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TW202413642A - 用於抑制ｓｃａｐ表現的ｒｎａｉ構建體及其使用方法 - Google Patents

用於抑制ｓｃａｐ表現的ｒｎａｉ構建體及其使用方法 Download PDF

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布來迪 Ｊ 賀伯瑞奇
安瑞塔 達司
奧莉佛 霍曼
丹尼爾 Ｃ Ｈ 林
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美商安進公司
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Abstract

本揭露關於用於降低SCAP基因的表現的RNAi構建體，如siRNA。還描述了使用這樣的RNAi構建體治療或預防肝病如非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的方法。

Description

用於抑制SCAP表現的RNAI構建體及其使用方法
本揭露關於用於調節SREBP切割活化蛋白（SCAP）的肝臟表現的組成物及方法。特別地，本揭露關於經由RNA干擾降低SCAP表現的基於核酸的治療劑、及利用這樣的基於核酸的治療劑來治療或預防肝臟疾病如非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的方法。 藉由引用併入以電子方式提交的材料
藉由引用以其全文併入本文的是與本文同時提交的核苷酸/胺基酸序列表，並且其標識如下：創建於2023年5月19日的、名稱為「A-2911-WO 01-SEC.xml」的一個550千位元組的XML文件。 相關申請的交叉引用
本申請要求2022年5月25日提交的美國臨時申請案號63/345,513的權益，將其特此藉由引用以其全文併入。
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）構成一系列肝臟病變，為世界上最常見的慢性肝病，其患病率在過去20年中翻倍，且如今據估計影響了大約20%世界人口（Sattar等人 (2014) BMJ [英國醫學雜誌] 349: g4596；Loomba和Sanyal (2013) Nature Reviews Gastroenterology & hepatology [自然評論：胃腸病學和肝病學] 10(11):686-690；Kim和Kim (2017) Clin Gastroenterol Hepatol [臨床胃腸病學和肝病學] 15(4):474-485；Petta等人 (2016) Dig Liver Dis [消化病和肝病] 48(3):333-342）。NAFLD開始於肝臟中的三酸甘油酯積累，且定義為個體中超過5%的肝細胞中存在細胞質脂滴，該個體1) 無明顯飲酒史且2) 其中其他類型肝病的診斷已被排除在外（Zhu等人 (2016) World J Gastroenterol [世界胃腸病學雜誌] 22(36):8226-33；Rinella (2015) JAMA [美國醫學會雜誌] 313(22):2263-73；Yki-Jarvinen (2016) Diabetologia [糖尿病學] 59(6):1104-11）。在一些個體中，肝臟中異位脂肪的積累（稱為脂肪變性）觸發炎症和肝細胞損傷，導致稱為非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的更晚期疾病（Rinella, 同上）。截至2015年，預計7500萬至1億名美國人患有NAFLD，其中NASH占NAFLD診斷的大約10%-30%（Rinella, 同上；Younossi等人 (2016) Hepatology [肝病學] 64(5):1577-1586）。
NAFLD發作的關鍵觸發因素之一係肝臟中三酸甘油酯（TG）穩態的喪失，其導致TG和脂肪酸積累增加。隨著時間的推移，脂毒性耗盡了肝細胞的適應性和再生性響應，導致炎症、先天免疫系統的活化和脂肪性肝炎。進行性NASH觸發肝臟內的膠原沈積或纖維化。隨著纖維化級別的惡化，10%-29%的NASH個體的肝臟變為肝硬化性的並最終導致肝細胞癌。
固醇響應元件結合蛋白（SREBP）家族在對從頭脂肪生成和TG在肝臟內積累的調節中發揮重要作用。在內質網（ER）中，SREBP以無活性先質的形式合成。SREBP切割活化蛋白（SCAP）係SREBP家族的轉錄因子的唯一已知的調節因子。在合成後，SCAP立即與SREBP形成複合物，並將SREBP護送至高基小胞。在此處，SREBP被進一步加工以釋放轉錄因子的活性胺基末端。活性SREBP易位至細胞核並與SREBP響應元件結合以驅動靶基因的轉錄活化。因此，抑制SCAP功能可以阻止活性SREBP的加工，並減少肝臟中的脂肪生成和TG積累。
目前，NAFLD症狀係經由減重和治療任何繼發性病症來控制的，因為沒有藥理學治療獲得批准。因此，需要在受影響的個體中治療NAFLD的組成物和方法。
本揭露提供了一種包含有義股和反義股的RNAi構建體，其中該RNAi構建體抑制SREBP切割活化蛋白（SCAP）mRNA的表現。在某些實施方式中，RNAi構建體包含具有與在表1中所列出的反義序列差異不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸的區域。
在一些實施方式中，本文所述之RNAi構建體的有義股包含與反義股的序列充分互補以形成長度為約15至約30個鹼基對的雙股體區的序列。在該等和其他實施方式中，有義股和反義股的長度各自為約15至約30個核苷酸。在一些實施方式中，RNAi構建體包含至少一個鈍端。在其他實施方式中，RNAi構建體包含至少一個核苷酸突出端。這樣的核苷酸突出端可包含至少1至6個未配對核苷酸，且可位於有義股3’端、反義股3’端、或有義股和反義股兩者的3’端。在某些實施方式中，RNAi構建體在有義股3’端和反義股3’端處包含兩個未配對核苷酸的突出端。在其他實施方式中，RNAi構建體在反義股3’端處包含具有兩個未配對核苷酸的突出端，且在有義股3’端/反義股5’端包含鈍端。
本揭露之RNAi構建體可包含一或多種經修飾的核苷酸，包括具有對核糖環、核鹼基或磷酸二酯主鏈的修飾的核苷酸。在一些實施方式中，對RNAi構建體的核糖環的修飾包括一或多種2’-修飾。這樣的2’-修飾可以包括經2’-氟修飾的核苷酸、經2’-O-甲基修飾的核苷酸、經2’-O-甲氧基乙基修飾的核苷酸、經2’-O-烯丙基修飾的核苷酸或雙環核酸（BNA）。對核糖環的修飾還可以包括二醇核酸（GNA）的摻入，其中該核糖環被丙二醇替代。在一個特定實施方式中，RNAi構建體包含一或多個經2’-氟修飾的核苷酸、經2’-O-甲基修飾的核苷酸、或其組合。在一些實施方式中，RNAi構建體的有義股和反義股中的所有核苷酸均為經修飾的核苷酸。無鹼基核苷酸可摻入本揭露之RNAi構建體中，例如，作為有義股的3’端、5’端、或3’端和5’端兩者的末端核苷酸。在這樣的實施方式中，無鹼基核苷酸可為反向的，例如藉由3’-3’核苷酸間鍵或5’-5’核苷酸間鍵連接至相鄰核苷酸。
在一些實施方式中，RNAi構建體包含至少一個主鏈修飾，如經修飾的核苷酸間或核苷間鍵。在某些實施方式中，本文所述之RNAi構建體包含至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在特定實施方式中，硫代磷酸酯核苷酸間鍵可位於有義股和/或反義股的3’或5’端。
本揭露還提供了一種組成物，該組成物包含上述RNAi構建體和藥學上可接受的載劑、賦形劑或稀釋劑；以及在有需要的患者中降低SCAP表現的方法，該等方法包括向該患者投與上述RNAi構建體或組成物。
本揭露還包括RNAi構建體，該等RNAi構建體用於降低SCAP表現，如用於治療NAFLD或NASH。還提供了抑制SCAP表現的RNAi構建體用於製備用於治療NAFLD的藥物之用途。
本揭露部分地是基於RNAi構建體的設計和產生，該等RNAi構建體靶向SREBP切割活化蛋白（SCAP）基因並降低SCAP在肝臟細胞中的表現。SCAP表現的抑制可用於治療或預防與SCAP表現相關的病症，包括肝臟相關疾病，例如單純性脂肪肝（脂肪變性）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化（不可逆的晚期肝臟瘢痕形成）、或SCAP介導的高脂血症或高三酸甘油脂血症。
本揭露提供了用於調節編碼SCAP的基因的表現的組成物和方法。在一些實施方式中，基因可處於細胞或受試者（如哺乳動物（例如人））內。在一些實施方式中，本揭露之組成物包含靶向SCAP mRNA並降低SCAP在細胞或哺乳動物中的表現的RNAi構建體。這樣的RNAi構建體可用於治療或預防各種形式的肝臟相關疾病，例如單純性脂肪肝（脂肪變性）、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化（不可逆的晚期肝臟瘢痕形成）、或SCAP介導的高脂血症或高三酸甘油脂血症（參見例如Lee等人, Experimental & Molecular Medicine[實驗與分子醫學], 52: 724-729 (2020)）。
如上所討論，SCAP（SREBP切割活化蛋白）係固醇調節的護送蛋白（sterol-regulated escort protein），該等護送蛋白將SREBP從其在內質網中的合成位點轉運到其在高基氏體中的切割位點，在切割位點中，它們被釋放胞質NH 2-末端轉錄因子結構域的兩種蛋白酶依序切割。細胞培養實驗表明缺乏SCAP的突變體細胞具有低水平的SREBP先質，這明顯是因為該等蛋白質在不存在SCAP的情況下不穩定。另外，SCAP缺陷型CHO細胞不能合成膽固醇，並且它們需要外部膽固醇來源來生長（Rawson等人, J Biol Chem. [生物化學雜誌], 274: 28549-28556 (1999)）。SCAP還作為膽固醇感測器起作用，這係由SCAP的多起源膜結構域介導的。該固醇感測模體中的點突變阻止SREBP切割的固醇遏制，並導致膽固醇的不受調節的過度產生。
脂質合成的控制在肝臟中尤其重要，肝臟合成脂質不僅用於其自身用途，而且還用於作為脂蛋白輸出到血漿中。血漿脂蛋白膽固醇的水平藉由用他汀類藥物治療而降低。另外，當血漿胰島素升高（如在肥胖和非胰島素依賴型糖尿病中可能發生的）時，肝的脂肪酸合成升高。在肝臟中，轉基因小鼠中SREBP-1a的可溶性轉錄活化結構域的過表現導致大塊的脂肪肝。過表現固醇抗性突變體SCAP的轉基因小鼠出現肝臟過度產生膽固醇，並且當飼餵膽固醇時無法表現出正常的回饋抑制，這表明SCAP在肝臟中起調節作用。在肝臟中具有條件性SCAP缺陷的小鼠表現出肝臟中膽固醇和脂肪酸合成的基礎速率降低，這主要是由於編碼多種生物合成酶的mRNA減少（(Matsuda等人, Genes & Development [基因與發育] 15: 1206-121 (2001)）。另外，NASH/NAFLD患者表現出增加的SREBP1c及其靶基因的表現和轉錄活性。總之，該等數據提供了肝脂質合成需要SCAP和SREBP的體內證據。
RNA干擾（RNAi）為將外源性RNA引入細胞，導致編碼靶向的蛋白質的mRNA特異性降解，從而導致蛋白質表現降低的過程。RNAi技術和肝遞送兩者中的進步及採用其他基於RNAi的療法的不斷增加的積極結果表明RNAi為藉由直接地靶向調節肝臟中的脂質合成的基因（如SCAP）而治療性治療NAFLD的有效手段。
如本文所用，術語「RNAi構建體」係指包含RNA分子的試劑，當引入細胞中時，該RNA分子能夠經由RNA干擾機制下調靶基因（例如SCAP）的表現。「RNA干擾」係核酸分子以序列特異性方式（例如藉由RNA誘導緘默化複合物（RISC）途徑）誘導靶RNA分子（例如，傳訊者RNA或mRNA分子）的切割和降解的過程。在一些實施方式中，RNAi構建體包含雙股RNA（dsRNA）分子，該分子包含兩條反平行的連續核苷酸鏈，其彼此充分互補以雜交形成雙股體區。雙股RNAi構建體也可以被稱為RNAi「觸發物」。術語「雜交（hybridize或hybridization）」係指互補多核苷酸的配對，典型地經由在兩個多核苷酸中的互補鹼基之間的氫鍵合（例如，Watson-Crick氫鍵合、Hoogsteen氫鍵合或反向Hoogsteen氫鍵合）而配對。包含具有與靶序列（例如靶mRNA）基本上互補的序列的區域的鏈被稱為「反義股」。「有義股」係指包括與反義股的區域基本上互補的區域的鏈。在一些實施方式中，有義股可以包含具有與靶序列基本上相同的序列的區域。
在某些實施方式中，雙股RNA的有義股和反義股可為兩個單獨的分子，這兩個分子雜交而形成雙股體區，否則係未連接的。由兩條單獨的股形成的這樣的雙股RNA分子被稱為「小干擾RNA」或「短干擾RNA」（siRNA）。siRNA係一類非編碼的雙股RNA分子，其典型地為約20-27個鹼基對，並且係RNAi的核心。因此，在一些實施方式中，本揭露之RNAi構建體包含siRNA。在其他實施方式中，RNAi構建體可為微小RNA（也稱為「miRNA」或「成熟miRNA」）。miRNA係存在於植物、動物和一些病毒中的小的（長度大約18-24個核苷酸）非編碼RNA分子。miRNA類似於siRNA，但miRNA起源於內源性先質髮夾RNA結構。miRNA藉由與靶mRNA的互補區進行鹼基配對並經由RISC途徑指導靶RNA的切割來調節基因表現。
在一些實施方式中，本揭露提供針對SCAP的RNAi構建體。在一些實施方式中，RNAi構建體係包含有義股和反義股的siRNA，其中該反義股包含與SCAP mRNA序列互補的區域。RNAi反義股的區域可以與SCAP mRNA序列的任何合適的區域互補。例如，反義股可以包含與SCAP mRNA序列的編碼區或3’非翻譯區（UTR）互補的區域。
雙股RNAi分子可以包括對核糖核苷酸的化學修飾，包括對核糖核苷酸的核糖、鹼基或主鏈組分的修飾，如本文所述或本領域已知那些。出於本揭露之目的，術語「雙股RNA」涵蓋如在雙股RNA分子（例如siRNA、shRNA等）中所採用的任何這樣的修飾。
如本文所用，若包含第一序列的多核苷酸可以在某些條件（如生理條件）下與包含第二序列的多核苷酸雜交形成雙股體區，則該第一序列與該第二序列「互補」。其他這樣的條件可以包括熟悉該項技術者已知的中等或嚴格雜交條件。若在一或兩個核苷酸序列的整個長度上包含第一序列的多核苷酸與包含第二序列的多核苷酸鹼基配對而無任何誤配，則認為該第一序列與該第二序列完全互補（100%互補）。若序列與靶序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補，則該序列與靶序列「基本上互補」。互補百分比可以藉由將第一序列中與第二或靶序列中對應位置處的鹼基互補的鹼基數除以該第一序列的總長度來計算。若在兩個序列雜交時在30個鹼基對的雙股體區上存在不超過5個、4個、3個、2個或1個誤配，則還可說序列與另一個序列基本上互補。通常，若存在如本文所定義的任何核苷酸突出端，則在確定兩個序列之間的互補程度時不考慮這樣的突出端的序列。舉例而言，長度為21個核苷酸的有義股和長度為21個核苷酸的反義股雜交形成在各鏈3’端處具有2個核苷酸突出端的19個鹼基對雙股體區，這兩條鏈將被認為是完全互補，如該術語在本文中所用。
在一些實施方式中，反義股的區域包含與靶RNA序列（例如SCAP mRNA）的區域完全互補的序列。在這樣的實施方式中，有義股可以包含與反義股的序列完全互補的序列。在其他這樣的實施方式中，有義股可以包含與反義股的序列基本上互補的序列，例如在由有義股和反義股形成的雙股體區中有1、2、3、4或5個誤配。在某些實施方式中，較佳的是在末端區域內（例如，在鏈5’端和/或3’端的6、5、4、3、2或1個核苷酸內）發生任何誤配。在一個實施方式中，由有義股和反義股形成的雙股體區中之任何誤配理想地發生在反義股5’端的6、5、4、3、2或1個核苷酸內。
當dsRNA的兩條基本上互補的鏈由單獨的RNA分子構成時，那些分子不需要但可以共價連接。如果兩條鏈藉由以除了在一條鏈的3’端與相應的另一條鏈的5’端之間的不間斷核苷酸鏈以外的方式共價連接從而形成雙股體結構，則連接結構被稱為「連接子」。RNA鏈可具有相同或不同數目的核苷酸。雙股體中鹼基對的最大數目為dsRNA的最短鏈中的核苷酸數目減去雙股體中存在的任何突出端。除雙股體結構外，RNAi可包含一或多個核苷酸突出端。
在其他實施方式中，雜交形成雙股體區的有義股和反義股可為單個RNA分子的一部分，即有義股和反義股為單個RNA分子的自身互補區的一部分。在這樣的情況下，單個RNA分子包含雙股體區（也稱為莖區）和環區。有義股的3’端藉由將形成環區的連續未配對核苷酸序列與反義股的5’端連接。環區典型地具有足夠的長度以允許RNA分子自身向後折疊，使得反義股可以與有義股鹼基配對以形成雙股體或莖區。環區可以包含約3至約25、約5至約15、或約8至約12個未配對核苷酸。如本文所指出，具有至少部分自我互補區的這樣的RNA分子被稱為「短髮夾RNA」（shRNA）。在一些實施方式中，環區可包含至少1、2、3、4、5、10、20或25個未配對核苷酸。在其他實施方式中，環區可具有10、9、8、7、6、5、4、3、2或更少個未配對核苷酸。在某些實施方式中，本文揭露的RNAi構建體包含shRNA。單個的至少部分自我互補的RNA分子的長度可為約35個核苷酸至約100個核苷酸、約45個核苷酸至約85個核苷酸、或約50至約60個核苷酸，並且包含雙股體區和環區，各區具有本文所敘述的長度。
在一些實施方式中，本文揭露的RNAi構建體包含有義股和反義股，其中該反義股包含具有與SCAP傳訊者RNA（mRNA）序列基本上或完全互補的序列的區域。如本文所用，「SCAP mRNA序列」係指編碼SCAP蛋白（包括來自任何物種（例如小鼠、大鼠、非人靈長類動物、人）的SCAP蛋白變體或同種型）的任何傳訊者RNA序列，包括剪接變體。SCAP在本領域中也被稱為SREBF伴侶。
SCAP mRNA序列還包括被表現為其互補DNA（cDNA）序列的轉錄物序列。cDNA序列係指表現為DNA鹼基（例如，鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶）而非RNA鹼基（例如，鳥嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶和胞嘧啶）的mRNA轉錄物的序列。因此，本文揭露的RNAi構建體的反義股可包含具有與靶SCAP mRNA序列或SCAP cDNA序列基本上或完全互補的序列的區域。SCAP mRNA或cDNA序列可以包括但不限於任何SCAP mRNA或cDNA序列，如可以衍生自NCBI參考序列NM_001320044.2或NM_012235.4。
反義股的區域可以與SCAP mRNA序列的至少15個連續核苷酸基本上互補或完全互補。在一些實施方式中，反義股包含與之互補區域的SCAP mRNA序列的靶區域的範圍可以為約15至約30個連續核苷酸、約16至約28個連續核苷酸、約18至約26個連續核苷酸、約17至約24個連續核苷酸、約19至約25個連續核苷酸、約19至約23個（例如，19、20、21、22、或23個）連續核苷酸、或約19至約21個連續核苷酸。在某些實施方式中，包含與SCAP mRNA序列基本上或完全互補的序列的反義股的區域，在一些實施方式中，可以包含來自在表1中所列出的反義序列的至少19個連續核苷酸。在一些實施方式中，有義和/或反義序列包含來自在表1中所列出的序列且具有不超過1、2或3個核苷酸誤配的至少15個連續核苷酸（例如，至少16、17或18個連續核苷酸）。
RNAi構建體的有義股典型地包含與反義股的序列充分互補，使得兩條股在生理條件下雜交以形成雙股體區的序列。「雙股體區」係指在兩個互補或基本上互補的多核苷酸中的區域，這兩個多核苷酸藉由Watson-Crick鹼基配對或其他氫鍵合相互作用而相互形成鹼基對，從而在兩個多核苷酸之間產生雙股體。RNAi構建體的雙股體區應具有足夠的長度以允許RNAi構建體例如藉由接合Dicer酶和/或RISC複合物（描述在下面）進入RNA干擾途徑。例如，在一些實施方式中，雙股體區的長度為約15至約30個鹼基對。在該範圍內的雙股體區的其他長度亦為合適的，如約15至約28個鹼基對、約15至約26個鹼基對、約15至約24個鹼基對、約15至約22個鹼基對、約17至約28個鹼基對、約17至約26個鹼基對、約17至約24個鹼基對、約17至約23個鹼基對、約17至約21個鹼基對、約19至約25個鹼基對、約19至約23個鹼基對、或約19至約21個鹼基對。在一個實施方式中，雙股體區的長度為約17至約24個鹼基對。在另一個實施方式中，雙股體區的長度為約19至約21個鹼基對。例如，雙股體區的長度可以為約19個鹼基對。
在一些實施方式中，本文揭露的RNAi構建體含有約17至約24個核苷酸的雙股體區，該雙股體區與靶RNA序列（例如，SCAP靶mRNA序列）相互作用以指導靶RNA的切割。不希望受理論束縛，引入細胞內的長雙股RNA可藉由稱為Dicer的III型核酸內切酶分解為siRNA（Sharp等人 (2001) Genes Dev. [基因與發育] 15:485）。Dicer為核糖核酸酶-III樣酶，其將dsRNA加工成具有特徵性的兩個鹼基3’突出端的19-23個鹼基對短干擾RNA（Bernstein等人, (2001) Nature [自然] 409:363）。然後將siRNA摻入RNA誘導緘默化複合物（RISC）中，其中一或多種解旋酶解開siRNA雙股體，使得互補反義股能夠指導靶標識別（Nykanen等人, (2001) Cell [細胞], 107: 309）。在與適當的靶mRNA結合後，RISC內的一或多種核酸內切酶切割靶標以誘導緘默化（Elbashir等人, (2001) Genes Dev. [基因與發育] 15: 188）。
對於其中有義股和反義股為兩個單獨分子的實施方式（例如siRNA RNAi構建體），有義股和反義股的長度不需要與雙股體區的長度相同。例如，一條或兩條股可能長於雙股體區，且具有側接該雙股體區的一或多個未配對核苷酸或誤配。因此，在一些實施方式中，RNAi構建體包含至少一個核苷酸突出端。如本文所用，「核苷酸突出端」係指延伸超過在鏈末端處的雙股體區的未配對的一或多個核苷酸。當一條鏈的3’端延伸超過另一條鏈的5’端或當一條鏈的5’端延伸超過另一條鏈的3’端時，典型地產生核苷酸突出端。核苷酸突出端的長度通常是在1與6個核苷酸之間、1與5個核苷酸之間、1與4個核苷酸之間、1與3個核苷酸之間、2與6個核苷酸之間、2與5個核苷酸之間、或2與4個核苷酸之間。在一些實施方式中，核苷酸突出端包含1、2、3、4、5或6個核苷酸。在一個特定實施方式中，核苷酸突出端包含1至4個核苷酸。在某些實施方式中，核苷酸突出端包含2個核苷酸。突出端中的核苷酸可為如本文所述之核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸或經修飾的核苷酸。在一些實施方式中，突出端包含5’-尿苷-尿苷-3’（5’-UU-3’）二核苷酸。在這樣的實施方式中，UU二核苷酸可包含核糖核苷酸或經修飾的核苷酸，例如經2’-修飾的核苷酸。在其他實施方式中，突出端包含5’-去氧胸苷-去氧胸苷-3’（5’-dTdT-3’）二核苷酸。
核苷酸突出端可以在一條或兩條股的5’端或3’端處。例如，在一個實施方式中，RNAi構建體在反義股的5’端和3’端處包含核苷酸突出端。在另一個實施方式中，RNAi構建體在有義股的5’端和3’端處包含核苷酸突出端。在一些實施方式中，RNAi構建體在有義股的5’端和反義股的5’端處包含核苷酸突出端。在其他實施方式中，RNAi構建體在有義股的3’端和反義股的3’端處包含核苷酸突出端。
RNAi構建體可以在雙股RNA分子的一端處包含單個核苷酸突出端，且在另一個末端處包含鈍端。「鈍端」意指有義股與反義股在分子末端處完全鹼基配對，並且不存在延伸超過雙股體區的未配對核苷酸。在一些實施方式中，RNAi構建體在有義股3’端處包含核苷酸突出端，且在有義股5’端和反義股3’端處包含鈍端。在其他實施方式中，RNAi構建體在反義股3’端處包含核苷酸突出端，且在反義股5’端和有義股3’端處包含鈍端。在某些實施方式中，RNAi構建體在雙股RNA分子兩端處包含鈍端。在這樣的實施方式中，有義股和反義股具有相同長度，且雙股體區的長度與有義股和反義股相同（即，該分子在其整個長度上為雙股）。
有義股和反義股可各自獨立地為任何合適的長度，如約15至約30個核苷酸長度、約18至約28個核苷酸長度、約19至約27個核苷酸長度、約19至約25個核苷酸長度、約19至約23個核苷酸長度、約21至約25個核苷酸長度、或約21至約23個核苷酸長度。在某些實施方式中，有義股和反義股的長度各自為約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、或約25個核苷酸。在一些實施方式中，有義股和反義股具有相同的長度，但形成短於該等股從而使得RNAi構建體具有兩個核苷酸突出端的雙股體區。例如，在一個實施方式中，RNAi構建體包含 (i) 長度各自為21個核苷酸的有義股和反義股、(ii) 長度為19個鹼基對的雙股體區、和 (iii) 在有義股3’端和反義股3’端兩者處有2個未配對核苷酸的核苷酸突出端。在另一個實施方式中，RNAi構建體包含 (i) 長度各自為23個核苷酸的有義股和反義股、(ii) 長度為21個鹼基對的雙股體區、和 (iii) 在有義股3’端和反義股3’端處有2個未配對核苷酸的核苷酸突出端。在其他實施方式中，有義股和反義股具有相同長度且在其整個長度上形成雙股體區，使得在雙股分子的任一端上不存在核苷酸突出端。在一個這樣的實施方式中，RNAi構建體為鈍端的且包含 (i) 其長度各自為21個核苷酸的有義股和反義股和 (ii) 長度為21個鹼基對的雙股體區。在另一個實施方式中，RNAi構建體為鈍端的且包含 (i) 其長度各自為23個核苷酸的有義股和反義股和 (ii) 長度為23個鹼基對的雙股體區。
在其他實施方式中，有義股或反義股長於另一條股，且兩條股形成長度等於較短股長度從而使得RNAi構建體包含至少一個核苷酸突出端的雙股體區。例如，在一個實施方式中，RNAi構建體包含 (i) 長度為19個核苷酸的有義股、(ii) 長度為21個核苷酸的反義股、(iii) 長度為19個鹼基對的雙股體區、和 (iv) 在反義股3’端處有2個未配對核苷酸的單個核苷酸突出端。在另一個實施方式中，RNAi構建體包含 (i) 長度為21個核苷酸的有義股、(ii) 長度為23個核苷酸的反義股、(iii) 長度為21個鹼基對的雙股體區、和 (iv) 在反義股3’端處有2個未配對核苷酸的單個核苷酸突出端。
本文揭露的RNAi構建體的反義股可包含在表1中所列出的反義序列中之任一個的序列、或者該等反義序列中之任一個的核苷酸1-18、2-18、1-19、2-19、1-21或2-21的序列。在表1中所列出的每個反義序列包含與SCAP mRNA序列互補的16-19個連續核苷酸的序列加兩個核苷酸的突出端序列。因此，在一些實施方式中，反義股包含SEQ ID NO: 148-294或SEQ ID NO: 442-588中之任一個的核苷酸1-18、2-18、1-19、2-19、1-21或2-21的序列。同樣地，本文揭露的RNAi構建體的有義股可包含在表1中所列出的有義序列中之任一個的序列、或者該等有義序列中之任一個的核苷酸1-18、2-18、1-19、2-19、1-21或2-21的序列。因此，在一些實施方式中，有義股包含SEQ ID NO: 1-147或SEQ ID NO: 295-441中之任一個的核苷酸1-18、2-18、1-19、2-19、1-21或2-21的序列。 經修飾的核苷酸
本文揭露的RNAi構建體（如在表1中所列出的那些）可以包含一或多個經修飾的核苷酸。「經修飾的核苷酸」係指具有對核苷、核鹼基、戊糖環、或磷酸酯基團的一或多個化學修飾的核苷酸。如本文所用，經修飾的核苷酸不涵蓋含有腺苷一磷酸、鳥苷一磷酸、尿苷一磷酸和胞苷一磷酸的核糖核苷酸，以及含有去氧腺苷一磷酸、去氧鳥苷一磷酸、去氧胸苷一磷酸和去氧胞苷一磷酸的去氧核糖核苷酸。然而，RNAi構建體可包含經修飾的核苷酸、核糖核苷酸和去氧核糖核苷酸的組合。將經修飾的核苷酸摻入雙股RNA分子的一條或兩條股中可以例如藉由降低分子對核酸酶和其他降解過程的敏感性來改善RNA分子的體內穩定性。還可藉由摻入經修飾的核苷酸來增強RNAi構建體降低靶基因表現的效力。
在某些實施方式中，經修飾的核苷酸具有核糖的修飾。該等糖修飾可包括戊糖環的2’和/或5’位置處的修飾以及雙環糖修飾。經2’-修飾的核苷酸係指具有戊糖環的核苷酸，該戊糖環在2’位置處具有除H或OH以外的取代基。這樣的2’-修飾包括但不限於2’-O-烷基（例如O-C1-C10或O-C1-C10取代的烷基）、2’-O-烯丙基（O-CH 2CH=CH 2）、2’-C-烯丙基、2’-氟、2’-O-甲基（OCH 3）、2’-O-甲氧基乙基（O-(CH 2) 2OCH 3）、2’-OCF 3、2’-O(CH 2) 2SCH 3、2’-O-胺基烷基、2’-胺基（例如NH 2）、2’-O-乙胺和2’-疊氮基。在戊糖環的5’位置處的修飾包括但不限於5’-甲基（R或S）、5’-乙烯基和5’-甲氧基。
