TW202338098A

TW202338098A - 自低分子量肝素前體化學酶合成低分子量肝素之方法

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Publication number: TW202338098A
Application number: TW111142181A
Authority: TW
Inventors: 羅伯特約翰林赫德特; 強納森賽斯多迪克; 俞琰垒; 傅立; 贺鵬; 夏可; 索尼瓦荷希; 张福明; 王鴻
Original assignee: 美商瑞瑟勒綜合技術協會; 日商大塚製藥工場股份有限公司
Priority date: 2021-11-05
Filing date: 2022-11-04
Publication date: 2023-10-01
Also published as: WO2023081336A3; WO2023081336A2; KR20240172173A; EP4426750A2; CA3236567A1

Abstract

本發明係關於自工程化大腸桿菌K5莢膜多醣(例如，大腸桿菌K5肝素前體)分離之初始材料製備適用於USP依諾肝素鈉之等效用途之低分子量肝素(LMWH)。大腸桿菌CPS係用酸處理以去除3-去氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸(Kdo)殘基，及經由鹼處理進一步水解以形成具有堪比依諾肝素之分子量及 N-乙醯化之低分子量 N-磺酸基、 N-乙醯基肝素前體(LMW-NSNAH)。該LMW-NSNAH係經由一系列酶修飾由C5-差向異構酶、2- O-、6- O-及3- O-磺酸基轉移酶轉化為LMWH。包括該LMWH之組合物係在不使用源於豬之肝素之情況下製備，且因此受益於更好之原材料可用性、更好地控制製造過程、減少對污染、摻雜或動物病毒或雜質之擔憂。此外，經證實LMWH產品在結構及功能上堪比傳統醫藥LMWH。

Description

自低分子量肝素前體化學酶合成低分子量肝素之方法

肝素產品係實踐現代醫學中廣泛使用之臨床抗凝血劑。低分子量肝素(LMWH)當前係藉由受控化學或酶解聚自動物組織提取之未分級肝素(UFH)製備。在許多臨床應用中，LMWH已取代UFH且當前佔肝素市場之60%以上。在過去，已作出大量努力來依賴於化學酶方法製備生物工程化UFH以解決對動物來源之UFH之擔憂。

肝素係通常由富含肝素蛋白多醣之動物組織，主要由豬腸製備。肝素係一種直鏈高度硫酸化多醣，發現其作為蛋白多醣共價附接至核心蛋白絲甘蛋白(serglycin)並儲存於肥胖細胞之細胞內顆粒中。其係由包含1,4-糖苷連接至D-葡萄胺糖(GlcN)之β-D-葡萄醣醛酸(GlcA)或α-L-艾杜糖醛酸(IdoA)之重複二醣單元構成。不同於DNA及蛋白質之合成，肝素之生物合成不為模板驅動的，且因此所得多醣在長度及取代模式上係異質的。某些動物細胞中之肝素生物合成起始於內質網，涉及四醣連接子(D-木糖(Xyl)-D-半乳糖(Gal)-Gal-GlcA)之形成，該四醣連接子系鏈至其核心蛋白之絲胺酸殘基。接著，通過由兩種稱為外生性骨疣蛋白(exostosin)醣苷基轉移酶(EXT) 1及EXT 2之聚合酶驅動形成 N-乙醯基-α-D-葡萄胺糖(GlcNAc) 1,4-連接之GlcA之重複二醣構築嵌段而發生鏈式聚合，形成肝素前體(肝素之主鏈)。

現參考圖1，肝素前體係[→4) GlcA (1→4) GlcNAc (1→] _n之重複二醣單元之直鏈。通過去 N-乙醯化及 N-硫酸化、C5-差向異構化及均發生於高爾基隔室中之一系列3’-磷酸腺苷5’-磷酸硫酸酯(PAPS)依賴性 O-硫酸化反應發生此主鏈之後續修飾。由 N-去乙醯酶/ N-磺酸基轉移酶(NDST)催化此等反應以形成 N-磺酸基-α-D-葡萄胺糖(GlcNS)殘基、C5-差向異構酶(Epi)，將GlcA殘基轉化為L-艾杜糖醛酸(IdoA)，及將磺酸基轉移至多醣鏈之2- O-、6- O-、3- O-磺酸基轉移酶(ST)。藥物肝素係多分散且異質的，具有18至20 kDa之平均分子量。

如上文提及，當前藉由UFH之受控化學或酶解聚產生LMWH。LMWH在治療抗凝中具有數個優於UFH之優點，包括高皮下生體可用率及更可預測之藥物動力學概況、更長之血漿半衰期及更低之肝素誘導之血小板減少症(HIT)之發生率。市售LMWH係平均分子量在3至8 kDa之範圍內之多分散、分級肝素。例如，依諾肝素(~4,500 Da)係使用苯甲基化，接著鹼性水解產生，達肝素(~6,000 Da)係源於受控亞硝酸解聚，及亭紮肝素(~6,500 Da)係藉由受控肝素酶消化製備。在該等三種藥物中，由Sanofi產生之依諾肝素(Lovenox®)在全球LMWH市場佔有主要份額及於各種應用中具有效用及安全性之最廣泛臨床證據，且因此具有最廣泛範圍之治療適應症。最近，創始依諾肝素之專利權及補充保護證書已過期。2010年，由美國食品及藥物管理局(FDA)批准通用形式之依諾肝素已降低藥物價格、使得LMWH可用於更廣泛之病患群體。然而，LMWH之品質及供應依賴於源於動物之肝素之品質。人們越來越擔憂豬肝素之短缺，及肝素且因此LMWH之供應鏈正處於雜質、污染及摻雜之威脅下。為此，已致力於研發及改善合成UFH及LMWH之技術及方法。

以成功表現重組肝素生物合成酶(包括醣苷基轉移酶、C5-Epi及2-、6-、3-OST)之UFH之化學酶合成已成為可能。化學酶法緊密模擬肝素生物合成途徑。生物工程化UFH製法起始於大腸桿菌K5莢膜多醣(CPS)肝素前體作為初始材料。肝素前體之化學去 N-乙醯化及 N-磺化提供 N-磺酸基肝素前體，該前體後續使用C5-Epi及2-、6-、3-OST修飾。此生物工程化UFH已顯示與藥用豬肝素之化學及生物等效性。

已使用 N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶(KfiA)及肝素前體合成酶(pmHS2)，自尿苷-5’-二磷酸(UDP)-糖供體及源於肝素前體之二醣受體化學酶合成均質、單分散、類磺達肝癸鈉(fondaparinux-like)之超LMWH。此外，亦已合成均質十二醣LMWH之單一目標結構並證實係血栓預防中替代LMWH之可行候選物。此等化學酶過程依賴於使用昂貴之UDP-糖供體來反復合成均質分子物種。

本發明之態樣係關於一種製造低分子量肝素(LMWH)之方法。在一些實施例中，該方法包括提供一定量之肝素前體；使該肝素前體與一或多種酸接觸以形成經酸處理之肝素前體；藉由其解聚及去 N-乙醯化轉化該經酸處理之肝素前體以形成低分子量 N-磺酸基、 N-乙醯基肝素前體(LMW-NSNAH)；及將該LMW-NSNAH酶轉化為LMWH。在一些實施例中，該肝素前體係大腸桿菌莢膜多醣。在一些實施例中，該肝素前體係經由大腸桿菌K5之工程化菌株合成。

