTGTTAGCTAGGTTTTCTTCTTCTTCACTTTTAAAACTAAATAGATGGACAATGCTTATGATGCAATAAGGTTTAATAAACACTGTTCAGTTCAGTATTTGGTCATGTAATTCCTGTTAAAAAACAGTCATCTCCTTGGTTTAAAAAAATTAAAAGTGGGAAAACAAAGAAATAGCAGAATATAGTGAAAAAAAATAACCACAGTATTTTTGTTTGGACTTACCACTTTGAAATCAAATTAGAGGAAGGCATACAGGGAAGAAATTATCCCATTTGGACAAACAGCATGTTCTCACAGTAAGCACTTATCACACTTACTTGTCAACTTTTAGAATCAAATCTAGTAGCTGACAGTACCAGGATCAGGGGTGCCAACCCTAAGCACCCCCAGAAAGCTGACTGGCCCTGTGGTTCCCACTCCAGACATGATGTCAGCTGTGAAATCCACCTCCCTGGACCATAATTAGGCTTCTGTTCTTCAGGAGACATTTGTTCAAAGTCATTTGGGCAACCATATTCTGAAAACAGCCCAGCCAGGGTGATGGATCACTTTGCAAAGATCCTCAATGAGCTATTTTCAAGTGATGACAAAGTGTGAAGTTAAGGGCTCATTTGAGAACTTTCTTTTTCATCCAAAGTAAATTCAAATATGATTAGAAATCTGACCTTTTATTACTGGAATTCTCTTGACTAAAAGTAAAATTGAATTTTAATTCCTAAATCTCCATGTGTATACAGTACTGTGGGAACATCACAGATTTTGGCTCCATGCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAGATTATTTGGATTAAAAACAAAGACTTTCTTAAGAGATGTAAAATTTTCATGATGTTTTCTTTTTTGCTAAAACTAAAGAATTATTCTTTTACATTTCAGAGCCTTGATGGATGAAACCATGAAAGAGCTGAAAGCTTACAAGTCTGAGCTGGAGGAACAGTTGACCCCAGTGGCTGAGGAGACCAGGGCCAGATTGTCCAAGGAACTGCAGGCTGCTCAGGCAAGGTTGGGGGCAGATATGGAGGATGTGTGTGGGAGGTTGGTGCAGTACAGTGGTGAGGTGCAGGCCATGCTGGGACAGAGCACTGAAGAGCTAAGGGTCAGATTAGCAAGTCATTTGAGGAAGCTGAGAAAGAGGCTGCTGAGAGATGCTGATGACCTTCAGAAGAGACTGGCTGTCTACCAAGCTGGTGCCAGAGAAGGGGCTGAAAGAGGTCTCTCAGCCATCAGGGAGAGGCTGGGGCCTCTGGTTGAGCAGGGTAGGGTGAGAGCAGCCACTGTGGGATCCCTGGCTGGTCAACCACTCCAAGAAAGAGCACAGGCCTGGGGGGAGAGACTGAGGGCCAGGATGGAGGAAATGGGCAGCAGGACAAGAGACAGGCTGGATGAGGTCAAGGAGCAAGTAGCAGAAGTGAGGGCCAAACTGGAGGAACAGGCCCAGCAGATCAGACTCCAAGCTGAGGCCTTCCAGGCCAGGCTGAAATCTTGGTTTGAGCCTTTGGTAGAAGACATGCAGAGGCAGTGGGCAGGGTTGGTAGAAAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGGACTTCAGCAGCCCCTGTGCCCTCAGACAATCAC TGA

ApoE3ch-43-RBPi-FIXi (SEQ ID NO: 108) ATGAAGGTCCTCTGGGCTGCCCTGCTGGTCACCTTTCTAGCTGGTCAGTGGCAGCCAGGGGCAGCTGCACCCTTTGCAGCTCCAGGGTTCCCCAAGGGCCCTGCCTGCTGATGGCCAGTGGGCATTGTGAAGGGAAGGGAGCACCAAATGGGTGGAGGGAGGGAGGAAGCCCTTTGCCCTGGCTTGGCTGAGGATCCCCTTGGCTTTTGCAGGGTGCCAGGCCAAGGTGGAACAAGCAGTGGAAACTGAGCCTGAGCCTGAGCTGAGGCAACAGACAGAGTGGCAGTCTGGTCAGAGGTGGGAGCTTGCACTGGGGAGGTTCTGGGATTACCTGAGGTGGGTCCAGACCCTGAGTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTCCTTAGCTCACAGGTTACTCAGGAGTTGAGGTTTGTTTCCTTTTTTATAATACATTGAGTATGCTTGCCTTTTAGATATAGAAATATCTGATTCTGTCTTCTTCACTAAATTTTGATTACATGATTTGACAGCAATATTGAAGAGTCTAACAGCCAGCACCCAGGTTGGTAAGTACTGGTTCTTTGTTAGCTAGGTTTTCTTCTTCTTCACTTTTAAAACTAAATAGATGGACAATGCTTATGATGCAATAAGGTTTAATAAACACTGTTCAGTTCAGTATTTGGTCATGTAATTCCTGTTAAAAAACAGTCATCTCCTTGGTTTAAAAAAATTAAAAGTGGGAAAACAAAGAAATAGCAGAATATAGTGAAAAAAAATAACCACAGTATTTTTGTTTGGACTTACCACTTTGAAATCAAATTAGAGGAAGGCATACAGGGAAGAAATTATCCCATTTGGACAAACAGCATGTTCTCACAGTAAGCACTTATCACACTTACTTGTCAACTTTTAGAATCAAATCTAGTAGCTGACAGTACCAGGATCAGGGGTGCCAACCCTAAGCACCCCCAGAAAGCTGACTGGCCCTGTGGTTCCCACTCCAGACATGATGTCAGCTGTGAAATCCACCTCCCTGGACCATAATTAGGCTTCTGTTCTTCAGGAGACATTTGTTCAAAGTCATTTGGGCAACCATATTCTGAAAACAGCCCAGCCAGGGTGATGGATCACTTTGCAAAGATCCTCAATGAGCTATTTTCAAGTGATGACAAAGTGTGAAGTTAAGGGCTCATTTGAGAACTTTCTTTTTCATCCAAAGTAAATTCAAATATGATTAGAAATCTGACCTTTTATTACTGGAATTCTCTTGACTAAAAGTAAAATTGAATTTTAATTCCTAAATCTCCATGTGTATACAGTACTGTGGGAACATCACAGATTTTGGCTCCATGCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAGATTATTTGGATTAAAAACAAAGACTTTCTTAAGAGATGTAAAATTTTCATGATGTTTTCTTTTTTGCTAAAACTAAAGAATTATTCTTTTACATTTCAGAGCACTCATGGATGAAACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAAAGTGAACTGGAAGAACAGCTGACCCCTGTTGCAGAAGAAACCAGGGCAAGGCTCTCCAAAGAGCTGCAAGCTGCTCAGGCAAGACTGGGTGCTGACATGGAGGATGTCTGTGGCAGGCTGGTGCAGTATAGTGGTGAGGTGCAGGCAATGCTGGGGCAGTCCACTGAAGAGCTGAGGGTGAGGCTGGCCTCTCATCTTAGGAAGTTAAGGAAGAGGCTGCTCAGGGATGCTGATGACCTCCAGAAGAGGCTGGCTGTGTATCAGGCTGGGGCAAGGGAGGGGGCAGAGAGGGGCCTCTCTGCCATAAGGGAGAGACTGGGTCCACTGGTGGAACAGGGCAGGGTGAGAGCAGCCACAGTGGGCTCTCTGGCAGGGCAGCCCCTCCAAGAAAGAGCCCAGGCTTGGGGAGAAAGACTGAGGGCCAGGATGGAGGAAATGGGATCCAGGACAAGGGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCAAAGCTGGAAGAGCAAGCCCAGCAGATCAGGCTCCAGGCTGAAGCTTTCCAAGCAAGGCTGAAAAGCTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCAGGCCTGGTGGAGAAAGTTCAGGCAGCTGTGGGTACTTCAGCTGCACCTGTCCCTTCTGACAATCAC TGA

ApoE3ch-44-RBPi-FIXi (SEQ ID NO: 109) ATGAAAGTCCTGTGGGCAGCCCTCCTGGTCACCTTCCTGGCTGGTCAGTGGCAGCCAGGGGCAGCTGCACCCTTTGCAGCTCCAGGGTTCCCCAAGGGCCCTGCCTGCTGATGGCCAGTGGGCATTGTGAAGGGAAGGGAGCACCAAATGGGTGGAGGGAGGGAGGAAGCCCTTTGCCCTGGCTTGGCTGAGGATCCCCTTGGCTTTTGCAGGCTGTCAAGCTAAAGTGGAGCAGGCTGTGGAAACAGAGCCTGAGCCAGAACTTAGACAACAAACTGAGTGGCAGAGTGGGCAGAGGTGGGAGCTGGCCTTGGGCAGATTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTCCAGACTCTTTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTCCTGTCCAGTCAGGTGACCCAGGAGCTGAGGTTTGTTTCCTTTTTTATAATACATTGAGTATGCTTGCCTTTTAGATATAGAAATATCTGATTCTGTCTTCTTCACTAAATTTTGATTACATGATTTGACAGCAATATTGAAGAGTCTAACAGCCAGCACCCAGGTTGGTAAGTACTGGTTCTTTGTTAGCTAGGTTTTCTTCTTCTTCACTTTTAAAACTAAATAGATGGACAATGCTTATGATGCAATAAGGTTTAATAAACACTGTTCAGTTCAGTATTTGGTCATGTAATTCCTGTTAAAAAACAGTCATCTCCTTGGTTTAAAAAAATTAAAAGTGGGAAAACAAAGAAATAGCAGAATATAGTGAAAAAAAATAACCACAGTATTTTTGTTTGGACTTACCACTTTGAAATCAAATTAGAGGAAGGCATACAGGGAAGAAATTATCCCATTTGGACAAACAGCATGTTCTCACAGTAAGCACTTATCACACTTACTTGTCAACTTTTAGAATCAAATCTAGTAGCTGACAGTACCAGGATCAGGGGTGCCAACCCTAAGCACCCCCAGAAAGCTGACTGGCCCTGTGGTTCCCACTCCAGACATGATGTCAGCTGTGAAATCCACCTCCCTGGACCATAATTAGGCTTCTGTTCTTCAGGAGACATTTGTTCAAAGTCATTTGGGCAACCATATTCTGAAAACAGCCCAGCCAGGGTGATGGATCACTTTGCAAAGATCCTCAATGAGCTATTTTCAAGTGATGACAAAGTGTGAAGTTAAGGGCTCATTTGAGAACTTTCTTTTTCATCCAAAGTAAATTCAAATATGATTAGAAATCTGACCTTTTATTACTGGAATTCTCTTGACTAAAAGTAAAATTGAATTTTAATTCCTAAATCTCCATGTGTATACAGTACTGTGGGAACATCACAGATTTTGGCTCCATGCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAGATTATTTGGATTAAAAACAAAGACTTTCTTAAGAGATGTAAAATTTTCATGATGTTTTCTTTTTTGCTAAAACTAAAGAATTATTCTTTTACATTTCAGGGCTCTCATGGATGAGACAATGAAAGAGCTGAAGGCCTACAAAAGTGAGCTGGAAGAGCAGCTGACCCCAGTGGCTGAAGAGACAAGGGCCAGGTTAAGCAAAGAGCTCCAGGCTGCCCAGGCCAGGCTGGGAGCAGACATGGAGGATGTCTGTGGCAGGCTGGTGCAGTATAGTGGGGAGGTGCAAGCCATGTTAGGCCAGAGCACTGAAGAGCTGAGGGTGAGGTTAGCTTCTCACCTGAGAAAATTAAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGGTTGGCTGTTTACCAGGCAGGGGCTAGAGAGGGAGCAGAGAGGGGCCTCTCTGCCATCAGAGAGAGGCTGGGCCCCCTTGTGGAGCAGGGCAGGGTGAGAGCAGCCACTGTTGGCTCACTTGCAGGGCAGCCTCTGCAGGAAAGAGCCCAGGCATGGGGGGAGAGACTGAGGGCAAGAATGGAAGAGATGGGCTCAAGGACAAGAGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCAGAAGTGAGGGCCAAGCTAGAGGAACAGGCCCAGCAGATCAGGCTCCAGGCAGAAGCCTTCCAGGCCAGGCTCAAGTCCTGGTTTGAGCCCTTAGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTACAGGCTGCTGTGGGGACTTCAGCAGCCCCAGTGCCCAGTGACAACCAC TGA