「雙環糖修飾」係指戊糖環的修飾，其中橋將環的兩個原子連接而形成第二環從而產生雙環糖結構。在一些實施方式中，雙環糖修飾包含在戊糖環的4’與2’碳之間的橋。包含具有雙環糖修飾的糖部分的核苷酸在本文中被稱為「雙環核酸」、「橋接的核酸」或「BNA」。「鎖核酸」（LNA）係2’,4’-雙環核酸（2’,4’-BNA），其中核糖環由連接2’-氧和4’-碳的亞甲基橋鎖定。示例性雙環糖修飾包括但不限於α-L-亞甲基氧基（4’-CH 2-O-2’）雙環核酸（BNA）；β-D-亞甲基氧基（4’-CH 2-O-2’）BNA（LNA）；伸乙基氧基（4’-(CH 2)2-O-2’）BNA；胺基氧基（4’-CH 2-O-N(R)-2’）BNA；氧基胺基（4’-CH 2-N(R)-O-2’）BNA；甲基(亞甲基氧基)（4’-CH(CH 3)-O-2’）BNA（也稱為受限乙基或cEt）；亞甲基-硫代（4’-CH 2-S-2’）BNA；亞甲基-胺基（4’-CH 2-N(R)-2’）BNA；甲基碳環（4’-CH 2-CH(CH3)-2’）BNA；丙烯碳環（4’-(CH 2)3-2’）BNA；和甲氧基(伸乙基氧基)（4’-CH(CH 2OMe)-O-2’）BNA（也稱為受限MOE或cMOE）。可以摻入本文揭露的RNAi構建體中的該等和其他經糖修飾的核苷酸描述於例如美國專利9,181,551、美國專利公開案號2016/0122761以及Deleavey和Damha, Chemistry and Biology[化學和生物學], 19: 937-954 (2012)。
在一些實施方式中，RNAi構建體包含一或多個經2’-氟修飾的核苷酸、經2’-O-甲基修飾的核苷酸、經2’-O-甲氧基乙基修飾的核苷酸、經2’-O-烯丙基修飾的核苷酸、雙環核酸（BNA）、或其組合。在某些實施方式中，RNAi構建體包含一或多個經2’-氟修飾的核苷酸、經2’-O-甲基修飾的核苷酸、經2’-O-甲氧基乙基修飾的核苷酸、或其組合。在一個特定實施方式中，RNAi構建體包含一或多個經2’-氟修飾的核苷酸、經2’-O-甲基修飾的核苷酸、或其組合。
RNAi構建體的有義股和反義股均可包含一或多個經修飾的核苷酸。例如，在一些實施方式中，有義股包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個經修飾的核苷酸。在某些實施方式中，有義股中的所有核苷酸均為經修飾的核苷酸。在一些實施方式中，反義股包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個經修飾的核苷酸。在其他實施方式中，反義股中的所有核苷酸均為經修飾的核苷酸。在某些其他實施方式中，有義股中的所有核苷酸和反義股中的所有核苷酸均為經修飾的核苷酸。在該等和其他實施方式中，經修飾的核苷酸可為經2’-氟修飾的核苷酸、經2’-O-甲基修飾的核苷酸、或其組合。
在某些實施方式中，摻入本發明RNAi構建體的一條或兩條股中的經修飾的核苷酸具有核鹼基（在本文中也稱為「鹼基」）的修飾。「經修飾的核鹼基」或「經修飾的鹼基」係指除天然存在的嘌呤鹼基腺嘌呤（A）和鳥嘌呤（G）以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U）以外的鹼基。經修飾的核鹼基可為合成的或天然存在的修飾，並且包括但不限於通用鹼基、5-甲基胞嘧啶（5-me-C）、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤（X）、次黃嘌呤（I）、2-胺基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鳥嘌呤，以及腺嘌呤和鳥嘌呤的其他烷基衍生物，腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基衍生物和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-鹵尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶（假尿嘧啶），4-硫尿嘧啶，8-鹵代、8-胺基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，5-鹵代（特別是5-溴）、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤，7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤，以及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。
在一些實施方式中，經修飾的鹼基為通用鹼基。「通用鹼基」係指在不改變所得到的雙股體區的雙螺旋結構的情況下，與RNA和DNA中的全部天然鹼基不加選擇地形成鹼基對的鹼基類似物。通用鹼基對於熟悉該項技術者而言係已知的，並且包括但不限於肌苷、C-苯基、C-萘基和其他芳香族衍生物、唑羧基醯胺、和硝基唑衍生物（如3-硝基吡咯、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚和6-硝基吲哚）。
可以摻入本發明RNAi構建體中的其他合適的經修飾鹼基包括在Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. [反義核酸藥物開發], 第10卷: 297-310, 2000和Peacock等人, J. Org.Chem. [有機化學雜誌], 第76卷: 7295-7300, 2011中描述的那些，將這兩份文獻特此藉由引用以其全文併入。熟悉該項技術者充分瞭解鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶可被其他核鹼基（如上述經修飾的核鹼基）替代，而基本上不改變包含攜帶這樣的替代核鹼基的核苷酸的多核苷酸的鹼基配對特性。
在一些實施方式中，RNAi構建體的有義股和反義股可以包含一或多個無鹼基核苷酸。「無鹼基核苷酸」或「無鹼基核苷」係在核糖的1’位置處缺少核鹼基的核苷酸或核苷。在某些實施方式中，將無鹼基核苷酸摻入RNAi構建體的有義股和/或反義股的末端。在一個實施方式中，有義股在其3’端、其5’端、或其3’和5’端兩者處包含作為末端核苷酸的無鹼基核苷酸。在另一個實施方式中，反義股在其3’端、其5’端、或其3’和5’端兩者處包含作為末端核苷酸的無鹼基核苷酸。在其中無鹼基核苷酸係末端核苷酸的這樣的實施方式中，其可為反向核苷酸--即藉由3’-3’核苷酸間鍵（當在鏈的3’端時）或5’-5’核苷酸間鍵（當在鏈的5’端時）而不是天然的3’-5’核苷酸間鍵與相鄰核苷酸連接。無鹼基核苷酸也可以包含糖修飾，如上述的任何糖修飾。在某些實施方式中，無鹼基核苷酸包含2’-修飾，如2’-氟修飾、2’-O-甲基修飾、或2’-H（去氧）修飾。在一個實施方式中，無鹼基核苷酸包含2’-O-甲基修飾。在另一個實施方式中，無鹼基核苷酸包含2’-H修飾（即去氧無鹼基核苷酸）。
在一些實施方式中，有義股和/或反義股中的腺苷核苷酸之前的所有嘧啶核苷酸均為經修飾的核苷酸。例如，當序列5’-CA-3’或5’-UA-3’出現在任一股中時，胞苷和尿苷核苷酸為經修飾的核苷酸，較佳的是經2’-O-甲基修飾的核苷酸。在某些實施方式中，有義股中的所有嘧啶核苷酸均為經修飾的核苷酸（例如經2’-O-甲基修飾的核苷酸），且在反義股中的序列5’-CA-3’或5’-UA-3’的所有出現中的5’核苷酸為經修飾的核苷酸（例如經2’-O-甲基修飾的核苷酸）。在其他實施方式中，雙股體區中的所有核苷酸均為經修飾的核苷酸。在這樣的實施方式中，經修飾的核苷酸較佳的是經2’-O-甲基修飾的核苷酸、經2’-氟修飾的核苷酸、或其組合。
在RNAi構建體包含核苷酸突出端的實施方式中，突出端中的核苷酸可為核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸或經修飾的核苷酸。在一個實施方式中，突出端中的核苷酸為去氧核糖核苷酸，例如去氧胸苷。在另一個實施方式中，突出端中的核苷酸為經修飾的核苷酸。例如，在一些實施方式中，突出端中的核苷酸為經2’-O-甲基修飾的核苷酸、經2’-氟修飾的核苷酸、經2’-甲氧基乙基修飾的核苷酸、或其組合。
本揭露之RNAi構建體還可以包含一或多個經修飾的核苷酸間鍵。如本文所用，術語「經修飾的核苷酸間鍵」係指除天然3’至5’磷酸二酯鍵外的核苷酸間鍵。在一些實施方式中，經修飾的核苷酸間鍵為含磷核苷酸間鍵，如磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、烷基膦酸酯（例如，膦酸甲酯、3’-伸烷基膦酸酯）、次膦酸酯、胺基磷酸酯（例如，3’-胺基胺基磷酸酯和胺基烷基胺基磷酸酯）、硫代磷酸酯（P=S）、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代胺基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、和硼烷磷酸酯。在一個實施方式中，經修飾的核苷酸間鍵為2’至5’磷酸二酯鍵。在其他實施方式中，經修飾的核苷酸間鍵為不含磷核苷酸間鍵，且因此可稱為經修飾的核苷間鍵。這樣的不含磷的鍵包括但不限於𠰌啉鍵（部分由核苷的糖部分形成）；矽氧烷鍵（-O-Si(H) 2-O-）；硫化物、亞碸和碸鍵；甲醯基和硫代甲醯基鍵；含烯的主鏈；胺基磺酸酯主鏈；亞甲基甲基亞胺基（-CH 2-N(CH 3)-O-CH 2-）和亞甲基肼鍵；磺酸酯和磺醯胺鍵；醯胺鍵；以及具有混合的N、O、S和CH 2組分部分的其他鍵。在一個實施方式中，經修飾的核苷間鍵為產生肽核酸或PNA的基於肽的鍵（例如胺基乙基甘胺酸），如美國專利5,539,082、5,714,331和5,719,262中所述之那些。可以在揭露的RNAi構建體中使用的其他合適的經修飾的核苷酸間和核苷間鍵描述於美國專利6,693,187和9,181,551、美國專利公開案號2016/0122761以及Deleavey和Damha, 同上中。
在某些實施方式中，RNAi構建體包含一或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。硫代磷酸酯核苷酸間鍵可以存在於RNAi構建體的有義股、反義股或兩條股中。例如，在一些實施方式中，有義股包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在其他實施方式中，反義股包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在仍其他實施方式中，兩條股包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。RNAi構建體可以在有義股、反義股或兩條股的3’-端、5’-端、或3’-端和5’-端兩者處包含一或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。例如，在某些實施方式中，RNAi構建體在有義股、反義股、或兩條股的3’端處包含約1至約6或更多個（例如約1、2、3、4、5、6或更多個）連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在其他實施方式中，RNAi構建體在有義股、反義股或兩條股的5’端處包含約1至約6或更多個（例如約1、2、3、4、5、6或更多個）連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在一個實施方式中，RNAi構建體包含在有義股3’端處的單個硫代磷酸酯核苷酸間鍵和在反義股3’端處的單個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在另一個實施方式中，RNAi構建體在反義股3’端處包含兩個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵（即在反義股3’端處的第一和第二核苷酸間鍵處的硫代磷酸酯核苷酸間鍵）。在另一個實施方式中，RNAi構建體在反義股的3’端和5’端處包含兩個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在又另一個實施方式中，RNAi構建體在反義股的3’端和5’端兩者處包含兩個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵，且在有義股5’端處包含兩個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在仍另一個實施方式中，RNAi構建體在反義股3’端和5’端兩者處包含兩個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵，且在有義股3’端和5’端兩者處包含兩個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵（即，在反義股5’端和3’端兩者的第一和第二核苷酸間鍵處的硫代磷酸酯核苷酸間鍵和在有義股5’端和3’端兩者處第一和第二核苷酸間鍵處的硫代磷酸酯核苷酸間鍵）。在一條或兩條股包含一或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵的任何實施方式中，股內剩餘核苷酸間鍵可為天然3’至5’磷酸二酯鍵。例如，在一些實施方式中，有義股和反義股中之每個核苷酸間鍵選自磷酸二酯和硫代磷酸酯，其中至少一個核苷酸間鍵為硫代磷酸酯。
在RNAi構建體包含核苷酸突出端的實施方式中，該突出端中的兩個或更多個未配對核苷酸可藉由硫代磷酸酯核苷酸間鍵來連接。在某些實施方式中，反義股和/或有義股的3’端處的核苷酸突出端中的所有未配對核苷酸藉由硫代磷酸酯核苷酸間鍵來連接。在其他實施方式中，反義股和/或有義股的5’端處的核苷酸突出端中的所有未配對核苷酸藉由硫代磷酸酯核苷酸間鍵來連接。在仍其他實施方式中，任何核苷酸突出端中的所有未配對核苷酸藉由硫代磷酸酯核苷酸間鍵來連接。
在一些實施方式中，揭露的RNAi構建體的有義股、反義股、或者反義股和有義股兩者的5’端包含磷酸酯部分。如本文所用，術語「磷酸酯部分」係指包括未經修飾的磷酸酯（-O-P=O)(OH)OH）以及經修飾的磷酸酯的末端磷酸酯基團。經修飾的磷酸酯包括如下的磷酸酯，其中O和OH基團中之一或多個被H、O、S、N(R)或烷基所替代，其中R係H、胺基保護基團或者未經取代或經取代的烷基。示例性磷酸酯部分包括但不限於5’-單磷酸酯；5’二磷酸酯；5’-三磷酸酯；5’-鳥苷帽（7-甲基化的或非甲基化的）；5’-腺苷帽或任何其他經修飾或未經修飾的核苷酸帽結構；5’-單硫代磷酸酯（硫代磷酸酯）；5’-單二硫代磷酸酯（二硫代磷酸酯）；5’-α-硫代三磷酸酯；5’-γ-硫代三磷酸酯、5’-胺基磷酸酯；5’-乙烯基磷酸酯；5’-烷基膦酸酯（其中「烷基」可以為甲基、乙基、異丙基、丙基等）；和5’-烷基醚膦酸酯（其中「烷基醚」可以為甲氧基甲基、乙氧基甲基等）。
可摻入本文揭露的RNAi構建體中的經修飾的核苷酸可具有多於一種本文所述之化學修飾。例如，經修飾的核苷酸可以具有對核糖的修飾以及對核鹼基的修飾。舉例而言，經修飾的核苷酸可包含2’糖修飾（例如，2’-氟或2’-O-甲基）且包含經修飾的鹼基（例如，5-甲基胞嘧啶或假尿嘧啶）。在其他實施方式中，經修飾的核苷酸可以包含糖修飾與對5’磷酸的修飾的組合，當將經修飾的核苷酸摻入多核苷酸時，該等修飾將產生經修飾的核苷酸間或核苷間鍵。例如，在一些實施方式中，經修飾的核苷酸可包含糖修飾，如2’-氟修飾、2’-O-甲基修飾、或雙環糖修飾、以及5’硫代磷酸酯基團。因此，在一些實施方式中，RNAi構建體的一條或兩條鏈包含經2’修飾的核苷酸或BNA與硫代磷酸酯核苷酸間鍵的組合。在某些實施方式中，RNAi構建體的有義股和反義股兩者均包含經2’-氟修飾的核苷酸、經2’-O-甲基修飾的核苷酸和硫代磷酸酯核苷酸間鍵的組合。包含經修飾的核苷酸和核苷酸間鍵的示例性RNAi構建體顯示在表1和表2中。 RNAi 構建體的功能
本文揭露的RNAi構建體理想地降低或抑制SCAP在細胞（特別是肝臟細胞）中的表現。因此，在一個實施方式中，本揭露提供一種藉由使細胞與本文所述之任何RNAi構建體接觸來降低SCAP在該細胞中的表現的方法。細胞可為體外或體內的。可以藉由測量SCAP mRNA、SCAP蛋白、或者與SCAP表現有關的另一種生物標誌物的量或水平來對SCAP表現進行評估。相對於在未用RNAi構建體處理或未用對照RNAi構建體處理的細胞或動物中的SCAP表現，可以確定在用本文揭露的RNAi構建體處理的細胞或動物中SCAP表現的降低。例如，在一些實施方式中，藉由如下方式對SCAP表現的降低進行評估：(a) 測量在用本文揭露的RNAi構建體處理的肝臟細胞中SCAP mRNA的量或水平；(b) 測量用對照RNAi構建體（例如，針對肝臟細胞中未表現的RNA分子的RNAi構建體、或者具有無義序列或加擾序列的RNAi構建體）處理或者不用構建體處理的肝臟細胞中SCAP mRNA的量或水平；和 (c) 將來自 (a) 中經處理細胞的測量SCAP mRNA水平與來自 (b) 中對照細胞的測量SCAP mRNA水平進行比較。在比較之前，可以將經處理細胞和對照細胞中的SCAP mRNA水平相對於對照基因（例如18S核糖體RNA）的RNA水平歸一化。可以藉由多種方法來測量SCAP mRNA水平，該等方法包括北方墨點法分析、核酸酶保護測定、螢光原位雜交（FISH）、反轉錄酶（RT）-PCR、即時RT-PCR、定量PCR等。
在其他實施方式中，藉由如下方式對SCAP表現的降低進行評估：(a) 測量用本文揭露的RNAi構建體處理的肝臟細胞中SCAP蛋白的量或水平；(b) 測量用對照RNAi構建體（例如，針對肝臟細胞中未表現的RNA分子的RNAi構建體、或者具有無義序列或加擾序列的RNAi構建體）處理或者不用構建體處理的肝臟細胞中SCAP蛋白的量或水平；和 (c) 將來自 (a) 中經處理細胞的測量SCAP蛋白水平與來自 (b) 中對照細胞的測量SCAP蛋白水平進行比較。SCAP蛋白水平可以使用熟悉該項技術者已知的任何合適的方法來測量，該等方法包括但不限於西方墨點法、免疫測定（例如ELISA）和流動式細胞分析術。測量SCAP mRNA或蛋白質的任何合適的方法都可以用於對本文揭露的RNAi構建體的功效進行評估。
在一些實施方式中，評估SCAP表現程度的方法在體外在天然表現SCAP的細胞（例如肝臟細胞）或者已被工程化以表現SCAP的細胞中進行。在某些實施方式中，該等方法在體外在肝臟細胞中進行。合適的肝臟細胞包括但不限於原代肝細胞（例如人、非人靈長類動物或齧齒動物的肝細胞）、HepAD38細胞、HuH-6細胞、HuH-7細胞、HuH-5-2細胞、BNLCL2細胞、Hep3B細胞或HepG2細胞。在一個實施方式中，肝臟細胞為Hep3B細胞。在另一個實施方式中，肝臟細胞為HepG2細胞。
在其他實施方式中，評估SCAP表現程度的方法在體內進行。例如，可以將RNAi構建體和任何對照RNAi構建體投與至動物（例如齧齒動物或非人靈長類動物），並且在處理後可在從該動物收穫的肝臟組織中對SCAP mRNA或蛋白質水平進行評估。可替代地或另外地，可以在經處理的動物中對與SCAP表現相關的生物標誌物或功能表現型進行評估。
在某些實施方式中，本文揭露的RNAi構建體將SCAP在肝臟細胞中的表現降低至少40%、至少45%、或至少50%。在一些實施方式中，本文揭露的RNAi構建體將SCAP在肝臟細胞中的表現降低至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、或至少85%。在其他實施方式中，本文揭露的RNAi構建體將SCAP在肝臟細胞中的表現降低約90%或更多，例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。可以藉由本文所述之任何方法或本領域中已知的其他方法來測量SCAP表現的降低百分比。例如，在某些實施方式中，RNAi構建體在體外在Hep3B細胞（含有野生型SCAP）中以5 nM將SCAP表現抑制至少40%。在相關實施方式中，RNAi構建體在體外在Hep3B細胞中以5 nM將SCAP表現抑制至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、或至少75%。在其他實施方式中，RNAi構建體在體外在Hep3B細胞中以5 nM將SCAP表現抑制至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、或至少98%。在某些實施方式中，本文揭露的RNAi構建體在體外在HepG2細胞中以5 nM將SCAP表現抑制至少40% 。在相關實施方式中，本文揭露的RNAi構建體在體外在HepG2細胞中以5 nM將SCAP表現抑制至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、或至少75%。在其他實施方式中，RNAi構建體在體外在HepG2細胞中以5 nM將SCAP表現抑制至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、或至少98%。在某些實施方式中，RNAi構建體在體外在表現人SCAP的CHO轉染細胞中以5 nM將SCAP表現抑制至少40%。在相關實施方式中，RNAi構建體在體外在表現人SCAP的CHO轉染細胞中以5 nM將SCAP表現抑制至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、或至少75%。在其他實施方式中，RNAi構建體在體外在表現人SCAP的CHO轉染細胞中以5 nM將SCAP表現抑制至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、或至少98%。可以使用包括例如RNA FISH或微滴式數位PCR在內的多種技術測量SCAP的降低（參見例如，Kamitaki等人, Digital PCR[數位PCR] .Methods in Molecular Biology[分子生物學方法], 1768: 401-422 (2018). doi:10.1007/978-1-4939-7778-9_23）。
在一些實施方式中，計算IC 50值，以便評估本文揭露的RNAi構建體抑制SCAP在肝臟細胞中的表現的效力。「IC 50值」為實現50%生物或生物化學功能抑制所需的劑量/濃度。在其他實施方式中，RNAi構建體的效力可以藉由計算「AC 50」值來評估，該值係實現50%生物或生物化學功能活化所需的劑量/濃度。任何物質或拮抗劑的IC 50值或AC 50值可以藉由構建劑量-響應曲線並在任何測定中檢查不同濃度的物質或拮抗劑對表現程度或功能活性的影響來確定。給定拮抗劑或物質的IC 50值可以藉由確定抑制最大生物響應或天然表現程度的一半所需的濃度來計算。因此，任何RNAi構建體的IC 50值可以藉由在任何測定（如免疫測定、RNA FISH測定或微滴式數位PCR測定）中確定抑制肝臟細胞中天然SCAP表現程度（例如對照肝臟細胞中的SCAP表現程度）的一半所需的RNAi構建體的濃度來計算。類似地，給定物質的AC 50值可以藉由確定活化最大生物響應或天然表現程度的一半所需的濃度來計算。本文揭露的RNAi構建體可以以小於約20 nM（例如，小於約15 nM、10 nM、5 nM、或1 nM）的IC 50抑制SCAP在肝細胞（例如Hep3B細胞）中的表現。例如，揭露的RNAi構建體可以以約0.001 nM至約20 nM、約0.001 nM至約10 nM、約0.001 nM至約5 nM、約0.001 nM至約1 nM、約0.1 nM至約10 nM、約0.1 nM至約5 nM、或約0.1 nM至約1 nM的IC 50抑制SCAP在肝臟細胞中的表現。在某些實施方式中，RNAi構建體以約1 nM至約10 nM（例如約5 nM）的IC 50抑制SCAP在肝臟細胞（例如Hep3B細胞）中的表現。本文揭露的RNAi構建體可以以小於約20 nM的IC 50抑制SCAP在肝臟細胞（例如HepG2細胞）中的表現。例如，RNAi構建體可以以約0.001 nM至約20 nM、約0.001 nM至約10 nM、約0.001 nM至約5 nM、約0.001 nM至約1 nM、約0.1 nM至約10 nM、約0.1 nM至約5 nM、或約0.1 nM至約1 nM的IC 50抑制SCAP在肝臟細胞中的表現。在某些實施方式中，RNAi構建體以約1 nM至約10 nM（例如約5 nM）的IC 50抑制SCAP在肝臟細胞（例如HepG2細胞）中的表現。本文揭露的RNAi構建體可以以小於約20 nM的IC 50抑制SCAP在表現人SCAP的細胞（例如CHO轉染細胞）中的表現。例如，RNAi構建體以約0.001 nM至約20 nM、約0.001 nM至約10 nM、約0.001 nM至約5 nM、約0.001 nM至約1 nM、約0.1 nM至約10 nM、約0.1 nM至約5 nM、或約0.1 nM至約1 nM的IC 50抑制SCAP在表現SCAP的細胞中的表現。在某些實施方式中，RNAi構建體以約1 nM至約10 nM（例如約5 nM）的IC 50抑制SCAP在表現SCAP的細胞中的表現。
本文揭露的RNAi構建體可使用本領域已知的技術（例如常規核酸固相合成）來容易地製成。RNAi構建體的多核苷酸可使用標準核苷酸或核苷先質（例如亞磷醯胺）在合適的核酸合成儀上組裝。自動核酸合成儀由幾個供應商商業銷售，該等合成儀包括來自應用生物系統公司（Applied Biosystems）（福斯特城，加利福尼亞州（Foster City, CA））的DNA/RNA合成儀、來自生物自動化公司（BioAutomation）（歐文市，德克薩斯州（Irving, TX））的MerMade合成儀、和來自電氣醫療集團生命科學部（GE Healthcare Life Sciences）（匹茲堡市，賓夕凡尼亞州（Pittsburgh, PA））的OligoPilot合成儀。
2’甲矽烷基保護基團可與核糖核苷的5’位置處的酸不穩定性二甲氧基三苯甲基（DMT）結合使用，以經由亞磷醯胺化學合成寡核苷酸。已知最終去保護條件不會顯著降解RNA產物。所有合成均可在任何自動或手動合成儀中以大、中或小規模進行。合成還可以在多孔板、柱或載玻片中進行。
2’-O-甲矽烷基基團可以經由暴露於氟離子來去除，該等氟離子可以包括任何氟離子源，例如含有與無機反離子配對的氟離子的那些鹽（例如氟化銫和氟化鉀）、或含有與有機反離子配對的氟離子的那些鹽（例如四烷基氟化銨）。冠醚催化劑可以與無機氟化物組合用於去保護反應中。示例性氟離子源包括但不限於四丁基氟化銨或胺基氫氟化物（例如，將水性HF與三乙胺組合在偶極非質子溶劑（例如二甲基甲醯胺）中）。
選擇用於亞磷酸三酯和磷酸三酯上的保護基團可以改變三酯對氟化物的穩定性。磷酸三酯或亞磷酸三酯的甲基保護可以穩定與氟離子的鍵聯且改善過程產率。
由於核糖核苷具有反應性2’羥基取代基，因此可能希望用與5’-O-二甲氧基三苯甲基保護基團正交的保護基團（例如對用酸處理穩定的保護基團）保護RNA中的反應性2’位置。甲矽烷基保護基團符合該標準，且可以在最終的氟化物去保護步驟中容易地去除，這可以導致最少RNA降解。
四唑催化劑可用於標準亞磷醯胺偶合反應。示例性催化劑包括例如四唑、S-乙基-四唑、苄基巰基四唑和對硝基苯基四唑。
合成本文所述之RNAi構建體的另外的方法對於熟悉該項技術者而言將是顯而易見的。另外，各個合成步驟可以交替序列或順序進行，以得到希望的化合物。其他合成化學轉化、保護基團（例如，對於鹼基上存在的羥基、胺基等）和可用於合成本文所述RNAi構建體的保護基團方法（保護和去保護）係本領域已知的且包括例如以下中描述的那些：R. Larock, Comprehensive Organic Transformations [綜合有機轉化], VCH Publishers [VCH出版社] (1989)；T. W. Greene和P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis [有機合成中的保護基團], 第2版,John Wiley and Sons [約翰威立父子公司] (1991)；L. Fieser和M. Fieser, Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis [費塞爾和用於有機合成的費塞爾試劑], John Wiley and Sons [約翰威立父子公司] (1994)；以及L. Paquette編輯, Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis [有機合成試劑百科全書], John Wiley and Sons [約翰威立父子公司] (1995) 及其後續版本。RNAi構建體的定製合成還可從幾個商業供應商處獲得，該等供應商包括Dharmacon公司（Dharmacon, Inc.）（拉斐特，科羅拉多州（Lafayette, CO））、Axo實驗室股份有限公司（AxoLabs GmbH）（庫爾姆巴赫（Kulmbach），德國）和Ambion公司（Ambion, Inc.）（福斯特城，加利福尼亞州）。