在一些實施例中，使肝素前體與一或多種酸接觸以形成經酸處理之肝素前體包括經由酸水解自該肝素前體去除3-去氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸(Kdo)殘基。在一些實施例中，將該經酸處理之肝素前體轉化為LMW-NSNAH包括經由用一或多種鹼處理該經酸處理之肝素前體水解該經酸處理之肝素前體；用一或多種另外酸處理該經酸處理之肝素前體；使該經酸處理之肝素前體與一或多種酶接觸；或其組合。在一些實施例中，藉由去解聚及其 N-乙醯化將該經酸處理之肝素前體轉化為LMW-NSNAH進一步包括在其去 N-乙醯化後將該經酸處理之肝素前體再乙醯化及將該經酸處理之肝素前體 N-硫酸化以獲得LMW-NSNAH。

在一些實施例中，在經酸處理之肝素前體去 N-乙醯化後將其再乙醯化包括使該經酸處理之肝素前體與乙酸酐接觸。在一些實施例中，將該經酸處理之肝素前體 N-硫酸化以獲得LMW-NSNAH包括使該經酸處理之肝素前體與三甲胺三氧化硫、吡啶三氧化硫，或其組合接觸。在一些實施例中，在該經酸處理之肝素前體去 N-乙醯化後將其再乙醯化包括使該經酸處理之肝素前體與約53 μM/L乙酸酐接觸。在一些實施例中，將該經酸處理之肝素前體 N-硫酸化以獲得LMW-NSNAH包括使該經酸處理之肝素前體與約76 mM/L三甲胺三氧化硫接觸。

在一些實施例中，將LMW-NSNAH酶轉化為LMWH包括使該LMW-NSNAH與C5-Epi及2-OST接觸以形成包括 N-磺酸基、 N-乙醯基、2- O-磺酸基IdoA之肝素前體(NSNA2SH)。在一些實施例中，將該LMW-NSNAH酶轉化為LMWH包括使該NSNA2SH與6- O-磺酸基轉移酶-3、6- O-磺酸基轉移酶-1，或其組合接觸以形成包括 N-磺酸基、 N-乙醯基、2- O-磺酸基、6- O-磺酸基IdoA之肝素前體(NSNA2S6SH)。在一些實施例中，將該LMW-NSNAH酶轉化為LMWH包括使該NSNA2S6SH與3- O-磺酸基轉移酶-1接觸以形成LMWH。

在一些實施例中，LMW-NSNAH具有介於約3,800至約4,500道爾頓之間的分子量。在一些實施例中，該LMW-NSNAH包括介於約10%至約15%之間的 N-乙醯基。在一些實施例中，該LMWH係具有介於約90至約125 IU/mg之間的抗因子Xa之依諾肝素之異質、多分散形式。

本發明之態樣係關於一種中間LMW-NSNAH，該LMW-NSNAH係藉由一種方法產生，該方法包括提供一定量之肝素前體，其中該肝素前體係大腸桿菌莢膜多醣；使該肝素前體與一或多種酸接觸以經由水解自該肝素前體去除Kdo殘基以形成經酸處理之肝素前體；及藉由去解聚及其 N-乙醯化轉化該經酸處理之肝素前體以形成LMW-NSNAH。在一些實施例中，該LMW-NSNAH具有一定分子量及 N-磺酸基與 N-乙醯基之比率使得其用C5-差向異構酶及至少一種磺酸基轉移酶進行酶處理產生具有與源於動物之依諾肝素一致之分子量及化學性質之最終產物。在一些實施例中，該LMW-NSNAH具有介於約3,800至約4,500道爾頓之間的分子量。在一些實施例中，該LMW-NSNAH包括介於約10%至約15%之間的 N-乙醯基。

在一些實施例中，將經酸處理之肝素前體轉化為LMW-NSNAH包括經由用一或多種鹼處理該經酸處理之肝素前體水解；用一或多種另外酸處理該經酸處理之肝素前體；使該經酸處理之肝素前體與一或多種酶接觸；或其組合。在一些實施例中，其解聚及去-N乙醯化將該經酸處理之肝素前體轉化為LMW-NSNAH進一步包括將該經酸處理之肝素前體添加至包括甲醇、無水碳酸鈉及約53 μM/L乙酸酐之反應介質以形成再乙醯化肝素前體並將該再乙醯化肝素前體添加至包括無水碳酸鈉及約76 mM/L三甲胺三氧化硫之反應介質以獲得LMW-NSNAH。

本發明之態樣係關於一種包括LMWH之組合物，其中該LMWH係經由酶轉化由大腸桿菌莢膜多醣製備之LMW-NSNAH製備。

相關申請案之交叉參考

本申請案主張2021年11月5日申請之美國臨時申請案第63/276,212號及2022年2月15日申請之63/310,410之權益，其等係以引用之方式併入本文中，該引用之程度就如同本文以全文引用之方式揭示其等一樣。關於聯邦贊助研究及研發之聲明

本發明係在美國政府之支持下根據由美國科學基金會授予之基金編號DMR-1933525進行。美國政府對本發明享有某些權利。

現參考圖2，本發明之一些實施例係關於一種製造低分子量肝素(LMWH) (本文中亦稱為「化學生物合成」或「化學生物催化」 LMWH)之方法200。在一些實施例中，於202，提供一定量之肝素前體。在一些實施例中，該肝素前體係由細菌源，即，一或多種細菌合成。在一些實施例中，該肝素前體係自用於方法200之步驟中之一或多種細菌分離，即，方法200在細胞外進行。在一些實施例中，該肝素前體由該細菌源分泌及隨後自其分離以用於方法200中。在一些實施例中，在該細菌源裂解以釋放該肝素前體後，經由任何合適之方法收集該肝素前體以用於方法200中。在一些實施例中，方法200之至少一些步驟在細胞內(即，於該細菌源本身內)發生。在一些實施例中，將該肝素前體提供202給反應容器，於該反應容器中進行方法200中之後續步驟之至少一者。

在一些實施例中，細菌源係任何合適之野生型或工程化細菌。在一些實施例中，該細菌源包括大腸桿菌(大腸桿菌)菌株。在一些實施例中，該細菌源包括大腸桿菌K5。在一些實施例中，該細菌源包括大腸桿菌K5之工程化菌株。在一些實施例中，大腸桿菌K5之工程化菌株已去除果糖基轉移酶。

在一些實施例中，肝素前體係大腸桿菌莢膜多醣(CPS)。不希望受理論束縛，用於方法200中自細菌源(例如，去除果糖基轉移酶之大腸桿菌K5之工程化菌株)分離之肝素前體係酸性CPS。如上文討論，肝素前體係具有重複結構→4)-β-GlcA) (1→4)-α-GlcNAc (1→之直鏈。在一些實施例中，用於方法200中之肝素前體具有介於約35 kDa至約65 kDa之間的平均分子量。在一些實施例中，該肝素前體具有介於約45 kDa至約55 kDa之間的平均分子量。在一些實施例中，該肝素前體具有介於約48 kDa至約52 kDa之間的平均分子量。在例示性實施例中，於步驟202提供之肝素前體CPS可具有49 kDa之平均分子量，遠大於商業UFH及LMWH之分子量。