ApoE3ch-heur45-RBPi-FIXi (SEQ ID NO: 110) ATGAAGGTCCTCTGGGCAGCTCTCCTGGTTACCTTCTTAGCTGGTCAGTGGCAGCCAGGGGCAGCTGCACCCTTTGCAGCTCCAGGGTTCCCCAAGGGCCCTGCCTGCTGATGGCCAGTGGGCATTGTGAAGGGAAGGGAGCACCAAATGGGTGGAGGGAGGGAGGAAGCCCTTTGCCCTGGCTTGGCTGAGGATCCCCTTGGCTTTTGCAGGCTGTCAAGCCAAAGTAGAACAAGCAGTGGAAACAGAGCCAGAGCCAGAGCTCAGACAGCAAACAGAATGGCAGTCTGGTCAGAGATGGGAACTGGCACTGGGTAGGTTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTCCAGACCCTGTCAGAGCAGGTCCAGGAAGAGCTGCTGAGCAGCCAGGTGACTCAAGAGCTGAGGTTTGTTTCCTTTTTTATAATACATTGAGTATGCTTGCCTTTTAGATATAGAAATATCTGATTCTGTCTTCTTCACTAAATTTTGATTACATGATTTGACAGCAATATTGAAGAGTCTAACAGCCAGCACCCAGGTTGGTAAGTACTGGTTCTTTGTTAGCTAGGTTTTCTTCTTCTTCACTTTTAAAACTAAATAGATGGACAATGCTTATGATGCAATAAGGTTTAATAAACACTGTTCAGTTCAGTATTTGGTCATGTAATTCCTGTTAAAAAACAGTCATCTCCTTGGTTTAAAAAAATTAAAAGTGGGAAAACAAAGAAATAGCAGAATATAGTGAAAAAAAATAACCACAGTATTTTTGTTTGGACTTACCACTTTGAAATCAAATTAGAGGAAGGCATACAGGGAAGAAATTATCCCATTTGGACAAACAGCATGTTCTCACAGTAAGCACTTATCACACTTACTTGTCAACTTTTAGAATCAAATCTAGTAGCTGACAGTACCAGGATCAGGGGTGCCAACCCTAAGCACCCCCAGAAAGCTGACTGGCCCTGTGGTTCCCACTCCAGACATGATGTCAGCTGTGAAATCCACCTCCCTGGACCATAATTAGGCTTCTGTTCTTCAGGAGACATTTGTTCAAAGTCATTTGGGCAACCATATTCTGAAAACAGCCCAGCCAGGGTGATGGATCACTTTGCAAAGATCCTCAATGAGCTATTTTCAAGTGATGACAAAGTGTGAAGTTAAGGGCTCATTTGAGAACTTTCTTTTTCATCCAAAGTAAATTCAAATATGATTAGAAATCTGACCTTTTATTACTGGAATTCTCTTGACTAAAAGTAAAATTGAATTTTAATTCCTAAATCTCCATGTGTATACAGTACTGTGGGAACATCACAGATTTTGGCTCCATGCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAGATTATTTGGATTAAAAACAAAGACTTTCTTAAGAGATGTAAAATTTTCATGATGTTTTCTTTTTTGCTAAAACTAAAGAATTATTCTTTTACATTTCAGGGCCCTCATGGATGAAACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGAGTGAGTTAGAAGAGCAGCTCACACCTGTGGCTGAAGAAACAAGGGCCAGGCTCAGCAAGGAGCTGCAAGCTGCACAGGCCAGGCTGGGTGCTGATATGGAGGATGTGTGTGGCAGGCTGGTGCAGTATAGTGGTGAAGTCCAGGCCATGTTGGGCCAATCCACAGAGGAGCTCAGGGTCAGGCTGGCCTCCCATCTCAGGAAACTAAGAAAGAGACTGCTCAGGGATGCTGATGACCTTCAGAAGAGGCTGGCTGTGTACCAGGCAGGAGCCAGAGAGGGGGCTGAGAGGGGTCTCTCAGCCATCAGGGAAAGACTTGGGCCCTTGGTTGAGCAGGGCAGGGTGAGAGCAGCCACAGTTGGGTCTCTGGCTGGCCAGCCCCTCCAGGAGAGAGCTCAGGCCTGGGGTGAGAGACTGAGGGCCAGGATGGAGGAGATGGGGAGCAGGACCAGGGACAGGTTGGATGAGGTCAAGGAGCAGGTGGCAGAAGTGAGAGCCAAGCTGGAAGAGCAGGCCCAGCAAATCAGGCTGCAAGCAGAGGCATTTCAGGCCAGGCTGAAGTCATGGTTTGAGCCTCTGGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCTGGGCTGGTGGAAAAGGTACAGGCTGCTGTGGGCACCAGTGCAGCACCTGTCCCATCTGATAACCAT TGA

ApoE3ch-46-RBPi-FIXi (SEQ ID NO: 111) ATGAAAGTCCTGTGGGCAGCCCTCCTTGTGACCTTCCTGGCAGGTCAGTGGCAGCCAGGGGCAGCTGCACCCTTTGCAGCTCCAGGGTTCCCCAAGGGCCCTGCCTGCTGATGGCCAGTGGGCATTGTGAAGGGAAGGGAGCACCAAATGGGTGGAGGGAGGGAGGAAGCCCTTTGCCCTGGCTTGGCTGAGGATCCCCTTGGCTTTTGCAGGCTGTCAAGCAAAGGTGGAGCAGGCTGTAGAGACTGAGCCAGAGCCTGAACTGAGGCAGCAGACAGAATGGCAGTCTGGCCAGAGATGGGAGCTGGCCCTGGGAAGATTTTGGGACTACCTGAGGTGGGTCCAGACCCTGTCAGAACAGGTTCAGGAAGAGCTGCTTTCCAGCCAAGTGACACAGGAGCTGAGGTTTGTTTCCTTTTTTATAATACATTGAGTATGCTTGCCTTTTAGATATAGAAATATCTGATTCTGTCTTCTTCACTAAATTTTGATTACATGATTTGACAGCAATATTGAAGAGTCTAACAGCCAGCACCCAGGTTGGTAAGTACTGGTTCTTTGTTAGCTAGGTTTTCTTCTTCTTCACTTTTAAAACTAAATAGATGGACAATGCTTATGATGCAATAAGGTTTAATAAACACTGTTCAGTTCAGTATTTGGTCATGTAATTCCTGTTAAAAAACAGTCATCTCCTTGGTTTAAAAAAATTAAAAGTGGGAAAACAAAGAAATAGCAGAATATAGTGAAAAAAAATAACCACAGTATTTTTGTTTGGACTTACCACTTTGAAATCAAATTAGAGGAAGGCATACAGGGAAGAAATTATCCCATTTGGACAAACAGCATGTTCTCACAGTAAGCACTTATCACACTTACTTGTCAACTTTTAGAATCAAATCTAGTAGCTGACAGTACCAGGATCAGGGGTGCCAACCCTAAGCACCCCCAGAAAGCTGACTGGCCCTGTGGTTCCCACTCCAGACATGATGTCAGCTGTGAAATCCACCTCCCTGGACCATAATTAGGCTTCTGTTCTTCAGGAGACATTTGTTCAAAGTCATTTGGGCAACCATATTCTGAAAACAGCCCAGCCAGGGTGATGGATCACTTTGCAAAGATCCTCAATGAGCTATTTTCAAGTGATGACAAAGTGTGAAGTTAAGGGCTCATTTGAGAACTTTCTTTTTCATCCAAAGTAAATTCAAATATGATTAGAAATCTGACCTTTTATTACTGGAATTCTCTTGACTAAAAGTAAAATTGAATTTTAATTCCTAAATCTCCATGTGTATACAGTACTGTGGGAACATCACAGATTTTGGCTCCATGCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAGATTATTTGGATTAAAAACAAAGACTTTCTTAAGAGATGTAAAATTTTCATGATGTTTTCTTTTTTGCTAAAACTAAAGAATTATTCTTTTACATTTCAGAGCCCTTATGGATGAGACAATGAAAGAACTGAAGGCTTATAAAAGTGAGCTAGAGGAGCAGCTGACCCCAGTGGCTGAAGAGACCAGGGCCAGGCTCAGCAAAGAGCTCCAGGCTGCACAGGCCAGATTGGGAGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGGAGACTAGTGCAGTACAGTGGTGAAGTGCAGGCCATGCTGGGACAAAGCACAGAAGAGTTGAGAGTCAGGCTGGCATCCCACCTGAGGAAACTCAGGAAAAGACTGCTCAGGGATGCTGATGACCTCCAGAAGAGACTGGCAGTCTATCAGGCTGGTGCCAGAGAGGGGGCAGAGAGGGGACTCTCAGCCATCAGGGAGAGGCTGGGGCCTCTGGTTGAGCAGGGCAGAGTCAGAGCAGCAACAGTGGGGAGTCTGGCAGGCCAGCCCTTACAAGAGAGAGCTCAGGCATGGGGAGAGAGGCTGAGGGCCAGGATGGAAGAAATGGGATCAAGGACTAGAGACAGGTTGGATGAAGTAAAGGAGCAGGTGGCAGAAGTGAGGGCCAAGCTTGAGGAGCAGGCCCAGCAGATCAGGCTACAGGCTGAGGCATTTCAGGCCAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAGCCCTTGGTGGAGGATATGCAGAGGCAGTGGGCTGGATTGGTGGAAAAGGTACAGGCTGCTGTGGGCACCTCAGCAGCTCCTGTCCCCTCTGATAATCAT TGA

ApoE3ch-47-RBPi-FIXi (SEQ ID NO: 112) ATGAAGGTCCTCTGGGCAGCCCTGCTGGTCACCTTCCTGGCTGGTCAGTGGCAGCCAGGGGCAGCTGCACCCTTTGCAGCTCCAGGGTTCCCCAAGGGCCCTGCCTGCTGATGGCCAGTGGGCATTGTGAAGGGAAGGGAGCACCAAATGGGTGGAGGGAGGGAGGAAGCCCTTTGCCCTGGCTTGGCTGAGGATCCCCTTGGCTTTTGCAGGCTGCCAGGCCAAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCAGAGCCAGAGCTGAGGCAGCAGACAGAGTGGCAGTCTGGCCAGAGATGGGAGCTGGCCCTGGGAAGATTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTCCAGACCCTGTCAGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGAGCTCCCAGGTGACCCAGGAGCTGAGGTTTGTTTCCTTTTTTATAATACATTGAGTATGCTTGCCTTTTAGATATAGAAATATCTGATTCTGTCTTCTTCACTAAATTTTGATTACATGATTTGACAGCAATATTGAAGAGTCTAACAGCCAGCACCCAGGTTGGTAAGTACTGGTTCTTTGTTAGCTAGGTTTTCTTCTTCTTCACTTTTAAAACTAAATAGATGGACAATGCTTATGATGCAATAAGGTTTAATAAACACTGTTCAGTTCAGTATTTGGTCATGTAATTCCTGTTAAAAAACAGTCATCTCCTTGGTTTAAAAAAATTAAAAGTGGGAAAACAAAGAAATAGCAGAATATAGTGAAAAAAAATAACCACAGTATTTTTGTTTGGACTTACCACTTTGAAATCAAATTAGAGGAAGGCATACAGGGAAGAAATTATCCCATTTGGACAAACAGCATGTTCTCACAGTAAGCACTTATCACACTTACTTGTCAACTTTTAGAATCAAATCTAGTAGCTGACAGTACCAGGATCAGGGGTGCCAACCCTAAGCACCCCCAGAAAGCTGACTGGCCCTGTGGTTCCCACTCCAGACATGATGTCAGCTGTGAAATCCACCTCCCTGGACCATAATTAGGCTTCTGTTCTTCAGGAGACATTTGTTCAAAGTCATTTGGGCAACCATATTCTGAAAACAGCCCAGCCAGGGTGATGGATCACTTTGCAAAGATCCTCAATGAGCTATTTTCAAGTGATGACAAAGTGTGAAGTTAAGGGCTCATTTGAGAACTTTCTTTTTCATCCAAAGTAAATTCAAATATGATTAGAAATCTGACCTTTTATTACTGGAATTCTCTTGACTAAAAGTAAAATTGAATTTTAATTCCTAAATCTCCATGTGTATACAGTACTGTGGGAACATCACAGATTTTGGCTCCATGCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAGATTATTTGGATTAAAAACAAAGACTTTCTTAAGAGATGTAAAATTTTCATGATGTTTTCTTTTTTGCTAAAACTAAAGAATTATTCTTTTACATTTCAGGGCCCTGATGGATGAAACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGAGTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAAGAGACCAGGGCCAGGCTCAGCAAGGAGCTGCAGGCTGCCCAGGCCAGGCTGGGAGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGCAGGCTGGTGCAGTACAGTGGTGAGGTGCAGGCCATGCTGGGACAGAGCACTGAAGAGCTGAGGGTCAGGCTGGCCTCCCACCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGACTGCTCAGGGATGCTGATGACCTCCAGAAGAGGCTGGCTGTGTACCAGGCTGGGGCCAGAGAGGGGGCAGAGAGGGGACTCTCAGCCATCAGGGAGAGGCTGGGGCCTCTGGTGGAGCAGGGCAGGGTGAGAGCAGCCACAGTGGGCTCTCTGGCAGGCCAGCCTCTCCAGGAAAGAGCTCAGGCCTGGGGAGAGAGACTGAGGGCCAGGATGGAGGAGATGGGCAGCAGGACCAGGGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATCAGGCTCCAGGCAGAGGCCTTCCAGGCCAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTCCAGGCTGCTGTGGGCACCTCAGCAGCCCCTGTCCCCAGTGACAACCAC TGA