本文揭露的RNAi構建體可包含配體。如本文所用，「配體」係指能夠與另一種化合物或分子直接地或間接地相互作用的任何化合物或分子。配體與另一種化合物或分子的相互作用可引發生物響應（例如，活化訊息傳遞級聯、誘導受體介導的內吞作用）或者可僅為物理締合。配體可以修飾所附接的雙股RNA分子的一或多種特性，如RNA分子的藥效學、藥動學、結合、吸收、細胞分佈、細胞攝取、電荷和/或清除特性。
配體可包含血清蛋白（例如，人血清白蛋白、低密度脂蛋白、球蛋白）、膽固醇部分、維生素（例如，生物素、維生素E、維生素B12）、葉酸部分、類固醇、膽汁酸（例如膽酸）、脂肪酸（例如棕櫚酸、肉豆蔻酸）、碳水化合物（例如聚葡萄醣、聚三葡萄糖、幾丁質、殼聚糖、菊粉、環糊精或透明質酸）、糖苷、磷脂、或抗體或其結合片段（例如，使RNAi構建體靶向特定細胞類型（如肝臟細胞）的全抗體或結合片段）。配體的其他實例包括染料、嵌入劑（例如吖啶）、交聯劑（例如補骨脂素、絲裂黴素C）、卟啉（例如，TPPC4、texaphyrin、Sapphyrin）、多環芳烴（例如啡𠯤、二氫啡𠯤）、人工核酸內切酶（例如EDTA）、親脂性分子（例如，金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪酮、1,3-二O(十六烷基)甘油、香葉氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、03-(油醯基)石膽酸、03-(油醯基)膽酸、二甲氧基三苯甲基或吩㗁𠯤）、肽（例如，觸角肽、Tat肽、RGD肽）、烷化劑、聚合物（例如，聚乙二醇（PEG）、PEG-40K）、聚胺基酸和多胺（例如，精胺、亞精胺）。
在某些實施方式中，配體具有內體溶解特性。內體溶解配體促進內體裂解和/或RNAi構建體或其組分從內體轉運到細胞的細胞質。內體溶解配體可為顯示出pH依賴性膜活性和融合性的聚陽離子肽或肽模擬物。在一個實施方式中，內體溶解配體在內體pH下呈現其活性構形。「活性」構形係內體溶解配體促進內體裂解和/或RNAi構建體或其組分從內體轉運到細胞的細胞質的構形。示例性內體溶解配體包括GALA肽（Subbarao等人, Biochemistry [生物化學], 第26卷: 2964-2972, 1987）、EALA肽（Vogel等人, J. Am. Chem. Soc. [美國化學會誌], 第118卷: 1581-1586, 1996）、以及它們的衍生物（Turk等人, Biochem. Biophys. Acta [生物化學與生物物理學報], 第1559卷: 56-68, 2002）。在一個實施方式中，內體溶解組分可含有化學基團（例如胺基酸），其響應於pH的變化將經歷電荷或質子化的變化。內體溶解組分可為直鏈或支鏈的。
在一些實施方式中，配體包含脂質或其他疏水分子。在一個實施方式中，配體包含膽固醇部分或其他類固醇。據報告經膽固醇軛合的寡核苷酸較其未經軛合的對應物更具活性（Manoharan, Antisense Nucleic Acid Drug Development [反義核酸藥物開發], 第12卷: 103-228, 2002）。包含用於與核酸分子軛合的膽固醇部分和其他脂質的配體也已經描述於美國專利7,851,615、7,745,608、和7,833,992中。在另一個實施方式中，配體可包含葉酸部分。與葉酸部分軛合的多核苷酸可以經由受體介導的內吞作用途徑被細胞攝取。這樣的葉酸-多核苷酸軛合物描述於例如美國專利8,188,247中。
考慮到SCAP在肝臟細胞（例如肝細胞）中被表現，在某些實施方式中，希望將RNAi構建體特異性地遞送至肝臟細胞。在一些實施方式中，RNAi構建體可以藉由使用與肝臟細胞表面上表現的蛋白質結合或相互作用的配體而特異性靶向肝臟。例如，在某些實施方式中，配體可包含一或多種特異性結合肝細胞上表現的受體的抗原結合蛋白（例如抗體或其結合片段（例如Fab、scFv））。
在某些實施方式中，配體包含碳水化合物。「碳水化合物」係指由一或多個具有至少6個碳原子（可為直鏈、支鏈或環狀）和與每個碳原子鍵合的氧、氮或硫原子的單糖單元構成的化合物。碳水化合物包括但不限於糖（例如單糖、二糖、三糖、四糖和含有約4、5、6、7、8或9個單糖單元的寡糖）和多糖（如澱粉、糖原、纖維素和多糖膠）。在一些實施方式中，摻入配體中的碳水化合物為選自戊糖、己糖或庚糖的單糖以及包括這樣的單糖單元的二糖和三糖。在其他實施方式中，摻入配體中的碳水化合物為胺基糖，如半乳糖胺、葡萄糖胺、N-乙醯半乳糖胺和N-乙醯葡萄糖胺。
在一些實施方式中，配體包含己糖或己糖胺。己糖可選自葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖或果糖。己糖胺可選自果糖胺、半乳糖胺、葡萄糖胺或甘露糖胺。在某些實施方式中，配體包含葡萄糖、半乳糖、半乳糖胺或葡萄糖胺。在一個實施方式中，配體包含葡萄糖、葡萄糖胺或N-乙醯葡萄糖胺。在另一個實施方式中，配體包含半乳糖、半乳糖胺或N-乙醯基-半乳糖胺。在特定實施方式中，配體包含N-乙醯基-半乳糖胺。包含葡萄糖、半乳糖和N-乙醯基-半乳糖胺（GalNAc）的配體在使化合物靶向肝臟細胞方面特別有效（參見例如，D’Souza和Devarajan, J. Control Release [控釋雜誌], 第203卷: 126-139, 2015）。可以摻入本文揭露的RNAi構建體中的含GalNAc或半乳糖的配體的實例描述於美國專利7,491,805；8,106,022；和8,877,917；美國專利公開案號2003/0130186；以及WIPO公開案號WO 2013/166155中。
在某些實施方式中，配體包含多價碳水化合物部分。如本文所用，「多價碳水化合物部分」係指包含能夠獨立地與其他分子結合或相互作用的兩個或更多個碳水化合物單元的部分。例如，多價碳水化合物部分包含兩個或更多個由碳水化合物構成的結合結構域，其可以結合兩個或更多個不同分子或同一分子上的兩個或更多個不同位點。碳水化合物部分的價表示該碳水化合物部分內的單個結合結構域的數目。例如，關於碳水化合物部分的術語「一價」、「二價」、「三價」和「四價」分別係指具有一個、兩個、三個和四個結合結構域的碳水化合物部分。多價碳水化合物部分可以包含多價乳糖部分、多價半乳糖部分、多價葡萄糖部分、多價N-乙醯基-半乳糖胺部分、多價N-乙醯基-葡萄糖胺部分、多價甘露糖部分、或多價岩藻糖部分。在一些實施方式中，配體包含多價半乳糖部分。在其他實施方式中，配體包含多價N-乙醯基-半乳糖胺部分。在該等和其他實施方式中，多價碳水化合物部分為二價、三價或四價的。在這樣的實施方式中，多價碳水化合物部分可為雙觸角或三觸角的。在一個特定實施方式中，多價N-乙醯基-半乳糖胺部分為三價或四價的。在另一個特定實施方式中，多價半乳糖部分為三價或四價的。用於摻入本文揭露的RNAi構建體中的示例性含GalNAc配體包括含三觸角GalNAc的配體（也稱為「GalNAc3」）。
配體可以直接或間接地附接或軛合到RNAi構建體的RNA分子上。例如，在一些實施方式中，配體直接共價附接至RNAi構建體的有義股或反義股。在其他實施方式中，配體經由連接子共價附接至RNAi構建體的有義股或反義股。配體可以附接至本文揭露的RNAi構建體的多核苷酸（例如有義股或反義股）的核鹼基、糖部分或核苷酸間鍵。與嘌呤核鹼基或其衍生物的軛合或附接可發生在包括環內和環外原子在內的任何位置處。在某些實施方式中，嘌呤核鹼基的2、6、7或8位置附接至配體。與嘧啶核鹼基或其衍生物的軛合或附接也可發生在任何位置處。在一些實施方式中，嘧啶核鹼基的2、5和6位置可以附接至配體。與核苷酸的糖部分的軛合或附接可以發生在任何碳原子處。糖部分的可附接至配體的示例性碳原子包括2’、3’和5’碳原子。1’位置也可以附接至配體，如在無鹼基核苷酸中。核苷酸間鍵也可以支持配體附接。對於含磷鍵（例如，磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、胺基磷酸酯等），配體可直接附接至磷原子或與磷原子結合的O、N或S原子上。對於含胺或醯胺的核苷間鍵（例如PNA），配體可附接至胺或醯胺的氮原子或附接至相鄰碳原子。
在某些實施方式中，配體可以附接至有義股或反義股的3’端或5’端。在某些實施方式中，配體共價附接至有義股的5’端。例如，在一些實施方式中，配體附接至有義股的5’末端核苷酸。在某些這樣的實施方式中，配體附接在有義股的5’末端核苷酸的5’位置處。在其他實施方式中，配體共價附接至有義股的3’端。例如，在一些實施方式中，配體附接至有義股的3’末端核苷酸。在某些這樣的實施方式中，配體附接在有義股的3’末端核苷酸的3’位置處。在可替代實施方式中，配體附接在有義股的3’端附近，但在一或多個末端核苷酸之前（即在1、2、3或4個末端核苷酸之前）。在一些實施方式中，配體附接在有義股的3’末端核苷酸的糖的2’位置處。
在某些實施方式中，配體經由連接子附接至有義股或反義股。「連接子」係使配體共價連接至RNAi構建體的多核苷酸組分的原子或原子團。連接子可為約1至約30個原子的長度、約2至約28個原子的長度、約3至約26個原子的長度、約4至約24個原子的長度、約6至約20個原子的長度、約7至約20個原子的長度、約8至約20個原子的長度、約8至約18個原子的長度、約10至約18個原子的長度、以及約12至約18個原子的長度。在一些實施方式中，連接子可以包含雙官能連接部分，其通常包含具有兩個官能基的烷基部分。選擇官能基中之一個以結合目的化合物（例如RNAi構建體的有義股或反義股），且選擇另一個以基本上結合任何選定基團，如本文所述之配體。在某些實施方式中，連接子包含重複單元（如乙二醇或胺基酸單元）的鏈結構或寡聚物。典型地用於雙官能連接部分的官能基的實例包括但不限於用於與親核基團反應的親電子試劑和用於與親電子基團反應的親核試劑。在一些實施方式中，雙官能連接部分包括胺基、羥基、羧酸、硫醇、不飽和度（例如雙鍵或三鍵）等。
可用於將配體附接至RNAi構建體中的有義股或反義股的連接子包括但不限於吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯、6-胺基己酸、經取代的C 1-C 10烷基、經取代的或未經取代的C 2-C 10烯基、或者經取代的或未經取代的C 2-C 10炔基。這樣的連接子的較佳取代基基團包括但不限於羥基、胺基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫醇、硫代烷氧基、鹵素、烷基、芳基、烯基和炔基。
在某些實施方式中，連接子為可切割的。可切割連接子為在細胞外足夠穩定，但是在進入靶細胞後經切割以釋放連接子保持在一起的兩個部分的連接子。在一些實施方式中，可切割連接子在靶細胞中或在第一參考條件（其可以例如經選擇以模擬或代表細胞內條件）下比在受試者血液中或在第二參考條件（其可以例如經選擇以模擬或代表在血液或血清中發現的條件）下切割快至少10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多倍、或至少100倍。
可切割連接子易受切割劑（例如pH、氧化還原電位或降解性分子的存在）影響。通常，切割劑在細胞內比在血清或血液中更普遍或以更高水平或活性被發現。這樣的降解性試劑的實例包括：經選擇用於特定底物或不具有底物特異性的氧化還原劑，包括例如存在於細胞中的氧化或還原酶或還原劑（如硫醇），其可藉由還原來使氧化還原可切割連接子降解；酯酶；可形成酸性環境的內體或試劑，例如產生pH為五或更低的那些；可藉由充當一般酸來使酸可切割連接子水解或降解的酶、肽酶（其可為底物特異性的）、和磷酸酶。
可切割連接子可包含易受pH影響的部分。人血清的pH為7.4，而平均細胞內pH略低，範圍為約7.1-7.3。內體具有更高酸性pH，在5.5-6.0範圍內，且溶酶體具有約5.0的甚至更高酸性pH。一些連接子將具有可切割基團，其在較佳的pH下切割，從而將RNA分子自配體釋放到細胞內，或進入所希望的細胞區室。
連接子可包括可由特定酶切割的可切割基團。摻入連接子中的可切割基團的類型可取決於待靶向的細胞。例如，靶向肝臟的配體可以藉由包括酯基團的連接子連接至RNA分子。肝臟細胞富含酯酶，且因此該連接子在肝臟細胞中將比在不富含酯酶的細胞類型中更有效地切割。富含酯酶的其他類型的細胞包括肺、腎皮質和睪丸的細胞。當靶向富含肽酶的細胞（如肝臟細胞和滑膜細胞）時，可以使用含有肽鍵的連接子。
通常，可以藉由測試降解性試劑（或條件）切割候選連接子的能力來評價候選可切割連接子的適用性。還希望還測試候選可切割連接子在血液中或當與其他非靶組織接觸時抵抗切割的能力。因此，可以確定第一條件與第二條件之間對切割的相對易感性，其中第一條件經選擇為指示靶細胞中的切割，而第二條件經選擇為指示其他組織或生物流體（例如血液或血清）中的切割。評價可以在無細胞系統中、在細胞中、在細胞培養物中、在器官或組織培養物中或在整個動物中進行。在無細胞或培養條件下進行初步評價並藉由對整個動物進行進一步評價來確認可能是有用的。在一些實施方式中，與在血液或血清中（或者在經選擇以模擬細胞外條件的體外條件下）相比，有用的候選連接子在細胞中（或者在經選擇以模擬細胞內條件的體外條件下）的切割快至少2、4、10、20、50、70或100倍。
在其他實施方式中，使用氧化還原可切割連接子。氧化還原可切割連接子在還原或氧化時被切割。還原性可切割基團的實例為二硫連接基團（-S-S-）。為了確定候選可切割連接子是否是合適的「還原性可切割連接子」或者例如是否適合與特定RNAi構建體和特定配體一起使用，可以採用本文所述之一或多種方法。例如，可以藉由與二硫蘇糖醇（DTT）或本領域已知的其他還原劑一起培養來評價候選連接子，其模擬將在細胞（例如靶細胞）中觀察到的切割速率。也可以在經選擇以模擬血液或血清條件的條件下評價候選連接子。在特別實施方式中，候選連接子在血液中被切割至多10%。在其他實施方式中，與在血液中（或者在經選擇以模仿細胞外條件的體外條件下）相比，有用的候選連接子在細胞中（或者在經選擇以模擬細胞內條件的體外條件下）的降解快至少2、4、10、20、50、70、或100倍。
在又其他實施方式中，基於磷酸酯的可切割連接子藉由降解或水解磷酸酯基團的試劑來切割。水解細胞中的磷酸酯基團的試劑的實例為酶，例如細胞中的磷酸酶。基於磷酸酯的可切割基團的實例係-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-，其中Rk可為氫或C 1-C 10烷基。特定的實施方式包括-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-SP(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。另一特定實施方式為-O-P(O)(OH)-O-。該等候選連接子可以使用與上述那些類似的方法評價。
在其他實施方式中，連接子可包含酸可切割基團，該等基團為在酸性條件下被切割的基團。在一些實施方式中，酸可切割基團在pH為約6.5或更低（例如，約6.0、5.5、5.0或更低）的酸性環境中被切割，或藉由試劑如可充當一般酸的酶來切割。在細胞中，特定的低pH細胞器（如內體和溶酶體）可以為酸可切割基團提供切割環境。酸可切割連接基團的實例包括但不限於腙、酯和胺基酸酯。酸可切割基團可具有通式-C=NN-、C(O)O或-OC(O)。當附接至酯的氧（烷氧基基團）的碳係芳基基團時，特定實施方式係經取代的烷基基團或三級烷基基團（如二甲基、戊基或三級丁基）。該等候選物可以使用與上述那些類似的方法評價。
在其他實施方式中，連接子可包含基於酯的可切割基團，該等基團藉由細胞中的酶（如酯酶和醯胺酶）來切割。基於酯的可切割基團的實例包括但不限於伸烷基、亞烯基和亞炔基基團的酯。酯可切割基團具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。該等候選連接子可以使用與上述那些類似的方法評價。
在另外的實施方式中，連接子可以包含基於肽的可切割基團，該等基團藉由細胞中的酶（如肽酶和蛋白酶）來切割。基於肽的可切割基團為在胺基酸之間形成的肽鍵，以產生寡肽（例如，二肽、三肽等）和多肽。基於肽的可切割基團不包括醯胺基團（-C(O)NH-）。醯胺基團可以在任何伸烷基、亞烯基或亞炔基之間形成。肽鍵為在胺基酸之間形成的特殊類型的醯胺鍵，以產生肽和蛋白質。基於肽的可切割基團通常限於在產生肽和蛋白質的胺基酸之間形成的肽鍵（即，醯胺鍵），並且不包括整個醯胺官能基。基於肽的可切割連接基團具有通式-NHCHR AC(O)NHCHR BC(O)-，其中R A和R B係兩個相鄰胺基酸的側鏈。該等候選物可以使用與上述那些類似的方法評價。
適合於將配體附接到本文所述之RNAi構建體中的有義股或反義股的其他類型的連接子為本領域已知的，且可以包括例如以下中描述的連接子：美國專利7,723,509；8,017,762；8,828,956；8,877,917；和9,181,551。
在某些實施方式中，共價附接至RNAi構建體的有義股或反義股的配體包含GalNAc部分，例如多價GalNAc部分。在一些實施方式中，多價GalNAc部分為三價GalNAc部分且附接至有義股的3’端。在其他實施方式中，多價GalNAc部分為三價GalNAc部分且附接至有義股的5’端。在又其他實施方式中，多價GalNAc部分為四價GalNAc部分且附接至有義股的3’端。在仍其他實施方式中，多價GalNAc部分為四價GalNAc部分且附接至有義股的5’端。
在一些實施方式中，可以藉由投與編碼並控制RNAi構建體的細胞內表現的載體，將本文揭露的RNAi構建體遞送至目的細胞或組織。「載體」（本文中也稱為「表現載體」）係可用於將目的核酸遞送至細胞內部的物質的組成物。許多載體係本領域已知的，包括但不限於線性多核苷酸、與離子或兩親性化合物締合的多核苷酸、質體和病毒。因此，術語「載體」包括自主複製的質體或病毒。病毒載體的實例包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體等。載體可以在活細胞中複製，或者其可以以合成方式製成。
通常，用於表現RNAi構建體的載體將包含一或多個與編碼該RNAi構建體的序列可操作連接的啟動子。短語「可操作連接」、「可操作地連接」或「在轉錄控制下」在本文中可互換使用以指示如下情形：啟動子相對於多核苷酸序列處於正確位置和方向，以控制RNA聚合酶的轉錄的起始和多核苷酸序列的表現。「啟動子」係指由活化基因序列的特異性轉錄所需的細胞合成機制或經引入的合成機制識別的序列。合適的啟動子包括但不限於RNA pol I、pol II、HI或U6 RNA pol III、和病毒啟動子（例如人巨細胞病毒（CMV）立即早期基因啟動子、SV40早期啟動子、和勞斯肉瘤病毒長末端重複）。在一些實施方式中，採用HI或U6RNA pol III啟動子。啟動子可為組織特異性或誘導型啟動子。令人特別感興趣的是肝臟特異性啟動子，如來自人α-1抗胰蛋白酶基因、白蛋白基因、血紅素結合蛋白基因和肝脂酶基因的啟動子序列。誘導型啟動子包括例如由蛻皮激素、雌激素、孕酮、四環素和異丙基-PD1-硫代半乳糖苷（IPTG）調節的啟動子。
當RNAi構建體包含siRNA時，兩條單獨的股（有義股和反義股）可以自單個載體或兩個單獨的載體表現。例如，在一些實施方式中，編碼有義股的序列與第一載體上的啟動子可操作連接，且編碼反義股的序列與第二載體上的啟動子可操作連接。在這樣的實施方式中，將第一載體和第二載體例如藉由感染或轉染共同引入靶細胞，使得有義股和反義股一旦被轉錄，將在細胞內雜交以形成siRNA分子。在另一個實施方式中，有義股和反義股由位於單個載體中的兩個單獨的啟動子轉錄。在這樣的實施方式中，編碼有義股的序列可以與第一啟動子可操作連接，且編碼反義股的序列可以與第二啟動子可操作連接，其中第一啟動子和第二啟動子位於單個載體中。在一個實施方式中，載體包含與編碼siRNA分子的序列可操作連接的第一啟動子和在相反方向上與相同序列可操作連接的第二啟動子，使得自該第一啟動子轉錄序列導致siRNA分子的有義股的合成，且自該第二啟動子轉錄序列導致siRNA分子的反義股的合成。
當RNAi構建體包含shRNA時，編碼單個至少部分自身互補的RNA分子的序列與啟動子可操作連接以產生單個轉錄物。在一些實施方式中，編碼shRNA的序列包含藉由連接子多核苷酸序列連接的反向重複序列，以在轉錄後產生shRNA的莖和環結構。
在一些實施方式中，編碼RNAi構建體的載體為病毒載體。適合表現本文所述RNAi構建體的各種病毒載體系統包括但不限於腺病毒載體、反轉錄病毒載體（例如慢病毒載體、莫洛尼氏鼠白血病病毒）、腺相關病毒載體；單純疱疹病毒載體；SV40載體；多瘤病毒載體；乳頭狀瘤病毒載體；微小核糖核酸病毒載體；和痘病毒載體（例如牛痘病毒）。在某些實施方式中，病毒載體為反轉錄病毒載體（例如慢病毒載體）。
適用於在本揭露中使用的各種載體、用於將編碼siRNA或shRNA分子的核酸序列插入載體中的方法、和將載體遞送至目的細胞的方法係本領域已知的（參見例如，Dornburg, Gene Therap. [基因療法], 第2卷: 301-310, 1995；Eglitis, Biotechniques [生物技術], 第6卷: 608-614, 1988；Miller, HumGene Therap. [人類基因療法], 第1卷: 5-14, 1990；Anderson, Nature [自然], 第392卷: 25-30, 1998；Rubinson D A等人, Nat. Genet.[自然遺傳學], 第33卷: 401-406, 2003；Brummelkamp等人, Science [科學], 第296卷: 550-553, 2002；Brummelkamp等人, Cancer Cell [癌細胞], 第2卷: 243-247, 2002；Lee等人, Nat Biotechnol [自然生物技術], 第20卷: 500-505, 2002；Miyagishi等人, Nat Biotechnol [自然生物技術], 第20卷: 497-500, 2002；Paddison等人, GenesDev [基因發育], 第16卷: 948-958, 2002；Paul等人, Nat Biotechnol [自然生物技術], 第20卷: 505-508, 2002；Sui等人, Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊], 第99卷: 5515-5520, 2002；和Yu等人, Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊], 第99卷: 6047-6052, 2002）。 組成物
本揭露還提供組成物和配製物，該等組成物和配製物包含本文所述之RNAi構建體和藥學上可接受的載劑、賦形劑或稀釋劑。這樣的組成物和配製物可用於在有需要的受試者中降低SCAP的表現。當考慮臨床應用時，將以適合於預期應用的形式製備藥物組成物和配製物。通常，這將需要製備基本上不含熱原以及可能對人或動物有害的其他雜質的組成物。
短語「藥學上可接受的」或「藥理學上可接受的」係指當投與於動物或人時不產生不良反應、過敏或其他不利反應的分子實體和組成物。如本文所用，「藥學上可接受的載劑、賦形劑或稀釋劑」包括可接受的用於配製藥物（如適合於向人投與的藥物）的溶劑、緩衝劑、溶液、分散介質、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這樣的介質和試劑用於藥學上活性物質之用途為本領域熟知的。除非任何常規介質或試劑與本揭露之RNAi構建體不相容，否則考慮其在治療組成物中之用途。還可將補充活性成分摻入組成物中，條件係它們不會使組成物的載體或RNAi構建體失活。
用於配製藥物組成物的組成物和方法取決於幾種標準，包括但不限於投與途徑、待治療的疾病或障礙的類型和程度、以及待投與的劑量。在一些實施方式中，基於預期遞送途徑配製藥物組成物。例如，在某些實施方式中，配製藥物組成物以用於腸胃外遞送。腸胃外遞送形式包括靜脈內、動脈內、皮下、鞘內、腹膜內以及肌內注射或輸注。在一個實施方式中，配製藥物組成物以用於靜脈內遞送。在這樣的實施方式中，藥物組成物可包括基於脂質的遞送媒介物。在另一個實施方式中，配製藥物組成物以用於皮下遞送。在這樣的實施方式中，藥物組成物可包括靶向配體（例如，本文所述之含GalNAc的配體）。
在一些實施方式中，藥物組成物包含有效量的本文所述之RNAi構建體。「有效量」係足以產生有益或希望的臨床結果的量。在一些實施方式中，有效量係足以降低SCAP在受試者肝細胞中的表現的量。在一些實施方式中，有效量可為足以僅部分降低SCAP表現（例如，降低至與人雜合子中野生型SCAP對偶基因的表現相當的水平）的量。
本文揭露的RNAi構建體的有效量可為從約0.01 mg/kg體重至約100 mg/kg體重、約0.05 mg/kg體重至約75 mg/kg體重、約0.1 mg/kg體重至約50 mg/kg體重、約1 mg/kg至約30 mg/kg體重、約2.5 mg/kg體重至約20 mg/kg體重或約5 mg/kg體重至約15 mg/kg體重。包含有效量的RNAi構建體的藥物組成物可以每週、每兩週、每月、每季度或每半年投與。所認為的有效量和投與頻率的準確確定可以基於幾個因素，包括患者大小、年齡、性別、待治療的障礙類型（例如脂肪變性、NAFLD、NASH或肝硬化）、使用的特定RNAi構建體和投與途徑。可以使用常規方法和/或在適當的動物模型中測試來確認本文揭露的任何特定RNAi構建體的有效劑量和體內半衰期的估計值。
膠體分散系統（如大分子複合物、奈米膠囊、微球、珠粒）和基於脂質的系統（包括水包油乳液、膠束、混合膠束和脂質體）可以用作本文揭露的RNAi構建體或編碼這樣的構建體的載體的遞送媒介物。適用於遞送核酸的市售脂肪乳液包括INTRALIPID®、LIPOSYN®、LIPOSYN®II、LIPOSYN®III、NUTRILIPID和其他類似的脂質乳液。用作體內遞送媒介物的較佳的膠體系統係脂質體（即，人工膜囊泡）。RNAi構建體可以封裝在脂質體（如陽離子脂質體）內。可替代地，本文揭露的RNAi構建體可以與脂質（如陽離子脂質）複合。合適的脂質和脂質體包括中性（例如二油醯基磷脂醯乙醇胺（DOPE）、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼（DMPC）和二棕櫚醯磷脂醯膽鹼（DPPC））、二硬脂醯磷脂醯膽鹼）、陰性（例如二肉豆蔻醯磷脂醯甘油（DMPG））、和陽離子型（例如二油醯基四甲基胺基丙基（DOTAP）和二油醯基磷脂醯乙醇胺（DOTMA））。這樣的膠體分散系統的製備和使用為本領域熟知的。示例性配製物也揭露於例如美國專利5,783,565；5,837,533；5,981,505；6,127,170；6,217,900；6,379,965；6,383,512；6,747,014；7,202,227；和WO 03/093449中。
在一些實施方式中，本文揭露的RNAi構建體完全封裝於脂質配製物中，例如，以形成SPLP、pSPLP、SNALP、或其他核酸-脂質顆粒。如本文所用，術語「SNALP」係指穩定的核酸-脂質顆粒，包括SPLP。如本文所用，術語「SPLP」係指包含封裝於脂質囊泡內的質體DNA的核酸-脂質顆粒。SNALP和SPLP典型地含有陽離子脂質、非陽離子脂質、和防止顆粒聚集的脂質（例如，PEG-脂質軛合物）。SNALP和SPLP對於全身應用特別有用，因為它們在靜脈內注射後展現出循環壽命延長，並且在遠端部位（例如，與投與部位物理分離的部位）積累。SPLP包括「pSPLP」，其包括PCT公開案號WO 00/03683中所闡述的經封裝的縮合劑-核酸複合物。核酸-脂質顆粒典型地具有約50 nm至約150 nm、約60 nm至約130 nm、約70 nm至約110 nm、或約70 nm至約90 nm的平均直徑，且基本上無毒。另外，存在於核酸-脂質顆粒中的核酸在水溶液中理想地對用核酸酶的降解具有抗性。核酸-脂質顆粒及其製備方法揭露於例如美國專利5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410；和6,815,432；和PCT公開案號WO 96/40964中。