在一些實施例中，於204，自提供之肝素前體去除3-去氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸(Kdo)殘基。在一些實施例中，經由水解自該肝素前體去除該等Kdo殘基。在一些實施例中，經由酸水解自該肝素前體去除該等Kdo殘基。在一些實施例中，使該肝素前體與一或多種酸接觸以去除該等Kdo殘基並經由該酸水解形成經酸處理之肝素前體。在一些實施例中，如下文中將更詳細討論，該一或多種酸包括適用於去除該等Kdo殘基而不將該肝素前體降解至其無法再酶轉化為肝素之程度之任何酸或酸之組合。在一些實施例中，該一或多種酸包括鹽酸(HCl)。

在一些實施例中，於206，藉由其解聚及去 N-乙醯化轉化去除Kdo殘基之肝素前體(本文中亦稱為「去Kdo肝素前體」)以形成低分子量 N-磺酸基、 N-乙醯基肝素前體(LMW-NSNAH)。在一例示性實施例中，於步驟204利用之一或多種酸亦用以減小肝素前體分子量，將該肝素前體去 N-乙醯化，或其組合。在步驟206之一些實施例中，其係經酸處理之肝素前體，藉由其解聚及去 N-乙醯化轉化該肝素前體以形成該LMW-NSNAH。在一些實施例中，該去Kdo-肝素前體係經去 N-乙醯化及解聚以獲得肝素前體之低分子量形式，例如，LMW-NSNAH，其具有介於約3,000至約10,000道爾頓之間的平均分子量。在一些實施例中，該去Kdo-肝素前體係經去 N-乙醯化及解聚以獲得具有在約4,000至約7,000道爾頓之範圍內之平均分子量之LMW-NSNAH。在一些實施例中，該去Kdo-肝素前體係經去 N-乙醯化及解聚以獲得具有在約3,800至約4,500道爾頓之範圍內之平均分子量之LMW-NSNAH。在一些實施例中，該去Kdo-肝素前體係經去 N-乙醯化及解聚以獲得介於約85%至約90%之間的去 N-乙醯化。

在一些實施例中，藉由其解聚及去 N-乙醯化轉化206去Kdo-肝素前體(例如，經酸處理之肝素前體)經由水解發生。在一些實施例中，該水解係用一或多種鹼、一或多種另外酸、一或多種酶，或其組合處理該去-Kdo肝素前體之結果。在一些實施例中，該一或多種鹼包括鹼金屬組合物，例如，包括一或多種鹼金屬。在一些實施例中，該一或多種鹼包括氫氧化物。在一些實施例中，該一或多種鹼包括氫氧化鈉(NaOH)。在一些實施例中，該一或多種鹼具有介於約1N至約3N之間的濃度。在一些實施例中，該一或多種鹼具有約2N之濃度。在一些實施例中，該一或多種酶包括內切β-葡萄糖醛酸苷酶。

如上文討論，在一些實施例中，去Kdo-肝素前體係經解聚以達成介於約3,000至約10,000道爾頓之間的平均分子量。在一些實施例中，該去Kdo-肝素前體係經解聚以達成介於約4,000至約7,000道爾頓之間的平均分子量。在一些實施例中，該去Kdo-肝素前體係經解聚以達成介於約3,800至約4,500道爾頓之間的平均分子量。在一些實施例中，該去Kdo-肝素前體係經去 N-乙醯化以於該去Kdo肝素前體上達成約10%至約15%之 N-乙醯基。在一些實施例中，反應溫度(55、60、65及70℃)及時間(24、48、72及96 h)可用於轉化步驟206。在一例示性實施例中，在65℃下48 h反應時間後，該去Kdo-肝素前體之平均分子量降低至經GPC測定的3.9 kDa。

在一些實施例中，轉化206去Kdo-肝素前體包括在其去 N-乙醯化及/或解聚後，再乙醯化206A該去Kdo-肝素前體。在一些實施例中，該經解聚之肝素前體係經至少部分再乙醯化。在一些實施例中，再乙醯化206A該去Kdo-肝素前體包括使該去Kdo-肝素前體與乙酸酐接觸。在一些實施例中，再乙醯化206A包括添加甲醇、無水碳酸鈉及乙酸酐。在一些實施例中，添加之乙酸酐之量足以於該去Kdo-肝素前體上達成約10%至約15%之 N-乙醯基。在一些實施例中，該乙酸酐之濃度係約介於約40 μM/L至約60 μM/L之間。在一些實施例中，該乙酸酐之濃度係約介於約45 μM/L至約55 μM/L之間。在一些實施例中，該乙酸酐之濃度係約介於約50 μM/L至約55 μM/L之間。在一些實施例中，該乙酸酐之濃度係約53 μM/L。在一些實施例中，使該去-Kdo肝素前體與乙酸酐接觸複數次。在一些實施例中，使該去-Kdo肝素前體與乙酸酐以預定間隔接觸至少4次。在一些實施例中，該等間隔係有規律的。在一些實施例中，該等間隔係無規律的。在一些實施例中，該等間隔係介於約10分鐘至約30分鐘之間。在一些實施例中，該等間隔係約20分鐘。

在一些實施例中，轉化206去Kdo-肝素前體進一步包括 N-硫酸化206B該去Kdo-肝素前體。在一些實施例中， N-硫酸化206B該去Kdo-肝素前體獲得LMW-NSNAH。在一些實施例中， N-硫酸化206B該去Kdo-肝素前體包括使該去Kdo-肝素前體(例如，經酸處理之肝素前體)與三甲胺三氧化硫、吡啶三氧化硫，或其組合接觸。在一些實施例中，藉由添加相等部分之無水碳酸鈉及三甲胺三氧化硫將該肝素前體 N-硫酸化206B。在一些實施例中，三氧化物反應物(例如，三甲胺三氧化硫、吡啶三氧化硫等)之濃度係介於約60 mM/L至約90 mM/L之間。在一些實施例中，該三氧化物反應物之濃度係介於約70 mM/L至約80 mM/L之間。在一些實施例中，該三氧化物反應物之濃度係約76 mM/L。

在一些實施例中，LMW-NSNAH具有介於約3,000至約10,000道爾頓之間的分子量。在一些實施例中，該LMW-NSNAH具有介於約4,000至約7,000道爾頓之間的分子量。在一些實施例中，該LMW-NSNAH具有介於約3,800至約4,500道爾頓之間的分子量。在一些實施例中，該LMW-NSNAH包括介於約10%至約15%之間的 N-乙醯基。