ApoE3ch-heur31-RBPi-FIXi (SEQ ID NO: 113) ATGAAAGTGCTGTGGGCTGCCCTGCTGGTCACATTCCTGGCTGGTCAGTGGCAGCCAGGGGCAGCTGCACCCTTTGCAGCTCCAGGGTTCCCCAAGGGCCCTGCCTGCTGATGGCCAGTGGGCATTGTGAAGGGAAGGGAGCACCAAATGGGTGGAGGGAGGGAGGAAGCCCTTTGCCCTGGCTTGGCTGAGGATCCCCTTGGCTTTTGCAGGCTGCCAGGCCAAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACAGAGCCAGAGCCAGAACTGAGGCAGCAGACAGAGTGGCAGTCTGGCCAAAGATGGGAGCTAGCCCTGGGAAGATTCTGGGACTACCTGAGATGGGTGCAGACCCTCTCAGAACAAGTCCAGGAGGAGCTGCTGTCCTCACAGGTGACCCAGGAGCTGAGGTTTGTTTCCTTTTTTATAATACATTGAGTATGCTTGCCTTTTAGATATAGAAATATCTGATTCTGTCTTCTTCACTAAATTTTGATTACATGATTTGACAGCAATATTGAAGAGTCTAACAGCCAGCACCCAGGTTGGTAAGTACTGGTTCTTTGTTAGCTAGGTTTTCTTCTTCTTCACTTTTAAAACTAAATAGATGGACAATGCTTATGATGCAATAAGGTTTAATAAACACTGTTCAGTTCAGTATTTGGTCATGTAATTCCTGTTAAAAAACAGTCATCTCCTTGGTTTAAAAAAATTAAAAGTGGGAAAACAAAGAAATAGCAGAATATAGTGAAAAAAAATAACCACAGTATTTTTGTTTGGACTTACCACTTTGAAATCAAATTAGAGGAAGGCATACAGGGAAGAAATTATCCCATTTGGACAAACAGCATGTTCTCACAGTAAGCACTTATCACACTTACTTGTCAACTTTTAGAATCAAATCTAGTAGCTGACAGTACCAGGATCAGGGGTGCCAACCCTAAGCACCCCCAGAAAGCTGACTGGCCCTGTGGTTCCCACTCCAGACATGATGTCAGCTGTGAAATCCACCTCCCTGGACCATAATTAGGCTTCTGTTCTTCAGGAGACATTTGTTCAAAGTCATTTGGGCAACCATATTCTGAAAACAGCCCAGCCAGGGTGATGGATCACTTTGCAAAGATCCTCAATGAGCTATTTTCAAGTGATGACAAAGTGTGAAGTTAAGGGCTCATTTGAGAACTTTCTTTTTCATCCAAAGTAAATTCAAATATGATTAGAAATCTGACCTTTTATTACTGGAATTCTCTTGACTAAAAGTAAAATTGAATTTTAATTCCTAAATCTCCATGTGTATACAGTACTGTGGGAACATCACAGATTTTGGCTCCATGCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAGATTATTTGGATTAAAAACAAAGACTTTCTTAAGAGATGTAAAATTTTCATGATGTTTTCTTTTTTGCTAAAACTAAAGAATTATTCTTTTACATTTCAGGGCCCTGATGGATGAAACAATGAAGGAGCTGAAGGCATATAAGTCAGAATTGGAGGAGCAGCTGACTCCTGTGGCTGAGGAGACCAGGGCTAGACTCTCCAAGGAGCTCCAGGCTGCCCAGGCCAGATTAGGAGCAGACATGGAGGATGTCTGTGGGAGGCTGGTGCAGTACAGTGGTGAGGTCCAGGCCATGCTGGGCCAAAGCACAGAGGAGCTGAGGGTCAGGCTGGCCAGCCATCTGAGGAAGCTGAGGAAAAGGCTGCTCAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGACTGGCAGTGTACCAGGCTGGTGCCAGAGAGGGGGCAGAGAGGGGGCTCTCAGCCATCAGAGAGAGGCTGGGGCCTCTGGTGGAGCAGGGCAGAGTGAGGGCTGCCACTGTGGGCTCCTTGGCAGGACAGCCCCTCCAAGAGAGAGCTCAGGCCTGGGGAGAGAGGCTCAGGGCCAGGATGGAGGAAATGGGCAGTAGGACCAGGGACAGGCTTGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTCAGAGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCTCAGCAGATTAGGCTGCAGGCAGAAGCCTTCCAGGCCAGGCTGAAATCCTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAAGACATGCAAAGGCAGTGGGCAGGGCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGCACATCAGCTGCCCCTGTGCCCAGTGATAACCAC TGA

ApoE3ch-heur33-RBPi-FIXi (SEQ ID NO: 114) ATGAAAGTGCTATGGGCAGCCCTCTTGGTGACCTTCCTGGCTGGTCAGTGGCAGCCAGGGGCAGCTGCACCCTTTGCAGCTCCAGGGTTCCCCAAGGGCCCTGCCTGCTGATGGCCAGTGGGCATTGTGAAGGGAAGGGAGCACCAAATGGGTGGAGGGAGGGAGGAAGCCCTTTGCCCTGGCTTGGCTGAGGATCCCCTTGGCTTTTGCAGGCTGCCAGGCCAAGGTGGAGCAGGCTGTGGAGACAGAGCCAGAACCAGAGCTGAGACAGCAAACTGAGTGGCAGTCAGGCCAGAGATGGGAGCTGGCCCTGGGGAGATTTTGGGACTACTTAAGGTGGGTCCAGACCCTCAGTGAGCAGGTGCAGGAAGAGCTGCTGAGCTCCCAGGTCACCCAGGAGCTGAGGTTTGTTTCCTTTTTTATAATACATTGAGTATGCTTGCCTTTTAGATATAGAAATATCTGATTCTGTCTTCTTCACTAAATTTTGATTACATGATTTGACAGCAATATTGAAGAGTCTAACAGCCAGCACCCAGGTTGGTAAGTACTGGTTCTTTGTTAGCTAGGTTTTCTTCTTCTTCACTTTTAAAACTAAATAGATGGACAATGCTTATGATGCAATAAGGTTTAATAAACACTGTTCAGTTCAGTATTTGGTCATGTAATTCCTGTTAAAAAACAGTCATCTCCTTGGTTTAAAAAAATTAAAAGTGGGAAAACAAAGAAATAGCAGAATATAGTGAAAAAAAATAACCACAGTATTTTTGTTTGGACTTACCACTTTGAAATCAAATTAGAGGAAGGCATACAGGGAAGAAATTATCCCATTTGGACAAACAGCATGTTCTCACAGTAAGCACTTATCACACTTACTTGTCAACTTTTAGAATCAAATCTAGTAGCTGACAGTACCAGGATCAGGGGTGCCAACCCTAAGCACCCCCAGAAAGCTGACTGGCCCTGTGGTTCCCACTCCAGACATGATGTCAGCTGTGAAATCCACCTCCCTGGACCATAATTAGGCTTCTGTTCTTCAGGAGACATTTGTTCAAAGTCATTTGGGCAACCATATTCTGAAAACAGCCCAGCCAGGGTGATGGATCACTTTGCAAAGATCCTCAATGAGCTATTTTCAAGTGATGACAAAGTGTGAAGTTAAGGGCTCATTTGAGAACTTTCTTTTTCATCCAAAGTAAATTCAAATATGATTAGAAATCTGACCTTTTATTACTGGAATTCTCTTGACTAAAAGTAAAATTGAATTTTAATTCCTAAATCTCCATGTGTATACAGTACTGTGGGAACATCACAGATTTTGGCTCCATGCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAGATTATTTGGATTAAAAACAAAGACTTTCTTAAGAGATGTAAAATTTTCATGATGTTTTCTTTTTTGCTAAAACTAAAGAATTATTCTTTTACATTTCAGGGCCCTTATGGATGAAACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGTCAGAACTGGAGGAGCAGCTCACCCCTGTGGCTGAGGAGACCAGGGCAAGGCTCTCCAAGGAGCTACAGGCAGCCCAGGCCAGGCTGGGTGCAGACATGGAGGATGTCTGTGGGAGACTGGTGCAGTACAGTGGTGAAGTACAGGCCATGCTTGGCCAATCCACAGAGGAGTTGAGGGTGAGGCTGGCCTCCCACCTGAGGAAGCTGAGAAAGAGACTCCTCAGGGATGCAGATGACCTCCAGAAGAGGCTGGCAGTTTACCAGGCAGGGGCCAGAGAGGGTGCAGAAAGAGGGCTGTCAGCCATCAGGGAAAGGCTGGGCCCTCTGGTGGAGCAGGGCAGAGTGAGAGCAGCAACTGTTGGCTCCTTGGCTGGGCAGCCTCTGCAGGAGAGAGCTCAGGCCTGGGGGGAGAGACTCAGGGCCAGGATGGAGGAGATGGGCTCCAGGACAAGGGACAGGTTGGATGAAGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGAGCAAAGTTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATCAGGCTTCAGGCAGAGGCCTTCCAGGCCAGGCTGAAGTCCTGGTTTGAGCCACTGGTGGAGGATATGCAGAGACAGTGGGCAGGCCTGGTGGAGAAGGTCCAGGCAGCAGTGGGTACCTCTGCAGCCCCAGTTCCCAGTGACAATCAC TGA

ApoE3chAGTco3-RBPi-FIXi (SEQ ID NO: 115) ATGAAGGTGCTGTGGGCTGCCCTGCTGGTGACCTTCCTGGCTGGTCAGTGGCAGCCAGGGGCAGCTGCACCCTTTGCAGCTCCAGGGTTCCCCAAGGGCCCTGCCTGCTGATGGCCAGTGGGCATTGTGAAGGGAAGGGAGCACCAAATGGGTGGAGGGAGGGAGGAAGCCCTTTGCCCTGGCTTGGCTGAGGATCCCCTTGGCTTTTGCAGGCTGTCAGGCTAAAGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAGCCAGAGCTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGCCAGAGATGGGAGCTGGCTCTGGGCAGGTTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTGCAGACCCTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGTCTTCTCAGGTGACCCAGGAACTGAGGTTTGTTTCCTTTTTTATAATACATTGAGTATGCTTGCCTTTTAGATATAGAAATATCTGATTCTGTCTTCTTCACTAAATTTTGATTACATGATTTGACAGCAATATTGAAGAGTCTAACAGCCAGCACCCAGGTTGGTAAGTACTGGTTCTTTGTTAGCTAGGTTTTCTTCTTCTTCACTTTTAAAACTAAATAGATGGACAATGCTTATGATGCAATAAGGTTTAATAAACACTGTTCAGTTCAGTATTTGGTCATGTAATTCCTGTTAAAAAACAGTCATCTCCTTGGTTTAAAAAAATTAAAAGTGGGAAAACAAAGAAATAGCAGAATATAGTGAAAAAAAATAACCACAGTATTTTTGTTTGGACTTACCACTTTGAAATCAAATTAGAGGAAGGCATACAGGGAAGAAATTATCCCATTTGGACAAACAGCATGTTCTCACAGTAAGCACTTATCACACTTACTTGTCAACTTTTAGAATCAAATCTAGTAGCTGACAGTACCAGGATCAGGGGTGCCAACCCTAAGCACCCCCAGAAAGCTGACTGGCCCTGTGGTTCCCACTCCAGACATGATGTCAGCTGTGAAATCCACCTCCCTGGACCATAATTAGGCTTCTGTTCTTCAGGAGACATTTGTTCAAAGTCATTTGGGCAACCATATTCTGAAAACAGCCCAGCCAGGGTGATGGATCACTTTGCAAAGATCCTCAATGAGCTATTTTCAAGTGATGACAAAGTGTGAAGTTAAGGGCTCATTTGAGAACTTTCTTTTTCATCCAAAGTAAATTCAAATATGATTAGAAATCTGACCTTTTATTACTGGAATTCTCTTGACTAAAAGTAAAATTGAATTTTAATTCCTAAATCTCCATGTGTATACAGTACTGTGGGAACATCACAGATTTTGGCTCCATGCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAGATTATTTGGATTAAAAACAAAGACTTTCTTAAGAGATGTAAAATTTTCATGATGTTTTCTTTTTTGCTAAAACTAAAGAATTATTCTTTTACATTTCAGGGCCCTGATGGATGAGACTATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGTCTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAGGAGACCAGGGCCAGGCTGAGCAAGGAGCTGCAGGCTGCCCAGGCCAGACTGGGGGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGCAGACTGGTGCAGTACAGTGGGGAGGTGCAGGCCATGCTGGGGCAGTCTACTGAGGAGCTGAGGGTGAGGCTGGCCAGCCACCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGGCTGGCTGTGTATCAGGCTGGGGCTAGGGAGGGGGCTGAGAGGGGCCTGTCTGCCATCAGGGAGAGGCTGGGGCCTCTGGTGGAGCAGGGCAGGGTGAGGGCTGCCACTGTGGGGAGCCTGGCTGGCCAGCCTCTGCAGGAGAGGGCTCAGGCCTGGGGGGAGAGGCTGAGGGCCAGGATGGAGGAGATGGGGAGCAGGACCAGGGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCCAAGCTGGAAGAGCAGGCCCAGCAGATCAGGCTGCAGGCTGAGGCCTTCCAGGCCAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGCACCTCTGCTGCCCCTGTGCCCTCTGACAATCAC TGA

ApoE3ch外顯子

ApoE3ch外顯子1 (SEQ ID NO: 116) ATGAAGGTGCTGTGGGCTGCCCTGCTGGTGACCTTCCTGGCTG

ApoE3ch外顯子2 (SEQ ID NO: 117) GCTGTCAGGCTAAAGTGGAGCAGGCTGTGGAGACTGAGCCTGAGCCAGAGCTGAGGCAGCAGACTGAGTGGCAGTCTGGCCAGAGATGGGAGCTGGCTCTGGGCAGGTTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTGCAGACCCTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGTCTTCTCAGGTGACCCAGGAACTGAG

ApoE3ch外顯子3 (SEQ ID NO: 118) GGCCCTGATGGATGAGACTATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGTCTGAGCTGGAGGAGCAGCTGACCCCTGTGGCTGAGGAGACCAGGGCCAGGCTGAGCAAGGAGCTGCAGGCTGCCCAGGCCAGACTGGGGGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGCAGACTGGTGCAGTACAGTGGGGAGGTGCAGGCCATGCTGGGGCAGTCTACTGAGGAGCTGAGGGTGAGGCTGGCCAGCCACCTGAGGAAGCTGAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGGCTGGCTGTGTATCAGGCTGGGGCTAGGGAGGGGGCTGAGAGGGGCCTGTCTGCCATCAGGGAGAGGCTGGGGCCTCTGGTGGAGCAGGGCAGGGTGAGGGCTGCCACTGTGGGGAGCCTGGCTGGCCAGCCTCTGCAGGAGAGGGCTCAGGCCTGGGGGGAGAGGCTGAGGGCCAGGATGGAGGAGATGGGGAGCAGGACCAGGGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCCAAGCTGGAAGAGCAGGCCCAGCAGATCAGGCTGCAGGCTGAGGCCTTCCAGGCCAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGCACCTCTGCTGCCCCTGTGCCCTCTGACAATCAC TGA