適用於注射的藥物組成物包括例如無菌水溶液或分散液和用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。通常，該等製劑為無菌的且流動到易於注射的程度。製劑應在製造和儲存條件下穩定，且應防止微生物（如細菌和真菌）的污染作用。適合的溶劑或分散介質可以含有例如水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等）、其合適的混合物、和植物油。可以例如藉由使用包衣（如卵磷脂）、藉由維持所需的粒度（在分散體的情況下）和/或藉由使用界面活性劑來維持適當的流動性。對微生物作用的防止可以藉由各種抗菌劑和抗真菌劑（例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等）來實現。在許多情況下，等滲劑（例如，糖或氯化鈉）可以包括在組成物中。可藉由包括延遲吸收的試劑（例如，單硬脂酸鋁和明膠）來實現可注射組成物的延長吸收。
無菌可注射溶液可以藉由如下來製備：將適當量的RNAi構建體（單獨或與配體複合）連同所希望的任何其他成分（如以上所述）一起摻入溶劑中，然後過濾滅菌。通常，藉由將各種滅菌的活性成分摻入無菌媒介物中來製備分散液，該無菌媒介物含有基礎分散介質和希望的其他成分。在用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，合適的製備方法包括真空乾燥和冷凍乾燥技術，其產生一或多種活性成分加上來自其先前無菌過濾溶液的任何另外的希望的成分的粉末。
本文提供的組成物可以配製成中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括例如衍生自無機酸（例如，鹽酸或磷酸）或衍生自有機酸（例如，乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等）的酸加成鹽（與游離胺基基團一起形成）。與游離羧基基團形成的鹽還可衍生自無機鹼（例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵）或衍生自有機鹼（例如，異丙胺、三甲胺、組胺酸、普魯卡因等）。
例如對於在水溶液中的腸胃外投與，通常將溶液適當地緩衝，且首先用例如足夠的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。這樣的水溶液可用於例如靜脈內、肌內、皮下和腹膜內投與。如熟悉該項技術者所知，理想地使用無菌水性介質。舉例說明，可將單次劑量溶解於1 ml等滲NaCl溶液中，並添加到1000 ml皮下注射液中或在所建議輸注部位注射（參見例如「Remington’s Pharmaceutical Sciences [雷明頓製藥科學]」 第15版, 第1035-1038頁和第1570-1580頁）。對於人投與，製劑應符合FDA標準所要求的無菌性、產熱原性、一般安全性和純度標準。在本揭露之某些實施方式中，藥物組成物包含無菌鹽水溶液和本文所述之RNAi構建體，或由其組成。在其他實施方式中，藥物組成物包含本文所述之RNAi構建體和無菌水（例如注射用水，WFI），或由其組成。在仍其他實施方式中，藥物組成物包含本文所述之RNAi構建體和磷酸鹽緩衝液（PBS），或由其組成。
在一些實施方式中，藥物組成物與用於投與的裝置一起包裝或儲存於該裝置內。用於可注射配製物的裝置包括但不限於注射口、載藥注射器、自動注射器、注射泵、隨身注射器和注射筆。用於霧化或粉末配製物的裝置包括但不限於吸入器、吹入器、吸氣器等。因此，本揭露包括投與裝置，該等投與裝置包含用於治療或預防一或多種本文所述障礙的藥物組成物。 用於抑制 SCAP 表現的方法
本揭露還提供抑制SCAP基因在細胞中的表現的方法。該等方法包括使細胞與有效抑制SCAP在細胞中的表現的量的RNAi構建體（例如，雙股RNAi構建體）接觸。使細胞與RNAi構建體（例如，雙股RNAi構建體）接觸可以在體外或體內進行。使細胞在體內與RNAi構建體接觸包括使受試者（例如，人受試者）內的細胞或細胞群與RNAi構建體接觸。接觸細胞的體外和體內方法的組合也在本揭露之範圍內。
本揭露提供用於降低或抑制SCAP在有需要的受試者中的表現的方法、以及治療或預防與SCAP表現或活性相關的病症、疾病或障礙的方法。「與SCAP表現相關的病症、疾病或障礙」係指其中SCAP表現程度被改變或者其中SCAP表現程度的升高與發展出該病症、疾病或障礙的風險增加相關的病症、疾病或障礙。
如上所討論，接觸細胞可為直接的或間接的。此外，可以經由靶向配體實現與細胞接觸，該靶向配體包括本文所述或本領域已知的任何配體。在較佳的實施方式中，靶向配體為碳水化合物部分（例如三觸角GalNAc配體（GalNAc3））或將RNAi構建體引導至目的位點的任何其他配體。
在一個實施方式中，使細胞與RNAi接觸包括藉由促進或實現攝取或吸收到細胞中來「引入」或「將RNAi遞送到細胞中」。吸收或攝取RNAi可以藉由無協助擴散過程或主動細胞過程或借助助劑或裝置發生。例如，對於體內引入，可以將RNAi注射到組織部位或全身投與。體外引入到細胞中可以使用本領域已知的方法（如電穿孔和脂質轉染）來實現。另外的方法在下文中描述和/或在本領域中為已知的。
如本文所用，術語「抑制」與「降低」、「緘默化」、「下調」、「阻抑」和其他類似術語可互換使用，且包括任何水平的抑制。
短語「抑制SCAP的表現」旨在係指對任何SCAP基因（例如小鼠SCAP基因、大鼠SCAP基因、猴SCAP基因、或人SCAP基因）以及SCAP基因的變體或突變體的表現的抑制。因此，在基因操縱的細胞、細胞群、或生物的上下文中，SCAP基因可為野生型SCAP基因、突變體SCAP基因或轉基因SCAP基因。
「抑制SCAP基因的表現」包括任何水平的SCAP基因的抑制，例如，SCAP基因表現的至少部分阻抑。可基於與SCAP基因表現相關的任何變數的水平或者水平的變化（例如SCAP mRNA水平或SCAP蛋白水平），對SCAP基因的表現進行評估。可以在單個細胞或細胞群（包括例如衍生自受試者的樣本）中評估該水平。
可藉由與對照水平相比與SCAP表現相關的一或多個變數的絕對或相對水平的降低，對抑制進行評估。對照水平可為本領域中使用的任何類型的對照水平，例如，給藥前基線水平、或由未經處理或用對照（例如僅緩衝對照或無活性試劑對照）處理的類似受試者、細胞或樣本確定的水平。在一些實施方式中，SCAP基因的表現被抑制至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%。
SCAP基因表現的抑制可藉由由第一細胞或細胞群（這樣的細胞可存在於例如衍生自受試者的樣本中）所表現的mRNA的量的減少來表現，在該第一細胞或細胞群中SCAP被轉錄並且該第一細胞或細胞群已經經過處理（例如，藉由使一或多個細胞與本文揭露的RNAi構建體接觸，或者藉由向正存在或曾存在該等細胞的受試者投與本文揭露的RNAi構建體），使得與基本上與該第一細胞或細胞群相同但尚未經過如此處理的第二細胞或細胞群（一或多個對照細胞）相比，SCAP基因的表現被抑制。可以藉由使用下式將經處理細胞中的mRNA水平表示為對照細胞中的mRNA水平的百分比來評估抑制：
可替代地，可根據在功能上與SCAP基因表現有關的參數（例如，SCAP蛋白表現或SREBP蛋白家族活性）的降低來對SCAP基因表現的抑制進行評估。可在內源地或重組地表現SCAP的任何細胞中，藉由在本領域中已知的任何測定來確定SCAP基因緘默化。
SCAP蛋白表現的抑制可藉由由細胞或細胞群所表現的SCAP蛋白的水平（例如，在獲自受試者的樣本中所表現的蛋白質的水平）的降低來表現。如上所解釋，為評估mRNA阻抑，經處理的細胞或細胞群中蛋白質表現程度的抑制可以類似地表示為對照細胞或細胞群中蛋白質水平的百分比。
可用於對SCAP基因表現的抑制進行評估的對照細胞或細胞群包括尚未與本文揭露的RNAi構建體接觸的細胞或細胞群。例如，在用RNAi構建體對受試者進行治療之前，對照細胞或細胞群可衍生自單個受試者（例如，人或動物受試者）。
可利用本領域中已知的用於對mRNA表現進行評估的任何方法（如上面提到的那些）來確定由細胞或細胞群所表現的SCAP mRNA的水平或者循環SCAP mRNA的水平。在一些實施方式中，藉由對轉錄的多核苷酸或其部分（例如SCAP基因的mRNA）進行檢測來確定樣本中SCAP的表現程度。在這方面，例如可以使用RNA提取技術自細胞中提取RNA，該等提取技術包括例如酸性酚/異硫氰酸胍提取（RNAzol B；生物起源公司（Biogenesis））、RNeasy RNA製備套組（kit）（凱傑公司（Qiagen））或PAXgene（普裡阿勒蒂克斯公司，瑞士（PreAnalytix，Switzerland））。利用核糖核酸雜交的典型測定形式包括核連續測定、RT-PCR、RNA酶保護測定（Melton等人, Nuc. Acids Res. [核酸研究]，12:7035）、北方墨點法、原位雜交和微陣列分析。循環SCAP mRNA可以使用WO 2012/177906中描述的方法來檢測。
在一個實施方式中，使用核酸探針來確定SCAP的表現程度。如本文所用，術語「探針」係指能夠與特定SCAP序列選擇性結合的任何分子。探針可由熟悉該項技術者合成，或衍生自適當的生物製劑。探針可以經專門設計以被標記。可用作探針的分子的實例包括但不限於RNA、DNA、蛋白質、抗體和有機分子。
經分離的mRNA可用於雜交或擴增測定，該等測定包括但不限於南方墨點法或北方墨點法分析、聚合酶鏈反應（PCR）分析和探針陣列。確定mRNA水平的一種方法涉及使經分離的mRNA與可以與SCAP mRNA雜交的核酸分子（探針）接觸。在一個實施方式中，將mRNA固定於固體表面上且與探針接觸，例如藉由在瓊脂糖凝膠上運行經分離的mRNA並將mRNA自凝膠轉移至膜（如硝化纖維素）。在可替代實施方式中，將一或多個探針固定於固體表面上，並使mRNA與一或多個探針接觸，例如在Affymetrix基因晶片陣列中。熟悉該項技術者可以容易地適應用於確定SCAP mRNA水平的已知mRNA檢測方法。
確定樣本中SCAP表現程度的可替代方法涉及例如對樣本中的mRNA進行核酸擴增和/或應用反轉錄酶（以製備cDNA）的過程，例如藉由RT-PCR（參見例如，美國專利4,683,202）、連接酶鏈反應（Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 88: 189-193）、自我持續序列複製（Guatelli等人 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 87: 1874-1878）、轉錄擴增系統（Kwoh等人 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 86: 1173-1177）、Q-β複製酶（Lizardi等人 (1988) Bio/Technology [生物技術] 6: 1197）、滾環複製（Lizardi等人, 同上；以及美國專利5,854,033）或者任何其他核酸擴增方法，然後利用熟悉該項技術者熟知的技術對經擴增的分子進行檢測。若這樣的分子以非常低的數目存在，則該等檢測方案尤其可用於檢測核酸分子。在本揭露之一些方面，藉由定量螢光RT-PCR（即，TAQMAN™系統）確定SCAP的表現程度。可以使用膜墨點（如用於雜交分析，如北方墨點法、南方墨點法、斑點等）或微孔、樣本管、凝膠、珠粒或纖維（或包含結合的核酸的任何固體支持物）來監測SCAP mRNA的表現程度（參見例如，美國專利5,445,934；5,677,195；5,770,722；5,744,305；和5,874,219）。SCAP表現程度的確定還可包括使用溶液中的核酸探針。在某些實施方式中，使用分支DNA（bDNA）測定或即時PCR（qPCR）評估mRNA表現程度。
可利用本領域中已知的用於測量蛋白質水平的任何方法來確定SCAP蛋白表現的水平。這樣的方法包括例如電泳、毛細管電泳、高效液相層析（HPLC）、薄層層析（TLC）、超擴散層析、流體或凝膠沈澱素反應、吸收光譜、比色測定、分光光度測定、流動式細胞分析術、免疫擴散（單或雙）、免疫電泳、西方墨點法、放射性免疫分析法（RIA）、酶聯免疫吸附測定（ELISA）、免疫螢光測定、電化學發光測定等。
在一些實施方式中，本文揭露的方法的功效可以藉由檢測或監測與SCAP相關的疾病的症狀的減少來監測，該症狀如胃腸道疼痛，呼吸困難，高血壓或四肢、面部、喉、上呼吸道、腹部、軀幹和生殖器的腫脹。可以使用本領域已知的任何方法在體外或體內評估該等症狀。
在一些實施方式中，向受試者投與RNAi構建體或包含RNAi構建體的組成物，使得將該RNAi構建體遞送至在該受試者內的特定部位。可使用衍生自受試者內特定部位的液體或組織的樣本中SCAP mRNA或SCAP蛋白的水平或水平的變化的測量值來評估SCAP表現的抑制。在一些實施方式中，可以將RNAi構建體遞送至如肝臟、脈絡叢、視網膜和胰臟的部位。該部位還可為來自任一上述部位的細胞的子部分或子組。該部位還可包括表現特定類型受體的細胞。 治療或預防與 SCAP 相關的疾病的方法
本揭露提供治療性和預防性方法，該等方法包括向患有與SCAP相關的疾病、障礙和/或病症或者易於發展出與SCAP相關的疾病、障礙和/或病症的受試者投與如本文所述之RNAi構建體、包含RNAi構建體的組成物（例如藥物組成物）、或包含RNAi構建體的載體。與SCAP相關的疾病的非限制性實例包括例如脂肪肝（脂肪變性）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化、肝臟中的脂肪積累、肝臟炎症、肝細胞壞死、肝纖維化、肥胖、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）、高三酸甘油脂血症和高脂血症。在一個實施方式中，與SCAP相關的疾病係NAFLD。在另一個實施方式中，與SCAP相關的疾病係NASH。在另一個實施方式中，與SCAP相關的疾病係脂肪肝（脂肪變性）。在另一個實施方式中，與SCAP相關的疾病係胰島素抵抗。
在某些實施方式中，本揭露提供一種用於在有需要的患者中降低SCAP的表現的方法，該方法包括向該患者投與本文所述之任何RNAi構建體。如本文所用，術語「患者」係指哺乳動物，包括人，且與術語「受試者」可互換使用。與未接受RNAi構建體的患者中的SCAP表現程度相比，患者肝細胞中的SCAP表現程度理想地在投與RNAi構建體後降低。
本文揭露的方法可用於治療患有與SCAP相關的疾病的受試者，例如將從SCAP基因表現和/或SCAP蛋白產生的減少中受益的受試者。在一個方面，本揭露提供在患有非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的受試者中降低SCAP基因表現的水平的方法。在另一個方面，本揭露提供在患有NAFLD的受試者中降低SCAP蛋白的水平的方法。
本文揭露之治療方法（和用途）包括向受試者（例如人）投與治療有效量的所揭露的靶向SCAP基因的RNAi構建體、包含該RNAi構建體的藥物組成物或包含該RNAi構建體的載體。
在一個方面，本揭露提供在患有NAFLD的受試者中預防至少一種症狀的方法，該至少一種症狀例如存在hedgehog傳訊途徑升高、疲勞、虛弱、體重減輕、食慾不振、噁心、腹痛、蜘蛛樣血管、皮膚和眼睛發黃（黃疸）、搔癢、腿部液體積聚和腫脹（水腫）、腹部腫脹（腹水）、和精神錯亂。該等方法包括向受試者投與預防有效量的RNAi構建體（例如siRNA）、包含RNAi構建體的藥物組成物、或編碼RNAi構建體的載體，從而在將從SCAP基因表現的降低中受益的患有障礙的受試者中預防至少一種症狀。「預防有效量」係指在必要的劑量和時間段下有效實現所希望的預防結果（例如，預防疾病發作）的量。
在另一個方面，本揭露提供治療有效量的本文揭露的RNAi構建體用於治療受試者，例如將從SCAP基因表現的降低和/或抑制中受益的受試者之用途。在另外的方面，本揭露提供靶向SCAP基因的RNAi構建體（例如，siRNA）、或者包含靶向SCAP基因的RNAi構建體的藥物組成物在製造用於治療受試者（例如將從SCAP基因表現和/或SCAP蛋白產生的降低和/或抑制中受益的受試者，如將從SCAP基因表現的降低中受益的患有障礙（例如與SCAP相關的疾病）的受試者）的藥物中之用途。
本揭露提供本文揭露的RNAi構建體（例如siRNA）用於預防患有可受益於SCAP基因表現和/或SCAP蛋白產生的降低和/或抑制的障礙的受試者中之至少一種症狀之用途。例如，本揭露提供本文所述之RNAi構建體、包含其的組成物以及包含其的載體在治療NAFLD中之用途。
在另外的方面，本揭露提供所揭露的RNAi構建體、包含其的組成物或包含其的載體在製造藥物中之用途，該藥物用於預防患有受益於SCAP基因表現和/或SCAP蛋白產生的降低和/或抑制的障礙例如SCAP相關疾病的受試者中之至少一種症狀。
在一個實施方式中，向患有與SCAP相關的疾病（例如非酒精性脂肪性肝病（NAFLD））的受試者投與靶向SCAP的RNAi構建體，使得當向該受試者投與該RNAi構建體時，SCAP基因例如在該受試者的細胞、組織、血液或其他組織或體液中的表現降低至少約10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、62%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或者至少約99%或更多。
本文揭露的方法和用途包括投與本文所述之組成物，使得靶SCAP基因的表現的降低持續任何合適的時間量，如約1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、18、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76或約80小時。在一個實施方式中，靶SCAP基因的表現在延長的持續時間（例如至少約2、3、4、5、6、7天或更長時間，例如約1週、2週、3週、或者約4週或更長時間）內降低。
根據本文揭露的方法和用途的RNAi構建體的投與可導致在患有與SCAP相關的疾病（例如NAFLD）的患者中這樣的疾病或障礙的嚴重程度、體征、症狀和/或標誌物的降低。在此上下文中，「降低」意指這樣的水平的統計學顯著降低。降低可為例如至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或約100%。可以例如藉由測量疾病進展、疾病緩解、症狀嚴重程度、疼痛減輕、生活品質、維持治療效果所需的藥物劑量、疾病標誌物或適用於所治療或靶向以預防的給定疾病的任何其他可測量參數的水平來評估治療或預防疾病的功效。藉由測量這樣的參數中之任一個或任何參數組合來監測治療或預防功效在熟悉該項技術者的能力範圍內。例如，可以例如藉由定期監測NAFLD症狀、肝臟脂肪水平或下游基因的表現來評估治療NAFLD的功效。後續讀數與初始讀數的比較為醫師提供治療是否有效的指示。關於靶向SCAP的RNAi或其藥物組成物的投與，「有效針對」與SCAP相關的疾病表明以臨床上適當的方式投與導致在至少統計學上顯著部分的患者中的有益效果，如症狀的改善、治癒、疾病的減輕、生命的延長、生活品質的改善、或者通常被熟悉治療NAFLD和/或與SCAP相關的疾病及相關原因的醫生認為是積極的其他效果。
當疾病狀態的一或多個參數得到統計學顯著改善時，或者由於未能惡化或未發展出在其他情況下預期會出現的症狀時，治療或預防效果明顯。作為實例，在可測量疾病參數中，至少10%，較佳的是至少20%、30%、40%、50%或更多有利變化可以指示有效治療。還可以使用如本領域已知的用於給定疾病的實驗動物模型來判斷給定RNAi構建體或該構建體的配製物的功效。當使用實驗動物模型時，當觀察到標誌物或症狀的統計學顯著降低時，證明了治療功效。
可以向受試者投與任何治療有效量的RNAi構建體。治療有效量的RNAi構建體的示例性範圍包括但不限於從約0.01 mg/kg體重至約100 mg/kg體重、約0.05 mg/kg體重至約75 mg/kg體重、約0.1 mg/kg體重至約50 mg/kg體重、約1 mg/kg至約30 mg/kg體重、或約2.5 mg/kg體重至約20 mg/kg體重。本揭露還涵蓋在所敘述範圍中間的值和範圍。
RNAi構建體或包含其的組成物的投與可以將SCAP蛋白水平（例如，在患者的細胞、組織、血液、尿液或其他區室中）的存在降低至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或至少約99%或更多。
在投與全劑量RNAi之前，可以向患者投與較小劑量（如5%輸注），並監測不良反應（如過敏）。在另一個實例中，可以監測患者的不想要的免疫刺激效果，如提高的細胞介素（例如，TNF-α或INF-α）水平。
由於對SCAP表現的抑制性作用，根據本揭露之組成物或由其製備的藥物組成物可以增強患有與SCAP相關的疾病（例如，NAFLD）的患者的生活品質。
本文揭露的RNAi可以「裸」形式投與，其中將經修飾或未經修飾的RNAi構建體直接懸浮在水性或合適的緩衝溶劑中，作為「游離RNAi」。在不存在藥物組成物的情況下投與游離RNAi。游離RNAi可以處於合適的緩衝溶液中。緩衝溶液可包含乙酸鹽、檸檬酸鹽、穀醇溶蛋白、碳酸鹽或磷酸鹽、或其任何組合。在一個實施方式中，緩衝溶液為磷酸鹽緩衝液（PBS）。可以調節含有RNAi的緩衝溶液的pH和滲透壓（osmolality），使其適用於向受試者投與。
可替代地，本文揭露的RNAi構建體可以作為藥物組成物（如脂質體配製物）投與。
將從SCAP基因表現的降低和/或抑制中受益的受試者係患有非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和/或如本文所述或以其他方式為本領域已知的另一與SCAP相關的疾病或障礙的那些受試者。
本揭露進一步提供RNAi構建體或其藥物組成物與其他藥物和/或其他治療性方法的組合用於治療將會從SCAP基因表現的降低和/或抑制中受益的受試者（例如患有與SCAP相關的疾病的受試者）的方法和用途，該等其他藥物和/或其他治療性方法例如已知的藥物和/或已知的治療性方法，例如目前用於治療該等障礙的那些。
例如，在某些實施方式中，將靶向SCAP基因的RNAi構建體與例如可用於治療與SCAP相關的疾病的藥劑組合投與。例如，適用於治療將從SCAP表現的降低中受益的受試者（例如，患有與SCAP相關的疾病的受試者）的另外的治療劑和治療性方法包括靶向SCAP基因的不同部分的RNAi構建體、治療劑、和/或用於治療與SCAP相關的疾病的程序、或任何前述項的組合。
在某些實施方式中，將靶向SCAP基因的一部分的第一RNAi構建體與靶向該SCAP基因的不同部分的第二RNAi構建體組合投與。例如，第一RNAi構建體可以包含形成雙股區的第一有義股和第一反義股，其中所述第一有義股的基本上所有的核苷酸和該第一反義股的基本上所有的核苷酸係經修飾的核苷酸，其中所述第一有義股軛合至在3’-末端處附接的配體，並且其中該配體係藉由二價或三價分支連接子附接的一或多種GalNAc衍生物；並且該第二RNAi構建體可以包含形成雙股區的第二有義股和第二反義股，其中該第二有義股的基本上所有的核苷酸和該第二反義股的基本上所有的核苷酸係經修飾的核苷酸，其中該第二有義股軛合至在3’-末端處附接的配體，並且其中該配體係藉由二價或三價分支連接子附接的一或多種GalNAc衍生物。在一個實施方式中，第一和第二有義股的所有核苷酸和/或第一和第二反義股的所有核苷酸均包含修飾。經修飾的核苷酸可為本文所述之經修飾的核苷酸中之任一種或組合。
在其他實施方式中，將靶向SCAP基因的第一RNAi構建體與靶向不同於SCAP基因的基因的第二RNAi構建體組合投與。例如，靶向SCAP基因的RNAi構建體可以與靶向含patatin樣磷脂酶結構域3（PNPLA3）基因的RNAi構建體組合投與。I148M突變體PNPLA3蛋白係具有強大的人基因驗證的治療非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的治療性靶標。PNPLA3 I148M的表現導致過量肝臟脂肪的積累，並驅動與非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）相關的表現型的發病率、進展和嚴重程度增加。可將靶向SCAP基因的第一RNAi構建體和靶向不同的基因（例如PNPLA3基因）的第二RNAi構建體作為相同藥物組成物的一部分而投與。可替代地，可將靶向SCAP基因的第一RNAi構建體和靶向不同基因（例如PNPLA3基因）的第二RNAi構建體作為不同藥物組成物的一部分而投與。
RNAi構建體和另外的治療劑和/或治療可在相同時間和/或在相同組合中例如進行腸胃外投與，或者可以將另外的治療劑作為單獨的組成物的一部分或者在單獨的時間和/或藉由本領域中已知或本文所述之另一種方法投與。
本揭露還提供了使用本文揭露的RNAi構建體和/或含有RNAi構建體的組成物來降低和/或抑制SCAP在細胞中的表現（基因或蛋白質表現）的方法。在又其他方面，提供了本文揭露的RNAi構建體和/或包含RNAi構建體的組成物用於製造藥物之用途，該藥物用於降低和/或抑制SCAP基因在細胞中的表現。在仍其他方面，本揭露提供用於降低和/或抑制細胞中SCAP蛋白的產生的本文所述之RNAi和/或包含RNAi構建體的組成物。在又其他方面，提供了本文所述之RNAi構建體和/或包含RNAi構建體的組成物用於製造藥物之用途，該藥物用於降低和/或抑制細胞中SCAP蛋白的產生。該等方法和用途包括使細胞與本文揭露的RNAi構建體（例如siRNA）接觸，並且將該細胞維持足夠時間以獲得SCAP基因的mRNA轉錄物的降解，從而抑制SCAP基因的表現或者抑制細胞中SCAP蛋白的產生。基因表現的降低可以藉由本領域已知的或本文所述之用於確定mRNA或蛋白質水平的任何方法來評估。
在本文揭露的方法和用途中，細胞可以在體外或體內進行接觸，即細胞可以在受試者外（例如，在細胞培養物中）或在受試者體內。適合於使用本文揭露的方法進行處理的細胞可為表現SCAP基因的任何細胞，例如來自患有NAFLD的受試者的細胞或者包含表現載體的細胞，該表現載體包含SCAP基因或SCAP基因的一部分。用於在所揭露的方法中使用的合適的細胞包括例如哺乳動物細胞，例如靈長類動物細胞（如人細胞或非人靈長類動物細胞，例如猴細胞或黑猩猩細胞）、非靈長類動物細胞（如牛細胞、豬細胞、駱駝細胞、駱馬細胞、馬細胞、山羊細胞、兔細胞、綿羊細胞、倉鼠、天竺鼠細胞、貓細胞、狗細胞、大鼠細胞、小鼠細胞、獅子細胞、老虎細胞、熊細胞、或水牛細胞）、鳥類細胞（例如鴨細胞或鵝細胞）、或鯨細胞。在一個實施方式中，細胞係人細胞。
在細胞中SCAP基因表現可被抑制至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或約100%。
在細胞中SCAP蛋白產生可被抑制至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或約100%。
本文揭露的體內方法和用途可包括向受試者投與含有RNAi構建體的組成物，其中該RNAi構建體包括與受試者的SCAP基因的RNA轉錄物的至少一部分互補的核苷酸序列。當待治療的生物為人時，組成物可以藉由本領域已知的任何方式投與，包括但不限於皮下、靜脈內、口服、腹膜內或腸胃外途徑，包括顱內（例如，腦室內、實質內和鞘內）、肌內、透皮、氣道（氣溶膠）、鼻腔、直腸和局部（包括口腔和舌下）投與。在某些實施方式中，組成物藉由皮下或靜脈內輸注或注射投與。在一個實施方式中，組成物藉由皮下注射投與。
在一些實施方式中，經由長效注射投與。長效注射可以在延長的時間段內以一致方式釋放RNAi構建體。因此，長效注射可減少獲得希望的效果（例如，希望的SCAP抑制、或治療性或預防性效果）所需的給藥頻率。長效注射還可以提供更一致的血清濃度。長效注射可包括皮下注射或肌內注射。在一些實施方式中，長效注射為皮下注射。
在一些實施方式中，經由泵投與。泵可為外部泵或手術植入泵。在某些實施方式中，泵為皮下植入滲透泵。在其他實施方式中，泵為輸注泵。輸注泵可用於靜脈內、皮下、動脈或硬膜外輸注。在較佳的實施方式中，輸注泵為皮下輸注泵。在其他實施方式中，泵為將RNAi構建體遞送至受試者的手術植入泵。
可以基於是否希望局部或全身治療並基於待治療的區域來選擇投與方式。可以選擇投與途徑和投與部位以增強靶向。
該等方法和用途包括向哺乳動物（例如人）投與包含靶向哺乳動物細胞中的SCAP基因的RNAi構建體（例如，siRNA）的組成物，並且維持該哺乳動物足夠時間以獲得該SCAP基因的mRNA轉錄物的降解，從而抑制該SCAP基因在該哺乳動物中的表現。可以藉由本領域已知或本文所述之任何方法在獲自投與了RNAi構建體的受試者的樣本中評估基因表現和/或蛋白質表現的降低。在一個實施方式中，組織樣本充當用於監測SCAP基因和/或蛋白表現降低的組織材料。在另一個實施方式中，血液樣本充當用於監測SCAP基因和/或蛋白表現降低的組織材料。
在一些實施方式中，可以藉由執行5'-RACE或本領域中已知方案的修改來評估在投與RNAi構建體後RISC介導的靶mRNA（例如，SCAP mRNA）體內切割的驗證（Lasham A等人, (2010) Nucleic Acid Res.[核酸研究], 38 (3) p-el9; 和Zimmermann等人 (2006) Nature[自然] 441: 111-4）。