於208，將LMW-NSNAH酶轉化為LMWH。在一些實施例中，酶轉化208經由一或多個連續酶處理發生，各處理包括一或多種酶。在一些實施例中，將該LMW-NSNAH酶轉化208為LMWH包括使該LMW-NSNAH與C5-差向異構酶(C5-Epi)及2- O-磺酸基轉移酶(2-OST)接觸以形成包括 N-磺酸基、 N-乙醯基、2- O-磺酸基IdoA之肝素前體(NSNA2SH)。在一些實施例中，將該LMW-NSNAH酶轉化208為LMWH包括使該NSNA2SH與一或多種磺酸基轉移酶接觸。在一些實施例中，將該LMW-NSNAH酶轉化208為LMWH包括使該NSNA2SH與6- O-磺酸基轉移酶-3 (6-OST-3)、6- O-磺酸基轉移酶-1 (6-OST-1)，或其組合接觸以形成包括 N-磺酸基、 N-乙醯基、2- O-磺酸基、6- O-磺酸基IdoA之肝素前體(NSNA2S6SH)。在一些實施例中，將該LMW-NSNAH酶轉化208為LMWH包括使該NSNA2S6SH與3- O-磺酸基轉移酶-1 (3-OST)接觸以形成LMWH。在一些實施例中，該LMWH係具有介於約90至約125 IU/mg之間的抗因子Xa之依諾肝素之異質、多分散形式。在一些實施例中，將一定量包括鏈之1,6-去水甘露糖引至該LMWH。

本發明之一些實施例係關於中間物LMW-NSNAH。如上文討論，該中間物LMW-NSNAH係一或多個對由細菌源合成之肝素前體初始材料之處理步驟之結果。自此等細菌獲得該肝素前體初始材料用於後續轉化為肝素產品提供許多優於源於動物之肝素產品之優點，例如，材料可用性、純度等，及本發明之方法確保將源於細菌之肝素前體轉化為中間物LMW-NSNAH及隨後轉化為功能上等同於源於動物之肝素之LMWH。

在製造LMW-NSNAH之方法之一些實施例中，提供一定量之肝素前體。如上文討論，在一些實施例中，該肝素前體係大腸桿菌CPS。在一些實施例中，使該肝素前體與一或多種酸接觸以經由水解自該肝素前體去除Kdo殘基以形成經酸處理之肝素前體。在一些實施例中，然後可使用適當大小且經配置之分離膜(例如，具有1 kDa分子量截止點)自反應介質之剩餘部分分離現一經酸水解即不含Kdo之經酸處理之肝素前體。

動物中之肝素前體中間物與用於本發明之方法之CPS中之肝素前體之間的主要差異係其上生物合成其等之受體。在動物中，該肝素前體係組裝於與核心蛋白絲甘蛋白之絲胺酸殘基附接之四醣鍵聯區域(Xyl-Gal-Gal-GlcA)對應之受體上。然而，肝素前體CPS之生物合成於醣脂質受體上啟動，該醣脂質受體係由多個連接之Kdo殘基構成。

現參考圖3，如上文於本發明之實施例中於步驟204討論，在另外LMWH-合成步驟(例如，步驟206至208)前去除醣脂質末端(包括Kdo殘基)，因為在源於豬之LMWH產品中未發現該醣脂質末端。來自步驟204之反應條件用以去除Kdo，但亦可水解 N-乙醯基並減小肝素前體分子量。使用 ¹H NMR及GPC分析，經測定在一例示性實施例中，在90℃下在pH=1下用HCl將來自大腸桿菌K5 (去除果糖基轉移酶)之肝素前體處理1 h，釋放Kdo而不修飾肝素前體鏈。在 ¹H NMR中於1.5至2.5 ppm觀察到之Kdo信號於滲餘物中缺失，指示已成功去除該Kdo。

在一些實施例中，然後藉由其解聚及去 N乙醯化轉化經酸處理之肝素前體以形成LMW-NSNAH。在一些實施例中，將該經酸處理之肝素前體轉化為LMW-NSNAH包括經由用一或多種鹼處理該經酸處理之肝素前體，用一或多種另外酸處理該經酸處理之肝素前體，使該經酸處理之肝素前體與一或多種酶接觸，或其組合水解。在一些實施例中，將該經酸處理之肝素前體轉化為LMW-NSNAH包括將該經酸處理之肝素前體添加至反應介質(包括甲醇、無水碳酸鈉及約53 μM/L乙酸酐)以形成再乙醯化肝素前體。

現參考圖4A至4B，肝素前體之化學去 N-乙醯化與本發明之實施例一致，例如，藉由鹼水解，導致部分(或完全)去除GlcNAc殘基之 N-乙醯基並透過β-消除使多醣鏈解聚。在例示性實施例中，由於來自上文步驟206之去 N-乙醯化中之反應條件，因此基於NMR分析，未發現乙醯基(100%去 N-乙醯化)。然後將該肝素前體再乙醯化，例如，於步驟206A，藉由在鹼處理後及在 N-硫酸化前，例如，於步驟206B添加一定量之乙酸酐。在一些實施例中，將經酸處理之肝素前體轉化為LMW-NSNAH包括將再乙醯化肝素前體添加至包括無水碳酸鈉及約76 mM/L三甲胺三氧化硫之反應介質以將該再乙醯化肝素前體 N-硫酸鹽化並獲得LMW-NSNAH。

明確參考圖4A，在此例示性實施例中，146 mg低分子量 N-磺酸基、 N-乙醯基肝素前體係獲自1 g經酸處理之肝素前體，具有4,200 Da之分子量。對應於GlcNAc殘基之5.31 ppm峰，及對應於GlcNS殘基之5.55 ppm峰之 ¹H NMR分析提供在10%至15%之範圍內之 N-乙醯基/ N-磺酸基比率，提供一種符合針對依諾肝素之美國藥典(USP)標準之產品。在一些實施例中，LMW-NSNAH具有一定分子量及 N-磺酸基與 N-乙醯基之比率使得其用C5-Epi及磺酸基轉移酶(例如，2-OST、6-OST-1、6-OST-3、3-OST等，或其組合)進行酶處理，產生一種具有與源於動物之依諾肝素一致之分子量及化學性質之最終產物。如上文討論，在一些實施例中，該LMW-NSNAH具有介於約3,000至約10,000道爾頓之間的分子量。在一些實施例中，該LMW-NSNAH具有介於約4,000至約7,000道爾頓之間的分子量。在一些實施例中，該LMW-NSNAH具有介於約3,800至約4,500道爾頓之間的分子量。在一些實施例中，該LMW-NSNAH包括介於約10%至約15%之間的 N-乙醯基。

現參考圖5A至5C，本發明之一些實施例係關於一種包括LMWH之組合物。在一些實施例中，該LMWH係經由酶轉化由細菌源(例如，大腸桿菌CPS)製備之LMW-NSNAH製備。在一些實施例中，該組合物中之LMWH符合USP依諾肝素規範。

經證實經由對LMW-NSNAH之一系列酶修飾，化學酶合成LMWH與本發明之實施例一致，其符合USP依諾肝素規範。由C5-Epi催化將NSNAH轉化為NSNA2SH，該C5-Epi在可逆反應中將GlcA殘基轉化為IdoA殘基，然後用2- O-硫酸化經由2-OST鎖定到位，以提供IdoA2S殘基。使用6-OST-1及6-OST-3將NSNA2SH轉化為NSNA2S6SH。使用3-OST將NSNA2S6SH轉化為LMWH。藉由二醣組成分析監測C5-Epi/2-OST及6-OST-X反應。藉由抗Xa活性分析監測3-OST反應。二醣組成分析係用於確定硫酸化狀態，及基於商業依諾肝素，目標範圍NS2S為68至74%。