內含子

FIXi (FIX衍生之內含子；無CpG) (SEQ ID NO: 119) GTTTGTTTCCTTTTTTATAATACATTGAGTATGCTTGCCTTTTAGATATAGAAATATCTGATTCTGTCTTCTTCACTAAATTTTGATTACATGATTTGACAGCAATATTGAAGAGTCTAACAGCCAGCACCCAGGTTGGTAAGTACTGGTTCTTTGTTAGCTAGGTTTTCTTCTTCTTCACTTTTAAAACTAAATAGATGGACAATGCTTATGATGCAATAAGGTTTAATAAACACTGTTCAGTTCAGTATTTGGTCATGTAATTCCTGTTAAAAAACAGTCATCTCCTTGGTTTAAAAAAATTAAAAGTGGGAAAACAAAGAAATAGCAGAATATAGTGAAAAAAAATAACCACAGTATTTTTGTTTGGACTTACCACTTTGAAATCAAATTAGAGGAAGGCATACAGGGAAGAAATTATCCCATTTGGACAAACAGCATGTTCTCACAGTAAGCACTTATCACACTTACTTGTCAACTTTTAGAATCAAATCTAGTAGCTGACAGTACCAGGATCAGGGGTGCCAACCCTAAGCACCCCCAGAAAGCTGACTGGCCCTGTGGTTCCCACTCCAGACATGATGTCAGCTGTGAAATCCACCTCCCTGGACCATAATTAGGCTTCTGTTCTTCAGGAGACATTTGTTCAAAGTCATTTGGGCAACCATATTCTGAAAACAGCCCAGCCAGGGTGATGGATCACTTTGCAAAGATCCTCAATGAGCTATTTTCAAGTGATGACAAAGTGTGAAGTTAAGGGCTCATTTGAGAACTTTCTTTTTCATCCAAAGTAAATTCAAATATGATTAGAAATCTGACCTTTTATTACTGGAATTCTCTTGACTAAAAGTAAAATTGAATTTTAATTCCTAAATCTCCATGTGTATACAGTACTGTGGGAACATCACAGATTTTGGCTCCATGCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAGATTATTTGGATTAAAAACAAAGACTTTCTTAAGAGATGTAAAATTTTCATGATGTTTTCTTTTTTGCTAAAACTAAAGAATTATTCTTTTACATTTCAG

RBPi (RBP4內含子；無CpG) (SEQ ID NO: 120) GTCAGTGGCAGCCAGGGGCAGCTGCACCCTTTGCAGCTCCAGGGTTCCCCAAGGGCCCTGCCTGCTGATGGCCAGTGGGCATTGTGAAGGGAAGGGAGCACCAAATGGGTGGAGGGAGGGAGGAAGCCCTTTGCCCTGGCTTGGCTGAGGATCCCCTTGGCTTTTGCAG

VCLi (VCL內含子；無CpG) (SEQ ID NO: 121) GTAGGCAATCTGAGACAAAAAGCCTACTCTTGAAGATAATAATGGAAGATTGATGATTGTTTAGAATGAAAATATGTTGAATGCTGCACATCTGTGTTACCATGTTTGCTAGTTGTCCACCCATGTGATTGAATACTCTGAAATATTTTTTCAG

CpG減少之ApoE

ApoE3_h5 (SEQ ID NO: 124) ATGAAGGTGTTGTGGGCAGCACTGCTGGTCACTTTCCTGGCAGGCTGCCAGGCGAAGGTGGAGCAGGCAGTAGAGACTGAACCAGAACCTGAACTGAGGCAACAGACTGAATGGCAGAGTGGTCAAAGATGGGAACTGGCCCTTGGAAGGTTTTGGGACTACCTGAGGTGGGTGCAGACCCTCAGTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTGAGCTCCCAGGTGACCCAAGAACTAAGGGCTCTGATGGATGAGACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGTCTGAGCTGGAGGAACAGCTCACCCCAGTGGCTGAAGAGACTAGAGCAAGGCTCAGCAAGGAGTTGCAGGCTGCCCAGGCCAGGCTGGGGGCTGACATGGAAGATGTATGTGGAAGGCTTGTGCAGTACAGGGGCGAGGTGCAGGCCATGCTGGGACAGAGCACTGAAGAGCTGAGGGTTCGGCTAGCCTCCCACTTAAGGAAGCTAAGAAAAAGACTGCTCAGAGATGCCGACGACCTCCAGAAGAGACTGGCTGTGTACCAGGCTGGAGCCAGAGAGGGAGCAGAGAGAGGACTGAGTGCCATTAGGGAGAGATTGGGTCCCCTGGTAGAGCAGGGCAGGGTCAGAGCTGCCACAGTGGGCTCTTTGGCAGGCCAGCCTTTGCAGGAAAGAGCTCAGGCCTGGGGAGAGAGACTGAGAGCCAGGATGGAGGAGATGGGATCTAGGACCAGGGACAGACTGGATGAAGTCAAAGAACAAGTTGCTGAGGTCCGGGCTAAGCTGGAGGAGCAAGCCCAGCAGATTAGGCTACAGGCAGAGGCCTTCCAGGCCAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAGCCTTTGGTAGAGGACATGCAGAGACAGTGGGCTGGGTTGGTGGAGAAGGTCCAGGCTGCTGTTGGCACATCAGCAGCCCCTGTCCCCAGTGACAACCAC TGA

ApoE3_h6 (SEQ ID NO: 125) ATGAAGGTCCTCTGGGCAGCCCTGCTGGTCACATTCCTGGCAGGCTGTCAAGCCAAGGTGGAACAAGCTGTGGAGACTGAGCCAGAGCCAGAGCTCAGGCAGCAAACAGAGTGGCAGTCGGGGCAGAGATGGGAATTGGCACTGGGAAGATTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTTCAGACCCTGTCAGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTCCTGAGCTCACAAGTCACTCAAGAGCTGAGAGCACTTATGGATGAAACCATGAAGGAATTAAAGGCCTACAAATCAGAATTGGAAGAGCAGCTGACACCTGTGGCTGAAGAGACCAGGGCCAGACTGAGTAAAGAACTGCAAGCAGCCCAGGCCAGACTTGGAGCTGACATGGAGGATGTTTGTGGCAGGCTGGTGCAGTACAGAGGTGAAGTCCAAGCCATGCTGGGACAATCCACAGAGGAGCTGCGTGTCCGGCTAGCCAGCCACCTAAGAAAACTGAGGAAGAGACTCCTGAGGGATGCTGATGATCTCCAGAAAAGGTTGGCTGTGTACCAAGCTGGAGCCAGGGAAGGAGCTGAAAGGGGACTCTCTGCCATCAGAGAAAGACTGGGTCCCCTGGTGGAGCAGGGCAGGGTGCGGGCAGCAACAGTGGGAAGCTTGGCAGGACAGCCACTCCAGGAAAGGGCACAGGCATGGGGAGAAAGGCTGAGAGCACGGATGGAAGAGATGGGCAGCAGGACCAGGGACAGGCTGGATGAGGTGAAGGAACAAGTGGCAGAGGTAAGGGCAAAACTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATTCGCCTCCAGGCTGAAGCCTTCCAAGCAAGGTTGAAAAGCTGGTTTGAGCCTCTTGTGGAAGACATGCAGAGACAGTGGGCTGGCCTTGTGGAAAAAGTCCAAGCTGCAGTAGGCACCAGTGCAGCACCTGTCCCATCAGACAACCAT TGA

ApoE3_h7 ((SEQ ID NO: 126) ATGAAAGTCCTCTGGGCTGCCTTGCTGGTAACTTTCTTGGCTGGCTGCCAGGCCAAGGTGGAGCAAGCTGTGGAAACAGAGCCTGAGCCGGAGCTGAGGCAACAGACAGAATGGCAGTCAGGCCAGAGGTGGGAGCTGGCTCTGGGGAGATTCTGGGATTACCTTCGCTGGGTCCAGACACTCTCTGAACAAGTGCAAGAGGAGCTGCTGTCCTCCCAAGTCACCCAGGAGCTGAGAGCCTTGATGGATGAAACCATGAAAGAGCTGAAAGCTTACAAGTCTGAGCTGGAGGAACAGTTGACCCCAGTGGCTGAGGAGACCAGGGCCAGATTGTCCAAGGAACTGCAGGCTGCTCAGGCAAGGTTGGGGGCAGATATGGAGGATGTGTGTGGGAGGTTGGTGCAGTACAGAGGTGAGGTGCAGGCCATGCTGGGACAGAGCACTGAAGAGCTAAGGGTCAGATTAGCAAGTCATTTGAGGAAGCTGAGAAAGAGGCTGCTGAGAGACGCGGATGACCTTCAGAAGAGACTGGCTGTCTACCAAGCTGGTGCCAGAGAAGGGGCTGAAAGAGGTCTCTCAGCCATCAGGGAGAGGCTGGGGCCTCTGGTTGAGCAGGGTAGGGTGAGGGCGGCTACTGTGGGATCCCTGGCTGGTCAACCACTCCAAGAAAGAGCACAGGCCTGGGGGGAGAGACTCCGTGCCAGAATGGAGGAAATGGGCAGCAGGACAAGAGACAGGCTGGATGAGGTCAAGGAGCAAGTAGCAGAAGTGAGGGCCAAACTGGAGGAACAGGCCCAGCAGATCAGACTCCAAGCTGAGGCCTTCCAGGCCAGGCTGAAATCTTGGTTTGAGCCTTTGGTAGAAGACATGCAGAGGCAGTGGGCAGGGTTGGTAGAAAAGGTGCAGGCTGCTGTGGGGACTTCAGCAGCCCCTGTGCCCTCAGACAATCAC TGA

ApoE3_h12 (SEQ ID NO: 127) ATGAAGGTCCTCTGGGCTGCCCTGCTGGTCACCTTTCTAGCTGGGTGCCAGGCCAAGGTGGAACAAGCAGTGGAAACTGAGCCTGAGCCTGAGCTGAGGCAACAGACAGAGTGGCAGTCTGGTCAGAGGTGGGAGCTTGCACTGGGGAGGTTCTGGGATTACCTCCGCTGGGTGCAGACCCTGAGTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTCCTTAGCTCACAGGTTACTCAGGAGTTGAGAGCACTCATGGATGAAACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAAAGTGAACTGGAAGAACAGCTGACCCCTGTTGCAGAAGAAACCAGGGCAAGGCTCTCCAAAGAGCTGCAAGCTGCTCAGGCAAGACTGGGTGCTGACATGGAGGATGTCTGTGGCAGGCTGGTGCAGTATCGTGGCGAAGTACAGGCAATGCTGGGGCAGTCCACTGAAGAGCTGAGAGTGCGGCTGGCTTCTCATCTTAGGAAGTTAAGGAAGAGGCTGCTCCGAGATGCTGATGACCTCCAGAAGAGGCTGGCTGTGTATCAGGCTGGGGCAAGGGAGGGGGCAGAGAGGGGCCTCTCTGCCATAAGGGAGAGACTGGGTCCACTGGTGGAACAAGGCCGAGTGAGAGCAGCCACAGTCGGCTCTCTGGCAGGGCAGCCCCTCCAAGAAAGAGCCCAGGCTTGGGGAGAAAGACTGAGGGCCAGGATGGAGGAAATGGGATCCAGGACAAGAGATCGCCTGGATGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCTGAGGTGAGGGCAAAGCTGGAAGAGCAAGCCCAGCAGATCAGGCTCCAGGCTGAAGCTTTCCAAGCAAGGCTGAAAAGCTGGTTTGAGCCCCTGGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCAGGCCTGGTGGAGAAAGTTCAGGCAGCTGTGGGTACTTCAGCTGCACCTGTCCCTTCTGACAATCAC TGA

ApoE3_h15 (SEQ ID NO: 128) ATGAAAGTCCTGTGGGCAGCGCTCCTGGTCACCTTCCTGGCTGGCTGTCAAGCTAAAGTGGAGCAGGCTGTGGAAACAGAGCCTGAGCCAGAACTTAGACAACAAACTGAGTGGCAGAGTGGGCAGAGGTGGGAGCTGGCCTTGGGCAGATTCTGGGACTACCTGCGCTGGGTCCAGACTCTTTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTCCTGTCCAGTCAGGTGACCCAGGAGCTGAGGGCTCTCATGGATGAGACAATGAAAGAGCTGAAGGCCTACAAAAGTGAGCTGGAAGAGCAGCTGACCCCAGTGGCTGAAGAGACAAGGGCCAGGTTAAGCAAAGAGCTCCAGGCTGCCCAGGCCAGGCTGGGAGCAGACATGGAGGATGTCTGCGGCCGCCTGGTCCAGTATAGAGGGGAGGTGCAAGCCATGTTAGGCCAGAGCACTGAAGAGCTGAGGGTGAGGTTAGCTTCTCACCTGAGAAAATTAAGGAAGAGGCTGCTGAGGGATGCTGATGACCTGCAGAAGAGGTTGGCTGTTTACCAGGCAGGGGCTAGAGAGGGAGCAGAGAGGGGCCTCTCTGCCATCAGAGAGAGGCTGGGCCCCCTTGTGGAGCAGGGCCGTGTCCGGGCAGCTACTGTTGGCTCACTTGCAGGGCAGCCTCTGCAGGAAAGAGCCCAGGCATGGGGGGAGCGGTTAAGGGCAAGAATGGAAGAGATGGGCTCAAGGACAAGAGACAGGCTGGACGAAGTGAAGGAGCAGGTGGCAGAAGTGAGGGCCAAGCTAGAGGAACAGGCCCAGCAGATTCGCCTCCAGGCAGAAGCCTTCCAGGCCAGGCTCAAGTCCTGGTTTGAGCCCTTAGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCTGGCCTGGTGGAGAAGGTACAGGCTGCTGTGGGGACTTCAGCAGCCCCAGTGCCCAGTGACAACCAC TGA