應當理解，本文揭露的所有核糖核酸序列可以藉由用胸腺嘧啶鹼基取代序列中的尿嘧啶鹼基而轉化為去氧核糖核酸序列。同樣地，本文揭露的所有去氧核糖核酸序列可以藉由用尿嘧啶鹼基取代序列中的胸腺嘧啶鹼基而轉化為核糖核酸序列。本揭露涵蓋去氧核糖核酸序列、核糖核酸序列和含有本文揭露的所有序列的去氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的混合物的序列。
另外地，本文揭露的任何核酸序列可以用化學修飾的任何組合進行修飾。熟悉該項技術者將容易理解，在某些情況下，描述經修飾的多核苷酸的命名如「RNA」或「DNA」為任意的。例如，可以將包含在核糖上具有2’-OH取代基的核苷酸和胸腺嘧啶鹼基的多核苷酸描述為具有經修飾的糖的DNA分子（對於DNA的天然2’-H為2’-OH）或描述為具有經修飾的鹼基的RNA分子（對於RNA的天然尿嘧啶為胸腺嘧啶（甲基化尿嘧啶））。
因此，本文提供的核酸序列（包括但不限於序列表中闡述的那些）旨在涵蓋含有天然或經修飾的RNA和/或DNA的任何組合的核酸，包括但不限於具有經修飾核苷鹼基的這樣的核酸。作為另外的實例且為非限制性，具有序列「ATCGATCG」的多核苷酸涵蓋具有經修飾或未經修飾的這樣的序列的任何多核苷酸，包括但不限於包含RNA鹼基的這樣的化合物，如具有序列「AUCGAUCG」的那些化合物、和具有一些DNA鹼基和一些RNA鹼基的那些化合物（如「AUCGATCG」）、以及具有其他經修飾鹼基的多核苷酸（如「ATmeCGAUCG」），其中meC指示在5-位置處包含甲基的胞嘧啶鹼基。
以下實例（包括所進行的實驗和所實現的結果）僅出於說明目的而提供，並且不應解釋為限制所附申請專利範圍的範圍。 實例
本文描述的所有動物實驗均由美商安進公司（Amgen）的機構動物護理和使用委員會（Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC）批准，並根據實驗室動物護理與使用指南（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）第8版（美國國家研究委員會（National Research Council (U.S.)））進行護理。實驗室動物護理與使用指南更新委員會（Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）, 美國實驗室動物研究所（Institute for Laboratory Animal Research (U.S.)）, 和美國國家科學院出版社（National Academies Press (U.S.)） (2011) Guide for the care and use of laboratory animals[實驗室動物的護理與使用指南].第8版, 國家科學院出版社, 華盛頓特區。將小鼠有十二小時光照、十二小時黑暗週期（0600-1800小時）的22°C ± 2°C空調房內單獨收容。除非另有指明，否則動物可隨意獲得常規食物（Envigo公司，2920X；或如另外說明的食物）並經由自動澆水系統獲得水（經逆滲透純化）。在結束時，在深度麻醉下藉由心臟穿刺收集血液，且然後根據實驗室動物護理評估和認證協會（Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care，AAALAC）的指南，藉由二次物理方法實施安樂死。 實例 1 ：經修飾的 SCAP siRNA 分子的選擇、設計和合成
使用人SREBP切割活化蛋白（SCAP）轉錄物的生物資訊學分析鑒定靶向SCAP基因的治療性siRNA分子的最佳序列的鑒定和選擇。將siRNA觸發物製備為經化學修飾的siRNA雙股體，該雙股體由有義（隨從）股和反義（指導）股組成。兩條股的長度均為18-23個核苷酸，具有兩個鹼基對的3’突出端。對siRNA進行修飾，使得每個核苷酸的核糖中的天然2’-OH被2’-OMe或2’-F基團取代，並且兩條股每一端處的兩個磷酸二酯酶核苷酸間鍵被硫代磷酸酯替代，以減少由外切核酸酶進行的降解。產生的未經修飾和經修飾的反義和有義siRNA序列顯示在表1中。
表1和本申請其他部分中的核苷酸序列根據以下符號列出：A、U、G、和C = 對應的核糖核苷酸；dT = 去氧胸苷；dA = 去氧腺苷；dC = 去氧胞苷；dG = 去氧鳥苷；invAb = 反向無鹼基；invDT = 反向的去氧胸苷；invDA = 反向的去氧腺苷；invDC = 反向的去氧胞苷；invDG = 反向的去氧鳥苷；a、u、g、和c = 對應的2’-O-甲基核糖核苷酸；Af、Uf、Gf、和Cf = 對應的2’-去氧-2’-氟（「2’-氟」）核糖核苷酸；Ab = 無鹼基；MeO-I = 2’甲氧基肌苷；GNA = 二醇核酸；sGNA = 具有3’硫代磷酸酯的二醇核酸；LNA = 鎖核酸。在序列中「s」的插入指示兩個相鄰的核苷酸藉由硫代磷酸二酯基團（例如硫代磷酸酯核苷酸間鍵）連接。除非另有指明，否則所有其他核苷酸藉由3’-5’磷酸二酯基團連接。 [表1].針對SCAP的未經修飾和經修飾的siRNA序列
雙股體編號 有義（ 5’-3’ ） 經修飾的 SEQ ID NO （有義 - 經修飾的） 有義（ 5’-3’ ）未經修飾的 SEQ ID NO （有義 - 未經修飾的） 反義（ 5’-3’ ） 經修飾的 SEQ ID NO （反義 - 經修飾的） 反義（ 5’-3’ ）未經修飾的 SEQ ID NO （反義 - 未經修飾的）
1 ggaccuGfuGfGfAfAfuucacscs[invAb] 1 ggaccuguggaauucacc 295 usGfsgugaAfuuccAfcAfgguccsusu 148 uggugaauuccacagguccuu 442
2 ggaccuGfuGfGfAfAfuucacscs[invAb] 2 ggaccuguggaauucacc 296 usGfsgUfgAfAfuuccAfcAfgguccsusu 149 uggugaauuccacagguccuu 443
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6 ggaccuGfuGfGfAfAfuucaccs[invAb] 6 ggaccuguggaauucacc 300 usGfsgugaAfuuccAfcAfgguscsc 153 uggugaauuccacaggucc 447
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21 cuguccAfuUfGfAfCfauucgccgs[invAb] 21 cuguccauugacauucgccg 315 asCfsggcgAfaugucaAfuGfgacagsusu 168 acggcgaaugucaauggacaguu 462
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23 cuguccAfuUfgAfcauucgccgs[invAb] 23 cuguccauugacauucgccg 317 asCfsggcgaauguCfaAfuGfgacagsusu 170 acggcgaaugucaauggacaguu 464
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25 ggaaagAfgCfCfGfAfguaucsus[invAb] 25 ggaaagagccgaguaucu 319 asAfsgauaCfucggCfuCfuuuccsusu 172 aagauacucggcucuuuccuu 466
26 ggaaagAfgCfCfGfAfguaucsus[invAb] 26 ggaaagagccgaguaucu 320 asAfsgAfuAfCfucggCfuCfuuuccsusu 173 aagauacucggcucuuuccuu 467
27 ggaaAfgAfgCfcgaguaucus[invAb] 27 ggaaagagccgaguaucu 321 asAfsgauacucggCfuCfuUfuccsusu 174 aagauacucggcucuuuccuu 468
28 ggaaagAfgCfCfGfAfguaucuuus[invAb] 28 ggaaagagccgaguaucuuu 322 asAfsgauaCfucggCfuCfuuuccsusu 175 aagauacucggcucuuuccuu 469
29 ggaaagAfgCfCfGfAfguaucus[invAb] 29 ggaaagagccgaguaucu 323 asAfsgauaCfucggCfuCfuuuscsc 176 aagauacucggcucuuucc 470
30 ggaaAfgAfGfCfCfgaguaucus[invAb] 30 ggaaagagccgaguaucu 324 asAfsgauaCfucggcuCfuUfuccsusu 177 aagauacucggcucuuuccuu 471
31 aaagagCfcGfAfGfUfaucuuscs[invAb] 31 aaagagccgaguaucuuc 325 asGfsaagaUfacucGfgCfucuuususu 178 agaagauacucggcucuuuuu 472
32 ggaaagagCfcGfAfGfUfaucuucs[invAb] 32 ggaaagagccgaguaucuuc 326 asGfsaagaUfacucGfgCfucuuuccsusu 179 agaagauacucggcucuuuccuu 473
33 ggaaagAfgCfCfGfAfguaucuucs[invAb] 33 ggaaagagccgaguaucuuc 327 asGfsaagaUfacucggCfuCfuuuccsusu 180 agaagauacucggcucuuuccuu 474
34 ggaaagagCfcGfAfGfUfaucuucs[invAb] 34 ggaaagagccgaguaucuuc 328 asGfsaagaUfacucGfgCfucuuuscsc 181 agaagauacucggcucuuucc 475
35 ggaaagAfgCfcGfaguaucuucs[invAb] 35 ggaaagagccgaguaucuuc 329 asGfsaagauacucGfgCfuCfuuuccsusu 182 agaagauacucggcucuuuccuu 476
36 aaagagCfcGfAfGfUfaucuucuus[invAb] 36 aaagagccgaguaucuucuu 330 asGfsaagaUfacucGfgCfucuuuscsc 183 agaagauacucggcucuuucc 477
37 gcggcgAfgAfUfUfUfuccccsus[invAb] 37 gcggcgagauuuuccccu 331 usAfsggggAfaaauCfuCfgccgcsusu 184 uaggggaaaaucucgccgcuu 478
38 ggcgagAfuUfUfUfCfcccuascs[invAb] 38 ggcgagauuuuccccuac 332 asGfsuaggGfgaaaAfuCfucgccsusu 185 aguaggggaaaaucucgccuu 479
39 aagauaUfcUfCfGfGfgccuuscs[invAb] 39 aagauaucucgggccuuc 333 asGfsaaggCfccgaGfaUfaucuususu 186 agaaggcccgagauaucuuuu 480
40 cgggccUfuCfUfAfCfaaccasus[invAb] 40 cgggccuucuacaaccau 334 asAfsugguUfguagAfaGfgcccgsusu 187 aaugguuguagaaggcccguu 481
41 cugcagUfuUfAfGfAfgggacscs[invAb] 41 cugcaguuuagagggacc 335 asGfsguccCfucuaAfaCfugcagsusu 188 aggucccucuaaacugcaguu 482
42 acggggAfcCfUfGfUfuacagsas[invAb] 42 acggggaccuguuacaga 336 asUfscuguAfacagGfuCfcccgususu 189 aucuguaacagguccccguuu 483
43 cggcucAfaCfGfGfUfucccusus[invAb] 43 cggcucaacgguucccuu 337 asAfsagggAfaccgUfuGfagccgsusu 190 aaagggaaccguugagccguu 484
44 uguacuGfaCfUfGfGfcagccsgs[invAb] 44 uguacugacuggcagccg 338 asCfsggcuGfccagUfcAfguacasusu 191 acggcugccagucaguacauu 485
45 ccccugCfaGfUfUfUfagaggsgs[invAb] 45 ccccugcaguuuagaggg 339 usCfsccucUfaaacUfgCfaggggsusu 192 ucccucuaaacugcagggguu 486
46 uguccaUfuGfAfCfAfuucgcscs[invAb] 46 uguccauugacauucgcc 340 asGfsgcgaAfugucAfaUfggacasusu 193 aggcgaaugucaauggacauu 487
47 ggcuggCfaCfCfGfUfugucusgs[invAb] 47 ggcuggcaccguugucug 341 asCfsagacAfacggUfgCfcagccsusu 194 acagacaacggugccagccuu 488
48 ggcucaAfcGfGfUfUfcccuusgs[invAb] 48 ggcucaacgguucccuug 342 usCfsaaggGfaaccGfuUfgagccsusu 195 ucaagggaaccguugagccuu 489
49 gcucaaCfgGfUfUfCfccuugsas[invAb] 49 gcucaacgguucccuuga 343 asUfscaagGfgaacCfgUfugagcsusu 196 aucaagggaaccguugagcuu 490
50 caacggUfuCfCfCfUfugauusus[invAb] 50 caacgguucccuugauuu 344 asAfsaaucAfagggAfaCfcguugsusu 197 aaaaucaagggaaccguuguu 491
51 acgguuCfcCfUfUfGfauuucsus[invAb] 51 acgguucccuugauuucu 345 asAfsgaaaUfcaagGfgAfaccgususu 198 aagaaaucaagggaaccguuu 492
52 gugggaUfgUfAfCfUfgacugsgs[invAb] 52 gugggauguacugacugg 346 asCfscaguCfaguaCfaUfcccacsusu 199 accagucaguacaucccacuu 493
53 cugaaaCfuCfCfCfCfuugccsas[invAb] 53 cugaaacuccccuugcca 347 asUfsggcaAfggggAfgUfuucagsusu 200 auggcaaggggaguuucaguu 494
54 gauccuGfaCfAfUfCfauuggsgs[invAb] 54 gauccugacaucauuggg 348 usCfsccaaUfgaugUfcAfggaucsusu 201 ucccaaugaugucaggaucuu 495
55 ugguccAfcGfUfGfCfacuucsas[invAb] 55 ugguccacgugcacuuca 349 usUfsgaagUfgcacGfuGfgaccasusu 202 uugaagugcacguggaccauu 496
56 guggacUfcUfGfAfCfcgcaasas[invAb] 56 guggacucugaccgcaaa 350 asUfsuugcGfgucaGfaGfuccacsusu 203 auuugcggucagaguccacuu 497
57 ggaggaGfaUfUfGfGfugucgscs[invAb] 57 ggaggagauuggugucgc 351 asGfscgacAfccaaUfcUfccuccsusu 204 agcgacaccaaucuccuccuu 498
58 aguguuUfcCfCfUfGfgcacasas[invAb] 58 aguguuucccuggcacaa 352 asUfsugugCfcaggGfaAfacacususu 205 auugugccagggaaacacuuu 499
59 ggagauUfgGfUfGfUfcgcugsas[invAb] 59 ggagauuggugucgcuga 353 asUfscagcGfacacCfaAfucuccsusu 206 aucagcgacaccaaucuccuu 500
60 ucgcugAfgCfUfCfAfuccccscs[invAb] 60 ucgcugagcucauccccc 354 asGfsggggAfugagCfuCfagcgasusu 207 agggggaugagcucagcgauu 501
61 ugucccGfgGfCfAfUfuccaascs[invAb] 61 ugucccgggcauuccaac 355 asGfsuuggAfaugcCfcGfggacasusu 208 aguuggaaugcccgggacauu 502
62 ggaguuCfuGfUfCfUfcuuugscs[invAb] 62 ggaguucugucucuuugc 356 asGfscaaaGfagacAfgAfacuccsusu 209 agcaaagagacagaacuccuu 503
63 gagguaAfcCfUfGfGfgggccsus[invAb] 63 gagguaaccugggggccu 357 asAfsggccCfccagGfuUfaccucsusu 210 aaggcccccagguuaccucuu 504
64 acaccaUfcAfCfGfUfugcagscs[invAb] 64 acaccaucacguugcagc 358 asGfscugcAfacguGfaUfggugususu 211 agcugcaacgugaugguguuu 505
65 cggcuaCfuUfCfAfCfccuagsus[invAb] 65 cggcuacuucacccuagu 359 asAfscuagGfgugaAfgUfagccgsusu 212 aacuagggugaaguagccguu 506
66 cauugaCfcAfGfAfCfcauggsus[invAb] 66 cauugaccagaccauggu 360 asAfsccauGfgucuGfgUfcaaugsusu 213 aaccauggucuggucaauguu 507
67 aggagaUfuGfGfUfGfucgcusgs[invAb] 67 aggagauuggugucgcug 361 usCfsagcgAfcaccAfaUfcuccususu 214 ucagcgacaccaaucuccuuu 508
68 ccgccuUfcCfCfUfCfuucggsgs[invAb] 68 ccgccuucccucuucggg 362 asCfsccgaAfgaggGfaAfggcggsusu 215 acccgaagagggaaggcgguu 509
69 auugaaGfgGfGfUfGfcugugscs[invAb] 69 auugaaggggugcugugc 363 asGfscacaGfcaccCfcUfucaaususu 216 agcacagcaccccuucaauuu 510
70 ccugguccAfcGfUfGfCfacuucas[invAb] 70 ccugguccacgugcacuuca 364 usUfsgaagUfgcacGfuGfgaccaggsusu 217 uugaagugcacguggaccagguu 511
71 ccugguCfcAfCfGfUfgcacuucas[invAb] 71 ccugguccacgugcacuuca 365 usUfsgaagUfgcacguGfgAfccaggsusu 218 uugaagugcacguggaccagguu 512
72 ugguccAfcGfUfGfCfacuucaaus[invAb] 72 ugguccacgugcacuucaau 366 usUfsgaagUfgcacGfuGfgaccasgsg 219 uugaagugcacguggaccagg 513
73 ccugguccAfcGfUfGfCfacuucas[invAb] 73 ccugguccacgugcacuuca 367 usUfsgaagUfgcacGfuGfgaccasgsg 220 uugaagugcacguggaccagg 514
74 ccugguCfcAfcGfugcacuucas[invAb] 74 ccugguccacgugcacuuca 368 usUfsgaagugcacGfuGfgAfccaggsusu 221 uugaagugcacguggaccagguu 515
75 ggagauUfgGfUfGfUfcgcugsas[invAb] 75 ggagauuggugucgcuga 369 asUfscAfgCfGfacacCfaAfucuccsusu 222 aucagcgacaccaaucuccuu 516
76 acaccaUfcAfCfGfUfugcagscs[invAb] 76 acaccaucacguugcagc 370 asGfscUfgCfAfacguGfaUfggugususu 223 agcugcaacgugaugguguuu 517
77 ggagAfuUfGfGfUfgucgcugas[invAb] 77 ggagauuggugucgcuga 371 asUfscagcGfacaccaAfuCfuccsusu 224 aucagcgacaccaaucuccuu 518
78 acacCfaUfCfAfCfguugcagcs[invAb] 78 acaccaucacguugcagc 372 asGfscugcAfacgugaUfgGfugususu 225 agcugcaacgugaugguguuu 519
79 ggagAfuUfgGfugucgcugas[invAb] 79 ggagauuggugucgcuga 373 asUfscagcgacacCfaAfuCfuccsusu 226 aucagcgacaccaaucuccuu 520
80 acacCfaUfcAfcguugcagcs[invAb] 80 acaccaucacguugcagc 374 asGfscugcaacguGfaUfgGfugususu 227 agcugcaacgugaugguguuu 521
81 ggagauUfgGfUfGfUfcgcugas[invAb] 81 ggagauuggugucgcuga 375 asUfscagcGfacacCfaAfucuscsc 228 aucagcgacaccaaucucc 522
82 acaccaUfcAfCfGfUfugcagcs[invAb] 82 acaccaucacguugcagc 376 asGfscugcAfacguGfaUfggusgsu 229 agcugcaacgugauggugu 523
83 ggagauUfgGfUfGfUfcgcugauus[invAb] 83 ggagauuggugucgcugauu 377 asUfscagcGfacacCfaAfucuccsusu 230 aucagcgacaccaaucuccuu 524
84 acaccaUfcAfCfGfUfugcagcuus[invAb] 84 acaccaucacguugcagcuu 378 asGfscugcAfacguGfaUfggugususu 231 agcugcaacgugaugguguuu 525
85 ucgcugAfgCfUfCfAfuccccscs[invAb] 85 ucgcugagcucauccccc 379 asGfsgGfgGfAfugagCfuCfagcgasusu 232 agggggaugagcucagcgauu 526
86 ucgcUfgAfGfCfUfcaucccccs[invAb] 86 ucgcugagcucauccccc 380 asGfsggggAfugagcuCfaGfcgasusu 233 agggggaugagcucagcgauu 527
87 ucgcUfgAfgCfucaucccccs[invAb] 87 ucgcugagcucauccccc 381 asGfsggggaugagCfuCfaGfcgasusu 234 agggggaugagcucagcgauu 528
88 ucgcugAfgCfUfCfAfucccccuus[invAb] 88 ucgcugagcucaucccccuu 382 asGfsggggAfugagCfuCfagcgasusu 235 agggggaugagcucagcgauu 529
89 ucgcugAfgCfUfCfAfucccccs[invAb] 89 ucgcugagcucauccccc 383 asGfsggggAfugagCfuCfagcsgsa 236 agggggaugagcucagcga 530
90 ggcucaAfcGfGfUfUfcccuusgs[invAb] 90 ggcucaacgguucccuug 384 usCfsaAfgGfGfaaccGfuUfgagccsusu 237 ucaagggaaccguugagccuu 531
91 ggcuCfaAfCfGfGfuucccuugs[invAb] 91 ggcucaacgguucccuug 385 usCfsaaggGfaaccguUfgAfgccsusu 238 ucaagggaaccguugagccuu 532
92 ggcuCfaAfcGfguucccuugs[invAb] 92 ggcucaacgguucccuug 386 usCfsaagggaaccGfuUfgAfgccsusu 239 ucaagggaaccguugagccuu 533
93 ggcucaAfcGfGfUfUfcccuugaus[invAb] 93 ggcucaacgguucccuugau 387 usCfsaaggGfaaccGfuUfgagccsusu 240 ucaagggaaccguugagccuu 534
94 ggcucaAfcGfGfUfUfcccuugs[invAb] 94 ggcucaacgguucccuug 388 usCfsaaggGfaaccGfuUfgagscsc 241 ucaagggaaccguugagcc 535
95 gcggcgagAfuUfUfUfCfcccuacs[invAb] 95 gcggcgagauuuuccccuac 389 asGfsuaggGfgaaaAfuCfucgccgcsusu 242 aguaggggaaaaucucgccgcuu 536
96 cggcucaaCfgGfUfUfCfccuugas[invAb] 96 cggcucaacgguucccuuga 390 asUfscaagGfgaacCfgUfugagccgsusu 243 aucaagggaaccguugagccguu 537
97 gcggcgAfgAfUfUfUfuccccuacs[invAb] 97 gcggcgagauuuuccccuac 391 asGfsuaggGfgaaaauCfuCfgccgcsusu 244 aguaggggaaaaucucgccgcuu 538
98 cggcucAfaCfGfGfUfucccuugas[invAb] 98 cggcucaacgguucccuuga 392 asUfscaagGfgaaccgUfuGfagccgsusu 245 aucaagggaaccguugagccguu 539
99 gcggcgAfgAfuUfuuccccuacs[invAb] 99 gcggcgagauuuuccccuac 393 asGfsuaggggaaaAfuCfuCfgccgcsusu 246 aguaggggaaaaucucgccgcuu 540