明確參考圖5A，於4、12、24、48、72、96及120 h時間點測定NSNAH轉化為NSNA2SH。不希望受理論束縛，由於此等酶對較短鏈受質之活性降低，因此與本發明之實施例一致之LMWH之合成比化學生物合成UFH之合成慢得多。於96 h時間點達成之最大轉化百分比為69.3%之NS2S，其符合USP依諾肝素規範。現參考圖5B，於24 h內完成NS2S轉化為NS2S6S。UFH具有足夠長度之鏈以結合AT及凝血酶兩者以提供三元複合物，其將凝血酶滅活並因此防止凝塊形成。相比之下，LMWH包含比UFH更小之鏈且此等中之大多數之長度足以結合AT，滅活因子Xa。因此，透過抗Xa活性監測與本發明之實施例一致之LMWH之合成。現參考圖5C，在乾燥之基礎上，依諾肝素之抗因子Xa之效價係不小於90 IU/mg且不大於125 IU/mg。在用3-OST處理120 h後可達成此活性且在進一步酶反應中不存在增加之抗凝血劑活性。

再次參考圖4B，GPC係用以使用USP依諾肝素鈉分子量校準物測定與本發明之實施例一致之LMWH之分子量。依諾肝素鈉之重量平均分子量之USP標準為4,500 Da，範圍係介於3,800至5,000 Da之間。由於硫酸化增加最終產物之分子量，因此針對LMW-NSNAH中間物設定3,800至4,500 Da之目標分子量。如預期，針對低分子量NSNAH，於4,200 Da開始，最終LMWH產品之分子量已增加至4,350 Da。

使用當前USP依諾肝素專論中描述之方法量測NSNA2S6SH中間物及最終LMWH產品之抗凝血劑活性。在乾燥之基礎上計算，依諾肝素鈉之目標抗凝血劑活性具有不小於90且不超過125抗因子Xa國際單位(IU)/mg之效價，及不小於20.0且不超過35.0抗因子IIa IU/mg。抗Xa與抗IIa活性之比率係介於3.3至5.3之間。

於各種時間點定期去除20 µL反應溶液並藉由HPLC-GPC進行抗Xa活性及濃度分析。該抗Xa活性(參見圖5C)於最初48 h內增加及然後減慢直至達成105 IU/mg之活性。

參考下表1，與本發明之實施例一致之LMWH具有105 IU/mg之抗Xa活性及24 IU/mg之抗IIa活性及其中抗Xa/IIa比率為4.4，與USP依諾肝素一致。

抗凝血劑活性	IC ₅₀
	抗Xa (IU/mg)	抗IIa (IU/mg)	抗Xa/IIa 比率	AT (µg/mg)	PF4 (µg/mg)
依諾肝素	110 ± 4.4	28 ± 2.6	3.9 ± 0.22	11.0 ± 0.53	2.7 ± 0.26
化學生物催化 LMWH	105 ± 2.6	24 ± 1.0	4.4 ± 0.13	12.0 ± 0.29	2.8 ± 0.35
USP標準	90-125	20.0-35.0	3.3-5.3	-	-

表1：來自三倍製劑之LMWH之抗凝血劑活性及IC ₅₀值的總結

現參考圖6，利用使用肝素裂解酶I、II及III之處理進行與本發明之實施例一致之LMWH及其中間物之二醣組成分析。基於硫酸化程度及位置，此等處理提供8種不同之二醣產物。然後藉由強陰離子交換高效液相層析術(SAX-HPLC)分析此等二醣以監測中間物生物合成及最終產物(參見圖7A至7B)。與本發明之實施例一致之肝素、依諾肝素對照品及LMWH之二醣組合物係顯示於下表2中。

	肝素對照品(%)	依諾肝素(%)	LMWH (%)
0S	4.2 ± 0.15	3.1 ± 0.28	3.9 ± 0.21
NS	3.3 ±0.10	3.0 ± 0.35	3.8 ± 0.21
6S	3.3 ± 0.12	3.6 ± 0.07	4.4 ± 0.14
2S	2.0 ± 0.21	1.9 ± 0.07	0.1 ± 0.08
NS6S	10.6 ± 0.23	10.3 ± 0.49	17.3 ± 0.49
NS2S	7.7 ± 0.21	7.0 ± 0.14	3.5 ± 0.0
2S6S	1.5 ± 0.23	1.8 ± 0.28	0.9 ± 0.39
四1	0.3 ± 0.06	0.4 ± 0.08	0.3 ± 0.08
參	65.1 ± 0.81	66.3 ± 0.07	62.6 ±0.01
四2	1.7 ± 0.21	1.9 ± 0.17	1.8 ± 0.14
四3	0.1 ± 0.05	0.4 ± 0.09	0.5 ± 0.09
四4	0.1 ± 0.06	0.3 ± 0.02	0.6 ± 0.07
四5	0.1 ± 0.03	0.1 ± 0.04	0.1 ±0.04
四1至5小計	2.3 ± 0.31	3.1 ± 0.40	3.3 ± 0.40
總計(二及四)	100.0	100.0	100.0

表2：來自三倍製劑之LMWH之二醣及四醣組成分析

現參考圖8A至8B，用與上文描述之實施例一致之化學 N-硫酸化、2-OST/C5-Epi、6-OST及3-OST處理對自細菌源分離之肝素前體進行處理，提供與依諾肝素類似之二醣組合物。相較於依諾肝素中66.3%之TriS含量，化學生物催化LMWH之TriS含量為62.6%。該化學生物催化LMWH之NS6S為17.3%，高於依諾肝素的10.3%，而該LMWH之NS2S為3.5%，低於依諾肝素之7.0%。此表明2-OST轉化係低於6-OST轉化。應注意3- O-硫酸化葡萄胺糖殘基對肝素裂解酶裂解具有抗性。因此，除抗凝血劑活性分析外，接著藉由用肝素酶I、II及III處理進行四醣分析，接著用SAX-HPLC分析所得抗性四醣。

現參考圖9，已表徵五種包括3-OST之四醣：(1) ΔUA-GlcNAc6S-GlcUA-GlcNS3S (其中ΔUA係去氧-α-L-蘇型-己-4-烯哌喃糖醛酸)；(2) ΔUA-GlcNAc6S-GlcUA-GlcNS3S6S；(3) ΔUA-GlcNS6S-GlcUA-GlcNS3S；(4) ΔUA2S-GlcNAc6S-GlcUA-GlcNS3S6S；(5) ΔUA2S-GlcNS6S-GlcUA-GlcNS3S6S。結果顯示相較於依諾肝素，化學生物催化LMWH具有類似包括3-OST之四醣分佈(再次參見表2)。於二醣及四醣組成分析中，經由本發明之實施例產生之LMWH係高度接近於依諾肝素。