ApoE3_h24 (SEQ ID NO: 129) ATGAAGGTCCTCTGGGCAGCTCTCCTGGTTACCTTCTTAGCTGGCTGTCAAGCCAAAGTAGAACAAGCAGTGGAAACAGAGCCGGAGCCAGAGCTCAGACAGCAAACAGAATGGCAGTCTGGTCAGAGATGGGAACTGGCACTGGGTAGGTTCTGGGACTACCTGAGGTGGGTCCAGACCCTGTCAGAGCAGGTCCAGGAAGAGCTGCTGAGCAGCCAGGTGACTCAAGAGCTGCGTGCCCTCATGGATGAAACCATGAAGGAGCTGAAGGCCTACAAGAGTGAGTTAGAAGAGCAGCTCACACCTGTGGCTGAAGAAACAAGGGCCCGCCTCAGCAAGGAGCTGCAAGCTGCACAGGCCAGGCTGGGTGCTGATATGGAGGATGTGTGCGGCAGGCTGGTGCAGTATCGTGGGGAAGTCCAGGCCATGTTGGGCCAATCCACAGAGGAGCTCAGAGTTCGCCTTGCCTCCCATCTCAGGAAACTAAGAAAGAGACTACTGCGGGATGCTGATGACCTTCAGAAGAGGCTGGCTGTGTACCAGGCAGGAGCCAGAGAGGGGGCTGAGAGGGGTCTCTCAGCCATCAGGGAAAGACTTGGGCCCTTGGTTGAGCAGGGCAGGGTGCGGGCAGCCACAGTTGGGTCTCTGGCTGGCCAGCCCCTCCAGGAGAGAGCTCAGGCCTGGGGTGAGAGACTTCGAGCTAGGATGGAGGAGATGGGGAGCAGGACCAGGGACAGGTTGGATGAGGTCAAGGAGCAGGTGGCAGAAGTGAGAGCCAAGCTGGAAGAGCAGGCCCAGCAAATCAGGCTGCAAGCAGAGGCATTTCAGGCCCGGCTCAAGTCATGGTTTGAGCCTCTGGTGGAGGACATGCAGAGGCAGTGGGCTGGGCTGGTGGAAAAGGTACAGGCTGCTGTGGGCACCAGTGCAGCACCTGTCCCATCTGATAACCAT TGA

ApoE3_h30 (SEQ ID NO: 130) ATGAAAGTCCTGTGGGCAGCCCTCCTTGTGACCTTCCTGGCAGGCTGTCAAGCAAAGGTGGAGCAGGCTGTAGAGACTGAGCCAGAGCCTGAACTGAGGCAGCAGACAGAATGGCAGTCTGGCCAGAGATGGGAGCTGGCCCTGGGAAGATTTTGGGACTATCTCCGCTGGGTCCAGACCCTGTCAGAACAGGTTCAGGAAGAGCTGCTTTCCAGCCAAGTGACACAGGAGCTGAGAGCCCTTATGGATGAGACAATGAAAGAACTGAAGGCTTATAAAAGTGAGCTAGAGGAGCAGCTGACCCCAGTGGCTGAAGAGACCCGGGCCCGGCTGAGCAAAGAGCTCCAGGCTGCACAGGCCAGATTGGGAGCTGACATGGAGGATGTGTGTGGGAGACTAGTGCAGTACAGGGGTGAAGTGCAGGCCATGCTGGGACAAAGCACAGAAGAGTTGAGAGTCAGGCTGGCATCCCACCTGAGGAAACTCAGGAAAAGACTCCTCCGTGATGCAGATGACCTCCAGAAGAGACTGGCAGTCTATCAGGCTGGTGCCAGAGAGGGCGCCGAGAGAGGACTCTCAGCCATCAGGGAGCGGCTGGGGCCTCTGGTTGAGCAGGGCAGAGTCAGAGCAGCAACAGTGGGGAGTCTGGCCGGCCAGCCCTTACAAGAGAGAGCTCAGGCATGGGGAGAGAGGCTTCGCGCTAGGATGGAAGAAATGGGATCAAGGACTAGAGACAGGTTGGATGAAGTAAAGGAGCAGGTGGCAGAAGTGAGGGCCAAGCTTGAGGAGCAGGCCCAGCAGATCAGGCTACAGGCTGAGGCATTTCAGGCCAGGCTGAAGAGCTGGTTTGAGCCCTTGGTGGAGGATATGCAGAGGCAGTGGGCTGGATTGGTGGAAAAGGTACAGGCTGCTGTTGGGACGAGTGCTGCTCCTGTCCCCTCTGATAATCAT TGA

實例

下文提供進一步說明本發明之不同特徵的實例及用於實踐本發明之方法。所提供之實例並不限制所主張之本發明。

實例 1 ： 肝臟介導之 ApoE3(ch) 及 ApoE3 轉殖基因表現

使用野生型C57BL/6及ApoE基因剔除(KO)小鼠，及包含表現ApoE3(ch)或ApoE3之轉殖基因的rAAV來評估ApoE3(ch)及ApoE3轉殖基因表現對膽固醇的影響。重組AAV核酸係由rAAV聚核苷酸構成，該等rAAV聚核苷酸包含功能上偶合至編碼ApoE3或ApoE(ch)之核酸的ApoE/hAAT啟動子/強化子，以及其他表現載體組件及ITR，如圖1中所繪示。

雌性野生型C57BL/6及ApoE基因剔除(KO)小鼠(B6.129P2-Apoetm1Unc/J, Jackson Labs，細胞株#：002052)係獲自Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine, USA)。ApoE基因剔除小鼠患有高脂血症且在年齡為六個月時出現自發性動脈粥樣硬化。在8週齡時收集基線血漿。在9週齡時，經由尾部靜脈，靜脈內投與作為對照之200 mL賦形劑稀釋劑(PBS180/0.001%普朗尼克(Pluronic) F66，pH 7.3)，或200 mL含有低劑量或高劑量rAAV (轉殖基因及殼體)之稀釋劑。包含ApoE3(ch)轉殖基因之重組AAV係以3e12 vg/kg之低劑量或1e13 vg/kg之高劑量提供。包含ApoE3轉殖基因之重組AAV係以3e12 vg/kg之低劑量或6e12 vg/kg rAAV之高劑量提供。總設計提供於表2中。病毒殼體包含具有SEQ ID NO: 83之VP1 (美國專利第9,169,299號)、具有SEQ ID NO: 122之VP2及具有SEQ ID NO: 123之VP3。

表2

小組	雌性小鼠數目	基因型	轉殖基因	劑量	所注射之體積
1	8	C57BL/6	賦形劑對照		200 µL
2	8	ApoE KO	賦形劑對照		200 µL
3	8	ApoE KO	ApoE/hAAT.hApoE3ch	低	200 µL
4	8	ApoE KO	ApoE/hAAT.hApoE3ch	高	200 µL
5	8	ApoE KO	ApoE/hAAT.hApoE3	低	200 µL
6	8	ApoE KO	ApoE/hAAT.hApoE3	高	200 µL

根據製造商之說明書，在AAV注射之後的前8週，每週收集血漿，且其後每月收集，以用於使用EnzyChrom™ AF HDL及LDL/VLDL分析法套組(Bioassay Systems, Hayward, CA, USA)來量測總膽固醇、高密度脂蛋白(HDL)及低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白(LDL/VLDL)膽固醇且藉由ELISA (Mabtech Ab, Sweden)來量測ApoE3蛋白。

圖2A至圖2E繪示在36週之時程內ApoE基因剔除小鼠中之ApoE3及ApoE3(ch)轉殖基因表現，以及轉殖基因表現對膽固醇之影響。包含ApoE(ch)轉殖基因之重組AAV係以3e12 vg/kg之低劑量或1e13 vg/kg之高劑量提供。包含ApoE3轉殖基因之重組AAV係以3e12 vg/kg之低劑量或6e12 vg/kg rAAV之高劑量提供。圖2A繪示hAPOE產生，圖2B繪示總膽固醇，圖2C繪示HDL，圖2D繪示LDL/VLDL膽固醇比率，且圖2E繪示總膽固醇/HDL比率。血漿hAPOE含量與總膽固醇(p＜0.0001；斯皮爾曼(Spearman) r= -0.6214)、LDL/VLDL膽固醇(p＜0.0001；斯皮爾曼r= -0.6854)、總膽固醇/HDL比率(p＜0.0001；斯皮爾曼r= -0.6792)顯著負相關，但與HDL膽固醇(p＜0.0001，斯皮爾曼r=0.4584)顯著正相關。

實例 2 ： CpG 耗盡之 ApoE3(ch) 及 ApoE3 轉殖基因表現

使用野生型C57BL/6及ApoE基因剔除(KO)小鼠，及包含不同CpG耗盡之ApoE3(ch)及ApoE3轉殖基因的rAAV來評估不同CpG耗盡之ApoE(ch)及ApoE構築體對膽固醇的影響。重組AAV核酸含有功能上偶合至編碼ApoE3或ApoE(ch)之核酸的ApoE/hAAT啟動子/強化子，以及其他表現載體組件及ITR，如圖1中所繪示。

雌性野生型C57BL/6及ApoE基因剔除(KO)小鼠(B6.129P2-Apoetm1Unc/J, Jackson Labs，細胞株#：002052)係獲自Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine, USA)。在8週齡時收集基線血漿。在9週齡時，經由尾部靜脈，靜脈內投與作為對照之200 mL賦形劑稀釋劑(PBS180/0.001%普朗尼克F66，pH 7.3)，或200 mL含有1e13 vg/kg (2e11總vg)之rAAV (轉殖基因及殼體)之稀釋劑。病毒殼體包含具有SEQ ID NO: 83之VP1、具有SEQ ID NO: 122之VP2及具有SEQ ID NO: 123之VP3。

根據製造商之說明書，在rAAV注射後的第3週及第6週收集血漿，以用於使用EnzyChrom™ AF HDL及LDL/VLDL分析法套組(Bioassay Systems, Hayward, CA, USA)量測總膽固醇、高密度脂蛋白(HDL)及低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白(LDL/VLDL)膽固醇且藉由ELISA (Mabtech Ab, Sweden)量測ApoE3蛋白。結果展示於圖3A至圖3E、圖4A至圖4E、圖5A至圖5E及圖6A至圖6E中。不同構築體之SEQ ID NO:提供於表3中。

表 3

ApoE3(ch)	SEQ ID NO:	ApoE3	SEQ ID NO:
APOE3ch-N	1	APOE3-N	2
APOE3ch-4	6	APOE3-3	20
APOE3ch-6	8	APOE3-8	25
APOE3ch-7	9	APOE3-9	26
APOE3ch-9	11	APOE3-11	28
APOE3ch-10	12	APOE3-12	29
APOE3ch-11	13	APOE3-15	31
APOE3ch-13	15
APOE3ch-15	17

圖3A至圖3E繪示在3週時來自不同構築體之ApoE3(ch)轉殖基因表現，及轉殖基因表現對膽固醇之影響。圖3A繪示hAPOE含量，圖3B繪示總膽固醇，圖3C繪示LDL/VLDL膽固醇比率，圖3D繪示HDL膽固醇，且圖3E繪示總膽固醇/HDL比率。

圖4A至圖4E繪示在6週時來自不同構築體之ApoE3(ch)轉殖基因表現，及轉殖基因表現對膽固醇之影響。圖4A繪示hAPOE含量，圖4B繪示總膽固醇，圖4C繪示LDL/VLDL膽固醇比率，圖4D繪示HDL膽固醇，且圖4E繪示總膽固醇/HDL比率。

圖5A至圖5E繪示在3週時來自不同構築體之ApoE3轉殖基因表現，及轉殖基因表現對膽固醇之影響。圖5A繪示hAPOE含量，圖5B繪示總膽固醇，圖5C繪示LDL/VLDL膽固醇比率，圖5D繪示HDL膽固醇，且圖5E繪示總膽固醇/HDL比率。

圖6A至圖6E繪示在6週時來自不同構築體之ApoE3轉殖基因表現，及轉殖基因表現對膽固醇之影響。圖6A繪示hAPOE含量，圖6B繪示總膽固醇，圖6C繪示LDL/VLDL膽固醇比率，圖6D繪示HDL膽固醇，且圖6E繪示總膽固醇/HDL比率。

實例 3 ：肝臟表現

肝臟組織樣品係獲自在六週時在實例2中治療之小鼠，且測定hAPOE/總蛋白(圖7A)及載體基因體拷貝數(VCGN)/μg gDNA (圖7B)。藉由JESS測定hAPOE含量。藉由每微克gDNA之qPCR對VCGN進行評估。H&E病理學評估未觀測到肝臟組織之免疫浸潤(資料未示出)。

實例 4 ：動脈粥狀瘤病變

使用野生型及ApoE基因剔除小鼠，及包含表現ApoE3(ch)或ApoE3之轉殖基因的rAAV來評估ApoE3(ch)及ApoE3轉殖基因表現對動脈粥狀瘤病變的影響。藉由在AAV注射後的40週，對來自實例1中所使用之小鼠的動脈粥狀瘤脂肪包涵體進行目測及定量來評估主動脈之動脈粥狀瘤病變。

在AAV注射後的40週，藉由在轉移至蔗糖梯度之前於三聚甲醛(4%)中浸沒固定24小時來收集主動脈。將主動脈在dPBS中洗滌，在60%異丙醇中平衡，且用油紅O染色動脈粥狀瘤脂肪包涵體。在正面製劑中以全組織包埋(whole-mount)形式剝離主動脈以用於成像，來自不同小組之代表性背部及同時影像提供於圖8中。圖9繪示病變面積百分比之定量，其中圖上之各點為來自小鼠之資料。

實例 5 ： ApoE3 及 ApoE3ch 轉殖基因表現之抗發炎作用

進一步評估實例1中所治療之小鼠以測定包含APOE3ch或APOE轉殖基因之rAAV的抗發炎作用。每月自經rAAV治療之APOE KO小鼠收集血漿。將來自第20週、第24週及第28週(n=5/組)之血漿組合，以提供足夠體積來操作由MesoScale Diagnostics製造之小鼠細胞介素組合以量測發炎標記物。MesoScale Diagnostics小鼠細胞介素組合對19種發炎標記物(V-PLEX小鼠細胞介素19-Plex套組)進行量測。相對於WT小鼠，經賦形劑(媒劑對照)治療之APOE KO小鼠中之六種發炎血漿蛋白升高，且相對於APOE3(ch)基因療法標準化。