100 cggcucAfaCfgGfuucccuugas[invAb] 100 cggcucaacgguucccuuga 394 asUfscaagggaacCfgUfuGfagccgsusu 247 aucaagggaaccguugagccguu 541
101 ggcgagAfuUfUfUfCfcccuacuus[invAb] 101 ggcgagauuuuccccuacuu 395 asGfsuaggGfgaaaAfuCfucgccsgsc 248 aguaggggaaaaucucgccgc 542
102 gcucaaCfgGfUfUfCfccuugauus[invAb] 102 gcucaacgguucccuugauu 396 asUfscaagGfgaacCfgUfugagcscsg 249 aucaagggaaccguugagccg 543
103 gcggcgagAfuUfUfUfCfcccuacs[invAb] 103 gcggcgagauuuuccccuac 397 asGfsuaggGfgaaaAfuCfucgccsgsc 250 aguaggggaaaaucucgccgc 544
104 cggcucaaCfgGfUfUfCfccuugas[invAb] 104 cggcucaacgguucccuuga 398 asUfscaagGfgaacCfgUfugagcscsg 251 aucaagggaaccguugagccg 545
105 agaagauaUfcUfCfGfGfgccuucs[invAb] 105 agaagauaucucgggccuuc 399 asGfsaaggCfccgaGfaUfaucuuscsu 252 agaaggcccgagauaucuucu 546
106 agaagauaUfcUfCfGfGfgccuucs[invAb] 106 agaagauaucucgggccuuc 400 asGfsaaggCfccgaGfaUfaucuucususu 253 agaaggcccgagauaucuucuuu 547
107 agaagaUfaUfCfUfCfgggccuucs[invAb] 107 agaagauaucucgggccuuc 401 asGfsaaggCfccgagaUfaUfcuucususu 254 agaaggcccgagauaucuucuuu 548
108 agaagaUfaUfcUfcgggccuucs[invAb] 108 agaagauaucucgggccuuc 402 asGfsaaggcccgaGfaUfaUfcuucususu 255 agaaggcccgagauaucuucuuu 549
109 aagauaUfcUfCfGfGfgccuucuus[invAb] 109 aagauaucucgggccuucuu 403 asGfsaaggCfccgaGfaUfaucuuscsu 256 agaaggcccgagauaucuucu 550
110 ccugguccAfcGfUfGfCfacuucas[invAb] 110 ccugguccacgugcacuuca 404 usUfsgaagUfgcacguGfgAfccaggsusu 257 uugaagugcacguggaccagguu 551
111 gcggcgagAfuUfUfUfCfcccuacs[invAb] 111 gcggcgagauuuuccccuac 405 asGfsuaggGfgaaaauCfuCfgccgcsusu 258 aguaggggaaaaucucgccgcuu 552
112 cggcucaaCfgGfUfUfCfccuugas[invAb] 112 cggcucaacgguucccuuga 406 asUfscaagGfgaaccgUfuGfagccgsusu 259 aucaagggaaccguugagccguu 553
113 agaagauaUfcUfCfGfGfgccuucs[invAb] 113 agaagauaucucgggccuuc 407 asGfsaaggCfccgagaUfaUfcuucususu 260 agaaggcccgagauaucuucuuu 554
114 ccugguccAfcGfUfGfCfacuucas[invAb] 114 ccugguccacgugcacuuca 408 usUfsgaagUfgcacGfuGfgAfccaggsusu 261 uugaagugcacguggaccagguu 555
115 gcggcgagAfuUfUfUfCfcccuacs[invAb] 115 gcggcgagauuuuccccuac 409 asGfsuaggGfgaaaAfuCfuCfgccgcsusu 262 aguaggggaaaaucucgccgcuu 556
116 cggcucaaCfgGfUfUfCfccuugas[invAb] 116 cggcucaacgguucccuuga 410 asUfscaagGfgaacCfgUfuGfagccgsusu 263 aucaagggaaccguugagccguu 557
117 agaagauaUfcUfCfGfGfgccuucs[invAb] 117 agaagauaucucgggccuuc 411 asGfsaaggCfccgaGfaUfaUfcuucususu 264 agaaggcccgagauaucuucuuu 558
118 ccugguCfcAfcGfugcacuucas[invAb] 118 ccugguccacgugcacuuca 412 usUfsgaaGfUfgcacguGfgAfccaggsusu 265 uugaagugcacguggaccagguu 559
119 gcggcgAfgAfuUfuuccccuacs[invAb] 119 gcggcgagauuuuccccuac 413 asGfsuagGfGfgaaaauCfuCfgccgcsusu 266 aguaggggaaaaucucgccgcuu 560
120 cggcucAfaCfgGfuucccuugas[invAb] 120 cggcucaacgguucccuuga 414 asUfscaaGfGfgaaccgUfuGfagccgsusu 267 aucaagggaaccguugagccguu 561
121 agaagaUfaUfcUfcgggccuucs[invAb] 121 agaagauaucucgggccuuc 415 asGfsaagGfCfccgagaUfaUfcuucususu 268 agaaggcccgagauaucuucuuu 562
122 ggagauUfgGfUfGfUfcgcugas[invAb] 122 ggagauuggugucgcuga 416 asUfscagcGfacaccaAfuCfuccsusu 269 aucagcgacaccaaucuccuu 563
123 ucgcugAfgCfUfCfAfucccccs[invAb] 123 ucgcugagcucauccccc 417 asGfsggggAfugagcuCfaGfcgasusu 270 agggggaugagcucagcgauu 564
124 acaccaUfcAfCfGfUfugcagcs[invAb] 124 acaccaucacguugcagc 418 asGfscugcAfacgugaUfgGfugususu 271 agcugcaacgugaugguguuu 565
125 ggcucaAfcGfGfUfUfcccuugs[invAb] 125 ggcucaacgguucccuug 419 usCfsaaggGfaaccguUfgAfgccsusu 272 ucaagggaaccguugagccuu 566
126 ggagauUfgGfUfGfUfcgcugas[invAb] 126 ggagauuggugucgcuga 420 asUfscagcGfacacCfaAfuCfuccsusu 273 aucagcgacaccaaucuccuu 567
127 ggagAfuUfgGfugucgcugas[invAb] 127 ggagauuggugucgcuga 421 asUfscagCfGfacaccaAfuCfuccsusu 274 aucagcgacaccaaucuccuu 568
128 ucgcugAfgCfUfCfAfucccccs[invAb] 128 ucgcugagcucauccccc 422 asGfsggggAfugagCfuCfaGfcgasusu 275 agggggaugagcucagcgauu 569
129 ucgcUfgAfgCfucaucccccs[invAb] 129 ucgcugagcucauccccc 423 asGfsgggGfAfugagcuCfaGfcgasusu 276 agggggaugagcucagcgauu 570
130 acaccaUfcAfCfGfUfugcagcs[invAb] 130 acaccaucacguugcagc 424 asGfscugcAfacguGfaUfgGfugususu 277 agcugcaacgugaugguguuu 571
131 acacCfaUfcAfcguugcagcs[invAb] 131 acaccaucacguugcagc 425 asGfscugCfAfacgugaUfgGfugususu 278 agcugcaacgugaugguguuu 572
132 ggcucaAfcGfGfUfUfcccuugs[invAb] 132 ggcucaacgguucccuug 426 usCfsaaggGfaaccGfuUfgAfgccsusu 279 ucaagggaaccguugagccuu 573
133 ggcuCfaAfcGfguucccuugs[invAb] 133 ggcucaacgguucccuug 427 usCfsaagGfGfaaccguUfgAfgccsusu 280 ucaagggaaccguugagccuu 574
134 ucgcugAfgCfUfCfAfucccccs[invAb] 134 ucgcugagcucauccccc 428 asGfsgGfgGfAfugagCfuCfagcsgsa 281 agggggaugagcucagcga 575
135 ucgcugAfgCfUfCfAfuccccscs[invAb] 135 ucgcugagcucauccccc 429 asGfsgGfgGfAfugagcuCfaGfcgasusu 282 agggggaugagcucagcgauu 576
136 ugguCfcAfCfGfUfgcacuucaaus[invAb] 136 ugguccacgugcacuucaau 430 usUfsgaagUfgcacguGfgAfccasgsg 283 uugaagugcacguggaccagg 577
137 ugguccAfcGfUfGfCfacuucaaus[invAb] 137 ugguccacgugcacuucaau 431 usUfsgaagUfgcacguGfgAfccasgsg 284 uugaagugcacguggaccagg 578
138 ugguccAfcGfUfGfCfacuucaaus[invAb] 138 ugguccacgugcacuucaau 432 usUfsgaagUfgcacGfuGfgAfccasgsg 285 uugaagugcacguggaccagg 579
139 ggagauUfgGfUfGfUfcgcugauus[invAb] 139 ggagauuggugucgcugauu 433 asUfscagcGfacaccaAfuCfuccsusu 286 aucagcgacaccaaucuccuu 580
140 ggagauUfgGfUfGfUfcgcugauus[invAb] 140 ggagauuggugucgcugauu 434 asUfscagcGfacacCfaAfuCfuccsusu 287 aucagcgacaccaaucuccuu 581
141 ggagAfuUfGfGfUfgucgcugauus[invAb] 141 ggagauuggugucgcugauu 435 asUfscagcGfacaccaAfuCfuccsusu 288 aucagcgacaccaaucuccuu 582
142 acaccaUfcAfCfGfUfugcagcuus[invAb] 142 acaccaucacguugcagcuu 436 asGfscugcAfacguGfaUfgGfugususu 289 agcugcaacgugaugguguuu 583
143 acaccaUfcAfCfGfUfugcagcuus[invAb] 143 acaccaucacguugcagcuu 437 asGfscugcAfacgugaUfgGfugususu 290 agcugcaacgugaugguguuu 584
144 ggcuCfaAfCfGfGfuucccuugaus[invAb] 144 ggcucaacgguucccuugau 438 usCfsaaggGfaaccguUfgAfgccsusu 291 ucaagggaaccguugagccuu 585
145 ggcuCfaAfCfGfGfuucccuugs[invAb] 145 ggcucaacgguucccuug 439 usCfsaaggGfaaccguUfgAfgscsc 292 ucaagggaaccguugagcc 586
146 cggcucAfaCfGfGfUfucccuugas[invAb] 146 cggcucaacgguucccuuga 440 asUfscaagGfgaaccgUfuGfagcscsg 293 aucaagggaaccguugagccg 587
147 cggcucAfaCfGfGfUfucccuugas[invAb] 147 cggcucaacgguucccuuga 441 asUfscaagGfgaacCfgUfuGfagcscsg 294 aucaagggaaccguugagccg 588
實例 2 ：在 RNA FISH 測定中所選擇 SCAP siRNA 分子的功效
在靶向核糖核酸分子的螢光原位雜交測定（RNA FISH）中篩選實例1中合成的siRNA分子以確定IC 50和最大活性值。
進行了RNA FISH測定以藉由測試siRNA來測量SCAP mRNA敲低。將Hep3B細胞（購自ATCC）在補充有10%胎牛血清（FBS，西格瑪公司（Sigma））和1%青黴素-鏈黴素（P-S，康寧公司（Corning））的最低必需培養基（MEM，康寧公司）中進行培養。siRNA轉染如下進行：藉由BioMek FX（貝克曼庫爾特公司（Beckman Coulter））將1 μL的測試siRNA和4 μL的普通MEM添加至PDL包被的CellCarrier-384 Ultra測定板（珀金埃爾默公司（PerkinElmer））中。然後，藉由Multidrop Combi試劑分配器（賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）），將在普通MEM中預稀釋的5 μL的Lipofectamine RNAiMAX（賽默飛世爾科技公司）（在5 μL MEM中0.035 μL的RNAiMAX）分配入測定板中。在將siRNA/RNAiMAX混合物於室溫（RT）下培養20分鐘後，用Multidrop Combi試劑分配器將30 μL補充有10% FBS和1% P-S的MEM中的Hep3B細胞（2000個細胞/孔）添加至轉染複合物中並將該等測定板於RT下保持20分鐘，之後將它們移至培養箱中。將細胞在37°C和5% CO 2下培養72小時。
按照製造商的方案，使用Affymetrix QuantiGene® View RNA HC篩選測定套組（QVP0011）、Affymetrix View HC訊息擴增套組3-plex（QVP0213）和Affymetrix基因特異性探針（SCAP人0.33 mL View RNA 6型（650標記）VA6-20279-01和PPIB人0.44 mL View RNA 1型（488標記）VA1-10148-01）進行RNA FISH測定。
首先將板用連續100%、70%和50%乙醇洗滌再水化。然後將細胞用PBS洗滌，且隨後根據套組說明書進行透化和蛋白酶消化。根據製造商的方案製備靶工作探針組，將其添加到孔中，並在40°C下培養3小時。按照製造商的方案進行使用工作探針組、工作前置放大器、工作放大器和工作LP的連續雜交。最後，應用細胞核複染色（Hoechst 33342和Cell Mask Blue；分子探針公司（Molecular Probes））。將板在室溫下培養30分鐘，用PBS洗滌，用80 μl的PBS覆蓋，且然後將板密封用於成像。
在Opera Phenix高含量篩選系統（珀金埃爾默公司）上，使用針對Hoechst 33342和Cell Mask Blue的UV通道、針對1型探針的488通道、和針對6型探針的647通道對所有板成像。
使用Columbus軟體分析RNA FISH數據，且使用Genedata Screener生成圖像。對圖像進行分析以獲得每個細胞的平均斑點計數。使用高（含有磷酸鹽緩衝液，康寧公司）和低（無靶探針對）對照孔對斑點計數進行歸一化。繪製相對於總siRNA濃度的歸一化值，且將數據擬合到Genedata Screener（基因數據公司（Genedata））中的四參數S形模型以獲得IC 50和最大活性。
將測定的結果顯示在表2中。將SCAP活性表示為與對照相比敲低的百分比。負值指示SCAP水平降低。對幾種siRNA觸發物進行了另外的測試，其結果顯示在表2的最後一列中。 [表2].使用經修飾的SCAP siRNA的RNA FISH測定
雙股體編號 有義（ 5’-3’ ） SEQ ID NO: （有義） 反義（ 5’-3’ ） SEQ ID NO: （反義） RNA FISH IC50 IP [nM] RNA FISH 最大 活性（ % ） RNA FISH 另外的測試平均活性（ % ）
1 ggaccuGfuGfGfAfAfuucacscs[invAb] 1 usGfsgugaAfuuccAfcAfgguccsusu 148 3.24 -73.7   
2 ggaccuGfuGfGfAfAfuucacscs[invAb] 2 usGfsgUfgAfAfuuccAfcAfgguccsusu 149 1.04 -82.7   
3 ggacCfuGfUfGfGfaauucaccs[invAb] 3 usGfsgugaAfuuccacAfgGfuccsusu 150 1.23 -80.6   
4 ggacCfuGfuGfgaauucaccs[invAb] 4 usGfsgugaauuccAfcAfgGfuccsusu 151 1.18 -78.5   
5 ggaccuGfuGfGfAfAfuucaccaus[invAb] 5 usGfsgugaAfuuccAfcAfgguccsusu 152 -- -34.6 -64.0
6 ggaccuGfuGfGfAfAfuucaccs[invAb] 6 usGfsgugaAfuuccAfcAfgguscsc 153 6.63 -65.7 -54.9
7 gcgagaUfuUfUfCfCfccuacscs[invAb] 7 asGfsguagGfggaaAfaUfcucgcsusu 154 0.916 -68.8 -70.9
8 gcgagaUfuUfUfCfCfccuacscs[invAb] 8 asGfsgUfaGfGfggaaAfaUfcucgcsusu 155 1.13 -81.7   
9 gcgaGfaUfUfUfUfccccuaccs[invAb] 9 asGfsguagGfggaaaaUfcUfcgcsusu 156 1.82 -85.0   
10 gcgaGfaUfuUfuccccuaccs[invAb] 10 asGfsguaggggaaAfaUfcUfcgcsusu 157 1.89 -73.0   
11 gcgagaUfuUfUfCfCfccuaccs[invAb] 11 asGfsguagGfggaaAfaUfcucsgsc 158 3.52 -63.9 -57.6
12 gcgagaUfuUfUfCfCfccuaccuus[invAb] 12 asGfsguagGfggaaAfaUfcucgcsusu 159 7.67 -69.7 -64.8
13 ccugucCfaUfUfGfAfcauucsgs[invAb] 13 asCfsgaauGfucaaUfgGfacaggsusu 160 3.76 -69.2 -63.3
14 ccugucCfaUfUfGfAfcauucsgs[invAb] 14 asCfsgAfaUfGfucaaUfgGfacaggsusu 161 1.44 -82.4   
15 ccugUfcCfAfUfUfgacauucgs[invAb] 15 asCfsgaauGfucaaugGfaCfaggsusu 162 0.62 -88.5   
16 ccugUfcCfaUfugacauucgs[invAb] 16 asCfsgaaugucaaUfgGfaCfaggsusu 163 6.04 -55.4 -40.3
17 ccugucCfaUfUfGfAfcauucguus[invAb] 17 asCfsgaauGfucaaUfgGfacaggsusu 164 1.65 -77.8   
18 ccugucCfaUfUfGfAfcauucgs[invAb] 18 asCfsgaauGfucaaUfgGfacasgsg 165 16.10 -68.3 -61.0
19 guccauUfgAfCfAfUfucgccsgs[invAb] 19 asCfsggcgAfauguCfaAfuggacsusu 166 1.61 -78.5   
20 cuguccauUfgAfCfAfUfucgccgs[invAb] 20 asCfsggcgAfauguCfaAfuggacagsusu 167 1.17 -86.61   
21 cuguccAfuUfGfAfCfauucgccgs[invAb] 21 asCfsggcgAfaugucaAfuGfgacagsusu 168 1.83 -88.59   
22 cuguccauUfgAfCfAfUfucgccgs[invAb] 22 asCfsggcgAfauguCfaAfuggacsasg 169 1.67 -82.83   
23 cuguccAfuUfgAfcauucgccgs[invAb] 23 asCfsggcgaauguCfaAfuGfgacagsusu 170 3.35 -81.06   
24 guccauUfgAfCfAfUfucgccguus[invAb] 24 asCfsggcgAfauguCfaAfuggacsasg 171 2.75 -81.36   
25 ggaaagAfgCfCfGfAfguaucsus[invAb] 25 asAfsgauaCfucggCfuCfuuuccsusu 172 1.44 -84.3   
26 ggaaagAfgCfCfGfAfguaucsus[invAb] 26 asAfsgAfuAfCfucggCfuCfuuuccsusu 173 1.4 -73.61   
27 ggaaAfgAfgCfcgaguaucus[invAb] 27 asAfsgauacucggCfuCfuUfuccsusu 174 2.7 -83.17   
28 ggaaagAfgCfCfGfAfguaucuuus[invAb] 28 asAfsgauaCfucggCfuCfuuuccsusu 175 1.05 -76.92   
29 ggaaagAfgCfCfGfAfguaucus[invAb] 29 asAfsgauaCfucggCfuCfuuuscsc 176 3.02 -79.38   
30 ggaaAfgAfGfCfCfgaguaucus[invAb] 30 asAfsgauaCfucggcuCfuUfuccsusu 177 1.82 -88.68   
31 aaagagCfcGfAfGfUfaucuuscs[invAb] 31 asGfsaagaUfacucGfgCfucuuususu 178 1.37 -90   
32 ggaaagagCfcGfAfGfUfaucuucs[invAb] 32 asGfsaagaUfacucGfgCfucuuuccsusu 179 2.18 -79.50   
33 ggaaagAfgCfCfGfAfguaucuucs[invAb] 33 asGfsaagaUfacucggCfuCfuuuccsusu 180 0.486 -80.75   
34 ggaaagagCfcGfAfGfUfaucuucs[invAb] 34 asGfsaagaUfacucGfgCfucuuuscsc 181 3.03 -83.15   
35 ggaaagAfgCfcGfaguaucuucs[invAb] 35 asGfsaagauacucGfgCfuCfuuuccsusu 182 3.01 -91.24   
36 aaagagCfcGfAfGfUfaucuucuus[invAb] 36 asGfsaagaUfacucGfgCfucuuuscsc 183 2.91 -82.11   
37 gcggcgAfgAfUfUfUfuccccsus[invAb] 37 usAfsggggAfaaauCfuCfgccgcsusu 184 2.69 -61.2 -63.6
38 ggcgagAfuUfUfUfCfcccuascs[invAb] 38 asGfsuaggGfgaaaAfuCfucgccsusu 185 1.50 -79.1   
39 aagauaUfcUfCfGfGfgccuuscs[invAb] 39 asGfsaaggCfccgaGfaUfaucuususu 186 2.50 -73.0   
40 cgggccUfuCfUfAfCfaaccasus[invAb] 40 asAfsugguUfguagAfaGfgcccgsusu 187 3.28 -73.1   
41 cugcagUfuUfAfGfAfgggacscs[invAb] 41 asGfsguccCfucuaAfaCfugcagsusu 188 1.76 -78.3   
42 acggggAfcCfUfGfUfuacagsas[invAb] 42 asUfscuguAfacagGfuCfcccgususu 189 1.45 -84.3   
43 cggcucAfaCfGfGfUfucccusus[invAb] 43 asAfsagggAfaccgUfuGfagccgsusu 190 14.90 -63.7 -32.2
44 uguacuGfaCfUfGfGfcagccsgs[invAb] 44 asCfsggcuGfccagUfcAfguacasusu 191 3.59 -53.2 -41.7
45 ccccugCfaGfUfUfUfagaggsgs[invAb] 45 usCfsccucUfaaacUfgCfaggggsusu 192 12.20 -50.0 -49.1
46 uguccaUfuGfAfCfAfuucgcscs[invAb] 46 asGfsgcgaAfugucAfaUfggacasusu 193 0.55 -87.4   
47 ggcuggCfaCfCfGfUfugucusgs[invAb] 47 asCfsagacAfacggUfgCfcagccsusu 194 3.20 -48.1 -8.4
48 ggcucaAfcGfGfUfUfcccuusgs[invAb] 48 usCfsaaggGfaaccGfuUfgagccsusu 195 3.10 -79.8   
49 gcucaaCfgGfUfUfCfccuugsas[invAb] 49 asUfscaagGfgaacCfgUfugagcsusu 196 2.20 -92.1   
50 caacggUfuCfCfCfUfugauusus[invAb] 50 asAfsaaucAfagggAfaCfcguugsusu 197 0.97 -79.4   
51 acgguuCfcCfUfUfGfauuucsus[invAb] 51 asAfsgaaaUfcaagGfgAfaccgususu 198 0.67 -89.9   
52 gugggaUfgUfAfCfUfgacugsgs[invAb] 52 asCfscaguCfaguaCfaUfcccacsusu 199 5.38 -59.6 -39.1
53 cugaaaCfuCfCfCfCfuugccsas[invAb] 53 asUfsggcaAfggggAfgUfuucagsusu 200 -- -20.0 -7.6