現參考圖10A至10B，進行一維 ¹H及 ¹³C NMR光譜以表徵依諾肝素及經由本發明之實施例產生之LMWH之結構。所有依諾肝素 ¹H峰均可經指定。兩種LMWH之光譜看起來非常相似但仍具有一些差異。GlcNS3S峰與ΔUA2S之H1自5.44至5.42 ppm重疊。IdoA2S峰係經指定自5.17至5.09 ppm。相較於依諾肝素，在5.90 ppm化學生物催化LMWH下之H4 ΔUA強度更低。於5.48、5.43、5.33、5.13、5.07及4.51 ppm之信號峰對應於變旋異構氫。該LMWH具有自5.09至5.00 ppm之另外兩個峰，不希望受理論束縛，其可為IdoA2S或雜質。相較於依諾肝素或學名藥(generic)依諾肝素，經由本發明之實施例產生之化學生物催化LMWH具有極少量之1,6-脫水甘露糖。

現參考圖11A至11C，肝素之抗凝血劑活性係主要透過其結合及調節AT而介導。因此，肝素與AT之間的相互作用係一個用於抗凝過程之步驟。使用競爭性表面電漿子共振(SPR)以量測固定於晶片表面上之USP肝素相比於經由本發明之實施例產生之LMWH之競爭性AT結合。導致反應單元(RU)減少50%之IC ₅₀值可自LMWH溶液濃度(高達50 µg/mL)範圍內之圖計算。針對依諾肝素及化學生物催化LMWH之IC ₅₀值之結果分別為11.0及12.0 µg/mL。因此，經由本發明之實施例產生之LMWH之AT結合活性略低於依諾肝素，但仍於可接受範圍內。

參考圖11D至11F，特別受關注由肝素與血小板因子IV (PF4)相互作用引起之肝素誘導之血小板減少症(HIT)，導致不良之免疫紊亂。針對經由本發明之實施例產生之LMWH進行HIT可能性之分析。使用一種快速方法以評估PF4結合並透過溶液競爭SPR計算IC ₅₀值。相較於依諾肝素為2.7 µg/mL，針對經由本發明之實施例產生之LMWH量測之IC ₅₀為2.8 µg/mL。此等結果堪比在2.4至2.9 µg/mL範圍內之LMWH樣品。該LMWH對PF4之結合親和力比UFH小得多，導致針對LMWH，HIT之可能性更低。實例

材料：透過發酵製備大腸桿菌K5肝素前體CPS。製備2-、6-、3-OST及C5-Epi酶。依諾肝素LMWH標準品，依諾肝素鈉分子量校準品A (1400、2250、4550及9250 Da)及B (1800、3350及6650 Da)係購自美國藥典(USP, Rockville, MD)。人類抗凝血酶III (AT)及血小板因子4 (PF4)係購自Hyphen BioMed (Neuville-sur-Oise, France)。重組黃桿菌肝素裂解酶I、II、III (分別為EC編號4.2.2.7、4.2.2.X及4.2.2.8)係表現於大腸桿菌中並經純化。不飽和肝素二醣標準品係購自Iduron (Manchester, UK)。Biophen肝素抗Xa (2階段)及抗IIa (2階段)套組係購自Aniara (West Chester, OH, USA)。

K5肝素前體之醣脂質末端之去除。用鹽酸處理由去除果糖基轉移酶之大腸桿菌K5製備之肝素前體CPS以去除醣脂質受體3-去氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸(Kdo)。將肝素前體溶解於鹽酸溶液中並將pH調整至1，然後在90℃下培養1 h。藉由氫氧化鈉將該溶液之pH重新調整至7並藉由透析去鹽。藉由NMR分析確定結果。

藉由化學裂解製備低分子量 N-磺酸基、 N-乙醯基肝素前體(LMW-NSNAH)。不含Kdo之肝素前體之去 N-乙醯化及解聚係藉由受控鹼性反應進行。將樣品(20 g/L)溶解於50 mL 2 N NaOH中並在65℃下於搖瓶中培養48 h，冷卻至室溫，並用HCl將pH調整至7.0。藉由添加甲醇(3.5 mL)、無水碳酸鈉(130 mM/L)及乙酸酐(53 µM/L，各添加四次，間隔為20 min)進行受控再乙醯化。添加一定量之乙酸酐以達成經NMR測定的10至15%之 N-乙醯基。接著，藉由添加相等部分之無水碳酸鈉(130 mM/L)及三甲胺三氧化硫(76 mM/L)並在47℃下混合48 h進行 N-硫酸化。藉由使用鄰苯二甲醛(OPA)分析量測未經取代之胺監測硫酸化程度。藉由NMR測定硫酸鹽與乙醯基比率。在4℃下用85%甲醇將低分子量LMW-NSNAH沈澱整夜。藉由用85%甲醇清洗四次去除殘餘之鹽並以1800 x g離心。

藉由酶修飾製備化學生物合成LMWH。用C5-Epi及2-OST處理LMW-NSNAH樣品(50 mg)以提供低分子量 N-磺酸基、 N-乙醯基、2-磺酸基肝素前體(LMW-NSNA2SH)。詳細之反應條件如下：受質濃度為1 mg/mL，PAPS濃度為5 mM，各固定化酶(C5-Epi/2-OST)以1 mg/mL於50%漿液中。在37℃下於50 mM 2-( N-嗎啉基)乙磺酸緩衝液(pH 7.2)中用0.05% NaN ₃及125 mM NaCl將該反應物培養120 h。在該反應完成後，過濾該混合物以去除酶樹脂並使用1 kDa分子量截止點膜管針對蒸餾水進行透析以去除鹽及其他小分子雜質。二醣組成分析係用以監測並證實硫酸化反應。接著，使用固定化酶進行受控6-OST及3-OST反應以產生LMWH，即，化學生物催化LMWH。該等反應條件係與該C5-Epi/2-OST反應中使用之條件相似。二醣組成分析及抗Xa活性分析係分別用以監測反應狀態。

藉由凝膠滲透層析術(GPC)測定分子量。藉由GPC高效液相層析術(HPLC)使用依諾肝素鈉分子量校準物測定分子量。使用保護管柱BioSuite 7.5 x 75 mm以保護兩個串聯之分析管柱：Waters BioSuite™ 125，5 µm HR SEC 7.8 x 300 mm管柱(Waters Corporation, Milford, MA)。流動相為0.5 M硝酸鋰並將流動速率設定為0.6 mL/min。樣品注射體積為20 µL，及濃度為5 mg/mL。