結果展示於圖10A至圖10F中。APOE3ch L及APOE3-L係指被提供3e12 vg/kg rAAV之低劑量之KO小鼠。APOE3ch-H及APOE3-H係指被提供1e13 vg/kg rAAV之高劑量之KO小鼠。圖10A繪示IL-5含量，圖10B繪示IL-6含量，圖10C繪示TNF-α含量，圖10D繪示IL-17A/F含量，圖10E繪示CCL2含量，且圖10F繪示CXCL2。單因子ANOVA，鄧尼特氏事後檢定。相對於WT賦形劑，#p＜0.05，##p＜0.01，相對於KO賦形劑，*p＜0.05，**p＜0.01。

實例 6 ： ApoE3 及 ApoE3ch 轉殖基因表現對 GFAP 之作用

進一步評估實例1中所治療之小鼠以測定包含APOEch或APOE轉殖基因之rAAV對膠質纖維酸性蛋白(GFAP)含量之作用。藉由使用毛細管電泳(JESS, Protein Simple)或免疫螢光定量對蛋白質進行定量來量測不同大腦區域中之GFAP含量。在用APOE3(ch)基因療法治療APOE KO小鼠後的40週收集大腦樣品。

結果展示於圖11A至圖11D中。APOE3ch-H及APOE3-H係指被提供1e13 vg/kg rAAV之高劑量之KO小鼠。APOE3ch L及APOE3-L係指被提供3e12 vg/kg rAAV之低劑量之KO小鼠。圖11A繪示藉由JESS所測定的皮質中之GFAP/總蛋白。圖11B繪示藉由JESS所測定的海馬回中之GFAP/總蛋白。圖11C繪示藉由免疫螢光定量所測定的整個大腦中之GFAP面積%。圖11D繪示藉由免疫螢光定量所測定的海馬回中之GFAP面積%。

用抗GFAP抗體(AB5541, Millipore；1:500)對大腦發炎性星形膠質細胞標記物GFAP進行免疫螢光染色，且使用HALO®影像分析軟體(IndicaLabs)對GFAP面積百分比進行定量，顯示APOE KO小鼠之整個大腦及海馬回中之GFAP免疫反應性增加。在投與APOE3(ch)及APOE3基因療法之小鼠中，升高之GFAP免疫反應性以劑量依賴性方式降低。藉由GFAP蛋白質及蛋白質定量，在皮質及海馬回中觀測到類似結果。

實例 7 ： ApoE3 及 ApoE3ch 轉殖基因表現對突觸前及突觸後蛋白之作用

進一步評估實例1中所治療之小鼠以測定包含APOE3ch或APOE3轉殖基因之rAAV對突觸前及突觸後蛋白之作用。在APOE3(ch)基因療法或媒劑處理後的40週，自小鼠製備大腦溶胞物。為了確定APOE3(ch)及APOE轉殖基因表現是否對大腦內神經元連接之數目具有影響，藉由在皮質及海馬回中進行毛細管電泳(JESS, Protein Simple)分別對突觸前蛋白及突觸後蛋白突觸素及PSD-95進行定量。

結果展示於圖12A至圖12D中。APOE3ch (低)及APOE3 (低)係指被提供3e12 vg/kg rAAV之低劑量之KO小鼠。APOE3ch (高)及APOE3 (高)係指被提供1e13 vg/kg rAAV之高劑量之KO小鼠。圖12A繪示海馬回中之突觸素/總蛋白。圖12B繪示海馬回中之PSD-95/總蛋白。圖12C繪示皮質中之突觸素/總蛋白。圖12D繪示皮質中之PSD-95/總蛋白。

實例 7 ：動脈粥狀瘤病變 (9 週 )

藉由對經rAAV治療之ApoE基因剔除小鼠(B6.129P2-Apoetm1Unc/J, Jackson Labs，細胞株#：002052)中的動脈粥狀瘤病變進行定量來評估包含APOE3ch或APOE3轉殖基因之rAAV對動脈粥樣硬化之作用。自患有預先存在之重度動脈粥樣硬化的1歲APOE KO小鼠收集主動脈。重組AAV核酸含有功能上偶合至編碼ApoE3或ApoE3ch之核酸的ApoE/hAAT啟動子/強化子，以及其他表現載體組件及ITR，如圖1中所繪示。表4概述ApoE編碼序列。

表 4

	SEQ ID NO:	圖
APOE3ch-N	1
APOE3-N	2
APOE3-3	20
APOE3ch-9	11

來自基線組之主動脈充當治療之前動脈粥樣硬化之量度。用包含天然ApoE3 (ApoE3-N)及天然ApoE3ch (ApoE3ch-N)轉殖基因序列，以及CpG-0、經密碼子最佳化之變異體APOE3-3及APOE3ch-9的rAAV治療剩餘小鼠。以兩個劑量(2e11 vg/小鼠或2e12總vg/小鼠)投與rAAV持續9週，隨後收集主動脈，用油紅O染色動脈粥樣硬化病變，且對病變體積/主動脈%進行定量。

圖13A至圖13D繪示病變面積百分比之定量，其中圖上之各點表示一隻小鼠。圖13A繪示KO小鼠及以下投與編碼ApoE之不同轉殖基因序列之小鼠中的主動脈病變面積%：E3N (天然ApoE3) 2e ¹¹vg/kg、E3-3 (ApoE3-3) 2e ¹¹vg/kg及E3-3 (ApoE3-3) 2e ¹²vg/kg。圖13B繪示來自圖13A之KO基線及來自圖13A之E3N (天然ApoE3) 2e ¹¹vg/kg及E3-3 (ApoE3-3) 2e ¹¹vg/kg小組之組合。圖13C繪示KO小鼠及投與編碼以下之不同轉殖基因序列之KO小鼠中的主動脈病變面積%：E3chN (天然ApoE3ch) 2e ¹¹vg/kg、E3ch-9 (ApoE3ch-9) 2e ¹¹vg/kg及E3ch-9 (ApoE3ch-9) 2e ¹²vg/kg。圖13D繪示來自圖13C之KO基線及E3chN (天然ApoE3ch) 2e ¹¹vg/kg及E3ch-9 (ApoE3ch-9) 2e ¹¹vg/kg之組合。

所有構築體之APOE3(ch)及APOE(ch)基因療法顯示，與基線組相比，預先存在之動脈粥樣硬化病變之減少大於17%，此支持APOE3(ch)基因治療可能逆轉動脈粥樣硬化。

實例 8 ：認知研究

已報導APOE KO小鼠在≥1歲時具有學習及記憶認知缺陷。在新穎物體識別(Novel Object Recognition；NOR)記憶測試(Antunes及Biala G, Cogn Process. 2012年5月;13(2):93-110)中，測試一歲之APOE KO小鼠(B6.129P2-Apoetm1Unc/J, Jackson Labs，細胞株#：002052)，發現其在用APOE3及APOE3ch基因療法治療之前識別記憶顯著下降。測試量測對熟悉物體之記憶，其係藉由對新穎物體之偏好所量測。對新穎物體(＞50%)時間之偏好為正常認知行為，表明小鼠具有完整之長期識別記憶。

經由尾部靜脈，以2e11 vg/小鼠之低劑量或2e12總vg/小鼠之高劑量靜脈內投與天然ApoE3 (E3天然)、天然ApoE3ch (E3ch天然)、ApoE3-3 (E3-3)及ApoE3ch-9 (E3ch-9)。構築體描述於表4中。圖14A繪示C57BL/6及ApoE基因剔除小鼠之NOR結果(*p＜0.05，未配對之雙尾t檢定)。圖14B繪示投與天然ApoE及ApoE(ch)序列之NOR結果。圖14C繪示用低劑量之編碼CpG-0 ApoE3 (E3-3)之rAAV及ApoE (Ech-9) rAAV之NOR結果。圖14D繪示用高劑量之編碼CpG-0 ApoE (E3-3)之rAAV及ApoE3ch (Ech-9) rAAV之NOR結果。在經由尾部靜脈，以兩個劑量(2e11 vg/小鼠或2e12總vg/小鼠)單次靜脈內投與天然APOE3及APOE3ch序列，以及CpG-0、經密碼子最佳化之變異體E3-3及E3ch-9後的5週，NOR記憶效能完全恢復至年齡匹配之野生型(WT)小鼠效能。

實例 9 ：額外 ApoE3 構築體

評估編碼ApoE之不同的經密碼子最佳化之CpG減少轉殖基因的能力。將轉殖基因插入質體中，將該質體一式三份轉染於AML-12細胞中。轉染後72小時，量測細胞培養物上清液中之ApoE3及抗原含量。藉由ELISA分析ApoE3含量且繪製為平均值+/-標準差。

圖15A提供展示編碼ApoE3及無CpG構築體ApoE3-3的經密碼子最佳化之CpG減少cDNA之效能的條形圖。本申請案中亦描述之不同構築體及與一些完全CpG構築體之序列一致性提供於表5中。

表 5

	SEQ ID NO:	百分比一致性
wtApoE3	1
H30	130	與H46 (SEQ ID NO: 101) 97.0%一致
H24	129	與H45 (SEQ ID NO: 100) 97.5%一致
H6	125	與H41 (SEQ ID NO: 96) 98.2%一致
H12	127	與H43 (SEQ ID NO: 98) 97.8%一致
H7	126	與H42 (SEQ ID NO: 97) 98.4%一致
H15	128	與H44 (SEQ ID NO: 99) 97.6%一致
H5	124	與H40 (SEQ ID NO: 95) 98.8%一致
E3-3	20

圖15B提供展示藉由添加內含子序列而官能化之經密碼子最佳化的ApoE3 cDNA之效能的條形圖。將內含子插入密碼子15 G/GC處(位點1)及/或密碼子79 AG/G處(位點2)之信號肽中。在指示一個內含子且未提供位點之此等情況下，將內含子插入位點1中。提及內含子RBP4i、VCLi及FIXi，若沒有指示無CpG，則指示野生型序列。VCLi-無CpG係指SEQ ID NO: 121之內含子。RBP4i-無CpG係指SEQ ID NO: 120之內含子。出於比較目的，將含有非內含子之經密碼子最佳化之ApoE3-3及H30變異體納入作為基準。藉由ELISA分析ApoE3含量且繪製為平均值+/-標準差。

儘管本發明已參考其某些特定實施例進行描述及說明，但熟習此項技術者將瞭解，可在不背離本發明之精神及範疇之情況下對程序及方案作各種調適、變化、修改、替代、缺失或添加。

圖1提供重組腺相關病毒(recombinant adeno-associated viral；rAAV)聚核苷酸卡匣之示意性實例。所提供之實例提供5' ITR、ApoE/hAAT啟動子/強化子、HBB2內含子、Kozak序列、ApoE3(ch) 編碼核酸、聚腺苷酸(polyA)序列及3' ITR之位置。

圖2A至圖2E繪示在36週之時程內，ApoE基因剔除小鼠中之ApoE3及ApoE3ch轉殖基因表現，以及轉殖基因表現對膽固醇之影響。包含ApoE3(ch)轉殖基因之重組AAV係以3e12 vg/kg之低劑量或1e13 vg/kg之高劑量提供。包含ApoE3轉殖基因之重組AAV係以3e12 vg/kg之低劑量或6e12 vg/kg rAAV之高劑量提供。圖2A繪示hAPOE血漿含量，圖2B繪示總膽固醇，圖2C繪示LDL/VLDL，圖2D繪示HDL，且圖2E繪示總膽固醇/HDL比率。第0週時間點指示在AAV投與之前的膽固醇含量。

圖3A至圖3E繪示在治療後的3週時來自不同構築體之ApoE3ch轉殖基因表現，及轉殖基因表現對膽固醇之影響。圖3A繪示hAPOE含量(相對賦形劑，** p＜0.01，*** p＜0.001，**** p＜0.0001；+等於APOE3ch天然表現)，圖3B繪示總膽固醇(相對於WT賦形劑，# p＜0.05，## p＜0.01，### p＜0.001，#### p＜0.0001；相對於KO賦形劑，* p＜0.05，**p＜0.01，*** p＜0.001，**** p＜0.0001；來自KO賦形劑動物之降低百分比描繪於選定條形圖上)；圖3C繪示LDL/VLDL (相對於WT賦形劑，## p＜0.01，### p＜0.001，#### p＜0.0001；相對於KO賦形劑，* p＜0.05，**** p＜0.0001；來自KO賦形劑動物之降低百分比描繪於選定條形圖上)；圖3D繪示HDL膽固醇(相對於WT賦形劑，# p＜0.05，## p＜0.01，### p＜0.001)；及圖3E繪示總膽固醇/HDL比率(相對於WT賦形劑，## p＜0.01；相對於KO賦形劑，* p＜0.05；來自KO賦形劑動物之增加百分比描繪於選定條形圖上)。

圖4A至圖4E繪示在治療後的6週時來自不同構築體之ApoE3ch轉殖基因表現，及轉殖基因表現對膽固醇之影響。圖4A繪示hAPOE含量(相對賦形劑，** p＜0.01，*** p＜0.001，**** p＜0.0001；+等於APOE3ch天然表現)；圖4B繪示總膽固醇(相對於WT賦形劑，## p＜0.01，#### p＜0.0001；相對於KO賦形劑，* p＜0.05，*** p＜0.001，**** p＜0.0001；來自KO賦形劑動物之降低百分比描繪於選定條形圖上)；圖4C繪示LDL/VLDL (相對於WT賦形劑，### p＜0.001，#### p＜0.0001；相對於KO賦形劑，* p＜0.01，**** p＜0.0001；來自KO賦形劑動物之降低百分比描繪於選定條形圖上)；圖4D繪示HDL膽固醇(相對於WT賦形劑，# p＜0.05，#### p＜0.0001；相對於KO賦形劑，* p＜0.05，** p＜0.01；來自KO賦形劑動物之增加百分比描繪於選定條形圖上)；及圖4E繪示總膽固醇/HDL比率(相對於WT賦形劑，## p＜0.01；相對於KO賦形劑，* p＜0.05)。