54 gauccuGfaCfAfUfCfauuggsgs[invAb] 54 usCfsccaaUfgaugUfcAfggaucsusu 201 2.77 -66.2 -32.8
55 ugguccAfcGfUfGfCfacuucsas[invAb] 55 usUfsgaagUfgcacGfuGfgaccasusu 202 1.70 -78.7   
56 guggacUfcUfGfAfCfcgcaasas[invAb] 56 asUfsuugcGfgucaGfaGfuccacsusu 203 5.67 -47.1 -23.4
57 ggaggaGfaUfUfGfGfugucgscs[invAb] 57 asGfscgacAfccaaUfcUfccuccsusu 204 0.91 -80.6   
58 aguguuUfcCfCfUfGfgcacasas[invAb] 58 asUfsugugCfcaggGfaAfacacususu 205 2.22 -57.4 -45.6
59 ggagauUfgGfUfGfUfcgcugsas[invAb] 59 asUfscagcGfacacCfaAfucuccsusu 206 3.50 -84.1   
60 ucgcugAfgCfUfCfAfuccccscs[invAb] 60 asGfsggggAfugagCfuCfagcgasusu 207 3.30 -75.0   
61 ugucccGfgGfCfAfUfuccaascs[invAb] 61 asGfsuuggAfaugcCfcGfggacasusu 208 5.09 -51.0 -32.3
62 ggaguuCfuGfUfCfUfcuuugscs[invAb] 62 asGfscaaaGfagacAfgAfacuccsusu 209 0.31 -91.4   
63 gagguaAfcCfUfGfGfgggccsus[invAb] 63 asAfsggccCfccagGfuUfaccucsusu 210 2.24 -62.1 -48.2
64 acaccaUfcAfCfGfUfugcagscs[invAb] 64 asGfscugcAfacguGfaUfggugususu 211 3.50 -86.7   
65 cggcuaCfuUfCfAfCfccuagsus[invAb] 65 asAfscuagGfgugaAfgUfagccgsusu 212 17.80 -55.9 -37.4
66 cauugaCfcAfGfAfCfcauggsus[invAb] 66 asAfsccauGfgucuGfgUfcaaugsusu 213 3.28 -54.7 -42.2
67 aggagaUfuGfGfUfGfucgcusgs[invAb] 67 usCfsagcgAfcaccAfaUfcuccususu 214 0.79 -71.5   
68 ccgccuUfcCfCfUfCfuucggsgs[invAb] 68 asCfsccgaAfgaggGfaAfggcggsusu 215 -- -40.5 -31.4
69 auugaaGfgGfGfUfGfcugugscs[invAb] 69 asGfscacaGfcaccCfcUfucaaususu 216 2.73 -71.0   
70 ccugguccAfcGfUfGfCfacuucas[invAb] 70 usUfsgaagUfgcacGfuGfgaccaggsusu 217 3.51 -77.78   
71 ccugguCfcAfCfGfUfgcacuucas[invAb] 71 usUfsgaagUfgcacguGfgAfccaggsusu 218 1.83 -76.44   
72 ugguccAfcGfUfGfCfacuucaaus[invAb] 72 usUfsgaagUfgcacGfuGfgaccasgsg 219 7.48 -88.25   
73 ccugguccAfcGfUfGfCfacuucas[invAb] 73 usUfsgaagUfgcacGfuGfgaccasgsg 220 5.25 -80.05   
74 ccugguCfcAfcGfugcacuucas[invAb] 74 usUfsgaagugcacGfuGfgAfccaggsusu 221 5.77 -81.11   
75 ggagauUfgGfUfGfUfcgcugsas[invAb] 75 asUfscAfgCfGfacacCfaAfucuccsusu 222 2.9 -81.52   
76 acaccaUfcAfCfGfUfugcagscs[invAb] 76 asGfscUfgCfAfacguGfaUfggugususu 223 3.93 -90.02   
77 ggagAfuUfGfGfUfgucgcugas[invAb] 77 asUfscagcGfacaccaAfuCfuccsusu 224 500 -8.18 -64.7
78 acacCfaUfCfAfCfguugcagcs[invAb] 78 asGfscugcAfacgugaUfgGfugususu 225 4.2 -86.99   
79 ggagAfuUfgGfugucgcugas[invAb] 79 asUfscagcgacacCfaAfuCfuccsusu 226 6.53 -88.09   
80 acacCfaUfcAfcguugcagcs[invAb] 80 asGfscugcaacguGfaUfgGfugususu 227 7 -87.92   
81 ggagauUfgGfUfGfUfcgcugas[invAb] 81 asUfscagcGfacacCfaAfucuscsc 228 12.1 -71.94   
82 acaccaUfcAfCfGfUfugcagcs[invAb] 82 asGfscugcAfacguGfaUfggusgsu 229 16.6 -76.00   
83 ggagauUfgGfUfGfUfcgcugauus[invAb] 83 asUfscagcGfacacCfaAfucuccsusu 230 6.5 -85.33   
84 acaccaUfcAfCfGfUfugcagcuus[invAb] 84 asGfscugcAfacguGfaUfggugususu 231 7.52 -78.50   
85 ucgcugAfgCfUfCfAfuccccscs[invAb] 85 asGfsgGfgGfAfugagCfuCfagcgasusu 232 3.65 -76.02   
86 ucgcUfgAfGfCfUfcaucccccs[invAb] 86 asGfsggggAfugagcuCfaGfcgasusu 233 4.87 -78.97   
87 ucgcUfgAfgCfucaucccccs[invAb] 87 asGfsggggaugagCfuCfaGfcgasusu 234 17.4 -64.39 -44.7
88 ucgcugAfgCfUfCfAfucccccuus[invAb] 88 asGfsggggAfugagCfuCfagcgasusu 235 14.8 -63.94 -55.5
89 ucgcugAfgCfUfCfAfucccccs[invAb] 89 asGfsggggAfugagCfuCfagcsgsa 236 12.5 -66.64 -57.4
90 ggcucaAfcGfGfUfUfcccuusgs[invAb] 90 usCfsaAfgGfGfaaccGfuUfgagccsusu 237 4.7 -85.50   
91 ggcuCfaAfCfGfGfuucccuugs[invAb] 91 usCfsaaggGfaaccguUfgAfgccsusu 238 7.08 -86.03   
92 ggcuCfaAfcGfguucccuugs[invAb] 92 usCfsaagggaaccGfuUfgAfgccsusu 239 9.84 -79.22   
93 ggcucaAfcGfGfUfUfcccuugaus[invAb] 93 usCfsaaggGfaaccGfuUfgagccsusu 240 22.6 -80.97   
94 ggcucaAfcGfGfUfUfcccuugs[invAb] 94 usCfsaaggGfaaccGfuUfgagscsc 241 20.5 -63.66 -55.4
95 gcggcgagAfuUfUfUfCfcccuacs[invAb] 95 asGfsuaggGfgaaaAfuCfucgccgcsusu 242 3.88 -82.42   
96 cggcucaaCfgGfUfUfCfccuugas[invAb] 96 asUfscaagGfgaacCfgUfugagccgsusu 243 4.55 -85.51   
97 gcggcgAfgAfUfUfUfuccccuacs[invAb] 97 asGfsuaggGfgaaaauCfuCfgccgcsusu 244 3.09 -80.60   
98 cggcucAfaCfGfGfUfucccuugas[invAb] 98 asUfscaagGfgaaccgUfuGfagccgsusu 245 3.29 -92.30   
99 gcggcgAfgAfuUfuuccccuacs[invAb] 99 asGfsuaggggaaaAfuCfuCfgccgcsusu 246 9.43 -79.94   
100 cggcucAfaCfgGfuucccuugas[invAb] 100 asUfscaagggaacCfgUfuGfagccgsusu 247 4.23 -89.56   
101 ggcgagAfuUfUfUfCfcccuacuus[invAb] 101 asGfsuaggGfgaaaAfuCfucgccsgsc 248 17.9 -78.53   
102 gcucaaCfgGfUfUfCfccuugauus[invAb] 102 asUfscaagGfgaacCfgUfugagcscsg 249 5.36 -88.46   
103 gcggcgagAfuUfUfUfCfcccuacs[invAb] 103 asGfsuaggGfgaaaAfuCfucgccsgsc 250 6.13 -78.57   
104 cggcucaaCfgGfUfUfCfccuugas[invAb] 104 asUfscaagGfgaacCfgUfugagcscsg 251 3.3 -90.52   
105 agaagauaUfcUfCfGfGfgccuucs[invAb] 105 asGfsaaggCfccgaGfaUfaucuuscsu 252 7.32 -71.83   
106 agaagauaUfcUfCfGfGfgccuucs[invAb] 106 asGfsaaggCfccgaGfaUfaucuucususu 253 5.56 -70.77   
107 agaagaUfaUfCfUfCfgggccuucs[invAb] 107 asGfsaaggCfccgagaUfaUfcuucususu 254 35.6 -45.72 -25.7
108 agaagaUfaUfcUfcgggccuucs[invAb] 108 asGfsaaggcccgaGfaUfaUfcuucususu 255 500 -21.94 -11.6
109 aagauaUfcUfCfGfGfgccuucuus[invAb] 109 asGfsaaggCfccgaGfaUfaucuuscsu 256 8.22 -72.74   
110 ccugguccAfcGfUfGfCfacuucas[invAb] 110 usUfsgaagUfgcacguGfgAfccaggsusu 257 6.21 -74.11   
111 gcggcgagAfuUfUfUfCfcccuacs[invAb] 111 asGfsuaggGfgaaaauCfuCfgccgcsusu 258 5.7 -77.61   
112 cggcucaaCfgGfUfUfCfccuugas[invAb] 112 asUfscaagGfgaaccgUfuGfagccgsusu 259 3.81 -92.67   
113 agaagauaUfcUfCfGfGfgccuucs[invAb] 113 asGfsaaggCfccgagaUfaUfcuucususu 260 38.8 -55.21 -29.1
114 ccugguccAfcGfUfGfCfacuucas[invAb] 114 usUfsgaagUfgcacGfuGfgAfccaggsusu 261 5.26 -74.45   
115 gcggcgagAfuUfUfUfCfcccuacs[invAb] 115 asGfsuaggGfgaaaAfuCfuCfgccgcsusu 262 5.58 -82.96   
116 cggcucaaCfgGfUfUfCfccuugas[invAb] 116 asUfscaagGfgaacCfgUfuGfagccgsusu 263 3.43 -84.24   
117 agaagauaUfcUfCfGfGfgccuucs[invAb] 117 asGfsaaggCfccgaGfaUfaUfcuucususu 264 28.7 -56.99 -21.7
118 ccugguCfcAfcGfugcacuucas[invAb] 118 usUfsgaaGfUfgcacguGfgAfccaggsusu 265 3.3 -75.82   
119 gcggcgAfgAfuUfuuccccuacs[invAb] 119 asGfsuagGfGfgaaaauCfuCfgccgcsusu 266 4.89 -82.00   
120 cggcucAfaCfgGfuucccuugas[invAb] 120 asUfscaaGfGfgaaccgUfuGfagccgsusu 267 2.6 -94.24   
121 agaagaUfaUfcUfcgggccuucs[invAb] 121 asGfsaagGfCfccgagaUfaUfcuucususu 268 24.3 -61.77 -42.7
122 ggagauUfgGfUfGfUfcgcugas[invAb] 122 asUfscagcGfacaccaAfuCfuccsusu 269 10.9 -82.25   
123 ucgcugAfgCfUfCfAfucccccs[invAb] 123 asGfsggggAfugagcuCfaGfcgasusu 270 8.51 -69.15 -69.4
124 acaccaUfcAfCfGfUfugcagcs[invAb] 124 asGfscugcAfacgugaUfgGfugususu 271 5.34 -80.19   
125 ggcucaAfcGfGfUfUfcccuugs[invAb] 125 usCfsaaggGfaaccguUfgAfgccsusu 272 6.52 -81.92   
126 ggagauUfgGfUfGfUfcgcugas[invAb] 126 asUfscagcGfacacCfaAfuCfuccsusu 273 9.62 -86.67   
127 ggagAfuUfgGfugucgcugas[invAb] 127 asUfscagCfGfacaccaAfuCfuccsusu 274 8.3 -83.21   
128 ucgcugAfgCfUfCfAfucccccs[invAb] 128 asGfsggggAfugagCfuCfaGfcgasusu 275 7.23 -71.83   
129 ucgcUfgAfgCfucaucccccs[invAb] 129 asGfsgggGfAfugagcuCfaGfcgasusu 276 5.58 -72.60   
130 acaccaUfcAfCfGfUfugcagcs[invAb] 130 asGfscugcAfacguGfaUfgGfugususu 277 500 -83.34   
131 acacCfaUfcAfcguugcagcs[invAb] 131 asGfscugCfAfacgugaUfgGfugususu 278 9.05 -85.16   
132 ggcucaAfcGfGfUfUfcccuugs[invAb] 132 usCfsaaggGfaaccGfuUfgAfgccsusu 279 4.92 -86.26   
133 ggcuCfaAfcGfguucccuugs[invAb] 133 usCfsaagGfGfaaccguUfgAfgccsusu 280 4.45 -87.64   
134 ucgcugAfgCfUfCfAfucccccs[invAb] 134 asGfsgGfgGfAfugagCfuCfagcsgsa 281 24.6 -56.17 -64.7
135 ucgcugAfgCfUfCfAfuccccscs[invAb] 135 asGfsgGfgGfAfugagcuCfaGfcgasusu 282 7.15 -74.41   
136 ugguCfcAfCfGfUfgcacuucaaus[invAb] 136 usUfsgaagUfgcacguGfgAfccasgsg 283 3.71 -79.80   
137 ugguccAfcGfUfGfCfacuucaaus[invAb] 137 usUfsgaagUfgcacguGfgAfccasgsg 284 5.24 -78.85   
138 ugguccAfcGfUfGfCfacuucaaus[invAb] 138 usUfsgaagUfgcacGfuGfgAfccasgsg 285 7.83 -81.55   
139 ggagauUfgGfUfGfUfcgcugauus[invAb] 139 asUfscagcGfacaccaAfuCfuccsusu 286 8.21 -77.02   
140 ggagauUfgGfUfGfUfcgcugauus[invAb] 140 asUfscagcGfacacCfaAfuCfuccsusu 287 8.24 -83.79   
141 ggagAfuUfGfGfUfgucgcugauus[invAb] 141 asUfscagcGfacaccaAfuCfuccsusu 288 10.6 -83.56   
142 acaccaUfcAfCfGfUfugcagcuus[invAb] 142 asGfscugcAfacguGfaUfgGfugususu 289 18 -76.24   
143 acaccaUfcAfCfGfUfugcagcuus[invAb] 143 asGfscugcAfacgugaUfgGfugususu 290 18.4 -76.34   
144 ggcuCfaAfCfGfGfuucccuugaus[invAb] 144 usCfsaaggGfaaccguUfgAfgccsusu 291 11.2 -80.59   
145 ggcuCfaAfCfGfGfuucccuugs[invAb] 145 usCfsaaggGfaaccguUfgAfgscsc 292 17.8 -64.03 -68.1
146 cggcucAfaCfGfGfUfucccuugas[invAb] 146 asUfscaagGfgaaccgUfuGfagcscsg 293 5.28 -91.97   
147 cggcucAfaCfGfGfUfucccuugas[invAb] 147 asUfscaagGfgaacCfgUfuGfagcscsg 294 500 -28.59 -90.2
實例 3 ： 在小鼠模型中所選擇 SCAP siRNA 分子的功效篩選
7-8週齡且大於20克的雄性Balbc小鼠獲自查理斯河實驗室（Charles River Laboratories）（查理斯河實驗室公司，麻塞諸塞州（Charles Rivers Laboratory, Inc, MA））。為了穩健的肝表現，用AAV8病毒載體對小鼠給藥。用在200 μl的細胞培養級PBS中重構的1 x 10 12個病毒顆粒對每隻動物給藥。AAV載體編碼基於螢光素酶基因的報告構建體。腹膜內投與Xenolight Rediject D-螢光素底物（珀金埃爾默公司）10分鐘後，藉由測量從螢光素/螢光素酶反應產生的光訊息來分析螢光素酶活性。將該等光訊息指示為通量。使用來自珀金埃爾默公司的IVIS Lumina S5 Spectrum臨床前體內影像儀進行生物發光成像（BLI）。藉由在肝臟上放置小且相同的目的區域（ROI）進行BLI圖像分析，並使用Living Image軟體4.7.2進行分析。
為了監測SCAP siRNA的活性，螢光素酶報告基因的3’UTR區包括特異性SCAP mRNA序列，siRNA可以與該mRNA序列結合並活化螢光素酶報告基因的降解。在AAV投與後兩週，針對基線螢光素酶活性對小鼠成像。然後根據基線圖像強度將動物隨機化，並分組為每種siRNA 5隻動物。第二天，用在有義股的5’端處與三觸角GalNAc（GalNAc3）軛合的SCAP siRNA以3 mg/kg體重（mpk）對小鼠皮下給藥。siRNA給藥後四週，進行BLI成像以監測螢光素酶活性。第4週的siRNA效力在表3中顯示為%緘默化數據，其藉由歸一化每個siRNA組與PBS組的第4週（Wk4）通量 : 基線通量的比率計算。總共測試了158種觸發物，其中幾種包括不同的化學修飾。 [表3].SCAP siRNA的體內效力
雙股體編號 有義（ 5’-3’ ） SEQ ID NO: （有義） 反義（ 5’-3’ ） SEQ ID NO: （反義） BLI 劑量 BLI wk4 % 緘默化
1 ggaccuGfuGfGfAfAfuucacscs[invAb] 1 usGfsgugaAfuuccAfcAfgguccsusu 148 3 mpk -80.34
2 ggaccuGfuGfGfAfAfuucacscs[invAb] 2 usGfsgUfgAfAfuuccAfcAfgguccsusu 149 3 mpk -15.88
3 ggacCfuGfUfGfGfaauucaccs[invAb] 3 usGfsgugaAfuuccacAfgGfuccsusu 150 3 mpk -53.3
4 ggacCfuGfuGfgaauucaccs[invAb] 4 usGfsgugaauuccAfcAfgGfuccsusu 151 3 mpk -42.49
5 ggaccuGfuGfGfAfAfuucaccaus[invAb] 5 usGfsgugaAfuuccAfcAfgguccsusu 152 3 mpk -63.11
6 ggaccuGfuGfGfAfAfuucaccs[invAb] 6 usGfsgugaAfuuccAfcAfgguscsc 153 3 mpk -3.65
7 gcgagaUfuUfUfCfCfccuacscs[invAb] 7 asGfsguagGfggaaAfaUfcucgcsusu 154 3 mpk -86.33
8 gcgagaUfuUfUfCfCfccuacscs[invAb] 8 asGfsgUfaGfGfggaaAfaUfcucgcsusu 155 3 mpk -79.59
9 gcgaGfaUfUfUfUfccccuaccs[invAb] 9 asGfsguagGfggaaaaUfcUfcgcsusu 156 3 mpk -72.82
10 gcgaGfaUfuUfuccccuaccs[invAb] 10 asGfsguaggggaaAfaUfcUfcgcsusu 157 3 mpk -84.66
11 gcgagaUfuUfUfCfCfccuaccs[invAb] 11 asGfsguagGfggaaAfaUfcucsgsc 158 3 mpk -47.38
12 gcgagaUfuUfUfCfCfccuaccuus[invAb] 12 asGfsguagGfggaaAfaUfcucgcsusu 159 3 mpk -81.46
13 ccugucCfaUfUfGfAfcauucsgs[invAb] 13 asCfsgaauGfucaaUfgGfacaggsusu 160 3 mpk -65.41
14 ccugucCfaUfUfGfAfcauucsgs[invAb] 14 asCfsgAfaUfGfucaaUfgGfacaggsusu 161 3 mpk -77.07
15 ccugUfcCfAfUfUfgacauucgs[invAb] 15 asCfsgaauGfucaaugGfaCfaggsusu 162 3 mpk -79.08
16 ccugUfcCfaUfugacauucgs[invAb] 16 asCfsgaaugucaaUfgGfaCfaggsusu 163 3 mpk -73.33
17 ccugucCfaUfUfGfAfcauucguus[invAb] 17 asCfsgaauGfucaaUfgGfacaggsusu 164 3 mpk -83.3
18 ccugucCfaUfUfGfAfcauucgs[invAb] 18 asCfsgaauGfucaaUfgGfacasgsg 165 3 mpk -27.8
19 guccauUfgAfCfAfUfucgccsgs[invAb] 19 asCfsggcgAfauguCfaAfuggacsusu 166 3 mpk -71.1
20 cuguccauUfgAfCfAfUfucgccgs[invAb] 20 asCfsggcgAfauguCfaAfuggacagsusu 167 3 mpk -57.77
21 cuguccAfuUfGfAfCfauucgccgs[invAb] 21 asCfsggcgAfaugucaAfuGfgacagsusu 168 3 mpk -64.67
22 cuguccauUfgAfCfAfUfucgccgs[invAb] 22 asCfsggcgAfauguCfaAfuggacsasg 169 3 mpk -73.67
23 cuguccAfuUfgAfcauucgccgs[invAb] 23 asCfsggcgaauguCfaAfuGfgacagsusu 170 3 mpk -56.27
24 guccauUfgAfCfAfUfucgccguus[invAb] 24 asCfsggcgAfauguCfaAfuggacsasg 171 3 mpk -79.22
25 ggaaagAfgCfCfGfAfguaucsus[invAb] 25 asAfsgauaCfucggCfuCfuuuccsusu 172 3 mpk -76.7
26 ggaaagAfgCfCfGfAfguaucsus[invAb] 26 asAfsgAfuAfCfucggCfuCfuuuccsusu 173 3 mpk -86.88
27 ggaaAfgAfgCfcgaguaucus[invAb] 27 asAfsgauacucggCfuCfuUfuccsusu 174 3 mpk -64.51
28 ggaaagAfgCfCfGfAfguaucuuus[invAb] 28 asAfsgauaCfucggCfuCfuuuccsusu 175 3 mpk -88.89
29 ggaaagAfgCfCfGfAfguaucus[invAb] 29 asAfsgauaCfucggCfuCfuuuscsc 176 3 mpk -44.87
30 ggaaAfgAfGfCfCfgaguaucus[invAb] 30 asAfsgauaCfucggcuCfuUfuccsusu 177 3 mpk -69.31
31 aaagagCfcGfAfGfUfaucuuscs[invAb] 31 asGfsaagaUfacucGfgCfucuuususu 178 3 mpk -78
32 ggaaagagCfcGfAfGfUfaucuucs[invAb] 32 asGfsaagaUfacucGfgCfucuuuccsusu 179 3 mpk -67.98
33 ggaaagAfgCfCfGfAfguaucuucs[invAb] 33 asGfsaagaUfacucggCfuCfuuuccsusu 180 3 mpk -86.86
34 ggaaagagCfcGfAfGfUfaucuucs[invAb] 34 asGfsaagaUfacucGfgCfucuuuscsc 181 3 mpk -66.29
35 ggaaagAfgCfcGfaguaucuucs[invAb] 35 asGfsaagauacucGfgCfuCfuuuccsusu 182 3 mpk -66.65
36 aaagagCfcGfAfGfUfaucuucuus[invAb] 36 asGfsaagaUfacucGfgCfucuuuscsc 183 3 mpk -74.06
37 gcggcgAfgAfUfUfUfuccccsus[invAb] 37 usAfsggggAfaaauCfuCfgccgcsusu 184 3 mpk -14.96