抗凝血劑活性。使用BIOPHEN肝素抗Xa (2階段)及抗IIa (2階段)套組遵循由製造商提供之方案測定產品之抗凝血劑活性。簡而言之，AT (抗Xa試劑1 (r1))、因子Xa (r2)及因子Xa特異性色原體受質(r3)係用於抗Xa活性，及AT (抗IIa試劑1 (R1))、人類凝血酶(R2)及因子IIa特異性色原體受質(R3)係用於抗II活性。各試劑均用1 mL蒸餾水重構並振盪直至完全溶解。在適當之緩衝液(Tris-EDTA-NaCl-PEG，pH 8.4)中針對r1/R1及r2/R2進行1/5稀釋後，在使用前針對r3/R3使用蒸餾水立即恢復該等試劑。將參考標準品及稀釋樣品製備成適當之濃度。將樣品(40 μL)添加至96孔盤內並在37℃下培養5 min，添加40 μL r1/R1並充分混合及培養2 min，接著添加40 μL r2/R2並培養2 min，及最後添加40 μL r3/R3並再培養2 min。藉由添加80 μL 50 mM乙酸停止反應。然後於405 nm測定吸光度。使用不同濃度之依諾肝素標準品之標準曲線計算抗Xa及抗IIa活性。

二醣及四醣組成分析。藉由於Shimadzu ^TMLC-2030系統(Shimadzu, Kyoto, Japan)上進行具有紫外線偵測器之强陰離子交換(SAX)-HPLC確定二醣及四醣組成。在37℃下使用肝素裂解酶I、II及III (各10 mU)於消化緩衝液(50 mM乙酸銨，包括2 mM氯化鈣，pH 7.0)中之混合物將樣品(100 g)徹底消化2h。藉由煮沸10 min終止反應並藉由以10000 x g離心10 min去除變性酶。藉由與Shimadzu ^TMLC-20 AD泵、CBM-20A控制器、SIL-20AHT自動取樣器及SPD-20AV UV偵測器偶合之HPLC系統分析濃度為1 μg/μL之上清液。用流動相A (1.8 mM磷酸二氫鈉，pH=3)平衡Spherisorb SAX層析管柱(4.0 x 250 mm，5.0 μm，Waters)及接著使用流動相B (1.8 mM磷酸二氫鈉及2 M過氯酸鈉，pH=3)梯度溶析。二醣分析使用一定梯度之流動相B，於30 min內自5%增加至50%，保持5 min，然後變化至5%並保持15 min。四醣分析使用以下梯度：15至32.5%流動相B自0至40 min，於50 min時42.5%流動相B，於54 min時50%，及在0.45 mL/min之流動速率下維持1 min。

核磁共振(NMR)光譜學分析。NMR光譜係於配備具有z軸梯度之 ¹H/ ²H/ ¹³C/ ¹⁵N冷凍探針之Bruker 800 MHz (18.8 T)標準孔(standard-bore) NMR光譜儀上獲得。將樣品溶解於0.4 mL 99.96% D ₂O中並凍乾，及然後重複兩次。 ¹H/ ¹³C 1D NMR係於298 k下進行。

表面電漿子共振(SPR)分析。SPR量測係於使用BIAcore 3000控制及BIAevaluation ^TM軟體(4.0.1版)操作之BIAcore ^TM3000儀器(GE, Uppsala, Sweden)上進行。基於製造商之方案，將藉由使肝素之還原端偶合至胺-PEG3-生物素(Pierce, Rockford, IL)製備之生物素化肝素固定至經鏈黴親和素塗佈之晶片。使用SPR透過IC ₅₀之量測進行表面肝素與結合至蛋白質之LMWH (經由本發明之實施產生)之間的競爭研究。以30 μL/min之流動速率將與不同濃度之LMWH混合於HBS-EP緩衝液(0.01 M 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸) (HEPES)、0.15 M NaCl、3 mM乙二胺四乙酸(EDTA)、0.005%表面活性劑P20，pH 7.4)中之AT (250 nM)或PF4 (125 nM)注射於該晶片上。使用循序注射10 mM甘胺酸-HCl (pH 2.5)及2 M NaCl進行解離及再生以獲得在各運行後完全再生之表面。針對各組競爭實驗，進行對照實驗以確保表面係經完全再生，且在運行之間獲得之結果係可比較的。

本發明之方法及系統係有利於產生適用於依諾肝素鈉(最廣泛使用之低分子量肝素產品)之等效用途之LMWH。本發明之化學生物催化LMWH旨在充當傳統藥物LMWH之可比較版本。

依諾肝素係通常藉由僅自豬腸黏膜分離之肝素苯甲酯之鹼性解聚獲得。然而，源於豬之依諾肝素之製備及用途存在顯著缺點，即動物來源之肝素初始材料之可變性、原材料及其等雜質之有限可用性及較差控制。

本發明之LMWH及包括該LMWH之組合物係在未使用源於豬之肝素之情況下製備，且因此在無源於豬之UFH之解聚步驟之情況下製備。相反，本發明之方法利用細菌源(諸如工程化大腸桿菌K5)來產生用作LMWH產品之主鏈前體之肝素前體。一種解聚方法(例如，經由鹼組合物)可獲得適當鏈長度之主鏈，然後該主鏈可經由C5-Epi、2- O-、6- O-及3- O-磺酸基轉移酶修飾。此等方法較為便宜，但仍可製備高純度、異質、多分散形式之依諾肝素。此外，此等化學酶合成之LMWH具有數個優於由動物來源之UFH製備之LMWH之優點，包括更佳之原材料可用性、更佳之製造過程控制、減少有關污染、摻雜或動物病毒或雜質之擔憂。

儘管已關於本發明之例示性實施例描述並闡述本發明，但熟習此項技術者應瞭解可於其中及對其進行前述及各種其他改變、省略及添加，而不背離本發明之精神及範圍。

200:方法 202:步驟 204:步驟 206:步驟 206A:步驟 206B:步驟 208:步驟

圖式出於闡述本發明之目的顯示本發明揭示標的之實施例。然而，應瞭解本申請案不限於該等圖式中顯示之精確配置及工具，其中：

圖1係肝素前體之化學結構；

圖2係一種根據本發明之一些實施例製造低分子量肝素(LMWH)之方法之圖；

圖3係顯示自低分子量 N-磺酸基、 N-乙醯基肝素前體(LMW-NSNAH)去除之3-去氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸(Kdo)之 ¹H NMR分析之圖；

圖4A係顯示藉由凝膠滲透層析術(GPC)進行之化學生物合成LMW-NSNAH之分子量分析之圖；

圖4B係顯示藉由GPC進行之化學生物催化LMWH之分子量分析之圖；

圖5A係顯示根據本發明之一些實施例在酶合成化學生物合成LMWH期間藉由2- O-磺酸基轉移酶及C5-差向異構酶反應進行之NS2S轉化之圖；

圖5B係顯示根據本發明之一些實施例在酶合成化學生物合成LMWH期間藉由6- O-磺酸基轉移酶反應進行之Tris轉化之圖；

圖5C係如抗Xa活性證明，根據本發明之一些實施例在酶合成化學生物合成LMWH期間藉由3- O-磺酸基轉移酶反應進行3S轉化之圖；

圖6係經由用肝素裂解酶I、II及III處理鑑定之根據本發明之一些實施例之化學生物合成LMWH及其中間物之二醣結構之表；

圖7A係顯示藉由強陰離子交換高效液相層析術(SAX-HPLC)之根據本發明之一些實施例之化學生物合成LMWH之二醣光譜分析的圖；

圖7B係顯示藉由SAX-HPLC之根據本發明之一些實施例之化學生物合成LMWH之四醣光譜分析的圖；

圖8A係顯示根據本發明之一些實施例之化學生物合成LWMH之二醣組成分析之圖；

圖8B係顯示根據本發明之一些實施例之化學生物合成LWMH之四醣組成分析之圖；

圖9描繪含有來自根據本發明之一些實施例之化學生物合成LWMH之四醣結構之5種3- O-硫酸化之化學結構；

圖10A係顯示根據本發明之一些實施例之依諾肝素及化學生物合成LMWH之 ¹H NMR之圖；

圖10B係顯示根據本發明之一些實施例之依諾肝素及化學生物催化LMWH之 ¹³C NMR分析之圖；

圖11A至11B係顯示分別與根據本發明之一些實施例之依諾肝素及化學生物催化LMWH競爭結合至肝素表面之抗凝血酶III (AT)之表面電漿子共振(SPR)傳感圖之圖；