圖5A至圖5E繪示在3週時來自不同構築體之ApoE3轉殖基因表現，及轉殖基因表現對膽固醇之影響。圖5A繪示hAPOE含量(相對賦形劑，*** p＜0.001，**** p＜0.0001；除非用括號指示)；圖5B繪示總膽固醇(相對於WT賦形劑，# p＜0.05，### p＜0.01，#### p＜0.0001；相對於賦形劑，* p＜0.05，**** p＜0.0001；或用括號指示比較；來自KO賦形劑動物之降低百分比描繪於選定條形圖上)；圖5C繪示LDL/VLDL (相對於WT賦形劑，# p＜0.05，### p＜0.01，#### p＜0.0001；相對於KO賦形劑，* p＜0.05，**** p＜0.0001；或用括號指示比較；來自KO賦形劑動物之降低百分比描繪於選定條形圖上)；圖5D繪示HDL膽固醇(相對於WT賦形劑，# p＜0.05，### p＜0.01，#### p＜0.0001；相對於KO賦形劑，* p＜0.05，**** p＜0.0001；或用括號指示比較；來自KO賦形劑動物之增加百分比描繪於選定條形圖上)；及圖5E繪示總膽固醇/HDL比率(相對於WT賦形劑，## p＜0.01；相對於KO賦形劑，* p＜0.05)。

圖6A至圖6E繪示在6週時來自不同構築體之ApoE3轉殖基因表現，及轉殖基因表現對膽固醇之影響。圖6A繪示hAPOE含量(相對賦形劑，*** p＜0.001，**** p＜0.0001，除非用括號指示)；圖6B繪示總膽固醇(相對於WT賦形劑，# p＜0.05，#### p＜0.0001；相對於KO賦形劑，**** p＜0.0001；來自KO賦形劑動物之降低百分比描繪於選定條形圖上)；圖6C繪示LDL/VLDL膽固醇(相對於WT賦形劑，# p＜0.05，### p＜0.001，#### p＜0.0001；相對於KO賦形劑，**** p＜0.0001；來自KO賦形劑動物之降低百分比描繪於選定條形圖上)；圖6D繪示HDL膽固醇(相對於WT賦形劑，# p＜0.05，## p＜0.01，#### p＜0.0001；相對於KO賦形劑，** p＜0.01；來自KO賦形劑動物之降低百分比描繪於選定條形圖上)；及圖6E繪示總膽固醇/HDL比率(相對於WT賦形劑，## p＜0.01；相對於KO賦形劑，* p＜0.05，**p＜0.01)。

圖7A及圖7B繪示由不同構築體產生的肝臟組織之hAPOE/總蛋白含量(圖7A；相對於E3(ch)天然構築體，p＜0.05)及載體基因體拷貝數/µg gDNA (圖7B)。圖7B中提及「相對於天然不顯著」指示E3ch-天然構築體與不同CpG減少之構築體之間的差異不顯著(相對於E3-天然構築體，構築體E3-8、E3-9、E3-11、E3-12及E3-15之*p＜0.05)。

圖8提供經油紅O染色之動脈粥狀瘤脂肪包涵體之黑色及白色圖式。WT賦形劑係指野生型小鼠(C57BL/6)所投與之賦形劑。KO賦形劑係指ApoE基因剔除小鼠(B6.129P2-Apoetm1Unc/J, Jackson Labs，細胞株#：002052)所投與之賦形劑。APOE3ch(低)係指被提供3e12 vg/kg rAAV之低劑量之KO小鼠。APOE3ch(高)係指被提供1e13 vg/kg rAAV之高劑量之KO小鼠。APOE3(低)係指被提供3e12 vg/kg rAAV之低劑量之KO小鼠。APOE3(高)係指被提供6e12 vg/kg rAAV之高劑量之KO小鼠。

圖9繪示主動脈病變面積百分比。WT賦形劑係指野生型小鼠(C57BL/6)所投與之賦形劑。KO賦形劑係指ApoE基因剔除小鼠(B6.129P2-Apoetm1Unc/J, Jackson Labs，細胞株#：002052)所投與之賦形劑。KO賦形劑係指ApoE基因剔除小鼠所投與之賦形劑。APOEch(低)係指被提供3e12 vg/kg rAAV之低劑量之KO小鼠。APOEch(高)係指被提供1e13 vg/kg rAAV之高劑量之KO小鼠。APOE3(低)係指被提供3e12 vg/kg rAAV之低劑量之KO小鼠。APOE3(高)係指被提供6e12 vg/kg rAAV之高劑量之KO小鼠。相對於KO賦形劑，**** p＜0.0001；或用括號指示比較。

圖10A至圖10F為說明ApoE基因剔除(KO)小鼠(B6.129P2-Apoetm1Unc/J, Jackson Labs，細胞株#：002052)中包含APOE3ch或APOE3轉殖基因之rAAV之抗發炎作用的條形圖。APOE3ch L及APOE3-L係指被提供3e12 vg/kg rAAV之低劑量之KO小鼠。APOE3ch-H及APOE3-H係指被提供1e13 vg/kg rAAV之高劑量之KO小鼠。使用MesoScale Diagnostics小鼠細胞介素組合來量測抗發炎作用。圖10A繪示IL-5含量，圖10B繪示IL-6含量，圖10C繪示TNF-α含量，圖10D繪示IL-17A/F含量，圖10E繪示CCL2含量，圖10F繪示CXCL2。單因子ANOVA，鄧尼特氏事後檢定(Dunnett's post-hoc test)。相對於WT賦形劑，#p＜0.05，##p＜0.01，相對於KO賦形劑，*p＜0.05，**p＜0.01。

圖11A至圖11D為說明ApoE基因剔除(KO)小鼠(B6.129P2-Apoetm1Unc/J, Jackson Labs，細胞株#：002052)中包含APOEch或APOE轉殖基因之rAAV對膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillar acidic protein；GFAP)含量之作用的條形圖。APOE3ch L及APOE3-L係指被提供3e12 vg/kg rAAV之低劑量之KO小鼠。APOE3ch-H及APOE3-H係指被提供1e13 vg/kg rAAV之高劑量之KO小鼠。圖11A繪示藉由JESS毛細管電泳(ProteinSimple)測定的皮質中之GFAP/總蛋白。圖11B繪示藉由JESS毛細管電泳(ProteinSimple)測定的海馬回中之GFAP/總蛋白。圖11C繪示藉由用抗GFAP抗體(AB5541，Millipore；1:500)進行免疫螢光染色測定的整個大腦中之GFAP面積%及使用HALO®影像分析軟體(IndicaLabs)定量之GFAP面積%。圖11D繪示藉由免疫螢光定量使用HALO®影像分析軟體(IndicaLabs)測定的海馬回中之GFAP面積%。單因子ANOVA，隨後進行鄧尼特氏事後檢定或費雪氏事後檢定(Fisher's posthoc test)。相對於WT，#p＜0.05，相對於KO賦形劑，*p＜0.05，**p＜0.01。

圖12A至圖12D為說明ApoE基因剔除(KO)小鼠(B6.129P2-Apoetm1Unc/J, Jackson Labs，細胞株#：002052)中包含APOE3ch或APOE3轉殖基因之rAAV對皮質及海馬回中之前突觸蛋白及後突觸蛋白之作用的條形圖。APOE3ch (低)及APOE3 (低)係指被提供3e12 vg/kg rAAV之低劑量之KO小鼠。APOE3ch (高)及APOE3 (高)係指被提供1e13 vg/kg rAAV之高劑量之KO小鼠。圖12A繪示海馬回中之突觸素/總蛋白。圖12B繪示海馬回中之PSD-95/總蛋白。圖12C繪示皮質中之突觸素/總蛋白。圖12D繪示皮質中之PSD-95/總蛋白。藉由JESS毛細管電泳(ProteinSimple)測定突觸蛋白。克魯斯卡-沃利斯(Kruskal-Wallis)單因子ANOVA，隨後進行鄧尼特氏事後檢定。相對於WT，#p＜0.05，相對於KO賦形劑，*p＜0.05，**p＜0.01。

圖13A至圖13D為說明1週齡ApoE基因剔除(KO)小鼠(B6.129P2-Apoetm1Unc/J, Jackson Labs，細胞株#：002052)中包含APOE3ch或APOE3轉殖基因之rAAV對預先存在之病變的動脈粥樣硬化逆轉之作用的條形圖。圖13A繪示KO小鼠及投與以下編碼ApoE之不同轉殖基因序列之小鼠中的主動脈病變面積%：E3N (天然ApoE3) 2e ¹¹vg/kg、E3-3 (ApoE3-3) 2e ¹¹vg/kg及E3-3 (ApoE3-3) 2e ¹²vg/kg。圖13B繪示來自圖13A之KO基線及來自圖13A之E3N (天然ApoE3) 2e ¹¹vg/kg及E3-3 (ApoE3-3) 2e ¹¹vg/kg組之組合之動脈粥樣硬化病變的變化%。圖13C繪示未經治療之KO小鼠及投與以下編碼ApoE3ch之不同轉殖基因序列之KO小鼠中的主動脈病變面積%：E3N (天然ApoE3ch) 2e ¹¹vg/kg、E3ch-9 (ApoE3ch-9) 2e ¹¹vg/kg及E3ch-9 (ApoE3ch-9) 2e ¹²vg/kg。圖13D繪示來自圖13C之KO基線及來自圖13C之E3N (天然ApoE3ch) 2e ¹¹vg/kg及E3ch-9 (ApoE3ch-9) 2e ¹¹vg/kg組之組合之動脈粥樣硬化病變的變化%。

圖14A至圖14D繪示在新穎物體識別(Novel Object Recognition；NOR)記憶測試中認知缺陷測試及用APOE3(ch)rAAV逆轉5週之結果。以2e11 vg/小鼠之低劑量或2e12總vg/小鼠之高劑量投與rAAV。圖14A繪示1週齡C57BL/6及ApoE基因剔除小鼠(*p＜0.05，未配對之雙尾t檢定)之NOR結果，表明1週齡ApoE基因剔除小鼠相比於年齡匹配之C57BL/6小鼠之認知障礙。圖14B繪示在基因療法之前，及在基因療法治療之前及之後在相同小鼠中使用天然ApoE3及ApoE3(ch)序列進行基因療法治療5週後的NOR結果。圖14C繪示用低劑量之編碼CpG-0 ApoE3 (E3-3)之rAAV及ApoE3ch (E3ch -9) rAAV之NOR結果。圖14D繪示用高劑量之編碼CpG-0 ApoE3 (E3-3)之rAAV及ApoE3ch (E3ch -9) rAAV之NOR結果。

圖15A及圖15B繪示來自不同轉殖基因之ApoE表現。圖15A提供展示編碼ApoE3之經密碼子最佳化、CpG減少之cDNA之效能的條形圖。將編碼野生型(wt) ApoE3或經密碼子最佳化之ApoE3 cDNA的質體一式三份地轉染至AML-12細胞中，且在轉染後的72小時，在細胞培養上清液中量測抗原含量。藉由ELISA分析ApoE3含量且繪製為平均值+/-標準差。圖15B提供展示藉由添加內含子序列而官能化之經密碼子最佳化的ApoE3 cDNA之效能的條形圖。將編碼野生型(wt) ApoE3或ApoE3之含有內含子之cDNA變異體的質體一式三份地轉染至AML-12細胞中，且在轉染後的72小時，在細胞培養上清液中量測抗原含量。出於比較目的，將含有非內含子之經密碼子最佳化之ApoE3-3及H30變異體納入作為基準。藉由ELISA分析ApoE3含量且繪製為平均值+/-標準差。