38 ggcgagAfuUfUfUfCfcccuascs[invAb] 38 asGfsuaggGfgaaaAfuCfucgccsusu 185 3 mpk -88.43
39 aagauaUfcUfCfGfGfgccuuscs[invAb] 39 asGfsaaggCfccgaGfaUfaucuususu 186 3 mpk -77.32
40 cgggccUfuCfUfAfCfaaccasus[invAb] 40 asAfsugguUfguagAfaGfgcccgsusu 187 3 mpk 0
41 cugcagUfuUfAfGfAfgggacscs[invAb] 41 asGfsguccCfucuaAfaCfugcagsusu 188 3 mpk -54.07
42 acggggAfcCfUfGfUfuacagsas[invAb] 42 asUfscuguAfacagGfuCfcccgususu 189 3 mpk 0
43 cggcucAfaCfGfGfUfucccusus[invAb] 43 asAfsagggAfaccgUfuGfagccgsusu 190 3 mpk -66.71
44 uguacuGfaCfUfGfGfcagccsgs[invAb] 44 asCfsggcuGfccagUfcAfguacasusu 191 3 mpk -45.12
45 ccccugCfaGfUfUfUfagaggsgs[invAb] 45 usCfsccucUfaaacUfgCfaggggsusu 192 3 mpk 0
46 uguccaUfuGfAfCfAfuucgcscs[invAb] 46 asGfsgcgaAfugucAfaUfggacasusu 193 3 mpk -69.36
47 ggcuggCfaCfCfGfUfugucusgs[invAb] 47 asCfsagacAfacggUfgCfcagccsusu 194 -- --
48 ggcucaAfcGfGfUfUfcccuusgs[invAb] 48 usCfsaaggGfaaccGfuUfgagccsusu 195 3 mpk -87.62
49 gcucaaCfgGfUfUfCfccuugsas[invAb] 49 asUfscaagGfgaacCfgUfugagcsusu 196 3 mpk -86.43
50 caacggUfuCfCfCfUfugauusus[invAb] 50 asAfsaaucAfagggAfaCfcguugsusu 197 3 mpk -60.78
51 acgguuCfcCfUfUfGfauuucsus[invAb] 51 asAfsgaaaUfcaagGfgAfaccgususu 198 3 mpk -74.51
52 gugggaUfgUfAfCfUfgacugsgs[invAb] 52 asCfscaguCfaguaCfaUfcccacsusu 199 3 mpk -20.77
53 cugaaaCfuCfCfCfCfuugccsas[invAb] 53 asUfsggcaAfggggAfgUfuucagsusu 200 -- --
54 gauccuGfaCfAfUfCfauuggsgs[invAb] 54 usCfsccaaUfgaugUfcAfggaucsusu 201 -- --
55 ugguccAfcGfUfGfCfacuucsas[invAb] 55 usUfsgaagUfgcacGfuGfgaccasusu 202 3 mpk -73.63
56 guggacUfcUfGfAfCfcgcaasas[invAb] 56 asUfsuugcGfgucaGfaGfuccacsusu 203 -- --
57 ggaggaGfaUfUfGfGfugucgscs[invAb] 57 asGfscgacAfccaaUfcUfccuccsusu 204 3 mpk -34.27
58 aguguuUfcCfCfUfGfgcacasas[invAb] 58 asUfsugugCfcaggGfaAfacacususu 205 -- --
59 ggagauUfgGfUfGfUfcgcugsas[invAb] 59 asUfscagcGfacacCfaAfucuccsusu 206 3 mpk -76.45
60 ucgcugAfgCfUfCfAfuccccscs[invAb] 60 asGfsggggAfugagCfuCfagcgasusu 207 3 mpk -45.22
61 ugucccGfgGfCfAfUfuccaascs[invAb] 61 asGfsuuggAfaugcCfcGfggacasusu 208 -- --
62 ggaguuCfuGfUfCfUfcuuugscs[invAb] 62 asGfscaaaGfagacAfgAfacuccsusu 209 3 mpk -48.69
63 gagguaAfcCfUfGfGfgggccsus[invAb] 63 asAfsggccCfccagGfuUfaccucsusu 210 -- --
64 acaccaUfcAfCfGfUfugcagscs[invAb] 64 asGfscugcAfacguGfaUfggugususu 211 -- --
65 cggcuaCfuUfCfAfCfccuagsus[invAb] 65 asAfscuagGfgugaAfgUfagccgsusu 212 -- --
66 cauugaCfcAfGfAfCfcauggsus[invAb] 66 asAfsccauGfgucuGfgUfcaaugsusu 213 -- --
67 aggagaUfuGfGfUfGfucgcusgs[invAb] 67 usCfsagcgAfcaccAfaUfcuccususu 214 3 mpk -73.73
68 ccgccuUfcCfCfUfCfuucggsgs[invAb] 68 asCfsccgaAfgaggGfaAfggcggsusu 215 -- --
69 auugaaGfgGfGfUfGfcugugscs[invAb] 69 asGfscacaGfcaccCfcUfucaaususu 216 -- --
70 ccugguccAfcGfUfGfCfacuucas[invAb] 70 usUfsgaagUfgcacGfuGfgaccaggsusu 217 3 mpk -59.29
71 ccugguCfcAfCfGfUfgcacuucas[invAb] 71 usUfsgaagUfgcacguGfgAfccaggsusu 218 3 mpk -83.99
72 ugguccAfcGfUfGfCfacuucaaus[invAb] 72 usUfsgaagUfgcacGfuGfgaccasgsg 219 3 mpk -70.67
73 ccugguccAfcGfUfGfCfacuucas[invAb] 73 usUfsgaagUfgcacGfuGfgaccasgsg 220 3 mpk -63.01
74 ccugguCfcAfcGfugcacuucas[invAb] 74 usUfsgaagugcacGfuGfgAfccaggsusu 221 3 mpk -49.48
75 ggagauUfgGfUfGfUfcgcugsas[invAb] 75 asUfscAfgCfGfacacCfaAfucuccsusu 222 3 mpk -67.13
76 acaccaUfcAfCfGfUfugcagscs[invAb] 76 asGfscUfgCfAfacguGfaUfggugususu 223 -- --
77 ggagAfuUfGfGfUfgucgcugas[invAb] 77 asUfscagcGfacaccaAfuCfuccsusu 224 3 mpk -64.32
78 acacCfaUfCfAfCfguugcagcs[invAb] 78 asGfscugcAfacgugaUfgGfugususu 225 -- --
79 ggagAfuUfgGfugucgcugas[invAb] 79 asUfscagcgacacCfaAfuCfuccsusu 226 3 mpk -69.66
80 acacCfaUfcAfcguugcagcs[invAb] 80 asGfscugcaacguGfaUfgGfugususu 227 -- --
81 ggagauUfgGfUfGfUfcgcugas[invAb] 81 asUfscagcGfacacCfaAfucuscsc 228 3 mpk -70.56
82 acaccaUfcAfCfGfUfugcagcs[invAb] 82 asGfscugcAfacguGfaUfggusgsu 229 -- --
83 ggagauUfgGfUfGfUfcgcugauus[invAb] 83 asUfscagcGfacacCfaAfucuccsusu 230 3 mpk -85.28
84 acaccaUfcAfCfGfUfugcagcuus[invAb] 84 asGfscugcAfacguGfaUfggugususu 231 -- --
85 ucgcugAfgCfUfCfAfuccccscs[invAb] 85 asGfsgGfgGfAfugagCfuCfagcgasusu 232 3 mpk -81.14
86 ucgcUfgAfGfCfUfcaucccccs[invAb] 86 asGfsggggAfugagcuCfaGfcgasusu 233 3 mpk -74.05
87 ucgcUfgAfgCfucaucccccs[invAb] 87 asGfsggggaugagCfuCfaGfcgasusu 234 3 mpk -66.76
88 ucgcugAfgCfUfCfAfucccccuus[invAb] 88 asGfsggggAfugagCfuCfagcgasusu 235 3 mpk -73.73
89 ucgcugAfgCfUfCfAfucccccs[invAb] 89 asGfsggggAfugagCfuCfagcsgsa 236 3 mpk -74.58
90 ggcucaAfcGfGfUfUfcccuusgs[invAb] 90 usCfsaAfgGfGfaaccGfuUfgagccsusu 237 3 mpk -68.23
91 ggcuCfaAfCfGfGfuucccuugs[invAb] 91 usCfsaaggGfaaccguUfgAfgccsusu 238 3 mpk -94.43
92 ggcuCfaAfcGfguucccuugs[invAb] 92 usCfsaagggaaccGfuUfgAfgccsusu 239 3 mpk -89.89
93 ggcucaAfcGfGfUfUfcccuugaus[invAb] 93 usCfsaaggGfaaccGfuUfgagccsusu 240 3 mpk -94.81
94 ggcucaAfcGfGfUfUfcccuugs[invAb] 94 usCfsaaggGfaaccGfuUfgagscsc 241 3 mpk -91.36
95 gcggcgagAfuUfUfUfCfcccuacs[invAb] 95 asGfsuaggGfgaaaAfuCfucgccgcsusu 242 -- --
96 cggcucaaCfgGfUfUfCfccuugas[invAb] 96 asUfscaagGfgaacCfgUfugagccgsusu 243 3 mpk -87.69
97 gcggcgAfgAfUfUfUfuccccuacs[invAb] 97 asGfsuaggGfgaaaauCfuCfgccgcsusu 244 -- --
98 cggcucAfaCfGfGfUfucccuugas[invAb] 98 asUfscaagGfgaaccgUfuGfagccgsusu 245 3 mpk -94.03
99 gcggcgAfgAfuUfuuccccuacs[invAb] 99 asGfsuaggggaaaAfuCfuCfgccgcsusu 246 -- --
100 cggcucAfaCfgGfuucccuugas[invAb] 100 asUfscaagggaacCfgUfuGfagccgsusu 247 3 mpk -67.91
101 ggcgagAfuUfUfUfCfcccuacuus[invAb] 101 asGfsuaggGfgaaaAfuCfucgccsgsc 248 -- --
102 gcucaaCfgGfUfUfCfccuugauus[invAb] 102 asUfscaagGfgaacCfgUfugagcscsg 249 3 mpk -70.86
103 gcggcgagAfuUfUfUfCfcccuacs[invAb] 103 asGfsuaggGfgaaaAfuCfucgccsgsc 250 -- --
104 cggcucaaCfgGfUfUfCfccuugas[invAb] 104 asUfscaagGfgaacCfgUfugagcscsg 251 3 mpk -92.8
105 agaagauaUfcUfCfGfGfgccuucs[invAb] 105 asGfsaaggCfccgaGfaUfaucuuscsu 252 -- --
106 agaagauaUfcUfCfGfGfgccuucs[invAb] 106 asGfsaaggCfccgaGfaUfaucuucususu 253 -- --
107 agaagaUfaUfCfUfCfgggccuucs[invAb] 107 asGfsaaggCfccgagaUfaUfcuucususu 254 -- --
108 agaagaUfaUfcUfcgggccuucs[invAb] 108 asGfsaaggcccgaGfaUfaUfcuucususu 255 -- --
109 aagauaUfcUfCfGfGfgccuucuus[invAb] 109 asGfsaaggCfccgaGfaUfaucuuscsu 256 -- --
110 ccugguccAfcGfUfGfCfacuucas[invAb] 110 usUfsgaagUfgcacguGfgAfccaggsusu 257 -- --
111 gcggcgagAfuUfUfUfCfcccuacs[invAb] 111 asGfsuaggGfgaaaauCfuCfgccgcsusu 258 -- --
112 cggcucaaCfgGfUfUfCfccuugas[invAb] 112 asUfscaagGfgaaccgUfuGfagccgsusu 259 -- --
113 agaagauaUfcUfCfGfGfgccuucs[invAb] 113 asGfsaaggCfccgagaUfaUfcuucususu 260 -- --
114 ccugguccAfcGfUfGfCfacuucas[invAb] 114 usUfsgaagUfgcacGfuGfgAfccaggsusu 261 -- --
115 gcggcgagAfuUfUfUfCfcccuacs[invAb] 115 asGfsuaggGfgaaaAfuCfuCfgccgcsusu 262 -- --
116 cggcucaaCfgGfUfUfCfccuugas[invAb] 116 asUfscaagGfgaacCfgUfuGfagccgsusu 263 -- --
117 agaagauaUfcUfCfGfGfgccuucs[invAb] 117 asGfsaaggCfccgaGfaUfaUfcuucususu 264 -- --
118 ccugguCfcAfcGfugcacuucas[invAb] 118 usUfsgaaGfUfgcacguGfgAfccaggsusu 265 -- --
119 gcggcgAfgAfuUfuuccccuacs[invAb] 119 asGfsuagGfGfgaaaauCfuCfgccgcsusu 266 -- --
120 cggcucAfaCfgGfuucccuugas[invAb] 120 asUfscaaGfGfgaaccgUfuGfagccgsusu 267 -- --
121 agaagaUfaUfcUfcgggccuucs[invAb] 121 asGfsaagGfCfccgagaUfaUfcuucususu 268 -- --
122 ggagauUfgGfUfGfUfcgcugas[invAb] 122 asUfscagcGfacaccaAfuCfuccsusu 269 -- --
123 ucgcugAfgCfUfCfAfucccccs[invAb] 123 asGfsggggAfugagcuCfaGfcgasusu 270 -- --
124 acaccaUfcAfCfGfUfugcagcs[invAb] 124 asGfscugcAfacgugaUfgGfugususu 271 -- --
125 ggcucaAfcGfGfUfUfcccuugs[invAb] 125 usCfsaaggGfaaccguUfgAfgccsusu 272 -- --
126 ggagauUfgGfUfGfUfcgcugas[invAb] 126 asUfscagcGfacacCfaAfuCfuccsusu 273 -- --
127 ggagAfuUfgGfugucgcugas[invAb] 127 asUfscagCfGfacaccaAfuCfuccsusu 274 -- --
128 ucgcugAfgCfUfCfAfucccccs[invAb] 128 asGfsggggAfugagCfuCfaGfcgasusu 275 -- --
129 ucgcUfgAfgCfucaucccccs[invAb] 129 asGfsgggGfAfugagcuCfaGfcgasusu 276 -- --
130 acaccaUfcAfCfGfUfugcagcs[invAb] 130 asGfscugcAfacguGfaUfgGfugususu 277 -- --
131 acacCfaUfcAfcguugcagcs[invAb] 131 asGfscugCfAfacgugaUfgGfugususu 278 -- --
132 ggcucaAfcGfGfUfUfcccuugs[invAb] 132 usCfsaaggGfaaccGfuUfgAfgccsusu 279 -- --
133 ggcuCfaAfcGfguucccuugs[invAb] 133 usCfsaagGfGfaaccguUfgAfgccsusu 280 -- --
134 ucgcugAfgCfUfCfAfucccccs[invAb] 134 asGfsgGfgGfAfugagCfuCfagcsgsa 281 -- --
135 ucgcugAfgCfUfCfAfuccccscs[invAb] 135 asGfsgGfgGfAfugagcuCfaGfcgasusu 282 -- --
136 ugguCfcAfCfGfUfgcacuucaaus[invAb] 136 usUfsgaagUfgcacguGfgAfccasgsg 283 -- --
137 ugguccAfcGfUfGfCfacuucaaus[invAb] 137 usUfsgaagUfgcacguGfgAfccasgsg 284 -- --
138 ugguccAfcGfUfGfCfacuucaaus[invAb] 138 usUfsgaagUfgcacGfuGfgAfccasgsg 285 -- --
139 ggagauUfgGfUfGfUfcgcugauus[invAb] 139 asUfscagcGfacaccaAfuCfuccsusu 286 -- --
140 ggagauUfgGfUfGfUfcgcugauus[invAb] 140 asUfscagcGfacacCfaAfuCfuccsusu 287 -- --
141 ggagAfuUfGfGfUfgucgcugauus[invAb] 141 asUfscagcGfacaccaAfuCfuccsusu 288 -- --
142 acaccaUfcAfCfGfUfugcagcuus[invAb] 142 asGfscugcAfacguGfaUfgGfugususu 289 -- --
143 acaccaUfcAfCfGfUfugcagcuus[invAb] 143 asGfscugcAfacgugaUfgGfugususu 290 -- --
144 ggcuCfaAfCfGfGfuucccuugaus[invAb] 144 usCfsaaggGfaaccguUfgAfgccsusu 291 -- --
145 ggcuCfaAfCfGfGfuucccuugs[invAb] 145 usCfsaaggGfaaccguUfgAfgscsc 292 -- --
146 cggcucAfaCfGfGfUfucccuugas[invAb] 146 asUfscaagGfgaaccgUfuGfagcscsg 293 -- --
147 cggcucAfaCfGfGfUfucccuugas[invAb] 147 asUfscaagGfgaacCfgUfuGfagcscsg 294 -- --
本說明書中所提及的所有公開、專利以及專利申請藉由引用併入本文，達到如同每一個單獨的公開、專利或專利申請被專門地並且單獨地指示藉由引用併入的相同的程度。然而，本文對參考文獻的引用不應解釋為承認這樣的參考文獻為本發明的先前技術。在藉由引用併入的參考文獻中所提供的任何定義或術語與在本文中所提供的術語和討論不同的情況下，以本發明術語和定義為準。
認為前述書面說明足以能夠使熟悉該項技術者來實踐本發明。前述描述和實例詳述本發明的某些較佳的實施方式，且描述由諸位發明人所考慮的最佳模式。然而，將理解的是無論前述內容可如何詳細地出現在文本中，本發明可以按多種方式實施，並且本發明應該根據所附申請專利範圍及其任何等同物來解釋。
無
無
無
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Claims (42)

  1. 一種包含有義股和反義股的RNAi構建體，其中該反義股包含具有與在表1中所列出的反義序列差異不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸的區域，並且其中該RNAi構建體抑制SREBP切割活化蛋白（SCAP）mRNA的表現。
  2. 如請求項1之RNAi構建體，其中該有義股包含與該反義股的序列充分互補以形成長度為約15至約30個鹼基對的雙股體區的序列。
  3. 如請求項1或請求項2之RNAi構建體，其中該雙股體區的長度為約17至約24個鹼基對。
  4. 如請求項1至3中任一項之RNAi構建體，其中該雙股體區的長度為約19至約21個鹼基對。
  5. 如請求項4之RNAi構建體，其中該雙股體區的長度為19個鹼基對。
  6. 如請求項1至5中任一項之RNAi構建體，其中該有義股和該反義股的長度各自為約15至約30個核苷酸。
  7. 如請求項6之RNAi構建體，其中該有義股和該反義股的長度各自為約19至約27個核苷酸。
  8. 如請求項7之RNAi構建體，其中該有義股和該反義股的長度各自為約21至約25個核苷酸。
  9. 如請求項8之RNAi構建體，其中該有義股和該反義股的長度各自為約21至約23個核苷酸。
  10. 如請求項1至9中任一項之RNAi構建體，該RNAi構建體包含至少一個鈍端。
  11. 如請求項1至10中任一項之RNAi構建體，該RNAi構建體包含至少一個具有1至4個未配對核苷酸的核苷酸突出端。
  12. 如請求項11之RNAi構建體，其中該核苷酸突出端具有兩個未配對核苷酸。
  13. 如請求項11或12之RNAi構建體，其中該RNAi構建體在該有義股的3’端、該反義股的3’端、或者該有義股和該反義股兩者的3’端處包含核苷酸突出端。
  14. 如請求項11至13中任一項之RNAi構建體，其中該核苷酸突出端包含5’-UU-3’二核苷酸或5’-dTdT-3’二核苷酸。
  15. 如請求項1至14中任一項之RNAi構建體，其中該RNAi構建體包含至少一個經修飾的核苷酸。
  16. 如請求項15之RNAi構建體，其中該經修飾的核苷酸係經2’-修飾的核苷酸。
  17. 如請求項15之RNAi構建體，其中該經修飾的核苷酸係經2’-氟修飾的核苷酸、經2’-O-甲基修飾的核苷酸、經2’-O-甲氧基乙基修飾的核苷酸、經2’-O-烯丙基修飾的核苷酸、雙環核酸（BNA）、二醇核酸、反向核苷酸、或其組合。
  18. 如請求項17之RNAi構建體，其中該經修飾的核苷酸係經2’-O-甲基修飾的核苷酸、經2’-O-甲氧基乙基修飾的核苷酸、經2’-氟修飾的核苷酸、或其組合。
  19. 如請求項15至18中任一項之RNAi構建體，其中該有義股和該反義股中的所有核苷酸均為經修飾的核苷酸。
  20. 如請求項19之RNAi構建體，其中該經修飾的核苷酸係經2’-O-甲基修飾的核苷酸、經2’-氟修飾的核苷酸、或其組合。
  21. 如請求項1至20中任一項之RNAi構建體，該RNAi構建體包含至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
  22. 如請求項21之RNAi構建體，其中該RNAi構建體在該反義股的3’端處包含兩個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
  23. 如請求項21之RNAi構建體，其中該RNAi構建體在該反義股的3’端和5’端兩者處包含兩個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵，且在該有義股的5’端處包含兩個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
  24. 如請求項1至23中任一項之RNAi構建體，其中該反義股包含選自表1中所列出的反義序列的序列。
  25. 如請求項1至24中任一項之RNAi構建體，其中該有義股包含選自表1中所列出的有義序列的序列。
  26. 如請求項1至25中任一項之RNAi構建體，其中該RNAi構建體係表1中所列出的雙股體化合物中之任一種。
  27. 如請求項1至26中任一項之RNAi構建體，該RNAi構建體係小干擾RNA（siRNA）。
  28. 如請求項1至27中任一項之RNAi構建體，其中與已經與對照RNAi構建體一起培養的肝臟細胞中的SCAP表現程度相比，在與該RNAi構建體一起培養之後，該RNAi構建體降低肝臟細胞中的SCAP表現程度。
  29. 如請求項28之RNAi構建體，其中該等肝臟細胞係Hep3B或HepG2細胞。
  30. 如請求項1至29中任一項之RNAi構建體，其中該RNAi構建體在活體外以5 nM將Hep3B細胞中的SCAP表現抑制至少40%。
  31. 如請求項1至29中任一項之RNAi構建體，其中該RNAi構建體在活體外以5 nM將HepG2細胞中的SCAP表現抑制至少40%。
  32. 如請求項1至31中任一項之RNAi構建體，其中該RNAi構建體以小於約5 nM的IC50抑制SCAP在Hep3B細胞中的表現。
  33. 如請求項1至31中任一項之RNAi構建體，其中該RNAi構建體以小於約5 nM的IC50抑制SCAP在HepG2細胞中的表現。
  34. 如請求項1至33中任一項之RNAi構建體，該RNAi構建體進一步包含與肝臟細胞表面上表現的一或多種蛋白質結合的配體。
  35. 一種組成物，該組成物包含如請求項1至34中任一項之RNAi構建體和藥學上可接受的載劑、賦形劑或稀釋劑。
  36. 一種用於在有需要的患者中降低SCAP的表現的方法，該方法包括向該患者投與如請求項1至34中任一項之RNAi構建體。
  37. 一種用於在有需要的患者中降低SCAP的表現的方法，該方法包括向該患者投與如請求項35之組成物。
  38. 如請求項36或請求項37之方法，其中與未接受該RNAi構建體的患者中的SCAP表現程度相比，在投與該RNAi構建體後的患者中SCAP在肝細胞中的表現程度降低。
  39. 如請求項36至38中任一項之方法，其中該患者患有非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）。
  40. 如請求項39之方法，其中該患者患有非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。
  41. 如請求項1至34中任一項之RNAi構建體或如請求項35之組成物，其用於在治療NAFLD中使用。
  42. 一種如請求項1至34中任一項之RNAi構建體或如請求項35之組成物於製備用於治療NAFLD的藥物之用途。
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