圖11C係顯示使用AT抑制資料之根據本發明之一些實施例之依諾肝素及化學生物催化LMWH之IC ₅₀計算之圖；

圖11D至11E係顯示分別與根據本發明之一些實施例之依諾肝素及化學生物催化LMWH競爭結合至肝素表面之血小板因子IV (PF4)之SPR傳感圖的圖；及

圖11F係顯示使用PF4抑制資料之根據本發明之一些實施例之依諾肝素及化學生物催化LMWH之IC ₅₀計算之圖。

200:方法

202:步驟

204:步驟

206:步驟

206A:步驟

206B:步驟

208:步驟

Claims

一種製造低分子量肝素(LMWH)之方法，其包括：提供一定量之肝素前體；使該肝素前體與一或多種酸接觸以形成經酸處理之肝素前體；藉由其解聚及去 N-乙醯化轉化該經酸處理之肝素前體以形成低分子量 N-磺酸基、 N-乙醯基肝素前體(LMW-NSNAH)；及將該LMW-NSNAH酶轉化為LMWH，其中該肝素前體係大腸桿菌莢膜多醣。
如請求項1之方法，其中該肝素前體係經由大腸桿菌K5之工程化菌株合成。
如請求項1之方法，其中使該肝素前體與一或多種酸接觸以形成經酸處理之肝素前體包括：經由酸水解自該肝素前體去除3-去氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸(Kdo)殘基。
如請求項1之方法，其中將該經酸處理之肝素前體轉化為LMW-NSNAH包括經由以下水解該經酸處理之肝素前體：用一或多種鹼處理該經酸處理之肝素前體；用一或多種另外酸處理該經酸處理之肝素前體；使該經酸處理之肝素前體與一或多種酶接觸；或其組合。
如請求項1之方法，其中藉由其解聚及去 N-乙醯化將該經酸處理之肝素前體轉化為LMW-NSNAH進一步包括：在其去N-乙醯化後將該經酸處理之肝素前體再乙醯化；及將該經酸處理之肝素前體 N-硫酸化以獲得LMW-NSNAH。
如請求項5之方法，其中：在其去 N-乙醯化後將該經酸處理之肝素前體再乙醯化包括：使該經酸處理之肝素前體與乙酸酐接觸；及將該經酸處理之肝素前體 N-硫酸化以獲得LMW-NSNAH包括：使該經酸處理之肝素前體與三甲胺三氧化硫、吡啶三氧化硫，或其組合接觸。
如請求項5之方法，其中在其去 N-乙醯化後將該經酸處理之肝素前體再乙醯化包括：使該經酸處理之肝素前體與約53 μM/L乙酸酐接觸。
如請求項5之方法，其中將該經酸處理之肝素前體 N-硫酸化以獲得LMW-NSNAH進一步包括：使該經酸處理之肝素前體與約76 mM/L三甲胺三氧化硫接觸。
如請求項1之方法，其中將該LMW-NSNAH酶轉化為LMWH進一步包括：使該LMW-NSNAH與C5-Epi及2-OST接觸以形成包括 N-磺酸基、 N-乙醯基、2- O-磺酸基IdoA之肝素前體(NSNA2SH)。
如請求項9之方法，其中將該LMW-NSNAH酶轉化為LMWH進一步包括：使該NSNA2SH與6- O-磺酸基轉移酶-3、6- O-磺酸基轉移酶-1，或其組合接觸以形成包括 N-磺酸基、 N-乙醯基、2- O-磺酸基、6- O-磺酸基IdoA之肝素前體(NSNA2S6SH)。
如請求項10之方法，其中將該LMW-NSNAH酶轉化為LMWH進一步包括：使該NSNA2S6SH與3- O-磺酸基轉移酶-1接觸以形成LMWH。
如請求項1之方法，其中該LMW-NSNAH具有介於約3,800至約4,500道爾頓之間的分子量。
如請求項1之方法，其中該LMW-NSNAH包括介於約10%至約15%之間的 N-乙醯基。
如請求項1之方法，其中該LMWH係具有介於約90至約125 IU/mg之間的抗因子Xa之依諾肝素之異質、多分散形式。
一種中間低分子量 N-磺酸基、 N-乙醯基肝素前體(LMW-NSNAH)，該LMW-NSNAH係藉由一種包括以下之方法產生：提供一定量之肝素前體，其中該肝素前體係大腸桿菌莢膜多醣；使該肝素前體與一或多種酸接觸以經由水解自該肝素前體去除3-去氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸(Kdo)殘基以形成經酸處理之肝素前體；及藉由其解聚及去 N-乙醯化轉化該經酸處理之肝素前體以形成LMW-NSNAH；其中該LMW-NSNAH具有一定分子量及 N-磺酸基與 N-乙醯基之比率使得其用C5-差向異構酶及至少一種磺酸基轉移酶進行酶處理產生具有與源於動物之依諾肝素一致之分子量及化學性質之最終產物。
如請求項15之中間LMW-NSNAH，其中該LMW-NSNAH具有介於約3,800至約4,500道爾頓之間的分子量。
如請求項15之中間LMW-NSNAH，其中該LMW-NSNAH包括介於約10%至約15%之間的 N-乙醯基。
如請求項15之中間LMW-NSNAH，其中將該經酸處理之肝素前體轉化為LMW-NSNAH包括經由以下水解：用一或多種鹼處理該經酸處理之肝素前體；用一或多種另外酸處理該經酸處理之肝素前體；使該經酸處理之肝素前體與一或多種酶處理；或其組合。
如請求項15之中間LMW-NSNAH，其中藉由其解聚及去 N-乙醯化將該經酸處理之肝素前體轉化為LMW-NSNAH進一步包括：將該經酸處理之肝素前體添加至包括甲醇、無水碳酸鈉及約53 μM/L乙酸酐之反應介質以形成再乙醯化肝素前體；及將該再乙醯化肝素前體添加至包括無水碳酸鈉及約76 mM/L三甲胺三氧化硫之反應介質以獲得LMW-NSNAH。
一種包括低分子量肝素(LMWH)之組合物，其中該LMWH係經由酶轉化由大腸桿菌莢膜多醣製備之低分子量 N-磺酸基、 N-乙醯基肝素前體(LMW-NSNAH)製備。