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Claims

一種聚核苷酸，其包含與SEQ ID NO: 63-67中之任一者之序列或SEQ ID NO: 95-105及124-130之核苷酸55至951具有至少85%之序列一致性的ApoE編碼核苷酸序列，其中該聚核苷酸編碼包含與SEQ ID NO: 32至少90%一致之胺基酸序列的ApoE3相關蛋白，其中該蛋白質包含在對應於SEQ ID NO: 32之胺基酸112之位置處的半胱胺酸及在對應於SEQ ID NO: 32之胺基酸158之位置處的精胺酸，其中該ApoE編碼核苷酸序列視情況包含一或多個內含子。
如請求項1之聚核苷酸，其中該ApoE編碼核苷酸序列包含至少一個內含子。
如請求項1之聚核苷酸，其中該ApoE編碼核苷酸序列不包含任何內含子。
如請求項1至3中任一項之聚核苷酸，其中該ApoE編碼核苷酸序列與SEQ ID NO: 3-10、12-14、16-19、21-25、27-30、95-105及124-130中之任一者之核苷酸55至951具有至少95%之序列一致性。
如請求項1至3中任一項之聚核苷酸，其中該ApoE編碼核苷酸序列與SEQ ID NO: 63-67中之任一者具有至少95%之序列一致性。
如請求項1至5中任一項之聚核苷酸，其中該ApoE3相關蛋白進一步包含在對應於SEQ ID NO: 32之胺基酸136之位置處的絲胺酸。
如請求項1至5中任一項之聚核苷酸，其中該ApoE3相關蛋白包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。
如請求項1至5中任一項之聚核苷酸，其中該ApoE3相關蛋白包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列。
如請求項1至3中任一項之聚核苷酸，其中該ApoE編碼核苷酸序列與SEQ ID NO: 63具有至少95%之序列一致性且該ApoE3相關蛋白包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列。
如請求項1至9中任一項之聚核苷酸，其中該ApoE3相關蛋白進一步包含5'信號肽且該ApoE3編碼核酸序列進一步包含編碼該信號肽之核苷酸序列。
如請求項10之聚核苷酸，其中該信號肽與SEQ ID NO: 36、42、44、46、48、50、52、54、56及68-71中之任一者之胺基酸序列具有至少90%之一致性。
如請求項11之聚核苷酸，其中編碼該信號肽之該核苷酸序列與SEQ ID NO: 37-41、43、45、47、49、51、53、55、57及72-75中之任一者之序列包含至少90%之一致性。
如請求項1至12中任一項之聚核苷酸，其中該ApoE編碼核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 20、26、31、11、15及95-105中之任一者之序列具有至少95%之序列一致性的序列。
如請求項1至13中任一項之聚核苷酸，其中該ApoE3相關蛋白包含SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35之序列。
如請求項1之聚核苷酸，其中該ApoE編碼核苷酸序列包含以下之序列：(i) SEQ ID NO: 3-10、12-14、16-19、21-25、27-30、95-105及124-130中之任一者之核苷酸55至951；(ii) SEQ ID NO: 3-10、12-14、16-19、21-25、27-30、95-105及124-130中之任一者之核苷酸55至954；(iii) SEQ ID NO: 63-67中之任一者之核苷酸1至897；(iv) SEQ ID NO: 63-67中之任一者；(v) SEQ ID NO: 3-31、95-105及124-140中之任一者之核苷酸1至951；或(vi) SEQ ID NO: 3-31、95-105及124-130中之任一者。
如請求項1之聚核苷酸，其中該ApoE編碼核苷酸序列包含與以下至少95%一致之序列：(i) SEQ ID NO: 3-10、12-14、16-19、21-25、27-30、95-105及124-130中之任一者之核苷酸55至951；(ii) SEQ ID NO: 3-10、12-14、16-19、21-25、27-30、95-105及124-130中之任一者之核苷酸55至954；(iii) SEQ ID NO: 63-67中之任一者之核苷酸1至897；(iv) SEQ ID NO: 63-67中之任一者；(v) SEQ ID NO: 3-31、95-105及124-130中之任一者之核苷酸1至951；或(vi) SEQ ID NO: 3-31、95-105及124-130中之任一者；且該ApoE3相關蛋白包含SEQ ID NO: 34或35之胺基酸序列。
如請求項2之聚核苷酸，其中該ApoE編碼核苷酸序列依5'至3'，包含： (a) 對應於SEQ ID NO: 1之核苷酸1至43的第一外顯子，其中該第一外顯子與SEQ ID NO: 3-31、95-105及124-130中之任一者之核苷酸1至43具有至少85%之序列一致性，其限制條件為該第一外顯子之末端3'核苷酸為G； (b) 在對應於SEQ ID NO: 1之核苷酸43與44之間的位置處之第一內含子； (c) 對應於SEQ ID NO: 1之核苷酸44至236的第二外顯子；其中該第二外顯子與SEQ ID NO: 3-31、95-105及124-130中之任一者之核苷酸44至236具有至少85%之序列一致性，其限制條件為該第二外顯子之末端5'核苷酸為G且該第二外顯子之末端3'核苷酸為AG； (d) 在對應於SEQ ID NO: 1之核苷酸236與237之間的位置處之第二內含子；及 (e) 對應於SEQ ID NO: 1之核苷酸237至951的第三外顯子，其中該第三外顯子與SEQ ID NO: 3-31、95-105及124-130中之任一者之核苷酸237至951具有至少85%之序列一致性，其限制條件為該第三外顯子之末端5'核苷酸為G；其中該第一、第二及第三外顯子一起編碼該ApoE3相關蛋白，其中該ApoE相關蛋白包含與SEQ ID NO: 35至少95%一致之胺基酸序列。
如請求項17之聚核苷酸，其中該第一內含子包含與SEQ ID NO: 119-122中之任一者具有至少50%之序列一致性的序列，且該第二內含子獨立地包含與SEQ ID NO: 119-121中之任一者具有至少50%之序列一致性的序列。
如請求項18之聚核苷酸，其中該第一內含子係由SEQ ID NO: 119-121中之任一者之序列或與SEQ ID NO: 119-121中之任一者之差異為1至10個核苷酸之序列組成，且該第二內含子獨立地由SEQ ID NO: 119-121中之任一者之序列或與SEQ ID NO: 119-121中之任一者之差異為1至10個核苷酸之序列組成。
如請求項17至19中任一項之聚核苷酸，其中，該第一外顯子與SEQ ID NO: 11、20或95-105中之任一者之核苷酸1至43具有至少95%之序列一致性；該第二外顯子與SEQ ID NO: 11、20或95-105中之任一者之核苷酸44至236具有至少95%之序列一致性；及該第三外顯子與SEQ ID NO: 11、20或95-105中之任一者之核苷酸237至951具有至少95%之序列一致性；其中該ApoE相關蛋白與SEQ ID NO: 35具有至少98%之序列一致性。
如請求項20之聚核苷酸，其中該ApoE編碼核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 106-115中之任一者具有至少95%之序列一致性的序列。
如請求項21之聚核苷酸，其中該ApoE相關蛋白包含SEQ ID NO: 34或35之序列。
如請求項22之聚核苷酸，其中該ApoE編碼核苷酸序列包含SEQ ID NO: 106-115中之任一者之序列。
如請求項17至21中任一項之聚核苷酸，其中該ApoE3相關蛋白包含SEQ ID NO: 34或35之序列。
如請求項1至24中任一項之聚核苷酸，其中該ApoE3編碼核苷酸序列含有0至10個CpG。
如請求項1至25中任一項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸為表現卡匣，其包含一或多個可操作地連接至該ApoE編碼核苷酸序列之表現控制元件。
如請求項26之聚核苷酸，其中該表現卡匣包含可操作地連接至該ApoE3編碼核苷酸序列之5'啟動子及可操作地連接至該ApoE3編碼核苷酸序列之3'聚腺苷酸化位點。
如請求項27之聚核苷酸，其中該表現卡匣依5'至3'，包含可操作地連接至該ApoE3相關編碼核苷酸序列之啟動子或啟動子/強化子、內含子、Kozak序列、該ApoE3編碼核酸序列及聚腺苷酸化信號。
如請求項27或28之聚核苷酸，其中該啟動子為肝臟特異性啟動子。
如請求項27至29中任一項之聚核苷酸，其包含啟動子/強化子，其中該強化子與SEQ ID NO: 58具有至少95%之序列一致性。
如請求項27至30中任一項之聚核苷酸，其中該啟動子為hAAT啟動子。
如請求項27或28之聚核苷酸，其中該啟動子提供CNS細胞中之表現。
如請求項32之聚核苷酸，其中該表現卡匣進一步包含抑制背根節、肝臟或免疫細胞表現之一或多個miRNA標靶序列。
如請求項28至33中任一項之聚核苷酸，其中該內含子包含SEQ ID NO: 60之序列，且該聚腺苷酸化信號包含SEQ ID NO: 61或SEQ ID NO: 62之序列。
如請求項26至34中任一項之聚核苷酸，其中該表現卡匣進一步包含選擇性地靶向編碼ApoE2、ApoE3或ApoE4之核酸的一或多種抑制性核酸。
如請求項35之聚核苷酸，其中該抑制性核酸選擇性地靶向編碼ApoE4之核酸。
如請求項26至36中任一項之聚核苷酸，其中該表現卡匣含有至多約10%之CpG。
如請求項26至37中任一項之聚核苷酸，其中該表現卡匣包含與SEQ ID NO: 76-80中之任一者具有至少95%之序列一致性的核苷酸序列。
如請求項1至38中任一項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸為DNA。
如請求項26至39中任一項之聚核苷酸，其中該表現卡匣包含與經修飾之SEQ ID NO: 76具有至少95%之序列一致性的核苷酸序列，其中藉由用SEQ ID NO: 3-10、12-14、16-19、21-25、27-30、95-115及124-130中之任一者置換核苷酸1295至2248來修飾SEQ ID NO: 76。
一種重組病毒載體核酸，其包含如請求項26至40中任一項之聚核苷酸及提供用於病毒封裝及/或複製之5'及/或3'病毒元件。
如請求項41之重組病毒載體核酸，其中該重組病毒載體核酸為DNA且包含側接該聚核苷酸之5'末端的腺相關病毒(AAV)反向重複序列(ITR)及/或側接該聚核苷酸之3'末端的AAV ITR。
如請求項42之重組病毒載體核酸，其中該5'及/或3'病毒元件各自選自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.10、AAVrh.74及AAV3B。
如請求項43之重組病毒載體核酸，其中該5' ITR包含與SEQ ID NO: 81具有至少95%之序列一致性的序列，且該3' ITR包含與SEQ ID NO: 82具有至少95%之序列一致性的序列。
如請求項41至44中任一項之重組病毒載體核酸，其中該重組病毒載體核酸含有至多約10%之CpG。
一種基因遞送載具，其中該基因遞送載具為包含如請求項1至40中任一項之聚核苷酸或如請求項41至45中任一項之重組病毒載體核酸的病毒或非病毒載體。
如請求項46之基因遞送載具，其中該基因遞送載具為病毒載體。
如請求項47之基因遞送載具，其中該病毒載體為重組AAV、重組慢病毒載體或重組腺病毒載體。
如請求項48之基因遞送載具，其中該病毒載體為該重組AAV，且該重組AAV載體包含殼體，該殼體包含與AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.74、AAV3B、AAV-2i8、AAVrh.10、AAVrh.8、AAVHSC、AAV-B1、AAV-AS、AAV1/rh.10、SEQ ID NO: 83及SEQ ID NO: 84中之任一者之VP1、VP2或VP3具有至少90%之序列一致性的VP1、VP2或VP3。
如請求項49之基因遞送載具，其中該殼體為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.74、AAV3B、AAV-2i8、AAVrh.10、AAVrh.8、AAVHSC、AAV-B1、AAV-AS、AAV1/rh.10殼體；或該殼體包含具有SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO:84之VP1。
如請求項46之基因遞送載具，其中該基因遞送載具為非病毒載體。
如請求項51之基因遞送載具，其中該非病毒載體為選自由以下組成之群的奈米粒子：脂質奈米粒子(LNP)、聚合物奈米粒子、脂質聚合物奈米粒子(LPNP)、基於蛋白質或肽之奈米粒子、基於DNA樹枝狀聚合物或DNA之奈米載體、碳奈米管、微粒、微膠囊、無機奈米粒子、肽籠奈米粒子及外泌體。
如請求項52之基因遞送載具，其中該非病毒載體為LNP或LPNP。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至40中任一項之聚核苷酸、如請求項41至45中任一項之重組病毒載體核酸，或如請求項46至53中任一項之基因遞送載具及醫藥學上可接受之載劑。
如請求項54之醫藥組合物，其中該組合物包含重組AAV及空AAV殼體，其中該空AAV殼體與該重組AAV之比率為100:1至1:100。
一種治療個體以降低膽固醇、降低LDL/VLDL、增加HDL或降低總膽固醇/HDL比率；或治療高膽固醇血症、III型家族性高脂蛋白血症、家族性高膽固醇血症、失智症、支架後再狹窄(post-stent restenosis)、動脈粥樣硬化、冠心病或阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)或降低該等病症之可能性的方法；該方法包含向該個體投與有效量之如請求項1至40中任一項之聚核苷酸、如請求項41至45中任一項之重組病毒載體核酸、如請求項46至53中任一項之基因遞送載具或如請求項54或55之醫藥組合物。
如請求項56之方法，其中該方法在有需要之個體中降低膽固醇、降低該LDL/VLDL、增加HDL、或降低該總膽固醇/HDL比率。
如請求項57之方法，其中該個體具有高膽固醇血症。
如請求項56之方法，其中該方法治療個體之高膽固醇血症、III型家族性高脂蛋白血症、血管型失智症(vascular dementia)、額顳葉型失智症(frontotemporal dementia)、類澱粉腦血管病變、支架後再狹窄、動脈粥樣硬化、冠心病或阿茲海默氏病，或降低該等病症之可能性。
如請求項56至59中任一項之方法，其中該個體為斯他汀類藥物(statin)低反應者或對斯他汀類藥物不耐受。
如請求項56之方法，其中該方法治療個體之阿茲海默氏病或降低該病症之可能性。
如請求項61之方法，其中該投與包含腦實質內、腦池內或腦室內投與。
如請求項61之方法，其中經靜脈內投與該聚核苷酸、該重組病毒載體核酸、該基因遞送載具或該醫藥組合物。
如請求項56至63中任一項之方法，其中該個體具有至少一個ApoE4對偶基因，為EpoE4同型合子，或為 PSEN1突變攜帶者。
如請求項64之方法，其進一步包含投與有效量之抑制性核酸以減少該個體中之天然ApoE4表現。
如請求項56至65中任一項之方法，其中該個體為人類。
一種AAV載體基因體質體，其包含如請求項41至45中任一項之重組病毒核酸。
如請求項67之AAV基因體質體，其中該質體缺乏 rep及 cap基因。
一種產生rAAV載體之方法，該方法包含以下步驟：培養包含rAAV輔助病毒活性之rAAV生產細胞株，其中該生產細胞之該基因體包含如請求項41至45中任一項之重組病毒載體核酸、 rep基因及 cap基因，其中產生該rAAV載體。
一種產生rAAV載體之方法，該方法包含以下步驟：培養包含如請求項67或68之AAV基因體質體的rAAV容許細胞，其中該rAAV容許細胞進一步包含(a)作為該細胞基因體之一部分及/或由一或多個獨立質體提供之 rep及 cap基因，及(b)由該細胞基因體提供及/或由一或多個獨立質體提供之輔助病毒活性。
如請求項70之方法，其中該rAAV容許細胞為封裝細胞，其中該封裝之該基因體包含 cap基因及 rep基因。
如請求項70之方法，其中(a) 該 rep基因、該 cap基因及該輔助活性提供於單個質體中或(b) 該 rep基因及該 cap基因係由 rep/ cap質體提供且該輔助活性係由輔助質體提供。
一種獲得rAAV載體之方法，該方法包含以下步驟：(a)使用如請求項69至72中任一項之方法產生該rAAV，及(b)純化該rAAV。
一種聚核苷酸，其包含與SEQ ID NO: 119-121中之任一者之序列具有至少50%序列一致性的序列，其中該聚核苷酸具有0至5個CpG。
如請求項74之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含SEQ ID NO: 119-121中之任一者之序列，或與SEQ ID NO: 119-121中之任一者之差異為1至10個核苷酸之序列，其中該聚核苷酸不具有CpG。
如請求項75之聚核苷酸，其係由SEQ ID NO: 119-121中之任一者之序列組成。